HU221795B1 - Acetoxi-hidroxid szintetáz-promóter, bejuttatott gének növényekben történő expresszálására - Google Patents

Abstract

A találmány tárgyát olyan izolált, nem kódoló nukleotidszekvenciákképezik (kukoricaeredetű acetoxi-hidroxid-szinte- táz-promoterek),amelyek heterológ génexpresszió megvalósítására alkalmazhatóknövényekben. A találmány tárgyát képezik továbbá az izoláltnukleotidszekvenciákat tartalmazó nukleinsavkonstrukciók, vektorok ésnövényi sejtek. A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárásheterológ gén nagymértékű expresszálására növényben és/vagy a növénykülönböző szöveteiben, valamint eljárás szelektálható markergénexpresszálására a találmány szerinti promo- ter alkalmazásával. ŕ

Description

A találmány tárgyát olyan izolált, nem kódoló nukleotidszekvenciák képezik (kukoricaeredetű acetoxi-hidroxid-szintetáz-promoterek), amelyek heterológ génexpresszió megvalósítására alkalmazhatók növényekben. A találmány tárgyát képezik továbbá az izolált nukleotidszekvenciákat tartalmazó nukleinsavkonstrukciók, vektorok és növényi sejtek.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás heterológ gén nagymértékű expresszálására növényben és/vagy a növény különböző szöveteiben, valamint eljárás szelektálható markergén expresszálására a találmány szerinti promoter alkalmazásával.

A növényvilág két törzsre osztható fel, a Bryophyta-törzsre és a TracheophytaAörzsK. A Tracheophyta-törzs több mint 266 000 fajt tartalmaz, amelyek négy altörzsre csoportosíthatók. A Pteropsida-altörzsben található az Angiospermae-osztály. Ez az osztály két alosztályra osztható fel, a kétszikűekre és az egyszikűekre.

Mivel az egyszikűek alosztálya sok, fontos gabonaés takarmánynövényt tartalmaz, ezért élénk érdeklődést vált ki a növénygenetikusokból, hogy transzgenikus egyszikűeket tudjanak előállítani. Körülbelül 50 000 faja ismert az egyszikűeknek. Ezekhez tartoznak a liliomok, pálmák, orchideák, íriszek, tulipánok, sások és a fűfélék. A ffifélékhez tartozik a kukorica, búza, rizs és az összes többi gabonaféle. Sajnos az egyszikűek különösen nehéz feladatot jelentenek a génsebészek számára, ezért a növényi munkák zömét a kétszikűekkel végezték.

A kétszikűek alosztálya a kettő közül a nagyobbik csoport, körülbelül 200 000 faja ismert. A boglárka, az oroszlánszáj, a szegfű, a magnólia, a mák, a káposzta, a rózsa, a borsó, a karácsonyi csillagvirág, a gyapotnövény, a kaktusz, a sárgarépa, az áfonya, a menta, a paradicsom, a napraforgó, a szilfa, a tölgy- és a juharfa a kétszikűek 250 családjának 19 képviselője.

Rendszerint a DNS-molekulában található genetikai információ szolgál templátként számos rövid RNSmolekula szintéziséhez. Az RNS-molekulák zöme viszont specifikus polipeptidláncok szintéziséhez szolgál templátként. Az RNS-polimeráz-molekula, amely kezdi az RNS-szintézist, egy specifikus nukleotidszegmenst (gyakran promotemek hívják) ismer fel. Miután a funkcionális RNS-lánc transzkripciója befejeződött, jelek egy másik csoportja vezet az RNS-szintézis terminációjához, és az RNS-polimeráz-molekula távozásához a megfelelő DNS-templátról.

Jelenleg számos közönséges promoter használatos a heterológ génexpresszió irányításához egyszikű növényekben.

Dávid McElroy és munkatársai (1990) egy olyan konstrukció tranziens expressziós vizsgálati eljárását írták le, amelyben a rizseredetű aktin-1-gént (Actl) transzformált rizsprotoplasztokban füzionálták bakteriális β-glükuronidáz-génhez (GUS), és ez azt mutatta, hogy az aktinpromoter nagymértékű génexpressziót eredményez. Ez az expresszió körülbelül 6-szor nagyobb volt, mint a kukoricaeredetű alkohol dehidrogenáz-l-gén (Adhl) promoterrel, és egy intakt Actl-5’intron jelenlététől függött.

Dávid McElroy és munkatársai (1991) egyszikűek transzformációjára alkalmas optimalizált vektorok előállítását írták le, amelyekhez vagy karfioleredetű mozaikvírus (CaMV) 35S-promoterét vagy az Actl-promotert használták. Tranziens expressziós vizsgálati eljárást végeztek mind a transzformált rizs- mind a kukoricaprotoplasztokon. Ha az említett mindkét promoterszekvenciához Actl-intront és optimalizált GUS transzlációs iniciációs szakaszt kapcsoltak, a gén expressziója jelentősen fokozódott. Nem közölt eredményként megemlítették azt is, hogy kimutatták, hogy az aktinpromoter irányítja a GUS-expressziót a búza-, a zab-, az árpa- és a cirokprotoplasztok tranziens mérési eljárásában.

Wanggen Zhang és munkatársai (1991) transzgenikus rizsnövények in situ hibridizációs tanulmányait közlik. A rizsnövények egy Actl-GUS génfuziót tartalmaztak, amelyekben az Actl-promoter konstitutív expressziót hoz létre mind vegetatív, mind reproduktív szövetekben.

Jun Cao és munkatársai (1992) közleményükben transzgenikus rizsnövényeket szelektáltak bialophos szelekciós marker segítségével, majd bar-génnel transzformálták, amelynek expresszióját vagy CaMV-35Spromoter vagy rizseredetű Actl-promoter vezérelt.

Alán H. Christensen és munkatársai (1992) leírták, hogy a kukoricaprotoplasztok transzformálása a kukorica Uhi-l-CAT génfiizióval körülbelül 10-szer magasabb CAT-aktivitást adott a tranziens expressziós vizsgálati eljárásban, mint a kukoricasejtek CaMV-35SGUS génfiizióval transzformálva. Az Ubi-1 és az Ubi-2 transzkripciós szint Northem-blot-analízise és a fiatal kukoricanövények azt követő hősokkja azt demonstrálta, hogy mindkét gén konstitutívan fejeződik ki 25 °C-on, de a hősokk után indukálódik.

Seiichi Toki és munkatársai (1992) stabilan transzformáit transzgenikus növényeket írtak le, amelyeket a bar-gén elektroporációval létrehozott transzformációjával kaptak, az expressziót kukoricaeredetű Ubi-l-promoter vezérelte és a szelekció bialophosszal történt. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy az Ubi-1-promoter megfelelően magas génexpresszió vezérlésére használható rizsben, amelynek segítségével termékeny, transzgenikus rizsnövényeket szelektálhattak és regenerálhattak.

J. Troy és munkatársai (1993) stabilan transzformált búzanövényeket állítottak elő éretlen embriókból előállított kalluszpreparátumok részecskebombázásával, amelyek mind bar-gént, mind kukoricaeredetű GUS-gént tartalmaztak, mindkettő expresszióját kukoricaeredetű Ubi-1-promoter vezérelte, és azután bialophosszal szelektáltak. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy az Ubi-l-promoter megfelelően magas génexpressziót vezérelt búzában, amelynek segítségével termékeny, transzgenikus növényeket szelektálhattak és regenerálhattak.

Yuechun Wan és Peggy G. Lemaux (1994) stabilan transzformált árpanövényeket állítottak elő az embrionális árpaszövetek részecskebombázásával, amelyek mind bar-gént, mind GUS-gént tartalmaztak, mindkettő

HU 221 795 BI expresszióját kukoricaeredetű Ubi-1-promoter vezérelte, és azután bialophosszal szelektáltak. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy az Ubi-1-promoter megfelelően magas génexpressziót vezérelt árpában, amelynek segítségével termékeny, transzgenikus növényeket szelektálhattak és regenerálhattak. Egy másik kísérletben kisszámú növényt bombáztak. A növények vagy Ubi-bar vagy CaMV-35S-bar konstrukciót tartalmaztak. A kapott transzformánsok számában nem volt szignifikáns különbség.

Junko Kyozuka és munkatársai (1991) transzgenikus rizsnövényeket állítottak elő kukoricaeredetű Adhl-promoter-GUS fúzió rizsprotoplasztokba ültetésével. A GUS-expressziót úgy határozták meg, hogy transzgenikus növényekben mérték a GUS-aktivitást. A kukoricaeredetű Adhl-promoter konstitutív expressziót vezérelt a növény minden vizsgált részében. Ahogyan az korábban már ismertté vált a kukoricában lezajló Adhl-vezérelt expresszióról is, az Adhlvezérelt GUS-expresszió a gyökerekben anaerob körülmények között indukálódott.

D. I. Last és munkatársai (1991) kukoricaeredetű Adhl-promotert módosítottak úgy, hogy a kukoricaeredetű ADHl-gén anaerob reszponzív elemet több kópiában és az Agrobacterium tumefaciens-bSÍ származó oktopinszintetáz-gén ocs-elemeit (pEmu) építették be. A különböző egyszikű fajok pEmu-GUS-zal transzformáit protoplasztjainak tranziens expressziós vizsgálati eljárásában a legjobb konstrukció 10-50-szer nagyobb expressziót adott búzában, kukoricában, rizsben és alakorban, mint a CaMV-35S-promoterrel vezérelt expresszió.

Róbert Bower és Róbert G. Birch (1992) stabil transzformánsokat állítottak elő cukorrépa embrionális kalluszának transzformációjával neomycin-foszfotranszferáz-génnel, az Emu-promoter vezérletével.

A. Chamberlain és munkatársai (1994) Emu-promotert alkalmaztak négy különböző szelekciós marker expressziójának vezérlésére (neomycin-foszfotranszferáz, hygromycin-foszfotranszferáz, phosphinotrycin-N-acetil-transzferáz és egy mutáns herbicidrezisztenciát okozó acetol-acetát-szintetáz), amelyeket búzába és rizsbe transzformáltak. Búzakalluszokat és transzformált rizsnövényeket kaptak a transzformánsok szelektálása után, demonstrálva, hogy a promoter szelekciós markergének expressziójának vezérlésére alkalmazható, így transzformált gabonafélék előállítására alkalmas.

Nemrégiben publikáltak egy irodalmi összefoglalót olyan promoterekről, amelyek idegen gének expresszióját vezérlik transzgenikus gabonafélékben. Az összefoglalót a referenciajegyzék tartalmazza (McElroy és Brettel, 1994).

Számos promoter használatos jelenleg kétszikű növények transzformációjára. Ezek a promoterek különféle fonásokból származnak. Az általánosan használt promoterek egyik csoportját Agrobacterium tumefaciensból izolálták, ahol funkciójuk az opinszintetázgén expressziójának vezérlése. Az opinszintetázgént a T-DNSszegmens tartalmazza, amely a növényi genomba integrálódik az infekció során. Ezek a következő promoterek: oktopinszintetáz (ocs)-promoter [L. Comai és munkatársai (1985); C. Waldron és munkatársai (1985)], a mannopinszintetáz (mas)-promoter [L. Comai és munkatársai (1985), K. E. McBridge és K. R. Summerfelt (1990)] és a nopalinszintetáz (nos)-promoter [M. W. Bevan és munkatársai (1983), L. Herrera-Estrella és munkatársai (1983), R. T. Fraley és munkatársai (1983), M. De Block és munkatársai (1984), R. Hain és munkatársai (1985)]. Ezek a promoterek sokféle növényi szövetben aktívak.

Számos víruspromoter is alkalmazható kétszikűek heterológ génexpressziójának vezérlésére [J. C. Kridl és R. M. Goodman (1986)]. A karfioleredetű mozaikvírus 35S-promotere az egyik leggyakrabban használt kétszikűek transzformációjára, mivel nagymértékű génexpressziót eredményez szinte minden szövetben [J. Odell és munkatársai (1985), D. W. Ow és munkatársai (1986), D. M. Shah és munkatársai (1986)]. A promoter módosított változatai is használatosak, beleértve a két tandem módon kapcsolódott 35S-promotert [R. Kay és munkatársai (1987)] és a mas-35S-promotert [L. Comai és munkatársai (1990)], amely a mannopinszintetáz-promoterből áll tandem módon kapcsolódva a 35S-promoterhez. Mindkét említett promoter magasabb szintű génexpressziót vezérel, mint a 35S-promoter egy kópiája. Más használatban lévő víruseredetű promoter a karfioleredetű mozaikvírus 19S-promotere [J. Paszkowski és munkatársai (1984), E. Balazs és munkatársai] és a fügeeredetű mozaikvírus 34S-promotere [M. Sanger és munkatársai (1990)].

Az AHAS-expresszióról készült tanulmányokban számos növény esetében kimutatták, hogy az AHAS minden növényi szövetben kifejeződik. Gail Schmitt és Bijay K. Singh (1990) leírták, hogy limabab különféle szöveteiben végzett enzimaktivitás-mérések alapján, az AHAS-aktivitás minden vizsgált szövetben megtalálható volt, beleértve a leveleket, törzseket, gyökereket, virágokat, hüvelyeket és a merisztémákat. Az AHASaktivitás majdnem állandó volt a törzsekben, de lecsengő volt a levelekben, gyökerekben és merisztémákban a kor növekedésével.

Sharon J. Kheeler és munkatársai (1993) leírták, hogy a dohány két acetoxi-hidroxid-szintetázt kódoló gént tartalmaz, a SurA-t és SurB-t. Mindkét gén kifejeződik az összes szövettípusban. Az expressziós szintben négyszeres variáció lehetséges az egyes szövetek szerint. A kifejlett szervekben a legmagasabb az expressziós szint. In situ hibridizációs vizsgálatok kimutatták, hogy a legmagasabb szintű expressziót következetesen vagy metabolikusan aktív vagy gyorsan osztódó sejtekben figyelhetjük meg. A SurB-gén magasabb szinten expresszálódott az összes vizsgált szövetben, mint a SurA-gén.

Therese Ouellet és munkatársai (1992) leírták, hogy a Brassica fajok acetoxi-hidroxi-szintetázt kódoló multigéncsaládokat tartalmaznak. Az öt AHAS-gén közül négyet azonosítottak a Brassica napus-b&n. Génspecifikus próbákon alapuló RN-áz-protekciós vizsgálati eljárásokat alkalmaztak, hogy meghatározzák a géncsalád különböző tagjainak expresszióját a különböző Bras3

HU 221 795 Bl sica fajokban. Kettő a gének közül, az AHAS1 és az AHAS3 konstitutívan fejeződött ki minden vizsgált szövetben. Az AHAS2-transzkriptumok csak a reproduktív szervekben és a magok extraembrionális szövetében voltak megtalálhatóak. A negyedik gén, az AHAS4 által kódolt transzkriptumokat nem detektáltak, így erről a génről azt gondolták, hogy pszeudogén.

Dalé L. Shaner és N. Moorthy Mallipudi (1991) közleményében fiatal kukoricalevelek és szuszpenziós tenyészetben növesztett BMS-sejtek AHAS-aktivitásának összehasonlítása azt mutatta, hogy a BMS-sejtek aktivitása egy gramm friss tömegre vonatkoztatva körülbelül 5,8-szor nagyobb volt a levelekben találhatónál. Mivel a BMS-sejtek aktívan osztódtak, ez az eredmény összhangban van az előző idézett tanulmánnyal, amely a dohány és a limabab esete volt. Ez azt mutatta, hogy a fiatal aktívan osztódó szövetekben több AHASaktivitás található, mint az öregebb szövetekben.

A bevitt gének nagymértékű expresszálására kukoricából származó AHAS-promotereket alkalmaztunk különféle növényi szövetekben. A kukoricaeredetű alslés als2-gének promotereit klónoztuk és szekvenáltuk (1. ábra, 2. ábra, 3. ábra), és ezután az említett génekből származó promotereket bevittük egy plazmidba a bétaglükuronidáz (GUS) riportergéntől 5’-irányban. Mindkét promoterffagmens a XI12-kukorica-sejtvonalból származott. Az alsl-promoter-fragmens megközelítőleg 1400 bp, az als2-promoter-fragmens pedig 819 bp méretű volt. Az AHAS-promoterek aktivitásának meghatározásához a kiméraplazmidokat Black Mexican Sweet kukoricaprotoplasztokba és rizsprotoplasztokba juttattuk a tranziens expressziós szint vizsgálatához. Összehasonlításképpen, a protoplasztokat a CaMV-35S-promoterrel is transzformáltuk, amely a GUS riportergént irányítja. A kiméraplazmidok expresszióját a kukoricasejtekben a GUS-enzim aktivitásának mérésével határoztuk meg. Az als2-kukoricapromoter aktivitása egyenlő vagy nagyobb volt, mint a CaMV-35S-promoter aktivitása mindkét sejttípusban (4. ábra). Az 5. ábrán láthatjuk a béta-glükuronidáz-enzim aktivitásának mérési eredményeit a kukorica-BMS-sejtvonalakban, melyeket stabilan transzformáltunk vagy pCD221 B-vel (als2-GUSocs terminátorplazmid) vagy pAC400-zal (CaMV 35SGUS-ocs terminátorplazmid). Az AHAS-mRNS megoszlásának analíziséhez radioaktívan jelölt RNSpróbákat növényi szövetekhez in situ hibridizáltunk. Az eredmények azt mutatták, hogy a kukoricaeredetű AHAS-promoterek aktívak a legtöbb növényi részben (6. ábra, 7. ábra, 8. ábra).

Az Arabidopsis-eredetíi AHAS-promoter aktivitását Arabidopsis növényekben vizsgáltuk, amelyeket stabilan transzformáltunk Agrobacterium tumefaciens-sél. Az Arabidopsis-AHAS-gén 5'-végi promoterszakaszát fuzionáltuk a GUS riportergénhez a pBIN19-bináris vektorba inszertálva, és ezt használtuk az Arabidopsis transzformációjához. A transzformált növények vizsgálata kimutatta a GUS-expressziót (jelezve a promoter aktivitását) a legtöbb növényi részben.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a leíráshoz csatolt ábrákat.

Az 1. ábrán az ALS1-AHAS promoterszekvencia látható az XA17-kukorica-sejtvonalból.

A 2. ábrán az ALS2-AHAS promoterszekvencia látható az XA17-kukorica-sejtvonalból.

A 3. ábrán az ALS2-AHAS promoterszekvencia látható az XI12-kukorica-sejtvonalból.

A 4. ábrán látható oszlopdiagram mutatja be a Black Mexican Sweet kukoricasejtekből vagy a rizseredetű sejtszuszpenzióból készült protoplasztok tranziens expressziós vizsgálatának béta-glükuronidáz-aktivitásait. Az említett sejtek vizsgálata a pCD221B-plazmiddal (als2-promoterGUS-ocs terminátorplazmid) vagy a pAC400-plazmiddal (CaMV-35 SGUS-ocs terminátorplazmid) végzett transzformáció után történt. A GUS-aktivitást pmol/perc/mg proteinben adtuk meg. Az eredmények három független kísérletből származtak.

Az 5. ábrán látható oszlopdiagram mutatja be a bétaglükuronidáz aktivitását stabilan transzformáit Black Mexican Sweet kukoricasejtvonalakban transzformáció után, amely vagy pCD221B-plazmiddal (als2promoter-GUS-ocs terminátor) vagy PAC400-plazmiddal (CaMV-35SGUS-ocs terminátor) történt. A „CK” jelzi a nem transzformált kontrollszövetet. A GUS-aktivitást pmol/perc/mg proteinben adtuk meg.

6. ábra: 2 hetes fiatal kukoricanövényekből származó levélörvök in situ hibridizációs kísérletei radioaktívan jelölt RNS-próbák segítségével. Szövetmetszeteket készítettünk és hibridizáltunk RNS-próbákhoz, amelyek vagy AHAS-szensz szálat (AHAS-) vagy AHAS-antiszensz szálat (AHAS+) kódolnak. Összehasonlításképpen SSU-szensz szálat (RUBISCO kis alegység) (SSU-) vagy SSU-antiszensz szálat (SSU+) kódoló próbákat használtunk. Mindkét esetben csak az antiszensz szál (⁺) esetében váquk, hogy hibridizálódjon a szövetben található mRNS-hez. a) SSU⁺-próba; b) SSU-próba; c) AHAS⁺-próba; d) AHAS-próba.

7. ábra: Kukoricamag in situ hibridizációs vizsgálata 12 nappal a beporzás után. Az elkészítés módját lásd a 6. ábra leírásánál, a) embrió és szuszpenzor, AHAS⁺-próba; b) embrió és szuszpenzor, AHAS--próba; c) magburok, aleuron és endospermium, AHAS^_-próba; d) magburok, aleuron és endospermium, AHAS⁺-próba.

8. ábra: Fiatal kukoricanövény apikális merisztémájának in situ hibridizációs vizsgála4

HU 221 795 Bl ta. Az elkészítés módját lásd a 6. ábra leírásánál, a) és b) AHAS⁺-próba; c) és d) AHAS--próba.

A tudósok olyan lehetőségeket tárnak fel a genetikai módosítás felhasználásával, amelyek a növényeket a kívánt tulajdonságokkal ruházzák fel. A génsebészeti eljárások olyan tulajdonságok feljavítására is alkalmasak, mint például az íz, szerkezet, méret, pestisrezisztencia és gyomirtószer-rezisztencia, szín, a termés savassága vagy édessége. Ezek az eljárások sokkal gyorsabb stratégiának bizonyulnak, mint a hagyományos keresztezési módszerek.

A találmány tárgyát kukoricaeredetű és Arabidopszs-eredetű AHAS-promoterek, vektorok és az ezeket a promotereket tartalmazó növényi sejtek képezik. (A jelen leírás vonatkozásában a „promoter” kifejezésen olyan nukleotidszekvenciát értünk, amely a gén 5’végén található, és amelyhez az RNS-polimeráz kötődik.) A kukoricaeredetű alsl- és az als2-géneket megklónoztuk és szekvenáltuk, és a gének promoterrégióit bejuttattuk egy plazmidba a GUS riportergéntől 5’-irányban. A leírás vonatkozásában „riportergén”-en olyan nukleotidszekvenciát értünk, amely a kérdéses promoter után 3’-irányban fuzionált, így a promotemél induló transzkripció áthalad a riportergénen. A riportergének valamilyen nagyon könnyen mérhető enzimet kódolnak; például a jelen találmány szerint a kiméraplazmidok expresszióját kukoricasejtekben a béta-glükuronidáz (GUS)-enzim aktivitásának mérésével határozzuk meg.

Szakember számára nyilvánvaló, hogy az AHASpromoterek sokféle növényi szövetben igen aktívak, és sokféle növényben lehet alkalmazni új gének kifejezésére. Ilyen új gének lehetnek például - anélkül, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk - herbicidrezisztencia-gének, a növényi patogének iránti detoxifikációs és rezisztenciagének.

A szabadalmi igénypontokban említett promoterek heterológ génexpresszióra használhatók egyszikűekben, beleértve - nem korlátozó jelleggel - a következő növényeket: kukorica, rizs, búza, árpa, cirok, zab, rozs és köles. Szakember számára világos, hogy a szabadalmi igénypontokban említett promoterek kétszikűekben is képesek expressziót vezérelni, bár azt várhatjuk, hogy az egyszikű-eredetű promoterek expressziója kétszikűekben alacsonyabb szintű lesz, mint az egyszikűekben.

Szakember számára egyértelmű, hogy a kukoricaeredetű als2-promoter vezérelhet génexpressziót más egyszikű fajban is. Például a rizseredetű Actl-promoter vezérel génexpressziót kukoricaprotoplasztokban, a kukoricaeredetű Emu-promotert használtuk transzgenikus búza, árpa és rizs szelektálásához, és az Arabidopsis AHAS-promoterét (ez kétszikű-eredetű promoter) használtuk AHAS-gén expressziójára transzgenikus dohányban és transzgenikus burgonyában. A szabadalmi igénypontokban említett kukoricaeredetű als2 a legjobban kukoricában működik, de más egyszikűben is vezérel génexpressziót. Kukoricában és más fajokban végzett kutatások alapján, ez a promoter konstitutív génexpressziót kell hogy vezéreljen a növény különböző részeiben. A legmagasabb szintű expressziót vagy aktívan osztódó vagy metabolikusan aktív szövetben találhatjuk.

Szakember számára számos technika ismert egyszikű növények transzformálására, beleértve - nem korlátozó jelleggel - a következőket: részecskebombázás, PEG-közvetített transzformáció, elektroporáció és szilikonrostok használatosak. Az összes említett technika alkalmazza a DNS-vektorokat a transzformálandó nukleotidszekvenciák célba juttatására. A következő vektorok alkalmasak a találmány szerinti megoldásban történő hasznosításra, de az igényelt oltalmi kör nem korlátozódik csak ezekre: markergéneket tartalmazó vektorok a transzgenikus anyag szelekciója céljából; hygromicin-, kanamycin- és bialophosrezisztenciát, valamint imidazolinon- és szulfonil-karbamid gyomirtószerekkel szembeni rezisztenciát kiváltó géneket tartalmazó vektorok.

Az alábbi példák csak a találmány szerinti megoldás szemléltetését szolgálják, és semmilyen értelemben sem korlátozzák az igényelt oltalmi kört.

Példák

Az alsl- és als2-promoterek hatékonyságát a GUSaktivitás mérésével becsüljük meg kukorica- és rizsprotoplasztokban vagy olyan konstrukciókat tartalmazó kukorica-sejtvonalakban, amelyekben ezeket a promoterszekvenciákat a GUS-génhez fuzionáltunk. A vektorok előállítását és a transzformációs eljárást az alábbiakban ismertetjük.

1. példa

Kiméra CaMV-35S-GUS, alsl-GUSés als2-GUS géneket tartalmazó konstrukciók A pAC400-plazmid egy pUC19-alapú plazmid, amely a következő fúziókat tartalmazza: a CaMV-35Spromoterből származó 418 bp-os EcoRI-Xbal fragmenst klónozva 5’-irányban egy 1,7 kb méretű Xbal-PstI fragmenshez, ez utóbbi tartalmazza a GUS-gént, és egy 700 bp-os Pstl-BamHI fragmenst, amely tartalmazza az oktopinszintetáz-terminátort. Az alsl- és az als2-gént a kukoricaeredetű XI12-sejtvonalból preparált génkönyvtár szkrínelése útján izoláltuk. Az alsl-gén ATG-iniciációs kódjától 5’-irányban található 1,4 kilobázis (kb) méretű EcoRI-NcoI fragmenst szubklónoztunk a pAC400plazmidba a CaMV-35S-promoter helyett, így létrehoztuk a pCD223B-plazmidot. Az als2-gén ATG-iniciációs kódjától 5’-irányban található 819 bp méretű Pstl-Ncol fragmenst szubklónoztuk a pBluescript®KS-plazmidba (a Stratagene cégtől szereztük be) a GUS-ocs terminátorfúziótól 5’-irányban, így létrehoztuk a pCD221B-plazmidot. A kukoricaeredetű als2-promoterszekvenciája a

3. ábrán látható.

2. példa

A rizs- és kukoricaprotoplasztok transzformációja és vizsgálati eljárásai

Protoplasztokat izoláltunk rizs- (Nortai) vagy kukorica- (Black Mexican Sweet; BMS) szuszpenziós sej5

HU 221 795 Bl tekből és transzformáltuk azokat pAC221B- vagy pAC400-plazmiddal PEG-közvetített transzformációt alkalmazva, L. A. Lyznik és munkatársai (1989) és J. Y. Peng és munkatársai (1990) eljárása szerint. A tranziens mérési eljáráshoz a transzformált rizsprotoplasztokat Millipore-szűrőkre szélesztettük, majd azokat tápláló („feeder”) sejteket tartalmazó táptalajra helyeztük. A transzformált BMS-protoplasztokat 3 ml folyékony táptalajban tenyésztettük. Két nappal a transzformáció után, a protoplaszttenyészeteket összegyűjtöttük és extraháltuk GUS-extrakciós pufferrel. A GUS-aktivitást fluorimetriásan mértük R. A. Jefferson (1987) eljárása szerint.

A BMS-kukoricatenyészetekből a stabil transzformánsok előállítása céljából a protoplasztokat együtt transzformáltuk pFF19K- (neomycin-foszfotranszferázt kódoló szelekciós markergént tartalmaz), pCD221Bvagy pAC400-plazmiddal. Transzformáció után a protoplasztokat Millipore-szűrőkre szélesztettük, majd azokat tápláló sejteket tartalmazó táptalajra helyeztük. Egy hét múlva a protoplaszttenyészeteket áthelyeztük tápláló sejteket és 100 mg/1 kanamycint tartalmazó tápközegbe. A protoplaszttenyészeteket ezután 100 mg/1 kanamycint tartalmazó friss MS-táptalajba helyeztük addig, amíg rezisztens kalluszok jelentek meg. A kanamycinrezisztens kalluszokat egyenként kivettük, és további kéthárom hétig növesztettük kanamycin jelenlétében. A kanamycinrezisztens kalluszokat „X-Gluc”-festékkel festettük meg, vagy MUG-gal mutattuk ki a GUS-pozitív kalluszokat R. A. Jefferson (1987) eljárása szerint. A kalluszt a GUS-expresszió alapján azonosítottuk, extrakciós pufferben tártuk fel és mértük az enzimaktivitást; a GUS-aktivitást fluorimetriásan mértük.

A fenti kísérletek adatait a 4. és az 5. ábrán láthatjuk.

Egy kukoricaeredetű, imidazolinon típusú gyomirtószer-rezisztenciát okozó AHAS-gént (a kukoricaeredetű als2-promoter vezéreli) használtunk szelekciós markerként BMS-, Al 88 χ B73-sejtek és rizssejtek transzgenikus telepeinek kiválasztására a transzformáció után. Ezek az eredmények alátámasztják azt az elméletet, hogy az als2-promoter elegendően nagymértékű expressziót vezérel ahhoz, hogy a markergén expresszióját is vezérelje.

3. példa

In situ hibridizáció

Metszeteket készítettünk lényegében J. A. Langdale és munkatársai leírása alapján (1988). A szövetet 4%-os formaldehidben fixáltuk, etanollal dehidratáltuk, xilénnel derítettük és parafilmbe ágyaztuk. A szövetet 8-10 μηι-es szeletekre vágtuk és poli-L-lizinnel borított mikroszkóplemezekre helyeztük. A parafílmet xilénnel távolítottuk el, és a szövetet etanolos mosással és vizes öblítéssel rehidratáltuk. RNS-próbákat preparáltunk az als2-promotert kódoló régió 172 nukleotidot (nt) tartalmazó fragmensének mindkét szálából (⁺ és -), és a SSU-kódoló régió 392 nukleotidot (nt) tartalmazó fragmenséből, melyhez „Ambion Maxiscript®” Kitet használtunk. A metszeteket Meyerowitz és munkatársai (1988) módszere szerint hibridizáltuk a próbával 50 °Con, egy éjszakán keresztül, 4 χ hígított SPB-oldatban [100 pl 10 χ sóoldat (3M NaCl, 10 mM TRIS pH 6,8, 50 mM DTA); 400 pl formamid; 200 μΐ 50% dextránszulfát; 40 μΐ 10 mg/ml tRNS; 10 μΐ 1 M DTT; 50 μΐ 10 mg/ml poli-A], A próbát 50%-os formaldehidben és 10 mM DTT-ben denaturáltuk 80 °C-on 30 percig. A metszeteket 2x15 percig mostuk a mosópufferrel (lxsóoldat, 50% formamid, 10 mM TRIS pH 8,0, 1 mM EDTA és 10 mM DTT) 50 °C-on, RN-áz-A-val (20 pg/ml NTE-ben) emésztettük 30 percig 37 °C-on, 5 χ mostuk NTE-pufferrel 37 °C-on összesen 1 óráig, 2x30 percig mostuk mosópufferrel 50 °C-on, etanollal dehidratáltuk és levegőn szárítottuk. A metszeteket autoradiográfiának vetettük alá 37 °C-ra előmelegített emulzióba merítve sötét szobában, 30 perc-1 óráig szárítottuk és az előhívásig sötétben tároltuk 4 °C-on. A metszeteket 2 percig hívtuk elő, vízzel öblítettük, legalább 5 percig fixáltuk és újra öblítettük vízzel. A szövetet „Alcien Blue” festékkel festettük meg, etanollal és xylénnel festéktelenítettük. „Permount”-tal ellátva a szövetet sötét háttérmezős („dark field”) mikroszkópban vizsgáltuk.

Az in situ hibridizációs kísérlet 6-8. ábrákon látható adatai azt mutatják, hogy a gén a kukoricaembrió minden részében kifejeződik.

Az AHAS-promoter által vezérelt expressziót a következőképpen vizsgálhatjuk:

1. Als2-GUS fúziós gént készítünk, és meghatározzuk a GUS-aktivitást transzgenikus kukoricában és rizsben. Korábbi kísérletek kukoricapromoterrel demonstrálták azt a lehetőséget, hogy kukoricapromoter által vezérelt expresszió rizsben is vizsgálható (Junko Kyozuka és munkatársai, 1991). A transzgenikus növények szelekciója után hisztokémiai analízist végezünk a növényeken különféle fejlődési állapotokban azért, hogy meghatározzuk a szövet- és a sejtspecifitást. Ez a technika általánosan használható a promoter aktivitásának vizsgálatához mind egyszikűekben, mind kétszikűekben.

2. Tranziens expressziós vizsgálati eljárást hajtunk végre a protoplasztokon, amelyeket különböző növényfajokból preparáltunk az als2-GUS konstrukcióval való transzformálást követően. Ezt a megközelítést alkalmazzuk a különböző promoterek funkcionális hatásának elemzéséhez heterológ fajokban. A protoplasztokat az említett konstrukcióval transzformáljuk és inkubáljuk, hogy a bevitt gén kifejeződjön és a fehérje fölhalmozódjon. Az inkubáció után megmérjük a sejtben lévő transzformált gén által kódolt fehérje mennyiségét, így meghatározzuk a promoter által vezérelt transzformáit gén expresszióját.

HIVATKOZÁSOK JEGYZÉKE

1. Dávid McElroy et al., (1990) Isolation of an efficient actin promoter fór use in rice transformation. The Plánt Cell 2: 163-171.

2. Dávid McElroy et al., (1991) Construction of expression vectors based on the rice actin 1 (Actl) 5’ region fór use in monocot transformation. Mól. Gén Génét. 231: 150-160.

HU 221 795 Bl

3. Wanggen Zhang et al., (1991) Analysis of the Actl 5’ region activity in transgenic rice plants. The plánt Cell 3: 1155-1165.

4. Jun Cao et al., (1992) Regeneration of herbicide resistant transgenic rice plants following microprojectile-mediated transformation of suspension culture celis. Plánt Cell Reports 11: 586-591.

5. Alán H. Christensen et al., (1992) Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation. Plánt Molecular Biology 18: 675-689.

6. Seiichi Toki et al., (1992) Expression of a maize ubiquitin gene promoter-bar chimeric gene in transgenic rice plants. Plánt Physiol. 100: 1503-1507.

7. J. Troy et al., (1993) Rapid production of multiple independent lines of fertile transgenic wheat (Triticum aestivum). Plánt Physiol. 102: 1077-1084.

8. Yuechun Wan and Peggy G. Lemaux, (1994) Generation of a large number of independently transformed fertile barley plants. Plánt Physiol. 104: 37-48.

9. Junko Kyozuka et al., (1991) Anaerobic induction and tissue-specific expression of maize Adhl promoter in transgenic rice and their progeny. Mól. Gén Génét. 228: 40-48.

10. D. I. Last et al., (1991) pEmu: an improved promoter fór gene expression in cereal celis. Theor. Appl. Génét. 81: 581-588.

11. Róbert Bower and Róbert G. Birch, (1992) Transgenic sugarcane plants via microprojectile bombardment. The Plánt Journal 2 (3): 409-416.

12. D. A. Chamberlain et al., (1994) The use of the Emu promoter with antibiotic and herbicide resistance genes fór the selection of transgenic wheat callus and rice plants. Aust. J. Piát. Physiol., 21: 95-112.

13. L. Comai et al., (1985) Expression in plants of a mutant aroA gene from Salmonella typhimurium confers tolerance to glyphosate. Natúré 317: 741-744.

14. C. Waldron et al., (1985) Resistance to hygromycin B: A new marker fór plánt transformation studies. Plánt Mól. Bioi. 5: 103-108.

15. Kevin E. McBride and Kristin R. Summerfelt, 1990) Improved binary vectors ΐοτ Agrobacteriummediated plánt transformation. Plánt Mól. Bioi. 14: 269-276.

16. Michael Bevan et al., (1983) A chimeric-antibiotic resistance gene as a selectable marker fór plánt cell transformation. Natúré 304: 184-187.

17. Luis Herrera-Estrella et al., (1983) Expression of chimeric genes transferred intő plánt celis using Tiplasmid-derived vector. Natúré 304: 209-213.

18. Róbert T. Fraley et al., (1983) Expression of bacterial genes in plánt celis. P. N. A. S. 80: 4803-4807.

19. Marc De Block et al., (1984) Expression of foreign genes in regenerated plants and in their progeny. EMBO J. 3: 1681-1689.

20. R. Hain et al., (1985) Uptake, integration, expression and genetic transmission of a selectable chimeric gene by plánt protoplasts. Mól. Gén Génét. 199:

161-168.

21. J. C. Kridl and Róbert M. Goodman, (1986) Transcriptional regulatory sequences from plánt viruses. BioEssays4: 4-8.

22. Joan T. Odell et al., (1985) Identification of DNA sequences required fór activity of the cauliflower mosaic vírus 35S-promoter. Natúré 313: 810-812.

23. Dávid W. Ow et al., (1986) Transient and stable expression of the firefly luciferase gene in plánt celis and transgenic plants. Science 234: 856-959.

24. D. M. Shah et al., (1896) Engineering herbicide tolerance in transgenic plants. Science 233: 478-481.

25. Róbert Kay et al., (1987) Duplication of CaMV 35S promoter sequences creates a strong enhancer fór plánt genes. Science 236: 1299-1302.

26. L. Comai et al., (1990) Növel and usefúl properties of a chimeric plánt promoter combining CaMV 35S and MAS elements. Plánt Mól. Bioi. 15: 373-381.

27. J. Pazskowski et al., (1984) Direct gene transfer to plants. EMBO J. 3: 2717-2722.

28. Ervin Balazs et al., (1985) Chimeric vector construction fór higher-plant transformation. Gene 40: 343-348.

29. Margaret Sanger et al., (1990) Characteristics of a strong promoter from figwort mosaic vírus: Comparison with the analogous 35S promoter from cauliflower mosaic vírus and the regulated mannopine synthase promoter. Plánt Mól. Bioi. 14: 433-443.

30. Gail Schmidt and Bijay K. Singh, (1990) Tissue distribution of acetohydroxyacid synthase activity at various developmental stages of lima bean. PesticideSci. 30(4): 418-419.

31. Sharon J. Kheeler et al., (1993) Reguládon of tobacco acteolactate synthase gene expression. Plánt Physiol. 102: 1009-1018.

32. Therese Ouellet et al., (1992) Members of the acetohydroxyacid synthase multigene family of Brassica napus have divergent pattems of expression. The Plánt Journal 2: 321-330.

33. Dalé L. Shaner and N. Moorthy Mallipudi, (1991) Imidazolinone-Acetohydroxyacid synthase interactions. In The Imidazolinone Herbicides ed. Dalé L. Shaner and Susan L. O’Connor CRC Press (Boca Raton, FL.)

34. R. A. Jefferson, (1987) Assaying chimeric genes in plants: the GUS gene fusion system. Plánt Mól. Bioi. Rept. 5: 387-405.

35. L. A. Lyznik et al., (1989) Stable transformation of maize protoplasts with gusA and neo genes. Plánt Mól. Bioi 13: 151-161.

36. J. Y. Peng et al., (1990) Co-transformation of indica rice protoplasts with neo and gusA genes. Plánt Cell Rept. 9: 168-172.

37. J. A. Langdale et al., (1988) Cellular pattem of photosynthetic gene expression in developing maize leaves. Gene Dev. 2: 106-115.

38. E. Meyerowitz et al., (1988) In situ hybridization to RNA in plánt tissue. Plánt Mól. Bio. Rept. 5: 242-250.

HU 221 795 Bl

SZEKVENCIALISTA

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 413 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: genomi DNS HIPOTETIKUS: nem ANTISZENSZ: nem

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: TCTAGAGAAA CTAAACTACT AATAAAAATT ATTTTTAGCA 60

TATTTNNAAA TGATAAAGTT TAACTAAAAG TGCACCGCTA 120

GACCGTAAAT CTCTTCCACG CACTCTGTCG TGTACCAACG 180

ACCTTTGTGT ATTATGTACG GATTCGGGCA ACGGACATTT 240

NATTCCCATC TGAACCACAC ATCTCTGAAC AAAAGTAGGG 300

TTTCCCACAA TCCCACTCCG TGCCAGGTGC CACCCTCCCC 360

GACAGCCGCC CGCAACCATG GCCACCGCCG CCACCGCGGC 413

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 509 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CCGGATTTCC CTGTTGCGGA TTGCGGGTGG CAGCCTGGCA 60

GATTCCCTTG TCTGGGCCCC TTGTGTCAGT ACCGTCTGTA 120

GTCCACAGTC AAGTCCAAAA TCTCCCCTCT TTTTTTTAAC 180

TGACGCACGC TGTCGTGTAC CAGCACTCGG TGGACACCAC 240

CGTCGGTCCC ACGTCGACAG GCCCCACCGT CCGGTCTGTA 300

CGGACGTGTC GTCGTCGTCT TGCGAGTCCC ATTCCCATCA 360

CTGAACAAAA GCAGGGAGGC CTCCACGCAC ATCCCCCTTT 420

CCCACCCCAA ACCCTCGCGC CGCCTCCGAG ACAGCCGCCG 480

GCCGCGTCTA CCGCGCTCAC TGGCGCCAC

509

A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 829 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

TATTTTAGTA

AACCACCGTA

TGCTGTGGAA

CGACGTCGGT

GAGGCGCCCG

AAGCCCTCGC

CGCCGCGCTC

CTGTNGTTTA

AATCCAAAGA

ACGCTCACGT

TTGCCAGTCC

CGTAGCCCCC

GCCGCTCCGA

ACC

GGTGGGTGCG

CTCCGATGAC

GGAACAGTTC

GTTTGTAATC

GCGTGTACGT

CCATCTGAGC

CTCCACTCCG

CAACCATGGC

ACCCCGTTTG

ATGCACCGTC

AAAACCTCCT

CAGGCCGACA

ATTCGGGCGA

CACACATCCT

GTCCGTGGCA

CACCGCCGCC

HU 221 795 Bl

A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEIRASA:

CTGCAGGTCA 60 GTGGGTGAGT	ACGGATCACC	TATCAACATC	CCAGCTAAAA	ACAGTAAAAA	GGGGGAAAAC
TGAGTCTGTC	TTGTGGAAAA	AACGTTTTAG	TTTCTCCTGG	AATTAACAAT
120 AAAAACAGTT	GAACAAGATT	GACTGTTCCT	CCGGGAGGGT	TTGGAACATC	GTTACAGATG
180 TGAGCGAAAG	GTGAGGAAAC	AGAGCGGAGG	GCTTGGAGGT	GACCTCGGTA	GTCAGACGCC
240 GGAGTTGAGC	TTGATGACGA	CACCGTACTG	GCGTACCAGG	CCTAGTAGTG	AACACCGGGC
300 CTGAAGCTGT	CGCCGCCGCT	GCTCATCTTG	TNGGCTGTGC	NCGGTGTCCC	TGTTGCGGAT
360 TGCGGGTGGC	AGCCTGGCAG	GTGGGTGCGA	CCCGTTTGGA	CTCCCTGATC	TGGGCCCTTT
420 GTGTCAGTAC	CGTCTGTACT	CCGATGACAT	GCACANCGTC	GTCCACAGTC	AAGTCCACAA
480 TCTCCCCTCT	TTTTTTAACG	GAATAGTTNC	AAAATCTCCT	TGACGCACGC	TATCGTGTAC
540 CAGCGCTCAC	TGGACACCAC	GTTTGTAATC	CACGCCGACA	CGTCGNTCCC	ACGTCGACAG
600 GCCCCACCGT	CCGGTCTGTA	GCGTGTACGT	ATTCGGGCAA	CGGACGTGTC	GTCGTCGTCT
660 TGCNNNNGTC	CCANNNCCCA	TCACCATCTG	AGCCATCACA	TCTCATGCGT	GAANAAAAGC
720 AGGGAAGGCC	TCTACGCACA	TCCCCCTTTC	TNNCTNNNNT	CCGTGTCCGT	GGCACCCAGG
780 GGAAACCCTC	GCGCCGCCTC	CGAGACAGCC	GCCGCAACCA	TGGCCACCG

829

Claims (16)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Izolált nukleotidszekvencia, amely gének növényekben történő expresszálására alkalmas AHAS-promotert és egy heterológ gént kódoló szekvenciát tartalmaz.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti nukleotidszekvencia, amely AHAS-promoterként a kukoricaeredetű alslvagy als2-gén promoterét tartalmazza.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti nukleotidszekvencia, amely AHAS-promoterként

   a) 1. ábrán látható, 1. azonosító számú szekvenciát tartalmazó szekvenciát,

   b) 2. ábrán látható, 2. azonosító számú szekvenciát tartalmazó szekvenciát, vagy

   c) 3. ábrán található, 3. azonosító számú szekvenciát tartalmazó szekvenciát tartalmaz.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti nukleotidszekvencia, amely AHAS-promoterként a kukoricaeredetű als2-gén promoterét tartalmazza.
5. 5. Az 1. igénypont szerinti nukleotidszekvencia, amely AHAS-promoterként egyszikű növényből izolált promotert tartalmaz.
6. 6. Az 1. igénypont szerinti nukleotidszekvencia, amely AHAS-promoterként kukoricából izolált promotert tartalmaz.
7. 7. Transzformációs vektor, amely 1-6. igénypontok bármelyike szerinti nukleotidszekvenciát tartalmaz.
8. 8. Növényi sejt, amely 7. igénypont szerinti vektort tartalmaz.
9. 9. Kifejlett növény, amely 1-6. igénypontok bármelyike szerinti nukleotidszekvenciát tartalmaz.
10. 10. Eljárás heterológ gén nagymértékű expresszálására növényben és/vagy a növény különböző szöveteiben, azzal jellemezve, hogy a növényben az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti nukleotidszekvenciát expresszáltatjuk.
11. 11. Nukleinsavkonstrukció, amely 1-6. igénypontok bármelyike szerinti szekvenciát tartalmaz.
12. 12. A 11. igénypont szerinti nukleinsavkonstrukció, amely heterológ génként olyan mutáns gént tartalmaz, amely képes egy szelektálható transzgenikus anyagot rezisztenciával felruházni.
13. 13. A 12. igénypont szerinti nukleinsavkonstrukció, amely heterológ génként AHAS-gént tartalmaz.
14. 14. Eljárás a 12. vagy 13. igénypont szerinti nukleinsavkonstrukció szelekciós markerként történő alkalmazására, azzal jellemezve, hogy:

    (i) a nukleinsavkonstrukció beépítésével növényi eredetű anyagot rekombináns úton transzformálunk, (ii) a növényi eredetű anyagot egy meghatározott vegyületet tartalmazó táptalajra helyezzük, (iii) azonosítjuk a vegyület jelenlétében növekedésre képes növényi eredetű anyagokat.
15. 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mutáns génként AHAS-gént tartalmazó nukleinsavkonstrukciót alkalmazunk.
16. 16. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy meghatározott vegyületként imidazolinonvagy szulfonil-karbamid-vegyületet alkalmazunk.