JP2003274924A - 細胞分離方法及び装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】従来の細胞分離装置は大型かつ高価であるとい
う欠点があり、また分離の際に細胞に電界を印加するな
どの少なからず細胞に損傷を及ぼすものであった。 【解決手段】装置の小型化、廉価化を図るために細胞導
入口、流路、分岐流路およびポンプ手段を一体のチップ
上に形成し、かつ特にポンプ手段には細胞に直接電界を
印加することの無い電気浸透流ポンプを用いる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、健康状態の判断
や、免疫診断、免疫治療を行うために、血液に含まれる
リンパ球等の細胞を、電気泳動速度や比重の違いを利用
してＴ細胞、Ｂ細胞等の亜集団に区別し、その数を計測
し、または其々の亜集団に分離するための分離手段なら
びにその装置に関する。特に必要な機能、構造の一部が
一つの板状のチップに集積されており、必要な検体が微
量ですみ、携帯性、即時性、使い捨て、安価などを特徴
とする微小流体力学やｍｉｃｒｏ−ＴＡＳ、Ｌａｂ−ｏ
ｎ−ａ−Ｃｈｉｐといわれる分野に関する。

【０００２】

【従来の技術】リンパ球は体内の免疫機能を担う中心で
あり、機能的系統的にいくつかの異なる細胞集団であ
る、Ｂ細胞、キラーＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッ
サーＴ細胞などのリンパ球亜群から構成されている。リ
ンパ球は言うまでもなく個体の免疫応答に関する様々な
情報をもっており、ある亜群を分取し詳細に調べること
で、または抹消血中のリンパ球亜群の比率を測定するだ
けでも、免疫診断を行うための有益な情報を得ることが
できる。あるいはある種のリンパ球を体外で培養し、体
内に戻すような免疫治療を行う上でも、リンパ球亜群の
区別・分離は重要かつ一般的基本的なものとなってき
た。

【０００３】通常、このようなリンパ球亜群比率の測定
や、特定の亜群の分取には、特定の亜群と結びつく蛍光
抗体を作用させたリンパ球を、ノズルから細かい水滴に
含まれる形で空中に押し出し、その一つ一つの蛍光や散
乱から亜群を区別・計数し、さらに静電力によって特定
の亜群を含む水滴だけの軌道を曲げ分取する、フローサ
イトメトリー法が使用されるが、これは装置も大掛かり
で高価なものであり、メンテナンスも大変で、必要な時
に手軽に使えるものではなかった。簡易的な方法として
は、特定の亜群だけを吸着するように、表面に抗体を固
定化するなどした特殊な繊維状やビーズ状の樹脂がつめ
られたカラムを通すことにより、分離する方法がある
が、これはリンパ球を損傷したり、カラムのコンディシ
ョニングに手間が掛かったり、また滴下速度などの条件
により吸着率が異なり、定量性に問題がある。また細胞
電気泳動装置やフリーフロー電気泳動装置を用い、表面
電荷濃度の違いにより、Ｔ細胞とＢ細胞を分離する方法
は、以前はよく使用されたが、やはり装置が大型で、近
年はフローサイトメトリー法に取って代わられつつある
が、この手法の利点は、抗体を用いないため細胞の損傷
が少ないことにあり、免疫治療を目的とした用途等に現
在も使われている。

【０００４】近年、ｍｉｃｒｏＴＡＳ、Ｌａｂ−ｏｎ−
ａ−Ｃｈｉｐという技術分野が立ち上がりつつあり、従
来の分析技術や化学合成法を、一つのチップの上に集積
化することで、システムの小型化、必要な試薬や検体量
の縮小化、低コスト化、高速化、高機能化を実現してい
る。このようなチップ上でリンパ球のＴ、Ｂ細胞分離を
行った例はすでに公知となっている。（特願２００１−
３０４１７８）本方法によれば緩衝液のｐＨ変化を抑制
しながら、一箇所にバンド状に並べたリンパ球を電気泳
動させることによってＴとＢ細胞に分離できる。また、
遠心分離と電気泳動を同時に行うことによっても同様に
これらの細胞を分離できることが示されている。

【０００５】また、家庭や緊急医療現場で、一滴の血液
から、人間の健康管理に必要な血液分析を１チップで行
うことを目的とした、ヘルスケアデバイスのような、血
液分析チップが最近開発されている。（特開２００１−
２５８８６８）もし１チップ上で細胞分離が可能であれ
ば、免疫診断から健康管理に有益な情報が得られる。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】このように、現在細胞
分離に用いられているフローサイトメトリ装置は大がか
りで高価なものであることから、これが免疫診断、免疫
治療の恩恵を万人が浴するための一つの大きな障壁とな
っている。もしこのような細胞分離がチップ上で実現で
きれば、小型、安価、簡便、即時などのチップ化のメリ
ットにより、日常的免疫診断、健康管理といったことに
適用することができ、人々の安寧に寄与するところ大で
ある。さらに当該フローサイトメトリ法の場合、細胞分
離の際に電界を細胞に印加しているため、細胞に少なか
らず損傷を与えてしまうという問題があった。

【０００７】またチップ上で電気泳動を用い細胞分離を
行う場合においても細胞に電界を印加しているために細
胞に損傷を及ぼしていると考えられ、これは細胞分離の
応用を著しく狭める大きな問題である。

【０００８】

【課題を解決するための手段】細胞に悪影響を及ぼす電
界などを印加すること無く、細胞分離を行うためにダウ
ンフロー型の電気浸透流ポンプを用いる。当該ポンプに
ついては公知例（特願２００１−１１６０９１）に詳し
いが、図１を用いて簡単に説明する。流路手段１０１、
上流流路１０２，小断面積流路１０３，下流流路１０４
および液溜め１１０には予め電解液が満たされており、
これら流路の途中には２箇所のゲル電極１０５および１
０７を介して白金電極１０６および１０８が接続されて
いる。また１０９も流路手段であり、上流の様々な以降
と接続されている。今、図中の矢印方向に電解液の輸送
を行いたいとすると、上流側の白金電極１０６に正の電
圧を印加し、下流側の白金電極１０８は接地する。これ
により当該電極１０６、１０８間に印加された電圧によ
り生じる電気浸透流のために、流路内の電解質液体は図
中の矢印の向きに移動する。この結果、上流側の流路手
段１０９には陰圧（吸引力）が生じるため、図１に示し
た機構がポンプとしての作用を有することを示してい
る。ここで電圧をゲル電極を介して印加しているのは、
電極反応に伴う水素や酸素の発生や電解質溶液のｐＨ変
動を抑制するためであり、また小断面積流路１０３を有
するのはより高いポンプ力を得るためである。ここで強
調しておくべきことは図１に示した電気浸透流ポンプの
上流側においては、電解液に電界が全く印加されていな
いことである。すなわち当該ポンプをチップ上に形成し
て細胞分離に用いた場合、細胞に直接電界を印加するこ
と無く任意の細胞を任意の方向に輸送することができる
ので、これを細胞の検出手段と組み合わせることにより
複数の種類の細胞をそれぞれ任意の細胞貯めに分別する
ことができる。

【０００９】

【発明の実施の形態】図２に本発明に基づき、作製した
細胞分離チップとその周辺構成図を示す。２０１はチッ
プを構成する基板であり、この上には検体である細胞の
液溜め２０２、流路２０３があり、その下流において流
路はＹ字に分岐し、それぞれ分岐流路Ａ２０４および分
岐流路Ｂ２０５がある。それぞれの分岐流路の下流には
それぞれ電気浸透流ポンプＡ２０６と電気浸透流ポンプ
Ｂ２０７が配置されている。今、液溜め２０２に２種類
の細胞を複数個入れて液溜め及び流路を緩衝液などの液
体で満たす。このとき１種類の細胞には予め蛍光抗体を
付着させてある。（この場合蛍光抗体を付着させた細胞
を細胞Ａ、付着させていない細胞を細胞Ｂとする）その
後に圧力流あるいはチップ上の電気浸透流ポンプにより
細胞を下流へと導く。このとき流路２０３の途中におい
て、光源２１０から光を照射し、この光により細胞表面
に蛍光抗体がある場合には蛍光を発し、この蛍光は検出
器２１１により検出される。同時にこの地点を通過する
細胞はＣＣＤカメラ２１２によっても観察している。こ
れらのデータは制御コンピュータ２１３に送られ、細胞
の流速と観察地点からＹ字分岐地点までの距離から、電
気浸透流ポンプＡとＢのオンあるいはオフのタイミング
を算出する。すなわち、いま蛍光を発する細胞（すなわ
ち細胞Ａ）を検知したとすると、その細胞がＹ字分岐路
に達する直前に電気浸透流ポンプＡをオン、電気浸透流
ポンプＢをオフにし、細胞Ａを分岐流路Ａへと引き込
む。蛍光を発しない細胞Ｂの場合にはその逆に電気浸透
流ポンプＡをオフ、電気浸透流ポンプＢをオンとし、こ
れを分岐流路Ｂへと引き込む。このようなことを繰り返
すことで２種類の細胞を電界などを印加することなく電
気浸透流ポンプによる液体の流れのみで分離することが
できる。なお蛍光を発しない細胞Ｂの場合はＣＣＤカメ
ラ２１２によって当該細胞を確認している。

【００１０】上の場合、２種類の細胞を蛍光の有無によ
り見分けていたが、その他の細胞の形状の違いから見分
けるなどの方法でも同様に細胞を分別することができ
る。

【００１１】

【実施例】〔第一の実施例〕図２に示した細胞分離チッ
プを用い、リンパ球のＴ細胞の内のＣＤ４とＣＤ８の分
離を試みた。チップ基板としては安価なポリエチレンテ
レフタレート（ＰＥＴ）を用い、これを流路や液溜めパ
ターンを光露光法や乾式エッチング法を用いて形成した
石英製の型に押し当て、チップ基板にパターンを転写、
形成した。このＣＤ４とＣＤ８の個数比を調べることに
よって後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）やＢ型肝炎の
診断が可能である。あらかじめＣＤ４にのみ付着する蛍
光抗体処理をこれらの細胞に施し、液溜め１０２に導入
する。このとき流路と液溜め全体をＨＢＳＳ溶液（ＨＥ
ＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｈａｎｋｓ‘ ｂａｌａｎ
ｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で満たす。その
後に細胞を下流へと流し、その途中で蛍光の有無を検出
してそのデータより電気浸透流ポンプのオン、オフによ
り細胞を分離していく。その結果分岐流路Ａに蛍光を発
するＣＤ４のみが、分岐流路Ｂに蛍光を発しないＣＤ８
のみが分離できていることが確認された。

【００１２】〔第二の実施例〕図３には図２に示した細
胞分離チップを改造したものを示している。同図におい
て図２と同じ名称のものは、図２の符号をそのまま用い
た。この場合、２つの分岐流路の途中に電気浸透流ポン
プを設置し、またその下流にそれぞれ分別した細胞を溜
めておく細胞溜めＡ３０１と細胞溜めＢ３０２を設置し
ているところが図２と異なる。こうすることによって図
１の場合に多数の細胞を分別する際にそれぞれの分岐流
路のポンプ上に細胞が集まり、それが抵抗となってポン
プ能力が低下してきてしまっていたが、図２のように途
中に電気浸透流ポンプを設置して、さらにその下流に液
溜めを設けることで分別した細胞を液溜めに格納しなが
ら細胞を分別していくことができる。実際に第一の実施
例と同様にＣＤ４とＣＤ８の分離を試みたところ電気浸
透流ポンプの能力の低下を伴うことなくこれらを分別す
ることができた。

【００１３】

【発明の効果】以上に述べたとおり、本発明による細胞
分離装置では、複数の細胞の種類を蛍光や細胞形状から
判断し、その結果から電気浸透流ポンプを制御して細胞
を分離していく。電気浸透流ポンプは細胞に直接電界を
印加することはないので、非損傷の細胞分離が実現する
ことができる。本発明においては２種類の細胞の分離を
行ったが、分岐流路を多くするかそれらを多段は位置す
ることにより、より多くの種類の細胞を同時に分離する
ことが可能であることは容易に推測することができる。
さらに本発明の細胞分離装置は従来装置と比較して小型
かつ安価に構成できるので、これにより多くの人々に免
疫診断、免疫治療を提供することが可能となった。

【図面の簡単な説明】

【図１】 電気浸透流ポンプを説明する図である。

【図２】 本発明の細胞分離装置の構成を説明する図で
ある。

【図３】 本発明の細胞分離装置の構成を説明する図で
ある。

【符号の説明】

１０１ 流路手段 １０２ 上流流路 １０３ 小断面積流路 １０４ 下流流路 １０５ ゲル電極 １０６ 白金電極 １０７ ゲル電極 １０８ 白金電極 １０９ 流路手段 １１０ 液溜め ２０１ 基板 ２０２ 検体入口液溜め ２０３ 流路 ２０４ 分岐流路Ａ ２０５ 分岐流路Ｂ ２０６ 電気浸透流ポンプＡ ２０７ 電気浸透流ポンプＢ ２０８ 細胞Ａ ２０９ 細胞Ｂ ２１０ 光源 ２１１ 検出器 ２１２ ＣＣＤカメラ ２１３ 制御コンピュータ ３０１ 細胞溜めＡ ３０２ 細胞溜めＢ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 斧田 博之 兵庫県神戸市北区星和台１丁目18番20号 (72)発明者 堀池 靖浩 東京都西東京市東伏見３丁目２番地12号 Ｆターム(参考） 4B029 AA23 AA27 BB11 CC01 4B065 AA90X BA30 CA44 CA46

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 複数の種類の細胞を分離する装置であっ
   て、細胞の導入口、細胞を移動するための流路、分離し
   た細胞を導く複数の分岐流路と細胞を輸送するための複
   数のポンプ手段が一枚の板や棒状のものに一体で形成さ
   れており、当該ポンプ手段を作動させたときに細胞に直
   接電界が印加されることが無いことを特徴とし、また細
   胞を識別する検出手段からの信号に基づき、それぞれの
   ポンプ手段を作動あるいは不作動として所望の分岐流路
   に所望の種類の細胞を導き細胞分離を行うことを特徴と
   した細胞分離装置。
2. 【請求項２】 請求項１に記載のポンプ手段が特に電気
   浸透流ポンプであることを特徴とする細胞分離装置。
3. 【請求項３】 請求項１に記載のポンプ手段が特に電気
   浸透流ポンプであることを特徴とする細胞分離方法。