IT202000003287A1 - Uso di un estratto di erbe comprendente verbascoside e aucubina per il trattamento di osteoartrite del ginocchio - Google Patents

Description

DESCRIZIONE dell'invenzione avente per titolo:

"Uso di un estratto di erbe comprendente verbascoside e aucubina per il trattamento di osteoartrite del ginocchio"

La presente invenzione riguarda un estratto di erbe comprendente o, alternativamente, consistente di un estratto di almeno una pianta del genere Aloysia , preferibilmente Lippia citriodora (Palau) Kunth (verbena odorosa) e/o Verbena Officinalis L. (verbena comune), e un estratto di almeno una pianta del genere Plantago, preferibilmente Plantago lanceolata L. (piantaggine) e/o Plantago major L. (cinquenervia), comprendente, detto estratto di erbe, verbascoside e aucubina. Inoltre, la presente invenzione riguarda una composizione comprendente detto estratto di erbe e il suo uso come antinfiammatorio, analgesico e/o antispasmodico, preferibilmente per uso nel trattamento dell osteoartrite, quale l'osteoartrite del ginocchio. Infine, la presente invenzione riguarda un procedimento per la preparazione di detto estratto di erbe.

Per il trattamento di stati infiammatori e di dolore, quali ad esempio l'osteoartrite in generale o 1'osteoartrite del ginocchio in particolare, sono disponibili in commercio principalmente i tradizionali antinfiammatori steroidei (i.e. cortisone e derivati), che presentano gravi effetti collaterali, e gli antinfiammatori non steroidei (acronimo, FANS).

Il ginocchio ? la sede articolare pi? comunemente colpita in corso di osteoartrite sintomatica (in breve, OA) . L'osteoartrite del ginocchio, diagnosticata in oltre 250 milioni di persone in tutto il mondo, ha effetti significativi sulla funzionalit? del paziente e comporta costi sociali considerevoli in termini di morbilit?, ad esempio, perdita del lavoro e sostituzione articolare. I risultati del processo di osteoartrite sono la degradazione della cartilagine e l'infiammazione sinoviale; queste caratteristiche sono associate allo sviluppo di sintomi di dolore, rigidit? e disabilit? funzionale .

L'attuale trattamento dell'osteoartrite , in particolare osteoartrite del ginocchio, si basa sulla gestione dei sintomi e principalmente sul controllo del dolore. Le linee guida cliniche raccomandano l'uso di farmaci antinfiammatori non steroidei (in breve, FANS) in pazienti con sintomi persistenti. Sebbene i FANS tradizionali siano i farmaci pi? frequentemente prescritti per l'osteoartrite , sono caratterizzati da numerosi potenziali effetti avversi, tra cui sanguinamento gastrointestinale, effetti collaterali cardiovascolari e rischio di nefrotossicit?.

I FANS bloccano in maniera pi? o meno reversibile il sito di legame dell'enzima cicloossigenasi (COX). La cicloossigenasi ? un enzima coinvolto nel processo infiammatorio e porta alla produzione, a partire dall'acido arachidonico, di numerosi mediatori infiammatori (i.e. prostaglandine (PG), prostacicline (PC), trombossani (TX) e leucotrieni (LT)). La cicloossigenasi esiste in due isoforme: la COX-1, costitutivo dell?organismo, non coinvolto nel processo infiammatorio ma coinvolto nella produzione della protezione gastrica, e la COX-2, enzima inducibile, presente durante il processo infiammatorio e responsabile della sintesi dei mediatori infiammatori nella sede flogistica. I primi FANS sintetizzati, ancora oggi utilizzati, non hanno azione selettiva nei confronti delle due isoforme della COX, inibendole entrambe. Ci? spiega l?effetto antinfiammatorio dato dall'inibizione della COX-2 (l'enzima coinvolto nel processo flogistico) e rende conto degli effetti collaterali a livello gastrico, in quanto la soppressione dell'attivit? della COX-1 porta alla riduzione della sintesi di prostaglandine (PG) e, conseguentemente, dell'effetto protettivo delle prostaglandine (i.e. PGE2) sulla mucosa gastrica (le PGE inibiscono la produzione di HCl nello stomaco, favoriscono la produzione di muco e la secrezione di bicarbonato, che contrasta l'acidit? gastrica). In particolare, in caso di utilizzo di FANS per periodi prolungati o cronico si pu? avere danno gastrico, lesioni ulceroidi delle mucose, effetti collaterali cardiovascolari e nefrotossicit? indotta da NSADD.

Al fine di ridurre gli effetti collaterali dei FAMS, la ricerca farmacologica ha sviluppato inibitori selettivi della CQX-2 rispetto a CQX-1 (i.e celecoxib, etoricoxib, valdecoxib, firocoxib) . A causa dell'elevata similitudine strutturale tra le due isoforme di ciclossigenasi , C0X-1 e C0X-2, la selettivit? d'azione di questi farmaci nei confronti della C0X-2 non ? completa ma solo parziale, portando a una riduzione degli effetti collaterali a livello gastrico rispetto ai FANS non selettivi, ma non alla loro completa soppressione .

Il problema tecnico che la presente invenzione affronta e risolve ? quello di fornire una composizione naturale con effetti antiinfiammatori, analgesici e antispasmodici, priva di effetti collaterali, in particolare per il trattamento, preventivo e/o curativo, dell'osteoartrite delle articolazioni, quali ginocchio, anca, spalla, mano e/o cervicale, preferibilmente osteoartrite del ginocchio.

Inoltre, la presente invenzione ha lo scopo di fornire una composizione alternativa agli attuali trattamenti dell'osteoartrite (e.g. FANS), in particolare dell'osteoartrite del ginocchio, anca, spalla, mano e/o cervicale, preferibilmente osteoartrite dei ginocchio, che abbia efficacia analoga o superiore e non presenti gli effetti collaterali che potrebbero presentare i trattamenti attualmente in uso, quali i FANS (e.g. FANS COX-2 inibitori).

A seguito di una intensa e prolungata attivit? di ricerca, la Richiedente ha scoperto che composizioni comprendenti verbascoside e aucubina di origine naturale ottenute per estrazione di almeno una pianta del genere Aloysla, preferibilmente Lippia citriodora (verbena odorosa) e/o Verbena Officinalis (verbena comune), e almeno una pianta del genere Plantago, prefer?bilmente Plantago lanceolata (piantaggine) e/o Plantago major (cinquenervia) , sono efficaci come antinfiammatori, analgesici e antispastici. In particolare, dette composizioni o estratti di erbe (in breve, composizioni dell'invenzione e estratti di erbe dell'invenzione) agiscono come inibitori della cicloossigenasi-2 (COX-2), enzima coinvolto negli stati infiammatori, in modo selettivo rispetto alla cicloossigenasi-1 (COX-1). In aggiunta, detti estratti di erbe o composizioni dell'invenzione hanno propriet? antiossidanti.

Inoltre, le composizioni e gli estratti di erbe dell'invenzione non sono citotossici e sono privi di effetti collaterali, rendendo possibile la loro somministrazione ad un'ampia gamma di soggetti, tra cui anche soggetti pediatrici, anziani e donne in gravidanza .

In particolare, le composizioni e gli estratti di erbe dell'invenzione risultano potenzialmente privi di effetti collaterali in modo superiore rispetto ai FANS attualmente utilizzati nell'arte nota (e.g. FANS COX-2 inibitori) in quanto sono selettivi verso COX-2 e presentano propriet? antiossidanti.

Infine, gli estratti di erbe dell'invenzione sono di facile preparazione (i.e. procedimento di estrazione) ed economicamente vantaggiosi.

Questi scopi ed altri ancora, che risulteranno chiari dalla descrizione dettagliata che segue, sono raggiunti dagli estratti di erbe e dalle composizioni della presente invenzione grazie alle caratteristiche tecniche rivendicate nelle unite rivendicazioni.

FIGURE

Figura 1: cromatogramma HPLC a lunghezza d'onda di ?=330 nm per il verbascoside nell'estratto di erbe dell'invenzione.

Figura 2: cromatogramma HPLC a lunghezza d'onda di ?=205 nm per l'aucubina nell'estratto di erbe dell'invenzione. Figura 3: analisi dell'espressione COX-2 mediante RT-PCR.

Figura 4: inuminodosaggio PGE2.

Figura 5: studio clinico, confronto delle variazioni del punteggio totale dell'indice WOMAC nei gruppi di VERBAScox<? >e celecoxib durante il periodo di studio di 2 settimane . Le barre di errore rappresentano deviazioni standard .

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE

Forma oggetto della presente invenzione un estratto di erbe (in breve, estratto di erbe dell'invenzione) comprendente o, alternativamente, consistente di un estratto di almeno una pianta del genere Aloysia , preferibilmente Lippia citriodora e/o Verbena Officinalis , e un estratto di almeno una pianta del genere Plantago, preferibilmente Plantago lanceolata e/o Plantago major, in cui detto estratto di erbe comprende in % in peso verbascoside compresa nell'intervallo da 1% a 50% e aucubina compresa nell'intervallo da 0,1% a 30%, in cui dette % sono rispetto al peso totale dell'estratto di erbe.

In una forma di realizzazione preferita, detto estratto di erbe dell'invenzione comprendente o, alternativamente, consistente di un estratto di Lippia citriodora e/o Verbena Officinalis e un estratto di Plantago lanceolata e/o Plantago major, in cui detto estratto di erbe comprende in % in peso verbascoside compresa nell'intervallo da 1% a 50% e aucubina compresa nell'intervallo da 0,1% a 30%, in cui dette % sono rispetto al peso totale dell'estratto di erbe.

In una forma di realizzazione maggiormente preferita, detto estratto di erbe dell'invenzione comprendente o, alternativamente, consistente di un estratto di Llppla citriodora e un estratto di Plantago lanceolata, in cui detto estratto di erbe comprende in % in peso verbascoside compresa nell'intervallo da 1% a 50% e aucubina compresa nell'intervallo da 0,1% a 30%, in cui dette % sono rispetto al peso totale dell'estratto di erbe .

In una forma di realizzazione preferita, detto estratto di erbe dell' invenzione, preferibilmente di Lippia citriodora e Plantago lanceolata, comprende in % in peso verbascoside compresa nell'intervallo da 2% a 25%, preferibilmente da 3% a 10%, pi? preferibilmente del 5 0,5%; e aucubina compresa nell'intervallo da 0,5% a 15% preferibilmente da 1% a 5%, pi? preferibilmente del 2 0,2%, in cui dette % sono rispetto al peso totale dell'estratto di erbe.

I contenuti di verbascoside e aucubina nell'estratto di erbe dell' invenzione in % in peso rispetto al peso totale dell'estratto possono essere determinati secondo tecniche note al tecnico del ramo; preferibilmente possono essere determinate mediante tecniche qualiquantitative di cromatografia liquida ad alta pressione o ad alta prestazione (HPLC) con rilevamento mediante DAD (diode-array detector) ad una lunghezza d'onda di ?-330 nm per il verbascoside e di ?-2 05 nm per l'aucubina (Figura 1 e Figura 2).

Nel contesto della presente invenzione, con il termine "Lippia citriodora" viene inteso la Lippia citriodora (Palau) Kunth o Aloysia citriodora Pa?au, comunemente chiamata "verbena odorosa" o "lemon verben", La Lippia citriodora ? una pianta arbustiva perenne del genere Aloysia della famiglia Verbenaceae dell'ordine Lamiales, da non confondere con la "verbena comune" o Verbena officinalis. Sinonimi di Lippia citriodora sono, inoltre, Aloysia triphylla, Verbena citriodora e Verbena triphyilla . La fitocomposizione di Lippia citriodora ? principalmente rappresentata da terpenoidi, ma sono presenti anche vari polifenol? tra cui il verbascoside.

Nel contesto della presente invenzione, con il termine "Verbena officinalis" viene inteso la Verbena officinalis L. (L. quale Carl Nilsson Linnaeus), pianta arbustiva perenne del genere Aloysia della famiglia Verbenaceae dell'ordine Lamiales, comunemente chiamata "verbena" o "verbena comune".

Il verbascoside (nome IUPAC [6?[2?(3,4? diidrossifenil )etossi]-5-idrossi -2-(idrossimetil )-4-(3,4,5-triidrossi-6-metilossan-2-il) ossiossan-3-il] (E)-3- (3,4-diidrossifenil)prop-2-enoato) , GAS nr 61276-17-3) ? un fenilpropanoide ampiamente distribuito nel regno vegetale, caratterizzato da un residuo di acido caffeico ed uno di idrossitirosolo legati ad un glucopiranoside ai lati opposti della catena zuccherina attraverso, rispettivamente, un legame estere e glicosidico. Pu? essere trovato in specie deli'ordine delle Lamia les, oppure pu? anche essere prodotto in colture di cellule vegetali. Il verbascoside {conosciuto anche come acteoside) ? un metabolita secondario prodotto dalla pianta (i.e. Lippia citriodora o Verbena officinalis ) come agente di difesa da parassiti ed insetti ed ? noto per il suo elevato potere antiossidante.

Nel contesto della presente invenzione, con il termine "Plantago lanceolata" viene inteso Plantago lanceolata L. (1753) (L. quale Cari N?isson Linnaeus), comunemente chiamata "piantaggine lanciuola" o "piantaggine". La Plantago lanceolata ? una pianta erbacea officinale perenne del genere Plantago della famiglia delle Plantaginaceae dell'ordine delle Lamiales.

Nel contesto della presente invenzione, con il termine "Plantago major" viene inteso Plantago major L. (1753) (L. quale Cari Nilsson Linnaeus), una pianta erbacea officinale perenne del genere Plantago della famiglia delle Plantaginaceae dell'ordine delle Lamiales. La Plantago major ? conosciuta con numerosi nomi comuni: ansoglossa, centonervi, cinquenervi, coda di topo, erba bruna, erba di cento nervi, erba dei sette nervi, lanciola, lingua di cane, lingua di pecora, lingua d'oca, mestolaccio, orecchio d'asino, orecchio di lepre, orecchiella, pentinervi, petacciola pelosa e tiratilo.

L'aucubina (nome IUPAC (2S,3R,4S,5S,6R) -2-[ [(1S,4aR,5S,7aS)-5-idrossi-7- (idrossimetil)-1, 4a,5,7atetraidrociclopenta [c]piran-1-il]ossi]-6-(idrossimetil) ossane-3,4,5-triol , GAS nr 479-98-1) ? un iridoide glicoside trovato nelle foglie di varie piante. Gli iridoidi appartengono alla pi? grande classe dei terpenoidi. L'aucubina pu? attenuare le risposte infiammatorie indotte dal fattore di necrosi tumorale a.

L'estratto di erbe dell'invenzione pu? essere un estratto di foglie, radici, fiori, steli o stimmi di detta almeno una pianta del genere Aloysia, preferibilmente Lippia citriodora e/o Verbena officlnalis e un estratto di foglie, radici, fiori, steli o stimmi di detta almeno una pianta del genere Plantago , preferibilmente Plantago lanceolata e/o Plantago major; preferibilmente ? un estratto di foglie di Lippia citriodora e/o Verbena officinalis e di foglie di Plantago lanceolata e/o Plantago major; pi? preferibilmente ? un estratto di foglie di Lippia citriodora e di foglie di Plantago lanceolata.

Preferibilmente, detto estratto di erbe dell'invenzione, preferibilmente di Lippia citriodora e Plantago lanceolata , comprendente verbascoside e aucubina nelle % in peso dell'invenzione (preferibilmente verbascoside da 2% a 25, preferibilmente da 3% a 10%, e aucubina da 0,5%, a 15%, preferibilmente da 1% a 5%), ? un estratto secco avente un residuo secco in % in peso compreso nell'intervallo da 90% a 100% rispetto al peso totale dell'estratto di erbe, preferibilmente da 95% a 100%, pi? preferibilmente da 98% a 100%. Vantaggiosamente, l'estratto di erbe dell'invenzione ? un estratto secco di foglie di Lippia citriodora e/o Verbena officinalis, preferibilmente Lippia citriodora, e di foglie di Piantago lanceolata e/o Plantago major, preferibilmente Plantago lanceolata , comprendente verbascoside e aucubina nelle % in peso dell'invenzione, preferibilmente verbascoside titolata al 5 0,5% e aucubina titolata al 2 0,2%.

In una forma di realizzazione particolarmente preferita, detto estratto di erbe dell'invenzione ? un estratto secco in forma granulare (o estratto secco granulare). I granuli (o microgranuli) di detto estratto secco in forma granulare sono granuli di dimensioni pressoch? uniformi e aventi una dimensione di particella media compresa nell'intervallo da 20 a 150 mesh, misurata attraverso setacciatori meccanici o manuali.

Vantaggiosamente, detto estratto secco in forma granulare, in aggiunta all'estratto di detta almeno una pianta del genere Aloysia, preferibilmente Lippia citriodora e/o Verbena officinalis, e all'estratto di detta almeno una pianta del genere Plantago , preferibilmente Plantago lanceolata e/o Plantago major, comprende inoltre un supporto scelto nel gruppo comprendente o, alternativamente, consistente di maltodestrina, gomma arabica, inulina, fibre vegetali, polialcoli, fruttoligosaccaridi , lecitine, destrosio, isomalto e zuccheri di vario genere; preferibilmente detto supporto ? maltodestrina.

Un esempio preferito della composizione o estratto di erbe dell'invenzione , ottenuto secondo il procedimento della presente invenzione, ? un estratto secco in forma granulare comprendente un supporto (e.g. maltodestrina), in cui detto estratto ? un estratto di foglie di Lippia citriodora e di foglie di Plantago lanceolata, e in cui detto estratto comprende verbascoside da 2% a 25%, preferibilmente da 3% a 10% (e.g. 5 0,5%), e aucubina da 0,5%, a 15%, preferibilmente da 1% a 5% (e.g. 2 ? 0,2%) in cui le % sono % in peso rispetto al peso totale dell'estratto secco in forma granulare.

Detto estratto secco in forma granulare, preferibilmente comprendente detto supporto, ha il vantaggio di essere altamente solubile e, inoltre, altamente scorrevole permettendo una migliore performance dei macchinari industriali per la sua lavorazione, ad esempio per la preparazione di composizione, quali ad esempio capsule, compresse, polveri per bustine e composizioni liquide, comprendenti l'estratto di erbe dell'invenzione.

Inoltre, l'estratto secco in forma granulare dell'invenzione, preferibilmente comprendente detto supporto, ha il vantaggio di essere formulabile in forma orosolubile e idrosolubile, vale a dire in forme di somministrazione facilmente fruibili.

In una ulteriore forma di realizzazione, l'estratto secco in forma granulare dell' invenzione pu? essere ricoperto o incapsulato o rivestito con una matrice di rivestimento, in cui detta matrice di rivestimento sia tale da impartire all'estratto secco in forma granulare sia una gastro-protezione sia un rilascio modulato nell'intestino dei principi attivi in esso contenuti (i.e. verbascoside e aucubina) . Detta matrice di rivestimento (agente di coati ng) pu? comprendere o, alternativamente consistere di acidi grassi liberi o relativi esteri, cere, lacche o loro miscele. Con matrice di rivestimento di gastroprotezione, viene inteso che i granuli di estratto secco sono rivestiti con un involucro che li protegge dall'ambiente acido dello stomaco in modo che arrivino inalterati nell'intestino dove rilasciano il principio attivo consentendone i'assorbimento .

Forma oggetto della presente invenzione una composizione comprendente o, alternativamente, consistente dell'estratto di erbe dell'invenzione secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione descritte nella presente invenzione e, opzionalmente, almeno un additivo e/o eccipiente di grado alimentare o farmaceutico.

Nel caso in cui non siano presenti detti additivo e/o eccipienti, la composizione dell'invenzione coincide con l'estratto di erbe dell'invenzione, preferibilmente con l'estratto di erbe secco in forma granulare dell'invenzione comprendente detto supporto.

Nel contesto della presente invenzione, detto almeno un additivo e/o eccipiente di grado farmaceutico o alimentare, opzionalmente presente nella composizione dell'invenzione, ? una sostanza priva di attivit? terapeutica adatta per uso farmaceutico o alimentare. Detti additivo e/o eccipiente accettabili per uso farmaceutico o alimentare comprendono tutte le sostanze ausiliarie note all'esperto del ramo come, ad esempio, diluenti, solventi (tra cui acqua, glicerina, alcol etilico) , solubilizzanti, addensanti, edulcoranti, antiagglomeranti, agenti di carica, aromatizzanti, coloranti, lubrificanti, tensioattivi, antimicrobici, antiossidanti, conservanti, tamponi per stabilizzare il pH e loro miscele; esempi specifici sono: tamponi fosfato, stearato di magnesio, biossido di silicone, carbossimetilcellulosa sodica reticolata, cellulosa microcristallina, idrossipropilmetilcellulosa , aromi naturali o artificiali.

In una forma di realizzazione la composizione dell'invenzione, comprendente l'estratto di erbe dell'invenzione e, opzionalmente, almeno un additivo e/o eccipiente di grado alimentare o farmaceutico, come definiti nella presente descrizione, pu? comprendere inoltre un ulteriore componente (o componente attivo) scelto dal gruppo comprendente o, alternativamente, consistente di: vitamine del gruppo B, C, D, E, sali organici e/o inorganici di magnesio, di selenio, di zinco e loro miscele.

Forma oggetto della presente invenzione una composizione farmaceutica, composizione nutraceutica, prodotto integratore alimentare o un prodotto alimentare o un alimento a fine medico speciale (Novel food), una composizione per dispositivo medico o una composizione cosmetica comprendente o, alternativamente, consistente della composizione dell'invenzione secondo le forme di realizzazione descritte nella presente descrizione.

Il termine "dispositivo medico" nel contesto della presente invenzione ? usato nel significato secondo il Decreto Legislativo italiano 24 febbraio 1997, n. 46, oppure secondo il nuovo Regolamento Dispositivi Medici (UE) 2017/745 (MDR).

La composizione della presente invenzione pu? essere in una forma liquida, quale soluzione, sistema liquido bifasico, sospensione, dispersione o sciroppo, in forma semisolida, quale gel, crema o schiuma, oppure in forma solida, quale polvere, granuli o microgranuli, scaglie, aggregati, compressa, compressa masticabile, capsula, losanga, pasticca, barretta e forme equivalenti.

La composizione dell'invenzione pu? essere formulata per somministrazione orale (uso orale o somministrazione gastroenterica) , sublinguale (o buccale), transmucosale o topica.

In una forma di realizzazione preferita, la composizione dell'invenzione ? per uso orale, preferibilmente in forma solida; ancora pi? preferibilmente in una forma di granuli, microgranuli, scaglie, polvere, polvere o granuli o microgranuli orosolubili o solubili, compressa, capsula o soft-gel.

Forma oggetto della presente invenzione la composizione dell'invenzione secondo quanto sopra descritto, in cui detta composizione ? per uso come medicamento.

Detta composizione secondo l'invenzione ? per uso come antinfiammatorio, analgesico e/o antispasmodico in un soggetto avente necessit?.

In particolare, la composizione dell' invenzione ? per uso nel trattamento sintomatico di patologie infiammatorie muscolo-scheletriche, reumatologiche, articolari e in post-chirurgia, preferibilmente per uso in metodi di trattamento di osteoartrite , artrite reumatoide e spondilite anchilosante.

Vantaggiosamente, la composizione dell'invenzione ? per uso nel trattamento, preventivo e/o curativo, dell'osteoartrite del ginocchio, anca, spalla, mano e/o cervicale, preferibilmente per l'osteoartrite del ginocchio .

In particolare, la composizione dell'invenzione per uso come analgesico, quale sostanza che attenua o elimina la sensazione del dolore senza ridurre lo stato di coscienza, ? una composizione per uso nel trattamento di mal di denti, dismenorrea, dolori post-operatori, dolori cervicali, dolori artritici, dolori o crampi addominali, dolori muscolo-scheletrici, dolori post-parto, dolori da trauma sportivo o contusione e dolori generici.

L'estratto di erbe dell'invenzione titolato in verbascoside e aucubina esercita significativi effetti antinfiammatori e analgesici agendo come un inibitore specifico della COX-2; inoltre, non ? citotossico ed ? privo di effetti collaterali rilevanti. Detta attivit? dell'estratto di erbe dell'invenzione ? imputabile ad un effetto sinergico o di potenziamento reciproco svolto da verbascoside e aucubina contro la iper-espressione di COX-2 in stati infiammatori o di condizioni di dolore.

In aggiunta, la composizione dell'invenzione ? per uso come antiossidante, antimicrobico e antipiretico per diminuire la temperatura corporea in caso di febbre.

In una forma di realizzazione alternativa, la composizione dell'invenzione ? per uso come coadiuvante ad un trattamento, preventivo e/o curativo, antinfiammatorio, analgesico, antispasmodico, antiossidante, antimicrobico e/o antipiretico, in particolare per le patologie, sintomi e/o disturbi descritti nella presente invenzione, preferibilmente osteoartrite , quale osteoartrite del ginocchio, anca, spalla, mano e/o cervicale.

La composizione dell'invenzione ? da intendersi indifferentemente per uso umano o veterinario, cio? come composizione da applicare a soggetti umani o animali con le modalit? note all'esperto del ramo.

La presente invenzione si riferisce, inoltre, ad un metodo di trattamento, preventivo e/o sintomatico, di patologie infiammatorie muscolo-scheletriche, reumatologiche, articolari e in post-chirurgia (e.g. osteoartrite , artrite reumatoide e spondilite anchilosante) e sintomi e/o disturbi ad esse associate, preferibilmente osteoartrite , quale osteoartrite del ginocchio, anca, spalla, inano e/o cervicale; ad un metodo di trattamento, preventivo e/o sintomatico, analgesico e/o antispasmodico per ridurre o eliminare sintomi e/o disturbi associati o derivanti al dolore (e.g. mal di denti, dismenorrea, dolori post-operatori, dolori cervicali, dolori artritici, dolori o crampi addominali, dolori muscolo-scheletrici, dolori postparto, dolori da trauma sportivo o contusione e dolori generici) , quale un metodo di trattamento; ad un metodo di trattamento antiossidante, antimicrobico e/o antipiretico, in cui detti metodi di trattamento comprendono la somministrazione della composizione dell'invenzione come sopra definita in una quantit? efficace ad un soggetto avente necessit?.

La composizione dell'invenzione per uso nel trattamento, preventivo o curativo, dell'osteoartrite del ginocchio, anca, spalla, mano e/o cervicale, preferibilmente del ginocchio, pu? essere somministrata per via orale al soggetto avente necessit? in una quantit? tale da fornire da 400 mg/die a 1600 mg/die, preferibilmente da 500 mg/die a 1200 mg/die, pi? preferibilmente da 600 mg/die a 1000 mg/die, di detto estratto di erbe (preferibilmente estratto secco in forma granulare comprendente un supporto) comprendente o, alternativamente, consistente di un estratto di Lippia citriodora (Palau) Kunth e/o Verbena Officinalis L., e un estratto di Plantago lanceolata L. e/o Piantago major L., in cui detto estratto di erbe comprende verbascoside in una % in peso compresa nell'intervallo da 2% a 25%, preferibilmente da 3% a 10%, e aucubina in una % in peso compresa nell'intervallo da 0,5% a 15%, preferibilmente da 1% a 5%, in cui dette % sono rispetto al peso totale dell'estratto di erbe.

Vantaggiosamente, la composizione dell'invenzione per uso nel trattamento, preventivo o curativo, dell'osteoartrite del ginocchio, anca, spalla, mano e/o cervicale, preferibilmente del ginocchio, pu? essere somministrata per via orale al soggetto avente necessit? in una quantit? tale da fornire da 400 mg/die a 1600 mg/die, preferibilmente da 500 mg/die a 1200 mg/die, pi? preferibilmente da 600 mg/die a 1000 mg/die, di detto estratto di erbe (preferibilmente estratto secco in forma granulare comprendente un supporto) comprendente o, alternativamente, consistente di un estratto di Lippia citriodora (Palau) Kunth e un estratto di Plantago lanceolata L., in cui detto estratto di erbe comprende verbascoside in una % in peso compresa nell'intervallo da 3% a 10%, e aucubina in una % in peso compresa nell'intervallo da 1% a 5%, in cui dette % sono rispetto al peso totale dell'estratto di erbe.

La presente invenzione si riferisce, inoltre, all'uso non-terapeutico della composizione dell'invenzione secondo le varie forme di realizzazione riportate nella presente descrizione, in cui detto uso ? per un trattamento non-terapeutico di malesseri o sensazioni di disagio collegate alla sfera del dolore e degli spasmi dell'intestino e dell'addome.

Infine, forma oggetto dell'invenzione un procedimento per la preparazione dell'estratto di erbe dell'invenzione (in breve, procedimento dell'invenzione), secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione riportate nella presente descrizione, comprendente le fasi di:

(I) predisporre (a) almeno una pianta del genere Aloysia comprendente verbascoside , preferibilmente Lippia citriodora e/o Verbena Officinalis, e/o (b) almeno una pianta del genere Plantago comprendente aucubina, preferibilmente Plantago lanceolata e/o Plantago major, in un impianto di estrazione; seguito da

(II) miscelare (a) e/o (b) con un solvente idroalcolico (c), preferibilmente etanolo/acqua, in cui il rapporto in peso [(a) e/o (b)]:(c) ? compreso nell'intervallo da 1:1 a 1:25, preferibilmente da 1:3 a 1:20, pi? preferibilmente da 1:6 a 1:15; seguito da

(III) riscaldare sotto agitazione ad una temperatura compresa nell'intervallo da 30?C a 90?C, preferibilmente da 40?C a 80?C, pi? preferibilmente da 50?C a 70?C, per un tempo compreso nell'intervallo da 20 a 240 minuti, preferibilmente da 30 a 180 minuti, pi? preferibilmente da 40 a 120 minuti, ad ottenere un estratto grezzo (d) comprendente una fase solida e una fase liquida; seguito da

(IV) separare la fase liquida di detto estratto grezzo (d) dalla fase solida di detto estratto grezzo (d) ad ottenere una fase liquida isolata (e);

(V) concentrare la fase liquida isolata (e).

Il procedimento dell'invenzione, comprendente le fasi da (I) a (V), pu? essere eseguito estraendo (a), preferibilmente Lippia citriodora, e (b), preferibilmente Plantago lanceolata, contemporaneamente in un unico impianto di estrazione. Alternativamente, l'estrazione di (a), preferibilmente Lippia citriodora, e l'estrazione di (b), preferibilmente Plantago lanceolata , possono essere eseguite in modo separato su due diversi impianti di estrazione.

In una forma di realizzazione preferita, (a), preferibilmente Lippia citriodora, e (b), preferibilmente Plantago lanceolata, sono estratte contemporaneamente in un unico impianto di estrazione.

In detto procedimento dell'invenzione, l'estrazione (i.e. fase (II) e fase (III)) ? effettuata in tempi brevi permettendo di estrarre gli attivi (i.e. verbascoside e/o aucubina) dalla materia prima estratta lasciando inalterati e bilanciati i costituenti del fitocomplesso originariamente contenuti nelle piante (a) e (b) come definite nel contesto della presente invenzione, preferibilmente (a) Lippia citriodora e (b) Plantago lanceolata.

In una forma di realizzazione del procedimento dell 'invenzione , comprendente le fasi da (I) a (V) descritte e opzionalmente, le fasi da (VI) a (VIII), - la fase (V) di concentrare la fase liquida isolata (e) ? eseguita mediante rimozione parziale del solvente (c), ad esempio per evaporazione, fino ad ottenere un estratto molle (f) avente un residuo secco compreso nell'intervallo da 20% a 80% in peso sul peso totale dell'estratto molle (f) , preferibilmente da 30% a 70%, pi? preferibilmente da 40% a 60%; e

- la fase (V) di concentrare ? seguita dalla fase (VI) di essiccare detto estratto molle (f) a dare un estratto secco (g) , in cui detto estratto secco (g) ha un residuo secco in % in peso compreso nell'intervallo da 90% a 100% rispetto al peso totale dell'estratto secco (g), preferibilmente da 95% a 100%, pi? preferibilmente da 98% a 100%.

Detta fase (VI) di essiccare comprende la rimozione, parziale o quasi totale, del solvente (c) utilizzato durante l'estrazione, ad esempio mediante l'evaporazione del solvente con tecniche convenzionali al tecnico del ramo .

L'estratto secco (g) ottenuto dal procedimento dell' invenzione (fasi da (I) a (VI)) ? l'estratto di erbe dell'invenzione comprendente o, alternativamente, consistente di un estratto di almeno una pianta del genere Aloysia , preferibilmente Lippia cltriodora e/o Verbena Officinalis, e un estratto di almeno una pianta del genere Piantano, preferibilmente Plantago lanceolata e/o Plantago major, comprende in % in peso verbascoside compresa nell'intervallo da 1% a 50% e aucubina compresa nell'intervallo da 0,1% a 30%, in cui dette % sono rispetto al peso totale dell'estratto di erbe, nelle varie forme di realizzazione descritte nella presente descrizione .

In una forma di realizzazione, la fase (VI) di essiccare ? seguita dalla fase (VII) di granulare detto estratto secco (g), a dare un estratto secco in forma granulare (h) come definito nel contesto della presente invenzione .

In una forma di realizzazione preferita, la fase (VI) di essiccare ? concomitante alla fase (VII) d? granulare in quanto detta fase (VI) d? essiccare ? condotta mediante un granulatore a letto fluido, secondo procedure standard note al tecnico del ramo, in cui ? utilizzato un supporto e detto supporto ? miscelato a detto estratto molle (f), a dare un estratto secco granulato (h) come definito nel contesto della presente invenzione .

Vantaggiosamente, detto supporto ? scelto nel gruppo comprendente o, alternativamente, consistente di maltodestrina, gomma arabica, inulina, fibre vegetali, polialcoli, fruttoligosaccar idi, lecitine, destrosio, isomalto e zuccheri di vario genere, preferibilmente maltodestrina .

Le fasi di essiccare e granulare con metodo di granulazione mediante un granulatore a letto fluido porta all'ottenimento di un estratto di erbe secco in forma di granuli secondo la presente invenzione di dimensioni pressoch? uniformi, in cui detti granuli hanno le seguenti caratteristiche:

- altissima scorrevolezza che consente un'ottima lavorabilit?, ad esempio l'ottenimento di capsule e compresse di peso e durezza uniformi, con una minima perdita e maggior produttivit? nella fase di produzione di solidi orali;

- velocit? di dissoluzione che risulta molto pi? elevata rispetto ai convenzionali estratti secchi in polvere; questo si riflette in una pi? alta biodisponibilit? in vivo ed una migliore farmacocinetica degli attivi dell'estratto (?.e. verbascoside e aucubina);

- assenza di formazione di polvere all'atto dell'apertura della confezione in busta (e.g. composizioni orosolubili o solubili);

- possibilit? di rivestimento dell'estratto granulare con opportuno agente per 1'ottenimento di granuli a rilascio controllato o resistenti a pH specifico (e.g. gastroprotetti) .

Vantaggiosamente, nel procedimento dell'invenzione, le fasi da (I) a (V) o (VI) o (VII), sono seguite dalla fase (Vili) di determinare il contenuto di verbascoside e aucubina nell'estratto (f), (g) o (h) mediante tecniche quali-quantitative di cromatografia liquida ad alta pressione o ad alta prestazione (HPLC) ad una lunghezza d'onda di ?=330 nm per il verbascoside e di h=205 nm per l'aucubina.

In una forma di realizzazione preferita, nel procedimento dell'invenzione comprendente le fasi da (I) a (V) o (VI) o (VII) o (VIII), in detta fase (I) di predisporre sono predisposte le foglie di (a), preferibilmente Lippia citriodora, comprendenti verbascoside e/o le foglie di (b), preferibilmente Plantago lanceolata, comprendenti aucubina; preferibilmente le foglie essiccate di (a), preferibilmente Lippia citriodora, e/o foglie essiccate di (b), preferibilmente Plantago lanceolata ; pi? preferibilmente in cui dette foglie essiccate sono in un taglio scelto tra polvere, taglio tisana o taglio filtro .

In una forma di realizzazione preferita, nel procedimento dell'invenzione comprendente le fasi da (I) a (V) o (VI) o (VII) o (VIII), in detta fase (II) il solvente idroalcolico (c) ? una miscela etanolo/acqua avente un grado alcolico compreso nell'intervallo da 10? a 80? alcolici, preferibilmente da 20?-70? alcolici.

Vantaggiosamente, nel procedimento dell'invenzione comprendente le fasi da (I) a (V) o (VI) o (VII) o (VIII), la fase (IV) di separare ? effettuata mediante una tecnica scelta tra le tecniche di chiarificazione, decantazione, centrifugazione e/o filtrazione del substrato da purificare, preferibilmente centrifugazione .

Vantaggiosamente, nel procedimento dell'invenzione comprendente le fasi da (I) a (V) o (VI) o (VII) o (VIII) , la fase (V) di concentrare, quale fase di rimozione o evaporazione di parte del solvente utilizzato durante l'estrazione, ? condotta secondo una tecnica di concentrazione sottovuoto scelta tra sottovuoto con evaporatore a bolla, sottovuoto con film cadente e sottovuoto con strato sottile, preferibilmente con strato sottile.

La concentrazione dell'estratto sottovuoto consente di ridurre notevolmente i tempi di produzione e di recuperare il solvente.

In una forma di realizzazione maggiormente preferita, il procedimento dell'invenzione comprende o, alternativamente, consiste delle fasi di:

(I) predisporre le foglie di (a) Lippia citriodora comprendente verbascoside e le foglie di (b) Plantago lanceolata comprendente aucubina; preferibilmente foglie essiccate; seguito da

- (II) miscelare (a) e (b) con il solvente (c) etanolo/acqua avente un grado alcolico compreso nell'intervallo da 10? a 80? alcolici, in cui (a) e (b) sono in rapporto in peso compreso nell'intervallo da 1:6 a 1:15; seguito da

- (III) riscaldare sotto agitazione ad una temperatura compresa nell'intervallo da 50?C a 70?C, per un tempo compreso nell'intervallo da 40 a 120 minuti, ad ottenere un estratto grezzo (d) comprendente una fase solida e una fase liquida; seguito da

- (IV) separare la fase liquida di detto estratto grezzo (d) dalla fase solida di detto estratto grezzo (d), preferibilmente con la tecnica di centrifugazione, ad ottenere una fase liquida isolata (e); seguito da

(V) concentrare la fase liquida isolata (e) mediante evaporazione parziale del solvente (c) fino ad ottenere un estratto molle (f) avente un residuo secco compreso nell'intervallo da 40% a 60% in peso sul peso totale dell'estratto molle (f); seguito da

(VI) essiccare detto estratto molle (f) a dare un estratto secco (g), in cui detto estratto secco (g) ha un residuo secco in % in peso compreso nell'intervallo da 90% a 100%, preferibilmente da 98% - 100%, rispetto al peso totale dell'estratto secco (g); in cui detta fase (VI) di essiccare ? condotta mediante un granulatore a letto fluido in cui ? utilizzato un supporto e detto supporto ? miscelato a detto estratto molle (f); e in cui detto supporto ? scelto nel (gruppo comprendente o, alternativamente, consistente di maltodestrina, gomma arabica, inulina, fibre vegetali, polialcoli, fruttoligosaccaridi , lecitine, destrosio, isomalto e zuccheri di vario genere, preferibilmente maltodestrina .

Per chiarezza, per raggiungere lo scopo della presente invenzione, i componenti (o componenti attivi) dell'estratto di erbe della presente invenzione, quali l'estratto di (a) e l'estratto di (b) titolati in verbascoside e aucub?na secondo le % in peso descritte nella presente invenzione, possono essere anche somministrati separatamente (preferibilmente in un intervallo di tempo da 30 minuti a 1 ora) ed in qualunque ordine ma, preferibilmente, l'estratto di (a) e l'estratto di (b) sono somministrati ad un soggetto contemporaneamente, ancora pi? preferibilmente in una unica composizione per ottenere un effetto pi? rapido e per facilit? di somministrazione.

Quando i componenti (o componenti attivi) dell'estratto di erbe della presente invenzione, quali l'estratto di Lippia cltriodora e l'estratto di Plantago lanceolata titolati in verbascoside e aucubina sono somministrati in una unica composizione, detta unica composizione corrisponde alla composizione della presente invenzione.

Se non diversamente specificato, l'espressione composizione o estratto o altro che comprende un componente in una quantit? "compresa in un intervallo da x a y" intende che detta componente pu? essere presente nella composizione o estratto o altro in tutte le quantit? presenti in detto intervallo, anche se non esplicitate, estremi dell'intervallo compresi.

PARTE SPERIMENTALE I

Poich? la CGX-2 ? un enzima inducibile coinvolto nell?infiammazione, ? stato studiato l'effetto di una composizione secondo 1'invenzione (estratto di erbe di Lippia citriodora e Plantago lanceolata titolato in verbascoside (>= 5%) e aucubina (>= 2%)) verso le espressioni di COX-2 nei neutrofili umani stimolate da LPS (lipopolisaccaride batterico) usando sia la trascrizione inversa della reazione a catena della polimerasi (Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction, in breve RT-PCR) sia un saggio immunologico PGE2 .

METODI E MATERIALI

1.1. Isolamento dei neutrofili

I neutrofili umani sono stati isolati da campioni di sangue intero prelevati da 10 volontari sani (5 uomini e 5 donne, et? media: 34,11 3,7 anni) utilizzando il kit di isolamento dei neutrofili umani EasySep? Direct Dopo l'isolamento, i neutrofili sono stati risospesi ad una concentrazione di 5 * 106 cellule / ml nella soluzione salina bilanciata di Hank (37 ?C) contenente 10 mM di HEPES pH 7,4, 1,6 mM di Ca<2+ >e non Mg<2>".

1.2. Materiale

- LPS ? stato acquistato da InvivoGen (Tolosa, Francia). - L'estratto vegetale (estrazione acqua/etanolo) in forma granulare secondo l'invenzione titolato in verbascoside (>5%) e aucubina (_>2%) (VERBAScox<?>, marchio registrato da

- Celecoxib (un noto inibitore farmacologico di COX- 2) ? stato acquistato da

1.3. Vitalit? cellulare

La vitalit? cellulare ? stata determinata utilizzando il kit di analisi MTT in base al protocollo del produttore (MTT: bromuro di 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio) . Al fine di determinare la citotossicit? dell'estratto di erbe dell'invenzione, le cellule sono state incubate con soluzioni acquose dell'estratto di erbe dell'invenzione a tre diverse concentrazioni (1%, 3% e 5%) per 24 ore. Le colture del gruppo di controllo non sono state trattate e la loro vitalit? ? stata fissata a 100%. A scopo di confronto, le cellule sono state anche trattate per 24 ore con una soluzione di Celecoxib all'1%, che ? stata preparata come descritto in precedenza [Agrawal S., et al.: Solubility enhancement of poorly water soluble celecoxib for parenteral formulations. Int J Pharm Sei (2012) 3: 2325-2336]. Dopo l?incubazione, 10 ?l del reagente di etichettatura MTT sono stati aggiunti a ciascun pozzetto. Dopo 4 ore, ? stata aggiunta una aliquota da 100 ?l di soluzione di solubilizzazione, seguita da un'incubazione di 12 ore. L'assorbanza ? stata successivamente misurata con un lettore di micropiastre a una lunghezza d?onda di prova di 595 nm e una lunghezza d'onda di riferimento di 690 nm. La densit? ottica (OD) ? stata calcolata come differenza tra l'assorbanza al riferimento lunghezza d'onda e quella alla lunghezza d'onda del test. La percentuale di vitalit? ? stata calcolata utilizzando la seguente formula: (OD del campione trattato / OD di controllo) x 100.

1.4. Incubazioni con LPS in diverse condizioni sperimentali

Gli esperimenti sono stati condotti su terreno RPMI (RPMI: Rosewell Park Memorisi Institute, terreno povero di cationi Ca2+ e Mg2+ comunemente usato per le cellule della linea bianca del sangue) integrato con siero bovino fetale all?1% (37?C, 5% CO2,95% di umidit?) dopo aver seminato neutrofili (5x10<5 >cellule / pozzetto) in una piastra a 96 pozzetti. Le seguenti condizioni sono state utilizzate:

1) cellule non trattate (controllo),

2) cellule esposte a 5 ?g/mL di LPS per 24 h,

3) cellule esposte a 5 ?g/mL di LPS pi? estratto di erbe dell'<' >invenzione in soluzione 1% per 24 h,

4) cellule esposte a 5 ?g/ml di LPS pi? estratto di erbe dell'<? >invenzione in soluzione al 3% per 24 ore,

5) cellule esposte a 5 ?g/ml di LPS pi? estratto di erbe dell'invenzione in soluzione al 5% per 24 ore e

6) cellule esposte a 5 ?g/ml di LPS pi? celecoxib in soluzione all?1% per 24 ore.

1.5. Analisi dell'espressione di mRNA COX-1 e COX-2

Per identificare le espressioni di mRNA di COX-1 e COX-2, ? stata eseguita RT-PCR. L?RNA totale ? stato isolato dai neutrofili usando RNAzoI<?>B (TEL-TEST, Friendswood, TX, USA) . 2 ?L di RNA e 2 ?L di esameri casuali (Promega) sono stati aggiunti insieme e la miscela ? stata riscaldata a 65?C per 10 minuti. 1 ?L di trascrittasi inversa AMV (Promega), 5 ?L di dNTP 10 mM (Promega), 1 ?L di RNasin (Promega) e 5 ?L di 10 x tampone AMV RT (Promega) sono stati quindi aggiunti alla miscela. Il volume finale ? stato portato a 50 ?L con acqua trattata con dietil pirocarbonato e la miscela di reazione ? stata quindi incubata a 42?C per 1 ora. L'amplificazione della PCR ? stata eseguita in un volume di reazione di 4 0 ?L contenente 1 ?L di cDNA appropriato, 1 ?L di ciascun set di primer a una concentrazione di 10 pM, 4 pL di 10 x tampone RT, 1 pi di 2,5 mM dNTP e 2 unit? di DNA polimerasi Taq (Promega) .

La sequenza dei primer per la CGX-1 umana era la seguente: 5?- CGCCAGTGAATCCCTGTTGTT-3 ' e reverse 5'-AAGGTGGCATTGACAAACTCC-3 '.

La sequenza di primer per la COX-2 umana era la seguente: 5'- CTGGCGCTCAGCCATACAG-3 ' e reverse 5'-CGCACTTATACTGGTCAAATCCC-3 '.

La sequenza dei primer per la gliceridemia 3-fosfato deidrogenasi (GAPDH; gene housekeeping) era la seguente: 5 ?-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3 ' e reverse 5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3 '.

Le amplificazioni della PCP, sono state eseguite utilizzando un sistema GeneAmp? 9600 PCR

alle seguenti condizioni: iniziale denaturazione a 94?C per 5 min, seguita da 40 cicli, ciascuno consistente di denaturazione a 94?C per 30 s, ricottura a 58?C per 30 s, estensione a 72?C per 30 s, con una fase di estensione finale alla fine della procedura a 72?C per 5 min. Le quantit? di prodotti RT-PCR per ciascuna delle specie di mRNA alle sei diverse condizioni sperimentali sopra descritte sono state calcolate densitometricamente utilizzando il software Molecular Analyst? Gli esperimenti sono stati condotti in triplicato e i dati quantitativi di espressione genica sono stati normalizzati ai livelli di espressione di GAPDH.

1.6. Valutazione delle concentrazioni di PGE2

La valutazione delle concentrazioni di PGE2 in ciascun pozzetto alle sei diverse condizioni sperimentali ? stata eseguita utilizzando un kit di immunoanalisi enzimatica competitiva PGE2 disponibile in commercio Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in triplice copia.

1.7. Analisi dei dati

I calcoli statistici sono stati eseguiti utilizzando GraphPad 7.0 I risultati sono espressi come medie ? deviazioni standard. I dati sono stati analizzati mediante una ANOVA a distanza seguita da test di Dunn post-hoc. Un valore P a due code <0,05 ? stato considerato statisticamente significativo .

RISULTATI

1.8. Vitalit? cellulare

Sulla base dei risultati del test MTT, la viabilit? delle cellule incubate per 24 ore con l'estratto di erbe dell'invenzione solubilizzato all'1%, 3% e 5% delle concentrazioni era 91 ? 3%, 87 ? 5% e 81 ? 7 % del valore di controllo (100%) osservato nelle celle non trattate. La vitalit? cellulare delle cellule incubate con celecoxib 1% era 90 2%.

Complessivamente, i risultati del test MTT hanno rivelato che l'estratto di erbe dell'invenzione non esercitava alcuna importante citotossicit? nei neutrofili umani.

1.9. Analisi dell'espressione COX-1 e CGX-2 mediante RT-PCR

L'analisi RT-PCR dei livelli di mRNA di COX-1 e COX-2 ? stata eseguita al fine di fornire una stima dei relativi livelli di espressione di questi geni alle sei diverse condizioni sperimentali sopra delineate. I livelli di mRNA di COX-1 e COX-2 in cellule non trattate sono stati usati come valore di controllo e fissati a 100 unit? arbitrarie (a.u.).

Dopo il trattamento con 5 ?g/ml di LPS per 24 ore, l'espressione di COX-1 ? stata di 108 ? 10 a.u.

I livelli di mRNA di COX-1 dopo esposizione a 5 ?g/ml di LPS pi? estratto di erbe dell'invenzione a concentrazioni dell'1%, 3% e 5% per 24 ore erano 111 ? 8, 961 11 e 91 i 9 a.u., rispettivamente.

I livelli di espressione delle cellule esposte a 5 ?g/ml di LPS pi? celecoxib all?1% per 24 ore erano 116 ? 4 a.u. Tutti questi cambiamenti non erano statisticamente significativi, suggerendo che i trattamenti non influenzano l'espressione di COX-1.

Il livello di mRNA di COX-2 dopo il trattamento con 5 ?g /ml di LPS per 24 ore ? stato significativamente aumentato a 971 ? 49 a.u.

I livelli di mRNA di CGX-2 dopo esposizione a 5 ?g/ml di LPS pi? estratto di erbe dell'invenzione a concentrazioni dell'1%, 3% e 5% per 24 ore erano 702 1 51, 536 63 e 449 46 a.u., rispettivamente (tutti P <0,001 versus trattamento con 5 ?g/ml di LPS).

I livelli di espressione delle cellule esposte a 5 ?g/ml di LPS pi? celecoxib all'1% per 24 ore erano 283 37 a.u. (Figura 3; P <0,001 verso estratto di erbe dell'invenzione alla concentrazione del 5%).

1.10. Immunodosaggio PGE2

I risultati del saggio inuminologico PGE2 hanno rivelato che, dopo 24 ore di esposizione a LPS, la quantit? di PGE2 ? aumentata da 5,12 1 1,24 pg/pozzetto a 66,21 1 3,67 pg/pozzetto.

I livelli di PGE2 dopo esposizione a 5 pg/ml di LPS pi? estratto di erbe dell'invenzione a concentrazioni dell'1%, 3% e 5% per 24 ore erano 46.29 3.10 pg/pozzetto, 39.83 ? 2.97 pg/pozzetto e 32.11 ? 3.89 pg/pozzetto (tutti P <0,001 verso trattamento con 5 pg/ml LPS).

Concentrazioni di PGE2 a 5 pg/ml di LPS pi? celecoxib all'1% per 24 ore erano 19,21 ? 2,39 pg/pozzetto (Figura 4; P <0,001 verso estratto di erbe dell'invenzione alla concentrazione del 5%).

DISCUSSIONE DEI RISULTATI

Una maggiore espressione di COX-2 porta ad una maggiore produzione di PGE2, che a sua volta ? strettamente associata all'insorgenza di infiammazione e dolore. I principali risultati di queste aree di studio sono i seguenti :

1) l'estratto di erbe dell'invenzione titolato in verbascoside e aucubina non ? significativamente citotossico come mostrato dal dosaggio MIT;

2) l'estratto non inibisce significativamente la COX-1, mentre ? in grado di sopprimere 1'iperespressione di COX-2 indotta da LPS a livello di mRNA nei neutrofili umani ;

3) in un modello sperimentale infiammatorio in vitro, l'effetto dell'estratto di erbe dell'invenzione con una concentrazione del 5% era paragonabile a quello ottenuto con celecoxib all'1%, sebbene, in termini di riduzione assoluta e relativa dell'espressione di mRNA di COX-2 e produzione di PGE2 nei neutrofili umani, celecoxib ha sovraperf ormato significativamente l?estratto di erbe dell'invenzione .

Questi risultati dimostrano che l'estratto di erbe dell'invenzione ? in grado di inibire sia l'espressione di COX-2 che la s?ntesi di PGE2 in un tipo di cellula (neutrofili umani) che svolge un ruolo chiave nell'infiammazione acuta. In altre parole, questi risultati dimostrano che l'estratto di erbe dell'invenzione titolato in verbascoside e aucubina ? sicuro (non citotossico) e pu? esercitare significativi effetti antinfiammatori e analgesici agendo come un inibitore specifico della COX-2.

Conseguentemente, i dati sperimentali della presente descrizione dimostrano che verbascoside e aucubina contenuti nell'estratto di erbe dell'invenzione esercitano effetti sinergici o di potenziamento reciproco contro l'espressione di COX-2 in stati infiammatori o di condizioni di dolore

PARTE SPERIMENTALE II

La Richiedente ha effettuato uno studio clinico; studio pilota randomizzato, in singolo cieco, con controllo attivo allo scopo di studiare l'efficacia clinica della somministrazione orale di VERBAScox<?>, un estratto vegetale secondo l'invenzione in grado di inibire la cicloossigenasi-2 umana (COX-2), in pazienti affetti da osteoartrite del ginocchio (in breve, OA) da lieve a moderata .

Lo scopo principale di questo studio pilota era confrontare l'entit? dell'alleviamento del dolore e del miglioramento della capacit? funzionale dei pazienti sottoposti a somministrazione orale di VERBAScox<? >rispetto a pazienti trattati con celecoxib, un noto inibitore farmacologico della COX-2. Inoltre, sono stati misurati i livelli sierici della sostanza P (in breve, SP), un neuropeptide appartenente alla famiglia delle tachichinine coinvolto nella percezione del dolore, come marcatore biochimico della risposta al trattamento.

METODI E MATERIALI

11 .1. Pazienti

Detto studio clinico era uno studio pilota randomizzato, in singolo cieco, con controllo attivo su 150 pazienti consecutivi (117 donne e 33 uomini). Erano ammissibili pazienti di et? compresa tra 40 e 75 anni con diagnosi clinica di osteoartrite del ginocchio secondo i criteri dell'American College of Rheumatology [16]. I criteri di inclusione erano i seguenti: 1) presenza di sintomi da almeno un mese, 2) numero di leucociti nel liquido sinoviale < 2000/ml, 3) dolore su una scala analogica visiva (VAS) ? 2 a riposo e 4) durata della rigidit? al mattino ? 30 min. Sono stati applicati 1 seguenti criteri di esclusione: 1) gravidanza o allattamento, 2) anamnesi positiva per gravi patologie renali, epatiche, cardiache, gastrointestinali o ematologiche, 3) presenza di tumori maligni, 4) presenza di disturbi neurologici o psichiatrici, 5) atopia o disturbi allergici, 6) diabete mellito o altri disturbi endocrini, 7} disturbi della coagulazione, 8) anamnesi positiva per ulcera peptica, 9) uso di corticosteroidi nelle quattro settimane precedenti lo studio e 10) uso di FANS nelle due settimane precedenti lo studio. Secondo il sistema di classificazione Kellgren-Lawrence [17], il 61,3% e il 38,7% dei pazienti dello studio avevano rispettivamente un punteggio di 1 e 2. I pazienti sono stati quindi classificati come affetti da osteoartrite del ginocchio da lieve a moderata. Il protocollo di studio era conforme ai principi della Dichiarazione di Helsinki. Prima dello studio, ogni paziente ? stato informato dello scopo della ricerca e da ciascuno ? stato ottenuto un consenso informato scritto.

II.2 . Materiali

- VERBAScox<? >(composizione secondo l'invenzione): secondo quanto riportato al punto 1.2; nel presente studio clinico era sotto forma di compresse contenenti 800 mg di estratto titolato in verbascoside (>5%) e aucubina (>2%) .

- Celecoxib (composizione comparativa): capsule orali di celecoxib 200 mg, commercializzate da

II.3. Procedure

Il periodo di studio ? stato di due .settimane.

Al basale, sono stati registrati l?indice di massa corporea (BMI) e la durata del dolore di tutti i partecipanti .

I pazienti (n = 150) sono stati randomizzati in tre gruppi di studio (rapporto 1:1:1). La sequenza di randomizzazione ? stata generata da un apposito software .

I pazienti nel gruppo di controllo (n = 50) non sono stati sottoposti ad alcun trattamento (attesa vigile). I pazienti nel gruppo di VERBAScox<? >(n = 50) hanno ricevuto una somministrazione orale (800 mg/die; una compressa) di estratto vegetale VERBAScox<? >per 2 settimane .

I pazienti nel gruppo di Celecoxib (n = 50) che hanno assunto Celecoxib (200 mg/die; una capsula) per 2 settimane .

I medici esaminatori e il personale di laboratorio erano in cieco rispetto al gruppo di trattamento, mentre i pazienti dello studio non erano in cieco rispetto al trattamento assegnato. A tutti 1 partecipanti ? stato chiesto di sospendere altre terapie concomitanti durante il periodo dello studio.

Sono state eseguite un totale di tre valutazioni (al basale, a una settimana e al termine del periodo di trattamento di 2 settimane).

11.4. Endpoint clinici

Gli endpoint clinici includevano:

1) valutazione da parte del paziente del punteggio del dolore da artrite (VAS) a riposo (intervallo: 0-10; dove 0 ? assenza di dolore e 10 ? il dolore massimo),

2) valutazione del paziente del punteggio del dolore da artrite (VAS) al movimento (intervallo: 0-10; dove 0 ? assenza di dolore e 10 ? il dolore massimo),

3) intervallo di movimento articolare (gradi) e

4) punteggio dell'indice WOMAC (Western Ontario and McMaster University) [Salaffi et al. Osteoarthritis Cartilage 2003; 11: 551-60].

1 punteggi dell'indice WOMAC sono composti da sottoscale che misurano dolore (intervallo: 0-20; dove 0 ? assenza di dolore e 20 ? il dolore massimo) , rigidit? (intervallo: 0-8, dove 0 ? assenza di rigidit? e 8 ? la rigidit? massima) e funzionalit? fisica (intervallo: 0-68, dove 0 indica la migliore funzionalit? e 68 la peggiore funzionalit?) . Il punteggio composito totale risultante varia da 0 a 96.

11.5. Misurazioni dei livelli sierici della sostanza P In occasione di ogni valutazione, sono stati raccolti in provette campioni di sangue venoso per la separazione del siero. Il sangue ? stato lasciato coagulare a temperatura ambiente per 30 minuti e quindi centrifugato a 1.000 xg per 15 minuti. Il siero ? stato rimosso e le aliquote sono state congelate a -80?C fino al momento delle misurazioni laboratoristiche. I livelli sierici di sostanza P sono stati valutati utilizzando un saggio ELISA secondo il protocollo del produttore

L'assorbanza a 450 nm ? stata misurata su un lettore di micropiastre ELISA Il limite di rilevazione di questo saggio era di 25 pg/ml e i coefficienti di variazione intra e inter-saggio erano rispettivamente dell '8% e del 13%. Tutti i campioni sono stati processati contemporaneamente al termine dello studio da personale di laboratorio in cieco rispetto ai dati clinici.

II.6 . Sicurezza

La sicurezza ? stata valutata registrando gli eventi avversi emergenti dal trattamento e i cambiamenti rispetto al basale nei test clinici di laboratorio, nei segni vitali e negli esami obiettivi, che sono stati tutti effettuati durante le visite alle settimane 1 e 2. Le variazioni clinicamente rilevanti dei valori di laboratorio sono state definite come:

aspartato aminotransf erasi (AST) e/o alanina transaminasi (ALT) ? 3 x limite superiore della norma (ULN) ,

- creatinina ? 1,3 x ULN,

- azoto ureico nel sangue (BUN) > 2 x ULN,

riduzione del valore dell'ematocrito ? 5 punti percentuali rispetto al basale e

- diminuzione del valore dell'emoglobina > 2 g/dl dal basale .

II.7. Analisi statistica

Le variabili categoriche sono espresse come conteggi e frequenze percentuali e sono state confrontate tramite test chi-quadrato. Le variabili continue sono riportate come medie ? deviazione standard e sono state confrontate nei tre punti di valutazione tramite ANOVA seguita da test di Newman-Keuls post-hoc. Tutte le analisi sono state eseguite utilizzando GraphPad Prism, versione 7.0 e SPSS 17.0 Valori P a due code < 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi .

RISULTATI II.8. Pazienti - Gruppi di studio

Le caratteristiche basali dei tre gruppi di studio sono illustrate nella Tabella 1. Non esistevano differenze significative intergruppo in termini di et?, sesso, BMI, durata del dolore, dolore a riposo, dolore al movimento, intervallo di movimento (gradi) e punteggi dell'indice WOMAC. I parametri laboratoristici di sicurezza (AST, ALT, creatinina, BUM, ematocrito ed emoglobina) al basale rientravano tutti nell'intervallo di normalit? (dati non illustrati). Il campione di studio pu? quindi essere considerato rappresentativo di una popolazione clinica di pazienti affffetti da osteoartrite del ginocchio da lieve a moderata che necessitano di trattamento farmacologico.

II.9. Endpoint clinici

Nessun paziente si ? ritirato dallo studio. Gli endpoint clinici dei tre gruppi di studio sono illustrati nella Tabella 2. Non sono state osservate differenze significative nel tempo nel braccio di controllo (attesa vigile). Rispetto ai valori al basale, non era evidente alcuna differenza significativa tra il gruppo di VERBAScox<? >e il gruppo di Celecoxib al termine del periodo di studio di 2 settimane.

La Figura 1 confronta le variazioni del punteggio totale dell'indice WGMAC nei gruppi di VERBAScox<? >e Celecoxib durante il periodo di studio di 2 settimane.

II.10. Livelli sierici della sostanza P

La tabella 3 riassume le variazioni temporali dei livelli sierici di sostanza P nei tre gruppi di studio. Non sono state osservate differenze significative nel tempo nel braccio di controllo (attesa vigile). A una settimana, Celecoxib, ha prodotto una riduzione statisticamente significativa dei livelli sierici di sostanza P rispetto ai valori basali. Tuttavia, non era evidente alcuna differenza significativa tra il gruppo di VERBAScox<? >e il gruppo di Celecoxib al termine del periodo di studio di 2 settimane ed entrambi i bracci di trattamento hanno evidenziato riduzioni simili rispetto ai valori basali.

II.11. Sicurezza

Non si sono verificati eventi avversi emergenti dal trattamento nel gruppo trattato con VERBAScox<? >(Tabella 4).

DISCUSSIONE

In questo studio pilota randomizzato, in singolo cieco, con controllo attivo, ? stato rilevato che la somministrazione di VERBAScox<? >(800 mg/die) in pazienti affetti da osteoartrite del ginocchio da lieve a moderata ? efficace e sicura almeno come una dose terapeutica standard di Celecoxib in termini di alleviamento del dolore e miglioramento della capacit? funzionale dopo un ciclo di trattamento di 2 settimane. ? interessante notare che il decorso temporale della riduzione di sostanza P nel siero ha seguito un andamento simile, suggerendo che gli effetti clinici di VERBAScox<? >e Celecoxib potrebbero almeno in parte essere mediati da una diminuzione dei livelli sierici di questo mediatore bioch?mico di dolore e infiammazione.

La somministrazione di VERBAScox<? >p?er due settimane si ? dimostrata sicura, con eventi avversi emergenti dal trattamento sporadici e simili a quelli osservati nel gruppo di Celecoxib; nessuno di questi eventi ha comportato la sospensione del trattamento. In particolare, non si sono manifestati cambiamenti rispetto al basale nei test di sicurezza di laboratorio in entrambi i gruppi di VERBAScox<? >e Celecoxib.

L'efficacia dell'effetto analgesico di Celecoxib nell ?osteoartr?te del ginocchio si manifesta entro due giorni dall'inizio del trattamento ed ? noto che l'assunzione d? 200 mg/die garantisce un controllo efficace della sintomatologia dolorosa. E stato quindi utilizzato questo dosaggio per il braccio di trattamento con controllo attivo.

Tramite esperimenti in vitro (vedasi parte sperimentale I), ? stato precedentemente dimostrato che VERBAScox<? >? in grado di inibire la COX-2 con modalit? dosedipendente. Nel presente studio, l'efficacia clinica comparabile di VERBAScox<? >e Celecoxib ? stata dimostrata da punteggi simili in VAS a riposo, VAS al movimento, intervallo di movimento e punteggio totale dell'indice WOMAC a 2 settimane.

VERBAScox<? >pu? essere clinicamente efficace contro l'osteoartr?te , in particolare osteoartr?te del ginocchio, da lieve a moderata non solo per la sua capacit? di inibire la COX-2, ma anche per altre propriet? attive dei suoi componenti. Il verbascoside ? infatti caratterizzato da un elevato potere antiossidante, mentre 1'aucubina pu? attenuare le risposte infiammatorie indotte dal fattore di necrosi tumorale a.

La possibilit? che VERBAScox<? >possa esercitare ulteriori effetti antiossidanti e antinfiammatori indipendenti dalla COX-2 spiegherebbe perch? la sua efficacia clinica sia risultata simile a quella del Celecoxib a 2 settimane, nonostante sia un inibitore meno potente della COX-2. ? importante sottolineare come l'entit? delle riduzioni nel punteggio totale dell'indice WOMAC al termine dello studio (da 28,2 ? 4,0 a 16,0 ? 2,7 nel gruppo di VERBAScox<? >e da 27,6 ? 3,8 a 15,1 ? 2,2 nel gruppo di Celecoxib) debba essere considerata un miglioramento clinicamente rilevante. A questo proposito, ? necessario ricordare come le differenze minime clinicamente importanti nel punteggio totale dell'indice WOMAC siano comprese tra 9,5 e 10,1 per l'osteoar trite del ginocchio e dell'anca.

Nel presente studio, i miglioramenti dei sintomi clinici in entrambi i gruppi di trattamento attivo (VERBAScox<? >e Celecoxib) sono stati accompagnati da una significativa riduzione dei livelli sierici di sostanza P, un neuropeptide rilasciato dai nervi sensoriali che esercita diversi effetti pro-infiammatori . ? da notare che la sostanza P non solo ? coinvolta nella percezione del dolore, ma ? anche in grado di sovraregolare l'espressione di COX-2. Negli ultimi anni, sempre pi? prove hanno mostrato il ruolo svolto da sostanza P nelle malattie delle articolazioni umane, inclusa 1 ?osteoartrite . ? quindi possibile che la riduzione dei livelli di sostanza P possa contribuire agli effetti antinfiammatori e antidolorifici di VERBAScox<? >e Celecoxib .

Concludendo, i risultati ottenuti nel presente studio clinico dimostrano come la somministrazione orale di VERBAScox? (800 mg/die, composizione secondo l'invenzione) in pazienti affetti da osteoartrite del ginocchio da lieve a moderata ? efficace e sicura in termini di alleviamento del dolore e miglioramento della capacita funzionale dopo un periodo di trattamento di 2 settimane .

Inoltre, i risultati ottenuti nei presente studio clinico dimostrano come la somministrazione orale di VERBAScox<? >(composizione secondo l'invenzione) e il trattamento con Celecoxib (FANS, composizione comparativa dell'arte nota) per 2 settimane abbiano effetti simili nel ridurre i sintomi dell?osteoartrite del ginocchio da lieve a moderata.

La riduzione dei livelli sierici della sostanza P ha seguito un modello temporale sovrapponibile e potrebbe essere almeno in parte responsabile degli effetti clinici osservati.

Tabella 1 (Caratteristiche dei tre gruppi di studio al basale)

Abbreviazioni: VAS, scala analogica visiva; WOMAC, Western Ontario and McMaster Universities.

Tabella 2 (Decorso temporale degli endpoint clinici nei tre gruppi di studio;

I dati sono espressi come medie e deviazioni standard. *P < 0,001 rispetto al basale. ?P < 0,001 rispetto al braccio VERBAScox<? >a una settimana.

Tabella 3 (Decorso temporale dei liveli sierici di sostanza P nei tre gruppi di studio)

*P < 0,001 rispetto al basale . ?P <0,001 rispetto al braccio VERBAScox<? >a una settimana. SP: sostanza P

Tabella 4 (Eventi avversi emergenti dal trattamento osservati nei bracci di VERBAScox<? >e celecoxib)

I dati sono espressi come numero di pazienti (percentuali tra parentesi).

Claims (10)

1. RIVENDICAZIONI 1. Una composizione per uso nel trattamento, preventivo e/o curativo, dell?osteoartrite del ginocchio, anca, spalla, mano e/o cervicale mediante somministrazione di una quantit? terapeutica di detta composizione ad un soggetto avente necessit?, in cui detta composizione comprende - un estratto di erbe comprendente o, alternativamente, consistente di un estratto di almeno una pianta del genere Aloysia e un estratto di almeno una pianta del genere Plantago, in cui detto estratto di erbe comprende verbascoside in una % in peso compresa nell?intervallo da 1% a 50% e aucubina in una % in peso compresa nell?intervallo da 0,1% a 30%, in cui dette % sono rispetto al peso totale dell?estratto di erbe; e, opzionalmente, - almeno un additivo e/o eccipiente di grado alimentare o farmaceutico.
2. 2. La composizione per uso secondo la rivendicazione 1, in cui detta composizione ? per uso nel trattamento, preventivo e/o curativo, dell?osteoartrite del ginocchio.
3. 3. La composizione per uso secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui detta almeno una pianta del genere Aloysia ? scelta dal gruppo comprendente o, alternativamente, consistente di Lippia citriodora (Palau) Kunth, Verbena Officinalis L. e una loro miscela, e in cui detta almeno una pianta del genere Plantago ? scelta dal gruppo comprendente o, alternativamente, consistente di Plantago lanceolata L., Plantago major L. e una loro miscela.
4. 4. La composizione per uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detta almeno una pianta del genere Aloysia ? Lippia citriodora (Palau) Kunth e in cui detta almeno una pianta del genere Plantago ? Plantago lanceolata L.
5. 5. La composizione per uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detto estratto di erbe comprende verbascoside in una % in peso compresa nell?intervallo da 2% a 25%, preferibilmente da 3% a 10%, e aucubina in una % in peso compresa nell?intervallo da 0,5% a 15%, preferibilmente da 1% a 5%, in cui dette % sono rispetto al peso totale dell?estratto di erbe.
6. 6. La composizione per uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detto estratto di erbe ? un estratto secco in forma granulare avente un residuo secco in % in peso compreso nell?intervallo da 90% a 100%, rispetto al peso totale dell?estratto secco; preferibilmente da 95% a 100%; pi? preferibilmente da 98% a 100%.
7. 7. La composizione per uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detta almeno una pianta del genere Aloysia ? Lippia citriodora (Palau) Kunth e in cui detta almeno una pianta del genere Plantago ? Plantago lanceolata L., in cui detto estratto di erbe comprende verbascoside in una % in peso compresa nell?intervallo da 3% a 10% e aucubina in una % in peso compresa nell?intervallo da 1% a 5%, in cui dette % sono rispetto al peso totale dell?estratto di erbe; preferibilmente in cui detto estratto di erbe ? un estratto secco in forma granulare avente un residuo secco in % in peso compreso nell?intervallo da 90% a 100%, rispetto al peso totale dell?estratto secco.
8. 8. La composizione per uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detta composizione ? somministrata per via orale.
9. 9. La composizione per uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detta composizione ? somministrata per via orale al soggetto avente necessit? in una quantit? tale da fornire da 400 mg/die a 1600 mg/die, preferibilmente da 500 mg/die a 1200 mg/die, pi? preferibilmente da 600 mg/die a 1000 mg/die, di detto estratto di erbe comprendente o, alternativamente, consistente di un estratto di Lippia citriodora (Palau) Kunth e/o Verbena Officinalis L., e un estratto di Plantago lanceolata L. e/o Plantago major L., in cui detto estratto di erbe comprende verbascoside in una % in peso compresa nell?intervallo da 2% a 25%, preferibilmente da 3% a 10%, e aucubina in una % in peso compresa nell?intervallo da 0,5% a 15%, preferibilmente da 1% a 5%, in cui dette % sono rispetto al peso totale dell?estratto di erbe.
10. 10. La composizione per uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detta composizione ? somministrata per via orale al soggetto avente necessit? in una quantit? tale da fornire da 400 mg/die a 1600 mg/die, preferibilmente da 500 mg/die a 1200 mg/die, pi? preferibilmente da 600 mg/die a 1000 mg/die, di detto estratto di erbe comprendente o, alternativamente, consistente di un estratto di Lippia citriodora (Palau) Kunth e un estratto di Plantago lanceolata L., in cui detto estratto di erbe comprende verbascoside in una % in peso compresa nell?intervallo da 3% a 10%, e aucubina in una % in peso compresa nell?intervallo da 1% a 5%, in cui dette % sono rispetto al peso totale dell?estratto di erbe.