JP2003524378A - サイクリンｄ１の過剰発現により媒介される真核細胞内での所望のタンパク質の過剰発現 - Google Patents
サイクリンｄ１の過剰発現により媒介される真核細胞内での所望のタンパク質の過剰発現Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、（a）サイクリンD遺伝子産物をコードする挿入された核酸、および（b）関心のあるタンパク質をコードする挿入された核酸を含む、タンパク質発現に有用な真核細胞（該サイクリンD遺伝子産物および前記の関心のあるタンパク質は該細胞内で発現される）に関する。本発明はまた、（a）サイクリンD遺伝子産物をコードする核酸と関心のあるタンパク質をコードする核酸とを真核細胞内に挿入し、（b）関心のあるタンパク質の発現を可能にする条件下で該細胞を培養し、（c）関心のあるタンパク質を単離することを含む、関心のあるタンパク質の製造方法に関する。該細胞は、好ましくは哺乳類細胞であり、CHO細胞が最も好ましい。該サイクリンD遺伝子産物は、好ましくはヒト由来である。適当な関心のあるタンパク質には、エリトロポエチン（EPO）、オステオプロテゲリン（OPG）、OPG-Fc、レプチン、Fc-レプチンおよび新規赤血球形成刺激タンパク質（NESP）が含まれる。
Description
【０００１】
（発明の背景）
哺乳動物の細胞周期の進行は、サイクリン依存性キナーゼ（CDK）の秩序だっ
た活性化により駆動される。活性なCDKは、触媒サブユニット、およびサイクリ
ンと称される調節サブユニットから構成される。CDK活性は、サイクリンとCDKイ
ンヒビター（CKI）との相互作用を介して、および翻訳後修飾（例えば、リン酸
化）により調節される。
た活性化により駆動される。活性なCDKは、触媒サブユニット、およびサイクリ
ンと称される調節サブユニットから構成される。CDK活性は、サイクリンとCDKイ
ンヒビター（CKI）との相互作用を介して、および翻訳後修飾（例えば、リン酸
化）により調節される。
【０００２】
細胞周期段階間の移行は、定められたチェックポイントにおいて種々のサイク
リンサブユニットにより調節される（例えば、G1/S移行はG1サイクリンにより、
S期を通過する進行はSサイクリンにより、そして分裂期への進入はG2または分裂
サイクリンにより調節される）。G1後期の限定点（R）において、細胞はS期に進
入するように委ねられ、その後は、細胞分裂を完了させるためにはマイトジェン
増殖因子はもはや要求されない。
リンサブユニットにより調節される（例えば、G1/S移行はG1サイクリンにより、
S期を通過する進行はSサイクリンにより、そして分裂期への進入はG2または分裂
サイクリンにより調節される）。G1後期の限定点（R）において、細胞はS期に進
入するように委ねられ、その後は、細胞分裂を完了させるためにはマイトジェン
増殖因子はもはや要求されない。
【０００３】
サイクリンDおよびEはG1期中に順次合成され、これがS期への進入のための律
速段階となるため、それらはG1サイクリンとみなすことができる。少なくとも3
種の哺乳類遺伝子がD型サイクリン（D1、D2およびD3）をコードしている。D型サ
イクリンは、分裂刺激に対する遅延初期応答の一部として進行的に誘導され、そ
れらは細胞系譜に特異的に発現される。D型サイクリンとCDK4およびCDK6との集
合はマイトジェンにより翻訳後に調節される。集合したら、サイクリンD結合型C
DKは、触媒活性を獲得するためにはCDK活性化キナーゼ（CAK）によりリン酸化さ
れる必要がある。
速段階となるため、それらはG1サイクリンとみなすことができる。少なくとも3
種の哺乳類遺伝子がD型サイクリン（D1、D2およびD3）をコードしている。D型サ
イクリンは、分裂刺激に対する遅延初期応答の一部として進行的に誘導され、そ
れらは細胞系譜に特異的に発現される。D型サイクリンとCDK4およびCDK6との集
合はマイトジェンにより翻訳後に調節される。集合したら、サイクリンD結合型C
DKは、触媒活性を獲得するためにはCDK活性化キナーゼ（CAK）によりリン酸化さ
れる必要がある。
【０００４】
サイクリンD遺伝子は、A型、B型またはE型サイクリンとは異なる進化樹分枝上
に存在し、D型サイクリンは、他のサイクリンとは異なるいくつかの特性を有す
る。該サイクリンは短寿命（t1/2<25分）のタンパク質である。G1期中の増殖因
子の消失は、サイクリンDの安定した蓄積を妨げ、これは、増殖因子枯渇細胞がR
点を越えて進行しないことと相関している。このように、サイクリンA、Bおよび
Eの周期的発現とは異なり、サイクリンDの発現は細胞外シグナルにより調節され
る。
に存在し、D型サイクリンは、他のサイクリンとは異なるいくつかの特性を有す
る。該サイクリンは短寿命（t1/2<25分）のタンパク質である。G1期中の増殖因
子の消失は、サイクリンDの安定した蓄積を妨げ、これは、増殖因子枯渇細胞がR
点を越えて進行しないことと相関している。このように、サイクリンA、Bおよび
Eの周期的発現とは異なり、サイクリンDの発現は細胞外シグナルにより調節され
る。
【０００５】
げっ歯類またはヒト繊維芽細胞内でのヒトサイクリンD1およびEの過剰発現はG
1期を短縮し、細胞サイズを減少させ、G1期からS期への移行のための血清要求性
を低下させる（Resnitzkyら, MCB 14, 1669-79 (1994); Quelleら, Genes & Dev elopment 7, 1559-71 (1993); Ohtsubo & Roberts, Science 259, 1908-12 (199
2)）。これらの結果は、Dサイクリンが、サイクリンEにより生理的に調節される
機能を無効にしたり、その逆も生じうることを示唆している。しかしながら、サ
イクリンDまたはEの過剰発現は繊維芽細胞のトランスフォーメーションにつなが
らない。すなわち、細胞は依然として血清依存性であり、接触阻止を受け、半固
体培地内でコロニーを形成する能力を有さない。また、サイクリンD1の過剰発現
は内在性遺伝子の増幅を増強することが判明しており、このことは、それが腫瘍
発生中のゲノム不安定性において何らかの役割を果たしていることを示唆してい
る（Zhouら, Cancer Res. 56: 36-9 (1996)）。
1期を短縮し、細胞サイズを減少させ、G1期からS期への移行のための血清要求性
を低下させる（Resnitzkyら, MCB 14, 1669-79 (1994); Quelleら, Genes & Dev elopment 7, 1559-71 (1993); Ohtsubo & Roberts, Science 259, 1908-12 (199
2)）。これらの結果は、Dサイクリンが、サイクリンEにより生理的に調節される
機能を無効にしたり、その逆も生じうることを示唆している。しかしながら、サ
イクリンDまたはEの過剰発現は繊維芽細胞のトランスフォーメーションにつなが
らない。すなわち、細胞は依然として血清依存性であり、接触阻止を受け、半固
体培地内でコロニーを形成する能力を有さない。また、サイクリンD1の過剰発現
は内在性遺伝子の増幅を増強することが判明しており、このことは、それが腫瘍
発生中のゲノム不安定性において何らかの役割を果たしていることを示唆してい
る（Zhouら, Cancer Res. 56: 36-9 (1996)）。
【０００６】
（発明の概要）
本発明は、真核細胞であって、
（a）いずれの天然発現レベルよりも高いレベルで該細胞内で機能的に発現され
るサイクリンD遺伝子産物と、 （b）いずれの天然発現レベルよりも高いレベルで該細胞内で発現される関心の
あるタンパク質とを含んでなる真核細胞に関する。
るサイクリンD遺伝子産物と、 （b）いずれの天然発現レベルよりも高いレベルで該細胞内で発現される関心の
あるタンパク質とを含んでなる真核細胞に関する。
【０００７】
本発明はまた、関心のあるタンパク質の製造方法であって、
（A）真核細胞を作製し（該真核細胞は、
（1）いずれの天然発現レベルよりも高いレベルのサイクリンD遺伝子産物と
、 （2）いずれの天然発現レベルよりも高いレベルの関心のあるタンパク質と
を発現する）、 （B）前記の関心のあるタンパク質の発現と該サイクリンD遺伝子産物の機能的発
現とを可能にする条件下で該細胞を培養し、 （C）前記の関心のあるタンパク質を単離することを含んでなる製造方法に関す
る。
、 （2）いずれの天然発現レベルよりも高いレベルの関心のあるタンパク質と
を発現する）、 （B）前記の関心のあるタンパク質の発現と該サイクリンD遺伝子産物の機能的発
現とを可能にする条件下で該細胞を培養し、 （C）前記の関心のあるタンパク質を単離することを含んでなる製造方法に関す
る。
【０００８】
本発明の細胞は、好ましくは、哺乳類細胞であり、CHOが最も好ましい。該サ
イクリンD遺伝子産物は、好ましくは、哺乳類のものであり、ヒト由来のものが
最も好ましい。該サイクリンD遺伝子または関心のあるタンパク質をコードする
遺伝子（またはそれらの両方）は、細胞内の発現ベクター内に含まれていてもよ
く、あるいは細胞ゲノム内に組込まれていてもよい。
イクリンD遺伝子産物は、好ましくは、哺乳類のものであり、ヒト由来のものが
最も好ましい。該サイクリンD遺伝子または関心のあるタンパク質をコードする
遺伝子（またはそれらの両方）は、細胞内の発現ベクター内に含まれていてもよ
く、あるいは細胞ゲノム内に組込まれていてもよい。
【０００９】
関心のある多数のタンパク質を本発明において使用することができる。特に、
EPO、OPG、レプチンおよびNESPならびにそれらの誘導体を使用することができる
。
EPO、OPG、レプチンおよびNESPならびにそれらの誘導体を使用することができる
。
【００１０】
（発明の詳細な記載）
本明細書全体で用いる用語に関しては、特定の場合において限定されない限り
、以下の定義が適用される。
、以下の定義が適用される。
【００１１】
核酸の「挿入」なる語は、核酸が外的方法（例えば、トランスフェクション）
により細胞または生物内に導入されることを意味する。挿入される核酸は、細胞
ゲノムにとって外来性の又は該細胞ゲノム内に既に存在する配列を有していても
よい。後者の場合、該挿入核酸は、該挿入核酸にコードされるタンパク質の、よ
り高度な又は差次的に調節される発現を可能にする。
により細胞または生物内に導入されることを意味する。挿入される核酸は、細胞
ゲノムにとって外来性の又は該細胞ゲノム内に既に存在する配列を有していても
よい。後者の場合、該挿入核酸は、該挿入核酸にコードされるタンパク質の、よ
り高度な又は差次的に調節される発現を可能にする。
【００１２】
「EPO関連タンパク質」は、組換えDNA法および他の方法により製造されうるエ
リトロポエチンならびにその誘導体および類似体を意味する。そのような誘導体
には、末端トランケート化、中間部のアミノ酸の除去（例えば、結合するDNAの
制限酵素処理および再連結によるもの）、アミノ酸の置換などを有するタンパク
質が含まれる。そのような誘導体には、融合タンパク質（例えば、Fc領域を有す
るもの）も含まれる。エリトロポエチン誘導体の代表例は、国際特許出願WO91/0
5867、94/09257、88/03808および86/07594（それらのそれぞれを参照により本明
細書に組み入れることとする）に記載されている。
リトロポエチンならびにその誘導体および類似体を意味する。そのような誘導体
には、末端トランケート化、中間部のアミノ酸の除去（例えば、結合するDNAの
制限酵素処理および再連結によるもの）、アミノ酸の置換などを有するタンパク
質が含まれる。そのような誘導体には、融合タンパク質（例えば、Fc領域を有す
るもの）も含まれる。エリトロポエチン誘導体の代表例は、国際特許出願WO91/0
5867、94/09257、88/03808および86/07594（それらのそれぞれを参照により本明
細書に組み入れることとする）に記載されている。
【００１３】
「レプチン関連タンパク質」なる語は、組換えDNA法および他の方法により製
造されうるレプチン（好ましくは、ヒトレプチン）およびその誘導体を意味する
。そのような誘導体には、末端トランケート化、中間部のアミノ酸の除去、アミ
ノ酸の置換などを有するタンパク質が含まれる。また、この定義には、レプチン
を含む融合タンパク質（例えば、レプチンとFcフラグメントとを含む融合タンパ
ク質）も含まれる。適当なレプチン誘導体は、特許出願WO96/40912（1996年12月
19日付け出願）、WO96/05309（1996年2月22日付け出願）、WO97/06816（1997年2
月27日付け出願）およびWO97/18833（1997年5月29日付け出願）（それらのそれ
ぞれを参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。
造されうるレプチン（好ましくは、ヒトレプチン）およびその誘導体を意味する
。そのような誘導体には、末端トランケート化、中間部のアミノ酸の除去、アミ
ノ酸の置換などを有するタンパク質が含まれる。また、この定義には、レプチン
を含む融合タンパク質（例えば、レプチンとFcフラグメントとを含む融合タンパ
ク質）も含まれる。適当なレプチン誘導体は、特許出願WO96/40912（1996年12月
19日付け出願）、WO96/05309（1996年2月22日付け出願）、WO97/06816（1997年2
月27日付け出願）およびWO97/18833（1997年5月29日付け出願）（それらのそれ
ぞれを参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。
【００１４】
「OPG関連タンパク質」なる語は、組換えDNA法および他の方法により製造され
うるOPGおよびその誘導体を意味する。そのような誘導体には、末端トランケー
ト化、中間部のアミノ酸の除去（例えば、結合するDNAの制限酵素処理および再
連結によるもの）、アミノ酸の置換などを有するタンパク質が含まれる。そのよ
うな誘導体には、融合タンパク質（例えば、Fc領域を有するもの）も含まれる。
OPG誘導体の代表例は、国際特許出願WO97/23614（これを参照により本明細書に
組み入れることとする）に記載されている。
うるOPGおよびその誘導体を意味する。そのような誘導体には、末端トランケー
ト化、中間部のアミノ酸の除去（例えば、結合するDNAの制限酵素処理および再
連結によるもの）、アミノ酸の置換などを有するタンパク質が含まれる。そのよ
うな誘導体には、融合タンパク質（例えば、Fc領域を有するもの）も含まれる。
OPG誘導体の代表例は、国際特許出願WO97/23614（これを参照により本明細書に
組み入れることとする）に記載されている。
【００１５】
製造方法
遺伝子構築物
本発明で使用する核酸は、組換え核酸法により製造することができる。例えば
、Nellesら, J. Biol. Chem., 262, 10855 (1987)の組換えDNA法を参照されたい
。
、Nellesら, J. Biol. Chem., 262, 10855 (1987)の組換えDNA法を参照されたい
。
【００１６】
該核酸は、ゲノムDNA、サブゲノムDNA、cDNA、合成DNAおよびそれらの組合せ
を含む種々の起源に由来するものであってもよい。ゲノムDNAおよびcDNAは、多
数の方法により得ることができる。所望の配列をコードする細胞を単離し、ゲノ
ムDNAを断片化し（例えば、1以上の制限エンドヌクレアーゼでの処理によるもの
）、得られた断片をクローニングし、所望の配列に相補的なプローブで同定し、
所望の活性をコードする配列の存在に関してスクリーニングすることができる。
cDNAの場合には、該cDNAをクローニングし、得られたクローンを、所望の領域を
コードするcDNAに関するプローブでスクリーニングする。所望のクローンを単離
したら、ゲノムDNAの場合と実質的に同じ方法により該cDNAを操作することがで
きる。
を含む種々の起源に由来するものであってもよい。ゲノムDNAおよびcDNAは、多
数の方法により得ることができる。所望の配列をコードする細胞を単離し、ゲノ
ムDNAを断片化し（例えば、1以上の制限エンドヌクレアーゼでの処理によるもの
）、得られた断片をクローニングし、所望の配列に相補的なプローブで同定し、
所望の活性をコードする配列の存在に関してスクリーニングすることができる。
cDNAの場合には、該cDNAをクローニングし、得られたクローンを、所望の領域を
コードするcDNAに関するプローブでスクリーニングする。所望のクローンを単離
したら、ゲノムDNAの場合と実質的に同じ方法により該cDNAを操作することがで
きる。
【００１７】
該遺伝子構築物は、関心のあるタンパク質のコード配列に加えて多数の調節領
域を含有すべきである。発現のためには、適当な宿主に認識される転写および翻
訳シグナルが必要である。また、該コード配列は、宿主細胞に和合性のプロモー
ターに結合しているべきである。該プロモーターは、発現の更なる制御を可能に
する誘導プロモーター、または構成的プロモーターであってもよい。多数の適当
なプロモーターが当技術分野において公知である。
域を含有すべきである。発現のためには、適当な宿主に認識される転写および翻
訳シグナルが必要である。また、該コード配列は、宿主細胞に和合性のプロモー
ターに結合しているべきである。該プロモーターは、発現の更なる制御を可能に
する誘導プロモーター、または構成的プロモーターであってもよい。多数の適当
なプロモーターが当技術分野において公知である。
【００１８】
あるいは、ゲノムDNA由来のプロモーター領域を該コード配列と共に得ること
ができる。該コード領域に結合した転写調節および翻訳開始シグナルを宿主細胞
が認識する限り、該コード配列に隣接した5'領域を保有させ、転写および翻訳調
節のために使用することができる。この領域は、典型的には、転写および翻訳の
開始に関連した配列、例えば、TATAボックス、キャップ形成配列、CAAT配列など
を含むであろう。典型的には、この領域は、少なくとも約150塩基対長、より典
型的には約200bpであり、約1〜2kbを超えることはめったにない。
ができる。該コード領域に結合した転写調節および翻訳開始シグナルを宿主細胞
が認識する限り、該コード配列に隣接した5'領域を保有させ、転写および翻訳調
節のために使用することができる。この領域は、典型的には、転写および翻訳の
開始に関連した配列、例えば、TATAボックス、キャップ形成配列、CAAT配列など
を含むであろう。典型的には、この領域は、少なくとも約150塩基対長、より典
型的には約200bpであり、約1〜2kbを超えることはめったにない。
【００１９】
また、該非コード3'領域（特に、その転写終結調節配列、例えば、終結シグナ
ルおよびポリアデニル化領域）が保有されていてもよい。さらに、該非コード3'
領域はまた、エンハンサーを含有していてもよい。該転写終結シグナルが宿主細
胞内で十分に機能的でない場合には、その代わりに、異なる遺伝子に由来する機
能的3'領域を使用することができる。そのような代わりに使用される3'領域の選
択は、発現用に選択される細胞系に左右されるであろう。
ルおよびポリアデニル化領域）が保有されていてもよい。さらに、該非コード3'
領域はまた、エンハンサーを含有していてもよい。該転写終結シグナルが宿主細
胞内で十分に機能的でない場合には、その代わりに、異なる遺伝子に由来する機
能的3'領域を使用することができる。そのような代わりに使用される3'領域の選
択は、発現用に選択される細胞系に左右されるであろう。
【００２０】
宿主の性質に応じて、多種多様な転写および翻訳調節配列を使用することがで
きる。該転写および翻訳調節配列は、ウイルス（例えば、アデノウイルス、ウシ
パピローマウイルス、シミアンウイルスなど）に由来するものであってもよい。
ただし、これは、該調節シグナルが、宿主内で高レベルの発現を示す遺伝子に由
来する場合に限られる。あるいは、哺乳類発現産物（例えば、アクチン、コラー
ゲン、ミオシンなど）に由来するプロモーターを使用することができる。抑制ま
たは活性を可能にする転写開始調節シグナルは、該遺伝子の発現がモジュレーシ
ョンされうるように選択することができる。そのような1つの制御可能なモジュ
レーション技術としては、温度変化による発現の抑制または開始を可能にする温
度感受性の調節シグナルの使用が挙げられる。もう1つの制御可能なモジュレー
ション技術としては、ある種の化学物質に対して感受性である調節シグナルの使
用が挙げられる。
きる。該転写および翻訳調節配列は、ウイルス（例えば、アデノウイルス、ウシ
パピローマウイルス、シミアンウイルスなど）に由来するものであってもよい。
ただし、これは、該調節シグナルが、宿主内で高レベルの発現を示す遺伝子に由
来する場合に限られる。あるいは、哺乳類発現産物（例えば、アクチン、コラー
ゲン、ミオシンなど）に由来するプロモーターを使用することができる。抑制ま
たは活性を可能にする転写開始調節シグナルは、該遺伝子の発現がモジュレーシ
ョンされうるように選択することができる。そのような1つの制御可能なモジュ
レーション技術としては、温度変化による発現の抑制または開始を可能にする温
度感受性の調節シグナルの使用が挙げられる。もう1つの制御可能なモジュレー
ション技術としては、ある種の化学物質に対して感受性である調節シグナルの使
用が挙げられる。
【００２１】
該構築物は、宿主細胞に対して内因性の核酸配列を、該細胞に対して内因性で
あっても内因性でなくてもよいプロモーター、エンハンサーおよび他の調節領域
と共に含んでいてもよい。そのような構築物は、該内因性配列の発現の増強（例
えば、構成的プロモーターとの作動的共役によるもの）または制御（例えば、調
節シグナルとの作動的共役によるもの）を可能にする。
あっても内因性でなくてもよいプロモーター、エンハンサーおよび他の調節領域
と共に含んでいてもよい。そのような構築物は、該内因性配列の発現の増強（例
えば、構成的プロモーターとの作動的共役によるもの）または制御（例えば、調
節シグナルとの作動的共役によるもの）を可能にする。
【００２２】
該遺伝子構築物を得るために、当技術分野で公知の通常の技術に従いDNA断片
を連結することができる。そのような技術には、付着末端断片を平滑末端に（ま
たはその逆）変換するための制限酵素の使用、付着末端を埋めて平滑末端を得る
ためのポリメラーゼおよびヌクレオチドの使用、望ましくない連結を避けるため
のアルカリホスファターゼの使用、および断片を連結するためのリガーゼの使用
が含まれる。
を連結することができる。そのような技術には、付着末端断片を平滑末端に（ま
たはその逆）変換するための制限酵素の使用、付着末端を埋めて平滑末端を得る
ためのポリメラーゼおよびヌクレオチドの使用、望ましくない連結を避けるため
のアルカリホスファターゼの使用、および断片を連結するためのリガーゼの使用
が含まれる。
【００２３】
該構築物は、該構築物が宿主ゲノム内に組込まれる（例えば、相同組換えによ
るもの）ことになる場合の選択を可能にする遺伝子と共に、形質転換により細胞
内に導入することができる。通常、該構築物は、宿主細胞により認識される複製
系を有するベクターの一部である。
るもの）ことになる場合の選択を可能にする遺伝子と共に、形質転換により細胞
内に導入することができる。通常、該構築物は、宿主細胞により認識される複製
系を有するベクターの一部である。
【００２４】
発現ベクター
本発明の分子を製造するための発現ベクターには、プラスミドまたは他のベク
ターが含まれる。一般に、そのようなベクターは、種々の細胞型における発現を
可能にする制御配列を含有する。所望のコード配列および制御配列を含有する適
当な発現ベクターは、当技術分野において公知の組換えDNA技術を用いて構築す
ることができ、それらの多くは、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laborator y Manual , 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y
. (1989)に記載されている。
ターが含まれる。一般に、そのようなベクターは、種々の細胞型における発現を
可能にする制御配列を含有する。所望のコード配列および制御配列を含有する適
当な発現ベクターは、当技術分野において公知の組換えDNA技術を用いて構築す
ることができ、それらの多くは、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laborator y Manual , 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y
. (1989)に記載されている。
【００２５】
本発明において意図される発現ベクターは、少なくとも、関心のあるタンパク
質をコードする核酸またはサイクリンD遺伝子産物の複製および発現を指令しう
る。1つのクラスのベクターは、動物ウイルス（例えば、ウシパピローマウイル
ス、ポリオーマウイルス、アデノウイルスまたはSV40）に由来する自律複製性染
色体外プラスミドを与えるDNA要素を用いるものである。もう1つのクラスのベク
ターは、宿主細胞染色体内への所望の遺伝子配列の組込みに基づくものである。
質をコードする核酸またはサイクリンD遺伝子産物の複製および発現を指令しう
る。1つのクラスのベクターは、動物ウイルス（例えば、ウシパピローマウイル
ス、ポリオーマウイルス、アデノウイルスまたはSV40）に由来する自律複製性染
色体外プラスミドを与えるDNA要素を用いるものである。もう1つのクラスのベク
ターは、宿主細胞染色体内への所望の遺伝子配列の組込みに基づくものである。
【００２６】
本発明において有用な発現ベクターは、典型的には、複製起点、発現されるDN
A配列の5'側（すなわち上流）に位置するプロモーター、および転写終結配列を
含有する。適当な複製起点には、例えば、ColE1、pSC101、M13、SV40およびEBV
複製起点が含まれる。適当な終結配列には、例えば、ウシ成長ホルモン、SV40、
lacZおよびAcMNPV多角体ポリアデニル化シグナルが含まれる。適当なプロモータ
ーには、例えば、サイトメガロウイルスプロモーター、lacZプロモーター、gal
10プロモーターおよびAcMNPV多角体プロモーターが含まれる。また、該プロモー
ター配列は、発現のモジュレーション（例えば、増殖培地内の栄養素または他の
誘導物質の存在または不存在によるもの）を可能にするように誘導可能なもので
あってもよい。一例として、バクテリオファージラムダpla5から得られるlacオ
ペロン（これはIPTGにより誘導されうる）が挙げられる。
A配列の5'側（すなわち上流）に位置するプロモーター、および転写終結配列を
含有する。適当な複製起点には、例えば、ColE1、pSC101、M13、SV40およびEBV
複製起点が含まれる。適当な終結配列には、例えば、ウシ成長ホルモン、SV40、
lacZおよびAcMNPV多角体ポリアデニル化シグナルが含まれる。適当なプロモータ
ーには、例えば、サイトメガロウイルスプロモーター、lacZプロモーター、gal
10プロモーターおよびAcMNPV多角体プロモーターが含まれる。また、該プロモー
ター配列は、発現のモジュレーション（例えば、増殖培地内の栄養素または他の
誘導物質の存在または不存在によるもの）を可能にするように誘導可能なもので
あってもよい。一例として、バクテリオファージラムダpla5から得られるlacオ
ペロン（これはIPTGにより誘導されうる）が挙げられる。
【００２７】
また、該発現ベクターは、所望の産物の最適な発現のための他の調節配列を含
んでいてもよい。そのような配列には、発現産物の安定性をもたらす安定性リー
ダー配列、発現産物の分泌をもたらす分泌リーダー配列、該DNA配列の発現をア
ップレギュレーションするエンハンサー、および制限エンドヌクレアーゼによる
切断のための部位を付与する制限酵素認識配列が含まれる。これらの物質のすべ
ては当技術分野において公知であり、商業的に入手可能である。例えば、Okayam
a, Mol. Cell Biol., 3, 280 (1983)を参照されたい。
んでいてもよい。そのような配列には、発現産物の安定性をもたらす安定性リー
ダー配列、発現産物の分泌をもたらす分泌リーダー配列、該DNA配列の発現をア
ップレギュレーションするエンハンサー、および制限エンドヌクレアーゼによる
切断のための部位を付与する制限酵素認識配列が含まれる。これらの物質のすべ
ては当技術分野において公知であり、商業的に入手可能である。例えば、Okayam
a, Mol. Cell Biol., 3, 280 (1983)を参照されたい。
【００２８】
適当な発現ベクターはまた、形質転換宿主細胞の表現型選択を可能にするマー
カー配列を含んでいてもよい。そのようなマーカーは、栄養要求宿主に対する原
栄養性、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質耐性）などを付与しうる。該選択マー
カー遺伝子は、発現されるコード配列に直接結合していても、あるいはコトラン
スフェクションにより同一細胞内に導入されてもよい。選択マーカーの具体例に
は、ネオマイシン、アンピシリン、ハイグロマイシン耐性などに関する遺伝子が
含まれる。
カー配列を含んでいてもよい。そのようなマーカーは、栄養要求宿主に対する原
栄養性、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質耐性）などを付与しうる。該選択マー
カー遺伝子は、発現されるコード配列に直接結合していても、あるいはコトラン
スフェクションにより同一細胞内に導入されてもよい。選択マーカーの具体例に
は、ネオマイシン、アンピシリン、ハイグロマイシン耐性などに関する遺伝子が
含まれる。
【００２９】
使用する実際の発現ベクターの特性は、使用する宿主細胞に適合するものでな
ければならない。例えば、哺乳類宿主の場合には、発現ベクターは、哺乳類細胞
のゲノムから単離されたプロモーター（例えば、マウスメタロチオニンプロモー
ター）またはこれらの細胞内で増殖するウイルスから単離されたプロモーター（
例えば、ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター）を含有していてもよい。
ければならない。例えば、哺乳類宿主の場合には、発現ベクターは、哺乳類細胞
のゲノムから単離されたプロモーター（例えば、マウスメタロチオニンプロモー
ター）またはこれらの細胞内で増殖するウイルスから単離されたプロモーター（
例えば、ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター）を含有していてもよい。
【００３０】
本発明のコード配列を挿入することができる商業的に入手可能な適当な発現ベ
クターには、哺乳類発現ベクターpcDNA IまたはpcDNA I/Neo（これが好ましい）
、バキュロウイルス発現ベクターpBlueBac、原核性発現ベクターpcDNA IIおよび
酵母発現ベクターpYes2（これらはすべて、Invitrogen Corp, San Diego, Calif
.から入手可能である）。
クターには、哺乳類発現ベクターpcDNA IまたはpcDNA I/Neo（これが好ましい）
、バキュロウイルス発現ベクターpBlueBac、原核性発現ベクターpcDNA IIおよび
酵母発現ベクターpYes2（これらはすべて、Invitrogen Corp, San Diego, Calif
.から入手可能である）。
【００３１】
宿主細胞
本発明はまた、関心のあるタンパク質およびサイクリンD遺伝子産物のDNA配列
を含む発現ベクターを含有する宿主細胞に関する。適当な宿主細胞としては、真
核細胞、例えば、スポドプテラ・フルジペルダ（Spodoptera frugiperda）、昆
虫細胞、COS-7細胞、ヒト繊維芽細胞およびサッカロミセス・セレビシエ（Sacch
aromyces cerevisiae）細胞が挙げられる。宿主細胞として有用でありうる哺乳
類細胞には、繊維芽細胞由来の細胞（例えば、VEROまたはCHO-K1）またはリンパ
系由来の細胞（例えば、SP2/0-AG14またはP3x63Sg8）またはそれらの誘導体が含
まれる。好ましい哺乳類宿主細胞はCHO細胞である。
を含む発現ベクターを含有する宿主細胞に関する。適当な宿主細胞としては、真
核細胞、例えば、スポドプテラ・フルジペルダ（Spodoptera frugiperda）、昆
虫細胞、COS-7細胞、ヒト繊維芽細胞およびサッカロミセス・セレビシエ（Sacch
aromyces cerevisiae）細胞が挙げられる。宿主細胞として有用でありうる哺乳
類細胞には、繊維芽細胞由来の細胞（例えば、VEROまたはCHO-K1）またはリンパ
系由来の細胞（例えば、SP2/0-AG14またはP3x63Sg8）またはそれらの誘導体が含
まれる。好ましい哺乳類宿主細胞はCHO細胞である。
【００３２】
骨髄腫またはリンパ腫細胞などの不死化細胞も、適当な宿主細胞である。これ
らの細胞は、培養フラスコ中の適当な栄養培地内で増殖させたり、あるいは同系
宿主（例えば、マウスまたはラット）または免疫不全宿主もしくは宿主部位（例
えば、ヌードマウスまたはハムスター嚢）内に注射することができる。特に、腹
水の産生およびキメラ分子の収穫のために腹腔内に該細胞を導入することができ
る。あるいは、該細胞を皮下注射し、抗体を該宿主の血液から集めることができ
る。該細胞は、ハイブリドーマ細胞と同様に使用することができる。Diamondら,
N. Eng. J. Med., 304, 1344 (1981); Monoclonal Antibodies: Hybridomas-A New Dimension in Biologic Analysis （Kennattら編）Plenum (1980)を参照され
たい。
らの細胞は、培養フラスコ中の適当な栄養培地内で増殖させたり、あるいは同系
宿主（例えば、マウスまたはラット）または免疫不全宿主もしくは宿主部位（例
えば、ヌードマウスまたはハムスター嚢）内に注射することができる。特に、腹
水の産生およびキメラ分子の収穫のために腹腔内に該細胞を導入することができ
る。あるいは、該細胞を皮下注射し、抗体を該宿主の血液から集めることができ
る。該細胞は、ハイブリドーマ細胞と同様に使用することができる。Diamondら,
N. Eng. J. Med., 304, 1344 (1981); Monoclonal Antibodies: Hybridomas-A New Dimension in Biologic Analysis （Kennattら編）Plenum (1980)を参照され
たい。
【００３３】
発現ベクターは、当技術分野で公知の種々の方法により宿主細胞内に導入する
ことができる。例えば、宿主細胞内への発現ベクターのトランスフェクションは
、リン酸カルシウム沈殿法により行うことができる。しかし、宿主細胞内に発現
ベクターを導入するための他の方法（例えば、エレクトロポレーション、リポソ
ーム融合、核注入、およびウイルスまたはファージの感染）も用いることができ
る。
ことができる。例えば、宿主細胞内への発現ベクターのトランスフェクションは
、リン酸カルシウム沈殿法により行うことができる。しかし、宿主細胞内に発現
ベクターを導入するための他の方法（例えば、エレクトロポレーション、リポソ
ーム融合、核注入、およびウイルスまたはファージの感染）も用いることができ
る。
【００３４】
発現ベクターを含有する宿主細胞は、以下の6つの一般的アプローチの1以上に
より同定することができる：（a）DNA-DNAハイブリダイゼーション、（b）マー
カー遺伝子機能の存在または不存在、（c）宿主細胞内の遺伝子構築物をコード
するmRNA転写産物の産生により測定される転写レベルの評価、（d）遺伝子産物
の免疫学的検出、（e）酵素アッセイ、および（f）PCR。これらの方法は当技術
分野でよく知られており、例えば、参照により本明細書に組み入れる米国特許第
5,744,314号を参照されたい。
より同定することができる：（a）DNA-DNAハイブリダイゼーション、（b）マー
カー遺伝子機能の存在または不存在、（c）宿主細胞内の遺伝子構築物をコード
するmRNA転写産物の産生により測定される転写レベルの評価、（d）遺伝子産物
の免疫学的検出、（e）酵素アッセイ、および（f）PCR。これらの方法は当技術
分野でよく知られており、例えば、参照により本明細書に組み入れる米国特許第
5,744,314号を参照されたい。
【００３５】
また、本発明の発現ベクターおよびDNA分子を配列決定することも可能である
。種々の配列決定方法が当技術分野で公知である。例えば、Sangerら, Proc. Na tl. Acad. Sci. USA 74, 5463-7 (1977)に記載のジデオキシターミネーション法
、およびProc. Natl. Acad. Sci USA 74, 560-4 (1977)に記載のマキサム・ギル
バート法を参照されたい。
。種々の配列決定方法が当技術分野で公知である。例えば、Sangerら, Proc. Na tl. Acad. Sci. USA 74, 5463-7 (1977)に記載のジデオキシターミネーション法
、およびProc. Natl. Acad. Sci USA 74, 560-4 (1977)に記載のマキサム・ギル
バート法を参照されたい。
【００３６】
発現ベクターを適当な宿主細胞内に導入したら、関心のあるタンパク質の大量
発現を可能にする条件下で該宿主細胞を培養することができる。関心のあるタン
パク質は、通常の条件（例えば、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、アフィニテ
ィークロマトグラフィー、電気泳動など）に従い単離し精製することができる。
好ましい方法はアフィニティークロマトグラフィーである。
発現を可能にする条件下で該宿主細胞を培養することができる。関心のあるタン
パク質は、通常の条件（例えば、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、アフィニテ
ィークロマトグラフィー、電気泳動など）に従い単離し精製することができる。
好ましい方法はアフィニティークロマトグラフィーである。
【００３７】
もちろん、すべての発現ベクターおよびDNA調節配列が、本発明の核酸を発現
するように同等に十分に機能するとは限らないと理解されるべきである。また、
すべての宿主細胞が同一発現系で同等に十分に機能するとは限らない。しかしな
がら、当業者であれば、過度な実験を行うことなく且つ本発明の範囲および精神
から逸脱することなく本明細書に記載の指針を用いて発現ベクター、DNA調節配
列および宿主細胞からの選択を行うことができる。
するように同等に十分に機能するとは限らないと理解されるべきである。また、
すべての宿主細胞が同一発現系で同等に十分に機能するとは限らない。しかしな
がら、当業者であれば、過度な実験を行うことなく且つ本発明の範囲および精神
から逸脱することなく本明細書に記載の指針を用いて発現ベクター、DNA調節配
列および宿主細胞からの選択を行うことができる。
【００３８】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明の特定の実施形態を以下に詳細に説明する。これらの実施形態は典型例
であり、本発明の広範な適用性を例示するものである。特に示さない限り、これ
らの実施形態は本発明の好ましい要素を含む。
であり、本発明の広範な適用性を例示するものである。特に示さない限り、これ
らの実施形態は本発明の好ましい要素を含む。
【００３９】
材料および方法
プラスミド
ヒトサイクリンD1遺伝子（Genbank受託番号M64349）をpcDNA 3.1（Invitrogen
）内にクローニングし、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター/エンハンサ
ー下で構成的に発現させて、pcDNA3.1/サイクリンD1を得た。また、該ベクター
は、G418の存在下での安定な哺乳類細胞系の選択のためのネオマイシン耐性遺伝
子を保持する。
）内にクローニングし、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター/エンハンサ
ー下で構成的に発現させて、pcDNA3.1/サイクリンD1を得た。また、該ベクター
は、G418の存在下での安定な哺乳類細胞系の選択のためのネオマイシン耐性遺伝
子を保持する。
【００４０】
細胞培養
CHOd(SF)細胞を100mmディッシュ中の完全培地 [DMEM (Gibco/BRL)、5％ウシ胎
仔血清 (JRH Biosciences)、1％ヒポキサンチン/チミジン (HT)(Gibco/BRL)およ
び1％グルタミン/ペニシリン/ストレプトマイシン (Gibco/BRL)]内で増殖させた
。該細胞をトリプシン処理し、計数し、60mmプレート（Falcon）内に1x10e6細胞
/ディッシュで播いた。AM-1 CHOd細胞をAmgen VM-soy培地内の浮遊攪拌培養内で
増殖させた。細胞を計数し、遠心分離し、完全培地に再懸濁し、60mmプレート内
に1x10e6細胞/ディッシュで播いた。細胞を一晩インキュベートした。トランス
フェクションの3時間後、該培地上の培地を4mlの新鮮培地と交換した。
仔血清 (JRH Biosciences)、1％ヒポキサンチン/チミジン (HT)(Gibco/BRL)およ
び1％グルタミン/ペニシリン/ストレプトマイシン (Gibco/BRL)]内で増殖させた
。該細胞をトリプシン処理し、計数し、60mmプレート（Falcon）内に1x10e6細胞
/ディッシュで播いた。AM-1 CHOd細胞をAmgen VM-soy培地内の浮遊攪拌培養内で
増殖させた。細胞を計数し、遠心分離し、完全培地に再懸濁し、60mmプレート内
に1x10e6細胞/ディッシュで播いた。細胞を一晩インキュベートした。トランス
フェクションの3時間後、該培地上の培地を4mlの新鮮培地と交換した。
【００４１】
サイクリンD1のトランスフェクション
このトランスフェクションでは、サイクリンD1 cDNAインサートを含有するベ
クターpcDNA 3.1 neo（登録商標）（Invitrogen）を使用した。60mmプレートの
細胞ごとに、5μgのpcDNA3.1/サイクリンD1（2mg/ml）および5μgのマウスゲノ
ム担体DNA（Clontech）（100μg/ml）を172.5μlの無菌蒸留水に加えた。25マイ
クロリットルの2.5M CaCl2を該DNA溶液に加えて、最終容積を250μlとした。ベ
クター対照として、170.5μlの無菌水に5μgのpneoベクターDNA（1.126mg/ml）
を5μgの担体DNAと共に加え、ついで25μlの2.5M CaCl2を加えた。模擬対照とし
て、25μlの2.5M CaCl2を225μlの水に加えた。該DNA溶液を等容積（250μl）の
2x HBS（280mM NaCl、10mM KCl、1.5mM NaHPO42H2O、0.2mMデキストロース、50m
M HEPES、pH7.05）に滴下し、その間じゅう、絶えず通気した。該DNA/HBS溶液を
室温で30分間インキュベートした。該培地を該CHO細胞プレートから除去し、該D
NA/HBS溶液（全容積500μl/ディッシュ）を滴下した。合計3個のプレートをpcDN
A3.1/サイクリンD1で処理し、各細胞系ごとに該ベクターおよび模擬対照につい
てそれぞれ1個のプレートを処理した。該細胞を室温で30分間インキュベートし
、ついで5mlの完全培地を各ディッシュに加えた。ついで該細胞を37℃で一晩イ
ンキュベートした。翌日、該培地を新鮮な培地と交換した。
クターpcDNA 3.1 neo（登録商標）（Invitrogen）を使用した。60mmプレートの
細胞ごとに、5μgのpcDNA3.1/サイクリンD1（2mg/ml）および5μgのマウスゲノ
ム担体DNA（Clontech）（100μg/ml）を172.5μlの無菌蒸留水に加えた。25マイ
クロリットルの2.5M CaCl2を該DNA溶液に加えて、最終容積を250μlとした。ベ
クター対照として、170.5μlの無菌水に5μgのpneoベクターDNA（1.126mg/ml）
を5μgの担体DNAと共に加え、ついで25μlの2.5M CaCl2を加えた。模擬対照とし
て、25μlの2.5M CaCl2を225μlの水に加えた。該DNA溶液を等容積（250μl）の
2x HBS（280mM NaCl、10mM KCl、1.5mM NaHPO42H2O、0.2mMデキストロース、50m
M HEPES、pH7.05）に滴下し、その間じゅう、絶えず通気した。該DNA/HBS溶液を
室温で30分間インキュベートした。該培地を該CHO細胞プレートから除去し、該D
NA/HBS溶液（全容積500μl/ディッシュ）を滴下した。合計3個のプレートをpcDN
A3.1/サイクリンD1で処理し、各細胞系ごとに該ベクターおよび模擬対照につい
てそれぞれ1個のプレートを処理した。該細胞を室温で30分間インキュベートし
、ついで5mlの完全培地を各ディッシュに加えた。ついで該細胞を37℃で一晩イ
ンキュベートした。翌日、該培地を新鮮な培地と交換した。
【００４２】
CHO(SF)細胞は、該トランスフェクションの48時間後にコンフルエントに達し
た。該細胞をトリプシン処理し、8x100mmディッシュに対して1x60mmディッシュ
の割合で完全培地内で再プレーティングした。翌日、該培地を、1mg/mlゲネティ
シン（Geneticin）（G418）（Gibco/BRL）を含有する完全培地と交換した。AM-1
CHO細胞はトランスフェクションの72時間後にコンフルエントに達し、それを同
様に再プレーティングした。該細胞上の培地を新鮮な完全培地 + G418で週2回交
換した。G418選択培地の最初の添加の10日後、ガラスクローニングシリンダー（
Bellco）を使用して、CHO(SF)およびAM-1 CHOサイクリンD1をトランスフェクト
したプレートからコロニーを単離した。細胞をトリプシン処理し、再び24ウェル
プレート内に播いた。CHO(SF)細胞のトランスフェクション頻度（>100コロニー/
プレート）は、AM-1 CHO細胞の場合（20〜30コロニー/プレート）よりはるかに
高かった。CHO(SF)/サイクリンD1プレートからは合計72個のコロニーを単離し、
AM-1 CHO/サイクリンD1プレートからは68個のコロニーを単離した。G418選択培
地を含有する模擬対照ディッシュのいずれのセットにおいても、コロニーは存在
しなかった。コロニーを拾った後、プレートの各セットからの残りの細胞をトリ
プシン処理し、100mmディッシュ中のプール培養（CHO(SF)/サイクリンD1は3個の
プール、AM-1 CHO/サイクリンD1は2個のプール）内に集めた。
た。該細胞をトリプシン処理し、8x100mmディッシュに対して1x60mmディッシュ
の割合で完全培地内で再プレーティングした。翌日、該培地を、1mg/mlゲネティ
シン（Geneticin）（G418）（Gibco/BRL）を含有する完全培地と交換した。AM-1
CHO細胞はトランスフェクションの72時間後にコンフルエントに達し、それを同
様に再プレーティングした。該細胞上の培地を新鮮な完全培地 + G418で週2回交
換した。G418選択培地の最初の添加の10日後、ガラスクローニングシリンダー（
Bellco）を使用して、CHO(SF)およびAM-1 CHOサイクリンD1をトランスフェクト
したプレートからコロニーを単離した。細胞をトリプシン処理し、再び24ウェル
プレート内に播いた。CHO(SF)細胞のトランスフェクション頻度（>100コロニー/
プレート）は、AM-1 CHO細胞の場合（20〜30コロニー/プレート）よりはるかに
高かった。CHO(SF)/サイクリンD1プレートからは合計72個のコロニーを単離し、
AM-1 CHO/サイクリンD1プレートからは68個のコロニーを単離した。G418選択培
地を含有する模擬対照ディッシュのいずれのセットにおいても、コロニーは存在
しなかった。コロニーを拾った後、プレートの各セットからの残りの細胞をトリ
プシン処理し、100mmディッシュ中のプール培養（CHO(SF)/サイクリンD1は3個の
プール、AM-1 CHO/サイクリンD1は2個のプール）内に集めた。
【００４３】
トランスフェクトされた細胞をコンフルエントになるまで増殖させ、ついで6
ウェルプレート内に再プレーティングした（1クローン/プール当たり2ウェル）
。コンフルエントに達したら、各クローン/プール当たり1ウェルの細胞を250ml
の1％ Triton溶解バッファー（1％ Triton X100、1mM NaVo3、50mM Tris/HCl pH
8、100mM NaCl、プロテアーゼ阻害剤）で細胞溶解した。ライセートを14Kで15分
間遠心分離した。上清を集め、-20℃で保存した。ライセートをサイクリンD1の
発現に関してウエスタンブロット法により分析した。25μlの各サンプル + 対照
サンプル（親CHO(SF)およびAM-1 CHO系のもの）を5μlの5X PAGEゲルサンプルバ
ッファーと混合し、3分間煮沸し、12％ Novex Tris-グリシンゲル上にローディ
ングした。該ゲルを0.2μのニトロセルロースフィルター（Schleicher and Schu
ell）上にエレクトロブロッティングした。該フィルターを抗サイクリンD1 Ab-3
モノクローナル抗体（Calbiochem）でプローブし、Amersham ECL試薬を使用して
現像した。結果は、該プール培養における及び該クローンのほとんどにおける種
々の程度のサイクリンD1の過剰発現を示した。
ウェルプレート内に再プレーティングした（1クローン/プール当たり2ウェル）
。コンフルエントに達したら、各クローン/プール当たり1ウェルの細胞を250ml
の1％ Triton溶解バッファー（1％ Triton X100、1mM NaVo3、50mM Tris/HCl pH
8、100mM NaCl、プロテアーゼ阻害剤）で細胞溶解した。ライセートを14Kで15分
間遠心分離した。上清を集め、-20℃で保存した。ライセートをサイクリンD1の
発現に関してウエスタンブロット法により分析した。25μlの各サンプル + 対照
サンプル（親CHO(SF)およびAM-1 CHO系のもの）を5μlの5X PAGEゲルサンプルバ
ッファーと混合し、3分間煮沸し、12％ Novex Tris-グリシンゲル上にローディ
ングした。該ゲルを0.2μのニトロセルロースフィルター（Schleicher and Schu
ell）上にエレクトロブロッティングした。該フィルターを抗サイクリンD1 Ab-3
モノクローナル抗体（Calbiochem）でプローブし、Amersham ECL試薬を使用して
現像した。結果は、該プール培養における及び該クローンのほとんどにおける種
々の程度のサイクリンD1の過剰発現を示した。
【００４４】
それらの2つのAM-1 CHO/サイクリンD1プール培養およびそれらの2つの最高発
現CHO(SF)/サイクリンD1プール培養を一緒にして、後続のトランスフェクション
で用いる各細胞系に関する「マスタープール」とした。ヒポキサンチン/チミジ
ンを含まない選択培地 [DMEM、5％透析ウシ胎仔血清（Hyclone）、非必須アミノ
酸、グルタミン/ペニシリン/ストレプトマイシン] 内で該細胞を増殖させること
によりそれらがDHFR陰性表現型を保有していたか否かを判定するために、該マス
タープール培養を試験した。この培地においては細胞の増殖は何ら検出されなか
った。
現CHO(SF)/サイクリンD1プール培養を一緒にして、後続のトランスフェクション
で用いる各細胞系に関する「マスタープール」とした。ヒポキサンチン/チミジ
ンを含まない選択培地 [DMEM、5％透析ウシ胎仔血清（Hyclone）、非必須アミノ
酸、グルタミン/ペニシリン/ストレプトマイシン] 内で該細胞を増殖させること
によりそれらがDHFR陰性表現型を保有していたか否かを判定するために、該マス
タープール培養を試験した。この培地においては細胞の増殖は何ら検出されなか
った。
【００４５】
EPOのトランスフェクション
CHO(SF)/サイクリンD1およびAM-1 CHO/サイクリンD1のマスタープール培養を
、1mg/mlのG418で補足された完全CHOd培地内に維持した。これらの細胞を60mmプ
レート内に8x10e5細胞/ディッシュで播き、一晩培養した。前記プロトコールを
用いて、pSW19（pDSRα2の近縁誘導体）/EPO標的DNA、pDSRα2ベクター対照DNA
、およびニシン精子担体DNA（Gibco/BRL）で該細胞をトランスフェクトした。最
終濃度5μg/ディッシュのpSW19/EPO DNAを使用した。トランスフェクションの24
時間後、該細胞に新鮮な培地を与えた。トランスフェクションの72時間後、該細
胞をトリプシン処理し、選択培地 + 1mg/ml G418内に1:8、1:10および1:20の比
（60mmプレート対100mmプレート）で再プレーティングした。該細胞上の培地を
、G418を含有する新鮮な培地で週2回交換した。再プレーティングの12日後、CHO
(SF)/サイクリンD1/EPOでトランスフェクトされたプレートから48個のコロニー
を単離した。残りの細胞をトリプシン処理し、2つのプール培養内に集めた。再
プレーティングの15日後、AM-1 CHO/サイクリンD1/EPOでトランスフェクトされ
たプレートから48個のコロニーを単離し、残りの細胞を2つのプール内に集めた
。該プールの100mmプレート培養または単離されたクローンからのコンフルエン
トな24ウェル培養からの無血清馴らし培地収穫物上で、ウエスタンブロット法に
よりEPOの発現を分析した。還元条件下でゲル泳動を行い、抗EPOモノクローナル
抗体2D8でブロットをプローブした。
、1mg/mlのG418で補足された完全CHOd培地内に維持した。これらの細胞を60mmプ
レート内に8x10e5細胞/ディッシュで播き、一晩培養した。前記プロトコールを
用いて、pSW19（pDSRα2の近縁誘導体）/EPO標的DNA、pDSRα2ベクター対照DNA
、およびニシン精子担体DNA（Gibco/BRL）で該細胞をトランスフェクトした。最
終濃度5μg/ディッシュのpSW19/EPO DNAを使用した。トランスフェクションの24
時間後、該細胞に新鮮な培地を与えた。トランスフェクションの72時間後、該細
胞をトリプシン処理し、選択培地 + 1mg/ml G418内に1:8、1:10および1:20の比
（60mmプレート対100mmプレート）で再プレーティングした。該細胞上の培地を
、G418を含有する新鮮な培地で週2回交換した。再プレーティングの12日後、CHO
(SF)/サイクリンD1/EPOでトランスフェクトされたプレートから48個のコロニー
を単離した。残りの細胞をトリプシン処理し、2つのプール培養内に集めた。再
プレーティングの15日後、AM-1 CHO/サイクリンD1/EPOでトランスフェクトされ
たプレートから48個のコロニーを単離し、残りの細胞を2つのプール内に集めた
。該プールの100mmプレート培養または単離されたクローンからのコンフルエン
トな24ウェル培養からの無血清馴らし培地収穫物上で、ウエスタンブロット法に
よりEPOの発現を分析した。還元条件下でゲル泳動を行い、抗EPOモノクローナル
抗体2D8でブロットをプローブした。
【００４６】
OPGのトランスフェクション
CHOd(SF)/サイクリンD1およびAM-1 CHOd/サイクリンD1マスタープールならび
にCHOd(SF)親系内へのpSW19/OPG DNA構築物のトランスフェクションを、EPOのト
ランスフェクションと同様に行った。2つの別々のOPG-Fc(22-201)のトランスフ
ェクションを全3個の宿主細胞系内に行った。合計124個のCHO(SF)、110個のCHO(
SF)/cycDおよび147個のAM-1 CHO/cycDコロニーをOPG-Fc(22-201)のトランスフェ
クションから拾った。得られたクローンおよびプールにおいて、抗huIgG-Fc-HRP
抗体（Pierce）またはアフィニティー精製されたウサギポリクローナル抗huOPG
を使用するウエスタンブロット法により、OPGの発現を分析した。
にCHOd(SF)親系内へのpSW19/OPG DNA構築物のトランスフェクションを、EPOのト
ランスフェクションと同様に行った。2つの別々のOPG-Fc(22-201)のトランスフ
ェクションを全3個の宿主細胞系内に行った。合計124個のCHO(SF)、110個のCHO(
SF)/cycDおよび147個のAM-1 CHO/cycDコロニーをOPG-Fc(22-201)のトランスフェ
クションから拾った。得られたクローンおよびプールにおいて、抗huIgG-Fc-HRP
抗体（Pierce）またはアフィニティー精製されたウサギポリクローナル抗huOPG
を使用するウエスタンブロット法により、OPGの発現を分析した。
【００４７】
DNAのヨウ化プロピジウム染色
細胞を100mmプレート内に播き、約50％コンフルエントになるまで増殖させた
。該アッセイのためには、細胞が対数期になければならない。該細胞をトリプシ
ン処理により収穫し、等容積のDMEM/FBSを含有する遠心管内にピペッティングし
た。該細胞懸濁液のアリコートを血球計算盤で計数した。細胞密度は約106〜107 細胞/5mlであるべきである。該細胞を1000xgでの遠心分離によりペレット化し、
氷冷PBSで2回洗浄した。該細胞は単個細胞懸濁（浮遊）液中になければならない
。0.5mlのPBSを加え、該細胞懸濁液をボルテックスした。ついで、該細胞懸濁液
を穏やかに混合しながら2mlの70％エタノールを該管の壁面に沿わせて滴下する
ことにより、該細胞を固定した。最低限の固定時間は30分である（この段階で、
該細胞懸濁液を染色および分析の前に4℃で約2週間保存することができる）。該
細胞を該エタノール上清の除去のために遠心分離し、PBSで1回洗浄し、4℃で5分
間再水和させる。該細胞を遠心分離し、該PBSを除去し、該ペレットを0.5mlのヨ
ウ化プロピジウム溶液（Molecular Probes）（PBS中で調製した50μg/ml）に再
懸濁した。DNアーゼを含まないRNアーゼ（10mg/ml）（Boehringer Mannheim）の
10μlを加え、該細胞懸濁液を37℃で20分間インキュベートした。該サンプルを1
mlのPBSで希釈し、1時間以内にFACSにより分析した。
。該アッセイのためには、細胞が対数期になければならない。該細胞をトリプシ
ン処理により収穫し、等容積のDMEM/FBSを含有する遠心管内にピペッティングし
た。該細胞懸濁液のアリコートを血球計算盤で計数した。細胞密度は約106〜107 細胞/5mlであるべきである。該細胞を1000xgでの遠心分離によりペレット化し、
氷冷PBSで2回洗浄した。該細胞は単個細胞懸濁（浮遊）液中になければならない
。0.5mlのPBSを加え、該細胞懸濁液をボルテックスした。ついで、該細胞懸濁液
を穏やかに混合しながら2mlの70％エタノールを該管の壁面に沿わせて滴下する
ことにより、該細胞を固定した。最低限の固定時間は30分である（この段階で、
該細胞懸濁液を染色および分析の前に4℃で約2週間保存することができる）。該
細胞を該エタノール上清の除去のために遠心分離し、PBSで1回洗浄し、4℃で5分
間再水和させる。該細胞を遠心分離し、該PBSを除去し、該ペレットを0.5mlのヨ
ウ化プロピジウム溶液（Molecular Probes）（PBS中で調製した50μg/ml）に再
懸濁した。DNアーゼを含まないRNアーゼ（10mg/ml）（Boehringer Mannheim）の
10μlを加え、該細胞懸濁液を37℃で20分間インキュベートした。該サンプルを1
mlのPBSで希釈し、1時間以内にFACSにより分析した。
【００４８】
遺伝子増幅
メトトレキセート（MTX）を該増殖培地に徐々に段階的に加えることにより、
該細胞における遺伝子増幅を行った。低い3つの濃度（1nM、2.5nMおよび5nM）の
メトトレキセート中、100mmプレート内で1:10の比で該細胞を継代培養した。該
細胞の増殖をモニターし、最初にコンフルエントに達したプレートを、次のラウ
ンドの増幅に使用した。該細胞が2以上のメトトレキセート濃度において同等に
十分に増殖した場合には、最高の濃度を次のラウンドで用いた。48時間の無血清
DMEM収穫物（4ml/プレート）を、ウエスタンブロットまたはEIAによるタンパク
質発現レベルの分析に採用した。該細胞を、メトトレキセートを含む完全培地内
で24時間回収し、ついで1:10の比で3つのより高い濃度のメトトレキセート中に
継代培養した。MTXの濃度を10nMの増加量で100nMまで増加させた。一般に、該タ
ンパク質発現レベルが100nMまでにピークに達しない場合には、最大発現レベル
に達するまで100nMの増加量で増幅を継続する。最適濃度が決定したら、MTXの存
在下で該細胞を維持した。
該細胞における遺伝子増幅を行った。低い3つの濃度（1nM、2.5nMおよび5nM）の
メトトレキセート中、100mmプレート内で1:10の比で該細胞を継代培養した。該
細胞の増殖をモニターし、最初にコンフルエントに達したプレートを、次のラウ
ンドの増幅に使用した。該細胞が2以上のメトトレキセート濃度において同等に
十分に増殖した場合には、最高の濃度を次のラウンドで用いた。48時間の無血清
DMEM収穫物（4ml/プレート）を、ウエスタンブロットまたはEIAによるタンパク
質発現レベルの分析に採用した。該細胞を、メトトレキセートを含む完全培地内
で24時間回収し、ついで1:10の比で3つのより高い濃度のメトトレキセート中に
継代培養した。MTXの濃度を10nMの増加量で100nMまで増加させた。一般に、該タ
ンパク質発現レベルが100nMまでにピークに達しない場合には、最大発現レベル
に達するまで100nMの増加量で増幅を継続する。最適濃度が決定したら、MTXの存
在下で該細胞を維持した。
【００４９】
AM-1/D細胞系の作製
AM-1/D細胞系を、1987年10月27日付け発行の米国特許第4,703,008号およびUrl
aubら(1980), Proc. Natl. Acad. Sci. 77:4461（それらを共に参照により本明
細書に組み入れることとする）に記載のCHOd(-)細胞系から誘導した。VM-SOY培
地内での継代（この場合、ウシ胎仔血清のレベルを次第に減少させて、最終的に
は0にした）により、該CHOd(-)細胞系を順応させた。得られた無血清順応細胞系
AM-1は尚もdhfr(-)表現型を保有する。ヒトサイクリンD1を過剰発現するように
該AM-1細胞系を操作した。
aubら(1980), Proc. Natl. Acad. Sci. 77:4461（それらを共に参照により本明
細書に組み入れることとする）に記載のCHOd(-)細胞系から誘導した。VM-SOY培
地内での継代（この場合、ウシ胎仔血清のレベルを次第に減少させて、最終的に
は0にした）により、該CHOd(-)細胞系を順応させた。得られた無血清順応細胞系
AM-1は尚もdhfr(-)表現型を保有する。ヒトサイクリンD1を過剰発現するように
該AM-1細胞系を操作した。
【００５０】
トランスフェクションのための標準的なリン酸カルシウム沈殿法により、pcDN
A3.1/サイクリンD1をAM-1細胞系内にトランスフェクトした。G418での選択に際
して、該コロニーをトリプシン処理し、2つのプールに集めた。ヒトサイクリンD
1特異的抗体（抗サイクリンD1 Ab-3、Calbiochem）を使用する、該プールから調
製された細胞ライセートのウエスタンブロット法（図1）により、ヒトサイクリ
ンD1タンパク質の発現が示された。多数のコロニーをクローニングリングでラン
ダムに拾い、該細胞ライセートを調製し、さらに分析した。予想したとおり、ヒ
トサイクリンD1の発現は該クローンによって様々であった。該クローンと比較す
ると、それらの2つのプールは、全体的に高レベルのヒトサイクリンD1タンパク
質を示した（図1）。それらの2つのプールをマスタープール培養（AM-1/D）内に
集めた（それは、後続のすべての実験で使用した親細胞系であった）。
A3.1/サイクリンD1をAM-1細胞系内にトランスフェクトした。G418での選択に際
して、該コロニーをトリプシン処理し、2つのプールに集めた。ヒトサイクリンD
1特異的抗体（抗サイクリンD1 Ab-3、Calbiochem）を使用する、該プールから調
製された細胞ライセートのウエスタンブロット法（図1）により、ヒトサイクリ
ンD1タンパク質の発現が示された。多数のコロニーをクローニングリングでラン
ダムに拾い、該細胞ライセートを調製し、さらに分析した。予想したとおり、ヒ
トサイクリンD1の発現は該クローンによって様々であった。該クローンと比較す
ると、それらの2つのプールは、全体的に高レベルのヒトサイクリンD1タンパク
質を示した（図1）。それらの2つのプールをマスタープール培養（AM-1/D）内に
集めた（それは、後続のすべての実験で使用した親細胞系であった）。
【００５１】
AM-1/D細胞系内で発現されたヒトサイクリンD1は機能的である
本発明者らは、ヒトサイクリンD1が、細胞周期動力学のその改変により機能的
に発現されることを確認した。例えば、図2および後記を参照されたい。
に発現されることを確認した。例えば、図2および後記を参照されたい。
【００５２】
AM-1/DおよびAM-1細胞系由来の非同調細胞をヨウ化プロピジウムで染色し、FA
CScan（Becton Dickinson）により分析した。図2A〜2Dは、相対DNA含量（x軸）
および細胞数（y軸）を示す。AM-1/D細胞（40.08％、40.14％）では、AM-1細胞
（33.73％、32.25％）の場合より有意に多数の細胞がS期に存在した。このこと
は、CHO細胞系であるAM-1/D内でのヒトサイクリンD1の過剰発現が、細胞周期動
力学を有意に改変するほどに機能的であることを示した。
CScan（Becton Dickinson）により分析した。図2A〜2Dは、相対DNA含量（x軸）
および細胞数（y軸）を示す。AM-1/D細胞（40.08％、40.14％）では、AM-1細胞
（33.73％、32.25％）の場合より有意に多数の細胞がS期に存在した。このこと
は、CHO細胞系であるAM-1/D内でのヒトサイクリンD1の過剰発現が、細胞周期動
力学を有意に改変するほどに機能的であることを示した。
【００５３】
実施例1
発現ベクターpDSRα2でヒトOPG（GenBank受託番号U94332）-Fc融合タンパク質
を発現させるために、プラスミドpDSRα2/OPG-Fcを構築した。標準的なリン酸カ
ルシウム沈殿法を用いて、pDSRα2/OPG-Fcの線状化DNAを、AM-1/D細胞および未
修飾の元のAM-1細胞内に平行してトランスフェクトした。HT補足物を欠く選択培
地内に細胞を2週間配置した後、各トランスフェクションからの44個のコロニー
をランダムに拾った。
を発現させるために、プラスミドpDSRα2/OPG-Fcを構築した。標準的なリン酸カ
ルシウム沈殿法を用いて、pDSRα2/OPG-Fcの線状化DNAを、AM-1/D細胞および未
修飾の元のAM-1細胞内に平行してトランスフェクトした。HT補足物を欠く選択培
地内に細胞を2週間配置した後、各トランスフェクションからの44個のコロニー
をランダムに拾った。
【００５４】
該コロニーを個々に24ウェルプレート内に移し、コンフルエントになるまで増
殖させた。48時間後、無血清馴らし培地を集め、ヒトOPGに特異的な抗血清を使
用するEIAにより分析した。図3は、これらの2つの細胞系に由来する種々のレベ
ルのOPG-Fcを発現するクローンの数を示している。より高レベルの該組換えタン
パク質を発現するAM-1/D細胞系由来クローンが、有意に、より多数存在すること
、および20mg/ml以上のOPG-Fcを発現する最高発現クローンのすべてがAM-1/D細
胞系に由来することが明らかである。
殖させた。48時間後、無血清馴らし培地を集め、ヒトOPGに特異的な抗血清を使
用するEIAにより分析した。図3は、これらの2つの細胞系に由来する種々のレベ
ルのOPG-Fcを発現するクローンの数を示している。より高レベルの該組換えタン
パク質を発現するAM-1/D細胞系由来クローンが、有意に、より多数存在すること
、および20mg/ml以上のOPG-Fcを発現する最高発現クローンのすべてがAM-1/D細
胞系に由来することが明らかである。
【００５５】
実施例2
プラスミドpDSRα2/hEpoを、ヒトEpo遺伝子を発現するように構築し、前記の
リン酸カルシウム法に従いAM-1/D細胞内にトランスフェクトした。さらなる分析
のために、48個のコロニーをランダムに拾った。該高発現クローンのうちの4個
を馴らし培地のEIA分析により同定し、メトトレキセート増幅（1nMから開始した
）に付した。図4は、増幅過程中のEPOの発現を示す。それらのクローンのうちの
2つ（AM-1/Dクローン2およびAM-1/Dクローン33）は、MTXの濃度の増加と共に上
昇するEPO産生を示し、これは、遺伝子増幅が成功したことを示している。これ
らのクローンを凍結-融解および徹底的な継代に際して試験したところ、Epoの発
現の喪失は生じず、これは、これらのクローンにおけるEpo遺伝子発現の安定性
を示している。
リン酸カルシウム法に従いAM-1/D細胞内にトランスフェクトした。さらなる分析
のために、48個のコロニーをランダムに拾った。該高発現クローンのうちの4個
を馴らし培地のEIA分析により同定し、メトトレキセート増幅（1nMから開始した
）に付した。図4は、増幅過程中のEPOの発現を示す。それらのクローンのうちの
2つ（AM-1/Dクローン2およびAM-1/Dクローン33）は、MTXの濃度の増加と共に上
昇するEPO産生を示し、これは、遺伝子増幅が成功したことを示している。これ
らのクローンを凍結-融解および徹底的な継代に際して試験したところ、Epoの発
現の喪失は生じず、これは、これらのクローンにおけるEpo遺伝子発現の安定性
を示している。
【００５６】
AM-1/サイクリンD CHO細胞内でのOPGの発現
2つのOPG構築物の発現をAM-1/サイクリンD CHO細胞および他のCHO細胞系にお
いて比較した。OPG(22-201)-FcをAM-1/サイクリンD CHO細胞および親CHO細胞系
（無血清培地内での増殖に予め順応されているもの）[CHO(SF)]内にトランスフ
ェクトした。OPG(22-194)・cys-FcをAM-1サイクリンD CHO細胞内およびその親AM-
1 CHO細胞系内にトランスフェクトした。該トランスフェクションは、標準的な
リン酸カルシウム法およびDHFR選択により行った。トランスフェクトされたコロ
ニーを、ガラスクローニングシリンダーを使用して単離した。個々のコロニーを
コンフルエントになるまで24ウェルプレート内で増殖させた。無血清馴らし培地
収穫物を、OPGに対するポリクローナル抗血清を使用するウエスタンブロット法
により分泌OPGに関して分析した。ウエスタンブロット法で最高レベルの発現を
示すクローンからの馴らし培地サンプルを、ELISAにより更に分析した。本発明
者らは、AM-1 CHO細胞またはAM-1/サイクリンD CHO細胞由来の46個のクローンに
おいてOPG(22-194)-cys-Fcの発現レベルを比較した（図5）。本発明者らはまた
、ウエスタンブロット法により予め決定された24個の最高発現クローンにおいて
OPG(22-201)-Fcの発現を比較した（図6）。それぞれの場合において、AM-1/サイ
クリンD CHO細胞系由来のクローンは、CHO(SF)またはAM-1 CHO細胞由来のクロー
ンより有意に高いレベルの発現を示している。
いて比較した。OPG(22-201)-FcをAM-1/サイクリンD CHO細胞および親CHO細胞系
（無血清培地内での増殖に予め順応されているもの）[CHO(SF)]内にトランスフ
ェクトした。OPG(22-194)・cys-FcをAM-1サイクリンD CHO細胞内およびその親AM-
1 CHO細胞系内にトランスフェクトした。該トランスフェクションは、標準的な
リン酸カルシウム法およびDHFR選択により行った。トランスフェクトされたコロ
ニーを、ガラスクローニングシリンダーを使用して単離した。個々のコロニーを
コンフルエントになるまで24ウェルプレート内で増殖させた。無血清馴らし培地
収穫物を、OPGに対するポリクローナル抗血清を使用するウエスタンブロット法
により分泌OPGに関して分析した。ウエスタンブロット法で最高レベルの発現を
示すクローンからの馴らし培地サンプルを、ELISAにより更に分析した。本発明
者らは、AM-1 CHO細胞またはAM-1/サイクリンD CHO細胞由来の46個のクローンに
おいてOPG(22-194)-cys-Fcの発現レベルを比較した（図5）。本発明者らはまた
、ウエスタンブロット法により予め決定された24個の最高発現クローンにおいて
OPG(22-201)-Fcの発現を比較した（図6）。それぞれの場合において、AM-1/サイ
クリンD CHO細胞系由来のクローンは、CHO(SF)またはAM-1 CHO細胞由来のクロー
ンより有意に高いレベルの発現を示している。
【００５７】
無血清培地順応CHO細胞内でのNESPの発現
pDSR・2発現ベクター内に挿入されたNESP DNAを、標準的なリン酸カルシウム法
により、3つの異なる無血清順応CHOd細胞系（CHOd(SF)、AM-1およびAM-1/サイク
リンD）内にトランスフェクトした。クローンのトランスフェクション、選択お
よび単離は、付着培養内の血清含有培地内で行った。まず、高レベルのNESPを発
現するクローンを、EPOに対するモノクローナル抗体を使用するウエスタンブロ
ット法により同定した。発現の定量をEIAにより行った。各細胞系由来の最高発
現クローンを、無血清培地内の懸濁培養内での増殖に関して試験した。また、付
着培養内の血清含有培地内のメトトレキセートの濃度を徐々に増加させながら増
殖させることにより、該クローンをDNA増幅に付した。増幅過程中のNESPの発現
を、ウエスタンブロットおよびEIA分析によりモニターした。該増幅過程中の種
々の段階で、該クローンを無血清懸濁培養内での増殖および発現に関して分析し
た。AM-1/サイクリンD CHO細胞系由来のクローンは、その他の2つの親CHO細胞系
に由来するものより全体的に高レベルのNESP発現を示した（図7）。また、該ク
ローンを等電点電気泳動により分析して、アイソフォームの分布を測定した。そ
れらの種々のクローンにおける又は該親CHO細胞系由来の対照細胞系（61L）にお
けるアイソフォーム分布の有意な相違は認められなかった。
により、3つの異なる無血清順応CHOd細胞系（CHOd(SF)、AM-1およびAM-1/サイク
リンD）内にトランスフェクトした。クローンのトランスフェクション、選択お
よび単離は、付着培養内の血清含有培地内で行った。まず、高レベルのNESPを発
現するクローンを、EPOに対するモノクローナル抗体を使用するウエスタンブロ
ット法により同定した。発現の定量をEIAにより行った。各細胞系由来の最高発
現クローンを、無血清培地内の懸濁培養内での増殖に関して試験した。また、付
着培養内の血清含有培地内のメトトレキセートの濃度を徐々に増加させながら増
殖させることにより、該クローンをDNA増幅に付した。増幅過程中のNESPの発現
を、ウエスタンブロットおよびEIA分析によりモニターした。該増幅過程中の種
々の段階で、該クローンを無血清懸濁培養内での増殖および発現に関して分析し
た。AM-1/サイクリンD CHO細胞系由来のクローンは、その他の2つの親CHO細胞系
に由来するものより全体的に高レベルのNESP発現を示した（図7）。また、該ク
ローンを等電点電気泳動により分析して、アイソフォームの分布を測定した。そ
れらの種々のクローンにおける又は該親CHO細胞系由来の対照細胞系（61L）にお
けるアイソフォーム分布の有意な相違は認められなかった。
【００５８】
本明細書の全体にわたり使用されている略語は以下のとおりに定義される。
【００５９】
【表１】
【図１】
図１は、pcDNA3.1/サイクリンD1でトランスフェクトされヒトサイクリンD1特
異的抗体で処理されたAM-1細胞のライセートのウエスタンブロットを示す（「材
料および方法」を参照されたい）。このブロットは、AM-1/D細胞内でのヒトサイ
クリンD1の発現を示している。
異的抗体で処理されたAM-1細胞のライセートのウエスタンブロットを示す（「材
料および方法」を参照されたい）。このブロットは、AM-1/D細胞内でのヒトサイ
クリンD1の発現を示している。
【図２Ａ】
図２Ａは、ヨウ化プロピジウムで染色されFACScan（Becton Dickinson; 「材
料および方法」を参照されたい）により分析されたAM-1/DおよびAM-1細胞系由来
の非同調細胞の相対DNA含量（x軸）および細胞数（y軸）を示すヒストグラムで
ある。これらの図は、AM-1/D細胞のS期において、有意に、より多数の細胞が存
在したことを示している。
料および方法」を参照されたい）により分析されたAM-1/DおよびAM-1細胞系由来
の非同調細胞の相対DNA含量（x軸）および細胞数（y軸）を示すヒストグラムで
ある。これらの図は、AM-1/D細胞のS期において、有意に、より多数の細胞が存
在したことを示している。
【図２Ｂ】
図２Ｂは、ヨウ化プロピジウムで染色されFACScan（Becton Dickinson; 「材
料および方法」を参照されたい）により分析されたAM-1/DおよびAM-1細胞系由来
の非同調細胞の相対DNA含量（x軸）および細胞数（y軸）を示すヒストグラムで
ある。これらの図は、AM-1/D細胞のS期において、有意に、より多数の細胞が存
在したことを示している。
料および方法」を参照されたい）により分析されたAM-1/DおよびAM-1細胞系由来
の非同調細胞の相対DNA含量（x軸）および細胞数（y軸）を示すヒストグラムで
ある。これらの図は、AM-1/D細胞のS期において、有意に、より多数の細胞が存
在したことを示している。
【図２Ｃ】
図２Ｃは、ヨウ化プロピジウムで染色されFACScan（Becton Dickinson; 「材
料および方法」を参照されたい）により分析されたAM-1/DおよびAM-1細胞系由来
の非同調細胞の相対DNA含量（x軸）および細胞数（y軸）を示すヒストグラムで
ある。これらの図は、AM-1/D細胞のS期において、有意に、より多数の細胞が存
在したことを示している。
料および方法」を参照されたい）により分析されたAM-1/DおよびAM-1細胞系由来
の非同調細胞の相対DNA含量（x軸）および細胞数（y軸）を示すヒストグラムで
ある。これらの図は、AM-1/D細胞のS期において、有意に、より多数の細胞が存
在したことを示している。
【図２Ｄ】
図２Ｄは、ヨウ化プロピジウムで染色されFACScan（Becton Dickinson; 「材
料および方法」を参照されたい）により分析されたAM-1/DおよびAM-1細胞系由来
の非同調細胞の相対DNA含量（x軸）および細胞数（y軸）を示すヒストグラムで
ある。これらの図は、AM-1/D細胞のS期において、有意に、より多数の細胞が存
在したことを示している。
料および方法」を参照されたい）により分析されたAM-1/DおよびAM-1細胞系由来
の非同調細胞の相対DNA含量（x軸）および細胞数（y軸）を示すヒストグラムで
ある。これらの図は、AM-1/D細胞のS期において、有意に、より多数の細胞が存
在したことを示している。
【図３】
図３は、種々のレベルのOPG-Fcを発現するクローンの数を示すグラフである。
前記実施例1に記載のとおりに、AM-1/D細胞をプラスミドpDSRα2/OPG-Fcでトラ
ンスフェクトした。このグラフは、最高発現クローンがAM-1/D細胞系に由来する
ことを示している。
前記実施例1に記載のとおりに、AM-1/D細胞をプラスミドpDSRα2/OPG-Fcでトラ
ンスフェクトした。このグラフは、最高発現クローンがAM-1/D細胞系に由来する
ことを示している。
【図４】
図４は、増幅に用いたMTXの濃度に対してプロットされたEPOの発現を示すグラ
フである。前記実施例2に記載のとおりに、AM-1/D細胞をプラスミドpDSRα2/hEP
Oでトランスフェクトした。それらのうちの2個のクローンが、MTX濃度の上昇に
つれて上昇するEPO産生を示し、これは、遺伝子増幅が成功したことを示してい
る。
フである。前記実施例2に記載のとおりに、AM-1/D細胞をプラスミドpDSRα2/hEP
Oでトランスフェクトした。それらのうちの2個のクローンが、MTX濃度の上昇に
つれて上昇するEPO産生を示し、これは、遺伝子増幅が成功したことを示してい
る。
【図５】
図５は、AM-1 CHO細胞またはAM-1/サイクリンD CHO細胞に由来する46個のクロ
ーンにおけるOPG(22-194)-cys-Fcの発現レベルの比較を示す。AM-1/サイクリンD
CHO細胞系由来のクローンは、AM-1 CHO細胞由来のクローンより有意に高いOPG(
22-194)-cys-Fc発現レベルを示している。
ーンにおけるOPG(22-194)-cys-Fcの発現レベルの比較を示す。AM-1/サイクリンD
CHO細胞系由来のクローンは、AM-1 CHO細胞由来のクローンより有意に高いOPG(
22-194)-cys-Fc発現レベルを示している。
【図６】
図６は、ウエスタンブロット法により予め決定された24個の最高発現クローン
におけるOPG(22-201)-Fc発現の比較を示す。それぞれの場合において、AM-1/サ
イクリンD CHO細胞系由来のクローンは、CHO(SF)細胞由来のクローンより有意に
高いOPG(22-201)-Fc発現レベルを示している。
におけるOPG(22-201)-Fc発現の比較を示す。それぞれの場合において、AM-1/サ
イクリンD CHO細胞系由来のクローンは、CHO(SF)細胞由来のクローンより有意に
高いOPG(22-201)-Fc発現レベルを示している。
【図７】
図７は、各親CHO細胞系由来の14個の最良クローンにおける、EIAにより測定さ
れた平均NESP発現を示す。馴らし培地サンプルを24ウェルプレートから集めた（
第2日の収穫物）。サンプルをウエスタンブロット法により予備スクリーニング
した。
れた平均NESP発現を示す。馴らし培地サンプルを24ウェルプレートから集めた（
第2日の収穫物）。サンプルをウエスタンブロット法により予備スクリーニング
した。
【図８】
図８は、攪拌培養およびバイオリアクター培養の収穫物のIEFウエスタンブロ
ットを示すものであり、攪拌培養およびバイオリアクター培養からの分泌NESPタ
ンパク質のアイソフォーム分布が比較されている。攪拌収穫物は未増幅クローン
からのものである。ローラーボトル馴らし培地から精製された標準NESPタンパク
質は、所望の高分子量アイソフォームを示している。該馴らし培地収穫物は、す
べてのアイソフォームを含有している。該ブロットは、すべてのサンプルにおけ
る高アイソフォームの存在を示している。
ットを示すものであり、攪拌培養およびバイオリアクター培養からの分泌NESPタ
ンパク質のアイソフォーム分布が比較されている。攪拌収穫物は未増幅クローン
からのものである。ローラーボトル馴らし培地から精製された標準NESPタンパク
質は、所望の高分子量アイソフォームを示している。該馴らし培地収穫物は、す
べてのアイソフォームを含有している。該ブロットは、すべてのサンプルにおけ
る高アイソフォームの存在を示している。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年７月３１日（２００１．７．３１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，
ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ
Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ
Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ
，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ
，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，
ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ
Ｂ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ
，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，
ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ
Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ
，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，
ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，Ｙ
Ｕ，ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 ギユダス，ジヤン・マリ
アメリカ合衆国、カリフオルニア・91362、
サウザンド・オークス、エスパーナ・レイ
ン・3102
(72)発明者 ブランコー，デビツド・ウイリアム
アメリカ合衆国、カリフオルニア・91326、
ノースリツジ、トリビユーン・ストリー
ト・18800
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA21 CA04 CA07 DA02
EA04 GA11 HA01 HA03
4B064 AG01 AG18 CA10 CA19 DA01
4B065 AA91X AA93Y AB01 BD39
CA24 CA44
Claims (20)
- 【請求項１】 真核細胞であって、 （a）いずれの天然発現レベルよりも高いレベルで該細胞内で機能的に発現され
るサイクリンD遺伝子産物と、 （b）いずれの天然発現レベルよりも高いレベルで該細胞内で発現される関心の
あるタンパク質とを含んでなる真核細胞。 - 【請求項２】 哺乳類細胞である、請求項1に記載の細胞。
- 【請求項３】 CHO細胞である、請求項1に記載の細胞。
- 【請求項４】 無血清培地に順応した、請求項3に記載の細胞。
- 【請求項５】 AM-1細胞である、請求項1に記載の細胞。
- 【請求項６】 該サイクリンD遺伝子産物が哺乳類サイクリンD1を含む、請
求項1に記載の細胞。 - 【請求項７】 該サイクリンD遺伝子産物がヒトサイクリンDを含む、請求項
1に記載の細胞。 - 【請求項８】 該サイクリンD遺伝子産物がヒトサイクリンD1を含む、請求
項1に記載の細胞。 - 【請求項９】 前記の関心のあるタンパク質が、EPO関連タンパク質、OPG関
連タンパク質またはレプチン関連タンパク質である、請求項1に記載の細胞。 - 【請求項１０】 前記の関心のあるタンパク質が、EPO、NESP、OPG、OPG-Fc
、レプチンまたはFc-レプチンである、請求項1に記載の細胞。 - 【請求項１１】 関心のあるタンパク質の製造方法であって、 （A）真核細胞を作製し（該真核細胞は、 （1）いずれの天然発現レベルよりも高いレベルのサイクリンD遺伝子産物と
、 （2）いずれの天然発現レベルよりも高いレベルの関心のあるタンパク質と
を発現する）、 （B）前記の関心のあるタンパク質の発現と該サイクリンD遺伝子産物の機能的発
現とを可能にする条件下で該細胞を培養し、 （C）前記の関心のあるタンパク質を単離することを含んでなる製造方法。 - 【請求項１２】 該細胞が哺乳類細胞である、請求項11に記載の製造方法。
- 【請求項１３】 該細胞がCHO細胞である、請求項11に記載の製造方法。
- 【請求項１４】 該細胞が無血清培地に順応している、請求項13に記載の製
造方法。 - 【請求項１５】 該細胞がAM-1細胞である、請求項11に記載の製造方法。
- 【請求項１６】 該サイクリンD遺伝子産物が哺乳類サイクリンD1を含む、
請求項11に記載の製造方法。 - 【請求項１７】 該サイクリンD遺伝子産物がヒトサイクリンDを含む、請求
項11に記載の製造方法。 - 【請求項１８】 該サイクリンD遺伝子産物がヒトサイクリンD1を含む、請
求項11に記載の製造方法。 - 【請求項１９】 前記の関心のあるタンパク質が、EPO関連タンパク質、OPG
関連タンパク質またはレプチン関連タンパク質である、請求項19に記載の製造方
法。 - 【請求項２０】 前記の関心のあるタンパク質が、EPO、NESP、OPG、OPG-Fc
、レプチンまたはFc-レプチンである、請求項19に記載の製造方法。
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