JP3107492B2 - リポ蛋白分画中の成分の定量方法 - Google Patents
リポ蛋白分画中の成分の定量方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、血清、血漿などの生体
試料中のリポ蛋白の特定分画に含まれる成分を定量する
方法に関し、とりわけ臨床検査での使用を目的とするＬ
ＤＬ分画中のコレステロール等の定量方法に関する。
試料中のリポ蛋白の特定分画に含まれる成分を定量する
方法に関し、とりわけ臨床検査での使用を目的とするＬ
ＤＬ分画中のコレステロール等の定量方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】血液中で脂質はアポ蛋白と結合し、リポ
蛋白を形成して代謝される。リポ蛋白は比重によって通
常、カイロミクロン（ＣＭ）、超低比重リポ蛋白（ＶＬ
ＤＬ）、低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）、高比重リポ蛋白
（ＨＤＬ）等の分画に分類される。そして種々の疾病の
要因がこれらリポ蛋白の代謝に影響を与え、リポ蛋白分
画の血中での増加や減少につながっている。このうちＬ
ＤＬは血管壁へのコレステロールの蓄積に関与して動脈
硬化作用を示すことが知られており、ＬＤＬ分画中のコ
レステロールは一般に悪玉コレステロールと呼ばれ、動
脈硬化症や虚血性心疾患などの予防や診断のために測定
される。
蛋白を形成して代謝される。リポ蛋白は比重によって通
常、カイロミクロン（ＣＭ）、超低比重リポ蛋白（ＶＬ
ＤＬ）、低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）、高比重リポ蛋白
（ＨＤＬ）等の分画に分類される。そして種々の疾病の
要因がこれらリポ蛋白の代謝に影響を与え、リポ蛋白分
画の血中での増加や減少につながっている。このうちＬ
ＤＬは血管壁へのコレステロールの蓄積に関与して動脈
硬化作用を示すことが知られており、ＬＤＬ分画中のコ
レステロールは一般に悪玉コレステロールと呼ばれ、動
脈硬化症や虚血性心疾患などの予防や診断のために測定
される。
【０００３】従来ＬＤＬ分画の測定法としては、沈澱
法、超遠心法、電気泳動法等が知られている。沈澱法は
ポリアニオンなどの沈澱剤を用いて分別沈澱させ、ＬＤ
Ｌ分画を測定するものであるが、超遠心法、電気泳動法
と同様に操作が非常に繁雑であり、臨床検査の分野で汎
用されている自動分析装置では利用できないという欠点
がある。また１価のカチオンを有するポリビニルスルフ
ェートを添加する方法（特開昭５８−４５５６２号）も
あるが、やはり自動分析装置を利用することができな
い。
法、超遠心法、電気泳動法等が知られている。沈澱法は
ポリアニオンなどの沈澱剤を用いて分別沈澱させ、ＬＤ
Ｌ分画を測定するものであるが、超遠心法、電気泳動法
と同様に操作が非常に繁雑であり、臨床検査の分野で汎
用されている自動分析装置では利用できないという欠点
がある。また１価のカチオンを有するポリビニルスルフ
ェートを添加する方法（特開昭５８−４５５６２号）も
あるが、やはり自動分析装置を利用することができな
い。
【０００４】特定分画に含まれる成分として臨床検査の
分野では種々のものが確認されているが、とりわけ、コ
レステロール、トリグリセライド、リン脂質などがよく
知られている。このうちで例えばコレステロールを定量
する場合のコレステロール定量には、近年緩和な条件で
使用でき、また反応の特異性が高い酵素法と呼ばれてい
る酵素反応を用いる方法がもっぱら使用されている。こ
れは、コレステロールエステラーゼ（ＣＥ）とコレステ
ロールオキシダーゼ（ＣＯ）にパーオキシダーゼ（ＰＯ
Ｄ）と色原体を組合せて可視領域での吸光度を測定する
方法と、ＣＥとコレステロール脱水素酵素（ＣＨＤ）に
補酵素を組合せて紫外領域での吸光度を測定する方法に
大別できる。
分野では種々のものが確認されているが、とりわけ、コ
レステロール、トリグリセライド、リン脂質などがよく
知られている。このうちで例えばコレステロールを定量
する場合のコレステロール定量には、近年緩和な条件で
使用でき、また反応の特異性が高い酵素法と呼ばれてい
る酵素反応を用いる方法がもっぱら使用されている。こ
れは、コレステロールエステラーゼ（ＣＥ）とコレステ
ロールオキシダーゼ（ＣＯ）にパーオキシダーゼ（ＰＯ
Ｄ）と色原体を組合せて可視領域での吸光度を測定する
方法と、ＣＥとコレステロール脱水素酵素（ＣＨＤ）に
補酵素を組合せて紫外領域での吸光度を測定する方法に
大別できる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】前述のように従来のＬ
ＤＬ分画の測定法では、自動分析装置への応用ができな
い。沈殿法は遠心分離による試料の分取工程が必要なた
めマルチチャンネルによる自動測定ができないことに加
え、分取時に誤ってコンタミネーションを起す危険性も
含んでいる。本発明の目的は、上述の問題点を改良し
て、試料の分取工程を必要としない、生体試料中のリポ
蛋白の特定分画に含まれる成分を自動分析装置により定
量することができる方法を提供することにあり、とりわ
け、臨床検査におけるＬＤＬ分画中のコレステロールの
有用な定量方法を提供することにある。
ＤＬ分画の測定法では、自動分析装置への応用ができな
い。沈殿法は遠心分離による試料の分取工程が必要なた
めマルチチャンネルによる自動測定ができないことに加
え、分取時に誤ってコンタミネーションを起す危険性も
含んでいる。本発明の目的は、上述の問題点を改良し
て、試料の分取工程を必要としない、生体試料中のリポ
蛋白の特定分画に含まれる成分を自動分析装置により定
量することができる方法を提供することにあり、とりわ
け、臨床検査におけるＬＤＬ分画中のコレステロールの
有用な定量方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意研究し
た結果、特定のリポ蛋白分画を凝集させ、特定のリポ蛋
白以外のリポ蛋白分画に含まれ当該定量すべき特定のリ
ポ蛋白分画に含まれる成分と同じ成分を定量反応に関与
しない別の反応系に導けば、その間特定のリポ蛋白自体
は凝集しているため、この別の反応には作用しないこと
を見い出した。そして更に研究を重ねた結果、この後特
定のリポ蛋白分画を少なくとも定量反応できる程度に解
凝集して、当該成分を定量反応に付し、更に場合によっ
ては定量反応を測定できる程度に特定のリポ蛋白分画を
溶解して定量反応を停止できることがわかった。そして
この定量反応により生じた変化、すなわち該成分又は該
試薬の濃度変化、反応により生じた生成物、たとえば吸
光又は発光物質の濃度などを測定することにより、前述
の問題が解決でき、本発明の目的が達成できることがわ
かり、本発明を完成するに至った。
た結果、特定のリポ蛋白分画を凝集させ、特定のリポ蛋
白以外のリポ蛋白分画に含まれ当該定量すべき特定のリ
ポ蛋白分画に含まれる成分と同じ成分を定量反応に関与
しない別の反応系に導けば、その間特定のリポ蛋白自体
は凝集しているため、この別の反応には作用しないこと
を見い出した。そして更に研究を重ねた結果、この後特
定のリポ蛋白分画を少なくとも定量反応できる程度に解
凝集して、当該成分を定量反応に付し、更に場合によっ
ては定量反応を測定できる程度に特定のリポ蛋白分画を
溶解して定量反応を停止できることがわかった。そして
この定量反応により生じた変化、すなわち該成分又は該
試薬の濃度変化、反応により生じた生成物、たとえば吸
光又は発光物質の濃度などを測定することにより、前述
の問題が解決でき、本発明の目的が達成できることがわ
かり、本発明を完成するに至った。
【０００７】即ち本発明は、生体試料中の特定のリポ蛋
白分画に含まれる成分を直接定量する方法であって、特
定のリポ蛋白分画を凝集させ、特定のリポ蛋白分画以外
のリポ蛋白分画に含まれ当該定量すべき特定のリポ蛋白
分画に含まれる成分と同じ成分を定量反応に関与しない
別の反応系に導き、特定のリポ蛋白分画を少なくとも定
量反応できる程度に解凝集して、当該成分を定量反応に
付し、定量反応により生じた変化を測定することを特徴
とするリポ蛋白分画に含まれる成分の定量方法を提供す
るものである。また、本発明は、低比重リポ蛋白（ＬＤ
Ｌ）を含有する試料から、選択的にＬＤＬ以外のリポ蛋
白中のコレステロールを定量反応に関与しない別の反応
系に導いた後、ＬＤＬ中のコレステロールに対して酵素
反応を作用させて、反応によって発生する反応生成物を
定量することを特徴とするＬＤＬ中のコレステロールの
定量法を提供するものである。 ここにおいて、コレステ
ロールに対して酵素反応を作用させるに際し、ＬＤＬ中
のコレステロールを反応可能にする試薬を存在させるこ
とができる。 また、ＬＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステ
ロールを定量反応に関与しない別の反応系に導く方法
が、少なくともＬＤＬを選択的に凝集させ凝集体を生成
することができる試薬を添加することによって、コレス
テロールに対して酵素反応を作用させることができる。
白分画に含まれる成分を直接定量する方法であって、特
定のリポ蛋白分画を凝集させ、特定のリポ蛋白分画以外
のリポ蛋白分画に含まれ当該定量すべき特定のリポ蛋白
分画に含まれる成分と同じ成分を定量反応に関与しない
別の反応系に導き、特定のリポ蛋白分画を少なくとも定
量反応できる程度に解凝集して、当該成分を定量反応に
付し、定量反応により生じた変化を測定することを特徴
とするリポ蛋白分画に含まれる成分の定量方法を提供す
るものである。また、本発明は、低比重リポ蛋白（ＬＤ
Ｌ）を含有する試料から、選択的にＬＤＬ以外のリポ蛋
白中のコレステロールを定量反応に関与しない別の反応
系に導いた後、ＬＤＬ中のコレステロールに対して酵素
反応を作用させて、反応によって発生する反応生成物を
定量することを特徴とするＬＤＬ中のコレステロールの
定量法を提供するものである。 ここにおいて、コレステ
ロールに対して酵素反応を作用させるに際し、ＬＤＬ中
のコレステロールを反応可能にする試薬を存在させるこ
とができる。 また、ＬＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステ
ロールを定量反応に関与しない別の反応系に導く方法
が、少なくともＬＤＬを選択的に凝集させ凝集体を生成
することができる試薬を添加することによって、コレス
テロールに対して酵素反応を作用させることができる。
【０００８】本発明で特定のリポ蛋白分画を凝集させる
には、凝集剤と抗体を用いるのが好適である。ここで凝
集剤とは、化学反応によって凝集を惹起させるものであ
り、また抗体とは、特定のリポ蛋白分画に対する抗体で
あって、免疫凝集反応を生じさせるものである。このよ
うな凝集剤と抗体は、凝集させる分画によって単独で用
いたり又はどちらかを先に加えた後で他を加えたり、同
時に加えたりして組合せて用いることができる。このよ
うな凝集剤としては、本発明の目的が達成できるもので
あれば良く、例えば前述の沈澱法に用いられる沈澱剤の
ほか種々のものが利用できる。例えば血液中のリポ蛋白
のうちＬＤＬ分画を凝集させる目的では、ポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ）のほか、リンタングステン酸，デ
キストラン硫酸，ヘパリン等を単独で、又はＭg++，Ｍn
++，Ｃa++，Ｌi++，Ｎi++等のカチオンと組合せて用い
ることができる。
には、凝集剤と抗体を用いるのが好適である。ここで凝
集剤とは、化学反応によって凝集を惹起させるものであ
り、また抗体とは、特定のリポ蛋白分画に対する抗体で
あって、免疫凝集反応を生じさせるものである。このよ
うな凝集剤と抗体は、凝集させる分画によって単独で用
いたり又はどちらかを先に加えた後で他を加えたり、同
時に加えたりして組合せて用いることができる。このよ
うな凝集剤としては、本発明の目的が達成できるもので
あれば良く、例えば前述の沈澱法に用いられる沈澱剤の
ほか種々のものが利用できる。例えば血液中のリポ蛋白
のうちＬＤＬ分画を凝集させる目的では、ポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ）のほか、リンタングステン酸，デ
キストラン硫酸，ヘパリン等を単独で、又はＭg++，Ｍn
++，Ｃa++，Ｌi++，Ｎi++等のカチオンと組合せて用い
ることができる。
【０００９】また、抗体としては、本発明の目的が達成
できるものであれば良く、例えばリポ蛋白のＬＤＬ分画
を免疫凝集させる目的では、ＬＤＬ分画に対する抗体と
して、ＬＤＬ，アポＢ，β−リポ蛋白に対するポリクロ
ーナル抗体又はモノクローナル抗体の１種又は複数種を
用いることができる。
できるものであれば良く、例えばリポ蛋白のＬＤＬ分画
を免疫凝集させる目的では、ＬＤＬ分画に対する抗体と
して、ＬＤＬ，アポＢ，β−リポ蛋白に対するポリクロ
ーナル抗体又はモノクローナル抗体の１種又は複数種を
用いることができる。
【００１０】本発明で特定のリポ蛋白分画に含まれる成
分を検出し定量する目的で用いる試薬には、臨床検査な
どの分野で公知の試薬が利用できる。例えばコレステロ
ールを定量する目的では、前述の酵素法におけるＣＥ，
ＣＯ，ＰＯＤを用いた試薬が好ましい。
分を検出し定量する目的で用いる試薬には、臨床検査な
どの分野で公知の試薬が利用できる。例えばコレステロ
ールを定量する目的では、前述の酵素法におけるＣＥ，
ＣＯ，ＰＯＤを用いた試薬が好ましい。
【００１１】このような試薬を試料と定量反応させて当
該反応を停止させるまでの反応時間は用いる試薬により
異なる。反応を途中で停止させても終点で測定したもの
と定量値としては同じ結果が得られるものもあるが、通
常１〜６０分間から選択でき、例えばコレステロールを
定量するためにＣＥ，ＣＯ，ＰＯＤを用いた場合は一般
に２〜３０分間から選択できる。
該反応を停止させるまでの反応時間は用いる試薬により
異なる。反応を途中で停止させても終点で測定したもの
と定量値としては同じ結果が得られるものもあるが、通
常１〜６０分間から選択でき、例えばコレステロールを
定量するためにＣＥ，ＣＯ，ＰＯＤを用いた場合は一般
に２〜３０分間から選択できる。
【００１２】本発明で当該定量反応を停止させるには公
知の方法が利用できるが、例えば酵素法による場合はそ
の酵素を阻害させるための阻害剤を用いることもでき
る。このような阻害剤としては、重金属，防腐剤，蛋白
変性剤，界面活性剤等から選択できる。ＣＥ，ＣＯ，Ｐ
ＯＤを用いたコレステロールの定量では、アジ化ナトリ
ウム，グアニジン塩酸等を例としてあげることができ
る。
知の方法が利用できるが、例えば酵素法による場合はそ
の酵素を阻害させるための阻害剤を用いることもでき
る。このような阻害剤としては、重金属，防腐剤，蛋白
変性剤，界面活性剤等から選択できる。ＣＥ，ＣＯ，Ｐ
ＯＤを用いたコレステロールの定量では、アジ化ナトリ
ウム，グアニジン塩酸等を例としてあげることができ
る。
【００１３】定量反応を停止する代わりに、定量反応が
飽和した後に成分を検出してもよく、あるいは、反応の
開始から一定時間後に成分を検出し、予め作成された検
量線を用いて成分の量を測定してもよい。
飽和した後に成分を検出してもよく、あるいは、反応の
開始から一定時間後に成分を検出し、予め作成された検
量線を用いて成分の量を測定してもよい。
【００１４】本発明で特定のリポ蛋白分画に含まれる成
分と同じ成分を定量反応に関与しない別の反応系に導く
ための反応系としては種々のものをあげることができ
る。例えば前述のコレステロールを定量する目的でＣ
Ｅ，ＣＯ，ＰＯＤを用いた場合、これらの必要な酵素は
含むが発色に関与する試薬（色原体）の一部を除いたも
のを試薬として反応させると、無色の複合体を形成す
る。この後、目的とする定量反応を行うためＣＥ，Ｃ
Ｏ，ＰＯＤおよび色原体のすべてを反応させても、無色
の複合体はこれには関与しない。
分と同じ成分を定量反応に関与しない別の反応系に導く
ための反応系としては種々のものをあげることができ
る。例えば前述のコレステロールを定量する目的でＣ
Ｅ，ＣＯ，ＰＯＤを用いた場合、これらの必要な酵素は
含むが発色に関与する試薬（色原体）の一部を除いたも
のを試薬として反応させると、無色の複合体を形成す
る。この後、目的とする定量反応を行うためＣＥ，Ｃ
Ｏ，ＰＯＤおよび色原体のすべてを反応させても、無色
の複合体はこれには関与しない。
【００１５】この例としてリポ蛋白の特定分画を凝集さ
せたあとで、ＣＥ，ＣＯ，ＰＯＤおよび色原体としてＨ
ＤＡＯＳ（正式名：Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホ
プロピル）−３,５−ジメトキシアニリン）を作用させ
ると、特定のリポ蛋白分画以外のリポ蛋白分画に含まれ
る該成分であるコレステロールエステルとコレステロー
ルはＣＥ，ＣＯの作用により過酸化水素を発生し、これ
にＰＯＤとＨＤＡＯＳが反応して無色の複合体を形成す
る。このとき、特定のリポ蛋白分画自体は凝集している
ため、この反応には関与しない。次に特定のリポ蛋白分
画をＣＥとＣＯが作用できる程度に解凝集し、ＣＥ，Ｃ
Ｏ，ＰＯＤおよびＨＤＡＯＳと４−アミノアンチピリン
からなる定量用試薬を反応させると、特定のリポ蛋白分
画に含まれる該成分であるコレステロールエステルとコ
レステロールはＣＥ，ＣＯの作用により過酸化水素を発
生し、これにＰＯＤ，４−アミノアンチピリン、ＨＤＡ
ＯＳが反応して５８０ｎｍ付近の波長に極大吸収を有す
る色素を生成する。このとき、この反応の吸光度を測定
できる程度に凝集を溶解させ、吸光度を測定することに
より、特定のリポ蛋白分画に含まれるコレステロールが
定量できる。
せたあとで、ＣＥ，ＣＯ，ＰＯＤおよび色原体としてＨ
ＤＡＯＳ（正式名：Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホ
プロピル）−３,５−ジメトキシアニリン）を作用させ
ると、特定のリポ蛋白分画以外のリポ蛋白分画に含まれ
る該成分であるコレステロールエステルとコレステロー
ルはＣＥ，ＣＯの作用により過酸化水素を発生し、これ
にＰＯＤとＨＤＡＯＳが反応して無色の複合体を形成す
る。このとき、特定のリポ蛋白分画自体は凝集している
ため、この反応には関与しない。次に特定のリポ蛋白分
画をＣＥとＣＯが作用できる程度に解凝集し、ＣＥ，Ｃ
Ｏ，ＰＯＤおよびＨＤＡＯＳと４−アミノアンチピリン
からなる定量用試薬を反応させると、特定のリポ蛋白分
画に含まれる該成分であるコレステロールエステルとコ
レステロールはＣＥ，ＣＯの作用により過酸化水素を発
生し、これにＰＯＤ，４−アミノアンチピリン、ＨＤＡ
ＯＳが反応して５８０ｎｍ付近の波長に極大吸収を有す
る色素を生成する。このとき、この反応の吸光度を測定
できる程度に凝集を溶解させ、吸光度を測定することに
より、特定のリポ蛋白分画に含まれるコレステロールが
定量できる。
【００１６】この他の例として、定量反応とは異なる反
応で定量反応には関与しない反応系を用いることもでき
る。例えば、定量反応に前述のＣＥ，ＣＯ，ＰＯＤの酵
素反応を用いるとき、特定のリポ蛋白分画以外のリポ蛋
白分画の成分とはＣＥ，ＣＨＤ及びＮＡＤ+の反応系を
作用させ、ＮＡＤＨを生成させる反応系に導く。このあ
と、ＣＨＤを阻害させてこの反応が進行しないように
し、特定のリポ蛋白分画をＣＥ，ＣＯが作用できる程度
に解凝集し、ＣＥ，ＣＯ，ＰＯＤおよびＨＤＡＯＳと４
−アミノアンチピリンからなる定量用試薬により反応さ
せ、前述のようにこの反応の吸光度を測定できる程度に
凝集を溶解させ、吸光度を測定することにより、特定の
リポ蛋白分画に含まれるコレステロールが定量できる。
応で定量反応には関与しない反応系を用いることもでき
る。例えば、定量反応に前述のＣＥ，ＣＯ，ＰＯＤの酵
素反応を用いるとき、特定のリポ蛋白分画以外のリポ蛋
白分画の成分とはＣＥ，ＣＨＤ及びＮＡＤ+の反応系を
作用させ、ＮＡＤＨを生成させる反応系に導く。このあ
と、ＣＨＤを阻害させてこの反応が進行しないように
し、特定のリポ蛋白分画をＣＥ，ＣＯが作用できる程度
に解凝集し、ＣＥ，ＣＯ，ＰＯＤおよびＨＤＡＯＳと４
−アミノアンチピリンからなる定量用試薬により反応さ
せ、前述のようにこの反応の吸光度を測定できる程度に
凝集を溶解させ、吸光度を測定することにより、特定の
リポ蛋白分画に含まれるコレステロールが定量できる。
【００１７】本発明で凝集した特定のリポ蛋白分画を少
なくとも定量できる程度に解凝集させるには、溶解剤と
して界面活性剤、無機塩類などを単独又は複数種用いる
ことができる。溶解剤の例として、トリトンＸ，アデカ
トール，塩化ナトリウム，塩化カリウム等を挙げること
ができる。例えばＬＤＬ分画を凝集させたあと、少なく
とも定量できる程度に解凝集させるには、トリトンＸ−
１００を用いることができる。また、場合によっては定
量反応を測定できる程度に溶解させるには、溶解剤とし
て蛋白変性剤、界面活性剤、無機塩類などを単独又は複
数種用いることができる。その例として、グアニジンお
よびその塩を挙げることができる。
なくとも定量できる程度に解凝集させるには、溶解剤と
して界面活性剤、無機塩類などを単独又は複数種用いる
ことができる。溶解剤の例として、トリトンＸ，アデカ
トール，塩化ナトリウム，塩化カリウム等を挙げること
ができる。例えばＬＤＬ分画を凝集させたあと、少なく
とも定量できる程度に解凝集させるには、トリトンＸ−
１００を用いることができる。また、場合によっては定
量反応を測定できる程度に溶解させるには、溶解剤とし
て蛋白変性剤、界面活性剤、無機塩類などを単独又は複
数種用いることができる。その例として、グアニジンお
よびその塩を挙げることができる。
【００１８】
【発明の作用および効果】本発明の方法では、特定のリ
ポ蛋白分画を凝集させ、定量を目的としないリポ蛋白分
画に含まれる成分は定量反応に関与しない反応系に導
き、特定のリポ蛋白分画を少なくとも定量反応できる程
度に解凝集して定量反応させ、更に場合によっては定量
反応を測定できる程度に溶解して定量反応を停止させ、
この定量反応により生じた変化を測定するという操作を
連続的に行うことにより、従来困難であった臨床検査で
の自動分析装置を用いたマルチチャンネル化による測定
が可能となる。また定量用の試薬には公知の酵素を用い
ることができるため、反応時間を短縮でき、多検体処理
も可能である。
ポ蛋白分画を凝集させ、定量を目的としないリポ蛋白分
画に含まれる成分は定量反応に関与しない反応系に導
き、特定のリポ蛋白分画を少なくとも定量反応できる程
度に解凝集して定量反応させ、更に場合によっては定量
反応を測定できる程度に溶解して定量反応を停止させ、
この定量反応により生じた変化を測定するという操作を
連続的に行うことにより、従来困難であった臨床検査で
の自動分析装置を用いたマルチチャンネル化による測定
が可能となる。また定量用の試薬には公知の酵素を用い
ることができるため、反応時間を短縮でき、多検体処理
も可能である。
【００１９】更に従来の沈澱法では遠心分離の上清を検
体とするため余分な量の試料が必要で、試料である血清
等も多く必要であるが、本発明の方法では試料を直接検
体とするため検体量の微量化が可能で、多項目同時測定
に適している。加えて、本発明の方法では光学的な測定
が可能なため、臨床検査の分野で汎用されている多くの
分析装置へ応用ができる等、本発明の方法は臨床検査に
極めて有用な効果を奏するものである。
体とするため余分な量の試料が必要で、試料である血清
等も多く必要であるが、本発明の方法では試料を直接検
体とするため検体量の微量化が可能で、多項目同時測定
に適している。加えて、本発明の方法では光学的な測定
が可能なため、臨床検査の分野で汎用されている多くの
分析装置へ応用ができる等、本発明の方法は臨床検査に
極めて有用な効果を奏するものである。
【００２０】
【実施例】以下、本発明をより詳細に説明するために実
施例をあげるが、本発明はこれらに限定されるものでは
ない。実施例１ 本発明の方法で、ＬＤＬ分画中のコレステロールを定量
する例を示す。まず次の試薬を準備した。 試薬１（Ｒ１）：抗ヒトアポＢヤギ血清 試薬２（Ｒ２）：２０％ＰＥＧ４０００，１３単位／ml
ＣＥ，１３単位／mlＣＯ，１.０単位／ml ＰＯＤ，０.
２mg／ml Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピ
ル）−３,５−ジメトキシアニリン，０.０５％トリトン
Ｘ−１００ 試薬３（Ｒ３）：１％トリトンＸ−１００，０.１１mg
／ml ４−アミノアンチピリン色原体 試薬４（Ｒ４）：７Ｍ−グアニジン塩酸，１Ｍ−グアニ
ジンチオシアネート塩
施例をあげるが、本発明はこれらに限定されるものでは
ない。実施例１ 本発明の方法で、ＬＤＬ分画中のコレステロールを定量
する例を示す。まず次の試薬を準備した。 試薬１（Ｒ１）：抗ヒトアポＢヤギ血清 試薬２（Ｒ２）：２０％ＰＥＧ４０００，１３単位／ml
ＣＥ，１３単位／mlＣＯ，１.０単位／ml ＰＯＤ，０.
２mg／ml Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピ
ル）−３,５−ジメトキシアニリン，０.０５％トリトン
Ｘ−１００ 試薬３（Ｒ３）：１％トリトンＸ−１００，０.１１mg
／ml ４−アミノアンチピリン色原体 試薬４（Ｒ４）：７Ｍ−グアニジン塩酸，１Ｍ−グアニ
ジンチオシアネート塩
【００２１】上述の試薬を用いて、ＬＤＬ分画中のコレ
ステロールが１５８.４mg／dlの高値ヒト血清（Ｓ）を
希釈して系列を作り、それを検体にして日立７０７０形
自動分析装置で図１のパターンにより測定し、各希釈系
列をグラフにした。その結果を図２に示す。この結果か
ら、本発明の方法によればＬＤＬ分画中のコレステロー
ルを直線性よく定量できることがわかる。
ステロールが１５８.４mg／dlの高値ヒト血清（Ｓ）を
希釈して系列を作り、それを検体にして日立７０７０形
自動分析装置で図１のパターンにより測定し、各希釈系
列をグラフにした。その結果を図２に示す。この結果か
ら、本発明の方法によればＬＤＬ分画中のコレステロー
ルを直線性よく定量できることがわかる。
【００２２】実施例２ 本発明の方法で、ＬＤＬ分画中のコレステロールを定量
し、従来の方法での定量結果と比較した。本発明の方法
に従い、実施例１の試薬を用いて、同様に新鮮なヒト血
清（Ｓ）を検体にして日立７０７０形自動分析装置で図
１のパターンにより測定し、標準液の測定値からＬＤＬ
分画中のコレステロールの定量法［クリニカル・ケミス
トリー（Clin. Chem. ）１８, ４９９, １９７２］によ
り、これらの血清中のＬＤＬ分画中のコレステロールを
定量した結果と比較した。その結果を表１に示す。
し、従来の方法での定量結果と比較した。本発明の方法
に従い、実施例１の試薬を用いて、同様に新鮮なヒト血
清（Ｓ）を検体にして日立７０７０形自動分析装置で図
１のパターンにより測定し、標準液の測定値からＬＤＬ
分画中のコレステロールの定量法［クリニカル・ケミス
トリー（Clin. Chem. ）１８, ４９９, １９７２］によ
り、これらの血清中のＬＤＬ分画中のコレステロールを
定量した結果と比較した。その結果を表１に示す。
【００２３】この結果から、本発明の方法によれば、従
来のフリーデワルド法と測定値がよく相関しており（相
関係数 ｒ＝０.９８７）、ＬＤＬ分画中のコレステロー
ルが自動分析装置で定量できることがわかった。
来のフリーデワルド法と測定値がよく相関しており（相
関係数 ｒ＝０.９８７）、ＬＤＬ分画中のコレステロー
ルが自動分析装置で定量できることがわかった。
【００２４】
【表１】
【図１】 自動分析装置における検体および試薬投入パ
ターンを示す図。
ターンを示す図。
【図２】 実施例２の結果を示すグラフ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭63−18269（ＪＰ，Ａ) 特表 平７−501945（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/92 C12Q 1/60
Claims (5)
- 【請求項１】 生体試料中の特定のリポ蛋白分画に含ま
れる成分を直接定量する方法であって、選択的にリポ蛋
白分画を凝集させ、この凝集物を分離することなく分散
状態のまま、凝集された以外のリポ蛋白分画に含まれる
当該定量すべき特定のリポ蛋白分画に含まれる成分と同
じ成分を定量反応に関与しない別の反応系に導き、その
後特定のリポ蛋白分画を少なくとも定量反応できる程度
に解凝集して、当該成分を定量反応に付し、定量反応に
より生じた変化を測定することを特徴とするリポ蛋白分
画に含まれる成分の定量方法。 - 【請求項２】 選択的にリポ蛋白分画を凝集させる凝集
剤が、ポリエチレングリコール、リンタングステン酸、
デキストラン硫酸、へパリンを単独、又はこれらのいず
れかとＭｇ ＋＋ ，Ｍｎ ＋＋ ，Ｃａ ＋＋ ，Ｌｉ ＋＋ ，Ｎｉ
＋＋ 等のカチオンとの組合せ、又はＬＤＬ若しくはアポ
Ｂ若しくはβ−リポ蛋白に対する抗体から選ばれる請求
項１に記載のリポ蛋白分画に含まれる成分の定量方法。 - 【請求項３】 特定のリポ蛋白分画が低比重リポ蛋白
（ＬＤＬ）であり、定量すべき特定のリポ蛋白分画（Ｌ
ＤＬ）に含まれる成分がコレステロールである請求項１
又は２に記載の定量方法。 - 【請求項４】 低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）を含有する試
料から、選択的に少なくともＬＤＬを含むリポ蛋白を凝
集させ、凝集物を分離することなく分散状態のまま、凝
集されなかったリポ蛋白中のコレステロールを消化する
ことによって、これら凝集されなかたリポ蛋白中のコレ
ステロールを定量反応に関与しない別の反応系に導くこ
とを特徴とする２種以上のリポ蛋白分画中のコレステロ
ールに対する酵素反応を分別的に進行させる方法。 - 【請求項５】 選択的に少なくともＬＤＬを含むリポ蛋
白を凝集させるためにポリエチレングリコール、リンタ
ングステン酸、デキストラン硫酸、へパリンを単独、又
はこれらのいずれかとＭｇ ＋＋ ，Ｍｎ ＋＋ ，Ｃａ ＋＋ ，
Ｌｉ ＋＋ ，Ｎｉ ＋＋ 等のカチオンとの組合せ、又はＬＤ
Ｌ若しくはアポＢ若しくはβ−リポ蛋白に対する抗体か
ら選ばれる凝集剤を使用することを特徴とする請求項４
の方法。
Priority Applications (2)
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|---|---|---|---|
| JP06066998A JP3107492B2 (ja) | 1994-04-05 | 1994-04-05 | リポ蛋白分画中の成分の定量方法 |
| EP95105024A EP0676642A1 (en) | 1994-04-05 | 1995-04-04 | Method for quantitatively analyzing a component in a lipoprotein fraction |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP06066998A JP3107492B2 (ja) | 1994-04-05 | 1994-04-05 | リポ蛋白分画中の成分の定量方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07280812A JPH07280812A (ja) | 1995-10-27 |
| JP3107492B2 true JP3107492B2 (ja) | 2000-11-06 |
Family
ID=13332192
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP06066998A Expired - Fee Related JP3107492B2 (ja) | 1994-04-05 | 1994-04-05 | リポ蛋白分画中の成分の定量方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0676642A1 (ja) |
| JP (1) | JP3107492B2 (ja) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3256241B2 (ja) * | 1995-03-16 | 2002-02-12 | 協和メデックス株式会社 | 低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量法 |
| CN1148891A (zh) * | 1995-03-20 | 1997-04-30 | 协和梅迪克斯株式会社 | 低密度脂蛋白中或极低密度脂蛋白中的胆甾醇的定量法 |
| CA2246308C (en) | 1996-12-09 | 2008-11-18 | Denka Seiken Co., Ltd. | Method for quantifying cholesterol in high-density lipoprotein |
| DE69737108T2 (de) | 1997-04-14 | 2007-07-05 | Denka Seiken Co., Ltd. | Methode zur quantifizierung von cholesterol in lipoproteinen geringer dichte |
| US5814472A (en) * | 1997-05-13 | 1998-09-29 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Measurement of LDL-cholesterol |
| JP4542234B2 (ja) * | 1999-06-21 | 2010-09-08 | 積水メディカル株式会社 | コレステロール定量用試料の前処理方法およびこれを利用する特定のリポ蛋白中のコレステロール定量法 |
| BR0012311B1 (pt) * | 1999-06-21 | 2012-12-11 | método e agente para tratamento prévio de amostra para quantificação de colesterol, método e kit para quantificação de colesterol em lipo-proteìnas especìficas usando o mesmo, método para a quantificação de colesterol livre e total. | |
| AU2001260714A1 (en) | 2000-06-07 | 2001-12-17 | International Reagents Corporation | Method of analyzing components in biological samples |
-
1994
- 1994-04-05 JP JP06066998A patent/JP3107492B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-04-04 EP EP95105024A patent/EP0676642A1/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0676642A1 (en) | 1995-10-11 |
| JPH07280812A (ja) | 1995-10-27 |
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