FR2805265A1 - Oligonucleotides immunostimulants - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne un oligonucléotide capable de stimuler des cellules humaines du systÚme immunitaire, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence nucléotidique ayant la formule suivante 5'GAGAATTCTTTACCTTTTAT3', dans laquelle T signifie Thymine, A Adénine, C Cytosine, et G Guanine, et en ce qu'il est dépourvu de dinucléotide CG dans lequel la Cytosine C n'est pas méthylée. Un tel oligonucléotide trouve une application particuliÚrement intéressante comme adjuvant vaccinal.
Description
OLIGONUCLEOTIDES IMMUNOSTIMULANTS La présente invention est relative au domaine des immunostimulants. Plus particuliÚrement, l'invention concerne des oligonucléotides capables de stimuler cellules humaines intervenant dans le systÚme immunitaire, et à leur utilisation comme adjuvant vaccinal.
Un grand nombre d'oligonucléotides ont déjà été décrits dans l'art antérieur, relation avec leurs propriétés immunostimulantes. Ainsi, la demande EP 0 468 520 décrit des polynucléotides immunostimulants constitués par un simple brin d'ADN linéaire comprenant de 10 à 100 nucléotides s'enchaßnant selon une séquence palindromique.
Selon la demande WO 96I02 555, l'activité immunostimulatrice d'oligonucléotides liée à la présence d'une séquence dinucléotique 5' CG 3', dans laquelle C n'est méthylée, l'activité immunostimulante étant plus forte si le motif CG est précédé en 5' du dinucléotide GA et I ou suivi en 3' du dinucléotide TC ou encore TT.
Au contraire, selon la demande de brevet WO 98l52 962, il n'est pas nécessaire la séquence de l'oligonucléotide soit un palindrome, ni qu'elle comprenne dinucléotide CG ; en effet, les 3 nucléotides décrits dans cette demande pour une utilisation en tant qu'adjuvant vaccinal ont les séquences suivantes : 5' GACGTT 3', 5' GAGCTT 3', ainsi que 5' TCCGGA 3'.
Selon le brevet US 5,663,153, l'activité immunostimulante d'oligonucléotides n'est pas liée à la séquence des nucléotides, mais à la nature de la liaison entre nucléotides, présence d'au moins une liaison phosphorothioate permettant d'induire une reponse locale du systÚme immunitaire.
La plupart tests de l'art antĂ©rieur pour Ă©valuer l'activitĂ© immunostimulante des oligonuclĂ©otides proposĂ©s, sont effectuĂ©s soit in vitro sur des cellules animales (essentiellement des cellules murines), soit in vivo sur des souris. Cependant, les diffĂ©rences existant entre le systĂšme immunitaire de la souris et celui de l'ĂȘtre humain, conduit Ă des diffĂ©rences entre les rĂ©sultats obtenus sur des cellules murines ceux obtenus sur des cellules humaines.
Or l'industrie pharmaceutique a un grand besoin d'immunostimulants pouvant ĂȘtre administrĂ©s Ă l'homme, notamment dans le domaine des vaccins.
La prĂ©sente invention a donc pour but de proposer des oligonuclĂ©otides capables stimuler cellules du systĂšme immunitaire de l'ĂȘtre humain.
Pour atteindre ce but, l'invention a pour objet un oligonucléotide capable de stimuler des cellules humaines du systÚme immunitaire caractérisé en ce qu'il comprend moins séquence 5' GAGAATTCTTTACCTTTTAT 3' dans laquelle T est la Thymine, A est l'Adénine, C est la Cytosine, et G la Guanine, et en ce qu'il est dépourvu de dinucléotide CG dans lequel la Cytosine C ne serait pas méthylée.
Selon une caractéristique de l'invention, l'oligonucléotide comprend de 15 à 100 nucléotides.
Selon une autre caractéristique, l'oligonucléotide selon l'invention est capable d'induire prolifération des lymphocytes humains.
Selon autre caractéristique, l'oligonucléotide selon l'invention est capable d'accroßtre l'expression des marqueurs d'activation CD25, CD69 et CD86 sur les lymphocytes B humains.
L'invention concerne également l'utilisation d'un tel oligonucléotide pour la fabrication d'un médicament.
L'invention également pour objet un adjuvant vaccinal caractérisé en ce comprend moins un oligonucléotide capable de stimuler des cellules humaines systÚme immunitaire possédant au moins une séquence 5' GAGAATTCTTTACCTTTTAT 3' dans laquelle T est la Thymine, A est l'Adénine, C est la Cytosine, et G la Guanine, et en ce qu'il est dépourvu de dinucléotide CG dans lequel la Cytosine C ne serait pas méthylée. L'invention également pour objet une composition vaccinale à usage humain comprenant moins un antigÚne vaccinal caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins un oligonucléotide capable de stimuler des cellules humaines du systÚme immunitaire possédant au moins une séquence 5' GAGAATTCTTTACCTTTTAT 3' dans laquelle T est la Thymine, A est l'Adénine, C est la Cytosine; et G la Guanine, et en ce qu'il est dépourvu de dinucléotide CG dans lequel la Cytosine C ne serait pas méthylée.
La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui va suivre, en référence aux figures 1 et 2 qui illustrent les résultats obtenus lors des tests décrits aux exemples 1 et 2.
Par oligonuclĂ©otide au sens de la prĂ©sente invention, on entend un polynuclĂ©otide comprenant au moins 15 nuclĂ©otides. La limite supĂ©rieure de la taille des oligonuclĂ©otides n'est pas vraiment dĂ©terminĂ©e. On peut cependant noter que, plus l'oligonuclĂ©otide sera long, plus sa purification sera difficile Ă effectuer lors des Ă©tapes de synthĂšse , et plus le prix de revient en sera Ă©levĂ©. D'autre part, il est probable qu oligonuclĂ©otide de grande longueur aura plus de difficultĂ©s Ă pĂ©nĂ©trer dans les cellules. Aussi, pour les besoins de la prĂ©sente invention, on considere qu'une limitation de la taille de l'oligonuclĂ©otide Ă 100 nuclĂ©otides est appropriĂ©e. oligonuclĂ©otide est de prĂ©fĂ©rence un oligonuclĂ©otide simple brin; il peut s'agir oligodĂ©soxyribonuclĂ©otide ou d'un oligoribonuclĂ©otide. On a obtenu particuliĂšrement bons rĂ©sultats en utilisant un oligodĂ©soxyribonuclĂ©otide. oligonuclĂ©otides convenant aux fins de l'invention peuvent se prĂ©senter sous forme de phosphodiester ou, afin d'ĂȘtre plus stables, sous forme de phosphorothioates d'hybrides phosphodiester I phosphorothioates. Les oligonuclĂ©otides phosphorothioates sont ceux prĂ©fĂ©rĂ©s.
L'oligonuclĂ©otide selon l'invention est capable de stimuler des cellules humaines systĂšme immunitaire, telles que les lymphocytes B, les lymphocytes T, monocytes et cellules dendritiques. Cette stimulation est apprĂ©ciĂ©e notamment par la lymphoprolifĂ©ration ou par l'expression de marqueurs d'activation, tels que les marqueurs CD25 , CD69 et CD86 sur les lymphocytes B. II est possible de sĂ©lectionner les oligonuclĂ©otides d'intĂ©rĂȘt au moyen de tests diffĂ©rents de ceux proposĂ©s dans la prĂ©sente demande, Ă condition cependant s'agisse de tests Ă©valuant capacitĂ© de stimulation de cellules humaines, et non comme dans la plupart documents de l'art antĂ©rieur, de tests Ă©valuant capacitĂ© de la stimulation cellules murines. II serait notamment possible de tester l'expression d'autres marqueurs d'activation des lymphocytes, ou l'expression de- marqueurs de prolifĂ©ration tels que le marqueur K167; des tests relatifs Ă l'augmentation des marqueurs d'activation et de maturation des cellules dendritiques pourraient Ă©galement ĂȘtre utilisĂ©s. De mĂȘme, des tests permettant l'apprĂ©ciation de l'augmentation de production de certaines cytokines peuvent Ă©galement ĂȘtre utilisĂ©s. Selon une caractĂ©ristique de l'invention, l'oligonuclĂ©otide comprend au moins une sĂ©quence nuclĂ©otidique 5' GAGAATTCTTTACCTTTTAT 3' dans laquelle T signifie Thymine, C Cytosine, G Guanine, et A AdĂ©nine. Cette sĂ©quence peut ĂȘtre 5' terminale, 3' terminale ou ĂȘtre entourĂ©e par d'autres nuclĂ©otides. Elle peut ĂȘtre unique ou rĂ©pĂ©tĂ©e plusieurs fois Ă l'identique Ă l'intĂ©rieur d'un mĂȘme oligonuclĂ©otide Selon l'invention, foligonuclĂ©otide ne comporte pas forcĂ©ment de sĂ©quence palindromique. MalgrĂ© cette absence de sĂ©quence palindromique, un tel oligonucleotide est capable de stimuler des cellules humaines du systĂšme immunitaire.
Selon caractĂ©ristique, l'oligonuclĂ©otide selon l'invention est dĂ©pourvu de dinuclĂ©otide CG dans lequel la Cytosine ne serait pas mĂ©thylĂ©e. La capacitĂ© des oligonuclĂ©otides de l'art antĂ©rieur Ă ĂȘtre immunostimulants a presque toujours Ă©tĂ© interprĂ©tĂ©e comme liĂ©e Ă la prĂ©sence de motifs CpG non mĂ©thylĂ©s (Cf. notamment l'article de Krieg et al dans Nature d'avril 1995 citĂ© ci-dessus), cette interprĂ©tation Ă©tant en cohĂ©rence avec l'observation selon laquelle la frĂ©quence ce dinuclĂ©otide Ă©tait environ 4 fois plus importante dans le gĂ©nome des bactĂ©ries dans celui des vertĂ©brĂ©s. De façon surprenante, on a maintenant trouvĂ© que oligonuclĂ©otides entiĂšrement dĂ©pourvus de ce motif dinuclĂ©otidique Ă©taient cependant parfaitement capables de stimuler les cellules du systĂšme immunitaire humain. Selon une caractĂ©ristique particuliĂšre, foligonuclĂ©otide selon l'invention est dĂ©pourvu ou appauvri en sĂ©quence nuclĂ©otidique capable d'inhiber les cellules du systeme immunitaire humain. En effet, afin d'obtenir un effet global immunostimulant, si motifs inhibiteurs ou neutralisants tels que, par exemple, ceux dĂ©crits dans demande 98l52 581 sont prĂ©sents, il faut que leur effet soit supprimĂ© ou rĂ©duit, grĂące Ă prĂ©sence d'une sĂ©quence Ă effet immunostimulant plus prononcĂ©, ou grĂące Ă prĂ©sence d'un plus grand nombre de sĂ©quences selon l'invention.
La présente invention a également pour objet un adjuvant vaccinal comprenant au moins oligonucléotide immunostimulant ayant au moins un motif 5' GAGAATTCTTTACCTTTTAT 3' tel que mentionné ci-dessus. Par adjuvant vaccinal, on entend un produit qui permet d'accroßtre ou de modifier la réponse du systÚme immunitaire d'un organisme vis à vis de l'administration d'un antigÚne. En particulier, il peut s'agir d'une augmentation de la réponse humorale ou de la réponse cellulaire.
L'action d'un adjuvant vaccinal peut Ă©galement ĂȘtre, non pas une augmentation de la rĂ©ponse qui se produirait en l'absence d'adjuvant, mais une orientation diffĂ©rente de la rĂ©ponse produite : par exemple, orientation vers une rĂ©ponse cellulaire plutĂŽt qu'une rĂ©ponse humorale, production de certaines cytokines plutĂŽt que d'autres, production certains types ou sous-types d'anticorps plutĂŽt que d'autres, stimulation certaines cellules plutĂŽt que d'autres, etc...
L'oligonuclĂ©otide immunostimulant de la prĂ©sente invention peut ĂȘtre utilisĂ© comme adjuvant vaccinal quelle que soit la nature de l'antigĂšne administrĂ© et quel que soit le nombre valences utilisĂ©es. Il peut ĂȘtre le seul adjuvant utilisĂ© ou, au contraire, ĂȘtre un Ă©lement d'une combinaison adjuvante.
L'action adjuvante de l'oligonuclĂ©otide selon l'invention peut ĂȘtre obtenue, soit lorsqu'il associĂ© Ă l'antigĂšne ou aux antigĂšnes lors de leur administration, i.e. lorsqu'ils font partie de la mĂȘme composition vaccinale, soit lorsqu'il est administrĂ© sĂ©parĂ©ment de l'antigĂšne ou des antigĂšnes. On prĂ©fĂšre cependant l'utiliser dans la mĂȘme composition vaccinale que l'antigĂšne ou les antigĂšnes Ă administrer. L'oligonucleotide selon l'invention peut avantageusement ĂȘtre administrĂ© toutes les voies susceptibles d'ĂȘtre utilisĂ©es pour une composition vaccinale: voie muqueuse voie systĂ©mique.
L'un des objets de l'invention est une composition vaccinale comprenant moins un oligonucléotide immunostimulant ayant une séquence .
5' GAGAATTCTTTACCTTTTAT 3' telle que décrite ci-dessus.
Une composition vaccinale selon l'invention peut ĂȘtre destinĂ©e Ă l'immunisation contre une seule maladie, ou destinĂ©e Ă l'immunisation contre plusieurs maladies. II peut s'agir d'une composition vaccinale liquide ou lyophilisĂ©e. Elle peut comprendre, outre les antigĂšnes, tout ou partie des composants habituellement prĂ©sents dans un vaccin : tampons, stabilisants, conservateurs, ... Elle peut Ă©galement comprendre un ou plusieurs adjuvant(s) autre(s) que ceux objets de la prĂ©sente invention. Elle peut Ă©galement comprendre plusieurs adjuvants objets de la prĂ©sente invention, constituĂ©s soit par des oligonuclĂ©otides ayant tous le mĂȘme motif 5' GAGAATTCTTTACCTTTTAT 3' mais se diffĂ©renciant par les nuclĂ©otides en 5' et/ou en 3', soit par des oligonuclĂ©otides ayant des motifs 5' GAGAATTCTTTACCTTTTAT 3' diffĂ©rents, dont les sĂ©quences en 5' et 3' sont identiques ou diffĂ©rentes.
La composition vaccinale selon l'invention peut ĂȘtre destinĂ©e Ă une administration prophylactique ou Ă une administration thĂ©rapeutique.
La composition vaccinale selon l'invention peut ĂȘtre formulĂ©e de maniĂšre Ă optimiser l'action adjuvante de l'oligonuclĂ©otide objet de l'invention. Ainsi, l'oligonuclĂ©otide peut ĂȘtre couplĂ© Ă un lipide, tel que le cholestĂ©rol ; il peut ĂȘtre intĂ©grĂ© dans une Ă©mulsion de type huile I eau ou formulĂ© sous forme de liposomes.
Les exemples qui suivent illustrent des modes de réalisation particuliers de la présente invention. <U>Exemple 1</U> Synthese <U>des</U> oliaonucléotides On prepare un oligonucléotide dont la séquence est la suivante: 5' GAGAATTCTTTACCTTTTAT 3'.
La synthÚse est réalisée au moyen d'un automate synthétiseur fourni par Applied Biosystems qui met en ceuvre la méthode chimique standard au phosphoramidite et qui comporte à chaque cycle une étape d'oxydation, qui est réalisée au moyen d'une solution tétraéthylthiuram I acétonitrile pour obtenir une liaison phosphorothioate.
On prepare en outre, de la mĂȘme façon, un oligonuclĂ©otide <B>AI 5(S)</B> ne comprend que A et qui est phosphorothioate sur toute sa longueur. Cet oligonuclĂ©otide est un temoin nĂ©gatif car il n'entraĂźne ni prolifĂ©ration ni augmentation l'expression des marqueurs d'activation sur les lymphocytes B.
On prépare également un oligonucléotide 1d(S) dont la séquence identifiée dans la demande de brevet W096102555 et est la suivante:5' GCATGACGTTGAGCT 3'; cet oligonucléotide comporte des liaisons phosphorothioates sur toute sa longueur et est utilisé comme témoin positif.
Tous les oligonucléotides sont maintenus en solution dans du tampon PBS <U>Exemple 2</U> <U>Test de</U> Lymahoarolifération On isole des lymphocytes à partir du sang périphérique d'un donneur, en procédant à une centrifugation sur un gradient de Ficoll. Ces lymphocytes sont ajustés à 4.106 cellules I ml dans du milieu de culture AIMV additionné Glutamine, de Streptomycine et de Pénicilline.
Les cellules sont distribuées en plaques 96 puits (fond rond) sous 100 pl, soit 2.105 cellules par puits. On ajoute ensuite 100pl d'une solution 4pM (ou d'une solution 0.8NM, ou encore d'une solution 0.16NM) des oligonucléotides à tester produits à l'exemple 1 (1 seul type d'oligonucléotide par puits) afin d'obtenir une concentration finale soit de 2 pM, soit de 0.4pM,soit de 0.08pM.
AprĂšs incubation 3 jours d'incubation Ă 37 C en atmosphĂšre humide Ă 5% C02,on ajoute de la thymidine tritiĂ©e (Amersham TRK 120) prĂ©alablement diluee dans du milieu de culture , Ă raison de 1 pCi par puits sous 50 pl. AprĂšs 7. Ă 8 heures d'incubation Ă l'Ă©tuve (5% C02, 37 C), les plaques peuvent ĂȘtre congelĂ©es Ă -80 C et traitĂ©es plus tard.
A l'aide du "Harvester", on récolte le contenu des puits sur des plaques Unifilter GF/C et on réalise 6 lavages en eau distillée puis un lavage en éthanol 70% afin de précipiter l'ADN.
AprÚs séchage des plaques, 25 pl de liquide scintillant (Microscint-40, Packard) sont distribués dans chaque puits et permettent de quantifier la radioactivite (rayonnements émis par le tritium) en mesurant le nombre de coups I minute. (cpm) émis par chaque puits sur le compteur Top Count (Packard).
résultats obtenus pour chacun des oligonucléotides testés sont représentés figure 1, qui indique, pour chaque oligonucléotide testé l'indice de stimulation IS. indice IS est calculé de la façon suivante: _ (CPM de l'oligonucléotide testé - CPM du contrÎle milieu)/ CPM contrÎle milieu. remarque que l'oligonucléotide selon l'invention (3DbTT) qui ne comprend pas de dinucléotide CG est capable d'induire une prolifération des lymphocytes humains identique à celle mesurée pour l'oligonucléotide de l'art antérieur (3Db) comprenant dinucléotide CG. Par contre, les résultats du contrÎle négatif (A15) sont bien négatifs.
<U>Exemple 3</U> <U>Test relatif aux marqueurs d'activation</U> Le test est effectuĂ© Ă partir de lymphocytes isolĂ©s d 'un donneur comme dĂ©crit Ă l'exemple prĂ©cĂ©dent, et ajustĂ©s Ă 2.106 cellules/ml dans le mĂȘme milieu de culture. Les lymphocytes sont ensuite incubĂ©s dans des tubes en polypropylĂšne de 4m1 Ă raison de 2mlltube. On ajoute dans chaque puits une quantitĂ© d'oligonuclĂ©otides Ă tester prĂ©parĂ©s Ă l'exemple 1 (1 oligonuclĂ©otide I tube) suffisante pour obtenir une concentration en oligonuclĂ©otide 2 pM. AprĂšs 3 jours d'incubation, les cellules sont rĂ©parties en 3 tubes micronic Ă raison de 106 cellules par tube. AprĂšs centrifugation, les cellules sont remises en suspension dans 100p1 de tampon IF (ImmunoFluorescence) composĂ© de PBS <B>0.1%</B> BSA <B>0.01%</B> Azide de sodium. On procĂšde ensuite au marquage des cellules en ajoutant 5 pl de chacun des anticorps fluorescents suivants: - tube : CD20 PE/ CD69 FITC - tube CD20 PE/ CD25 FITC - tube CD20 PE/ CD86 FITC Le CD20 un marqueur des lymphocytes B.
Le CD69 un marqueur d'activation précoce des lymphocytes B et T. Le CD25 un récepteur de l'Interleukine 2.
Le CD86 une molécule de costimulation B7-2.
AprĂšs %z heure d'incubation Ă 4 C; les cellules sont lavĂ©es et remises en suspension en tampon IF additionnĂ© de 0.5% de formol. Les cellules sont analysĂ©es un cytofluorimĂštre (FACScan) en double marquage, avec une fenĂȘtre d'Ă©tude 5000 cellules CD20+ (lymphocytes B).
Les résutats obtenus sont illustrés sur la Figure 2 qui indique, pour chaque oligonucléotide testé, le %age de lymphocytes B exprimant l'un des marqueurs testés.
On constate que l'oligonuclĂ©otide selon l'invention ne contenant pas de motif CG est capable d'induire une augmentation de l'expression de certains marqueurs d'activation CD25, CD69, CD86) sur les lymphoctes B identique Ă celle mesurĂ©e pour l'oligonuclĂ©otide de l'art antĂ©rieur comprenant un tel dinuclĂ©otide CG. En effet, le pourcentage de lymphocytes B exprimant de tels marqueurs est du mĂȘme ordre dans les 2 Par contre, la sĂ©quence composĂ©e de 15 A a un pourcentage de lymphocytes B activĂ©s nettement plus faible.
Claims (10)
1. Oligonucléotide immunostimulant , caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence nucléotidique ayant la formule suivante GAGAATTCTTTACCTTTTAT 3', dans laquelle T signifie Thymine,.A Adénine Cytosine , G Guanine, et en ce qu'il est dépourvu de dinucléotide CG dans lequel la Cytosine C ne serait pas méthylée.
2. Oligonucléotide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend de à 100 nucléotides.
3. Oligonucléotide selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le motif 5' GAGAATTCTTTACCTTTTAT 3' est répété au moins 1 fois.
4. Oligonucléotide selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est capable d'induire la prolifération des lymphocytes B humains.
5. Oligonucléotide selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce est capable d'accroßtre l'expression des marqueurs d'activation CD25 , marqueur CD86, ou du marqueur CD69 sur les lymphocytes B humains.
6. Utilisation d'un oligonucléotide selon une des revendications précédentes pour la fabrication d'un médicament.
7. Utilisation d'un oligonucléotide selon une des revendications 1 à 5, pour la fabrication d'un immunostimulant humain.
8. Utilisation d'un oligonucléotide selon une des revendications 1 à 5, pour la fabrication d'un adjuvant vaccinal.
9. Utilisation d'un oligonucléotide selon une des revendications 1 à 5, pour la fabrication d'une composition vaccinale.
10. Composition vaccinale ' usage humain, comprenant au moins un antigÚne vaccinal, caractérisée ce qu'elle comprend en outre au moins un oligonucléotide selon une des revendications 1 à 5
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