KR102133931B1

KR102133931B1 - 아세트아미노펜 노출에 대응하는 히드라 유전자 및 이를 이용한 수생태계 환경오염 진단 방법

Info

Publication number: KR102133931B1
Application number: KR1020200013928A
Authority: KR
Inventors: 염승식; 야민다고 아데; 조예진; 원효경
Original assignee: 한국해양과학기술원
Priority date: 2020-02-05
Filing date: 2020-02-05
Publication date: 2020-07-15

Abstract

본 발명은 아세트아미노펜(Acetaminophen) 노출에 대응하는 히드라(Hydra magnipapillata) 유전자 및 이를 이용하여 수생태계 환경오염을 진단하는 방법에 관한 것으로, 히드라에 아세트아미노펜을 노출시킨 후 변화되는 유전자를 분석한 결과, 5000 ㎍/L의 아세트아미노펜에 12시간 노출군에서 32종, 24시간 노출군에서 66종, 48시간 노출군에서 37종, 72시간 노출군에서 84종의 유전자들이 발현량이 변화되는 것을 확인하였고, 상기 차등발현 유전자들 중 생체 내 생리 및 대사와 연관되는 것으로 예상되는 25종의 유전자들을 선별하였으며, 선별된 유전자들의 기능 분석을 통해 아세트아미노펜의 노출이 히드라의 어떤 생물학적 기능에 영향을 미치는가를 예측할 수 있는 바, 상기 25종의 유전자들은 아세트아미노펜 노출을 확인할 수 있는 바이오마커로 유용하게 활용할 수 있다.

Description

아세트아미노펜 노출에 대응하는 히드라 유전자 및 이를 이용한 수생태계 환경오염 진단 방법{Acetaminophen responsive genes in hydra magnipapillata and the method for diagnosing aquatic environment pollution using the same}

본 발명은 아세트아미노펜 노출에 대응하는 히드라 유전자 및 이를 이용한 수생태계 환경오염 진단 방법에 관한 것이다.

질병의 치료를 위해 의약품들은 현대생활에 있어 매우 중요한 필수품이다. 전국 각 도시의 하수종말처리장 수질을 분석한 결과, 무분별하게 버려지고 있는 불용의약품으로 인한 콜레스테롤 저하제, 소염 및 해열 진통제 등이 검출되었다. 이런 의약품들은 인간뿐 아니라 동물과 농산물 생산, 수산물 양식에도 광범위하게 사용되고 있으며, 사람이나 동물에게 투여된 후 그 일부가 그대로 또는 생체 내에서 대사체로 변환되어 소변이나 대변으로 배설되어 환경 속으로 들어가게 된다. 또한 가정에서 사용하지 않거나 사용하다가 남은 약들은 쓰레기통, 변기에 버려지고 제약회사에서 생산되어 유통기한을 넘긴 의약품은 폐기되어야 하는데 그대로 환경에 버려지는 경우도 있어서 수질 등 환경오염으로 인하여 사람의 건강에 영향을 미치거나, 생태계를 교란하게 될 것이다. 최근 환경에 잔류하는 의약품들이 새로운 오염물질로 거론되고 있으며, 사용과 폐기에 따른 지속적 방출로 인하여 하천 및 토양오염을 가중시킨다는 여러 연구 결과가 발표되고 있다.

아세트아미노펜은 대표적인 해열 진통제 성분으로, 발열, 두통, 근육통, 치통 등의 완화를 위해 사용된다. 아세트아미노펜은 cyclooxygenase-2의 활성을 저해하여 통증 완화시킨다. 2003년의 연구결과에 의하면 영국에서는 2000년 400 톤 이상의 아세트아미노펜이 소비되었던 것으로 파악되었고(Sebastine과 Wakeman, 2003, Process Saf. Environ. 81: 229-235). 환경에서는 12.24-200 μg/L까지 검출된 바 있다(Villar-Navarro 등, 2018, Water Research, 139: 19-29; Gheorghe 등, 2016, Environ. Monit. Assess. 188: 379; Togola와 Budzinski, 2008, J. Chromatogr. A. 1177: 150-158). 인구의 증가속도와 스트레스원의 증가로 인해, 그 사용량은 매년 증가될 것으로 생각된다. 따라서 의약품에 의한 수환경 오염을 진단하고, 그 생물학적 위험성을 예측하기 위해, 수생동물모델을 대상으로 한 위해성 연구가 필요하다.

한편, 히드라(Hydra magnipalillata)는 신경세포를 갖고 있는 최초의 다세포 동물로서, 생물 진화의 연구에도 매우 중요한 위치를 차지하고 있다. 이배엽성 동물로서 번식은 무성 및 유성생식에 의하며, 뛰어난 재생능력을 갖고 있다. 형태형성과 관련된 신호전달계(Hobmayer 등, 2000, Nature 407: 186-189; Arvizu 등, 2006, Differentiation 74: 305-312; Augustin 등, 2006, Dev. Biol. 296: 62-70; Kaesbauer 등, 2007, Bev. Biol. 303: 376-390), 재생과 관련된 신호 및 신호전달계(Bode, 2003, Dev. Dyn. 226: 225-236; Fujisawa, 2003, Dev. Dyn. 226: 182-189; Holstein 등, 2003, Dev. Dyn. 226: 257-267), 세포분화의 신호전달과 관련된 연구(Thomsen 등, 2004, Mech. Dev. 121: 195-204; Philipp 등, 2005, Gene Expr. Patterns, 5: 397-402) 및 조직의 fate 결정 신호(Bielen 등, 2007, Development, 134: 4187-4197)등이 알려져 있다. 이러한 신호전달계는 진화과정을 통해 모든 동물에 공통적으로 존재함으로, 히드라에서의 신호전달계 이상을 다른 동물에 외삽할 수 있다. 대부분의 동물에서 초기발생 과정에만 발현하는 다양한 유전자들이 히드라에서는 성체에서도 그 발현이 유지된다. 따라서 시기적인 제한을 받지 않고 이와 관련된 신호전달계의 연구가 가능하며, 각 세포형에 대한 분자마커들이 알려져 있어, 세포분화에 대한 연구도 가능하다. 또한, 유전자 및 단백질 발현의 로컬리제이션(localization)을 위한 in situ hybridization(ISH) 및 immunohistochemistry(IHC) 법도 정립되어 있고, 현재 160,000 클론의 ESTs 정보 및 게놈 정보(genome data)가 데이터베이스(DB)화 되어 있어(Chapman 등, 2010, Nature 464: 592-596), 다양한 신호전달계에 속하는 유전자들에 대한 정보 검색이 가능하다. 환경위해성연구의 대체실험동물로서 히드라의 중요성에 대해서도 논의된 바 있다(Yum 등, 2014, Mol. Cell. Toxicol. 10: 339-346).

이에 본 발명자들은 아세트아미노펜 노출에 대한 특이 유전자후보의 확보 및 검출을 위해, DDBJ/EMBL/NCBI 유전자 데이터베이스에 축적되어 있는 유전자 정보로부터 17,000여개의 singleton을 추출하였다. 추출된 singleton들에 대한 oligo-probe를 디자인하고, 이들을 탑재한 17K Hydra Express Gene Microarray(HEGEM)을 완성하였다. 상기 17K HEGEM을 이용하여 아세트아미노펜 노출에 의해 발현량이 변화되는 유전자를 발굴함으로써, 아세트아미노펜 노출 여부를 확인할 수 있는 바이오마커 및 이를 이용한 노출 여부를 확인하는 방법, 그리고 아세트아미노펜 노출에 의한 히드라의 생리와 대사변화를 예측하는 방법을 확립하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 아세트아미노펜 노출에 대응하는 히드라(Hydra magnipapillata) 유전자, 및 이를 이용한 아세트아미노펜 노출 여부 또는 생물학적 기능 변화 예측 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 25로 기재되는 모든 유전자 각각의 핵산 서열의 올리고뉴클레오티드 전부 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된, 아세트아미노펜(Acetaminophen) 노출 여부 검출용 마이크로어레이 칩(microarray chip)을 제공한다.

또한, 본 발명은 1) 피검 시료에 노출된 실험군의 히드라와, 정상 대조군의 히드라에서 각각 RNA를 분리하는 단계; 2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 RNA로부터 cDNA를 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질로 표지하는 단계; 3) 단계 2)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 제 1항의 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계; 4) 반응한 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및 5) 분석한 데이터에서 제 1항의 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는, 시료 내 아세트아미노펜 노출 여부 검출 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 1) 피검 시료에 노출된 실험군의 히드라와, 정상 대조군의 히드라에서 각각 RNA를 분리하는 단계; 2) 단계 1)의 RNA를, 서열번호 1 내지 25로 기재되는 각각의 유전자에 상보적이고 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 모두 사용하여 정량 실시간 RT-PCR(Quantitative real-time reverse transcript polymerase chain reaction, qRT-PCR)을 수행하는 단계; 및 3) 단계 2)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는, 시료 내 아세트아미노펜 노출 여부 검출 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 마이크로어레이 칩을 포함하는, 아세트아미노펜 노출 여부 검출용 키트를 제공한다.

아울러, 본 발명은 서열번호 1 내지 25로 기재되는 각각의 유전자에 상보적이고 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 모두 포함하는 아세트아미노펜 노출 여부 검출용 키트를 제공한다.

본 발명은 아세트아미노펜 노출에 대응하는 히드라 유전자를 분석하였고, 5000 ㎍/L의 아세트아미노펜에 12시간 노출군에서 32종, 24시간 노출군에서 66종, 48시간 노출군에서 37종, 72시간 노출군에서 84종의 유전자들이 발현량이 변화되는 것을 확인하였고, 상기 차등발현 유전자들 중 생체 내 생리 및 대사와 연관되는 것으로 예상되는 25종의 유전자들을 선별하였으며, 선별된 유전자들의 기능 분석을 통해 아세트아미노펜의 노출이 히드라의 어떤 생물학적 기능에 영향을 미치는가를 예측할 수 있는 바, 상기 25종의 유전자들은 아세트아미노펜 노출을 확인할 수 있는 바이오마커로 유용하게 활용할 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 아세트아미노펜(Acetaminophen) 노출에 대응하여 발현이 변화하는 히드라(Hydra magnipapillata) 유래의 유전자를 발굴하였으며, 상기 아세트아미노펜 노출에 대하여 발현량이 변화하는 히드라 유래 유전자를 집적한 마이크로어레이 칩을 아세트아미노펜 노출 여부 검출 및 수생태계 오염 상태를 진단하는데 이용할 수 있다.

본 발명은 서열번호 1 내지 25로 기재되는 모든 유전자 각각의 핵산 서열의 올리고뉴클레오티드 전부 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된, 아세트아미노펜(Acetaminophen) 노출 여부 검출용 마이크로어레이 칩(microarray chip)을 제공한다.

상기 유전자는 히드라(Hydra magnipapillata)로부터 유래된 것일 수 있다.

상기 아세트아미노펜 노출 여부 검출용 마이크로어레이 칩은 당업자에게 알려진 방법으로 제작할 수 있다. 구체적으로, 상기 탐색된 유전자를 프로브로 이용하여 마이크로어레이 칩의 기판상에 고정화시킬 수 있다. 이때, 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등이 사용될 수 있다. 상기 마이크로어레이 칩의 기판에는 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-Llysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 활성기가 코팅될 수 있다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글라스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막, 및 니트로셀룰로스 막으로 이루어진 군에서 선택되는 것으로 제조된 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 1) 피검 시료에 노출된 실험군의 히드라와, 정상 대조군의 히드라에서 각각 RNA를 분리하는 단계; 2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 RNA로부터 각기 다른 형광물질로 표지한 cRNA를 합성하는 단계; 3) 단계 2)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cRNA를 제 1항의 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계; 4) 반응한 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및 5) 분석한 데이터에서 제 1항의 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는, 시료 내 아세트아미노펜 노출 여부 검출 방법을 제공한다.

상기 시료는 생체시료, 식품시료, 화학시료, 공업시료, 임상시료 및 환경시료로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

상기 단계 2)의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

상기 키트는 스트렙타비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(strepavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 형광물질군으로부터 선택되는 어느 하나를 추가적으로 포함할 수 있다.

또한, 상기 키트는 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA(complementary DNA)를 합성하기 위한 역전사효소, dNTPs(deoxynucleotide triphosphates) 및 rNTPs(ribonucleotide triPhosphates, 사전 혼합형 또는 분리 공급형), 표식시약, 및 세척 완충용액으로 이루어진 반응 시약군으로부터 선택되는 어느 하나를 추가적으로 포함할 수 있다.

아울러, 본 발명은 서열번호 1 내지 25로 기재되는 각각의 유전자에 상보적이고 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 모두 포함하는, 아세트아미노펜 노출 여부 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 아세트아미노펜 노출에 의해 변화하는 히드라 유래의 유전자를 발굴하기 위하여, 아세트아미노펜에 대한 두부 및 촉수재생 반수저해 농도(Inhibitory concentration 50, IC₅₀)를 결정하여 5000 ㎍/L에 히드라 20 개체를 각각 12, 24, 48 및 72 시간 동안 노출시켜 배양한 후, RNA를 분리하여 대조군과 비교하여 2배 이상 변화되는 유전자들을 선별하였다. 그 결과, 12시간 노출군에서 32종(증가 31종, 감소 1종; 표 2 및 표 3), 24시간 노출군에서 66종(증가 61종, 감소 5종; 표 4 및 표 5), 48시간 노출군에서 37종(증가 33종, 감소 4종; 표 6 및 표 7), 72시간 노출군에서 84종(증가 81종, 감소 3종; 표 8 및 표 9)의 유전자 발현이 2배 이상 변화되는 것을 확인하였다(표 2 내지 표 9 참조). 또한, 이들 차등발현 유전자들 중 생체 내 생리 및 대사와 연관되는 것으로 예상되는 25종의 유전자들을 선별하였다(표 10 참조).

따라서, 상기 유전자들의 기능 분석을 통해 아세트아미노펜의 노출이 히드라의 어떤 생물학적 기능에 영향을 미치는가를 예측할 수 있으며, 상기 25종의 유전자들은 아세트아미노펜 노출을 확인할 수 있는 바이오마커로 유용하게 활용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해서 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 히드라 마이크로어레이의 제작

히드라 마이크로어레이의 제작을 위해, DDBJ/EMBL/NCBI 유전자 데이터베이스에 축적되어 있는 히드라(Hydra magnipapillata)의 17,000 여개의 싱글레톤(singleton) 유전자 정보를 기초로 올리고 프로브(oligo-probe)를 디자인하고, 이를 합성하여 슬라이드 글라스 위에 탑재함으로써 17K Hydra Express Gene Microarray(HEGEM)을 제작하였다.

<실시예 2> 아세트아미노펜(Acetaminophen)에 노출된 히드라로부터 유전자의 분리

<실시예 2-1> 히드라의 배양

히드라(Hydra magnipapillata) 야생형(wild strain) 105는 일본국립유전학연구소(National Institute of Genetics, Yata, Mishima, Japan)에서 분양받아 배양액(1 mM NaCl, 1 mM CaCl₂, 0.1 mM KCl, 0.1 mM MgSO₄, 1 mM Tris (hydroxymethyl) aminoethane(pH 7.6))에서 배양하였다. 수온은 18℃로 고정하였으며, 이틀에 한번 갓 부화한 아르테미아(Artemia) 유생을 먹이로 공급하였다. 먹이 공급 후, 수 시간 이후에 배양액을 교환하였다.

<실시예 2-2> 아세트아미노펜의 노출 조건 확립

히드라를 대상으로 아세트아미노펜(Acetaminophen) 노출 조건을 확립하기 위해, 아세트아미노펜에 대한 두부 및 촉수재생 반수저해 농도(Inhibitory concentration 50, IC₅₀)를 결정하였다(표 1).

차등발현 유전자 검출을 위한 노출 농도는 72 시간 IC₅₀(231.3mg/L)의 약 1/50에 해당하는 5,000 ㎍/L에 히드라 20 개체를 각각 12, 24, 48 및 72 시간 동안 노출하였다.

표 1은 히드라에서의 아세트아미노펜 반수저해 농도를 나타낸 것이다.

노출 시간	IC₅₀ (단위 mg/L)
72시간	231.3
96시간	487.9

<실시예 2-3> RNA 추출 및 정제

상기 <실시예 2-2>의 조건대로 아세트아미노펜(5000 ㎍/L)을 노출시킨 12, 24, 48 또는 72시간의 각 노출 실험군 및 노출하지 않은 대조군의 히드라조직에 Tri-Reagent 용액(Molecular Research Center Inc, Cincinnati, Ohaio, USA) 1 ㎖을 넣고 유리 균질기(glass homogenizer)를 이용하여 균질화하고, 실온에 10분간 방치하였다. 클로로포름 200 ㎕를 첨가하여 잘 섞은 후, 실온에서 10분간 방치하고, 15분간 원심분리(12,000×g, 4℃)하였다. 그런 다음, 상층액을 수득하여, 아이소프로판올(isopropanol) 500 ㎕를 넣고, 상온에 5분간 방치하였다. 약 20 분간 원심분리(12,000×g, 4℃)한 후, 용액을 제거하여 침전물만을 취합하였고, 상기 침전물에 70% 에탄올 용액 50 ㎕를 넣어 5분간 원심분리한 뒤, 에탄올 용액을 제거하고 침전된 RNA를 건조시켰다. 건조 후, 적당량의 에틸피로카보네이트(diethylpyrocarbonate, DEPC)로 처리한 멸균수에 용해하였다.

<실시예 2-4> 형광물질 표지된 cRNA 합성

상기 <실시예 2-3>에서 정제된 노출 실험군 및 대조군의 전체 RNA(total RNA)는 Agilent's Low RNA Input Linear Amplification Kit Plus (Agilent Technologies, USA)를 사용하여 제조사의 프로토콜을 따라 다음과 같이 Cy3 및 Cy5로 표지하였다.

구체적으로, RNA 1 ㎍을 dT-T7 프로모터 프라이머(dT-promoter primer)와 MMLV-역전사효소(MMLV-Reverse transcriptase)와 혼합하여 40℃에서 2시간 동안 역전사반응을 수행하였다. 그런 다음, T7 중합효소(T7 polymerase)를 첨가하여 40℃에서 2시간 동안 선형 증폭(linear amplification)을 수행하였다. 이와 같은 증폭과정을 통해 실험군 및 대조군의 시료를 각각 Cy3-CTP와 Cy5-CTP로 표지하였다.

<실시예 3> 마이크로어레이(microarray) 혼성화(hybridization) 및 분석

<실시예 3-1> 마이크로어레이 혼성화

상기 <실시예 2-4>에서 형광물질이 라벨링된 cRNA 시료를 Qiagen PCR purification kit을 사용하여 정제하고, 증류수로 용출하였다. 정제된 형광표지-cRNA 시료를 혼성화 완충액(hybridization buffer)(3×SSC, 0.3% SDS, 50% 포름아미드(formamide), 20 ㎍ Cot-1 DNA, 20 ㎍ 효모균(yeast) tRNA)에 첨가한 후, microcon YM-30으로 농축하여 혼성화 혼합물(mixture)을 만들었다. 혼성화 혼합물을 95℃로 3분 동안 가열하여 변성시키고 12,000×g에서 30초간 원심분리하며 온도를 낮추었다.

<실시예 1>에서 제조된 히드라 마이크로어레이에 커버슬립(coverslip)을 덮고, 혼성화 혼합물을 파이펫팅(pipetting)하였다. 그 후, 마이크로어레이를 GT-Hyb 챔버(Chamber)에 넣고 65℃에서 16시간 동안 반응시켜 혼성화를 시킨 후, 챔버에서 마이크로어레이를 꺼내어 세척하고, 마이크로어레이를 회전하여 건조한 후 스캐닝할 때까지 암실에서 보관하였다. 실험이 완료된 히드라 oligo-마이크로어레이는 Axon GenePix 4000B scanner(Axon Instrument, USA)를 사용하여 스캔하였으며, GenePix Pro 6.0 program을 이용하여 스캔 이미지로부터 각 점을 그리딩 파일(gridding file)을 이용하여 그리딩하고, 정량화하여 각 점의 Cy5/Cy3 강도 및 비율등의 분석값이 포함된 GPR 파일(GPR file)을 얻었다.

<실시예 3-2> 마이크로어레이의 분석

GenePix Pro Program에서 얻어진 GPR 파일로부터, 분석 프로그램인 GeneSpring 7.3.1(Agilent Technologies, USA)를 이용하여 아래와 같이 분석을 수행하였다.

표준화(Normalization)는 LOWESS(locally weighted regression scatterplot smoothing)를 이용하여 수행하였고, 신뢰할 수 있는 유전자(Reliable gene)는 중앙값의 합이 배경(background)보다 낮거나, 각 화소(pixel) 값의 표준편차가 유의하지 않은 점을 플래그 아웃(flag-out)함으로써 유의한 유전자를 얻었다. 유의한 유전자(Significant genes)는 정규화된 비율(normalized ratio) 값이 2배 이상 차이를 보이는 것들을 선별하였다.

<실시예 3-3> 특이 유전자 후보군 확인

1차적으로, 아세트아미노펜 노출 시간별 유전자 발현량이 2배 이상 변화되는 유전자들을 선별하였다.

그 결과, 12시간 노출군에서 32종(증가 31종, 감소 1종; 표 2), 24시간 노출군에서 66종(증가 61종, 감소 5종; 표 3), 48시간 노출군에서 37종(증가 33종, 감소 4종; 표 4), 72시간 노출군에서 84종(증가 81종, 감소 3종; 표 5)의 유전자 발현이 2배 이상 변화되는 것을 확인하였다(표 2 내지 표 5 참조).

아세트아미노펜(5,000 ㎍/L) 12시간 노출군에서 발현량이 증가된 유전자 (31종)

GenBank Acc.	유전자 이름(Gene name)	발현 변화
XM_002159705	tetratricopeptiderepeatdomain18	5.5
XM_002163272	Calmodulin(CaM)	5
XM_002166284	nucleartranscriptionfactorY,gamma	5
XM_002171100	LINE1-likeRNA-directedDNApolymerase	4.7
XM_002163542	thrombospondintype1repeat-containingprotein2	4.1
XM_002165417	AldehydedehydrogenasetypeIII	4.1
XM_002168891	hypotheticalproteinLOC100200621	4
XM_002155406	hypotheticalproteinLOC100209558	3.9
XM_002164217	transcriptionfactorIIIA,putative	3.8
XM_002166497	predicted protein	3.8
XM_002171093	ZincfingerBEDdomain-containingprotein1	3.7
XM_002167903	transposase(putative)	3.5
XM_002156219	Y64G10A.7 (LOC100199089)	3.5
XM_002166728	predicted protein (LOC100202743)	3.3
XM_002166002	AGAP001049-PA (LOC100203666)	3.3
XM_002162428	predicted protein (LOC100206761)	3
XM_002154102	conserved hypothetical protein (LOC100207416)	3
XM_002166349	vasa-relatedproteinCnVAS1	2.8
XM_002159819	hypothetical protein LOC100200934 (LOC100200934)	2.8
XM_002163019	Y52D5A.1 (LOC100204794)	2.7
XM_002155169	PIF/Harbinger-likeprotein	2.7
XM_002169690	RCC2homolog	2.6
XM_002159385	gamete fusion-like protein (FusM)	2.4
XM_002158646	smallheatshockprotein	2.4
XM_002168296	predicted protein (LOC100206775)	2.3
XM_002154887	predicted protein (LOC100204881)	2.3
XM_002166161	mucin2	2.3
XM_002154859	conserved hypothetical protein (LOC100211478)	2.2
XM_002162284	Adalprotein	2.2
XM_002169727	transposasedomain-containingprotein	2.1
XM_002155419	hypotheticalproteinLOC100202204	2

아세트아미노펜(5,000 ㎍/L) 12시간 노출군에서 발현량이 감소된 유전자 (1종)

GenBank Acc.	유전자 이름(Gene name)	발현 변화
XM_002155491	oxidativestressprotein	-2.5

아세트아미노펜(5,000 ㎍/L) 24시간 노출군에서 발현량이 증가된 유전자 (61종)

GenBank Acc.	유전자 이름(Gene name)	발현 변화
XM_002169214	predicted protein (LOC100211057)	8.5
XM_002168296	predicted protein (LOC100206775)	7.4
XM_002159819	hypotheticalproteinLOC100200934	7.2
XM_002159705	tetratricopeptiderepeatdomain18	6.6
XM_002160201	conserved hypothetical protein (LOC100208305)	6.4
XM_002156369	MGC85118protein	6.2
XM_002168564	predicted protein (LOC100204874)	5.7
XM_002162820	EGF-like-domain,multiple3	5.6
XM_002156707	tyrosinekinasereceptor	4.7
XM_002164217	transcriptionfactorIIIA,putative	4.6
XM_002156219	Y64G10A.7 (LOC100199089)	4.4
XM_002155090	periculin	4.3
XM_002154916	hypothetical protein LOC100213187	4.2
XM_002154329	ATP-dependentDNAhelicasePIF1	4.2
XM_002168496	queuinetRNAribosyltransferase,putative	4.1
XM_002166002	AGAP001049-PA (LOC100203666)	4
XM_002171100	LINE1-likeRNA-directedDNApolymerase	3.9
XM_002158742	hypotheticalproteinLOC100200450	3.8
XM_002163648	hypotheticalproteinLOC100198744	3.8
XM_002166181	periculin	3.7
XM_002155169	PIF/Harbinger-likeprotein	3.5
XM_002170619	hepatopancreaskazal-typeproteinaseinhibitor	3.5
XM_002159692	predicted protein (LOC100207915)	3.4
XM_002162162	predicted protein (LOC100210397)	3.3
XM_002165249	ViralA-typeinclusionproteinrepeat,putative	3.3
XM_002165146	TPR	3.1
XM_002154685	predicted protein (LOC100210731)	3.1
XM_002158049	GSTM2protein	3.1
XM_002164282	embryonic-1	3.1
XM_002167903	transposase(putative)	3
XM_002163906	F59H6.5 (LOC100200858)	3
XM_002163049	mucin1,cellsurfaceassociated	2.8
XM_002159360	predicted protein (LOC100212284)	2.8
XM_002158818	hypothetical protein LOC100213161	2.8
XM_002155086	fascin2	2.8
XM_002155187	AGAP001049-PA (LOC100204965)	2.7
XM_002169654	predicted protein (LOC100206796)	2.7
XM_002168770	predicted protein (LOC100212392)	2.6
XM_002170755	Os02g0236500 (LOC100202302)	2.5
XM_002163554	hypotheticalproteinLOC100212404	2.4
XM_002158978	predicted protein (LOC100208242)	2.4
XM_002169621	SCO1-like,putative	2.3
XM_002170132	PMS1proteinhomolog1	2.3
XM_002166009	conserved hypothetical protein (LOC100203206)	2.3
XM_002171093	ZincfingerBEDdomain-containingprotein1	2.3
XM_002163019	Y52D5A.1 (LOC100204794)	2.3
XM_002161961	predicted protein (LOC100205381)	2.3
XM_002162252	putativeascorbateperoxidase	2.2
XM_002158646	smallheatshockprotein	2.2
XM_002167113	predicted protein (LOC100202830)	2.2
XM_002154102	conserved hypothetical protein (LOC100207416)	2.2
XM_002165417	AldehydedehydrogenasetypeIII	2.2
XM_002166497	predicted protein (LOC100210282)	2.2
XM_002171073	hypothetical protein LOC100205096	2.2
XM_002154859	conserved hypothetical protein (LOC100211478)	2.2
XM_002157841	DAZ-likeprotein	2.2
XM_002169968	embryonic-1	2.2
XM_002159385	gamete fusion-like protein (FusM)	2.1
XM_002167229	putative3-glucanase	2.1
XM_002169727	transposasedomain-containingprotein	2.1
XM_002165378	predicted protein (LOC100205682)	2.1

아세트아미노펜(5,000 ㎍/L) 24시간 노출군에서 발현량이 감소된 유전자 (5종)

GenBank Acc.	유전자 이름(Gene name)	발현 변화
XM_002154713	verylargeinducibleGTPase1	-2
XM_002166335	tyrosinekinasereceptor	-2.2
XM_002155491	oxidativestressprotein	-2.8
XM_002169302	hypotheticalproteinLOC100206448	-9.6
XM_002169831	hypotheticalproteinLOC100209805	-11.2

아세트아미노펜(5,000 ㎍/L) 48시간 노출군에서 발현량이 증가된 유전자 (33종)

GenBank Acc.	유전자 이름(Gene name)	발현 변화
XM_002160201	conserved hypothetical protein (LOC100208305)	8.4
XM_002167113	predicted protein (LOC100202830)	5.5
XM_002167592	H28G03.4 (LOC100214969)	5.1
XM_002164217	transcriptionfactorIIIA,putative	4.4
XM_002168496	queuinetRNAribosyltransferase,putative	4.1
XM_002156219	Y64G10A.7 (LOC100199089)	3.8
XM_002156707	tyrosinekinasereceptor	3.7
XM_002163801	immediateearlyproteinhomolog-related	3.7
XM_002159143	ATP-bindingcassette,sub-familyB(MDR/TAP),member6	3.6
XM_002169812	Os02g0236500 (LOC100204594)	3.6
XM_002168891	hypothetical protein LOC100200621	3.4
XM_002167288	hypothetical protein LOC100214587	3.4
XM_002154329	ATP-dependent DNA helicase PIF1	3.3
XM_002163019	Y52D5A.1 (LOC100204794)	3
XM_002159819	hypothetical protein LOC100200934	2.9
XM_002166002	AGAP001049-PA (LOC100203666)	2.9
XM_002169621	SCO1-like,putative	2.7
XM_002171093	ZincfingerBEDdomain-containingprotein1	2.7
XM_002171100	LINE1-likeRNA-directedDNApolymerase	2.7
XM_002159385	gamete fusion-like protein (FusM)	2.6
XM_002170630	Uncharacterized protein F54H12.3 (LOC100207145)	2.6
XM_002154887	predicted protein (LOC100204881)	2.6
XM_002167903	transposase(putative)	2.5
XM_002154102	conserved hypothetical protein (LOC100207416)	2.4
XM_002155187	AGAP001049-PA (LOC100204965)	2.4
XM_002155169	PIF/Harbinger-like protein	2.3
XM_002168770	predicted protein (LOC100212392)	2.3
XM_002157518	predicted protein (LOC100212520)	2.2
XM_002170755	Os02g0236500 (LOC100202302)	2.1
XM_002166349	vasa-relatedproteinCnVAS1	2.1
XM_002158934	predicted protein (LOC100201066)	2.1
XM_002168861	predicted protein (LOC100203601)	2
XM_002166728	predicted protein (LOC100202743)	2

아세트아미노펜(5,000 ㎍/L) 48시간 노출군에서 발현량이 감소된 유전자 (4종)

GenBank Acc.	유전자 이름(Gene name)	발현 변화
XM_002160019	Y20F4.5 (LOC100212801)	-2.1
XM_002155491	oxidativestressprotein	-2.6
XM_002169302	hypotheticalproteinLOC100206448	-2.7
XM_002169831	hypotheticalproteinLOC100209805	-2.8

아세트아미노펜(5,000 ㎍/L) 72시간 노출군에서 발현량이 증가된 유전자 (81종)

GenBank Acc.	유전자 이름(Gene name)	발현 변화
XM_002169214	predicted protein (LOC100211057)	483.7
XM_002164282	embryonic-1	93.7
XM_002155090	periculin	55.2
XM_002154916	hypothetical protein LOC100213187	53.6
XM_002158742	hypothetical protein LOC100200450	48
XM_002169968	embryonic-1	42.7
XM_002166181	periculin	42.6
XM_002153775	hypothetical protein LOC100206472	38
XM_002158049	GSTM2 protein	33.6
XM_002158818	hypothetical protein LOC100213161	21.9
XM_002159692	predicted protein (LOC100207915)	19.5
XM_002170619	hepatopancreas kazal-type proteinase inhibitor	18.1
XM_002162252	putative ascorbate peroxidase	15.1
XM_002170829	GI18027 (LOC100199297)	12.2
XM_002160201	conserved hypothetical protein (LOC100208305)	10.9
XM_002167229	putative 3-glucanase	10.7
XM_002155086	fascin 2	10.3
XM_002159040	type II transmembrane C-type lectin	10
XM_002159617	CDK5 regulatory subunit associated protein 1	9.6
XM_002157290	conserved hypothetical protein (LOC100205450)	7.8
XM_002171073	hypothetical protein LOC100205096	6.4
XM_002156707	tyrosine kinase receptor	6.1
XM_002154033	Hydroxymethylglutaryl-CoA lyase, mitochondrial	5.9
XM_002167427	T-box protein AmphiTbx6/16	5.3
XM_002165146	TPR	5.2
XM_002163019	Y52D5A.1 (LOC100204794)	5.2
XM_002163801	immediate early protein homolog-related	5.1
XM_002161879	chromosome 21 open reading frame 29	5
XM_002155917	predicted protein (LOC100204912)	4.9
XM_002166002	AGAP001049-PA (LOC100203666)	4.7
XM_002167592	H28G03.4 (LOC100214969)	4.6
XM_002166497	predicted protein (LOC100210282)	4.6
XM_002154329	ATP-dependent DNA helicase PIF1	4.4
XM_002166161	mucin 2	4.4
XM_002163272	Calmodulin (CaM)	4.3
XM_002168496	queuine tRNA ribosyltransferase, putative	4.2
XM_002156219	Y64G10A.7 (LOC100199089)	4.2
XM_002168564	predicted protein (LOC100204874)	4.1
XM_002164217	transcription factor IIIA, putative	4.1
XM_002156622	tyrosine kinase receptor	4
XM_002167113	predicted protein (LOC100202830)	3.9
XM_002166889	putative endo-1,3-beta-glucanase	3.9
XM_002161814	Cnnos1 protein (Cnnos1)	3.7
XM_002161183	chromosome 21 open reading frame 29	3.6
XM_002169621	SCO1-like, putative	3.6
XM_002163648	hypothetical protein LOC100198744	3.5
XM_002171093	Zinc finger BED domain-containing protein 1	3.5
XM_002159881	Pftaire-1	3.1
XM_002157841	DAZ-like protein	3.1
XM_002170387	kelch-like 2, Mayven	3
XM_002159143	ATP-binding cassette, sub-family B (MDR/TAP), member 6	2.9
XM_002159705	tetratricopeptide repeat domain 18	2.9
XM_002160702	predicted protein (LOC100211463)	2.9
XM_002158823	antistasin	2.9
XM_002167903	transposase (putative)	2.8
XM_002157873	hypothetical protein LOC100213162	2.7
XM_002169812	Os02g0236500 (LOC100204594)	2.7
XM_002166284	nuclear transcription factor Y, gamma	2.6
XM_002154859	conserved hypothetical protein (LOC100211478)	2.5
XM_002162162	predicted protein (LOC100210397)	2.5
XM_002159819	hypothetical protein LOC100200934	2.5
XM_002154283	predicted protein (LOC100211827)	2.4
XM_002165420	hypothetical protein LOC100205972	2.4
XM_002155669	hlpA	2.4
XM_002157447	ADP-ribosylation factor-like 11	2.4
XM_002166137	DNA damage-binding protein 1	2.4
XM_002155169	PIF/Harbinger-like protein	2.4
XM_002165417	Aldehyde dehydrogenase type III	2.4
XM_002162621	predicted protein (LOC100206788)	2.4
XM_002167112	predicted protein (LOC100212131)	2.3
XM_002165502	viral A-type inclusion protein	2.3
XM_002170817	hypothetical protein LOC100200832	2.2
XM_002159385	gamete fusion-like protein (FusM)	2.2
XM_002168770	predicted protein (LOC100212392)	2.2
XM_002154967	Plastid ribosomal protein L11 large ribosomal subunit	2.2
XM_002165246	Dihydrolipoyl dehydrogenase, mitochondrial	2.1
XM_002154102	conserved hypothetical protein (LOC100207416)	2.1
XM_002171100	LINE1-like RNA-directed DNA polymerase	2.1
XM_002160768	small heat shock protein	2
XM_002162396	predicted protein (LOC100212840)	2
XM_002169690	RCC2 homolog	2

아세트아미노펜(5,000 ㎍/L) 72시간 노출군에서 발현량이 감소된 유전자 (3종)

GenBank Acc.	유전자 이름(Gene name)	발현 변화
XM_002163542	thrombospondin type 1 repeat-containing protein 2	-3
XM_002169302	hypothetical protein LOC100206448	-4.7
XM_002169831	hypothetical protein LOC100209805	-5

아세트아미노펜 노출 차등발현 유전자에서 선별된 25종의 유전자

GenBank acc.	Gene symbol	12 시간	24 시간	48 시간	72 시간	서열 번호
	1. DNA damage
XM_002170132	PMS1		2.3			1
XM_002166137	DDB1				2.4	2
XM_002163049	MUC1		2.8			3
XM_002166161	MUC2				4.4	4
	2. Protein damage
XM_002165146	TPR/uncharacterizedLOC100207207		3.1		5.2	5
XM_002170387	KLHL2				3	6
	3. Genomic instability
XM_002154329	PIF1		4.2	3.3	4.4	7
XM_002155669	HLPA				2.4	8

XM_002165417	ADLH3	4.1			2.4	9
XM_002162252	APX		2.2		15.1	10
XM_002158049	GSTM2		3.1		33.6	11
XM_002165246	DLD				2.1	12
XM_002155491	Oxidative stress protein	-2.5	-2.8	-2.6		13
	5. Stress response
XM_002170619	KPI		3.5		18.1	14
	6. Apoptosis
XM_002157447	ARL11				2.4	15
	7. Cell cycle
XM_002169690	RCC2	2.6			2	16
XM_002159881	PFTAIRE1				3.1	17
	8. Sex determination
XM_002166349	CNVAS1/RH37	2.8		2.1		18
XM_002159385	FUSM/HAP2A	2.4	2.1	2.6	2.2	19
XM_002161814	CNNOS1/				3.7	20
	uncharacterized
	LOC100192236
XM_002157841	DAZL		2.2		3.1	21
	9. Morphogenesis
XM_002155086	FSCN2/Fascin-like		2.8		10.3	22
XM_002159360	NR2F2		2.8			23
	10. Multidrug resistance
XM_002159143	ABCB6			3.6	2.9	24
	11. Immune sysyem
XM_002159617	CDK5RAP1				9.6	25

또한, 상기 표 10에 나타난 바와 같이, 차등발현 유전자들 중 DNA 손상(DNA damage), 단백질 손상(protein damage), 게놈 불안정성(genomic instability), 산화 스트레스 반응(oxidative stress response), 스트레스 반응(stress response), 세포사멸(apoptosis), 세포 주기(cell cycle), 성 결정(sex determination), 형태 형성(morphogenesis), 다약제 내성(multidrug resistance), 면역 시스템(immune system)에 관여할 것으로 예상되는 25종의 유전자들을 선별하였다(표 10).

따라서, 이들 선별된 유전자 25종은 수생태계 환경내 아세트아미노펜 노출 예측 및 아세트아미노펜 노출에 의한 히드라의 생리 및 대사 변화를 예측할 수 있는 바이오마커로 유용하게 이용될 수 있다.

<110> Korea Institute Of Ocean Science & Technology <120> Acetaminophen responsive genes in hydra magnipapillata and the method for diagnosing aquatic environment pollution using the same <130> 2020p-01-015 <160> 25 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1278 <212> RNA <213> Hydra magnipapillata <400> 1 atgaataagt tacctttatc tacagtagaa cttattacaa gcactcaggt tataatcagt 60 ttggtgtctg ttgtaaaaga acttgttgaa aactcacttg attctggctg tgacagcata 120 gatgttagat tggatgaaaa tggtctatct aagattgaag tgcaagataa tggtactggt 180 attgctttag aagatattca atatgtttgc aaacagcatt acacaagcaa aattagaaat 240 gaattagatt tgcttaactt aacgcaatat ggttttcgtg gtgaagctct tttttcaata 300 tgttcagttg gtgatgtttt tataacaact aaaacaaaag cagatcaggt ttcaaaaaaa 360 tatagttttt caaagtatgg tgaaattatt agttctgaaa taactcatca taatgtagga 420 actatagtca ctgtattaaa tttgttcaaa gcattgcctg ttcgcagaaa attatatgag 480 aacaatcgta aagttagaga agaagttaag tgtattgaag agttactaat atcttacggc 540 atagcgatgc ccaaactgcg cattactctt aagtatgaca aaaatataat atggaggaaa 600 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120 actttacagg accaacagac ttaaatttga tagttgctaa aaataataaa ttagagttac 180 atatggtaac tcctgagggt ctgcaaccta aatttgattt aaatgtgtat gggagagtag 240 cagttatgca attatttaga cctcaaaatg aaaaccaaga tttgcttttt atattaactg 300 agcggtatcg aactgctata ttagcttata aagcagaaac tggtgatatt ataacaaaag 360 cttatggtga tgtgcag 377 <210> 3 <211> 1041 <212> RNA <213> Hydra magnipapillata <400> 3 atggttaaga aatatagtgg catgaatgca ggattgagag aaacagatcg taactgtatt 60 ttttctagct gtgtaaatcg tgctgtaaat cttgtgaatg tcgattgcgc tcaatcgaca 120 atgaagcaat tgcgtagttt ggaaaaactc aacaaatcac taccactcgc accaaatttt 180 tcaacagcac ttccaatcgc accaaatctt tctacaacaa taccaatcgc accaaatctt 240 ttaacagcac ttccaaccgc accaaatctt tcaacagcac ttccaatcgc accaaatctt 300 tcaacagcac ttcctatcgc accaaatctt tcaacagcac ttccaatcgc accaaatctt 360 tcaacagtac ttccaatcgc accaaatctt tcaacagcac ttccaatcgc accaaatctt 420 tcaacagcac tactaatcgc accaaatctt tcaacagcac taccaatcgc accaaatctt 480 tcaacagcac taccaatcgc accaaatctt tcaacagcac taccaatcgc accaaatctt 540 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ccctaccggc aaagtaaagt caattcaatt 480 catagtaatg ttttggcaca aacatacgca caaacattag agtctcttat tgctaaccaa 540 agtgtagtta gtcaacaaat acataatcat gttcaacaac aaattcaaag caaagctttg 600 aaaaatctta gcaagacatc ggtttgtgtt ttttgtcgaa ataatggtga gtccagagaa 660 ttttacagct cgcacacttt aaaagataac gaaggaaata ctatgtgccc aatacttaga 720 gcctacacat gcccactctg caagtcacat ggtaaccaat cacatacaat taaatattgt 780 cctaaatata ctccaaaacc gaaaacagat aaattattag atatcagcat gcctttactt 840 tagcttacga tgaattttta tttgatattt aaaaatgaaa gaaatttaat tttgtttagt 900 gaggtataac tattttttat gtacatatct aagttctctt gcgcgcattc ttgctgcgca 960 agattgtttt gttttgcatg ctctattttt ttaggtgagc ttttaaattt ttacgttcat 1020 tttttcattg atagttttaa attaatcctt caaaatattt tcattattat cctagttaaa 1080 ttttaaaggc agttttttaa attatacagt ctcttgattt tatcttattt tgtttattcg 1140 tcttatttaa tgtttgtata taacgaccgc agaaaatgct tagcgttcca tagtttattt 1200 aaaattcttt gtctcatctt acagtatgat aatatttttc tttatttgaa caaccttcat 1260 catataagct tttcgtcgta ggctttttta aatttaaaaa ccgccaatta ctggtatctg 1320 taaaaaaaaa aaaactacag gtgttacatt aaatctgttt actaagtaat atttaatcta 1380 tgtgaatgtt cctttatgtt ttaatatttt taacaatgta atcaagtagg actaaaactt 1440 tcttattttt ttcttttcaa ttttagtcct aattttagat aaaatttaat cgcgattatc 1500 attttatgat ttgtacatgc aagaattttg tggtgttaag aaaaccttca tatttgtgtt 1560 tatatattta aacgctgtaa atagcgtgtc aaagattctg tattagattt tacgccatat 1620 tgtatttagt ttttattcga atataacgaa tgcagatttt 1660 <210> 21 <211> 748 <212> RNA <213> Hydra magnipapillata <400> 21 catatagcgt gtttatgttt tttgttttcg tgacaacaca caatttaaat taaacgttat 60 gtcgtcgtta atgtcatctc aaggcccgtt gaaggccatt catattcaag ttccaattgg 120 aattccaact ccagatggcg gattagaaat tcctaatcgt gttttcttgg gaggcatacc 180 caccgagaca actgaattag agctggagtt gtttttttct gattacggat tagttaaaga 240 tgtgcgaatt gtaacagacc gagttactgg tgaatgtaaa ggttatggat ttgttacatt 300 tgatgaaaat gaagatataa acgagcttgt tgttaagaaa tccatcaata tgaaagggaa 360 aaagcttcgg gttagaaaag cgattcgacg caacggttcc caatttaaca gttgtggtaa 420 ttcaagtgaa 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gagattggtt ggaaaaactc caattgaaac attaatacga 1440 gatattctta tttctggtac atcatatgat tggcccactt taaactactc tgaaagaact 1500 taa 1503 <210> 24 <211> 2643 <212> RNA <213> Hydra magnipapillata <400> 24 atgacccgcg acatcgagcg gggcacccgt ggcgtgcatt cgctgatcag ctattcgctc 60 tacagcatcg ttcccaccct gatcgaggtg gcgttggtgc tgacgctgct ggcggtcaag 120 ttcgatgtct ggttcgcctg gatcaccggc attgcactgg tggtgtacat cgccttcacg 180 gttacggtca ccgagtggcg cacgcagttc cgcaaaaaga tgaacgagat ggacagcaca 240 gcccacagcc gcgccatcga ttcgctgctg aactacgaga cgctcatcat cgccagtgca 300 ctggtcacca tgttgtggcg tgctacccaa ggcgtggtgg acgggcgcat gacgctgggg 360 gacctggtca tggtcaacgc cttcatgatc cagctctaca ttccgctaaa ttttctgggt 420 gtgatctacc gggagatcaa gcaaagcctg accgacttgg agaaaatgtt tagcctgatg 480 gagcgtgagc gcgaaattgc cgatgcaccc gaggctcccc ccttgcagtt ggcggccgat 540 ggttcggacg ccagcgtgcg gtttgaaggt gtcactttca gctacgaccc cgcaggcagc 600 aaggcagccg caggcaccga agcgcgcacc atcctgcacc acatcagctt cgagattcct 660 gcgggcaaaa ccgtcgctgt ggtggggccc 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Claims

서열번호 1 내지 25로 기재되는 모든 유전자 각각의 핵산 서열의 올리고뉴클레오티드 전부 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된, 아세트아미노펜(Acetaminophen) 노출 여부 검출용 마이크로어레이 칩(microarray chip).
제 1항에 있어서, 상기 유전자는 히드라(Hydra magnipapillata)로부터 유래된 것을 특징으로 하는, 아세트아미노펜 노출 여부 검출용 마이크로어레이 칩.
1) 피검 시료에 노출된 실험군의 히드라와, 정상 대조군의 히드라에서 각각 RNA를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 RNA로부터 각기 다른 형광물질로 표지한 cRNA를 합성하는 단계;
3) 단계 2)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cRNA를 제 1항의 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계;
4) 반응한 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및
5) 분석한 데이터에서 제 1항의 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는, 시료 내 아세트아미노펜 노출 여부 검출 방법.
제 3항에 있어서, 상기 시료는 생체시료, 식품시료, 화학시료, 공업시료, 임상시료 및 환경시료로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 아세트아미노펜 노출 여부 검출 방법.
제 3항에 있어서, 상기 단계 2)의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 아세트아미노펜 노출 여부 검출 방법.
1) 피검 시료에 노출된 실험군의 히드라와, 정상 대조군의 히드라에서 각각 RNA를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 RNA를, 서열번호 1 내지 25로 기재되는 각각의 유전자에 상보적이고 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 모두 사용하여 정량 실시간 RT-PCR(Quantitative real-time reverse transcript polymerase chain reaction, qRT-PCR)을 수행하는 단계; 및
3) 단계 2)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는, 시료 내 아세트아미노펜 노출 여부 검출 방법.
제 6항에 있어서, 상기 시료는 생체시료, 식품시료, 화학시료, 공업시료, 임상시료 및 환경시료로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 아세트아미노펜 노출 여부 검출 방법.
제 1항의 마이크로어레이 칩을 포함하는, 아세트아미노펜 노출 여부 검출용 키트.
제 8항에 있어서, 상기 키트는 스트렙타비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(streptavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 형광물질군으로부터 선택되는 어느 하나를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 아세트아미노펜 노출 여부 검출용 키트.
제 8항에 있어서, 상기 키트는 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA(complementary DNA)를 합성하기 위한 역전사효소, dNTPs(deoxynucleotide triphosphates) 및 rNTPs(ribonucleotide triPhosphates, 사전 혼합형 또는 분리 공급형), 표식시약, 및 세척 완충용액으로 이루어진 반응 시약군으로부터 선택되는 어느 하나를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 아세트아미노펜 노출 여부 검출용 키트.
서열번호 1 내지 25로 기재되는 각각의 유전자에 상보적이고 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 모두 포함하는, 아세트아미노펜 노출 여부 검출용 키트.