JP2002090365A - 腎障害の検査手段 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】簡便な腎障害の検査手段を提供することであ
る。 【解決手段】腎障害に関連してみられる尿中脂肪球及び
卵円形脂肪体が含有する脂肪顆粒に着目し、それらに含
有されるリポタンパク質若しくはその類縁体、またはこ
れらに含有される成分の量が有意に腎障害との関連性を
示唆するものであることを見出し、本発明の腎障害の検
査手段を完成した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明が属する技術分野】本発明は、腎障害の検査に関
するものであって、尿中のリポタンパク質若しくはその
類縁体、またはこれらに含有される成分を測定する検査
手段に関する。

【０００２】

【従来の技術】尿沈渣中に含まれる成分は、腎に由来す
る成分、尿路から混入してくる成分、さらには尿中で析
出してくる結晶性成分等多種である。沈渣の種類、量を
調べることは、腎・尿路疾患の鑑別とその程度を知る上
で非常に重要である。これらは、通常染色法による鏡検
により行われている。また、尿中マクロファージの表面
抗原を調べることによりＩｇＡ腎症の病態診断が可能で
あること（臨床検査，42巻，588〜590，1998）、尿中脂
肪球および卵円形脂肪体（以下、単に脂肪体と呼ぶこと
もある）の鑑別を尿沈渣脂肪染色により行うことにより
腎障害の検査が可能であることが示されている（検査と
技術，26巻，441-446，1998）。

【０００３】さらに、尿中に出現してくる大型マクロフ
ァージは白血球の表面抗原ＣＤ１４が陰性、２５Ｆ９が
陽性であり、通常のマクロファージがＣＤ１４陽性、２
５Ｆ９陰性であることと大きく異なっており、しかも大
型マクロファージに脂肪球、卵円形脂肪体が属している
ことが示され、これらを測定することは、腎障害の検査
として有用であることが述べられている（臨床病理，47
巻，総会号，73，1999）。

【０００４】しかしながら、これらの測定はいずれも、
染色による鏡検、モノクローナル抗体を用いた蛍光標識
免疫染色による鏡検あるいはフローサイトメトリー等に
より行われていた。これらの方法では、１検体ずつ鏡検
またはフローサイトメトリー等により検査するため、操
作が煩雑で多数検体の測定は困難であった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、腎障
害の簡便な検査手段を提供することである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記大型
マクロファージを微量コレステロール（ｍＣＨＯ）で測
定可能と考えｍＣＨＯを測定していたところ、大型マク
ロファージが低いレベルでもｍＣＨＯが高値である検体
があることを見出した。また、リポタンパク質が出現す
る患者は、疾患の進行が速く、腎不全に移行する確率が
高いものであった。そこで鋭意研究を重ねた結果、リポ
タンパク質若しくはその類縁体、またはこれらに含有さ
れる成分、特にアポタンパク質の量が有意に腎障害との
関連性を示唆するものであることを見出し、本発明の腎
障害の検査手段を完成した。

【０００７】すなわち本発明は、 １．尿中のリポタンパク質若しくはその類縁体、または
これらに含有される成分を測定することを特徴とする腎
障害の検査手段、 ２．リポタンパク質若しくはその類縁体が、抗ヒトアポ
Ａ−Ｉ抗体が反応しうるタンパク質または抗ヒトアポＡ
−II抗体が反応しうるタンパク質のいずれか１または両
方を含有する物質であることを特徴とする前項１に記載
の検査手段、 ３．リポタンパク質若しくはその類縁体が、高比重リポ
タンパク質若しくはその類縁体であることを特徴とする
前項１または２に記載の検査手段。 ４．リポタンパク質若しくはその類縁体に含有される成
分として、アポタンパク質を測定することを特徴とする
前項１〜３のいずれか１に記載の検査手段。 ５．リポタンパク質若しくはその類縁体に含有される成
分として、抗ヒトアポＡ−Ｉ抗体が反応しうるタンパク
質または抗ヒトアポＡ−II抗体が反応しうるタンパク質
から選択される１または両方を測定することを特徴とす
る前項１〜４のいずれか１に記載の検査手段、 ６．尿中の抗ヒトアポＡ−Ｉ抗体が反応しうるタンパク
質または抗ヒトアポＡ−II抗体が反応しうるタンパク質
から選択される１または両方を測定することを特徴とす
る腎障害の検査手段、 ７．さらに尿中の脂質成分を測定することを特徴とする
前項１〜６のいずれか１に記載の検査手段、 ８．脂質成分がコレステロールであることを特徴とする
前項７に記載の検査手段、 ９．前項１〜８のいずれか１に記載の検査に必要な試薬
をキット化または単品で構成してなる検査用試薬、から
なる。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明は、腎障害の検査手段であ
って、尿中のリポタンパク質若しくはその類縁体、また
はこれらに含有される成分を測定することを特徴とす
る。ここで、手段とは、目的を達成するための方法およ
び／または媒体を意味する。すなわち、本発明の腎障害
の検査手段は、尿中のリポタンパク質若しくはその類縁
体、またはこれらに含有される成分を測定することによ
って達成される。さらに、これらの物質に加えて、尿中
の脂質成分を測定することを特徴とする腎障害の検査手
段を提供する。

【０００９】尿中の脂質成分としては、脂肪滴、脂肪体
および／または脂肪球に含まれるものおよび高比重リポ
タンパク質様（ＨＤＬ様）のリポタンパク質を主要な測
定対象とする。特に腎疾患において尿中にＨＤＬ様リポ
タンパク質が現れることを新規に見出した。血清中にお
いては、脂質はリポタンパク質として存在しているが、
尿中では顕微鏡でみえる程度の粒子（脂肪滴、脂肪体お
よび／または脂肪球）となっていることが多い。これら
不溶性の脂肪の塊になっているものについて、本発明で
はその脂質成分量について酵素反応による定量を可能と
する。

【００１０】（対象リポタンパク質若しくはその類縁
体、またはこれらに含有される成分）本発明において、
主として測定の対象とする尿中のリポタンパク質若しく
はその類縁体、またはこれらに含有される成分は次のと
おりである。一定の割合の脂質とタンパク質を含む複合
体をリポタンパク質といい、キロミクロン、ＶＬＤＬ、
ＩＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ等が挙げられるが、これらに限
定されるものではない。脂質成分は、後述の（対象とす
る脂質成分）に記した内容とほぼ同様であるが、主にコ
レステロール、トリアシルグリセロール、リン脂質、遊
離脂肪酸等が挙げられる。これらの脂質の一部はきわめ
て疎水性が強いため、リポタンパク質とよばれる特殊な
構造体を形成し、表面にはアポタンパク質とよばれる特
殊なタンパク質を配置する。アポタンパク質は、リポタ
ンパク質の構造決定のうえで重要な役割を示すとともに
リポタンパク質代謝のうえでも重要な機能を果たす。

【００１１】各種リポタンパク質の主要アポタンパク質
として、キロミクロンについてはＡ−Ｉ、Ｂ、Ｃ−Ｉ、
II、IIIが、ＶＬＤＬについてはＢ、Ｃ−Ｉ、II、III、
Ｅが、ＩＤＬについてはＢ、Ｅが、ＬＤＬについてはＢ
が、ＨＤＬ₂およびＨＤＬ₃についてはＡ−Ｉ、IIが構成
成分として知られている。

【００１２】本発明におけるリポタンパク質の類縁体と
は、電荷の異なったもの、糖その他の物質により修飾さ
れたもの、分子量が異なるもの、アミノ酸配列が類似す
るもの等が例示される。

【００１３】本発明における抗ヒトアポＡ−Ｉ抗体が反
応しうるタンパク質または抗ヒトアポＡ−II抗体が反応
しうるタンパク質とは、ヒトアポＡ−Ｉタンパク質また
はヒトアポＡ−IIタンパク質そのものの他、これらのタ
ンパク質と共通する構造を有することにより、上記抗体
と反応しうるタンパク質も含む趣旨である。

【００１４】（脂質成分）本発明で測定の対象とする尿
中の脂質成分は、例えば、中性脂肪およびその誘導体、
リン脂質およびその誘導体、過酸化脂質、ステロール
類、脂肪酸、脂肪酸塩、脂肪酸エステル、脂肪族アルコ
ール、脂肪族アルデヒド、糖脂質、スフィンゴ脂質、プ
ロスタグランジン、カロチノイド等の中から選ばれた１
種または２種以上の脂質成分であり、その濃度または含
量をこれらの脂質成分に作用する酵素を働かせて測定す
る。脂質成分のうち特に重要な対象は、ステロール類お
よび／またはリン脂質である。

【００１５】（測定試料の処理）尿試料は尿自体でもよ
く、尿を遠心分離して得られる尿沈渣画分またはその上
清画分であってもよい。本発明の脂質成分の測定方法は
尿試料を何ら処理することなく直接測定することが可能
であるだけでなく、尿を遠心分離し尿沈渣を分画し、そ
の画分の脂質成分を測定することも可能である。

【００１６】（測定方法）尿中に含有されるリポタンパ
ク質若しくはその類縁体、またはこれらに含有される成
分の測定は、これらの物質を検出可能な測定方法で測定
すればよく、特に限定されない。該測定は、界面活性剤
を使用しなくても使用しても良い。例えばリポタンパク
質若しくはその類縁体を測定する場合には、界面活性剤
は用いないで測定するのが好ましく、これらに含有され
る成分を測定する場合には、界面活性剤を用いて測定す
るのが好ましい。

【００１７】（リポタンパク質の測定方法）リポタンパ
ク質の測定は、例えばＨＰＬＣ、超遠心、ポリエチレン
グリコールを用いた凝集法などによりリポタンパク質を
分画し、分画したリポタンパク質を重量法にて測定する
ことができる。

【００１８】（アポタンパク質の測定方法）一方、アポ
タンパクの測定に関しては、抗原抗体反応による測定が
可能である、例えば、アポＡ−Ｉタンパクでは、抗アポ
Ａ−Ｉタンパク抗体を用いて、免疫比濁法、粒子凝集免
疫測定法、酵素免疫測定法等の公知の測定法が適用でき
る。他のアポタンパクの例としてアポＡ−ＩＩ、アポ
Ｂ、アポＣ、アポＥ、アポＬＰ（ａ）等がある。

【００１９】（界面活性剤の添加）界面活性剤は、尿中
の測定対象物を可溶化または分散し均質にし、尿のどの
部分を採ってもよいように測定対象物を均質化したり、
および／または酵素や抗体等により定量可能な状態にさ
せたりする作用を有する物質であれば特に限定されない
が、脂肪滴、脂肪体、脂肪球およびリポタンパク質を可
溶化する作用を有し、これらが包含する脂質成分、タン
パク質、不溶性の脂質等を可溶化・分散・遊離させ均質
にしうるものが好ましい。また、超音波処理を単独また
は界面活性剤処理と組み合わせてもよい。

【００２０】本発明の具体例では、非イオン界面活性剤
としてトリトンＸ-100を例示したが、格別にこれらに限
定されるものではない。当業者は、本発明に開示する結
果をもとに、単純な実験的繰り返しにより効果の比較を
行い、界面活性剤を選択することができる。非イオン界
面活性剤以外に、陽イオン、陰イオン界面活性剤、両イ
オン界面活性剤または配糖体を適宜用いることも無論可
能である。さらに、界面活性剤を２種以上併用して用い
ることにより、より確実に可溶化または分散させ均質化
効果を達成することができる。

【００２１】界面活性剤の添加量は、０．１〜５ｗ／ｖ
％が一般的であるが、可溶化または分散による均質化の
程度を考慮して、適宜増量・減量することにより選択可
能である。処理条件である温度・時間等は、単純な実験
的繰り返しにより決定することができる。また、好まし
くは、前処理として予め尿に界面活性剤を添加し、可溶
化または分散させ均質化処理を行っておくことも可能で
ある。この場合、１０〜４０℃の温度で、数秒から数分
程度の処理で充分である。無論、この界面活性剤処理
は、酵素反応処理との同時処理も可能である。処理は、
適宜段階的処理を行ってもよいが、より好ましくは自動
化された条件か一元処理がなされることが好ましい。

【００２２】（酵素を用いた脂質成分の定量）尿中に含
有される脂質成分の測定は、尿中の脂質成分を検出可能
な測定方法で測定すればよい。尿中の脂質成分は、血清
中のものと比較して約1/1000〜1/100しかなく、血清脂
質測定用試薬では測定が困難である。

【００２３】上記のように界面活性剤等の添加により可
溶化または分散させ均質化した尿中脂質成分の測定は、
酵素を用いた脂質の定量方法を用いて行うが、その方法
は公知の方法であれば特に限定されない。例えば、ＨＰ
ＬＣ法、ガスクロマトグラフィー法、電気泳動法、化学
的方法、酵素を用いた方法が例示される。このうち、酵
素を用いた方法は操作性、感度などの面から好適に用い
られる。本発明の脂質成分の測定方法では、下記の具体
例に示すように、分解反応、脱水素反応、または酸化反
応を触媒する酵素から選ばれる１種または２種以上の酵
素を利用して、脂質成分の測定を行うことができる。尿
中の脂質成分は、血清中の脂質成分と比較して微量にし
か存在しておらず、酵素を用いることにより高感度に測
定が可能となる。

【００２４】具体的には、中性脂肪を測定する例とし
て、リパーゼで中性脂肪をグリセロールと脂肪酸に分解
し、生じるグリセロールを酵素反応により測定する。グ
リセロールの酵素反応による測定は、グリセロールキナ
ーゼとグリセロール‐３‐リン酸脱水素酵素を作用さ
せ、補酵素ＮＡＤからＮＡＤＨへの変化速度を測定する
方法、グリセロールキナーゼとグリセロールリン酸酸化
酵素を作用させ生じる過酸化水素を測定する方法、グリ
セロールキナーゼとグリセロール‐３‐リン酸脱水素酵
素およびグリセロールリン酸酸化酵素を作用させサイク
リング反応によりグリセロールを測定する高感度測定
法、グリセロール脱水素酵素を作用させて測定する方法
等が用いられる。

【００２５】リン脂質を測定する場合には、ホスホリパ
ーゼおよびグリセロホスホリルコリンジエステラーゼを
作用させて、グリセロール−３−リン酸を生じさせ、そ
のグリセロール−３−リン酸を中性脂肪の場合と同様に
測定する方法、その他のリン脂質を酵素的に測定する公
知の方法が用いられる。

【００２６】生体中の代表的ステロールであるコレステ
ロールを測定するには、コレステロール酸化酵素を作用
させて、過酸化水素を生じさせ、その過酸化水素をペル
オキシダーゼにより測定する方法、またはコレステロー
ル脱水素酵素を作用させ補酵素ＮＡＤのＮＡＤＨへの変
化速度、あるいは変化量を測定する方法、さらには、同
じくコレステロール脱水素酵素を用いて、補酵素ＮＡＤ
ＨとチオＮＡＤの２種類の補酵素を用いることによる平
衡増幅反応により高感度にコレステロールを測定する方
法（特開平08-70894公報）や、コレステロールオキシダ
ーゼ等により変換される酸化型補酵素を還元型補酵素に
再生する第二のデヒドロゲナーゼの還元型基質の存在
下、コレステロールを基質としてサイクリング反応をお
こさせて測定する方法（特開平11-18797公報）等が知ら
れている。

【００２７】コレステロールの脂肪酸エステルの場合に
は、コレステロールエステラーゼ等の分解酵素を働かせ
ることにより、遊離のコレステロールに変換して上記の
方法で測定することが可能である。

【００２８】脂肪酸の場合には、アシルコエンザイムＡ
シンセターゼおよびアシルコエンザイムＡオキシダーゼ
を作用させて生じる過酸化水素を測定する方法が用いら
れる。

【００２９】プロスタグランジンではプロスタグランジ
ン脱水素酵素を作用させて測定できる。

【００３０】糖脂質の場合には、糖脂質分解リパーゼお
よび他のリパーゼを作用させて、グリセロールを生成さ
せ測定することが可能である。

【００３１】スフィンゴ脂質の場合にもスフィンゴ脂質
分解リパーゼを作用させ測定することが可能である。

【００３２】脂質成分の測定法は、上記に例示した方法
に限定されず、既知の脂質成分の測定方法に準じて適宜
変更・追加が可能である。

【００３３】本発明においては、上記本発明の尿中のリ
ポタンパク質若しくはその類縁体、またはこれらに含有
される成分の測定方法に必要な試薬をキット化または単
品で構成してなる試薬を提供する。本発明の試薬には、
尿中の不溶性脂肪を可溶化または分散させ均質化させる
ための界面活性剤、および脂質成分を定量するための試
薬を含むこともできる。また、測定に必要な試薬を担体
に含有させた簡単型の測定用デバイスであってもよい。

【００３４】（腎障害の検査手段）本発明の課題解決手
段の別の一は、尿中に含有されるリポタンパク質若しく
はその類縁体、またはこれらに含有される成分、脂質成
分を適宜組合わせ、測定することを特徴とする腎障害の
検査手段である。従来、腎障害の検出のための尿中脂肪
粒等の検査は顕微鏡所見等の煩雑な手段により行われて
いた。本発明では、上記本発明の簡便な尿中脂質成分の
測定方法を用いて得られた、尿中に含まれるリポタンパ
ク質若しくはその類縁体、またはこれらに含有される成
分、脂質成分の測定結果が、有意に腎障害との関連性を
示唆するものであることを見出し、簡便な腎障害の検査
手段を達成した。また、尿中の上記物質の量をスコア化
して、スコアにより被検者の腎障害の程度を判定可能に
する。

【００３５】本発明の腎障害の検査手段には、上記本発
明の尿中のリポタンパク質若しくはその類縁体、これら
に含有される成分、または脂質成分の測定方法を利用す
ることができ、これらを適宜組合わせても良い。測定の
対象とする尿中に含有される脂質成分は、主に尿中の脂
肪滴、脂肪体および／または脂肪球、ＨＤＬ様リポタン
パク質に含まれる。そして、少なくとも、中性脂肪およ
びその誘導体、リン脂質およびその誘導体、過酸化脂
質、ステロール類、脂肪酸、脂肪酸塩、脂肪酸エステ
ル、脂肪属アルコール、脂肪属アルデヒド、糖脂質、ス
フィンゴ脂質、プロスタグランジン、カロチノイドの中
から選ばれた１種あるいは２種以上の脂質成分を測定の
対象とする。また、リポタンパク質若しくはその類縁体
に含有される成分として、上記脂質の他、抗ヒトアポＡ
−Ｉ抗体が反応しうるタンパク質、抗ヒトアポＡ−II抗
体が反応しうるタンパク質、その他のアポタンパク質が
例示され、測定の対象とすることができる。また、リポ
タンパク質若しくはその類縁体としては、脂質とタンパ
ク質を含む複合体であれば良く、キロミクロン、ＶＬＤ
Ｌ、ＩＤＬ、ＨＤＬ等、およびその類縁体が例示され
る。

【００３６】実験例では、腎障害患者のコレステロール
値とリン脂質値を測定したが、これらは有意差をもって
正常人に比して高値であり、この結果により、尿中に含
有する脂質成分、少なくともコレステロールおよび／ま
たはリン脂質を定量することは、腎障害の発見に有用で
あることが判明した。また、腎疾患の患者の治療前後の
アポＡ−Ｉと各種尿中成分について測定を行った。この
結果、治療後にはアポＡ−Ｉの減少が認められ、腎障害
の診断に有用であることが示唆された。

【００３７】かくして本発明は、尿中のリポタンパク質
若しくはその類縁体、またはこれらに含有される成分、
脂質成分を測定し、その結果を解析することにより腎障
害の検出およびその程度の判定を可能にする腎障害の検
査手段を提供する。

【００３８】本発明は、腎障害の検出およびその程度の
判定のために、上記物質の測定に加えて、尿中に含まれ
る白血球の表面抗原の測定または検出を行う方法も組合
せて利用することを開示する。特に上記物質が高値（例
えば、脂質、リポタンパク類および／またはアポタンパ
ク類の測定結果やそれらのスコア化）を示した試料につ
いてのみ、尿中に含まれる白血球の表面抗原の測定また
は検出を行う方法を導入してもよい。これらの組合せに
より、より好適な腎障害の検査を可能となる。つまり、
尿中の脂質成分の測定と合わせて、尿中に含まれる白血
球の表面抗原の測定または検出を組み合わせることによ
り、腎障害の検出およびその程度の判定がより好適に行
われる。

【００３９】尿中の上記物質の測定と尿中に含まれる白
血球の表面抗原の測定または検出とを組合せて腎障害の
検査を行う場合、尿の一部を上記物質の測定に用いると
共に、一部を遠心分離により尿沈渣画分を分画して白血
球の表面抗原、例えばＣＤ１４、ＣＤ１６、２５Ｆ９
等、を公知の鏡検あるいはフローサイトメトリー等によ
り測定検出することも可能である。また、尿沈渣画分の
一部を用いて、上記物質を測定し、残りの一部で白血球
の表面抗原を鏡検あるいはフローサイトメトリー等で検
出測定することも可能である。さらに、尿の一部は遠心
分離により尿沈渣を分画し、白血球表面抗原を測定検出
する一方、尿の一部を凍結融解および／または界面活性
剤処理等を単独あるいは組合せて、尿中の細胞や粒子状
物質を破壊させる工程を経た尿検体を用いて測定を行う
ことも可能である。

【００４０】本発明の腎障害の検査手段が包含する、尿
中脂質の測定、尿中リポタンパク類および／または尿中
アポタンパク類の測定、あるいはこれらと尿中に含まれ
る白血球の表面抗原の測定若しくは検出、により得られ
た結果を随時組合せて解析することは、より好適な腎障
害判定を可能とする。解析に用いる測定結果は適宜選定
可能である。例えば、コレステロールとリン脂質の比を
指標にすることも可能であり、その比とＣＤ１４の測定
検出結果を組合せることもできる。尿中に含まれる白血
球の表面抗原の測定検出結果も複数の結果を組合せるこ
とができる。

【００４１】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに説明す
るが、本発明は実施例に限定されるものではない。

【００４２】

【実施例１】正常人の尿と腎障害患者の尿について、コ
レステロール濃度を測定した。尿は予め１０％トリトン
Ｘ−１００と９：１の割合で混合し、尿検体とした。コ
レステロール測定は下記の組成の測定試薬２種類を調製
し、尿検体１０μＬをとり、２５０μＬの試薬−１に添
加し、３７℃で５分間反応後、１００μＬの試薬−２を
添加し、添加後、１分目から３分目までの波長４１５ｎ
ｍにおける１分間あたりの吸光度変化量を求め、コレス
テロール濃度を求めた。その結果を表１に示した。

【００４３】試薬−１ ＰＩＰＥＳ ２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ １５０ｍｍｏｌ／Ｌ トリトンＸ−１００ ０．３ ｗ／ｖ％ コール酸ナトリウム ０．３ ｗ／ｖ％ チオＮＡＤ １．２５ｍｍｏｌ／Ｌ 牛血清アルブミン ０．１ ｗ／ｖ％ コレステロール脱水素酵素 ３Ｕ／ｍｌ コレステロールエステラーゼ ５Ｕ／ｍｌ ｐＨ ７．０

【００４４】試薬―２ ＣＨＥＳ １７５ｍｍｏｌ／Ｌ トリトンＸ−１００ ０．３ ｗ／ｖ％ コール酸ナトリウム ０．３ ｗ／ｖ％ β―ＮＡＤＨ ３．５ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ ９．１

【００４５】

【実施例２】実施例１で調製した尿検体について、リン
脂質濃度を測定した。リン脂質測定は下記の組成の測定
試薬２種類を調製し、尿検体１０μＬをとり、２５０μ
Ｌの試薬−１に添加し、３７℃で５分間反応後、１００
μＬの試薬−２を添加し、添加後、１分目から３分目ま
での波長５４６ｎｍにおける１分間あたりの吸光度変化
量を求め、リン脂質濃度を求めた。その結果を表１に示
した。

【００４６】 試薬−１ ＨＥＰＥＳ ５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ_２ １．０ｍｍｏｌ／Ｌ トリトンＸ−１００ ０．２ ｗ／ｖ％ グリセロール−３−リン酸脱水素酵素 １．５Ｕ／ｍｌ ホスホリパーゼＡ１ ２．０Ｕ／ｍｌ ホスホリパーゼＡ２ ２．０Ｕ／ｍｌ グリセロホスホリルコリンホスホ−ジエステラーゼ ０．６Ｕ／ｍｌ ＮＡＤＨ ０．５ｍＭ フェノール ０．０５％ アスコルビン酸オキシダーゼ ３Ｕ／Ｌ ｐＨ ８．０

【００４７】 試薬−２ リン酸緩衝液 ２０ｍｍｏｌ／Ｌ グリセロ−３−リン酸オキシダーゼ ２００Ｕ／ｍｌ ＰＯＤ １０Ｕ／ｍｌ ４−アミノアンチピリン ２．０ｍＭ ｐＨ ７．５

【００４８】その結果、腎障害患者の尿中コレステロー
ルおよびリン脂質の濃度は、正常人に比べて明らかに高
値であることが判り、少なくとも尿中のコレステロール
および／またはリン脂質を測定することにより、腎障害
の検査が可能となることが示唆された。

【００４９】

【００５０】

【実施例３】１２２例の尿検体（ＩｇＡ腎症［ＩｇＡ
Ｎ］５１例、糖尿病性腎症［ＤＭＮ］１０例、糸球体硬
化症［Ｎｅｐｈｒｏｓｃｒｅｌｏｓｉｓ］９例、膜性腎
症［ＭＮ］６例、膜性増殖性糸球体腎炎［ＭＰＧＮ］７
例、急速進行性腎症［ＲＰＧＮ］１２例、微小変化型ネ
フロ−ゼ症候群［ＭＣＮ］３例、巣状糸球体硬化症［Ｆ
ＧＳ］１２例、慢性腎不全［ＣＲＦ］ ５例、正常７
例）中のリン脂質、遊離コレステロ−ル、コレステロ−
ル、アポＡ−Ｉの濃度を測定した。

【００５１】その結果を図１〜５に示した。、これらの
何れの脂質関連マーカーも、上記の腎障害のいずれかの
疾患群で正常尿に比して有意に高値を示すことが判り、
尿中の脂質成分を測定することにより、腎障害を検査、
診断することが可能であることが明かになった。また、
別途、堀田らが報告しているオイルレッドＯ陽性パ−テ
ィクル（尿中脂肪球）の個数（５ｍＬ中）を測定した
（Takashi Oda,Osamu Hotta et al.Kidney Internation
al ,Vol.53,1190-1200,1998.）。

【００５２】尿中脂肪球は、ＩｇＡＮ、ＲＰＧＮ、ＦＧ
Ｓで特に高値を示したが、逆に、ＭＣＮなどでは正常尿
と変わらない。それに比して、本発明の方法ではＩｇＡ
Ｎ、ＲＰＧＮ、ＦＧＳのみならず、他の腎障害をも感度
良く検出できることが判り、本発明の有用性が確かめら
れた。

【００５３】なお、コレステロ−ルの測定は実施例１に
示す方法、リン脂質の測定は実施例２に示す方法、遊離
コレステロ−ルの測定は実施例１に示す試薬−１からコ
レステロールエステラーゼを除いたほかは、実施例１と
同様の操作を行い測定を行った。

【００５４】アポＡ−Ｉの測定は、アポＡ−Ｉ免疫試薬
・ＮＤ「コクサイ」を用いて測定を行った。

【００５５】尿は予め１０％トリトンＸ−１００と９：
１の割合で混合し、尿検体とした。尿検体１０μＬ、１
６０μＬの第一試薬、４０μＬの第二試薬の試薬検体比
で測定した以外は取扱説明書に準じて操作を行った。

【００５６】

【実施例４】定期健康診断受診者から採取された尿検体
１７５例を用いて、尿中コレステロールを実施例１に記
載の方法によって測定し、健常人の尿中コレステロール
の参照値を求めた。健常人の血清中のコレステロール値
は通常１３０〜２５０ｍｇ／ｄＬであるのに対して、尿
中コレステロールの値は、血清コレステロール値の１０
００分の１以下で０．０１〜０．２５ｍｇ／ｄＬであっ
た。

【００５７】 対照として、市販の血清中コレステロール
測定キットを用いて、測定したが、何れの検体もコレス
テロールを測定することはできなかった。このことか
ら、尿中コレステロールの測定は、本発明の実施例１に
記載された方法等を用いる高感度測定法が必要であるこ
とがわかった。

【００５８】

【実施例５】正常人の尿と腎障害患者の尿中のコレステ
ロールについて、ＨＰＬＣおよび電気泳動により分析を
行った。

【００５９】（試料の調製）限外ろ過を用いて尿の濃縮
を行った。正常尿は約１３０倍、患者尿は約１０倍に濃
縮を行った。

【００６０】（実験例１：ＨＰＬＣによる分析）カラム
は Superose 6(直径1.0cm×30cm)およびSuperose 12
（直径1.0cm×30cm）（ファルマシア）を直列で用い
た。また、緩衝液は10mM Tris-HCl buf. pH 7.5(0.14M
NaCl, 1.0mM EDTA-2Na, 0.1% NaN3含有)を用い、流速は
0.3mL/minで送液を行った。上記で調製した試料100μL
をインシ゛ェクションし、また標品として血清30μLをインシ゛ェクション
した。２分おきに分画し、各フラクションのコレステロ
ール濃度を測定した。測定は、実施例１に示す方法で測
定を行った。

【００６１】その結果を図６〜図８に示した。図６およ
び図８に示すように、腎障害患者の尿には血清ＨＤＬ画
分と同じ保持時間の位置にピークが見られたことから、
ＨＤＬと同じ分子サイズの脂質画分が含まれていること
が示唆された。また図６および図７に示すように、正常
尿は血清ＶＬＤＬ画分よりも更に大きな分子サイズのと
ころにピークがあり、細胞からの剥離などが考えられ
た。

【００６２】（実験例２：電気泳動による分析）システ
ムとしてヘレナ研究所のコレトリコンボを使用し、アガ
ロースゲルを用いて電気泳動を行った。

【００６３】正常および患者尿は原点から泳動されなか
った。この事は表面電荷がないことを意味しており、表
面タンパク質の修飾が考えられた。糸球体の基底膜は電
荷バリア−で血中タンパク質などの漏出を抑えている。
しかし、ＨＤＬが疾患により修飾を受け電荷を失ったと
考えると、基底膜を通過することができる。こうした修
飾の多くは酸化が主たる要因であり、酸化リポタンパク
質が、尿細管上皮細胞に接着して細胞毒性を示すことが
考えられた。

【００６４】

【実施例６】（治療前・治療後の尿成分の比較）腎疾患
患者（ＲＰＧＮ）の治療前、治療後の尿中の微量コレス
テロール（ｍＣＨＯ）および尿中成分または血清中のク
レアチニンを測定した。また、尿中の成分についてはク
レアチニン補正を行った。

【００６５】コレステロールは実施例１に示す方法、ア
ポＡ−Ｉの測定はアポＡ−Ｉオート「第一」、アルブミ
ンはｍ−ＡＬＢ免疫試薬（国際試薬社製）、蛋白質の測
定はｍ−ＴＰ試薬（国際試薬社製）、Ｎ−アセチルβ−
Ｄ−グルコサミナダーゼ（ＮＡＧ）は、Ｎ−アッセイ
ＮＡＧ「ニットボー」（日東紡績社製）、クレアチニン
はＣＲＥ試薬・ＬＢ「コクサイ」（国際試薬社製）を用
いて測定した。また、尿は予め２０％トリトンＸ−１０
０と５０：１の割合で混合した。

【００６６】その結果を図９〜図１３に示した。アポＡ
−Ｉは治療後においては検出されなかったが、他の腎疾
患マーカーであるクレアチニン、ＮＡＧ、ＴＰ、ＡＬＢ
は治療後であっても検出されており、アポＡ−Ｉは他の
マーカーとは異なった側面から腎障害の検査が可能とな
ることが示唆された。

【００６７】

【発明の効果】以上説明したように本発明の検査手段に
より、より確実な腎障害の検査が可能となった。

【図面の簡単な説明】

【図１】尿中脂質関連マーカー（オイルレッド陽性粒
子）と疾患との関係を示す図である。（実施例３）

【図２】尿中脂質関連マーカー（遊離コレステロール）
と疾患との関係を示す図である。（実施例３）

【図３】尿中脂質関連マーカー（アポＡ−Ｉ）と疾患と
の関係を示す図である。（実施例３）

【図４】尿中脂質関連マーカー（リン脂質）と疾患との
関係を示す図である。（実施例３）

【図５】尿中脂質関連マーカー（全コレステロール）と
疾患との関係を示す図である。（実施例３）

【図６】コレステロール標品のＨＰＬＣ分析結果を示す
図である。〈実施例５）

【図７】濃縮正常尿のＨＰＬＣ分析結果を示す図であ
る。〈実施例５）

【図８】腎疾患患者尿のＨＰＬＣ分析結果を示す図であ
る。〈実施例５）

【図９】 腎疾患患者の治療前、治療後の尿中のｍＣＨ
Ｏおよび血清中のクレアチニンの測定値を示す図であ
る。〈実施例６）

【図１０】 腎疾患患者の治療前、治療後の尿中のｍＣ
ＨＯおよび尿中Ｎ−アセチルβ−Ｄ−グルコサミニダー
ゼの測定値を示す図である。〈実施例６）

【図１１】 腎疾患患者の治療前、治療後の尿中のｍＣ
ＨＯおよび尿中タンパク質の測定値を示す図である。
〈実施例６）

【図１２】 腎疾患患者の治療前、治療後の尿中のｍＣ
ＨＯおよび尿中アルブミンの測定値を示す図である。
〈実施例６）

【図１３】 腎疾患患者の治療前、治療後の尿中のｍＣ
ＨＯおよび尿中アポＡ−Ｉの測定値を示す図である。
〈実施例６）

【符号の説明】

（図１〜５について） １：ＩｇＡ腎症疾患 ２：糖尿病性腎症疾患 ３：糸球体硬化症疾患 ４：膜性腎症疾患 ５：膜性増殖性糸球体腎炎疾患 ６：急速進行性腎症疾患 ７：微小変化型ネフローゼ症候群疾患 ８：単状糸球体硬化症疾患 ９：慢性腎不全疾患 １０：正常 （図９〜１３について） ●：アポＡ−Ｉ陰性患者についての測定値 ○：アポＡ−Ｉ陽性患者についての測定値

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/92 Ｇ０１Ｎ 33/92 Ａ Ｆターム(参考） 2G045 AA16 AA25 CB03 DA36 DA62 DA69 FA26 FA29 FB01 FB03 FB05 FB06 GC10 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ70 QQ76 QQ79 QR12 QR15 QR41 QR42 QR48 QR50 QR52 QS28 QX01

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】尿中のリポタンパク質若しくはその類縁
   体、またはこれらに含有される成分を測定することを特
   徴とする腎障害の検査手段。
2. 【請求項２】リポタンパク質若しくはその類縁体が、抗
   ヒトアポＡ−Ｉ抗体が反応しうるタンパク質または抗ヒ
   トアポＡ−II抗体が反応しうるタンパク質のいずれか１
   または両方を含有する物質であることを特徴とする請求
   項１に記載の検査手段。
3. 【請求項３】リポタンパク質若しくはその類縁体が、高
   比重リポタンパク質若しくはその類縁体であることを特
   徴とする請求項１または２に記載の検査手段。
4. 【請求項４】リポタンパク質若しくはその類縁体に含有
   される成分として、アポタンパク質を測定することを特
   徴とする請求項１〜３のいずれか１に記載の検査手段。
5. 【請求項５】リポタンパク質若しくはその類縁体に含有
   される成分として、抗ヒトアポＡ−Ｉ抗体が反応しうる
   タンパク質または抗ヒトアポＡ−II抗体が反応しうるタ
   ンパク質から選択される１または両方を測定することを
   特徴とする請求項１〜４のいずれか１に記載の検査手
   段。
6. 【請求項６】尿中の抗ヒトアポＡ−Ｉ抗体が反応しうる
   タンパク質または抗ヒトアポＡ−II抗体が反応しうるタ
   ンパク質から選択される１または両方を測定することを
   特徴とする腎障害の検査手段。
7. 【請求項７】さらに脂質成分を測定することを特徴とす
   る請求項１〜６のいずれか１に記載の検査手段。
8. 【請求項８】脂質成分がコレステロールであることを特
   徴とする請求項７に記載の検査手段。
9. 【請求項９】請求項１〜８のいずれか１に記載の検査に
   必要な試薬をキット化または単品で構成してなる検査用
   試薬。