JP2003516125A

JP2003516125A - Ｄｎａ単離方法

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Publication number: JP2003516125A
Application number: JP2001533977A
Authority: JP
Inventors: ナイジェル・エリック・トゥック; フィリップ・ランデグ・トーマス; マイケル・ケネス・ケンリック
Original assignee: ユィロス・アクチボラグ
Priority date: 1999-10-28
Filing date: 2000-10-20
Publication date: 2003-05-13
Also published as: US6852851B1; WO2001030995A1; GB2355717A; GB9925468D0; US6992181B2; AU7935300A; EP1224278A1; US20050019819A1

Abstract

(57)【要約】ＣＤ機器中において細胞からＤＮＡ若しくは細胞核、あるいはその混合物を単離するための装置及び方法を開示する。該方法は、細胞質膜及び少なくとも核膜の一部を溶解するように全細胞の懸濁液を溶解剤で処理し、その溶解物を、各マイクロチャネルにチャネル中でＤＮＡからなるメッシュが形成されるようマイクロチャネルを通じて液体を通過させながらＤＮＡ及び細胞核の通過あるいは流動を妨げるバリアをチャネル内に配置して提供している、微細工法装置のマイクロチャネル中に導入することを含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、例えばＤＮＡ探索、増幅、配列決定などの更なる分析に先立つ、微
細工法装置（microfabricated apparatus）、特にはＣＤ機器における細胞試料
、特には哺乳類の血液からのＤＮＡの単離に関する。

【０００２】血液を含む種々の細胞源から、迅速にかつ簡便にＤＮＡを単離する必要がある
。ＤＮＡの確保は、配列決定及びハイブリダイゼーション技術の応用を通じて、
多数の生物体中のゲノムの分析及び特徴付けに大いに役立ってきた。ＤＮＡ単離
及び精製のための従来の手法は、フェノール／クロロホルムを含む多段階の工程
に基づいている（例えば、Sambrook, J 他、Molecular Cloning：A Laboratory,
Manual. 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989参照）。
これらの工程は、本来的に煩雑であり、結局ダメージをうけたＤＮＡ試料を得る
ことに帰することもあり得るし、また一般的には自動化するのは難しい。無害な
抽出方法が幾つか報告されてはいる（Nucleic Acids Research, 15, 859, 1897
；Analytical Biochemistry, 120, 282-288 1982）が、これらの手法は、大規模
な透析、あるいはフィルターの使用が必要とされる。改良抽出方法では、カオト
ロピック剤（Bio Techniques, 22, 550-553, 1997）を使用するものもある。他
には、特定の細胞型に適用可能であって、溶解、希釈、ＰＣＲ管への添加だけで
済むものもある（Bio Techniques, 11, 30-31, 1991）。

【０００３】米国特許第5650506号（Becton Dickinson）は、ＤＮＡを含有する懸濁液から
ＤＮＡが結合し、その膜からＤＮＡの溶出が可能である十分な親水性及び電気陽
性度を呈する変性ガラス繊維膜に関する。該変性ガラス繊維膜は、他の細胞成分
からのＤＮＡの単離に有益である。ガラス繊維上での血液からＤＮＡの単離に関
して、有益な製品もある（ＧＦＸ（登録商標）Genomic Blood DNA Purification
Kit, Amersham Pharmacia Biotech）。

【０００４】米国特許第5705628号及び5898071号は、ポリヌクレオチドを含有する溶液から
当該ポリヌクレオチドを磁性微粒子のような固体表面に可逆的にかつ非特異的に
結合させることにより、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びＰＮＡといったポリヌクレオチド
を分離する方法を開示する。Dynal A/S、ノルウェーにより市販されている製品
「Dynabeads DNA Sirect」において同様の手法が利用されてきた。

【０００５】米国特許第5447864号は、一端が開口しており、その先方端に渡ってひろがる
膜を有するピペットチップ機器を用いて細胞から核を分離する方法を開示してい
る。本方法は、細胞核の大部分を無傷で残しながら、核膜の一部と一緒に細胞質
膜を選択的に溶解するよう全細胞を含有する液体を処理することを包含する。処
理液を該膜にのせ、それによりその表面上に溶解核からのＤＮＡのメッシュが形
成され無傷の細胞核が捕捉される。細胞の他の成分から捕捉された細胞核を分離
するために、次いでその表面上のＤＮＡからなるメッシュを洗浄する。当該方法
で使用される機器もまた記載されており、当該機器は、その先方端全体を覆う膜
を有するピペットチップからなる。

【０００６】微細構造機器でＤＮＡを単離する方法は、時間がかかり、遠心分離、ピペッテ
ィング、ボルテクス（vortexing）あるいは加熱インキュベーション工程がしば
しば必要とされる従来技術の実質的な簡易化が要求されている。全血からＤＮＡ
を精製する１つの方法では、直接ＰＣＲ（Nucleic Acids Reseach, 24, 380〜38
5, 1996）に先立って白血球細胞を単離するので、ＰＣＲの主要な阻害物質、す
なわちヘモグロビンは除去されている。別の方法（Science, 282, 399〜401, 19
98）は細胞を溶解させる食塩水と血液を混同することを包含する。次いで溶解物
を、電荷相互作用によりＤＮＡが結合するガラス壁を有するチャンバー中に導入
し、残りの試料は排出する。ＤＮＡはエタノール／水混合物で洗浄した後、隣接
するチャンバーへ溶出する。

【０００７】国際出願ＷＯ97／21090は、微量分析的及び微量合成的工程を実施するための
方法及び装置に関する。本発明は、試料流入ポート、液体マイクロチャネル、反
応チャンバー、及び流出ポートを含む回転可能なディスクからなる装置を提供す
る。該装置内での例えば試薬、試料、及び他の液体成分といった液体の移動は、
ディスクに埋め込まれたマイクロチャネルを通じてディスクの回転により生じる
液体の求心加速度により促進される。ＤＮＡ合成、微量抽出、及び細胞カウント
を含む広汎な工程を実施するための本発明の装置に特異的な方法が提供される。

【０００８】シリコン流動性のマイクロチップを用いてラムダバクテリオファージの検定試
料から短い（５００ｂｐ）及び中程度の（４８００ｂｐ）ＤＮＡの抽出及び濃縮
をする方法は、J. Biomechanical Engineering, 121, 23〜27（1999）に開示さ
れている。この工程により得られた核酸を分析するためにＰＣＲ及びゲル電気泳
動を利用した。

【０００９】上述のＤＮＡ単離工程の多段特性は、処理量を制限する。更には、当該工程は
容易には自動化できない。試料調製は、ゲノムＤＮＡの投入が必要とされ、一貫
して工程における律速段階であることが示されている。本発明は、複数の細胞試
料を並行して処理させることが可能な様式におけるＤＮＡの単離に関する。ＤＮ
Ａ単離の従来法に係る複雑で連続的な抽出工程が、各ウェルが試料を添加したり
除去したりするために別々にアクセスされなければならないマルチチャネル及び
マイクロウェルピペッティング工程とは対照的に、ミクロ流体工学を利用して並
行して途切れなく実施される。

【００１０】従って、本発明は、複数のマイクロチャネルを含む微細工法装置においてＤＮ
Ａ及び／あるいは細胞核を単離する方法を提供し、当該方法は、ＤＮＡ及び／あ
るいは細胞核に対するバリア（barrier）として作用する１つあるいはそれ以上
のマイクロチャネル中にメッシュを形成することを包含する。好ましくは、前記微細工法装置の１つあるいはそれ以上のマイクロチャネルに
おいて形成されるメッシュが核酸のメッシュを包含する。

【００１１】本発明の１つの態様において、細胞からＤＮＡ若しくは細胞核、あるいはその
混合物を単離する方法を提供し、当該方法は：ａ）細胞質膜及び少なくとも核膜の一部を溶解するように全細胞の懸濁液を溶解
剤で処理し；ｂ）工程ａ）からの溶解物を、微細工法装置のマイクロチャネルであって、当該
各マイクロチャネルが、マイクロチャネルを通じて液体を通過させながらＤＮＡ
及び細胞核の通過あるいは流動を妨げるための手段を組み込むことによりＤＮＡ
からなるメッシュをチャネル内に形成するマイクロチャネル中に導入し；そしてｃ）該ＤＮＡからなるメッシュを洗浄することを包含する。細胞核を単離することを所望する場合、工程ａ）が、一定量の核膜が無傷なま
まであるのに適切なように実施されなければならない。

【００１２】本発明の別の態様において、細胞からＤＮＡ若しくは細胞核、あるいはその混
合物を単離するための微細工法装置を提供し、その装置は回転可能なディスクを
含み、そのディスクは、環状の試料リザーバ−と連絡してディスクの中心に向っ
て配置し、次いでそのリザーバーが放射状に配列した複数のマイクロチャネルと
連結される試料導入ポートを含み、各マイクロチャネルは、ディスクの周縁部に
向って配置される入口チャネル及び出口チャネル、そしてマイクロチャネルを通
じて液体を通過させながらＤＮＡ及び細胞核の通過あるいは流動を妨げるために
各マイクロチャネルに組み込まれた手段を含む。ＤＮＡ及び細胞核の通過あるいは流動を妨げるために各マイクロチャネルに組
み込まれた手段がバリアを包含するのが適切である。

【００１３】本発明の１つの好ましい実施の形態においては、該バリアが、液体を通過させ
ながらＤＮＡ及び細胞核の流動あるいは通過を妨げるビーズからなる。本発明に
係る第２の実施の形態において、該バリアはマイクロチャネル内に配置された隆
起構造からなる。該隆起構造は、例えば支柱（pillar）を形成するよう成形され
ているのが好ましい。本発明の特に好ましい実施の形態においては、該隆起構造
がマイクロチャネルの底面部に配置され、液体を通過させながらＤＮＡ及び細胞
核の流動あるいは通過を妨げるような支柱を形成するよう成形されている。

【００１４】本発明の方法は、核を有する適当な細胞源、例えば植物細胞及び動物細胞から
、ＤＮＡ及び細胞核を単離するのに利用され得る。本発明は、特には哺乳類の細
胞ＤＮＡ、更にいえば、全血からのＤＮＡの単離に適している。適切には、本方
法の工程ａ）が、細胞溶解物を微細工法装置のマイクロチャネル中へ導入するの
に前もって、別々の容器中で実施されてもよい。別法としては、工程ａ）が、該
溶解物を該装置のマイクロチャネル中へ導入するのに前もって、例えば環状の試
料リザーバ−内部にある全細胞懸濁液を溶解剤で処理することにより、微細工法
装置内で実施されてもよい。

【００１５】本発明の方法において用いられるビーズは、任意の適切な組成、例えばプラス
チック材であってもよい。適切なプラスチックは、ポリマー中の架橋の程度次第
で多孔質であってもなくてもよく、そのようなプラスチックとしては、ポリスチ
レン、スチレンアクリレートコポリマー、ジビニルベンゼンで架橋したポリスチ
レン、ポリビニルトルエン、ポリメタクリレート、及びポリカーボネートが挙げ
られる。別の材料としては、ポリサッカライド（例えばデキストラン）、金属酸
化物（例えばアルミニウム酸化物）、ガラス、及びカーボンが挙げられる。更に
、該ビーズの表面を、表面がＤＮＡにより更に結合されやすくさせるために化学
的及び物理的手段により、例えば陽性電荷種で誘導することにより処理したり活
性化したりしてもよい。

【００１６】微細工法装置のマイクロチャネルの少なくとも幾つかは、それぞれアッセイを
実施したりＤＮＡをプロセシングしたりするための反応チャンバーを更に包含し
、直列でバリアの下流部に連結しているのが好ましい。

【００１７】本発明を更によく理解されるように、実施例を例示だけの目的で、そして添付
する図面を参照して以下に記載する：図１は、ＤＮＡ単離を実施するための微細組立てディスクの平面図であり；図２ａは、ＤＮＡ単離のためのマイクロビーズを含有する微細工法装置の個々の
マイクロチャネル要素の平面図における略図であり；図２ｂは、マイクロチャネルが支柱を形成するためにマイクロチャネルの底面部
上に配置された隆起構造を提供する微細工法装置の個々のマイクロチャネル要素
の平面図における略図であり；図２ｃは、マイクロチャネル中に形成されたチャンバー内部にマイクロビーズが
含有されている微細工法装置の個々のマイクロチャネル要素の平面図における略
図であり；図２ｄは、マイクロチャネル中に形成されたチャンバー内部に隆起構造がが配置
した微細工法装置の個々のマイクロチャネル要素の平面図における略図であり；
図３は、本発明の方法に従ってビーズにより捕捉し、エピ蛍光顕微鏡を用いてPi
coGreen染色液により視覚化した、抗凝結剤としてＥＤＴＡを混ぜたヒトの全血
からのＤＮＡを示す画像であり；そして図４は、本方法に従ってＰＢＳ緩衝液をマイクロチャネルに通したコントロール
試料からの画像である。

【００１８】本発明は、ディスクの中央部に向って配置し、環状の試料リザーバー（２）に
連結する試料導入ポート（図示せず）を提供し、次いでそのリザーバーが放射状
に配列した複数のマイクロチャネル（３）と連結するように微細細工された回転
可能なディスク（１）からなる微細工法装置（図１に示す）を用いて、細胞から
ＤＮＡを単離する方法を提供する。各マイクロチャネル（３）は、液体及び／あ
るいは試料を除去するためにディスクの周縁部に向って配置する試料入口チャネ
ル（４）及び出口チャネル（５）を含む。閉鎖したチャンバーと連結するチャネ
ルを特定するためにカバープレート（図示せず）をディスク上に置いている。各
マイクロチャネルは、一方の末端で環状の試料リザーバーに、反対側の末端にで
共通の廃液チャネルに連結している。

【００１９】適切にはディスク（１）が、一体型又は合わせ型の成形構造であり、任意で透
過性プラスチック又はポリマー材料から分離成形し、装置を液体で充填させ液体
試料を除去させるために閉鎖構造で特定の位置に開口部を提供するよう組み立て
ることにより形成される。適切には、プラスチック又はポリマー材料が、疎水性
を有するように選択され得る。好ましいプラスチック又はポリマー材料は、ポリ
スチレンあるいはポリカーボネートから選択される。別法としては、マイクロチ
ャネルの表面を、所望の特性を与えるようマイクロチャネルの内部に親水性又は
疎水性の局在領域を作るために、該表面の特性を変えるための化学的又は物理的
手段を用いて付加的に選択的に変更してもよい。好ましいプラスチックは、荷電
された表面をもつポリマ−、適切には、化学的に若しくはイオンプラズマで処理
されたポリスチレン、ポリカーボネート、あるいは他の硬質透明ポリマーから選
択される。

【００２０】最も簡単な形態において、装置は２つの相補性パーツとして作成され、１パー
ツがあるいはそれぞれが貼り合わせるときに固体ディスク本体の内部で中心部か
ら放射上に配置させて複数のマイクロチャネルを形成する成形構造を搭載する。
別法としては、マイクロチャネルがディスクの表面中に微細細工される微細加工
方法により形成され、チャネルを閉鎖するために例えばプラスチック膜であるカ
バープレートをその表面に接着してもよい。

【００２１】微細加工装置の個々のマイクロチャネル（３）が図２ａ〜２ｄに示されている
。１つの好ましい態様（図２ａに示す）においては、各マイクロチャネル（１０
）が左側末端でリザーバー（２）に連結する、チャネル（１２）を通じて反応チ
ャンバー（１５）まで延びる試料入口チャネル（１１）、及び右側末端で廃棄チ
ャネル（６）に連結する出口チャネル（１３）からなる。各マイクロチャネルは
反応チャンバー（１５）の上流にマイクロビーズ（１４）の層あるいは「プラグ
」を含み、マイクロチャネルの階段壁あるいは境界面（interface）（１６）に
より適所に維持されている。このビーズの「プラグ」は、液体を通過させながら
マイクロチャネルを通過するＤＮＡ及び細胞核を捕捉する役割を果たす。好都合
には、境界面（１６）の上流のチャネル（１１）は、境界面（１６）の下流のチ
ャネル（１２）よりも大きい断面積を有することにより特徴付けられる。適切に
は界面（１６）の下流のチャネル（１２）の断面積が、界面（１６）の上流のチ
ャネルの断面積の０.９９〜０.０１倍であり、マイクロビーズを通過させない寸
法であるのが適切であり、マイクロビースは、チャネルの上流と下流との間の境
界面で「プラグ」を形成する。

【００２２】本発明の第２の好ましい態様（図２ｂに示す）においては、各マイクロチャネ
ル（２０）が左側末端でリザーバー（２）に連結する、チャネル（１２）を通じ
て反応チャンバー（２３）まで延びる試料入口チャネル（２１）、及び右側末端
で廃棄チャネル（６）に連結する出口チャネル（２２）からなる。反応チャンバ
ー（２３）の上流のチャネル（２１）には、マイクロチャネルの底面部上に配置
された隆起構造が提供される。その隆起構造は、支柱を形成するように成形され
ており、液体を通過させながらその支柱に達するＤＮＡ及び細胞核の流動あるい
は通過に対するバリアを形成する。

【００２３】本発明の別の好ましい態様（図２ｃに示す）においては、各マイクロチャネル
（３０）が左側末端でリザーバー（２）に連結する入口チャネル（３１）、本発
明の方法を実施するのに使用する複数のマイクロビース（３５）を含み、チャネ
ル（３２）を通じて反応チャンバー（３６）まで延びるチャンバー（３４）、及
び共通の廃棄チャネル（６）に連結する出口チャネル（３３）からなる。好都合
には、チャンバー（３４）を反応チャンバー（３６）と連結させるチャネル（３
２）が、チャンバー（３４）の上流のチャネル（３１）の０.９９〜０.０１倍の
断面積であり、マイクロビーズを通過させない寸法であって、それによりチャン
バー内に集められてビーズの「プラグ」となっていることにより特徴付けられる
。

【００２４】本発明の更なる好ましい態様（図２ｄに示す）においては、各マイクロチャネ
ル（４０）が左側末端でリザーバー（２）に連結する入口チャネル（４１）、チ
ャネル（４２）を通じて反応チャンバー（４６）まで延びるチャンバー（４４）
、及び共通の廃棄チャネル（６）に連結する出口チャネル（４３）からなる。チ
ャンバー（４４）には、チャンバーの底面部上に配置された隆起構造が提供され
てもよい。その隆起構造は、支柱（４５）を形成するように成形されており、液
体を通過させながらその支柱に達するＤＮＡ及び細胞核の流動あるいは通過に対
するバリアを形成する。

【００２５】適切には、チャンバー（３４、４４）は、１００μｍ^２から４,０００,０００
μｍ^２の範囲、好ましくは１０００μｍ^２から１,０００,０００μｍ^２の範囲、
及び更に好ましくは１０,０００μｍ^２から１,０００,０００μｍ^２の範囲の床
面積となる大きさである。

【００２６】マイクロチャネルは細胞核の動きに適合する寸法であるのが適切である。適切
には、マイクロチャネルは、任意の断面形状、例えば四角形、長方形、円形、台
形、及び三角形であってもよく、典型的には２０〜３０μｍあるいはそれ以上の
大きさの寸法である。適切には２５０μｍ幅のマイクロチャネルが使用されても
よい。

【００２７】好ましくは２ａ〜２ｄに示されるように、各マイクロチャネルには、ＤＮＡの
マニピュレーションのために、あるいは本発明の方法により単離されたＤＮＡを
用いるアッセイを実施するために、直列でバリアの下流に連結した反応チャンバ
ー（１５、２３、３６、４６）が提供される。該反応チャンバーは、チャンバー
（３４、４４）の体積の２倍から１０分の１であるのが適切である。典型的には
、本発明の方法により調製されたＤＮＡのアッセイを実施したりマニピュレーシ
ョンを行うための反応物の適切な体積は１０ｎｌから１μｌの範囲である。適切
には、出口チャネル（１３、２２、３３、４３）は、反応チャンバー（１５、２
３、３６、４６）の上流のチャネル（１２、２０、３２、４２）の０.９９から
０.０１倍の範囲の断面積を有することにより特徴付けられる。

【００２８】マイクロチャネル（２４）又はチャンバー（４５）中に形成される隆起構造（
支柱）は、液体を通過させながら機器中に懸濁液体として運ばれた細胞核を通過
させないぐらい狭い構造間の間隙を提供するように選択された寸法からなる。マ
イクロチャネル（２４）又はチャンバー（４５）中に形成される隆起した支柱の
間の間隙の適切な寸法は５μｍから５０μｍの範囲であり、捕捉するよう選択さ
れた細胞核の型及び大きさによる。

【００２９】本発明の方法において用いられるビーズは、任意の適切な組成、例えばプラス
チック材であってもよい。適切なプラスチックは、ポリマー中の架橋の程度次第
で多孔質であってもなくてもよく、そのようなプラスチックとしては、ポリスチ
レン、スチレンアクリレートコポリマー、ジビニルベンゼンで架橋したポリスチ
レン、ポリビニルトルエン、ポリメタクリレート、及びポリカーボネートが挙げ
られる。別の材料としては、ポリサッカライド（例えばデキストラン）、金属酸
化物（例えばアルミニウム酸化物）、ガラス、及びカーボンが挙げられる。ビー
ズの表面は、ＤＮＡが例えば疎水結合、荷電相互作用、あるいは物理的吸着によ
り結合可能である材料からなるのが好ましい。ビーズの荷電された表面は静電相
互作用を好み得るし、一方荷電されていないポリマー表面は疎水結合が促進され
得る。それ故、ビーズの表面を、ＤＮＡの結合能を改善するために化学的及び物
理的手段により、処理したり活性化したりしてもよい。例えば、ＤＮＡによりビ
ーズの表面により結合しやすくさせるために、ビーズの表面を当業者には周知で
あるような陽性荷電した化学基で誘導したり修飾したりしてもよい。結合は、ビ
ーズ表面への付加的なコ−ティング、例えばポリリジンの使用により更に改善さ
れ得る。ＤＮＡの捕捉に適切なビーズの大きさは、５μｍから１００μｍ、好ま
しくは１５μｍから５０μｍの範囲が適切である。

【００３０】細胞の性質及び細胞源は本発明には決定的ではない。すなわち、植物細胞及び
動物細胞を含む任意の細胞源からの核をもつ細胞が使用され得る。本発明は全血
液を含む哺乳類の細胞からの細胞核及びＤＮＡの単離に特に有益である。細胞か
ら細胞核を単離する方法の第一工程は、核膜の一部と共に細胞全体の細胞膜を選
択的に溶解させることである。本発明のこの工程は、適切な容器中で実施されて
もよく、細胞溶解物は微細工法装置の環状の試料リザーバ−へ搬送される。別法
としては、細胞懸濁液を試料リザーバ−中に導入し、次に本方法に従って細胞質
膜と少量の核膜を溶解するように溶解緩衝液を添加してもよい。本発明の方法に
よる細胞溶解のプロトコールは、米国特許第5447864号に開示されている。例え
ば、１０ｍＭ Tris、ｐＨ８.０、３２０ｍＭスクロース、及び１％ Triton X−
100を含有する溶解緩衝液を、室温で５分間細胞をインキュベートすることによ
り赤血球及び白血球膜、及び少量の核膜を溶解するのに使用してもよい。本発明
の方法に適切な別の溶解緩衝液としては、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の
ような陰イオン界面活性剤がある。

【００３１】上述により得られた細胞溶解混合物を、微細工法装置（１）の各マイクロチャ
ネルの入口チャネル中に導入し、ディスクを適切な手段、及び回転力（centripe
tal force）によりディスクの周縁部に向って細胞溶解物の外側へ、そしてディ
スクのマイクロチャネル中に形成されたビーズあるいは支柱のバリアに向って各
入口チャネル（４）に沿って移動させるのに十分なスピードで回転させる。この
ようにして、ディスクの回転により、細胞溶解物がマイクロチャネル中に配置し
たバリアに向って流され、更にＤＮＡ、あるいは細胞核の捕捉のためのＤＮＡか
らなるメッシュが形成される。別法としては、細胞溶解物を固定したディスクの
疎水性表面上に不連続な液滴として加えられ、ディスクの回転は、バリアでＤＮ
Ａ及び細胞核の捕捉するために適したマイクロチャネル中にその混合物を移動す
るために利用する。次に捕捉したＤＮＡメッシュを、マイクロチャネル中に形成
されたメッシュに洗浄溶液を通すことにより洗浄する。洗浄溶液を、各マイクロ
チャネルの入口チャネルを介して微細工法装置中に導入し、ディスクは、マイク
ロチャネルに沿って、そして中に捕捉されたＤＮＡメッシュに洗浄液を通すため
に回転させる。

【００３２】捕捉されたＤＮＡ及び細胞核に存在する夾雑物を除去する洗浄工程に続いて、
溶解剤を含有する溶液を各マイクロチャネルに通すことにより、ＤＮＡを遊離す
るためにメッシュにより捕捉された細胞核を更に処理する。溶解剤は、核膜を破
壊可能なものである。例えば、リン酸緩衝化生理食塩水中に０.５％（w/v）ドデ
シル硫酸ナトリウム及びプロテイナーゼＫ（２５０μｇ/ｍｌ）を含有する試薬
を使用してもよい。別法としては、ＤＮＡメッシュ中に捕捉された細胞核の核膜
を、８０℃から９５℃の範囲の温度で１〜３０分間ディスクを加熱することによ
り破壊してもよい。

【００３３】遊離に続いて、核ＤＮＡを、洗浄によりバリアから除去してもよい。本発明の
方法により獲得したＤＮＡのプロセシングは、メッシュ上で実施してもよいし、
あるいはＤＮＡを回転力によって微細工法装置の周縁部に向って移動させてから
続いてプロセシングしてもよい。この場合、微細工法装置の個々のマイクロチャ
ネルには、ディスクの周縁部近くに配置され、バリア手段と出口チャネルとの間
のマイクロチャネル中に直列に連結される反応チャンバーが提供されてもよい。
反応チャンバーは、反応チャンバーの上流よりも小さな径を有する狭いチャネル
により共通の廃棄チャネルに連結する。チャネルの径の差により、上述のような
回転と回転力の制御された条件下において、本発明の方法により単離されたＤＮ
Ａの試料はバリア部位から反応チャンバーまで移動し、ＤＮＡのプロセシングあ
るいは、マニピュレーションのために試薬が添加される。

【００３４】本発明の方法により単離されたＤＮＡは、ＰＣＲあるいは他の工程に適してい
る。もしＤＮＡの制限が必要であれば、メッシュ上で制限消化をin situで実施
してもよい。制限消化したＤＮＡを同様に、次のプロセシングのために適切なス
ピードでディスクを回転させることにより反応チャンバーに移動してもよい。本発明は、以下に続く実施例を参考として示すことにより更に示される。

【００３５】実施例１特定の試験においては以下の工程で行われ、液体は吸引によりマイクロチャネ
ル中に導入した：以下に示す大きさのマイクロチャネル（長さ４０００μｍｘ幅１２０μｍ、マ
イクロチャネルの長さの半分は奥行き６０μｍで、残りは奥行き１０μｍ）に１
５μｍ径の硬い単分散球状プラスチックビーズ（非誘導体化ジビニルベンゼンで
架橋したポリスチレン、ＳＯＵＲＣＥ（登録商標）プラスチック、Amersham Pha
rmacia Biotech）を充填した。これらはマイクロチャネルの奥行きのある領域と
奥行きのない領域との間の境界面にビーズの薄い層を形成した（図２ａ参照）。

【００３６】ＥＤＴＡ全血の５μｌを等量の１０ｍＭ Tris、ｐＨ８.０、３２０ｍＭスク
ロース、５ｍＭＭｇＣｌ_２、及び１％（v/v） Triton X−100を含有する溶解緩
衝液と混合し、室温で５分間インキュベートした。溶解物は、溶解緩衝液とリン
酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ、Sigma）の１：１の混合物で１０倍に希釈した。
希釈した溶解物０.４μｌは、ビーズを含むマイクロチャネルを通じて引き込ん
だ。ビーズを１μｌのＰＢＳで洗浄し、次に１μｌのＴＥ（１０ｍＭ Tris/ＨＣ
ｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７.５）中に１：２００に希釈したPicoGreen（２本
鎖ＤＮＡに特異的な蛍光染色液；Molecular Probes Inc.、USA）で洗浄し、次い
でＴＥのみ１μｌで洗浄した。

【００３７】ビーズを、ビーズ上のＤＮＡに結合したPicoGrenn染色を視覚化するために、
約４８０ｎｍの励起波長及び約５２０ｎｍの発光波長をもつエピ蛍光分光計を用
いて検定した（図３に示す）。血液をＰＢＳで置き換えたコントロールは、マイ
クロチャネルの奥行きのある区画と奥行きのない区画との間の境界面に充填され
たビーズのバックグラウンドの蛍光のみを呈して同じ経過に終わった（図４に示
す）。

【００３８】実施例２ PicoGreenで視覚化しなかったことを除いて実施例１に記載されるのと同様に
、ＤＮＡを冷凍したクエン酸血から奥行きのないビーズ床上で単離した。この場
合、多少大きいチャネル（長さ４０００μｍｘ幅５００μｍ、マイクロチャネル
の長さの半分は奥行き５５μｍで、残りは奥行き１０μｍ）を用いた。

【００３９】以下に示す試薬を含有する溶液を、核を溶解しＤＮＡを遊離するためにチャン
バー中に導入した：１０ｍＭ Tris/ＨＣｌ、ｐＨ８、０.５％ＳＤＳ、１ｍｇ/
ｍｌプロテイナーゼＫ。反応混合物は、５５℃で５分間インキュベーションし
た。チャンバーの内容物は、以下の組成を含有する１μｌの溶液で洗浄した：１
ｘＰＣＲ緩衝液II（Perkin Elmer ABI）;６％ α-シクロデキストリン（Aldrich
）。結果生じた液体を回収し、水で１０μｌまで希釈した。

【００４０】ＰＣＲは抽出したＤＮＡについて以下の通りに実施した：５μｌの希釈したＤＮＡを以下の組成を含有するＰＣＲ混合物（最終容量２５
μｌ）に添加した：１ｘＰＣＲ緩衝液II（Perkin Elmer ABI）；１.５ｍＭＭｇ
Ｃｌ_２；２００μＭデオキシヌクレオチド；１Ｕ AmpliTaq Gold（Perkin Elme
r ABI）；１５pmol エクソン２及び部分的なフランキングイントロンからなるＣ
ＹＰ２Ｄ６遺伝子の１０３５ｂｐ領域に特異的な各プライマー。その反応混合物
は以下のプロトコールを使用してサイクルさせた：９５℃ｘ９分；（９５℃ｘ１
５秒、６０℃ｘ３０秒、７２℃ｘ４５秒）ｘ３５回；７２℃ｘ５分。

【００４１】生成物は、アガロースゲル電気泳動及びエチジウムブロミドで染色した後ＵＶ
光のもとで視覚化することにより分析した。はっきりと目に見えるＰＣＲ生成物
が試験ＤＮＡから得られた。生成物は、ネガティブコントロールにおいては存在
せず、他の方法により単離した純粋なＤＮＡを含有するポジティブコントロール
においては存在した。

【００４２】ＰＣＲ生成物を１：１０００に希釈し、この希釈されたテンプレートの２.５
μｌをＣＹＰ２Ｄ６のエクソン２を含む２６２ｂｐからなるプライマーを除いて
１回目と同様の組成を含有する２回目のＰＣＲ混合物（最終容量２５μｌ）に添
加し、AmpliTaqを使用した。サイクルプログラムは、AmpliTaq Goldを用いる場
合のみ必要とされる最初の９５℃でのインキュベーションを省略して同様である
。１μｌのオリジナルの希釈されたＤＮＡ単離物を用いて同じ反応を行った（す
なわち、オリジナルのＤＮＡのネストしない増幅を試みた）。

【００４３】再度のアガロース電気泳動により単離したＤＮＡから作成されたＰＣＲ生成物
の存在が示された。この場合、ネストしたＰＣＲは非常に強い増幅が得られた。
オリジナルのＤＮＡを直接ＰＣＲに用いた場合にもまた、弱いがはっきりと目に
見える生成物が得られた。ネガティブ及びポジティブコントロールは予想した結
果を呈した。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＤＮＡ単離を実施するための微細組立てディスクの平面図である
。

【図２ａ】ＤＮＡ単離のためのマイクロビーズを含有する微細工法装置の
個々のマイクロチャネル要素の平面図における略図である。

【図２ｂ】マイクロチャネルが支柱を形成するためにマイクロチャネルの
底面部上に配置された隆起構造を提供する微細工法装置の個々のマイクロチャネ
ル要素の平面図における略図である。

【図２ｃ】マイクロチャネル中に形成されたチャンバー内部にマイクロビ
ーズが含有されている微細工法装置の個々のマイクロチャネル要素の平面図にお
ける略図である。

【図２ｄ】マイクロチャネル中に形成されたチャンバー内部に隆起構造が
が配置した微細工法装置の個々のマイクロチャネル要素の平面図における略図で
ある。

【図３】本発明の方法に従ってビーズにより捕捉し、エピ蛍光顕微鏡を用
いてPicoGreen染色液により視覚化した、抗凝結剤としてＥＤＴＡを混ぜたヒト
の全血からのＤＮＡを示す画像である。

【図４】本方法に従ってＰＢＳ緩衝液をマイクロチャネルに通したコント
ロール試料からの画像である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者マイケル・ケネス・ケンリックイギリス、シーエフ83・１エスジー、ウェールズ、カーフィリー、キャッスルビュー、エマニュエル・クロース４番Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA19 AA20 CA01 HA20 4B029 AA09 AA23 BB20 CC01 4B065 AA90X BD03 BD36

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】複数のマイクロチャネルを含む微細工法装置においてＤＮＡ
及び／あるいは細胞核を単離する方法であって、ＤＮＡ及び／あるいは細胞核に
対するバリア（barrier）として作用する１つあるいはそれ以上のマイクロチャ
ネル中においてメッシュを形成することを包含する、方法。
【請求項２】該微細工法装置の１つあるいはそれ以上のマイクロチャネル
において形成されるメッシュが、核酸のメッシュを包含する、請求項１に記載の
方法。
【請求項３】細胞からＤＮＡ若しくは細胞核、あるいはその混合物を単離
する方法であって：ａ）細胞質膜及び少なくとも核膜の一部を溶解するように全細胞の懸濁液を溶解
剤で処理し；ｂ）工程ａ）からの溶解物を、微細工法装置のマイクロチャネルであって、当該
各マイクロチャネルが、マイクロチャネルを通じて液体を通過させながらＤＮＡ
及び細胞核の通過あるいは流動を妨げるための手段を組み込んだをチャネル内に
形成することによりＤＮＡからなるメッシュをチャネル中に形成する、マイクロ
チャネル中に導入し；そしてｃ）該ＤＮＡからなるメッシュを洗浄することを包含する、方法。
【請求項４】工程ａ）において、核膜の大部分が無傷なままで実施される
、請求項３に記載の方法。
【請求項５】該微細工法装置が、回転可能なディスクを含み、そのディス
クは、環状の試料リザーバ−と連絡してディスクの中心に向って配置し、次いで
そのリザーバーが放射状に配列した複数のマイクロチャネルと連結される試料導
入ポートを含み、各マイクロチャネルは、ディスクの周縁部に向って配置される
入口チャネル及び出口チャネル、そしてマイクロチャネルを通じて液体を通過さ
せながらＤＮＡ及び細胞核の通過あるいは流動を妨げるために各マイクロチャネ
ルに組み込まれた手段を含む、請求項３あるいは４に記載の方法。
【請求項６】該ＤＮＡ及び細胞核の通過あるいは流動を妨げるために各マ
イクロチャネルに組み込まれた手段が、バリアを包含する、請求項３から５に記
載の方法。
【請求項７】該バリアが、液体を通過させながらＤＮＡ及び細胞核の流動
あるいは通過を妨げるビーズからなる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】該ビーズが、ポリスチレン、スチレンアクリレートコポリマ
ー、ジビニルベンゼンで架橋したポリスチレン、ポリビニルトルエン、ポリメタ
クリレート、及びポリカーボネート、ポリサッカライド、金属酸化物、ガラス、
及びカーボンから選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】該バリアが、マイクロチャネル内に配置された隆起構造から
なる、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】該隆起構造が、マイクロチャネルの底面部に配置され、液
体を通過させながらＤＮＡ及び細胞核の流動あるいは通過を妨げるような支柱を
形成するよう成形されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】微細工法装置のマイクロチャネルの少なくとも幾つかが、
それぞれアッセイを実施したりＤＮＡをプロセシングしたりするための反応チャ
ンバーを更に包含する、請求項３から１０に記載の方法。
【請求項１２】工程ａ）の全細胞が植物細胞及び動物細胞から選択される
、請求項３から１１に記載の方法。
【請求項１３】工程ｃ）が、マイクロチャネルに洗浄溶液を通すことによ
り実施される、請求項３から１２に記載の方法。
【請求項１４】メッシュに捕捉された細胞核が、ＤＮＡを遊離するために
更に処理される、請求項３から１３に記載の方法。
【請求項１５】細胞からＤＮＡ若しくは細胞核、あるいはその混合物を単
離するための微細工法装置であって、回転可能なディスクを含み、そのディスク
は、環状の試料リザーバ−と連絡してディスクの中心に向って配置し、次いでそ
のリザーバーが放射状に配列した複数のマイクロチャネルと連結される試料導入
ポートを含み、各マイクロチャネルは、ディスクの周縁部に向って配置される入
口チャネル及び出口チャネル、そしてマイクロチャネルを通じて液体を通過させ
ながらＤＮＡ及び細胞核の通過あるいは流動を妨げるために各マイクロチャネル
に組み込まれた手段を含む、装置。
【請求項１６】該ＤＮＡ及び細胞核の通過あるいは流動を妨げるために各
マイクロチャネルに組み込まれた手段が、バリアを包含する、請求項１５に記載
の装置。
【請求項１７】該バリアが、液体を通過させながらＤＮＡ及び細胞核の流
動あるいは通過を妨げるビーズからなる、請求項１６に記載の装置
【請求項１８】該ビーズが、ポリスチレン、スチレンアクリレートコポリ
マー、ジビニルベンゼンで架橋したポリスチレン、ポリビニルトルエン、ポリメ
タクリレート、及びポリカーボネート、ポリサッカライド、金属酸化物、ガラス
、及びカーボンから選択される、請求項１７に記載の装置。
【請求項１９】該バリアが、マイクロチャネル内に配置された隆起構造か
らなる、請求項１６に記載の措置。
【請求項２０】該隆起構造が、マイクロチャネルの底面部に配置され、支
柱を形成するよう成形されている、請求項１９に記載の装置。
【請求項２１】微細工法装置のマイクロチャネルの少なくとも幾つかが、
それぞれアッセイを実施したりＤＮＡをプロセシングしたりするための反応チャ
ンバーを更に包含する、請求項１５から２０に記載の装置。
【請求項２２】請求項１から１４のいずれかに記載の方法により単離され
た、ＤＮＡ。