DE69534101T2

DE69534101T2 - Verwendung eines acetohydroxysäure-synthase-promoters zur expression von eingeführten genen in pflanzen

Info

Publication number: DE69534101T2
Application number: DE69534101T
Authority: DE
Inventors: Gabriele Dietrich; Jane Smith; Jianying Peng
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1994-09-08
Filing date: 1995-09-05
Publication date: 2006-03-23
Anticipated expiration: 2015-09-06
Also published as: ATE291631T1; BG101270A; JPH10504968A; CA2198497C; FI119818B; MX9701684A; KR970705637A; HUT77109A; JP3655922B2; EE03933B1; WO1996007746A1; HU221795B1; UA48951C2; AU3544895A; CN1157637A; NO323171B1; FI970958A0; NO971069D0; EP0779928B1; RO117190B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Isolation von nichtcodierenden Nukleosequenzen, die sich als Promoter für die heterologe Genexpression bei Pflanzen eignen. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Vektoren und Pflanzenzellen, die die isolierten Nukleotidsequenzen umfassen.
ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Das Pflanzenreich gliedert sich in zwei Stämme, nämlich die Bryophyta und die Tracheophyta. Der Stamm Tracheophyta beinhaltet über 266,000 Arten, die in vier Unterstämme eingeteilt werden. Der Unterstamm Pteropsida beinhaltet die Klasse Angiospermae. Diese Klasse wird in zwei Unterklassen, nämlich die zweikeimblättrigen Pflanzen (Dikotyledonen) und die einkeimblättrigen Pflanzen (Monokotyledonen) aufgeteilt.
Da zu den Monokotyledonen viele wichtige Körner- und Futterpflanzen zählen, ist die Pflanzengenetik sehr daran interessiert, transgene Monokotyledonen herstellen zu können. Es sind ungefähr 50,000 Monokotyledonen-Arten bekannt. Zu diesen zählen die Lilien, Palmen, Orchideen, Iris-Arten, Tulpen, Seggen und Gräser. Zu den Gräsern zählen Mais, Weizen, Reis und alle sonstigen getreideartigen Körnerfrüchte. Leider war es äußerst schwierig, Monokotyledonen genetisch zu modifizieren, und daher wurde der Großteil der Arbeiten mit Pflanzen an Dikotyledonen durchgeführt.
Die Dikotyledonen sind die größere Gruppe dieser beiden Gruppen; es sind ungefähr 200,000 Arten bekannt. Hahnenfuß, Löwenmaul, Nelke, Magnolie, Mohn, Kohl, Rose, Erbse, Weihnachtsstern, Baumwollpflanze, Kaktus, Karotte, Heidelbeere, Minze, Tomate, Sonnenblume, Ulme, Eiche und Ahorn stehen für 19 der 250 Dikotyledonen-Familien.
Die genetische Information innerhalb eines DNA-Moleküls dient üblicherweise als Matrize für die Synthese einer Vielzahl von kürzeren RNA-Molekülen, von denen die meisten wiederum als Matrizen für die Synthese von bestimmten Polypeptidketten dienen. Einzelne Nukleotidsegmente (die häufig als Promoter bezeichnet werden) werden von RNA-Polymerase-Molekülen, die die RNA-Synthese starten, erkannt. Nach Beendigung der Transkription einer funktionellen RNA-Kette führt eine zweite Gruppe von Signalen zum Abbruch der RNA-Synthese und zum Ablösen der RNA-Polymerase-Moleküle von ihren jeweiligen DNA-Matrizen.
Derzeit werden einige häufig vorkommende Promoter dazu verwendet, die heterologe Genexpression in monokotylen Pflanzen anzutreiben.
David McElroy et al. (1990) stellten fest, daß Assays zur vorübergehenden Expression eines Konstrukts, in dem der Promoter des Actin-1-Gens (Act 1) aus Reis mit dem bakteriellen β-Glucuronidase-Gen (GUS) in transformierten Reisprotoplasten fusioniert war, zeigte, daß der Actinpromoter eine starke Genexpression antreibt. Diese Expression war ungefähr 6mal stärker als diejenige, die mit dem Promoter des Alkoholdehydrogenase-1-Gens (Adh1) aus Mais erzielt wurde und ist vom Vorliegen eines intakten Act1 5'-Intron abhängig.
David McElroy et al. (1991) stellten fest, daß optimierte Vektoren für die Transformation von Monokotyledonen entweder mit dem 35S-Promoter des Blumenkohlmosaikvirus (CaMV) oder mit dem Act1-Promoter konstruiert wurden. Assays mit vorübergehender Expression wurden mit transformierten Reis- und Maisprotoplasten durchgeführt. Das Hinzufügen des Act1-Introns und einer optimierten GUS-Translationsinitiationsstelle an jede dieser Promotersequenzen erhöhte die Genexpression wesentlich. Als unveröffentlichtes Ergebnis wird auch festgestellt, daß gezeigt wurde, daß der Actinpromoter die GUS-Expression in transienten Assays an Weizen-, Hafer-, Gersten- und Sorghumprotoplasten antreibt.
Wanggen Zhang et al. (1991) stellten fest, daß in-situ-Hybridisierungsuntersuchungen an transgenen Reispflanzen, die eine Act1-GUS-Genfusion trugen, zeigten, daß der Act1-Promoter sowohl in vegetativem als auch in reproduktivem Gewebe ein konstitutives Expressionsmuster aufweist.
Jun Cao et al. (1992) stellten fest, daß nach Transformation mit dem bar-Gen, das entweder unter der Kontrolle des CaMV-35S-Promoters oder des Reis-Act1-Promoters exprimiert wurde, transgene Reispflanzen auf Bialophos selektiert wurden.
Alan H. Christensen et al. (1992) stellten fest, daß Maisprotoplasten, die mit einer Mais-Ubi-1-CAT-Genfusion transformiert worden waren, ungefähr 10mal höhere CAT-Aktivitätsniveaus aufwiesen als Maiszellen, die in Assays zur vorrübergehenden Expression mit einer CaMV-35S-GUS-Infusion transformiert worden waren. Mit Northern-Blot-Analysen der Ubi-1- und Ubi-2-Transkriptmengen nach mit Hitzeschock behandelten Maiskeimlingen wurde nachgewiesen, daß beide Gene bei 25°C konstitutiv exprimiert werden, jedoch nach dem Hitzeschock induziert werden.
Seiichi Toki et al. (1992) stellten fest, daß nach Transformation mittels Elektroporation des bar-Gens, das unter der Kontrolle des Mais-Ubi-1-Promoters exprimiert wurde, und Selektion auf Bialophos stabil transformierte transgene Reispflanzen erhalten wurden. Dieses Ergebnis zeigt, daß der Ubi-1-Promoter dazu verwendet werden kann, eine so starke Genexpression in Reis anzutreiben, daß fortpflanzungsfähige transgene Reispflanzen selektiert und regeneriert werden können.
J. Troy et al. (1993) stellten fest, daß nach Beschuß von Kalli, die von unreifen Embryos stammten, mit dem bar-Gen und mit GUS, die jeweils unter der Kontrolle des Mais-Ubi-1-Promoters exprimiert wurden, und anschließende Selektion auf Bialophos stabil transformierte Weizenpflanzen erhalten wurden. Dieses Ergebnis zeigt, daß der Ubi-1-Promoter dazu verwendet werden kann, eine so starke Genexpression in Weizen anzutreiben, daß fortpflanzungsfähige transgene Weizenpflanzen selektiert und regeneriert werden können.
Yuechun Wan und Peggy G. Lemaux (1994) stellten fest, daß nach Mikroprojektil-Beschuß von embryonalem Gerstengewebe mit dem bar-Gen und mit GUS, die jeweils unter der Kontrolle des Mais-Ubi-1-Promoters exprimiert wurden, und anschließende Selektion auf Bialophos stabil transformierte fortpflanzungsfähige Gerstenpflanzen erhalten wurden. Dieses Ergebnis zeigt, daß der Ubi-1-Promoter dazu verwendet werden kann, eine so starke Genexpression in Gerste anzutreiben, daß fortpflanzungsfähige transgene Gerstenpflanzen selektiert und regeneriert werden können. Bei einem Versuch, in dem eine kleine Anzahl von Pflanzen entweder mit Ubi-bar oder mit CaMV-35S-bar beschossen wurden, wurden keine wesentlichen Unterschiede bezüglich der Anzahl der erhaltenen Transformanten beobachtet.
Junko Kyozuka et al. (1991) stellten fest, daß zur Gewinnung von transgenen Reispflanzen eine Mais-Adh1- Promoter-GUS-Fusion in Reisprotoplasten eingeführt wurde. Zur Bestimmung des GUS-Expressionsmusters wurde die GUS-Aktivität in den transgenen Planzen untersucht. Es wurde gefunden, daß der Mais-Adh1-Promoter die konstitutive Expression in allen Teilen der geprüften Pflanzen förderte. Wie dies zuvor für die Expression von Adh1 in Mais gezeigt wurde, wurde auch die von Adh1 angetriebene GUS-Expression in den Wurzeln durch anaerobe Bedingungen induziert.
D. I. Last et al. (1991) stellten fest, daß, wenn der Mais-Adh1-Promoter durch Zugabe von mehreren Kopien des "Anaerobic Responsive"-Elements des Mais-ADH1-Gens und von ocs-Elementen aus dem Octopinsynthasegen von Agrobacterium tumefaciens (pEmu) modifiziert wurde. In Assays zur vorübergehenden Expression, die an Protoplasten von unterschiedlichen Monokotyledonen-Arten, die mit pEmu-GUS, dem besten Konstrukt, transformiert worden waren, durchgeführt wurden, wurden bei Weizen, Mais, Reis, Einkorn und Lolium multiflorum 10–50mal höhere Expressionsniveaus erzielt als mit dem CaMV-35S-Promoter.
Robert Bower und Robert G. Birch (1992) stellten fest, daß nach Transformation von embryogenem Zuckerrohrkallus mit dem Neomycin-Phosphotransferasegen unter der Kontrolle des Emu-Promoters stabile Transformanten erhalten wurden.
D. A. Chamberlain et al. (1994) stellten fest, daß der Emu-Promoter dazu verwendet wurde, um die Expression von vier unterschiedlichen selektierbaren Markergenen (Neomycin-Phosphotransferase, Hygromycinphosphotransferase, Phosphinotricin-N-Acetyltransferase und eine Acetolactatsynthase-Mutante, die Herbizidresistenz verleiht), die sowohl in Weizen als auch in Reis transformiert worden waren, anzutreiben. Nach der Selektion der Transformanten erhielt man Weizenkallus und transformierte Reispflanzen, wodurch gezeigt wurde, daß der Promoter dazu verwendet werden kann, um die Expression von selektierbaren Markergenen für die Gewinnung von transformierten Getreidearten anzutreiben.
Ein Übersichtsartikel über die Promoterelemente, die für die Kontrolle der Fremdgenexpression in transgenen Getreidearten verwendet wurden, wurde in jüngster Zeit veröffentlicht und bildet durch Bezugnahme Bestandteil des vorliegenden Texts. (McElroy und Brettel, 1994).
Derzeit werden mehrere Promoter für die Transformation von dikotyledonen Pflanzen verwendet. Diese Promoter stammen von verschiedenen unterschiedlichen Quellen. Eine Gruppe von häufig verwendeten Promotern wurde aus Agrobacterium tumefaciens isoliert, wo sie dahingehend agieren, daß sie die Expression der Opinsynthasegene, die auf dem T-DNA-Segment, das während der Infektion in das pflanzliche Genom integriert wird, vorhanden sind, antreiben. Zu diesen Promotern zählen der Octopinsynthase (ocs)-Promoter (L. Comai et al., 1985; C. Waldron et al., 1985), der Mannopinsynthase (mas)-Promoter (L. Comai et al., 1985; K. E. McBride und K. R. Summerfelt, 1990) und der Nopalinsynthase (nos)-Promoter (M. W. Bevan et al., 1983; L. Herrera-Estrella et al., 1983, R. T. Fraley et al., 1983, M. De Block et al., 1984, R. Hain et al., 1985). Diese Promoter sind in verschiedensten pflanzlichen Geweben aktiv.
Zum Vorantreiben der heterologen Genexpression in Dikotyledonen werden auch mehrere Viruspromoter verwendet (J. C. Kridl und R. M. Goodman, 1986). Einer der am häufigsten für die Transformation von Dikotyledonen verwendeten Promoter ist der Blumenkohlmosaikvirus-35S-Promoter, da er eine starke Genexpression in beinahe allen Geweben vermittelt (J. Odell et al., 1985; D. W. Ow et al., 1986; D. M. Shah et al., 1986). Modifikationen dieses Promoters werden ebenfalls verwendet, darunter eine Konfiguration mit zwei Tandem-35S-Promotern (R. Kay et al., 1987) und dem mas-35S-Promoter (L. Comai et al., 1990), die aus dem Mannopinsynthasepromoter in Tandem mit dem 35S-Promoter besteht. Gemeinsam treiben diese Promoter eine noch stärkere Genexpression an als eine einzelne Kopie des 35S-Promoters. Zu weiteren Viruspromotern, die verwendet wurden, zählen der Blumenkohlmosaikvirus-19S-Promoter (J. Paszkowski et al., 1984; E. Balazs et al.) und der 34S-Promoter des Figwort Mosaik Virus (M. Sanger et al., 1990).
Aus Untersuchungen der AHAS-Expression an mehreren Pflanzen geht hervor, daß AHAS in allen pflanzlichen Geweben exprimiert wird. Gail Schmitt und Bijay K. Singh (1990) stellten fest, daß Enzymassays, die an verschiedenen Geweben der Limabohne durchgeführt wurden, zeigten, daß in allen geprüften Geweben, darunter Blättern, Stengeln, Wurzeln, Blüten, Hülsen und Meristemen, AHAS-Aktivität vorlag. Es wurde gefunden, daß die AHAS-Aktivität in den Stengeln ziemlich konstant ist, jedoch in den Blättern, Wurzeln und Meristemen mit zunehmendem Alter abnahm.
Sharon J. Kheeler et al. (1993) stellten fest, daß Tabak zwei Gene, die für die Acetohydroxysäuresynthase codieren, nämlich SurA und SurB, enthält. Es scheint, daß beide Gene in allen Gewebetypen exprimiert werden, wobei das Expressionsniveau in den unterschiedlichen Geweben um ungefähr das vierfache schwankt. Es scheint, daß in Entwicklung begriffene Organe das höchste Expressionsniveau aufweisen. Aus in-situ-Hybridisierungsuntersuchungen ging hervor, daß das höchste Expressionsniveau immer in metabolisch aktiven Zellen oder Zellen mit rascher Teilungstätigkeit beobachtet wurde. In allen geprüften Geweben wurde SurB stärker als SurA exprimiert.
Therese Ouellet et al. (1992) stellten fest, daß Brassica-Arten Multigenfamilien, die für die Acetohydroxysäuresynthase codieren, enthalten. In Brassica napus wurden vier der fünf AHAS-Gene identifiziert. Zur Bestimmung der Expressionsmuster der unterschiedlichen Mitglieder der Genfamilie in verschiedenen Brassica-Arten wurden RNAse-Schutz-Assays mit genspezifischen Sonden durchgeführt. Es wurde gefunden, daß zwei dieser Gene, nämlich AHAS1 und AHAS3, in allen geprüften Geweben konstitutiv exprimiert wurden. AHAS2-Transkripte wurden nur in den reproduktiven Organen und in extraembryonalem Gewebe von Samen nachgewiesen. Transkripte, die von dem vierten Gen, nämlich AHAS4, codiert wurden, wurden nicht nachgewiesen, und es wird daher angenommen, daß dieses Gen ein Pseudogen darstellt.
Dale L. Shaner und N. Moorthy Mallipudi (1991) stellten fest, daß aus einem Vergleich der AHAS-Aktivität in jungen Maisblättern und in in Suspensionskultur gezüchteten BMS-Zellen hervorgeht, daß die Aktivität der BMS-Zellen pro Gramm Frischgewicht ungefähr 5,8mal höher lag als dies bei den Blattproben der Fall war. Da sich die BMS-Zellen aktiv teilen stimmt dieses Ergebnis mit Ergebnissen von früheren Untersuchungen am Tabak und an der Limabohne überein, in denen gezeigt wurde, daß jüngere Gewebe mit aktiver Teilungstätigkeit mehr AHAS-Aktivität als ältere Gewebe aufweisen.
DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Es wird ein Mais-AHAS-Promoter für die starke Expression von eingeführten Genen in verschiedenen Pflanzengeweben verwendet. Der Promoter des Mais-als2-Gens wird kloniert und sequenziert (3), und die Promoterregion von diesem Gen wird dann in 5'-Richtung des Beta-Glucuronidase (GUS)-Reportergens in ein Plasmid eingeführt. Das Promoterfragment stammt von der Maislinie XI12. Das als2-Promoterfragment enthält 819 Basenpaare. Für die Bestimmung der Aktivität des AHAS-Promoters werden die Hybridplasmide dann in Protoplasten von Mais "Black Mexican Sweet" und in Reisprotoplasten eingebracht, um das Ausmaß der Transientenexpression zu untersuchen. Für Vergleichszwecke werden Protoplasten auch mit einem Plasmid mit den CaMV-35S-Promoter, der das GUS-Reportergen antreibt, transformiert. Die Expression der Hybridplasmide in den Maiszellen wird durch Untersuchen der GUS-Enzymaktivität bestimmt. Die Aktivität des Mais-als2-Promoters war in beiden Zelltypen gleich hoch wie bzw. höher als die Aktivität des CaMV-35S-Promoters (4). In 5 sind die Ergebnisse der Beta-Glucuronidase-Assays gezeigt, die an Mais-BMS-Zellinien, welche stabil entweder mit pCD221B (als2-GUS-ocs-Terminator-Plasmid) oder mit pAC400 (CaMV 35S-GUS-ocs-Terminator-Plasmid) transformiert worden waren, durchgeführt wurden. Eine Untersuchung der AHAS-mRNA-Verteilung durch in-situ-Hybridisierung von radioaktivmarkierten RNA-Sonden mit Pflanzengewebe zeigt, daß die Mais-AHAS-Promoter in den meisten Pflanzenteilen aktiv sind (6, 7, 8).
Die Aktivität des Arabidopsis-AHAS-Promoters wird in Arabidopsis-Pflanzen, die stabil mit Agrobacterium tumefaciens transformiert sind, untersucht. Die stromaufwärtsliegende Promoterregion des Arabidopsis-AHAS-Gens wird mit dem GUS-Reportergen fusioniert, in den binären Vektor pBIN19 eingefügt und für die Transformation von Arabidopsis verwendet. Eine Untersuchung der transformierten Pflanzen zeigt GUS-Expression (die die Promoteraktivität anzeigt) in den meisten Pflanzenteilen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
1 beschreibt die AHAS-Promotersequenz ALS1 aus Mais XA17.
2 beschreibt die AHAS-Promotersequenz ALS2 aus Mais XA17.
3 beschreibt die AHAS-Promotersequenz ALS2 aus Mais XI12.
4 ist ein Balkendiagramm, das die Beta-Glucuronidase-Aktivität von transienten Assays von Protoplasten von Maiszellen "Black Mexican Sweet" oder Reis-Suspensionszellen nach Transformation mit pDC221B (als2-Promoter-GUS-ocs-Terminator-Plasmid) oder pAC400 (CaMV 35S-GUS-ocs-Terminator-Plasmid) zeigt. Die GUS-Aktivität wird als pmol/min/mg Protein berechnet. Die Ergebnisse stammen von drei unabhängigen Versuchen.
5 ist ein Balkendiagramm, das die Beta-Glucuronidase-Aktivität in stabiltransformierten "Black Mexican Sweet"-Zellinien nach Transformation mit entweder pCD221B (als2-Promoter-GUS-ocs-Terminator) oder PAC400 (CaMV 35S-GUS-OCS-Terminator) zeigt. CK bedeutet untransformiertes Kontrollgewebe. Die GUS-Aktivität wird als pmol/min/mg Protein berechnet.
6 – In-situ-Hybridisierungsuntersuchungen von Blattwirteln aus 2 Wochen alter Maiskeimpflanze, bei denen radioaktivmarkierte RNA-Sonden verwendet wurden. Gewebeschnittpräparate wurden hergestellt und mit RNA-Sonden, die entweder für den AHAS-Sinn-Strang (AHAS-) oder den AHAS-Antisinn-Strang (AHAS+) codieren, hybridisiert. Für einen Vergleich wurden auch die SSU (kleine Untereinheit der RUBISCO)-Sinn-Strang (SSU-)- bzw. SSU-Antisinn-Strang (SSU+)-Sonden verwendet. In jedem Fall wird erwartet, daß nur der Antisinn-Strang (+) mit der in dem Gewebe vorhandenen mRNA hybridisiert. a) (SSU+)-Sonde; b) (SSU–)-Sonde; c) (AHAS+)-Sonde; d) (AHAS–)-Sonde.
7 – In-situ-Hybridisierungsuntersuchungen am Maiskorn 12 Tage nach der Bestäubung; Herstellung wie bei 6; a) Embryo und Suspensor, (AHAS+)-Sonde; b) Embryo und Suspensor, (AHAS–)-Sonde; c) Pericarp, Aleuron und Endosperm, (AHAS–)-Sonde; d) Pericarp, Aleuron und Endosperm, (AHAS+)-Sonde.
8 – In-situ-Hybridisierungsuntersuchungen am Apicalmeristem von junger Maispflanze; Herstellung wie für 6 beschrieben. a) und b) (AHAS+)-Sonde; c) und d) (AHAS–)-Sonde.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
In der Wissenschaft wird erforscht, wie genetische Modifikation dazu verwendet werden kann, Pflanzen erwünschte Eigenschaften zu verleihen. Es werden gentechnische Verfahren, die zur Verbesserung von Eigenschaften wie Geschmack, Textur, Größe, Schädlings- und Herbizidresistenz, Farbe, Säure oder Süße von Nahrungspflanzen verwendet werden, als wesentlich schnellere Strategie als traditionelle Verfahren der Kreuzungszüchtung erforscht.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Mais-AHAS-Promoters für die Expression von Markergenen, sowie Vektoren und Pflanzenzellen, die diese Promoter umfassen. (Im Zusammenhang mit der vorliegenden Anmeldung wird ein Promoter als eine Nukleotidsequenz definiert, die Stromaufwärts eines Gens, das als Signal für die Bindung der RNA-Polymerase dient, liegt.) Das Mais-als2-Gen wird kloniert und sequenziert, und die Promoterregion dieses Gens wird dann in ein Plasmid in 5'-Richtung vom GUS-Reportergen eingebracht. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Anmeldung wird ein Reportergen als eine Nukleotidsequenz definiert, die stromabwärts von dem interessierenden Promoter fusioniert ist, so daß Transkripte, die an dem Promoter initiiert werden, am Reportergen entlang verlaufen. Reportergene codieren eine leicht meßbare Enzymaktivität; so wird zum Beispiel in der vorliegenden Erfindung die Expression von Hybridplasmiden in Maiszellen durch Untersuchung der Beta-Glucuronidase (GUS)-Enzymaktivität bestimmt.
Dem Fachmann ist klar, daß der AHAS-Promoter in vielen unterschiedlichen Pflanzengeweben hochaktiv ist und dazu verwendet werden kann, um neue Gene in verschiedenen Pflanzen zu exprimieren. Zu neuen Genen zählen Gene für Herbizidresistenz, Entgiftung und Resistenz gegen Pflanzenpathogene, was jedoch keine Einschränkung bedeutet.
Der Promoter kann für die heterologe Genexpression in Monokotyledon, darunter Mais, Reis, Weizen, Gerste, Sorghum, Hafer, Roggen und Hirse, was jedoch keine Einschränkung darstellen soll, verwendet werden.
Dem Fachmann ist klar, daß der Mais-als2-Promoter dazu verwendet werden kann, um die Genexpression in anderen monokotylen Arten anzutreiben. So treibt zum Beispiel der Reis-Act1-Promoter die Genexpression in Maisprotoplasten, der Mais-Emu-Promoter wurde für die Selektion von transgenem Weizen, transgener Gerste und transgenem Reis verwendet, und der Arabidopsis-AHAS-Promoter, ein Dikotyledonen-Promoter, wurde dazu verwendet, um die AHAS-Genexpression in transgenem Tabak und in transgener Kartoffel anzutreiben. Der Mais-als2 funktioniert am besten in Mais, treibt jedoch auch die Genexpression in anderen Monokotyledonen an. Angesichts von Untersuchungen, die an Mais und anderen Arten durchgeführt wurden, sollte dieser Promoter die konstitutive Expression eines Gens überall in der Pflanze antreiben. Das höchste Expressionsniveau wird entweder in Gewebe mit aktiver Teilungstätigkeit oder in metabolisch aktivem Gewebe beobachtet.
Für die Transformation von monokotylen Kulturpflanzen wurden verschiedene unterschiedliche Techniken, mit denen der Fachmann vertraut ist, verwendet, darunter Beschießung mit Mikroprojektilen, die PEG-vermittelte Transformation, Elektroporation sowie Silikonfasern, was jedoch keine Einschränkung darstellen soll. Bei allen diesen Techniken werden DNA-Vektoren für die Abgabe der zu transformierenden Nukleotidsequenzen verwendet. Zu Vektoren, die sich für die vorliegende Erfindung eignen, zählen Vektoren mit Markergenen, die für die Selektion von transgenem Material, darunter Genen, die Resistenz gegen Hygromycin, Kanamycin, Bialophos und die Imidazolinon- und Sulfonylharnstoffherbizide verleihen, verwendet werden, was jedoch keine Einschränkung darstellen soll.
Das folgende Beispiel dient lediglich zur Veranschaulichung der Erfindung und soll nicht als Einschränkung der Erfindung verstanden werden.
BEISPIEL
Die Wirkung des als1- und als2-Promoters wird dadurch bestimmt, daß man die GUS-Aktivität in Mais- und Reisprotoplasten oder Maiszellinien mit Konstrukten, in denen diese Promotersequenzen mit dem GUS-Gen fusioniert sind, bestimmt. Die Herstellung der Vektoren und die Transformationsvorschrift sind unten beschrieben.
Konstrukte, die die CaMV-35S-GUS-, als1-GUS- und als2-GUS-chimäre enthalten
Bei dem Plasmid pAC400 handelt es sich um ein auf pUC19 basierendes Plasmid, enthaltend eine Fusion des 418 Basenpaare (bp) langen EcoRI-XbaI-Fragments des CaMV-35S-Promoters, das stromaufwärts eines 1,7 kb langen XbaI-PstI-Fragments, das das GUS-Gen enthält, kloniert ist mit einem 700 bp langen PstI-BamHI-Fragment, das den Octopinsynthase-Terminator enthält. Die Gene als1 und als2 werden dadurch erhalten, daß man eine mit der Maislinie XI12 hergestellte Genombibliothek durchmustert. Ein EcoRI-NcoI-Fragment, das 1,4 Kilobasen (kb) der Sequenz stromaufwärts des ATG-Initiationscodons des als1-Gens enthält, wird statt dem CaMV-35S-Promoter in pAC400 subkloniert, wodurch man zu pCD223B gelangt. Ein 819 bp langes PstI-NcoI-Fragment stromaufwärts des ATG von als2 wurde vor die gleiche GUS-ocs-Terminator-Fusion in pBluescript^® KS-(Stratagene) subkloniert, wodurch man zu pCD221B gelangte. Die Sequenz des als2-Promoters aus Mais XI12 ist in 3 dargestellt.
Transformation und Assay von Reis- und Maisprotoplasten
Es werden Protoplasten aus Suspensionszellen von Reis (Nortai) oder Mais (Black Mexican Sweet; BMS) isoliert und nach den Vorschriften von L. A. Lyznik et al. (1989) und J. Y. Peng et al. (1990) für die PEG-vermittelte Transformation mit pAC221B ode pAC400 transformiert. Für transiente Assays werden transformierte Reisprotoplasten auf Millipore-Filter, die auf Medium mit Fütterzellen gelegt wurden, ausplattiert und die transformierten BMS-Protoplasten werden in 3 ml Flüssigmedium kultiviert. Zwei Tage nach der Transformation werden die Protoplastenkulturen gewonnen und mit GUS-Extraktionspuffer extrahiert. Die GUS-Aktivität wird fluorimetrisch nach der Vorschrift von R. A. Jefferson (1987) gemessen.
Zur Gewinnung von stabilen Transformanten aus der BMS-Mais-Kultur werden Protoplasten mit pFF19K (das das selektierbare Markergen, das für Neomycin-Phosphortransferase codiert, enthält) sowie pCD221B oder pAC400 cotransformiert. Nach der Transformation werden die Protoplasten auf Millipore-Filter, die auf Medium mit Fütterzellen belegt wurden, kultiviert. Eine Woche später werden die Protoplastenkulturen auf Medium, das Fütterzellen und 100 mg/l Kanamycin enthält, umgesetzt. Die Protoplastenkulturen werden so lange auf frisches MS-Medium mit 100 mg/l Kanamycin umgesetzt, bis resistente Kalli zu erkennen sind. Einzelner kanamycinresistenter Kallus wird isoliert und noch zwei bis drei Wochen in Gegenwart von Kanamycin gezüchtet. Kanamycinresistenter Kallus wird mit X-Gluc gefärbt oder mit MUG nach der Vorschrift von R. A. Jefferson (1987) getestet, um auf GUS-positiven Kallus zu durchmustern. Kallus, der dahingehend identifiziert wird, daß er GUS exprimiert, wird in Extraktionspuffer zermahlen und getestet; die GUS-Aktivität wird fluorimetrisch gemessen.
Die Werte aus diesen Versuchen sind in den 4 und 5 dargestellt.
Ein mutiertes Mais-AHAS-Gen, das Resistenz gegen Imidazolinonherbizide verleiht und vom Mais-als2-Promoter getrieben wird, wird als selektierbarer Marker verwendet, um nach Transformation von BMS- und A188 × B73-Zellen und Reiszellen transgenene Callus zu erhalten. Dieses Ergebnis stützt die Hypothese, daß der als2-Promoter das Expressionsniveau stark genug antreibt, um die Markergenexpression anzutreiben.
In-situ-Hybridisierung
Es werden Schnittpräparate im wesentlichen wie von J. A. Langdale et al (1988) beschrieben, hergestellt.
Es wird Gewebe in 4% Fomaldehyd fixiert, in Ethanol entwässert, mit Xylol verdrängt und in Parafilm eingebettet. Das Gewebe wird in Scheiben mit einer Dicke von 8–10 μm geschnitten und auf Objektträger, die mit Poly-L-Lysin beschichtet wurden, gelegt. Das Paraffin wird mit Xylol entfernt und das Gewebe wird durch Waschen mit Ethanol und Spülen mit Wasser redydriert. Mit beiden Strängen (+ und –) eines 172 Nukleotide (nt) langen Fragments von der als2 codierenden Region und eines 392 nt langen Fragments der für SSU-codierenden Region werden mit dem Ambion Maxiscript^® Kit RNA-Sonden hergestellt. Die Schnittpräparate werden nach der Vorschrift von Meyerowitz et al (1988) bei 50°C über Nacht in im Verhältnis 1:4 verdünntem SPB [100 μl 10 × Salze (3M NaCl, 10 mM Tris p.H. 6,8, 50 mM DTA); 400 μl Formamid; 200 μl 50%iges Dextransulphat; 40 μl 10 mg/ml tRNA; 10 μl 1M DTT; 50 μl 10 mg/ml Poly-A] mit der Sonde, die 30 Sekunden lang mit 50%igem Formaldehyd und 10 mM DTT bei 80°C denaturiert wurde, hybridisiert. Die Schnittpräparate werden 2 × 15 Minuten lang bei 50°C mit Waschpuffer (1 × Salze, 50% Formamid, 10 mM Tris p.H. 8, 1 mM EDTA und 10 mM DTT) gewaschen, 30 Minuten lang bei 37°C mit RNase A (20 μg/ml in NTE) behandelt, insgesamt 1 Stunde lang bei 37°C 5 × in NTE-Puffer gewaschen, bei 50°C 2 × 30 Minuten lang mit Waschpuffer gewaschen, mit Ethanol entwässert und an der Luft getrocknet. Mit den Schnittpräparaten werden Autoradiogramme erstellt, und zwar dadurch, daß man die Präparate in der Dunkelkammer in auf 37°C vorgewärmte Emulsion eintaucht, 30 Minuten bis 1 Stunde lang trocknet und bis zum Entwickeln im Dunkeln bei 4°C aufbewahrt. Die Schnittpräparate werden 2 Minuten lang entwickelt, mit Wasser gespült, mindestens 5 Minuten lang fixiert und nochmals mit Wasser gespült. Das Gewebe wird mit Alcianblau gefärbt und dann mit Ethanol und Xylol entfärbt. Das Gewebe wird in Permount eingebettet, und dann mit dem Dunkelfeldmikroskop beobachtet.
Aus den Werten der in-Situ-Hybridisierungsversuche in 6–8 geht hervor, daß das Gen auch überall im Maisembryo exprimiert wird.
Die Expression des AHAS-Promoters kann folgendermaßen ausgewertet werden:

1. Es wird ein als2-GUS-Fusionsgen konstruiert und das Muster der GUS-Aktivität innerhalb von transgenen Mais- oder Reispflanzen wird bestimmt. In früheren Untersuchungen mit einem Maispromoter wurde gezeigt, daß es möglich ist, die Maispromoterexpression in Reis auszuwerten (Junko Kyozuka et al., 1991). Nach der Selektion der transgenen Pflanzen wurden mit Pflanzengewebe in unterschiedlichen Entwicklungsstadien histochemische Analysen durchgeführt, um die Gewebe- und Zelltypspezifität zu bestimmen. Diese Technik wird allgemein für die Auswertung der Promoteraktivität in monokoytlen sowie dikotylen Pflanzen verwendet.
2. Es werden transiente Expressionsassays an Protoplasten, die von unterschiedlichen Pflanzenarten nach Transformation von als2-GUS-Konstrukten hergestellt werden, durchgeführt. Mit diesem Vorgehen wird die Fähigkeit von unterschiedlichen Promotern, in heterologen Arten zu funktionieren, ausgewertet. Es werden Protoplasten mit dem interessierenden Konstrukt transformiert und dann inkubiert, um eine Expression des induzierten Gens und eine Anreicherung des Proteins zu gestatten. Nach der Inkubation werden die Zellen in Assay auf das Vorhandensein des vom Transgen codierten Proteins geprüft, um die Wirkung des Promoters, der die Expression des Transgens antreibt, zu bestimmen.

LITERATURANGABEN

1. David McElroy et al., (1990) Isolation of an efficient actin promoter for use in rice transformation. The Plant Cell 2: 163–171.
2. David McElroy at al., (1991) Construction of expression vectors based on the rice actin 1 (Act1) 5' region for use in monocot transformation. Mol. Gen Genet. 231: 150–160.
3. Wanggen Zhang et al., (1991) Analysis of the Act1 5' region activity in transgenic rice plants. The plant Cell 3: 1155–1165.
4. Jun Cao et al., (1992) Regeneration of herbicide resistant transgenic rice plants following microprojectile-mediated transformation of suspension culture cells. Plant Cell Reports 11: 585–591.
5. Alan H. Christensen et al., (1992) Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation. Plant Molecular Biology 18: 675–689.
6. Seiichi Toki et al., (1992) Expression of a maize ubiquitin gene promoter-bar chimeric gene in transgenic rice plants. Plant Physiol. 100: 1503–1507.
7. J. Troy et al., (1993) Rapid production of multiple independent lines of fertile transgenic wheat (Triticum aestivum). Plant Physiol. 102: 1077–1084.
8. Yuechun Wan und Peggy G. Lemaux, (1994) Generation of a large number of independently transformed fertile barley plants. Plant Physiol. 104: 37–48.
9. Junko Kyozuka et al., (1991) Anaerobic induction and tissue-specific expression of maize Adh1 promoter in transgenic rice and their progeny. Mol. Gen. Genet. 228: 40–48.
10. D. I. Last et al., (1991) pEmu: an improved promoter for gene expression in cereal cells. Theor. Appl. Genet. 81: 581–588.
11. Robert Bower und Robert G. Birch (1992) Transgenic sugarcane plants via microprojectile bombardment. The Plant Journal 2 (3): 409–416.
12. D. A. Chamberlain et al., (1994) The use of the Emu promoter with antibiotic and herbicide resistance genes for the selection of transgenic wheat callus and rice plants. Aust. J. Plat. Physiol., 21: 95–112.
13. L. Comai et al. (1985) Expression in plants of a mutant aroA gene from Salmonella typhimurium confers tolerance to glyphosate. Nature 317: 741–744.
14. C. Waldron et al. (1985) Resistance to hygromycin B: A new marker for plant transformation studies. Plast Mol. Biol. 5: 103–108.
15. Kevin E. McBride und Kristin R. Summerfelt (1990) Improved binary vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Mol. Biol. 14: 269–276.
16. Michael Bevan et al. (1983) A chimeric antibiotic resistance gene as a selectable marker for plant cell transformation. Nature 304: 184–187.
17. Luis Herrera-Estrella et al. (1983) Expression of chimeric genes transferred into plant cells using Ti-plasmid-derived vector. Nature 304: 209–213.
18. Robert T. Fraley et al. (1983) Expression of bacterial genes in plant cells. P.N.A.S. 80: 4803–4807.
19. Marc De Block et al. (1984) Expression of foreign genes in regenerated plants and in their progeny. EMBO J. 3: 1681–1689.
20. R. Hain et al. (1985) Uptake, integration, expression and genetic transmission of a selectable chimeric gene by plant protoplasts. Mol. Gen. Genet. 199: 161–168.
21. J. C. Kridl und Robert M. Goodman (1986) Transcriptional regulatory sequences from plant viruses. Bio Essays 4: 4–8.
22. Joan T. Odell et al. (1985) Identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter. Nature 313: 810–812.
23. David W. Ow et al (1986) Transient and stable expression of the firefly luciferase gene in plant cells and transgenic plants. Science 234: 856–959.
24. D. M. Shah et al. (1896) Engineering herbicide tolerance in transgenic plants. Science 233: 478–481.
25. Robert Kay et al. (1987) Duplication of CaMV 35S promoter sequences creates a strong enhancer for plant genes. Science 236: 1299–1302.
26. L. Comai et al. (1990) Novel and useful properties of a chimeric plant promoter combining CaMV 35S and MAS elements. Plant Mol. biol. 15: 373–381.
27. J. Paszkowski et al. (1984) Direct gene transfer to plants. EMBOJ. 3: 2717–2722.
28. Ervin Balazs et al. (1985) Chimeric vector construction for higher-plant transformation. Gene 40: 343–348.
29. Margaret Sanger et al. (1990) Characteristics of a strong promoter from figwort mosaic virus: Comparison with the analogous 35S promoter from cauliflower mosaic virus and the regulated mannopine synthase promoter. Plant Mol. Biol. 14: 433–443.
30. Gail Schmidt und Bijay K. Singh (1990) Tissue distribution of acetohydroxyacid synthase activity at various developmental stages of lima bean. Pesticide Sci. 30 (4): 418–419.
31. Sharon J. Kheeler et al., (1993) Regulation of tobacco acteolactate synthase gene expression. Plant Physiol. 102: 1009–1018.
32. Therese Ouellet et al., (1992) Members of the acetohydroxyacid synthase multigene family of Brassica napus have divergent patterns of expression. The Plant Journal 2: 321–330.
33. Dale L. Shaner und N. Moorthy Mallipudi (1991) Imidazolinone-Acetohydroxyacid synthase interactions. In The Imidazolinone Herbicides ed. Dale L. Shaner and Susan L. O'Connor CRC Press (Boca Raton, FL.)
34. R. A. Jefferson (1987). Assaying chimeric genes in plants: the GUS gene fusion system. Plant Mol. Biol. Rept 5: 387–405.
35. L. A. Lyznik et al. (1989). Stable transformation of maize protoplasts with gusA and neo genes. Plant Mol biol 13: 151–161.
36. J. Y. Peng et al. (1990). Co-transformation of indica rice protoplasts with neo and gusA genes. Plant Cell Rept 9: 168–172.
37. J. A. Langdale et al., (1988), Cellular pattern of photosynthetic gene expression in developing maize leaves. Gene Dev. 2: 106–115.
38. E. Meyerowitz et al., (1988), In situ hybridization to RNA in plant tissue. Plant Mol. Bio. Rept., 5: 242–250.

SEQUENZBESCHREIBUNG

Claims

Verwendung einer Nukleotidsequenz eines Mais-AHAS-Promoters des als2-Gens gemäß SEQ ID NO. 3 für die Expression von Markergenen in monokotylen Pflanzen.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die vom Mais-AHAS-Promoter getriebene Expression von Markergenen Herbizidresistenz, Entgiftung und/oder Resistenz gegen Pflanzenpathogene verleiht.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 und 2 für die Erzeugung eines Transformationsvektors für die Transformation in monokotyle Pflanzen oder Teile dieser Pflanzen.