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JP2023538114A - メソテリン陽性がんを治療するための組成物及び方法 - Google Patents

メソテリン陽性がんを治療するための組成物及び方法 Download PDF

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JP2023538114A JP2023512376A JP2023512376A JP2023538114A JP 2023538114 A JP2023538114 A JP 2023538114A JP 2023512376 A JP2023512376 A JP 2023512376A JP 2023512376 A JP2023512376 A JP 2023512376A JP 2023538114 A JP2023538114 A JP 2023538114A
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Abstract

本開示は、メソテリンに特異的な第１の活性化因子受容体、及びメソテリン陽性がん細胞において喪失しているリガンドに特異的な第２の抑制性受容体を含む免疫細胞、並びにがんの治療のためにそれを作製及び使用する方法を提供する。【選択図】図１５Ｂ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年９月３０日に出願された米国仮特許出願第６３／０８５，９７１号、及び２０２０年８月２０日に出願された米国仮特許出願第６３／０６８，２４５号の優先権の利益を主張するものであり、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、養子細胞療法及びがん治療の分野に関する。
参照による配列表の組み込み
配列表の項目の出願は、ＥＦＳ－ＷＥＢを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出されている配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２１年８月１７日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、Ａ２ＢＩ＿０１９＿０３ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名前であり、１．０８ＭＢサイズである。
細胞療法は、様々な疾患、特にがんの治療のための強力なツールである。従来の養子細胞療法において、免疫細胞は、特異的受容体、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように操作され、これにより、標的細胞によって発現されるリガンドとの受容体の相互作用を介して細胞標的に対する免疫細胞の活性化が誘導される。多くの標的が正常な組織で発現されるため、好適な標的分子の同定は依然として困難である。この発現は、移植された細胞が、標的分子を発現する正常な組織を標的とするときに毒性をもたらし得る。したがって、養子細胞療法による、疾患、特にがんの治療に有用な組成物及び方法が当該技術分野において必要とされている。
メソテリン（ＭＳＬＮ）は、１９９２年にがん標的として提案された（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５２：１８１－８６）が、依然としてＭＳＬＮを利用する実行可能な治療法は存在していない。それは、ほとんどの中皮腫で発現されるだけではなく、卵巣、子宮頸部、子宮、胃、膵臓、及び肺腺がんの多くのサブセットでも発現される。（Ｈａｓｓａｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ３４：４１７１－７９）正常な成人では、ＭＳＬＮは中皮にのみ存在し、この組織自体は必須ではない可能性がある。ＭＳＬＮを対象とするいくつかの研究用治療薬、例えば、免疫毒素コンジュゲート、抗体－薬物コンジュゲート、二重特異性抗体、ＣＡＲ－Ｔ、及びハイブリッドＴＣＲ－ｓｃＦｖが試験されている。
全身投与された全ての有効な治療薬は毒性を有していた。したがって、ＭＳＬＮ（＋）がんの治療に関連する組成物及び方法に対する必要性が当該技術分野において存在している。
Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５２：１８１－８６ Ｈａｓｓａｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ３４：４１７１－７９
本明細書では、ＭＳＬＮ（＋）がんの治療に関連する組成物及び方法が提供される。有利には、本明細書に開示される組成物及び方法は、ヘテロ接合性（ＬＯＨ）の喪失を利用して、ＭＳＬＮ（＋）がんに対処することができる。本明細書に開示される組成物及び方法は、ある場合には、ＭＳＬＮ標的化活性化因子受容体と遮断因子受容体とを対合することによって、正常組織に対する全身毒性を回避することができる。理論に拘束されることなく、遮断因子抗原をコードする遺伝子座におけるＬＯＨによって引き起こされる腫瘍組織対正常組織における遮断因子抗原発現の差異は、腫瘍死滅に対する高い選択性を付与することができることである。
本開示は、免疫細胞であって、（ａ）メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む、第１の受容体と、（ｂ）ＭＳＬＮ＋がん細胞において喪失した非標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む、第２の受容体と、を含み、第１の受容体が、ＭＳＬＮに応答する活性化因子受容体であり、第２の受容体が、非標的抗原に応答する抑制性受容体である、免疫細胞を提供する。
本開示の免疫細胞のいくつかの実施形態において、非標的抗原は、ヘテロ接合性の喪失によってＭＳＬＮ＋がん細胞において喪失している。
本開示の免疫細胞のいくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質の対立遺伝子バリアントに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、又はＨＬＡ－Ｃタンパク質の対立遺伝子バリアントに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、又はＨＬＡ－Ｃ＊０７に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ＊０２に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、表６に開示されるような相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、又は表６若しくは表７のＣＤＲと比較して、最大で１、２、若しくは３個の置換、欠失、若しくは挿入を有するＣＤＲ配列を含む。いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号４２～４７若しくは配列番号４８～５３の相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、又は配列番号４２～４７若しくは配列番号４８～５３のＣＤＲと比較して、最大で１、２、若しくは３個の置換、欠失、若しくは挿入を有するＣＤＲ配列を含む。いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、表５に開示されるポリペプチド配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列から選択されるポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号３０～４１のうちのいずれか１つ、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。
本開示の免疫細胞のいくつかの実施形態において、第１の受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、表２に開示されるような相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、又は表２のＣＤＲと比較して、最大で１、２、若しくは３個の置換、欠失、若しくは挿入を有するＣＤＲ配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、表３に示す配列を含む重鎖可変（ＶＨ）部分、及び表４に示す配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）部分、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号２３３を含む重鎖可変（ＶＨ）部分、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列、及び配列番号２７９を含む軽鎖可変（ＶＬ）部分、又はそれと８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号３～６、８０及び１５４～２１５からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号１７１のｓｃＦｖ配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。
本開示の免疫細胞のいくつかの実施形態において、第１の受容体は、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ヒンジドメインは、ＣＤ８αヒンジドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ８αヒンジドメインは、配列番号７の配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号１１の配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＣＤ２８共刺激ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζ活性化ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、配列番号２８５の配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体は、配列番号３０３の配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。
本開示の免疫細胞のいくつかの実施形態において、第２の受容体は、ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン又はその機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメインは、配列番号７０と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一であるか、又はそれと同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、第２の受容体は、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン又はその機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン又はその機能的バリアントは、配列番号７４と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一であるか、又はそれと同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、第２の受容体は、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメイン又はその機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメインは、配列番号７３と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一であるか、又はそれと同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、第２の受容体は、ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメイン、それらのうちのいずれかの機能的バリアント、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメイン、ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン、及びＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメインは、配列番号７１、又は配列番号７１と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一であるか、若しくはそれと同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、第２の受容体は、配列番号３４８の配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。
本開示の免疫細胞のいくつかの実施形態において、ＭＳＬＮ＋がん細胞は、中皮腫がん細胞、卵巣がん細胞、子宮頸がん細胞、結腸直腸がん細胞、食道がん細胞、頭頸部がん細胞、腎臓がん細胞、子宮がん細胞、胃がん細胞、膵臓がん細胞、肺がん細胞、結腸直腸がん細胞若しくは胆管がん細胞、又はＭＳＬＮを発現する任意のがん細胞である。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮ＋がん細胞は、中皮腫がん細胞、卵巣がん細胞、子宮頸部細胞、子宮がん細胞、胃がん細胞、膵臓がん細胞又は肺腺がん細胞である。
いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮ＋がん細胞は、上皮がん細胞である。上皮がんは、上皮細胞に由来するがんである。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮ＋上皮がんは、がん腫である。
本開示の免疫細胞のいくつかの実施形態において、ＭＳＬＮ＋がん細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊０２を発現しないＭＳＬＮ＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２－がん細胞である。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮ＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２－がん細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊０２の喪失をもたらす、ＨＬＡ－Ａにおけるヘテロ接合性の喪失によってＭＳＬＮ＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２＋細胞から派生する。いくつかの実施形態において、第１の受容体及び第２の受容体はともに、ヘテロ接合性の喪失を有するＭＳＬＮ＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２ーがん細胞の存在下で免疫細胞を特異的に活性化する。いくつかの実施形態において、第１の受容体及び第２の受容体はともに、ヘテロ接合性の喪失によってＨＬＡ－Ａ＊０２を喪失していないＭＳＬＮ＋細胞の存在下では免疫細胞を特異的に活性化しない。
本開示の免疫細胞のいくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋ＣＤ４－Ｔ細胞である。
本開示の免疫細胞のいくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩ遺伝子の発現及び／又は機能は、低下又は除去されている。いくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩ遺伝子は、ベータ－２－マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、干渉ＲＮＡを更に含み、干渉ＲＮＡは、Ｂ２Ｍ ｍＲＮＡの配列に相補的な配列を含む。いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡは、表１３に示す配列の群から選択される配列、又はそれに対して最大で１、２、３、若しくは４個の置換、挿入若しくは欠失を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡは、Ｂ２Ｍ ｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介性分解を誘導することができる。いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡは、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡは、（ａ）Ｂ２Ｍ ｍＲＮＡの配列に相補的な配列を５’末端から３’末端に有する、第１の配列と、（ｂ）第１の配列に相補的な配列を５’末端から３’末端に有する、第２の配列と、を含み、第１の配列及び第２の配列が、ｓｈＲＮＡを形成する。いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡは、ＧＣＡＣＴＣＡＡＡＧＣＴＴＧＴＴＡＡＧＡＴＣＧＡＡＡＴＣＴＴＡＡＣＡＡＧＣＴＴＴＧＡＧＴＧＣ（配列番号３４９）若しくはＧＴＴＡＡＣＴＴＣＣＡＡＴＴＴＡＣＡＴＡＣＣＧＡＡＧＴＡＴＧＴＡＡＡＴＴＧＧＡＡＧＴＴＡＡＣ（配列番号３５０）の配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む配列によってコードされる。
本開示の免疫細胞のいくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩ遺伝子の発現及び／又は機能は、低下又は除去されている。いくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩ遺伝子は、ベータ－２－マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｂ２Ｍをコードする配列に対する１つ以上の修飾を含み、１つ以上の修飾が、Ｂ２Ｍの発現を低下させ、かつ／又は機能を除去する。いくつかの実施形態において、１つ以上の修飾は、Ｂ２Ｍをコードする内因性遺伝子の１つ以上の不活性化変異を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の不活性化変異は、欠失、挿入、置換、又はフレームシフト変異を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の不活性化変異は、Ｂ２Ｍをコードする内因性遺伝子の配列を特異的に標的とする少なくとも１つのガイド いくつかの実施形態においてｅ核酸（ｇＮＡ）との複合体において、核酸誘導型エンドヌクレアーゼとともに導入される。いくつかの実施形態において、ｇＮＡは、表１２に示す配列セットの群から選択される配列、又はそれに対して最大で１、２、３、若しくは４個の置換、挿入若しくは欠失を有する配列を含む。
本開示の免疫細胞のいくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩ遺伝子の発現及び／又は機能は、低下又は除去されている。いくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩ遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ＊０２である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｍＲＮＡの配列に相補的な配列を含む、干渉ＲＮＡを含むポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡは、ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｍＲＮＡのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）媒介性分解を誘導することができる。いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡは、（ａ）ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｍＲＮＡの配列に相補的な配列を５’末端から３’末端に有する、第１の配列と、（ｂ）第１の配列に相補的な配列を５’末端から３’末端に有する、第２の配列と、を含み、第１の配列及び第２の配列が、ｓｈＲＮＡを形成する、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡは、１４に示す配列を含む。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊０２をコードする内因性遺伝子の配列に対する１つ以上の修飾を含み、１つ又は修飾が、ＨＬＡ－Ａ＊０２の発現を低下させ、かつ／又は機能を除去する。いくつかの実施形態において、１つ以上の修飾は、ＨＬＡ－Ａ＊０２をコードする内因性遺伝子の１つ以上の不活性化変異を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の不活性化変異は、ＨＬＡ－Ａ＊０２をコードする内因性遺伝子の配列を特異的に標的とする少なくとも１つのガイド核酸（ｇＮＡ）との複合体において、核酸誘導型エンドヌクレアーゼとともに導入される。いくつかの実施形態において、ｇＮＡは、表１１に示す配列を含む。
本開示の免疫細胞のいくつかの実施形態において、第１の受容体は、配列番号１６４の配列を含み、第２の受容体は、配列番号５２の配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ＧＣＡＣＴＣＡＡＡＧＣＴＴＧＴＴＡＡＧＡＴＣＧＡＡＡＴＣＴＴＡＡＣＡＡＧＣＴＴＴＧＡＧＴＧＣ（配列番号３４９）若しくはＧＴＴＡＡＣＴＴＣＣＡＡＴＴＴＡＣＡＴＡＣＣＧＡＡＧＴＡＴＧＴＡＡＡＴＴＧＧＡＡＧＴＴＡＡＣ（配列番号３５０）を含む配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％の同一性を有する配列によってコードされるｓｈＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体及び第２の受容体は、単一のポリヌクレオチドによってコードされ、第１及び第２の受容体をコードする配列は、自己切断ポリペプチドをコードする配列によって分離される。いくつかの実施形態において、自己切断ポリペプチドは、ＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号３５１）の配列を含むＴ２Ａ自己切断ポリペプチドを含む。
本開示の免疫細胞のいくつかの実施形態において、免疫細胞は、自己由来である。
本開示の免疫細胞のいくつかの実施形態において、免疫細胞は、同種異系である。
本開示は、治療有効量の本開示の免疫細胞を含む、医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を更に含む。
本開示は、ＭＳＬＮ＋がんの治療における医薬として使用するための治療有効量の本開示の免疫細胞を含む、医薬組成物を提供する。
本開示は、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系であって、（ａ）メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む、第１の受容体、及び（ｂ）ＭＳＬＮ＋がん細胞において喪失している非標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む、第２の受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドを含み、第１の受容体が、ＭＳＬＮ＋がん細胞上のＭＳＬＮに応答する活性化因子受容体であり、第２の受容体が、非標的抗原に応答する抑制性受容体である、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系を提供する。
本開示のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系のいくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系は、本開示の免疫細胞の生成に使用するための、第１の受容体及び第２の受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む、１つ以上のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系は、Ｂ２Ｍに特異的なｓｈＲＮＡをコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体、第２の受容体、及びＢ２Ｍに特異的なｓｈＲＮＡをコードする配列は、同じポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、（ａ）Ｂ２Ｍに特異的なｓｈＲＮＡをコードする配列は、ＧＣＡＣＴＣＡＡＡＧＣＴＴＧＴＴＡＡＧＡＴＣＧＡＡＡＴＣＴＴＡＡＣＡＡＧＣＴＴＴＧＡＧＴＧＣ（配列番号３４９）若しくはＧＴＴＡＡＣＴＴＣＣＡＡＴＴＴＡＣＡＴＡＣＣＧＡＡＧＴＡＴＧＴＡＡＡＴＴＧＧＡＡＧＴＴＡＡＣ（配列番号３５０）、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）第１の受容体をコードする配列は、配列番号３０３のポリペプチド、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％の同一性を有する配列をコードする配列を含み、（ｃ）第２の受容体をコードする配列は、配列番号３４８のポリペプチドをコードする配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。
本開示は、本開示の１つ以上のポリヌクレオチドを含む、ベクターを提供する。
本開示は、ＭＨＣクラスＩ遺伝子座におけるヘテロ接合性の喪失を有するＭＳＬＮ＋がん細胞を死滅させる方法であって、有効量の本開示の免疫細胞又は医薬組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。
本開示は、ＭＨＣクラスＩ遺伝子座におけるヘテロ接合性の喪失を有するＭＳＬＮ＋腫瘍を有する対象においてＭＳＬＮ＋がんを治療する方法であって、有効量の本開示の免疫細胞又は医薬組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。
本開示は、対象においてがんを治療する方法であって、（ａ）対象の正常細胞及び複数のがん細胞のＨＬＡ－Ａ遺伝子型又は発現を決定することと、（ｂ）任意選択で、対象の複数のがん細胞におけるＭＳＬＮの発現を決定することと、（ｃ）正常細胞がＨＬＡ－Ａ＊０２を発現し、複数のがん細胞がＨＬＡ－Ａ＊０２を発現せず、複数のがん細胞がＭＳＬＮ陽性である場合、有効量の本開示の免疫細胞又は医薬組成物を対象に投与することと、を含む、方法を提供する。
本開示の方法のいくつかの実施形態において、対象は、ＭＳＬＮ（ＭＳＬＮ＋）を発現し、ＨＬＡ－Ａ＊０２発現を喪失した悪性腫瘍を有するヘテロ接合型ＨＬＡ－Ａ＊０２患者である。いくつかの実施形態において、対象は、ＭＳＬＮを発現し、ＨＬＡ－Ａ＊０２発現を喪失した再発性切除不能又は転移性固形腫瘍を有するヘテロ接合型ＨＬＡ－Ａ＊０２患者である。いくつかの実施形態において、がんは、中皮腫がん、卵巣がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、食道がん、頭頸部がん、腎臓がん、子宮がん、胃がん、膵臓がん、肺がん、結腸直腸がん、又は胆管がんを含む。いくつかの実施形態において、がんは、中皮腫、卵巣がん、子宮頸がん、子宮がん、胃がん、膵臓がん、又は肺腺がんを含む。いくつかの実施形態において、がんは、対象において再発している。いくつかの実施形態において、がんは、１つ以上の以前に投与された抗がん療法に対して難治性である。いくつかの実施形態において、がんは、転移性である。
本開示の方法のいくつかの実施形態において、がん細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊０２を発現しないＭＳＬＮ＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２がん細胞を含む。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮ＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２－がん細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊０２の喪失をもたらす、ＨＬＡ－Ａにおけるヘテロ接合性の喪失によってＭＬＳＮ＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２＋細胞から派生する。いくつかの実施形態において、第１の受容体及び第２の受容体はともに、ＭＳＬＮ＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２－がん細胞の存在下で免疫細胞を特異的に活性化する。いくつかの実施形態において、第１の受容体及び第２の受容体はともに、ＨＬＡ－Ａ＊０２を喪失していないＭＳＬＮ＋細胞の存在下で免疫細胞を特異的に活性化しない。
本開示の方法のいくつかの実施形態において、免疫細胞又は医薬組成物の投与は、対象における腫瘍のサイズを縮小させる。いくつかの実施形態において、腫瘍は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約１００％減少する。いくつかの実施形態において、腫瘍は除去される。
本開示の方法のいくつかの実施形態において、免疫細胞又は医薬組成物の投与は、対象における腫瘍の増殖を阻止する。
本開示の方法のいくつかの実施形態において、免疫細胞又は医薬組成物の投与は、対象における腫瘍の数を減少させる。
本開示の方法のいくつかの実施形態において、免疫細胞又は医薬組成物の投与は、対象におけるがん細胞の選択的死滅をもたらすが、正常細胞の死滅をもたらさない。いくつかの実施形態において、死滅した細胞の少なくとも約６０％は、がん細胞であるか、死滅した細胞の約６５％は、がん細胞であるか、死滅した細胞の約７０％は、がん細胞であるか、死滅した細胞の約７５％は、がん細胞であるか、死滅した細胞の約８０％は、がん細胞であるか、死滅した細胞の約８５％は、がん細胞であるか、死滅した細胞の約９０％は、がん細胞であるか、死滅した細胞の約９５％は、がん細胞であるか、又は死滅した細胞の約１００％は、がん細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞又は医薬組成物の投与は、対象のがん細胞の少なくとも約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％又は全ての死滅をもたらす。
本開示の方法のいくつかの実施形態において、免疫細胞又は医薬組成物の投与は、第１の活性化因子受容体を含むが、第２の抑制性受容体を含まない他の等価の免疫細胞の投与よりも、対象に対して少ない副作用をもたらす。
本開示は、複数の免疫細胞を作製する方法であって、（ａ）複数の免疫細胞を提供することと、（ｂ）本開示のポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド系又はベクターで複数の免疫細胞を形質転換することと、を含む、方法を提供する。
本開示は、本開示の免疫細胞又は医薬組成物を含む、キットを提供する。いくつかの実施形態において、キットは、使用説明書を更に含む。
ＴＣＧＡデータベースからの遮断因子候補遺伝子の発現を示す表である。（＊）は、以前に中皮において発現されていると同定された遺伝子を示す。 正常組織におけるメソテリン（ＭＳＬＮ）発現を示すプロットである。 ＴＣＧＡがんにわたるＭＳＬＮの発現を示すプロットである（腫瘍及び正常試料を用いた。）略語：ＢＬＣＡ（膀胱がん）、ＢＲＣＡ（乳がん）、ＣＥＳＣ（子宮頸部扁平上皮がん及び子宮頸管腺がん）、ＣＨＯＬ 胆管がん）、ＣＯＡＤ（結腸腺がん）、ＥＳＣＡ（食道がん）、ＧＢＭ（多形膠芽腫）、ＨＮＳＣ（頭頸部扁平上皮がん）、ＫＩＣＨ（嫌色素性腎臓）、ＫＩＲＰ（腎臓乳頭状腎細胞がん）、ＬＩＨＣ（肝臓肝細胞がん）、ＬＵＡＤ（肺腺がん）、ＬＵＳＣ（肺扁平上皮がん）、ＰＡＡＤ（膵臓腺がん）、ＰＲＡＤ（前立腺腺がん）、ＰＣＰＧ（褐色細胞腫及び傍神経節腫）、ＲＥＡＤ（直腸腺がん）、ＳＡＲＣ（肉腫）、ＳＫＣＭ（皮膚黒色腫）、ＴＨＣＡ（甲状腺がん）、ＴＨＹＭ（胸腺腫）、ＳＴＡＤ（胃腺がん）、ＵＣＥＣ（子宮体子宮内膜がん）。 ＣＣＬＥ細胞株におけるＭＳＬＮ発現を示すプロットである。 正常組織におけるＬＲＲＮ４発現を示すプロットである。 ＴＣＧＡがんにわたるＬＲＲＮ４の発現を示すプロットである（腫瘍及び正常試料を用いた）。 ＴＣＧＡ腫瘍にわたるＬＲＲＮ４の発現を示すプロットである。 ＣＣＬＥ細胞株におけるＬＲＲＮ４の発現を示すプロットである。 ＬＲＲＮ４の膜貫通ドメインに対する１０個のロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）及びフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインの分布を示すプロットである。これらのドメインのほとんどは、細胞表面上に位置する可能性が高い。 ｐＭＨＣ ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｓｃＦｖ ＬＩＲ－１ベースの抑制性受容体が、無細胞ビーズベースのアッセイにおいてシスでＪｕｒｋａｔ細胞の活性化を阻害することができることを示す。 ｐＭＨＣ ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｓｃＦｖ ＬＩＲ－１ベースの抑制性受容体が、標的細胞として白血病細胞株Ｋ５６２を使用したＭＳＬＮ ｓｃＦｖ ＣＡＲによるＪｕｒｋａｔ細胞の活性化を阻害することができる。 ｐＭＨＣ ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｓｃＦｖ ＬＩＲ－１ベースの抑制性受容体が、ｐＭＨＣ ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｓｃＦｖ ＬＩＲ－１ベースの抑制性受容体並びにＨＬＡ－Ａ＊０２＋ＨｅＬａ及びＳｉＨａ細胞を標的細胞として使用して、ＭＳＬＮ ｓｃＦｖ ＣＡＲによる、ＩＦＮγの倍数誘導によって測定した場合のＪｕｒｋａｔ細胞の活性化を阻害することができることを示す図（左）及びグラフ（右）である。 ｐＭＨＣ ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｓｃＦｖ ＬＩＲ－１ベースの抑制性受容体が、ＨＬＡ－Ａ＊０２－ＳｉＨａ細胞ではなく、ＨＬＡ－Ａ＊０２＋ＳｉＨａ細胞を使用して、ＭＳＬＮ ＣＡＲ活性化因子による死滅を阻害することを示す。 ヘテロ接合性の喪失によりがん細胞において喪失する潜在的な抑制性受容体標的を同定するために使用したバイオインフォマティクスパイプラインの図である。 がん細胞において発現されない潜在的な抑制性受容体標的を同定するために使用したバイオインフォマティクスパイプラインの１つである。 ＨＬＡ－Ａ＊０２遮断因子が、高密度抗原であるＭＳＬＮに向けられたＭＳＬＮ ＣＡＲ活性化因子を阻害することを示す一対のプロットである。ＭＳＬＮ又はＭＳＬＮ及びＨＬＡ－Ａ＊０２のいずれかを発現するＫ５６２細胞と共培養したＭＳＬＮ ＬＢＤ１－ＣＡＲ又はＭＳＬＮ ＬＢＤ１－ＣＡＲ及びＡ２－ＬＩＲ－１でトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊０２の存在下でのみ、Ａ２－ＬＩＲ－１遮断因子を用いた高密度抗原による活性化の遮断を示す。 ＨＬＡ－Ａ＊０２遮断因子が、高密度抗原であるＭＳＬＮに向けられたＭＳＬＮ ＣＡＲ活性化因子を阻害することを示す一対のプロットである。ＭＳＬＮ ＬＢＤ１－ＣＡＲ Ｔ細胞による内因性ＭＳＬＮ＋ＨｅＬａ細胞の死滅は、Ａ２－ＬＩＲ－１遮断因子を用いたＨＬＡ－Ａ＊０２の存在下で遮断される。 ＨＬＡ－Ａ＊０２遮断因子が、高密度抗原であるＭＳＬＮに向けられたＭＳＬＮ ＣＡＲ活性化因子を阻害することを示す一対のプロットである。ＭＳＬＮ ＬＢＤ２－ＣＡＲ Ｔ細胞による内因性ＭＳＬＮ＋ＨｅＬａ細胞の死滅が示される。Ｔ細胞死滅に対するＡ２－ＬＩＲ－１遮断因子の効果は、部分的に活性化因子ＬＢＤによって制御され、遮断因子モジュール又は活性化因子／遮断因子の対の更なる最適化が必要とされ得ることを示唆する。 ＨＬＡ－Ａ＊０２ ＬＩＲ１抑制性受容体（ＰＡ２．１、マウス及びヒト化）が、ＭＳＬＮ及びＨＬＡ－Ａ＊０２を発現するＨｅＬａ細胞の存在下で、ＭＳＬＮ第３世代ＣＡＲを発現するＴ細胞による死滅を効果的に遮断することを示す一連のプロットである。上の並び：ＭＳＬＮ＋ ＨＬＡ－Ａ＊０２＋ＨｅＬａ標的細胞、下の並び：ＭＳＬＮ＋ ＨＬＡ－Ａ＊０２－ＨｅＬａ細胞（対照）。マウスＳＳ１第３世代ＣＡＲ（右上、ボックスで囲まれている）は、ヒト化Ｍ５及びヒト化ＳＳ１ ＣＡＲよりも優れたウィンドウを提供する。 ＨＬＡ－Ａ＊０２ ＬＩＲ１抑制性受容体（ＰＡ２．１、マウス及びヒト化）が、ＭＳＬＮ＋ＨＬＡ－Ａ＊０２＋Ｃａｐａｎ－２細胞の存在下で、ＭＳＬＮ第３世代ＣＡＲを発現するＴ細胞による死滅を効果的に遮断することを示す一連のプロットである。 マウスＳＳ１ ｓｃＦｖを有する第２世代ＣＡＲを発現するＴ細胞による、ＭＳＬＮ＋ＨＬＡ－Ａ＊０２＋ＨｅＬａ細胞（左）又は天然のＭＳＬＮ＋ＨＬＡ－Ａ＊０２＋であるＨＣＴ１１６野生型（ＷＴ）細胞の死滅が、ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｓｃＦｖ ＬＩＲ１抑制性受容体によって効果的に遮断されることを示す一対のプロットである。 ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｓｃＦｖ ＬＩＲ－１遮断因子の同時形質導入を伴う及び伴わない、Ｔ細胞によるマウスＳＳ１第２世代ＣＡＲの発現を示す一連の蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）プロットである。 ＫＲＡＳ ＴＣＲによるＪｕｒｋａｔ細胞の活性化を遮断するＨＬＡ－Ａ＊０２抑制性受容体の能力に対するＬＩＲ－１ヒンジの効果を示すプロットである。Ｈ：ヒンジ、Ｔ：膜貫通ドメイン、ＩＣＤ：細胞内ドメイン、ｓ：短い。ＬＩＲ－１構築物は、図２０Ｂにより詳細に記載されている。元のより長いヒンジと同様に、より短いＬＩＲ－１ヒンジブロックを有するヒト化ＰＡ２．１及びヒト化ＢＢ７．２ ＫＲＡＳ ＴＣＲ活性化因子及び下の表（配列番号３５２～３５６）に示されるＨＬＡ－Ａ＊０２ ｓｃＦｖ ＬＩＲ－１抑制性受容体を発現するＪｕｒｋａｔ細胞についてのＥＣ５０シフト（＋／－ＨＬＡ－Ａ＊０２標的細胞）を示すプロット及び表である。 ＫＲＡＳ ＴＣＲによるＪｕｒｋａｔ細胞の活性化を遮断するＨＬＡ－Ａ＊０２抑制性受容体の能力に対するＬＩＲ－１ヒンジの効果を示すプロットである。Ｈ：ヒンジ、ＴＭ：膜貫通ドメイン、ＩＣＤ：細胞内ドメイン、ｓ：短い、ｔｒ：切断型。ＬＩＲ－１構築物は、図２１Ｂにより詳細に記載されている。わずかに長いヒンジを有するマウスＰＡ２．１は、Ｔ２－Ｊｕｒｋａｔアッセイにおける元のＬＩＲ－１ヒンジと同様に機能する。 ＫＲＡＳ ＴＣＲ活性化因子及び下の表（配列番号３５７～３６１）に示され、長さは左の表に示されるＨＬＡ－Ａ＊０２ ｓｃＦｖ ＬＩＲ－１抑制性受容体を発現するＪｕｒｋａｔ細胞についてのＥＣ５０シフト（＋／－ＨＬＡ－Ａ＊０２標的細胞）を示すプロット及び一対の表である。 ２つの標的で選択的細胞傷害性を達成するためのＴｍｏｄアプローチを示す（Ｔｍｏｄとは、活性化因子及び抑制性受容体の組み合わせを発現する免疫細胞を指す）。図２２Ａは、肺（及び他の重要な臓器）が、ＭＳＬＮ（＋）中皮ライニングに囲まれており、ＭＳＬＮ標的化薬についてのオンターゲット、オフ腫瘍毒性の高いリスクを生じることを示す。腫瘍が、ＬＯＨを介してこの対立遺伝子を喪失したＨＬＡ－Ａ＊０２についての患者のヘテロ接合型を選択することにより、ＭＳＬＮ活性化ＣＡＲ－Ｔ細胞を標的にして腫瘍細胞を特異的に死滅させ、正常な中皮を温存する機会がある。図２２Ｂは、ＭＳＬＮ標的化Ｔｍｏｄ構築物の分子組成を示す（Ｔｍｏｄとは、対合した活性化因子及び抑制性受容体を指す）。２つの受容体は、単一の構築物内で同時発現され、コードされた融合タンパク質は、細胞内で切断されて、活性化因子及び遮断因子を生成する。 ２つの標的で選択的細胞傷害性を達成するためのＴｍｏｄアプローチを示す（Ｔｍｏｄとは、活性化因子及び抑制性受容体の組み合わせを発現する免疫細胞を指す）。図２２Ａは、肺（及び他の重要な臓器）が、ＭＳＬＮ（＋）中皮ライニングに囲まれており、ＭＳＬＮ標的化薬についてのオンターゲット、オフ腫瘍毒性の高いリスクを生じることを示す。腫瘍が、ＬＯＨを介してこの対立遺伝子を喪失したＨＬＡ－Ａ＊０２についての患者のヘテロ接合型を選択することにより、ＭＳＬＮ活性化ＣＡＲ－Ｔ細胞を標的にして腫瘍細胞を特異的に死滅させ、正常な中皮を温存する機会がある。図２２Ｂは、ＭＳＬＮ標的化Ｔｍｏｄ構築物の分子組成を示す（Ｔｍｏｄとは、対合した活性化因子及び抑制性受容体を指す）。２つの受容体は、単一の構築物内で同時発現され、コードされた融合タンパク質は、細胞内で切断されて、活性化因子及び遮断因子を生成する。 選択的ＭＳＬＮ結合剤の単離及び特徴付けを示す。オンターゲットプローブは、標識した可溶性ＭＳＬＮ（Ａｃｒｏ Ｂｉｏ）であり、対抗選択のために使用したオフターゲットプローブは、可溶性ＣＥＡ及びＥＧＦＲタンパク質の混合物であった。図２３Ａは、ＩｇＧライブラリーの濃縮を示す。図２３Ｂは、ｓｃＦｖライブラリーの濃縮を示す。図２３Ｃは、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＭＳＬＮ ＣＡＲ（Ｇｅｎ３）の表面発現を示す。細胞をＣＡＲ構築物でトランスフェクトし、プロテインＬ又は単量体可溶性ＭＳＬＮで染色した（方法を参照されたい）。ベンチマーク及びＣＡＲ１－６発現ヒストグラムを標示する。ＰＥ、フィコエリトリン；ＮＡ、ニュートラビジン；ＳＡ、ストレプトアビジン。「オンターゲットＮＧＳ」は、個々のイディオタイプの濃縮を決定するために収集され、ＤＮＡ配列決定に供される細胞集団に対応する。図２３Ｄは、表面に付着したＭＳＬＮタンパク質を用いた固体状態Ｊｕｒｋａｔ細胞アッセイにおけるＭＳＬＮ結合剤の特徴付けを示す（Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０２０を参照されたい）。異なるｓｃＦｖを有する６２個のＣＡＲ構築物（Ｇｅｎ３）を、ＣＡＲを発現させるためにＪｕｒｋａｔ細胞内で一過性にトランスフェクトし、６時間後に表面結合組換えヒトｓＭＳＬＮ（Ａｃｒｏ Ｂｉｏ）に対する機能的応答を評価した。ほとんどが、ある程度の応答を生じた。 選択的ＭＳＬＮ結合剤の単離及び特徴付けを示す。オンターゲットプローブは、標識した可溶性ＭＳＬＮ（Ａｃｒｏ Ｂｉｏ）であり、対抗選択のために使用したオフターゲットプローブは、可溶性ＣＥＡ及びＥＧＦＲタンパク質の混合物であった。図２３Ａは、ＩｇＧライブラリーの濃縮を示す。図２３Ｂは、ｓｃＦｖライブラリーの濃縮を示す。図２３Ｃは、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＭＳＬＮ ＣＡＲ（Ｇｅｎ３）の表面発現を示す。細胞をＣＡＲ構築物でトランスフェクトし、プロテインＬ又は単量体可溶性ＭＳＬＮで染色した（方法を参照されたい）。ベンチマーク及びＣＡＲ１－６発現ヒストグラムを標示する。ＰＥ、フィコエリトリン；ＮＡ、ニュートラビジン；ＳＡ、ストレプトアビジン。「オンターゲットＮＧＳ」は、個々のイディオタイプの濃縮を決定するために収集され、ＤＮＡ配列決定に供される細胞集団に対応する。図２３Ｄは、表面に付着したＭＳＬＮタンパク質を用いた固体状態Ｊｕｒｋａｔ細胞アッセイにおけるＭＳＬＮ結合剤の特徴付けを示す（Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０２０を参照されたい）。異なるｓｃＦｖを有する６２個のＣＡＲ構築物（Ｇｅｎ３）を、ＣＡＲを発現させるためにＪｕｒｋａｔ細胞内で一過性にトランスフェクトし、６時間後に表面結合組換えヒトｓＭＳＬＮ（Ａｃｒｏ Ｂｉｏ）に対する機能的応答を評価した。ほとんどが、ある程度の応答を生じた。 選択的ＭＳＬＮ結合剤の単離及び特徴付けを示す。オンターゲットプローブは、標識した可溶性ＭＳＬＮ（Ａｃｒｏ Ｂｉｏ）であり、対抗選択のために使用したオフターゲットプローブは、可溶性ＣＥＡ及びＥＧＦＲタンパク質の混合物であった。図２３Ａは、ＩｇＧライブラリーの濃縮を示す。図２３Ｂは、ｓｃＦｖライブラリーの濃縮を示す。図２３Ｃは、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＭＳＬＮ ＣＡＲ（Ｇｅｎ３）の表面発現を示す。細胞をＣＡＲ構築物でトランスフェクトし、プロテインＬ又は単量体可溶性ＭＳＬＮで染色した（方法を参照されたい）。ベンチマーク及びＣＡＲ１－６発現ヒストグラムを標示する。ＰＥ、フィコエリトリン；ＮＡ、ニュートラビジン；ＳＡ、ストレプトアビジン。「オンターゲットＮＧＳ」は、個々のイディオタイプの濃縮を決定するために収集され、ＤＮＡ配列決定に供される細胞集団に対応する。図２３Ｄは、表面に付着したＭＳＬＮタンパク質を用いた固体状態Ｊｕｒｋａｔ細胞アッセイにおけるＭＳＬＮ結合剤の特徴付けを示す（Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０２０を参照されたい）。異なるｓｃＦｖを有する６２個のＣＡＲ構築物（Ｇｅｎ３）を、ＣＡＲを発現させるためにＪｕｒｋａｔ細胞内で一過性にトランスフェクトし、６時間後に表面結合組換えヒトｓＭＳＬＮ（Ａｃｒｏ Ｂｉｏ）に対する機能的応答を評価した。ほとんどが、ある程度の応答を生じた。 選択的ＭＳＬＮ結合剤の単離及び特徴付けを示す。オンターゲットプローブは、標識した可溶性ＭＳＬＮ（Ａｃｒｏ Ｂｉｏ）であり、対抗選択のために使用したオフターゲットプローブは、可溶性ＣＥＡ及びＥＧＦＲタンパク質の混合物であった。図２３Ａは、ＩｇＧライブラリーの濃縮を示す。図２３Ｂは、ｓｃＦｖライブラリーの濃縮を示す。図２３Ｃは、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＭＳＬＮ ＣＡＲ（Ｇｅｎ３）の表面発現を示す。細胞をＣＡＲ構築物でトランスフェクトし、プロテインＬ又は単量体可溶性ＭＳＬＮで染色した（方法を参照されたい）。ベンチマーク及びＣＡＲ１－６発現ヒストグラムを標示する。ＰＥ、フィコエリトリン；ＮＡ、ニュートラビジン；ＳＡ、ストレプトアビジン。「オンターゲットＮＧＳ」は、個々のイディオタイプの濃縮を決定するために収集され、ＤＮＡ配列決定に供される細胞集団に対応する。図２３Ｄは、表面に付着したＭＳＬＮタンパク質を用いた固体状態Ｊｕｒｋａｔ細胞アッセイにおけるＭＳＬＮ結合剤の特徴付けを示す（Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０２０を参照されたい）。異なるｓｃＦｖを有する６２個のＣＡＲ構築物（Ｇｅｎ３）を、ＣＡＲを発現させるためにＪｕｒｋａｔ細胞内で一過性にトランスフェクトし、６時間後に表面結合組換えヒトｓＭＳＬＮ（Ａｃｒｏ Ｂｉｏ）に対する機能的応答を評価した。ほとんどが、ある程度の応答を生じた。 ＭＳＬＮ ＣＡＲ対ベンチマークＣＡＲ Ｍ５、ＳＳ１及びｍ９１２の感受性を示す。全ての構築物は、ＳＳ１（Ｇｅｎ２）を除いてＧｅｎ３であった。６時間の共培養アッセイにおける感受性を評価するために、Ｊｕｒｋａｔ細胞の用量応答（ＲＬＵ）を測定した。（１）滴定したＭＳＬＮコードｍＲＮＡを使用して、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトし、（２）ＱＩＦＩＫＩＴ（定量分析キット、Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、フローサイトメトリーベースの表面発現をＭＳＬＮ分子／細胞に変換し、（３）６つの新規及び３つのベンチマークＣＡＲの分子／細胞感受性（ＥＣ５０）を、用量応答曲線に適合させることにより計算した。アッセイの検出限界を下回る感受性を有するこれらのＣＡＲについて、ＥＣ５０は、３０００未満のＭＳＬＮ分子／細胞として報告した。各構築物についての最大シグナル（Ｅｍａｘ）も示した。実験を１～４回繰り返した。 ＣＡＲ３選択性を示す。Ｍ５ ＣＡＲに対してベンチマークされたＭＳＬＮ ＣＡＲ３選択性の例。ＭＳＬＮ（＋）又はＭＳＬＮ（－）細胞株によるＪｕｒｋａｔ細胞機能アッセイにおけるＣＡＲの活性化を測定した。ＭＳＬＮ（＋）細胞株については、比較のためにＭＳＬＮノックアウトによってバリアントＭＳＬＮ（－）バージョンが生成されたより詳細なオフターゲット特徴付けについては、図３２Ｂを参照されたい。 ＭＳＬＮ ｍＡｂ及びフローサイトメトリーによる染色によって評価したヒト細胞株におけるＭＳＬＮの発現を示す。Ｋ５６２は、抗ＭＳＬＮ抗体に対していくらかの交差反応性を示したが、ＣＡＲ３又はＭ５ベンチマークＣＡＲに対する機能的反応性は観察されなかった。 ＭＳＬＮ及びＡ＊０２ ｍＲＮＡ（ＣＣＬＥ）のプロットしたレベルを示し、タンパク質（ＱＩＦＩＫＩＴ）は相関を示す。タンパク質とｍＲＮＡレベルとの間の変換は、標準曲線を使用して計算した（以下の実施例８についての方法を参照されたい）。 本研究で使用した細胞株の概要を示す。様々ながん細胞株におけるＭＳＬＮ及びＡ＊０２の表面密度の定量化、並びに正常肺組織（ＧＴＥｘ）における対応する報告されたｍＲＮＡレベル。ＱＩＦＩＫＩＴ（定量分析キット、Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、操作された及び野生型の腫瘍細胞株の表面ＭＳＬＮ及びＡ＊０２を定量化した。細胞株ＨＬＡ－Ａハプロタイプが、Ａ＊０２についてヘテロ接合型である場合、ＴＰＭ値を２で割った。場合によっては、ＨＬＡ－Ａ対立遺伝子コピー数は不明であることに留意されたい。ＭＳ７５１＋形質導入Ａ＊０２（４３８ＴＰＭ）のＴＰＭ値を、標準曲線を使用してその表面Ａ＊０２タンパク質レベルの測定から推定した。ＨＬＡ－Ａ＊０２で形質導入された細胞株は、タンパク質の内因性レベルを発現する細胞株（太字の黒のボックス）よりも、正常肺組織のＡ＊０２：ＭＳＬＮ比をより良く模倣する。ＴＰＭ、１００万個当たりの転写産物；ｎａ、該当なし；Ａ＊０２：ＨＬＡ－Ａ＊０２。 ＱＩＦＩＫＩＴを使用したＭＳＬＮ分子／細胞の定量化を示す。抗ヒトＭＳＬＮマウス抗体クローン６１８９２３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、約１００，０００個の細胞を染色した。細胞を洗浄した後、抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ２１２３７）を使用して、細胞及びＱＩＦＩビーズの両方を染色した。表面上のＭＳＬＮ分子の数を、ＱＩＦＩ抗原標準曲線を使用して定量化した。 Ｊｕｒｋａｔ細胞機能アッセイにおけるＭＳＬＮ ＣＡＲ Ｔｍｏｄ構築物の特徴付けを示す。６つのＨｕＴＡＲＧ由来のＭＳＬＮ活性化因子（ＣＡＲ１～６）及びベンチマークＣＡＲ Ｍ５及びＳＳ１活性化因子を、Ａ＊０２遮断因子（黒丸）又は空のベクター対照（白丸）と対合した。ＣＡＲ＋／－遮断因子を発現するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴルシフェラーゼ細胞を、Ａ＊０２：０１ ｍＲＮＡの滴定でトランスフェクトした野生型の内因性ＭＳＬＮ（＋）ＨｅＬａ細胞と共培養した。機能的応答（ＲＬＵ）を、６時間の共培養後に評価した。表面上の滴定した抗原分子を、ＱＩＦＩＫＩＴを使用して定量化した。ＩＣ５０（分子／細胞）値を図に示す。ＣＡＲ１～６はＧｅｎ３であり、ＣＡＲ Ｍ５及びＳＳ１はＧｅｎ２である。 Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＭＳＬＮ ＣＡＲ３ Ｔｍｏｄ構築物についてのＥＣ５０を確立するためのＭＳＬＮ（－）ＨｅＬａ標的細胞におけるＭＳＬＮ及びＡ＊０２ ｍＲＮＡの二次元滴定を示す。ＭＳＬＮ（－）ＨｅＬａ標的細胞を、連続希釈したＭＳＬＮ ｍＲＮＡでトランスフェクトし、定常Ａ＊０２ ｍＲＮＡ及びＪｕｒｋａｔ細胞を、一過性にトランスフェクトして、ＭＳＬＮ ＣＡＲ３及びＡ＊０２遮断因子を発現させた。機能的応答（ＲＬＵ）を、６時間の共培養後に評価した。 Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＭＳＬＮ ＣＡＲ３ Ｔｍｏｄ構築物についてのＩＣ５０を確立するための、連続希釈したＡ＊０２ ｍＲＮＡ及び定常ＭＳＬＮ ｍＲＮＡでのＭＳＬＮ（－）ＨｅＬａ標的細胞のトランスフェクションを示す。 ＭＳＬＮ並びにＡ＊０２ ｍＲＮＡ及びタンパク質のプロットしたレベルを示す。正常（ＧＴＥｘデータベース）及び腫瘍の組織及び細胞株（ＴＣＧＡ、ＣＣＬＥデータベース）におけるＭＳＬＮ及びＨＬＡ－Ａ発現レベルに関連する構築物のＥＣ５０及びＩＣ５０。タンパク質とｍＲＮＡレベルとの間の変換は、図２５Ｂ；方法に示される標準曲線を使用して計算した）。グラフに示されるＨｅＬａ及びＭＳ７５１ Ａ＊０２トランスジェニック細胞株バリアントは、正常な組織における活性化因子及び遮断因子標的比をより良く模倣する。 初代Ｔ細胞におけるＭＳＬＮ ＣＡＲ及びＣＡＲ３ Ｔｍｏｄ細胞傷害性を示す。ＣＡＲ又はＴｍｏｄで形質導入された初代Ｔ細胞を、示されるように、エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）＝１：１で、腫瘍又は正常標的細胞のいずれかと４８時間共培養した。Ａ＊０２：ＭＳＬＮ（Ｂ：Ａ）標的抗原比は、２～２７：１の範囲であった。Ｍ５は、Ｇｅｎ２ ＣＡＲであり、他の全ては、Ｇｅｎ３であった。腫瘍＝ＭＳＬＮ（＋）Ａ＊０２（－）標的細胞；正常＝ＭＳＬＮ（＋）Ａ＊０２（＋）標的細胞。 細胞傷害性アッセイにおけるベンチマークＣＡＲに対するＡ＊０２遮断因子と対合したリードＣＡＲ３受容体の比較を示す。ＳＳ１ ＣＡＲは、Ｇｅｎ２構築物であり、その他は、Ｇｅｎ３である。２つの別々のレンチウイルスベクターを使用して様々なＣＡＲ＋／－Ａ＊０２遮断因子で形質導入した初代Ｔ細胞を、内因性ＭＳＬＮ（＋）Ａ＊０２（－）腫瘍又はＭＳＬＮ（＋）Ａ＊０２（＋）正常ＨｅＬａ細胞と培養して、細胞傷害性を評価した。形質導入した初代Ｔ細胞を、０．６：１又は０．３：１の最終的な有効なエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比について、形質導入されていないＴ細胞で希釈することによって、一定の活性化因子又は活性化因子－遮断因子二重陽性集団パーセンテージ［１５％Ａ（＋）又はＡ（＋）Ｂ（＋）］細胞に正規化した。両方のＥ：Ｔ比は、Ｔ細胞もＡ＊０２遮断因子を発現したときに、Ａ＊０２抗原の存在下で選択的死滅をもたらした。 腫瘍又は正常標的細胞との４８時間の共培養後の分泌ＩＦＮ－ｇを示す。 ＭＳＬＮ ＣＡＲ３ Ｔｍｏｄ細胞が、混合腫瘍及び正常細胞共培養物において、ＲＦＰ（＋）腫瘍細胞を選択的に死滅させ、ＧＦＰ（＋）正常細胞を温存することを示す。ＨｅＬａ細胞株の接着性のために、死滅した標的は表面上にクラスターとして残存する傾向がある。白い矢印は、死滅したＲＦＰ（＋）腫瘍細胞のいくつかの例を指している。Ｅ：Ｔ ０．６：１及び正常：腫瘍＝１：１の例。 Ｅ：Ｔ＝１：１及び正常：腫瘍＝９：１での混合された正常及び腫瘍共培養物における細胞傷害性を示す（他の比については図３１Ｂを参照されたい）。ＣＡＲ３又はＣＡＲ３ Ｔｍｏｄ構築物で形質導入された初代Ｔ細胞を、ＨｅＬａ標的細胞と４８時間共培養し、それぞれ、ＭＳＬＮ（＋）Ａ＊０２（＋）正常及びＭＳＬＮ（＋）Ａ＊０２（－）腫瘍細胞株において発現されたＧＦＰ及びＲＦＰを使用して画像化した。 ＭＳＬＮ ＣＡＲ３ Ｔｍｏｄ細胞が、混合腫瘍及び正常細胞共培養物において、ＲＦＰ（＋）腫瘍細胞を選択的に死滅させることを示す。ＣＡＲ３ Ｔｍｏｄ構築物で形質導入された初代Ｔ細胞を、ＨｅＬａ細胞と４８時間共培養し、それぞれ、ＭＳＬＮ（＋）Ａ＊０２（＋）正常及びＭＳＬＮ（＋）Ａ＊０２（－）腫瘍細胞株において発現されたＧＦＰ及びＲＦＰを使用して画像化した。 ９：１～１：９の範囲の正常：腫瘍；Ｅ：Ｔ＝０．６：１での混合された正常及び腫瘍共培養物におけるＣＡＲ３及びＣＡＲ３ Ｔｍｏｄの細胞傷害性を示す。 ＭＳＬＮ ＣＡＲ３ Ｔｍｏｄ構築物が、選択的、持続的かつ可逆的な細胞傷害性を媒介することを示す。ＣＡＲ３又はＣＡＲ３ Ｔｍｏｄを形質導入した初代Ｔ細胞を、腫瘍又は正常な標的細胞のいずれかと４８時間、Ｅ：Ｔ＝１．２：１で共培養した。次に、Ｔ細胞を採取し、死滅した又は非接着性の標的細胞を枯渇させ、更に４８時間、新鮮な腫瘍又は正常な標的細胞に再播種した。ＲＡＣＡ、反復抗原チャレンジアッセイ。Ｒ１、ラウンド１；Ｒ２、ラウンド２。 ＭＳＬＮ（＋）及びＭＳＬＮ（－）対照標的細胞のサブセットでのＪｕｒｋａｔ細胞機能アッセイにおけるＭＳＬＮ ＣＡＲ３ Ｔｍｏｄ構築物選択性が、オフターゲット活性を示さなかったことを示す（以下の実施例８についての方法を参照されたい）。バーの高さは、技術的複製物からの平均に対応する。 ＲＡＣＡ（反復抗原チャレンジアッセイ）及び可逆性アッセイの概略図を示す。ＣＡＲ３又はＣＡＲ３ Ｔｍｏｄを形質導入した初代Ｔ細胞を、腫瘍又は正常な標的のいずれかと４８時間、Ｅ：Ｔ＝１．２：１で共培養した。次に、Ｔ細胞を採取し、あらゆる死滅した又は上昇した標的細胞を枯渇させ、更に４８時間、新鮮な腫瘍又は正常な標的に再播種した。 可溶性循環ＭＳＬＮ（ｓＭＳＬＮ）が、ＣＡＲ－Ｔ活性に影響を及ぼさないことを示す。Ｍ５ベンチマークＣＡＲ又はＣＡＲ３による腫瘍又は正常標的細胞の急性細胞傷害性は、５００ｎｇ／ｍＬのｓＭＳＬＮ（Ａｃｒｏ Ｂｉｏ）の存在によっては影響を受けなかった。 ｓＭＳＬＮが構造的にインタクトであり、受容体に結合することができることを示す、フローサイトメトリーによって分析された標識されたｓＭＳＬＮ単量体又は四量体による一過性にトランスフェクトされたＣＡＲ（＋）Ｊｕｒｋａｔ細胞の染色を示す。 異種移植片モデルにおける腫瘍細胞の選択的死滅を媒介するＴｍｏｄ構築物を示す。図３４Ａは、二重隣接腫瘍及び正常なＭＳ７５１異種移植片モデルの概略図を示す。図３４Ｂは、生物発光値が、光子／秒／ｃｍ２／ｓｒのフラックス単位でのカラースケールの右側であることを示す。０日目＝Ｔ細胞注射前、８日目及び１５日目＝Ｔ細胞注射後。図３４Ｃは、キャリパー測定によって評価された移植片サイズを示す（以下の実施例８についての結果を参照されたい）。 異種移植片モデルにおける腫瘍細胞の選択的死滅を媒介するＴｍｏｄ構築物を示す。図３４Ａは、二重隣接腫瘍及び正常なＭＳ７５１異種移植片モデルの概略図を示す。図３４Ｂは、生物発光値が、光子／秒／ｃｍ２／ｓｒのフラックス単位でのカラースケールの右側であることを示す。０日目＝Ｔ細胞注射前、８日目及び１５日目＝Ｔ細胞注射後。図３４Ｃは、キャリパー測定によって評価された移植片サイズを示す（以下の実施例８についての結果を参照されたい）。 異種移植片モデルにおける腫瘍細胞の選択的死滅を媒介するＴｍｏｄ構築物を示す。図３４Ａは、二重隣接腫瘍及び正常なＭＳ７５１異種移植片モデルの概略図を示す。図３４Ｂは、生物発光値が、光子／秒／ｃｍ２／ｓｒのフラックス単位でのカラースケールの右側であることを示す。０日目＝Ｔ細胞注射前、８日目及び１５日目＝Ｔ細胞注射後。図３４Ｃは、キャリパー測定によって評価された移植片サイズを示す（以下の実施例８についての結果を参照されたい）。 ＭＳＬＮ ＣＡＲ Ｔｍｏｄが、異種移植片モデルにおいて腫瘍を選択的に死滅させることを示す 図３５Ａは、ＭＳＬＮ ＣＡＲ又はＣＡＲ３ Ｔｍｏｄで形質導入した初代Ｔ細胞を、Ｅ：Ｔ＝１．４：１で４８時間、インビトロでＨＬＡ－Ａ ＫＯ腫瘍又はＡ＊０２－トランスジェニック正常ＭＳ７５１標的細胞のいずれかと共培養したことを示す。Ｍ５は、Ｇｅｎ２ ＣＡＲであり、他の全ては、Ｇｅｎ３であった。腫瘍＝ＭＳＬＮ（＋）Ａ＊０２（－）標的細胞；正常＝ＭＳＬＮ（＋）Ａ＊０２（＋）標的細胞。図３５Ｂは、図３４Ｃに示すデータについての個々のマウス異種移植片増殖曲線を示す。図３５Ｃは、Ｔ細胞注射後の正常細胞及び腫瘍細胞のＢＬＩ定量化を示す。 ＭＳＬＮ ＣＡＲ Ｔｍｏｄが、異種移植片モデルにおいて腫瘍を選択的に死滅させることを示す 図３５Ａは、ＭＳＬＮ ＣＡＲ又はＣＡＲ３ Ｔｍｏｄで形質導入した初代Ｔ細胞を、Ｅ：Ｔ＝１．４：１で４８時間、インビトロでＨＬＡ－Ａ ＫＯ腫瘍又はＡ＊０２－トランスジェニック正常ＭＳ７５１標的細胞のいずれかと共培養したことを示す。Ｍ５は、Ｇｅｎ２ ＣＡＲであり、他の全ては、Ｇｅｎ３であった。腫瘍＝ＭＳＬＮ（＋）Ａ＊０２（－）標的細胞；正常＝ＭＳＬＮ（＋）Ａ＊０２（＋）標的細胞。図３５Ｂは、図３４Ｃに示すデータについての個々のマウス異種移植片増殖曲線を示す。図３５Ｃは、Ｔ細胞注射後の正常細胞及び腫瘍細胞のＢＬＩ定量化を示す。 ＭＳＬＮ ＣＡＲ Ｔｍｏｄが、異種移植片モデルにおいて腫瘍を選択的に死滅させることを示す 図３５Ａは、ＭＳＬＮ ＣＡＲ又はＣＡＲ３ Ｔｍｏｄで形質導入した初代Ｔ細胞を、Ｅ：Ｔ＝１．４：１で４８時間、インビトロでＨＬＡ－Ａ ＫＯ腫瘍又はＡ＊０２－トランスジェニック正常ＭＳ７５１標的細胞のいずれかと共培養したことを示す。Ｍ５は、Ｇｅｎ２ ＣＡＲであり、他の全ては、Ｇｅｎ３であった。腫瘍＝ＭＳＬＮ（＋）Ａ＊０２（－）標的細胞；正常＝ＭＳＬＮ（＋）Ａ＊０２（＋）標的細胞。図３５Ｂは、図３４Ｃに示すデータについての個々のマウス異種移植片増殖曲線を示す。図３５Ｃは、Ｔ細胞注射後の正常細胞及び腫瘍細胞のＢＬＩ定量化を示す。 Ａ＊０２（＋）又は（－）Ｔ細胞におけるＡ＊０２遮断因子のシス結合が機能を抑止することを示す。Ａ＊０２四量体によるＡ＊０２（＋）Ｊｕｒｋａｔ細胞及び初代Ｔ細胞における遮断因子の結合は、自己Ａ＊０２のシス結合のために有意に低下した。結合の低下（遮断因子の利用可能性の低下に起因する）は、遮断因子活性の低下と相関していた。細胞傷害性アッセイは、Ｅ：Ｔ＝０．５：１で示される。 ＭＳＬＮ Ｔｍｏｄ系が、自己Ｔ細胞に拡大され得ることを示す。図３７Ａは、Ａ＊０２（＋）ドナーにおける自己Ａ＊０２のシス結合が、Ａ＊０２（－）ドナーにおける観察されたレベルと同様に、Ａ＊０２四量体への結合によって示されるように、ＣＲＩＳＰＲによるＡ＊０２四量体Ｂ２Ｍノックアウト（ＫＯ）への結合を排除し、遮断因子の利用可能性を回復させることを示す。図３７Ｂは、腫瘍（黒）又は正常（白）標的細胞と培養した活性化因子のみ及びＭＳＬＮ ＳＳ１ ＣＡＲ Ｔｍｏｄ初代Ｔ細胞を示す細胞傷害性アッセイを示す。ＭＳＬＮ ＳＳ１ ＣＡＲ Ｔｍｏｄ構築物は、ＭＳＬＮ（＋）Ａ＊０２（－）腫瘍ＨｅＬａ標的細胞を死滅させるが、シス結合の結果として、自己Ａ＊０２の存在下ではもはや遮断しない。Ａ＊０２（＋）ドナーの場合、遮断は、Ｂ２Ｍ ＣＲＩＳＰＲ ＫＯを介してのみ達成される。Ｅ：Ｔ＝１．２：１。図３７Ｃは、４８時間での代表的な画像を示す。 ＭＳＬＮ Ｔｍｏｄ系が、自己Ｔ細胞に拡大され得ることを示す。図３７Ａは、Ａ＊０２（＋）ドナーにおける自己Ａ＊０２のシス結合が、Ａ＊０２（－）ドナーにおける観察されたレベルと同様に、Ａ＊０２四量体への結合によって示されるように、ＣＲＩＳＰＲによるＡ＊０２四量体Ｂ２Ｍノックアウト（ＫＯ）への結合を排除し、遮断因子の利用可能性を回復させることを示す。図３７Ｂは、腫瘍（黒）又は正常（白）標的細胞と培養した活性化因子のみ及びＭＳＬＮ ＳＳ１ ＣＡＲ Ｔｍｏｄ初代Ｔ細胞を示す細胞傷害性アッセイを示す。ＭＳＬＮ ＳＳ１ ＣＡＲ Ｔｍｏｄ構築物は、ＭＳＬＮ（＋）Ａ＊０２（－）腫瘍ＨｅＬａ標的細胞を死滅させるが、シス結合の結果として、自己Ａ＊０２の存在下ではもはや遮断しない。Ａ＊０２（＋）ドナーの場合、遮断は、Ｂ２Ｍ ＣＲＩＳＰＲ ＫＯを介してのみ達成される。Ｅ：Ｔ＝１．２：１。図３７Ｃは、４８時間での代表的な画像を示す。 ＭＳＬＮ Ｔｍｏｄ系が、自己Ｔ細胞に拡大され得ることを示す。図３７Ａは、Ａ＊０２（＋）ドナーにおける自己Ａ＊０２のシス結合が、Ａ＊０２（－）ドナーにおける観察されたレベルと同様に、Ａ＊０２四量体への結合によって示されるように、ＣＲＩＳＰＲによるＡ＊０２四量体Ｂ２Ｍノックアウト（ＫＯ）への結合を排除し、遮断因子の利用可能性を回復させることを示す。図３７Ｂは、腫瘍（黒）又は正常（白）標的細胞と培養した活性化因子のみ及びＭＳＬＮ ＳＳ１ ＣＡＲ Ｔｍｏｄ初代Ｔ細胞を示す細胞傷害性アッセイを示す。ＭＳＬＮ ＳＳ１ ＣＡＲ Ｔｍｏｄ構築物は、ＭＳＬＮ（＋）Ａ＊０２（－）腫瘍ＨｅＬａ標的細胞を死滅させるが、シス結合の結果として、自己Ａ＊０２の存在下ではもはや遮断しない。Ａ＊０２（＋）ドナーの場合、遮断は、Ｂ２Ｍ ＣＲＩＳＰＲ ＫＯを介してのみ達成される。Ｅ：Ｔ＝１．２：１。図３７Ｃは、４８時間での代表的な画像を示す。 ｓｃＦｖライブラリーからの複数ラウンドの細胞選別を通じた抗ＨＬＡ－Ａ＊１１結合剤の濃縮を示す。オンターゲットプローブは、標識されたＨＬＡ－Ａ＊１１四量体であり、オフターゲットタンパク質は、無関係のＭＨＣ四量体の混合物であった。 ｍＲＮＡ滴定アッセイにおけるＪｕｒｋａｔ細胞活性化を示す。ＨｅＬａ標的細胞を、連続希釈ＨＬＡ－Ａ＊１１ ｍＲＮＡでトランスフェクトし、Ｊｕｒｋａｔ細胞を一過性にトランスフェクトして、ＨＬＡ－Ａ＊１１ ＣＡＲ４を発現させた。機能的応答（ＲＬＵ）を、６時間の共培養後に評価した。ＰＥ、フィコエリトリン。 内因性ＭＳＬＮ（＋）ＨｅＬａ標的細胞上で増加する遮断因子抗原の存在下で、ＭＳＬＮ ＣＡＲ３及びＡ＊０３、Ａ＊１１又はＢ＊０７遮断因子構築物を発現するＪｕｒｋａｔ細胞を遮断したことを示す。 ＭＳＬＮ ＣＡＲ３＋Ａ＊１１遮断因子の初代Ｔ細胞の細胞傷害性アッセイを示す。ＣＡＲ３及びＡ＊１１：０１指向性遮断因子で形質導入した初代Ｔ細胞は、Ａ＊１１：０１でＨｅＬａ標的細胞を効率的に遮断し、ＣＡＲのみの細胞と同じくらい効果的に野生型ＨｅＬａ細胞を死滅させる。形質導入した初代Ｔ細胞を、Ｅ：Ｔ＝０．８：１で、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１を伴って、又は伴わずにＨｅＬａ細胞と共培養した。ここで使用される腫瘍及び正常な標的細胞の両方が、ＧＦＰを発現したことに留意されたい。図３９Ｃは、図３９Ｂについての４８時間における代表的な共培養画像を示す。 ＭＳＬＮ ＣＡＲ３＋Ａ＊１１遮断因子の初代Ｔ細胞の細胞傷害性アッセイを示す。ＣＡＲ３及びＡ＊１１：０１指向性遮断因子で形質導入した初代Ｔ細胞は、Ａ＊１１：０１でＨｅＬａ標的細胞を効率的に遮断し、ＣＡＲのみの細胞と同じくらい効果的に野生型ＨｅＬａ細胞を死滅させる。形質導入した初代Ｔ細胞を、Ｅ：Ｔ＝０．８：１で、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１を伴って、又は伴わずにＨｅＬａ細胞と共培養した。ここで使用される腫瘍及び正常な標的細胞の両方が、ＧＦＰを発現したことに留意されたい。図３９Ｃは、図３９Ｂについての４８時間における代表的な共培養画像を示す。
本明細書では、がんと正常（すなわち、健常又は野生型）細胞との間のリガンドの遺伝子発現の相違に応答する２つの受容体系を含む免疫細胞を使用してがんを治療するための組成物及び方法が提供される。これらの発現の相違は、がん細胞におけるヘテロ接合性の喪失に起因し得る。代替的に、発現の相違は、遺伝子発現が、がん細胞において発現されないか、又は正常細胞よりも低いレベルでがん細胞において発現されるためであり得る。２受容体系は、免疫細胞、例えば、養子細胞療法において使用される免疫細胞において発現され、これらの免疫細胞の活性を、ヘテロ接合性の喪失又は発現の相違を示すがん細胞に標的化する。この２受容体系において、第１の受容体（活性化因子受容体、本明細書においてＡモジュールと称されることがある）は、免疫細胞を活性化するか、又はその活性化を促進するのに対して、第２の受容体（抑制性受容体、本明細書において遮断因子、抑制因子受容体、又はＢモジュールと称されることがある）は、第１の受容体による免疫細胞の活性化を阻害するように作用する。各受容体は、特異的リガンドに結合するリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を含有する。リガンド結合時の２つの受容体からのシグナルは、免疫細胞によって統合される。例えば、がん細胞において抑制性リガンドをコードする遺伝子座のヘテロ接合性の喪失、又は転写レベルの相違による、がん細胞及び正常細胞における第１及び第２の受容体に対するリガンドの差次的発現は、第１の活性化因子リガンドを発現するが、第２の抑制性リガンドを発現しない標的がん細胞による免疫細胞の活性化を媒介する。
大規模な染色体欠失によるヘテロ接合性（ＬＯＨ）の喪失は、腫瘍における遺伝的差異の原因である。ＬＯＨは、ゲノム内のほぼ全ての遺伝子座に影響を及ぼす腫瘍発生における一般的な事象であり、遺伝子のおよそ２０％が平均的な腫瘍内でＬＯＨを示す。ＬＯＨは、全ての悪性細胞が特定の生殖細胞対立遺伝子を欠く腫瘍を見出すことができるため、正常組織から腫瘍を明確に区別するための手段を提供する。ＬＯＨを受ける１つの遺伝子座は、多型の、豊富な、遍在性の表面抗原をコードする、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子座である。本明細書に記載の２受容体系は、第１の受容体を用いて、腫瘍抗原陽性腫瘍細胞に曝露されたＴ細胞（「活性化因子モジュール」と称されることもある）を活性化し、第２の受容体を利用して、ＨＬＡ－Ａ＊０２タンパク質などの表面遮断因子抗原の存在下での免疫細胞の活性化を防止する。本明細書に記載の二重受容体系（本明細書では「Ｔｍｏｄ」と称されることもある）は、細胞療法としての他の有利な特性を有し、これには、免疫細胞の可逆的活性化／遮断、並びに腫瘍及び「正常」細胞の混合物における選択性が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書に提供される組成物及び方法の特定の実施形態において、本明細書に記載の２受容体系を含む免疫細胞は、メソテリン（ＭＳＬＮ）陽性がんを治療するために使用される。これには、中皮腫がん、卵巣がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、食道がん、頭頸部がん、腎臓がん、子宮がん、胃がん、膵臓がん、肺がん、結腸直腸がん、又は胆管がんが含まれる。いくつかの実施形態において、がんは、対象において再発している。いくつかの実施形態において、がんは、１つ以上の以前に投与された抗がん療法に対して難治性である。いくつかの実施形態において、がんは、転移性である。ＭＳＬＮ陽性がんの場合、活性化因子受容体の標的抗原は、主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体におけるＭＳＬＮ又はそのペプチド抗原である。ＭＳＬＮは、とりわけ、正常な脂肪、卵管、肺及び唾液腺組織において発現される（図２）。特定の腫瘍におけるその発現のために、ＭＳＬＮは、適切な治療薬でこれらのがん細胞を特異的に標的とすることができる場合、ＭＳＬＮ＋腫瘍の選択的死滅を媒介することができる、魅力的な腫瘍特異的抗原である。しかしながら、非がん（非標的）細胞における正常なＭＳＬＮ発現は、養子細胞療法などの標的療法に対するＭＳＬＮの有効な使用を妨げている。ＭＳＬＮ活性化因子受容体を抑制性受容体と対にすることにより、本明細書で提供される方法は、養子細胞療法の特異性を増加させ、用量制限毒性などの、これらの療法と関連する有害な作用を減少させる。
いくつかの実施形態において、活性化因子に対するリガンドは、ＭＨＣクラスＩと複合体化されたＭＳＬＮペプチドである。本明細書に記載される方法において、このＭＳＬＮ標的化活性化因子受容体は、抑制性受容体と対にされ、これにより、正常なＭＳＬＮ陽性組織に対するその細胞溶解作用を遮断することによって活性化因子の安全ウィンドウが増加する。しかしながら、腫瘍細胞は、抑制因子、又は遮断因子、受容体に対するリガンドを発現しないため、活性化因子受容体は依然として、２受容体系を含む免疫細胞による腫瘍細胞の標的化死滅を誘導する。第２の抑制性受容体に対する標的は、肺、中皮及び脂肪組織などのＭＳＬＮ陽性組織によって発現されるが、がん細胞においては発現されず、抑制性受容体は、この「非標的抗原」を抑制刺激として認識する。第２の抑制性受容体に対する例示的な標的は、肺組織によって発現され、ヘテロ接合性（ＬＯＨ）又は他の機構の喪失によりＭＳＬＮ陽性がん細胞から喪失され、抑制性受容体上の対立遺伝子特異的リガンド結合ドメインを介して他の対立遺伝子と区別することができるがん細胞内に単一の対立遺伝子形態を残す。抑制性受容体の例示的な標的には、ヒト白血球抗原Ａ（ＨＬＡ－Ａ）などの主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、及び他のＨＬＡ。ＨＬＡは、ＨＬＡ－Ａ＊０１．、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０７、及びその他などのバリアント遺伝子によってコードされ、これらは、ヘテロ接合性の喪失を通じてＭＳＬＮ陽性がん細胞から喪失され得る。代替的に、抑制性受容体の更なる例示的な標的としては、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ１）、カテコール－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）、及びＣ－Ｘ－Ｃモチーフケモカインリガンド１６（ＣＸＣＬ１６）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの各々は、抗体にアクセス可能なその細胞外ドメインにおけるアミノ酸変化を有する、共通の非同義バリアント形態を有し、これは、ＭＳＬＮ又はＭＳＬＮ ｐＭＨＣ応答性活性化因子受容体などの活性化因子受容体によって活性化された操作されたＴ細胞を用いてＭＳＬＮ陽性がんを有する患者を安全に治療するように設計された細胞インテグレーターに対する抑制性受容体、又は遮断因子受容体標的として使用され得る。
本開示の組成物及び方法は、正常組織上のＭＳＬＮの発現によって引き起こされる用量制限毒性（ＤＬＴ）を減少又は除去することができる。本開示は、第２のリガンド（非標的抗原と呼ばれる、ＭＳＬＮ以外のリガンド又は代替として、遮断因子抗原）の存在下で養子免疫細胞の活性化を遮断する第２の抑制性受容体を付加することによって、養子細胞療法を使用してＭＳＬＮ陽性がんを治療するためにがん細胞におけるＭＳＬＮを標的化する方法を提供する。本明細書に記載される組成物及び方法を使用して、ＭＳＬＮを発現する腫瘍細胞は、これらの腫瘍細胞が、活性化因子リガンドであるＭＳＬＮのみを発現するため、２つの受容体を発現する、免疫細胞などの養子細胞によって攻撃される。対照的に、ＭＳＬＮと非標的抗原を発現する正常な細胞は、養子免疫細胞から保護される。正常な細胞上の非標的抗原に対する抑制性受容体の応答により、ＭＳＬＮ標的化活性化因子受容体による免疫細胞の活性化を防止する。この二重標的化アプローチは、ＭＳＬＮ陽性のがん患者においてＭＳＬＮ指向性細胞療法を安全かつ効果的に投与することを可能にする治療ウィンドウを作り出す。
本開示は、オンターゲット毒性を誘導する強力なＭＳＬＮ ＣＡＲ及びＴＣＲの使用を可能にする方法及び組成物を提供し、これらのＭＳＬＮ標的化受容体を、それらの毒性を緩和することによって治療薬として有用にする。
変形例では、本明細書に記載される組成物及び方法を使用して、非標的抗原の発現が、非標的抗原をコードする配列における部分的遺伝子欠失、エピジェネティックサイレンシング、及び点変異又は短縮型変異を含むが、これらに限定されない、ヘテロ接合性の喪失以外の原因によって部分的又は完全に低下する、標的細胞を死滅させることができ、かつ／又は対象を治療することができる。
定義
本開示をより詳細に説明する前に、本明細書で使用される特定の用語の定義を提供することは、その定義を理解することに役立ち得る。
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様又は同等の任意の方法及び材料を特定の実施形態の実施又は試験に使用することができるが、組成物、方法及び材料の好ましい実施形態が本明細書に記載されている。本開示の目的のために、以下の用語を以下に定義する。追加の定義は、本開示全体を通して説明されている。
本明細書で使用される場合、「約」又は「およそ」という用語は、基準量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量又は長さに対して１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％と同じ程度に変化する量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量又は長さを指す。一実施形態において、「約」又は「およそ」という用語は、基準量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量又は長さについて±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、又は±１％の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量又は長さの範囲を指す。
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、その天然の状態で通常それに付随する成分を実質的又は本質的に含まない材料を意味する。特定の実施形態において、「得られた」又は「派生された」という用語は、単離されたと同義的に使用される。
「対象」、「患者」及び「個体」という用語は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指すために本明細書において互換的に使用される。インビボで得られた、又はインビトロで培養された生物学的実体の組織、細胞、及びそれらの子孫もまた包含される。本明細書で使用される場合、「対象」、「患者」又は「個体」は、本明細書で企図されるベクター、組成物、及び方法で治療され得る疼痛を示す任意の動物を含む。好適な対象（例えば、患者）には、実験動物（マウス、ラット、ウサギ、又はモルモットなど）、農場動物、及び家畜又はペット（ネコ又はイヌなど）が含まれる。非ヒト霊長類、及び好ましくはヒト患者が含まれる。
本明細書で使用される場合、「治療」又は「治療すること」は、任意の有益又は望ましい効果を含み、症状の最小限の改善さえ含み得る。「治療」は、必ずしも、疾患若しくは状態、又はその関連する症状の完全な根絶又は治癒を示すとは限らない。
本明細書で使用される場合、「予防する」、及び「予防される」、「予防すること」などの類似の単語は、疾患の症状の可能性を予防、阻害、又は減少させるためのアプローチを示す。それはまた、疾患若しくは状態の発症若しくは再発を遅延させること、又は疾患の症状の発生若しくは再発を遅延させることを指す。本明細書で使用される場合、「予防」及び同様の単語はまた、発症又は再発前の疾患の強度、効果、症状及び／又は負荷を減少させることを含む。
本明細書で使用される場合、「量」という用語は、臨床結果を含む、有益又は所望の予防又は治療結果を達成するためのウイルスの「有効な量」又は「有効量」を指す。
ウイルス又は細胞の「治療有効量」は、個体の疾患状態、年齢、性別、及び体重、並びにウイルス又は細胞が個体において所望の応答を誘発する能力などの要因に応じて変化し得る。治療有効量はまた、ウイルス又は細胞のあらゆる毒性又は有害作用が、治療的に有益な効果により上回る量である。「治療有効量」という用語は、対象（例えば、患者）を「治療する」のに有効である量を含む。
生理学的応答、例えば、電気生理学的活性又は細胞活性の「増加した」又は「増大した」量は、典型的には、「統計的に有意な」量であり、未処理の細胞における活性のレベルの１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０倍以上である（例えば、５００、１０００倍）（その間で１を超える全ての整数及び小数点、例えば、１．５、１．６、１．７．１．８などを含む）増加を含み得る。
生理学的応答、例えば、電気生理学的活性又は細胞活性の「低減した」又は「減少した」量は、典型的には、「統計的に有意な」量であり、未処理の細胞における活性のレベルの１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０倍以上である（例えば、５００、１０００倍）（その間で１を超える全ての整数及び小数点、例えば、１．５、１．６、１．７．１．８などを含む）低減を含み得る。
「維持する」、又は「保存する」、又は「維持」、又は「変化なし」、又は「実質的な変化なし」、又は「実質的な低減なし」とは、一般に、ビヒクル、又は対照分子／組成物のいずれかによって引き起こされる応答と同等の生理学的応答を指す。同等の応答は、参照応答とは著しく異なっていない、又は測定可能なほど異なっていないものである。
一般に、「配列同一性」又は「配列相同性」とは、２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列のそれぞれの正確なヌクレオチド対ヌクレオチド又はアミノ酸対アミノ酸の対応を指す。典型的には、配列同一性を決定するための技術は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定すること、及び／又はそれによってコードされるアミノ酸配列を決定すること、並びにこれらの配列を第２のヌクレオチド又はアミノ酸配列と比較することを含む。２つ以上の配列（ポリヌクレオチド又はアミノ酸）は、それらの「パーセント同一性」を決定することによって比較され得る。核酸配列又はアミノ酸配列に関わらず、２つの配列のパーセント同一性は、２つのアラインメントされた配列間の正確な一致の数を、より短い配列の長さで除算し、１００を乗じたものである。パーセント同一性はまた、例えば、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）から入手可能なバージョン２．２．９を含む、高度なＢＬＡＳＴコンピュータプログラムを使用して配列情報を比較することによって決定され得る。ＢＬＡＳＴプログラムは、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４－２２６８（１９９０）のアラインメント方法に基づき、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）、Ｋａｒｌｉｎ Ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５８７７（１９９３）、及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２（１９９７）に考察されている。簡潔に述べると、ＢＬＡＳＴプログラムは、同一性を、同一のアラインメントされた記号（一般に、ヌクレオチド又はアミノ酸）の数を２つの配列のうちの短い方の記号の総数で除算したものとして定義する。プログラムを使用して、比較されるタンパク質の全長にわたるパーセント同一性を決定することができる。デフォルトパラメータは、短いクエリ配列で、例えば、ｂｌａｓｔｐプログラムで検索を最適化するために提供される。このプログラムではまた、Ｗｏｏｔｔｏｎ ａｎｄ Ｆｅｄｅｒｈｅｎ，Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７：１４９－１６３（１９９３）のＳＥＧプログラムによって決定されるように、ＳＥＧフィルタを使用して、クエリ配列のセグメントをマスクオフ（ｍａｓｋ－ｏｆｆ）することができる。所望の配列同一性度の範囲は、およそ８０％～１００％、及びそれらの間に整数値である。典型的には、開示される配列と特許請求される配列との間のパーセント同一性は、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％である。
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド系」とは、１つ以上のポリヌクレオチドを指す。１つ以上のポリヌクレオチドは、特定の用途のために連携して働くように、又は所望の形質転換細胞を産生するように設計され得る。
「外因性」という用語は、生物体外に由来する核酸、タンパク質又はペプチド、低分子化合物などを含む、任意の分子を指すために本明細書で使用される。対照的に、「内因性」という用語は、生物体内に由来する（すなわち、生物によって天然に産生される）任意の分子を指す。
「ＭＯＩ」という用語は、感染標的（例えば、細胞）に対する作用物質（例えば、ウイルス粒子）の比である、感染多重度を指すために本明細書で使用される。
本記載では、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲、又は整数範囲は、別段の指示がない限り、列挙した範囲内の任意の整数の値、及び適切な場合、その分数（整数の１０分の１及び１００分の１など）を含むと理解されるべきである。「約」という用語は、数字又は数値の直前にある場合、その数字又は数値が、プラス又はマイナス１０％の範囲にあることを意味する。
本明細書で使用される場合、「標的細胞」とは、養子細胞療法によって標的化される細胞を指す。例えば、標的細胞は、がん細胞であってもよく、これは、養子細胞療法の移植されたＴ細胞によって死滅させることができる。本開示の標的細胞は、本明細書に記載されるような標的抗原を発現し、非標的抗原を発現しない。
本明細書で使用される場合、「非標的細胞」とは、養子細胞療法によって標的化されない細胞を指す。例えば、がん細胞を標的とする養子細胞において、正常な、健常な、非がん性細胞は、非標的細胞である。対象におけるいくつかの、又は全ての非標的細胞は、標的抗原及び非標的抗原の両方を発現し得る。対象における非標的細胞は、これらの細胞が標的抗原も発現するか否かに関係なく、非標的抗原を発現し得る。
本明細書で使用される場合、「非標的対立遺伝子バリアント」とは、その産物が非標的細胞によって発現されるが、標的細胞によって発現されない遺伝子の対立遺伝子を指す。例えば、非標的対立遺伝子バリアントは、対象の正常な非がん細胞によって発現されるが、対象のがん細胞によって発現されない遺伝子の対立遺伝子である。非標的対立遺伝子バリアントの発現は、非標的対立遺伝子バリアントをコードする遺伝子のヘテロ接合性、変異、又はエピジェネティック修飾の喪失を含むが、これらに限定されない、任意の機構によって、がん細胞内で喪失され得る。
本明細書で使用される場合、抗原結合ドメインなどのリガンド結合ドメインに関して使用される場合、「に特異的な」又は「に特異的に結合する」とは、名前を付けられた標的に対して高い特異性を有するリガンド結合ドメインを指す。抗体特異性は、リガンド結合ドメインと、対応するリガンドとの間の適合の良さ、又はリガンド結合ドメインが類似若しくは更に異なったリガンドを識別する能力の尺度とみなされ得る。特異性と比較して、親和性は、低親和性リガンド結合ドメインが弱く結合し、高親和性リガンド結合ドメインが強く結合するように、リガンド結合ドメインとリガンドとの間の結合の強度の尺度である。標的対立遺伝子に特異的であるリガンド結合ドメインは、遺伝子の異なる対立遺伝子を識別することができるものである。例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０２に特異的であるリガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ＊０１又はＨＬＡ－Ａ＊０３などの他のＨＬＡ－Ａ対立遺伝子に結合しないか、又は弱く結合するだけである。当業者は、リガンド結合ドメインが特定の標的に特異的であると言うことができるが、本明細書に記載の受容体系におけるその機能に影響を与えない１つ以上の追加の標的への結合レベルが依然として低いことを理解するであろう。
本明細書で使用される場合、「標的抗原」は、抗原という用語又は特定の抗原の名称を使用して参照されるかどうかに関わらず、がん細胞などの標的細胞によって発現される抗原を指す。標的抗原の発現は、標的細胞に限定されない。標的抗原は、対象において、がん細胞及び正常な非がん細胞の両方によって発現され得る。
本明細書で使用される場合、「非標的抗原」（又は「遮断因子抗原」）は、抗原という用語又は特定の抗原の名称を使用して参照されるかどうかに関わらず、正常な非がん細胞によって発現され、がん細胞において発現されない抗原を指す。この発現の相違により、抑制性受容体が、非標的細胞の存在下では免疫細胞の活性化を阻害することを可能にするが、標的細胞の存在下では阻害することを可能にしない。
多型とは、集団におけるヌクレオチド配列の２つ以上のバリアントの存在を指す。多型は、１つ以上の塩基の変化、挿入、反復、又は欠失を含み得る。多型には、例えば、単純反復配列（ＳＳＲ）及び一塩基多型（ＳＮＰ）が含まれ、これは、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）又はグアニン（Ｇ）の単一ヌクレオチドが変化するときに生じる変異である。
本明細書で使用される場合、「親和性」とは、受容体上の単一のリガンド結合部位、例えば、本明細書に記載される受容体のいずれかの抗原結合ドメインに対する抗原へのリガンドの結合の強度を指す。リガンド結合ドメインは、それらのリガンドとのより弱い相互作用（低親和性）、又はより強い相互作用（高親和性）を有することができる。
Ｋｄ、又は解離定数は、例えば、受容体及びその同族リガンドを含む巨大分子複合体がリガンド及び受容体に分離する場合など、より大きな物体がより小さな成分に可逆的に分離する傾向を測定する一種の平衡定数である。Ｋｄが高い場合、受容体を占有するためには高濃度のリガンドが必要であり、リガンドに対する受容体の親和性が低いことを意味する。逆に、低いＫｄは、リガンドが受容体に対して高い親和性を有することを意味する。
本明細書で使用される場合、「応答する」又は「に応答する」受容体は、リガンド（すなわち、抗原）が結合すると、細胞内ドメインの既知の機能に対応するシグナルを生成する、細胞内ドメインを含む受容体を指す。標的抗原に結合した活性化因子受容体は、活性化因子受容体を発現する免疫細胞の活性化を引き起こすシグナルを生成することができる。非標的抗原に結合した抑制性受容体は、活性化因子受容体を発現する免疫細胞の活性化を防止又は低下させる抑制シグナルを生成することができる。受容体の応答性、及び受容体を発現する免疫細胞を活性化又は阻害するそれらの能力は、レポーターアッセイ及び細胞傷害性アッセイを含むがこれらに限定されない、当該技術分野で既知であり、本明細書に記載される任意の手段によってアッセイされ得る。
本明細書で使用される場合、免疫細胞の「活性化」又は「活性化される」免疫細胞とは、免疫応答に特徴的な１つ以上の機能を行うことができる免疫細胞を指す。これらの機能には、増殖、サイトカインの放出、及び細胞傷害性、すなわち標的細胞の死滅が含まれる。活性化された免疫細胞は、当業者に明白であるマーカーを発現する。例えば、活性化Ｔ細胞は、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ２５及びＨＬＡ－ＤＲのうちの１つ以上を発現することができる。活性化因子受容体（例えば、ＭＳＬＮ ＣＡＲ）を発現する免疫細胞は、標的細胞によって発現される標的抗原（例えば、ＭＳＬＮ）への受容体の結合に応答するようになると、活性化因子受容体によって活性化され得る。「標的抗原」はまた、「活性化因子抗原」とも称され得、標的細胞によって単離又は発現され得る。抑制性受容体を発現する免疫細胞の活性化は、活性化因子受容体が標的活性化因子リガンドに結合している場合であっても、抑制性受容体が非標的抗原（例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０２）に応答するようになったときに防止され得る。「非標的抗原」はまた、「抑制性リガンド」又は「遮断因子」とも称され得、標的細胞によって単離又は発現され得る。
免疫細胞上での受容体発現は、本明細書に記載の活性化因子受容体及び抑制性受容体の存在を報告するアッセイによって検証され得る。例えば、免疫細胞の集団を、標識分子（例えば、フルオロフォア標識受容体特異的抗体又はフルオロフォア標識受容体特異的リガンド）で染色し、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）フローサイトメトリーを使用して定量化することができる。この方法は、免疫細胞の集団における免疫細胞のパーセンテージを、活性化因子受容体、抑制性受容体、又は両方の受容体を発現するものとして特徴付けることを可能にする。本明細書に記載の免疫細胞によって発現される活性化因子受容体及び抑制性受容体の比は、例えば、デジタルドロップレットＰＣＲによって決定され得る。これらのアプローチを使用して、本明細書に記載の免疫細胞、医薬組成物、及びキットの産生及び製造のための細胞の集団を特徴付けることができる。本明細書に記載の免疫細胞、医薬組成物、及びキットについて、活性化因子受容体及び抑制性受容体の両方を発現する免疫細胞の好適なパーセンテージが、本明細書に記載の方法に対して特異的に決定されることを理解されたい。例えば、活性化因子受容体及び抑制性受容体の両方を発現する免疫細胞の好適なパーセンテージは、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％であり得る。更なる例として、免疫細胞の５０％～９９％、６０％～９５％、６５％～９５％、６５％～９０％、７０％～９０％、７５％～９０％、７５％～８５％、８０％～９９％、８５％～９９％、９０％～９９％、又は９５％～９９％は、活性化因子受容体及び抑制性受容体の両方を発現することができる。例えば、免疫細胞における活性化因子受容体及び抑制性受容体の好適な比は、約５：１、約４：１、約３：１、約２：１、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、又は約１：５であり得る。精製、濃縮、及び／又は枯渇ステップは、本明細書に記載の免疫細胞、医薬組成物、及びキットについての好適な値を満たすために、免疫細胞の集団に対して使用することができることを理解されたい。
本明細書に記載の免疫細胞によって発現される応答性受容体は、受容体の細胞内ドメインによって生成されると予想されるシグナルの生成を測定するアッセイによって検証され得る。Ｊｕｒｋａｔ－ルシフェラーゼＮＦＡＴ細胞（Ｊｕｒｋａｔ細胞）などのレポーター細胞株を使用して、応答性受容体を特徴付けることができる。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、Ｔ細胞に由来し、活性化Ｔ細胞（ＮＦＡＴ）誘導性ルシフェラーゼレポーター系の安定に組み込まれた核因子を含む。ＮＦＡＴは、免疫細胞活性化に必要な転写因子のファミリーであり、その活性化は、Ｔ細胞活性化についてのシグナルマーカーとして使用され得る。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、本明細書に記載の活性化因子受容体及び／又は抑制性受容体で形質導入又はトランスフェクトされ得る。活性化因子受容体は、Ｊｕｒｋａｔ細胞がルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する場合、リガンドの結合に応答し、応答性のレベルは、レポーター遺伝子発現のレベルによって決定され得る。ルシフェラーゼの存在は、ルシフェリンなどの任意の既知のルシフェラーゼ検出試薬を使用して決定され得る。抑制性受容体は、Ｊｕｒｋａｔ細胞内の活性化因子受容体と共発現したときに、リガンドの結合に応答し、正常に応答する免疫細胞を活性化因子受容体に応答してルシフェラーゼを発現することを防止する。例えば、抑制性受容体の応答性は、活性化因子及び抑制因子の両方を発現するＪｕｒｋａｔ細胞において、以下を観察することによって決定及び定量化され得る：１）Ｊｕｒｋａｔ細胞が、活性化因子受容体リガンドの存在下及び抑制性受容体リガンドの不在下でルシフェラーゼを発現し、２）Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるルシフェラーゼの発現が、活性化因子受容体リガンド及び抑制性受容体リガンドの両方の存在下で低下又は除去される。このアプローチを使用して、活性化因子受容体、並びに活性化因子受容体及び抑制性受容体の特定の対の感受性、効力、及び選択性を決定することができる。感受性、効力、及び選択性は、用量反応実験を使用してＥＣ５０又はＩＣ５０値によって定量化することができ、活性化因子受容体リガンド及び／又は抑制性受容体リガンドは、活性化因子受容体又は活性化因子受容体及び抑制性受容体の特定の対を発現するＪｕｒｋａｔ細胞の培養物中に滴定される。代替的に、ＥＣ５０及びＩＣ５０値は、活性化因子受容体、又は活性化因子受容体及び抑制性受容体の特定の対を発現する免疫細胞（例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞又は初代免疫細胞）と、増加した量の活性化因子リガンド又は抑制因子リガンドを発現する標的細胞との共培養において決定することができる。増加した量の活性化因子リガンド又は抑制因子リガンドは、例えば、標的細胞への、ｍＲＮＡをコードする活性化因子リガンド若しくは抑制因子リガンドの滴定、又は異なるレベルの標的リガンドを天然に発現する標的細胞の使用によって、標的細胞において達成され得る。様々な量の標的及び非標的リガンドを発現する使用した標的細胞を決定する場合の活性化因子受容体及び抑制性受容体についての例示的な好適なＥＣ５０及びＩＣ５０値には、活性化因子受容体について１００万個当たり１０個以下の転写産物（ＴＰＭ）のＥＣ５０、例えば、２～１０個のＴＰＭのＥＣ５０、及び抑制性受容体について２５個以下のＴＰＭのＩＣ５０、例えば、５～２１個のＴＰＭのＩＣ５０が含まれる。
活性化因子受容体又は活性化因子受容体及び抑制性受容体の特定の対を発現する本明細書に記載の免疫細胞の活性化は、当該免疫細胞との共インキュベーション後の標的細胞の生存率を測定するアッセイによって更に決定され得る。エフェクター細胞と称されることがある免疫細胞は、活性化因子受容体リガンド、抑制性受容体リガンド、又は活性化因子受容体及び抑制性受容体リガンドの両方を発現する標的細胞と共インキュベートされる。共インキュベーション後、標的細胞の生存率は、細胞培養における生存率を測定する任意の方法を使用して測定される。例えば、生存率は、テトラゾリウム塩基質を使用して活性ミトコンドリア酵素を測定するミトコンドリア機能アッセイを使用して決定され得る。生存率は、イメージングに基づく方法を使用して決定することもできる。標的細胞は、緑色蛍光タンパク質又は赤色蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質を発現することができる。全細胞蛍光の減少は、標的細胞の生存率の減少を示す。活性化因子受容体又は活性化因子受容体及び抑制性受容体の特定の対を発現する免疫細胞とのインキュベーション後の標的細胞の生存率の減少は、免疫細胞の標的細胞媒介性活性化と解釈される。免疫細胞の選択性の尺度は、このアプローチを使用して決定することもできる。活性化因子受容体及び抑制性受容体の対を発現する免疫細胞は、以下が観察される場合、選択的である：１）活性化因子受容体リガンドを発現するが、抑制性受容体リガンドを発現しない標的細胞では生存率が減少し、２）活性化因子受容体リガンド及び抑制性受容体リガンドの両方を発現する標的細胞では生存率が減少しない。これらの測定値から、陰性対照（活性化因子受容体を発現しない免疫細胞）のパーセンテージとしての標的細胞の生存率の減少に基づいて免疫細胞活性化のパーセンテージを定量化する「特異的死滅」値を導出することができる。更に、これらの測定値から、抑制性受容体リガンドの不在下で活性化因子受容体リガンドを発現する標的細胞において観察される特異的死滅と、活性化因子受容体リガンド及び抑制性受容体リガンドの両方を発現する標的細胞において観察される特異的死滅との比を表す「選択性比」値を導出することができる。このアプローチを使用して、本明細書に記載の免疫細胞、医薬組成物、及びキットの産生及び製造のための細胞の集団を特徴付けることができる。免疫細胞、医薬組成物、及びキットについての好適な特異的死滅値は、例えば、以下の基準であり得る：１）抑制性受容体リガンドの不在下で免疫細胞及び活性化因子受容体リガンドを発現する標的細胞の４８時間の共インキュベーション後の少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の特異的死滅、並びに２）活性化因子受容体リガンド及び抑制性受容体リガンドの両方を発現する標的細胞の４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、３％以下、又は１％以下の特異的死滅。
更なる例として、免疫細胞、医薬組成物、及びキットについての好適な特異的死滅値は、以下の基準であり得る：１）活性化因子リガンドを発現するが、抑制因子リガンドを発現しない標的細胞の３０％～９９％、４０％～９９％、５０％～９９％、５５％～９５％、６０％～９５％、６０％～９０％、５０％～８０％、５０％～７０％、又は５０％～６０％が死滅し、２）活性化因子リガンド及び抑制因子リガンドを発現する標的細胞の１％～４０％、３％～４０％、５％～４０％、５％～３０％、１０％～３０％、１５％～３０％、又は５％～２０％が死滅する。なお更なる例として、免疫細胞、医薬組成物、及びキットについての好適な特異的死滅値は、例えば、以下の基準であり得る：１）抑制性受容体リガンドの不在下での、免疫細胞及び活性化因子受容体リガンドを発現する標的細胞の４８時間の共インキュベーション後の少なくとも５０％の特異的死滅、並びに２）活性化因子受容体リガンド及び抑制性受容体リガンドの両方を発現する標的細胞の２０％以下の特異的死滅。更なる例として、免疫細胞は、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、３０時間、３６時間、４２時間、４８時間、５４時間、又は６０時間の時間にわたって、活性化因子リガンドを発現し、抑制因子リガンドを発現しない標的細胞の少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％を死滅させることができ、一方、同じ時間にわたって、活性化因子リガンド及び抑制因子リガンドを発現する標的細胞の４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、３％未満、又は１％未満を死滅させることができる。
免疫細胞、医薬組成物、及びキットについての抑制性リガンド値の不在下で活性化因子リガンドを発現する標的細胞の好適な特異的死滅値は、例えば、少なくとも約５０％～少なくとも約９５％であり得る。免疫細胞、医薬組成物、及びキットについての抑制性リガンド値の不在下で活性化因子リガンドを発現する標的細胞の好適な特異的死滅値は、例えば、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％であり得る。免疫細胞、医薬組成物、及びキットについての抑制性リガンド値の不在下で活性化因子リガンドを発現する標的細胞の好適な特異的死滅値は、例えば、最大で約５０％、最大で約５５％、最大で約６０％、最大で約６５％、最大で約７０％、最大で約７５％、最大で約８０％、最大で約８５％、最大で約９０％、又は最大で約９５％であり得る。免疫細胞、医薬組成物、及びキットについての活性化因子受容体リガンド及び抑制性受容体リガンドの両方を発現する標的細胞の好適な特異的死滅値は、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、又は約５％未満であり得るあり得る。免疫細胞、医薬組成物、及びキットについての好適な特異的死滅値は、標的細胞との免疫細胞の共インキュベーションの約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４２時間、約４８時間、約５４時間、約６０時間、約６６時間、又は約７２時間後に決定され得るされ得る。
免疫細胞、医薬組成物、及びキットについての抑制性リガンド値の不在下で活性化因子リガンドを発現する標的細胞の好適な特異的死滅値は、例えば、少なくとも約５０％～少なくとも約９５％であり得る。免疫細胞、医薬組成物、及びキットについての抑制性リガンド値の不在下で活性化因子リガンドを発現する標的細胞の好適な特異的死滅値は、例えば、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％であり得る。免疫細胞、医薬組成物、及びキットについての抑制性リガンド値の不在下で活性化因子リガンドを発現する標的細胞の好適な特異的死滅値は、例えば、最大で約５０％、最大で約５５％、最大で約６０％、最大で約６５％、最大で約７０％、最大で約７５％、最大で約８０％、最大で約８５％、最大で約９０％、又は最大で約９５％であり得る。免疫細胞、医薬組成物、及びキットについての活性化因子受容体リガンド及び抑制性受容体リガンドの両方を発現する標的細胞の好適な特異的死滅値は、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、又は約５％未満であり得るあり得る。免疫細胞、医薬組成物、及びキットについての好適な特異的死滅値は、標的細胞との免疫細胞の共インキュベーションの約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４２時間、約４８時間、約５４時間、約６０時間、約６６時間、又は約７２時間後に決定され得るされ得る。
本明細書で使用される場合、「機能的バリアント」という用語は、親タンパク質と比較して１つ以上のアミノ酸置換、挿入、又は欠失を有し、親タンパク質の１つ以上の所望の活性を保持するタンパク質を指す。機能的バリアントは、親タンパク質の１つ以上の所望の活性を保持するタンパク質の断片（すなわち、Ｎ末端及び／又はＣ末端欠失を有するバリアント）であり得る。
本明細書で言及される全ての刊行物及び特許は、各個々の刊行物又は特許が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されたかのように、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。矛盾する場合、本明細書におけるあらゆる定義を含む本出願が優先する。しかしながら、本明細書に引用される任意の参考文献、記事、出版物、特許、特許公開、及び特許出願の言及は、それらが有効な先行技術を構成する、又は世界のどの国でも一般的な知識の一部を形成するという認識、又はいかなる形態の示唆ではなく、それらとみなされるべきではない。
活性化因子受容体
本開示は、主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体における、がん細胞特異的抗原、又はそのペプチド抗原を含む標的抗原に特異的な第１の細胞外リガンド結合ドメインを含む、第１の受容体を提供する。第１の受容体は活性化因子受容体であり、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインによる標的抗原の結合時に、第１の受容体を発現する免疫細胞の活性化を媒介する。第１の受容体は、標的抗原（すなわち、活性化因子リガンド）に応答する。例えば、標的抗原が第１の受容体に結合又は接触するとき、第１の受容体は応答性であり、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインによる標的抗原の結合時に第１の受容体を発現する免疫細胞を活性化する。いくつかの実施形態において、第１の受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。いくつかの実施形態において、第１の受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）である。
いくつかの実施形態において、第１の受容体はヒト化される。本明細書で使用される場合、「ヒト化」とは、非ヒト種から単離されているか、又は非ヒト種から派生されている導入遺伝子における配列又は部分配列を、相同、又は機能的に等価なヒト配列と置き換えることを指す。例えば、ヒト化抗体は、マウスＣＤＲをヒトフレームワーク配列に移植し、続いて起源抗体からの対応するマウス残基に対する特定のヒトフレームワーク残基の逆置換によって作り出すことができる。
活性化因子標的
いくつかの実施形態において、第１の受容体についての標的抗原は、がん細胞特異的抗原である。標的がん細胞によって発現される任意の細胞表面分子は、第１の受容体リガンド結合ドメインに好適な標的抗原であり得る。例えば、細胞接着分子、細胞間シグナル伝達分子、細胞外ドメイン、走化性に関与する分子、糖タンパク質、Ｇタンパク質共役受容体、膜貫通、神経伝達物質のための受容体、又は電圧依存性イオンチャネルを、標的抗原として使用することができる。
いくつかの実施形態において、標的抗原は、主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体におけるがん細胞特異的抗原のペプチド抗原である。標的がん細胞によって発現され、がん細胞表面上の主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）によってペプチド抗原（ｐＭＨＣ）として提示される任意の分子は、第１の受容体細胞外リガンド結合ドメインに好適な標的抗原であり得る。
いくつかの実施形態において、がん細胞特異的抗原は、主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体におけるメソテリン（ＭＳＬＮ）、又はそのペプチド抗原である。
主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）は、免疫系の細胞に対する抗原を示し、免疫応答を誘発するタンパク質複合体である。ＭＨＣ－Ｉに対応するヒト白血球抗原（ＨＬＡ）は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃである。
ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ又はＨＬＡ－Ｇのいずれかを含む、がん細胞特異的ｐＭＨＣ抗原は、本開示の範囲内であると想定される。いくつかの実施形態において、がん細胞特異的抗原は、ＨＬＡ－Ａを含む。ＨＬＡ－Ａ受容体は、重α鎖及びより小さいβ鎖を含むヘテロ二量体である。α鎖は、ＨＬＡ－Ａのバリアントによってコードされ、一方、β鎖（β２－マイクログロブリン）は、不変である。数千のバリアントＨＬＡ－Ａ遺伝子が存在し、これらの全ては、本開示の範囲内に入る。いくつかの実施形態において、ＭＨＣ－Ｉは、ヒト白血球抗原Ａ＊０２対立遺伝子（ＨＬＡ－Ａ＊０２）を含む。
いくつかの実施形態において、がん細胞特異的抗原は、ＨＬＡ－Ｂを含む。ＨＬＡ－Ｂ遺伝子の数百のバージョン（対立遺伝子）が知られており、それらの各々には、特定の数（ＨＬＡ－Ｂ＊２７など）が与えられる。
いくつかの実施形態において、がん細胞特異的抗原は、ＨＬＡ－Ｃを含む。ＨＬＡ－Ｃは、ＨＬＡクラスＩ重鎖パラログに属する。このクラスＩ分子は、重鎖及び軽鎖（ベータ－２マイクログロブリン）からなるヘテロ二量体である。１００を超えるＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子が当該技術分野で既知である。
いくつかの実施形態において、がん細胞特異的抗原は、卵巣がん抗原、膵臓がん抗原、肺がん抗原、結腸直腸がん抗原、又は中皮腫抗原である。いくつかの実施形態において、がん細胞特異的抗原は、結腸直腸がん抗原である。いくつかの実施形態において、がん細胞特異的抗原は、ＭＳＬＮ又はそのペプチド抗原である。
いくつかの実施形態において、がん細胞特異的抗原は、ＭＳＬＮ、又は主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体におけるそのペプチド抗原である。ＭＳＬＮは、通常、中皮細胞、並びに肺、卵管、唾液腺及び脂肪組織において発現される４０ＫＤａのタンパク質である（図２）。ＭＳＬＮは、中皮腫がん、卵巣がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、食道がん、頭頸部がん、腎臓がん、子宮がん、胃がん、膵臓がん、肺がん、結腸直腸がん、又は胆管がんを含む、複数のヒト腫瘍型において発現される。いくつかの実施形態において、がんは、対象において再発している。いくつかの実施形態において、がんは、１つ以上の以前に投与された抗がん療法に対して難治性である。いくつかの実施形態において、がんは、転移性である。
ＭＳＬＮの全てのアイソフォームは、本開示のがん細胞特異的抗原として想定される。ＭＳＬＮアイソフォーム１プレタンパク質は、ＮＣＢＩ記録番号ＮＰ＿００５８１４．２に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮは、以下のアミノ酸配列を含む：
Figure 2023538114000002
いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮは、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。
ＭＳＬＮアイソフォーム２プレタンパク質は、ＮＣＢＩ記録番号ＮＰ＿０３７５３６．２に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮは、以下のアミノ酸配列を含む：
Figure 2023538114000003
いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮは、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。
いくつかの実施形態において、がん細胞特異的抗原は、ＭＳＬＮに由来するペプチド抗原である。いくつかの実施形態において、ペプチド抗原は、配列番号１及び／又は配列番号２の部分配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチド抗原は、配列番号１及び／又は配列番号２の部分配列と同一の配列を含む。
細胞外リガンド結合ドメイン
本開示は、標的抗原に特異的な第１の細胞外リガンド結合ドメインを含む、第１の受容体を提供する。いくつかの実施形態において、標的抗原は、がん細胞特異的抗原を含む。
いくつかの実施形態において、がん細胞特異的抗原は、ＭＳＬＮ又はＭＨＣ－Ｉと複合体化されたＭＳＬＮ由来ペプチド抗原であり、第１の受容体のリガンド結合ドメインは、ＭＳＬＮ抗原を認識し、それに結合する。
リガンド依存的な様式で受容体の活性を調節することができる任意の種類のリガンド結合ドメインは、本開示の範囲内として想定される。いくつかの実施形態において、リガンド結合ドメインは、抗原結合ドメインである。例示的な抗原結合ドメインには、とりわけ、ｓｃＦｖ、ＳｄＡｂ、Ｖβのみのドメイン、並びにＴＣＲ α及びβ鎖可変ドメインに由来するＴＣＲ抗原結合ドメインが含まれる。
任意の種類の抗原結合ドメインは、本開示の範囲内として想定される。
例えば、第１の細胞外リガンド結合ドメインは、例えば、Ｖβのみのドメイン、単一ドメイン抗体断片（ｓｄＡｂ）又は重鎖抗体ＨＣＡｂ、マウス、ヒト化又はヒト抗体に由来する一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含む、連続ポリペプチド鎖の一部であり得る（Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｉｎ：Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、Ｈｏｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６）。いくつかの態様において、第１の細胞外リガンド結合ドメインは、抗体断片を含む、抗原結合ドメインを含む。更なる態様において、第１の細胞外リガンド結合ドメインは、ｓｃＦｖ又はｓｄＡｂを含む、抗体断片を含む。
「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原に特異的に結合する、免疫グロブリン分子に由来するタンパク質、又はポリペプチド配列を指す。抗体は、ポリクローナル若しくはモノクローナル起源のインタクトな免疫グロブリン、又はその断片であり得、天然又は組換え源に由来し得る。
「抗体断片」又は「抗体結合ドメイン」という用語は、抗原結合ドメイン、すなわち、インタクトな抗体の抗原決定可変領域を含有する、抗体又はその組換えバリアントの少なくとも１つの部分を指し、これは、抗原及びその定義されたエピトープなどの標的に対する抗体断片の認識及び特異的結合を付与するのに十分である。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、一本鎖（ｓｃ）Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）抗体断片、線状抗体、単一ドメイン抗体（「ｓｄＡｂ」と略記される）（ＶＬ又はＶＨのいずれか）、ラクダ科ＶＨＨドメイン、並びに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
「ｓｃＦｖ」という用語は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片、及び重鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片を含む融合タンパク質を指し、軽鎖及び重鎖可変領域は、短い可撓性ポリペプチドリンカーを介して連続して連結され、単一のポリペプチド鎖として発現することが可能であり、ｓｃＦｖは、それが由来するインタクトな抗体の特異性を保持する。
抗体に関して「重鎖可変領域」又は「ＶＨ」（又は、単一ドメイン抗体、例えば、ナノボディの場合、「ＶＨＨ」）は、フレームワーク領域として知られている隣接ストレッチ間に介在する３つのＣＤＲを含有する重鎖の断片を指し、これらのフレームワーク領域は、一般に、ＣＤＲよりも高度に保存され、ＣＤＲを支持するための足場を形成する。
本明細書で使用される場合、指定されない限り、ｓｃＦｖは、例えば、ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端に関して、いずれかの順序でＶＬ及びＶＨ可変領域を有してもよく、ｓｃＦｖは、ＶＬ－リンカー－ＶＨを含んでもよく、又はＶＨ－リンカー－ＶＬを含んでもよい。
いくつかの実施形態において、活性化因子及び／又は抑制性受容体の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、リンカーによって結合されたＶＬ及びＶＨ領域を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、グリシンセリンリンカー、例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号１５２）を含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、ｓｃＦｖのＮ末端においてシグナル配列を更に含む。例示的なシグナル配列には、ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣ（配列番号３６２）が含まれ、これは、ＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＴＣＣＣＣＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧＣＴＡＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＧＡＧＧＴＧＣＣＡＧＡＴＧＴ（配列番号１５３）によってコードされる。
「抗体軽鎖」という用語は、抗体分子中に存在する２つの種類のポリペプチド鎖のうちの、それらの天然に存在する立体配座における、より小さいものを指す。カッパ（「Ｋ」）及びラムダ（「λ」）軽鎖は、２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。
「組換え抗体」という用語は、組換えＤＮＡ技術を使用して生成される抗体、例えば、バクテリオファージ又は酵母発現系によって発現される抗体を指す。この用語はまた、抗体をコードするＤＮＡ分子の合成によって生成され、ＤＮＡ分子が抗体タンパク質を発現する抗体、又は抗体を特定するアミノ酸配列を意味すると解釈されるべきであり、ＤＮＡ又はアミノ酸配列は、当該技術分野で利用可能であり、周知である組換えＤＮＡ又はアミノ酸配列技術を使用して得られている。
「Ｖβドメイン」、「Ｖβのみのドメイン」、「β鎖可変ドメイン」又は「単一可変ドメインＴＣＲ（ｓｖｄ－ＴＣＲ）」という用語は、第２のＴＣＲ可変ドメインの不在下で抗原に特異的に結合する単一Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ベータ可変ドメインから本質的になる抗原結合ドメインを指す。Ｖβのみのドメインは、相補性決定領域（ＣＤＲ）を使用して抗原に関与する。各Ｖβのみのドメインは、３つの相補体決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含有する。追加のエレメントは、Ｖβドメインが、第２のＴＣＲ可変ドメインの不在下でエピトープに結合するように構成されることを条件に組み合わされてもよい。
いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、抗体断片、一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）、又はβ鎖可変ドメイン（Ｖβ）を含む。
いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＴＣＲ α鎖可変ドメイン及びＴＣＲ β鎖可変ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ｓｃＦｖ抗原結合ドメインを含む。例示的なＭＳＬＮ ｓｃＦｖを以下の表１に示す。
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いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖドメインは、ＭＳＬＮに結合する。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、ＣＡＲのリガンド結合ドメインである。ＭＳＬＮに特異的な例示的なｓｃＦｖドメインを、上記の表１に示す。表１において、下線は、ＣＤＲ配列を示す。
いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号３～６、８０若しくは１５４～２１５の配列、又は表１に記載する配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７％の同一性又は少なくとも９９％の同一性を有する抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、表１に記載の配列番号３～６、８０、又は１５４～２１５の配列を含む抗原結合ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号１７１の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７％の同一性又は少なくとも９９％の同一性を有する結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号１７１の配列を含む結合ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号３～６のうちのいずれか１つと少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７％の同一性又は少なくとも９９％の同一性を有するｓｃＦｖ抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号３～６又は８０のうちのいずれか１つの配列を含むｓｃＦｖ抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号３～６又は８０からなる群から選択される配列から本質的になる。
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表２において、示される重鎖（ＨＣ）ＣＤＲと対になった軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲを左欄に示す。
いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、表２に記載のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、及びＨＣ ＣＤＲ３（例えば、表２のライン＃１、ライン＃２、ライン＃３のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、及びＨＣ ＣＤＲ３など）、又は表２のＣＤＲと比較して最大で１、２、若しくは３個の置換、欠失、若しくは挿入を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、表２に記載のＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、及びＬＣ ＣＤＲ３（例えば、表２のラインＡ、ラインＢ、又はラインＣのＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、及びＬＣ ＣＤＲ３）、又は表２のＣＤＲと比較して最大で１、２、若しくは３個の置換、欠失、若しくは挿入を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、表２に記載のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、及びＨＣ ＣＤＲ３（例えば、表２のライン＃１、ライン＃２、ライン＃３のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、及びＨＣ ＣＤＲ３など）を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、表２に記載のＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、及びＬＣ ＣＤＲ３（例えば、表２のラインＡ、ラインＢ、又はラインＣのＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、及びＬＣ ＣＤＲ３）を含む。
いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、表２に記載のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＨＣ ＣＤＲ３、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、及びＬＣ ＣＤＲ３（例えば、ライン１に記載のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２及びＨＣ ＣＤＲ３、並びにラインＡのＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、及びＬＣ ＣＤＲ３）を含む いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、表２に記載のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、及びＨＣ ＣＤＲ３（例えば、表２のライン＃１、ライン＃２、ライン＃３のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、及びＨＣ ＣＤＲ３など）、又は表２のＣＤＲと比較して最大で１、２、若しくは３個の置換、欠失、若しくは挿入を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、表２に記載のＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、及びＬＣ ＣＤＲ３（例えば、表２のラインＡ、ラインＢ、又はラインＣのＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、及びＬＣ ＣＤＲ３）、又は表２のＣＤＲと比較して最大で１、２、若しくは３個の置換、欠失、若しくは挿入を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、表２に記載の１つ以上のＨＣ ＣＤＲ及び表２に記載の１つ以上のＬＣ ＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、（ｉ）表２の１つのラインに記載のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、及びＨＣ ＣＤＲ３（例えば、表２のライン＃１、ライン＃２、ライン＃３のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、及びＨＣ ＣＤＲ３など）、並びに（ｉｉ）表２の１つのラインに記載のＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、及びＬＣ ＣＤＲ３（例えば、表２のラインＡ、ラインＢ、又はラインＣのＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、及びＬＣ ＣＤＲ３）を含む。各場合において、ＨＣ ＣＤＲは、重鎖及び軽鎖が類似性を共有するため、所望の発現及び結合活性を確認するための日常的な試験を用いて、ＬＣ ＣＤＲのいずれかと対合され得る。しかしながら、いくつかの実施形態の重鎖と軽鎖との間の好ましい対合は、表２の右側の欄に示される。
いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＳＧＤＹＹＷＳ（配列番号４３８）の配列を含むＨＣ ＣＤＲ１、ＹＩＹＹＳＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号４５４）の配列を含むＨＣ ＣＤＲ２、及びＣＡＲＥＤＶＶＫＧＡＦＤＩＷ（配列番号５３３）の配列を含むＨＣ ＣＤＲ３、又はそれと比較して最大で１、２若しくは３個のアミノ酸置換、挿入、若しくは欠失を有するＣＤＲ配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＳＧＤＹＹＷＳ（配列番号４３８）の配列を含むＨＣ ＣＤＲ１、ＹＩＹＹＳＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号４５４）の配列を含むＨＣ ＣＤＲ２、及びＣＡＲＥＤＶＶＫＧＡＦＤＩＷ（配列番号５３３）の配列を含むＨＣ ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ（配列番号５３５）の配列を含むＬＣ ＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号５３９）の配列を含むＬＣ ＣＤＲ２、及びＱＱＳＹＳＴＰＬＴ（配列番号５４２）の配列を含むＬＣ ＣＤＲ３、又はそれと比較して最大で１、２若しくは３個のアミノ酸置換、挿入、若しくは欠失を有するＣＤＲ配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ（配列番号５３５）の配列を含むＬＣ ＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号５３９）の配列を含むＬＣ ＣＤＲ２、及びＱＱＳＹＳＴＰＬＴ（配列番号５４２）の配列を含むＬＣ ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＳＧＤＹＹＷＳ（配列番号４３８）の配列を含むＨＣ ＣＤＲ１、ＹＩＹＹＳＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号４５４）の配列を含むＨＣ ＣＤＲ２、ＣＡＲＥＤＶＶＫＧＡＦＤＩＷ（配列番号５３３）の配列を含むＨＣ ＣＤＲ３、ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ（配列番号５３５）の配列を含むＬＣ ＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号５３９）の配列を含むＬＣ ＣＤＲ２、及びＱＱＳＹＳＴＰＬＴ（配列番号５４２）の配列を含むＬＣ ＣＤＲ３、又はそれと比較して最大で１、２、若しくは３個のアミノ酸置換、挿入、若しくは欠失を有するＣＤＲ配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＳＧＤＹＹＷＳ（配列番号４３８）の配列を含むＨＣ ＣＤＲ１、ＹＩＹＹＳＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号４５４）の配列を含むＨＣ ＣＤＲ２、ＣＡＲＥＤＶＶＫＧＡＦＤＩＷ（配列番号５３３）の配列を含むＨＣ ＣＤＲ３、ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ（配列番号５３５）の配列を含むＬＣ ＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号５３９）の配列を含むＬＣ ＣＤＲ２、及びＱＱＳＹＳＴＰＬＴ（配列番号５４２）の配列を含むＬＣ ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、ＧＹＴＭＮ（配列番号４４８）、ＬＩＴＰＹＮＧＡＳＳＹＮＱＫＦＲＧ（配列番号４７０）及びＧＧＹＤＧＲＧＦＤＹ（配列番号５３４）の配列から選択されるＣＤＲを含む重鎖を含む。いくつかの実施形態において、重鎖は、ＧＹＴＭＮ（配列番号４４８）、ＬＩＴＰＹＮＧＡＳＳＹＮＱＫＦＲＧ（配列番号４７０）、及びＧＧＹＤＧＲＧＦＤＹ（配列番号５３４）の配列を含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号５３８）、ＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号５４１）、及びＱＱＷＳＧＹＰＬＴ（配列番号５４５）の配列から選択されるＣＤＲを含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖は、ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号５３８）、ＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号５４１）、及びＱＱＷＳＧＹＰＬＴ（配列番号５４５）の配列を含む。
ＭＳＬＮに特異的な抗原結合ドメインの例示的な重鎖及び軽鎖の配列を、以下の表３及び４に記載する。好ましい実施形態において、重鎖と対合した軽鎖が、表３の右側に示される。
Figure 2023538114000075
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いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、表３に記載の重鎖可変領域（ＶＨ）配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、表３に記載のＶＨと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨ配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、表４に記載の軽鎖可変領域（ＶＬ）配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、表４に記載の記載のＶＬと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＬ配列を含む。
いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、（ｉ）表２に記載のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、及びＨＣ ＣＤＲ３配列（例えば、表２のライン＃１、ライン＃２、ライン＃３のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、及びＨＣ ＣＤＲ３など）を含み、（ｉｉ）表３に記載のＶＨ配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨを含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、（ｉ）表２の１つのラインに記載のＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、及びＬＣ ＣＤＲ３配列（例えば、表２のラインＡ、ラインＢ、又はラインＣのＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、及びＬＣ ＣＤＲ３）、並びに表４に記載のＶＬ配列を含み、（ｉｉ）表４に記載の記載のＶＬと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、（ｉ）表３に記載のＶＨ配列、又は表３に記載のＶＨと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨ配列、及び（ｉｉ）表４に記載のＶＬ配列、又は表４に記載の記載のＶＬと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＬを含む。各場合において、ＶＨは、重鎖及び軽鎖が類似性を共有するため、所望の発現及び結合活性を確認するための日常的な試験を用いて、ＶＬのいずれかと対合され得るが、表３と表４との間の好ましい対合は、表４の＃欄に対応する、表３の「ＬＣ」欄に示される。
いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号２３３のＶＨ配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号２３３のＶＨ配列を含む。
いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号２７９のＶＬ配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号２７９のＶＬ配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号２３３のＶＨ配列、及び配列番号２７９のＶＬ配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＨ及びＶＬは、リンカー、例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号１５２）の配列を含むリンカーについて分離される。ＶＨ及びＶＬは、任意の配向、例えば、ＶＨ、リンカー、ＶＬ、又は代替的に、ＶＬ、リンカーＶＨであり得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される抗原結合ドメインのＣＤＲ中の１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、又は６個）のアミノ酸残基は、別のアミノ酸で置換される。置換は、アミノ酸の同じファミリー内の置換であるという意味で「保存的」であり得る。天然に存在するアミノ酸は、以下の４つのファミリーに分割され得、保存的置換はそれらのファミリー内で行われる。（１）塩基性側鎖を有するアミノ酸：リジン、アルギニン、ヒスチジン；（２）酸性側鎖を有するアミノ酸：アスパラギン酸、グルタミン酸；（３）非荷電極性側鎖を有するアミノ酸：アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン；及び（４）非極性側鎖を有するアミノ酸：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システイン。抗体のＣＤＲのアミノ酸配列を、アミノ酸の付加、欠失又は置換によって変化させることにより、標的抗原に対する結合親和性の増加などの様々な効果が得られ得る。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
本開示は、第１の活性化因子受容体、及びそれを含む免疫細胞を提供する。いくつかの実施形態において、第１の受容体は、キメラ抗原受容体である。
本明細書で使用される場合、「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」という用語は、Ｔ細胞受容体に由来する人工受容体を指すことができ、特定の免疫エフェクター細胞に人工特異性を移植する操作された受容体を包含する。ＣＡＲは、Ｔ細胞にモノクローナル抗体の特異性を付与するために用いられてもよく、それによって、例えば、養子細胞療法での使用のために、多数の特異的Ｔ細胞が生成されることが可能になる。特定の実施形態において、ＣＡＲは、例えば、腫瘍関連抗原に対する細胞の特異性を指示する。例示的なＣＡＲは、細胞内活性化ドメイン、膜貫通ドメイン、及び腫瘍関連抗原結合領域を含む細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ヒンジドメインを更に含む。特定の態様において、ＣＡＲは、ＣＤ３膜貫通ドメイン及びエンドドメインに融合した、モノクローナル抗体に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の融合を含む。他のＣＡＲ設計の特異性は、受容体のリガンド（例えば、ペプチド）に由来し得る。ある特定の場合において、ＣＡＲは、ＣＤ３、４－１ＢＢ、ＦｃＲ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＤＡＰ１０、及び／又はＯＸ４０などの追加の共刺激シグナル伝達のためのドメインを含む。ある場合には、分子は、共刺激分子、イメージングのためのレポーター遺伝子、プロドラッグの添加時にＴ細胞を条件付きで除去する遺伝子産物、ホーミング受容体、サイトカイン、及びサイトカイン受容体を含む、ＣＡＲと同時発現され得る。
いくつかの実施形態において、第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＣＡＲの細胞外ドメインに融合される。
いくつかの実施形態において、本開示のＣＡＲは、細胞外ヒンジ領域を含む。ヒンジ領域の組み込みは、ＣＡＲ－Ｔ細胞からのサイトカイン産生に影響を及ぼし、インビボでのＣＡＲ－Ｔ細胞の拡大を改善することができる。例示的なヒンジは、ＩｇＤ及びＣＤ８ドメイン、例えば、ＩｇＧ１から単離又は派生され得る。いくつかの実施形態において、ヒンジは、ＣＤ８α又はＣＤ２８から単離されるか、又は派生される。
いくつかの実施形態において、ヒンジは、ＣＤ８α又はＣＤ２８から単離されるか、又は派生される。いくつかの実施形態において、ＣＤ８αヒンジは、ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ（配列番号７）の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ８αヒンジは、配列番号７を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ８αヒンジは、配列番号７から本質的になる。いくつかの実施形態において、ＣＤ８αヒンジは、ＡＣＣＡＣＧＡＣＧＣＣＡＧＣＧＣＣＧＣＧＡＣＣＡＣＣＡＡＣＡＣＣＧＧＣＧＣＣＣＡＣＣＡＴＣＧＣＧＴＣＧＣＡＧＣＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＣＧＣＣＣＡＧＡＧＧＣＧＴＧＣＣＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＧＧＧＧＧＣＧＣＡＧＴＧＣＡＣＡＣＧＡＧＧＧＧＧＣＴＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＴＧＴＧＡＴ（配列番号８）の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＣＤ８αヒンジは、配列番号８によってコードされる。
いくつかの実施形態において、ＣＤ２８ヒンジは、ＣＴＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号９）の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８ヒンジは、配列番号９を含むか、又はそれから本質的になる。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８ヒンジは、ＴＧＴＡＣＣＡＴＴＧＡＡＧＴＴＡＴＧＴＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＡＣＣＴＡＧＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＡＡＣＣＡＴＴＡＴＣＣＡＴＧＴＧＡＡＡＧＧＧＡＡＡＣＡＣＣＴＴＴＧＴＣＣＡＡＧＴＣＣＣＣＴＡＴＴＴＣＣＣＧＧＡＣＣＴＴＣＴＡＡＧＣＣＣ（配列番号１０）の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８ヒンジは、配列番号１０によってコードされる。
本開示のＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインに融合される膜貫通ドメインを含むように設計され得る。いくつかの実施形態において、ＣＡＲにおけるドメインのうちの１つと自然に会合する膜貫通ドメインが使用される。例えば、ＣＤ２８共刺激ドメインを含むＣＡＲはまた、ＣＤ２８膜貫通ドメインを使用してもよい。いくつかの場合において、膜貫通ドメインは、同じ又は異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのそのようなドメインの結合を避け、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるために、アミノ酸置換によって選択又は修飾され得る。
膜貫通ドメインは、天然又は合成源のいずれかに由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質に由来し得る。膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４のアルファ、ベータ、若しくはゼータ鎖、又はＩｇＧ４などの免疫グロブリンから単離されてもよいか、又は派生されてもよい（すなわち、それらの少なくとも膜貫通領域を含む）。代替的に、膜貫通ドメインは合成であってもよく、その場合、ロイシン及びバリンなどの主に疎水性残基を含む。いくつかの実施形態において、フェニルアラニン、トリプトファン、及びバリンのトリプレットは、合成膜貫通ドメインの各末端に見出される。任意選択で、好ましくは２～１０アミノ酸長の短いオリゴリンカー又はポリペプチドリンカーが、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインとの間に結合を形成してもよい。グリシン－セリンダブレットは、特に好適なリンカーを提供する。
本開示のＣＡＲのいくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ２８膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ（配列番号１１）の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号１１を含むか、又はそれから本質的になる。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、ＴＴＣＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＣＧＴＴＧＴＧＧＧＣＧＧＣＧＴＧＣＴＧＧＣＣＴＧＣＴＡＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＴＣＡＴＣＡＴＣＴＴＴＴＧＧＧＴＧ（配列番号１２）の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号１２によってコードされる。
本開示のＣＡＲのいくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ＩＬ－２Ｒベータ膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２Ｒベータ膜貫通ドメインは、ＩＰＷＬＧＨＬＬＶＧＬＳＧＡＦＧＦＩＩＬＶＹＬＬＩ（配列番号１３）の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２Ｒベータ膜貫通ドメインは、配列番号１３を含むか、又はそれから本質的になる。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２Ｒベータ膜貫通ドメインは、
Figure 2023538114000082
 （配列番号１４）の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２Ｒベータ膜貫通ドメインは、配列番号１４によってコードされる。
本開示のＣＡＲの細胞質ドメイン、又はそうでなければ、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが配置されている免疫細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも１つの活性化を担う。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特殊化された機能を指す。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを形質導入し、細胞に特殊化された機能を実行させるタンパク質の部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体を用いることができるが、多くの場合、ドメイン全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分が使用される範囲で、そのような切断部分は、エフェクター機能シグナルを形質導入する限り、インタクトな鎖の代わりに使用されてもよい。ある場合には、複数の細胞内ドメインを組み合わせて、本開示のＣＡＲ－Ｔ細胞の所望の機能を達成することができる。したがって、細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを形質導入するのに十分な１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインの任意の切断部分を含むことを意味する。
本開示のＣＡＲにおいて使用するための細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の細胞質配列、及び抗原受容体関与後のシグナル伝達を開始するために協調的に作用する共受容体、並びにこれらの配列の任意の誘導体又はバリアント、及び同じ機能的能力を有する任意の合成配列が挙げられる。
したがって、本開示のＣＡＲの細胞内ドメインは、少なくとも１つの細胞質活性化ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内活性化ドメインは、ＣＡＲ Ｔ細胞のエフェクター機能を活性化するのに必要なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達が存在することを確実にする。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの細胞質活性化は、ＣＤ２４７分子（ＣＤ３ζ）活性化ドメイン、刺激性キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）ＫＩＲ２ＤＳ２活性化ドメイン、又は１２ｋＤａ（ＤＡＰ１２）活性化ドメインのＤＮＡＸ活性化タンパク質である。
いくつかの実施形態において、ＣＤ３ζ活性化ドメインは、ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＫＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号１５）の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＤ３ζ活性化ドメインは、配列番号１５を含むか、又はそれから本質的になる。いくつかの実施形態において、ＣＤ３ζ活性化ドメインは、ＡＧＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＧＡＣＧＣＣＣＣＣＧＣＧＴＡＣＡＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＣＴＡＴＡＡＣＧＡＧＣＴＣＡＡＴＣＴＡＧＧＡＣＧＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＴＧＴＴＴＴＧＧＡＣＡＡＧＣＧＴＡＧＡＧＧＣＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＧＧＧＡＡＡＧＣＣＧＡＧＡＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＴＡＡＧＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＴＧＡＧＡＴＴＧＧＧＡＴＧＡＡＡＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＧＡＧＧＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＡＣＧＡＴＧＧＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＧＧＡＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＣＴＴＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＣＧＣ（配列番号１６）の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＣＤ３ζ活性化ドメインは、配列番号１６によってコードされる）。
ＴＣＲのみを通じて生成されるシグナルは、多くの場合、Ｔ細胞の完全な活性化には不十分であり、二次又は共刺激シグナルもまた必要であることが知られている。したがって、Ｔ細胞活性化は、２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列である、ＴＣＲを介して抗原依存性の一次活性化を開始するもの（一次細胞質シグナル伝達配列）、及び二次又は共刺激シグナルを提供するために抗原非依存的に作用するもの（二次細胞質シグナル伝達配列）によって媒介されると言うことができる。
一次細胞質シグナル伝達配列は、刺激的な方式、又は抑制的な方式のいずれかでＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する。刺激的な様式で作用する一次細胞質シグナル配列は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ又はＩＴＡＭとして知られているシグナル伝達モチーフを含有し得る。いくつかの実施形態において、ＩＴＡＭは、任意の２つの他のアミノ酸（ＹｘｘＬ／Ｉ（配列番号５４６））によってロイシン又はイソロイシンから分離されたチロシンを含有する。いくつかの実施形態において、細胞質ドメインは、１、２、３、４、又は５個のＩＴＡＭを含有する。例示的なＩＴＡＭ含有細胞質ドメインは、ＣＤ３ζ活性化ドメインである。本開示のＣＡＲに使用され得る一次細胞質シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭの更なる例としては、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。
いくつかの実施形態において、単一のＩＴＡＭを含むＣＤ３ζ活性化ドメインは、ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号１７）の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ３ζ活性化ドメインは、配列番号１７を含む。いくつかの実施形態において、単一のＩＴＡＭを含むＣＤ３ζ活性化ドメインは、ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号１７）のアミノ酸配列から本質的になる。いくつかの実施形態において、単一のＩＴＡＭを含むＣＤ３ζ活性化ドメインは、
Figure 2023538114000083
 （配列番号１８）の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＣＤ３ζ活性化ドメインは、配列番号１８によってコードされる。
いくつかの実施形態において、ＣＡＲの細胞質ドメインは、それ自体でＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むか、又は本開示のＣＡＲの文脈において有用な任意の他の所望の細胞質ドメインと組み合わせるように設計され得る。例えば、ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ζ鎖部分及び共刺激ドメインを含むことができる。共刺激ドメインとは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部分を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要とされる、抗原受容体又はそのリガンド以外の細胞表面分子である。そのような分子の例としては、共刺激ドメインが挙げられ、その共刺激ドメインは、ＩＬ－２Ｒβ、Ｆｃ受容体ガンマ（ＦｃＲγ）、Ｆｃ受容体ベータ（ＦｃＲβ）、ＣＤ３ｇ分子ガンマ（ＣＤ３γ）、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５分子（ＣＤ５）、ＣＤ２２分子（ＣＤ２２）、ＣＤ７９ａ分子（ＣＤ７９ａ）、ＣＤ７９ｂ分子（ＣＤ７９ｂ）、がん胎児抗原関連細胞接着分子３（ＣＤ６６ｄ）、ＣＤ２７分子（ＣＤ２７）、ＣＤ２８分子（ＣＤ２８）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー９（４－１ＢＢ）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー４（ＯＸ４０）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー８（ＣＤ３０）、ＣＤ４０分子（ＣＤ４０）、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）、誘導性Ｔ細胞共刺激（ＩＣＯＳ）、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２分子（ＣＤ２）、ＣＤ７分子（ＣＤ７）、ＴＮＦスーパーファミリーメンバー１４（ＬＩＧＨＴ）、キラー細胞レクチン様受容体Ｃ２（ＮＫＧ２Ｃ）、及びＣＤ２７６分子（Ｂ７－Ｈ３）ｃ－刺激ドメイン、又はそれらの機能的バリアントからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、本開示のＣＡＲの細胞内ドメインは、少なくとも１つの共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態において、共刺激ドメインは、ＣＤ２８から単離されるか、又は派生される。
いくつかの実施形態において、本開示のＣＡＲの細胞内ドメインは、少なくとも１つの共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態において、共刺激ドメインは、ＣＤ２８から単離されるか、又は派生される。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８共刺激ドメインは、ＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ（配列番号１９）の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８共刺激ドメインは、配列番号１９を含むか、又はそれから本質的になる。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８共刺激ドメインは、ＡＧＧＡＧＣＡＡＧＣＧＧＡＧＣＡＧＡＣＴＧＣＴＧＣＡＣＡＧＣＧＡＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴＧＡＣＣＣＣＣＣＧＧＡＧＧＣＣＴＧＧＣＣＣＣＡＣＣＣＧＧＡＡＧＣＡＣＴＡＣＣＡＧＣＣＣＴＡＣＧＣＣＣＣＴＣＣＣＡＧＧＧＡＴＴＴＣＧＣＣＧＣＣＴＡＣＣＧＧＡＧＣ（配列番号２０）の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８共刺激ドメインは、配列番号２０によってコードされる。
いくつかの実施形態において、共刺激ドメインは、４－１ＢＢから単離されるか、又は派生される。いくつかの実施形態において、４－１ＢＢ共刺激ドメインは、ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号２８３）の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、４－１ＢＢ共刺激ドメインは、ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号２８３）を含むか、又はそれから本質的になる。いくつかの実施形態において、４－１ＢＢ共刺激ドメインは、ＡＡＡＣＧＧＧＧＣＡＧＡＡＡＧＡＡＡＣＴＣＣＴＧＴＡＴＡＴＡＴＴＣＡＡＡＣＡＡＣＣＡＴＴＴＡＴＧＡＧＧＣＣＡＧＴＡＣＡＡＡＣＴＡＣＴＣＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＴＧＴＡＧＣＴＧＣＣＧＡＴＴＴＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＴＧＴＧＡＡＣＴＧ（配列番号２８４）の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるヌクレオチド配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ２８共刺激ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζ活性化ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＫＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号２８５）の配列、又はそれと少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。
本開示のＣＡＲの細胞質シグナル伝達部分内の細胞質ドメインは、ランダム又は指定された順序で互いに連結され得る。任意選択で、例えば、２～１０アミノ酸長の短いオリゴリンカー又はポリペプチドリンカーが、連結を形成してもよい。グリシン－セリンダブレットは、好適なリンカーの一例を提供する。例示的なリンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号１５２）の配列を含む。
本開示のＣＡＲの細胞質シグナル伝達部分内の細胞質ドメインは、ランダム又は指定された順序で互いに連結され得る。任意選択で、例えば、２～１０アミノ酸長の短いオリゴリンカー又はポリペプチドリンカーが、連結を形成してもよい。グリシン－セリンダブレットは、好適なリンカーの一例を提供する。本開示の例示的な全長活性化因子受容体は、表２０に記載される。いくつかの実施形態において、第１の活性化因子受容体は、表２０に記載の配列番号２８６～３４７の配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の活性化因子受容体は、表２０に記載の配列番号２８６～３４７の配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の活性化因子受容体は、配列番号２８８の配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の活性化因子受容体は、配列番号２９７の配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の活性化因子受容体は、配列番号３０１の配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の活性化因子受容体は、配列番号３０２の配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の活性化因子受容体は、配列番号３０３の配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の活性化因子受容体は、配列番号３１４の配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の活性化因子受容体は、配列番号３３５の配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の活性化因子受容体は、配列番号３４０の配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の活性化因子受容体は、配列番号３４４の配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。
本開示のＣＡＲの細胞質シグナル伝達部分内の細胞質ドメインは、ランダム又は指定された順序で互いに連結され得る。任意選択で、例えば、２～１０アミノ酸長の短いオリゴリンカー又はポリペプチドリンカーが、連結を形成してもよい。グリシン－セリンダブレットは、好適なリンカーの一例を提供する。
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
本開示は、第１の活性化因子受容体、及びそれを含む免疫細胞を提供する。いくつかの実施形態において、第１の受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）である。
本明細書で使用される場合、「ＴＣＲ複合体」又は「ＴＣＲ／ＣＤ３複合体」と呼ばれることもある「ＴＣＲ」は、サブユニットと称されることもある、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、及びインバリアントＣＤ３鎖（ゼータ、ガンマ、デルタ、及びイプシロン）のうちの１つ以上を含むタンパク質複合体を指す。ＴＣＲアルファ鎖及びベータ鎖は、ペプチド－ＭＨＣ複合体に結合するヘテロ二量体として機能するようにジスルフィド結合され得る。ＴＣＲアルファ／ベータヘテロ二量体がペプチド－ＭＨＣに関与すると、関連するインバリアントＣＤ３サブユニット内のＴＣＲ複合体における立体構造変化が誘導され、これが、それらのリン酸化及び下流タンパク質との会合をもたらし、それによって一次刺激シグナルを形質導入する。例示的なＴＣＲ複合体では、ＴＣＲアルファ及びＴＣＲベータポリペプチドは、ヘテロ二量体を形成し、ＣＤ３イプシロン及びＣＤ３デルタは、ヘテロ二量体を形成し、ヘテロ二量体のためのＣＤ３イプシロン及びＣＤ３ガンマ、並びに２つのＣＤ３ゼータは、ホモ二量体を形成する。
任意の好適なリガンド結合ドメインは、本明細書に記載のＴＣＲの細胞外ドメイン、ヒンジドメイン又は膜貫通に融合され得る。例えば、リガンド結合ドメインは、抗体若しくはＴＣＲの抗原結合ドメインであってもよく、又は抗体断片、Ｖβのみのドメイン、直鎖抗体、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、若しくは単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含んでもよい。
いくつかの実施形態において、リガンド結合ドメインは、１つ以上のＴＣＲサブユニットの１つ以上の細胞外ドメイン又は膜貫通ドメインに融合される。ＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ又はＣＤ３ゼータであってもよい。例えば、リガンド結合ドメインは、ＴＣＲアルファ、若しくはＴＣＲベータに融合され得るか、又はリガンド結合の部分は、２つのサブユニットに融合され得、例えば、リガンド結合ドメインの部分は、ＴＣＲアルファ及びＴＣＲベータの両方に融合され得る。
ＴＣＲサブユニットには、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ガンマ、及びＣＤ３イプシロンが含まれる。ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、若しくはＣＤ３ゼータ、又はそれらの断片若しくは誘導体のうちのいずれか１つ以上は、本開示の刺激シグナルを提供することができる１つ以上のドメインに融合され得、それによって、ＴＣＲ機能及び活性が増強される。
任意の供給源から単離又は派生されるＴＣＲ膜貫通ドメインは、本開示の範囲内として想定される。膜貫通ドメインは、天然又は組換え源のいずれかに由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質に由来し得る。
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＴＣＲ複合体が標的に結合しているときはいつでも、細胞内ドメインにシグナル伝達することができる。本開示における特定の使用の膜貫通ドメインは、例えば、ＴＣＲ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン又はＣＤ３ガンマ、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４のアルファ、ベータ、又はゼータ鎖の膜貫通領域を少なくとも含み得る。
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ヒンジ、例えば、ヒトタンパク質由来のヒンジを介して、ＴＣＲのポリペプチドの細胞外領域、例えば、ＴＣＲアルファ又はベータ鎖の抗原結合ドメインに結合することができる。例えば、ヒンジは、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）ヒンジ、例えば、ＩｇＧ４ヒンジ、又はＣＤ８ａヒンジであってもよい。いくつかの実施形態において、ヒンジは、ＣＤ８α又はＣＤ２８から単離されるか、又は派生される。
いくつかの実施形態において、細胞外リガンド結合ドメインは、ＴＣＲの１つ以上の膜貫通ドメインに結合される。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＴＣＲアルファ膜貫通ドメイン、ＴＣＲベータ膜貫通ドメイン、又はその両方を含む。いくつかの実施形態において、膜貫通は、ＣＤ３ゼータ膜貫通ドメインを含む。
膜貫通ドメインは、膜貫通領域に隣接する１つ以上の追加のアミノ酸、例えば、膜貫通が由来したタンパク質の細胞外領域と会合する１つ以上のアミノ酸（例えば、細胞外領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は最大１５個のアミノ酸）、及び／又は膜貫通タンパク質が由来するタンパク質の細胞内領域と会合する１つ以上の追加のアミノ酸（例えば、細胞内領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は最大１５個のアミノ酸）を含み得る。
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、同じ又は異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのそのようなドメインの結合を避け、例えば、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるために、アミノ酸置換によって選択又は修飾され得る。
存在する場合、膜貫通ドメインは、天然ＴＣＲ膜貫通ドメイン、異種膜タンパク質由来の天然膜貫通ドメイン、又は人工膜貫通ドメインであってもよい。膜貫通ドメインは、膜アンカードメインであってもよい。限定されないが、天然又は人工膜貫通ドメインは、多くの場合、膜貫通セグメントに隣接する正電荷を有する、約２０個のアミノ酸の疎水性ａ－ヘリックスを含み得る。膜貫通ドメインは、１つの膜貫通セグメント又は２つ以上の膜貫通セグメントを有し得る。膜貫通ドメイン／セグメントの予測は、公開されている予測ツールを使用して作製され得る（例えば、ＴＭＨＭＭ，Ｋｒｏｇｈ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００１；３０５（３）：５６７－５８０、又はＴＭｐｒｅｄ，Ｈｏｆｍａｎｎ ＆ Ｓｔｏｆｆｅｌ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ－Ｓｅｙｌｅｒ １９９３；３４７：１６６）。膜アンカー系の非限定的な例としては、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）膜貫通ドメイン、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー（シグナル配列に翻訳後付加される）などが挙げられる。
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＴＣＲアルファ膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲアルファ膜貫通ドメインは、ＶＩＧＦＲＩＬＬＬＫＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬＲＬＷ（配列番号２１）の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲアルファ膜貫通ドメインは、配列番号２１を含むか、又はそれから本質的になる。いくつかの実施形態において、ＴＣＲアルファ膜貫通ドメインは、ＧＴＧＡＴＴＧＧＧＴＴＣＣＧＡＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＧＡＡＡＧＴＧＧＣＣＧＧＧＴＴＴＡＡＴＣＴＧＣＴＣＡＴＧＡＣＧＣＴＧＣＧＧＣＴＧＴＧＧ（配列番号２２）の配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＴＣＲベータ膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲベータ膜貫通ドメインは、ＴＩＬＹＥＩＬＬＧＫＡＴＬＹＡＶＬＶＳＡＬＶＬ（配列番号２３）の配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、又はそれと同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲベータ膜貫通ドメインは、配列番号２３を含むか、又はそれから本質的になる。いくつかの実施形態において、ＴＣＲベータ膜貫通ドメインは、ＡＣＣＡＴＣＣＴＣＴＡＴＧＡＧＡＴＣＴＴＧＣＴＡＧＧＧＡＡＧＧＣＣＡＣＣＴＴＧＴＡＴＧＣＣＧＴＧＣＴＧＧＴＣＡＧＴＧＣＣＣＴＣＧＴＧＣＴＧ（配列番号２４）の配列によってコードされる。
本開示のＴＣＲは、１つ以上の細胞内ドメインを含むことができる。本開示で使用するための細胞内ドメインを含む例示的なＴＣＲは、２０２０年９月６日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０４５２５０に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、膜貫通ドメインに刺激シグナルを提供することができる１つ以上のドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、刺激シグナルを提供することができる第１の細胞内ドメイン、及び刺激シグナルを提供することができる第２の細胞内ドメインを含む。他の実施形態において、細胞内ドメインは、刺激シグナルを提供することができる第１、第２及び第３の細胞内ドメインを含む。刺激シグナルを提供することができる細胞内ドメインは、ＣＤ２８分子（ＣＤ２８）ドメイン、ＬＣＫがん原遺伝子、Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ（Ｌｃｋ）ドメイン、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー９（４－１ＢＢ）ドメイン、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１８（ＧＩＴＲ）ドメイン、ＣＤ４分子（ＣＤ４）ドメイン、ＣＤ８ａ分子（ＣＤ８ａ）ドメイン、ＦＹＮがん原遺伝子、Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ（Ｆｙｎ）ドメイン、Ｔ細胞受容体関連タンパク質キナーゼ７０（ＺＡＰ７０）ドメインのゼータ鎖、Ｔ細胞（ＬＡＴ）ドメインの活性化のためのリンカー、リンパ球細胞質タンパク質２（ＳＬＰ７６）ドメイン、（ＴＣＲ）アルファ、ＴＣＲベータ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ガンマ、及びＣＤ３イプシロン細胞内ドメインからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、機能細胞、例えば、ＴＣＲ含有細胞、例えば、ＴＣＲ発現Ｔ細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成する。いくつかの実施形態において、本開示の第１の受容体の細胞内ドメインは、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。例えば、ＣＤ３ガンマ、デルタ、又はイプシロンの細胞内ドメインは、シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインは、同じタンパク質、例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ、ＴＣＲベータ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３イプシロン又はＣＤ３ゼータから単離されるか、又はそれらから派生される。
本開示の活性化因子受容体において使用するための細胞内ドメインの例としては、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＣＤ３ゼータ、及び４－１ＢＢの細胞質配列、並びに抗原受容体関与後のシグナル伝達を開始するために協調して作用する細胞内シグナル伝達共受容体、並びにこれらの配列の任意の誘導体又はバリアント、及び同じ機能的能力を有する任意の組換え配列が挙げられる。
いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。例示的な一次細胞内シグナル伝達ドメインには、一次刺激、又は抗原依存性刺激を担うタンパク質に由来するものが含まれる。
いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＣＤ３デルタ細胞内ドメイン、ＣＤ３イプシロン細胞内ドメイン、ＣＤ３ガンマ細胞内ドメイン、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメイン、ＴＣＲアルファ細胞内ドメイン、又はＴＣＲベータ細胞内ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＴＣＲアルファ細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲアルファ細胞内ドメインは、Ｓｅｒ－Ｓｅｒを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲアルファ細胞内ドメインは、ＴＣＣＡＧＣの配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＴＣＲベータ細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲベータ細胞内ドメインは、ＭＡＭＶＫＲＫＤＳＲ（配列番号２５）の配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性を有するか、又はそれと同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲベータ細胞内ドメインは、配列番号２５を含むか、又はそれから本質的になる。いくつかの実施形態において、ＴＣＲベータ細胞内ドメインは、ＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＴＣＡＡＧＡＧＡＡＡＧＧＡＴＴＣＣＡＧＡ（配列番号２６）の配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、少なくとも１つの刺激性細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ガンマ及びＣＤ３イプシロン細胞内ドメインなどの一次細胞内シグナル伝達ドメイン、並びに１つの追加の刺激性細胞内ドメイン、例えば、共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ガンマ及びＣＤ３イプシロン細胞内ドメインなどの一次細胞内シグナル伝達ドメイン、並びに２つの追加の刺激性細胞内ドメインを含む。
例示的な共刺激性細胞内シグナル伝達ドメインには、共刺激性シグナル、又は抗原非依存性刺激を担うタンパク質に由来するものが含まれる。共刺激分子には、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、並びにＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ３０、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）４－１ＢＢ（ＣＤ１３７、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー９）、及びＣＤ２８分子（ＣＤ２８）が含まれるが、これらに限定されない。共刺激タンパク質は、以下のタンパク質ファミリーに表され得る：ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、及びＮＫ細胞活性化受容体。このような分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３、ＣＤ４と特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。共刺激ドメインは、それが由来する分子の細胞内部分全体、若しくは天然の細胞内シグナル伝達ドメイン全体、又はそれらの機能的バリアントを含むことができる。
いくつかの実施形態において、刺激ドメインは、共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態において、共刺激ドメインは、ＣＤ２８又は４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む。ＣＤ２８及び４－１ＢＢは、完全なＴ細胞活性化に必要な十分に特徴付けられた共刺激分子であり、Ｔ細胞エフェクター機能を増強することが知られている。例えば、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインのみを含有する第１世代のＣＡＲにわたるサイトカインの放出、細胞溶解機能、及び持続性を強化するために、ＣＤ２８及び４－１ＢＢがキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）において利用されている。同様に、ＴＣＲに共刺激ドメイン、例えば、ＣＤ２８及び４－１ＢＢドメインを含めることにより、Ｔ細胞エフェクター機能を増加させることができ、典型的には、腫瘍細胞の表面上で下方制御される共刺激リガンドの不在下での共刺激を特異的に可能にすることができる。いくつかの実施形態において、刺激ドメインは、ＣＤ２８細胞内ドメイン又は４－１ＢＢ細胞内ドメインを含む。
抑制性受容体
本開示は、がん細胞、例えば、遺伝子の対立遺伝子バリアントにおいて喪失している非標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む、第２の受容体を提供する。非標的対立遺伝子バリアントは、限定されないが、非標的対立遺伝子バリアントの発現に影響を及ぼすエピジェネティック変化、非標的対立遺伝子バリアントをコードする遺伝子に対する変異、非標的対立遺伝子バリアントの発現を調節する細胞シグナル伝達の破壊、染色体消失、ゲノム遺伝子座の部分的若しくは完全な欠失、核酸若しくはヘテロクロマチンの修飾による遺伝子サイレンシング、又は他の機構による発現の喪失などの任意の機構を通してがん細胞内で喪失され得る。本明細書に開示される組成物及び方法の変形例において、処理された細胞又は対象は、非遺伝的変化のために非標的対立遺伝子バリアントの発現の喪失を示し得る。したがって、本開示は、ヘテロ接合性の喪失を含むが、これに限定されない任意の原因からの非標的抗原の発現を欠く細胞を死滅させる、かつ／又は対象を治療するための組成物及び方法を提供する。
非標的抗原は、主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体におけるタンパク質、又はその抗原ペプチドであってもよく、非標的抗原は多型を含む。非標的抗原は多型であるため、がん細胞内のヘテロ接合性の喪失によって生じ得る、非標的抗原をコードする遺伝子の単一コピーの喪失は、遺伝子の他の多型バリアントを保持するが、非標的抗原を喪失したがん細胞を生じる。例えば、ＨＬＡ遺伝子座にＨＬＡ－Ａ＊０２及びＨＬＡ－Ａ＊０１対立遺伝子を有する対象は、ＨＬＡ－Ａ＊０２対立遺伝子のみが喪失されるがんを有し得る。このような対象において、ＨＬＡ－Ａ＊０１タンパク質は依然として存在するが、抑制因子受容体が、ＨＬＡ－Ａ＊０２（又は他の非標的抗原）に特異的であるように設計されているため、がん細胞に遭遇する免疫細胞の抑制性受容体によって認識されない。正常な非悪性細胞において、ＨＬＡ－Ａ＊０２（又は他の非標的抗原）が存在し、操作された免疫細胞の活性化を阻害する。ヘテロ接合性の喪失を有するがん細胞において、ＨＬＡ－Ａ＊０２対立遺伝子バリアント（又は他の非標的抗原）が喪失される。抑制性受容体は、がん細胞には存在しないＨＬＡ－Ａ＊０２（又は他の非標的抗原）にのみ応答するため、抑制性受容体を発現するように操作された免疫細胞は、抑制性受容体から抑制シグナルを受け取らない。この機構によって、免疫細胞は、選択的に活性化され、ＭＳＬＮを発現するが、ヘテロ接合性の喪失によりＨＬＡ－Ａ＊０２（又は別の非標的抗原）を喪失しているがん細胞を選択的に死滅させる。本明細書では、ＨＬＡ－Ａを例として使用する。同様の多型変異は、他のＭＨＣ遺伝子の集団においても、また他の非ＭＨＣ遺伝子においても生じる。したがって、本開示は、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ１）、カテコール－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカインリガンド１６（ＣＸＣＬ１６）、ロイシンリッチリピートニューロナル４（ＬＲＲＮ４）及びウロプラキン３Ｂ（ＵＰＫ３Ｂ）から選択される非標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメイン、又は主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体におけるそれらの抗原ペプチドを含む、第２の受容体を提供し、非標的抗原は、非同義の細胞外ドメイン多型（例えば、ＩＣＡＭ１、ＣＯＭＴ、ＣＸＣＬ１６の細胞外ドメインにおける）、及びそれらを含む免疫細胞を含み得る。いくつかの実施形態において、第２の受容体は、抑制性キメラ抗原受容体である。代替的に、非標的抗原は、発現が腫瘍内で喪失されるが、重要なＭＳＬＮ発現正常組織（例えば、ＬＲＲＮ４、ＵＰＫ３Ｂ）に存在するタンパク質を含んでもよい。
例示的な抑制性受容体は、２０２０年９月６日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０４５２２８、２０２０年１２月１１日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０６４６０７、２０２１年４月２９日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０２９９０７、及び２０２０年１１月１０日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０５９８５６に記載されており、これらの各々の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、第２の受容体は、ヒト化される。
本開示は、非標的抗原の単一アミノ酸バリアント対立遺伝子を区別することができる細胞外リガンド結合を含む、抑制性受容体である、第２の受容体を提供する。非標的抗原の対立遺伝子バリアントを区別するこの能力は、第２の受容体が、リガンド結合ドメインによって認識される対立遺伝子を発現する非標的細胞の存在下で、第２の受容体を含む免疫細胞の活性化を抑制することを可能にする。しかしながら、免疫細胞の活性化は、対立遺伝子を喪失した標的細胞、例えば、ヘテロ接合性の喪失により遺伝子の１つの対立遺伝子を喪失したがん細胞の存在下では抑制されない。
本開示は、非標的抗原の異なるレベルの発現を区別することができる細胞外リガンド結合を含む、抑制性受容体である、第２の受容体を提供する。これにより、第２の受容体が、第２の受容体に対するリガンドを発現する非標的細胞の存在下で第２の受容体を含む免疫細胞の活性化を抑制することを可能にするが、第２の受容体に対するリガンドの低いレベルを発現するか、又は発現しないがん細胞の存在下での免疫細胞の活性化を可能にする。
抑制因子リガンド
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、標的細胞によって発現されず、非標的細胞によって発現される。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、健常な細胞、すなわち、がん細胞ではない細胞によって発現される。いくつかの実施形態において、標的細胞は、ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）を通じて非標的抗原の発現を喪失した複数のがん細胞である。いくつかの実施形態において、非標的細胞は、標的及び非標的抗原の両方を発現する、複数の健常な細胞（すなわち、非がん細胞）である。
標的細胞によって発現されない、非標的細胞によって発現される任意の細胞表面分子は、第２の受容体細胞外リガンド結合ドメインに好適な非標的抗原であり得る。例えば、細胞接着分子、細胞間シグナル伝達分子、細胞外ドメイン、走化性に関与する分子、糖タンパク質、Ｇタンパク質共役受容体、膜貫通、神経伝達物質のための受容体、又は電圧依存性イオンチャネルを、非標的抗原として使用することができる。
いくつかの実施形態において、標的抗原は、主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体におけるがん細胞特異的抗原のペプチド抗原である。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ヘテロ接合性の喪失に起因してがん細胞内で喪失される。ヘテロ接合性の喪失によりがん細胞内で喪失した例示的な非標的抗原には、ＩＣＡＭ１、ＣＯＭＴ及びＣＸＣＬ１６が含まれる。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＩＣＡＭ１、ＣＯＭＴ及びＣＸＣＬ１６の多型バリアントからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体におけるＩＣＡＭ１、ＣＯＭＴ、又はＣＸＣＬ１６の多型残基を含む抗原ペプチドである。
ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、又はＨＬＡ－Ｅのいずれかを含む非標的主要組織適合性複合体クラスＩ ＭＨＣ－Ｉ（又はｐＭＨＣ－Ｉ）抗原は、本開示の範囲内であると想定される。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ＭＨＣはＭＨＣクラスＩである。いくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩタンパク質は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、又はＨＬＡ－Ｅからなる群から選択されるＨＬＡクラスＩタンパク質の対立遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０３、又はＨＬＡ－Ａ＊１１を含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ｂ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊０７を含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｃ＊０７を含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａの対立遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａの対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０３、又はＨＬＡ－Ａ＊１１を含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊６９を含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ヒト白血球抗原Ａ＊０２対立遺伝子（ＨＬＡ－Ａ＊０２）を含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ｂの対立遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ｂの対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊０７を含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ｃを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｃ＊０７を含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＭＨＣ－Ｉとの複合体におけるＩＣＡＭ１又はその抗原ペプチドを含む。ヒトＩＣＡＭ１は、がん細胞においてＬＯＨを介して頻繁に喪失される。
野生型ヒトＩＣＡＭ１は、ＮＣＢＩ記録番号ＮＰ＿０００１９２．２に記載されており、その内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ＩＣＡＭ１は、
Figure 2023538114000084
 （配列番号２７）のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＩＣＡＭ１は、配列番号２７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。ＩＣＡＭ１の多型残基は、配列番号２７に太字としてマークされ、下線が引かれている。例えば、ｒｓ５４９８は、配列番号２７の４６９位にある多型であり、Ｋ又はＥであり得る。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＩＣＡＭ１の多型を含む。例えば、非標的抗原は、ＩＣＡＭ１の多型残基を含むＩＣＡＭ１に由来するペプチドを含む。ＩＣＡＭ１の多型残基は、配列番号２７のアミノ酸残基４６９を含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号２７のアミノ酸４６９を含む、ＩＣＡＭ１のペプチドを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号２７の４６９位にＫを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号２７の４６９位にＥを含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号２７の４６９位にＫを有するＩＣＡＭ１多型を含み、第２の受容体は、配列番号２７の４６９位にＥを有するＩＣＡＭ１リガンドに対してよりも、配列番号２７の４６９位にＫを有するＩＣＡＭ１リガンドに対して高い親和性を有するリガンド結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号２７の４６９位にＥを有するＩＣＡＭ１多型を含み、第２の受容体は、配列番号２７の４６９位にＫを有するＩＣＡＭ１リガンドに対してよりも、配列番号２７の４６９位にＥを有するＩＣＡＭ１リガンドに対して高い親和性を有するリガンド結合ドメインを含む。。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＭＨＣ－Ｉとの複合体におけるＣＯＭＴ又はその抗原ペプチドを含む。ヒトＣＯＭＴは、がん細胞においてＬＯＨを介して頻繁に喪失される。
野生型ヒトＣＯＭＴは、ＮＣＢＩ記録番号ＮＰ＿０００１９２．２に記載されており、その内容は、それらの体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ＣＯＭＴは、以下のアミノ酸配列を含む：
Figure 2023538114000085
いくつかの実施形態において、ＣＯＭＴは、配列番号２８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。ＣＯＭＴの多型残基は、配列番号２８に太字としてマークされ、下線が引かれている。例えば、Ｖ１５８Ｍは、配列番号２８の１５８位にある多型であり、Ｖ又はＭであり得る。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＣＯＭＴの多型を含む。例えば、非標的抗原は、ＣＯＭＴの多型残基を含むＣＯＭＴに由来するペプチドを含む。ＣＯＭＴ１の多型残基は、配列番号２８のアミノ酸残基１５８を含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号２８のアミノ酸１５８を含む、ＣＯＭＴのペプチドを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号２８の１５８位にＶを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号２８の１５８位にＭを含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号２８の１５８位にＶを有するＣＯＭＴ多型を含み、第２の受容体は、配列番号２８の１５８位にＭを有するＣＯＭＴリガンドに対してよりも、配列番号２８の１５８位にＶを有するＣＯＭＴリガンドに対して高い親和性を有するリガンド結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号２８の１５８位にＭを有するＣＯＭＴ多型を含み、第２の受容体は、配列番号２８の１５８位にＶを有するＣＯＭＴリガンドに対してよりも、配列番号２８の１５８位にＭを有するＣＯＭＴリガンドに対して高い親和性を有するリガンド結合ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＭＨＣ－Ｉとの複合体においてＣ－Ｘ－Ｃモチーフケモカインリガンド１６（ＣＸＣＬ１６）又はその抗原ペプチドを含む。ヒトＣＸＣＬ１６前駆体は、ＮＣＢＩ記録番号ＮＰ＿００１０９４２８２．１に記載されており、その内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ＣＸＣＬ１６は、
Figure 2023538114000086
 のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＣＸＣＬ１６の多型を含む。例えば、非標的抗原は、ＣＸＣＬ１６の多型残基を含むＣＸＣＬ１６に由来するペプチドを含む。ＣＸＣＬ１６の多型残基は、配列番号２９の１４２位及び２００位を含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号２９のアミノ酸１４２又は２００を含むＣＸＣＬ１６のペプチドを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号２９のアミノ酸２００におけるＡを含む、ＣＸＣＬ１６のペプチドを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号２９のアミノ酸２００におけるＶを含む、ＣＸＣＬ１６のペプチドを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号２９のアミノ酸１４２におけるＩを含む、ＣＸＣＬ１６のペプチドを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号２９のアミノ酸１４２におけるＴを含む、ＣＸＣＬ１６のペプチドを含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＣＸＣＬ１６の多型を含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号２９のアミノ酸２００におけるＡを含むＣＸＣＬ１６のペプチドを含み、第２の受容体は、配列番号２９の２００位におけるＶを有するＣＸＣＬ１６リガンドに対してよりも、配列番号２９の２００位におけるＡを有するＣＸＣＬ１６リガンドに対して高い親和性を有するリガンド結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号２９のアミノ酸２００におけるＶを含むＣＸＣＬ１６のペプチドを含み、第２の受容体は、配列番号２９の２００位におけるＡを有するＣＸＣＬ１６リガンドに対してよりも、配列番号２９の２００位におけるＶを有するＣＸＣＬ１６リガンドに対して高い親和性を有するリガンド結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号２９のアミノ酸１４２におけるＩを含むＣＸＣＬ１６のペプチドを含み、第２の受容体は、配列番号２９の１４２位におけるＴを有するＣＸＣＬ１６リガンドに対してよりも、配列番号２９の１４２位におけるＩを有するＣＸＣＬ１６リガンドに対して高い親和性を有するリガンド結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、配列番号２９のアミノ酸１４２におけるＴを含むＣＸＣＬ１６のペプチドを含み、第２の受容体は、配列番号２９の１４２位におけるＩを有するＣＸＣＬ１６リガンドに対してよりも、配列番号２９の１４２位におけるＴを有するＣＸＣＬ１６リガンドに対して高い親和性を有するリガンド結合ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、又はＨＬＡ－Ｃ＊０７を含む。本明細書に記載の実施形態で使用するために、特定のＨＬＡ対立遺伝子に結合するか、又はそれらを認識する様々な単一可変ドメインを表５に記載する。（相補性決定領域には下線が引かれている）：
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Figure 2023538114000122
Figure 2023538114000123
いくつかの実施形態において、第２の抑制性受容体のリガンド結合ドメインは、ｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊３、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、又はＨＬＡ－Ｃ＊０７に結合し、表５に記載の配列群から選択される配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊３、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、又はＨＬＡ－Ｃ＊０７に結合し、表５に記載の配列群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊０１を含み、第２の受容体の非標的細胞外リガンド結合ドメインは、表５に記載のＨＬＡ－Ａ＊０１ ｓｃＦｖ配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊０２を含み、第２の受容体の非標的細胞外リガンド結合ドメインは、表５に記載のＨＬＡ－Ａ＊０２ ｓｃＦｖ配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊０３を含み、第２の受容体の非標的細胞外リガンド結合ドメインは、表５に記載のＨＬＡ－Ａ＊０３ ｓｃＦｖ配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊１１を含み、第２の受容体の非標的細胞外リガンド結合ドメインは、表５に記載のＨＬＡ－Ａ＊１１ ｓｃＦｖ配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ｂ＊０７を含み、第２の受容体の非標的細胞外リガンド結合ドメインは、表５に記載のＨＬＡ－Ｂ＊０７ ｓｃＦｖ配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ｃ＊０７を含み、第２の受容体の非標的細胞外リガンド結合ドメインは、表５に記載のＨＬＡ－Ｃ＊０７ ｓｃＦｖ配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。
ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、及びＨＬＡ－Ｃ＊０７リガンド結合ドメインについての例示的な重鎖及び軽鎖ＣＤＲ（それぞれ、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３、又はＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３）を以下の表６に示す。
Figure 2023538114000124
Figure 2023538114000125
Figure 2023538114000126
Figure 2023538114000127
Figure 2023538114000128
Figure 2023538114000129
Figure 2023538114000130
Figure 2023538114000131
Figure 2023538114000132
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａを含む。いくつかの実施形態において、第２の抑制性受容体のリガンド結合ドメインは、表６又は表７に記載のＣＤＲ配列を含む、ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０３、又はＨＬＡ－Ａ＊１１リガンド結合ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ｂを含む。いくつかの実施形態において、第２の抑制性受容体のリガンド結合ドメインは、表６に記載のＣＤＲ配列を含むＨＬＡ－Ｂ＊０７リガンド結合ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ｃを含む。いくつかの実施形態において、第２の抑制性受容体のリガンド結合ドメインは、表６に記載のＣＤＲ配列を含むＨＬＡ－Ｃ＊０７リガンド結合ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、又はＨＬＡ－Ｃタンパク質の対立遺伝子バリアントに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、又はＨＬＡ－Ｃ＊０７に特異的に結合する。
いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ＊０１に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、表６に開示されるようなＨＬＡ－Ａ＊０１相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、又は表６のＨＬＡ－Ａ＊０１ ＣＤＲと比較して、最大で１、２、若しくは３個の置換、欠失、若しくは挿入を有するＣＤＲ配列を含む。
いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ＊０２に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、表６に開示されるようなＨＬＡ－Ａ＊０２相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、又は表６のＨＬＡ－Ａ＊０２ ＣＤＲと比較して、最大で１、２、若しくは３個の置換、欠失、若しくは挿入を有するＣＤＲ配列を含む。
いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号１０３～１０８若しくは配列番号１０９～１１４の相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、又は配列番号１０３～１０８若しくは配列番号１０９～１１４のＣＤＲと比較して、最大で１、２、若しくは３個の置換、欠失、若しくは挿入を有するＣＤＲ配列を含む。
いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ＊０３に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、表６に開示されるようなＨＬＡ－Ａ＊０３相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、又は表６のＨＬＡ－Ａ＊０３ ＣＤＲと比較して、最大で１、２、若しくは３個の置換、欠失、若しくは挿入を有するＣＤＲ配列を含む。
いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ＊１１に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、表７に開示されるようなＨＬＡ－Ａ＊１１相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、又は表７のＨＬＡ－Ａ＊１１ ＣＤＲと比較して、最大で１、２、若しくは３個の置換、欠失、若しくは挿入を有するＣＤＲ配列を含む。
いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ｂ＊０７に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、表６に開示されるようなＨＬＡ－Ｂ＊０７相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、又は表６のＨＬＡ－Ｂ＊０７ ＣＤＲと比較して、最大で１、２、若しくは３個の置換、欠失、若しくは挿入を有するＣＤＲ配列を含む。
いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ｃ＊０７に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、表６に開示されるようなＨＬＡ－Ｃ＊０７相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、又は表６のＨＬＡ－Ｃ＊０７ ＣＤＲと比較して、最大で１、２、若しくは３個の置換、欠失、若しくは挿入を有するＣＤＲ配列を含む。
リガンド結合ドメインのいずれかの更なる実施形態において、各ＣＤＲ配列は、１、２、３個以上の置換、挿入、又は欠失を有し得る。ＣＤＲ配列は、置換、欠失、又は挿入を許容し得る。配列アラインメントツール、日常的な実験、及び既知のアッセイを使用して、当業者は、過度の実験なしに、ＣＤＲ配列において、１、２、３個以上の置換、挿入、又は欠失を有するバリアント配列を生成及び試験することができる。
いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０２を含む非標的抗原、及び第２の受容体のリガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ＊０２リガンド結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、リガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ＊０２を含むｐＭＨＣ複合体において、ペプチドとは独立してＨＬＡ－Ａ＊０２に結合する。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０２リガンド結合ドメインは、ｓｃＦｖドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０２リガンド結合ドメインは、配列番号３０～４１のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０２リガンド結合ドメインは、配列番号３０～４１のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％同一の配列を含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊０２を含み、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号３０の配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊０２を含み、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、配列番号３０の配列を含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊０２を含み、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＤＶＬＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＲＴＳＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号７６２）の配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＲＩＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＨＩＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＷＩＹＰＧＮＶＮＴＥＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＨＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＥＥＩＴＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号７６３）の配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むＶＨを含む。いくつかの実施形態において、ＶＨ及びＶＬは、リンカー、例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号１５２）によって分離される。いくつかの実施形態において、ＶＨ及びＶＬは、ＮからＣ末端まで、ＶＨ、リンカー、及びＶＬで順序付けられる。いくつかの実施形態において、ＶＨ及びＶＬは、ＮからＣ末端まで、ＶＬ、リンカー、及びＶＨで順序付けられる。
いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｓｃＦｖは、配列番号４２～５３のうちのいずれか１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、配列番号４２～５３のうちのいずれか１つと少なくとも９５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、配列番号４２～５３のうちのいずれか１つと同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインの重鎖は、配列番号４２～５３のうちのいずれか１つの重鎖ＣＤＲを含み、抗原結合ドメインの軽鎖は、配列番号４２～５３のうちのいずれか１つの軽鎖ＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０２抗原結合ドメインは、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖は、配列番号４５～４７及び５１～５３から選択されるＣＤＲを含み、軽鎖は、配列番号４２～４４及び４８～５０から選択されるＣＤＲを含む。
いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０２抗原結合ドメインは、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖は、配列番号３０～４１のうちのいずれか１つの重鎖部分と少なくとも９５％同一の配列を含み、軽鎖は、配列番号３０～４１のうちのいずれか１つの軽鎖部分と少なくとも９５％同一の配列を含む。
いくつかの実施形態において、重鎖は、配列番号３０～４１のうちのいずれか１つの重鎖部分と同一の配列を含み、軽鎖は、配列番号３０～４１のうちのいずれか１つの軽鎖部分と同一の配列を含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊０１を含み、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ＊０１リガンド結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０１リガンド結合ドメインは、表５に記載の配列群から選択される配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９９％同一である配列を含むｓｃＦｖドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０１ ｓｃＦｖは、表６に記載のＨＬＡ－Ａ＊１ ＣＤＲ配列を含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊０３を含み、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ＊０３リガンド結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０３リガンド結合ドメインは、表５に記載の配列群から選択される配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９９％同一である配列を含むｓｃＦｖドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０３ ｓｃＦｖは、表６に記載のＨＬＡ－Ａ＊０３ ＣＤＲ配列を含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊１１を含み、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ＊１１リガンド結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊１１リガンド結合ドメインは、表５に記載の配列群から選択される配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９９％同一である配列を含むｓｃＦｖドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊１１ ｓｃＦｖは、表７に記載のＨＬＡ－Ａ＊１１ ＣＤＲ配列を含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ｂ＊０７を含み、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ｂ＊０７リガンド結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ｂ＊０７リガンド結合ドメインは、表５に記載の配列群から選択される配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９９％同一である配列を含むｓｃＦｖドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ｂ＊０７ ｓｃＦｖは、表６に記載のＨＬＡ－Ｂ＊０７ ＣＤＲ配列を含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ｃ＊０７を含み、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ｃ＊０７リガンド結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ｃ＊０７リガンド結合ドメインは、表５に記載の配列群から選択される配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９９％同一である配列を含むｓｃＦｖドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ｃ＊０７ ｓｃＦｖは、表６に記載のＨＬＡ－Ｃ＊０７ ＣＤＲ配列を含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊１１を含む。ＨＬＡ－Ａ＊１１に結合し、それを認識する当該技術分野で知られているか、又は本明細書で開示される様々な単一可変ドメインは、実施形態での使用に好適である。このようなｓｃＦｖとしては、例えば、上記表５に示されるペプチド非依存的な方式でＨＬＡ－Ａ＊１１に結合する、以下のマウス及びヒト化ｓｃＦｖ抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
ＨＬＡ－Ａ＊１１リガンド結合ドメインについての例示的な重鎖及び軽鎖ＣＤＲ（それぞれ、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３、又はＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３）を以下の表７に示す。表７のＶＨ ＣＤＲのうちのいずれか、及び表７に開示されるＶＬ ＣＤＲと組み合わせることができる。
Figure 2023538114000133
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊１１を含み、第２の受容体のリガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ＊１１リガンド結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、リガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ＊１１を含むｐＭＨＣ複合体において、ペプチドとは独立してＨＬＡ－Ａ＊１１に結合する。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊１１リガンド結合ドメインは、ｓｃＦｖドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊１１リガンド結合ドメインは、配列番号１１４～１２２のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊１１リガンド結合ドメインは、配列番号１１４～１２２のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一の配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊１１ ｓｃＦｖは、配列番号１１４～１２２のうちのいずれか１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、配列番号１１４～１２２のうちのいずれか１つと少なくとも９５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、配列番号１１４～１２２のうちのいずれか１つと同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインの重鎖は、配列番号１３２～１４０のうちのいずれか１つの重鎖ＣＤＲを含み、抗原結合ドメインの軽鎖は、配列番号１４１の軽鎖ＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊１１抗原結合ドメインは、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖は、配列番号９２～１１０から選択される１、２、又は３つのＣＤＲを含み、軽鎖は、配列番号１１１～１１３から選択される１、２、又は３つのＣＤＲを含む。
ＨＬＡ－Ａ＊１１抗原結合ドメインについての例示的な重鎖及び軽鎖配列は、以下の表８に提供される。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊１１抗原結合ドメインは、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖は、配列番号１３２～１４０のうちのいずれか１つの重鎖部分と少なくとも９５％同一の配列を含み、軽鎖は、配列番号１４１の軽鎖部分と少なくとも９５％同一の配列を含む。
いくつかの実施形態において、重鎖は、配列番号１１４～１２２のうちのいずれか１つの重鎖部分と同一の配列を含み、軽鎖は、配列番号１１４～１２２のうちのいずれか１つの軽鎖部分と同一の配列を含む。
Figure 2023538114000134
Figure 2023538114000135
Figure 2023538114000136
Figure 2023538114000137
差次的に発現された抑制因子リガンド
本開示は、がん細胞と正常細胞との間で差次的に発現される抑制因子リガンド（非標的抗原）を提供する。
抑制性受容体の活性化は、細胞の表面上の非標的抗原の存在によって媒介される。非標的抗原を発現する細胞は、非標的抗原の発現のレベルに基づいて抑制性受容体を活性化する。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、標的細胞及び非標的細胞の両方によって発現される。しかしながら、これらの実施形態において、非標的抗原は、標的細胞よりも高いレベルで非標的細胞によって発現される。非標的細胞によって発現される、より高いレベルの非標的抗原は、抑制性受容体を活性化し、それによって、免疫細胞の活性化を阻止する。対照的に、標的によって発現される、より低いレベルの非標的抗原は、抑制性受容体を活性化するのに十分ではなく、免疫細胞の活性化をもたらす。
代替的な実施形態において、非標的抗原は、非標的細胞によって発現されるが、標的細胞によっては発現されない。非標的抗原の発現がない場合、標的細胞は、標的受容体を活性化し、それによって、免疫細胞を活性化する。
差次的発現は、発現を測定するために使用される、当該技術分野で既知の任意の技術によって決定することができる。それらは、とりわけ、細胞における標的遺伝子のｍＲＮＡ及び／又はタンパク質レベルを測定するための技術を含む。試料中のタンパク質レベルを測定する方法には、免疫組織化学、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、及び液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）などの分析方法が含まれる。ｍＲＮＡレベルを測定する方法には、リアルタイム定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）、及びハイスループット配列決定が含まれる。発現の違いは、例えば、正常細胞と、疾患細胞、例えば、がん細胞との間で観察され得る。
非標的抗原による抑制性受容体の活性化は、当該技術分野で既知の様々な様式に従って生じ得る。非標的抗原による抑制性受容体の活性化は、当該技術分野で既知の方法によって決定することができる。例えば、抑制性受容体を発現する細胞における下流細胞内シグナル伝達のレベルは、レポーター遺伝子の使用によって測定することができる。
理論に拘束されることを望まないが、非標的抗原の発現が、抑制性受容体の活性化による免疫細胞の活性化を阻害するか否かは、非標的抗原対抑制因子受容体の比に応じて生じ得る。非標的抗原及び抑制性受容体の発現レベル、並びにそれらの比は、とりわけ、免疫組織化学及び蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を含む、当該技術分野で既知の方法によって決定することができる。標的細胞及び非標的細胞上の非標的抗原の発現レベルの分析を使用して、抑制性受容体を発現する免疫細胞の選択的標的化を予測することができる。標的又は非標的細胞上の非標的抗原の発現が低いか、又は全くないことは、例えば、本開示の免疫細胞において抑制性受容体が活性化されないことを示し得る。
代替的に、又は加えて、理論に拘束されることを望まないが、抑制性受容体の活性化を介した非標的抗原による免疫細胞活性化の阻害は、抑制性受容体に対する非標的抗原の親和性に依存し得る。親和性を測定する方法は、当該技術分野で既知であり、とりわけ、酵素結合免疫吸着アッセイ又は放射免疫アッセイ方法を含む。
代替的に、又は加えて、理論に拘束されることを望まないが、抑制性受容体の活性化を介した非標的抗原による免疫細胞活性化の阻害は、抑制性受容体と活性化因子受容体との間のクロストークに応じて生じ得、活性化因子受容体の活性の下方制御をもたらす。例えば、非標的抗原による抑制性受容体の活性化は、免疫細胞の表面上の活性化因子受容体の発現の低下をもたらし得る。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、標的細胞内で、正常細胞よりも低いレベルで発現される。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、健常な細胞、すなわち、がん細胞ではない細胞によって発現される。いくつかの実施形態において、非標的抗原発現レベルは、標的細胞において、非標的細胞の、少なくとも約１０分の１、少なくとも約３０分の１、少なくとも約５０分の１、少なくとも約７０分の１、少なくとも約９０分の１、少なくとも約１００分の１、少なくとも約１１０分の１、少なくとも約１５０分の１、少なくとも約２００分の１、少なくとも約２５０分の１、少なくとも約３００分の１、少なくとも約３５０分の１、少なくとも約４００分の１、少なくとも約４５０分の１、少なくとも約５００分の１、少なくとも約６００分の１、少なくとも約７００分の１、少なくとも約８００分の１、少なくとも約９００分の１、又は少なくとも約１０００分の１である。いくつかの実施形態において、非標的抗原発現レベルは、複数の健常な細胞の、約１０分の１、約３０分の１、約５０分の１、約７０分の１、約９０分の１、約１００分の１、又は約１１０分の１である。いくつかの実施形態において、非標的抗原発現レベルは、複数のがん細胞において、複数の健常な細胞の少なくとも約５分の１である。いくつかの実施形態において、非標的抗原発現レベルは、標的細胞において、非標的細胞の少なくとも約５分の１である。いくつかの実施形態において、標的細胞は、非標的抗原の発現が低い、又は全くない複数のがん細胞である。
標的細胞によって発現されない（又は低レベルで発現される）、非標的細胞によって発現される任意の細胞表面分子は、第２の受容体細胞外リガンド結合ドメインに好適な非標的抗原であり得る。例えば、細胞接着分子、細胞間シグナル伝達分子、細胞外ドメイン、走化性に関与する分子、糖タンパク質、Ｇタンパク質共役受容体、膜貫通タンパク質、神経伝達物質のための受容体、又は電圧依存性イオンチャネルを、非標的抗原として使用することができる。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体における、ロイシンリッチリピートニューロナル４（ＬＲＲＮ４）及びウロプラキンＢ３（ＵＰＫＢ３）、又はそれらのいずれかのペプチド抗原からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＭＨＣ－Ｉとの複合体におけるＬＲＲＮ４又はそのペプチド抗原である。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＭＨＣ－Ｉとの複合体におけるＵＰＫＢ３又はそのペプチド抗原である。
いくつかの実施形態において、標的抗原は、主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体におけるがん細胞特異的抗原のペプチド抗原である。
ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、又はＨＬＡ－Ｃのいずれかを含む非標的ＭＨＣ－Ｉ（ｐＭＨＣ）抗原は、本開示の範囲内であると想定される。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ｂを含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ｃを含む。
非標的抗原は、がん細胞、例えば、肺がん細胞において低い発現であるか、又は全く発現しないが、正常な肺組織などの正常な組織において発現されるタンパク質を含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＭＨＣ－Ｉとの複合体におけるＬＲＲＮ４又はその抗原ペプチドを含む。ヒトＬＲＲＮ４は、ＮＣＢＩ記録番号ＮＰ＿６８９８２４．２に記載されており、その内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ＬＲＲＮ４は、
Figure 2023538114000138
 のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＬＲＲＮ４は、配列番号７５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ＬＲＲＮ４は、配列番号７５と同一の配列を含む。
いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＭＨＣ－Ｉとの複合体におけるＵＰＫ３Ｂ又はその抗原ペプチドを含む。ＵＰＫ３Ｂの全てのアイソフォームは、本開示の範囲内として想定される。ヒトＵＰＫ３Ｂアイソフォームａ前駆体は、ＮＣＢＩ記録番号ＮＰ＿０８５０４７．１に記載されており、その内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ＵＰＫ３Ｂアイソフォームａ前駆体は、
Figure 2023538114000139
 のアミノ酸配列を含む。
ヒトＵＰＫ３Ｂアイソフォームｂ前駆体は、ＮＣＢＩ記録番号ＮＰ＿８７２６２５．１に記載されており、その内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ＵＰＫ３Ｂアイソフォームｂ前駆体は、
Figure 2023538114000140
 のアミノ酸配列を含む。
ヒトＵＰＫ３Ｂアイソフォームｃ前駆体は、ＮＣＢＩ記録番号ＮＰ＿８７２６２４．１に記載されており、その内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ＵＰＫ３Ｂアイソフォームｃ前駆体は、
Figure 2023538114000141
 のアミノ酸配列を含む。
ヒトＵＰＫ３Ｂアイソフォームｄ前駆体は、ＮＣＢＩ記録番号ＮＰ＿００１３３４６１３．１に記載されており、その内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ＵＰＫ３Ｂアイソフォームｃ前駆体は、
Figure 2023538114000142
 のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＵＰＫＢ３は、配列番号７６～７９のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列又は部分配列を含む。いくつかの実施形態において、ＵＰＫＢ３は、配列番号７６～７９と同一の配列又は部分配列を含む。
抑制性キメラ抗原受容体
本開示は、抑制性キメラ抗原受容体である第２の受容体を提供する。抑制性受容体は、ＭＨＣ－Ｉ複合体における非標的抗原又はそのペプチド誘導体に結合し、それを認識する細胞外リガンド結合ドメインを含んでもよい。
本明細書で使用される場合、「抑制性受容体」という用語は、免疫細胞の免疫活性を阻害又は抑制する抑制シグナルを形質導入することができる細胞内シグナル伝達ドメインに融合されるリガンド結合ドメインを指す。抑制性受容体は、免疫細胞抑制性の潜在能力を有し、免疫細胞活性化の潜在能力を有する受容体であるＣＡＲとは異なり、区別可能である。例えば、ＣＡＲは、細胞内刺激ドメイン及び／又は共刺激ドメインを含むので、受容体を活性化している。抑制性受容体は、細胞内阻害ドメインを含有する抑制性受容体である。
本明細書で使用される場合、「抑制シグナル」とは、免疫応答の抑制（例えば、サイトカイン産生の減少又は免疫細胞活性化の減少）をもたらす免疫細胞におけるシグナル伝達又はタンパク質発現の変化を指す。免疫細胞の阻害又は抑制は、選択的及び／若しくは可逆的であり得るか、又は選択的及び／若しくは可逆的ではない。
本開示の抑制性受容体は、細胞外リガンド結合ドメインを含み得る。リガンド依存的な様式で受容体の活性を調節することができる任意の種類のリガンド結合ドメインは、本開示の範囲内として想定される。抑制性受容体は、非標的抗原に応答する（例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０２）。例えば、非標的抗原（例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０２）が、抑制性受容体に結合又は接触する場合、抑制性受容体は応答性であり、抑制性受容体の細胞外リガンド結合ドメインによる非標的抗原の結合時に抑制性受容体を発現する免疫細胞における抑制シグナルを活性化する。
本開示の抑制性受容体は、細胞外リガンド結合ドメインを含み得る。リガンド依存的な様式で受容体の活性を調節することができる任意の種類のリガンド結合ドメインは、本開示の範囲内として想定される。
いくつかの実施形態において、リガンド結合ドメインは、抗原結合ドメインである。例示的な抗原結合ドメインには、とりわけ、ｓｃＦｖ、ＳｄＡｂ、Ｖβのみのドメイン、並びにＴＣＲ α及びβ鎖可変ドメインに由来するＴＣＲ抗原結合ドメインが含まれる。
任意の種類の抗原結合ドメインは、本開示の範囲内として想定される。
いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ｓｃＦｖである。
いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）、又はＨＬＡ－Ａ＊０２との複合体における、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ１）、カテコール－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカインリガンド１６（ＣＸＣＬ１６）、ロイシンリッチリピートニューロナル４（ＬＲＲＮ４）及びウロプラキン３Ｂ ＵＰＫ３Ｂの多型バリアント、又はそれらの抗原ペプチドに結合し、それらを認識する。いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ｓｃＦｖである。
いくつかの実施形態において、第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、抑制性受容体の細胞外ドメインに融合される。
いくつかの実施形態において、本開示の抑制性受容体は、細胞外ヒンジ領域を含む。例示的なヒンジは、ＩｇＤ及びＣＤ８ドメイン、例えば、ＩｇＧ１から単離又は派生され得る。いくつかの実施形態において、ヒンジは、ＣＤ８α又はＣＤ２８から単離されるか、又は派生される。
本開示の抑制性受容体は、抑制性受容体の細胞外ドメインに融合される膜貫通ドメインを含むように設計することができる。いくつかの場合において、膜貫通ドメインは、同じ又は異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのそのようなドメインの結合を避け、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるために、アミノ酸置換によって選択又は修飾され得る。
膜貫通ドメインは、天然又は合成源のいずれかに由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質に由来し得る。膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４のアルファ、ベータ、若しくはゼータ鎖、又はＩｇＧ４などの免疫グロブリンから単離されてもよいか、又は派生されてもよい（すなわち、それらの少なくとも膜貫通領域を含む）。代替的に、膜貫通ドメインは合成であってもよく、その場合、ロイシン及びバリンなどの主に疎水性残基を含む。いくつかの実施形態において、フェニルアラニン、トリプトファン、及びバリンのトリプレットは、合成膜貫通ドメインの各末端に見出される。任意選択で、好ましくは２～１０アミノ酸長の短いオリゴリンカー又はポリペプチドリンカーは、膜貫通ドメインと抑制性受容体の細胞内ドメインとの間の結合を形成してもよい。グリシン－セリンダブレットは、特に好適なリンカーを提供する。
本開示は、細胞内ドメインを含む抑制性受容体を提供する。本開示の抑制性受容体の細胞内ドメインは、他の場合に第１の受容体による活性化シグナルに応答して活性化されるであろう、抑制性受容体を含む免疫細胞の活性化を抑制することを担う。いくつかの実施形態において、抑制性細胞内ドメインは、免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む。いくつかの実施形態において、ＩＴＩＭを含む抑制性細胞内ドメインは、ＣＴＬＡ－４及びＰＤ－１などの免疫チェックポイント阻害剤から単離され得るか、又は派生され得る。ＣＴＬＡ－４及びＰＤ－１は、Ｔ細胞の表面上に発現する免疫抑制性受容体であり、Ｔ細胞応答の減衰又は終結において重要な役割を果たす。
いくつかの実施形態において、抑制性細胞内ドメインは、ヒト腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）受容体及びＣＤ２００受容体１から単離される。いくつかの実施形態において、ＴＲＡＩＬ受容体は、ＴＲ１０Ａ、ＴＲ１０Ｂ又はＴＲ１０Ｄを含む。
いくつかの実施形態において、抑制性細胞内ドメインは、グリコスフィンゴ脂質マイクロドメイン１（ＰＡＧ１）を有するリンタンパク質膜アンカーから単離される。いくつかの実施形態において、抑制性細胞内ドメインは、白血球免疫グロブリン様受容体Ｂ１（ＬＩＬＲＢ１）から単離される。
いくつかの実施形態において、阻害ドメインは、ヒトタンパク質、例えば、ヒトＴＲＡＩＬ受容体、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＡＧ１、又はＬＩＬＲＢ１タンパク質から単離されるか、又は派生される。
いくつかの実施形態において、阻害ドメインは、細胞内ドメイン、膜貫通、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、阻害ドメインは、細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、ヒンジ領域、又はそれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態において、阻害ドメインは、キラー細胞免疫グロブリン様受容体、３つのＩｇドメイン及び長い細胞質尾部２（ＫＩＲ３ＤＬ２）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体、３つのＩｇドメイン及び長い細胞質尾部３（ＫＩＲ３ＤＬ３）、白血球免疫グロブリン様受容体Ｂ１（ＬＩＲ－１及びＬＩＬＲＢ１とも呼ばれる、ＬＩＲ１）、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）、Ｆｃガンマ受容体ＩＩＢ（ＦｃｇＲＩＩＢ）、キラー細胞レクチン様受容体Ｋ１（ＮＫＧ２Ｄ）、ＣＴＬＡ－４、合成コンセンサスＩＴＩＭを含有するドメイン、ＺＡＰ７０ ＳＨ２ドメイン（例えば、Ｎ及びＣ末端ＳＨ２ドメインの１つ又は両方）、又はＺＡＰ７０ ＫＩ＿Ｋ３６９Ａ（キナーゼ不活性ＺＡＰ７０）から単離されるか、又は派生される。
いくつかの実施形態において、阻害ドメインは、ヒトタンパク質から単離されるか、又は派生される。
いくつかの実施形態において、第２の抑制性受容体は、阻害ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第２の抑制性受容体は、抑制性細胞内ドメイン及び／又は抑制性膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、抑制性細胞内ドメインは、抑制性受容体の細胞内ドメインに融合される。いくつかの実施形態において、抑制性細胞内ドメインは、抑制性受容体の膜貫通ドメインに融合される。
いくつかの実施形態において、第２の抑制性受容体は、同じタンパク質、例えば、ＩＴＩＭ含有タンパク質から単離されるか、又は派生される、単離されるか、又は派生される、細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞外ドメイン又はそれらの一部分を含む。いくつかの実施形態において、第２の抑制性受容体は、細胞内ドメイン及び／又は膜貫通ドメインと同じタンパク質、例えば、ＩＴＩＭ含有タンパク質から単離されるか、又は派生される、単離されるか、又は派生されるヒンジ領域を含む。
いくつかの実施形態において、第２の受容体は、阻害ドメインを含むＴＣＲ（抑制性ＴＣＲ）である。いくつかの実施形態において、抑制性ＴＣＲは、抑制性細胞内ドメイン及び／又は抑制性膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、抑制性細胞内ドメインは、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ガンマ若しくはＣＤ３イプシロンの細胞内ドメイン、又はそれらの一部分のＴＣＲに融合される。いくつかの実施形態において、抑制性細胞内ドメインは、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ガンマ又はＣＤ３イプシロンの膜貫通ドメインに融合される。
いくつかの実施形態において、第２の受容体は、阻害ドメインを含むＴＣＲ（抑制性ＴＣＲ）である。いくつかの実施形態において、阻害ドメインは、ＬＩＬＲＢ１から単離されるか、又は派生される。
ＬＩＬＲＢ１抑制性受容体
本開示は、ＬＩＬＲＢ１阻害ドメイン、並びに任意選択で、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン及び／若しくはヒンジドメイン、又はその機能的バリアントを含む、第２の抑制性受容体を提供する。ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン及び／又はＬＩＬＲＢ１ヒンジドメインを抑制性受容体に含めることにより、別の膜貫通ドメイン又は別のヒンジドメインを有する参照抑制性受容体と比較して、抑制性受容体によって生成される抑制シグナルが増加し得る。ＬＩＬＲＢ１阻害ドメインを含む第２の抑制性受容体は、本明細書に記載されるようなＣＡＲ又はＴＣＲであってもよい。本明細書に記載されるような任意の好適なリガンド結合ドメインは、ＬＩＬＲＢ１ベースの第２の抑制性受容体に融合され得る。
白血球免疫グロブリン様受容体Ｂ１としても知られている、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー１（ＬＩＬＲＢ１）、並びにＩＬＴ２、ＬＩＲ１、ＭＩＲ７、ＰＩＲＢ、ＣＤ８５Ｊ、ＩＬＴ－２ ＬＩＲ－１、ＭＩＲ－７、及びＰＩＲ－Ｂは、白血球免疫グロブリン様受容体（ＬＩＲ）ファミリーのメンバーである。ＬＩＬＲＢ１タンパク質は、ＬＩＲ受容体のサブファミリーＢクラスに属する。これらの受容体は、２～４個の細胞外免疫グロブリンドメイン、膜貫通ドメイン、及び２～４個の細胞質免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する。ＬＩＬＲＢ１受容体は、免疫細胞上で発現され、それは、抗原提示細胞上のＭＨＣクラスＩ分子に結合し、免疫応答の刺激を阻害する負のシグナルを形質導入する。ＬＩＬＲＢ１は、炎症反応、及び細胞傷害性を調節し、自己反応性を制限する際に役割を果たすと考えられている。ＬＩＬＲＢ１の異なるアイソフォームをコードする複数の転写バリアントが存在し、これらの全ては、本開示の範囲内であると企図される。
本明細書に記載される抑制性受容体のいくつかの実施形態において、抑制性受容体は、ＬＩＬＲＢ１から単離されるか、又は派生される１つ以上のドメインを含む。ＬＩＬＲＢ１から単離されるか、又は派生される１つ以上のドメインを有する受容体のいくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１の１つ以上のドメインは、配列番号５４の配列又は部分配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるか、又はそれと同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１の１つ以上のドメインは、配列番号５４の配列又は部分配列と同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１の１つ以上のドメインは、配列番号５４の配列又は部分配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるか、又はそれと同一であるアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１の１つ以上のドメインは、配列番号５４の配列又は部分配列と同一であるアミノ酸配列からなる。
ＬＩＬＲＢ１から単離されるか、又は派生される１つ以上のドメインを有する受容体のいくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１の１つ以上のドメインは、配列番号５５の配列又は部分配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるか、又はそれと同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる。
ＬＩＬＲＢ１の１つ以上のドメインを有する受容体のいくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１の１つ以上のドメインは、配列番号５５の配列又は部分配列と同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる。
様々な実施形態において、ポリペプチドを含む抑制性受容体が提供され、ポリペプチドは、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメイン又はその機能的バリアント、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン又はその機能的バリアント、及びＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン又は少なくとも１つ、若しくは少なくとも２つの免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む細胞内ドメインのうちの１つ以上を含み、各ＩＴＩＭは、独立して、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号５６）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号５７）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号５８）、及びＳＩＹＡＴＬ（配列番号５９）から選択される。
本明細書で使用される場合、「免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ」又は「ＩＴＩＭ」とは、免疫系の多くの抑制性受容体の細胞質尾部に見出される、Ｓ／Ｉ／Ｖ／ＬｘＹｘｘＩ／Ｖ／Ｌ（配列番号５４７）などのコンセンサス配列を有するアミノ酸の保存配列を指す。ＩＴＩＭ保有抑制性受容体が、それらのリガンドと相互作用した後、ＩＴＩＭモチーフがリン酸化され、抑制性受容体が、他の酵素、例えば、ホスホチロシンホスファターゼＳＨＰ－１及びＳＨＰ－２、又はＳＨＩＰと呼ばれるイノシトール－ホスファターゼを動員することが可能になる。
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、少なくとも１つの免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）、少なくとも２つのＩＴＩＭ、少なくとも３つのＩＴＩＭ、少なくとも４つのＩＴＩＭ、少なくとも５つのＩＴＩＭ、又は少なくとも６つのＩＴＩＭを含む、細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、１、２、３、４、５、又は６つのＩＴＩＭを有する。
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号５６）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号５７）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号５８）、及びＳＩＹＡＴＬ（配列番号５９）からなるＩＴＩＭの群から選択される少なくとも１つのＩＴＩＭを含む、細胞内ドメインを含む。
更なる特定の実施形態において、ポリペプチドは、少なくとも２つの免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む、細胞内ドメインを含み、各ＩＴＩＭは、独立して、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号５６）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号５７）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号５８）、及びＳＩＹＡＴＬ（配列番号５９）から選択される。
いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＩＴＩＭ ＮＬＹＡＡＶ（配列番号５６）及びＶＴＹＡＥＶ（配列番号５７）の両方を含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、配列番号６０と少なくとも９５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、配列番号６０と同一の配列を含むか、又はそれから本質的になる。
いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＩＴＩＭ ＶＴＹＡＥＶ（配列番号５７）及びＶＴＹＡＱＬ（配列番号５８）の両方を含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、配列番号６１と少なくとも９５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、配列番号６１と同一の配列を含むか、又はそれから本質的になる。
いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＩＴＩＭ ＶＴＹＡＱＬ（配列番号５８）及びＳＩＹＡＴＬ（配列番号５９）の両方を含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、配列番号６２と少なくとも９５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、配列番号６２と同一の配列を含むか、又はそれから本質的になる。
いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＩＴＩＭ ＮＬＹＡＡＶ（配列番号５６）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号５７）、及びＶＴＹＡＱＬ（配列番号５８）を含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、配列番号６３と少なくとも９５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、配列番号６３と同一の配列を含むか、又はそれから本質的になる。
いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＩＴＩＭ ＶＴＹＡＥＶ（配列番号５７）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号５８）、及びＳＩＹＡＴＬ（配列番号５９）を含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、配列番号６４と少なくとも９５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、配列番号６４と同一の配列を含むか、又はそれから本質的になる。
いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＩＴＩＭ ＮＬＹＡＡＶ（配列番号５６）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号５７）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号５８）、及びＳＩＹＡＴＬ（配列番号５９）を含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、配列番号６５と少なくとも９５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、配列番号６５と同一の配列を含むか、又はそれから本質的になる。
いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン（配列番号７０）と少なくとも９５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン（配列番号７０）と同一の配列を含むか、又はそれから本質的になる。
本開示のＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン又はその機能的バリアントは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも４、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、又は少なくとも８つのＩＴＩＭを有することができる。いくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン又はその機能的バリアントは、２、３、４、５、又は６つのＩＴＩＭを有する。
特定の実施形態において、細胞内ドメインは、２、３、４、５、又は６つの免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含み、各ＩＴＩＭは、独立して、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号５６）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号５７）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号５８）、及びＳＩＹＡＴＬ（配列番号５９）から選択される。
特定の実施形態において、細胞内ドメインは、少なくとも３つの免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含み、各ＩＴＩＭは、独立して、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号５６）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号５７）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号５８）、及びＳＩＹＡＴＬ（配列番号５９）から選択される。
特定の実施形態において、細胞内ドメインは、３つの免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含み、各ＩＴＩＭは、独立して、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号５６）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号５７）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号５８）、及びＳＩＹＡＴＬ（配列番号５９）から選択される。
特定の実施形態において、細胞内ドメインは、４つの免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含み、各ＩＴＩＭは、独立して、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号５６）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号５７）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号５８）、及びＳＩＹＡＴＬ（配列番号５９）から選択される。
特定の実施形態において、細胞内ドメインは、５つの免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含み、各ＩＴＩＭは、独立して、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号５６）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号５７）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号５８）、及びＳＩＹＡＴＬ（配列番号５９）から選択される。
特定の実施形態において、細胞内ドメインは、６つの免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含み、各ＩＴＩＭは、独立して、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号５６）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号５７）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号５８）、及びＳＩＹＡＴＬ（配列番号５９）から選択される。
特定の実施形態において、細胞内ドメインは、少なくとも７つの免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含み、各ＩＴＩＭは、独立して、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号５６）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号５７）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号５８）、及びＳＩＹＡＴＬ（配列番号５９）から選択される。
ＬＩＬＲＢ１タンパク質は、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３及びＤ４と呼ばれる４つの免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインを有する。いくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメインは、ＬＩＬＲＢ１ Ｄ３Ｄ４ドメイン又はその機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１ Ｄ３Ｄ４ドメインは、配列番号６６と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるか、又はそれと同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１ Ｄ３Ｄ４ドメインは、配列番号６６を含むか、又はそれから本質的になる。
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメイン又はその機能的バリアントを含む。実施形態において、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメイン、又はその機能的バリアントは、配列番号７３、配列番号６６、又は配列番号６７と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるか、又はそれらと同一である配列を含む。実施形態において、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメイン、又はその機能的バリアントは、配列番号７３、配列番号６６、又は配列番号６７と少なくとも９５％同一の配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメインは、配列番号７３、配列番号６６、又は配列番号６７と同一の配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメインは、配列番号７３、配列番号６６、又は配列番号６７と同一の配列から本質的になる。
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン又はその機能的バリアントである。いくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン又はその機能的バリアントは、配列番号７４と少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一又は少なくとも９９％の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン又はその機能的バリアントは、配列番号７４と少なくとも９５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメインは、配列番号７４と同一の配列を含む。実施形態において、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメインは、配列番号７４と同一の配列から本質的になる。
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ヒンジ、例えば、ヒトタンパク質由来のヒンジを介して、第２の抑制性受容体、例えば、抗原結合ドメイン又はリガンド結合ドメインの細胞外領域に結合することができる。例えば、いくつかの実施形態において、ヒンジは、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）ヒンジ、例えば、ＩｇＧ４ヒンジ、ＣＤ８ａヒンジ、又はＬＩＬＲＢ１ヒンジであり得る。
いくつかの実施形態において、第２の抑制性受容体は、阻害ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第２の抑制性受容体は、抑制性細胞内ドメイン及び／又は抑制性膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、阻害ドメインは、ＬＩＬＲ１Ｂから単離されるか、又は派生される。
ＬＩＬＲＢ１ドメインの組み合わせを含む抑制性受容体
いくつかの実施形態において、本開示のＬＩＬＲＢ１ベースの抑制性受容体は、１つを超えるＬＩＬＲＢ１ドメイン又はその機能的等価物を含む。例えば、いくつかの実施形態において、抑制性受容体は、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン及び細胞内ドメイン、又はＬＩＬＲＢ１ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む。
特定の実施形態において、抑制性受容体は、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメイン、又はその機能的バリアント、及びＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン、又はその機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号６８と少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一であるか、又はそれと同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号６８と少なくとも９５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号６８と同一の配列を含む。
更なる実施形態において、抑制性受容体は、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン又はその機能的バリアント、並びにＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン及び／又は少なくとも１つの免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む細胞内ドメインを含み、ＩＴＩＭは、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号５６）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号５７）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号５８）、及びＳＩＹＡＴＬ（配列番号５９）から選択される。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン又はその機能的バリアント、並びにＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン及び／又は少なくとも２つのＩＴＩＭを含む細胞内ドメインを含み、各ＩＴＩＭは、独立して、ＮＬＹＡＡＶ（配列番号５６）、ＶＴＹＡＥＶ（配列番号５７）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号５８）、及びＳＩＹＡＴＬ（配列番号５９）から選択される。
いくつかの実施形態において、抑制性受容体は、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号６９と少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一であるか、又はそれと同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号６９と少なくとも９５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号６９と同一の配列を含む。
好ましい実施形態において、抑制性受容体は、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメイン、又はその機能的バリアント、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン、又はその機能的バリアント、並びにＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン及び／又は少なくとも２つの免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む細胞内ドメインを含み、各ＩＴＩＭは、ＬＹＡＡＶ（配列番号５６）、ＶＴＹＡＥ（配列番号５７）、ＶＴＹＡＱＬ（配列番号５８）、及びＳＩＹＡＴＬ（配列番号５９）から独立して選択される。
いくつかの実施形態において、抑制性受容体は、配列番号７１若しくは配列番号７２と少なくとも９５％同一、又は配列番号７１若しくは配列番号７２と少なくとも９９％同一、又は配列番号７１若しくは配列番号７２と同一の配列を含む。
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号６８と少なくとも９９％同一、又は配列番号６８と少なくとも９９％同一、又は配列番号６８と同一の配列を含む。
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号６９と少なくとも９９％同一、又は配列番号６９と少なくとも９９％同一、又は配列番号６９と同一の配列を含む。
Figure 2023538114000143
Figure 2023538114000144
Figure 2023538114000145
Figure 2023538114000146
本開示の例示的な抑制性受容体は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ又はＨＬＡ－Ｃ非標的抗原のいずれかに特異的なｓｃＦｖを含み、その配列は表５に記載され、ＬＩＬＲＢ１ヒンジ、膜貫通及び細胞内ドメインにＮ末端で融合される。いくつかの実施形態において、ＬＩＬＲＢ１ヒンジは、配列番号７３の配列を含み、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメインは、配列番号７４の配列を含み、ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメインは、配列番号７０の配列を含む。例えば、第２の抑制性受容体は、配列番号７１のＮ末端に融合した表５のｓｃＦｖ配列を含む。
更なる例として、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊０２を含み、第２の抑制性受容体は、ＤＶＬＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＲＴＳＧＧＧＴＫＬＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＲＩＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＨＩＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＷＩＹＰＧＮＶＮＴＥＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＨＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＥＥＩＴＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＹＧＳＱＳＳＫＰＹＬＬＴＨＰＳＤＰＬＥＬＶＶＳＧＰＳＧＧＰＳＳＰＴＴＧＰＴＳＴＳＧＰＥＤＱＰＬＴＰＴＧＳＤＰＱＳＧＬＧＲＨＬＧＶＶＩＧＩＬＶＡＶＩＬＬＬＬＬＬＬＬＬＦＬＩＬＲＨＲＲＱＧＫＨＷＴＳＴＱＲＫＡＤＦＱＨＰＡＧＡＶＧＰＥＰＴＤＲＧＬＱＷＲＳＳＰＡＡＤＡＱＥＥＮＬＹＡＡＶＫＨＴＱＰＥＤＧＶＥＭＤＴＲＳＰＨＤＥＤＰＱＡＶＴＹＡＥＶＫＨＳＲＰＲＲＥＭＡＳＰＰＳＰＬＳＧＥＦＬＤＴＫＤＲＱＡＥＥＤＲＱＭＤＴＥＡＡＡＳＥＡＰＱＤＶＴＹＡＱＬＨＳＬＴＬＲＲＥＡＴＥＰＰＰＳＱＥＧＰＳＰＡＶＰＳＩＹＡＴＬＡＩＨ（配列番号３４８）の配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊０２を含み、第２の抑制性受容体は、配列番号３４８の配列を含む。
ポリヌクレオチド及びベクター
本開示は、本開示の第１及び第２の受容体の配列をコードするポリヌクレオチドを提供する。本開示は、本明細書に記載のポリヌクレオチド及びベクターを含む、免疫細胞を提供する。
いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２の受容体の配列は、プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、第１の受容体をコードする配列は、第１のプロモーターに作動可能に連結され、第２の受容体をコードする配列は、第２のプロモーターに作動可能に連結される。
本開示は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
いくつかの実施形態において、第１の受容体は、第１のベクターによってコードされ、第２の受容体は、第２のベクターによってコードされる。いくつかの実施形態において、両方の受容体は、単一のベクターによってコードされる。いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のベクターは、ｓｈＲＮＡ、例えば、Ｂ２Ｍ ｓｈＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、両方の受容体は、単一のベクターによってコードされる。いくつかの実施形態において、ベクターは、ｓｈＲＮＡ、例えば、Ｂ２Ｍ ｓｈＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、第１及び第２の受容体は、単一のベクターによってコードされる。単一のベクターを使用して複数のポリペプチドをコードする方法は、当業者に既知であり、とりわけ、異なるプロモーターの制御下で複数のポリペプチドをコードすること、又は、単一のプロモーターを使用して複数のポリペプチドの転写を制御する場合、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）及び／若しくは自己切断ペプチドをコードする配列の使用を含むであろう。例示的な自己切断ペプチドには、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ及びＦ２Ａ自己切断ペプチドが含まれる。いくつかの実施形態において、Ｔ２Ａ自己切断ペプチドは、ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号７６４）の配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｐ２Ａ自己切断ペプチドは、ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号７６５）の配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｅ２Ａ自己切断ペプチドは、ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号７６６）の配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｆ２Ａ自己切断ペプチドは、ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号７６７）の配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｔ２Ａ自己切断ペプチドは、ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号７６４）の配列を含む。前述のうちのいずれも、Ｎ末端ＧＳＧリンカーも含むこともできる。例えば、Ｔ２Ａ自己切断ペプチドは、ＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＡＧＧＧＣＡＧＡＧＧＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＣＡＴＧＴＧＧＣＧＡＣＧＴＧＧＡＡＧＡＧＡＡＣＣＣＴＧＧＣＣＣＣ（配列番号７６８）の配列によってコードされ得る、ＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号３５１）の配列も含むことができる。
いくつかの実施形態において、ベクターは、発現ベクター、すなわち、好適な細胞における第１及び／又は第２の受容体の発現のためのものである。
レンチウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターは、導入遺伝子の長期的で安定的な組み込み、及び娘細胞におけるその増殖を可能にするため、長期的な遺伝子移入を達成するのに好適なツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖細胞を形質導入することができるという点で、マウス白血病ウイルスなどのオンコレトロウイルスに由来するベクターよりも追加の利点を有する。これらはまた、低免疫原性という追加の利点も有する。
受容体をコードする天然又は合成核酸の発現は、典型的には、受容体又はその一部をコードする核酸をプロモーターに作動可能に連結し、構築物を発現ベクターに組み込むことによって達成される。ベクターは、真核生物の複製及び組み込みに好適であり得る。典型的なクローニングベクターは、転写及び翻訳ターミネーター、開始配列、並びに所望の核酸配列の発現の調節に有用なプロモーターを含有する。
受容体をコードするポリヌクレオチドは、いくつかの種類のベクターにクローニングすることができる。例えば、ポリヌクレオチドは、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、及びコスミドを含むが、これらに限定されない、ベクターにクローニングすることができる。特に目的のベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、及び配列決定ベクターが含まれる。
更に、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で、免疫細胞などの細胞に提供され得る。ウイルスベクター技術は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、並びに他のウイルス学及び分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルスが含まれるが、これらに限定されない。一般に、好適なベクターは、少なくとも１つの生物において機能的な複製起点、プロモーター配列、簡便な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び１つ以上の選択可能なマーカー（例えば、ＷＯ０１／９６５８４；ＷＯ０１／２９０５８；及び米国特許第６，３２６，１９３号）を含有する。
哺乳動物細胞への遺伝子移入のために、多くのウイルスベースのシステムが開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達システムのための簡便なプラットフォームを提供する。選択された遺伝子は、当該技術分野で既知の技術を使用して、ベクター内に挿入され、レトロウイルス粒子内にパッケージングされ得る。次いで、組換えウイルスを単離し、対象の細胞にインビボ又はエクスビボのいずれかで送達することができる。多くのレトロウイルスシステムが、当該技術分野で既知である。いくつかの実施形態において、アデノウイルスベクターが使用される。多くのアデノウイルスベクターが、当該技術分野で既知である。一実施形態において、レンチウイルスベクターが使用される。
追加のプロモーターエレメント、例えば、エンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは、開始部位の上流の領域３０～１１０塩基対（ｂｐ）に位置するが、多くのプロモーターが、最近、開始部位の下流にも機能的エレメントを含有することが示されている。プロモーターエレメント間の間隔はしばしば柔軟性があり、その結果、エレメントが互いに対して反転又は移動するときに、プロモーター機能が保存される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターでは、活性が低下し始める前に、プロモーターエレメント間の間隔を５０ｂｐ離して増加させることができる。プロモーターに応じて、個々のエレメントは、協調的又は独立してのいずれかで機能して、転写を活性化することができるように見える。
好適なプロモーターの一例は、最初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに作動可能に連結した任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することが可能な強力な構成的プロモーター配列である。好適なプロモーターの別の例は、伸長増殖因子－１α（ＥＦ－１α）である。しかしながら、限定されないが、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス最初期プロモーター、Ｒｏｕｓ肉腫ウイルスプロモーター、Ｕ６プロモーター、並びに限定されないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、及びクレアチンキナーゼプロモーターなどのヒト遺伝子プロモーターを含む、他の構成的プロモーター配列も使用され得る。更に、本開示は、構成的プロモーターの使用に限定されるべきではない。誘導性プロモーターもまた、本開示の一部として企図される。誘導性プロモーターの使用は、そのような発現が所望される場合に、作動可能に連結されるポリヌクレオチド配列の発現をオンにすることができるか、又は発現が所望されない場合に発現をオフにすることができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例としては、限定されないが、メタロチオニンプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリンプロモーターが挙げられる。
受容体の発現を評価するために、細胞内に導入される発現ベクターはまた、ウイルスベクターを介してトランスフェクト又は感染させようとする細胞集団からの発現細胞の同定及び選択を容易にするために、選択可能なマーカー遺伝子若しくはレポーター遺伝子のいずれか又は両方を含有することができる。他の態様において、選択可能なマーカーは、別個のＤＮＡ片上に担持されてもよく、同時トランスフェクション手順で使用されてもよい。選択可能なマーカー及びレポーター遺伝子の両方に、適切な調節配列を隣接させて、宿主細胞での発現を可能にすることができる。有用な選択マーカーには、例えば、ネオ（ｎｅｏ）などの抗生物質耐性遺伝子が含まれる。
レポーター遺伝子は、潜在的にトランスフェクト又は形質導入された細胞を同定し、調節配列の機能性を評価するために使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物若しくは組織内に存在しないか、又はそれによって発現されない遺伝子であり、その発現が、いくつかの容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性によって現れるポリペプチドをコードする遺伝子である。ＤＮＡがレシピエント細胞内に導入された後の好適な時間に、レポーター遺伝子の発現をアッセイする。好適なレポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼ、又は緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子が含まれ得る（例えば、Ｕｉ－Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．，２０００ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４７９：７９－８２）。好適な発現系は周知であり、既知の技術を使用して調製することができるか、又は商業的に入手することができる。一般に、レポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す最小５’隣接領域を有する構築物は、プロモーターとして同定される。このようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結されてもよく、プロモーターにより駆動される転写を調節する能力について作用物質を評価するために使用されてもよい。
遺伝子を細胞内に導入及び発現する方法は、当該技術分野で既知である。発現ベクターの文脈において、ベクターは、当該技術分野における任意の方法によって、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母、又は昆虫細胞内に容易に導入され得る。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的、又は生物学的手段によって宿主細胞内に移入することができる。
ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝突、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが含まれる。ベクター及び／又は外因性核酸を含む細胞を産生するための方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための１つの方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。
目的のポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための生物学的方法には、ＤＮＡ及びＲＮＡベクターの使用が含まれる。ウイルスベクター、及び特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えば、ヒト細胞内に遺伝子を挿入するために最も広範に使用される方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスなどに由来し得る。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号及び同第５，５８５，３６２号を参照のこと。
ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための化学的手段には、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズなどのコロイド分散系、並びに水中油エマルション、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む、脂質ベースの系が含まれる。インビトロ及びインビボで送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。
宿主細胞内に外因性核酸を導入するために使用される方法に関わらず、又はそうでなければ本開示の抑制因子に細胞を曝露するために使用される方法に関わらず、宿主細胞内の組換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、様々なアッセイを実施することができる。このようなアッセイには、例えば、サザン及びノーザンブロッティング、ＲＴ－ＰＣＲ及びＰＣＲなどの当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ、例えば、本開示の範囲内に含まれる作用物質を同定するために免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロット）によって、又は本明細書に記載のアッセイによって、特定のペプチドの存在又は不在を検出することなどの「生化学的」アッセイが含まれる。
免疫細胞
本開示は、本明細書に記載の受容体、ベクター及びポリヌクレオチドを含む、免疫細胞を提供する。
いくつかの実施形態において、免疫細胞は、（ａ）（ｉ）主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体におけるがん細胞特異的抗原、若しくはそのペプチド抗原、又は（ｉｉ）主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体におけるＭＳＬＮ、若しくはそのペプチド抗原から選択される標的抗原に特異的な第１の細胞外リガンド結合ドメインを含む、第１の受容体と、（ｂ）主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）、又はＨＬＡ－Ａ＊０２との複合体における、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ１）、カテコール－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカインリガンド１６（ＣＸＣＬ１６）、ロイシンリッチリピートニューロナル４（ＬＲＲＮ４）、及びウロプラキン３Ｂ ＵＰＫ３Ｂ、又はそれらの抗原ペプチドから選択される非標的抗原に特異的な第２の細胞外リガンド結合を含む、第２の受容体と、を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体は、ＣＡＲ又はＴＣＲである。いくつかの実施形態において、第２の受容体は、抑制性キメラ抗原受容体又はＴＣＲなどの抑制性受容体である。
本開示は、配列番号３０３の配列を含む第１の受容体と、配列番号３４８の配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む第２の受容体と、を含む、免疫細胞を提供する。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、配列番号３４９若しくは配列番号３５０を含む配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％の同一性を有する配列によってコードされるｓｈＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、配列番号３０３の配列を含む第１の受容体、配列番号３４８の配列を含む第２の受容体、及び配列番号３４９又は３５０の配列を含むｓｈＲＮＡをコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の受容体及び第２の受容体は、単一のポリヌクレオチドによってコードされ、第１及び第２の受容体をコードする配列は、自己切断ポリペプチドをコードする配列によって分離される。いくつかの実施形態において、自己切断ポリペプチドは、ＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号３５１）の配列を含むＴ２Ａ自己切断ポリペプチドを含む。
本明細書で使用される場合、「免疫細胞」という用語は、先天性又は適応性（後天性）免疫系に関与する細胞を指す。例示的な先天性免疫細胞には、好中球、単球及びマクロファージなどの食細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球好酸球及び好塩基球などの多形核白血球、並びに単球、マクロファージ及び肥満細胞などの単核細胞が含まれる。後天性免疫において役割を有する免疫細胞には、Ｔ細胞及びＢ細胞などのリンパ球が含まれる。
本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞」とは、胸腺において発生する骨髄前駆体に由来するリンパ球の種類を指す。ヘルパーＣＤ４＋ Ｔ細胞、細胞傷害性ＣＤ８＋ Ｔ細胞、記憶Ｔ細胞、調節ＣＤ４＋ Ｔ細胞、及び幹記憶Ｔ細胞を含む、胸腺への移行時に発生する、いくつかの異なる種類のＴ細胞が存在する。異なる種類のＴ細胞は、それらのマーカーの発現に基づいて、当業者によって区別することができる。Ｔ細胞の種類を区別する方法は、当業者には容易に明らかになるであろう。
いくつかの実施形態において、第１の受容体及び第２の受容体はともに、標的細胞の存在下で免疫細胞を特異的に活性化する。
いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ガンマデルタＴ細胞、インバリアントＴ細胞、ｉＮＫ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、インバリアントＴ細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、インバリアントナチュラルキラーＴ細胞（ｉＮＫＴ細胞）である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｂ細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ＣＤ８－である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ＣＤ８＋である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ＣＤ４＋である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ＣＤ４－である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ＣＤ８－／ＣＤ４＋である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ＣＤ８＋ＣＤ４－Ｔ細胞である。
いくつかの実施形態において、免疫細胞は、非天然である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、単離される。
本開示のベクターを用いて、Ｔ細胞などの免疫細胞の集団を形質転換する方法は、当業者には容易に明らかになるであろう。例えば、ＣＤ３＋Ｔ細胞は、製造業者の指示に従って、ＣＤ３＋Ｔ細胞陰性単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用してＰＢＭＣから単離することができる。Ｔ細胞は、ＣＤ３／２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（１：１の細胞対ビーズ比）及び３００ユニット／ｍＬのＩＬ－２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）の存在下で、５％のヒトＡ／Ｂ血清及び１％のＰｅｎ／ｓｔｒｅｐを補充したＸ－Ｖｉｖｏ １５培地中で１×１０＾６細胞／ｍＬの密度で培養することができる。２日後、Ｔ細胞を、当該技術分野で既知の方法を使用して、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクターで形質導入することができる。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、５の感染多重度（ＭＯＩ）で形質導入される。次いで、細胞は、濃縮の前に更に５日間、ＩＬ－２又はＩＬ－７／１５／２１の組み合わせなどの他のサイトカイン中で培養することができる。Ｂ細胞などの免疫細胞の他の集団、又はＴ細胞の他の集団を単離及び培養する方法は、当業者には容易に明らかであろう。この方法は、潜在的なアプローチを概説しているが、これらの方法論は、急速に進化していることに留意すべきである。例えば、末梢血単核細胞の優れたウイルス形質導入は、５日間の増殖後に達成して、９９％超のＣＤ３＋が高度に形質導入された細胞集団を生成することができる。
ＴＣＲ、ＣＡＲ、抑制性受容体、受容体又はそれらをコードするベクターを含むＴ細胞の集団を活性化及び培養する方法は、当業者には容易に明らかであろう。
ＴＣＲを発現するためのＴ細胞の遺伝子修飾の前又は後に関わらず、Ｔ細胞は、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号、同第６，５３４，０５５号、同第６，９０５，６８０号、同第６，６９２，９６４号、同第５，８５８，３５８号、同第６，８８７，４６６号、同第６，９０５，６８１号、同第７，１４４，５７５号、同第７，０６７，３１８号、同第７，１７２，８６９号、同第７，２３２，５６６号、同第７，１７５，８４３号、同第５，８８３，２２３号、同第６，９０５，８７４号、同第６，７９７，５１４号、同第６，８６７，０４１号、同第１００４０８４６号、及び米国特許出願公開第２００６／０１２１００５号に一般的に記載されている方法を使用して活性化及び増殖することができる。
いくつかの実施形態において、本開示のＴ細胞は、インビトロで増殖及び活性化される。一般に、本開示のＴ細胞は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する作用物質及びＴ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドを、それに付着させた表面との接触によってインビトロで増殖される。特に、Ｔ細胞集団は、例えば、抗ＣＤ３抗体との接触によって本明細書に記載されるように刺激され得る。Ｔ細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激には、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞の集団は、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適切な条件下で、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体と接触させることができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかの増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を使用することができる。抗ＣＤ２８抗体の例としては、９．３、Ｂ－Ｔ３、ＸＲ－ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ、Ｂｅｓａｎｃｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）が挙げられ、当該技術分野で一般的に知られている他の方法として使用することができる（Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ．３０（８）：３９７５－３９７７，１９９８、Ｈａａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０（９）：１３１９１３２８，１９９９、Ｇａｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ．２２７（１－２）：５３－６３，１９９９）。
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞についての一次刺激シグナル及び共刺激シグナルは、異なるプロトコルによって提供され得る。例えば、各シグナルを提供する作用物質は、溶液中にあってもよいか、又は表面に結合していてもよい。表面に結合されたとき、作用物質は、同じ表面に結合されてもよく（すなわち、「シス」形成において）、又は別々の表面に結合されてもよい（すなわち、「トランス」形成において）。代替的に、一方の作用物質は表面に結合してもよく、他方の作用物質は溶液中にあってもよい。いくつかの実施形態において、共刺激シグナルを提供する作用物質は細胞表面に結合し、一次活性化シグナルを提供する作用物質は溶液中にあるか、又は表面に結合している。ある特定の実施形態において、両方の作用物質は、溶液中にあってもよい。別の実施形態において、作用物質は、可溶性形態であってもよく、次いで、Ｆｃ受容体を発現する細胞、又は作用物質に結合する抗体若しくは他の結合剤などの表面に架橋されてもよい。これに関して、例えば、本開示におけるＴ細胞の活性化及び増殖に使用するために企図される人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）については、米国特許出願公開第２００４／０１０１５１９号及び同第２００６／００３４８１０号を参照されたい。
いくつかの実施形態において、２つの作用物質は、同じビーズ上に固定化されるか、すなわち「シス」、又は別個のビーズに固定化される、すなわち「トランス」のいずれかで、ビーズ上に固定化される。例として、一次活性化シグナルを提供する作用物質は、抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であり、共刺激シグナルを提供する作用物質は、抗ＣＤ２８抗体又はその抗原結合断片であり、両方の作用物質は、同等の分子量で同じビーズに共固定化される。一実施形態において、ＣＤ４＋Ｔ細胞拡大及びＴ細胞増殖のためのビーズに結合した各抗体の１：１の比が使用される。いくつかの実施形態において、ビーズに結合したＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比は、１００：１～１：１００及びその間にある全ての整数値の範囲である。本開示の一態様において、抗ＣＤ３抗体よりも多くの抗ＣＤ２８抗体が粒子に結合し、すなわち、ＣＤ３：ＣＤ２８の比が１未満である。本開示のある特定の実施形態において、ビーズに結合した抗ＣＤ２８抗体対抗ＣＤ３抗体の比は、２：１を超える。
Ｔ細胞又は他の標的細胞を刺激するために、１：５００～５００：１及びそれらの間の任意の整数値の粒子対細胞の比が使用され得る。当業者であれば容易に理解することができるように、粒子対細胞の比は、標的細胞に対する粒径に依存し得る。例えば、小さなサイズのビーズは、少しの細胞にのみ結合することができ、一方、より大きなビーズは、多くの細胞に結合することができる。ある特定の実施形態において、細胞対粒子の比は、１：１００～１００：１及びそれらの間の任意の整数値の範囲であり、更なる実施形態において、その比は、１：９～９：１及びそれらの間の任意の整数値を含み、また、Ｔ細胞を刺激するために使用することもできる。いくつかの実施形態において、１：１の細胞対ビーズの比が使用される。当業者は、様々な他の比が、本開示での使用に好適であり得ることを理解するであろう。特に、比は、粒径、並びに細胞のサイズ及び種類に応じて変動することになる。
本開示の更なる実施形態において、Ｔ細胞などの細胞を、作用物質をコーティングしたビーズと合わせ、続いてビーズ及び細胞を分離し、次いで細胞を培養する。代替的な実施形態において、培養前に、作用物質をコーティングしたビーズ及び細胞を分離しないが、ともに培養する。更なる実施形態において、ビーズ及び細胞を、最初に、磁力などの力を加えることによって濃縮し、その結果、細胞表面マーカーのライゲーションが増加し、それによって細胞刺激が誘導される。
例として、細胞表面タンパク質は、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８が結合してＴ細胞に接触する、常磁性ビーズを可能にすることによってライゲーションされ得る。一実施形態において、細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞）及びビーズ（例えば、１：１の比のＤＹＮＡＢＥＡＤＳ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ常磁性ビーズ）を緩衝液中に合わせる。ここでも、当業者は、任意の細胞濃度が使用され得ることを容易に理解することができる。ある特定の実施形態において、粒子及び細胞がともに混合される体積を著しく減少させる（すなわち、細胞の濃度を増加させる）ことが望ましく、細胞及び粒子の最大限の接触を確保することができる。例えば、一実施形態において、約２０億個の細胞／ｍｌの濃度が使用される。別の実施形態において、１億個を超える細胞／ｍｌが使用される。更なる実施形態において、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、又は５０００万個の細胞／ｍｌの細胞の濃度が使用される。更に別の実施形態において、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、又は１億個の細胞／ｍｌからの細胞の濃度が使用される。更なる実施形態において、１億２５００万個又は１億５０００万個の細胞／ｍｌの濃度が使用され得る。いくつかの実施形態において、１×１０６個の細胞／ｍＬの密度で培養される細胞が使用される。
いくつかの実施形態において、混合物は、数時間（約３時間）～約１４日間、又はその間の任意の時間単位の整数値で培養されてもよい。別の実施形態において、ビーズ及びＴ細胞は、２～３日間ともに培養される。Ｔ細胞培養に適切な条件は、血清（例えば、ウシ胎仔又はヒト血清）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インスリン、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＴＧＦβ、及びＴＮＦ－α、又は当業者に既知の細胞の増殖のための任意の他の添加剤を含む、増殖及び生存に必要な因子を含有し得る適切な培地（例えば、最小必須培地又はＲＰＭＩ培地１６４０又はＸ－ｖｉｖｏ １５（Ｌｏｎｚａ））を含む。細胞の増殖のための他の添加剤には、界面活性剤、プラスマネート、並びに還元剤、例えば、Ｎ－アセチル－システイン及び２－メルカプトエタノールが含まれるが、これらに限定されない。培地には、ＲＰＭＩ １６４０、ＡＩＭ－Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｘ－Ｖｉｖｏ １５、及びＸ－Ｖｉｖｏ ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒが含まれてもよく、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、及びビタミンが添加されており、血清を含まないか、あるいは適切な量の血清（若しくは血漿）若しくは規定のセットのホルモン、並びに／又はＴ細胞の増殖及び拡大に十分な量のサイトカインが補充されている。いくつかの実施形態において、培地は、５％のヒトＡ／Ｂ血清、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）及び３００ユニット／ｍｌのＩＬ－２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を補充したＸ－ＶＩＶＯ－１５培地を含む。
Ｔ細胞は、増殖を支持するために必要な条件下、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）及び雰囲気（例えば、空気＋５％のＣＯ２）で維持される。
いくつかの実施形態において、本開示のＴＣＲ、ＣＡＲ、及び抑制性受容体を含むＴ細胞は、自己由来である。拡大及び遺伝子修飾の前に、Ｔ細胞の供給源が対象から得られる。Ｔ細胞などの免疫細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含む、多数の供給源から得ることができる。本開示のある特定の実施形態において、当該技術分野で利用可能な任意の数のＴ細胞株が使用され得る。本開示のある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離などの当業者に既知の任意の数の技術を使用して、対象から収集された血液の単位から得ることができる。
いくつかの実施形態において、個体の循環血液からの細胞は、アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス生成物は、典型的には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、及び血小板を含む、リンパ球を含有する。いくつかの実施形態において、アフェレーシスによって収集された細胞を洗浄して、血漿画分を除去し、その後の処理ステップのために細胞を適切な緩衝液又は培地中に入れてもよい。いくつかの実施形態において、細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。代替的な実施形態において、洗浄液はカルシウムを欠き、マグネシウムを欠いてもよいか、又は全てではないが多くの二価カチオンを欠いてもよい。当業者であれば容易に理解するであろうが、洗浄ステップは、製造業者の指示に従って、半自動化「フロースルー」遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ ２９９１細胞プロセッサ、Ｂａｘｔｅｒ ＣｙｔｏＭａｔｅ、又はＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｌｌ Ｓａｖｅｒ ５）を使用することによってなど、当業者に既知の方法によって達成され得る。洗浄後、細胞は、様々な生体適合性緩衝液、例えば、Ｃａ２＋非含有ＰＢＳ、Ｍｇ２＋非含有ＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａなど、又は緩衝液を伴うか、若しくは伴わない他の生理食塩水中で再懸濁され得る。代替的に、アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去し、細胞を培養培地中に直接再懸濁させてもよい。
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞などの免疫細胞は、赤血球を溶解し、単球を枯渇させることによって、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配を介した遠心分離によって、又は向流遠心分離によって、末梢血リンパ球から単離される。Ｔ細胞、Ｂ細胞、又はＣＤ４＋Ｔ細胞などの免疫細胞の特定の亜集団は、陽性又は陰性選択技術によって更に単離され得る。例えば、一実施形態において、Ｔ細胞は、所望のＴ細胞の陽性選択に十分な期間、抗ＣＤ４コンジュゲートビーズとのインキュベーションによって単離される。
陰性選択によるＴ細胞集団などの免疫細胞集団の濃縮は、陰性選択された細胞に固有の表面マーカーを対象とする抗体の組み合わせによって達成され得る。１つの方法は、陰性磁気免疫接着又はフローサイトメトリーによる細胞の選別及び／又は選択であり、これは、陰性に選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーを対象とするモノクローナル抗体のカクテルを使用する。例えば、陰性選択によってＣＤ４＋細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲ、及びＣＤ８に対する抗体を含む。
陽性又は陰性選択による免疫細胞の所望の集団の単離のために、細胞及び表面（例えば、ビーズなどの粒子）の濃度を変化させることができる。ある特定の実施形態において、ビーズ及び細胞がともに混合される体積を著しく減少させる（すなわち、細胞の濃度を増加させる）ことが望ましく、細胞及びビーズの最大限の接触を確保することができる。
いくつかの実施形態において、細胞は、２～１０℃又は室温のいずれかで様々な速度で、様々な長さの時間、回転子上でインキュベートされてもよい。
刺激用Ｔ細胞、又はＴ細胞などの免疫細胞が単離されるＰＢＭＣも、洗浄ステップ後に凍結することができる。理論に拘束されることを望まないが、凍結及びその後の解凍ステップは、細胞集団における顆粒球、及びある程度は単球を除去することによって、より均一な生成物を提供する。血漿及び血小板を除去する洗浄ステップの後、細胞を凍結溶液中に懸濁させることができる。多くの凍結溶液及びパラメータが当該技術分野で既知であり、この文脈において有用であるが、１つの方法は、２０％のＤＭＳＯ及び８％のヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳ、あるいは１０％のデキストラン４０及び５％のデキストロース、２０％のヒト血清アルブミン及び７．５％のＤＭＳＯ、若しくは３１．２５％のＰｌａｓｍａｌｙｔｅ－Ａ、３１．２５％のデキストロース５％、０．４５％のＮａＣｌ、１０％のデキストラン４０及び５％のデキストロース、２０％のヒト血清アルブミン、及び７．５％のＤＭＳＯを含有する培養培地、又は例えば、Ｈｅｓｐａｎ及びＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａを含有する他の好適な細胞凍結培地を使用することを含み、次いで、細胞は、毎分１°の速度で－８０℃まで凍結され、液体窒素貯蔵タンクの気相に保存される。制御凍結の他の方法、及び－２０℃又は液体窒素中での制御されていない即座の凍結を使用してもよい。
本開示は、本明細書に記載の活性化因子及び／又は遮断因子受容体を発現する免疫細胞を提供し、免疫細胞は、主要組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩ複合体の発現及び／又は機能を低下させる。
いくつかの実施形態において、免疫細胞は、自己由来である。例えば、免疫細胞は、治療レジメンの一部として細胞を受容する同じ対象から単離されるか、又は派生される。遮断因子受容体によるＭＨＣクラスＩの発現及び／又は機能を低下させるように自己免疫細胞を修飾することは、ＭＨＣクラスＩ抗原に特異的であることが有利であり得る。理論に拘束されることを望まないが、ＭＨＣクラスＩの発現及び／又は機能が低下するように自己免疫細胞を修飾することは、シス又はトランスのいずれかにおいて、免疫細胞によって発現されるＭＨＣクラスＩによる遮断因子受容体の結合を低下させる。
いくつかの実施形態において、免疫細胞は、全て同種異系である。同種免疫細胞は、免疫細胞が投与される対象以外のドナーに由来し得る。同種異系細胞は、様々な遺伝子型の対象に使用するために調製及び貯蔵される可能性があるため、同種免疫細胞は、細胞療法において「既製の」又は「普遍的な」と一般的に称されている。
ＭＨＣクラスＩ複合体の発現及び／又は機能を低下させる任意の好適な方法は、本開示の範囲内であると想定され、とりわけ、ＭＨＣクラスＩ構成要素をコードする１つ以上のＲＮＡをノックダウンする干渉ＲＮＡの発現、又はＭＨＣクラスＩ構成要素をコードする遺伝子の修飾を含む。
主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）は、適応免疫系に必要なポリペプチドのセットをコードする脊椎動物ゲノム上の遺伝子座である。これらの中には、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃ、並びにそれらの対立遺伝子を含む、ＭＨＣクラスＩポリペプチドがある。ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子は、高度に多型であり、全ての有核細胞において発現される。ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－ＣによってコードされるＭＨＣクラスＩポリペプチド及びそれらの対立遺伝子は、β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）とヘテロ二量体を形成し、細胞の表面上の抗原と複合体で存在する。本明細書で言及されるように、ＭＨＣクラスＩ遺伝子又はポリペプチドは、ＭＨＣ又は該ポリペプチドをコードする対応する遺伝子に見出される任意のポリペプチドを指してもよい。いくつかの実施形態において、本開示の免疫細胞は、ＭＨＣクラスＩポリペプチド、例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃ、並びにそれらの対立遺伝子を含む、抑制因子リガンドによって不活性化される。ＨＬＡ－Ａ対立遺伝子は、例えば、限定されないが、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：０１：０１、及び／又はＨＬＡ－Ａ＊０２タンパク質と同一若しくは類似のタンパク質をコードする任意の遺伝子であり得る。したがって、本明細書に記載の自己分泌シグナル伝達／結合を防止するために、免疫細胞内のＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃによってコードされるポリペプチド、並びにそれらの対立遺伝子の発現を除去又は低下させることが望ましい。
ＭＨＣクラスＩポリペプチド発現が低下した免疫細胞
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の免疫細胞は、内因性ＭＨＣクラスＩポリペプチドの対立遺伝子をコードする内因性遺伝子の発現又は機能を不活性化するか、又は低下若しくは除去するように修飾される。いくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩポリペプチドをコードする遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及び／又はＨＬＡ－Ｃである。ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ遺伝子座によってコードされる。ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃの各々は、多くのバリアント対立遺伝子を含み、これらの全ては、本開示の範囲内であると想定される。いくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩポリペプチドをコードする遺伝子は、ＨＬＡ－Ａである。いくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩポリペプチドをコードする遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ＊０２である。いくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩポリペプチドをコードする遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１である。いくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩポリペプチドをコードする遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：０１である。いくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩポリペプチドをコードする遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：０１：０１である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の遺伝子操作された免疫細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子産物の発現を低下又は除去するように修飾される。ベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ、すなわち、ＭＨＣ－Ｉ複合体と会合するタンパク質をコードする。ＭＨＣ－Ｉ複合体は、細胞表面上の抗原の提示に必要とされる。ＭＨＣ－Ｉ複合体は、Ｂ２Ｍが欠失されると破壊され、機能しない（Ｗａｎｇ Ｄ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．４：１２３４－１２４５（２０１５））。更に、Ｂ２Ｍ遺伝子は、当該技術分野で既知の遺伝子編集技術を使用して、高効率で破壊することができる（Ｒｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２３：２２５５－２２６６（２０１７））。Ｂ２Ｍを低下又は除去することは、免疫細胞の表面上の機能的ＭＨＣ Ｉを低下又は除去することができる。
本開示は、免疫細胞における内因性標的遺伝子を編集するための遺伝子編集システムを提供する。本開示は、標的遺伝子の配列に特異的な干渉ＲＮＡを提供する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＴＡＬＥＮ及び亜鉛フィンガーなどの遺伝子編集システムを使用して、二本鎖切断を生成することができ、これは、相同性指向修復又は非相同末端結合（ＮＨＥＪ）などの遺伝子修復機構を通じて、変異を導入するために使用され得る。破壊した末端の切除後のＮＨＥＪ、又は不適切な末端結合は、欠失を導入するために使用され得る。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、ＭＨＣ－Ｉ複合体のサブユニットをコードする遺伝子を含む。
標的遺伝子配列には、プロモーター、エンハンサー、イントロン、エクソン、イントロン／エクソンジャンクション、転写産物（ｐｒｅ－ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びスプライスバリアント）、並びに／又は３’及び５’非翻訳領域（ＵＴＲ）が含まれるが、これらに限定されない。任意の遺伝子エレメント又は遺伝子エレメントの組み合わせは、本明細書に記載される免疫細胞における遺伝子編集の目的のために標的化され得る。標的遺伝子に対する修飾は、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して、標的遺伝子又は遺伝子産物の発現又は機能の変化又は破壊をもたらす標的遺伝子を編集することによって達成することができる。
いくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩポリペプチドをコードする遺伝子を修飾することは、遺伝子の全て又は一部分を欠失させることを含む。いくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩポリペプチドをコードする遺伝子を修飾することは、遺伝子に変異を導入することを含む。いくつかの実施形態において、変異は、欠失、挿入、置換、又はフレームシフト変異を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子を修飾することは、核酸誘導型エンドヌクレアーゼを使用することを含む。
本明細書に記載される標的遺伝子についての遺伝子配列は、当該技術分野で既知である。配列は、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ又はＮＣＢＩヌクレオチドデータベースなどの公開データベースに見出すことができる。配列は、遺伝子識別子を使用して見出すことができ、例えば、ＨＬＡ－Ａ遺伝子が、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３１０５を有し、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子が、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３１０６を有し、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子が、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３１０７を有し、Ｂ２Ｍ遺伝子が、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：５６７及びＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿００００１５．１０を有する。遺伝子配列は、キーワードを使用して公開データベースを検索することによっても見出すことができる。例えば、ＨＬＡ－Ａ対立遺伝子は、キーワード「ＨＬＡ－Ａ＊０２」、「ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１」、「ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：０１」、又は「ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：０１：０１」を検索することによって、ＮＣＢＩヌクレオチドデータベース中に見出すことができる。これらの配列は、当該技術分野で既知の様々な遺伝子編集技術における標的化に使用することができる。表１０は、本明細書に記載の修飾のために標的化されたＨＬＡ－Ａ対立遺伝子及びＢ２Ｍ遺伝子配列の非限定的な例示的配列を提供する。
Figure 2023538114000147
当業者は、ＴがＵに置換されて、ＲＮＡ配列をＤＮＡ配列に変換することができ、逆もまた同様であることを理解し、両方とも本開示の標的遺伝子配列として想定される。
いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、核酸誘導型エンドヌクレアーゼを使用して、本明細書に記載の免疫細胞内で編集される。例示的な核酸誘導型エンドヌクレアーゼには、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９などのクラスＩＩエンドヌクレアーゼが含まれる。
本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲ」又は「ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集」とは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピートのセット、又はそのようなリピートのセットを含むシステムを指す。「Ｃａｓ」は、本明細書で使用される場合、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を指す。「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ」系とは、標的遺伝子をサイレンシングするか、ノックアウトするか、又は変異させるために使用することができる、ＣＲＩＳＰＲ及びＣａｓに由来する系を指す。この系は、プラスミド及びファージなどの外来遺伝子エレメントに耐性を付与し、後天性免疫の一形態を提供する原核生物免疫系の一種である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、遺伝子編集に使用するために修飾されている。これは、真核生物細胞内に、１つ以上の特異的に設計されたガイド核酸（ｇＮＡ）、典型的にはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、及びｇＮＡとリボヌクレオタンパク質複合体を形成する適切なＣａｓエンドヌクレアーゼを導入することによって達成される。ｇＮＡは、ｇＮＡ－エンドヌクレアーゼタンパク質複合体を標的ゲノム位置に誘導し、エンドヌクレアーゼは標的ゲノム位置に鎖切断を導入する。この鎖切断は、非相同末端結合（欠失につながる）又は相同修復（挿入を生成することができる）などの細胞機構によって修復することができ、それによって宿主細胞ゲノム内に遺伝子修飾を導入することができる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、クラス別及び種類別に分類される。クラス２系は、現在、３つの異なる種類（ＩＩ型、Ｖ型、及びＶＩ型）に分類される単一の干渉タンパク質を表す。遺伝子編集に好適な任意のクラス２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、例えば、ＩＩ型、Ｖ型又はＶＩ型系は、本開示の範囲内として想定される。例示的なクラス２のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系には、Ｃａｓ９、Ｃｓｎ２、及びＣａｓ４が含まれる。例示的なクラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ系には、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ及びＣａｓ１２ｋ（Ｃ２ｃ５）が含まれる。例示的なクラス２のＶＩ型系には、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ及びＣａｓ１３ｄが含まれる。
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座と呼ばれることもある、ＣＲＩＳＰＲ配列は、交互にリピート及びスペーサーを含む。天然に存在するＣＲＩＳＰＲにおいて、スペーサーは、通常、プラスミド又はファージ配列などの細菌に対して外来の配列を含む。本明細書に記載されるように、スペーサー配列はまた、「標的化配列」と称されてもよい。遺伝子操作のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系において、スペーサーは、標的遺伝子配列（ｇＮＡ）に由来する。
例示的なクラス２のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系は、タンパク質Ｃａｓ９に依存し、これは、二重らせんの各鎖に対して１つである、２つの活性切断部位を有するヌクレアーゼである。Ｃａｓ９及び修飾ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座ＲＮＡを組み合わせることは、遺伝子編集のための系において使用され得る。Ｐｅｎｎｉｓｉ（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４１：８３３－８３６。いくつかの実施形態において、免疫細胞を修飾するために使用されるＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である。
したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、塩基対を付加若しくは欠失することによって、又は早期停止を導入し、それによって標的の発現を低下させることによって、本明細書に記載の免疫細胞における編集のために標的化された遺伝子などの標的遺伝子を編集するために使用され得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、代替的に、可逆的に標的遺伝子をオフにするＲＮＡ干渉のように使用され得る。哺乳動物細胞において、例えば、ＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質を標的遺伝子プロモーターに誘導し、ＲＮＡポリメラーゼを立体的に遮断することができる。
Ｃａｓタンパク質は、任意の細菌又は古細菌Ｃａｓタンパク質に由来し得る。任意の好適なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、本開示の範囲内として想定される。他の態様において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１３、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、それらのホモログ、又はそれらの修飾型のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質、Ｃ２ｃ１タンパク質、Ｃ２ｃ２タンパク質、Ｃ２ｃ３タンパク質、Ｃａｓ３、Ｃａｓ３－ＨＤ、Ｃａｓ５、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ１０、又はこれらの組み合わせ若しくは複合体である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。
当該技術分野において既知である技術、例えば、米国公開第２０１４／００６８７９７号及びＣｏｎｇ（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８１９－８２３に記載されているものを使用して、標的遺伝子を阻害する、人工ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を生成することができる。例えば、Ｔｓａｉ（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３２：６ ５６９－５７６、米国特許第８，８７１，４４５号、同第８，８６５，４０６号、同第８，７９５，９６５号、同第８，７７１，９４５号、及び同第８，６９７，３５９号に記載されているものの、標的遺伝子を阻害する、当該技術分野において既知の他の人工ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系もまた、生成され得る。特定のＣａｓタンパク質に好適なｇＮＡを設計する方法は、当業者に知られているであろう。
本開示は、関連するポリペプチド（例えば、核酸誘導型エンドヌクレアーゼ）の活性を、標的核酸ゲノム内の特定の標的遺伝子配列に導くことができる遺伝子標的化ガイド核酸（ｇＮＡ）を提供する。ゲノム標的化核酸は、ＲＮＡであり得る。ゲノム標的化ＲＮＡは、本明細書において「ガイドＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」と称される。ガイドＲＮＡは、目的の標的核酸配列にハイブリダイズする標的化配列、及びＣＲＩＳＰＲリピート配列を少なくとも含むことができる。いくつかのＩＩ型系において、ｇＲＮＡはまた、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と呼ばれる第２のＲＮＡを含み、本明細書において「足場」配列とも称される。ＩＩ型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）において、ＣＲＩＳＰＲリピート配列及び足場配列は、互いにハイブリダイズして二本鎖を形成する。Ｖ型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）において、ｃｒＲＮＡは、二本鎖を形成する。両方の系において、二本鎖は、ガイドＲＮＡ及び部位特異的ポリペプチドが複合体を形成するように、部位特異的ポリペプチドに結合することができる。遺伝子標的化核酸は、部位特異的ポリペプチドとの関連性により、複合体に標的特異性を提供することができる。したがって、遺伝子標的化核酸は、部位特異的ポリペプチドの活性を導くことができる。
いくつかの実施形態において、本開示は、標的化配列及びガイドＲＮＡ足場配列を含むガイドＲＮＡを提供し、標的化配列は、標的遺伝子の配列に相補的である。
例示的なガイドＲＮＡには、約１５～２０塩基の標的化配列が含まれる。当業者に理解されるように、各ｇＲＮＡは、そのゲノム標的配列に相補的な標的化配列を含むように設計することができる。例えば、標的化配列の各々、例えば、表１１及び表１４に示されるＤＮＡ配列のＲＮＡ型から、そのＰＡＭ部位を表す３つの３’ヌクレオチドを引いたものを、単一のＲＮＡキメラ又はｃｒＲＮＡに入れることができる。
核酸を標的とする遺伝子は、二分子ガイドＲＮＡであってもよい。核酸を標的とする遺伝子は、単一分子ガイドＲＮＡであってもよい。遺伝子標的化核酸は、例えば、対合ｇＲＮＡを含む、当該技術分野で既知のガイドＲＮＡの任意の既知の構成、又は単一のステップで使用される複数のｇＲＮＡであり得る。コード配列及びスプライスジャンクションが存在するゲノム配列から明らかであるが、遺伝子発現に必要な他の特徴は特異的であり、不明確であり得る。
二分子ガイドＲＮＡは、ＲＮＡの２本鎖を含むことができる。第１の鎖は、５’から３’方向の配列、任意選択のスペーサー伸長配列、標的化配列、及び最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列を含む。第２の鎖は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列に相補的）、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、及び任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列を含むことができる。
ＩＩ型系における単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、５’から３’方向に、任意選択のスペーサー伸長配列、標的化配列、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列、単一分子ガイドリンカー、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、及び任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列を含むことができる。任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長は、ガイドＲＮＡへの追加の機能性（例えば、安定性）に寄与するエレメントを含むことができる。単一分子ガイドリンカーは、最小ＣＲＩＳＰＲリピート及び最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を連結して、ヘアピン構造を形成することができる。任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長は、１つ以上のヘアピンを含むことができる。
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ又は単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、標的化配列及び足場配列を含むことができる。いくつかの実施形態において、足場配列は、Ｃａｓ９ ｇＲＮＡ配列である。いくつかの実施形態において、足場配列は、ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号７７３）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含むＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、足場配列は、ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号７７３）を含むＤＮＡ配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が、Ｃａｓ９系であるそれらの実施形態において、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０ヌクレオチドの標的化配列を含むことができる。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０ヌクレオチド未満の標的化配列を含むことができる。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０を超えるヌクレオチド標的化配列を含むことができる。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に１７～３０ヌクレオチドを有する可変長標的化配列を含むことができる。
好適な足場配列、及び足場標的配列の配置は、エンドヌクレアーゼの選択に依存し、当業者に知られているであろう。
ＩＩ型系における単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、例えば、Ｃａｓ９は、５’から３’方向に、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列及び標的化配列を含むことができる。
例示として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系において使用されるガイドＲＮＡ、又は他のより小さなＲＮＡは、以下に例示され、当該技術分野で説明されているように、化学的手段によって容易に合成され得る。化学的合成手順が継続的に拡大している一方で、ポリヌクレオチド長が、１００ヌクレオチド程度を超えて著しく増加するにつれて、高速液体クロマトグラフィー（ＰＡＧＥなどのゲルの使用を回避するＨＰＬＣ）などの手順によるこのようなＲＮＡの精製は、より困難になる傾向がある。より長いＲＮＡを生成するために使用される１つのアプローチは、ともにライゲーションされる２つ以上の分子を産生することである。Ｃａｓ９又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするものなどの、はるかに長いＲＮＡは、より容易に酵素的に生成される。様々な種類のＲＮＡ修飾は、ＲＮＡの化学的合成及び／又は酵素的生成の間又は後に導入することができ、例えば、当該技術分野で説明されているように、安定性を向上させ、先天性免疫応答の可能性若しくは程度を低減し、かつ／又は他の属性を向上させる修飾を導入することができる。
ｇＲＮＡの標的化配列は、目的の標的核酸中の配列にハイブリダイズする。ゲノム標的化核酸の標的化配列は、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対合）を介して、配列特異的な様式で標的核酸と相互作用することができる。標的化配列のヌクレオチド配列は、目的の標的核酸の配列に応じて変化し得る。
本明細書に記載のＣａｓ９系において、標的化配列は、系で使用されるＣａｓ９酵素のＰＡＭの逆相補体の５’に位置する標的核酸にハイブリダイズするように設計することができる。標的化配列は、標的配列と完全に一致し得るか、又はミスマッチを有し得る。各ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、標的ＤＮＡにおいて認識される、特定の方向及び位置における特定のＰＡＭ配列を有してもよい。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９は、標的核酸において、配列５’－ＮＲＧ－３’を含むＰＡＭを認識し、Ｒは、Ａ又はＧのいずれかを含み、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、Ｎは、標的化配列によって標的とされる標的核酸配列のすぐ３’である。適切なＰＡＭ配列の選択は、当業者には明白であろう。
標的配列は、ｇＲＮＡの標的化配列に相補的であり、それとハイブリダイズする。標的核酸配列は、２０ヌクレオチドを含むことができる。標的核酸は、２０ヌクレオチド未満を含むことができる。標的核酸は、２０ヌクレオチド超を含むことができる。標的核酸は、少なくとも、５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０個以上のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態において、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が、Ｃａｓ９系であるそれらの実施形態において、標的核酸配列は、ＰＡＭ配列の逆相補体の第１のヌクレオチドのすぐ５’の２０ヌクレオチドを含むことができる。この標的核酸配列は、多くの場合、ＰＡＭ鎖又は標的鎖と称され、相補的核酸配列は、多くの場合、非ＰＡＭ鎖又は非標的鎖と称される。当業者は、標的化配列が、標的核酸の非ＰＡＭ鎖にハイブリダイズすることを認識するであろう。例えば、ＵＳ２０１９／０１８５８４９Ａ１を参照されたい。
いくつかの例において、標的化配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％である。いくつかの例において、標的化配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、最大で約３０％、最大で約４０％、最大で約５０％、最大で約６０％、最大で約６５％、最大で約７０％、最大で約７５％、最大で約８０％、最大で約８５％、最大で約９０％、最大で約９５％、最大で約９７％、最大で約９８％、最大で約９９％、又は１００％である。いくつかの例において、標的化配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、標的核酸の相補鎖の標的配列の６つの連続した最も５’側のヌクレオチドにわたって１００％である。標的化配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、約２０個の連続したヌクレオチドにわたって少なくとも６０％であり得る。標的化配列及び標的核酸の長さは、１つのバルジ又は複数のバルジと考えられ得る、１～６ヌクレオチドによって異なり得る。
標的化配列は、当業者に既知のコンピュータプログラムを使用して設計又は選択することができる。コンピュータプログラムは、予測される融解温度、二次構造形成、予測されるアニーリング温度、配列同一性、ゲノムコンテキスト、クロマチンアクセシビリティ、％ＧＣ、ゲノム発生頻度（例えば、同一であるか、又は類似しているが、ミスマッチ、挿入、又は欠失の結果として１つ以上のスポットで変化する配列の）、メチル化状態、ＳＮＰの存在などの変数を使用することができる。利用可能なコンピュータプログラムは、入力として、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ、公式の遺伝子記号、Ｅｎｓｅｍｂｌ Ｇｅｎｅ ＩＤ、ゲノム座標、又はＤＮＡ配列を取得し、入力として指定された適切なゲノム領域を標的とするｓｇＲＮＡを含む出力ファイルを作成することができる。コンピュータプログラムはまた、標的遺伝子についてのｓｇＲＮＡのオンターゲット及びオフターゲット結合を示す統計及びスコアの要約を提供することができる（Ｄｏｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３４：１８４－１９１（２０１６））。本開示は、標的化配列を含むガイドＲＮＡを提供する。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡ足場配列を更に含む。いくつかの実施形態において、標的化配列は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、又はそれらの対立遺伝子からなる群から選択される標的遺伝子の配列に相補的である。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ遺伝子である。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子である。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子である。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、標的化配列は、表１１及び１４に開示される配列と約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％の同一性を共有するか、又はそれと同一である配列を含む。
いくつかの実施形態において、ｇＮＡは、内因性ＨＬＡ－Ａ遺伝子座の配列を特異的に標的とする。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ遺伝子座の配列を特異的に標的とするｇＮＡは、表１１に開示される配列から選択される配列と約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ遺伝子座の配列を特異的に標的とするｇＮＡは、表１１に開示される配列から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態において、ｇＮＡは、ＨＬＡ－Ａ＊０２対立遺伝子の配列を特異的に標的とする。例えば、ｇＲＮＡは、全てのＨＬＡ－Ａ＊０２対立遺伝子によって共有される配列を特異的に標的とし、それとハイブリダイズするが、ＨＬＡ－Ａ＊０２及びＨＬＡ－Ａ＊０３対立遺伝子によって共有されない。いくつかの実施形態において、ｇＮＡは、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１対立遺伝子の配列を特異的に標的とする。いくつかの実施形態において、ｇＮＡは、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：０１対立遺伝子の配列を特異的に標的とする。いくつかの実施形態において、ｇＮＡは、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：０１：０１対立遺伝子の配列を特異的に標的とする。いくつかの実施形態において、ｇＮＡは、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：０１：０１対立遺伝子の配列を特異的に標的とする。
いくつかの実施形態において、ｇＮＡは、ＨＬＡ－Ａ＊０２のコードＤＮＡ配列を特異的に標的とする。
いくつかの実施形態において、ｇＮＡは、１０００を超えるＨＬＡ－Ａ＊０２対立遺伝子によって共有されるコードＤＮＡ配列を特異的に標的とする。いくつかの実施形態において、１０００を超えるＨＬＡ－Ａ＊０２対立遺伝子におけるコードＤＮＡ配列を特異的に標的とするｇＮＡは、表１１に記載の配列から選択される配列と約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％の同一性を共有するか、又はそれと同一である配列を含む。
表１１～１４の配列をＤＮＡ配列として提示する。当業者は、対応するＲＮＡ配列に到達するために、表１１～１４に記載のものを含む任意のＤＮＡ配列において、チミン（Ｔ）がウラシル（Ｕ）に置き換えられ得ることを理解するであろう。
Figure 2023538114000148
Figure 2023538114000149
表１１に開示される配列は、ＰＡＭ配列を含む、対応するゲノム配列を含む。当業者は、ｇＲＮＡの標的化配列が、ｇＲＮＡについての対応するＰＡＭ部位を表す、表１１の配列の３つの３’末端ヌクレオチドを含まないことを理解するであろう。
本開示は、Ｂ２Ｍ遺伝子に特異的な標的化配列を含むｇＮＡを提供する。いくつかの実施形態において、ｇＮＡは、Ｂ２Ｍ遺伝子のコード配列（ＣＤＳ）配列を特異的に標的とする。いくつかの実施形態において、ｇＮＡは、Ｂ２Ｍ遺伝子プロモーター配列を標的とする配列を含む。
いくつかの実施形態において、ｇＮＡは、標的化配列及びｇＮＡ足場配列を含む。いくつかの実施形態において、標的化配列は、表１２に示される配列、又はそれと約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％の同一性を共有する配列を含む。
いくつかの実施形態において、標的化配列は、Ｂ２Ｍ遺伝子の配列に相補的である。いくつかの実施形態において、Ｂ２Ｍ遺伝子は、表１０に示されるＢ２Ｍ配列と約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％の同一性を共有する配列を含む。
Figure 2023538114000150
Figure 2023538114000151
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の免疫細胞は、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集を使用して編集される。
「ＴＡＬＥＮ」又は「ＴＡＬＥＮ遺伝子編集」とは、標的遺伝子を編集するために使用される人工ヌクレアーゼである、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼを指す。
ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合することによって人工的に産生される。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ菌に由来する転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）を操作して、ＴＣＲサブユニット、ＭＨＣクラスＩ複合体成分、又はＣＤ５２などの標的遺伝子の一部分を含む、任意の所望のＤＮＡ配列に結合させることができる。操作されたＴＡＬＥをＤＮＡ切断ドメインと合わせることにより、標的遺伝子配列を含む、任意の所望のＤＮＡ配列に特異的な制限酵素を産生することができる。次いで、これらを細胞内に導入することができ、それらをゲノム編集に使用することができる。
ＴＡＬＥＮを産生するために、ＴＡＬＥタンパク質は、野生型又は変異Ｆｏｌｄエンドヌクレアーゼである、ヌクレアーゼ（Ｎ）に融合される。ＦｏｋＩに対するいくつかの変異は、そのＴＡＬＥＮでの使用のために作製されており、これらは、例えば、切断特異性又は活性を改善する。
ＦｏｋＩドメインは二量体として機能し、適切な配向及び間隔を有する標的ゲノム内の部位に対して独自のＤＮＡ結合ドメインを有する２つの構築物を必要とする。ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインと、ＦｏｋＩ切断ドメインとの間のアミノ酸残基の数、及び２つの個々のＴＡＬＥＮ結合部位の間の塩基の数の両方は、高レベルの活性を達成するための重要なパラメータであるように見える。
標的遺伝子内の配列に特異的なＴＡＬＥＮは、モジュール成分を使用する様々なスキームを含む、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して構築することができる。
いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、ＺＦＮ遺伝子編集を使用して、本明細書に記載の免疫細胞において編集される。
「ＺＦＮ」又は「亜鉛フィンガーヌクレアーゼ」又は「ＺＦＮ遺伝子編集」とは、標的遺伝子を編集するために使用され得る人工ヌクレアーゼである、亜鉛フィンガーヌクレアーゼを指す。
ＴＡＬＥＮと同様に、ＺＦＮは、ＤＮＡ結合ドメインに融合したＦｏｌｄヌクレアーゼドメイン（又はその誘導体）を含む。ＺＦＮの場合、ＤＮＡ結合ドメインは、１つ以上の亜鉛フィンガーを含む。
亜鉛フィンガーは、１つ以上の亜鉛イオンによって安定化された小さなタンパク質構造モチーフである。亜鉛フィンガーは、例えば、Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２を含むことができ、およそ３ｂｐ配列を認識することができる。既知の特異性の様々な亜鉛フィンガーを組み合わせて、約６、９、１２、１５、又は１８ｂｐ配列を認識するマルチフィンガーポリペプチドを産生することができる。ファージディスプレイ、酵母ワンハイブリッドシステム、細菌ワンハイブリッド及びツーハイブリッドシステム、並びに哺乳動物細胞を含む、特定の配列を認識する亜鉛フィンガー（及びそれらの組み合わせ）を生成するために、様々な選択及びモジュラーアセンブリ技術が利用可能である。
ＴＡＬＥＮと同様に、ＺＦＮは、ＤＮＡを切断するために二量体化しなければならない。したがって、一対のＺＦＮは、非回文ＤＮＡ部位を標的とするために必要である。２つの個々のＺＦＮは、それらのヌクレアーゼが適切に離間した状態で、ＤＮＡの反対側の鎖に結合しなければならない。
また、ＴＡＬＥＮと同様に、ＺＦＮは、ＤＮＡ内に二本鎖切断を作り出すことができ、これは、不適切に修復された場合にフレームシフト変異を作り出すことができ、細胞における標的遺伝子又は遺伝子産物の発現及び量の減少をもたらす。ＺＦＮは、標的遺伝子内で変異するために相同組換えとともに使用することもできる。
標的遺伝子内の配列に特異的なＺＦＮは、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して構築することができる。
いくつかの実施形態において、１つ以上のＭＣＨ－Ｉ成分の発現及び機能は、ＲＮＡ干渉を使用して低減される。「ＲＮＡｉ」又は「ＲＮＡ干渉」とは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって媒介される、配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのプロセスを指す。ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ショートヘアピンＲＮＡ）、ｄｄＲＮＡ（ＤＮＡ指向性ＲＮＡ）、ｐｉＲＮＡ（Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ）、又はｒａｓｉＲＮＡ（リピート関連ｓｉＲＮＡ）などの二本鎖ＲＮＡ、及びそれらの修飾形態は全て、ＲＮＡ干渉を媒介することができる。これらのｄｓＲＮＡ分子は、商業的に利用可能であり得るか、又は既知の配列情報に基づいて設計及び調製され得る。これらの分子のアンチセンス鎖は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、又はそれらの組み合わせを含むことができる。ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドには、標的遺伝子の発現を阻害するＤＮＡ及びＲＮＡからなる二本鎖ポリヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。ｄｓＲＮＡ分子は、本明細書に記載されるように、１つ以上の修飾ヌクレオチドも含むことができ、これらは、いずれか又は両方の鎖に組み込むことができる。
ＲＮＡｉ遺伝子サイレンシング又はノックダウンにおいて、標的遺伝子の一部分に相補的である第１の（アンチセンス）鎖、及び第１のアンチセンス鎖に完全に又は部分的に相補的である第２の（センス）鎖を含むｄｓＲＮＡを生物に導入する。生物に導入した後、標的遺伝子特異的ｄｓＲＮＡは、比較的小さな断片（ｓｉＲＮＡ）に処理され、その後、生物全体に分布し、標的遺伝子のメッセンジャーＲＮＡを減少させ、標的遺伝子の完全又は部分的な欠失から生じる表現型に非常に似ているようになり得る表現型をもたらすことができる。
細胞内のある特定のｄｓＲＮＡは、リボヌクレアーゼＩＩＩ酵素である、Ｄｉｃｅｒ酵素の作用を受けることができる。Ｄｉｃｅｒは、ｄｓＲＮＡを、ｄｓＲＮＡのより短い部分、すなわち、ｓｉＲＮＡに処理することができる。ＲＮＡｉはまた、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られているエンドヌクレアーゼ複合体も含む。Ｄｉｃｅｒによる切断後、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡ標的のＲＩＳＣ複合体及び直接切断に入る。ｓｉＲＮＡの他方の鎖は、パッセンジャー鎖である。標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中央で行われる。したがって、ｓｉＲＮＡは、配列特異的な様式でＲＮＡ干渉を媒介することによって、遺伝子発現を下方制御又はノックダウンすることができる。
ＲＮＡ干渉に関して本明細書で使用される場合、「標的遺伝子」又は「標的配列」とは、対応するＲＮＡが、本明細書に記載されるように、ｄｓＲＮＡ又はｓｉＲＮＡを使用してＲＮＡｉ経路を介して分解するために標的化される遺伝子又は遺伝子配列を指す。例示的な標的遺伝子配列を表１０に示す。例えば、ｓｉＲＮＡを使用して遺伝子を標的化するために、ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子又は配列の少なくとも一部分に相補的、又は実質的に相補的なアンチセンス領域、及びアンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含む。一旦細胞内に導入されると、ｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣ複合体に、標的配列を含むＲＮＡを切断するように指示し、それによってＲＮＡを分解する。本開示は、干渉ＲＮＡを提供する。本開示の二本鎖ＲＮＡ分子は、当該技術分野で既知の任意の種類のＲＮＡ干渉分子の形態であってもよい。いくつかの実施形態において、二本鎖ＲＮＡ分子は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。他の実施形態において、二本鎖ＲＮＡ分子は、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子である。他の実施形態において、二本鎖ＲＮＡ分子は、細胞内で処理されてｓｉＲＮＡを産生するＤｉｃｅｒ基質である。他の実施形態において、二本鎖ＲＮＡ分子は、マイクロＲＮＡ前駆体分子の一部である。
いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒ基質として好適な長さであり、ＲＩＳＣ活性ｓｉＲＮＡ分子を産生するように処理され得る。例えば、Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，ＵＳ２００５／０２４４８５８を参照されたい。
Ｄｉｃｅｒ基質二本鎖ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ）は、活性ｓｉＲＮＡを産生するためにＤｉｃｅｒによって処理されるのに十分な長さのものであり得、以下の特性のうちの１つ以上を更に含み得る：（ｉ）Ｄｉｃｅｒ基質ｓｈＲＮＡは、例えば、アンチセンス鎖上に３’オーバーハングを有する非対称であってもよく、（ｉｉ）Ｄｉｃｅｒ基質ｓｈＲＮＡは、活性ｓｉＲＮＡへのＤｉｃｅｒ結合及びｄｓＲＮＡのプロセシングの配向、例えば、１つ以上のＤＮＡヌクレオチドの組み込みを指示するために、センス鎖上に修飾された３’末端を有してもよく、（ｉｉｉ）Ｄｉｃｅｒ基質ｄｓＲＮＡの第１及び第２の鎖は、２１～３０ｂｐの長さであってもよい。。
いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡは、Ｂ２Ｍ ｍＲＮＡの配列に相補的な配列を含む。いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡは、Ｂ２Ｍ ｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介性分解を誘導することができる。いくつかの実施形態において、Ｂ２Ｍ ｍＲＮＡ配列は、コード配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｂ２Ｍ ｍＲＮＡ配列は、非翻訳領域を含む。
いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡは、ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｍＲＮＡの配列に相補的な配列を含む。いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡは、ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介性分解を誘導することができる。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｍＲＮＡ配列は、コード配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｍＲＮＡ配列は、非翻訳領域を含む。
いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡは、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡは、Ｂ２Ｍ ｍＲＮＡに相補的な配列を５’から３’末端に有する第１の配列と、第１の配列に相補的な配列を５’から３’末端に有する第２の配列と、を含み、第１の配列及び第２の配列は、ｓｈＲＮＡを形成する。
いくつかの実施形態において、第１の配列は、１８、１９、２０、２１、又は２２ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、第１の配列は、表１３及び１４に示される配列から選択される配列に相補的である。いくつかの実施形態において、第１の配列は、２５％以上及び６０％未満のＧＣ含量を有する。いくつかの実施形態において、第１の配列は、表１３及び１４に示される配列から選択される配列に相補的である。いくつかの実施形態において、第１の配列は、同じ塩基の４つのヌクレオチド、又は７つのＣ若しくはＧヌクレオチド塩基のランを含まない。いくつかの実施形態において、第１の配列は、２１ヌクレオチドである。
第１の配列に相補的な例示的な標的Ｂ２Ｍ配列を表１３に示す。
ある場合には、第１の配列は、標的核酸配列と１００％の同一性、すなわち、完全な同一性、相同性、相補性を有し得る。他の場合には、第１の配列と標的核酸配列との間に１つ以上のミスマッチが存在し得る。例えば、センス領域と標的核酸配列との間に１、２、３、４、５、６、又は７個のミスマッチがあり得る。
表１３に示す配列をＤＮＡ配列として提示する。表１３に示す全ての配列において、チミン（Ｔ）は、標的ｍＲＮＡ配列の配列に到達するためにウラシル（Ｕ）によって置き換えられ得る。
Figure 2023538114000152
Figure 2023538114000153
Figure 2023538114000154
Ｂ２Ｍ ｓｈＲＮＡをコードする例示的な配列は、ＧＣＡＣＴＣＡＡＡＧＣＴＴＧＴＴＡＡＧＡＴＣＧＡＡＡＴＣＴＴＡＡＣＡＡＧＣＴＴＴＧＡＧＴＧＣ（配列番号３４９）の配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。Ｂ２Ｍ ｓｈＲＮＡをコードする更なる例示的な配列は、ＧＴＴＡＡＣＴＴＣＣＡＡＴＴＴＡＣＡＴＡＣＣＧＡＡＧＴＡＴＧＴＡＡＡＴＴＧＧＡＡＧＴＴＡＡＣ（配列番号３５０）の配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡは、ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｍＲＮＡの配列に相補的な配列を含む。いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡは、ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介性分解を誘導することができる。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｍＲＮＡ配列は、コード配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｍＲＮＡ配列は、非翻訳領域を含む。
いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡは、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡは、ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｍＲＮＡに相補的な配列を５’から３’末端に有する第１の配列と、第１の配列に相補的な配列を５’から３’末端に有する第２の配列と、を含み、第１の配列及び第２の配列は、ｓｈＲＮＡを形成する
第１の配列に相補的な例示的な標的ＨＬＡ配列を表１４に示す。
Figure 2023538114000155
Figure 2023538114000156
いくつかの実施形態において、第１の配列及び第２の配列は、ループと称されることもある、リンカーによって分離される。いくつかの実施形態において、第１の配列及び第２の配列の両方は、１つの一本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡベクターによってコードされる。いくつかの実施形態において、ループは、第１の配列と第２の配列との間にある。これらの実施形態において、第１の配列及び第２の配列は、ハイブリダイズして二本鎖領域を形成する。第１の配列及び第２の配列は、リンカー配列によって連結され、「ヘアピン」又は「ステムループ」構造を形成する。ｓｈＲＮＡは、一本鎖分子の対向する末端に相補的な第１の配列及び第２の配列を有することができ、その結果、分子は、相補的な配列部分と二本鎖領域を形成することができ、鎖は、リンカー（すなわちループ配列）によって二本鎖領域の一端で連結される。リンカー、又はループ配列は、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカーのいずれかであり得る。リンカーは、共有結合又は非共有結合相互作用を介して、第１の配列、及び任意選択で、第２の配列と相互作用することができる。
任意の好適なヌクレオチドループ配列は、本開示の範囲内として想定される。本開示のｓｈＲＮＡは、ｓｈＲＮＡの第１の配列を、ｓｈＲＮＡの第２の配列に結合するヌクレオチド、非ヌクレオチド、又は混合ヌクレオチド／非ヌクレオチドリンカーを含んでもよい。ヌクレオチドループ配列は、長さが、２ヌクレオチド以上、例えば、長さが、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５ヌクレオチドであり得る。例示的なループ配列は、表１６に開示されている。
いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡは、５’隣接配列及び３’隣接配列を更に含む。いくつかの実施形態において、５’隣接配列は、第１の配列の５’末端に連結され、３’隣接配列は、第２の配列の３’末端に連結される。
理論に拘束されることを望まないが、マイクロＲＮＡで見出されるものと同様の５’及び３’配列を有するｓｈＲＮＡステムループ配列を隣接させることで、内因性マイクロＲＮＡプロセシング機構によるプロセシングのためにｓｈＲＮＡを標的とすることができ、ｓｈＲＮＡプロセシングの有効性を高めることができると考えられる。代替的に、又は加えて、隣接配列は、ポリメラーゼＩＩ又はポリメラーゼＩＩＩプロモーターとのｓｈＲＮＡ適合性を増加させ、ｓｈＲＮＡ発現のより効果的な調節をもたらし得る。
いくつかの実施形態において、５’隣接配列は、表１５に示される配列から選択される。例示的な隣接配列を表１５に示す。
Figure 2023538114000157
いくつかの実施形態において、第１及び第２の配列は、一本鎖ポリヌクレオチド上に存在し、第１の配列及び第２の配列は、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５ヌクレオチドによって分離され、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５ヌクレオチドは、ｓｈＲＮＡ内のループ領域を形成する。いくつかの実施形態において、ループ領域は、表１６に記載の配列から選択される配列を含む。
Figure 2023538114000158
本開示のｓｈＲＮＡは、化学合成によって、インビトロ転写によって、又はＤｉｃｅｒ若しくは同様の活性を有する別の適切なヌクレアーゼによる、より長い二本鎖ＲＮＡの切断によって外因的に生成され得る。従来のＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを使用して保護されたリボヌクレオシドホスホロアミダイトから産生される化学合成されたｓｉＲＮＡは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘ．）、Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘ．）．Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）、又はＤｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，Ｃｏｌｏ．）などの商業的供給源から得ることができる。ｓｉＲＮＡは、例えば、溶媒若しくは樹脂による抽出、沈殿、電気泳動、クロマトグラフィー、又はそれらの組み合わせによって精製することができる。代替的に、ｓｉＲＮＡは、試料処理による損失を回避するために、ほとんど精製せずに使用してもよい。
いくつかの実施形態において、本開示のｓｈＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡをコードする核酸が、例えば、好適なプロモーターの制御下でクローニングされている発現ベクターを使用して産生され得る。
医薬組成物
本開示は、本開示の第１及び第２の受容体、並びに薬学的に許容される希釈剤、担体、又は賦形剤を含む免疫細胞を含む、医薬組成物を提供する。
このような組成物は、中性緩衝食塩水、ホスフェート緩衝食塩水などの緩衝液、グルコース、マンノース、スクロース又はデキストラン、マンニトールなどの炭水化物、タンパク質、ポリペプチド又はグリシンなどのアミノ酸、抗酸化剤、ＥＤＴＡ又はグルタチオンなどのキレート剤、及び防腐剤を含み得る。
いくつかの実施形態において、免疫細胞は、第１の受容体及び第２の受容体の両方を発現する。いくつかの実施形態において、免疫細胞の少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、又は約９５％は、第１の受容体及び第２の受容体の両方を発現する。いくつかの実施形態において、免疫細胞の少なくとも９０％は、第１の受容体及び第２の受容体の両方を発現する。
がんの治療
対象において複数のがん細胞を死滅させるか、又はがんを治療する方法であって、治療有効量の本開示の第１及び第２の受容体を含む免疫細胞を含む組成物を対象に投与することを含む、方法が、本明細書に提供される。免疫細胞は、同じ細胞内で両方の受容体を発現する。
がんは、異常な細胞が制御できずに分裂し、近くの組織に広がる疾患である。いくつかの実施形態において、がんは、液体腫瘍又は固形腫瘍を含む。例示的な液体腫瘍には、白血病及びリンパ腫が含まれる。がんは、上皮組織を含む、事実上体内の臓器で生じ得る。複数のがん細胞が、第１の活性化因子リガンドを発現し、第２の抑制因子リガンドを発現しない、任意のがんは、本開示の範囲内であると想定される。例えば、本明細書に記載の方法を使用して治療することができるＭＳＬＮ陽性がんには、中皮腫、卵巣がん、子宮頸がん、子宮がん、胃がん、膵臓がん、肺腺がんなどの肺がん、結腸直腸がん及び胆管がんが含まれる。
いくつかの実施形態において、複数のがん細胞は、標的抗原を発現する。いくつかの実施形態において、対象の複数のがん細胞は、ＭＳＬＮを発現する。ＭＳＮＬ陽性がんには、中皮腫がん、卵巣がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、食道がん、頭頸部がん、腎臓がん、子宮がん、胃がん、膵臓がん、肺がん、肺腺がん、結腸直腸がん、又は胆管がん、及び他の固形上皮腫瘍が含まれる。ＭＳＬＮを発現する更なるがんには、再発性、難治性又は転移性の胃がん、食道がん、頭頸部がん、及び腎臓がんが含まれる。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮ陽性がんは、上皮腫瘍、例えば、がん腫を含む。
ＭＳＬＮ＋腫瘍を有する対象においてＭＳＬＮ＋がんを治療する方法であって、腫瘍が、ＭＨＣクラスＩ遺伝子座においてヘテロ接合性の喪失を有する、方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、方法は、有効量の本明細書に記載の免疫細胞又は医薬組成物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）対象の正常細胞及び複数のがん細胞のＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、又はＨＬＡ－Ｃ遺伝子型又は発現を決定することと、（ｂ）対象の複数のがん細胞におけるＭＳＬＮの発現を決定することと、（ｃ）正常細胞が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、又はＨＬＡ－Ｃ非標的抗原を発現し、複数のがん細胞が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、又はＨＬＡ－Ｃ非標的抗原を発現せず、また、複数のがん細胞がＭＳＬＮ陽性である場合、有効量の本開示の免疫細胞又は医薬組成物を対象に投与することと、を含む。いくつかの実施形態において、例えば、がんが、ＭＳＬＮ＋であることが知られているそれらの実施形態において、方法は、（ａ）対象の正常細胞及び複数のがん細胞のＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ又はＨＬＡ－Ｃ遺伝子型又は発現を決定することと、（ｂ）正常細胞が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、又はＨＬＡ－Ｃ非標的抗原を発現し、複数のがん細胞が、非標的抗原を発現しない場合、有効量の本開示の免疫細胞又は医薬組成物を対象に投与することと、を含む。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、又はＨＬＡ－Ｃ＊０７を含む。
いくつかの実施形態において、複数のがん細胞は、ＩＣＡＭ１、ＣＯＭＴ、又はＣＸＣＬ１６の多型対立遺伝子を発現しない。例えば、がん細胞は、その遺伝子座におけるヘテロ接合性の喪失を通じて、ＣＡＭ１、ＣＯＭＴ又はＣＸＣＬ１６の対立遺伝子を喪失している。
いくつかの実施形態において、複数のがん細胞は、ＬＲＲＮ４若しくはＵＰＫ３Ｂを発現しないか、又は正常細胞よりも低い発現を有する。
本開示は、対象においてがんを治療する方法であって、（ａ）ＩＣＡＭ１の多型遺伝子座、ＣＯＭＴの多型遺伝子座、及びＣＸＣＬ１６の多型遺伝子座からなる群から選択される多型遺伝子座において、対象の正常細胞及び複数のがん細胞の遺伝子型を決定することと、（ｂ）複数のがん細胞におけるＭＳＬＮの発現を決定することと、（ｃ）正常細胞が多型遺伝子座に対してヘテロ接合性であり、複数のがん細胞が多型遺伝子座に対して半接合性であり、複数のがん細胞がＭＳＬＮ陽性である場合、複数の免疫細胞を対象に投与することと、を含み、複数の免疫細胞が、（ｉ）主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体においてＭＳＬＮ、又はそのペプチド抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む、第１の受容体、任意選択で、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、並びに（ｉｉ）主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体においてＩＣＡＭ１、ＣＯＭＴ、及びＣＸＣＬ１６から選択される非標的抗原、又はその抗原ペプチドに特異的な細胞外リガンド結合を含む、第２の受容体、任意選択で、抑制性キメラ抗原受容体を含み、非標的抗原が、多型を含む、方法を提供する。
ＳＮＰの存在又は不在のために、対象に由来するがん細胞及び正常細胞の遺伝子型を決定する方法は、当業者には容易に明らかになるであろう。ＳＮＰ遺伝子型決定方法には、とりわけ、デュアルプローブＴａｑＭａｎアッセイなどのＰＣＲベースの方法、アレイベースのハイブリダイゼーション方法、及び配列決定が含まれる。
対象に由来するがん又は正常細胞における標的抗原の発現を測定する方法は、当業者には容易に明らかになるであろう。これらには、とりわけ、ＲＮＡ配列決定及び逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）などのＲＮＡ発現を測定する方法、並びに免疫組織化学に基づく方法などのタンパク質発現を測定する方法が含まれる。複数のがん細胞におけるヘテロ接合性の喪失を測定する方法には、とりわけ、当該技術分野で既知の方法を使用してがん細胞から抽出されるゲノムＤＮＡのハイスループット配列決定が含まれる。
本開示は、対象においてがんを治療する方法であって、複数のがん細胞における非標的抗原の発現レベルを測定することと、複数のがん細胞における非標的抗原の発現レベルが、複数のがん細胞における非標的抗原の発現レベルよりも低く、非標的抗原の複数の健常な細胞の発現レベルよりも低い場合、対象を治療することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、非標的抗原は、ＬＲＲＮ４若しくはＵＰＫＢ３、又はＬＲＲＮ４若しくはＵＰＫＢ３のペプチド抗原を含む。いくつかの実施形態において、方法は、複数のがん細胞におけるＭＳＬＮの発現を決定することと、複数のがん細胞が、非標的抗原の発現が低いか、又は全くなく、複数のがん細胞が、ＭＳＬＮ陽性である場合、複数の免疫細胞を対象に投与することと、を含む。
対象に由来するがん又は細胞における標的抗原の発現を測定する方法は、当業者には容易に明らかになるであろう。これらには、とりわけ、ＲＮＡ配列決定及び逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）などのＲＮＡ発現を測定する方法、並びに免疫組織化学に基づく方法などのタンパク質発現を測定する方法が含まれる。
いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞である。
いくつかの実施形態において、免疫細胞は、同種異系又は自己由来である。
いくつかの実施形態において、第２の受容体は、第１の受容体を発現するが、第２の受容体を発現しない免疫細胞と比較して、ＭＳＬＮ陽性がん細胞に対する免疫細胞の特異性を増加させる。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、第１の受容体を発現するが、第２の受容体を発現しない免疫細胞と比較して、減少した副作用を有する。
本明細書に記載の免疫細胞又は医薬組成物の投与は、対象における腫瘍の増殖を阻止することができる。例えば、免疫細胞又は医薬組成物は、腫瘍細胞を死滅させることができるため、腫瘍は成長を停止するか、又はサイズが縮小される。ある場合には、免疫細胞又は医薬組成物は、対象における更なる腫瘍の形成を防止することができるか、又は腫瘍の総数を減少させることができる。
本明細書に記載の免疫細胞又は医薬組成物の投与は、対象において、野生型細胞ではなく、がん細胞の選択的死滅をもたらすことができる。いくつかの実施形態において、死滅した細胞の約６０％は、がん細胞であるか、死滅した細胞の約６５％は、がん細胞であるか、死滅した細胞の約７０％は、がん細胞であるか、死滅した細胞の約７５％は、がん細胞であるか、死滅した細胞の約８０％は、がん細胞であるか、死滅した細胞の約８５％は、がん細胞であるか、死滅した細胞の約９０％は、がん細胞であるか、死滅した細胞の約９５％は、がん細胞であるか、又は死滅した細胞の約１００％は、がん細胞である。
本明細書に記載の免疫細胞又は医薬組成物の投与は、対象のがん細胞の約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％又は全ての死滅をもたらし得る。
本明細書に記載の免疫細胞又は医薬組成物の投与は、第１の活性化因子受容体を含むが、第２の抑制性受容体を含まない、他の等価の免疫細胞の投与よりも、対象に対して少ない副作用をもたらすことができる。例えば、本明細書に記載の免疫細胞又は医薬組成物を投与することは、第２の抑制性受容体を用いずに投与するＭＳＬＮ ＣＡＲ、又はＭＳＬＮ ＴＣＲと比較して、用量制限毒性を低減させることができる。
がんの治療は、腫瘍のサイズの縮小をもたらし得る。腫瘍のサイズの縮小は、「腫瘍退縮」と称されることもある。好ましくは、治療後、腫瘍サイズは、治療前のサイズと比較して５％以上減少し、より好ましくは、腫瘍サイズは、１０％以上減少し、より好ましくは、２０％以上減少し、より好ましくは、３０％以上減少し、より好ましくは、４０％以上減少し、更により好ましくは、５０％以上減少し、最も好ましくは、７５％以上減少する。腫瘍のサイズは、任意の再現可能な測定手段によって測定され得る。腫瘍のサイズは、腫瘍の直径として測定され得る。
がんの治療は、腫瘍体積の減少をもたらし得る。好ましくは、治療後、腫瘍体積は、治療前のサイズと比較して５％以上減少し、より好ましくは、腫瘍体積は、１０％以上減少し、より好ましくは、２０％以上減少し、より好ましくは、３０％以上減少し、より好ましくは、４０％以上減少し、更により好ましくは、５０％以上減少し、最も好ましくは、７５％以上減少する。腫瘍体積は、任意の再現可能な測定手段によって測定され得る。
本明細書に記載の免疫細胞又は医薬組成物の投与は、対象における腫瘍のサイズを減少させることができる。いくつかの実施形態において、腫瘍のサイズは、免疫細胞又は医薬組成物の投与前の腫瘍のサイズと比較して、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約１００％減少する。いくつかの実施形態において、腫瘍は、除去される。
がんの治療は、腫瘍の数の減少をもたらす。好ましくは、治療後、腫瘍数は、治療前の数と比較して５％以上減少し、より好ましくは、腫瘍数は、１０％以上減少し、より好ましくは、２０％以上減少し、より好ましくは、３０％以上減少し、より好ましくは、４０％以上減少し、更により好ましくは、５０％以上減少し、最も好ましくは、７５％以上減少する。腫瘍の数は、任意の再現可能な測定手段によって測定され得る。腫瘍の数は、肉眼で見える腫瘍を数えることによって、又は指定された倍率で測定され得る。好ましくは、指定された倍率は、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、又は５０倍である。
がんの治療は、原発腫瘍部位から離れた他の組織又は臓器における転移性病変の数の減少をもたらし得る。好ましくは、治療後、転移性病変の数は、治療前の数と比較して５％以上減少し、より好ましくは、転移性病変の数は、１０％以上減少し、より好ましくは、２０％以上減少し、より好ましくは、３０％以上減少し、より好ましくは、４０％以上減少し、更により好ましくは、５０％以上減少し、最も好ましくは、７５％以上減少する。転移性病変の数は、任意の再現可能な測定手段によって測定され得る。転移性病変の数は、肉眼で見える転移性病変を数えることによって、又は指定された倍率で測定され得る。好ましくは、指定された倍率は、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、又は５０倍である。
がんの治療は、担体のみを受容する集団と比較して、治療対象の集団の平均生存時間の増加をもたらし得る。好ましくは、平均生存時間は、３０日超、より好ましくは６０日超、より好ましくは９０日超、及び最も好ましくは１２０日超増加する。集団の平均生存時間の増加は、任意の再現可能な手段によって測定され得る。集団の平均生存時間の増加は、例えば、集団について、活性化合物による治療の開始後の平均生存期間を計算することによって測定され得る。集団の平均生存時間の増加はまた、例えば、集団について、活性化合物による第１のラウンドの治療の完了後の平均生存期間を計算することによって測定され得る。
がんの治療は、治療されていない対象の集団と比較して、治療対象の集団の平均生存時間の増加をもたらし得る。好ましくは、平均生存時間は、３０日超、より好ましくは６０日超、より好ましくは９０日超、及び最も好ましくは１２０日超増加する。集団の平均生存時間の増加は、任意の再現可能な手段によって測定され得る。集団の平均生存時間の増加は、例えば、集団について、活性化合物による治療の開始後の平均生存期間を計算することによって測定され得る。集団の平均生存時間の増加はまた、例えば、集団について、活性化合物による第１のラウンドの治療の完了後の平均生存期間を計算することによって測定され得る。
がんの治療は、本開示の化合物ではない薬物、又はその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、代謝産物、アナログ若しくは誘導体による単剤療法を受ける集団と比較して、治療対象の集団の平均生存時間の増加をもたらし得る。好ましくは、平均生存時間は、３０日超、より好ましくは６０日超、より好ましくは９０日超、及び最も好ましくは１２０日超増加する。集団の平均生存時間の増加は、任意の再現可能な手段によって測定され得る。集団の平均生存時間の増加は、例えば、集団について、活性化合物による治療の開始後の平均生存期間を計算することによって測定され得る。集団の平均生存時間の増加はまた、例えば、集団について、活性化合物による第１のラウンドの治療の完了後の平均生存期間を計算することによって測定され得る。
がんの治療は、担体のみを受容する集団と比較して、治療対象の集団の死亡率の低下をもたらし得る。がんの治療は、未治療の集団と比較して、治療対象の集団の死亡率の低下をもたらし得る。がんの治療は、本開示の化合物ではない薬物、又はその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、代謝産物、アナログ若しくは誘導体による単剤療法を受ける集団と比較して、治療対象の集団の死亡率の低下をもたらし得る。好ましくは、死亡率は、２％超、より好ましくは５％超、より好ましくは１０％超、及び最も好ましくは２５％超低下する。治療対象の集団の死亡率の低下は、任意の再現可能な手段によって測定され得る。集団の死亡率の低下は、例えば、集団について、活性化合物による治療の開始後の単位時間当たりの疾患関連死の平均数を計算することによって測定され得る。集団の死亡率の低下は、例えば、集団について、活性化合物による第１のラウンドの治療の完了後の単位時間当たりの疾患関連死の平均数を計算することによっても測定され得る。
がんの治療は、腫瘍増殖速度の低下をもたらし得る。好ましくは、治療後、腫瘍増殖速度は、治療前の数値と比較して少なくとも５％減少し、より好ましくは、腫瘍増殖速度は、少なくとも１０％減少し、より好ましくは、少なくとも２０％減少し、より好ましくは、少なくとも３０％減少し、より好ましくは、少なくとも４０％減少し、より好ましくは、少なくとも５０％減少し、更により好ましくは、少なくとも５０％減少し、及び最も好ましくは、少なくとも７５％減少する。腫瘍増殖速度は、任意の再現可能な測定手段によって測定され得る。腫瘍増殖速度は、単位時間当たりの腫瘍直径の変化に応じて測定され得る。
がんの治療は、腫瘍再増殖の低下をもたらし得る。好ましくは、治療後、腫瘍再増殖は、５％未満であり、より好ましくは、腫瘍再増殖は、１０％未満であり、より好ましくは、２０％未満であり、より好ましくは、３０％未満であり、より好ましくは、４０％未満であり、より好ましくは、５０％未満であり、更により好ましくは、５０％未満であり、及び最も好ましくは、７５％未満である。腫瘍再増殖は、任意の再現可能な測定手段によって測定され得る。腫瘍再増殖は、例えば、治療後の以前の腫瘍縮小後の腫瘍の直径の増加を測定することによって測定される。腫瘍再増殖の減少は、治療が停止した後に腫瘍が再発しないことによって示される。
がんの治療又は予防は、細胞増殖速度の減少をもたらし得る。好ましくは、治療後、細胞増殖速度は、少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは少なくとも５０％、及び最も好ましくは少なくとも７５％減少する。細胞増殖の速度は、任意の再現可能な測定手段によって測定され得る。細胞増殖速度は、例えば、単位時間当たりの組織試料中の分裂細胞の数を測定することによって測定される。
がんの治療又は予防は、増殖細胞の割合の減少をもたらし得る。好ましくは、治療後、増殖細胞の割合は、少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは少なくとも５０％、及び最も好ましくは少なくとも７５％減少する。増殖細胞の割合は、任意の再現可能な測定手段によって測定され得る。好ましくは、増殖細胞の割合は、例えば、組織試料中の非分裂細胞の数に対する分裂細胞の数を定量化することによって測定される。増殖細胞の割合は、分裂指数と同等であり得る。
がんの治療又は予防は、細胞増殖の領域又はゾーンのサイズの減少をもたらし得る。好ましくは、治療後、細胞増殖の領域又はゾーンのサイズは、治療前のサイズと比較して少なくとも５％減少し、より好ましくは少なくとも１０％減少し、より好ましくは少なくとも２０％減少し、より好ましくは少なくとも３０％減少し、より好ましくは少なくとも４０％減少し、より好ましくは少なくとも５０％減少し、更により好ましくは少なくとも５０％減少し、最も好ましくは少なくとも７５％減少する。細胞増殖の領域又はゾーンのサイズは、任意の再現可能な測定手段によって測定され得る。細胞増殖の領域又はゾーンのサイズは、細胞増殖の領域又はゾーンの直径又は幅として測定され得る。
がんの治療又は予防は、異常な外観又は形態を有する細胞の数又は割合の減少をもたらし得る。好ましくは、治療後、異常な形態を有する細胞の数は、治療前のサイズと比較して少なくとも５％減少し、より好ましくは少なくとも１０％減少し、より好ましくは少なくとも２０％減少し、より好ましくは少なくとも３０％減少し、より好ましくは少なくとも４０％減少し、より好ましくは少なくとも５０％減少し、更により好ましくは少なくとも５０％減少し、最も好ましくは少なくとも７５％減少する。異常な細胞の外観又は形態は、任意の再現可能な測定手段によって測定され得る。異常な細胞の形態は、例えば、倒立組織培養顕微鏡を使用して、顕微鏡法によって測定され得る。異常な細胞の形態は、核多型の形態をとり得る。
投与量及び投与
本開示の免疫細胞及びは、局所治療又は全身治療が所望されるかどうかに応じて、いくつかの方式で投与され得る。
一般に、投与は非経口であってもよい。
養子細胞療法のための細胞の投与方法は既知であり、提供される方法及び組成物に関連して使用することができる。例えば、養子Ｔ細胞療法の方法は、例えば、Ｇｒｕｅｎｂｅｒｇらの米国特許出願公開第２００３／０１７０２３８号、及びＲｏｓｅｎｂｅｒｇの米国特許第４，６９０，９１５号に記載されている。
本開示の組成物は、非経口投与に好適である。本明細書で使用される場合、医薬組成物の「非経口投与」は、対象の組織の物理的破壊を特徴とする任意の投与経路、及び組織内の破壊を通じた医薬組成物の投与を含み、したがって、一般に、血流内、筋肉内、又は内臓内への直接投与をもたらす。したがって、非経口投与には、組成物の注射による医薬組成物の投与、外科的切開による組成物の適用、組織透過性非外科的創傷による組成物の適用などが含まれるが、これらに限定されない。特に、非経口投与には、皮下、腹腔内、筋肉内、胸骨内、静脈内、動脈内、髄腔内、脳室内、尿道内、頭蓋内、腫瘍内、滑液内注射又は注入、及び腎臓透析的注入技術が含まれることが企図されるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本開示の組成物の非経口投与は、静脈内又は動脈内投与を含む。
本開示は、本開示の複数の免疫細胞、及び薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。
非経口投与に好適な医薬組成物の製剤は、典型的には、通常、滅菌水又は滅菌等張食塩水などの薬学的に許容される担体と組み合わせた免疫細胞からなる。このような製剤は、ボーラス投与又は連続投与に好適な形態で調製、包装、又は販売されてもよい。注射用製剤は、単位剤形、例えば、アンプル又は防腐剤を含有する複数回用量容器中で調製、包装、又は販売されてもよい。非経口投与用の製剤には、懸濁液、溶液、油性又は水性ビヒクル中のエマルション、ペーストなどが含まれるが、これらに限定されない。このような製剤は、限定されないが、懸濁化剤、安定化剤、又は分散剤を含む、１つ以上の追加の成分を更に含んでもよい。非経口製剤には、塩、炭水化物、及び緩衝剤などの賦形剤を含有し得る水溶液も含まれる。例示的な非経口投与形態には、滅菌水溶液、例えば、プロピレングリコール水溶液又はデキストロース溶液中の溶液又は懸濁液が含まれる。このような剤形は、所望の場合、好適には、緩衝され得る。。非経口投与のための製剤は、即時及び／又は放出調節であるように製剤化され得る。放出調節製剤には、遅延放出、持続放出、パルス放出、制御放出、標的化放出及びプログラム放出が含まれる。
いくつかの実施形態において、免疫細胞を含む製剤化された組成物は、注射による投与に好適である。いくつかの実施形態において、免疫細胞を含む製剤化された組成物は、注入による投与に好適である。
本開示の医薬組成物は、単位剤形で好都合に提示することができ、製薬業界で周知の従来の技術に従って調製することができる。そのような技術には、免疫細胞を、薬学的担体又は賦形剤、例えば、液体担体と会合させるステップが含まれる。
水性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／又はデキストランを含む、懸濁液の粘度を増加させる物質を更に含有し得る。懸濁液はまた、安定剤を含有してもよい。
本開示の組成物は、追加的に、医薬組成物に従来見出される他の補助成分を含有してもよい。したがって、例えば、組成物は、例えば、かゆみ止め剤、収れん剤、局所麻酔剤若しくは抗炎症剤などの追加の、適合性の薬学的に活性な材料を含有してもよいか、又は染料、防腐剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤、及び安定剤などの、本開示の組成物の様々な剤形を物理的に処方するのに有用な追加の材料を含有してもよい。しかしながら、このような材料は、添加されるとき、本開示の組成物の免疫細胞の生物学的活性を不当に妨げるべきではない。
製剤又は組成物はまた、免疫細胞で治療されている特定の適応症、疾患、又は状態に有用な２つ以上の活性成分を含有してもよく、それぞれの活性は互いに悪影響を及ぼさない。このような活性成分は、好適には、意図する目的に効果的である量で組み合わせて存在する。したがって、いくつかの実施形態において、医薬組成物は、化学療法剤などの他の薬学的に活性な薬剤又は薬物を更に含む。
いくつかの態様における医薬組成物は、組成物の送達が、治療される部位の感作の前に、かつ治療される部位の感作を引き起こすのに十分な時間で生じるように、時間放出、遅延放出、及び持続放出送達系を用いることができる。多くの種類の放出送達系が利用可能であり、既知である。このような系は、組成物の反復投与を回避することができ、それによって、対象及び医師への利便性を増大させる。
投与は、治療過程を通じて連続的に又は断続的に、１回の用量で行うことができる。単回又は複数回の投与を、治療する医師によって選択される用量レベル及びパターンを用いて実施することができる。
いくつかの実施形態における医薬組成物は、がんを治療又は予防するのに有効な量、例えば、治療有効量又は予防有効量で免疫細胞を含有する。いくつかの実施形態において、治療的又は予防的有効性は、治療された対象の定期的評価によって監視される。数日、数週間又は数ヶ月にわたる反復投与については、状態に応じて、がんの徴候又は症状の所望の抑制が生じるまで治療を繰り返すことができる。しかしながら、他の投与レジメンが有用であり得、決定することができる。所望の用量は、組成物の単回ボーラス投与若しくは注入によって、又は組成物の複数回ボーラス投与若しくは注入によって送達することができる。
細胞又は細胞集団は、１回以上の用量で投与することができる。いくつかの実施形態において、有効量の細胞は、単回用量として投与され得る。いくつかの実施形態において、有効量の細胞は、ある期間にわたって１回を超える用量として投与され得る。投与のタイミングは、管理医師の判断の範囲内であり、患者の臨床状態に依存する。
細胞又は細胞集団は、血液バンク若しくはドナー、又は患者自身などの任意の供給源から得られてもよい。
有効量とは、治療的又は予防的利益をもたらす量を意味する。投与される用量は、レシピエントの年齢、健康及び体重、同時治療の種類（もしあれば）、治療の頻度及び所望の効果の性質に依存するであろう。いくつかの実施形態において、有効量の細胞又はそれらの細胞を含む組成物は、非経口的に投与される。いくつかの実施形態において、投与は、静脈内投与であり得る。いくつかの実施形態において、投与は、腫瘍内への注射によって直接行うことができる。
本開示の目的のために、例えば、所与の用量のこのような免疫細胞を哺乳動物に投与する際に、各々が異なる用量の免疫細胞を与えられる一組の哺乳動物の間で、標的細胞が溶解されるか、又は１つ以上のサイトカインが受容体を発現する免疫細胞によって分泌される程度を比較することを含むアッセイを使用して、哺乳動物に投与される開始用量を決定することができる。
いくつかの実施形態において、細胞は、抗体又は操作された細胞又は受容体又は薬剤、例えば、細胞傷害性剤若しくは治療剤などの別の治療介入と同時に、又は任意の順序で連続的になどで、併用療法の一部として投与される。本開示の免疫細胞は、いくつかの実施形態において、１つ以上の追加の治療剤とともに、又は別の治療介入に関連して、同時に若しくは任意の順序で連続的にのいずれかで同時投与される。いくつかの文脈では、免疫細胞集団が１つ以上の追加の治療剤の効果を増強するように、又はその逆であるように、免疫細胞が、十分に時間的に近い別の治療法とともに同時投与される。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、１つ以上の追加の治療剤の前に投与される。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、１つ以上の追加の治療剤の後に投与される。
実施形態において、リンパ枯渇化学療法は、養子免疫細胞の投与（例えば、注入）の前に、同時に、又はその後に、対象に投与される。一例において、リンパ枯渇化学療法は、免疫細胞の投与前に対象に投与される。例えば、リンパ枯渇化学療法は、養子細胞注入の１～４日前（例えば、１、２、３、又は４日）に終了する。実施形態において、複数回用量の養子細胞は、例えば、本明細書に記載されるように投与される。実施形態において、リンパ枯渇化学療法は、本明細書に記載の免疫細胞の投与（例えば、注入）の前に、同時に、又は後に、対象に投与される。リンパ枯渇の例としては、非骨髄性リンパ枯渇化学療法、骨髄性リンパ枯渇化学療法、全身照射などが挙げられるが、これらに限定され得ない。リンパ枯渇剤の例としては、抗胸腺細胞グロブリン、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＣＤ２抗体、ＴＣＲαβ遮断因子、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ１９抗体、ボルテゾミブ、リツキシマブ、抗ＣＤ１５４抗体、ラパマイシン、ＣＤ３免疫毒素、フルダラビン、シクロホスファミド、ブスルファン、メルファラン、マブセラ、タクロリムス、アレファセプト、アレムツズマブ、ＯＫＴ３、ＯＫＴ４、ＯＫＴ８、ＯＫＴ１１、フィンゴリモド、抗ＣＤ４０抗体、抗ＢＲ３抗体、Ｃａｍｐａｔｈ－１Ｈ、抗ＣＤ２５抗体、カルシニューリン阻害剤、ミコフェノール酸、及びステロイドが挙げられるが、これらに限定されず、これらは単独で、又は組み合わせて使用され得る。更なる例として、リンパ枯渇レジメンは、アレムツズマブ、シクロホスファミド、ベンドゥアムスチン（ｂｅｎｄｕａｍｕｓｔｉｎ）、リツキシマブ、ペントスタチン、及び／又はフルダラビンの投与を含むことができる。リンパ枯渇レジメンは、循環免疫細胞の減少の所望の転帰まで、１つ以上のサイクルで投与することができる。いくつかの実施形態において、リンパ枯渇は、対象におけるＣＤ５２＋細胞を特異的に標的とし、低減又は除去する薬剤を投与することを含み、免疫細胞は、ＣＤ５２発現を低減又は除去するように改変される。
いくつかの実施形態において、免疫刺激療法は、養子免疫細胞の投与前、投与と同時に、又は投与後（例えば、注入）に対象に投与される。いくつかの実施形態において、免疫刺激療法は、恒常性サイトカインを含む。いくつかの実施形態において、免疫刺激療法は、免疫刺激分子を含む。いくつかの実施形態において、免疫刺激療法は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－９、又はそれらの機能的断片を含む。いくつかの実施形態において、免疫刺激療法は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－９、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、免疫刺激療法は、ＩＬ－２、又はその機能的断片を含む。
自己細胞を使用する養子細胞療法のための方法は、免疫細胞を患者の血液から単離することと、細胞を、本明細書に記載の二重受容体系をコードする１つ以上のベクターで形質導入することを含む、単離された細胞に対して一連の修飾を実施することと、細胞を患者に投与することと、を含む。がん若しくは血液悪性腫瘍に罹患しているか、又はがん若しくは血液悪性腫瘍のリスクがある対象からの免疫細胞を提供することは、患者の血液からの免疫細胞の単離を必要とし、当該技術分野で既知の方法、例えば、白血球除去によって達成することができる。白血球除去中、対象からの血液が抽出され、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が分離され、血液の残りが対象の循環に戻される。ＰＢＭＣは、免疫細胞の試料として凍結、又は凍結保存のいずれかで貯蔵され、例えば、本明細書に記載の修飾などの更なる処理ステップのために提供される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の対象を治療する方法は、濃縮及び／又は枯渇、活性化、遺伝子修飾、拡大、製剤化、並びに凍結保存を含む、一連の修飾を含む、対象からの免疫細胞に対する修飾を含む。
本開示は、例えば、下流の手順、例えば、本明細書に記載の修飾のための対象ＰＢＭＣの調製のための当該技術分野で既知の洗浄及び分画方法であり得る濃縮及び／又は枯渇ステップを提供する。例えば、限定されないが、方法は、総赤血球及び血小板汚染物質を除去するためのデバイス、単球の枯渇及びリンパ球の単離のためのサイズベースの細胞分画のためのシステム、並びに／又は例えば、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ２５＋、若しくはＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞などの、Ｔ細胞の特定のサブセットの濃縮を可能にするシステムを含み得る。濃縮ステップに続いて、更なる処理のために、対象のＰＭＢＣから免疫細胞の標的サブ集団を単離する。当業者は、本明細書で提供される濃縮ステップが、任意の新たに発見される方法、デバイス、試薬、又はそれらの組み合わせも包含し得ることを理解するであろう。
本開示は、免疫細胞、例えば、それらのエクスビボ拡大に必要なＴ細胞の活性化を誘導するための当該技術分野で既知の任意の方法であり得る活性化ステップを提供する。免疫細胞活性化は、例えば、対象の免疫細胞を、樹状細胞の存在下で培養すること、対象の免疫細胞を、人工抗原提示細胞（ＡＡＰＣ）の存在下で培養すること、又は照射されたＫ５６２由来のＡＡＰＣの存在下で免疫細胞を培養することによって達成することができる。対象免疫細胞を活性化するための他の方法は、例えば、単離された活性化要素及び組成物、例えば、ビーズ、表面、又は活性化要素で官能化された粒子の存在下で免疫細胞を培養することであり得る。活性化要素には、例えば、抗体、例えば、抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体が含まれ得る。活性化要素はまた、例えば、サイトカイン、例えば、インターロイキン（ＩＬ）－２又はＩＬ－２１であってもよい。活性化要素はまた、例えば、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＣＯＳＬ、ＧＩＴＲＬ、及びＣＤ１３４Ｌなどの共刺激分子であってもよい。当業者は、本明細書に提供される活性化要素が、免疫細胞を活性化することができる任意の新たに発見される活性化要素、試薬、組成物、又はそれらの組み合わせも包含し得ることを理解するであろう。
本開示は、対象の免疫細胞を修飾するための遺伝子修飾ステップを提供する。いくつかの実施形態において、遺伝子修飾は、Ｂ２Ｍ又はＨＬＡ－Ａに相補的な本明細書に記載されるｓｈＲＮＡを含むベクターを用いて免疫細胞を形質導入することを含む。いくつかの実施形態において、遺伝子修飾は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介ゲノム操作を使用してＢ２Ｍ又はＨＬＡ－Ａにおける変異を誘導するように免疫細胞のゲノムを修飾することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、免疫細胞を、活性化因子及び抑制性受容体をコードする１つ以上のベクターで形質導入することを含み、それによって活性化因子及び抑制性受容体を発現する免疫細胞を産生する。
本開示は、遺伝子修飾された対象免疫細胞のための拡大ステップを提供する。遺伝子修飾された対象免疫細胞は、投与のための免疫細胞の治療用量を生成するために、当該技術分野で既知の任意の免疫細胞拡大システムで拡大することができる。例えば、コントローラポンプを含むシステムに使用するためのバイオリアクターバッグ、並びに自動供給及び廃棄物除去を可能にするプローブを、免疫細胞拡大に使用することができる。基部にガス透過性膜を有する細胞培養フラスコが、免疫細胞の拡大のために使用され得る。臨床用途のための免疫細胞の拡大を可能にする当該技術分野で既知の任意のそのようなシステムは、本明細書に提供される拡大ステップに包含される。免疫細胞は、拡大のために特異的に製剤化された培地中の培養系において拡大される。拡大はまた、本明細書に記載の活性化要素の存在下で本開示の免疫細胞を培養することによって促進され得る。当業者は、本明細書で提供される拡大ステップが、免疫細胞を拡大するために使用することができる任意の新たに発見される培養系、培地、又は活性化要素も包含し得ることを理解するであろう。
本開示は、拡大した遺伝子修飾された対象免疫細胞のための製剤化及び凍結保存ステップを提供する。提供される製剤化ステップは、例えば、本明細書に記載の治療方法の免疫細胞の調製及び拡大に使用される過剰な成分を洗い流すことを含む。当該技術分野で既知の免疫細胞と適合する任意の薬学的に許容される製剤培地又は洗浄緩衝液を使用して、免疫細胞を洗浄し、希釈／濃縮し、投与用の用量を調製することができる。製剤培地は、例えば、静脈内注入のための晶質液などの免疫細胞の投与のために許容され得る。任意選択で、凍結保存を使用して、免疫細胞を長期間貯蔵することができる。凍結保存は、例えば、細胞を、凍結保存成分を含有する凍結保存培地中に貯蔵することを含む、当該技術分野で既知の方法を使用して達成することができる。凍結保存成分は、例えば、ジメチルスルホキシド又はグリセロールを含むことができる。凍結保存培地中に貯蔵された免疫細胞は、貯蔵温度を－８０℃～－１９６℃まで低下させることにより凍結保存することができる。
いくつかの実施形態において、治療方法は、対象のＨＬＡ生殖細胞型を決定することを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ生殖細胞型は、骨髄において決定される。
いくつかの実施形態において、治療方法は、ＭＳＬＮの発現レベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮの発現レベルは、対象に由来する腫瘍組織試料中で決定される。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮの発現レベルは、次世代配列決定を使用して決定される。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮの発現レベルは、ＲＮＡ配列決定を使用して決定される。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮのレベルは、免疫組織化学を使用して決定される。
いくつかの実施形態において、治療方法は、治療有効量のＨＬＡ－Ａ＊０２抑制性受容体を含む免疫細胞を、それを必要とする対象に投与することを含み、対象は、ＨＬＡ生殖細胞系ＨＬＡ－Ａ＊０２ヘテロ接合性であり、ＨＬＡ－Ａ＊０２を喪失したがん細胞を有することが決定される。いくつかの実施形態において、治療方法は、治療有効量のＨＬＡ－Ａ＊０１抑制性受容体を含む免疫細胞を、それを必要とする対象に投与することを含み、対象は、ＨＬＡ生殖細胞系ＨＬＡ－Ａ＊０１ヘテロ接合性であり、ＨＬＡ－Ａ＊０１を喪失したがん細胞を有することが決定される。いくつかの実施形態において、治療方法は、治療有効量のＨＬＡ－Ａ＊０３を含む免疫細胞を、それを必要とする対象に投与することを含み、対象は、ＨＬＡ生殖細胞系ＨＬＡ－Ａ＊０３ヘテロ接合性であり、ＨＬＡ－Ａ＊０３を喪失したがん細胞を有することが決定される。いくつかの実施形態において、治療方法は、治療有効量のＨＬＡ－Ａ＊０７抑制性受容体を含む免疫細胞を、それを必要とする対象に投与することを含み、対象は、ＨＬＡ生殖細胞系ＨＬＡ－Ａ＊０７ヘテロ接合性であり、ＨＬＡ－Ａ＊０７を喪失したがん細胞を有することが決定される。いくつかの実施形態において、治療方法は、治療有効量のＨＬＡ－Ｃ＊０７抑制性受容体を含む免疫細胞を、それを必要とする対象に投与することを含み、対象は、ＨＬＡ生殖細胞系ＨＬＡ－Ｃ＊０７ヘテロ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃ＊０７を喪失したがん細胞を有することが決定される。いくつかの実施形態において、治療方法は、治療有効量のＨＬＡ－Ｂ＊０７抑制性受容体を含む免疫細胞を、それを必要とする対象に投与することを含み、対象は、ＨＬＡ生殖細胞系ＨＬＡ－Ｂ＊０７ヘテロ接合性であり、ＨＬＡ－Ｂ＊０７を喪失したがん細胞を有することが決定される。
様々な実施形態において、本開示は、ＭＳＬＮを発現し、ＨＬＡ－Ａ＊０２発現を喪失した悪性腫瘍を有するヘテロ接合型ＨＬＡ－Ａ＊０２患者の治療方法、及び／又はＭＳＬＮを発現し、ＨＬＡ－Ａ＊０２発現を喪失した再発性切除不能若しくは転移性固形腫瘍を有するヘテロ接合型ＨＬＡ－Ａ＊０２成人患者の治療方法を提供する。
いくつかの実施形態において、治療有効量の本明細書に記載の免疫細胞が投与される。いくつかの実施形態において、本開示の免疫細胞は、静脈内注射によって投与される。いくつかの実施形態において、本開示の免疫細胞は、腹腔内注射によって投与される。いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０６個の細胞、約１×１０６個の細胞、約２×１０６個の細胞、約３×１０６個の細胞、４×１０６個の細胞、約５×１０６個の細胞、約６×１０６個の細胞、約７×１０６個の細胞、約８×１０６個の細胞、約９×１０６個の細胞、約１×１０７個、約２×１０７個、約３×１０７個、約４×１０７個、約５×１０７個、約６×１０７個、約７×１０７個、約８×１０７個、約９×１０７個、約１×１０８個の細胞、約２×１０８個の細胞、約３×１０８個の細胞、約４×１０８個の細胞、約５×１０８個の細胞、約６×１０８個の細胞、約７×１０８個の細胞、約８×１０８個の細胞、約９×１０８個の細胞、約１×１０９個の細胞、約２×１０９個の細胞、約３×１０９個の細胞、約３×１０９個の細胞、約４×１０９個の細胞、約５×１０９個の細胞、約５×１０９個の細胞、約６×１０９個の細胞、約７×１０９個の細胞、約８×１０９個の細胞、約９×１０９個の細胞、約１×１０１０個の細胞、約２×１０１０個の細胞、約３×１０１０個の細胞、約４×１０１０個の細胞、約５×１０１０個の細胞、約６×１０１０個の細胞、約７×１０１０個の細胞、約８×１０１０個の細胞、又は約９×１０１０個の細胞を含む。
いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０６個の細胞～約９×１０１０個の細胞、約１×１０６個の細胞～約５×１０１０個の細胞、約２×１０６個の細胞～約５×１０９個の細胞、約３×１０６個の細胞～約５×１０９個の細胞、約４×１０６個の細胞～約３×１０９個の細胞、約５×１０６個の細胞～約２×１０９個の細胞、約６×１０６個の細胞～約１×１０９個の細胞、０．５×１０６個の細胞～約６×１０９個の細胞、約１×１０６個の細胞～約５×１０９個の細胞、約２×１０６個の細胞～約５×１０９個の細胞、約３×１０６個の細胞～約４×１０９個の細胞、約４×１０６個の細胞～約３×１０９個の細胞、約５×１０６個の細胞～約２×１０９個の細胞、約６×１０６個の細胞～約１×１０９個の細胞、０．５×１０６個の細胞～約６×１０８個の細胞、約１×１０６個の細胞～約５×１０８個の細胞、約２×１０６個の細胞～約５×１０８個の細胞、約３×１０６個の細胞～約４×１０８個の細胞、約４×１０６個の細胞～約３×１０８個の細胞、約５×１０６個の細胞～約２×１０８個の細胞、約６×１０６個の細胞～約１×１０８個の細胞、約７×１０６個の細胞～約９×１０８個の細胞、約８×１０６個の細胞～約８×１０８個の細胞、約９×１０６個の細胞～約７×１０８個の細胞、約１×１０７個の細胞～約６×１０８個の細胞、約２×１０７個の細胞～約５×１０８個の細胞、約７×１０６個の細胞～約９×１０７個の細胞、約８×１０６個の細胞～約８×１０７個の細胞、約９×１０６個の細胞～約７×１０７個の細胞、約１×１０７個の細胞～約６×１０７個の細胞、又は約２×１０７個の細胞～約５×１０７個の細胞を含む。
いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０５個の細胞～約９×１０１０個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０６個の細胞～約１×１０１０個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０６個の細胞～約５×１０９個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０６個の細胞～約１×１０９個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０６個の細胞～約６×１０８個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０６個の細胞～約９×１０１０個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０７個の細胞～約１×１０１０個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０７個の細胞～約５×１０９個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０７個の細胞～約１×１０９個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０７個の細胞～約６×１０８個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０８個の細胞～約９×１０１０個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０８個の細胞～約１×１０１０個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０８個の細胞～約５×１０９個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、治療有効量は、約０．５×１０８個の細胞～約１×１０９個の細胞を含む。治療用量で言及される場合、「約」という用語は、例えば、±０．５×１０６個の細胞、±０．５×１０７個の細胞、又は±０．５×１０８個の細胞であり得る。
キット及び製品
本開示は、本明細書に記載の受容体をコードするポリヌクレオチド及びベクター、並びに本明細書に記載の受容体を含む免疫細胞を含む、キット及び製品を提供する。いくつかの実施形態において、キットは、バイアル、シリンジ、及び使用説明書などの物品を含む。
いくつかの実施形態において、キットは、本開示の１つ以上の受容体をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド又はベクターを含む。
いくつかの実施形態において、キットは、本明細書に記載の第１及び第２の受容体を含む、複数の免疫細胞を含む。いくつかの実施形態において、複数の免疫細胞は、複数のＴ細胞を含む。
いくつかの実施形態において、キットは、使用説明書を更に含む。
実施形態の列挙
本開示は、以下の例示的な列挙された実施形態を参照して理解することができる。
１．がん細胞におけるヘテロ接合性の喪失に応答する免疫細胞であって、
ａ．第１の受容体、任意選択で、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、
ｉ．主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体におけるがん細胞特異的抗原、若しくはそのペプチド抗原、又は
ｉｉ．主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体におけるメソテリン（ＭＳＬＮ）、若しくはそのペプチド抗原から選択される標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む、第１の受容体、任意選択で、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と、
ｂ．主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体における、ＩＣＡＭ１、ＣＯＭＴ、及びＣＸＣＬ１６から選択される非標的抗原、又はそのペプチド抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む、第２の受容体、任意選択で、抑制性キメラ抗原受容体と、を含み、非標的抗原が、多型を含む、免疫細胞。
２．非標的抗原が、ヘテロ接合性（ＬＯＨ）の喪失によってがん細胞から喪失している、実施形態１に記載の免疫細胞。
３．非標的抗原が、配列番号２７と少なくとも９５％の同一性を共有するＩＣＡＭ１抗原であり、多型が、配列番号２７の４６９位にＫ又はＥを含む、実施形態１又は２に記載の免疫細胞。
４．非標的抗原が、配列番号２８と少なくとも９５％の同一性を共有するＣＯＭＴ抗原であり、多型が、配列番号２８の１５８位にＶ又はＭを含む、実施形態１又は２に記載の免疫細胞。
５．非標的抗原が、配列番号２９と少なくとも９５％の同一性を共有するＣＸＣＬ１６抗原であり、多型が、
ａ．配列番号２９の１４２位におけるＩ又はＴ、及び
ｂ．配列番号２９の２００位におけるＡ又はＶからなる群から選択される、実施形態１又は２に記載の免疫細胞。
６．非標的抗原が、非標的細胞において発現される、実施形態１～５のいずれか１つに記載の免疫細胞。
７．非標的細胞が、標的抗原及び非標的抗原の両方を発現する、実施形態１～６のいずれか１つに記載の免疫細胞。
８．がん細胞におけるタンパク質の低発現又は無発現に応答する免疫細胞であって、
ａ．第１の受容体、任意選択で、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、
ｉ．主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体におけるがん細胞特異的抗原、若しくはそのペプチド抗原、又は
ｉｉ．主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体におけるＭＳＬＮ、若しくはそのペプチド抗原から選択される標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む、第１の受容体、任意選択で、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と、
ｂ．主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体における、ＬＲＲＮ４及びＵＰＫ３Ｂから選択される非標的抗原、又はそのペプチド抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む、第２の受容体、任意選択で、抑制性キメラ抗原受容体と、を含み、非標的抗原が、非標的細胞によるよりも、がん細胞によって低いレベルで発現される、免疫細胞。
９．非標的抗原が、がん細胞によって発現されない、実施形態８に記載の免疫細胞。
１０．非標的細胞が、標的抗原及び非標的抗原の両方を発現する、実施形態９に記載の免疫細胞。
１１．標的抗原が、がん細胞特異的抗原である、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の免疫細胞。
１２．標的抗原が、主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体におけるがん細胞特異的抗原のペプチド抗原である、実施形態１１に記載の免疫細胞。
１３．がん細胞が、中皮腫がん細胞、卵巣がん細胞、子宮頸がん細胞、結腸直腸がん細胞、食道がん細胞、頭頸部がん細胞、腎臓がん細胞、子宮がん細胞、胃がん細胞、膵臓がん細胞、肺がん細胞、結腸直腸がん細胞又は胆管がん細胞である、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の免疫細胞。
１４．がん細胞が、ＭＳＬＮを発現する、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の免疫細胞。
１５．第１の受容体及び第２の受容体がともに、がん細胞の存在下で免疫細胞を特異的に活性化する、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の免疫細胞。
１６．免疫細胞が、Ｔ細胞である、実施形態１５に記載の免疫細胞。
１７．Ｔ細胞が、ＣＤ８＋ＣＤ４－Ｔ細胞である、実施形態１６に記載の免疫細胞。
１８．ＭＳＬＮが、配列番号１又は配列番号２と少なくとも９５％の同一性を共有する配列を含む、実施形態１～１７のいずれか１つに記載の免疫細胞。
１９．第１の受容体が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）である、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の免疫細胞。
２０．第１の受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の免疫細胞。
２１．第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインが、抗体断片、一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）、β鎖可変ドメイン（Ｖβ）、又はＴＣＲ α鎖可変ドメイン及びＴＣＲ β鎖可変ドメインを含む、実施形態１９又は２０に記載の免疫細胞。
２２．細胞外リガンド結合ドメインが、ｓｃＦｖを含む、実施形態１９又は２０に記載の免疫細胞。
２３．ｓｃＦｖが、配列番号３～６からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、実施形態２２に記載の免疫細胞。
２４．ｓｃＦｖが、配列番号３～６からなる群から選択される配列を含むか、又はそれから本質的になる、実施形態２２に記載の免疫細胞。
２５．がん細胞におけるヘテロ接合性の喪失に応答する免疫細胞であって、
ａ．主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体におけるメソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的な細胞外リガンド結合ドメイン、又はそのペプチド抗原を含む、第１の受容体、任意選択で、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と、
ｂ．非標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む、第２の受容体、任意選択で、抑制性キメラ抗原受容体と、を含み、非標的抗原が、ＨＬＡ－Ａ＊０２を含む、免疫細胞。
２６．第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインが、抗体断片、一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）、β鎖可変ドメイン（Ｖβ）、又はＴＣＲ α鎖可変ドメイン及びＴＣＲ β鎖可変ドメインを含む、実施形態２５に記載の免疫細胞。
２７．第１の受容体の細胞外リガンド結合ドメインが、ｓｃＦｖを含む、実施形態２５に記載の免疫細胞。
２８．ｓｃＦｖが、配列番号３～６からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、実施形態２７に記載の免疫細胞。
２８．ｓｃＦｖが、配列番号３～６からなる群から選択される配列を含むか、又はそれから本質的になる、実施形態２７に記載の免疫細胞。
２９．第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインが、抗体断片、一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）、β鎖可変ドメイン（Ｖβ）、又はＴＣＲ α鎖可変ドメイン及びＴＣＲ β鎖可変ドメインを含む、実施形態２５～２８のいずれか１つに記載の免疫細胞。
３０．第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインが、ｓｃＦｖを含む、実施形態２５～２８のいずれか１つに記載の免疫細胞。
３１．ｓｃＦｖが、配列番号３０～４１のいずれか１つと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％又は少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、実施形態３０に記載の免疫細胞。
３２．ｓｃＦｖが、配列番号３０～４１のいずれか１つの配列を含むか、又はそれから本質的になる、実施形態３０に記載の免疫細胞。
３３．第２の受容体の細胞外リガンド結合ドメインが、配列番号４２～５３からなる群から選択されるＣＤＲを含む、実施形態２５～３２のいずれか１つに記載の免疫細胞。
３４．第２の受容体が、ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン又はその機能的バリアントを含む、実施形態２５～３３のいずれか１つに記載の免疫細胞。
３５．ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメインが、配列番号６５と少なくとも９５％同一の配列を含む、実施形態３４に記載の免疫細胞。
３６．第２の受容体が、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン又はその機能的バリアントを含む、実施形態２５～３５のいずれか１つに記載の免疫細胞。
３７．ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン又はその機能的バリアントが、配列番号７４と少なくとも９５％同一の配列を含む、実施形態３６に記載の免疫細胞。
３８．第２の受容体が、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメイン又はその機能的断片若しくはバリアントを含む、実施形態２５～３７のいずれか１つに記載の免疫細胞。
３９．ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメインが、配列番号７３、配列番号６６、配列番号６７、配列番号８１～８４、又は配列番号９０～９１と少なくとも９５％同一の配列を含む、実施形態３８に記載の免疫細胞。
４０．第２の受容体が、ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン及びＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン、又はその機能的バリアントを含む、実施形態２５～３９のいずれか１つに記載の免疫細胞。
４１．ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン及びＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメインが、配列番号６９、又は配列番号６９と少なくとも９５％同一の配列を含む、実施形態４０に記載の免疫細胞。
４２．がん細胞が、中皮腫がん細胞、卵巣がん細胞、子宮頸がん細胞、結腸直腸がん細胞、食道がん細胞、頭頸部がん細胞、腎臓がん細胞、子宮がん細胞、胃がん細胞、膵臓がん細胞、肺がん細胞、結腸直腸がん細胞又は胆管がん細胞である、実施形態２５～４１のいずれか１つに記載の免疫細胞。
４３．がん細胞が、結腸直腸がん細胞である。
４４．がんが、ＭＳＬＮを発現する、実施形態２５～４３のいずれか１つに記載の免疫細胞。
４５．がん細胞が、ＨＬＡ－Ａ＊０２を発現しない、実施形態２５～４４のいずれか１つに記載の免疫細胞。
４６．非標的細胞が、ＭＳＬＮ及びＨＬＡ－Ａ＊０２を発現する、実施形態２５～４５のいずれか１つに記載の免疫細胞。
４７．第１の受容体及び第２の受容体がともに、標的細胞の存在下で免疫細胞を特異的に活性化する、実施形態２５～４６のいずれか１つに記載の免疫細胞。
４８．免疫細胞が、Ｔ細胞である、実施形態４７に記載の免疫細胞。
４９．Ｔ細胞が、ＣＤ８＋ＣＤ４－Ｔ細胞である、実施形態４８に記載の免疫細胞。
５０．ＭＳＬＮが、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を共有する配列を含む、実施形態２５～４９のいずれか１つに記載の免疫細胞。
５１．第１の受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴＣＲである、実施形態２５～５０のいずれか１つに記載の免疫細胞。
５２．治療有効量の実施形態１～５１のいずれか１つに記載の免疫細胞を含む、医薬組成物。
５３．薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を更に含む、実施形態５２に記載の医薬組成物。
５４．がんの治療において医薬として使用するための、実施形態５２又は５３に記載の医薬組成物。
５５．ポリヌクレオチド系であって、
ａ．第１の受容体、任意選択で、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、
ｉ．主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体におけるがん細胞特異的抗原、若しくはそのペプチド抗原、又は
ｉｉ．主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体におけるＭＳＬＮ、若しくはそのペプチド抗原から選択される標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む、第１の受容体、任意選択で、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、並びに
ｂ．主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体における、ＩＣＡＭ１、ＣＯＭＴ、及びＣＸＣＬ１６から選択される非標的抗原、又はその抗原ペプチドに特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む、第２の受容体、任意選択で、抑制性キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む、１つ以上のポリヌクレオチドを含み、非標的抗原が、多型を含む、ポリヌクレオチド系。
５６．ポリヌクレオチド系であって、
ａ．第１の受容体、任意選択で、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、
ｉ．主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体におけるがん細胞特異的抗原、若しくはそのペプチド抗原、又は
ｉｉ．主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体におけるＭＳＬＮ、若しくはそのペプチド抗原から選択される標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む、第１の受容体、任意選択で、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、並びに
ｂ．主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体における、ＬＲＲＮ４及びＵＰＫ３Ｂから選択される非標的抗原、又はそのペプチド抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む、第２の受容体、任意選択で、抑制性キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む、１つ以上のポリヌクレオチドを含み、非標的抗原が、非標的細胞によるよりも、がん細胞によって低いレベルで発現される、ポリヌクレオチド系。
５７．ポリヌクレオチド系であって、
ａ．主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）との複合体におけるＭＳＬＮに特異的な細胞外リガンド結合ドメイン、又はそのペプチド抗原を含む、第１の受容体、任意選択で、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、並びに
ｂ．非標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む、第２の受容体、任意選択で、抑制性キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む、１つ以上のポリヌクレオチドを含み、非標的抗原が、ＨＬＡ－Ａ＊０２を含む、ポリヌクレオチド系。
５８．実施形態５５～５７のいずれか１つに記載の１つ以上のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
５９．対象において複数のがん細胞を死滅させる、かつ／又はがんを治療する方法であって、有効量の実施形態１～５１のいずれか１つに記載の免疫細胞、又は実施形態５２～５４のいずれか１つに記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、方法。
６０．複数のがん細胞が、標的抗原を発現する、実施形態５９に記載の方法。
６１．複数のがん細胞が、非標的抗原を発現しない、実施形態５９又は６０に記載の方法。
６２．複数の免疫細胞を作製する方法であって、
ａ．複数の免疫細胞を提供することと、
ｂ．実施形態５５～５７のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド系、又は実施形態５８に記載のベクターで複数の免疫細胞を形質転換することと、を含む、方法。
６３．実施形態１～５１のいずれか１つに記載の免疫細胞、又は実施形態５２～５４のいずれか１つに記載の医薬組成物を含む、キット。
６２．使用説明書を更に含む、実施形態６３に記載のキット。
以下の実施例は、例示のみを目的としており、本発明の範囲を限定するものではない。実施例を通して、「遮断因子抗原」という用語は、非標的抗原の実施形態を説明するために使用される。
実施例１：差次的に発現した遮断因子の同定
候補遮断因子標的を、バイオインフォマティクスパイプラインを使用して同定した。簡潔に述べると、以下に記載するように、公的に入手可能な発現データベースを、正常な結腸組織と比較して腫瘍において発現の喪失を伴う遺伝子について検索した。これらの遺伝子を、膜タンパク質、及びＴＣＧＡ－ＭＥＳＯデータセット（中皮腫）における発現についてフィルタリングした。このプロセスの概要を図１４に示す。候補遮断因子標的は、健常な組織では中皮で発現されるが、卵巣がん及び膵臓がんを含む、メソテリン（ＭＳＬＮ）陽性がん、並びに肺がん及び結腸直腸がんのおよそ４分の３では発現されない。
簡潔に述べると、ヒトタンパク質の全セットをフィルタリングして、予測される細胞表面タンパク質を同定した。これらのタンパク質を、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）データベースを使用して発現について調べた。候補遺伝子の発現を、中皮腫において調べ、更なる分析のために、発現が、２を超える１００万キロベース当たりの転写産物（ＴＰＭ）、又は試料の５０％超で５を超えるＴＰＭの遺伝子を含めた。また、結腸直腸、卵巣、膵臓、及び肺腺がん腫瘍における候補遺伝子の発現も評価し、これらの腫瘍型における発現が、２未満のＴＰＭである遺伝子も更なる分析のために含めた。これらの遺伝子の概要を図１に示す。図２は、正常組織におけるＭＳＬＮのＲＮＡ発現を示す（Ｇｅｎｏｔｙｐｅ－Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＧＴＥｘプロジェクト、ｇｔｅｘｐｏｒｔａｌ．ｏｒｇ／ｈｏｍｅからのデータ）。メソテリンは、正常な脂肪、卵管、肺及び唾液腺組織で発現される。したがって、ＭＳＬＮ ＣＡＲ又はＴＣＲ Ｔ細胞が、これらの組織を標的にするのを防ぐことができる候補遮断因子も、ＭＳＬＮを発現する健常な組織で発現されるべきである。
腫瘍と正常組織におけるＭＳＬＮ発現を調べた（図３、ＴＣＧＡデータベース）。様々な細胞株におけるＭＳＬＮ発現も調べた（図４、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ、又はＣＣＬＥ）。図４に示す発現の細胞株ランク順序は、図３に見られるＭＳＬＮ腫瘍ランク発現と概ね相関していた。
ＬＲＲＮ４及びＵＰＫ３Ｂを、候補遮断因子標的として同定した。図５は、ＧＴｅｘポータル（ｗｗｗ．ｇｔｅｘｐｏｒｔａｌ．ｏｒｇ／ｈｏｍｅ／）からの正常組織におけるＬＲＲＮ発現を示し、一方、図６及び図７は、ＴＣＧＡ試料におけるＬＲＲＮ４発現を示し、図８は、ＣＣＬＥ細胞株におけるＬＲＲＮ４発現を示す。図５～図７において見ることができるように、ＭＳＬＮと同様に、ＬＲＲＮ４は、脂肪及び肺組織において高度に発現される。更に、ＬＲＲＮ４は、複数のロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）及びフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを含有する大きな細胞外ドメインを有する（図９）。
実施例２：ヘテロ接合性の喪失に起因してがん細胞内で喪失した候補遮断因子標的の同定
ヘテロ接合性の喪失に起因してＭＳＬＮ陽性がんにおいて喪失する候補遮断因子標的を、バイオインフォマティクスパイプラインを使用して同定した。
以下のデータベースを使用して、候補遮断因子標的を同定した：公開、集団頻度、分子結果、及びゲノムマッピング情報と併せたｄｂＳＮＰ、ヒト一塩基多様性並びに小規模の挿入及び欠失を含む一塩基多型のデータベース。一般的なバリエーションは、少なくとも１つの主要集団において０．０１以上のマイナー対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）を有し、ＮＣＢＩにおいてマイナー対立遺伝子を有する少なくとも２つの無関係な個体を有すると定義された。０．１以上のＭＡＦを、一般的なバリエーションについての基準として使用した。Ｕｎｉｐｒｏｔ（Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）は、ＥＭＢＬ－ＥＢＩ、ＳＩＢ、及びＰＩＲによってホストされるタンパク質配列及び注釈データについてのリソースとして使用した。ＧＴＥｘ（Ｔｈｅ Ｇｅｎｏｔｙｐｅ－Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）は、組織特異的な遺伝子発現及び調節についての公的リソースとして使用した。これは、約１０００人の個体にわたる５４の非疾患組織部位からの試料を含有する。ＴＣＧＡ（Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ）を、２０，０００を超える原発性がんについてのリソースとして使用し、３３種類のがんにわたる正常な試料を一致させた。ＣＣＬＥ（Ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ）は、５７の結腸直腸がん（ＣＲＣ）細胞株に関する情報を含む。Ｘｅｎａ ＵＣＳＣは、ＴＣＧＡ及びＧＴＥｘ発現データ（ＦＰＫＭ）を再正規化した。Ｂｒｏａｄ ＧＤＡＣ Ｆｉｒｅｈｏｓｅ Ｌｅｇａｃｙデータを、コピー番号分析に使用した。
ＮＣＢＩ ｄｂＳＮＰデータベースをダウンロードし、一般的なバリアントを検索した。ヘテロ接合性の喪失が高い（０．５以上）腫瘍コピー数ポータル内の検索に基づいて同定された染色体のバリアントのみが含まれ、０．１未満のマイナー対立遺伝子頻度を有するバリアントが除去された。ＶＥＰ（バリアント効果予測因子）を使用して、タンパク質コード領域にあるミスセンスバリアントをフィルタリングした。中皮腫において高度に発現されない遺伝子であるような、膜貫通ドメインを有しない遺伝子を除去した（ＴＣＧＡ－ＭＥＳＯ発現レベル＜５ＴＰＭ）。ＬＯＨ頻度が、０．５以下の遺伝子を除去した。遺伝子は、ゴルジ、ＥＲ、核、細胞質、ミトコンドリア、ヘリックス、リソソームを発現し、そしてプロペプチドを除去した。ＬＯＨ頻度を、ＴＣＧＡコピー数ポータルにおいて確認した。
フィルタを通過した遺伝子を、Ｅｎｓｅｍｂｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ又はＶＥＰ分析出力における他のバリアント、並びに遺伝子内のバリエーションの位置について確認した。１１個の遺伝子が、全てのフィルタを通過した。このプロセスの概要を図１３に示す。
ＩＣＡＭ１、ＣＯＭＴ及びＣＸＣＬ１６を標的とする候補遮断因子を同定した。ＩＣＡＭ１、ＣＯＭＴ及びＣＸＣＬ１６についての様々ながんにおけるＬＯＨの頻度の概要として、以下の表１７に示す。
Figure 2023538114000159
Figure 2023538114000160
実施例３：遮断因子リガンド結合ドメインの同定
ＣＤＲ配列が未知である場合、候補の遮断因子抗原に対する公的に入手可能な抗体が配列決定される。候補の遮断因子標的に対する抗体が入手可能でない場合、これらの抗体は、精製されたタンパク質（例えば、ＩＣＡＭ１、ＣＸＣＬ１６、及びＣＯＭＴ１）を用いたマウス、ラット、又はウサギの免疫化によって生成される。免疫化動物からの血清を使用して、ｍＡｂが遮断因子標的に結合するかどうかをスクリーニングする。遮断因子標的に対する抗体もまた、ｈｕＴＡＲＧ（商標）系を使用して生成される。次いで、所望の特異性を有する抗体を単離し、配列決定して、ＣＤＲ配列を決定する。
抗体から遮断因子標的までのＣＤＲ配列を使用して、標準的な分子生物学的技術を使用してｓｃＦｖを生成する。候補のｓｃＦｖは、抑制因子受容体ヒンジ又は膜貫通ドメインに融合され、標準的な分子生物学的技術を使用して抑制性受容体を生成する。候補のｓｃＦｖはまた、活性化因子受容体ヒンジ又は膜貫通ドメイン（例えば、ＣＡＲ）に融合され、標的抗原に結合するｓｃＦｖについての陽性対照として使用するための全長活性化因子受容体を生成する。抑制性受容体の状況において作用する候補ｓｃＦｖの能力を、ＮＦＡＴ－ルシフェラーゼレポーターアッセイを使用してＪｕｒｋａｔ細胞においてアッセイする。
実施例４：ＨＬＡ－Ａ＊０２遮断因子は、ＭＳＬＮ活性化因子により媒介されるＪｕｒｋａｔ細胞の活性化を遮断することができる
細胞培養
ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーターをコードするＪｕｒｋａｔ細胞を、ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手した。培養において、Ｊｕｒｋａｔ細胞を、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、及び０．４ｍｇ／ｍＬのＧ４１８／ジェネテシンを補充したＲＰＭＩ培地中に維持した。この研究で使用した全ての他の細胞株は、ＡＴＣＣから入手し、ＡＴＣＣによって示唆されるように維持した。
Ｊｕｒｋａｔ細胞トランスフェクション
Ｊｕｒｋａｔ細胞を、以下の設定：３パルス、１５００Ｖ、１０ｍｓｅｃを使用して、製造業者のプロトコルに従って、１００ｕＬフォーマットのネオンエレクトロポレーションシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により一過性にトランスフェクトした。同時トランスフェクションを、１ｅ６細胞当たり１～３ｕｇの活性化因子ＣＡＲ又はＴＣＲ構築物、及び１～３ｕｇの遮断因子構築物又は空のベクターで実施し、２０％の熱不活性化ＦＢＳ及び０．１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充したＲＰＭＩ培地中で回収した。
Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ルシフェラーゼ活性化研究
Ｊｕｒｋａｔ細胞を、１０％熱不活性化ＦＢＳ及び０．１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充した１５ｕＬのＲＰＭＩ中に再懸濁させ、ペプチド装填ビーズに添加し、６時間共培養した。Ｊｕｒｋａｔ発光を評価するために、ＯＮＥ－Ｓｔｅｐ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用した。アッセイは、技術的な複製で行った。
初代Ｔ細胞形質導入、拡大、及び濃縮
凍結したＰＢＭＣを３７℃の水浴中で解凍し、１％のヒト血清を含むＬｙｍｐｈｏＯＮＥ（Ｔａｋａｒａ）中の１ｅ６細胞／ｍＬで培養し、ＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ－２１（１０ｎｇ／ｍＬ）を補充した１：１００のＴ細胞ＴｒａｎｓＡｃｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して活性化した。２４時間後、レンチウイルスを、５のＭＯＩでＰＢＭＣに添加した。ＰＢＭＣを更に２～３日間培養して、細胞がＴｒａｎｓＡｃｔ刺激下で増殖することを可能にした。拡大後、活性化因子及び遮断因子形質導入初代Ｔ細胞を、製造業者の指示に従って抗ＰＥマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して濃縮した。簡潔に述べると、初代Ｔ細胞を、ＭＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中の０．５％のＢＳＡ＋２ｍＭのＥＤＴＡ）中で４℃で３０分間、１：１００希釈のＣＤ１９－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）とインキュベートした。細胞を、ＭＡＣＳ緩衝液中で３回洗浄し、ＭＡＣＳ緩衝液中で４℃で３０分間、二次抗体（１：２００）中でインキュベートした。次いで、細胞を、抗ＰＥマイクロビーズ中でインキュベートし、ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）に通した。
初代Ｔ細胞のインビトロ細胞傷害性研究
ｐＭＨＣ標的を用いた細胞傷害性研究のために、濃縮された初代Ｔ細胞を、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｂｉｏｓｅｔｔｉａ）、及びＧＦＰ又はＲＦＰを発現するＳｉＨａ又はＨｅＬａ細胞とインキュベートした。生きたルシフェラーゼ発現ＳｉＨａ又はＨｅＬａ細胞を、ウミシイタケルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して定量化した。濃縮した初代Ｔ細胞を、ＳｉＨａ若しくはＨｅＬａ（「腫瘍」細胞）又はＨＬＡ－Ａ＊０２形質導入ＳｉＨａ若しくはＨｅＬａ細胞（「正常」細胞）とインキュベートした。ＧＦＰ又はＲＦＰ及びウミシイタケルシフェラーゼ（Ｂｉｏｓｅｔｔｉａ）を安定に発現するＷＴ「腫瘍」ＳｉＨａ若しくはＨｅＬａ細胞、又はＲＦＰ及びルシフェラーゼ（Ｂｉｏｓｅｔｔｉａ）を安定に発現するＨＬＡ－Ａ＊０２「正常」ＳｉＨａ若しくはＨｅＬａ細胞を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ生細胞イメージャーを使用して、標識されていない初代Ｔ細胞とともに画像化した。
ＭＳＬＮ ＣＡＲ活性化因子及びｐＭＨＣ ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｓｃＦｖ ＬＩＲ－１ベースの抑制性受容体を発現するＪｕｒｋａｔエフェクター細胞の活性化を、ＮＦＡＴルシフェラーゼアッセイを使用してアッセイした。
Ｊｕｒｋａｔ細胞を、１：４の比の活性化因子：遮断因子ＤＮＡでトランスフェクトし、無細胞ビーズベースのアッセイにおいて活性化をアッセイした（図１０Ａ）。ビーズに、活性化因子抗原、又は活性化因子及び遮断因子抗原のいずれかを充填し、ビーズ対Ｊｕｒｋａｔ細胞の比を変化させた。無細胞ビーズベースのアッセイでは、ｐＭＨＣ ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｓｃＦｖ ＬＩＲ－１ベースの抑制性受容体は、細胞をシスでｐＭＨＣ ＨＬＡ－Ａ＊０２遮断因子及びＭＳＬＮ活性化因子を担持するビーズと接触させたときに、Ｊｕｒｋａｔ細胞の活性化を遮断することができた。ビーズ上のｐＭＨＣ ＨＬＡ－Ａ＊０２遮断因子の存在は、ＭＳＬＮ ＣＡＲのＥＭＡＸを１２倍以上シフトすることができた（図１０Ａ）。
１：４のＤＮＡ比で同じ活性化因子及び遮断因子でトランスフェクトした活性化Ｊｕｒｋａｔ細胞を、慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２を使用して活性化のためにアッセイした。Ｋ５６２は、活性化因子抗原であるＭＳＬＮを発現する。活性化因子及び遮断因子抗原（ＭＳＬＮ＋ＨＬＡ－Ａ＊０２＋）の両方を発現させるためにＨＬＡ－Ａ＊０２で形質導入したＫ５６２細胞、並びに活性化因子を発現したが、遮断因子抗原を発現しなかった非形質導入Ｋ５６２（ＭＳＬＮ＋ＨＬＡ－Ａ＊０２－）に対するＪｕｒｋａｔエフェクター細胞の応答をアッセイした。図１０Ｂで見ることができるように、Ｋ５６２細胞によるＨＬＡ－Ａ＊０２＋の発現は、ＭＳＬＮ ＣＡＲ ＥＭＡＸを５倍超シフトすることができた。
ＭＳＮＬ ｓｃＦｖ ＣＡＲを介した活性化を遮断するｐＭＨＣ ＨＬＡ－Ａ＊０２抑制性受容体の能力も、エフェクター初代Ｔ細胞及びＳｉＨａ又はＨｅＬａ標的細胞を使用してアッセイした。ＳｉＨａ及びＨｅＬａ細胞は、内因的にＭＳＬＮを発現し、ＨＬＡ－Ａ＊０２抑制性受容体標的を発現するように形質導入した。初代エフェクターＴ細胞の活性化を、ＩＦＮγの倍率誘導を調べることによってアッセイした。図１１に示すように、ｐＭＨＣ ＨＬＡ－Ａ＊０２ ＬＩＲ－１抑制性受容体は、ＨＬＡ－Ａ＊０２を発現するＳｉＨａ又はＨｅＬａ標的細胞を初代Ｔ細胞に提示したときに、初代Ｔ細胞の活性化を遮断することができた（それぞれ、１０倍及び５倍超の阻害）。
ｐＭＨＣ ＨＬＡ－Ａ＊０２抑制性受容体はまた、ＭＳＬＮを発現したが、ＨＬＡ－Ａ＊０２を発現しなかったＳｉＨａ細胞をＴ細胞に提示したときに、ＭＳＬＮ ｓｃＦｖ ＣＡＲ及びｐＭＨＣ ＨＬＡ－Ａ＊０２ ＬＩＲ－１抑制性受容体の両方を発現するＴ細胞による死滅を阻害することができた（図１２）。
実施例５：ＨＬＡ－Ａ＊０２遮断因子は、Ｋ５６２及びＨｅＬａ標的細胞を使用してＭＳＬＮに向けられたＭＳＬＮ ＣＡＲ活性化因子を阻害する
細胞培養
ＭＳＬＮ ＣＡＲ活性化因子及びＨＬＡ－Ａ０２ ＬＩＲ－１抑制性受容体を、Ｊｕｒｋａｔエフェクター細胞及びＫ５６２標的細胞を使用して調べた（図１５Ａ）。遮断因子標的であるＨＬＡ－Ａ＊０２を発現するＨｅＬａ細胞を死滅させる、ＭＳＬＮ ＣＡＲを発現するＭＳＬＮ ＣＡＲ Ｔ細胞（２つの異なるＭＳＬＮリガンド結合ドメインを有する）の能力もアッセイした（図１５Ｂ～図１５Ｃ）。ＭＳＬＮリガンドは、１００，０００個のエピトープ／細胞の領域に拡張することができる表面抗原を表す。一過性トランスフェクションアッセイにおいて異なるＤＮＡ濃度を使用して、Ａ対Ｂのモジュール発現の比を変化させた。活性化因子及び抑制性受容体系は、低及び高標的密度に対応するのに十分な柔軟性を有し、原則として、ｐＭＨＣ標的及び非ｐＭＨＣ表面抗原についての最適化を可能にする。
ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーターをコードするＪｕｒｋａｔ細胞を、ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手した。この研究で使用した全ての他の細胞株は、ＡＴＣＣから入手した。培養において、Ｊｕｒｋａｔ細胞を、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、及び０．４ｍｇ／ｍＬのＧ４１８／ジェネテシンを補充したＲＰＭＩ培地中に維持した。Ｋ５６２及びＨｅＬａ細胞を、ＡＴＣＣによって示唆されるように維持した。
ＭＳＬＮ抗原結合ドメイン
ＭＳＬＮ活性化ＣＡＲ ｓｃＦｖは、Ｂｅａｔｔｙ，ｅｔ ａｌ．ＷＯ２０１５／０９０２３０Ａ１に記載されているヒトＭ５（ＬＢＤ１）、並びにＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅ，２０１９（ＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅ，ｖｅｒｓｉｏｎ ３．６，ｖｅｒｓｉｏｎ ３．６ ｅｄ．Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）及びＵＳ６，８０９，１８４Ｂ１に記載されているヒト化ＳＳ１（ＬＢＤ２）から派生した。
Ｊｕｒｋａｔ細胞のトランスフェクション及び活性化
Ｊｕｒｋａｔ細胞を、以下の設定：３パルス、１５００Ｖ、１０ｍｓｅｃを使用して、製造業者のプロトコルに従って、１００ｕＬフォーマットのネオンエレクトロポレーションシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により一過性にトランスフェクトした。同時トランスフェクションを、１ｅ６細胞当たり１～３ｕｇの活性化因子構築物、及び１～３ｕｇの遮断因子構築物又は空のベクターで実施し、２０％の熱不活性化ＦＢＳ及び０．１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充したＲＰＭＩ培地中で回収した。遮断因子表面発現を確認するために、Ｊｕｒｋａｔ細胞を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で４℃で６０分間の、１０ｕｇ／ｍＬのストレプトアビジン－ＰＥ－ＨＬＡ－Ａ＊０２－ｐＭＨＣ四量体でのトランスフェクションの１８～２４時間後に染色し、フローサイトメトリー（ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ）によって特徴付けた。Ｊｕｒｋａｔ細胞活性化を、実施例４に記載されるＮＦＡＴ－ルシフェラーゼアッセイシステムを使用して評価した。
初代Ｔ細胞形質導入、拡大、及び濃縮
Ｌｅｕｋｏｐａｋｓは、ＡｌｌＣｅｌｌｓ（登録商標）から購入した。収集プロトコル及びドナーのインフォームドコンセントは、厳格な監督の下、施設内審査委員会（ＩＲＢ）によって承認された。ＨＩＰＡＡコンプライアンス及び承認されたプロトコルにも従った。実施例４に記載されるように、凍結ＰＢＭＣを解凍し、培養した。細胞を、各レンチウイルス、すなわち、活性化因子又は遮断因子受容体を含むレンチウイルスベクターについて、ＭＯＩ＝５で同時に同時形質導入した。ＰＢＭＣを更に２～３日間培養して、細胞がＴｒａｎｓＡｃｔ刺激下で増殖することを可能にした。拡大後、活性化因子及び遮断因子形質導入初代Ｔ細胞を、製造業者の指示に従って抗ＰＥマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して陽性選択によって遮断因子－陽性Ｔ細胞を濃縮した。簡潔に述べると、初代Ｔ細胞を、ＭＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中０．５％ＢＳＡ＋２ｍＭのＥＤＴＡ）中で４℃で６０分間、１０ｕｇ／ｍＬのストレプトアビジン－ＰＥ－ＨＬＡ－Ａ＊０２－ｐＭＨＣ四量体とインキュベートした。細胞をＭＡＣＳ緩衝液中で３回洗浄し、ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を通して、遮断因子－陽性細胞（遮断因子のみ及び活性化因子＋遮断因子細胞の混合物）を、形質導入されていない細胞及び活性化因子のみの細胞から分離した。
初代Ｔ細胞のインビトロ細胞傷害性研究
ｐＭＨＣ標的を用いた細胞傷害性研究のために、濃縮された初代Ｔ細胞を、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｂｉｏｓｅｔｔｉａ）を発現するＫ５６２又はＨｅＬａ標的細胞とインキュベートした。ＨＬＡ－Ａ＊０２陽性であった標的細胞もＧＦＰ及びホタルルシフェラーゼ（Ｂｉｏｓｅｔｔｉａ）を発現し、ＨＬＡ－Ａ＊０２陰性であった標的細胞は、ＲＦＰ及びホタルルシフェラーゼを発現した。標的細胞を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ生細胞イメージャーを使用して、標識されていない初代Ｔ細胞とともに画像化した。経時的な生きた標的細胞の蛍光強度を、ＩｎｃｕＣｙｔｅイメージングソフトウェアを使用して定量化した。
実施例６：第２及び第３世代ＣＡＲアーキテクチャ並びにＨＬＡ－Ａ＊０２遮断因子におけるマウスＳＳ１ ＭＳＬＮ抗原結合ドメイン活性化因子
最初は、ＭＳＬＮを標的とするヒト化Ｍ５及びＳＳ１ ｓｃＦｖを、第３世代ＣＡＲアーキテクチャ（ＣＤ２８、４－１ＢＢ及びＣＤ３ゼータ）とともに使用した。マウスＳＳ１ ｓｃＦｖ抗原結合ドメイン、及び第２世代ＣＡＲアーキテクチャ（４－１ＢＢ及びＣＤ３ゼータ細胞内ドメイン）を使用した効果をアッセイした。
ＨＬＡ－Ａ＊０２－ドナーＴ細胞を、ＰＡ２．１抗原結合ドメインを使用して、ＭＳＬＮ第３世代ＣＡＲ活性化因子（ＣＤ２８、４－１ＢＢ及びＣＤ３ゼータ細胞内ドメインを有するＣＡＲ）及びＨＬＡ－Ａ＊０２ ｓｃＦｖ ＬＩＲ－１遮断因子で形質導入した。ヒト化Ｍ５、ヒト化ＳＳ１、及びマウスＳＳ１ ｓｃＦｖを有するＭＳＬＮ ＣＡＲ活性化因子をアッセイした（表１）。ＨＬＡ－Ａ＊０２遮断因子配列は、表５に記載されている。Ｔ細胞を、実施例４及び５に記載されるように、活性化因子及び／又は遮断因子構築物で形質導入し、培養し、濃縮した。Ｔ細胞を形質導入後１４日目に使用し、１：１のエフェクター：標的比でＭＳＬＮ＋ＨｅＬａ標的細胞と培養した。細胞傷害性を、実施例４及び５に記載されるようにアッセイした。図１６は、ＨｅＬａ細胞もＨＬＡ－Ａ＊０２を発現したときに、抑制因子受容体が、ＭＳＬＮ第３世代ＣＡＲを発現するＴ細胞によるＨｅＬａ細胞の死滅を効果的に遮断することができたことを示す。更に、図１６は、マウスＳＳ１第３世代ＣＡＲ（右上のプロット、ボックスで囲まれている）が、ヒト化Ｍ５及びヒト化ＳＳ１ ＣＡＲよりも良好なウィンドウを提供することを示す。図１６において、Ｃ－０８８３は、陽性対照として使用されるＨＬＡ－Ａ＊０２ ＣＡＲであり、追加の配列は表１９に記載されていることに留意されたい。
ＭＳＬＮ活性化因子及びＨＬＡ－Ａ＊０２ ＬＩＲ１遮断因子を発現するＴ細胞が、ＭＳＬＮ＋ＨＬＡ－Ａ＊０２－Ｃａｐａｎ細胞を選択的に死滅させる能力もアッセイした（図１７）。Ｔ細胞を、実施例４及び５に記載されるように、活性化因子及び／又は遮断因子受容体構築物で形質導入し、培養し、濃縮した。Ｔ細胞を形質導入後１４日目に使用し、１：１のエフェクター：標的比でＣａｐａｎ標的細胞と培養した。細胞傷害性を、実施例４及び５に記載されるようにアッセイした。図１７は、Ｃａｐａｎ細胞もＨＬＡ－Ａ＊０２を発現したときに、抑制因子受容体が、ＭＳＬＮ第３世代ＣＡＲを発現するＴ細胞によるＣａｐａｎ細胞の死滅を効果的に遮断することができたことを示す。
マウスＳＳ１ ＭＳＬＮ１ ｓｃＦｖも、第２世代ＣＡＲ（４－１ＢＢ及びＣＤ３ゼータ細胞内ドメインを有するＣＡＲ）においてアッセイした。図１８は、ｍＳＳ１第２世代ＣＡＲを発現するＴ細胞による、ＭＳＬＮ＋ＨＬＡ－Ａ＊０２＋＿ＨｅＬａ細胞、及びＨＣＴ１１６野生型細胞（ＭＳＬＮ及びＨＬＡ－Ａ＊０２の両方を天然に発現する）の死滅が、ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｓｃＦｖ ＬＩＲ－１抑制性受容体によって効果的に遮断されたことを示す。図１８から見ることができるように、第２世代ｍＳＳ１ ＣＡＲは、ＢＢ７．２ ｓｃＦｖ抗原結合ドメインを有する抑制性受容体によるよりも、ＰＡ２．１ ｓｃＦｖ抗原結合ドメインを有する抑制性受容体によってより効果的に遮断された。抑制性受容体における短い及び長いＬＩＲ－１ヒンジ配列の効果、並びにＨＬＡ－Ａ＊０２ ｓｃＦｖにおけるＶＨ及びＶＬドメインの配置もアッセイした。
マウスＳＳ１ ｓｃＦｖを用いた第２世代ＣＡＲの発現も、ＦＡＣＳにより確認し、その結果を図１９に示す。ＳＳ１抗原結合ドメインを、組換え可溶性ＭＳＬＮリガンドを使用して染色した。
Figure 2023538114000161
Figure 2023538114000162
Figure 2023538114000163
実施例７：遮断活性に対するＬＩＲ－１ヒンジの効果のアッセイ
上記のＪｕｒｋａｔ ＮＦａｔルシフェラーゼアッセイを使用して、ＫＲＡＳ ＴＣＲ活性化因子を発現するＪｕｒｋａｔ細胞による死滅を遮断するＨＬＡ－Ａ＊０２ ｓｃＦｖ ＬＩＲ－１抑制性受容体の能力に対する異なるＬＩＲ－１ヒンジの効果をアッセイした。ヒト化ＰＡ２．１ ｓｃＦｖ ＬＩＲ－１受容体及びより短いＬＩＲ－１ヒンジを有するヒト化ＢＢ７．２ ｓｃＦｖ ＬＩＲ－１を、前述のようにＪｕｒｋａｔ細胞においてアッセイし、その結果を図２０Ａ～図２０Ｂに示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、様々なＬＩＲ－１由来のヒンジ、上記の方法を用いて、ＫＲＡＳ ＴＣＲ活性化因子受容体及び／又はＨＬＡ－Ａ＊０２ ｓｃＦｖ ＬＩＲ－１抑制性受容体（ヒト化ＰＡ２．１又はヒト化ＢＢ７．２）でトランスフェクトし、ＨＬＡ－Ａ１１陽性、又はＨＡ－Ａ１１及びＨＬＡ－Ａ＊０２陽性のいずれかであったＴ２標的細胞と共培養した。より短い及びより長いヒンジの両方を有する抑制性受容体は同様に挙動した（図２０Ａ～図２０Ｂ）。マウスＰＡ２．１ ｓｃＦｖ及びわずかに長いヒンジを有する抑制性受容体もまた、Ｔ２－Ｊｕｒｋａｔアッセイにおいて、より短いＬＩＲ－１ヒンジと同様に機能するアッセイを行った（図２１Ａ～図２１Ｂ）。ヒンジ配列は、図２０Ｂ及び図２１Ｂに黒で示され、灰色のＳＳは、抗原結合ドメインとヒンジとの間のリンカーを表し、灰色のＶＩＧＩＬは、ＬＩＲ－１膜貫通ドメインの開始を表す。抑制性受容体のヒンジ、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインは、全てＬＩＲ－１から派生した。図２０Ａ～図２０Ｂ及び図２１Ａ～図２１Ｂは、ＬＩＲ－１抑制性受容体に悪影響を及ぼすことなく、ＬＩＲ－１ヒンジの長さを変化させることができることを示す。より短いヒンジは、ＬＩＲ－１抑制性受容体をコードする核酸配列を、送達のためにレンチウイルスベクター内にパッケージングするときに利点を提供することができる。
実施例８：新しい抗ＭＳＬＮ抗体の同定
メソテリン（ＭＳＬＮ）は、肺がん及び他の多くの固形腫瘍において発現される古典的な腫瘍関連抗原である。しかしながら、ＭＳＬＮはまた、重要な内臓の表面を取り囲み、潤滑する正常な中皮においても発現される。この正常発現は、ＭＳＬＮ指向治療についての重篤な炎症の重大なリスクを引き起こす。この実施例は、がん細胞におけるＨＬＡ遺伝子座における共通のＬＯＨを利用して、Ｔ細胞が腫瘍と正常組織との違いを認識することを可能にする二重受容体（Ｔｍｏｄ）系を説明する。この実施例に記載されるＭＳＬＮ ＣＡＲ Ｔｍｏｄ構築物を用いて操作したＴ細胞は、以下を含有する。（ｉ）ＭＳＬＮ活性化ＣＡＲ、及び（ｉｉ）ＨＬＡ－Ａ＊０２によってゲーティングされた抑制性受容体。理論に拘束されることを望まないが、Ｔｍｏｄ系は、インビトロ及び異種移植モデルにおける混合細胞集団においてさえ、「正常」細胞を堅牢に保護する。ＭＳＬＮ ＣＡＲは、他のＨＬＡクラスＩ遮断因子と対合することもでき、ＨＬＡ－Ａ＊０２ヘテロ接合体を超えた患者へのアプローチの拡張を支持する。ＭＳＬＮ ＣＡＲ Ｔｍｏｄ構築物によって例示されるＴｍｏｄ機構は、以前に可能な場合よりも安全で、より効果的な方式でＭＳＬＮなどの固形腫瘍抗原を活用するための代替経路を提供することができる。メソテリン（ＭＳＬＮ）は１９９２年にがん標的として提案されたが［１］、ＭＳＬＮを利用した有効な治療法はまだ存在していない。それは、ほとんどの中皮腫で発現されるだけではなく、卵巣、子宮頸部、子宮、胃、膵臓、及び肺腺がんの多くのサブセットでも発現される［２］。正常な成人では、ＭＳＬＮは中皮にのみ存在し、この組織自体は必須ではない可能性がある［２、３］。しかしながら、ＭＳＬＮを標的とする免疫療法は、重要な内臓を取り囲むＭＳＬＮ（＋）中皮細胞に対する炎症発作のリスクを有する［４］。ＭＳＬＮを対象とするいくつかの研究用治療薬、例えば、免疫毒素コンジュゲート［５、６］、抗体－薬物コンジュゲート［７］、二重特異性抗体［８］、ＣＡＲ－Ｔ［９］、及びハイブリッドＴＣＲ－ｓｃＦｖ［１０］が試験されている。これまでに全身投与された有効な治療薬は全て毒性があった。最近、胸膜内注入を介してＭＳＬＮ ＣＡＲ－Ｔを送達するアプローチが報告されている［１１］。
この実施例は、治療薬の局所投与に依存するのではなく、代わりにＬＯＨを利用する、ＭＳＬＮ（＋）がんを治療するための例示的な方法を説明する。このアプローチは、ＭＳＬＮ標的化ＣＡＲを、ＨＬＡ－Ａ＊０２対立遺伝子を発現する正常細胞に対するエフェクター機能を遮断するＬＩＲ－１ベースの抑制性受容体と対にすることによって、正常組織に対する全身毒性を回避することを目的とする（図２２Ａ～２２Ｂ）。この二重受容体構築物は、ＭＳＬＮ（＋）腫瘍中にＨＬＡ－Ａ＊０２対立遺伝子のＬＯＨを有する遺伝的に定義されたがん患者を治療することを意図する。ＬＯＨによって引き起こされる腫瘍対正常組織におけるＨＬＡ－Ａ＊０２発現の差異は、腫瘍死滅のための高い選択性を付与すると考えられるエフェクター細胞へのオール・オア・ナッシング入力を生じさせる。
結果
強力な選択的ＭＳＬＮ ＣＡＲの単離及び特徴付け
ＣＡＲにおいて機能する強力な選択的ＭＳＬＮ指向性リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を同定するために、ＩｇＧ抗体（ｍＡｂ）又はｓｃＦｖのいずれかをコードする哺乳動物表面ディスプレイライブラリーをスクリーニングした（図２３Ａ～図２３Ｂ）。蛍光色素で標識した可溶性ビオチン化ＭＳＬＮをプローブとして使用して、ＦＡＣＳを介してＭＳＬＮのために染色したライブラリー中の細胞を濃縮した。陰性プローブとして、可溶性ＣＥＡ及びＥＧＦＲの混合物を使用して、非特異的結合特性を有するｍＡｂ又はｓｃＦｖをコードする細胞を枯渇させた。ＭＳＬＮ結合のための２ラウンドの濃縮の後、６２個の個々のＬＢＤを選択し、ｓｃＦｖ ＣＡＲに変換し、Ｊｕｒｋａｔ細胞における表面発現について確認し、固体状態Ｊｕｒｋａｔ細胞アッセイにおける機能活性について評価した（図２３Ｃ～図２３Ｄ）。このステップにより、更なる機能的特徴付けのために、最も感受性の高い選択的結合剤のサブセットの選択が可能になった。
６２個の結合剤のほとんどが、細胞表面に提示されるＭＳＬＮに対する機能的応答をもたらしたが、６個を更なる特徴付けのために選択し、配列結合剤ＣＤＲ（重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ及び軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ）を、表２、表３（重鎖；ＶＨ）及び表４（軽鎖；ＶＬ）に提供する。各場合において、ＨＣ－ＣＤＲ又はＶＨは、重鎖及び軽鎖が類似性を共有するため、所望の発現及び結合活性を確認するために日常的な試験を用いて、ＬＣ－ＣＤＲ又はＶＬのいずれかと対合され得る。
一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、ＶＨセグメントとＶＬセグメントとの間にリンカー（例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号１５２）又は別の好適なリンカー）を挿入することによって生成されて、ＶＨ－ＶＬ ｓｃＦｖを形成することができるか、又はＶＬ－ＶＨ ｓｃＦｖが代替的に構築され得る。軽鎖は高い配列類似性を有し、完全な抗体を生成するためのＶＬ及びＶＨの対合は、過度の実験なしに決定されている。例示的なｓｃＦｖを表１に提供し、例示的な重鎖及び軽鎖を表３及び４に提供し、例示的なＣＤＲ配列を表２に提供する。ＭＳＬＮ ｓｃＦｖを使用する例示的なキメラ抗原受容体の配列を、以下の表２０として提供する。
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６つの結合剤を、第３世代（Ｇｅｎ３）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ１～ＣＡＲ６）として発現させ［表１～４及び２０のそれぞれ、＃１６、１７、１８、２９、５５、及び５９に対応する］、Ｊｕｒｋａｔ機能アッセイの文献（ＳＳ１、Ｍ５、及びｍ９１２）からの抗ＭＳＬＮ ｓｃＦｖと比較した。ＣＡＲは、様々な感受性（ＥＣ５０）及び最大応答（Ｅｍａｘ）を示した（図２４Ａ）。全ての構築物は、ＳＳ１（Ｇｅｎ２）を除いてＧｅｎ３であった。６時間の共培養アッセイにおける感受性を評価するために、Ｊｕｒｋａｔ細胞の用量応答（ＲＬＵ）を測定した：（１）滴定したＭＳＬＮコードｍＲＮＡを使用して、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトし、（２）ＱＩＦＩＫＩＴ（定量分析キット、Ａｇｉｌｅｎｔ（登録手票））を使用して、フローサイトメトリーベースの表面発現をＭＳＬＮ分子／細胞に変換し、（３）６つの新規及び３つのベンチマークＣＡＲの分子／細胞感受性（ＥＣ５０）を、用量応答曲線に適合させることにより計算した。アッセイの検出限界を下回る感受性を有するこれらのＣＡＲについて、ＥＣ５０は、３０００未満のＭＳＬＮ分子／細胞として報告した。各構築物についての最大シグナル（Ｅｍａｘ）も示した。実験を１～４回繰り返した。
表２１は、形質導入された初代Ｔ細胞によるＨｅＬａ細胞の選択性ウィンドウ及び死滅効率を示す。活性化因子及び遮断因子＋初代Ｔ細胞でのＭＳＬＮ＋Ａ２－の死滅とＭＳＬＮ＋Ａ２＋ＨｅＬａ細胞の死滅との間の選択性ウィンドウの定量化。死滅効率は、活性化因子＋（のみ）Ｔ細胞と比較した、活性化因子及び遮断因子＋Ｔ細胞によるＭＳＬＮ＋Ａ２－ＨｅＬａ細胞の死滅の差を記載している。両方の測定は、最大８０％の観察された死滅に対応する時間まで計算する。
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６つの結合剤（ＣＡＲ１～６）を、Ｊｕｒｋａｔ機能アッセイ［１２～１４］における文献（ＳＳ１、Ｍ５及びｍ９１２）からのベンチマークＭＳＬＮ ｓｃＦｖと比較した。全てが、Ｇｅｎ２ ＳＳ１を除いてＧｅｎ３ ＣＡＲとして発現された。ＭＳＬＮ（＋）標的細胞については、合成ＭＳＬＮ ｍＲＮＡでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を使用した。ＣＡＲは、様々な感受性（ＥＣ５０）及び最大応答（Ｅｍａｘ）を示した（図２４Ａ）。６つの結合剤のうち、ＣＡＲ１６を除く全ては、ｈＭ５及びｓＳＳ１よりも高い感受性を示す。
要するに、抗ＭＳＬＮ結合剤を同定するための広範なキャンペーンは、ＮＧＳスクリーニングにおいて同定された数百の配列をもたらし、６２個の候補構築物が産生され、それらの全てがＭＳＬＮに結合する。これらのうち６つは、優れた活性を示した。ＣＡＲ１８及びＣＡＲ２９は、比較用ＣＡＲ構築物に対して優れた感受性を示した。
以前の研究では、Ｅｍａｘは、受容体の表面発現に関連しており、ＥＣ５０は、その結合及びシグナル伝達特性、特に、ＬＢＤに関連していることが示唆されている［１５、１６］。ＥＣ５０は、必要な標準曲線及びＱＩＦＩＫＩＴ方法論を使用して、Ｊｕｒｋａｔ細胞における発光によって測定された相対応答から、絶対分子／細胞に変換された［２７］。ベンチマークＣＡＲのうちの１つ（ｍ９１２）は、低い機能的感受性を示し、ＥＣ５０は、約８０Ｋ分子／細胞と推定された。他のベンチマーク及び新規のＣＡＲについてのＥＣ５０は、約６Ｋ分子／細胞の下方に及んだ。Ｊｕｒｋａｔ細胞においてＣＡＲとしてアッセイされたいくつかの新規ＬＢＤは、検出限界を下回るＥＣ５０を有した（３Ｋ未満の分子／細胞）。選択性の指標として、ＣＡＲ３及びベンチマークＭ５を、ＭＳＬＮ（＋）及び（－）細胞株のパネルに対する応答性について試験した。両方のＣＡＲは、ＭＳＬＮ特異的活性化を示し、ＭＳＬＮ（－）株に対して不活性であった（図２４Ｂ及び図２５Ａ）。
ＭＳＬＮ Ｔｍｏｄ構築物は、Ｊｕｒｋａｔ及び初代Ｔ細胞におけるＨＬＡ－Ａ＊０２抗原によって効率的に遮断される
ＣＡＲ１～６及びベンチマークＣＡＲを、Ｔｍｏｄ構築物の成分として試験し、ＣＡＲを、Ｊｕｒｋａｔ及び初代Ｔ細胞において機能的応答を阻害することが以前に示されているＡ＊０２指向性抑制性受容体又は「遮断因子」と対にした［１８］。この遮断因子は、ＩＴＩＭ含有ＬＩＲ－１タンパク質のヒンジ、膜貫通及び細胞内ドメインに融合したＡ＊０２結合ｓｃＦｖを含んだ（図２２Ｂ）。標的細胞として、本発明者らは、ＭＳＬＮ表面発現を特徴とする細胞株を使用した（図２５Ａ及び図２５Ｂ、図２６Ａ及び図２６Ｂ）。全てのＣＡＲを、リガンド依存的な様式で、Ａ＊０２指向性ＬＩＲ－１遮断因子によって遮断した（図２７Ａ）。高い感受性、選択性、及びＡ＊０２遮断因子との効果的な機能的対合の組み合わせのために、ＣＡＲ３を、ＭＳＬＮ Ｔｍｏｄリード活性化因子構築物として更なる研究のために選択した。
ＭＳＬＮ ＣＡＲ３ Ｔｍｏｄ構築物を、Ｊｕｒｋａｔ細胞における活性化及び遮断感受性のための一連の定量的ｍＲＮＡ滴定実験において詳細に検査した（図２７Ｂ及び図２７Ｃ）。標的細胞については、他のほとんどのがん株と同様に、内因性ＭＳＬＮを発現する子宮頸がんＨｅＬａ細胞株を使用した。この株は、ＨＬＡ－Ａ＊０２（－）である。ＭＳＬＮレベルを制御するために、ＣＲＩＳＰＲによって不活性化されたＭＳＬＮを有するバリアントを生成した。ｍＲＮＡ滴定実験は、ＭＳＬＮ ＣＡＲ３ Ｔｍｏｄ構築物についてのＥＣ５０及びＩＣ５０の推定を可能にし、これらのパラメータを、高品質の公的データベースから導出された正常及び腫瘍組織上の抗原の発現レベルとの関連で見た（図２８Ａ）。
これらの比較を行うために、第１のステップとして、ＭＳＬＮ ｍＲＮＡと表面タンパク質レベルとの間の相関を確立した（図２５Ｂ）。同じことが、ＨＬＡ－Ａ、並びにＭＳＬＮ Ｔｍｏｄ構築物のＥＣ５０及びＩＣ５０と比較して異なる組織のＨＬＡ－Ａ及びＭＳＬＮレベルをプロットするために使用される情報についても行われた。正常組織の大部分は、ＭＳＬＮ ＴｍｏｄのＥＣ５０をはるかに下回るＭＳＬＮレベルを発現した。対照的に、肺を含む特定の組織は、Ｔｍｏｄ構築物のＥＣ５０をはるかに上回るレベルでＭＳＬＮを発現し、したがって、有効な遮断因子がない場合、高リスクとみなされた。しかしながら、これらのリスクのある組織はまた、Ｔｍｏｄ ＩＣ５０を上回るＨＬＡ－Ａレベルを発現し、それらが、ＴｍｏｄのＡ＊０２標的化ＬＩＲ－１遮断因子成分によって細胞傷害性から保護されることを示唆する。機能的アッセイにおいて正常及び腫瘍組織をモデル化するために使用される細胞株（トランスジェニックＨＬＡ－Ａ＊０２ ＨｅＬａ及びＭＳ７５１を含む）もまた、グラフに示される。
次いで、ＭＳＬＮ ＣＡＲ３ Ｔｍｏｄ構築物の挙動を、初代Ｔ細胞において試験した。細胞傷害性が主な読み取りであり、二次測定としてＩＦＮ－γ分泌を用いた。標的細胞は、ＨｅＬａ細胞及びバリアントであった：（ｉ）天然ＭＳＬＮ（＋）Ａ＊０２（－）ＨｅＬａ細胞は、遮断因子抗原を含まない腫瘍細胞をモデル化し、（ｉｉ）トランスジェニックＡ＊０２（＋）バリアントＨｅＬａ細胞は、正常な中皮細胞をモデル化した。異なる構築物及び標的細胞の組み合わせは、全てのＭＳＬＮ ＣＡＲ Ｔｍｏｄ構築物が、腫瘍細胞を強力に死滅させ、Ａ＊０２－リガンド依存性様式で死滅を遮断することを実証した（図２８Ｂ）。文献からの他の２つのＭＳＬＮ ＣＡＲ（ＳＳ１及びＭ５）を比較のために使用した（図２９Ａ）。細胞傷害性は、ＩＦＮ－γ放出によって反映された（図２９Ｂ）。したがって、ＨＬＡ－Ａ＊０２指向性遮断因子及び異なるＭＳＬＮ ＣＡＲ活性化因子からなるＴｍｏｄ構築物は、Ｊｕｒｋａｔ及び初代Ｔ細胞アッセイの両方において、ＭＳＬＮ（＋）Ａ＊０２（－）標的細胞に対して高い効力及び特異性を示した。
ＭＳＬＮ ＣＡＲ３ Ｔｍｏｄ構築物は、混合細胞及び連続培養物における選択的な可逆的細胞傷害性を媒介する
がん細胞療法の文脈において重要なＭＳＬＮ ＣＡＲ３ Ｔｍｏｄ構築物の様々な他の特性を試験した。この構築物は、腫瘍及び正常な標的細胞の混合培養物における抗原選択的細胞傷害性を媒介した：ＲＦＰで標識された天然ＭＳＬＮ（＋）ＨＬＡ－Ａ＊０２（－）ＨｅＬａ細胞を、ＧＦＰで標識されたＭＳＬＮ（＋）Ａ＊０２（＋）細胞と異なる比で混合した。これらの共培養物を、異なる受容体構築物で操作されたＴ細胞に曝露し、画像化した。ＣＡＲのみの構築物が無差別に死滅したのに対して、Ｔｍｏｄ構築物は、Ａ＊０２（＋）細胞を無傷のままにして、天然のＨｅＬａ腫瘍細胞のみを死滅させた（図３０Ａ）。選択性は、９：１の正常：腫瘍細胞比でも検出可能であった（図３０Ｂ、図３１Ａ及び図３１Ｂ）。
Ｔｍｏｄ細胞が、オン（能動的に死滅させる）状態とオフ（遮断）状態とを切り替える能力を、細胞傷害性アッセイを読み取りとして使用して調べた。これらの実験では、形質導入したＴ細胞を、標的細胞のあるバッチから別のバッチに移した（図３２Ａ、図３３Ａ、）。Ｔｍｏｄ細胞は、それらが静止している正常な細胞に２日間曝露された後に活性化し、死滅させる能力を示した。その逆も当てはまった。腫瘍細胞の死滅に関与したＴｍｏｄ細胞は、迅速にオフ状態に切り替わり、移動後及び休止期間なしで正常細胞を死滅させることを控えることができた。状態を切り替える能力は、全部で４日間にわたって２サイクルを通じて維持された。
高レベル（中央値約２００ｎｇ／ｍｌ；範囲２０～２，０００ｎｇ／ｍｌ［１９］）で一部のがん患者の血液中に存在する、可溶性ＭＳＬＮ（ｓＭＳＬＮ）が、ＭＳＬＮ ＣＡＲ３ Ｔｍｏｄ細胞を阻害したかどうかを調査した。５００ｎｇ／ｍｌで培養物に添加されたｓＭＳＬＮは、ＣＡＲ又はＴｍｏｄ Ｔ細胞のいずれかの機能に影響を及ぼさなかった 図３３Ｂ及び図３３Ｃ）。まとめると、これらの結果は、ＭＳＬＮ ＣＡＲ３ Ｔｍｏｄが、腫瘍及び正常細胞の混合培養物において選択的で可逆的な細胞傷害性を媒介し、一部のがん患者の血液中で観察されるレベルでｓＭＳＬＮによる影響を受けないことが示唆された。これらの特徴の全ては、選択されたがん患者において安全かつ有効である可能性を有する細胞療法と一致している。
ＭＳＬＮ ＣＡＲ３ Ｔｍｏｄ細胞は、検出可能なオフターゲット活性を示さない
ＭＳＬＮ ＣＡＲ３ Ｔｍｏｄ細胞のオフターゲット反応性を系統的に探索するために、Ｊｕｒｋａｔ細胞活性化を、成人遺伝子発現の大部分を包含するように選択された標的細胞株のパネルによって試験した（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ；Ｍｅｔｈｏｄｓを参照されたい）。陽性対照を使用して、エフェクター細胞が、ＭＳＬＮ（＋）細胞株によって活性化され得ることを確認し、陰性対照を使用して応答についてのベースラインを設定した（図２６Ｂ；図３２Ｂ）。約１，０００分子／細胞と推定されるアッセイの高い感受性にも関わらず、ＣＡＲ３ Ｔｍｏｄ Ｊｕｒｋａｔ細胞において検出可能な応答は誘発されなかった。
ＭＳＬＮ ＣＡＲ３ Ｔｍｏｄ構築物は、異種移植片モデルにおける腫瘍細胞の選択的死滅を媒介する
インビボでのＭＳＬＮ ＣＡＲ３ Ｔｍｏｄ細胞の挙動を調べるために、マウス異種移植片モデルを使用した。ＨｅＬａ細胞は、免疫不全（ＮＳＧ）マウスにおいて良好に増殖しなかったため、別の子宮頸がん細胞株であるＭＳ７５１を移植標的細胞として開発した。天然ＭＳＬＮを活性化因子抗原として使用し、遮断因子抗原ＨＬＡ－Ａ＊０２を遺伝子導入によって操作して、正常な組織レベルにより良く近似させた。これらのインビボ実験において、ＭＳＬＮ（＋）Ａ＊０２（＋）トランスジェニックバリアントが正常細胞をモデル化した一方で、ＨＬＡ－Ａ＊０２のＣＲＩＳＰＲノックアウトによって生成されたＭＳＬＮ（＋）Ａ＊０２（－）ＭＳ７５１細胞は、腫瘍をモデル化した。
細胞株をルシフェラーゼで操作して、腫瘍生存及び増殖の独立した読み取りとして生物発光を可能にした。各コホートの半数のマウスにおいて、マウス（１０／コホート）の左脇腹に腫瘍細胞を移植し、右脇腹に正常細胞を移植し、残りの半数にはその逆を移植して、脇腹の増殖変動を制御した（図３４Ａ）。異種移植片の体積が約１００～１５０ｍｍ３に達した後、尾静脈を介してマウスに２Ｅ７総Ｔ細胞／マウスを注入した。短時間の遅延の後、ＣＡＲ及びＴｍｏｄ構築物の両方が、キャリパー及び生物発光強度によって等しく良好に測定されたＭＳＬＮ（＋）Ａ＊０２（－）腫瘍細胞を死滅させた（図３４Ｂ及び図３４Ｃ、図３５Ｂ及び図３５Ｃ）。ＣＡＲのみのＴ細胞は、同等の有効性で腫瘍及び正常の両方を死滅させたが、Ｔｍｏｄ細胞は、インビトロ細胞傷害性を反映して、腫瘍移植片のみを死滅させた（図１４Ａ）。Ｔｍｏｄ細胞の存在下で、正常な細胞移植片は、非形質導入Ｔ細胞又は生理食塩水で処置された対照群のものと同等に増殖した。これらの結果は、哺乳動物体内のＭＳＬＮ Ｔｍｏｄ系の選択性を劇的に実証し、観察されている他の活性化因子－遮断因子対と一致した（Ｓａｎｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ；［１８］）。
ＭＳＬＮ ＣＡＲ Ｔｍｏｄプラットフォームの拡張
ＨＬＡ－Ａ＊０２標的化遮断因子の使用は、遮断因子が、自己Ｔ細胞において産生される内因性ＨＬＡ－Ａ＊０２分子によってシスで結合され得る可能性を高める。実際に、遮断因子結合の減少は、天然のＪｕｒｋａｔ Ａ＊０２（－）細胞と比較して、トランスフェクトされたトランスジェニックＡ＊０２（＋）Ｊｕｒｋａｔ細胞においてＨＬＡ－Ａ＊０２四量体で観察された（図３６）。Ａ＊０２（－）ドナーＴ細胞と比較して、ＭＳＬＮ ＣＡＲ３ Ｔｍｏｄ又はＳＳ１ Ｔｍｏｄ構築物で形質導入したＨＬＡ－Ａ＊０２（＋）ドナー由来の初代Ｔ細胞において同様の減少が観察された（図３６、図３７Ａ）。より重要なことに、この減少した結合は、それらのＡ＊０２（－）対応物と比較して、Ａ＊０２（＋）Ｊｕｒｋａｔ及び初代Ｔ細胞の両方において不十分な遮断因子の機能に変換された（図３６、図３７Ｂ及び図３７Ｃ）。これらの観察は、Ａ＊０２指向性遮断因子を利用する自己ＭＳＬＮ ＣＡＲ３ Ｔｍｏｄ生成物に対して、シス結合がどのように問題を引き起こし得るかを例示した。
この問題に対処するために、本発明者らは、内因性β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）のＣＲＩＳＰＲ不活性化に基づいた解決策を開発した。Ｂ２Ｍは、全てのＨＬＡクラスＩ発現に必要であるため、このアプローチは、ＨＬＡ－Ａ＊０２のシス結合効果を軽減することが予想された。予測されたように、初代Ｔ細胞におけるＢ２Ｍのノックアウトは、遮断因子の結合及び機能を、Ａ＊０２（－）ドナーＴ細胞に匹敵するレベルまで回復させた（図３７Ａ～図３７Ｃ）。したがって、ＨＬＡ－Ａ＊０２（＋）ドナーにおける機能特性を有するシス結合産生ＭＳＬＮ Ｔｍｏｄ細胞のＣＲＩＳＰＲ媒介による抑止は、ＨＬＡ－Ａ＊０２（－）ドナーにおける機能と区別できなかった。これらの結果は、ＭＳＬＮ ＣＡＲ３ Ｔｍｏｄ構築物が、患者のＴ細胞におけるＡ＊０２の発現を低下させるための方法を用いるならば、同種異系細胞療法及び自己生成物に好適であり得ることを示唆する。
ＭＳＬＮ ＣＡＲ３は、ＨＬＡ－Ａ＊１１指向性遮断因子と対合され得る
Ａ＊０２指向性遮断因子を利用するＭＳＬＮ ＣＡＲ３ Ｔｍｏｄ構築物の優れた性能は、ＣＡＲ３が、他のＨＬＡクラスＩ対立遺伝子によってゲーティングされる遮断因子と対合され得る可能性を示唆した。これが真実であれば、Ｔｍｏｄプラットフォームを使用して、ＨＬＡ－Ａ＊０２に対してヘテロ接合型ではない患者を治療することが可能になる可能性があり、その数は、集団の６０％を超えると推定される［２０］。ＭＳＬＮ Ｔｍｏｄ系のモジュール性の概念実証のために、アジア人の集団で最も一般的なクラスＩ対立遺伝子であるＨＬＡ－Ａ＊１１を研究した［２０］。Ａ＊１１選択的ｓｃＦｖのスクリーニングを、ＭＳＬＮ ｓｃＦｖの単離について記載したものと同じ方法を使用して実施した（以下の方法を参照されたい）。哺乳動物ｓｃＦｖディスプレイライブラリーを使用する一連の濃縮ステップは、いくつかのＡ＊１１特異的ｓｃＦｖを生成した（図３８Ａ）。
１つの高性能ｓｃＦｖ（Ａ＊１１－ＬＢＤ４）をＬＩＲ－１に融合させ、Ｊｕｒｋａｔ細胞においてＭＳＬＮ ＣＡＲ３活性化因子と対合させた。このＡ＊１１遮断因子は、ｍＲＮＡ滴定実験から約３７，０００個の分子／細胞と推定されるＩＣ５０で良好な機能を示した（図３８Ｂ）。最後に、Ａ＊１１遮断因子と対合したＭＳＬＮ ＣＡＲ３は、ＨＬＡ－Ａ＊０２を遮断因子抗原として利用するＭＳＬＮ ＣＡＲ３ Ｔｍｏｄ構築物と同等の効力及び遮断を伴うＪｕｒｋａｔ細胞及び初代Ｔ細胞において良好に機能することが確認された（図３９Ａ～図３９Ｃ）。これらの結果に促されて、本発明者らは、Ａ＊０３及びＢ＊０７を標的とする他の２つの抗ＨＬＡ－Ｉモノクローナル抗体をｓｃＦｖに変換し、それらをＭＳＬＮ Ｔｍｏｄ遮断因子として試験した（図３９Ａ）。これらの知見は、Ｔｍｏｄ系が、１つの活性化因子と複数の遮断因子との対合に対応するのに十分にモジュール化され、それによって、細胞療法プラットフォームの利用可能性をより多くの患者に拡張することを示唆する。
考察
成体内のＭＳＬＮの分布を考慮すると［１、２、４］、遮断因子がＭＳＬＮ標的化活性化因子で十分に機能することが重要である。ここで説明するＡ＊０２遮断因子の特性は、それが、広範囲のＭＳＬＮ抗原レベルにわたってＣＡＲから生じる活性化シグナルを阻害することを示唆している。また、遮断因子は、オフターゲットを含む、ＣＡＲによって誘発されるＴ細胞活性化の他の供給源を阻害する可能性が高い。ＨＬＡ遮断因子抗原は、有核細胞内で遍在的に発現されるため、ＬＯＨのために選択された腫瘍のように遮断因子抗原が存在しない場合を除く、全ての状況下で抑制シグナルを提供するはずである。遮断因子はまた、刺激が正常な細胞又は細胞断片に関与する場合、Ｔ細胞療法について観察される毒性の継続的な供給源である、サイトカイン放出症候群を予防することができる［１４、３３］。
本明細書に記載のＭＳＬＮ治療候補は、遮断因子抗原対立遺伝子に対して生殖細胞系ヘテロ接合型であり、その腫瘍がＬＯＨを介してこの対立遺伝子を喪失した患者の選択を必要とする。幸いなことに、ＤＮＡ配列決定技術の強大な力を利用するこのような診断試験が最近開発されている［２７～２９］。ＤＮＡ配列に基づくＬＯＨ検出は、腫瘍内のクローン性ＬＯＨとサブクローン性ＬＯＨのほとんどの症例を区別するのに十分な感受性を有し、それによって、治療の恩恵を受ける可能性が最も高い患者を豊かにする。この診断法は、腫瘍からのゲノム配列を利用するため、対立遺伝子変異を検出し、ＨＬＡ－Ａ＊０２に限定されない。本明細書に記載のリードＭＳＬＮ Ｔｍｏｄ構築物は、ＨＬＡ－Ａ＊０２（＋）患者のサブセットに適用可能である。Ｔｍｏｄプラットフォームを他の患者に拡張することを目的として、本発明者らは、ＭＳＬＮ ＣＡＲ３活性化因子が、ＨＬＡ－Ａ＊１１を含む他の３つのＨＬＡ－Ｉ対立遺伝子産物を対象とする遮断因子と対合することができることを示した。Ａ＊１１は、ほとんどのアジア人の集団において最も頻繁に発生するＨＬＡ－Ｉ対立遺伝子であり、米国以外の世界の一部で利益を得るための重要な機会を表している。実際に、世界で最も一般的なＨＬＡ－Ｉ対立遺伝子の６～８を対象とした遮断因子のコレクションでは、ＨＬＡ遺伝子座にＬＯＨを有する固形腫瘍の大部分をカバーすることが可能であるはずであり、現在のところ固形腫瘍死亡率の１５％を超えると推定される［２２、３０］。加えて、本発明者らは、ＨＬＡ－Ａ＊０２遮断因子が、別の周知の腫瘍関連抗原であるＣＥＡを対象とするＣＡＲを含む他の活性化因子と効果的に対合することができるという研究を並行して示した（Ｓａｎｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ；３１）。
モジュラーＴｍｏｄ系は、治療法の中で特有である、細胞の能力を利用して、複数のシグナルを調整された応答に統合し、したがって固形腫瘍療法の基本的な障害に対処する手段を提供する［１８、２１、２２］。治療法は、腫瘍にアクセスし、細胞療法が有効であることが証明されている血液がんのために存在しない障壁を克服しなければならない［２３］。Ｔ細胞は、抗体を含む他のほとんどの治療法よりも、能動的な血管外漏出及び生体内分布のための自然な機構を有するという点で利点がある（概説について、Ｍａｓｔｒｏｇｉｏｖａｎｎｉ ｅｔ ａｌ．［２４］を参照されたい）。更に、ＬＯＨを利用する本明細書に記載のＴｍｏｄアプローチは、ほとんどの標的の正常な組織発現によってもたらされる固形腫瘍治療に対する重要な制約を緩和する。悪名高い非均質性にも関わらず、遺伝子変化の大部分は新生物の創始細胞において生じ、その全ての子孫に存在する［２５］。このような均質な変異には、ＬＯＨが含まれ、そのようなクローン性ＬＯＨが、腫瘍内に存在する後の変化からの診断試験によって区別することができる場合、ＨＬＡ遺伝子座におけるＬＯＨの不均一性は、耐性源を構成するはずはない［２６］。ほとんどのネオ抗原を生成する単一ヌクレオチド置換とは異なり、ＬＯＨは不可逆的な事象であり、治療によって強い選択圧が加えられた後でも安定であるはずである。最後に、チェックポイント阻害剤の使用がより一般的になるにつれて、ＨＬＡ－Ｉ喪失率は上昇し、ＭＳＬＮ Ｔｍｏｄ治療の恩恵を受け得る患者のプールが更に拡大する可能性が高くなるであろう［３４］。
材料及び方法
細胞株培養
細胞株は、ＡＴＣＣ（アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ））から購入し、製造業者の指示に従って取り扱った：Ｔ２、Ｓｈｐ７７、Ｒａｊｉ、ＭＳ７５１、Ａ－３７５、Ａ－４９８、ＳＷ９８２、ＳＷ４８０、ＨｅＬａ、ＮＩＨ－ＯＶＣＡＲ－３、ＨｅｐＧ２、ＮＣＩ－Ｈ５０８、ＬＮＣａＰクローンＦＧＣ、Ｋ５６２、Ｕ２ＯＳ、ＢＢ７．１、及びＧＡＰ Ａ３ハイブリドーマ。ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするＪｕｒｋａｔ細胞を、ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手し、１０％の熱失活（ＨＩＡ）ＦＢＳ（５６℃で１時間失活）、１％のペニシリン及びストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）、並びに０．４ｍｇ／ｍｌのジェネテシンを補充したＲＰＭＩ中に維持した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手し、５％のＨＩＡヒトＡＢ血清を補充したＸ－ＶＩＶＯ １５（Ｌｏｎｚａ）中で解凍し、製造業者によって推奨されるように、Ｔ細胞ＴｒａｎｓＡｃｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で活性化した。ＣＡＲ又はＣＡＲ Ｔｍｏｄ単一ベクター構築物のレンチウイルス形質導入（別段の記載がない限り、図１ｂを参照されたい）を、活性化後２４時間に行って、培養物を、１％のＨＩＡヒトＡＢ血清及び３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を補充したＬｙｍｐｈｏＯＮＥ Ｔ細胞拡大培地（ＴａｋａｒａＢｉｏ）中に維持した。
分子クローニング及びｍＲＮＡのインビトロ転写
活性化及び遮断ＣＡＲ構築物を、前述のように設計及び構築した９。簡潔に述べると、活性化ＣＡＲは、抗ＭＳＬＮ ｓｃＦｖ ＬＢＤを、ＣＤ８αヒンジ、ＣＤ２８膜貫通（ＴＭ）、並びにＣＤ２８、４－１ＢＢ、及びＣＤ３ζ細胞内ドメイン（ＩＣＤ）に融合させることによって作られた。遮断ＣＡＲは、モノクローナル抗体ＰＡ２．１［３２］、ＧＡＰ Ａ３［３６］、又はＢＢ７．１［３７］にそれぞれ由来する抗ＨＬＡ－Ａ＊０２、Ａ＊０３、又はＢ＊０７ ｓｃＦｖ ＬＢＤを、ＬＩＲ－１のヒンジ、ＴＭ、及びＩＣＤドメインに融合させることによって生成した。Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅクローニングを使用して遺伝子セグメントを合わせ、レンチウイルス発現ベクターにおいてヒトＥＦ１αプロモーターの下流に挿入した。
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）調製のために、ＰＣＲを使用して、インビトロ合成ｍＲＮＡに使用されるＤＮＡ鋳型を生成した。簡潔に述べると、Ｔ７プロモーターを、Ｎ末端プライマーを介して導入し、一般的なオーバーハング領域を、Ｎ末端プライマー及びＣ末端プライマーの両方に使用した。ＰＣＲ生成物を、Ｔ７ ＡＲＣＡ ｍＲＮＡキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｅ２０６０Ｓ）を使用して、インビトロ転写（ＩＶＴ）のための鋳型として使用した。ＩＶＴ反応は、１×ＡＲＣＡ／ＮＴＰ混合物、１．２５ｍＭのΨ－ＵＴＰ（ＴｒｉＬｉｎｋ）、２５ｕｇのＰＣＲ生成物鋳型、及び１×Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを含んだ。ＩＶＴ反応物を３７℃で２時間インキュベートし、次いで２ｕＬのＤＮａｓｅ Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３０３Ｓ）を各反応物に添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。ＩＶＴ反応物に、６５ｕＬの水、１０ｕＬの１０×ポリアデニル化反応緩衝液（ＮＥＢ Ｍ０２７６Ｓ）及び５ｕＬのポリアデニル化酵素（ＮＥＢ Ｍ０２７６Ｓ）を、約１００ｕＬの総体積に添加した。反応物を３７℃で３０分間インキュベートした。製造業者のプロトコルに従って、Ｍｏｎａｒｃｈ ＲＮＡクリーンアップキット（Ｔ２０４０Ｌ）を使用して、得られた生成物を洗浄した。
哺乳動物ディスプレイを使用したＭＳＬＮ及びＨＬＡ－Ａ＊１１結合剤の生成
ＨｕＴＡＲＧ哺乳動物ディスプレイ技術を使用した結合剤生成は、以前に記載されている（特許第ＵＳ ８，０１２，７１４Ｂ２号、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．、近刊）。ＭＳＬＮ結合剤生成のために、可溶性ＭＳＬＮ（カタログ番号ＭＳＮ－Ｈ８２Ｅ９）並びに無関係のオフターゲットタンパク質、ＥＧＦＲ及びＣＥＡを、Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。ＨｕＴＡＲＧライブラリーを、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を使用して、オンターゲット濃縮及びオフターゲット枯渇の連続ラウンドに供した。ＨＬＡ－Ａ＊１１結合剤生成キャンペーンを同様に実施した。ＨｕＴＡＲＧライブラリーを、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１四量体を使用してオンターゲット濃縮に供し、４つの無関係のＨＬＡクラスＩ四量体のプールを使用してオフターゲット枯渇に供した。両方のキャンペーンの最終ラウンドにおいて、オンターゲット及びオフターゲット結合細胞を収集し、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する断片を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して増幅させ、次世代配列決定（ＮＧＳ）によって配列決定した。目的の結合剤を、入力及び出力ＮＧＳカウントを比較することによって選択した。
ＭＳＬＮ表面定量化
表面メソテリン分子を定量化するために、接着細胞を最初にＤＰＢＳで一度洗浄し、次にＶｅｒｓｅｎｅで一度洗浄した。細胞をＶｅｒｓｅｎｅでコーティングし、約１５分間３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、フラスコを激しくタップして完全な解離を促進した。次いで、細胞を、１：２の比（Ｖｅｒｓｅｎｅ：ＤＰＢＳ）でＤＢＰＳで希釈し、カウントした。３００，０００個の細胞を、５００×ｇで５分間遠心分離した。細胞を、３００ｕＬの１×ＦＡＣＳ緩衝液（ＤＰＢＳ＋１％のＢＳＡ）中に再懸濁した。１００ｕＬのアリコートを、２つのｖ底ウェルに分けた。細胞を、１００ｕＬのＦＡＣＳ緩衝液で更に１回洗浄した、次いで、１０ｕｇ／ｍＬで１００ｕＬの抗ＭＳＬＮ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、クローン６１８９２３）で３０分間氷上で染色した。一次染色の後、洗浄のためにＱＩＦＩＫＩＴ（Ａｇｉｌｅｎｔ）からの５０ｕＬの較正ビーズを添加した。混合物を、１００ｕＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、次いで、氷上でＦＡＣＳ緩衝液中で２０００倍希釈した１００ｕＬの抗マウスＦ（ａｂ’）２－ヤギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）抗体で４５分間染色した。染色した細胞及びビーズを、１００ｕＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、次いで、１００ｕＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁して蛍光を測定した。各ビーズ集団の蛍光強度中央値対分子数をプロットする較正曲線を、ＱＩＦＩＫＩＴ（Ａｇｉｌｅｎｔ）によって提供される製造業者のプロトコルに従ってプロットした。内因性ＭＳＬＮ分子の数を、細胞の蛍光強度中央値を、ＱＩＦＩＫＩＴビーズで生成された較正曲線に適合させることによって決定した。
ＭＳＬＮ活性化因子及び様々な遮断因子感受性の決定
活性化因子又は遮断因子感受性を決定するために、抗原を様々な濃度で抗原（－）細胞株に滴定した。次いで、標準曲線を使用したフローサイトメトリー及びＱＩＦＩＫＩＴ方法論［１７］を使用して、絶対分子／細胞を計算することができた。次いで、Ｊｕｒｋａｔ細胞内で発現された活性化因子又は遮断因子のＥＣ５０又はＩＣ５０値を、それぞれ、発光によって測定した。具体的には、抗原ｍＲＮＡを用いたＨＥＫ２９３Ｔ又はＨｅＬａ細胞トランスフェクションを、４Ｄヌクレオフェクションキット（Ｌｏｎｚａ）を使用して行った。単一抗原滴定（すなわち、ＭＳＬＮ、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ｂ＊０７）について、ｍＲＮＡを、それぞれ、ＨＥＫ２９３Ｔ又はＨｅＬａ細胞について補足溶液（完全緩衝液）を補充したＳＥ又はＳＦ緩衝液中で１０００ｎｇ／ｕＬに希釈した。希釈したｍＲＮＡを、ストックｍＲＮＡを等体積の完全緩衝液に１３回添加することによって連続的に２倍希釈し、１５番目のウェルは追加されたｍＲＮＡを全て欠いていた。ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｇｉｂｃｏ）を使用して、標的細胞をフラスコから解離した。適切な数の細胞を採取し、次いで、１１．１ｅ６の生存細胞／ｍＬで完全緩衝液中に再懸濁した。２２．５ｕＬの再懸濁した細胞を、２．５ｕＬの連続希釈したｍＲＮＡに、２５ｕＬの細胞及びｍＲＮＡ混合物の最終体積で添加した。この試料の２０ｕＬを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞についてＣＭ－１３０プログラム又はＨｅＬａ細胞についてＣＮ－１１４プログラムを使用した、４Ｄヌクレオフェクター（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ）を使用してザップした（ｚａｐｐｅｄ）。細胞を、２８０ｕＬのＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ＋０．１％のＰ／Ｓ中に移した。１５ｕＬの希釈細胞を３８４ウェルプレートに移し、３７℃、５％ＣＯ２で１８～２４時間インキュベートした。残りの希釈細胞を、９６ウェルプレートに移し、上記のようにＱＩＦＩＫＩＴを使用して表面抗原発現の翌日分析のために保持した。並行して、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴルシフェラーゼエフェクター細胞を、以下のパラメータ：１５００Ｖ、１０ｍｓ、３パルスを使用して、ネオンエレクトロポレーションシステムを使用して、１ｅ６細胞当たり１ｕｇの適切なＣＡＲ ＤＮＡ、又は１ｅ６細胞当たり４ｕｇのＣＡＲ Ｔｍｏｄ ＤＮＡ（別段の記載がない限り、単一ベクター構築物）でトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、２０％熱不活性化（ＨＩＡ）ＦＢＳ及び０．１％のｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを補充した事前に加温したＲＰＭＩに直ちに移し、３７℃、５％ＣＯ２で１８～２４時間インキュベートした。次いで、Ｊｕｒｋａｔ細胞をカウントし、１ｍＬ当たり０．６７ｅ６細胞で、ＲＰＭＩ＋１０％のＨＩＡ ＦＢＳ及び０．１％のｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ中に再懸濁した。次いで、１５ｕＬ中の１ｅ４の再懸濁したＪｕｒｋａｔ細胞を、３８４ウェルプレート中のトランスフェクト細胞と６時間共培養した。ルシフェラーゼ活性は、ワンステップルシフェラーゼアッセイシステム（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して測定した。
ＭＳＬＮ及びＨＬＡ－Ａ＊０２を含む標的細胞同時トランスフェクションについては、ｍＲＮＡ希釈ステップの軽微な調整を除いて上記のプロトコルを使用した。ＨＬＡ－Ａ＊０２及びＭＳＬＮをコードするｍＲＮＡを、それぞれ、Ａｌｄｅｖｒｏｎ及びＴｒｉＬｉｎｋによって調製した。簡潔に述べると、ＥＣ５０曲線を生成するために、ＭＳＬＮ ｍＲＮＡを用いて１４点の２倍連続希釈を行った。この連続希釈を、様々な一定量のＡ＊０２ ｍＲＮＡの４つの希釈液の各々と組み合わせて、ＭＳＬＮ ｍＲＮＡの最上位濃度が５００ｎｇ／ｕｌであり、Ａ＊０２ ｍＲＮＡ濃度が以下の通りになるようにした：５００ｎｇ／ｕＬ、２５ｎｇ／ｕｌ、１．２５ｎｇ／ｕＬ、及び０ｎｇ／ｕＬ。ＩＣ５０曲線を生成するために、Ａ＊０２ ｍＲＮＡを用いて１４点の２倍連続希釈を行った。この連続希釈を、様々な一定量のＭＳＬＮ ｍＲＮＡの４つの希釈液の各々と組み合わせて、Ａ＊０２ ｍＲＮＡの最上位濃度が５００ｎｇ／ｕＬであり、ＭＳＬＮ ｍＲＮＡ濃度が以下の通りになるようにした：１２５ｎｇ／ｕＬ、２５ｎｇ／ｕｌ、５ｎｇ／ｕＬ、及び１ｎｇ／ｕＬ。
初代Ｔ細胞のインビトロ細胞傷害性アッセイ
Ｇｅｎ２ Ｍ５ ＣＡＲ、ＭＳＬＮ ＣＡＲ３又はＣＡＲ３ Ｔｍｏｄ単一ベクター構築物で形質導入した初代Ｔ細胞による、ＭＳＬＮ（＋）Ａ＊０２（－）ＲＦＰ（＋）腫瘍又はＭＳＬＮ（＋）Ａ＊０２（＋）ＧＦＰ（＋）正常標的細胞の死滅を、前述のように評価した［９］。簡潔に述べると、２，０００個の標的細胞を、黒色の透明底３８４ウェルプレート中のウェル当たり２５ｕＬの完全なＬｙｍｐｈｏＯｎｅ培地（１％のＨＩＡヒトＡＢ血清を含有する）中に入れ、５％ＣＯ２で３７℃で一晩接着させた。混合培養アッセイについて、標的細胞を、播種前に所望の比で予混合した。標的細胞プレーティングの約１６～１８時間後、Ｔ細胞をカウントし、３００×ｇで１０分間沈降させ、有効なエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）＝１：１（又は所望のＥ：Ｔに応じて多かれ少なかれ濃縮した）のために、２５ｕＬの完全なＬｙｍｐｈｏＯｎｅ培地中（追加のサイトカインの不在下）の２，０００個のＣＡＲ（＋）又はＴｍｏｄ（＋）Ｔ細胞で再懸濁し、標的細胞の上に穏やかにプレーティングした。ｓＭＳＬＮを含む実験のために、標的細胞でプレーティングした際に、Ｔ細胞を、５００ｎｇ／ｍＬの最終濃度のために、１０００ｎｇ／ｍＬ（２×）の可溶性の単量体ＭＳＬＮ（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を含有するＬｙｍｐｈｏＯｎｅ培地中に再懸濁した。各試料を３連のウェルで試験した。共培養の３０分以内に、プレートを、Ｉｎｃｕｃｙｔｅイメージャーを使用してＧＦＰ（＋）又はＲＦＰ（＋）標的細胞発現のために画像化し、その後、最大で４８時間、２～４時間ごとに連続画像を得た。標的細胞面積（すなわち、画像当たりのＧＦＰ（＋）又はＲＦＰ（＋）総面積）の定量化を、Ｉｎｃｕｃｙｔｅイメージングソフトウェアを使用して行った。ウェル当たり、時間＝０の面積に正規化することにより、プレーティングの変動性を考慮した。次いで、死滅を、ＣＡＲ又はＴｍｏｄ Ｔ細胞ウェルと、対応する非形質導入Ｔ細胞ウェルとの間の面積の差として定量化し、非形質導入Ｔ細胞ウェルに正規化した（死滅％＝（Ａ非形質導入－ＡＣＡＲ又はＴｍｏｄ）／Ａ非形質導入）。
初代Ｔ細胞におけるＨＬＡ－Ａ＊１１遮断因子評価のために、ＭＳＬＮ及びトランスジェニックＨＬＡ－Ａ＊１１抗原の天然レベルを発現するＨｅＬａ標的細胞を使用して、上記のように細胞傷害性アッセイを行った。
４８時間共培養後のサイトカイン分泌及び相対Ｔ細胞活性化を更に評価するために、各ウェルのＴ細胞を含有する培地を混合し、ｖ底プレートに移し、４００×ｇで５分間沈降させた。上清を回収し、製造業者の指示に従って、ＢＤヒトＩＦＮ－γフレックスキットを使用して、分泌されたＩＦＮ－γを更に分析するまで凍結させた。次いで、残りのＴ細胞を、ヒトＣＤ３のために染色し、洗浄し、フローサイトメトリーによって前方及び側方の散乱を特徴付けた［３５］。
反復抗原チャレンジアッセイ（ＲＡＣＡ）及び可逆性アッセイ
ＲＡＣＡ及び可逆性アッセイを、いくつかの修正を加えて、以前に記載されているように行った（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．、近刊［１８］）。簡潔に述べると、ＣＡＲ又はＴｍｏｄ形質導入初代Ｔ細胞を、有効なＥ：Ｔ＝１．２：１で上述したものと同様に、ＭＳＬＮ（＋）Ａ＊０２（－）ＲＦＰ（＋）腫瘍又はＭＳＬＮ（＋）Ａ＊０２（＋）ＧＦＰ（＋）正常標的細胞と共培養した。ラウンド１の画像を、３８４ウェルプレートフォーマットで４８時間にわたって撮影した。２５０，０００個の標的細胞及び３００，０００個のＣＡＲ３（＋）又はＣＡＲ３ Ｔｍｏｄ（＋）Ｔ細胞を含む並行な６ウェルプレートもまた、バルクＴ細胞単離及びラウンド間の移動を可能にするように設定した。４８時間後、Ｔ細胞を含有する培地を穏やかに混合し、円錐管に移した。生きた標的細胞と関与した残りのＴ細胞を、ＰＢＳ中の１０ｍＭのＥＤＴＡ＋０．５％のＢＳＡで単回の１分間のすすぎによって更に解離し、バルクＴ細胞画分と合わせた。次いで、これらの細胞（標的細胞残屑及び上昇した標的細胞とともに）を沈降させ、洗浄し、抗ＭＳＬＮ、抗ＥＧＦＲ、及び抗Ｎ－カドヘリンＰＥコンジュゲート抗体のカクテルで染色して、望ましくない標的細胞を染色した。次いで、これらの標的細胞を、抗ＰＥ ＭＡＣＳビーズにコンジュゲートさせ、続いてＬＳカラムを通して枯渇させ、清浄なＴ細胞画分を得た。次いで、Ｔ細胞をカウントし、ラウンド２の間（ラウンド１と同様に）、新鮮な腫瘍又は正常な標的細胞上に再播種した。次いで、ラウンド１で行ったように、イメージング及び定量化を正確に進めた。
ＭＳＬＮノックアウト細胞株生成
内因性ＭＳＬＮ（＋）細胞株についてのＭＳＬＮ（－）細胞株対照を開発するために、全長ＭＳＬＮを標的とするＣＲＩＳＰＲ戦略を利用した。メソテリンの異なるエクソンを標的とする２つのＡｌｔ－Ｒ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｓｇＲＮＡを、ｓｇＲＮＡ＿１標的化エクソン２、及びｓｇＲＮＡ＿２標的化エクソン１６で、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から得た。ｓｇＲＮＡを、ヌクレアーゼを含まない水中で再水和し、Ａｌｔ－Ｒ（登録商標）Ｓ．ｐ．ＨｉＦｉ Ｃａｓ９ヌクレアーゼＶ３（ＩＤＴ）と合わせて、９：１のｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９のモル比を得た。両方のＲＮＰ溶液を、室温で１０～２０分間別々にインキュベートして、ガイドの各々を、独立してＣａｓ９と複合体化させた。続いて、両方のガイドのＲＮＰ複合体を合わせ、製造業者の指示に従って所望の細胞に添加し、エレクトロポレーションした。ＣＲＩＳＰＲ後、細胞をスケールアップし、ＭＳＬＮ（－）集団（Ｒ＆Ｄ、抗ＭＳＬＮ ｐＡｂ又はクローン＃６１８９２３）上で選別した。次いで、バルク選別されたＭＳＬＮ（－）細胞を、Ｊｕｒｋａｔ細胞ベースのアッセイにおいて、ＭＳＬＮ結合剤に対してスクリーニングした。
Ｊｕｒｋａｔ細胞を使用した選択性スクリーニング
ＭＳＬＮ ＣＡＲ３ Ｔｍｏｄ細胞のオフターゲット反応性を探索するために、Ｊｕｒｋａｔ細胞活性化を、他の場所に記載されているものと同様に成人遺伝子発現の大部分を包含するように選択された標的細胞株の多様なパネルに対して試験した（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）。陽性対照を使用して、エフェクター細胞が、ＭＳＬＮ（＋）細胞株によって活性化され得ることを確認し、陰性対照を応答のベースラインに設定した（細胞株の特徴付けについては図２６Ｂ及び図２８Ａを参照されたい）。簡潔に述べると、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ルシフェラーゼ細胞を、一過性にトランスフェクトして、上記のように正確にＣＡＲ又はＣＡＲ３ Ｔｍｏｄのいずれかを発現させた。並行して、内因性ＭＳＬＮ（＋）標的細胞を、上記のＣＲＩＳＰＲを使用して生成されたそれぞれのＭＳＬＮ（－）対照標的細胞とともに、ウェル当たり１５ｕＬの完全なＲＰＭＩ（１０％のＦＢＳ及び１％のＰ／Ｓを含有する）中の１ｅ４標的細胞に３８４ウェルプレートフォーマットでプレーティングした。トランスフェクションのおよそ１８時間後、１ｅ４のＪｕｒｋａｔ細胞を各標的細胞と共培養し、６時間後に発光によりＧｅｎ２ Ｍ５ ＣＡＲと比較した活性を評価した。ルシフェラーゼ活性を、ワンステップルシフェラーゼアッセイシステム（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して測定した。
マウス異種移植片研究
盲検インビボ実験は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によって承認されたプロトコルの下でＥｘｐｌｏｒａ ＢｉｏＬａｂｓによって実施された。５～６週齢の雌のＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ Ｔｇ（ＨＬＡ－Ａ／Ｈ２－Ｄ／Ｂ２Ｍ）１Ｄｖｓ／ＳｚＪ（ＮＳＧ－ＨＬＡ－Ａ２／ＨＨＤ）マウスを、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓから購入した。研究開始前に、動物を住居環境に順応させた。各コホートのマウスの半数において、１００ｕＬ中でマトリゲルと１：１で混合した、５ｅ６のＭＳ７５１ホタルルシフェラーゼ（＋）ＨＬＡ－Ａ ＫＯ腫瘍又はウミシイタケルシフェラーゼ（＋）Ａ＊０２トランスジェニック正常細胞を、それぞれ、動物（１０／コホート）の右脇腹及び左脇腹に皮下移植し、残りの半数において逆にして、脇腹の増殖の変動を制御した。腫瘍が、各々１００～１５０ｍｍ３の平均（Ｖ＝Ｌ×Ｗ×Ｗ／２）に達したとき、動物を５つの群（ｎ＝１０）にランダム化し、２ｅ７のＴ細胞、又は生理食塩水対照を、尾静脈を介して投与した。注射前、Ｔ細胞は、約６０％のＣＡＲ（＋）又はＴｍｏｄ（＋）であった。Ｔ細胞注射後、研究期間中、キャリパーによる移植片測定を週に３回、ＢＬＩを週に１回実施した。各ＢＬＩ期間において、ＲｅｄｉＪｅｃｔ Ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ ｈ基質（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を最初に注射して、ウミシイタケルシフェラーゼ（＋）正常細胞を可視化し、その後、６時間後にＸｅｎｏＬｉｇｈｔ Ｄ－ルシフェリンカリウム塩（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を注射して、逆脇腹上のホタルルシフェラーゼ（＋）腫瘍細胞を可視化した。
初代Ｔ細胞におけるＢ２ＭのＣＲＩＳＰＲノックアウト
凍結ＰＢＭＣを解凍し、上記のように活性化した。形質導入を、ＭＯＩ １０でレンチウイルス（Ａｌｓｔｅｍ）を使用して、活性化の２４時間後に行った。形質導入の２４時間後に、初代Ｔ細胞を、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡ複合体でトランスフェクトした。簡潔に述べると、細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄した後、補充されたＰ３ヌクレオフェクション緩衝液（Ｌｏｎｚａ）中に再懸濁した。２０ｐｍｏｌのＣａｓ９（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）を、１３０ｐｍｏｌのＢ２Ｍ標的化ｓｇＲＮＡ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）と合わせ、Ｐ３ヌクレオフェクション緩衝液中でインキュベートした後、細胞に添加した。２０ｕＬの細胞及びリボ核タンパク質（ＲＮＰ）混合物を、１６ウェルのＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅ Ｓｔｒｉｐに移し、刺激Ｔ細胞プログラム（ＥＯ－１１５）を使用して４Ｄヌクレオフェクターでエレクトロポレーションした。細胞を、５％のＨＩＡヒトＡＢ血清及び３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を補充した１００ｕＬの事前に加温した培地である、Ｘ－ＶＩＶＯ １５（Ｌｏｎｚａ）中で回収した。ＰＢＭＣを、１％のＨＩＡヒトＡＢ血清及び３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を補充したＬｙｍｐｈｏＯＮＥ Ｔ細胞拡大培地（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）中で６日間培養及び拡大した。拡大後、陽性形質導入初代Ｔ細胞を、ＬＳカラムを使用して、プロテインＬ－ビオチン：ストレプトアビジン－ＰＥに対して、製造業者の指示に従って、抗ＰＥマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して濃縮した。次いで、Ｂ２Ｍ ＫＯ初代Ｔ細胞の細胞傷害性を、上記のように正確に評価した。
統計分析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して統計分析を行った。全てのＪｕｒｋａｔ細胞ベースのインビトロ研究（ｍＲＮＡ滴定実験を含む）は、技術的複製の平均±標準偏差（ＳＤ）として示され、一方、初代Ｔ細胞ベースのインビトロ研究は、技術的三重複製の平均±ＳＤとして示される。該当する場合、技術的複製は、個々のデータ点として示され、バーは平均を示す。全てのデータは、別段の記載がない限り、ｎ＝２の実験反復の最小値を表す。インビボ研究についてのデータは、平均±標準誤差（ＳＥＭ）として示される。ｍＲＮＡ滴定研究では、４パラメータの非線形回帰分析を使用して曲線を適合させた。ＥＣ５０及びＩＣ５０値は、曲線から直接計算した。直接比較は、別段の記載がない限り、対応のないパラメトリックｔ検定を使用して分析した。

参考文献
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１０ Ｄｉｎｇ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ａｂｓｔｒａｃｔ ２３０７：Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＣ－２１０，ａ ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＣＲ）ｆｕｓｉｏｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ（ＴＲｕＣ（商標））Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７９，２３０７－２３０７，ｄｏｉ：１０．１１５８／１５３８－７４４５．Ａｍ２０１９－２３０７（２０１９）．
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１５ Ｊａｍｅｓ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＴＣＲ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｐｒｅｄｉｃｔｓ ｔｈｅ ｍａｇｎｉｔｕｄｅ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ ｂｙ ＴＣＲ ｄｏｗｎｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８４，４２８４－４２９４，ｄｏｉ：１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．０９０３７０１（２０１０）．
１６ Ｘｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ａｃｕｔｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ａｎｔｉｇｅｎ．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２６，５６－６４，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｉｍｍ．２０２０．０７．０２０（２０２０）．
１７ Ｓｍｉｔｈ，Ｋ．Ｂ．＆ Ｅｌｌｉｓ，Ｓ．Ａ．Ｓｔａｎｄａｒｄｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｂｙ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２２８，２９－３６，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｓ００２２－１７５９（９９）０００８７－３（１９９９）．
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２５ Ｌｏｐｅｚ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｒｐｌａｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｗｈｏｌｅ－ｇｅｎｏｍｅ ｄｏｕｂｌｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｌｅｔｅｒｉｏｕｓ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ５２，２８３－２９３，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８８－０２０－０５８４－７（２０２０）．
２６ Ｆｏｏ，Ｊ．＆ Ｍｉｃｈｏｒ，Ｆ．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ａｎｔｉ－ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ Ｔｈｅｏｒ Ｂｉｏｌ ３５５，１０－２０，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｔｂｉ．２０１４．０２．０２５（２０１４）．
２７ Ｂｅａｕｂｉｅｒ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｅｍｐｕｓ ｘＴ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｏｎｃｏｌｏｇｙ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｓｓａｙ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ １０，２３８４－２３９６，ｄｏｉ：１０．１８６３２／ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２６７９７（２０１９）．
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２９ Ｆｏｒｄ，Ｌ．，Ｗｏｌｆｏｒｄ，Ｊ．Ｅ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｓ．Ｍ．＆ Ｒａｎｄａｌｌ，Ｌ．Ｍ．Ａ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｎ ｔｈｅ ＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＦｏｃｕｓ ＣＤｘＢＲＣＡ ｔｅｓｔｓ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ ２０，２８５－２９２，ｄｏｉ：１０．１０８０／１４７３７１５９．２０２０．１７０１４３８（２０２０）．
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３４．Ｍｏｎｔｅｓｉｏｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｓｏｍａｔｉｃ ＨＬＡ Ｃｌａｓｓ Ｉ Ｌｏｓｓ Ｉｓ ａ Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｅ Ｅｖａｓｉｏｎ Ｗｈｉｃｈ Ｒｅｆｉｎｅｓ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｕｒｄｅｎ ａｓ ａ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｏｆ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ １１，２８２－２９２（２０２１）．
３５．Ｂｏｈｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｆｏｒｗａｒｄ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒ ｉｓ ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅａｓｕｒｅ ｏｆ Ｔ－ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｂｕｔ ｉｓ ｎｏｔ ｕｎｉｖｅｒｓａｌｌｙ ｓｕｉｔｅｄ ｆｏｒ ｄｏｕｂｌｅｔ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ７９Ａ（８）：６４６－６５２（２０１１）．
３６．Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ＨＬＡ－Ａ３．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １（２）：８７－９０（１９８２）．
３７．Ｂｒｏｄｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ＨＬＡ ｓｙｓｔｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．４７：３－６１（１９７９）．

Claims (99)

  1. 免疫細胞であって、
    ａ．メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む、第１の受容体と、
    ｂ．ＭＳＬＮ＋がん細胞において喪失した非標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む、第２の受容体と、を含み、
    前記第１の受容体が、ＭＳＬＮに応答する活性化因子受容体であり、前記第２の受容体が、前記非標的抗原に応答する抑制性受容体である、免疫細胞。
  2. 前記非標的抗原が、ヘテロ接合性の喪失によって前記ＭＳＬＮ＋がん細胞において喪失している、請求項１に記載の免疫細胞。
  3. 前記第２の受容体の前記細胞外リガンド結合ドメインが、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質の対立遺伝子バリアントに特異的に結合する、請求項１又は２に記載の免疫細胞。
  4. 前記第２の受容体の前記細胞外リガンド結合ドメインが、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、又はＨＬＡ－Ｃタンパク質の対立遺伝子バリアントに特異的に結合する、請求項１～３のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  5. 前記第２の受容体の前記細胞外リガンド結合ドメインが、ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、又はＨＬＡ－Ｃ＊０７に特異的に結合する、請求項１～４のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  6. 前記第２の受容体の前記細胞外リガンド結合ドメインが、ＨＬＡ－Ａ＊０２に特異的に結合する、請求項５に記載の免疫細胞。
  7. 前記第２の受容体の前記細胞外リガンド結合ドメインが、表６に開示されるような相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、又は表６若しくは表７の前記ＣＤＲと比較して、最大で１、２、若しくは３個の置換、欠失、若しくは挿入を有するＣＤＲ配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  8. 前記第２の受容体の前記細胞外リガンド結合ドメインが、配列番号４２～４７若しくは配列番号４８～５３の相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、又は配列番号４２～４７若しくは配列番号４８～５３の前記ＣＤＲと比較して、最大で１、２、若しくは３個の置換、欠失、若しくは挿入を有するＣＤＲ配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  9. 前記第２の受容体の前記細胞外リガンド結合ドメインが、表５に開示されるポリペプチド配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列から選択されるポリペプチド配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  10. 前記第２の受容体の前記細胞外リガンド結合ドメインが、配列番号３０～４１のうちのいずれか１つ、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  11. 前記第１の受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  12. 前記第１の受容体の前記細胞外リガンド結合ドメインが、表２に開示されるような相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、又は表２の前記ＣＤＲと比較して、最大で１、２、若しくは３個の置換、欠失、若しくは挿入を有するＣＤＲ配列を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  13. 前記第１の受容体の前記細胞外リガンド結合ドメインが、表３に記載の配列を含む重鎖可変（ＶＨ）部分、及び表４に記載の配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）部分、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  14. 前記第１の受容体の前記細胞外リガンド結合ドメインが、配列番号２３３を含む重鎖可変（ＶＨ）部分、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列、及び配列番号２７９を含む軽鎖可変（ＶＬ）部分、又はそれと８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  15. 前記第１の受容体の前記細胞外リガンド結合ドメインが、配列番号３～６、８０及び１５４～２１５からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  16. 前記第１の受容体の前記細胞外リガンド結合ドメインが、配列番号１７１のｓｃＦｖ配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  17. 前記第１の受容体が、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  18. 前記ヒンジドメインが、ＣＤ８αヒンジドメインを含む、請求項１７に記載の免疫細胞。
  19. 前記ＣＤ８αヒンジドメインが、配列番号７の配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１８に記載の免疫細胞。
  20. 前記膜貫通ドメインが、ＣＤ２８膜貫通ドメインを含む、請求項１１～１９のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  21. 前記ＣＤ２８膜貫通ドメインが、配列番号１１の配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項２０に記載の免疫細胞。
  22. 前記細胞内ドメインが、ＣＤ２８共刺激ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζ活性化ドメインを含む、請求項１１～２１のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  23. 前記細胞内ドメインが、配列番号２８５の配列、又はそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項２２に記載の免疫細胞。
  24. 前記第１の受容体が、配列番号３０３の配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  25. 前記第２の受容体が、ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン又はその機能的バリアントを含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  26. 前記ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメインが、配列番号７０と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一であるか、又はそれと同一である配列を含む、請求項２５に記載の免疫細胞。
  27. 前記第２の受容体が、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン又はその機能的バリアントを含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  28. 前記ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン又はその機能的バリアントが、配列番号７４と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一であるか、又はそれと同一である配列を含む、請求項２７に記載の免疫細胞。
  29. 前記第２の受容体が、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメイン又はその機能的バリアントを含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  30. 前記ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメインが、配列番号７３と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一であるか、又はそれと同一である配列を含む、請求項２９に記載の免疫細胞。
  31. 前記第２の受容体が、ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン、ＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメイン、ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメイン、それらのうちのいずれかの機能的バリアント、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  32. 前記ＬＩＬＲＢ１ヒンジドメイン、ＬＩＬＲＢ１細胞内ドメイン及びＬＩＬＲＢ１膜貫通ドメインが、配列番号７１、又は配列番号７１と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一であるか、若しくはそれと同一である配列を含む、請求項３１に記載の免疫細胞。
  33. 前記第２の受容体が、配列番号３４８の配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１～３２のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  34. 前記ＭＳＬＮ＋がん細胞が、中皮腫がん細胞、卵巣がん細胞、子宮頸がん細胞、結腸直腸がん細胞、食道がん細胞、頭頸部がん細胞、腎臓がん細胞、子宮がん細胞、胃がん細胞、膵臓がん細胞、肺がん細胞、結腸直腸がん細胞又は胆管がん細胞である、請求項１～３３のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  35. 前記ＭＳＬＮ＋がん細胞が、中皮腫がん細胞、卵巣がん細胞、子宮頸部細胞、子宮がん細胞、胃がん細胞、膵臓がん細胞又は肺腺がん細胞である、請求項３４に記載の免疫細胞。
  36. 前記ＭＳＬＮ＋がん細胞が、ＨＬＡ－Ａ＊０２を発現しないＭＳＬＮ＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２－がん細胞である、請求項１～３５のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  37. 前記ＭＳＬＮ＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２－がん細胞が、ＨＬＡ－Ａ＊０２の喪失をもたらす、ＨＬＡ－Ａにおけるヘテロ接合性の喪失によってＭＳＬＮ＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２＋細胞から派生する、請求項３６に記載の免疫細胞。
  38. 前記第１の受容体及び前記第２の受容体がともに、ヘテロ接合性の喪失を有する前記ＭＳＬＮ＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２－がん細胞の存在下で前記免疫細胞を特異的に活性化する、請求項１～３７のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  39. 前記第１の受容体及び前記第２の受容体がともに、ヘテロ接合性の喪失によってＨＬＡ－Ａ＊０２を喪失していないＭＳＬＮ＋細胞の存在下では前記免疫細胞を特異的に活性化しない、請求項１～３８のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  40. 前記免疫細胞が、Ｔ細胞である、請求項１～３９のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  41. 前記Ｔ細胞が、ＣＤ８＋ＣＤ４－Ｔ細胞である、請求項４０に記載の免疫細胞。
  42. ＭＨＣクラスＩ遺伝子の発現及び／又は機能が、低下又は除去されている、請求項１～４１のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  43. 前記ＭＨＣクラスＩ遺伝子が、ベータ－２－マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）である、請求項４２に記載の免疫細胞。
  44. 干渉ＲＮＡを含むポリヌクレオチドを更に含み、前記干渉ＲＮＡが、Ｂ２Ｍ ｍＲＮＡの配列に相補的な配列を含む、請求項４３に記載の免疫細胞。
  45. 前記干渉ＲＮＡが、表１３に記載の配列の群から選択される配列、又はそれと比較して最大で１、２、３、若しくは４個の置換、挿入若しくは欠失を有する配列を含む、請求項４４に記載の免疫細胞。
  46. 前記干渉ＲＮＡが、前記Ｂ２Ｍ ｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介性分解を誘導することができる、請求項４４又は４５に記載の免疫細胞。
  47. 前記干渉ＲＮＡが、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、請求項４６に記載の免疫細胞。
  48. 前記ｓｈＲＮＡが、
    ａ．前記Ｂ２Ｍ ｍＲＮＡの配列に相補的な配列を５’末端から３’末端に有する、第１の配列と、
    ｂ．前記第１の配列に相補的な配列を５’末端から３’末端に有する、第２の配列と、を含み、
    前記第１の配列及び前記第２の配列が、前記ｓｈＲＮＡを形成する、請求項４７に記載の免疫細胞。
  49. 前記ｓｈＲＮＡが、ＧＣＡＣＴＣＡＡＡＧＣＴＴＧＴＴＡＡＧＡＴＣＧＡＡＡＴＣＴＴＡＡＣＡＡＧＣＴＴＴＧＡＧＴＧＣ（配列番号３４９）若しくはＧＴＴＡＡＣＴＴＣＣＡＡＴＴＴＡＣＡＴＡＣＣＧＡＡＧＴＡＴＧＴＡＡＡＴＴＧＧＡＡＧＴＴＡＡＣ（配列番号３５０）の配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む、配列によってコードされる、請求項４７又は４８に記載の免疫細胞。
  50. Ｂ２Ｍをコードする配列に対する１つ以上の修飾を含み、前記１つ以上の修飾が、Ｂ２Ｍの発現を低下させ、かつ／又は機能を除去する、請求項４３に記載の免疫細胞。
  51. 前記１つ以上の修飾が、Ｂ２Ｍをコードする内因性遺伝子の１つ以上の不活性化変異を含む、請求項５０に記載の免疫細胞。
  52. 前記１つ以上の不活性化変異が、欠失、挿入、置換、又はフレームシフト変異を含む、請求項５１に記載の免疫細胞。
  53. 前記１つ以上の不活性化変異が、Ｂ２Ｍをコードする前記内因性遺伝子の配列を特異的に標的とする少なくとも１つのガイド核酸（ｇＮＡ）との複合体において、核酸誘導型エンドヌクレアーゼとともに導入される、請求項５１又は５２に記載の免疫細胞。
  54. 前記ｇＮＡが、表１２に記載の配列の群から選択される配列、又はそれと比較して最大で１、２、３、若しくは４個の置換、挿入若しくは欠失を有する配列を含む、請求項５３に記載の免疫細胞。
  55. 前記ＭＨＣクラスＩ遺伝子が、ＨＬＡ－Ａ＊０２である、請求項４２に記載の免疫細胞。
  56. ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｍＲＮＡの配列に相補的な配列を含む、干渉ＲＮＡを含むポリヌクレオチドを更に含む、請求項５５に記載の免疫細胞。
  57. 前記干渉ＲＮＡが、前記ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｍＲＮＡのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）媒介性分解を誘導することができる、請求項５６に記載の免疫細胞。
  58. 前記干渉ＲＮＡが、
    ａ．前記ＨＬＡ－Ａ＊０２ ｍＲＮＡの配列に相補的な配列を５’末端から３’末端に有する、第１の配列と、
    ｂ．前記第１の配列に相補的な配列を５’末端から３’末端に有する、第２の配列と、を含む、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であり、
    前記第１の配列及び前記第２の配列が、前記ｓｈＲＮＡを形成する、請求項５７に記載の免疫細胞。
  59. ＨＬＡ－Ａ＊０２をコードする内因性遺伝子の配列に対する１つ以上の修飾を含み、前記１つ又は修飾が、ＨＬＡ－Ａ＊０２の発現を低下させ、かつ／又は機能を除去する、請求項５５に記載の免疫細胞。
  60. 前記１つ以上の修飾が、ＨＬＡ－Ａ＊０２をコードする前記内因性遺伝子の１つ以上の不活性化変異を含む、請求項５９に記載の免疫細胞。
  61. 前記１つ以上の不活性化変異が、ＨＬＡ－Ａ＊０２をコードする前記内因性遺伝子の配列を特異的に標的とする少なくとも１つのガイド核酸（ｇＮＡ）との複合体において、核酸誘導型エンドヌクレアーゼとともに導入される、請求項５９又は６０に記載の免疫細胞。
  62. 前記第１の受容体が、配列番号１６４の配列を含み、前記第２の受容体が、配列番号５２の配列、又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１～６１のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  63. ＧＣＡＣＴＣＡＡＡＧＣＴＴＧＴＴＡＡＧＡＴＣＧＡＡＡＴＣＴＴＡＡＣＡＡＧＣＴＴＴＧＡＧＴＧＣ（配列番号３４９）若しくはＧＴＴＡＡＣＴＴＣＣＡＡＴＴＴＡＣＡＴＡＣＣＧＡＡＧＴＡＴＧＴＡＡＡＴＴＧＧＡＡＧＴＴＡＡＣ（配列番号３５０）を含む配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％の同一性を有する配列によってコードされるｓｈＲＮＡを含む、請求項６２に記載の免疫細胞。
  64. 前記第１の受容体及び第２の受容体が、単一のポリヌクレオチドによってコードされ、前記第１及び第２の受容体をコードする配列が、自己切断ポリペプチドをコードする配列によって分離される、請求項６２又は６３に記載の免疫細胞。
  65. 前記自己切断ポリペプチドが、ＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号３５１）の配列を含むＴ２Ａ自己切断ポリペプチドを含む、請求項６３に記載の免疫細胞。
  66. 前記免疫細胞が、自己由来である、請求項１～６５のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  67. 前記免疫細胞が、同種異系である、請求項１～６５のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  68. 治療有効量の請求項１～６７のいずれか一項に記載の免疫細胞を含む、医薬組成物。
  69. 薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を更に含む、請求項６８に記載の医薬組成物。
  70. ＭＳＬＮ＋がんの治療において医薬として使用するための、請求項６８又は６９に記載の医薬組成物。
  71. ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系であって、
    ａ．メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む、第１の受容体、及び
    ｂ．ＭＳＬＮ＋がん細胞において喪失している非標的抗原に特異的な細胞外リガンド結合ドメインを含む、第２の受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む、１つ以上のポリヌクレオチドを含み、
    前記第１の受容体が、前記ＭＳＬＮ＋がん細胞上のＭＳＬＮに応答する活性化因子受容体であり、前記第２の受容体が、前記非標的抗原に応答する抑制性受容体である、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系。
  72. ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系であって、請求項１～６７のいずれか一項に記載の免疫細胞の生成に使用するための、前記第１の受容体及び前記第２の受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む、１つ以上のポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系。
  73. Ｂ２Ｍに特異的なｓｈＲＮＡをコードする配列を含む、請求項７１又は７２に記載のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系。
  74. 前記第１の受容体、前記第２の受容体、及びＢ２Ｍに特異的な前記ｓｈＲＮＡをコードする配列が、同じポリヌクレオチドによってコードされる、請求項７３に記載のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系。
  75. ａ．Ｂ２Ｍに特異的な前記ｓｈＲＮＡをコードする配列が、ＧＣＡＣＴＣＡＡＡＧＣＴＴＧＴＴＡＡＧＡＴＣＧＡＡＡＴＣＴＴＡＡＣＡＡＧＣＴＴＴＧＡＧＴＧＣ（配列番号３４９）若しくはＧＴＴＡＡＣＴＴＣＣＡＡＴＴＴＡＣＡＴＡＣＣＧＡＡＧＴＡＴＧＴＡＡＡＴＴＧＧＡＡＧＴＴＡＡＣ（配列番号３５０）、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み、
    ｂ．前記第１の受容体をコードする配列が、配列番号３０３のａを含むポリペプチドをコードする配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み、
    ｃ．前記第２の受容体をコードする配列が、配列番号３４８の配列を含むポリペプチドをコードする配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む、請求項７３又は７４に記載のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド系。
  76. 請求項７１～７５のいずれか一項に記載の１つ以上のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  77. ＭＨＣクラスＩ遺伝子座におけるヘテロ接合性の喪失を有するＭＳＬＮ＋がん細胞を死滅させる方法であって、有効量の請求項１～６５のいずれか一項に記載の免疫細胞又は請求項６６～６８のいずれか一項に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、方法。
  78. ＭＨＣクラスＩ遺伝子座におけるヘテロ接合性の喪失を有するＭＳＬＮ＋腫瘍を有する対象においてＭＳＬＮ＋がんを治療する方法であって、有効量の請求項１～６７のいずれか一項に記載の免疫細胞又は請求項６８～７０のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
  79. 対象においてがんを治療する方法であって、
    ａ．前記対象の正常細胞及び複数のがん細胞のＨＬＡ－Ａ遺伝子型又は発現を決定することと、
    ｂ．任意選択で、前記対象の複数のがん細胞におけるＭＳＬＮの発現を決定することと、
    ｃ．前記正常細胞が、ＨＬＡ－Ａ＊０２を発現し、前記複数のがん細胞が、ＨＬＡ－Ａ＊０２を発現せず、前記複数のがん細胞が、ＭＳＬＮ陽性である場合、有効量の請求項１～６５のいずれか一項に記載の免疫細胞、又は請求項６６～６８のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記対象に投与することと、を含む、方法。
  80. 前記対象が、ＭＳＬＮ（ＭＳＬＮ＋）を発現し、ＨＬＡ－Ａ＊０２発現を喪失した悪性腫瘍を有するヘテロ接合型ＨＬＡ－Ａ＊０２患者である、請求項７９に記載の方法。
  81. 前記対象が、ＭＳＬＮを発現し、ＨＬＡ－Ａ＊０２発現を喪失した再発性切除不能又は転移性固形腫瘍を有するヘテロ接合型ＨＬＡ－Ａ＊０２患者である、請求項７９に記載の方法。
  82. 前記がんが、中皮腫がん、卵巣がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、食道がん、頭頸部がん、腎臓がん、子宮がん、胃がん、膵臓がん、肺がん、結腸直腸がん、又は胆管がんを含む、請求項７９～８１のいずれか一項に記載の方法。
  83. 前記がんが、対象において再発しており、前記がんが、１つ以上の以前に投与された抗がん療法に対して難治性であり、かつ／又は前記がんが、転移性である、請求項８２のいずれか一項に記載の方法。
  84. 前記がん細胞が、ＨＬＡ－Ａ＊０２を発現しないＭＳＬＮ＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２－がん細胞を含む、請求項７９～８３のいずれか一項に記載の方法。
  85. 前記ＭＳＬＮ＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２－がん細胞が、ＨＬＡ－Ａ＊０２の喪失をもたらす、ＨＬＡ－Ａにおけるヘテロ接合性の喪失によってＭＬＳＮ＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２＋細胞から派生する、請求項８４に記載の方法。
  86. 前記第１の受容体及び前記第２の受容体がともに、前記ＭＳＬＮ＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２－がん細胞の存在下で前記免疫細胞を特異的に活性化する、請求項７９～８５のいずれか一項に記載の方法。
  87. 前記第１の受容体及び前記第２の受容体がともに、ＨＬＡ－Ａ＊０２を喪失していないＭＳＬＮ＋細胞の存在下で前記免疫細胞を特異的に活性化しない、請求項７９～８６のいずれか一項に記載の方法。
  88. 請求項１～５８のいずれか一項に記載の免疫細胞、又は請求項５９～６１のいずれか一項に記載の医薬組成物の投与が、前記対象における腫瘍のサイズを減少させる、請求項７９～８７のいずれか一項に記載の方法。
  89. 前記腫瘍が、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約１００％減少する、請求項８８に記載の方法。
  90. 前記腫瘍が、除去される、請求項８８に記載の方法。
  91. 前記免疫細胞又は前記医薬組成物の投与が、前記対象における腫瘍の増殖を阻止する、請求項８８又は８９に記載の方法。
  92. 前記免疫細胞又は前記医薬組成物の投与が、前記対象における腫瘍の数を減少させる、請求項７９～９１のいずれか一項に記載の方法。
  93. 前記免疫細胞又は前記医薬組成物の投与が、前記対象におけるがん細胞の選択的死滅をもたらすが、正常細胞の死滅をもたらさない、請求項７９～９２のいずれか一項に記載の方法。
  94. 死滅した前記細胞の少なくとも約６０％が、がん細胞であるか、死滅した前記細胞の約６５％が、がん細胞であるか、死滅した前記細胞の約７０％が、がん細胞であるか、死滅した前記細胞の約７５％が、がん細胞であるか、死滅した前記細胞の約８０％が、がん細胞であるか、死滅した前記細胞の約８５％が、がん細胞であるか、死滅した前記細胞の約９０％が、がん細胞であるか、死滅した前記細胞の約９５％が、がん細胞であるか、又は死滅した前記細胞の約１００％が、がん細胞である、請求項９３に記載の方法。
  95. 前記免疫細胞又は医薬組成物の投与が、前記対象の前記がん細胞の少なくとも約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％又は全ての前記死滅をもたらす、請求項９３に記載の方法。
  96. 前記免疫細胞又は前記医薬組成物の投与が、第１の活性化因子受容体を含むが、第２の抑制性受容体を含まない他の等価の免疫細胞の投与よりも、前記対象に対して少ない副作用をもたらす、請求項７９～９５のいずれか一項に記載の方法。
  97. 複数の免疫細胞を作製する方法であって、
    ａ．複数の免疫細胞を提供することと、
    ｂ．請求項７１～７５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド系、又は請求項７６に記載のベクターで前記複数の免疫細胞を形質転換することと、を含む、方法。
  98. 請求項１～６７のいずれか一項に記載の免疫細胞、又は請求項６８～７０８のいずれか一項に記載の医薬組成物を含む、キット。
  99. 使用説明書を更に含む、請求項９８に記載のキット。

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