JP2002186485A - エオタキシン、ＲＡＮＴＥＳ又はβ−ディフェンシン−２の核酸の測定方法及びそのための試薬、並びに抗炎症剤のスクリーニング方法 - Google Patents
エオタキシン、ＲＡＮＴＥＳ又はβ−ディフェンシン−２の核酸の測定方法及びそのための試薬、並びに抗炎症剤のスクリーニング方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 エオタキシン、RANTES又はβ−ディフェンシ
ン−２をコードする遺伝子の新規な測定方法及びそれを
利用した抗炎症活性物質の評価又は選択方法の提供。 【解決手段】 １対のPCR プライマーと、鋳型上の該プ
ライマーに挟まれた位置にハイブリダイズする、レポー
ターとクエンチャーを結合したプローブを用いて、PCR
法により鋳型としての遺伝子を測定する方法において、
特定のプライマーと特定のプローブとを用いて、エオタ
キシン、RANTES又はβ−ディフェンシン−２をコードす
る遺伝子特にmRNAを測定する方法、並びにそのためのキ
ットを提供する。これらは、抗炎症作用を有する物質の
評価又は選択のために有用である。
ン−２をコードする遺伝子の新規な測定方法及びそれを
利用した抗炎症活性物質の評価又は選択方法の提供。 【解決手段】 １対のPCR プライマーと、鋳型上の該プ
ライマーに挟まれた位置にハイブリダイズする、レポー
ターとクエンチャーを結合したプローブを用いて、PCR
法により鋳型としての遺伝子を測定する方法において、
特定のプライマーと特定のプローブとを用いて、エオタ
キシン、RANTES又はβ−ディフェンシン−２をコードす
る遺伝子特にmRNAを測定する方法、並びにそのためのキ
ットを提供する。これらは、抗炎症作用を有する物質の
評価又は選択のために有用である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、エオタキシン、RA
NTES又はβ−ディフェンシン−２のmRNA又はcDNAの測定
方法及びそのためのキットに関する。本発明は、例えば
抗炎症剤のスクリーニング方法又はアトピー性皮膚炎の
治療剤のスクリーニング方法として有用である。
NTES又はβ−ディフェンシン−２のmRNA又はcDNAの測定
方法及びそのためのキットに関する。本発明は、例えば
抗炎症剤のスクリーニング方法又はアトピー性皮膚炎の
治療剤のスクリーニング方法として有用である。
【０００２】
【従来の技術】皮膚の刺激性炎症又はアレルギー性炎症
の際には、炎症部位に好中球や好酸球などの炎症細胞が
遊走し、活性化され、炎症の発生に関与することが知ら
れており、この場合に炎症細胞の遊走及び活性化に関与
するケモカイン(chemokine)としてインターロイキン−
８（IL-8)、エオタキシン（eotaxin)、RANTES（Regulat
ed upon Activation, Normal T Expressed and Secrete
d)、β−ディフェンシン−２などが知られている。
の際には、炎症部位に好中球や好酸球などの炎症細胞が
遊走し、活性化され、炎症の発生に関与することが知ら
れており、この場合に炎症細胞の遊走及び活性化に関与
するケモカイン(chemokine)としてインターロイキン−
８（IL-8)、エオタキシン（eotaxin)、RANTES（Regulat
ed upon Activation, Normal T Expressed and Secrete
d)、β−ディフェンシン−２などが知られている。
【０００３】従って、炎症細胞によるこれらのケモカイ
ンの産生を抑制する物質を選択することにより抗炎症剤
の選択が可能となる。この場合、ケモカインの産生を測
定する方法としては、生成したIL-8、エオタキシン、な
どを測定する方法が考えられるが、より直接的、高感度
にこれらのケモタキシンの発現を測定するには、それら
をコードするmRNAを測定するのが好ましい。しかしなが
ら、遺伝子発現の定量的な測定は従来から困難であり、
コンパラティブPCR 法、コンペティティブPCR 法、ノー
ザンブロッティング法等によって半定量されていた。
ンの産生を抑制する物質を選択することにより抗炎症剤
の選択が可能となる。この場合、ケモカインの産生を測
定する方法としては、生成したIL-8、エオタキシン、な
どを測定する方法が考えられるが、より直接的、高感度
にこれらのケモタキシンの発現を測定するには、それら
をコードするmRNAを測定するのが好ましい。しかしなが
ら、遺伝子発現の定量的な測定は従来から困難であり、
コンパラティブPCR 法、コンペティティブPCR 法、ノー
ザンブロッティング法等によって半定量されていた。
【０００４】ポリメラーゼが連鎖反応法（PCR 法）は核
酸の増幅方法として広く使用されている。このPCR 法の
１用途として、リポーター色素１とクエンチャー色素２
を結合させたプローブを用いて核酸を測定する方法があ
る。この方法においては、PCR 法において使用するフォ
ワードプライマーがハイブリダイズする鋳型上の部位と
リバースプライマーがハイブリダイズする鋳型上の部位
とに挟まれた鋳型上の部位にハイブリダイズし、且つリ
ポーター色素１とクエンチャー色素２が結合しているプ
ローブを用い、５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を有
するDNA ポリメラーゼを用いてPCR 反応を行う。
酸の増幅方法として広く使用されている。このPCR 法の
１用途として、リポーター色素１とクエンチャー色素２
を結合させたプローブを用いて核酸を測定する方法があ
る。この方法においては、PCR 法において使用するフォ
ワードプライマーがハイブリダイズする鋳型上の部位と
リバースプライマーがハイブリダイズする鋳型上の部位
とに挟まれた鋳型上の部位にハイブリダイズし、且つリ
ポーター色素１とクエンチャー色素２が結合しているプ
ローブを用い、５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を有
するDNA ポリメラーゼを用いてPCR 反応を行う。
【０００５】例えば、図１の（Ａ）〜（Ｄ）において、
フォワードプライマーがDNA ポリメラーゼの使用により
伸長してプローブに対すると、プローブを構成するオリ
ゴヌクレオチドは、DNA ポリメラーゼが有する５′→
３′エキソヌクレアーゼ活性の作用により分解され、そ
の後を追ってフォワードプライマーの伸長生成物が生成
する。
フォワードプライマーがDNA ポリメラーゼの使用により
伸長してプローブに対すると、プローブを構成するオリ
ゴヌクレオチドは、DNA ポリメラーゼが有する５′→
３′エキソヌクレアーゼ活性の作用により分解され、そ
の後を追ってフォワードプライマーの伸長生成物が生成
する。
【０００６】この場合、レポーター１とクエンチャー２
がプローブに結合している間は近い位置にある両者の相
互作用により蛍光を発しないが、プライマーの伸長と共
にプローブを構成するオリゴヌクレオチドが分解されれ
ばレポーター１とクエンチャー２が切り離され、レポー
ター１はクエンチャー２の作用を受けないので紫外線の
照射により蛍光を発する。従って、特定のDNA に特異的
にハイブリダイズするプライマー及びプローブを選択す
ることにより、蛍光強度によって特定の核酸を選択的に
測定することができる。この方法はすでにTaq ManPCR
（商標）等として広く使用されている。
がプローブに結合している間は近い位置にある両者の相
互作用により蛍光を発しないが、プライマーの伸長と共
にプローブを構成するオリゴヌクレオチドが分解されれ
ばレポーター１とクエンチャー２が切り離され、レポー
ター１はクエンチャー２の作用を受けないので紫外線の
照射により蛍光を発する。従って、特定のDNA に特異的
にハイブリダイズするプライマー及びプローブを選択す
ることにより、蛍光強度によって特定の核酸を選択的に
測定することができる。この方法はすでにTaq ManPCR
（商標）等として広く使用されている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】上記の方法において
は、被験核酸、すなわち鋳型核酸上の上記のごとき位置
関係にある１対のプローブ、及びプローブを選択する必
要があるが、それのみならず同一のハイブリダイゼーシ
ョン条件下でプライマーよりも早くプローブが鋳型核酸
にハイブリダイズしなければならない。なぜなら、プラ
イマーの伸長生成物（１本鎖核酸）がプローブがハイブ
リダイズすべき位置を超えて伸長してしまえば、もはや
プローブがハイブリダイズすることができず、従ってDN
A ポリメラーゼの５′→３′エキソヌクレアーゼ活性に
より分解されることもできないからである。
は、被験核酸、すなわち鋳型核酸上の上記のごとき位置
関係にある１対のプローブ、及びプローブを選択する必
要があるが、それのみならず同一のハイブリダイゼーシ
ョン条件下でプライマーよりも早くプローブが鋳型核酸
にハイブリダイズしなければならない。なぜなら、プラ
イマーの伸長生成物（１本鎖核酸）がプローブがハイブ
リダイズすべき位置を超えて伸長してしまえば、もはや
プローブがハイブリダイズすることができず、従ってDN
A ポリメラーゼの５′→３′エキソヌクレアーゼ活性に
より分解されることもできないからである。
【０００８】特定のヌクレオチド配列が既知である２つ
の核酸がハイブリダイズする場合のハイブリダイズの生
じやすさは、融点（Tm）の計算によりある程度推定する
ことができる。しかしながらこの推定によって選択した
プライマーとプローブとの組合せが、必ずしも上記DNA
測定法において好結果をもたらすわけではなく、測定す
べき特定の核酸につき試行錯誤によりプローブとプライ
マーの組合わせを選択する必要がある。
の核酸がハイブリダイズする場合のハイブリダイズの生
じやすさは、融点（Tm）の計算によりある程度推定する
ことができる。しかしながらこの推定によって選択した
プライマーとプローブとの組合せが、必ずしも上記DNA
測定法において好結果をもたらすわけではなく、測定す
べき特定の核酸につき試行錯誤によりプローブとプライ
マーの組合わせを選択する必要がある。
【０００９】本発明は、例えば、抗炎症活性を有する薬
剤等の評価又は選択のための、簡便で、効率的で、多数
の被験物質を短時間で評価することができる手段を提供
しようとするものであり、そのために、エオタキシン、
RANTES又はβ−ディフェンシン−２をコードする遺伝子
の発現量、すなわちmRNA量を測定するための手段とし
て、前記のPCR 法を使用する。そして、本発明は、上記
PCR 法の実施のために特に適するプライマー対及びプロ
ーブを提供するものである。そこで本発明は、エネルギ
ーの短絡的消費を促進することが知られているエオタキ
シン、RANTES又はβ−ディフェンシン−２につき、これ
らをコードする核酸の測定のために有効なプライマーと
プローブとの特定の組合わせを提供しようとするもので
ある。
剤等の評価又は選択のための、簡便で、効率的で、多数
の被験物質を短時間で評価することができる手段を提供
しようとするものであり、そのために、エオタキシン、
RANTES又はβ−ディフェンシン−２をコードする遺伝子
の発現量、すなわちmRNA量を測定するための手段とし
て、前記のPCR 法を使用する。そして、本発明は、上記
PCR 法の実施のために特に適するプライマー対及びプロ
ーブを提供するものである。そこで本発明は、エネルギ
ーの短絡的消費を促進することが知られているエオタキ
シン、RANTES又はβ−ディフェンシン−２につき、これ
らをコードする核酸の測定のために有効なプライマーと
プローブとの特定の組合わせを提供しようとするもので
ある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
め、本発明は、フォワードプライマー及びリバースプラ
イマー、並びにレポーターとクエンチャーを有し前記両
プライマーに挟まれた領域内で鋳型核酸とハイブリダイ
ズするプローブを用い、５′→３′エキソヌクレアーゼ
活性を有するDNA ポリメラーゼによりポリメラーゼ連鎖
反応（PCR)を行うことによってmRNA又はcDNAを測定する
方法において、下記のプライマー対及びプローブを使用
する。
め、本発明は、フォワードプライマー及びリバースプラ
イマー、並びにレポーターとクエンチャーを有し前記両
プライマーに挟まれた領域内で鋳型核酸とハイブリダイ
ズするプローブを用い、５′→３′エキソヌクレアーゼ
活性を有するDNA ポリメラーゼによりポリメラーゼ連鎖
反応（PCR)を行うことによってmRNA又はcDNAを測定する
方法において、下記のプライマー対及びプローブを使用
する。
【００１１】（１）エオタキシンをコードするmRNA又は
cDNAを測定するために、前記一方のプライマーとしてエ
オタキシンをコードする核酸のヌクレオチド170 〜189
の領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを用
い、他方のプライマーとして前記核酸のヌクレオチド30
1 〜320 の領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチ
ドを用い、そして前記プローブとして前記核酸中のヌク
レオチド191 〜223 の領域にハイブリダイズするオリゴ
ヌクレオチドを用いる。
cDNAを測定するために、前記一方のプライマーとしてエ
オタキシンをコードする核酸のヌクレオチド170 〜189
の領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを用
い、他方のプライマーとして前記核酸のヌクレオチド30
1 〜320 の領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチ
ドを用い、そして前記プローブとして前記核酸中のヌク
レオチド191 〜223 の領域にハイブリダイズするオリゴ
ヌクレオチドを用いる。
【００１２】エオタキシンをコードする遺伝子上のプラ
イマー結合領域とプローブ結合領域の位置関係を図２に
示す。この配列は、Kitaura, M.ら、J.Biol.Chem.Vol.2
71 No.13, p.7725-7730 (1996)に記載されているヒトの
エオタキシンをコードするcDNAの塩基配列である。この
配列を配列番号：１に示し、図２の配列の１位が配列番
号：１の配列の１位に相当する。図２において上流の下
線部分がフォワードプライマーがハイブリダイズする領
域であり、下流の下線部分がリバースプライマーがハイ
ブリダイズする領域でありそしてそれらに挟まれた中間
の下線部分がプローブがハイブリダイズする領域であ
る。
イマー結合領域とプローブ結合領域の位置関係を図２に
示す。この配列は、Kitaura, M.ら、J.Biol.Chem.Vol.2
71 No.13, p.7725-7730 (1996)に記載されているヒトの
エオタキシンをコードするcDNAの塩基配列である。この
配列を配列番号：１に示し、図２の配列の１位が配列番
号：１の配列の１位に相当する。図２において上流の下
線部分がフォワードプライマーがハイブリダイズする領
域であり、下流の下線部分がリバースプライマーがハイ
ブリダイズする領域でありそしてそれらに挟まれた中間
の下線部分がプローブがハイブリダイズする領域であ
る。
【００１３】エオタキシン遺伝子測定用の好ましいプラ
イマー対及びプローブのヌクレオチド配列は次の通りで
ある（図２において、それぞれ右方向の矢印を付した下
線及び左方向の矢印を付した下線、並びにその間の矢印
のない下線により示す）。 フォワードプライマー 5′-GCCAGCTTCTGTCCCAACCA-
3′（配列番号：４） リバースプライマー 5′-GGCACAGATATCCTTGGCCA-3′
（配列番号：５） プローブ 5′-CTGCTGCTTTAACCTGGCCAATAGGAAGATACC-
3′（配列番号：６）。
イマー対及びプローブのヌクレオチド配列は次の通りで
ある（図２において、それぞれ右方向の矢印を付した下
線及び左方向の矢印を付した下線、並びにその間の矢印
のない下線により示す）。 フォワードプライマー 5′-GCCAGCTTCTGTCCCAACCA-
3′（配列番号：４） リバースプライマー 5′-GGCACAGATATCCTTGGCCA-3′
（配列番号：５） プローブ 5′-CTGCTGCTTTAACCTGGCCAATAGGAAGATACC-
3′（配列番号：６）。
【００１４】（２）RANTESをコードするmRNA又はcDNAを
測定するために、前記一方のプライマーとしてRANTESを
コードする核酸のヌクレオチド50〜71の領域にハイブリ
ダイズするオリゴヌクレオチドを用い、他方のプライマ
ーとして前記核酸のヌクレオチド274 〜300 の領域にハ
イブリダイズするオリゴヌクレオチドを用い、そして前
記プローブとして前記核酸中のヌクレオチド73〜94の領
域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを用いる。
測定するために、前記一方のプライマーとしてRANTESを
コードする核酸のヌクレオチド50〜71の領域にハイブリ
ダイズするオリゴヌクレオチドを用い、他方のプライマ
ーとして前記核酸のヌクレオチド274 〜300 の領域にハ
イブリダイズするオリゴヌクレオチドを用い、そして前
記プローブとして前記核酸中のヌクレオチド73〜94の領
域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを用いる。
【００１５】RANTESをコードする遺伝子上のプライマー
結合領域とプローブ結合領域の位置関係を図３に示す。
この配列は、Schall, T.J.ら、J.Immunol.Vol.141, p.1
018-1025 (1988)に記載されているヒトのRANTESをコー
ドするcDNAの塩基配列である。この配列を配列番号：２
に示し、図３の配列の１位が配列番号：２の配列の１位
に相当する。図３において上流の下線部分がフォワード
プライマーがハイブリダイズする領域であり、下流の下
線部分がリバースプライマーがハイブリダイズする領域
でありそしてそれらに挟まれた中間の下線部分がプロー
ブがハイブリダイズする領域である。
結合領域とプローブ結合領域の位置関係を図３に示す。
この配列は、Schall, T.J.ら、J.Immunol.Vol.141, p.1
018-1025 (1988)に記載されているヒトのRANTESをコー
ドするcDNAの塩基配列である。この配列を配列番号：２
に示し、図３の配列の１位が配列番号：２の配列の１位
に相当する。図３において上流の下線部分がフォワード
プライマーがハイブリダイズする領域であり、下流の下
線部分がリバースプライマーがハイブリダイズする領域
でありそしてそれらに挟まれた中間の下線部分がプロー
ブがハイブリダイズする領域である。
【００１６】RANTES遺伝子測定用の好ましいプライマー
対及びプローブのヌクレオチド配列は次の通りである
（図３において、それぞれ右方向の矢印を付した下線及
び左方向の矢印を付した下線、並びにその間の矢印のな
い下線により示す）。 フォワードプライマー 5′-CGCTCTCATCCTCATTGCTACT-
3′（配列番号：７） リバースプライマー 5′-AGCTCATCTCCAAAGAGTTGATGTA
CT-3′（配列番号：８） プローブ 5′-CCCTCTGCGCTCCTGCATCTGC-3′（配列番
号：９）。
対及びプローブのヌクレオチド配列は次の通りである
（図３において、それぞれ右方向の矢印を付した下線及
び左方向の矢印を付した下線、並びにその間の矢印のな
い下線により示す）。 フォワードプライマー 5′-CGCTCTCATCCTCATTGCTACT-
3′（配列番号：７） リバースプライマー 5′-AGCTCATCTCCAAAGAGTTGATGTA
CT-3′（配列番号：８） プローブ 5′-CCCTCTGCGCTCCTGCATCTGC-3′（配列番
号：９）。
【００１７】（３）β−ディフェンシン−２をコードす
るmRNA又はcDNAを測定するために、前記一方のプライマ
ーとしてβ−ディフェンシン−２をコードする核酸中の
ヌクレオチド84〜104 の領域にハイブリダイズするオリ
ゴヌクレオチドを用い、他方のプライマーとして前記核
酸中のヌクレオチド276 〜295 の領域にハイブリダイズ
するオリゴヌクレオチドを用い、そして前記プローブと
して前記核酸中のヌクレオチド108 〜139 の領域にハイ
ブリダイズするオリゴヌクレオチドを用いる。
るmRNA又はcDNAを測定するために、前記一方のプライマ
ーとしてβ−ディフェンシン−２をコードする核酸中の
ヌクレオチド84〜104 の領域にハイブリダイズするオリ
ゴヌクレオチドを用い、他方のプライマーとして前記核
酸中のヌクレオチド276 〜295 の領域にハイブリダイズ
するオリゴヌクレオチドを用い、そして前記プローブと
して前記核酸中のヌクレオチド108 〜139 の領域にハイ
ブリダイズするオリゴヌクレオチドを用いる。
【００１８】β−ディフェンシン−２をコードする遺伝
子上のプライマー結合領域とプローブ結合領域との位置
関係を図４に示す。この配列を配列番号：３に示し、図
４の配列の１位が配列番号：３の配列の１位に相当す
る。図４において上流の下線部分がフォワードプライマ
ーがハイブリダイズする領域であり、下流の下線部分が
リバースプライマーがハイブリダイズする領域であり、
そしてそれらに挟まれた中間の下線部分がプローブがハ
イブリダイズする領域である。
子上のプライマー結合領域とプローブ結合領域との位置
関係を図４に示す。この配列を配列番号：３に示し、図
４の配列の１位が配列番号：３の配列の１位に相当す
る。図４において上流の下線部分がフォワードプライマ
ーがハイブリダイズする領域であり、下流の下線部分が
リバースプライマーがハイブリダイズする領域であり、
そしてそれらに挟まれた中間の下線部分がプローブがハ
イブリダイズする領域である。
【００１９】β−ディフェンシン−２遺伝子測定用の好
ましいプライマー対及びプローブのヌクレオチド配列は
次の通りである（図４において、それぞれ右方向の矢印
を付した下線及び左方向の矢印を付した下線、並びにそ
の間の矢印のない下線により示す）。β−ディフェンシ
ン−２遺伝子測定用の好ましいプライマー及びプローブ
のヌクレオチド配列は次の通りである。 フォワードプライマー 5′-GCCTCTTCCAGGTGTTTTTGG-
3′（配列番号：10） リバースプライマー 5′CGCACGTCTCTGATGAGGGA3′
（配列番号：11） プローブ 5′-TATAGGCGATCCTGTTACCTGCCTTAAGAGTGG-
3′（配列番号：12）。
ましいプライマー対及びプローブのヌクレオチド配列は
次の通りである（図４において、それぞれ右方向の矢印
を付した下線及び左方向の矢印を付した下線、並びにそ
の間の矢印のない下線により示す）。β−ディフェンシ
ン−２遺伝子測定用の好ましいプライマー及びプローブ
のヌクレオチド配列は次の通りである。 フォワードプライマー 5′-GCCTCTTCCAGGTGTTTTTGG-
3′（配列番号：10） リバースプライマー 5′CGCACGTCTCTGATGAGGGA3′
（配列番号：11） プローブ 5′-TATAGGCGATCCTGTTACCTGCCTTAAGAGTGG-
3′（配列番号：12）。
【００２０】本発明においてはさらに、ヌクレオチド配
列が知られている核酸を特異的に測定することができる
ことが確認されているプライマー及びプローブを用いて
該核酸を測定し、これを対照として用いることができ
る。この様な対照としてグリセロアルデヒド−３−ホス
フェート・デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を用い
ることができる。この場合、グリセロアルデヒド−３−
ホスフェート・デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子中
の、一方のプライマーとしてヌクレオチド66〜84の領域
にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを使用し、他
方のプライマーとしてヌクレオチド272 〜291 の領域に
ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを使用し、そし
てプローブとしてヌクレオチド242 〜262 の領域のオリ
ゴヌクレオチドを用いて、グリセロアルデヒド−３−ホ
スフェート・デヒドロゲナーゼ遺伝子を測定する。
列が知られている核酸を特異的に測定することができる
ことが確認されているプライマー及びプローブを用いて
該核酸を測定し、これを対照として用いることができ
る。この様な対照としてグリセロアルデヒド−３−ホス
フェート・デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を用い
ることができる。この場合、グリセロアルデヒド−３−
ホスフェート・デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子中
の、一方のプライマーとしてヌクレオチド66〜84の領域
にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを使用し、他
方のプライマーとしてヌクレオチド272 〜291 の領域に
ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを使用し、そし
てプローブとしてヌクレオチド242 〜262 の領域のオリ
ゴヌクレオチドを用いて、グリセロアルデヒド−３−ホ
スフェート・デヒドロゲナーゼ遺伝子を測定する。
【００２１】グリセロアルデヒド−３−ホスフェート・
デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子上のプライマーと
プローブとの位置関係を図５に示す。この図において、
３本の下線を付した領域の意味は図２について記載した
通りである。グリセロアルデヒド−３−ホスフェート・
デヒドロゲナーゼ遺伝子測定用の好ましいプライマー及
びプローブのヌクレオチド配列は次の通りである。
デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子上のプライマーと
プローブとの位置関係を図５に示す。この図において、
３本の下線を付した領域の意味は図２について記載した
通りである。グリセロアルデヒド−３−ホスフェート・
デヒドロゲナーゼ遺伝子測定用の好ましいプライマー及
びプローブのヌクレオチド配列は次の通りである。
【００２２】フォワードプライマー 5′GAAGGTGAAGGT
CGGAGTC（配列番号：13） リバースプライマー 5′GAAGATGGTGATGGGATTTC（配列
番号：14） プローブ 5′AGGCTGAGAACGGGAAGCTTG（配列番号：1
5） 上記の種々のプライマー及びプローブ用のオリゴヌクレ
オチドのヌクレオチド数は15〜40個、そして好ましくは
20〜30個である。プライマー及びプローブのサイズが長
ければ、１本鎖DNA にハイブリダイズしにくくなり、短
かすぎればハイブリダイゼーションの特異性が低下する
からである。
CGGAGTC（配列番号：13） リバースプライマー 5′GAAGATGGTGATGGGATTTC（配列
番号：14） プローブ 5′AGGCTGAGAACGGGAAGCTTG（配列番号：1
5） 上記の種々のプライマー及びプローブ用のオリゴヌクレ
オチドのヌクレオチド数は15〜40個、そして好ましくは
20〜30個である。プライマー及びプローブのサイズが長
ければ、１本鎖DNA にハイブリダイズしにくくなり、短
かすぎればハイブリダイゼーションの特異性が低下する
からである。
【００２３】プライマー及びプローブの上記の特定のヌ
クレオチド配列は特に好ましい配列であるが、例えば20
ヌクレオチドからなるプライマー又はプローブは、鋳型
鎖との間に少数のミスマッチが存在してもハイブリダイ
ズし、PCR のプライマーとして、又は検出用プローブと
して機能し得ることが知られている。従って本発明プラ
イマー及びプローブは、上記の特定のヌクレオチド配列
を有するものに限定されず、例えば上記の具体的なヌク
レオチド配列に対して４個以下のヌクレオチドの置換、
欠失及び／又は付加により修飾されており、且つ所定の
領域にハイブリダイズすることができるプライマー及び
プローブも本発明に含まれる。
クレオチド配列は特に好ましい配列であるが、例えば20
ヌクレオチドからなるプライマー又はプローブは、鋳型
鎖との間に少数のミスマッチが存在してもハイブリダイ
ズし、PCR のプライマーとして、又は検出用プローブと
して機能し得ることが知られている。従って本発明プラ
イマー及びプローブは、上記の特定のヌクレオチド配列
を有するものに限定されず、例えば上記の具体的なヌク
レオチド配列に対して４個以下のヌクレオチドの置換、
欠失及び／又は付加により修飾されており、且つ所定の
領域にハイブリダイズすることができるプライマー及び
プローブも本発明に含まれる。
【００２４】本発明に用いるプローブはその一端、例え
ば５′−末端にレポーター色素を結合しており、そして
他端、例えば３′−末端にクエンチャー色素を結合して
いる。レポーター色素が例えば紫外線の照射によって蛍
光を発する物質であるのに対して、クエンチャーは、該
レポーター色素に距離的に接近して存在する場合レポー
ター色素に作用して蛍光の発生を消去する作用を有する
ものである。レポーター色素としては、例えば６−カル
ボキシ−フルオレッセイン（FAM)、テトラクロロ−６−
カルボキシフルオレッセイン（TET)、２，７−ジメトキ
シ−４，５−ジクロロ−６−カルボキシフルオレッセイ
ン（JOE)、ヘキソクロロ−６−カルボキシフルオレッセ
イン（HEX)等が挙げられ、他方クエンチャー色素として
は６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン（TAMRA)
等が使用される。
ば５′−末端にレポーター色素を結合しており、そして
他端、例えば３′−末端にクエンチャー色素を結合して
いる。レポーター色素が例えば紫外線の照射によって蛍
光を発する物質であるのに対して、クエンチャーは、該
レポーター色素に距離的に接近して存在する場合レポー
ター色素に作用して蛍光の発生を消去する作用を有する
ものである。レポーター色素としては、例えば６−カル
ボキシ−フルオレッセイン（FAM)、テトラクロロ−６−
カルボキシフルオレッセイン（TET)、２，７−ジメトキ
シ−４，５−ジクロロ−６−カルボキシフルオレッセイ
ン（JOE)、ヘキソクロロ−６−カルボキシフルオレッセ
イン（HEX)等が挙げられ、他方クエンチャー色素として
は６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン（TAMRA)
等が使用される。
【００２５】プローブオリゴヌクレオチドへのレポータ
ー色素及びクエンチャー色素の結合は、例えばプローブ
の５′側は、通常数個のメチレン鎖をリンカーとし、末
端のリン酸基にFAM 分子をリン酸エステルの形で結合
し、また、３′側については下に示す構造単位を介し、
アミド結合によりTAMRA 分子を結合する。
ー色素及びクエンチャー色素の結合は、例えばプローブ
の５′側は、通常数個のメチレン鎖をリンカーとし、末
端のリン酸基にFAM 分子をリン酸エステルの形で結合
し、また、３′側については下に示す構造単位を介し、
アミド結合によりTAMRA 分子を結合する。
【００２６】
【化１】
【００２７】本発明の方法は、本発明が対象とする、例
えば抗炎症作用を有する薬剤を評価又は選択するため
に、エオタキシン、RANTES又はβ−ディフェンシン−２
の発現量の測定方法として、mRNAを測定する場合に特に
有用である。この場合は、エオタキシン、RANTES又はβ
−ディフェンシンの発現を測定しようとする生物体の組
織又は細胞を被験物質の存在下で培養し、培養細胞から
常法に従ってmRNAを抽出し、次にそれに対して相補性の
cDNAを常法に従って合成した後、本発明のプライマーと
プローブを用いて、PCR を行えばよい。本発明はさら
に、上記の方法の実施のために使用されるキットをも提
供する。このキットは上に定義したプライマー及びプロ
ーブを含んで成る。本発明のキットはさらに、対照とし
て使用する核酸及びその核酸を測定するためのプライマ
ー及びプローブを含んでいてもよい。
えば抗炎症作用を有する薬剤を評価又は選択するため
に、エオタキシン、RANTES又はβ−ディフェンシン−２
の発現量の測定方法として、mRNAを測定する場合に特に
有用である。この場合は、エオタキシン、RANTES又はβ
−ディフェンシンの発現を測定しようとする生物体の組
織又は細胞を被験物質の存在下で培養し、培養細胞から
常法に従ってmRNAを抽出し、次にそれに対して相補性の
cDNAを常法に従って合成した後、本発明のプライマーと
プローブを用いて、PCR を行えばよい。本発明はさら
に、上記の方法の実施のために使用されるキットをも提
供する。このキットは上に定義したプライマー及びプロ
ーブを含んで成る。本発明のキットはさらに、対照とし
て使用する核酸及びその核酸を測定するためのプライマ
ー及びプローブを含んでいてもよい。
【００２８】本発明の方法は、本発明が対象とする、例
えば抗炎症作用を有する薬剤を評価又は選択するため
に、エオタキシン、RANTES又はβ−ディフェンシン−２
の発現量の測定方法として、mRNAを測定する場合に特に
有用である。この場合は、特定のサイトカインの発現を
測定しようとする生物体の組織を採取し、常法に従って
mRNAを抽出し、次にそれに対して相補性のcDNAを常法に
従って合成した後、本発明のプライマーとプローブを用
いて、PCR を行えばよい。本発明はさらに、上記の方法
の実施のために使用されるキットをも提供する。このキ
ットは上に定義したプライマー及びプローブを含んで成
る。本発明のキットはさらに、対照として使用する核酸
及びその核酸を測定するためのプライマー及びプローブ
を含んでいてもよい。
えば抗炎症作用を有する薬剤を評価又は選択するため
に、エオタキシン、RANTES又はβ−ディフェンシン−２
の発現量の測定方法として、mRNAを測定する場合に特に
有用である。この場合は、特定のサイトカインの発現を
測定しようとする生物体の組織を採取し、常法に従って
mRNAを抽出し、次にそれに対して相補性のcDNAを常法に
従って合成した後、本発明のプライマーとプローブを用
いて、PCR を行えばよい。本発明はさらに、上記の方法
の実施のために使用されるキットをも提供する。このキ
ットは上に定義したプライマー及びプローブを含んで成
る。本発明のキットはさらに、対照として使用する核酸
及びその核酸を測定するためのプライマー及びプローブ
を含んでいてもよい。
【００２９】本発明の方法の実施のために使用する細胞
としては、エオタキシン、RANTES又はβ−ディフェンシ
ン−２を発現し得る任意の動物細胞を使用することがで
き、例えば線維芽細胞又は、この細胞の培養細胞株等を
使用することができ、これらの細胞や組織の由来として
は、マウス、ラット、ヒト等の任意の動物からの細胞や
組織を使用することができるが、ヒトの細胞を用いるの
が好ましい。
としては、エオタキシン、RANTES又はβ−ディフェンシ
ン−２を発現し得る任意の動物細胞を使用することがで
き、例えば線維芽細胞又は、この細胞の培養細胞株等を
使用することができ、これらの細胞や組織の由来として
は、マウス、ラット、ヒト等の任意の動物からの細胞や
組織を使用することができるが、ヒトの細胞を用いるの
が好ましい。
【００３０】ヒト皮膚線維芽細胞は、市販されており、
例えばクラボウ（倉敷紡績株式会社）から入手可能であ
る。ヒト線維芽細胞の培養は、動物細胞を培養するため
の常法に従って行えばよいが、10％ウシ胎児血清を含む
DMEM培地（ダルベッコ変法イーグル培地）が特に好まし
い。
例えばクラボウ（倉敷紡績株式会社）から入手可能であ
る。ヒト線維芽細胞の培養は、動物細胞を培養するため
の常法に従って行えばよいが、10％ウシ胎児血清を含む
DMEM培地（ダルベッコ変法イーグル培地）が特に好まし
い。
【００３１】本発明のスクリーニング方法の実験におい
ては、細胞を上記の培地中で、被検物質の存在下、及び
対照としての非存在下で培養する。培養は37℃におい
て、５時間〜24時間行えばよい。培養後、RNA の単離及
びcDNAの合成を行い、PCR を実施する。RNA の単離及び
cDNAの合成については、実施例の項において記載する。
PCR は常法に従って行えばよい。
ては、細胞を上記の培地中で、被検物質の存在下、及び
対照としての非存在下で培養する。培養は37℃におい
て、５時間〜24時間行えばよい。培養後、RNA の単離及
びcDNAの合成を行い、PCR を実施する。RNA の単離及び
cDNAの合成については、実施例の項において記載する。
PCR は常法に従って行えばよい。
【００３２】本発明の測定対象となる遺伝子がコードし
ているケモカインあるいはβ−ディフェンシン−２は、
次のごとく皮膚の炎症反応あるいは皮膚の抗菌性と関連
している。 エオタキシン：好酸球、好塩基球にメインに作用するケ
モカインのうち、特に好酸球に特異的に作用する。好酸
球の遊走・脱顆粒を引き起こす。アトピー性皮膚炎・寄
生虫感染など慢性のアレルギーにおいて重要な役割を果
たす。皮膚線維芽細胞が産生することが知られている。
ているケモカインあるいはβ−ディフェンシン−２は、
次のごとく皮膚の炎症反応あるいは皮膚の抗菌性と関連
している。 エオタキシン：好酸球、好塩基球にメインに作用するケ
モカインのうち、特に好酸球に特異的に作用する。好酸
球の遊走・脱顆粒を引き起こす。アトピー性皮膚炎・寄
生虫感染など慢性のアレルギーにおいて重要な役割を果
たす。皮膚線維芽細胞が産生することが知られている。
【００３３】RANTES：エオタキシンと同様に好酸球に対
する作用で注目されているケモカイン。エオタキシンよ
りも作用するレセプター種が多く、CD45陽性メモリ−Ｔ
細胞に対しても遊走因子として働くことからＴ細胞の活
性化にも重要と考えられている。皮膚線維芽細胞や角化
細胞が産生することが知られている。 βディフェンシン−２：皮膚角化細胞などの上皮系の細
胞が産生する抗菌ペプチド。多くの種類の菌に対し、広
く抗菌作用を有する。乾癬患者の皮膚から最初に見出さ
れた。アトピー性皮膚炎患者の黄ブ菌との関連などにつ
いて注目されている。
する作用で注目されているケモカイン。エオタキシンよ
りも作用するレセプター種が多く、CD45陽性メモリ−Ｔ
細胞に対しても遊走因子として働くことからＴ細胞の活
性化にも重要と考えられている。皮膚線維芽細胞や角化
細胞が産生することが知られている。 βディフェンシン−２：皮膚角化細胞などの上皮系の細
胞が産生する抗菌ペプチド。多くの種類の菌に対し、広
く抗菌作用を有する。乾癬患者の皮膚から最初に見出さ
れた。アトピー性皮膚炎患者の黄ブ菌との関連などにつ
いて注目されている。
【００３４】
【実施例】次に、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。一般的方法 RNA の単離 細胞を2.2ml のチューブに入れ、2000Xg、５分間、４℃
で遠心を行い培養液を除去する。残った細胞にISOGEN
（ニッポンジーン）を１ml加え、撹拌し室温で５分間放
置する。
説明する。一般的方法 RNA の単離 細胞を2.2ml のチューブに入れ、2000Xg、５分間、４℃
で遠心を行い培養液を除去する。残った細胞にISOGEN
（ニッポンジーン）を１ml加え、撹拌し室温で５分間放
置する。
【００３５】0.2ml のクロロホルムを加え、15秒間撹拌
を行う。２−３分間、室温で放置後12000Xg 、15分間、
４℃で遠心後水層を別のチューブに移す。それに0.5ml
のイソプロパノールを加え、５−10分間室温で放置後12
000Xg 、10分間、４℃で遠心を行い、沈殿物を得る。得
られた沈殿物に75％エタノールを加え、12000Xg 、５分
間、４℃で遠心を行い、沈殿物を得る。沈殿物を風乾
後、蒸留水に溶かす（この溶液をRNA 溶液とする。）。
を行う。２−３分間、室温で放置後12000Xg 、15分間、
４℃で遠心後水層を別のチューブに移す。それに0.5ml
のイソプロパノールを加え、５−10分間室温で放置後12
000Xg 、10分間、４℃で遠心を行い、沈殿物を得る。得
られた沈殿物に75％エタノールを加え、12000Xg 、５分
間、４℃で遠心を行い、沈殿物を得る。沈殿物を風乾
後、蒸留水に溶かす（この溶液をRNA 溶液とする。）。
【００３６】cDNAの合成 １μｇのRNA を含むRNA 溶液10.5μｌに5XFirst Strand
Buffer (Gibco BRL)４μｌ、0.1 Ｍ DTT (Gibco BRL)
２μｌ、0.5mg ／ml oligo (dT) 12-18 Primer (Gibco
BRL)１μｌ、2.5mM dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP)
（宝酒造）１μｌ、124 Ｕ／μｌ RNase Inhibitor（宝
酒造）0.5 μｌ、200 Ｕ／μｌ M-MLV Reverse Transcr
iptase (Gibco BRL)１μｌの混合液を室温で10分間放置
後、37℃で50分間インキュベートする。
Buffer (Gibco BRL)４μｌ、0.1 Ｍ DTT (Gibco BRL)
２μｌ、0.5mg ／ml oligo (dT) 12-18 Primer (Gibco
BRL)１μｌ、2.5mM dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP)
（宝酒造）１μｌ、124 Ｕ／μｌ RNase Inhibitor（宝
酒造）0.5 μｌ、200 Ｕ／μｌ M-MLV Reverse Transcr
iptase (Gibco BRL)１μｌの混合液を室温で10分間放置
後、37℃で50分間インキュベートする。
【００３７】cDNAの測定 cDNA ５μｌ、10XPCR緩衝液(Perkin Elmer)５μｌ、25
mM MgCl 2 (Perkin Elmer)７μｌ、20μＭフォワードプ
ライマー0.75μｌ、20μＭリバースプライマー0.75μ
ｌ、３μＭプローブ５μｌ、2.5mM dATP (Perkin Elme
r) １μｌ、2.5mMdGTP (Perkin Elmer) １μｌ、2.5mM
dCTP (Perkin Elmer) １μｌ、５mM dUTP(Perkin Elme
r)１μｌ、蒸留水21.75 μｌ、AmpEraseR UNG (Perkin
Elmer) 0.5μｌ、AmpliTaqR DNA Polymerase (Perkin E
lmer) 0.25μｌの混合液をABI PRISM7700 (Perkin Elme
r)にセットし、PCR 反応を行う。温度条件は、50℃で２
分間、95℃で10分間で保温した後に、（95℃で15秒間、
60℃で１分間）のサイクルを40回行い、各サイクルごと
に蛍光強度を測定する。
mM MgCl 2 (Perkin Elmer)７μｌ、20μＭフォワードプ
ライマー0.75μｌ、20μＭリバースプライマー0.75μ
ｌ、３μＭプローブ５μｌ、2.5mM dATP (Perkin Elme
r) １μｌ、2.5mMdGTP (Perkin Elmer) １μｌ、2.5mM
dCTP (Perkin Elmer) １μｌ、５mM dUTP(Perkin Elme
r)１μｌ、蒸留水21.75 μｌ、AmpEraseR UNG (Perkin
Elmer) 0.5μｌ、AmpliTaqR DNA Polymerase (Perkin E
lmer) 0.25μｌの混合液をABI PRISM7700 (Perkin Elme
r)にセットし、PCR 反応を行う。温度条件は、50℃で２
分間、95℃で10分間で保温した後に、（95℃で15秒間、
60℃で１分間）のサイクルを40回行い、各サイクルごと
に蛍光強度を測定する。
【００３８】実施例１． エオタキシンをコードする遺
伝子の測定における標準曲線 エオタキシンをコードする遺伝子（鋳型）の初期分子量
（濃度）と、蛍光強度がベースラインから離脱して増加
し始めるまでのPCR のサイクル数(Threshold Cycle)CT
との関係を試験した。鋳型遺伝子、フォワードプライマ
ー、リバースプライマー及びプローブは次の通りであっ
た。
伝子の測定における標準曲線 エオタキシンをコードする遺伝子（鋳型）の初期分子量
（濃度）と、蛍光強度がベースラインから離脱して増加
し始めるまでのPCR のサイクル数(Threshold Cycle)CT
との関係を試験した。鋳型遺伝子、フォワードプライマ
ー、リバースプライマー及びプローブは次の通りであっ
た。
【００３９】鋳型：エオタキシン（Kitaura et al. J.B
iol.Chem. Vol.271, No.13, p.7725-7730 (1996)) フォワードプライマー：配列番号：４ リバースプライマー：配列番号：５ プローブ：配列番号：６ レポーター色素：FAM クエンチャー色素：TAMRA 結果を図６に示す。これらの結果、遺伝子の測定におい
ても核酸の分子数（濃度）と CT の間に直線関係があ
り、本発明の方法によって核酸の正確な測定が可能であ
ることが明らかになった。
iol.Chem. Vol.271, No.13, p.7725-7730 (1996)) フォワードプライマー：配列番号：４ リバースプライマー：配列番号：５ プローブ：配列番号：６ レポーター色素：FAM クエンチャー色素：TAMRA 結果を図６に示す。これらの結果、遺伝子の測定におい
ても核酸の分子数（濃度）と CT の間に直線関係があ
り、本発明の方法によって核酸の正確な測定が可能であ
ることが明らかになった。
【００４０】実施例２． RANTESをコードする遺伝子の
測定における標準曲線 RANTESをコードする遺伝子（鋳型）の初期分子量（濃
度）と、蛍光強度がベースラインから離脱して増加し始
めるまでのPCR のサイクル数(Threshold Cycle)C T との
関係を試験した。鋳型遺伝子、フォワードプライマー、
リバースプライマー及びプローブは次の通りであった。
測定における標準曲線 RANTESをコードする遺伝子（鋳型）の初期分子量（濃
度）と、蛍光強度がベースラインから離脱して増加し始
めるまでのPCR のサイクル数(Threshold Cycle)C T との
関係を試験した。鋳型遺伝子、フォワードプライマー、
リバースプライマー及びプローブは次の通りであった。
【００４１】鋳型：RANTES（Schall, T.J.et al., J.im
munol.Vol.141, p.1018-1025(1988)) フォワードプライマー：配列番号：７ リバースプライマー：配列番号：８ プローブ：配列番号：９ レポーター色素：FAM クエンチャー色素：TAMRA 結果を図７に示す。これらの結果、遺伝子の測定におい
ても核酸の分子数（濃度）と CT の間に直線関係があ
り、本発明の方法によって核酸の正確な測定が可能であ
ることが明らかになった。
munol.Vol.141, p.1018-1025(1988)) フォワードプライマー：配列番号：７ リバースプライマー：配列番号：８ プローブ：配列番号：９ レポーター色素：FAM クエンチャー色素：TAMRA 結果を図７に示す。これらの結果、遺伝子の測定におい
ても核酸の分子数（濃度）と CT の間に直線関係があ
り、本発明の方法によって核酸の正確な測定が可能であ
ることが明らかになった。
【００４２】実施例３． β−ディフェンシン−２をコ
ードする遺伝子の測定における標準曲線 β−ディフェンシン−２をコードする遺伝子（鋳型）の
初期分子量（濃度）と、蛍光強度がベースラインから離
脱して増加し始めるまでのPCR のサイクル数(Threshold
Cycle)CT との関係を試験した。鋳型遺伝子、フォワー
ドプライマー、リバースプライマー及びプローブは次の
通りであった。
ードする遺伝子の測定における標準曲線 β−ディフェンシン−２をコードする遺伝子（鋳型）の
初期分子量（濃度）と、蛍光強度がベースラインから離
脱して増加し始めるまでのPCR のサイクル数(Threshold
Cycle)CT との関係を試験した。鋳型遺伝子、フォワー
ドプライマー、リバースプライマー及びプローブは次の
通りであった。
【００４３】鋳型：β−ディフェンシン−２ フォワードプライマー：配列番号：１０ リバースプライマー：配列番号：１１ プローブ：配列番号：１２ レポーター色素：FAM クエンチャー色素：TAMRA 結果を図８に示す。これらの結果、遺伝子の測定におい
ても核酸の分子数（濃度）と CT の間に直線関係があ
り、本発明の方法によって核酸の正確な測定が可能であ
ることが明らかになった。
ても核酸の分子数（濃度）と CT の間に直線関係があ
り、本発明の方法によって核酸の正確な測定が可能であ
ることが明らかになった。
【００４４】実施例４． エオタキシンの発現に対する
IFN-γ及びIL-4の影響 ヒト線維芽細胞を直径６cmの培養皿でコンフルエントに
なるまで、10％ウシ胎児血清を含むDMEM培地で培養し、
実験に供した。種々の濃度のTNF-α、IFN-γ、IL-4を添
加し、24時間、37℃で培養した。次に細胞からRNA を単
離し、cDNAを合成したのち、本発明の方法に従い、エオ
タキシン遺伝子の発現量を測定した。その結果、図９に
示す通り、エオタキシンの発現に対して、IL-4は亢進作
用を示し、IFN-γは抑制作用を示した。
IFN-γ及びIL-4の影響 ヒト線維芽細胞を直径６cmの培養皿でコンフルエントに
なるまで、10％ウシ胎児血清を含むDMEM培地で培養し、
実験に供した。種々の濃度のTNF-α、IFN-γ、IL-4を添
加し、24時間、37℃で培養した。次に細胞からRNA を単
離し、cDNAを合成したのち、本発明の方法に従い、エオ
タキシン遺伝子の発現量を測定した。その結果、図９に
示す通り、エオタキシンの発現に対して、IL-4は亢進作
用を示し、IFN-γは抑制作用を示した。
【００４５】実施例５． RANTESの発現に対するIFN-γ
及びIL-4の影響 ヒト線維芽細胞を直径６cmの培養皿でコンフルエントに
なるまで、10％ウシ胎児血清を含むDMEM培地で培養し、
実験に供した。種々の濃度のTNF-α、IFN-γ、IL-4を添
加し、24時間、37℃で培養した。次に細胞からRNA を単
離し、cDNAを合成したのち、本発明の方法に従い、RANT
ES遺伝子の発現量を測定した。その結果、図１０に示す
通り、RANTESの発現に対して、IL-4は抑制作用を示し、
IFN-γは亢進作用を示した。
及びIL-4の影響 ヒト線維芽細胞を直径６cmの培養皿でコンフルエントに
なるまで、10％ウシ胎児血清を含むDMEM培地で培養し、
実験に供した。種々の濃度のTNF-α、IFN-γ、IL-4を添
加し、24時間、37℃で培養した。次に細胞からRNA を単
離し、cDNAを合成したのち、本発明の方法に従い、RANT
ES遺伝子の発現量を測定した。その結果、図１０に示す
通り、RANTESの発現に対して、IL-4は抑制作用を示し、
IFN-γは亢進作用を示した。
【００４６】実施例６． β−ディフェンシンの発現に
対するIFN 及びILの影響 ヒト線維芽細胞を直径６cmの培養皿でコンフルエントに
なるまで、10％ウシ胎児血清を含むDMEM培地で培養し、
実験に供した。種々の濃度のTNF-α、IFN-γ、IL-1αを
添加し、24時間、37℃で培養した。次に細胞からRNA を
単離し、cDNAを合成したのち、本発明の方法に従い、RA
NTES遺伝子の発現量を測定した。その結果、図１１に示
す通り、β−ディフェンシン２の発現はTNF-α及びIL-1
αにより誘導された。
対するIFN 及びILの影響 ヒト線維芽細胞を直径６cmの培養皿でコンフルエントに
なるまで、10％ウシ胎児血清を含むDMEM培地で培養し、
実験に供した。種々の濃度のTNF-α、IFN-γ、IL-1αを
添加し、24時間、37℃で培養した。次に細胞からRNA を
単離し、cDNAを合成したのち、本発明の方法に従い、RA
NTES遺伝子の発現量を測定した。その結果、図１１に示
す通り、β−ディフェンシン２の発現はTNF-α及びIL-1
αにより誘導された。
【００４７】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Shiseido <120> Method for masuring nucleic acid encoding eotaxin, RANTES or beta- defensin-2 and kit therefor <130> <160>
【００４８】 <210> 1 <211> 807 <212> DNA <213> Homo sapiens <223> Nucleotide sequence of DNA encoding human eotaxin <400> 1 gcattttttc aagttttatg atttatttaa cttgtggaac aaaaataaac cagaaaccac 60 cacctctcac gccaaagctc acaccttcag cctccaacat gaaggtctcc gcagcacttc 120 tgtggctgct gctcatagca gctgccttca gcccccaggg gctcgctggg ccagcttctg 180 tcccaaccac ctgctgcttt aacctggcca ataggaagat accccttcag cgactagaga 240 gctacaggag aatcaccagt ggcaaatgtc cccagaaagc tgtgatcttc aagaccaaac 300 tggccaagga tatctgtgcc gaccccaaga agaagtgggt gcaggattcc atgaagtatc 360 tggaccaaaa atctccaact ccaaagccat aaataatcac catttttgaa accaaaccag 420 agcctgagtg ttgcctaatt tgttttccct tcttacaatg cattctgagg taacctcatt 480 atcagtccaa agggcatggg ttttattata tatatatata tttttttttt aaaaaaaaac 540 gtattgcatt taatttattg aggctttaaa acttatcctc catgaatatc agttattttt 600 aaactgtaaa gctttgtgca gattctttac cccctgggag ccccaattcg atcccctgtc 660 acgtgtgggc aatgttcccc ctctcctctc ttcctccctg gaatcttgta aaggtcctgg 720 caaagatgat cagtatgaaa atgtcattgt tcttgtgaac ccaaagtgtg actcattaaa 780 tggaagtaaa tgttgtttta ggaatac 807
【００４９】 <210> 2 <211> 1160 <212> DNA <213> Homo sapiens <223> Nucleotide sequence of DNA encoding human RANTES <400> 2 cctccgacag cctctccaca ggtaccatga aggtctccgc ggcacgcctc gctgtcatcc 60 tcattgctac tgccctctgc gctcctgcat ctgcctcccc atattcctcg gacaccacac 120 cctgctgctt tgcctacatt gcccgcccac tgccccgtgc ccacatcaag gagtatttct 180 acaccagtgg caagtgctcc aacccagcag tcgtctttgt cacccgaaag aaccgccaag 240 tgtgtgccaa cccagagaag aaatgggttc gggagtacat caactctttg gagatgagct 300 aggatggaga gtccttgaac ctgaacttac acaaatttgc ctgtttctgc ttgctcttgt 360 cctagcttgg gaggcttccc ctcactatcc taccccaccc gctccttgaa gggcccagat 420 tctgaccacg acgagcagca gttacaaaaa ccttccccag gctggacgtg gtggctcagc 480 cttgtaatcc cagcactttg ggaggccaag gtgggtggat cacttgaggt caggagttcg 540 agacagcctg gccaacatga tgaaacccca tgtgtactaa aaatacaaaa aattagccgg 600 gcgtggtagc gggcgcctgt agtcccagct actcgggagg ctgaggcagg agaatggcgt 660 gaacccggga gcggagcttg cagtgagccg agatcgcgcc actgcactcc agcctgggcg 720 acagagcgag actccgtctc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaataca aaaattagcc 780 gcgtggtggc ccacgcctgt aatcccagct actcgggagg ctaaggcagg aaaattgttt 840 gaacccagga ggtggaggct gcagtgagct gagattgtgc cacttcactc cagcctgggt 900 gacaaagtga gactccgtca caacaacaac aacaaaaagc ttccccaact aaagcctaga 960 agagcttctg aggcgctgct ttgtcaaaag gaagtctcta ggttctgagc tctggctttg 1020 ccttggcttt gcaagggctc tgtgacaagg aaggaagtca gcatgcctct agaggcaagg 1080 aagggaggaa cactgcactc ttaagcttcc gccgtctcaa cccctcacag gagcttactg 1140 gcaaacatga aaaatcgggg 1160
【００５０】 <210> 3 <211> 336 <212> DNA <213> Homo sapiens <223> Nucleotide sequence of DNA encoding human beta-defencin-2 <400> 3 agactcagct cctggtgaag ctcccagcca tcagccatga gggtcttgta tctcctcttc 60 tcgttcctct tcatattcct gatgcctctt ccaggtgttt ttggtggtat aggcgatcct 120 gttacctgcc ttaagagtgg agccatatgt catccagtct tttgccctag aaggtataaa 180 caaattggca cctgtggtct ccctggaaca aaatgctgca aaaagccatg aggaggccaa 240 gaagctgctg tggctgatgc ggattcagaa agggctccct catcagagac gtgcgacatg 300 taaaccaaat taaactatgg tgtccaaaga tacgca 336
【００５１】 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplification of human gene for eotaxin <400> 4 gccagcttct gtcccaacca 20
【００５２】 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Reverse primer for amplification of human gene for eotaxin <400> 5 ggcacagata tccttggcca 20
【００５３】 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detection of human eotaxin <400> 6 ctgctgcttt aacctggcca ataggaagat acc 33
【００５４】 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplification of human gene for RANTES <400> 7 cgctctcatc ctcattgcta ct 22
【００５５】 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Reverse primer for amplification of human gene for RANTES <400> 8 agctcatctc caaagagttg atgtact 27
【００５６】 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detection of human gene for RANTES <400> 9 ccctctgcgc tcctgcatct gc 22
【００５７】 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplification of human gene for beta-defensin-2 <400> 10 gcctcttcca ggtgtttttg g 21
【００５８】 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for amplification of human gene for beta-defensin-2 <400> 11 cgcacgtctc tgatgaggga 20
【００５９】 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detection of human gene for beta-defensin-2 <400> 12 tataggcgat cctgttacct gccttaagag tgg 33
【００６０】 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplification of gene for glyceraldehide-3-phos phate dehydrogenase <400> 13 gaaggtgaag gtcggagtc 19
【００６１】 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for amplification of gene for glyceroldehyde-3-phos phate dehydrogenase <400> 14 gaagatggtg atgggatttc 20
【００６２】 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detection of gene for glyceraldehyde-3-phosphate dehydro genase <400> 15 aggctgagaa cgggaagctt g 21
【００６３】 <210> 16 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <223> Patial nucleotide sequence of rat gene for glyceraldehyde-3-phosph ate dehydrogenase <400> 16 gctcggctgg cgacgcaaaa gaagatgcgg ctgactgtcg agccacatcg ctcagacacc 60 atggggaagg tgaaggtcgg agtcaacgga tttggtcgta ttgggcgcct ggtcaccagg 120 gctgctttta actctggtaa agtggatatt gttgccatca atgacccctt cattgacctc 180 aactacatgg tttacatgtt ccaatatgat tccacccatg gcaaattcca tggcaccgtc 240 aaggctgaga acgggaagct tgtcatcaat ggaaatccca tcaccatctt ccaggagcga 300 gatccctcca aaatcaagtg gggcgatgct ggcgctgagt acgtcgtgga gtccactggc 360
【図１】図１は、本発明の測定法の原理を示す図であ
る。
る。
【図２】図２は、エオタキシンをコードするヒト由来の
cDNAのヌクレオチド配列と、それに対するプライマー及
びプローブの位置を示す図である。
cDNAのヌクレオチド配列と、それに対するプライマー及
びプローブの位置を示す図である。
【図３】図３は、RANTESをコードするヒト由来のcDNAの
ヌクレオチド配列と、それに対するプライマー及びプロ
ーブの位置を示す図である。
ヌクレオチド配列と、それに対するプライマー及びプロ
ーブの位置を示す図である。
【図４】図４は、β−ディフェンシン−２をコードする
ヒト由来のcDNAのヌクレオチド配列の１部分と、それに
対するプライマー及びプローブの位置を示す図である。
ヒト由来のcDNAのヌクレオチド配列の１部分と、それに
対するプライマー及びプローブの位置を示す図である。
【図５】図５は、グリセロアルデヒド−３−ホスフェー
ト・デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチ
ド配列の１部分と、それに対するプライマー及びプロー
ブの位置を示す図である。
ト・デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチ
ド配列の１部分と、それに対するプライマー及びプロー
ブの位置を示す図である。
【図６】図６は、エオタキシンをコードする遺伝子を本
発明の方法により測定した場合の、鋳型核酸の初期分子
数の対数と CT との関係を示すグラフである。
発明の方法により測定した場合の、鋳型核酸の初期分子
数の対数と CT との関係を示すグラフである。
【図７】図７は、RANTESをコードする遺伝子を本発明の
方法により測定した場合の、鋳型核酸の初期分子数の対
数と CT との関係を示すグラフである。
方法により測定した場合の、鋳型核酸の初期分子数の対
数と CT との関係を示すグラフである。
【図８】図８は、β−ディフェンシン−２をコードする
遺伝子を本発明の方法により測定した場合の、鋳型核酸
の初期分子数の対数と CT との関係を示すグラフであ
る。
遺伝子を本発明の方法により測定した場合の、鋳型核酸
の初期分子数の対数と CT との関係を示すグラフであ
る。
【図９】図９は、エオタキシンの発現に対するIFN-γ及
びIL-4の影響を示すグラフである。
びIL-4の影響を示すグラフである。
【図１０】図１０は、RANTESの発現に対するIFN-γ及び
IL-4の影響を示すグラフである。
IL-4の影響を示すグラフである。
【図１１】図１１は、β−ディフェンシンの発現に対す
るTNF-α及びIL-1αの影響を示すグラフである。
るTNF-α及びIL-1αの影響を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ 33/50 33/53 Ｍ 33/53 33/566 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 市川 秀之 神奈川県金沢区福浦２−12−１ 株式会社 資生堂リサーチセンター内 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA40 CB01 CB30 DA12 DA13 DA14 DA36 DA80 FB02 FB12 FB20 GC15 4B024 AA01 AA11 BA08 BA21 CA04 CA09 FA10 GA11 HA12 4B063 QA01 QQ08 QQ24 QQ43 QQ53 QR32 QR55 QR62 QS25 QS32 4C084 AA17 NA14 ZB112 ZB132
Claims (12)
- 【請求項１】 フォワードプライマー及びリバースプラ
イマー、並びにレポーターとクエンチャーを有し前記両
プライマーに挟まれた領域内で鋳型核酸とハイブリダイ
ズするプローブを用い、５′→３′エキソヌクレアーゼ
活性を有するDNA ポリメラーゼによりポリメラーゼ連鎖
反応（PCR)を行うことによってエオタキシン、RANTES又
はβ−ディフェンシン−２のmRNA又はcDNAを測定する方
法において、 （１）エオタキシンをコードするmRNA又はcDNAを測定す
るために、前記一方のプライマーとしてエオタキシンを
コードする核酸のヌクレオチド170 〜189 の領域にハイ
ブリダイズするオリゴヌクレオチドを用い、他方のプラ
イマーとして前記核酸のヌクレオチド301 〜320 の領域
にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを用い、そし
て前記プローブとして前記核酸中のヌクレオチド191 〜
223 の領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを
用い；あるいは、 （２）RANTESをコードするmRNA又はcDNAを測定するため
に、前記一方のプライマーとしてRANTESをコードする核
酸のヌクレオチド50〜71の領域にハイブリダイズするオ
リゴヌクレオチドを用い、他方のプライマーとして前記
核酸のヌクレオチド274 〜300 の領域にハイブリダイズ
するオリゴヌクレオチドを用い、そして前記プローブと
して前記核酸中のヌクレオチド73〜94の領域にハイブリ
ダイズするオリゴヌクレオチドを用い；あるいは、 （３）β−ディフェンシン−２をコードするmRNA又はcD
NAを測定するために、前記一方のプライマーとしてβ−
ディフェンシン−２をコードする核酸中のヌクレオチド
84〜104 の領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチ
ドを用い、他方のプライマーとして前記核酸中のヌクレ
オチド276 〜295 の領域にハイブリダイズするオリゴヌ
クレオチドを用い、そして前記プローブとして前記核酸
中のヌクレオチド108 〜139 の領域にハイブリダイズす
るオリゴヌクレオチドを用いる；ことを特徴とするmRNA
又はcDNAの測定方法。 - 【請求項２】 前記プライマー及びプローブが20〜40の
ヌクレオチドから成るオリゴヌクレオチドである、請求
項１に記載の方法。 - 【請求項３】 前記プライマー及びプローブが次のヌク
レオチド配列： エオタキシン遺伝子測定用 フォワードプライマー 5′-GCCAGCTTCTGTCCCAACCA-
3′（配列番号：４） リバースプライマー 5′-GGCACAGATATCCTTGGCCA-3′
（配列番号：５） プローブ 5′-CTGCTGCTTTAACCTGGCCAATAGGAAGATACC-
3′（配列番号：６） を有するか；あるいは RANTES遺伝子測定用 フォワードプライマー 5′-CGCTCTCATCCTCATTGCTACT-
3′（配列番号：７） リバースプライマー 5′-AGCTCATCTCCAAAGAGTTGATGTA
CT-3′（配列番号：８） プローブ 5′-CCCTCTGCGCTCCTGCATCTGC-3′（配列番
号：９）；または β−ディフェンシン遺伝子測定用 フォワードプライマー 5′-GCCTCTTCCAGGTGTTTTTGG-
3′（配列番号：10） リバースプライマー 5′CGCACGTCTCTGATGAGGGA3′
（配列番号：11） プローブ 5′-TATAGGCGATCCTGTTACCTGCCTTAAGAGTGG-
3′（配列番号：12） を有するか；あるいは該配列中の４個以下のヌクレオチ
ドの置換、欠失及び／又は付加により修飾されており、
且つ対応する領域にハイブリダイズすることができるヌ
クレオチド配列を有する、請求項１又は２に記載の方
法。 - 【請求項４】 対照としてさらに、グリセロアルデヒド
−３−ホスフェート・デヒドロゲナーゼをコードする遺
伝子中の、一方のプライマーとしてヌクレオチド66〜84
の領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを使用
し、他方のプライマーとしてヌクレオチド272 〜291 の
領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを使用
し、そしてプローブとしてヌクレオチド242 〜262 の領
域のオリゴヌクレオチドを用いて、グリセロアルデヒド
−３−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ遺伝子を測定す
る、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項５】 前記グリセロアルデヒド−３−ホスフェ
ート・デヒドロゲナーゼ測定用として、次のヌクレオチ
ド配列： フォワードプライマー 5′GAAGGTGAAGGTCGGAGTC（配
列番号：13） リバースプライマー 5′GAAGATGGTGATGGGATTTC（配列
番号：14） プローブ 5′AGGCTGAGAACGGGAAGCTTG（配列番号：1
5） を有するか、又は４個以下のヌクレオチドの置換、欠失
及び／又は付加により修飾されており且つ対応する領域
にハイブリダイズすることができるプライマー及びプロ
ーブを用いる、請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】 フォワードプライマー及びリバースプラ
イマー、並びにレポーターとクエンチャーを有し前記両
プライマーに挟まれた領域内で鋳型核酸とハイブリダイ
ズするプローブを含んで成る、５′→３′エキソヌクレ
アーゼ活性を有するDNA ポリメラーゼによりポリメラー
ゼ連鎖反応（PCR)を行うことによってエオタキシン、RA
NTES又はβ−ディフェンシン−２のmRNA又はcDNAを測定
するためのキットであって、 （１）エオタキシンをコードするmRNA又はcDNAを測定す
るために、前記一方のプライマーとしてエオタキシンを
コードする核酸のヌクレオチド170 〜189 の領域にハイ
ブリダイズするオリゴヌクレオチド、他方のプライマー
として前記核酸のヌクレオチド301 〜320 の領域にハイ
ブリダイズするオリゴヌクレオチド、及び前記プローブ
として前記核酸中のヌクレオチド191 〜223 の領域にハ
イブリダイズするオリゴヌクレオチド；あるいは、 （２）RANTESをコードするmRNA又はcDNAを測定するため
に、前記一方のプライマーとしてRANTESをコードする核
酸のヌクレオチド50〜71の領域にハイブリダイズするオ
リゴヌクレオチド、他方のプライマーとして前記核酸の
ヌクレオチド274 〜300 の領域にハイブリダイズするオ
リゴヌクレオチド、及び前記プローブとして前記核酸中
のヌクレオチド73〜94の領域にハイブリダイズするオリ
ゴヌクレオチド；あるいは、 （３）β−ディフェンシン−２をコードするmRNA又はcD
NAを測定するために、前記一方のプライマーとしてβ−
ディフェンシン−２をコードする核酸中のヌクレオチド
84〜104 の領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチ
ド、他方のプライマーとして前記核酸中のヌクレオチド
276 〜295 の領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオ
チド、及び前記プローブとして前記核酸中のヌクレオチ
ド108 〜139 の領域にハイブリダイズするオリゴヌクレ
オチド；を含み、前記プライマー及びプローブが15〜40
個のヌクレオチドから成るオリゴヌクレオチドである、
ことを特徴とするmRNA又はcDNAの測定用キット。 - 【請求項７】 前記プライマー及びプローブが20〜30の
ヌクレオチドから成るオリゴヌクレオチドである、請求
項６に記載のキット。 - 【請求項８】 前記プライマー及びプローブが次のヌク
レオチド配列： エオタキシン遺伝子測定用 フォワードプライマー 5′-GCCAGCTTCTGTCCCAACCA-
3′（配列番号：４） リバースプライマー 5′-GGCACAGATATCCTTGGCCA-3′
（配列番号：５） プローブ 5′-CTGCTGCTTTAACCTGGCCAATAGGAAGATACC-
3′（配列番号：６）； または RANTES遺伝子測定用 フォワードプライマー 5′-CGCTCTCATCCTCATTGCTACT-
3′（配列番号：７） リバースプライマー 5′-AGCTCATCTCCAAAGAGTTGATGTA
CT-3′（配列番号：８） プローブ 5′-CCCTCTGCGCTCCTGCATCTGC-3′（配列番
号：９）；または β−ディフェンシン−２遺伝子測定用 フォワードプライマー 5′-GCCTCTTCCAGGTGTTTTTGG-
3′（配列番号：10） リバースプライマー 5′CGCACGTCTCTGATGAGGGA3′
（配列番号：11） プローブ 5′-TATAGGCGATCCTGTTACCTGCCTTAAGAGTGG-
3′（配列番号：12） を有するか；あるいは該配列中の４個以下のヌクレオチ
ドの置換、欠失及び／又は付加により修飾されており、
且つ対応する領域にハイブリダイズすることができるヌ
クレオチド配列を有する、請求項６又は７に記載のキッ
ト。 - 【請求項９】 対照としてさらに、グリセロアルデヒド
−３−ホスフェート・デヒドロゲナーゼをコードする遺
伝子中の、一方のプライマーとしてヌクレオチド66〜84
の領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、他方
のプライマーとしてヌクレオチド272 〜291 の領域にハ
イブリダイズするオリゴヌクレオチド、及びプローブと
してヌクレオチド242 〜262 の領域のオリゴヌクレオチ
ドを含む請求項６〜８のいずれか１項に記載のキット。 - 【請求項１０】 前記グリセロアルデヒド−３−ホスフ
ェート・デヒドロゲナーゼ測定用として、次のヌクレオ
チド配列： フォワードプライマー 5′GAAGGTGAAGGTCGGAGTC（配
列番号：13） リバースプライマー 5′GAAGATGGTGATGGGATTTC（配列
番号：14） プローブ 5′AGGCTGAGAACGGGAAGCTTG（配列番号：1
5） を有するか、又は４個以下のヌクレオチドの置換、欠失
及び／又は付加により修飾されており且つ対応する領域
にハイブリダイズすることができるプライマー及びプロ
ーブを用いる、請求項９に記載のキット。 - 【請求項１１】 抗炎症作用を有する薬剤の評価又は選
択方法において、エオタキシン、RANTES又はβ−ディフ
ェンシン−２を発現し得る細胞を被験試料の存在下で培
養し、エオタキシン、RANTES又はβ−ディフェンシン−
２をコードするmRNAの量を請求項１〜５のいずれか１項
に記載の方法、又は請求項６〜10のいずれか１項に記載
のキット、により測定することを特徴とする方法。 - 【請求項１２】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の
方法により、又は請求項１〜１０のいずれか１項に記載
のキットにより評価された薬剤活性成分とする抗炎症
剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000391265A JP2002186485A (ja) | 2000-12-22 | 2000-12-22 | エオタキシン、ＲＡＮＴＥＳ又はβ−ディフェンシン−２の核酸の測定方法及びそのための試薬、並びに抗炎症剤のスクリーニング方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000391265A JP2002186485A (ja) | 2000-12-22 | 2000-12-22 | エオタキシン、ＲＡＮＴＥＳ又はβ−ディフェンシン−２の核酸の測定方法及びそのための試薬、並びに抗炎症剤のスクリーニング方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002186485A true JP2002186485A (ja) | 2002-07-02 |
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ID=18857445
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000391265A Withdrawn JP2002186485A (ja) | 2000-12-22 | 2000-12-22 | エオタキシン、ＲＡＮＴＥＳ又はβ−ディフェンシン−２の核酸の測定方法及びそのための試薬、並びに抗炎症剤のスクリーニング方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002186485A (ja) |
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-
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- 2000-12-22 JP JP2000391265A patent/JP2002186485A/ja not_active Withdrawn
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