DE60020855T2

DE60020855T2 - Bedingte immortalisierung von zellen

Info

Publication number: DE60020855T2
Application number: DE60020855T
Authority: DE
Inventors: Parmjit Stag Place JAT
Original assignee: Reneuron Ltd; Ludwig Institute for Cancer Research London
Current assignee: Reneuron Ltd; Ludwig Institute for Cancer Research London
Priority date: 1999-09-17
Filing date: 2000-09-18
Publication date: 2006-05-04
Anticipated expiration: 2020-09-19
Also published as: CN1373804A; WO2001021790A1; CA2383253A1; US6399384B1; DE60020855D1; AU757816B2; ES2241652T3; EP1212420B1; AU7301500A; EP1212420A1; JP2003510046A; ATE297987T1; IL148008A0

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Immortalisierung von Säuger- bzw. Säugetierzellen für die therapeutische Anwendung.
Hintergrund der Erfindung
Es besteht ein wachsendes Bewusstsein für die und Verständnis der Bedeutung der Transplantationstherapie zur Behandlung von Gewebe- und Organschäden. Während die Organtransplantation weit verbreitet praktiziert wird, befinden sich Therapien auf Basis der Transplantation von individuellen Zellen noch in einer vergleichsweise frühen Phase der klinischen Entwicklung.
Beispielsweise wird in wachsendem Maße bekannt, dass die Transplantation geeigneter Zellen in ein geschädigtes Gehirn beliebige sensorische, Motor-, Verhaltens- oder psychologische Defizite, welche durch die Schädigung hervorgerufen werden, verbessern oder korrigieren kann.
Damit die zellbasierenden Therapien anwendbar sind, muss es möglich sein, ausreichende Zellen für die Transplantation zu gewinnen. Ein Mittel, um dies sicherzustellen, ist das Kultivieren nicht-differenzierter Zellen unter Bedingungen, welche eine wiederholte Zellteilung und ein wiederholtes Zellwachstum erlauben. Eine Schwierigkeit bei der Verwendung nicht-differenzierter Zellen ist, dass die ungesteuerte Zellteilung entweder vor oder während der Transplantation in den Patienten ausgeschaltet werden muss, um ein unkontrolliertes Wachstum am Transplantationsort zu verhindern.
Es wurden viele verschiedene Techniken zur Bereitstellung geeigneter Zellen für die Transplantation entwickelt. Hinsichtlich der neuralen Transplantation ist eine Vorgehensweise, nicht-differenzierte fötale Zellen unter Kulturbedingungen zu halten, welche das Auftreten der Zellteilung erlauben, und danach in vitro vor der Transplantation eine Differenzierung zu induzieren.
Reynolds und Weiss, Science, 1992; 255: 1707, offenbaren die Verwendung des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF), um die In-vitro-Proliferation adulter Hirnzellen der Maus zu induzieren. Es wurde angenommen, dass unter geeigneten Bedingungen die Zellen dazu gebracht werden könnten, sich in Astrozyten und Neuronen zu differenzieren.
Die Internationale Patentanmeldung Nr. WO-A-94/16059 offenbart eine Technik zur Aufrechterhaltung einer primären neuronalen Zellkultur in vitro durch Züchten bzw. Kultivieren der Zellen in einem serumfreien Medium, das mit einem trophischem Faktor ergänzt ist.
Die Internationale Patentanmeldung Nr. WO-A-97/10329 offenbart eine alternative Technik, die eine konditioniert bzw. bedingt immortalisierte Zelllinie verwendet. Diese Zelllinie umfasst ein immortalisierendes, temperaturempfindliches bzw. -gesteuertes Onkogen, das unter permissiven Bedingungen neuroepitheliale Stammzellen im nicht-differenzierten Zustand hält. Nach der Transplantation wird das Onkogen aufgrund der höheren Temperatur des menschlichen Körpers (37°C) ausgeschaltet, und die Zellen differenzieren sich in die zur Reparatur des Schadens erforderlichen Zell-Typen. Der Vorteil der Verwendung des Onkogens ist, dass die Zellen bis zur Transplantation im nicht-differenzierten Zustand gehalten werden, wobei sich die Zellen zu diesem Zeitpunkt in Antwort auf den spezifischen Schaden in den Phänotyp der geschädigten oder verlorenen Zellen differenzieren. US 5688692 offenbart ebenfalls Zellen, die ein an DNA nicht bindendes, temperaturempfindliches T-Antigen exprimieren.
Es wird jedoch erkannt, dass, obwohl Onkogen-exprimierende humane Zellen eine verlängerte Lebensdauer aufweisen können, sie dennoch aufhören, sich zu teilen und schließlich der Krise (Zelltod) unterfallen.
Es ist ebenfalls vorgeschlagen worden, dass humane Zellen durch Rekonstituieren der Telomerase-Aktivität durch Einbringen einer exogenen Kopie der katalytischen Untereinheit der humanen Telomerase immortalisiert werden können (Bodnar et al., Science, 1998; 279: 249-252). Die Telomerase bewirkt den Erhalt von Telomeren, die sich an den Enden von Chromosomen befinden, und es wird angenommen, dass die allmähliche Verkürzung von Telomeren während der Zellverdoppelung zur Seneszenz bzw. Alterung beiträgt, und dass daher die Rekonstitution der Telomerase-Zellen immortalisiert. Die humane Telomerase ist zur Immortalisierung vieler verschiedener Zell-Typen verwendet worden.
Counter et al., PNAS (USA), 1998; 95(25): 4723-14728, offenbaren ebenfalls, dass die ektopische Expression der katalytischen Telomerase-Untereinheit (hTERT) es bereits gealterten Zellen erlauben kann, sich über den Zelltod hinaus bis zur zellulären Immortalität zu proliferieren. Die untersuchten Zellen wurden mit einem das SV40-T-Antigen exprimierenden Onkogen transformiert. Die Autoren ziehen jedoch den Schluss, dass die hTERT-Expression allein ausreichend sein kann, Zellen zu immortalisieren, und dass die Aktivierung von hTERT der kritische Schritt in der Tumorprogression sein könnte. Daher ist die allgemeine Lehre dieser Veröffentlichung, dass mit hTERT transformierte Zellen unsterblich sein würden. Dies bedeutet, dass die Zellen zur Verwendung in der Transplantationstherapie ungeeignet sein würden.
Während daher viele der vorstehend offenbarten Techniken verwendbar sein können, besteht weiterhin ein Bedarf an Verfahren zur Erzeugung von Zellen, welche die Immortalität vor der Transplantation erhalten, jedoch die Immortalität nach der Transplantation verlieren.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Erkenntnis, dass mit einem bedingt bzw. konditioniert induzierbaren Onkogen und mindestens der katalytischen Untereinheit des Telomerase-Komplexes transduzierte Zellen unter permissiven Bedingungen unsterblich sind, jedoch die Immortalität unter nicht-permissiven Bedingungen verlieren.
Unter einem Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung umfasst eine rekombinante oder genetisch modifizierte Säugerzelle ein bedingt induzierbares oder temperaturempfindliches Onkogen und ein exogenes Polynukleotid, das mindestens für die katalytische Untereinheit des Telomerase-Komplexes codiert.
Gemäß eines zweiten Gesichtspunkts der Erfindung umfasst ein rekombinantes Polynukleotid-Konstrukt ein Gen, das mindestens für die katalytische Untereinheit des Telomerase-Komplexes codiert, und ein bedingt induzierbares oder temperaturempfindliches Onkogen.
Unter einem dritten Gesichtspunkt umfasst ein Verfahren zur Immortalisierung einer Säugerzelle das Einbringen eines bedingt induzierbaren Onkogens und eines exogenen Polynukleotids, das für die katalytische Untereinheit des Telomerase-Gens codiert, in eine proliferierende Säugerzelle.
Unter einem vierten Gesichtspunkt können die erfindungsgemäßen Zellen in der Therapie, insbesondere in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer mit einem Zellverlust oder einer Zellschädigung assoziierten Erkrankung, verwendet werden. Beispielsweise können neuroepitheliale Stammzellen zur Behandlung von mit einer Hirnschädigung assoziierten Störungen, z.B. Alzheimer, verwendet werden.
Es wurde festgestellt, dass erfindungsgemäße Zellen einen hohen Stabilitätsgrad behalten und bei nicht-permissiven Temperaturen nicht unsterblich sind.
Dies ist eine überraschende und bedeutsame Erkenntnis, da anhand des Standes der Technik erwartet würde, dass Zellen aufgrund der Rekonstitution der Telomerase-Aktivität unsterblich bleiben. Es scheint jedoch, dass, obwohl das für die Telomerase codierende Gen konstitutiv ist, die Telomerase nicht den Erhalt der Immortalität bewirkt. Aufgrund der Aufrechterhaltung der Bedingtheit und erhöhten Stabilität sind die erfindungsgemäßen Zellen dazu geeignet, zur Erzeugung einer Zelllinie für die Transplantation seriell passagiert zu werden.
Beschreibung der Zeichnungen
Die folgenden Figuren veranschaulichen die Erfindung.
1 ist eine schematische Darstellung eines Polynukleotid-Konstrukts, das sowohl hTERT und das temperaturempfindliche Onkogen, das für das große T-Antigen von SV40 codiert, enthält; und
2 ist eine schematische Darstellung einer anderen Ausführungsform eines Konstrukts mit hTERT und dem Onkogen mit einer von der 1 verschiedenen Reihenfolge.
Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung offenbart Verfahren zur Herstellung von Zellen, die für die Transplantationstherapie geeignet sind und die bis zum Zeitpunkt der Transplantation unsterblich sind.
Die Zellen benötigen das Vorhandensein eines bedingt induzierbaren Onkogens. Der Ausdruck "bedingt induzierbar" bezieht sich vorliegend auf Onkogene, deren Expression unter gewissen Bedingungen reguliert werden kann. Das Onkogen wird bei Vorliegen sogenannter erlaubender bzw. permissiver Bedingungen exprimiert. Beispielsweise sind manche Onkogene temperaturempfindlich und werden nur dann exprimiert, wenn die Temperatur ihrer Umgebung unterhalb eines gewissen Werts liegt. In einer Ausführungsform der Erfindung ist das verwendete Onkogen eine nicht-DNA-bindende, temperaturempfindliche Mutante des großen T-Antigen-Gens von SV40 (U19tsA58). Geeignete andere Ausführungsformen sind ebenfalls bekannt und schließen das Onkogen des Polyom-T-Antigens ein.
Die Zellen benötigen ebenfalls ein exogenes Polynukleotid, das mindestens für die katalytische Untereinheit des Telomerase-Komplexes codiert. Der Ausdruck "exogen" wird vorliegend in seinem normalen Kontext verwendet und bezieht sich auf das in die Zelle eingeführte Polynukleotid und wird von natürlicherweise vorkommenden endogenen Polynukleotiden unterschieden. Die katalytische Untereinheit des Telomerase-Komplexes ist ein Enzym, das wie eine Reverse Transkriptase wirkt, und es ist im Fachgebiet bekannt. Die humane Untereinheit ist in GB-A-2317891 offenbart.
Das Onkogen und das für die Telomerase codierende Polynukleotid können in einem rekombinanten DNA- oder retroviralen Vektor oder Konstrukt enthalten sein, um die Zellen zu transduzieren/infizieren. Die zwei Komponenten können in einem Vektor enthalten sein, oder es kann jede in einem getrennten Vektor vorliegen. Die Vektoren oder Konstrukte der Erfindung können weiter eine geeignete Promotor-Region zur Initiation der Transkription von DNA und einen selektierbaren Marker bzw. eine selektierbare Markierung umfassen, welcher/welche zur Identifizierung derjenigen Zellen verwendet werden kann, die transduziert/infiziert worden sind. Die Regulation der Expression kann durch einem Fachmann bekannte Verfahren durchgeführt werden. Beispielsweise kann eine Regulation unter Verwendung des "long terminal repeat"(LTR)-Promotors bewirkt werden. Alternative Promotoren sind einem Fachmann ersichtlich. Beispielsweise kann eine Regulation unter Verwendung des Cytomegalovirus-(CMV)Promotors bewirkt werden. Der CMV-Promotor ist ein sehr starker Promotor und kann bevorzugt werden, wenn die Zellen neurale Zellen, z.B. neuroepitheliale Stammzellen, sind.
Verfahren zum Einbringen geeigneter Konstrukte in Zellen sind einem Fachmann bekannt.
Es können beliebige Säugerzellen in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Beispielsweise kann die Zelle eine endotheliale Zelle sein und zur Revaskularisierung des Beines, des Herzens und anderer Organe verwendet werden. Vorzugsweise ist die Zelle eine humane somatische Zelle, z.B. eine humane epitheliale Stammzelle, die zur Differenzierung in einen spezifischen Zell-Typ befähigt ist. Eine besonders bevorzugte Zelle ist eine humane neuroepitheliale Stammzelle, die in der neuralen Transplantation zur Behebung eines Zellverlusts bzw. -schadens und zur Korrektur von Verhaltens- oder psychologischen Defiziten verwendet werden kann. In einer anderen Ausführungsform können die Zellen eine differenzierte Zelle, z.B. die ß-Zellen der Langerhans'schen Inseln, sein. Weitere Zellen können diejenigen einschließen, die aus endokrinen Drüsen, Retinazellen, kochlearen Zellen, Leberzellen, Osteoblasten und Osteoklasten, Myoblasten und Keratinozyten erhalten werden können, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Vorzugsweise werden das Onkogen und die Telomerase in die Zelle während der frühen Kulturphase, üblicherweise innerhalb der ersten 10 Zellteilungen, eingebracht. Die Reihenfolge der Einbringung des Onkogens und der Telomerase ist für den Erfolg des Verfahrens nicht entscheidend, obwohl es bevorzugt ist, dass die Telomerase zuerst eingebracht wird. Dies liegt daran, dass überraschenderweise festgestellt wurde, dass die Erzeugung einer diploiden Zelllinie besser sichergestellt wird, wenn die Telomerase zuerst eingebracht wird.
Die transduzierte oder infizierte Zelle kann unter einem Fachmann bekannten Bedingungen kultiviert bzw. gezüchtet werden. Es ist bevorzugt, dass die Zellen unter Bedingungen ohne Stress kultiviert werden. Ein Fachmann kennt auf Basis der üblichen Kulturtechniken die für jeden einzelnen Zell-Typ geeigneten Bedingungen.
Die Erfindung wird nachstehend in den folgenden Beispielen mit Bezug auf die Zeichnungen weiter beschrieben. Die Beispiele zeigen, dass es durch Transduktion geeigneter humaner Zellen mit einem temperaturempfindlichen Onkogen und der katalytischen Untereinheit des Telomerase-Komplexes möglich ist, die Stabilität der Zellkulturen während ihrer Passage in einem geeigneten Kulturmedium zu erhalten.
Beispiel 1
1. Isolierung interlobulärer Brustfibroblasten (HMF) und mikrovaskulärer endothelialer Brustzellen (MMVE):
Kulturen von interlobulären Brustfibroblasten und mikrovaskulären endothelialen Brustzellen wurden aus normalem Brustgewebe, das mit Zustimmung von Patientinnen, die sich einer kosmetischen Operation (Reduktionsmammoplastie) unterzogen, erhalten. Kulturen von interlobulären Fibroblasten wurden, wie in Atherton et al., J. Cell Sci., 107: 2931-2939, beschrieben, hergestellt und in Dulbecco's modifizierten Eagles Medium (DMEM), ergänzt durch 10% fötales Kälberserum und Antibiotika (Penicillin/Streptomycin), gehalten. Endotheliale Zellen aus Mikrogefäßen wurden durch immunmagnetische Sortierung von Primärkulturen unter Verwendung des monoklonalen Maus-Antikörpers QBEND-40 gegen Thrombomodulin, im wesentlichen wie von Drake & Lock, Human Reprod., 1992; 6: 1156-1159, beschrieben, isoliert. Endotheliale Kulturen wurden im EGM-2-Medium (Biowhittaker) etabliert und gehalten.
2. In-vitro-Kultur von Zellen bis zur Alterung.
Als Kontrolle wurden Zellen zur Bestimmung des Zeitpunktes der Alterung bzw. Seneszenz kultiviert. Es wurde festgestellt, dass die Zellen eine Kultur-Lebensdauer von zwischen 10-16 Populationsverdoppelungen aufwiesen, wenn sie in EGM-2 kultiviert wurden. Abgesehen von einer Anhäufung granulärer Partikel im Zytoplasma, ähnelten die gealterten Zellen ihren Entsprechungen während früher Passagen, wobei sie sich von diesen nur aufgrund der vollständigen Abwesenheit der Mitose unterschieden.
3. Transduktion mit tsA58-U19 und verlängertes Wachstum bis zum Zelltod.
Noch proliferierende Zellpräparationen verschiedener individueller Spender wurden zwischen den Populationsverdoppelungen 6-9 mit der doppelt rekombinanten Mutante tsA58-U19 (Almazan und McKay, Brain Res., 1992; 579(s): 234-245) des SV-40-T-Antigen-Gens im das neo-r-Gen enthaltenden pZIP-Vektor transduziert. Die Transduktion wurde unter Verwendung eines Helfervirus-freien amphotropen retroviralen Verpackungssystems (PA317, Klon 8), wie in Stamps et al., Int. J. Cancer, 1994; 57(6): 865-874, beschrieben, durchgeführt. Es wurde Polybrene bei 8 μg/ml als Adjuvans verwendet, um die Virusaufnahme zu verbessern.
Die Transduktionsfrequenzen waren zwischen 10-25% nach Selektion mit Geneticin bei 0,25 mg/ml veränderlich. Nach dem Übergang zur für tsA58 permissiven Temperatur (33,5°C) wurden diese Kulturen weiter für zwischen 33 und 56 Populationsverdoppelungen bei einem Aufteilungsverhältnis von 1:4 passagiert. Während dieser Zeit blieben alle Zellen mit wenig oder keinem Wachstum bei 36,5°C und darüber streng temperaturempfindlich. In allen Fällen hörte das Wachstum jedoch schließlich unter dem Auftauchen einer abnormalen Mitose und abnormalen Zellmorphologien, einschließlich einer Größen- und nukleären Heterogenität, die den Zelltod anzeigt, auf. Eine Gesamtzahl von insgesamt nicht weniger als 10⁸ Zellen wurde bis zum Zelltod passagiert, ohne dass ein einziger Fall einer "spontanen" Immortalisierung beobachtet wurde. Dies steht im Gegensatz zu epithelialen Säugerzellen, die sich mit einer Häufigkeit von ungefähr 1 in 5 × 10⁶ Zellen, die bis zum Zelltod gehalten werden, wiederholt immortalisieren.
4. Transduktion mit h-TERT und nachfolgender Immortalisierung unter Beibehaltung eines bedingten Wachstums.
Frühe passagierte Zellen einer Spenderin, die mit dem ts-T-Antigen-System transduziert waren (MMVE-2), wurden weiter mit einer Kopie der vollständigen cDNA der katalytischen Untereinheit des humanen Telomerase-Gens im pBabe-Vektor (Morgenstern und Land, Nucleic Acids Research, 1990; 18: 3587-3596) zusammen mit einem Hygromycin-B-Resistenzgen unter Verwendung eines humanen amphotropen Verpackungssystems (TE-FLY) transduziert. Es wurde eine Reihe von vier klonierten Verpackungslinien verwendet, die zuvor hinsichtlich der höchsten Titer auf Basis der Übertragung der Hygromycin-Resistenz auf eine humane Ziel-Zelllinie (EJ-Blasenkarzinomzellen) selektioniert worden waren. Jede wurde verwendet, um in zweifacher Ausführung die MMVE-2-ts-T-Zellen in Gegenwart von 8 μg/ml Polybrene zu transduzieren. Eine erfolgreiche Transduktion wurde nach Selektion mit 25 μg/ml Hygromycin B festgestellt.
Überraschenderweise schienen die transduzierten Zellen die Alterung zu überwinden und proliferierten bei 33,5°C ohne jegliche offenkundige Krise oder Veränderung der Proliferationsraten für über 40 Wochen weiter. Die Zellen haben bis jetzt >100 Populationsverdoppelungen bei einer konstanten Rate durchgemacht und erscheinen funktionell unsterblich zu sein.
Wenn sie hinsichtlich der Temperaturempfindlichkeit durch Replika-Kultur bei 33,5, 36,5 und 39,5°C getestet wurden, waren die hTERT-transduzierten MMVE-2-ts-T-Zellen überraschenderweise genauso empfindlich wie frühe passagierte Zellen, die nur tsT aufwiesen. Im Gegensatz zur möglichen Erwartung wurde bei 36,5°C nur wenig und bei 39,5°C kein Wachstum festgestellt, d.h., die Zellen waren bedingt unsterblich. Alle Kulturen wurden mit dem EGM-2-Medium durchgeführt, das eine Reihe endothelspezifischer Wachstumsfaktoren, einschließlich b-FGF, VEGF, IGF-2 und Heparin, sowie 2% FCS enthält, was es somit vermeidet, die Zellen unter suboptimalen oder "Stress"-Wachstumsbedingungen zu testen.
Um das Ausmaß zu bestimmen, bis zu welchem der temperaturinduzierte Wachstumsstop irreversibel war, wurden die Fibroblasten-Kulturen unter Verwendung eines klonogenen Tests analysiert, in welchem die Kolonie-Bildungseffizienz (CE) unter optimalen Bedingungen (5% Sauerstoff bei 33,5°C) nach verschiedenen Zeitspannen des Wachstumsstops bei 39,5°C bestimmt wurde. Es lag eine deutliche Verminderung beim CE in den meisten Kulturen vor, die zur Zeit der nicht-permissiven Temperatur proportional war. In einer der HMF-Kulturen fiel beispielsweise der CE nach 14 Tagen bei 39,5°C auf <5% des Kontrollwerts ab, wobei die meisten Kolonien klein und unvollkommen waren. Die Ergebnisse zeigen die fortschreitende Irreversibilität der transduzierten Zellen und zeigen, dass dies eher auf die thermische Inaktivierung des T-Antigens als auf einen nicht-spezifischen Hitzeschockeffekt zurückzuführen ist.
Die Zellen wurden ebenfalls getestet, um festzustellen, ob sie nach der Inaktivierung des T-Antigens eine biochemische Alterung durchlaufen, indem die Kulturen hinsichtlich der alterungsaktivierten sauren ß-Galactosidase gefärbt wurden. Nach 4-8 Tagen bei 39,5°C zeigten alle Fibroblasten-Kulturen unterschiedliche Anzahlen positiver Zellen (1-10%), während in entsprechenden Kulturen bei 33,5°C keine positiven Zellen (<0,1%) beobachtet wurden. Dies ist mit einer sich in der Krise befindenden Kultur von HMF-Fibroblasten, die nur das T-Antigen aufweisen, vergleichbar, bei denen 53% der Zellen positiv waren. Dies zeigt, dass die immortalisierten Zellen zur Beibehaltung des Wachstums vom T-Antigen abhängig sind, und dass die Inaktivierung des T-Antigens eine irreversible Beendigung des Zellwachstums und den Eintritt in die Alterung hervorruft.
Die Zellkulturen wurden auch karyotypisiert, um zu bestimmen, ob das Timing und der zeitliche Ablauf der retroviralen Gentransduktion den chromosomalen Zustand der resultierenden Zellen beeinflusste. Es wurde eine diploide oder nahezu diploide Modalzahl von Chromosomen (46) sowohl in MMVE- als auch HMF-Zellen beobachtet, die erzeugt wurden, indem beide Gene während der frühen Phase (d.h., innerhalb der ersten 10 Zellteilungen) eingebracht wurden, wobei hTERT zuerst eingebracht wurde. Wenn beide Gene während der frühen Phase eingebracht wurden, und das Onkogen zuerst eingebracht wurde, wurde festgestellt, dass die Zellen einen bimodalen Karyotyp mit nahe diploiden und nahe tetraploiden Formen aufwiesen. Dies ist eine überraschende Feststellung und zeigt, dass diploide Zellen wirksamer hergestellt werden können, indem man die Wahl trifft, dass die katalytische Untereinheit der Telomerase zuerst in die Zelle eingeführt wird.
Zusammenfassend zeigen die erhaltenen Ergebnisse überraschenderweise, dass Zellen, welche das vollständige, für die katalytische Untereinheit der Telomerase codierende Gen und das temperaturempfindliche Onkogen umfassen, bedingt wachstumsfähig bleiben, d.h., die Zellen sind bei hohen Temperaturen nicht unsterblich.
Die obigen Ergebnisse zeigen, dass die getrennte Transduktion mit einem temperaturempfindlichen Onkogen und einer katalytischen Telomerase-Untereinheit im Vergleich zu Zellen, die nur das temperaturempfindliche Onkogen aufweisen, verbesserte Eigenschaften hervorrufen kann.
Obwohl eine getrennte Transduktion gute Ergebnisse zeigt, kann es leichter sein, einen geeigneten Vektor zu konstruieren, der sowohl das Onkogen als auch das für die Telomerase codierende Gen enthält.
Beispiel 2
Dieses Beispiel zeigt die Herstellung geeigneter Expressionsvektoren zur Co-Expression eines thermolabilen T-Antigens, das von der DNA-nicht-bindenden Mutante der frühen SV40-Region (U19tsA58) abgeleitet ist, der katalytischen Untereinheit hTERT des Telomerase-Komplexes (cDNA) (Counter et al., PNAS, 1998; 95(25): 14723-14728) und einer dominant wirkenden selektierbaren Neomycin-Phosphotransferase-Resistenzmarkierung (Neo), die G418 eine Resistenz verleiht (Clontech). Das Endkonstrukt wurde im retroviralen pBabe-Expressionsvektor zusammengesetzt, der auf dem murinen Moloney-Leukämievirus (Mo MuLV) mit hohem Titer basiert (Morgenstern und Land, supra). Der Retrovirus-Lebenszyklus wurde verwendet, um die frühe SV40-Region in Viren umzuwandeln, die nur das große T-Antigen herstellen. Alle Konstrukte wurden in einem rec-A-Wirt (JS4-rec-A-Derivat von MC1061) unter Verwendung einer Ampicillin-Selektion, zusammengesetzt.
Es wurden zwei Versionen des Vektors konstruiert:
Konstrukt 1
Dieses Konstrukt ist in der 1 dargestellt. Der Mo-MuLV-LTR wurde zur Steuerung von hTERT verwendet, und der frühe SV40-Promotor wird zur Steuerung sowohl von U19tsA58 als auch von Neo verwendet. Es wurde eine interne Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES) zwischen den Genen U19tsA58 und Neo integriert (mit dem Neo-Gen im Leseraster fusioniert), um eine Reinitiation der Translation durch eukaryotische Ribosomen zu induzieren.
Konstrukt 2
Dieses Konstrukt ist in der 2 dargestellt. Mo-MuLV-LTR wurde zur Steuerung von U19tsA58 verwendet, und der frühe SV40-Promotor wird verwendet, um hTERT und Neo zu steuern. Es wurde eine IRES-Sequenz zwischen hTERT und Neo eingefügt.
Klonierungsstrategie
Jeder Vektor wurde in drei Abschnitten zusammengesetzt. Es wurden die Vektoren pBabe-Neo-hTERT (hTERT wurde aus pCI-Neo-hTERT ausgeschnitten, der von R.A. Weinberg, Whitehead Institute, bereitgestellt wurde) und pBabe-Neo-U19tsA58 (bei dem U19tsA58 in der Sinn-Orientierung in Bezug auf die Retrovirus-Transkription eingefügt ist) verwendet, um das vordere Ende des Konstrukts 1 bzw. 2 herzustellen.
Die Klonierung der IRES und ihre Fusion im Leseraster des Neo-Gens wurden im Klonierungsvektor pPolyIII-I (von D. Kioussis, MRC, Mill Hill, erhalten) durchgeführt. pPolyIII-I ist ein nützlicher Vektor, um Gensequenzen zu konstruieren, da er einen großen Polylinker enthält, der viele Restriktionsschnittstellen, die eine 6er-Nukleotidsequenz erkennen, umfasst. Die dritte Komponente wurde aus dem Vektor pBabe-Puro (pBabe mit einem Puromycin-Resistenzgen) kloniert.
Konstrukt 1
A. Klonierung von IRES:Neo
Die Neo-Sequenz wurde mittels PCR, ausgehend vom pLXSN-Vektor (Clontech), amplifiziert. Um die Gesamtlänge des Konstrukts auf ein Minimum zu beschränken, wurde nur die für Neo codierende Region (Bp 2066 – Bp 2860 von pLXSN) verwendet. Die IRES mit 586 Bp (5'-nicht-codierende Region der Enzephalomyokarditis-Virus-(EMC)-RNA) ist aus dem Novogen-Vektor pCITE-1 erhältlich. Die Initiationsregion von EMC weist eine Bal I-Klonierungsstelle an Position 2918 und eine Nco I-Stelle an Position 2925 von pCITE-1 auf, was zur Einfügung der Fremdsequenz im Leseraster verwendet werden kann.
Es ist empfehlenswert, dass fremde Sequenzen ohne ihr eigenes AUG im Leseraster mit dem viralen AUG bei 2915-2917 fusioniert werden, jedoch erzeugt das Schneiden mit Bal I ein G am Anfang des ersten Kodons nach dem AUG der Fremdsequenz. Dies ist mit der Neo-Sequenz nicht kompatibel, bei der die erste Base nach dem AUG ein A ist. Um dieses Problem zu umgehen, wurde der zur Amplifikation der Neo-Sequenz, ausgehend von pLXSN, verwendete Neo-Primer, derart entworfen, dass die IRES-Sequenz zwischen den Basen 2918 und 2929 wieder hergestellt wurde.
Forwärts-Neo-Primer (SEQ ID NO. 1)
Um das 3'-Ende der Neo-Sequenz in pPolyIII-I einzufügen, wurde der 3'-PCR-Primer bzw. -Starter derart entworfen, dass er eine Sal I-Stelle und eine Cla I-Stelle enthielt (zur Klonierung aus pPolyIII-I in pBabe).
Rückwärts-Neo-Primer (SEQ ID NO. 2)
Es war daher möglich, die IRES aus pCITE-1 mit Eco RI und Bal I (Isoschizomere sind Mls I, Msc I) auszuschneiden und die Sequenz in die Eco RI- und Bal I-Stellen von pPolyIII-I zu ligieren. Die Neo-Sequenz wurde dann, ausgehend vom Vektor pLXSN, unter Verwendung der zuvor angegebenen Vorwärts- und Rückwärts-Neo-Primer amplifiziert, und die 3'-Region des PCR-Produkts wurde mit Sal I vor der Ligation in die Bal I- und Sal I-Stellen von pPolyIII-I-IRES geschnitten.
B. Einfügen von U19tsA58
U19tsA58 wurde aus pZip-U19tsA58 (von P. Jat vom Ludwig Institute for Cancer Research bereitgestellt) durch einen Verdau mit Bam HI ausgeschnitten und in die Bam-HI-Stelle von pPolyIII-I-IRES:Neo in der Sinn-Orientierung in Bezug auf die Retrovirus-Transkription eingefügt.
C. Endkonstrukt
Das Endkonstrukt wurde durch dreiteilige Ligation erzeugt:

(i) U19tsA58-IRES-Neo, ausgeschnitten aus pPolyIII-I-U19tsA58-IRES:Neo durch Sfi-I-Cla-I-Verdau;
(ii) die Vorderseite des durch Verdau mit Sfi I und Not I erhaltenen Konstrukts aus dem Vektor pBabe-Neo-hTERT. Es wird der linke Abschnitt benötigt; und
(iii) ein pBS-ori-enthaltendes Fragment, das durch Verdau mit Cla I und Not I aus dem Vektor pBabe-Puro erhalten wurde. Es wird die rechte Seite des Vektors benötigt.

Das Endkonstrukt ist wie in 1 gezeigt.
Konstrukt 2
A. pPolyIII-I-hTERT-IRES:Neo
Um die hTERT-cDNA und IRES:Neo in pPolyIII-I zu klonieren, wurde pBabe-Neo-hTERT zunächst mit Sal I verdaut, das am 3'-Ende von hTERT schneidet. Die Klonierungsstellen von hTERT sind Eco RI (5') und Sal I (3'), jedoch kann hTERT nicht in die Sal-I-Stelle von pPolyIII-I kloniert werden, da dies die Klonierungsstelle für das 3'-Ende von IRES:Neo ist. Daher wurde die hTERT-Sequenz vor dem Ausschneiden der cDNA-Sequenz aus pBabe-Neo-hTERT mit Eco RI mit stumpfen Enden versehen. PPolyIII-I-IRES:Neo wurde mit Eco RI ausgeschnitten, mit stumpfen Enden versehen und mit Sal I geschnitten, um IRES:Neo auszuschneiden. hTERT und IRES:Neo wurden dann in die Eco-RI- und Sal-I-Stellen von pPolyIII-I kloniert, wobei sie durch eine Ligation stumpfer Enden zwischen 3'-hTERT und 5'-IRES:Neo verbunden wurden.
Der Aufbau des Konstrukts 2 schloss eine dreiteilige Ligation ein:

(i) hTERT-IRES:Neo, ausgeschnitten aus pPolyIII-I-IRES:Neo an den Sfi-I- und Cla-I-Stellen;
(ii) die linke Seite des Konstrukts 2 wurde aus dem Vektor pBabe-Neo-U19tsA58 durch Verdau mit Sfi I und Not I erhalten; und
(iii) die rechte Seite des Konstrukts wurde aus dem Vektor pBabe-Puro durch Verdau mit Cla I und Not I erhalten. Das Endkonstrukt ist wie in 2 gezeigt.

Hinsichtlich der Ausgestaltung der Konstrukte kann es wünschenswerter sein, die Expression sowohl der Onkogen- als auch der hTERT-Komponenten durch den CMV-Promotor zu steuern. Dies könnte ausgeführt werden, indem die Komponenten unter Verwendung einer IRES-Sequenz unter Einfügung in einen retroviralen Vektor stromabwärts von einem CMV-Promotor verknüpft werden.
Die Konstrukte können verwendet werden, um geeignete Zellen zur Herstellung bedingt immortalisierter Zellen, die eine verbesserte Stabilität während der Passagierung aufweisen, zu transduzieren.
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Zellen können in der Therapie verwendet werden. Verfahren zur Herstellung von Formulierungen zur Verabreichung an einen Patienten sind einem Fachmann ersichtlich. Geeignete Hilfsstoffe, Verdünnungsmittel usw. sind ebenfalls auf Basis der derzeitigen Praxis in der Herstellung zellbasierter Therapien ersichtlich. Die zur Verabreichung benötigte Menge der Zellen ist in Abhängigkeit von der Form der Behandlung, der Schwere der Erkrankung/Schädigung und dem Bedarf an der Verabreichung mehrfacher Dosen über einen Behandlungszeitraum veränderlich.
Ein Fachmann kann jedoch leicht die geeignete Behandlung anhand bestehender Zelltransplantationstherapien bestimmen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Säugerzelle mit der Maßgabe, dass sie keine humane embryonale Stammzelle ist, umfassend ein bedingt induzierbares Onkogen und ein exogenes Polynukleotid, das für die katalytische Untereinheit des Telomerase-Komplexes codiert.
Zelle nach Anspruch 1, wobei das Onkogen und das exogene Polynukleotid in einem rekombinanten Vektor enthalten sind.
Zelle nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Onkogen temperaturempfindlich ist.
Zelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, die eine humane somatische Zelle ist.
Zelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, die eine Säugerbindegewebsfibroblastenzelle oder eine mikrovaskuläre Säugerzelle ist.
Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 4, die eine humane Stammzelle mit der Maßgabe ist, dass sie keine humane embryonale Stammzelle ist.
Zelle nach Anspruch 6, die eine neuroepitheliale Stammzelle ist.
Zelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Onkogen die temperaturempfindliche Mutante des SV-40-T-Antigen-Gens umfasst.
Zelle nach Anspruch 8, wobei die Mutante tsA58-U19 ist.
Rekombinantes Polynukleotid, das für die katalytische Untereinheit des Telomerase-Komplexes und ein bedingt induzierbares Onkogen codiert.
Polynukleotid nach Anspruch 10, das weiter ein selektierbares Markierungsgen und eine Promotorregion umfasst.
Verfahren zur Immortalisierung einer isolierten Säugerzelle mit der Maßgabe, dass sie keine humane embryonale Stammzelle ist, umfassend das Einbringen eines bedingt induzierbaren Onkogens und eines für die katalytische Untereinheit des Telomerase-Komplexes codierendes exogenes Polynukleotids in eine proliferierende Zelle.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Onkogen und das exogene Polynukleotid innerhalb der ersten 10 Zellteilungen in die Zelle eingebracht werden.
Verfahren nach Anspruch 12 oder Anspruch 13, wobei das exogene Polynukleotid vor dem Onkogen in die Zelle eingebracht wird.
Verwendung einer Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Erkrankung, die mit einem Zellverlust oder einer Zellschädigung assoziiert ist.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei die Zelle eine neuroepitheliale Stammzelle ist.