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JP2002534700A - 最適な高スループット分析システム - Google Patents

最適な高スループット分析システム

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Publication number
JP2002534700A
JP2002534700A JP2000593769A JP2000593769A JP2002534700A JP 2002534700 A JP2002534700 A JP 2002534700A JP 2000593769 A JP2000593769 A JP 2000593769A JP 2000593769 A JP2000593769 A JP 2000593769A JP 2002534700 A JP2002534700 A JP 2002534700A
Authority
JP
Japan
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channel
test compound
plug
microfluidic
microfluidic channel
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2000593769A
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JP2002534700A5 (ja
Inventor
アン・アール.・コッフ−シル
アンドレア・ダブリュー.・チャウ
Original Assignee
カリパー・テクノロジーズ・コープ.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by カリパー・テクノロジーズ・コープ. filed Critical カリパー・テクノロジーズ・コープ.
Publication of JP2002534700A publication Critical patent/JP2002534700A/ja
Publication of JP2002534700A5 publication Critical patent/JP2002534700A5/ja
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    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813Hybridisation assays
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01FMIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
    • B01F33/00Other mixers; Mixing plants; Combinations of mixers
    • B01F33/30Micromixers
    • B01F33/302Micromixers the materials to be mixed flowing in the form of droplets
    • B01F33/3021Micromixers the materials to be mixed flowing in the form of droplets the components to be mixed being combined in a single independent droplet, e.g. these droplets being divided by a non-miscible fluid or consisting of independent droplets
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01FMIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
    • B01F33/00Other mixers; Mixing plants; Combinations of mixers
    • B01F33/30Micromixers
    • B01F33/3039Micromixers with mixing achieved by diffusion between layers
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416Systems
    • G01N27/447Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704Details; Accessories
    • G01N27/44743Introducing samples
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S366/00Agitating
    • Y10S366/02Micromixers: segmented laminar flow with boundary mixing orthogonal to the direction of fluid propagation with or without geometry influences from the pathway

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Abstract

(57)【要約】 ミクロ流体の連続分析システムのスループットが、近接度および速度を最大にして複数の異なるサンプルをミクロ流体チャネル網に連続的に導入することにより最適化される。所与の試薬、反応時間などに対して、所望のスループットに基づいて最適化されたパラメータを含む装置が包含される。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】 発明の背景 ミクロ流体分析システムは、化学・生化学システムの分析におけるスループッ
トを増し、コストを低減し、自動化を改善し、データの質を向上させるという要
求を満たすための実用可能な手段としてますます見なされつつある。多くの場合
、これらの要求の多くを達成するというミクロ流体素子工学の目標が、小型化さ
れた従来技術の大規模な並列化により達せられてきた。従来の技術に対して多く
の恩恵を与える一方で、より小規模な並列システムは、例えば並列チャネル数の
ファクターだけ従来技術に対して改善するのみである。特に、これらのより小さ
いミクロ流体システムは、従来技術の制限のいくつかを取り除く一方で、それら
全てを除去するわけではない。よって、これらのシステムは一般に従来技術に対
する小さな改善(例えばコスト改善)を行い、ミクロ流体システムが解決できな
いさらなる制限(例えば並列システムの同時制御)に突き当たるのみである。 共有に係る公開された国際出願No.98/00231には、これらのことの
いくつかに取り組んだ方法及びシステムが記載されている。特に、試験化合物(
例えば製薬ライブラリ化合物)を連続してスクリーニングし、これらの化合物の
どれが所与の生体システムに所望の効果を有するのかを決めるアッセイ方法が記
載されている。単一のミクロ流体チャネル網にて化合物を連続してスクリーニン
グすることにより、相対的に高い連続スループットを依然として生じつつ、シス
テムの制御が単純化される。加えて、システムが例えば複数の独立のチャネル網
を設けて複数の化合物を連続的にスクリーニングすることにより並列化されるな
らば、スループットはさらに増す。
【0002】 しかしながら、直列システムでは、スループットを最大にする上で困難が生じ
得る。特に、スループットを最適化するには、システムに連続的に導入される化
合物間の間隔を最小にする必要がある。しかしながら、いくつかの要因、例えば
流体物質の拡散、電気泳動バイアス、分散などは、連続導入される隣接した化合
物間の間隔の最小化に不利となる。特に、流体サンプルは拡散し、分散しそして
電気泳動用のバイアスが付加され、又は汚される(smeared)ので、連続的に導入
される流体物質の混合を避けるために、各流体の容積に実質的な間隔が与えられ
ることが一般に要求される。試験化合物間に要する間隔が大きくなれば、複数の
化合物をスクリーニングするのに要する時間が長くなる。さらに、このような分
散は、微小スケールのチャネル内の流体物質の過度の稀釈を生じ得る。ミクロ流
体システムの寸法は極度に小さいので、一般に従来の分析で用いるよりも実質的
に少ない物質を用いてミクロ流体分析を始めるが、場合によってはしばしばこの
ような稀釈が起こることは許されない。 それにも関わらず、間隔を最小にして物質を連続的に導入可能にすることによ
りスループットを最大にできるミクロ流体システム、これらのシステムの使用方
法、及びこれらのシステムの設計方法を提供することが一般に望まれる。本発明
はこれらの要求と多様なその他の要求を満たす。
【0003】 発明の概要 一般に、本発明は、ミクロ流体チャネルシステム内で連続的に処理される物質
に対して最適なスループットを有する方法、装置及びシステムを提供する。 例えば、第1の態様では、本発明はミクロ流体チャネル内に複数の試験化合物
プラグ(plug)を連続的に輸送する方法を提供する。この方法は、最大寸法dより
小さな最小断面寸法を有する第1のミクロ流体チャネルを設けることを含む。こ
こで、
【数7】 第1の試験化合物プラグが導入され、続いて隣接のスペーサ流体プラグが導入さ
れる。上式において、Pは試験化合物プラグと隣接スペーサ流体プラグをチャネ
ルに導入するのに要する時間である。Dは試験化合物プラグにおける試験化合物
の拡散係数である。Tは試験化合物プラグがチャネルに導入されてから検出地点
に移動する時間量である。Kはチャネルの断面形状の性質に基づいた比例定数で
ある。nは、TがPより大きいという条件下で、時間Tにおえる試験化合物プラ
グ中の試験化合物の平均分散距離に対する初期プラグ長の比である。スペーサ流
体プラグに隣接して、第2試験化合物プラグが導入される。
【0004】 本発明の別の態様は、本体構造を有し、少なくとも第1ミクロ流体チャネルを
その中に配置したミクロ流体装置である。このチャネルは次式のdより小さな最
小断面寸法を有する。
【数8】 第1及び第2試験化合物プラグは、チャネル中にスペーサ流体プラグにより分離
されて配置される。第1試験化合物プラグとスペーサ流体プラグは、Lp の長さ
を有する。nは、試験化合物プラグ中の試験化合物の所望の分散距離に対する初
期プラグ長の比であり、約0.5〜約10である。Dは第1試験化合物の拡散係
数である。Tは試験化合物プラグがチャネルに導入されてから検出地点に移動す
るまでの時間である。Uは第1の微小スケールチャネルを通る試験化合物プラグ
の平均直線速度である。Kはチャネルの断面形状の性質に基づいた比例定数であ
る。 本発明の別の態様は、連続分析を行うためのミクロ流体チャネル網を設計する
方法である。この方法は、試験化合物プラグとスペーサプラグとを含む試験プラ
グのサイクル長を選択することを含む。試験化合物の拡散係数が同定される。試
験化合物に対して、総反応時間が選択される。サイクル長、拡散係数及び総反応
時間に基づいて、分析を行うための最大チャネル直径及びチャネル長の1又はそ
れ以上が決められる。試験化合物プラグ中の試験化合物は、総反応時間中にスペ
ーサ流体プラグの50%より少ないものが分散する。
【0005】 発明の詳細説明 I. 一般的な議論 本発明は、ミクロ流体装置又はシステムのチャネルを連続的に通過するサンプ
ル間に要求される時間を最小にすることにより、ミクロ流体装置又はシステムに
おける高スループットの実験及び超高スループットの実験でさえ行える方法を提
示する。特に、本発明は、いくつかの最適基準を満たすミクロ流体チャネルを設
けることにより、ミクロ流体チャネル中に連続的に導入され一定の間隔を置いて
配置された流体サンプルのスループットを最大にする方法を提供する。一般に、
十分に小さな断面寸法のミクロ流体システムを設けることにより、及び層流範囲
において流体操作を行うことにより、ミクロ流体チャネル中での拡散、分散及び
他の撹乱効果のレベルを実質的に下げることができ、それにより連続的に導入さ
れる物質間の間隔を最小にできる。これらの連続的に導入される物質間の間隔を
小さくすることにより、単位時間当たりにチャネルに連続的に導入できる異なる
物質の数(これも「スループット」という)を最大にできる。1つのチャネル内
において1化合物/分より大きな速度でスクリーニングされる化合物は、一般に
高スループットをいい、1化合物/10秒より大きな速度での化合物のスクリー
ニングは、一般に超高スループットの範疇に入る。
【0006】 図1は、本発明の連続分析方法及びシステムを概略示す。図示されているよう
に、ミクロ流体装置100は本体構造102を含み、その中に主分析チャネル1
04を配置する。一般に、主分析チャネル104は、主チャネル104中で連続
的に分析される様々なサンプル物質/試験化合物の源(図示せず)と流動自在に
連通している。図示されているように、主チャネルとサンプル物質の源との連通
は、チャネル104aを中に配した本体ピペット要素106を介して与えられ、
このチャネル104aは主分析チャネル104と流動自在に連通している。操作
中、一般には所与の分析用の試薬が主チャネル104に沿って流される。次に、
複数のサンプル物質/試験化合物プラグ108が主チャネルに連続的に導入され
、そこで分析試薬と相互作用する。連続して導入される試験プラグ間の分離を維
持するために、スペーサ流体プラグ110がピペットチャネル104a及び分析
チャネル104に導入される。試験プラグ及び相互作用する試薬は、それらが検
出器(例えば光検出器118)とセンシング上において連通したチャネル中の検
出地点に到達するまで、主チャネル104に沿って輸送される(矢印で示す)。
図1から明らかなように、システムのチャネル中により近づけて試験プラグを共
に詰めることができれば、単位時間当たりさらに多くの試験プラグを分析できる
。連続した高スループット分析のこの面は本発明の方法及びシステムにより直接
扱われる。
【0007】 特に、本発明は、少なくとも2つの異なる流体領域をミクロ流体チャネルを通
して輸送し、それにより2つの流体領域相互間の分散又は拡散が最小化される方
法を提供する。一般にこれは本発明によりミクロ流体チャネルを設けることによ
り達成され、該チャネルは、スループットが最適化されたチャネル寸法を有し、
試験プラグ物質の最小の分散/拡散を示す。一般にこれは、所与の分析システム
に対する最適なチャネル断面寸法や例えば反応時間、試験プラグ物質の拡散係数
、試験プラグの所望の厳格さ(stringency)/分解能などを選択することにより達
成される。ここで議論しているように、「分散」は流体媒体内での対流誘導型の
長手方向の物質分散として定義される。これは、例えば圧力駆動フローシステム
、カーブやコーナー付近での動電学的に駆動されるフローシステム、及び一様な
バッファーイオン濃度(例えば同じチャネルシステム内での高及び低塩溶液のプ
ラグ)を有する動電学的に駆動されるフローシステムにおいてストリームライン
を横切る速度変化を原因とする。本発明のチャネルシステムの目的のためには、
分散は一般にはフローと分子拡散とのカップリングによるもの、すなわちテーラ
ー(Taylor)分散として定義される。この態様では、対流的な輸送による分散の時
間スケールは、長く、すなわち流れ方向に直交する方向での分子拡散の時間スケ
ールに匹敵する。分散及びテーラー分散についての議論は、例えばTaylor et al
., Proc. Roy. Soc. London, (1953) 219A:186-203、Aris, Proc. Roy. Soc. Lo
ndon (1956) A235:67-77、Chatwin et al., J.Fluid mech. (1982) 120:347-358
、Doshi et al., Chem. Eng. Sci. (1978) 33:795-804 及びGuell et al., Chem
. Eng. Comm. (1987) 58:231-244を特に参照されたい。これらの各々はあらゆる
目的のため文献全体としてここに援用する。
【0008】 II. 最適化されたミクロ流体システム ミクロ流体チャネル内での試験プラグ物質の拡散/分散を図2に略示する。特
に、チャネルへの初期導入の地点では、試験プラグは明瞭な非拡散プラグとして
示されている(上図、時間=0)。試験プラグがチャネルに沿って輸送される所
与の時間(T)の後、図2(下図)に示されるように、円と四角で示された試験
プラグ内の物質が、元の試験プラグ容積から拡散及び分散する。平均分散距離は
、鎖線により示される。所望の分散距離と後に詳細に記載するnとの相関がある
ので、元の試験プラグ長(Lplug)、周期長(Lp )及び直線速度(U、矢印)
を図2に示す。ここに記載のように、例えば鎖線で示されたような所望のレベル
の拡散/分散を例えば越える過度な拡散/分散を許容しない最適化されたミクロ
流体チャネルが選択/設計される。 本発明に従って使用されるミクロ流体チャネルシステムに対する最適基準を決
める際には、多くの要因を考慮することを伴う。システムを最適にするためには
、例えばシステムが使用される特定の用途における一時的で化学的な要求だけで
なく、システムの構造的な特性の両方を考慮しなければならない。
【0009】 特に、所与のサンプル又は試験化合物物質の流体プラグ(「試験プラグ」とも
いう)をどのくらい近づけてチャネルに導入できるかを決めるに際に考慮しなけ
ればならないのは、(1)例えば物質の拡散係数のような物質の特性、(2)例
えば十分に検出可能な信号および物質プラグの許容できるレベルの粘着性を与え
るための、例えばサンプル又は試験化合物物質の導入と該物質の検出との間で必
要な時間のような用途における要求、及び(3)例えばチャネルの断面寸法のよ
うなミクロ流体チャネルの構造特性である。もちろん、他のいくつかの事項、例
えばミクロ流体装置及びシステムの製造コスト、反応速度、検出機構の感度など
も上記基準の各々に影響し得る。しかしながら、本発明は、上記基準に対して最
適化され且つこれら後者の基準やその他の影響因子を最適化することもできるミ
クロ流体装置及びシステムの製造及び使用方法を提供する。
【0010】 言及したように、一般に所与のアッセイを行うための特定の連続入力システム
のスループットを最適化するには、隣接した試験プラグ間の過度な混合を起こさ
ずできるだけ近づけて試験プラグを連続的に導入する必要がある。1番目として
、このことは、試験プラグ間を分離するために試験プラグ間にスペーサ流体プラ
グを導入することを要求する。しかしながら、2番目として、単位時間当たりシ
ステムを通って移動する試験プラグ数を最大にするために、スペーサプラグの長
さを考慮して最小にする一方で、必要な分離又は区分機能はなお実行する。スペ
ーサ流体プラグのこのような最小化において考慮を要することは、試験プラグ中
の物質がミクロ流体チャネルを通って進む間に拡散又は分散する速度、及び許容
できるレベルの拡散/分散のみを可能にするスペーサ流体プラグの長さの選択で
ある。
【0011】 試験プラグ物質の分散は、同物質の拡散と類似している。よって、拡散係数E
は、該物質の拡散係数に類似し、次式で定義される。
【数9】 ここで、dはチャネルの最小断面寸法であり、Uはチャネルを通って移動する物
質の平均直線速度(単位:mm/秒)であり、Kはチャネルの断面形状の関数で
ある比例因子であり、Dは物質又は溶質の分子拡散係数である。分子が拡散する
距離(x)は、次式で与えられる。
【数10】 ここで、Tは決められた拡散の時間量である。特定のシステムに分散と拡散の両
方が存在するならば、分散を追加的な拡散源として扱い、分子が移動する距離を
拡散と分散の結合により次の通り計算できる。
【数11】
【0012】 上述したように、ここに記載のシステムに関して真の関係領域は、結合した試
験/スペーサプラグの長さLp に対して所与の分子が移動する距離である。拡散
距離に対するプラグ長の比をnとして定義すると、次式が得られる。
【数12】 この式を整理してdについて解くと、次式が得られる。
【数13】 ここで、dは、特定のパラメータセット、例えば試験/スペーサプラグ長Lp
チェンネル中での物質の直線速度U、チャネル中での保留時間T及び所望の又は
許容できる分散距離nの下での、問題のチャネルの直径における上限である。
【0013】 試験プラグとスペーサの単一サイクルを導入するのに要する時間がPで定義さ
れるならば(これはシステムのスループットの逆数である)、元の周期長Lp
、試験プラグ/スペーサ流体プラグの直線速度Uとこれらのプラグを導入するた
めの期間Pとの積として書き直すことができる。これは上記等式を次のように簡
単にする。
【数14】 一般に、ミクロ流体システムにおいては、拡散が相対的に速い一方でシステムの
直線速度は遅い場合、例えばDが大きくUが小さい場合にのみ分子拡散の効果が
重要になる。しかしながら、一般的なミクロ流体システムでは、物質が過度に拡
散する前にシステムを通って移動させることが一般に望まれるので、一般に逆は
真である。その際、上記等式の第2項は小さくなり、一般には無視でき、よって
次式が得られる。
【数15】
【0014】 上記式に基づき、特定のアッセイにより定められたそれらのパラメータを単に
挿入すること、及び与えられてないそれらのパラメータを調整又は最適化するこ
とにより、連続入力の高スループット分析を最適化できる。例えば、所与に拡散
係数(D)、化合物間の所望の分解能(n)及び所望のスループット(1/P)
を有する試験化合物に対しチャネル内での所望の保留時間(T)が与えられたな
らば、分析が行われるチャネルの最も大きい最小断面寸法(d)を決めることが
できる。逆に、特定の寸法のチャネル(d)が与えられたならば、特定の拡散係
数(D)と化合物間の所望の分解能(n)とを有する所与の試験化合物に対して
許容された最大分析時間(T)を決めることができる。種々のパラメータも図2
に示されており、例えばここで、nは時間Tでの試験化合物物質の平均拡散長(
diff(avg.))に対する試験プラグの開始長(Lplug)の比として示されている
。図2に示されるように、鎖線は時間Tでの試験化合物物質の平均分散又は拡散
距離を表す。
【0015】 したがって、第1の態様では、本発明は、サンプル物質又は試験化合物物質を
含む流体プラグ(ここでは「試験プラグ」という)をミクロ流体チャネルを通し
て連続的に輸送する方法を提供し、その際、それら試験プラグはスペーサ流体の
プラグ、例えばバッファにより分離される。これを達成するために、試験プラグ
を連続的に輸送するミクロ流体チャネルが設けられ、その最小断面寸法は下記d
より小さいか又はほぼdに等しい。
【数16】 ここで、Dは存在する流体における試験プラグ中のサンプル物質又は試験化合物
物質の拡散係数であり、Tはミクロ流体チャネル中の試験プラグの全保留時間、
例えば、試験プラグがチャネルへ導入されてからチャネルに沿ったある地点で試
験プラグから所与の結果を検出するまでの時間である。特に好ましい態様では、
Pは約60秒より短く、Dは約10-5〜10-8cm2 /sであり、Tは1秒より
長く、nは約0.5〜約20である。
【0016】 関連の態様では、本発明は、連続した高スループット分析を行うためのミクロ
流体装置を提供する。特に、これらの装置は一般に本体構造を含み、その中に少
なくとも第1ミクロ流体チャネルを配置する。少なくとも1つのチャネルは、下
記dより小さな最小断面寸法を有する。
【数17】 ここで、チャネル中に配置される第1及び第2試験化合物プラグは、スペーサ流
体プラグにより分離され、第1試験化合物プラグと任意に含まれるスペーサ流体
プラグは長さがLp であり、nは、試験化合物プラグにおける試験化合物の所望
の分散距離に対する初期プラグ長の比であって約0.5〜約10であり、Dは第
1試験化合物の拡散係数であり、Kは比例因子であり、Tは試験化合物プラグが
チャネルに導入されて検出地点に移動するまでの時間であり、Uは第1の微小ス
ケールチャネルを通る試験化合物プラグの平均直線速度である。特に好ましい態
様では、Lp は約10mmより小さく、好ましくは約6mm以下であり、Uは約
0.05〜約10mm/秒であり、好ましくは約0.2〜2mm/秒であり、D
は約10-5〜約10-8cm2 /sであり、Tは約1秒より長く、Kは約1/21
0より大きく、好ましくは約1/210〜1/24であり、nは約0.5〜約1
0である。
【0017】 上述のように、ミクロチャネルにおける分散の性質は、少なくとも部分的には
問題のミクロチャネルの断面形状に依存する。例えば、円筒形で例えば円形の断
面形状を有するチャネルは、有限の幅又は無限の幅の(すなわち幅により限定さ
れない)楕円、矩形のチャネルとは異なる分散プロファイルを有する。上述した
計算は、各場合において比例因子Kを組み入れることにより、これらの異なるチ
ャネル形状に対してなお適用できる。円筒チャネルの場合には、比例定数は1/
192である。一方、楕円チャネルの場合には、式(1)で使用されるd2 が(
ab)に等しく(ここでaは楕円チャネルの長軸であり、bは楕円チャネルの短
軸である(図5Bに示す))、かつ、r=b/aであるならば、比例定数(K)
は次式で与えられる。
【数18】 よって、楕円チャネルの場合に上記式(7)及び(8)を整理すると、dは
【数19】 に等しい。
【0018】 分散がチャネル幅により制限されず、例えば「無限幅」を有し、dがチャネル
深さである矩形チャネルの場合には、比例因子は1/210である。しかしなが
ら、例えば図5Aに断面で示されるように、分散に影響しない幅、すなわち「有
限幅」を有するチャネルの場合には、比例因子は次の通りである。
【数20】 ここで、f(b/a)は図4に示されるグラフから決められ、このグラフはChat
win, et al., J. Fluid Mech. (1982) 120:347-358から得られたものであり、こ
こにあらゆる目的のために文献として援用する。
【0019】 一様な断面寸法を有するチャネルに関して一般的に記載したが、図6A〜6C
に略示するように、変化する断面寸法を含むチャネルシステム、例えば狭い断面
から広い断面になるチャネルにも適用できる。特に、上述した分散の計算は、上
記使用した直線速度の代わりに一定の容量流速(volumetric flow rate)により再
定式化される。特に、このように変化するチャネルシステム内では、流体の直線
速度は、流体が狭いチャネルから広いチャネルに流れる際に変わるけれども、容
量流速は同じままである。直線速度は容量流速と次のように関係する。
【0020】
【数21】 ここで、Sはチャネルの断面積である。よって、これを上記式(11)に代用す
ると、次式が得られる。
【数22】 よって、K=1/192である円筒チャネルの場合には、分散係数は次のように
計算される。
【0021】
【数23】 媒質がチャネルを通って流れ、その直径が図6Aに示されるようにd1 からd2 に変わる場合には、分散係数の比を解くことができ、最終的には次式となる。
【数24】 驚くべきことに、この等式から分かるのは、一定の容量流速の下で狭いチャネル
(例えばd1 )から広いチャネル(例えばd2 )に移動する際には、分散係数は
広いチャネル部分において初めに期待したように増大するのではなく減少するこ
とである。このことは異なる断面形状のチャネル、例えば図6Bと6Cにそれぞ
れ示されるような幅か深さの寸法のどちらかが変化する矩形チャネルなどにおい
ても成り立つ。例えば、幅(深さではない)がa1 からa2 に変化する矩形チャ
ネルでは、分散は次式で計算される。
【0022】
【数25】
【数26】 が1のオーダーならば、
【数27】 となり、再度分かるように、分散は幅が大きくされたチャネルでは減少する。
【0023】 チャネル深さが増大し、‘a’は一定のままでbがb1 からb2 に変化する場
合にも、次式により示されるように、同じことが成り立つ。
【数28】 分かるように、bがb1 からb2 に増大すると、f(b/a)は減少し、その結
果として相対分散、例えばE1 /E2 が減少する。変化した断面形状を有するチ
ャネルの議論についても、Taylor et al., Proc. Soc. London, (1953) 219A:18
6-203 、Aris, Proc. Roy. Soc. London (1956) A235:67-77、Chatwin et al.,
J. Fluid mech. (1982) 120:347-358 、Doshi et al., Chem. Eng. Sci. (1978)
33:795-804 、及びGuell et al., Chem. Eng. Comm. (1987) 58:231-244を参照
のこと。
【0024】 本発明は、最適化されたチャネル断面寸法を与えるという観点で一般的に記載
されてきたが、チャネル形状の他の要素は代替性があり例えば容易に変えられる
。しかしながら、特定の場合には、他のチャネル寸法は例えばスループットに関
係しない理由により決められる。例えば、光学的検出方法が用いられる場合には
、十分に大きな断面寸法を有するチャネルを使用して検出器による十分な信号取
得を可能にする必要がある。それとは別に、チャネルは、特定の物質が例えば細
胞やビードなどを通過し又は直線速度を落として反応体の適当なインキュベーシ
ョンを可能にすべく十分な大きさの断面を必要とし得る。このような場合には、
必要な断面寸法は上記表式に組み入れることができ、その要求に基づいてスルー
プットを最適化する。
【0025】 一般に、所与の分子の拡散係数は、分子サイズ及び分子が溶解した媒体の性質
の関数である。いずれにしても、一般にこれらの係数は、低粘性溶媒中の溶質の
拡散係数を概算するためのStokes-Einstein 式から次式の通り容易に求めること
ができる。
【数29】 ここで、
【外1】 はボルツマン定数であり、Tはシステムの温度であり、μは溶媒の粘性であり、
0 は溶質の半径である。高い粘性の溶媒では、分散係数はμ-2/3として変化す
る一方、極度に高い粘性の溶媒、例えばポリマー溶液やゲルでは分散は通常は粘
性に依存しない。
【0026】 特に好ましい態様では、本発明の方法及びシステムは、製薬ライブラリのスク
リーニング、例えば潜在的な薬理学的活性を有する化合物の大規模な収集におい
て使用される。一般に、このようなライブラリ化合物は、相対的に小さな分子、
例えば分子量が10,000ドルトンより小さく、好ましくは約1000ドルト
ンより小さいものからなる。そのような場合には、これらの化合物は一般に、約
10-5より小さく典型的には約10-5〜10-8に匹敵する拡散係数を有する。好
ましい態様では、本発明によるミクロ流体方法及びシステムの最適化は、約10 -5 〜約10-7の範囲の拡散係数を有する化合物に対して行われる。 所与の試験プラグに対する総保留時間(T)は、基準の数に依存して変わり得
る。一般に、保留時間は、試験プラグがミクロ流体チャネルの検出部の前を通過
する前に十分検出可能な信号を発生するのに要する時間に依存する。最も蛍光性
のアッセイでは、この保留時間は一般に変化するが、一般には約1秒より長く、
好ましくは約5秒より長く、しばしば30秒より長く、ある場合には60秒より
長い。もちろん、極度に速い反応では、保留時間は、最小化でき、又は全体の処
理の最適化(例えばサンプリングシステムが次の試験プラグを取る上げるのに十
分な時間を可能にしつつスループットを最大すること)のために単に選択され得
る。
【0027】 上述したように、特定の分析チャネルのスループットは、単位時間当たりに分
析チャネルを通して移動させ得る試験プラグ数、又はどれくらい近づけてこれら
のプラグをチャネルに導入できるかに部分的に依存する。したがって、試験プラ
グ及びそれに伴うスペーサプラグの長さは、例えば分析用の適当な試験プラグ物
質の存在を保証するのに必要な試験プラグのサイズだけでなく、所望のスループ
ットレベルにも依存する。よって、このパラメータは一般に、研究者の選択に依
存して変わり得る。しかしながら、高スループットの製薬スクリーニングの好適
な用途では、試験プラグとその隣接したスペーサ流体プラグの結合長(Lp )は
、約0.1〜約30mmであり、好ましくは約1〜約10mmである。試験プラ
グとその隣接するスペーサ領域を導入するための期間長(P)も同様に、導入さ
れるプラグの平均直線速度(U)だけでなく、プラグ長(Lp )に依存する。一
般に、期間長は変わるが、一般には約60秒より短く、好ましくは30秒より短
く、適切には20秒より短く、さらに好ましくは10秒より短く、しばしば5秒
より短く、一方、システム中での流体の直線速度は一般に約0.05mm/se
cから約10mm/secまで変わり、好ましくは約0.2mm/secから約
2mm/secまで変わる。
【0028】 上記基準の多くと共に、許容される拡散/分散の量(nにより測定)は、研究
者が試験プラグ間で望む分解能に依存して研究者が事前に決めるパラメータであ
る。例えば、所与の化合物ライブラリの粗いスクリーニングを行うことを望むな
らば、複数患者サンプル分析のようないくつかのクリティカルなサンプルの高度
に厳しい分析を行うよりもさらに拡散/分散に対し寛容となり得る。項nは、例
えば時間=0での元の試験プラグ長の観点からの拡散/分散長の逆数として定義
される。よって、例えば試験プラグ分子が元のサンプルプラグの長さの1/5の
平均分散/拡散を有すると仮定すると、元の試験プラグの縁の分子は、元のプラ
グ長の1/5の平均長を拡散/分散する。この場合、nは5に等しい。好ましい
態様では、ここに記載のミクロ流体システムにおける許容できる平均分散/拡散
は、0.5より大きく、好ましくは1以上、さらに好ましくは2以上、多くの場
合には4以上であるn値により与えられる。これは、元の試験プラグ長の200
%より小さく、好ましくは100%より小さく、さらに好ましくは50%より小
さく、多くの場合25%以下である平均分散距離に達する。一般に、nの値は、
20より小さく、しばしば10以下であり、多くの場合8以下であり、生じる平
均パーセント分散は、5%以上、しばしば10%以上、多くの場合12.5%以
上である。好ましい態様では、nは一般に上記の上限と下限の間、例えば0.5
〜20、好ましくは1〜10、4〜10又は1〜8の間にある。
【0029】 上記基準の好適な範囲に基づいて本発明により最適化されたミクロ流体チャネ
ルは、約200μmより小さい、好ましくは約100μmより小さい、さらに好
ましくは約50μmより小さい、多くの場合約20μmより小さく場合によって
は約10μmより小さい最小の断面寸法を有するであろう。 本明細書から理解できるように、ミクロ流体装置の最適化方法を提示すること
により、本発明は連続分析を行うためのそのような最適化システムを設計する方
法をも提供する。特に、これらの方法は、試験化合物プラグとスペーサプラグと
を含んだ試験プラグのサイクル長を選択することを含む。試験化合物の拡散係数
が同定される。試験化合物に対する総反応時間は、行われる反応の性質により要
求される所望の反応時間に基づいて選択される。サイクル長、拡散係数及び総反
応時間に基づいて例えば上記表式から、分析を実行するための最大チャネル直径
とチャネル長のうちの1つ又は1以上が決められる。これらの方法が一般に使用
されてミクロ流体システムを設計し、その際、試験化合物プラグ中の試験化合物
は、総反応時間中、元の試験化合物プラグ長の200%より短い平均分散長を有
し、好ましくは元の試験化合物プラグ長の100%より短い、さらに好ましくは
50%より短い、しばしば25%より短い平均分散距離を有する。
【0030】 ここに記載のような最適化された寸法のチャネルを組み込んだミクロ流体チャ
ネル、装置及びシステムは、単純な毛細管からその内部領域内で集積化されたチ
ャネル網を組み込んださらに複雑な平面ミクロ流体装置までのいくつかの構造的
な構成を組み込むことができる。好ましい態様では、ここに記載の方法が実行さ
れるミクロ流体チャネルは、ミクロ流体装置における集積化チャネル網の一部で
ある。このような集積化装置は、分離した部分、例えば毛細管要素、微小製造チ
ャンバーなどの集合を含むことができ、典型的にはこのようなミクロ流体装置は
、一緒に合わさった少なくとも2つの別々の平面基板から成る層状構造を有する
。それにより、チャネル網は、例えば平面基板層の一方又は両方の面内に製造さ
れることにより、合わさった基板の界面にて形成される。このような装置は、例
えば米国特許出願No.08/845,754(1997年4月25日提出)に
詳細に記載されており、全ての目的のため文献としてここに援用する。層状構造
を組み込んだミクロ流体装置の例が、図1に示されており、装置100の主な本
体構造102が少なくとも2つの別々の基板層114及び116から成り、これ
らの層は一緒に合わさって装置100のチャネル部分(例えばチャネル104)
を形成する。ここに記載の装置を製造する際使用する基板は、それらが受けるで
あろう条件、例えば過度の塩濃度、pH、圧力、温度などとの適合性だけでなく
、微小製造の容易さに基づいて一般に選択される。一般に、例えばリソグラフィ
ー製造技術を用いた微小製造に対する従順性や反応/分析条件に対する一般的な
不活性故に、シリカベースの基板が好ましい。別に好ましいのはポリマー基板で
あり、例えば射出成形、エンボス、スタンプ、又は他の製造方法を用いるシリカ
ベース基板に対してコスト及びい製造の容易さの点で優れ、それにより、多数の
安価な使い捨て装置を一度に製造できる。好ましいポリマー物質の例やこれらの
物質からミクロ流体装置を作る方法は、例えば米国特許出願No.08/843
,212(1997年4月14日提出)に記載されており、全ての目的のためそ
のまま文献としてここに援用する。
【0031】 高スループットの連続分析を行う際に使用するための好適なミクロ流体システ
ム300の全体例が、図3Aと図3Bに示される。図示されているように、ミク
ロ流体装置302は、その内部領域に配置された少なくとも第1分析チャネル3
04を有し、これは廃棄物リザバー306内で一端が終端する。このチャネルは
、チャネル316〜322を介してそれぞれ試薬源308〜314に流動自在に
連結される。分析チャネルは、ピペット要素324内に配置されたピペットチャ
ネル304aにも流動自在に連結される。異なる試験プラグとスペーサ流体プラ
グは、ピペット要素324の開放端を例えばマルチ窪みプレート332の窪み3
30内に配置された試験化合物源とスペーサ流体源に接触させることにより、チ
ャネル304a及び304内に吸引される。次に、試験プラグと分析上でのそれ
らの効果が、例えば検出器334により分析チャネル104において検出される
【0032】 図3に示される装置のチャネルを通して流体試薬、試験プラグ及びスペーサプ
ラグを移動させることだけでなく、試験流体プラグをスペーサプラグをマルチ窪
みプレートから分析チャネルに吸い入れることは、いくつかの方法のうちの任意
のものにより行われる。例えば、好ましい態様では、流体の移動は、差圧を与え
てそれにより流体流を所望することにより実現される。これは、真空、例えば負
の圧力又は正の圧力を装置の種々のチャネルの終点でのリザバー/ポートのうち
の1つ又は1以上に適用して流体をチャネルを通して制御自在に駆動することに
より、適宜達成される。交わる異なったチャネルセグメントを通して差圧を制御
して与えることにより、チャネルセグメントの各々を通って移動する物質の比を
制御できる。 別法として、それらのチャネルの長さに沿って電場をかけて流体及びその他の
物質を移動させる動電学的システムを用いて、流体輸送を行うことができる。一
般に、チャネル長の両端に電場をかけることは、種々のチャネル終点のリザバー
/ポートに配置された流体と接触して設けられた電極により達成される。この電
極は、必要な電圧を電極に送る適当な電子コントローラに接続される。制御され
た動電学的流体輸送システムを用いることにより、機械的なポンプ構造やバルブ
構造の必要性がなく、ミクロ流体装置内で流体及びその他の物質の流れと方向を
効果的に制御できる。制御された動電学的輸送は、例えば公開された国際特許出
願No.96/04547、Ramsey et al.に詳細に記載されており、全ての目
的のために文献としてここに援用する。
【0033】 本発明の最適化方法の性能を示すため、いくつかの代表的な分析が設定された
。次の表は、異なる分析に対するいくつかの異なる基準、及び異なる基準に基づ
いて分析を行うため最適化されたチャネル断面寸法の決定を示す。
【0034】
【表1】
【0035】 III. 最適化されたミクロ流体システムの用途 上述のように、一般に、本発明の最適化されたミクロ流体チャネル、装置及び
システムは、高スループット及び超スループットの連続分析を行う際に有効であ
る。特に好ましい高スループット分析は、生化学システムに有効な多数の製薬ラ
イブラリ化合物のスクリーニング、例えば臨床分析のための多数の患者サンプル
のスクリーニングなどを含む。 高スループットの製薬スクリーニング操作を行うためのミクロ流体装置及びシ
ステムの使用が、共有の国際特許出願No.WO98/00231に詳細に記載
してあり、全ての目的のためにそのまま文献としてここに援用する。要は、ミク
ロ流体チャネルが設けられ、それを通って生化学システムの少なくとも第1の成
分が一般には連続流として流れる。ここで使用されているように、一般に、「生
化学システム」とは、生体内で一般に見られる種類の分子間の化学的な相互作用
をいう。このような相互作用は、酵素反応、結合反応、シグナリング反応及びそ
の他の反応を含めて生体システムで起こる異化及び同化反応の全範囲を含む。さ
らに、ここに定義した生化学システムは、特定の生化学的相互作用の模倣である
モデルシステムをも含むであろう。本発明を行う上で特に興味ある生化学システ
ムの例としては、例えばレセプター−リガンドの相互作用、酵素−基質の相互作
用、バイオ有効性のスクリーニングのためモデル障壁システム(例えば細胞又は
膜片)を伴う細胞のシグナリング経路、輸送反応、及び種々の他の一般システム
が挙げられる。細胞又は生体の生存能力又は活性も、例えば毒物学の研究におい
て本発明の方法及び装置を用いてスクリーニングされ得る。
【0036】 生化学システムで有効な化合物をスクリーニングするための方法及び装置を提
供するために、本発明は一般に、アフェクター(affector)化合物が望まれる所与
の生体内生化学システムを模擬する生体外モデルシステムを組み入れる。化合物
がスクリーニングでき且つアフェクター化合物が望まれるシステムの範囲は広い
。例えば、望ましくない効果を有する生化学システムに関連した主要な事象を遮
断し、遅くし又は禁止する際に有効な化合物がスクリーニングできる。例えば、
遺伝病、癌、バクテリア又はウィルス感染などを含めて、病気の始まりや病気の
特定の症状の発生に対して少なくとも部分的に応答するシステムを遮断できる試
験化合物をスクリーニングできる。次に、これらのスクリーニングアッセイ方法
において約束した結果を示す化合物が、さらに適宜試験されて病気や病気の症状
を処理するのに有効な薬理学的薬剤が同定される。別法として、例えば患者に存
する欠陥を治療するのに望ましいと信じられている機能を有する生化学システム
を模擬、強化又は誘導できる化合物がスクリーニングされ得る。 一旦モデルシステムが選択されると、次に試験化合物のバッテリーがこれらの
モデルシステムに適用される。特定の生体外生化学システムに影響するそれらの
試験化合物を同定することにより、生体内システムの潜在的なアフェクターを同
定できる。
【0037】 それらの最も単純な形式では、本発明の方法及び装置において使用される生化
学システムモデルは、生化学システムの2つの成分間の相互作用、例えばレセプ
ター−リガンド相互作用、酵素−基質相互作用などにおける試験化合物の効果を
スクリーニングする。この形式では、一般に、生化学システムモデルは、アフェ
クターが探されるシステムにおける通常的な相互作用を行う2つの成分、例えば
レセプターとそのリガンド、又は酵素とその基質を含む。 試験化合物がこの相互作用に影響するかいなかを決めることは、システムを試
験化合物に接触させてシステムの機能、例えばレセプター−リガンド結合又は基
質転換をアッセイすることを伴う。次に、アッセイされた機能は、制御、例えば
試験化合物の無いとき又は既知のアフェクターの存在するときの同じ反応と比較
される。 二成分生化学システムの観点から記載されているが、本方法及び装置を用いて
、システムの結果又は最終製品が既知であり所定レベル、例えば酵素経路、細胞
シグナリング経路などにおいてアッセイ可能であるさらに複雑なシステムのアフ
ェクターをスクリーニングすることもできる。別法として、ここに記載の方法及
び装置を用いて、生化学システムの単一の成分と相互作用する化合物、例えば特
定の生化学化合物(例えば、レセプター、リガンド、酵素、核酸、構造的高分子
など)を特定的に結合する化合物をスクリーニングすることができる。
【0038】 生化学システムモデルは、細胞システム全体においても実現できる。例えば、
細胞応答に影響する試験化合物をスクリーニングして探しているならば、細胞全
体が利用できる。製薬研究に特に興味ある細胞機能/応答のいくつかの一般的な
例としては、輸送機能(すなわちイオンチャネル活性化)、結合機能(すなわち
リガンド/レセプター結合)、核酸交配、発現機能(すなわち遺伝子発現)及び
蛋白質転位、並びに細胞全体の生存能力が含まれる。これらの細胞機能をスクリ
ーニングするためのミクロ流体細胞ベーススクリーニングアッセイは、米国特許
出願No.09/104,519(1998年6月25日提出)に一般的に記載
されており、すべての目的のためそのまま文献としてここに援用する。変更され
た細胞システムは、ここに包含されたスクリーニングシステムにおいても使用で
きる。例えば、キメラレポーターシステムは、特定の生化学システムでの試験化
合物の効果の指示薬として使用できる。一般に、キメラレポーターシステムは、
レセプターの結合をそのリガンドに知らせる信号経路中に集積化された異種構造
のレポーターシステムを組み入れる。例えば、レセプターは、異種構造の蛋白質
、例えば容易に分析できる活性を有する酵素に融合し得る。リガンド結合による
レセプターの活性化は、異種構造の蛋白質を活性化し、それが検出を可能にする
。よって、代理レポーターシステムは、容易に検出できるイベント又は信号を作
り、それによりレセプター/リガンド結合のアッセイを与える。このようなキメ
ラレポーターシステムの例は、当該技術分野において以前から記載されている。
【0039】 加えて、バイオ有効性(例えば輸送)をスクリーニングする場合には、生体障
壁が含まれる。一般に、用語「生体障壁」とは、生体システム内での細胞層又は
膜層、又はその合成モデルをいう。このような生体障壁の例としては、上皮及び
内皮層(例えば血管内皮)などが含まれる。したがって、細胞ベースのスクリー
ニング操作の場合には、細胞の懸濁流が主ミクロ流体チャネルに沿って輸送され
て、そこに導入された試験化合物プラグと接触させられる。 生体応答は、しばしば、レセプターとそのリガンドとの結合により起こされ及
び/又は制御される。例えば、成長因子(すなわちEGF,FGF,PDGFな
ど)とそれらのレセプターとの相互作用は、例えば細胞増殖及び分化、媒介酵素
の活性化、メッセンジャー転換の刺激、イオンフラックスの変化、酵素の活性化
、細胞形状の変化、及び遺伝子発現レベルの変化を含めて、多様な生体応答を刺
激する。したがって、レセプターとそのリガンドとの相互作用の制御は、その相
互作用により起こされた生体応答の制御を与え得る。
【0040】 したがって、一つの態様では、本発明は、レセプター分子とそのリガンドとの
相互作用に影響する化合物をスクリーニングするのに有効である。ここに使用さ
れているように、一般に用語「レセプター」は特定的に相互に認識して結合する
1対の化合物のうちの一方をいう。この対のうちのもう一方は、「リガンド」と
いう。よって、レセプター/リガンドの対としては、典型的な蛋白質レセプター
(通常は会合した膜)とその天然リガンド(例えば別の蛋白質又は小さな分子)
を挙げることができる。レセプター/リガンド対としてはまた、抗体/抗原結合
対、相補的核酸、核酸会合蛋白質、及びそれらの核酸リガンドも含まれる。特定
的に会合した多くの生化学化合物が、当該技術分野では周知であり、本発明を行
うのに利用できる。 従来、レセプター/リガンド対のアフェクターをスクリーニングする方法は、
試験化合物の存在下においてレセプター/リガンド結合対をインキュベーション
することを伴っていた。次に、レセプター/リガンド対の結合レベルが、負及び
/又は正の制御と比較される。正常な結合の減少が見られる場合には、試験化合
物はレセプター/リガンド結合の反応抑制剤(inhibitor)であると決められる。
その結合の増加が見られる場合には、試験化合物は相互作用の向上剤又は誘発剤
であると決められる。
【0041】 類似でかつたぶん重なった生化学システムの組は、酵素とそれらの基質との相
互作用を含む。一般に、ここで使用される用語「酵素」は、触媒として作用して
他の化合物又は「基質」に化学変化を誘導する蛋白質をいう。 一般に、基質に対する酵素の活性のアフェクターは、スクリーニングされる化
合物の存在下又は不存在下において酵素の活性の変化を検出するのに最適な条件
の下で酵素を基質に接触させることによりスクリーニングされる。所定の反応時
間の後、混合物が分析され、反応生成物の存在又は基質量の減少が調べられる。
次に、触媒作用された基質量が、制御、すなわち試験化合物の不存在下又は公知
のエフェクター(effector)の存在下にて基質と接触される酵素を比較される。上
述のように、基質に対する酵素の活性を低下させる化合物は「反応抑制剤」とい
い、一方、その活性を強める化合物を「誘発剤」という。 一般に、本発明が包含する種々のスクリーニング方法は、複数の試験化合物を
ミクロ流体装置に連続的に導入することを伴う。一旦装置に注入されたなら、連
続した直列又は並列の分析方針(orientation)で生体システムに影響のある試験
化合物をスクリーニングできる。
【0042】 ここに使用されているように、用語「試験化合物」は、特定の生化学システム
に影響を与えることができる化合物でありスクリーニングされるものの集合をい
う。試験化合物は、広い種類の異なる化合物を含み、その際、化学化合物、化学
化合物の混合物(例えば多糖類)、小さい有機又は無機分子、生体高分子(例え
ばペプチッド、蛋白質、核酸)、又は例えばバクテリア、植物、菌類又は動物細
胞や組織のような生体物質からの抽出物、天然に生じる組成物又は合成組成物を
も含む。実施される特定の実施例に依存して、試験化合物が与えられ、例えば注
入されて溶液中に開放され、又はキャリアー又は固体サポート(例えばビード)
に付着させ得る。試験化合物の固定化のために、いくつかの適当な固体サポート
を用いることができる。適当な固体サポートの例としては、アガロース、セルロ
ース、デキストラン(Sephadex、Sepharose として市販)、カルボキシメチルセ
ルロース、ポリスチレン、ポリエチレングリコール(PEG)、濾紙、ニトロセ
ルロース、イオン交換樹脂、プラスチックフィルム、ガラスビード、ポリアミン
メチルビニルエーテル−マレイン酸共重合体、アミノ酸共重合体、エチレン−マ
レイン酸共重合体、ナイロン、絹などが挙げられる。加えて、ここに記載の方法
及び装置では、試験化合物は個別に又はグループでスクリーニングされ得る。有
効な試験化合物のヒット率の期待が、所与のグループに対する一つの正の結果よ
りも期待されていないくらい低い場合に、グループスクリーニングは特に有効で
ある。
【0043】 上述のスクリーニングアッセイを行う際、システムの機能は検出可能なイベン
ト又は信号を作ることにより示される。一般に、このような検出可能な信号は、
使用される特定のモデル生化学システムの機能に関連した発色又は蛍光信号を含
む。酵素システムでは、このような信号は、例えば発色基質又は蛍光基質に対す
る酵素の触媒作用の発揮により一般に作られる。結合システム、例えばレセプタ
ーリガンド相互作用の場合には、一般に信号は、ラベル付きリガンドとレセプタ
ーの会合又はその逆、又は会合が信号に量的又は一時的に与える変化を含む。 好ましい態様では、連続システムは、システムに影響を与える試験化合物が導
入されるときにのみ変わる一定信号を発生する。特に、システム成分がチャネル
に沿って流れる際、チャネルの検出領域又は窓にて相対的に一定の信号レベルを
作る。試験化合物は、周期的にチャネルに導入され、システム成分と混合される
。それらの試験化合物がシステムに影響する場合には、検出窓にて一定の信号レ
ベルからの偏差を生じる。この偏差は、スクリーニングされた特定の試験化合物
と相関され得る。
【0044】 例えば、第1成分が酵素で第2成分が基質である実施例では、基質は発色基質
又は蛍光基質とでき、酵素が基質に作用するときに適宜検出可能な信号を発生す
る。第1成分がレセプターで第2成分がリガンドである場合には、リガンドかレ
セプターのどちらかが検出可能な信号を伝え得る。どちらかのイベントでは、一
般に化合物の混合物及び流速は一定のままであり、それにより、検出窓116を
通過する第1及び第2成分の混合物の流れが、定常状態信号を発生する。一般に
、「定常状態信号」は、規則的で予測可能な信号強度プロファイルを有する信号
を意味する。そのようなものとしての定常状態信号には、一定の信号強度w有す
る信号、又は規則的な周期の強度を有する信号(これに対して正常信号プロファ
イルにおける変化が測定できる)が挙げられる。この後者の信号は、連続流シス
テムの説明において記載したように、例えば別の試験化合物を充填するため流体
流が周期的に中断される場合に発生される。上述の酵素システムで作られる信号
は、チャネルの長さに沿って変わる、すなわち、酵素が蛍光基質を蛍光性生成物
に変換する際には露光時間につれて増大するけれども、所与の一定流速の場合に
はチャネルに沿って任意の特定地点での信号は一定のままである。
【0045】 レセプター/リガンドシステムでも、定常状態信号における同様の変化が観測
され得る。特に、レセプターとその蛍光性リガンドは、チャネルに沿って異なる
流速を有するようにできる。このことは、チャネル内にサイズ排除マトリックス
を組み入れること、又は電気浸透法の場合には2つの成分の相対的な電気泳動移
動度を変えてレセプターがより速くチャネルを流れるようにすることにより達成
できる。再度、このことは、サイズ排除マトリックスの使用、又は電荷が変わっ
た化合物の異なる流速を生じさせるチャネル内での異なる表面電荷の使用により
達成できる。試験化合物がレセプターに結合する場合には、蛍光性信号において
暗いパルスを生じ、次により明るいパルスが続く。特定の動作原理に束縛される
ことなく、定常状態信号は、自由な蛍光性リガンド及びレセプターに結合した蛍
光性リガンドの両方の結果であると信じられている。結合したリガンドは、レセ
プターと同じ流速で進む一方、結合してないリガンドはもっと遅く進む。試験化
合物がレセプター−リガンド相互作用を抑制する場合には、レセプターは蛍光性
リガンドに「沿って運ばれ」ず、流れの方向にて蛍光性リガンドを稀釈し、自由
な蛍光性リガンドの超過を後ろに残す。このことは、定常状態信号を一時的に小
さくし、次に蛍光を一時的に大きくする。別法として、酵素システムで用いるも
のと類似の構成が使用でき、その際、レセプターとそのリガンドとの相互作用を
表す信号が存在する。例えば、レセプター−リガンド結合のpH効果を示すpH
指示薬は、例えばカプセル入りの細胞の形態で生化学システムと共に装置に組み
入れることができ、それにより、結合から生じるわずかなpH変化も検出できる
。Weaver, et al.、Bio/Technology(1988)6:1084-1089 を参照のこと。さらに、
レセプターリガンド結合から生じる酵素の活性化、例えばキナーゼの活性化をモ
ニターでき、又は活性化の際のそのような酵素における配座変化を、例えば発蛍
光団(fluorophore)の組み入れにより検出できる。この発蛍光団は、活性化の際
の酵素における配座変化により活性化又は抑制される。 以下の非制限的な実施例により本発明をさらに説明する。
【0046】 実施例 矩形反応チャネル(「チャネル」)を有する外部サンプリングピペット要素(
「毛細管」)を含むミクロ流体装置の最適なアッセイパラメータを決めるのに、
上述の計算を用いた。その際、反応チャネル内に酵素と基質を混合すべく圧力駆
動流を利用する一方、試験化合物を毛細管要素を通して周期的に導入した。外部
サンプリング毛細管要素を組み入れたミクロ流体装置の概略図を図3A及び3B
に示す。表2(左欄)は、予め決められたチャネル形状及び/又はアッセイ要件
に基づいたシステムの入力値を示す。表2(右欄)は、一旦所定の又は予め定め
られた値が確かめられたときの残りの変数に対する最適化された値を示す。
【0047】
【表2】
【0048】 上記表2から分かるように、いくつかのアッセイ及びチャネルパラメータが、
実行される装置において実行されるアッセイに基づいて予め決められた。例えば
、ミクロ流体装置構造の実際性(例えばチャネル及び毛細管の寸法)のみならず
、バッファー/アナライト(analyte)特性及びインキュベーション時間である。
これは、反応混合物が反応チャネル中に残る時間を決定し、それは流速とチャネ
ル長の関数である。同様に、チャネル深さは、チャネル内で信号を検出するのに
使用されるシステムの検出限界により、例えば検出領域で適当な信号レベルが存
在できるように決めることができる。 これらの所定又は予め決められたパラメータに基づいて、例えばスループット
及び/又は分散/拡散について最適化されたその他のパラメータを決めることが
できる。例えば、与えられた実施例では、目標は、スループットを最適化するこ
とであった。これは、外部毛細管要素内のみならず装置のチャネル内の両方での
流速値、及びサンプル流体プラグとスペーサプラグ(例えばサンプル流体プラグ
間に設けられる)の長さの値の計算を生じ、それにより、過度のサンプルプラグ
の混合無しに最適なスループットを可能にする、例えばスペーサプラグ長を最小
にする。例として、表式(6)を整理して次式を得ることによりスループットが
最適化される。
【数30】
【0049】 特記ないかぎり、ここに与えられた全ての濃度値は所与の成分の濃度をいい、
その成分は、その成分の任意の変換、分離又は反応とは独立な混合物又は溶液に
加えられて、一旦混合物又は溶液に加えられるとその成分を変えるか又は1以上
の異なる種にその成分を変形する。さらに、特定の方法が特許請求の範囲に特定
のステップ順で記載されているが、これらのステップ順が特許請求の範囲の文言
で明示的に与えられていない限り、種々のステップを任意の順で実行できること
が分かる。 まるで各個別の刊行物又は特許出願が特定的又は個別的に示されて文献として
援用されているように、全ての刊行物と特許出願が、同程度に文献としてここに
援用される。本発明は明確さと理解の容易さのために図及び実施例としていくら
か詳細に説明してきたが、特許請求の範囲の範囲内で特定の変化及び変更を行う
ことができるのは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図1】 複数のサンプル物質/試験化合物プラグを連続分析するためのミクロ流体シス
テムの実施例を断面にて略示する。
【図2】 ミクロ流体装置のミクロ流体チャネル内での特定分析中のサンプル物質/試験
化合物物質の拡散/分散を略示する。
【図3】 本発明により使用されるサンプル/試験化合物のライブラリに複数の分析を行
うためのミクロ流体装置及びシステムを略示する。
【図4】 矩形断面のチャネルを通る層流のf(b/a)の変化を表すグラフである。
【図5】 図5Aは矩形チャネルの断面を略示し、図5Bは適切に参照符号の付けられた
長軸と短軸を有する楕円チャネルの断面を示す。
【図6】 図6A〜6Cは、3つの断面寸法が変わっているチャネルを略示する。
【符合の説明】
100 ミクロ流体装置 102 本体構造 104 主分析チャネル 104a ピペットチャネル 106 ピペット要素 108 サンプル物質/試験化合物プラグ 110 スペーサ流体プラグ 114 基板層 116 基板層 118 検出器 300 ミクロ流体システム 302 ミクロ流体装置 304 第1分析チャネル 304a ピペットチャネル 308、310、312、314 試薬源 316、318、320、322 チャネル 324 ピペット要素 330 窪み 332 マルチ窪みプレート 334 検出器
【手続補正書】
【提出日】平成13年7月23日(2001.7.23)
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【数1】 第1試験化合物プラグを導入し、ここで、Pは前記試験化合物プラグをチャネ
ル中に導入する期間であり、Dは前記試験化合物プラグ中の試験化合物の拡散係
数であり、Kは比例因子であり、Tは前記試験化合物プラグがチャネルに導入さ
れてから検出地点に移動するまでの時間であり、nは時間Tにおける前記試験化
合物プラグ中の試験化合物の平均分散距離に対する初期プラグ長の比であり、T
はPより大きく、そして 前記第1試験化合物プラグの後に第2試験化合物プラグをチャネルに導入する
、 ことを含む上記方法。
【数2】 にほぼ等しく、ここで、r=b/aであり、ここで、bは楕円断面領域の短軸で
あり、aは楕円断面領域の長軸であり、
【数3】 である、請求項1記載の方法。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) G01N 33/566 G01N 33/566 (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZW ),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU, TJ,TM),AE,AL,AM,AT,AU,AZ, BA,BB,BG,BR,BY,CA,CH,CN,C R,CU,CZ,DE,DK,DM,EE,ES,FI ,GB,GD,GE,GH,GM,HR,HU,ID, IL,IN,IS,JP,KE,KG,KP,KR,K Z,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV,MA ,MD,MG,MK,MN,MW,MX,NO,NZ, PL,PT,RO,RU,SD,SE,SG,SI,S K,SL,TJ,TM,TR,TT,TZ,UA,UG ,US,UZ,VN,YU,ZA,ZW Fターム(参考) 2G042 AA01 BD18 BD20 CA10 CB03 DA10 FB05 HA03 HA07 2G058 AA09 DA01 DA07 4B063 QA01 QQ21 QQ41 QR01 QR31 QR56 QR67 QR83 QS32 QS39 QX02

Claims (41)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 ミクロ流体チャネルにおいて複数の試験化合物プラグを連続
    的に輸送する方法であって、 下記最大寸法dより小さい最小断面寸法を有する第1ミクロ流体チャネルを設
    定し、 【数1】 第1試験化合物プラグを導入し、ここで、Pは前記試験化合物プラグをチャネ
    ル中に導入する期間であり、Dは前記試験化合物プラグ中の試験化合物の拡散係
    数であり、Kは比例因子であり、Tは前記試験化合物プラグがチャネルに導入さ
    れてから検出地点に移動するまでの時間であり、nは時間Tにおける前記試験化
    合物プラグ中の試験化合物の平均分散距離に対する初期プラグ長の比であり、T
    はPより大きく、そして 前記第1試験化合物プラグの後に第2試験化合物プラグをチャネルに導入する
    、 ことを含む上記方法。
  2. 【請求項2】 Pが60秒より短く、Dが約10-5〜約10-8cm2 /sで
    あり、Tが1秒より長く、nが約0.5〜約20である、請求項1記載の方法。
  3. 【請求項3】 Pが20秒より短く、Dが約10-5〜約10-7cm2 /sで
    あり、Tが約5秒より長く、nが約1〜約8である、請求項1記載の方法。
  4. 【請求項4】 Kが約1/210〜約1/24である、請求項1記載の方法
  5. 【請求項5】 前記ミクロ流体チャネルが矩形断面領域を含み、Kが約1/
    210以上である、請求項1記載の方法。
  6. 【請求項6】 前記ミクロ流体チャネルが円形断面領域を含み、Kが約1/
    192に等しい、請求項1記載の方法。
  7. 【請求項7】 前記ミクロ流体チャネルが楕円断面領域を含み、Kが 【数2】 にほぼ等しく、ここで、r=b/aであり、ここで、bは楕円断面領域の短軸で
    あり、aは楕円断面領域の長軸であり、 【数3】 である、請求項1記載の方法。
  8. 【請求項8】 前記設定ステップで設定されるチャネルが、200μmより
    狭い幅を有する、請求項1記載の方法。
  9. 【請求項9】 前記設定ステップで設定されるチャネルが、100μmより
    狭い幅の最小断面寸法を有する、請求項1記載の方法。
  10. 【請求項10】 前記設定ステップで設定されるチャネルが、50μmより
    狭い幅の最小断面寸法を有する、請求項1記載の方法。
  11. 【請求項11】 前記設定ステップで設定されるチャネルが、20μmより
    狭い幅の最小断面寸法を有する、請求項1記載の方法。
  12. 【請求項12】 前記設定ステップで設定されるチャネルが、10μmより
    狭い幅の最小断面寸法を有する、請求項1記載の方法。
  13. 【請求項13】 生化学システムの少なくとも第1成分の流れを試験化合物
    プラグと同時に第1ミクロ流体チャネルの少なくとも一部を通して流し、そして 第1ミクロ流体チャネル内にて生化学システムの第1成分に対する試験化合物
    の効果を検出する、 ステップをさらに含む請求項1記載の方法。
  14. 【請求項14】 前記生化学システムの少なくとも第1成分の流れが、細胞
    の懸濁流からなり、前記検出ステップが、前記細胞の機能における試験化合物の
    効果を検出することを含む、請求項13記載の方法。
  15. 【請求項15】 前記生化学システムの少なくとも第1成分が、酵素と酵素
    に対する基質を含み、前記検出ステップが、前記酵素と基質との相互作用に対す
    る試験化合物の効果を検出することを含む、請求項13記載の方法。
  16. 【請求項16】 前記生化学システムの少なくとも第1成分が、特定の結合
    対の第1及び第2メンバーを含む、請求項13記載の方法。
  17. 【請求項17】 前記特定の結合対がレセプターとその相補リガンドからな
    る、請求項16記載の方法。
  18. 【請求項18】 前記特定の結合対が第1及び第2核酸配列からなり、該第
    1核酸配列は、前記第2核酸配列の少なくとも一部に相補的であり、前記第1核
    酸配列と前記第2核酸配列の交配を十分可能にする、請求項16記載の方法。
  19. 【請求項19】 前記第1試験化合物プラグを導入するステップは、隣接の
    スペーサ流体プラグを続けて導入し、その際、第1ミクロ流体チャネルの開放端
    を第1試験化合物源に接触して配置して所要量の第1試験化合物を吸引して第1
    試験化合物プラグを形成し、次に、ミクロ流体チャネルの開放端をスペーサ流体
    源に接触して配置して所要量のスペーサ流体をミクロ流体チャネルに吸引して試
    験化合物プラグに隣接してスペーサ流体プラグを形成することを含み、また 前記第2試験化合物プラグを導入するステップが、ミクロ流体チャネルの開放
    端を第2試験化合物源に接触して配置して所要量の第2試験化合物をミクロ流体
    チャネルに吸引して第2試験化合物プラグを形成することを含む、請求項1記載
    の方法。
  20. 【請求項20】 前記ミクロ流体チャネルを真空引きすることにより、前記
    第1試験化合物、スペーサ流体及び第2試験化合物を前記ミクロ流体チャネルに
    吸引する、請求項19記載の方法。
  21. 【請求項21】 前記第1試験化合物、スペーサ流体及び第2試験化合物を
    動電学的に前記ミクロ流体チャネルに吸引する、請求項19記載の方法。
  22. 【請求項22】 前記設定ステップで設定されるミクロ流体チャネルが、平
    面本体構造中に配置され、該本体構造は、それに取り付けられた外部ピペット要
    素を有し、該外部ピペット要素は、それを通って配置されたチャネルを有し、該
    チャネルは、第1端にて開放し、第2端にて前記第1ミクロ流体チャネルに流動
    自在に連結される、請求項19記載の方法。
  23. 【請求項23】 少なくとも第1ミクロ流体チャネルを中に配置した本体構
    造、及び スペーサ流体プラグにより分離され前記チャネル中に配置された第1及び第2
    試験化合物プラグ を含むミクロ流体装置であって、前記チャネルは、下記dより小さい最小断面寸
    法を有し、 【数4】 ここで前記第1試験化合物プラグとスペーサ流体プラグの長さがLp であり、n
    は試験化合物プラグ中の試験化合物の所望の分散距離に対する初期プラグ長の比
    であり、約0.5〜約10であり、Dは第1試験化合物の拡散係数であり、Kは
    比例因子であり、Tは試験化合物プラグがチャネルへ導入されてから検出地点に
    移動するまで時間であり、Uは第1微小スケールチャネルを通る試験化合物プラ
    グの平均直線速度である、前記ミクロ流体装置。
  24. 【請求項24】 Lp は10mmより短く、Uは約0.05〜10mm/s
    ecであり、Dは約10-5〜約10-8cm2 /sであり、Tは1秒より長く、K
    は約1/210以上であり、nは約0.5〜約10である、請求項23記載のミ
    クロ流体装置。
  25. 【請求項25】 Lp は約6mm以下であり、Uは約0.2〜2mm/se
    cであり、Dは約10-5〜約10-7cm2 /sであり、Tは約5秒より長く、n
    は約1〜約8である、請求項23記載のミクロ流体装置。
  26. 【請求項26】 前記ミクロ流体チャネルが、矩形断面領域を含み、Kが約
    1/210以上である、請求項23記載のミクロ流体装置。
  27. 【請求項27】 前記ミクロ流体チャネルが、円形断面領域を含み、Kが約
    1/192に等しい、請求項23記載のミクロ流体装置。
  28. 【請求項28】 前記ミクロ流体チャネルが、楕円断面領域を含み、Kが 【数5】 にほぼ等しく、ここでr=b/aであり、ここでbは楕円断面領域の短軸であり
    、aは楕円断面領域の長軸であり、 【数6】 である、請求項23記載のミクロ流体装置。
  29. 【請求項29】 前記第1ミクロ流体チャネルの最小断面寸法が200μm
    より小さい、請求項23記載のミクロ流体装置。
  30. 【請求項30】 前記第1ミクロ流体チャネルの最小断面寸法が100μm
    より小さい、請求項23記載のミクロ流体装置。
  31. 【請求項31】 前記第1ミクロ流体チャネルの最小断面寸法が50μmよ
    り小さい、請求項23記載のミクロ流体装置。
  32. 【請求項32】 前記第1ミクロ流体チャネルの最小断面寸法が20μmよ
    り小さい、請求項23記載のミクロ流体装置。
  33. 【請求項33】 前記第1ミクロ流体チャネルの最小断面寸法が10μmよ
    り小さい、請求項23記載のミクロ流体装置。
  34. 【請求項34】 前記ミクロ流体チャネルが円筒形であり、前記最小断面寸
    法が前記ミクロ流体チャネルの直径である、請求項23記載のミクロ流体装置。
  35. 【請求項35】 前記ミクロ流体チャネルが方形又は矩形であり、前記最小
    断面寸法が該チャネルの深さである、請求項23記載のミクロ流体装置。
  36. 【請求項36】 前記第1ミクロ流体チャネルと交差して流動自在に連通す
    る少なくとも第2ミクロ流体チャネルをさらに含む、請求項23記載のミクロ流
    体装置。
  37. 【請求項37】 前記第2ミクロ流体チャネルが、前記第1ミクロ流体チャ
    ネルと実質的に同じ断面寸法を有する、請求項36記載のミクロ流体装置。
  38. 【請求項38】 前記本体構造が平面構造である、請求項1記載のミクロ流
    体装置。
  39. 【請求項39】 前記平面本体構造が、少なくとも第1及び第2平面基板層
    を含み、それらが共に合わさってその間に第1ミクロ流体チャネルを形成する、
    請求項38記載のミクロ流体装置。
  40. 【請求項40】 前記平面基板層が、シリカベース基板及びポリマー基板か
    ら選択される、請求項39記載のミクロ流体装置。
  41. 【請求項41】 連続分析を行うためのミクロ流体チャネル網を設計する方
    法であって、 試験化合物プラグとスペーサプラグとを含む試験プラグのサイクル長を選択し
    、 試験化合物の拡散係数を同定し、 試験化合物の総反応時間を選択し、そして 分析を行うための最大チャネル直径とチャネル長の1つ又は1つ以上をサイク
    ル長、拡散係数及び総反応時間に基づいて決め、それにより、試験化合物プラグ
    中の試験化合物が、総反応時間中にスペーサ流体プラグの50%より狭く分散す
    る、 ことを含む上記方法。
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