JP2003510046A

JP2003510046A - 細胞の条件的不死化

Info

Publication number: JP2003510046A
Application number: JP2001525348A
Authority: JP
Inventors: パルムジットジャット
Original assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd
Current assignee: Ludwig Institute for Cancer Research New York
Priority date: 1999-09-17
Filing date: 2000-09-18
Publication date: 2003-03-18
Also published as: CN1373804A; WO2001021790A1; CA2383253A1; US6399384B1; DE60020855D1; AU757816B2; ES2241652T3; EP1212420B1; AU7301500A; EP1212420A1; DE60020855T2; ATE297987T1; IL148008A0

Abstract

(57)【要約】組換え、または遺伝子操作された、哺乳動物細胞は、条件的に誘導性の癌遺伝子、およびテロメラーゼ複合体の触媒サブユニットをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。組換え細胞は、治療において有用であり、損失または損傷細胞に取って代わる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、治療用途のための哺乳動物細胞の不死化に関する。

【０００２】発明の背景組織および臓器に対する損傷を処置するための移植治療の重要性の増大する認
識および理解が存在する。臓器移植が広範に行われている一方、個々の細胞の移
植に基づく治療が、依然として、臨床開発の比較的初期段階にある。

【０００３】例えば、好適な細胞の損傷脳への移植が、この損傷によって引き起こされた任
意の感覚、運動、挙動または心理学的欠損を改善または補正（correct）し得る
という増大する認識が存在する。

【０００４】細胞ベースの治療が有用であるために、移植のために十分な細胞を得ることが
可能でなければならない。これを確実にするための１つの手段は、反復される細
胞分裂および増殖を可能にする条件下で、未分化細胞を培養することである。未
分化細胞を使用することに伴う１つの困難は、調節されない細胞分裂が、移植部
位での制御されない増殖を防止するために、患者への移植前または移植時のいず
れかにおいて、スイッチオフとされなければならないことである。

【０００５】多くの異なる技術が、移植に好適な細胞を提供するために開発されてきた。神
経移植に関して、１つのアプローチは、細胞分裂が生じることを可能にする培養
条件下で未分化胎児細胞を維持すること、および引き続いて移植前にインビトロ
での分化を誘発することであった。

【０００６】 ReynoldsおよびWeiss, Science, 1992; 255:1707は、成体マウス脳細胞のイン
ビトロ増殖を誘発するための上皮成長因子（ＥＧＦ）の使用を開示する。好適な
条件下で、細胞は、誘導されて星状細胞および神経細胞へ分化し得ると考えられ
ていた。

【０００７】国際特許出願第WO-A-94/16059は、少なくとも１つの栄養因子を補足した無血
清培地中で細胞を培養することによって、インビトロで初代神経細胞培養物を維
持するための技術を開示する。

【０００８】国際特許出願第WO-A-97/10329は、条件的に不死化された細胞系を使用する代
替技術を開示する。この細胞系は、許容条件下で感覚上皮幹細胞を未分化状態に
維持する、不死化温度感受性癌遺伝子を含む。移植の際、癌遺伝子は、人体のよ
り高い温度（３７℃）のためにスイッチオフされ、そして細胞は、損傷を修復す
るために必要とされる細胞タイプへと分化する。癌遺伝子を使用する利点は、細
胞が移植まで未分化状態で維持され、移植時に、細胞が、特定の損傷に応答して
、損傷または損失細胞の表現型へと分化することである。US 5688692はまた、非
ＤＮＡ結合温度感受性Ｔ抗原を発現する細胞を開示する。

【０００９】しかし、癌遺伝子を発現するヒト細胞は延長された寿命を有し得るが、それら
は依然として分裂を停止しそして結局はクリーゼ（crisis）（細胞死）を受ける
ことが認識されている。

【００１０】ヒト細胞は、ヒトテロメラーゼの触媒サブユニットの外因性コピーを組み込む
ことによってテロメラーゼ活性を再構築することにより不死化され得ることがま
た提案された（Bodnarら、Science, 1998; 279: 249-252）。テロメラーゼは、
染色体の末端で見られるテロメアを維持するように作用し、そして細胞複製の間
のテロメアの徐々の短縮化は老化に寄与し、それゆえテロメラーゼを再構築する
ことは細胞を不死化すると、考えられている。ヒトテロメラーゼは、現在、多く
の異なる細胞タイプを不死化するために使用されている。

【００１１】 Counterら、PNAS (USA), 1998; 95 (25): 4723-14728はまた、テロメラーゼ触
媒サブユニット（telomerase catalytic subunit）（ｈＴＥＲＴ）の異所性発現
（ectopic expression）は、老化後細胞（post senescent cell）がクリーゼを
超えて細胞不死化へと増殖することを可能にし得ることを開示する。研究される
細胞は、ＳＶ４０Ｔ−抗原を発現する癌遺伝子で形質転換された。しかし、著
者らは、ｈＴＥＲＴ発現のみで細胞を不死化するに十分であり得、そしてｈＴＥ
ＲＴの活性化は、腫瘍進行における重要な段階であり得ると結論付ける。従って
、この刊行物の全体的教示は、ｈＴＥＲＴ形質転換細胞は不死であるということ
である。これは、この細胞は移植治療における使用に不適であることを意味する
。

【００１２】従って、上記で開示される多くの技術は有用であり得る一方、移植の前に不死
性を保持するが、移植時に不死性を失う細胞を得るための方法についての必要性
が依然として存在する。

【００１３】発明の要旨本発明は、条件的に誘導性の癌遺伝子および少なくともテロメラーゼ複合体の
触媒サブユニットで形質導入された細胞は、許容状態下で不死であるが、非許容
状態下で不死性を失うという認識に基づく。

【００１４】本発明の１つの局面に従うと、組換え、または遺伝子操作された、哺乳動物細
胞は、条件的に誘導性のまたは温度感受性の癌遺伝子、および少なくともテロメ
ラーゼ複合体の触媒サブユニットをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。

【００１５】本発明の第２の局面に従うと、組換えポリヌクレオチド構築物は、少なくとも
テロメラーゼ複合体の触媒サブユニットをコードする遺伝子、および条件的に誘
導性または温度感受性の癌遺伝子を含む。

【００１６】第３の局面に従うと、哺乳動物細胞を不死化するための方法は、増殖中の哺乳
動物細胞内に、条件的に誘導性の癌遺伝子およびテロメラーゼ遺伝子の触媒サブ
ユニットをコードする外因性ポリヌクレオチドを組み込むことを含む。

【００１７】第４の局面に従うと、本発明の細胞は、治療において、特に細胞損失または損
傷に関連する疾患の処置のための医薬の製造において使用され得る。例えば、感
覚上皮幹細胞が、脳損傷に関連する障害（例えば、アルツハイマー病）の処置の
ために使用され得る。

【００１８】本発明に従う細胞は、高レベルの安定性を保持し、そして非許容温度で不死で
ないことが見出された。

【００１９】これは、先行技術に基づいて、テロメラーゼ活性の再構築に起因して、この細
胞が不死のままであることが予想されるので、驚くべきかつ重要な知見である。
しかし、テロメラーゼをコードする遺伝子は構成性（constitutive）であるが、
テロメラーゼは不死性を保持するようには作用しないようである。状態性（cond
itionality）および増加した安定性の保持は、本発明の細胞を、連続継代されて
移植用の細胞系を誘導するに好適にする。

【００２０】発明の説明本発明は、移植治療に好適であり、そして移植時まで不死である細胞を調製す
るための方法を開示する。

【００２１】細胞は、条件的に誘導性の癌遺伝子が存在することを必要とする。用語「条件
的に誘導性の（conditionally-inducible）」は、ここで、その発現が特定の条
件下で調節され得る癌遺伝子を言及するために使用される。癌遺伝子は、いわゆ
る許容状態が適用される場合に、発現する。例えば、いくつかの癌遺伝子は、温
度感受性であり、そしてそれらの環境の温度が特定の値以下である場合にのみ、
発現される。本発明の１つの実施形態において、使用される癌遺伝子は、ＳＶ−
４０ラージＴ−抗原遺伝子（SV-40 large T-antigen gene）の非ＤＮＡ結合性、
温度感受性突然変異体（non-DNA binding, temperature-sensitive, mutant）（
Ｕ１９ｔｓＡ５８）である。好適な代替物がまた公知であり、そしてポリオーマ
Ｔ−抗原の癌遺伝子を含む。

【００２２】細胞はまた、少なくともテロメラーゼ複合体の触媒サブユニットをコードする
外因性ポリヌクレオチドを必要とする。用語「外因性」は、ここで、その通常の
文脈において、細胞中へ導入されたポリヌクレオチドを言及するために使用され
、そして自然に発生する内因性ポリヌクレオチドと異なる。テロメラーゼ複合体
の触媒サブユニットは、逆転写酵素のように作用する酵素であり、そして当該分
野において公知である。ヒトサブユニットは、GB-A-2317891に開示される。

【００２３】癌遺伝子およびテロメラーゼをコードするポリヌクレオチドは、組換えＤＮＡ
またはレトロウイルスベクターまたは構築物に含まれ、細胞に形質導入／感染し
得る。２つの成分は、１つのベクター中へ組み込まれ得るか、または各々が別々
のベクター中へ含まれ得る。本発明のベクターまたは構築物は、さらに、ＤＮＡ
の転写を開始するに好適なプロモーター領域、および形質導入／感染を受けた細
胞を同定するために使用され得る選択可能なマーカーを含み得る。発現の調節は
、当業者に公知の方法によって行われ得る。例えば、調節は、長末端反復（ＬＴ
Ｒ）プロモーターを使用して行われ得る。代替のプロモーターは、当業者に明ら
かである。例えば、調節は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを使
用して行われ得る。ＣＭＶプロモーターは、非常に強力なプロモーターであり、
そして細胞が、神経細胞、例えば感覚上皮幹細胞である場合、好ましくあり得る
。

【００２４】好適な構築物を細胞中へ導入するための方法は、当業者に公知である。

【００２５】任意の哺乳動物細胞が、本発明において使用され得る。

【００２６】例えば、細胞は、内皮細胞であり得、そして脚、心臓および他の器官の血管再
生（revascularisation）のために使用され得る。好ましくは、細胞は、特定の
細胞型へ分化し得るヒト体細胞、例えばヒト上皮幹細胞である。特に好ましい細
胞は、ヒト感覚上皮幹細胞であり、これは、細胞損失または損傷を修復するため
および挙動または心理学的欠損を補正するために神経移植に使用され得る。ある
いは、細胞は、分化細胞、例えばランゲルハンス島のβ細胞であり得る。さらな
る細胞は、内分泌腺、網膜細胞、蝸牛細胞（cochlear cell）、肝細胞、骨芽細
胞および破骨細胞、筋芽細胞ならびにケラチノサイトから得ることができるもの
が挙げれるが、これらに限定されない。

【００２７】好ましくは、癌遺伝子およびテロメラーゼは、初期の培養段階、通常、最初の
１０細胞分裂内の間に、細胞中へ組み込まれる。癌遺伝子およびテロメラーゼを
組み込む順序は、方法の成功に重要でないが、テロメラーゼが最初に導入される
ことが好ましい。これは、驚くべきことに、テロメラーゼを最初に導入すること
は２倍細胞系（dipoid cell line）を達成することについてよりよい確信を提供
することが見出されたためである。

【００２８】形質導入または感染された細胞は、当業者に公知の条件下で培養され得る。細
胞は非ストレス化（non-stressed）条件下で培養されることが好ましい。当業者
は、慣用の培養技術に基づいて、各々特定の細胞型に好適な条件を理解するであ
ろう。

【００２９】本発明は、ここで、図面を参照して、以下の実施例においてさらに説明される
。実施例は、好適なヒト細胞を温度感受性癌遺伝子およびテロメラーゼ複合体の
触媒サブユニットで形質導入させることによって、細胞培養物が好適な培養培地
中で継代される際に安定性を保持することが可能となることを示す。

【００３０】実施例１１．乳小葉間繊維芽細胞（mammary interlobular fibroblast）（ＨＭＦ）お
よび乳微小血管内皮（mammary microvascular endothelial）（ＭＭＶＥ）細胞
の単離：乳小葉間繊維芽細胞および乳微小血管内皮細胞の培養物を、美容整形（縮小乳
房形成（reduction mammoplasty））を受ける患者から同意を得て得た、正常な
乳房組織から調製した。小葉間繊維芽細胞の培養物を、Athertonら, J. Cell Sc
i., 107:2931-2939に記載されるように調製し、そして１０％ウシ胎児血清およ
び抗生物質（ペニシリン／ストレプトマイシン）を補足したダルベッコの改変イ
ーグル培地（ＤＭＥＭ）で維持した。微小血管からの内皮細胞を、本質的にDark
e & Lock, Human Reprod., 1992; 6:1156-1159によって記載されるように、トロ
ンボモジュリン（thrombomodulin）に対するＱＢＥＮＤ−４０マウスモノクロー
ナル抗体を使用して、初代培養物の免疫磁気分離（immunomagnetic sorting）に
よって単離した。内皮培養物を確立しそして、ＥＧＭ−２培地（Ｂｉｏｗｈｉｔ
ｔａｋｅｒ）において維持した。

【００３１】２．老化への細胞のインビトロ培養。

【００３２】コントロールとして、細胞の調製物を培養し、老化のポイントを決定した。細
胞は、ＥＧＭ−２中で培養した場合、１０〜１６集団倍加（population doublin
g）の培養寿命を有すると分かった。細胞質中の粒状粒子の蓄積を別にすれば、
他の点では老化細胞は、有糸分裂の完全な非存在という点のみ異なって、それら
の初期培養対応物（early-passage counterpart）に似ていた。

【００３３】３．ｔｓＡ５８−Ｕ１９の形質導入およびクリーゼ（crisis）への延長増殖。

【００３４】種々の個体ドナー由来の細胞調製物が、集団倍加６〜９で依然として増殖して
いる間、これを、ｎｅｏ−ｒ遺伝子を含むｐＺＩＰベクター中のＳＶ−４０Ｔ
−抗原遺伝子のｔｓＡ５８−Ｕ１９（AlmazanおよびMcKay, Brain Res., 1992;
579(s): 234-245）二重組換え突然変異体（double recombinant mutant）で形質
導入した。形質導入を、Stampsら, Int. J. Cancer, 1994; 57 (6): 865-874に
記載されるように、ヘルパーウイルスフリー両栄養性レトロウイルスパッケージ
ングシステム（helper virus-free amphotropic retroviral packaging system
）（ＰＡ３１７、クローン８）を使用して行った。８μｇ／ｍｌのポリブレン（
Polybrene）をウイルス吸収を改善するためにアジュバントとして使用した。

【００３５】形質導入頻度（frequencies）は、０．２５ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（gen
eticin）を用いての選択後、１０〜２５％に変化した。ｔｓＡ５８についての許
容温度（３３．５℃）へ移した後、これらの培養物は、１：４のスプリット比（
split ratio）で３３〜５６集団倍加のために、さらに継代した。この間、全て
の細胞は、ストリンジェントに温度感受性のままであり、３６．５℃以上でほと
んどまたは全く増殖しなかった。しかし、全ての場合、増殖は、結局、クリーゼ
を示す異常有糸分裂ならびにサイズおよび核異質性（nuclear heterogeneity）
を含む異常細胞モルフォロジーが現れて、停止した。全部で１０⁸以上の細胞の
合計がクリーゼへと継代され、「自然発生的な」不死化の１つの例も観察されな
かった。これは、クリーゼへと維持された５×１０⁶の細胞において約１の頻度
で反復して不死化する乳上皮細胞とは対照的である。

【００３６】４．ｈ−ＴＥＲＴの形質導入、および条件的増殖の保持しての引き続いての不
死化。

【００３７】ｔｓＴ抗原システムで形質導入した１ドナー由来の初期培養細胞（ＭＭＶＥ
−２）を、さらに、ヒト両栄養性パッケージングシステム（human amphotropic
packaging system）（ＴＥ−ＦＬＹ）を使用して、ハイグロマイシンＢ−耐性遺
伝子（hygromycin B-resistance gene）を含むｐＢａｂｅベクター（Morgenster
nおよびLand, Nucleic Acids Research, 1990; 18 :3587-3596）中のヒトテロメ
ラーゼ遺伝子の触媒サブユニットの全長ｃＤＮＡコピーで形質導入した。一連の
４のクローン化パッケージング系を、標的ヒト細胞系（ＥＪ膀胱癌細胞）へのハ
イグロマイシン耐性の移入に基づいて前もって最も高い力価で選択した。各々を
、２重で、８μｇ／ｍｌポリブレンの存在下でＭＭＶＥ−２ｔｓＴ細胞を形質
導入するために使用した。成功した形質導入が、２５μｇ／ｍｌハイグロマイシ
ンＢを用いての選択後に観察された。

【００３８】驚くべきことに、形質導入された細胞は、老化を克服したようであり、そして
４０週を超える間、増殖速度の明白なクリーゼまたは変化なしで、３３．５℃で
増殖し続けた。細胞は、今のところ、定速で＞１００集団倍加を受け、そして機
能的に不死であるようある。

【００３９】３３．５、３６．５および３９．５℃での複製培養より温度感受性について試
験した場合、ｈＴＥＲＴ形質導入されたＭＭＶＥ−２ｔｓＴ細胞は、驚くべき
ことに、初期に継代したｔｓＴのみの細胞と同じぐらい感受性だった。予想され
得ることとは反対に、３６．５℃でほとんど増殖がなく、そして３９．５℃で全
く増殖せず、すなわち細胞は条件的に不死であった。全ての培養を、ｂ−ＦＧＦ
、ＶＥＧＦ、ＩＧＦ−２およびヘパリンを含む種々の内皮特異的成長因子ならび
に２％ＦＣＳを含むＥＧＭ−２培地を用いて、従って準最適（sub-optimal）又
は「ストレス化（stressed）」増殖条件下での細胞の試験を回避して、実施した
。

【００４０】温度誘導増殖抑制（temperature-induced growth arrest）が不可逆である程
度を決定するために、繊維芽細胞培養物を、コロニー形成効率（colony forming
efficiency）（ＣＥ）を３９．５℃での増殖抑制の種々の期間後に最適条件下
（３３．５℃で５％酸素）で決定するクローン原性アッセイを使用して分析した
。ほとんどの培養物のＣＥは、非許容温度での時間に比例して、有意に減少した
。ＨＭＦ培養物の１つにおいて、例えば、３９．５℃で１４日後のＣＥは、コン
トロール値の＜５％まで降下し、ほとんどのコロニーが小さくそして不完全（ab
ortive）であった。結果は、形質導入細胞の累進的な不可逆性を実証し、そして
これは熱ショックの非特異的効果よりもむしろＴ−抗原の熱的不活性化に起因す
ることを示す。

【００４１】細胞をまた、老化活性化酸βガラクトシダーゼのために培養物を染色すること
によって、Ｔ抗原の不活性化の際にそれらが生化学的老化を受けるかどうかを確
証するために試験した。３９．５℃で４〜８日後、全ての繊維芽細胞培養は、種
々の数の陽性細胞を示し（１〜１０％）、一方、３３．５℃での対応する培養物
において陽性細胞は検出されなかった（＜０．１％）。これは、Ｔ−抗原のみＨ
ＭＦ繊維芽細胞のクリーゼ培養物と比較し、ここで、５３％の細胞が陽性であっ
た。これは、不死化細胞はＴ−抗原に依存して増殖を維持すること、ならびにＴ
−抗原の不活性化は細胞増殖の不可逆的休止（cessation）および老化へのエン
トリー（entry）を生じさせることを実証する。

【００４２】細胞培養物をまた、核型分析（karyotyped）して、レトロウイルス遺伝子形質
導入の順序およびタイミングが得られる細胞の染色体状態に影響するかどうかを
測定した。二倍体または近二倍体モード（near-diploid modal）数の染色体（４
６）が、ＭＭＶＥおよびＨＭＦ細胞（；ｈＴＥＲＴを最初にして初期段階（すな
わち、最初の１０細胞分裂内）の間に両方の遺伝子を導入することによって誘導
した）の両方において観察された。両方の遺伝子を、癌遺伝子を最初にして初期
段階の間に導入した場合、細胞は、近二倍体および近四倍体形態を伴う２形態の
（bimodal）核型を有することが示された。これは、驚くべき知見であり、そし
て二倍体細胞は、細胞中へ最初にテロメラーゼの触媒サブユニットを挿入するこ
とを選択することによって、より効率的に調製され得ることを実証する。

【００４３】要約すれば、得られた結果は、驚くべきことに、テロメラーゼ触媒サブユニッ
トをコードする全長遺伝子および温度感受性癌遺伝子を含む細胞は、増殖につい
て条件的のままであり、すなわち細胞は高温で不死でないということを示す。

【００４４】上記の結果は、温度感受性癌遺伝子および触媒テロメラーゼサブユニットでの
別個の形質導入は、温度感受性癌遺伝子のみを含む細胞と比較して、改善された
特徴を示し得ることを実証する。

【００４５】別個の形質導入は良好な結果を示すが、癌遺伝子およびテロメラーゼをコード
する遺伝子の両方を有する好適なベクターを構築することはより容易であり得る
。

【００４６】実施例２この実施例は、ＳＶ４０初期領域の非ＤＮＡ結合突然変異体（Ｕ１９ｔｓＡ５
８）から誘導される熱不安定性Ｔ−抗原；テロメラーゼ複合体の触媒サブユニッ
トｈＴＥＲＴ（ｃＤＮＡ）（Counterら、PNAS, 1998; 95(25): 14723-14728）；
およびＧ４１８（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）への耐性をコードする優性に作用する選択
可能な（dominantly-acting selectable）ネオマイシンホスフォトランスフェラ
ーゼ耐性マーカー（Ｎｅｏ）を共発現する好適な発現ベクターの製造を実証する
。最終構築物は、高力価モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）に基
づくレトロウイルス発現ベクター、ｐＢａｂｅ（MorgensternおよびLand、上記
）において組み立てた。レトロウイルスライフサイクルを使用して、ＳＶ４０初
期領域を、ラージＴ抗原のみを作製するウイルスへ変換させた。全ての構築物を
、アンピシリン選択を使用して、ｒｅｃＡ−宿主（ＭＣ１０６１のＪＳ４−ｒ
ｅｃＡ誘導体）において組み立てた。

【００４７】ベクターの２つのバージョンを構築した：構築物１この構築物を図１に示す。ＭｏＭｕＬＶＬＴＲを使用して、ｈＴＥＲＴをド
ライブ(drive)させ、そしてＳＶ４０初期プロモーターを使用して、Ｕ１９ｔｓ
Ａ５８およびＮｅｏの両方をドライブさせた。内部リボソームエントリー部位（
internal ribosome entry site）（ＩＲＥＳ）を、Ｕ１９ｔｓＡ５８遺伝子とＮ
ｅｏ遺伝子との間に統合し（Ｎｅｏ遺伝子へインフレームで融合させた）、真核
生物リボソームによる翻訳の再開始を誘発させた。

【００４８】構築物２この構築物を図２に示す。ＭｏＭｕＬＶＬＴＲを使用して、Ｕ１９ｔｓＡ５
８をドライブさせ、そしてＳＶ４０初期プロモーターを使用して、ｈＴＥＲＴお
よびＮｅｏをドライブさせた。ＩＲＥＳ配列をｈＴＥＲＴとＮｅＯとの間に挿入
した。

【００４９】クローニング法各ベクターを３つのセクションで組み立てた。ベクターｐＢａｂｅＮｅｏ−
ｈＴＥＲＴ（ｐＣＩ−Ｎｅｏ−ｈＴＥＲＴから切り出したｈＴＥＲＴ、Ｒ．Ａ．
Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，ＷｈｉｔｅｈｅａｄＩｎｓｔｉｔｕｔｅより提供）、およ
びｐＢａｂｅ−Ｎｅｏ−Ｕ１９ｔｓＡ５８（ここで、Ｕ１９ｔｓＡ５８は、レト
ロウイルス転写に関してセンス配向で挿入される）を使用して、構築物１および
２それぞれのフロント−エンド（front-end）を調製した。

【００５０】ＩＲＥＳのクローニングおよびＮｅｏ遺伝子へのそのインフレーム融合を、ク
ローニングベクターｐＰｏｌｙＩＩＩ−Ｉ（Ｄ．Ｋｉｏｕｓｓｉｓ，ＭＲＣ，Ｍ
ｉｌｌＨｉｌｌから得た）において行った。ｐＰｏｌｙＩＩＩ−Ｉは、それが
６ヌクレオチド配列を認識する制限酵素についての多くの部位を含むラージポリ
リンカー（large polylinker）を含むので、遺伝子配列を構築するために有用な
ベクターである。第３成分は、ベクターｐＢａｂｅＰｕｒｏ（ピューロマイシ
ン耐性遺伝子を有するｐＢａｂｅ）からクローニングした。

【００５１】構築物１Ａ．ＩＲＥＳ：ＮｅｏのクローニングＮｅｏ配列を、ｐＬＸＳＮ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）ベクターからＰＣＲによって
増幅させた。この構築物の全長を最小に維持するために、Ｎｅｏコーディング領
域（ｐＬＸＳＮの２０６６ｂｐ〜２８６０ｂｐ）のみを使用した。５８６ｂｐ
ＩＲＥＳ（脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣ）ＲＮＡ５’非コーディング領域）は、
ＮｏｖｏｇｅｎベクターｐＣＩＴＥ−１から利用できる。ＥＭＣの開始領域は、
ｐＣＩＴＥ−１の２９１８位にＢａｌＩクローニング部位および２９２５にＮ
ｃｏＩ部位を有し、これは、インフレームで外来配列を挿入するために使用さ
れ得る。

【００５２】それら自体のＡＵＧを欠如している外来配列を、２９１５−２９１７でのウイ
ルスＡＵＧへインフレームで融合し、しかし、ＢａｌＩで切断することによっ
て、外来配列のＡＵＧの後の最初のコドンの初めにＧが生成される。これは、Ａ
ＵＧの後の最初の塩基がＡであるＮｅｏ配列と非適合性である。この問題を解決
するために、ｐＬＸＳＮからＮｅｏ配列を増殖するために使用される５’Ｎｅｏ
プライマーを、塩基２９１８と２９２９との間にＩＲＥＳ配列を再作製するよう
に設計した。

【００５３】

【数１】Ｎｅｏ配列の３’末端をｐＰｏｌｙＩＩＩ−Ｉへ挿入するために、３’ＰＣＲ
プライマーを、ＳａｌＩ部位およびＣｌａＩ部位を含むように設計する（ｐＰ
ｏｌｙＩＩＩ−ＩからｐＢａｂｅへクローニングするため）。

【００５４】

【数２】従って、ｐＣＩＴＥ−１からＩＲＥＳをＥｃｏＲＩおよびＢａｌＩ（アイソ
シゾーマーは、ＭｌｓＩ、ＭｓｃＩである）で切断し、そしてこの配列をｐＰ
ｏｌｙＩＩＩ−ＩのＥｃｏＲＩおよびＢａｌＩ部位へライゲートすることが可
能であった。次いで、Ｎｅｏ配列を、前述のフォワード（forward）およびリバ
ース（reverse）Ｎｅｏプライマーを使用してベクターｐＬＸＳＮから増幅し、
そしてＰＣＲ産物の３’領域をＳａｌＩで切断し、その後ｐＰｏｌｙＩＩＩ−
Ｉ−ＩＲＥＳのＢａｌＩおよびＳａｌＩ部位へライゲーションさせた。

【００５５】Ｂ．Ｕ１９ｔｓＡ５８の挿入Ｕ１９ｔｓＡ５８をｐＺｉｐ−Ｕ１９ｔｓＡ５８（Ｐ．ＪａｔｏｆＬｕｄ
ｗｉｇＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈより提
供）からＢａｍＨＩ消化によって切り出し、そしてｐＰｏｌｙＩＩＩ−Ｉ−Ｉ
ＲＥＳ：ＮｅｏのＢａｍＨＩ部位へ、レトロウイルス転写に関してセンス配向
（sense orientation）で、挿入した。

【００５６】Ｃ．最終構築物最終構築物を、以下の３つの部分のライゲーションによって作製した：（ｉ）ＳｆｉＩＣｌａＩ消化によって、ｐＰｏｌｙＩＩＩ−Ｉ−Ｕ１９ｔ
ｓＡ５８−ＩＲＥＳ：Ｎｅｏから切り出したＵ１９ｔｓＡ５８−ＩＲＥＳ−Ｎｅ
ｏ；（ｉｉ）ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩでの消化によって、ベクターｐＢａｂｅ−
Ｎｅｏ−ｈＴＥＲＴから得られた、構築物のフロント。左手セクションが必要で
あった；ならびに（ｉｉｉ）ＣｌａＩおよびＮｏｔＩでの消化によって、ベクターｐＢａｂｅ
−Ｐｕｒｏから得られた、ｐＢＳｏｒｉ−含有フラグメント。ベクターの右手
側が必要であった。

【００５７】構築物２Ａ．ｐＰｏｌｙＩＩＩ−Ｉ−ｈＴＥＲＴ−ＩＲＥＳ：ＮｅｏｈＴＥＲＴｃＤＮＡおよびＩＲＥＳ：ＮｅｏをｐＰｏｌｙＩＩＩ−Ｉへクロ
ーン化するために、ｐＢａｂｅＮｅｏ−ｈＴＥＲＴを、初めに、ｈＴＥＲＴの
３’末端で切断するＳａｌＩで消化した。ｈＴＥＲＴのクローニング部位はＥ
ｃｏＲＩ（５’）およびＳａｌＩ（３’）であるが、ｈＴＥＲＴは、これはＩ
ＲＥＳ：Ｎｅｏの３’末端のクローニング部位であるので、ｐＰｏｌｙＩＩＩ−
ＩのＳａｌＩ部位へクローン化され得ない。従って、ｈＴＥＲＴ配列を最初に
平滑末端化し（blunt-ended）、その後、ＥｃｏＲＩでｐＢａｂｅＮｅｏ−ｈ
ＴＥＲＴからｃＤＮＡ配列を切り出した。ｐＰｏｌｙＩＩＩ−Ｉ−ＩＲＥＳ：Ｎ
ｅｏをＥｃｏＲＩで切断し、平滑化（blunted）、そしてＳａｌＩで切断し、
ＩＲＥＳ：Ｎｅｏを切り出した。次いで、ｈＴＥＲＴおよびＩＲＥＳ：Ｎｅｏを
、３’ｈＴＥＲＴと５’ＩＲＥＳ：Ｎｅｏの間に平滑末端連結で結合して、ｐＰ
ｏｌｙＩＩＩ−ＩのＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ部位へクローン化した。

【００５８】構築物２の組み立ては、以下の３つの部分連結を含んだ：（ｉ）ＳｆｉＩおよびＣｌａＩ部位でｐＰｏｌｙＩＩＩ−Ｉ−ＩＲＥＳ：Ｎ
ｅｏから切り出したｈＴＥＲＴ−ＩＲＥＳ：Ｎｅｏ；（ｉｉ）ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩでの消化によって、ベクターｐＢａｂｅ−
Ｎｅｏ−Ｕ１９ｔｓＡ５８から得られた、構築物２の左手側；ならびに（ｉｉｉ）ＣｌａＩおよびＮｏｔＩでの消化によって、ベクターｐＢａｂｅ
−Ｐｕｒｏから得られた、構築物２の右手側。

【００５９】最終構築物は、図２に示す通りである。

【００６０】構築物の消化に関して、ＣＭＶプロモーター由来の癌遺伝子およびｈＴＥＲＴ
成分の両方の発現を調節することがより望ましくあり得る。これは、レトロウイ
ルスベクターにおいて、ＣＭＶプロモーターの下流での挿入に伴って、ＩＲＥＳ
配列を使用して成分を連結することによって、行われ得る。

【００６１】構築物は、好適な細胞を形質導入して、継代の間に改善した安定性を有する条
件的に不死化された細胞を製造するために使用され得る。

【００６２】本発明の組換え細胞は、治療における用途を有し得る。患者への送達用の製剤
の調製方法は、当業者に明らかである。好適な賦形剤、希釈剤等はまた、細胞ベ
ースの治療剤を調製することにおける現在のプラクティスに基づいて、明らかで
ある。送達のために必要とされる細胞の量は、処置の形態、疾患／損傷の重篤度
、および治療期間にわたって適用する複数の用量についての必要性に依存して変
化する。しかし、当業者は、容易に、現在の細胞移植治療に基づいて、適切な処
置を決定し得る。

【配列表】

【図面の簡単な説明】以下の図は、本発明を例示する。

【図１】図１は、ｈＴＥＲＴおよびＳＶ４０ラージＴ−抗原をコードする温度感受性癌
遺伝子の両方を含むポリヌクレオチド構築物の概略図である。

【図２】図２は、図１でのそれとは異なる順番でｈＴＥＲＴおよび癌遺伝子を有する代
替の構築物の概略図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ジャットパルムジットイギリス国ロンドンエスダブリュ１Ｅ５エージースタグプレイスゲレンハウスルードヴィッヒインスティテュートフォーキャンサーリサーチＦターム(参考） 4B024 AA01 CA02 CA04 DA02 DA03 EA02 FA02 GA11 HA08 HA17 4B065 AA90X AA93Y AA95X AB01 AB04 AC20 CA44 4C084 AA02 AA13 BA35 CA25 CA53 NA14 ZA162 4C087 AA01 AA02 AA03 BB65 CA04 NA14 ZA16

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】条件的に誘導性の癌遺伝子およびテロメラーゼ複合体の触媒
サブユニットをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、哺乳動物細胞。
【請求項２】前記癌遺伝子および前記外因性ポリヌクレオチドが、組換え
ベクター中に含まれる、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】前記癌遺伝子が温度感受性である、請求項１または請求項２
に記載の細胞。
【請求項４】ヒト体細胞である、前記請求項のいずれかに記載の細胞。
【請求項５】哺乳動物間質性繊維芽細胞または哺乳動物微小血管細胞であ
る、前記請求項のいずれかに記載の細胞。
【請求項６】ヒト幹細胞である、請求項１〜４のいずれかに記載の細胞。
【請求項７】感覚上皮幹細胞である、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】前記癌遺伝子が、ＳＶ−４０Ｔ−抗原遺伝子の温度感受性
突然変異体である、前記請求項のいずれかに記載の細胞。
【請求項９】前記突然変異体がｔｓＡ５８−Ｕ１９である、請求項８に記
載の細胞。
【請求項１０】テロメラーゼ複合体の触媒サブユニットおよび条件的に誘
導性の癌遺伝子をコードする、組換えポリヌクレオチド。
【請求項１１】さらに選択可能なマーカー遺伝子およびプロモーター領域
を含む、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】哺乳動物細胞を不死化するための方法であって、増殖中の
細胞内に、条件的に誘導性の癌遺伝子およびテロメラーゼ複合体の触媒サブユニ
ットをコードする外因性ポリヌクレオチドを組み込むことを包含する、方法。
【請求項１３】前記癌遺伝子および外因性ポリヌクレオチドが、最初の１
０細胞分裂内の細胞に組み込まれる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】前記外因性ポリヌクレオチドが、前記癌遺伝子の前に、前
記細胞中に導入される、請求項１２または請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】細胞損失または損傷に関連する疾患の処置のための医薬の
製造における、請求項１〜９のいずれかに記載の細胞の使用。
【請求項１６】前記細胞が感覚上皮幹細胞である、請求項１５に記載の使
用。