JP2003510254A

JP2003510254A - 核酸単離方法およびキット

Info

Publication number: JP2003510254A
Application number: JP2001525207A
Authority: JP
Inventors: シー．ハダド，ルイス
Original assignee: 3M Innovative Properties Co
Current assignee: 3M Innovative Properties Co
Priority date: 1999-09-21
Filing date: 2000-01-28
Publication date: 2003-03-18
Also published as: WO2001021632A1; DE60012549D1; EP1216255A1; AU2745000A; US20030018177A1; US6790642B2; US6383783B1; EP1216255B1; DE60012549T2

Abstract

(57)【要約】本発明は、サンプルから、好ましくは生物学的サンプルから核酸を単離する方法を提供する。この方法は、生物学的サンプルを疎水性有機ポリマー固相に適用して、選択的に標的核酸を捕捉し、核酸を非イオン性界面活性剤と共に除去することを伴う。別の方法は、疎水性有機ポリマー材料を非イオン性界面活性剤で処理して表面を洗浄し、引き続いて処理済み固形有機ポリマー材料に生物学的サンプルを接触させて、有機ポリマー固相に結合する核酸の量を減少させることを伴う。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】血液、細菌細胞培養液、および法医学サンプルなどの複合基質からの核酸（例
えばＤＮＡおよびＲＮＡ）の単離および精製は、遺伝子研究、核酸プローブ診断
学、法医学ＤＮＡ試験、およびその他の分野において重要な作業である。二本鎖
ＤＮＡからの一本鎖ＤＮＡの分離、および非結合核酸ハイブリダイゼーションプ
ローブからの結合核酸プローブの分離は、これらの分野で重要な技術である。核
酸を調製するための様々な方法が技術分野で既知であるが、それぞれに限界があ
る。

【０００２】伝統的にフェノールクロロホルム抽出が使用されているが、これは有毒で腐食
性の化学薬品の使用を要し、容易に自動化できない。核酸の精製には固相抽出も
使用されている。例えばＢｏｏｍら（米国特許番号第５，２３４，８０９号）は
、核酸を核酸源から単離する方法について述べており、そこでは反応容器中のチ
オシアン酸グアニジニウムなどの緩衝化カオトロピック剤にシリカ粒子懸濁液を
混合し、続いてサンプルを添加して完全に混合する。カオトロープの存在下で核
酸はシリカに吸収され、それは遠心分離によって液相から分離され、アルコール
−水混合物で洗浄されて、最終的に希水性緩衝液を使用して溶出される。シリカ
固相抽出は、核酸を溶出せずに残留カオトロープを除去するために、アルコール
洗浄のステップを必要とする。しかし引き続くステップで核酸の増幅または改質
のために使用される損傷を受けやすい酵素の阻害を防止するため、アルコールの
あらゆる痕跡を（加熱蒸発によって、または別の非常に揮発性で引火性の溶剤で
の洗浄によって）非常に注意深く除去しなくてはならない。

【０００３】Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ９１３５５）が提供するようなイオ
ン交換法では、高品質の核酸が製造される。しかしこれらからは高レベルの塩の
存在が帰結し、それらは核酸がさらに利用できるようになる前に、除去されなく
てはならない。

【０００４】本発明は、核酸の濃縮そして好ましくは精製と回収を含む、単離方法を提供す
る。それはまた、表面に付着する核酸量の低下方法も提供する。一実施態様では
、方法は、ポリプロピレン粉末およびポリテトラフルオロエチレンフィブリルな
どの疎水性有機ポリマー材料に核酸を付着させて、このような疎水性材料から非
イオン性界面活性剤によって核酸を除去する（例えば溶出する）ことを伴う。別
の実施態様では、非イオン性界面活性剤を使用して疎水性表面を処理し、疎水性
表面への核酸の付着を低下させ、そして好ましくは防止する。

【０００５】発明に従って単離した核酸は、例えばサンプル中で特定の核酸の存在を検出す
るためのアッセイで有用である。このようなアッセイは、疾病の予測および診断
、法医学、疫学、および公衆衛生において重要である。例えば単離したＤＮＡを
ハイブリダイゼーションおよび／または増幅の対象とし、個人における感染性ウ
イルスまたは突然変異遺伝子の存在を検出し、個人が感染性または遺伝性疾患に
かかる確率を求められるようにする。スクリーニングする数百、数千個のサンプ
ル中の１個のサンプルで感染性ウイルスまたは突然変異を検出する能力は、例え
ばＨＩＶ感染、癌、または癌に対する羅病性などの疾病のリスクを持つ観察集団
の早期診断または疫学において、あるいは早期検出が診断と治療に役立つかもし
れない新生児の疾病スクリーニングにおいて、かなりの重要性を持つ。さらに方
法は、培養細胞または生化学反応から核酸を単離するために、基礎研究所でも使
用できる。核酸は制限酵素消化、ベース配列決定、および増幅などの酵素による
変性のために使用できる。

【０００６】好ましい一実施態様では、サンプルから核酸を単離する方法は、標的核酸（例
えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ）を含むサンプルを疎水性有機ポリマー固相に導入
して、標的核酸の少なくとも一部を固相に付着するステップと、非イオン性界面
活性剤を固相に適用して、付着した標的核酸の少なくとも一部を除去するステッ
プと、を含む。好ましくはサンプルは、例えば細胞を含む生物学的サンプルであ
る。特定の実施態様では、生物学的サンプル導入に先立って、方法は、細胞を溶
解して、細胞の内容物を核酸を含む溶解産物として放出するステップを含む。

【０００７】特定の実施態様では、方法は添加された塩を含む結合緩衝液を疎水性有機ポリ
マー固相に導入して、固相に核酸を付着するのを助けるステップをさらに含む。
好ましくはサンプルを導入するのに先立って、結合緩衝液が導入される。特定の
実施態様では、方法は、付着した核酸を有する固相を洗浄して、サンプルの非核
酸成分を除去するステップをさらに含む。このような洗浄は、典型的に添加され
た塩を含む洗浄緩衝液で実施される。

【０００８】疎水性有機ポリマー固相材料は、好ましくはポリテトラフルオロエチレンなど
のフッ素化されたポリマーを含む。より好ましくは、それはポリエチレンまたは
ポリプロピレンなどのポリオレフィンを含む。非イオン性界面活性剤は、好まし
くはポリオキシエチレン界面活性剤であり、そしてより好ましくはポリオキシエ
チレン−コ−オキシプロピレン界面活性剤である。

【０００９】本発明は、サンプルから二本鎖ＤＮＡを単離する方法も提供する。方法は、二
本鎖ＤＮＡを含むサンプルを疎水性有機ポリマー固相に導入して、二本鎖ＤＮＡ
の少なくとも一部を固相に付着するステップと、付着した二本鎖ＤＮＡを有する
固相を洗浄して（一本鎖ＤＮＡを含む）サンプルの非二本鎖ＤＮＡ成分を除去す
るステップと、非イオン性界面活性剤を固相に適用して、付着した二本鎖ＤＮＡ
の少なくとも一部を除去するステップと、を含む。このようにして本発明の方法
は、様々なタイプの核酸の分離を含む。

【００１０】本発明は、疎水性有機ポリマー表面に付着する核酸の量を低下させる（そして
好ましくは防止する）方法も提供する。方法は、非イオン性界面活性剤を疎水性
有機ポリマー表面に適用するステップと、表面を溶剤（水、またはその中に界面
活性剤が溶解するようなその他の溶剤）で洗浄するステップと、核酸を含むサン
プルを表面に接触させるステップと、を含む。

【００１１】本発明は、核酸が付着する疎水性有機ポリマー固相、および核酸の少なくとも
一部を固相から除去できる非イオン性界面活性剤を含むキットも提供する。好ま
しくはキットは、さらに通過レセプタクル（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈｒｅｃ
ｅｐｔａｃｌｅ）も含む。

【００１２】定義「核酸」は、技術分野で既知の意味を有し、二本鎖または一本鎖構成、円形、
プラスミド、比較的短いオリゴヌクレオチド、ＰＮＡとも称されるペプチド核酸
（Ｎｉｅｌｓｅｎら著、Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．、２６、７３〜７８ページ
（１９９７）で述べられたような）などをはじめとするがこれに限定されるもの
ではない、多種多様な形状のＤＮＡおよびＲＮＡの双方を指す。

【００１３】「単離された」とは、その中でそれがもともと見つかったサンプルから除去さ
れた核酸を指す。これはオリジナルサンプル中のオリジナル溶剤以外の他のあら
ゆる材料を必ずしも除去することなく、所望の核酸を単純に濃縮することを含む
。これは例えばタンパク質、脂質、塩などの細胞成分のような、その他の材料か
ら所望の核酸を分離することも含む。より好ましくは単離した核酸は、実質的に
精製されている。「実質的に精製された」とは、例えばタンパク質、脂質、また
は塩などの細胞成分混入物の除去に関して少なくとも５０％、好ましくは少なく
とも８０％、そしてより好ましくは少なくとも９５％純粋な核酸を指す。これら
の百分率は、標的核酸とその他の（非標的）核酸、およびサンプル中の溶剤以外
の例えばタンパク質、脂質、塩などの細胞成分などの混入物の総量に対する、標
的核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ）の量を指す。したがって「実質的に精
製された」という用語は、概して、単離した核酸の引き続く使用に干渉できる化
合物が除去されるように、サンプルから細胞成分または反応混入物の大部分を分
離することを指す。

【００１４】「付着する」または「付着」または「結合」とは、ファンデルワールス相互作
用、静電的相互作用、親和結合、または物理的捕捉などの弱い力をはじめとする
、多種多様な機序を通じた可逆結合を指す。この用語の使用は作用機序を暗示せ
ず、吸着性および吸収性の機序を含む。

【００１５】「疎水性有機ポリマー固相」とは、同じでも異なっても良い、天然および／ま
たは合成起源の有機化合物でも良い、反復単位からできたポリマーを指す。これ
は、ホモポリマーおよびヘテロポリマー（例えばランダムでもブロックでも良い
共重合体、三元共重合体、四元共重合体など）を含む。疎水性ポリマーは、水の
表面張力よりも小さい（例えば約７２ダイン／ｃｍ未満）、そして好ましくはナ
イロンの臨界表面張力よりも小さい（例えば約４３ダイン／ｃｍ未満）臨界表面
張力を有する。この用語は、技術分野で周知の方法によって容易に調製できる、
繊維または粒子形態のポリマーを含む。このような材料は典型的に多孔性マトリ
ックスを形成するが、特定の実施態様では、固相は有機ポリマー材料の非多孔性
シートなどの固形表面も指す。

【００１６】「界面活性剤」は、溶解している媒体の表面または界面張力を低下させる物質
を指す。「非イオン性界面活性剤」とは、極性基が荷電していない界面活性剤分
子を指す。

【００１７】ポリプロピレン粉末およびポリテトラフルオロエチレンフィブリルなどの疎水
性有機ポリマー材料に核酸が付着し、このような疎水性材料から非イオン性界面
活性剤によって核酸が効果的に除去できることが見いだされた。さらにプラスチ
ックシートなどの疎水性有機ポリマー表面を処理して、疎水性表面に対する核酸
の付着を低下させ、好ましくは防止するのに非イオン性界面活性剤が使用できる
。

【００１８】本発明の方法を使用して、多種多様なサンプル、特に体液（例えば全血、血清
、尿、唾液）、種々の組織、細胞培養物などの生物学的サンプルから核酸を単離
できる。サンプルのタイプは、本発明の限界ではない。生物学的サンプルは、生
物学または生化学起源のものである。本発明の方法で使用するのに適したものは
、哺乳類、植物、細菌、または酵母起源に由来することができる。生物学的サン
プルは、単細胞形態または組織形態であることができる。細胞または組織は、生
体外（ｉｎｖｉｔｒｏ）培養物に由来することができる。

【００１９】細胞を含有するサンプルでは、細胞膜を最初に溶解し、核酸を含有する溶解産
物として細胞内容物を放出させる。ここでは溶解とは、外細胞膜、そして存在す
る場合は核膜を指す、細胞膜の物理的破壊である。これは煮沸、カオトロピック
剤処置、物理的破壊、または凍結／解凍などの標準技術を使用して実行できる。
典型的に細胞溶解産物から核酸を単離するためには、タンパク質を最初に除去す
ることが好ましい。これは、例えばアズラクトンビーズ（例えばミネソタ州セン
トポールの３ＭＣｏｍｐａｎｙからＥＭＰＨＡＺＥＡＢ１ビーズとして市販
されるタイプ、またはＰＣＴ国際公開第９４／００４６４号（３ＭＣｏｍｐａ
ｎｙ）で開示されるタイプ）で処理して、あるいはタンパク質が正電荷を保持す
るように十分低いｐＨで、サンプルをカチオン交換膜またはカラムに通過させて
実施できる。

【００２０】発明に従って、不純な、ある程度純粋な、または純粋なサンプルから（例えば
混入物から濃縮または分離して）核酸を単離しても良い。極めて不純なサンプル
から核酸を単離することもできるので、オリジナルのサンプルの純度は重要でな
い。例えば血液、唾液、または組織などの生物学的液体の不純なサンプルから、
核酸を除去することもできる。より高純度のオリジナルサンプルが所望されるな
らば、発明に従った単離に先立って、当業者に既知のあらゆる従来手段に従って
サンプルを処理しても良い。例えば核酸の単離に先立って、不溶物などの特定の
不純物を除去するようにサンプルを処理できる。

【００２１】ここで述べるようにして単離した核酸は、いかなる分子量でも良く、一本鎖形
態、二本鎖形態、環状、プラスミドなどの形態でも良い。様々なタイプの核酸が
互いに分離できる（例えばＤＮＡからＲＮＡ、または一本鎖ＤＮＡから二本鎖Ｄ
ＮＡ）。例えば本発明の方法を使用して、約１０〜約５０ベース長の小さなオリ
ゴヌクレオチドまたは核酸分子、約１０００ベース〜約１０，０００ベース長の
はるかに長い分子、そして約５０ｋｂ〜約５００ｋｂのさらに高分子量の核酸が
単離できる。態様によっては発明に従って単離した核酸が、好ましくは約１０ベ
ース〜約１００，０００キロベースの範囲でも良い。

【００２２】ここで述べる方法に従って、疎水性有機固相材料に適用される核酸サンプルは
、多種多様な容積であっても良い。例えば適用される容積は、１Ｌ程度に大きく
ても１μＬ程度に小さくても良い。それはその中で非常に小さな容積（１μＬ未
満）が使用されるミクロ流体形式（いわゆる「基板上の実験室」ｌａｂｏｎ
ａｃｈｉｐ）で使用することもできる。ここで述べたようにして固相マトリッ
クスに適用された核酸は、いかなる量でも良く、その量は固相の量によって定ま
る。好ましくは固相に適用される核酸の量は、典型的に固相乾燥重量の約１／１
０，０００〜約１／１００（核酸重量／固相重量）未満である。固相に適用され
る核酸の量は、例えば１００ｇ程度に大きくてもあるいは１ｐｇ程度に小さくて
も良い。

【００２３】固相材料から単離される所望の核酸は、好ましくは約３０％、より好ましくは
約７０％、そして最も好ましくは約９０％の量、または元々固相に適用された所
望の核酸の量を越える。したがって本発明の方法は、サンプルからの所望または
標的核酸の高回収率を提供する。さらに発明に従って、極めて少量の核酸分子を
定量的に回収しても良い。回収率または収量は、手順それ自体でなく、主にサン
プルの質に左右される。発明は大容量からの濃縮を必要としない核酸調製品を提
供するので、発明により核酸損失のリスクが回避される。

【００２４】典型的に核酸を含有するサンプルが、通過レセプタクル中の疎水性有機ポリマ
ー固相材料に添加されるが、このレセプタクルは必ずしも必要ない。次に核酸が
、疎水性有機ポリマー固相材料に付着する。好ましくは、標的核酸を含有するサ
ンプルと共に、またはそれに先立って添加できる結合緩衝液を使用して、核酸の
結合を増強しても良い。このような緩衝液としては、典型的に核酸と相溶性で、
約３〜１１のｐＨを有する標準生物学的緩衝液が挙げられる。例としては、ＡＭ
ＰＳＯ（３−［（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒ
ドロキシプロパンスルホン酸（＃Ａ７５８５、ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏ、ミズーリ州６３１７８セントルイス）、ＭＥＳ（２−［Ｎ−モルホリノ］
エタンスルホン酸）（＃Ｍ５２８７、ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、ミ
ズーリ州６３１７８セントルイス）。またはＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）（典型
的に約２０ミリモル（ｍＭ）の塩濃度）が挙げられる。結合緩衝液は典型的に添
加された塩も含み、疎水性結合を促進する。例としては、例えば約４００ｍＭあ
るいは１モルまでの濃度のリン酸、過塩素酸、クエン酸、または硫酸のナトリウ
ム塩が挙げられる。好ましくは、次に例えば緩衝液で核酸／固相材料を洗浄して
、付着した核酸から、消化されたタンパク質、脂質、およびその他の不要な細胞
成分などの非結合材料を分離する。この洗浄緩衝液は、典型的に核酸適合性で、
典型的にｐＨ範囲が約３〜約１１の生物学的緩衝液である。望ましくない材料を
除去するのに適した洗浄緩衝液の例としては、結合緩衝液について上で列挙した
ものが挙げられる。このような緩衝液は、結合緩衝液について上で列挙したもの
などの添加された塩を含んでも含まなくても良い。これらの材料を除去した後、
例えば上で列挙したもの（添加された塩なしの）などの溶出緩衝液中にある非イ
オン性界面活性剤で（溶出などによって）固相材料から除去することで、核酸を
回収しても良い。この好ましい方法を使用することで、回収される核酸は実質的
に純粋で濃縮され、引き続く実験（例えばベース配列決定実験）で即座に使用す
るのに適する。

【００２５】本発明の方法で有用な疎水性有機ポリマー固相材料は、核酸と可逆的に結合す
る多種多様な有機材料であっても良い。適切なポリマーの例としては、例えばポ
リオレフィンおよびフッ素化されたポリマーが挙げられる。固相材料は、使用に
先立って典型的に洗浄されて、塩およびその他の混入物が除去される。これは乾
燥状態で、あるいは即座に使用できる水性懸濁液中で保管できる。固相材料は好
ましくは、例えばピペット、シリンジ、または大型カラム、微量定量プレート、
またはミクロ流体装置などの通過レセプタクル中で使用されるが、このようなレ
セプタクルが関与しない懸濁方法を使用することもできる。

【００２６】本発明の方法で有用な疎水性有機ポリマー固相材料は、多種多様な形態の多種
多様な材料を含むことができる。例えばそれは、遊離または固定でも良い粒子、
繊維、微孔質フィルム、または膜の形態であることができる。本発明の通過用途
のためには、このような材料は典型的に多孔性マトリックスの形態でも良い。好
ましくはこのような用途のためには、固相材料は、例えばグラム当たり１平方メ
ートル（ｍ²／ｇ）を超えるなどの比較的大きな表面積を有する。核酸付着防止
のための固体表面の前処理などの通過装置の使用が関与しない用途では、固相材
料が多孔性マトリックス中にあってもなくても良い。

【００２７】一実施態様では、固相材料は、その中に絡まった粒子を有しても有さなくても
良いフィブリルマトリックスを含む。フィブリルマトリックスおよび粒子の双方
を使用する場合、少なくともその片方は疎水性であり、所望の（すなわち標的）
核酸を結合できる。フィブリルマトリックスは、多種多様な繊維のいずれでも含
むことができる。典型的に繊維は、水性環境では不溶性である。例としては、ガ
ラス繊維と、特にポリプロピレンおよびポリエチレンマイクロファイバー、アラ
ミド繊維などのポリオレフィン繊維と、特にポリテトラフルオロエチレン繊維な
どのフッ素化されたポリマーと、天然セルロース系繊維とが挙げられる。核酸結
合に対して活性でも不活性でも良い、繊維の混合物も使用できる。好ましくはフ
ィブリルマトリックスは、厚さが少なくとも約１５μｍで約１ｍｍ以下であり、
より好ましくは約５００μｍ以下のウェブを形成する。

【００２８】使用される場合、粒子は典型的に水性環境で不溶性である。それらは１つの材
料からできていても良いし、あるいは被覆された粒子などのように材料の組み合
わせからできていても良い。それらは膨潤性または非膨潤性であることができる
が、それらは好ましくは水および有機液体中で非膨潤性である。好ましくは粒子
が付着する場合、それは非膨潤性で疎水性の材料からできている。それらは標的
核酸への親和性で選択できる。いくつかの水膨潤性粒子の例は、米国特許番号第
４，５６５，６６３号（Ｅｒｒｅｄｅら）、第４，４６０，６４２号（Ｅｒｒｅ
ｄｅら）、および第４，３７３，５１９号（Ｅｒｒｅｄｅら）で述べられている
。水中で非膨潤性の粒子については、米国特許番号第４，８１０，３８１号（Ｈ
ａｇｅｎら）、第４，９０６，３７８号（Ｈａｇｅｎら）、第４，９７１，７３
６号（Ｈａｇｅｎら）、および第５，２７９，７４２号（Ｍａｒｋｅｌｌら）で
述べられている。好ましい粒子は、ポリプロピレン粒子（例えば粉末）などのポ
リオレフィン粒子である。核酸結合に対して活性または不活性の粒子の混合物も
使用できる。

【００２９】被覆された粒子を使用する場合、コーティングは、好ましくは水または有機物
不溶性の非膨潤性材料である。コーティングは、それに核酸が付着するものであ
ってもなくても良い。このようにして被覆されたベース粒子は、無機物または有
機物であることができる。ベース粒子は有機基が共有結合する、シリカ、アルミ
ナ、チタニア、ジルコニアなどの無機酸化物を含むことができる。例えば異なる
鎖長の脂肪族（Ｃ２、Ｃ４、Ｃ８、またはＣ１８基）などの共有結合する有機基
が使用できる。

【００３０】フィブリルマトリックスを含む適切な固相材料の例は、米国特許番号第５，２
７９，７４２号（Ｍａｒｋｅｌｌら）、第４，９０６，３７８号（Ｈａｇｅｎら
）、第４，１５３，６６１号（Ｒｅｅら）、第５，０７１，６１０号（Ｈａｇｅ
ｎら）、第５，１４７，５３９号（Ｈａｇｅｎら）、５，２０７，９１５号（Ｈ
ａｇｅｎら）、および第５，２３８，６２１号（Ｈａｇｅｎら）で述べられてい
る。ポリテトラフルオロエチレンマトリックス（ＰＴＦＥ）を含むものが特に好
ましい。

【００３１】ＰＴＦＥマトリックスは、米国特許番号第４，９０６，３７８号（Ｈａｇｅｎ
ら）で述べられた手順に従って調製できる。手短には、これは固形物の吸収能を
上回るのに十分な潤滑水の存在下でパテ状稠度を維持しながら、微粒子材料をポ
リテトラフルオロエチレン水性分散液に混合するステップと、約５０℃〜約１０
０℃の温度でパテ状塊を激しく混合して、ポリテトラフルオロエチレン粒子の最
初のフィブリル化を引き起こすステップと、パテ様塊を二軸圧延して、同一含水
量を保持しながらポリテトラフルオロエチレン粒子の追加的なフィブリル化を引
き起こすステップと、得られるシートを乾燥するステップと、を伴う。

【００３２】別の好ましい実施態様では、固相（例えば微孔質熱可塑性ポリマー担体）は、
フィブリルによって結合し多様な間隔で無作為に分散した、不均一な形の熱可塑
性ポリマーの等軸粒子によって特徴づけられる、微孔質構造を有する。粒子は互
いに間が開いており、その間に微細孔の網目状組織を提供する。粒子は、各粒子
から隣接する粒子に放射状に広がるるフィブリルによって相互に結合する。粒子
またはフィブリルの一方、または両方が、疎水性であって核酸を付着させても良
い。このような材料の好ましい例は、Ｈｇ表面積技術による測定で４０ｍ²／ｇ
程度の高表面積を有し、約５μｍまでの孔径を有する。

【００３３】このタイプの線維性材料は、誘起相分離の使用を伴う好ましい技術によって作
ることができる。これは均質な混合物を形成するのに十分な温度で、熱可塑性ポ
リマーを非混和液に溶融混合するステップと、溶液から製品を所望の形に成形す
るステップと、液体とポリマーの相分離を誘起するように成形製品を冷却するス
テップと、究極的にポリマーを固化して液体のかなりの部分を除去し、微孔質ポ
リマーマトリックスを残すステップと、を伴う。この方法および好ましい材料に
ついては、米国特許番号第４，７２６，９８９号（Ｍｒｏｚｉｎｓｋｉ）、第４
，９５７，９４３号（ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒら）、および第４，５３９，２５６
号（Ｓｈｉｐｍａｎ）で詳細に述べられている。このような材料は熱誘起相分離
膜（ＴＩＰＳ膜）と称され、特に好ましい。

【００３４】疎水性固相ポリマーに対する核酸の親和性は、核酸の固相への結合または付着
の間に使用する塩の濃度（ここで結合緩衝液と称する緩衝液の使用を通じて調節
できる）、または溶出ステップ中に使用する塩の濃度（ここで溶出緩衝液と称す
る緩衝液の使用を通じて調節できる）によって調節できる。所望するならば典型
的に約３〜約１１のｐＨ範囲内である結合および溶出緩衝液を使用して、異なる
形態の核酸を分離できる。固相次第では結合と溶出緩衝液の性質によって、異な
るタイプの核酸の結合が調節できる。リン酸塩などの高濃度の塩は、概してポリ
プロピレン微粒子などの固形担体の結合能を増大させる。場合によっては、これ
は異なる形態の核酸を分離するのに使用できる。

【００３５】核酸を固相から遊離して核酸を含有する溶液を形成するのに好ましい水溶液は
、十分な濃度の１つ以上の非イオン性界面活性剤を含む。核酸を遊離するのに好
ましい溶液は、水およびｐＨを維持するためにＰＢＳなどの最小量の緩衝液、お
よび最小量の非イオン性界面活性剤を含む。この最小量は、どの非イオン性界面
活性剤が使用されるかによって決まる。ＰＬＵＲＯＮＩＣＦ６８では、この量
は約０．０６ｍＭ以上である。概して効率的な溶出に必要な非イオン性界面活性
剤濃度は、その界面活性剤に対する臨界ミセル濃度（すなわち、例えば界面活性
剤分子の超顕微鏡的凝集などのミセルを作るのに必要な、水中界面活性剤の最小
濃度）よりも高くなくてはならない。核酸が固形担体から脱着するのに十分な時
間があれば、溶出流量は重要でない。

【００３６】多種多様な適切な非イオン性界面活性剤が知られている。それらとしては、例
えばポリオキシエチレン界面活性剤、カルボン酸エステル界面活性剤、カルボン
酸アミド界面活性剤などが挙げられる。市販される非イオン性界面活性剤として
は、ｎ−ドデカノイルスクロース、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、
ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコ
ピラノシド、ｎ−デカノイルスクロース、ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシ
ド、ｎ−デシル−β−Ｄ−チオマルトシド、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−グルコピラ
ノシド、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、ｎ−ヘキシル−β−Ｄ
−グルコピラノシド、ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オクタノイ
ルスクロース、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、シクロヘキシル−ｎ
−ヘキシル−β−Ｄ−マルトシド、シクロヘキシル−ｎ−メチル−β−Ｄ−マル
トシド、ジギトニン、および商品名ＰＬＵＲＯＮＩＣ、ＴＲＩＴＯＮ、ＴＷＥＥ
Ｎの下に市販されるもの、ならびにＫｉｒｋＯｔｈｍｅＴｅｃｈｎｉｃａｌ
Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａに列挙される市販されるその他の多くが挙げられる
。好ましい界面活性剤は、ポリオキシエチレン界面活性剤である。より好ましい
界面活性剤は、ポリオキシエチレン−コ−オキシプロピレン界面活性剤である。

【００３７】本発明の好ましい実施態様に従って、核酸を実質的に精製された形態で回収す
るステップが提供される。この実施態様では、固相材料から遊離された実質的に
精製された核酸を含有する、全溶出液または溶出溶液のアリコートのどちらかの
除去を伴う、回収率方法が考察された。このようなアリコートは、当業者に既知
の様々な分析および合成技術の対象にできる。

【００３８】本発明の方法を使用するための装置の例としては、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｎ
ｃ．（マサチューセッツ州０１７３０ベッドフォード）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｉｎ
ｃ．（カリフォルニア州９４５４７ハーキュリーズ）、Ｏｓｍｏｎｉｃｓ，Ｉｎ
ｃ．（マサチューセッツ州０１５８１ウェストバラ）、およびＷｈａｔｍａｎ，
Ｉｎｃ．（ニュージャージー州０７０１４クリフトン）などの会社が提供する標
準試験室フィルターホルダーおよびフィルター群が挙げられる。発明の方法は、
遠心分離、吸引、加圧をはじめとする手段によってフィルターを通る溶液移動を
容易にする（通過装置と称される）濾過装置内で実施できる。その他の装置とし
ては、微量定量プレートおよびミクロ流体装置が挙げられる。

【００３９】本発明は、ホルダーありまたはなしの固形担体（例えばシリンジフィルターホ
スダーまたはスピンフィルターホルダーなどのフィルターホルダー、あるいは微
粒子材料を保持するための保持フリットが両端にあるカラム）、希釈なしまたは
溶液中の非イオン性界面活性剤、および核酸を結合、溶出する取扱説明書を含む
キットも提供する。好ましくは本発明は、その中に疎水性固相有機ポリマー材料
を有する通過レセプタクル、および非イオン性界面活性剤を含むキットを提供す
る。

【００４０】本発明は、疎水性有機材料への核酸の付着を低下または防止する方法も提供す
る。しかし核酸との混合物中に非イオン性界面活性剤を含むＪＰ２２６８６８
２（ＨｉｔａｃｈｉＬｔｄ．）とは異なり、本発明の方法は、材料を界面活性
剤で前処理すること、好ましくは材料を洗浄してから材料を核酸に接触させるこ
とを伴う。

【００４１】実施例材料ＤＮＡ。特に断りのない限り、これらの実施例で使用したＤＮＡは、子ウシ胸
腺ＤＮＡ（ミズーリ州１４５０８セントルイスのＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏ．）であった。

【００４２】プラスミドＤＮＡ。ＰＵＣ１１９プラスミドＤＮＡは、ミネソタ州５５３４４
イーデンプレーリーのＡＴＧＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓによって調製された。
これをｐＨ６．８の１０または４００ｍＭリン酸の緩衝液のどちらかに、約３０
μｇ／ｍＬの濃度で溶解した。

【００４３】ヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）。ＨＴＰヒドロキシアパタイトは、カリフォ
ルニア州９４５４７ハーキュリーズのＢｉｏ−ＲａｄＣｏ．から入手した。

【００４４】リン酸緩衝液。使用したリン酸緩衝液は全て、等モル量のリン酸二水素カリウ
ムおよびリン酸水素二カリウムから調製した。

【００４５】界面活性剤。ＰＬＵＲＯＮＩＣＦ６８非イオン性界面活性剤（ニュージャー
ジー州０７０５４パーシッパニーのＢＡＳＦＣｏｒｐ．）。

【００４６】約９０％重量のＨＡＰを含有するヒドロキシアパタイト添加ＥＭＰＯＲＥ膜は
、米国特許番号第４，９０６，３７８号実施例１の方法によって作った。

【００４７】ポリプロピレン添加ＥＭＰＯＲＥ膜は、ポリプロピレンを使用したこと以外は
、米国特許番号第５，０７１，６１０号実施例１Ａの方法によって作った。

【００４８】Ｃ１８添加ＥＭＰＯＲＥ膜は、３ＭＣｏ．（ミネソタ州セントポール）から
市販される。

【００４９】熱誘起相分離膜フィルター（ＴＩＰＳ膜）は、孔径がミクロンからサブミクロ
ン範囲の高表面積（グラム当たり４０平方メートルまで）のポリマー膜である。
これらの実験で使用される膜は、ポリプロピレン（米国特許番号第４，７２６，
９８９号の実施例１〜４に従って作られた）またはポリエチレン（米国特許番号
第４，５３９，２５６号の実施例８Ｃに従って作られた）からできている。

【００５０】実施例１ＤＮＡの従来のクロマトグラフィーカラム中のＨＡＰへの付着特性およびＥＭＰ
ＯＲＥ膜への導入の比較ＨＡＰを以下のようにして従来のクロマトグラフィーカラムに導入した。真空
マニフォールド上に装着した標準２ｍＬクロマトグラフィーカラム（カリフォル
ニア州９４５４７ハーキュリーズのＢｉｏ−ＲａｄＣｏ．）に、１００ｍｇの
ＨＡＰを入れた。これを３ｍＬの５００ｍＭリン酸緩衝液、続いて５ｍＬの５０
ｍＭリン酸緩衝液で洗浄した。これに引き続き５０ｍＭリン酸緩衝液中５３μｇ
／ｍＬのＤＮＡを１ｍＬカラムに加え、次にそれを２ｍＬの５０ｍＭリン酸緩衝
液で洗浄し、１ｍＬの３００ｍＭリン酸緩衝液で溶出した。各ステップからの濾
液を２６０ｎｍでの吸光度（ＤＮＡの吸収極大）についてモニターした。

【００５１】ＨＡＰ添加ＥＭＰＯＲＥ膜（ＨＡＰおよびＰＴＦＥフィブリルのみを含有する
）の２５ｍｍディスク２個をシリンジフィルターホルダー中に配置して、高およ
び低濃度のリン酸緩衝液（３ｍＬの５００ｍＭリン酸緩衝液、続いて５ｍＬの５
０ｍＭリン酸緩衝液）で洗浄した。これに続き５０ｍＭリン酸中２２μｇ／ｍＬ
のＤＮＡを２ｍＬをディスクに適用し、それを次に２ｍＬの５０ｍＭリン酸、続
いて２ｍＬの３００ｍＭリン酸、続いて２ｍＬの５０ｍＭリン酸、そして２ｍＬ
の１．０Ｍリン酸緩衝液で洗浄した。このときも２６０ｎｍでの吸光度をモニタ
ーして、濾液中のＤＮＡレベルを測定した。２６０ｎｍでの吸光度として報告さ
れる結果は次のようであった。

【００５２】

【表１】

【００５３】低リン酸濃度（５０ｍＭ）ではＤＮＡはカラム中のＨＡＰに付着し、リン酸濃
度が３００ｍＭに上昇すると溶出された。しかしＨＡＰ添加ＥＭＰＯＲＥ膜での
結果は予期しないものだった。ＤＮＡは低リン酸条件で付着したが、より高いリ
ン酸濃度でも溶出しなかった。引き続く実験からは４００ｍＭのリン酸で溶解し
ても、ＤＮＡがこの膜に付着することが示された。さらにＸ線回折調査からは、
膜に導入された際にＨＡＰが変化しないことが示された。このような高リン酸濃
度ではＤＮＡはＨＡＰ粒子でなく、ＥＭＰＯＲＥ膜のポリテトラフルオロエチレ
ンフィブリルに結合性である。

【００５４】実施例２ＨＡＰ添加ＥＭＰＯＲＥ膜上のＤＮＡ付着および溶出シリンジフィルターホルダー内のＨＡＰ添加ＥＭＰＯＲＥ膜の２５ｍｍディス
ク１枚に、４ｍｇ／ｍＬのＰＬＵＲＯＮＩＣＦ６８を含有する約３５μｇ／ｍ
Ｌの５０ｍＭリン酸中のＤＮＡを２ｍＬを装入した。ディスクを４ｍｇ／ｍＬの
ＰＬＵＲＯＮＩＣＦ６８を含有する２ｍＬの５０ｍＭリン酸で洗浄し、続いて
４ｍｇ／ｍＬのＰＬＵＲＯＮＩＣＦ６８を含有する４００ｍＭリン酸の２ｍＬ
アリコートで２回洗浄した。濾液の２６０ｎｍ吸光度で測定されたように、ＤＮ
Ａは完全に付着して５０ｍＭリン酸では溶出しなかったが、リン酸濃度を４００
ｍＭに上昇させると少なくとも９０％が溶出した。

【００５５】別の実験では、新しい２５ｍｍディスクに５０ｍＭリン酸中に約３５μｇ／ｍ
ＬのＤＮＡを２ｍＬ装入して、２ｍＬの５０ｍＭリン酸洗浄液で１回洗浄し、２
ｍＬの４００ｍＭリン酸洗浄液で３回洗浄し、最後に４ｍｇ／ｍＬのＰＬＵＲＯ
ＮＩＣＦ６８を含有する２ｍＬの４００ｍＭリン酸洗浄液で２回洗浄した。こ
のときもＤＮＡは膜に結合したが、膜が高濃度のリン酸緩衝液を含有するＰＬＵ
ＲＯＮＩＣで処理されるまでは、（より高いリン酸濃度でも）溶出しなかった。
２６０ｎｍでの吸光度として報告される結果は次のようであった。

【００５６】

【表２】

【００５７】これらの結果は、ＰＬＵＲＯＮＩＣＦ６８が存在する場合、膜がＨＡＰのよ
うに振る舞うが、不在の場合は、膜がＤＮＡを溶出しないことを示す。

【００５８】実施例３ポリプロピレン添加およびＣ１８添加ＥＭＰＯＲＥ膜を用いたＤＮＡの付着実験ではＨＡＰ添加膜と同じようにして、ポリプロピレン添加（Ｈｉｍｏｎｔ
粉末ポリプロピレンから調製された、デラウェア州ウィルミントンのＭｏｎｔｅ
ｌｌＮｏｒｔｈＡｍｅｒｉｃａ）およびＣ１８添加ＥＭＰＯＲＥ膜を使用し
た。双方の膜を、５ｍＬのメタノール、続いて５ｍＬの水、続いて５ｍＬの４０
０ｍＭリン酸緩衝液で洗浄してプレコンディショニングした。チャレンジ（ｃｈ
ａｌｌｅｎｇｅ）溶液は、４００ｍＭリン酸緩衝液中におよそ６０μｇ／ｍＬの
子ウシ胸腺ＤＮＡであった。膜にこの溶液の１ｍＬアリコートを２回適用し、続
いて１ｍＬの４００ｍＭリン酸で４回洗浄し、そして１ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬＰ
ＬＵＲＯＮＩＣＦ６８水溶液で４回洗浄した。濾液をＤＮＡレベルについて２
６０ｎｍでモニターした。２６０ｎｍでの吸光度として報告される結果は次のよ
うであった。

【００５９】

【表３】

【００６０】これらの結果は、ＤＮＡがポリプロピレンおよびＣ１８Ｅｍｐｏｒｅ膜の双
方に付着して、ＰＬＵＲＯＮＩＣＦ６８で脱着できることを示す。回収率はポ
リプロピレンでは９０％近く、Ｃ１８では約７５％である。ＰＬＵＲＯＮＩＣ
Ｌ３１、ＴＷＥＥＮ２０、ＴＥＲＧＩＴＯＬＭＮ６、およびＮＯＮＩＤＥＴ
Ｐ４０などのその他の非イオン性界面活性剤は、これらの条件下での核酸溶出
の促進において全てＰＬＵＲＯＮＩＣＦ６８と同様に振る舞う。

【００６１】実施例４一本鎖および二本鎖ＤＮＡの付着の間の相違二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を煮沸すると、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に変
性する。ほぼ室温に戻すと、ＤＮＡは非常にゆっくりｄｓＤＮＡに戻る。以下の
実験では、１０ｍＭリン酸緩衝液中の５０μｇ／ｍＬのＤＮＡ溶液を二分した。
片方を１０分間煮沸して室温に冷却し即座に試験する一方、別の半分は煮沸せず
にを直接試験した。ポリプロピレン添加ＥＭＰＯＲＥ膜（ＭＩＣＲＯＰＲＯ６
００ポリプロピレン粉末から調製した、ニューヨーク州タリータウンのＭｉｃｒ
ｏＰｏｗｄｅｒｓ，Ｉｎｃ．）のディスク（２５ｍｍ径）をこれらの２種の溶
液でチャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）して、濾液の２６０ｎｍにおける吸光度
を測定して、どの程度のＤＮＡが付着したかを求めた。

【００６２】ＤＮＡ溶液の半分は、使用直前に１０分間煮沸して急速に室温に冷却した。２
６０ｎｍにおける吸光度は煮沸前に１．０１４であり、煮沸直後には１．２６で
あった。煮沸した（変性）および未変性溶液を使用してＥＭＰＯＲＥ膜をチャレ
ンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）し、濾液の吸光度をモニターした。実施例３で述べ
たようにして、メタノール洗浄、続いて水、続いて１０ｍＭリン酸緩衝液によっ
て膜をコンディショニングした。２６０ｎｍでの吸光度として報告される結果は
次のようであった。

【００６３】

【表４】

【００６４】これらの実験から明らかなように、未変性ＤＮＡは、膜に対して変性（一本鎖
）ＤＮＡより高い親和性を有する。この親和性の相違を使用して二本鎖ＤＮＡか
ら一本鎖ＤＮＡを分離できる。

【００６５】実施例５プラスミドＤＮＡを精製するためのＥＭＰＯＲＥ膜および非イオン性界面活性剤
の使用以下の実験からプラスミドＤＮＡがポリプロピレン添加ＥＭＰＯＲＥ膜（ＭＩ
ＣＲＯＰＲＯ６００ポリプロピレン粉末から調製される、ニューヨーク州タリ
ータウンのＭｉｃｒｏＰｏｗｄｅｒｓ，Ｉｎｃ．）に付着でき、非イオン性界
面活性剤で溶出できることが示される。一例では溶出するプラスミドが、混入物
から分離される。

【００６６】膜の２５ｍｍディスクをシリンジフィルターホルダーに入れて、５ｍＬのエタ
ノール、続いて５ｍＬの水、続いてチャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）緩衝液（
１０または４００ｍｍリン酸、ｐＨ６．８）で洗浄してプライムした。シリンジ
の助けを借りて３ｍＬのプラスミドＤＮＡ溶液を膜に通過させ、濾液を収集した
。次に１０ｍＭリン酸中の０．５％のＰＬＵＲＯＩＮＣＦ６８（ｐＨ６．８）
の３ｍＬを使用してプラスミドＤＮＡを溶出した。次に開始チャレンジ（ｃｈａ
ｌｌｅｎｇｅ）溶液、濾液、および溶出液の２６０ｎｍでの吸光度を測定した。
各溶液５０μＬを５μＬの標準ゲルローディング染料（ｇｅｌｌｏａｄｉｎｇ
ｄｙｅ）に混合した。次にアガロース電気泳動によって、この溶液５μＬを分
析した。２６０ｎｍでの吸光度として報告される結果は次のようであった。

【００６７】

【表５】

【００６８】電気泳動結果：４００ｍＭのリン酸チャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）では、
チャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）は全て付着し、濾液中には何も見られなかっ
た。膜をＰＬＵＲＯＮＩＣ界面活性剤で溶出すると、ほぼ半分のプラスミドが回
収されたが、溶出プラスミドＤＮＡの純度は、チャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ
）中とほぼ同じであった。１０ｍＭ緩衝液中でチャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ
）すると、溶出液は、プラスミドを汚染していたより低分子量のバンドを含んだ
。溶出液は、今度は精製されたプラスミドを含有した。

【００６９】実施例６ポリプロピレンＴＩＰＳ膜へのＤＮＡ付着および非イオン性界面活性剤による溶
出ポリプロピレンＴＩＰＳ膜（厚さ１００μｍ、密度＝０．１５３ｇ／ｃｍ³）
から２．５４ｃｍ径の円３個を切り取って、シリンジフィルターホルダー（マサ
チューセッツ州０１５８１ウェストバラのＭＳＩＩｎｃ．）に入れ、５ｍＬの
メタノール、続いて５ｍＬの水で洗浄した。ｐＨ７．２の１００ｍＭナトリウム
リン酸緩衝液中２００μｇ／ｍＬの子ウシ胸腺ＤＮＡ溶液３ｍＬをフィルターホ
ルダー内で重ねられたフィルターに通過させて、続いてリン酸緩衝液中１０ｍｇ
／ｍＬのＰＬＵＲＯＮＩＣＦ６８非イオン性界面活性剤３ｍＬを通過させた。
２６０ｎｍでのＵＶ吸光度を使用してこれらの溶液中のＤＮＡ量を求め、結果は
次のようであった。

【００７０】

【表６】

【００７１】これらの結果からは、ＤＮＡがポリプロピレンＴＩＰＳ膜に結合し、ＰＬＵＲ
ＯＮＩＣＦ６８溶液で溶出されることが示される。

【００７２】実施例７ポリエチレンＴＩＰＳ膜へのＤＮＡ付着および非イオン性界面活性剤による溶出ポリエチレンＴＩＰＳ膜（厚さ１２０μｍ、密度＝０．１８６ｇ／ｃｍ³）か
ら２．５４ｃｍ径の円を１個切り取って、シリンジフィルターホルダーに入れた
。膜を５ｍＬのメタノール、続いて５ｍＬの水で洗浄し、５０ｍＭのＡＭＰＳＯ
緩衝液（１００ｍＭの塩化ナトリウムを含有するｐＨ９．０の（３−［（１，１
ジメチル−２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン
酸（＃Ａ７５８５、ミズーリ州６３１７８セントルイスのＳｉｇｍａＣｈｅｍ
ｉｃａｌＣｏ）緩衝液）中１７μｇ／ｍＬの子ウシ胸腺ＤＮＡ、３ｍＬでチャ
レンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）した。次にフィルターを同一緩衝液中５ｍｇ／ｍ
ＬのＰＬＵＲＯＮＩＣＦ６８、３ｍＬで溶出した。２６０ｎｍでのＵＶ吸光度
を使用してこれらの溶液中のＤＮＡ濃度を求た。

【００７３】

【表７】

【００７４】これらの結果からは、ポリエチレンフィルターがＤＮＡに結合してＰＬＵＲＯ
ＮＩＣＦ６８で溶出できることが示された。

【００７５】実施例８ポリプロピレン膜にＤＮＡが付着するのを防止するための非イオン洗剤の使用この実験では、ポリプロピレンＴＩＰＳ膜を非イオン洗剤で洗浄し、続いて非
イオン洗剤がその中に溶解する同一緩衝液を使用して２回目の洗浄を行った。も
たらされた処理は、核酸が表面に付着するのを効果的にブロックした。２．５４
ｃｍ径のポリプロピレンＴＩＰＳ膜の円をフィルターホルダーに入れて、５ｍＬ
のメタノール、続いて５ｍＬの水、５ｍＬの１００ｍＭ塩化ナトリウム添加ＡＭ
ＰＳＯ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ９．０）中１０ｍｇ／ｍＬのＰＬＵＲＯＮＩＣ
Ｆ６８、そして最後に５ｍＬの塩化ナトリウム添加ＡＭＰＳＯ緩衝液で洗浄した
。次にそれを塩化ナトリウム添加ＡＭＰＳＯ緩衝液中１５μｇ／ｍＬの子ウシ胸
腺ＤＮＡサンプル３ｍＬで２回チャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）した。２６０
ｎｍでのＵＶ吸光度を使用してＤＮＡ濃度を求めた。

【００７６】

【表８】

【００７７】フィルターを通過する第１のサンプルは、フィルターホルダー中の残留洗浄溶
液によるいくらかの希釈のために、チャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）溶液より
も低い吸光度を有した。第２のサンプルは、チャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）
とほぼ同量のＤＮＡを有した。緩衝液がｐＨ６．０の２０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（
２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸）（＃Ｍ５２８７、ミズーリ州６３１
７８セントルイスのＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ）であったこと以外は
、同一条件を使用してこの実験を繰り返した。結果は実質的に同じだった。これ
らの結果からは、ＰＬＵＲＯＮＩＣＦ６８などの非イオン洗剤が、核酸がそれ
に結合しないようにポリマー表面を不活性化できることが示される。この不活性
化は、非イオン性界面活性剤の溶剤である緩衝液でポリマー表面が洗浄された後
でさえ、持ちこたえる。

【００７８】実施例９ＴＩＰＳ膜へのＲＮＡ付着３個の１インチ径ポリプロピレンＴＩＰＳ膜をフィルターホルダー内に重ねて
、５ｍＬのメタノール、続いて５ｍＬの蒸留水、続いてｐＨ６．０の５０ｍＭ
ＭＥＳ緩衝液５ｍＬで洗浄した。同一ＭＥＳ緩衝液中の５０μＭ／ｍＬリボ核酸
（Ｓｉｇｍａ）２ｍＬをフィルターの重なりに通過させた。次に重なりを２ｍＬ
のＭＥＳ緩衝液で洗浄し、次にＭＥＳ緩衝液中０．５％のＰＬＵＲＯＮＩＣＦ
６８、２ｍＬで溶出した。２６０ｎｍでのＵＶ吸光度によって、これら各段階の
ＲＮＡ量をモニターした。

【００７９】

【表９】

【００８０】ＲＮＡはＴＩＰＳ膜に完全に付着し、緩衝液単独による脱着に抵抗性であった
が、ＰＬＵＲＯＮＩＣＦ６８非イオン性界面活性剤によって、半分以上が溶出
した。

【００８１】実施例１０小さなＤＮＡオリゴマーの付着および溶出以下の実験では、疎水性ポリプロピレンＴＩＰＳ膜をＤＮＡの非常に小さなオ
リゴマーでチャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）し、次に非イオン性界面活性剤で
洗浄して溶出した。ＤＮＡオリゴマーは融解温度６５．８℃の一本鎖ＤＮＡの２
２量体であり、テキサス州７７３８０ウッドランズのＧｅｎｏｓｙｓＢｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から購入した。それをここではＯｌｉｇｏ２
２と称する。３個の２５ｍｍ径ポリプロピレンＴＩＰＳ膜をシリンジフィルター
ホルダー内に重ねて５ｍＬのメタノール、続いて５ｍＬの水、そしてｐＨ６．０
の５０ｍＭＭＥＳ緩衝液５ｍＬで洗浄した。次にフィルターの重なりをＭＥＳ
緩衝液中３８μｇ／ｍＬのＯｌｉｇｏ２２溶液２ｍＬでチャレンジ（ｃｈａｌｌ
ｅｎｇｅ）した。濾液を収集して、重なりを２ｍＬのＭＥＳ緩衝液、続いてＭＥ
Ｓ緩衝液中のＰＬＵＲＯＮＩＣＦ６８非イオン性界面活性剤２ｍＬで洗浄した
。チャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）濾液および洗浄中のＯｌｉｇｏ２２レベル
を２６０ｎｍでのＵＶ吸光度によってモニターした。

【００８２】

【表１０】

【００８３】結果からは、小さなオリゴマーが効果的にポリプロピレンＴＩＰＳ膜に付着し
て、非イオン性界面活性剤によって溶出することが示された。

【００８４】実施例１１ポリプロピレンＴＩＰＳ膜へのＲＮＡの結合およびＴＷＥＥＮ６０非イオン性界
面活性剤による溶出３個の１インチ径ポリプロピレンＴＩＰＳ膜をフィルターホルダー内で重ねて
、５ｍＬのメタノール、続いて５ｍＬの蒸留水、続いてｐＨ６．０の５０ｍＭ
ＭＥＳ緩衝液５ｍＬで洗浄した。次に同一ＭＥＳ緩衝液中の５０μＭ／ｍＬリボ
核酸（Ｓｉｇｍａ＃Ｒ７１２５）２ｍＬをフィルターの重なりに通過させた。次
に重なりを２ｍＬのＭＥＳ緩衝液で洗浄し、次にＭＥＳ緩衝液中のモノステアリ
ン酸ポリオキシエチレンソルビタン（Ｔｗｅｅｎ６０、＃Ｐ１６２９、ミズー
リ州６３１７８セントルイスのＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．）２ｍＬ
で溶出した。これらの各段階のＲＮＡ量を２６０ｎｍでのＵＶ吸光度によってモ
ニターした。結果は次のようであった。

【００８５】

【表１１】

【００８６】ＲＮＡはＴＩＰＳ膜に完全に吸着され、緩衝液単独による脱着に抵抗性であっ
たが、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン非イオン性界面活性剤に
よって、半分以上が溶出した。

【００８７】比較例１親水性膜からのＲＮＡ付着および溶出以下の実験からは、親水性の膜が核酸に結合しないため、この核酸抽出技術に
使用できないことが示される。

【００８８】２５ｍｍのＭＳＩ酢酸セルロース膜（ＭＳＩ，マサチューセッツ州０１５８１
ウェストバロ）３個をシリンジフィルターホルダーに入れて、５ｍＬの水、続い
てｐＨ９．０の５０ｍＭＡＭＰＳＯ緩衝液５ｍＬで洗浄した。次にフィルター
の重なりを２ｍＬの５０μｇ／ｍＬＲＮＡ（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏ、ミズーリ州６３１７８セントルイス）でチャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ
）し、次に２ｍＬのＡＭＰＳＯ緩衝液、続いてＡＭＰＳＯ緩衝液中の０．５％Ｐ
ＬＵＲＯＮＩＣＦ６８、２ｍＬで洗浄した。２６０ｎｍでのＵＶ吸光度によっ
て、これらの各溶出液のＲＮＡ量をモニターした。ｐＨ６．０の５０ｍＭＭＥ
Ｓ緩衝液を使用し、双方のｐＨでセルロースフィルター（ＯｓｍｏｎｉｃｓＩ
ｎｃ．）を使用して、この実験を繰り返した。

【００８９】１００μｇのＲＮＡチャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）では、７３μｇが濾液
中にあり、残り（２７μｇ）は最初の緩衝液洗浄中にあった。ＰＬＵＲＯＮＩＣ
Ｆ６８洗浄液中にはＲＮＡは見られなかった。ｐＨ９．０およびセルロースフ
ィルターで、同様の結果が得られた。これらの結果からは、核酸がこれらの親水
性膜に吸着されないことが示される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 2G045 AA40 BA13 BB03 CA25 CA26 CB01 CB03 DA12 DA13 DA14 4B024 AA20 CA01 HA19 4B063 QA01 QQ42 QS14 4C057 BB02 DD01 MM02 MM04

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】標的核酸を含むサンプルを疎水性有機ポリマー固相に導入し
て、標的核酸の少なくとも一部を固相に付着するステップと、非イオン性界面活性剤を固相に適用して、付着した標的核酸の少なくとも一部
を除去するステップと、を含むサンプルから核酸を単離する方法。
【請求項２】サンプルが生物学的サンプルを含む、請求項１に記載の方法
。
【請求項３】生物学的サンプルが細胞を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】生物学的サンプルを導入するのに先立って、細胞を溶解して
細胞内容物を核酸を含む溶解産物として放出するステップを含む、請求項３に記
載の方法。
【請求項５】生物学的サンプルが、全血、血清、尿、唾液、組織、または
細胞培養物を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】細胞が、哺乳類、細菌細胞、酵母細胞、または植物細胞であ
る、請求項３に記載の方法。
【請求項７】標的核酸がＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】ＤＮＡが一本鎖ＤＮＡを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】標的核酸がＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】標的核酸がＰＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】標的核酸がプラスミドＤＮＡを含む、請求項１に記載の方
法。
【請求項１３】添加された塩を含む結合緩衝液を疎水性有機ポリマー固相
に導入して、核酸を固相に付着させるのを助けるステップをさらに含む、請求項
１に記載の方法。
【請求項１４】核酸を含むサンプルを導入するのに先立って、結合緩衝液
が導入される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】付着した標的核酸を有する固相を洗浄して、サンプルの非
核酸成分を除去するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】洗浄が、添加された塩を含む洗浄緩衝液によって洗浄する
ステップを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】疎水性有機ポリマー固相がポリオレフィンを含む、請求項
１に記載の方法。
【請求項１８】ポリオレフィンがポリプロピレンを含む、請求項１７に記
載の方法。
【請求項１９】ポリオレフィンがポリエチレンを含む、請求項１７に記載
の方法。
【請求項２０】疎水性有機ポリマー固相がフッ素化されたポリマーを含む
、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】フッ素化されたポリマーがポリテトラフルオロエチレンを
含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン界面活性剤
の群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン−コ−オキ
シプロピレン界面活性剤の群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】核酸がサンプルから実質的に精製された形態で収集される
、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】疎水性有機ポリマー固相が多孔性マトリックスの形態であ
る、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】固相の表面積が、グラム当たり少なくとも約１平方メート
ルである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】二本鎖ＤＮＡを含むサンプルを疎水性有機ポリマー固相に
導入して、二本鎖ＤＮＡの少なくとも一部を固相に付着するステップと、付着した二本鎖ＤＮＡを有する固相を洗浄して、サンプルの非二本鎖ＤＮＡ成
分を除去するステップと、非イオン性界面活性剤を固相に適用して、付着した二本鎖ＤＮＡの少なくとも
一部を除去するステップと、を含むサンプルから二本鎖ＤＮＡを単離する方法。
【請求項２８】洗浄が、添加された塩を含む洗浄緩衝液で洗浄するステッ
プを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】非イオン性界面活性剤を疎水性有機ポリマー表面に適用す
るステップと、表面を溶剤で洗浄するステップと、核酸を含むサンプルを表面に
接触させるステップと、を含む、疎水性有機ポリマー表面に付着する核酸の量を
減少させる方法。
【請求項３０】ポリマー表面が水で洗浄される、請求項２９に記載の方法
。
【請求項３１】核酸が付着する疎水性有機ポリマー固相、および核酸の少
なくとも一部を固相から除去できる非イオン性界面活性剤を含むキット。
【請求項３２】通過レセプタクルをさらに含む、請求項３１に記載のキッ
ト。