FI60553C - Foerfarande foer framstaellning av ovulationsframkallande nonapeptidamidderivat - Google Patents

Description

«Swl ΓβΙ M1v kuulutusjulkaisu /λγγ, ^ (11) UTLÄGGN INCSSKRIFT ° ^ ^ ?g51j C (45) ' ^ ^ v ^ (51) Kv.lk.3/lnt.CI.3 C 07 C 105/52 SUOM I—FI N LAN D (*) Patenttihakemus — PatentansBkninf 22b 3/lb

(22) Hakamiapllvl — AnaSknlngadag 2 U. 0T · 7 U

* ' (23) AlkupUvi—Gikifhatadag 2U.07-7^ (41) Tullut julkiseksi — Blivlt offentll( 25 .01.75

Patentti-)· rekisterihallitus ............ . , . ,,,., _ , , (44) Nlhtlvlkilpanoo ja kuuLjulkalsun pvm__

Patent- och registerstyrelsen ' 7 Anrtksn utlagd odi utl.skr(ften publkerad 30.10.8l (32)(33)(31) Pry<l««y etuoikeus—Begird prloritet 2U.07.73

19.03.7U Japani-Japan(JP) 83389/73, 3173U/7U

(71) Takeda Chemical Industries, Ltd., 27, Doshomachi 2-chome, Higashi-ku,

Osaka, Japani-Japan(JP) {72) Masahiko Fujino, Hyogo, Japani-Japan(JP) (7U) Oy Borenius & Co Ab (5U) Menetelmä ovulaatiota aikaansaavien nonapeptidi amidijohdannaisten valmistamiseksi - Förfar ahde för framställning av ovulationsframkallande nonapeptidamidderivat

Keksinnön kohteena on menetelmä uusien nonapeptidiamidijohdannaisten valmistamiseksi, joilla on voimakas ovulaatiota aiheuttava vaikutus, ja joiden kaava on: (Pyr)Glu-R1-Trp-Ser-R2-(D)-Ala-R3- Arg-Pro-NH-R^ (I) jossa R^ on His, Tyr, Trp tai p-NH^-Phe; R2 on Tyr tai Phe;

Rg on Leu, Ile tai Nle ja R^ on 1...3 hiiliatomia sisältävä alkyyli, joka voi olla substituoitu hydroksyyliryhmällä.

Tässä selityksessä ja patenttivaatimuksissa on aminohapot ja peptidit merkitty lyhenteillä, joita yleisesti käytetään tekniikan tällä erikoisalalla, ja jotka on hyväksynyt Comittee on Biochemical Nomenclature of IUPAOIUB. Aminohapolla on L-konfiguraatio, ellei muuta erikoisesti ole merkitty.

Seuraavassa luetellaan eräitä käytettyjä lyhenteitä:

Ala alaniini

Arg arginiini 2 60553 BOC t-butoksikarbonyyli

Bzl bentsyyli DCC N,N’-disykloheksyylikarbodi-imidi

His histidiini HONB N-hydroksi-5-norborneeni-2,3-dikarboksimidi HOSu N-hydroksisukkinimidi IBOC Isobornyylioksikarbonyyli

Ile isoleusiini

Leu leusiini

Nle norleusiini OMe metyyliesteri OBzl bentsyyliesteri ONB N-hydroksi-5-norborneeni-2,3-dikarboksi-mmidiesteri

Osu N-hydroksisukkinimidiesteri

Phe fenyylialaniini p.NH2-Phe p-aminofenyylialaniini

Pro proliini (Pyr)Glu pyroglutamiinihappo

Ser seriini

Tos tosyyli

Trp tryptofaani

Tyr tyrosiini Z bentsyylioksikarbonyyli

Edellä mainitun substituentin R^ esimerkkinä esitetään 1...3 hiili-atomia sisältävänä suorakotjuisena tai haarautuneena alkyyliryhmänä, joka voi dLla substituoitu hydroksyyliryhmällä, metyyli, etyyli, n-propyyli, i-propyyli, hydroksimetyyli, l-hydroksietyyli, 2-hydroksi-etyyli, 2-hydroksi-n-propyyliT 3-hydroksi-n-propyyli, 2,2-dihydroksi- i-propyyli tai muut senkaltaiset.

On jo useita vuosia tiedetty, että hypotalamus sisältää tekijöitä, jotka >korkeämmällä tasolla säätävät trooppisten hormoonien erittymistä aivolisäkkeestä. Viime aikoina on sen jälkeen, kun on eristetty tyrotropiinia vapauttava hormooni ((TRH), eristetty sioista ja lampaista puhtaana hormooni, joka edistää luteiinihormoonin erittymistä ja joka on todettu dekapeptidiksi, jonka rakenne on : H-(Pyr) Glu-His-Trp-Ser-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2. (A.V. Schally ja kumpp., Biochem, Biophys. Res. Commun., 43, 1334 (1971): R. Guillemin ja 3 60553 kumpp., Proc. Nat. Acad. Sei., U.S.A., 6_9, 278 (1972) ). Tämän havainnon jälkeen on synteettisesti valmistettu joukko samankaltaisia peptidejä, joilla myös on suoritettu biologisia kokeita. Edellä mainitun aminohapporakenteen pienehkökin muutos vähentää kuitenkin vakavasti peptidin fysiologista vaikutusta, ja edellä esitettyä kemiallista kaavaa on pidetty oleellisena maksimaalisen fysiologisen aktiviteetin kehittämiseksi (A.V. Schally ja kumpp., Biochem. Biophys. Res. Commun., 366 (1972) ).

Synteettisesti on myös valmistettu eräänlaisia nonapeptidiamidijohdannaisia, joiden aktiviteetin on ilmoitettu olevan korkeintaan noin 5 kertaa suurempi kuin luonnossa esiintyvien luteiinihormonia vapauttavien hormonien aktiviteetti (M. Fujino et ai. Biochem. Biophys. Res. Commun., Voi. 49 (3), pp. 863...869 (1972) ).

Näissä olosuhteissa keksijä on onnistunut synteettisesti valmistamaan kaavan (I) mukaisia nonapeptidiamidijohdannaisia. Yllätyksellisesti on todettu, että näillä yhdisteillä on voimakkaampi munasolun irtoamista aiheuttava vaikutus kuin luonnossa esiintyvällä dekapeptidillä. Keksijä on myös havainnut, että nämä yhdisteet vaikuttavat aivolisäkkeeseen ja edistävät sekä luteiinihormoonin että munarakkuloita kiihottavan hormoonin erittymistä. Keksijä on edelleen todennut, että näitä yhdisteitä voidaan käyttää sekä ihmislääkkeinä, esim. lääkkeinä aivolisäkkeen toiminnan toteamiseksi tai sukurauhasten vajaukseen, että kuukautisten puutteeseen vaikuttavana lääkkeenä, että myös eläinlääkinnässä, erikoisesti eläinten siitostoiminnassa. Tämän hakemuksen kohteena oleva keksintö perustuu näihin yllätyksellisiin havaintoihin.

Keksinnön eräänä pääkohteena on näin ollen menetelmä sellaisten uusien nonapeptidiamidijohdannaisten (I) valmistamiseksi, joilla on voimakas munasolun irtoamista aiheuttava vaikutus.

Nonapeptidiamidijohdannaista (I) valmistetaan tavalla, joka tunnetaan siitä, että reagenssi (A), jona on L-pyroglutamiinihappo tai peptidi-tähde, jonka N-puoleisessa päässä on L-pyroglutamiinihappoyksikkö (H-(Pyr)Glu-), ja joka samalla tästä alkaen sisältää edellä mainitun aminohapposarjan, kondensoidaan reagenssin (B) kanssa, jona on amiini-komponentti, joka vastaa nonapeptidiamidijohdannaisen (I) muuta osaa, 4 60553 jolloin nämä molemmat reagenssit (a) ja (B) valinnanvaraisesti suojataan yhdellä tai useammalla suojaryhmällä, joka tai jotka tämän jälkeen poistetaan.

Näin ollen reagenssina (A) on L-pyroglutamiinihappo tai peptidifrag-mentti, jonka N-puoleisessa päässä on L-pyroglutamiinihappoyksikkö, ja joka samalla tästä päästä alkaen sisältää kaavan (I) mukaisen aminohapposarjan, kun taas reagenssin (A) kansBa kondensoitävänä reagenssina (B) on amiinikomponentti, joka vastaa nonapeptfcdiamidi-johdannaisen (I) muuta osaa, jolloin reagenssit (A) ja (B) voidaan valinnanvaraisesti suojata.

Seuraavassa taulukossa 1 on esimerkkeinä esitetty reagenssin (A) ja reagenssin (B) perusyhdistelmiä.

Taulukko 1

Reagenssi

Yhdistelmä__ 1 (Pyr)Glu-OH H-Rj-Trp-Ser-Rp-iDj-Ala- _ H^-Arg-Pro-NH-R^

2 (Pyr)Glu-R1-OH H-Trp-Ser-Rp-(D)-Ala-R

__ Arg-Pro-NH-R4 0 3 (PyrjGlu-Rj-Trp-OH ~H-S er-R2- (D) -Ala-R ,-Arg- __ Pro-NH-R4 4 (PyrjGlu-R^Trp-Ser- H-Ro- (D) -Ala-R, - Arg-Pro - ___ NH-R4 j ** ^Ry-OH1U~Rl""TrP*"Ser~ H“D) -Ala-R 3~Arg-Pr o-NH-R4 6 ^Ry-(D)UÄla'*0HP”Sör” H-R 3 - Arg- Pro -N H-R4 7 ^Byr)£lU7?1”£rp-Ser"' H-Arg-pro-NH-R/ __Rq-(D)-Ala-R ^-QH________ 4 8 (?rr?Sw?1"Srp:Sep" ~H“Pro-NH-R4

Rp-(D)-Ala-R^-Arg-OH 4 9 (Pyr)Glu-Rx-Trp-S er- NHp-R,

Ro-(D)-Ala-R3-Arg-Pro- 4 -Lei-li!_l___ 5 60553

On myös ennestään tunnettua, että suojattu L-glutamyyliryhmä, jonka yleinen kaava (il) on rco-ch2ch2ch(nh2)co- (II) jossa kaavassa R on alkoksiryhmä (esim. metoksi-, etoksi-, n-propoksi-, i-propoksi, n-butoksi-ryhmä, jne.), aralkyylioksiryhmä (esim. bent-syylioksiryhmä, jne.), tai aminoryhmä, helposti muutetaan itse L-pyroglut amyy1i ry hmäks i

H

n N CO- xr saattamalla se kosketukseen emäksen (ammoniakin, jne) tai hapon (etikkahapon, jne) kanssa, ja että ryhmä (II) tässä suhteessa on sama kuin itse L-pyroglutamyyliryhmä. Keksinnön mukaista tapaa sovellettaessa on pidettävä mielessä, että reagenssin(A) L-pyroglutarayyli-ryhraä (esim. H-(Pyr)Glu-) sisältää itse L-pyroglutamyyliryhmän lisäksi myös kaavan (II) mukaisen suojatun L-glutamyyliryhmän. Siinä tapauksessa, että reagenssin (A) H-(Pyr)Glu- tarkoittaa ryhmää (lit), muutetaan tämä ryhmä (II) helposti itse L-pyroglutamyyliryhmäksi soveltamalla sinänsä tunnettuja menetelmiä.

Keksinnön mukainen kondensoimisreaktio voidaan suorittaa soveltamalla peptidisidosten muodostamisesta ennestään tunnettuja kondensoimis-keinoja. Näistä mainittakoon atsidiprosessi, kloridiprosessi, happo-anhydridiprosessd, seka-happoanhydridiprosessi, DCC-pposessi, aktiivi-esteri prosessi, Woodward-reagenssin K-prosessi, karbodi-imidatsoli-prosessi, hapetus-pelkistysprosessi, DCC/HONB-prosessi ja muut (The Peptides, Voi. 1 (1966), Schröder and Lubke, Academic Press, New York, U.S.A. ja Belgian patentti no 796,399)·

Ennen kondensoimisreaktiota voidaan suojata ne karboksyyli- ja aminoryhmät, joiden ei tule osallistua suunniteltuun reaktioon, tai voidaan aktivoida reaktioon osallistuvat karboksyyli- ja/tai aminoryhmät sinänsä tunnetuin keinoin. Lähtömateriaalin karboksyyli-ryhmät voidaan suojata metallisuoloina, (esim. natrium- tai kalium-suoloina), tai estereinä (esim. metyyli-, etyyli-, bentsyyli-, p-nitrobentsyyli-, t-butyyli- tai t-amyyliestereinä).

6 60553 Lähtömateriaalien aminorytornien suojarytominä voidaan käyttää mitä tahansa tavanomaisia aminoryhmien suojaryhmiä, jotka tunnetaan peptidien synteettisestä valmistuksessa, ja joista esimerkkeinä mainittakoon bentsyylioksikarbonyyli, t-butoksikarbonyyli, iso-bornyylioksikarbonyyli. Seriinin hydroksyyliryhmä voidaan suojata tavanomaisilla suojaryhmillä, joista esimerkkinä mainittakoon bentsyyli, t-butyyli ja muut eetterin muodostavat ryhmät. Tyrosii-nin hydroksyyliryhmä voidaan suojata bentsyylillä, t-butyylillä ja muilla eetterin muodostavilla ryhmillä. Arginiinin guanidinoryhmä voidaan suojata esim. nitro-, tosyyli-, karbobentsoksi-, isobornyyli-oksikarbonyyli- tai adaaantyylioksikarbonyyliryhmällä. Esimerkkeinä lähtömateriaalien aktivoiduista karboksyyliryhmistä mainittakoon vastaava toappoanhydridi, atsidi, aktiiviset esterit (esterit alkoholien kanssa, esim. pentakloorifenoli, 2,4,5-trikloorifenoli, 2,4-dinitrofenoli, syaanometyylialkoholi, p-nitrofenoli, N-hydroksi-5-norborneeni-2,3-dikarboksimidi, N-hydroksisukkinimidi, N-hydroksi-ftalimidi tai N-toydroksibentstriatsoli) jne. Lähtömateriaalien aktivoituna aminoryhraänä voi olla esim. vastaava fosforihappoamidi. Seuraavassa taulukossa 2 on esimerkkeinä esitetty reagenssimateriaa-lien (A) ja (B) tällaisten karboksyyli- ja aminoryhmien yhdistelmiä.

Taulukko 2 -------------——--

Yhdistelmä- _Reagenssi _ esimerkki _{k}__(B)_ COOH nh2 cooh nh2 1*__Vapaa__suojattu suojattu__vappa_ 2 __Aktivoitu suojattu vapaa__vapaa_ 3 __Vapaa__suojattu suojattu__aktivoitu

Huom! Tapauksessa, joka on merkitty tähdellä *, käytetään reaktio-järjestelmässä sopivasti jotain vedenpoistoainetta (esim. karbodi-imidireagenssia, kuten disykloheksyyli-karbodi-imidiä). Keksinnön eräs sovellutustapa voidaan kirjoittaa seuraavasti: 7 60553 (PyrjGlu-R^-Trp + Ser-Rg-Suojaryhmä N0 . * 2 kondensaatio (esim.

v DOC/HONB Z-(D)-Ala-R3-Arg-Pro-NH-R4 (PyrjGlu-R^-Trp-Ser-Rg-Suojaryhmä I Suojaryhmän

Suojaryhmän poistaminen poistaminen (esim. katalyyttinen (esim. Hbr:n pelkistäminen Pd-kata- Y läsnäollessa) lyytin läsnäollessa) Ψ · 2 (PyrjGlu-R^-Trp-Ser-Rg (Dj-Ala-R^-Arg-Pro-NH-R^

I _I

Kondensaatio (jolloin esim. läsnä on DCC-HQNB tai DCC/hydroksibents-triatsolia).

no9 t c (Pyr)Glu-R^-Trp-Ser-Rg-(D)-Ala-R^-Arg-Pro-NH-R^

Suojaryhmän poistaminen (jolloin läsnä on esim. SnClpSa muurahais-iaapon vesiliuoksessa, katalyyttinen pelkistäminen Pd-katalyytin ▼ avulla tai HP:n avulla).

(Py r) Glu-R-j^-Trp-Ser-Rg- (D) -Ala-R^-Arg-Pro-NH-R^ Tämä reaktio voidaan suorittaa liuottimen läsnäollessa. Liuotin voidaan valita peptidien kondensoimisreaktioista tunnettujen liuottimien joukosta. Esimerkkeinä mainittakoon vedetön tai vesipitoinen dimetyyliformamidi, dimetyylisulfoksidi, pyridiini, kloroformi, dioksaani, dikloorimetaani, tetrahydrofuraani tai näiden liuottimien sopivat seokset.

Reaktiolämpötila valitaan yleensä alueelta, joka on tunnettu peptidi-sidosten muodostumiseen johtavista reaktioista, ja joka toisin sanoen normaalisti on rajoissa noin -20 °C...noin 30 °C. Keksinnön mukaisten yhdisteiden valmistukseen käytettyjä lähtömateriaaleja (suojattuja peptidejä) voidaan myös helposti valmistaa kiinteässä faasissa suoritettujen synteettisten prosessien avulla.

Haluttua kondensoimisreaktion tultua suoritetuksi voidaan tuotteen mahdollisesti sisältämät suojaryhmät .poistaa tunnettuja menetelmiä soveltamalla. Näistä menetelmistä mainittakoon katalyyttinen pelkistäminen jonkin katalyytin, kuten palladiummustan, palladioidun hiilen, 8 60553 platinan tai senkaltaisen läsnäollessa, edelleen hydrolysoimalla fluorivedyn, trifluorietikkahapon tai senkaltaisen avulla, ja pelkistäminen nestemäisessä ammoniakissa olevan metallisen natriumin avulla.

Täten valmistettu peptidi (I) voidaan ottaa talteen reaktioseoksesta soveltamalla peptidien talteenottamisesta ennestään tunnettuja menetelmiä, esim. uuttamista, jakotislaamista, pylväässä kromatografoimis-ta, jne.

Peptidi (I) voidaan myös ottaa talteen suolana tai metallikompleksi-yhdisteenä.

Hapoista, jotka soveltuvat suolojen muodostamiseksi peptidin (I) kanssa, mainittakoon epäorgaaniset hapot, kuten kloorivetyhappo, bromivetyhappo, perkloorihappo, typpihappo, tiosyaanihappo, rikkihappo, fosforihappo, jne. Orgaanisista hapoista mainittakoon muurahaishappo, etikkahappo, propionihappo, glykolihappo, maitohappo, omenah&ppo, oksaalihappo, malonihappo, meripihkahappo, maleiini-happo, fumaarihappo, antranyylihappo, kanelihappo, naftaleenisulfoni-happo ja sulfonyylihappo.

Metalleista, jotka voivat muodostaa metallikompleksiyhdisteitä peptidin (I) kanssa, mainittakoon esimerkkinä sinkki, nikkeli, koboltti, kupari ja rauta. Tällainen metallikompleksiyhdiste voidaan valmistaa soveltamalla tavanomaisia menetelmiä, esim. saattamalla peptidi (i) reagoimaan jonkin edellä mainitun metallin hydroksidin tai oksidin kanssa pH-arvon ollessa alueella noin 6...noin 8.

Keksinnön mukaisilla polypeptideillä (i) on LH-RH (luteiini-hormoonia vapauttavan hormoonin) vaikutus, joten ne kykenevät edistämään LH eli luteiinihormoonin ja PSH eli munarakkulaa kiihoittavan hormoonin erittymistä. Täten voidaan polypeptidejä (I) käyttää lääkkeinä munasolun irtoamisen aiheuttamiseksi naisissa ja naaraseläimissä (esim. rotissa, lampaissa, sioissa, lehmissä, hevosissa, linnuissa, esim. kanoissa). Näitä peptidejä voidaan myös käyttää muihin lääke-tarkoituksiin, joita varten on käytetty tavanomaisia LH-RH, LH- ja PSH-valmisteitä.

Koska polypeptidien (I) LH-RH-vaikutus on noin 20.akertaa suurempi 9 60553 kuin luonnossa esiintyvien tunnettujen peptidien LH-RH-vaikutus, voidaan niiden annostus määrätä edellä mainitun tehokertoimen perusteella, jolloin myös otetaan huomioon muut tekijät, esim. taudin laatu tai lääkkeen käyttäjä. Esimerkkinä mainittakoon, että sopiva annostus voidaan valita alueelta noin 2 ng...2 yug/kg kehonpainoa vuorokaudessa.

Polypeptidejä (I) annetaan pääasiallisesti muulla tavoin kuin suun kautta (esim. ruiskeina tai peräaukon tai emättimen kautta) vaikka niitä voidaan eräissä tapauksissa antaa suunkin kautta.

Antomuodoista mainittakoon esimerkkeinä ruiskeet, peräpuikot, pessaarit tai jauheet. Ruiskeita voidaan valmistaa liuottamalla noin 10 V...100 V polypeptidiä (I) 1 mljaan fysiologista suolaliuosta. Polypeptidejä (I) voidaan myös valmistaa lyofiloituina ampullituottei-na, joihin laimennusaineena lisätään mannitolia siten, että niitä voidaan välittömästi käyttää ruiskeina.

Keksinnön mukaisen tavan soveltamisessa käytettäviä peptidi-lähtömateriaaleja voidaan valmistaa soveltamalla joko peptidien synteettisestä valmistuksesta ennestään tunnettuja prosesseja tai käyttämällä muita sopivia prosesseja.

Peptidin (I) suhteellinen munasolun irtoamista aiheuttava vaikutus: Munasolun irtoamista aiheuttavaa vaikutusta on tutkittu käyttämällä Sprague-Dawley-rottia (4 vuorokauden kiimajaksoisiä naaraita), joihin yhdistettä ruiskutettiin ihonalaisesti klo 14.30 kiimapäivänä ja seuraavan päivän aamuna tarkastettiin irtoutuneet munat munajohtimen suppilossa. Tulokset (ED^q) verrattiin itse LH-RH:n avulla saatuihin tuloksiin. Tutkittujen yhdisteiden koetulokset on esitetty seuraa-vassa: 10 6055 3

Vertaus (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 __(luonnollinen LH-RH)_iqq#_

R1__R2 R3 1 R4 I

Peptidi His Tyr Leu etyyli 6,100% (I) His Tyr leu n-propyyli 4,800%

His Tyr Leu 2-hydroksi- etyyli 4,300% jHis Tyr Leu iso-propyyli 3,600% ; His Phe Leu etyyli 5,810%

His Phe Leu n-propyyli 2,900%

His Tyr Nle etyyli 4,800% | His Phe Ile etyyli 3,200%

Tyr Tyr Leu etyyli 2,010% _[ p-NHg-Phe Tyr Leu etyyli 2,150%

Keksinnön kuvaamiseksi esitetään seuraavat esimerkit* joissa käytetään seuraavia lyhenteitä:

Rf-arvo tarkoittaa ohukerroskromatografointia piihappogeelin avulla seuraavia liuotinjärjestelmiä käytettäessä:

Rf : etyyliasetaatti: pyridiini: etikkahappo:vesi «= 60:20:6:10 2

Rf : n-butanoli:etyyliasetaatti:etikkahappo:vesi «1:1:1;1

Rf^ : n-butanoli:etikkahappo:vesi= 4:1:1 4

Rf : kloroformi:metanoli:etikkahappo= 9:1:0,5

Esimerkeissä käytettyjen rekisteröityjen tavaramerkkien selitykset ovat seuraavat:

Celite: suodatusta edistävä aine, jota valmistaa toiminimi

Johns-Manville, USA

Biogel P-2; geelin suodatukseen käytettävää materiaalia, jota valmistaa toiminimi BIO.RAD, USA

Cephadex LH-20: esteröity dekstraanigeeli, jota valmistaa toiminimi

Pharmacia Pine Chemicals, Ruotsi Amberlite XAD-2; polystyreenihartsia

Amberlite IRA-410: voimakkaasti emäksistä anioninvaihtohartsia Amberlite CG-#10: voimakkaasti emäksistä anioninvaihtohartsia Amberlite CG-45: heikosti emäksistä anioninvaihtohartsia

Kaikkia näitä hartseja valmistaa t:mi Rohm & Haas Co,Ltd,USA.

11 60553

Esimerkki 1

Tuo 11 e en (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-(D)-Ala-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH^valm.

(a) tuotteen (Pyr)-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH valmistus 100 ml:aan metanolia liuotetaan 8,0 g tuotetta Z-Ser-Tyr-OMe Ja suoritetaan katalyyttinen pelkistäminen ilmastollisessa lämpötilassa Ja paineessa Johtamalla 4 tunnit aikana vetykaasua liuokseen, Johon on lisätty 500 mg palladiummustaa. Katalyytti poistetaan suodattamalla. Metanoli poistetaan tislaamalla alennetussa paineessa Ja alhaisessa lämpötilassa, ja jäännös liuotetaan 30 ml:aan dimetyyli-formamidia. Liuokseen lisätään 6,78 g tuotteen (Pyr)Glu-His-Trp-0H kiteitä, minkä jälkeen jäähdytetään jään avulla. Tämän jälkeen lisätään 5,4 g H0NB:a ja 5,0 g DCC:a, ja koko seosta sekoitetaan jääkylvyssä 8 tuntia ja huoneenlämmössä 10 tuntia.

Muodostunut sivutuote disykloheksyylikarbamidi poistetaan suodattamalla ja suodos konsentroidaan alennetussa paineessa. Lisätään 100 ml eetteriä, minkä jälkeen muodostunut sakka erotetaan suodattamalla, pestään eetterillä ja kuivataan. Saanto: 12,2 g. Tämä tuote liuotetaan etyyliasetaatin, pyridiinin, etikkahapon ja veden 60:20: 6:10-seokseen.

Liuos kaadetaan piihappogeeliä sisältävään pylvääseen (halkaisija 6,5 cm, pituus 19 cm), joka valmistetaan käyttämällä samaa liuotin-seosta, ja pylväs eluoidaan samalla liuotinseoksella, jolloin haluttu tuote (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OMe saadaan fraktioista 1480 ml...

1800 ml. Tämä eluaatti haihdutetaan kuiviin alennetussa paineessa ja pestään perusteellisesti vedellä. Saanto; 8,3 g· Ohutkerros-kromatografointia sovellettaessa piihappogeelin avulla tämä tuote antaa yhden ainoan Pauly ja Ehrlich-positiivisen täplän kohdissa 14^=0.29, Rf2=0.68 ja Rf3=0.43.

50 ml:aan metanolia liuotetaan 7,2 g tätä tuotetta ja jäähdytetään jään avulla, sekä lisätään hitaasti IN natriumhydroksidia tuotteen hydrolysoimiseksi. Liuosta sekoitetaan huoneenlämmössä 3 tuntia. Tämän jälkeen lisätään 3 ml IN kloorivetyhappoa, ja jäähdytetään liuos, jolloin muodostuu sakka. Tämä otetaan talteen suodattamalla, ja pestään kylmällä vedellä ja kuivataan. Tuote liuotetaan etanolin 12 60553 5-proaenttiseen vesiliuokseen, ja liuos kaadetaan pylvääseen (halkaisija 3 cm, pituus 25 cm), jossa on tuotetta "Amberlite XAD-2".

Sluointi suoritetaan gradienttimenetelmän avulla käyttämällä 800 ml etanolin 5-prosenttista liuosta ja 800 ml etanolin 90-prosenttista liuosta. Halutun tuotteen fraktiot kootaan, konsentroidaan alennetussa paineessa etanolin poistamiseksi ja lyofiloidaan.

Saanto; 5.9 g. Rf1^ 0.01, Rf2= 0.62, Rf3= 0.34.

Yhdisteen C^H^gNgOg.HgO alkuaineanalyysi:

Laskettu G, 56.65; H, 5.59; N, 15.55

Todettu C, 56.39; H, 5-70; N, 15.52

Aminohappoanalyysi suoritetaan hydrolysoimalla käyttäen 5,7 N kloorivetyhappoa tioglykolihapon läsnäollessa: Glu, 1.05; His, Q.98; Trp, 0.95; Ser, 0.98; Tyr, 1.03.

(b) Tuotteen Z-iDj-Ala-Leu-ArgilK^J-Pro-NH-C^-CH^ valmistus Seokseen, jossa on 30 ml dioksaania ja 10 ml dimetyyliformamidia, liuotetaan 1,14 g tuotetta H-Leu-ArgiNOgJ-Pro-NH-C^-CH^ ja 447 mg tuotetta Z-(D)-Ala-0H. Liuokseen lisätään 400 mg HONBsa ja seos jäähdytetään nopeaeti. Lisätään 460 mg DCC:a, minkä jälkeen seosta sekoitetaan 20 tuntia. Sivutuotteena muodostuva disykloheksyyli-karbamidi poistetaan suodattamalla ja suodos haihdutetaan kuiviin alennetussa paineessa. Jäännös liuotetaan lämmittäen etyyliasetaattiin, ja liuosta pestään natriumbikarbonaatin 4-prosenttisella vesi-liuoksella ja sitten vedellä. Tämän jälkeen kuivataan vedettömän natriumsulfaatin avulla ja haihdutetaan kuiviin alennetussa paineessa.

Jäännös liuotetaan jälleen pieneen määrään etyyliasetaattia, jota lämmitetään, ja liuos suodatetaan liukenemattomien komponenttien pienen määrän poistamiseksi. Suodoksen annetaan seistä, jolloin erottuu neulamaisia kiteitä. Nämä kiteet otetaan talteen suodattamalla, pestään etyyliasetaatilla ja kuivataan.

Saanto: 1.30 g. Sulamispiste 183...184 °C; <*)26 « -49.2° (c= 0.5, metanoli)

Yhdisteen C^0H^yOgNg alkuaineanalyysi

Laskettu: C, 54,45; H, 7.16; N, 19.05

Todettu: C, 54,42; H, 7,28; N, 18.86 13 60553 (c) Tuotteen (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-(D)-Ala-Leu-Arg-Pro-NH-CI^-CH^ valmistus 20 ml:aan etikkahappoa liuotetaan 155 mg tuotteen Z-(D)-Ala-Leu-ArgfNOgJ-Pro-NH-CHg-CH-j kiteitä, minkä jälkeen lisätään 100 mg palladiummustaa ja suoritetaan katalyyttinen pelkistäminen ilmastollisessa lämpötilassa ja paineessa 5 tuntia. Katalyytti poistetaan suodattamalla ja lisätään 0.45 ml IN kloorivetyhappoa, minkä jälkeen suodos haihdutetaan kuiviin alennetussa paineessa. Jäännös liuotetaan 10 mitään vettä ja lyofiloidaan. Jäljelle jäänyt valkea, kuohkea tuote ja 141 mg tuotetta (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH liuotetaan 10 mljaan dimetyyliformamidia, minkä jälkeen lisätään 60 mg H0NB:a, Jäähdytetään jään avulla ja lisätään tässä mainitussa järjestyksessä 0,25 ml N-etyylimorfoliinin 10-prosenttista dimetyyliformaraidiliuos-ta ja 50 mg DCC:a. Seosta sekoitetaan jäähdyttäen jään avulla 5 tuntia ja tämän jälkeen huoneenlämmössä 10 tuntia. Dimetyyliformamidi poistetaan tislaamalla alennetussa paineessa, ja lisätään 20 ml vettä. Liukenemattomat komponentit erotetaan suodattamalla ja suodos kaadetaan tuotetta Amberlite IRA-410 (asetaattimuoto) sisältävään pylvääseen (halkaisija 1 cm, pituus 5 cm), joka sitten pestään 50 ml:11a vettä, Poisvaluva liuos ja pesunesteet kootaan ja kaadetaan karboksimetyyliselluloosaa sisältävään pylvääseen (halkaisija 1,5 cm, pituus 25 cm). Eluointi suoritetaan soveltamalla gradientti-menetelmää ja käyttämällä 300 ml 0,005 M ammoniumasetaattiliuosta ja 300 ml 0,175 M ammoniumasetaattiliuosta. Fraktiot 170 ml...240 ml kootaan ja lyofiloidaan, jolloin saadaan 208 mg valkoista kuohkeata jauhetta. Tätä tuotetta ohutkerroskromatografoitaessa todetaan esiintyvän epäpuhtautta, jolla on laaja Rf-arvo. Tästä syystä tuotetta puhdistetaan uudelleen Amberlite XAD-2 sisältävän pylvään avulla, jonka halkaisija on 2 cm ja pituus on 20 cm. Edellä mainitun kuohkean tuotteen vesiliuos kaadetaan tuotetta Amberlite XAD-2 sisältävään pylvääseen, jonka valmistuksessa on käytetty vettä, ja eluointi suoritetaan soveltamalla gradienttimenetelmää ja käyttämällä 250 ml vettä ja 280 ml etanolin 75-prosenttista vesiliuosta. Fraktiot 170 ml...250 ml kootaan, etanoli poistetaan tislaamalla alennetussa paineessa, minkä jälkeen lgofiloidaan.

Saanto 129 mg. Rf1=0.062i Bf2=0.358 Λ/* (<* )^ = -47.0° (c=0.5» etikkahapon 5-prosenttista vesiliuosta) 14 60553

Aminohappoanalyysi (hydrolyysi tioglykolihapossa olevan HCl:n avulla): Glu, 0.9¾} His, 1.05; Trp, 1.04; Sar, 0,97; Tyr, 0.97; Ala, 1,00;

Leu, 1.04; Arg, 1.03} Pro, 1.00; etyyliamiini, 1,02 (saanto 86$).

Samalla tavoin saadaan kaavan (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-(D)-Ala~Leu-Arg-Pro-NHCH^ mukaista polypeptidiamidia käyttämällä toisena lähtö-materiaalina tuotetta .Z,-(D)-Ala-Leu~Arg(N02)-Pro-NH-CH^ tuotteen Z-(D)-Ala-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH2 asemesta edellisessä kohdassa (b). Tämän tuotteen fysikaaliset ja kemialliset ominaisuudet ovat: ( )^= -48.1° (c=0.6, etikkahappo)

Rf1^ 0.055; Rf2 = 0.335

Aminohappoanalyysi (hydrolyysi HCl:n avulla tioglykolihapon läsnäollessa): Glu, 1.00; His, 1.02; Trp, 0,89} Ser, 0.90; Tyr, Ο.98;

Ala, 1.00; Leu, 1.00; Arg, 1.04} Pro, 1.02; metyyliamiini, 0.97 (saanto 84.9$).

Esimerkki 2

Tuotteen (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-(D) -Ala-Leu-Arg-Pro-NH-CHg-C^-CH-j valmistus (a) Tuotteen Z-tDj-Ala-Leu-ArgdiC^-Pro-NH-CHg-CHg-CH^ valmistus 2 ml:aan bromivedyn 25-prosenttista jääetikkahappoliuosta liuotetaan 720 mg tuotetta Z-Leu-Arg(N02)“Pro-NH-CH2”CH2-CH-j. Liuosta ravistetaan 40 minuuttia, minkä jälkeen lisätään 20 ml kuivaa eetteriä. Muodostunut sakka otetaan talteen suodattamalla ja pestään kuivalla eetterillä. Täten saatu jauhe kuivataan alennetussa paineessa natriumhydroksidin avulla kuivauskaapissa. Kuivattu jauhe liuotetaan 5 ml:aan dimetyyliformamidia, minkä jälkeen lisätään 230 mg tuotetta Z-(D)-Ala-0H ja 200 mg H0NB:a. Liuosta jäähdytetään jään avulla ja lisätään 1,5 ml trietyyliamiinin 10-prosenttista dimetyyli-formamidiliuosta. Tähän liuokseen lisätään 230 mg DCC:a, ja seosta sekoitetaan huoneenlämmössä 10 tuntia. Dimetyyliformamidin suurin osa poistetaan tislaamalla alennetussa paineessa, ja jäännös liuotetaan lisäämällä 50 ml etyyliasetaattia. Liukenemattomat komponentit erotetaan suodattamalla ja suodos pestään kolmasti natriumbikarbonaatin 4-prosenttisella vesiliuoksella ja sitten kahdesti vedellä.

Liuos kuivataan vedettömän natriumsulfaatin avulla ja etyyliasetaatti poistetaan tislaamalla. Jäännös lisätään eetteriin :ja muodostunut 15 60553

Jauhe otetaan talteen suodattamalla, liuotetaan etyyliasetaattiin,

Jota lämmitetään, Ja puhdistetaan kiteyttämällä uudelleen eetteristä. Tällä tavoin aadaan 723 mg Jauhetta.

(Oi =-48.0° (c= 1.0, netanoli)

Yhdisteen C^H^gOgNg alkuaineanalyysi

Laskettu C, 55.18; H, 7.17; N, 18.68

Todettu C, 54.89; H,7.32; N, 18.44

Rf4= 0.62 (b) Tuotteen (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-(D)-Ala-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH2-CH3 valmistus

Seoksessa, jossa on 10 ml etikkahappoa ja 10 nil metanolia, pelkistetään 150 mg edellä olevan kohdan (a) mukaan saatua tuotetta Z-(D)-Ala-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH2-CH2 käyttämällä katalyyttina palladi-oitua hiiltä 4 tuntia. Katalyytti poistetaan suodattamalla ja liuotin tislataan suodoksesta alennetussa paineessa. Jäännös liuotetaan 0,4 raitaan seosta, jossa on IN kloorivetyhappoa ja 10 ml vettä, ja liuos lyofiloidaan. Täten saadaan valkoista kuohkeata jauhetta.

Tämä jauhe ja 141 mg tuotetta (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH liuotetaan 10 mitään dimetyyliformamidia, minkä jälkeen lisätään 60 mg HONBta ja 25 ml N-etyylimorfoliinin 10-prosenttista dimetyyliformamidiliuos-ta. Seos jäähdytetään -2° Cteen ja lisätään 55 mg DCCta. Seosta sekoitetaan ja jäähdytetään jään avulla 5 tuntia, minkä jälkeen sekoittamista jatketaan huoneenlämmössä 12 tuntia.

Reaktion päätyttyä dimetyyliformamidi poistetaan tislaamalla alennetussa paineessa ja jäännös liuotetaan 20 ml:aan vettä. Pieni määrä liukenematonta disykloheksyylikarbamidia poistetaan suodattamalla ja suodos kaadetaan pylvääseen, jonka halkaisija on 1 cm ja pituus 4 cm, ja johon on täytettty tuotetta Amberlite IRA-410 (asetaattimuoto), joka sitten pestään vedellä. Poisvaluva neste ja pesunesteet kootaan ja kaadetaan karboksimetyyliselluloosapylvääseen, jonka halkaisija on 1,5 cm ja pituus on 25 cm.

Tämän jälkeen pestään 0,005 M ammoniumasetaattipuskurilla, ja suoritetaan jatkuva elupinti käyttämällä 300 ml 0,005 M ammoniumasetaatti-puskuria (pH = 6,8) ja 300 ml 0,2 M ammoniumasetaattipuskuria (pH 6,y).

16 60553

Fraktiot 160 ml...230 ml kootaan, lyfiloidaan, kromatografoidaan uudelleen samoissa olosuhteissa kuin edellä sekä lyofiloidaan toisen kerran. Tuote kaadetaan tuotetta Biogel P-2 sisältävään pylvääseen, jonka halkaisija on 3 cm ja pituus 50 cm, ja käytetään eluoimisainee-na 5-prosenttista etikkahappoa. Haluttua tuotetta sisältävä eluaatti lyofiloidaan. Tässä selitetyllä tavalla saadaan 201 mg valkoista kuohkeata jauhetta.

(<* = -46.8° (c= 0.5$, 5# etikkahappo)

Rf2= 0.37; Rf1= 0.08

Aminohappoanalyysi (hydrolyysi 5.7N kloorivetyhapon avulla, jolloin läsnä on tioglykolihappoa: His, 0.97; Arg, 0.97; Trp, 0.91; Ser, 0.91; Glu, 1.00; Pro, 1.00; Ala, 0.98; Leu, 0.97; Tyr, 0.94 (saanto 86.4$).

Esimerkki 3

Tuotteen (Pyr)Grlu-His-Trp-Ser-Tyr-(D)-Ala-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH2-OH valmistus (a) Tuotteen Z-(D)-Ala-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH2-OH valmistus 3 ml:aan bromivedyn 20-prosenttista dioksaaniliuosta liuotetaan 722 mg tuotetta Z-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH2-0H. Liuosta ravistetaan 60 minuuttia, minkä jälkeen lisätään 30 ml kuivaa eetteriä.

Sakka otetaan talteen dekantoimalla, pestään kuivalla eetterillä ja kuivataan perusteellisesti natriumhydroksidin avulla kuivauskaapisea ja alennetussa paineessa.

Tuote liuotetaan 5 ml:aan dimetyyliformamidia, minkä jälkeen lisätään 230 mg tuotetta Z-(D)-Ala-0H, ja 210 mg HONBsa. Jäähdytetään jään avulla, minkä jälkeen lisätään 0,16 ml trietyyliamiinia ja 2j0 mg DCC:a tässä järjestyksessä. Seosta sekoitetaan jään avulla jäähdyttäen tunnin ajan ja tämän jälkeen huoneenlämmössä 4 tuntia. Reaktio-seos suodatetaan ja suodos lisätään 100 mlsaan kloroformia. Liuos pestään natriumbikarbonaatin 4-prosenttisella vesiliuoksella ja tämän jälkeen vedellä, kuivataan vedettömän natriumsulfaatin avulla ja haihdutetaan kuiviin alennetussa paineessa. Jäännös liuotdtaan kloroformin, metanolin ja etikkahapon 9:li0.5 liuotinseokseen, ja liuos kaadetaan piidioksidigeeliä sisältävään pylvääseen, jonka halkaisija on 3 cm ja pituus 40 cm, ja joka on valmistettu käyttämällä samaa liuotinta kuin edellä, minkä jälkeen kehitetään samalla liuottimelle.

17 60553

Fraktiot, joiden Rf4-arvo on 0,47, kootaan, haihdutetaan kuiviin alennetussa paineessa ja pestään eetterillä. Tällä tavoin saadaan 640 mg jauhetta.

(¾ = -47,2° (c=0.5, metanoli)

Yhdisteen G^0H^y0gNg alkuaineanalyysi

Laskettu C, 53.16; H, 6.99; N, 18.60

Todettu C, 52,84; H, 7.26; N, 18.21

Rf4= 40.47 (b) Tuotteen (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-(D)-Ala-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH2-OH valmistus 154 mg tuotetta Z-(D)-Ala-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH2-0H pelkistetään katalyyttisesti 10 ml:ssa etikkahappoa käyttämällä katalyyttina palladiummustaa 5 tuntia. Katalyytti erotetaan suodattamalla ja suodon haihdutetaan kuiviin alennetussa paineessa. Lisätään 10 ml vettä ja 0.45 ml IN kloorivetyhapon vesiliuosta, minkä jälkeen konsen-traatti lyofiloidaan. Jauhemainen lyofilisaatti ja 140 mg tuotetta (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH liuotetaan 10 mitään dimetyyliformamidia, minkä jälkeen lisätään 60 mg HONBta ja 0.25 ml N-ety,ylimorfoliinin 10-prosenttista dimetyyliformamidiliuosta. Seos jäähdytetään -2 °C: een ja lisätään 60 mg DOC:a. Seosta sekoitetaan ja jäähdytetään samalla jään avulla 6 tuntia,minkä jälkeen sekoitetaan huoneenlämmössä 12 tuntia. Reaktion sujuttua loppuun dimetyyliformamidi poistetaan tislaamalla alennetussa paineessa, ja jäännös liuotetaan 10 ml: aan wettä. Liukenemattomat komponentit erotetaan suodattamalla ja suodon kaadetaan tuotetta Amberlite IRA-410 (asetaattirauoto) sisältävään pylvääseen, jonka halkaisija on 1 cm ja pituus 4 cm, jolloin tuote muuttuu asetaatiksi. Tämän jälkeen suola puhdistetaan karboksi-metyyliselluloosaa sisältävän pylvään ja tuotetta Amberlite KAD-2 sisältävän pylvään avulla samalla tavoin kuin esimerkissä 1. Lyofi-loimalla saadaan valkoista kuohkeata jauhetta.

Saanto 146 mg.

(o< = -48.1° (c=0.05» 5^ etikkahappo)

Rf2 = 0.31, Rf1 = 0.025

Aminohappoanalyysi (hydrolyysi 5.7N kloorivetyhapon avulla, jolloin läsnä on tioglykolihappoa): His, 1.00; Arg, 0.98; Trp, 0.98; Ser, 0.92; Glu, 1.00; Pro, 1.00; Ala, 0.99; Leu, 1.00; Tyr, Ο.98 (saanto 87$)· ιβ 60553

Esimerkki 4

Tuotteen (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-(D)-Ala-Leu-Arg-Pro-NH-CH(CH^)^ valmistus (a) Tuotteen Z-(D)-Ala-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH(CH3)2 valmistus 720 mg tuotetta Z-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH(CH3)2 käsitellään samalla tavoin kuin esimerkissä 2-(a) ja kondensoidaan tämän jälkeen tuotteen Z-(D)-Ala-0H kanssa DCC*n ja H0NB:n avulla seoksessa, jossa on 5 ml dimetyyliformamidia ja 10 ml dikloorimetaania. Tuote uutetaan etyyliasetaatilla, jolloin saadaan 690 mg jauhetta.

(y )^ = -48,3° (c= 1.0, metanoli)

Yhdisteen C-j^H^gOgN^ alkuaineanalyysi

Laskettu C, 55.18; H, 7-17* N, 18.68

Todettu C, 54.78; H, 1.09; N, 18.22

Rf4= 0.61 (t>) Tuotteen (Pyr)Glu-Hi s-Trp-Ser-Tyr-(D)-Ala-Leu-Arg-Pro-NH- GH(CHg)2 valmistus

Tarkasti samalla tavalla kuin esimerkissä 2-(b) on selitetty, valmistetaan edellä mainittua yhdistettä tuotteista Z-(D)-Ala-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH(CH ^)2 ja (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH. Saanto 128 mg.

(t* )jp= “47.5° (c=0.5, 5# etikkahappo)

Rf2= 0.375, Rf ^0.08

Aminohappoanalyysi (hydrolyysi 5.7N kloorivetyhapon avulla, jolloin läsnä on tioglykolifcappoa): His, 0.99; Arg, Ο.98; Trp, 0.89; Ser, 0.94} Glu, 1.00; Pro, 1.00; Ala, 1.00; Leu, 1.02; Tyr, Ο.98 (86.5# saanto).

Esimerkki 5

Tuotteen (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-(D)-Ala-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH^ valmistus (a) Tuotteen (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-OH valmistus 100 ml:aan metanolia liuotetaan 4,0 g tuotetta Z-Ser-Phe-OMe. Liuos pelkistetään katalyyttisesti ilmastollisessa paineessa 1,5 tuntia 19 60553 käyttämällä katalyyttina 500 mg palladiummustaa. Katalyytti poistetaan suodattamalla ja välittömästi tämän jälkeen metanoli haihdutetaan suodoksesta tislaamalla alennetussa paineessa, minkä jälkeen jäännös liuotetaan 25 mljaan dimetyyliformamidia. Liuokseen lisätään 4.1 g tuotetta (Pyr)Glu-His-Trp-OH, minkä jälkeen lisätään 3,8 g HONBia ja 3 g DCCsa -5 °C:ssa. Seosta sekoitetaan 2 tuntia -5 °C:ssa, 2 tuntia 0 °C:ssa ja 8 tuntia huoneenlämmössä.

Muodostunut uisykloheksyylikarbamidi poistetaan suodattamalla ja suodos haihdutetaan kuiviin alennetussa paineessa. Jäännös hierretään etyyliasetaatin avulla ja muodostunut jauhe kootaan suodattamalla. Saanti: 6,7 g. Jauhe liuotetaan 30 ml:aan metanolin ja kloroformin 15:85 seosta, ja liuos kaadetaan piihappogeeliä sisältävään pylvääseen, jonka halkaisija on 6 cm ja pituus 12 cm, ja joka on liuotettu metanolin ja kloroformin 15:85 seoksella. Pylväs eluoi-daan 600 ml:lla metanolin ja kloroformin 15:85 seosta, 1 litralla metanolin ja kloroformin 25:75 seosta ja 1 litralla metanolin ja kloroformin 30:70 seosta. Fraktiot, jotka eluoidaan alkaen 400 ml: sta metanolin ja kloroformin 25:75 seosta 700 ml:aan metanolin ja kloroformin 30:70 seosta, kootaan ja haihdutetaan kuiviin alennetussa paineessa. Jäännös hierretään etyyliasetaatin avulla ja muodostunut jauhe .otetaan talteen suodattamalla, jolloin saadaan yhdistettä ( (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-OMs). Saanto: 4.2 g. Rf^ 0.29.

20 ml:aan metanolia suspendoidaan 3,5 g edellä valmistettua yhdistettä, ja suspensio jäähdytetään 0 °C:een, minkä jälkeen lisätään 9 ml IN natriumhydroksidiliuosta. Seosta sekoitetaan tunnin ajan, minkä jälkeen se neutraloidaan 8 ml:11a kloorivetyhapon IN liuosta. Metanoli tislataan alennetussa paineessa ja jäännökseen lisätään kylmää vettä. Muodostunut sakka otetaan talteen suodattamalla, pestään kylmällä vedellä ja kuivataan, jolloin saadaan haluttua yhdistettä. Rf2= 0.61 (¾ -3.3° (c= 0.55, jääetikkahappo) (b) Tuotteen (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-(D)-Ala-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CHgCH-j valmistus 15 ml:aan bromiveflyii 25-prosenttista jääetikkahappoliuosta liuotetaan 1.6 g tuotetta Z-(D)-Ala-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2CH-j, ja liuosta 20 60553 sekoitetaan huoneenlämmössä 50 minuuttia. Liuokseen lisätään 150 ml kuivaa eetteriä, ja muodostuneet sakat kootaan suodattamalla, kuivataan ja liuotetaan 30 mljaan vettä. Liuos kaadetaan tuotetta Amber-lite CG-410 (vapaa emäs) sisältävään pylvääseen, jonka halkaisija on 2,5 crn ja pituus 15 cm, ja pylväs pestään perusteellisesti meta-nolin ja veden 30:70 seoksella, loisyaluva neste ja pesuliuokset yhdistetään ja konsentroidaan metanolin haihduttamiseksi. Jäännös lyofiloidaan, jolloin saadaan H-iDj-Ala-Leu-ArgtNOgJ-Pro-NHCHgCH-j. Saanto 1.2 g. fif1= 0.21, Rf2= 0.64.

5 ml:aan dimetyyliformamidia liuotetaan 225 mg edellä valmistettua yhdistettä ja 280 mg tuotetta (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-OH, minkä jälkeen lisätään 150 mg H0NB:a. Seos jäähdytetään -10 °C:een ja lisätään 90 mg DGCsa. Seosta sekoitetaan 2 tuntia -10 °C:ssa, 4 tuntia 0 °C:ssa, ja 12 tuntia huoneenlämmössä. Muodostunut seos suodatetaan disykloheksyylikarbamidin poistamiseksi, ja suodokseen lisätään etyyliasetaattia. Muodostunut sakka kootaan suodattamalla, kuivataan ja liuotetaan etanolin ja veden 20:80 seokseen, jolloin samalla lämmitetään. Liuoksen annetaan seistä, jolloin muodostuu hienoja kiteitä, jotka erotetaan suodattamalla. Saanto 339 mg. (Cx)26,5= -43.6° (c=0.11, metanoli) Rf1* 0.22, Rf2= 0.74.

(c) Tuotteen (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-(D)-Ala-Leu-Arg-Pro-NH-CHgCH-j valmistus (I) 10 mljaan muurahaishapon 60-prosenttista vesiliuosta liuote taan 150 mg tuotetta (H-(D)-Ala-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2CH-j), joka valmistetaan edellä olevassa kohdassa (b) selitetyllä tavalla, minkä jälkeen lisätään 300 mg SnC^’^O. Seos lämmitetään 80...85 °G:een 2,5 tunniksi ja haihdutetaan kuiviin alennetussa paineessa. Jäännös uutetaan 30 ml:11a vettä, jonka lämpötila on 80 °C, minkä jälkeen suodatetaan. Suodos kaadetaan tuotetta Amberlite XAD-2 (noin 200 meshiä) sisältävään pylvääseen, jonka halkaisija on 3 cm ja pituus on 15 cm.

Pylväs pestään vedellä ja gradienttieluoidaan 300 ml:11a vettä ja 300 ml:11a 100-prosenttista etanolia. Haluttu yhdiste saadaan fraktioista 130 ml...220 ml, jotka kootaan ja konsentroidaan alennetussa paineessa etanolin haihduttamiseksi. Jäännös kaadetaan karbok-simetyyliselluloosaa .sisältävään pylvääseen, jonka halkaisija on 21 60553 2 cm ja pituus on 30 cm. Pylväs gradienttieluoidaan ammoniumasetaa-tilla 0,005...0,2 M (pH= 6,8). Haluttu tuote saadaan fraktioista 350 ml...500 ml, jotka kootaan ja lyofiloidaan, jolloin saadaan kuohkeata jauhetta. Saanto 1112 mg.

(* )24 = -44.3° (c= 0.53, 5# etikkahappo), Rf3^ 0.088, Rf2= 0.73.

Aminohappoanalyysi: His, 0.96; Arg, 1.04; Trp, 0.92; Ser, 0.96;

Glu 0.99; Pro, 1.08; Ala 1.00; Leu, 1.00; Phe, 1.00; etyyliamiini 1.04 (saanto 85#)· (il) Seokseen, jossa on 1 ml jääetikkahappoa ja 20 ml metanolia, liuotetaan 100 mg edellisessä vaiheessa (b) valmistettua yhdistettä, minkä jälkeen lisätään 100 mg palladiummustaa. Seos pelkistetään katalyyttisesti ilmastollisessa paineessa 2 vuorokautta, minkä jälkeen katalyytti poistetaan suodattamalla. Suodos haihdutetaan kuiviin alennetussa paineessa. Jäännös liuotetaan 3 ml:aan ammonium-asetaatin 0,005 M vesiliuosta, liuos kaadetaan karboksimetyylisellu-loosaa sisältävään pylvääseen, jonka halkaisija on 2 cm ja pituus on 30 cm, ja pylväs gradienttieluoidaan samoissa olosuhteissa kuin kohdassa (I). Fraktiot 350 ml...460 ml kootaan ja lyofiloidaan, jolloin saadaan haluttu tuote, jonka Rf-arvo ja ominaiskierto ovat identtisesti samat kuin,edellisessä kohdassa (i) valmistetun yhdisteen arvot.

(III) 5 ml:aan vedetöntä fluorivetyä, jossa on 0,2 ml anisolia ja 0,1 ml merkaptoetanolia, liuotetaan edellisessä kohdassa (b) selitetyllä tavalla valmistettu yhdiste, ja seosta sekoitetaan 0 Crssa 40 minuuttia. Seos haihdutetaan kuiviin alennetussa paineessa fluori-vedyn haihduttamiseksi. Jäännös liuotetaan 10 ml:aan vettä ja liukenemattomat komponentit erotetaan suodattamalla käyttämällä tuotetta Celite^®^ (toiminimen Johns-Manville, USA, rekisteröity tavaramerkki). Suodos kaadetaan tuotetta Amberlite CG-410 (asetaatti-muoto) sisältävän pylvään läpi, jonka halkaisija on 1 cm ja pituus on 10 cm, ja pylväs pestään vedellä. Pylvään läpi valunut liuos ja pesunesteet yhdistetään ja kaadetaan pylvääseen, jonka halkaisija on 2 cm ja pituus on 30 cm. Pylväs gradienttieluoidaan samoissa olosuhteissa kuin edellisessä kohdassa (I) on selitetty. Fraktiot 340 ml...460 ml kootaan ja lyofiloidaan, jolloin saadaan haluttu yhdiste. Saanto: 42 mg.

22 6 0 5 5 3

Valmistetulla tuotteella on sama Rf-arvo, ominaiskierto ja munasolun irtoamiseen vaikuttavan vaikutuksen ED^^-arvo kuin sillä yhdisteellä, joka valmistettiin edellä esitetyn kohdan (I) mukaisella tavalla.

Esimerkki 6

Tuotteen (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-(D)-Ala-Nle-Arg-Pro-NHCH2CHj valmistus (a) tuotteen Z-Nle-ArgiNOgJ-Pro-NH-Ci^CH^ valmistus 4 mljaan bromivedyn 25-prosenttista jääetikkahappoa liuotetaan 477»5 mg tuotetta Z-ArgiNOgJ-Pro-NH-CE^CH^, ja liuosta sekoitetaan huoneenlämmössä 30 minuuttia, minkä jälkeen lisätään kuivaa eetteriä. Muodostunut sakka kootaan suodattamalla, pestään eetterillä ja kuivataan natriumhydroksidin avulla alennetussa paineessa.

Toisaalta liuotetaan 265,3 mg tuotetta Z-Nle-OH seokseen, jossa on 2 ml etyyliasetaattia ja 2 ml dioksaania. Liuos jäähdytetään 0 °C: een, lisätään siihen 187 mg HONB:a ja 226 mg DCC:a, minkä jälkeen seosta sekoitetaan 3 tuntia.

Erottunut karbamidiyhdiste poistetaan suodattamalla. Suodos lisätään edellä valmistetun sakan liuokseen 1 mljssa dimetyyliformamidia, minkä jälkeen tiputtaen lisätään 0,28 ml trietyyliamiinia. Seosta sekoitetaan 12 tuntia, minkä jälkeen tislataan liuottimen haihduttamiseksi. Jäännös uutetaan 100 ml:lla kloroformia. Uutos pestään natriumbikarbonaatin 5-prosenttisella vesiliuoksella, kloorivety-hapon 0,5N liuoksella ja vedellä tässä järjestyksessä, ja kuivataan vedettömän natriumsulfaatin avulla. Kloroformi haihdutetaan tislaamalla. Jäännöstä hierretään eetterin avulla, minkä jälkeen saoste-taan uudelleen etanolista eetterin avulla siten, että saadaan haluttu yhdiste. Saanto 410 mg. Sulaa 109·..Hl °C:ssa (hajoaa), (y )£2= -50,4° (c= 0,5, etanoli).

Yhdisteen C27H4207N8* 1/2H2^ alkuaineanalyysi

Laskettu C, 54.07; H, 7.22; N, 18.68

Todettu C, 53.79; H, 7.09; N, 18.24 23 60553 (b) Tuotteen. Z-(D)-Ala-Nle-Arg(N02)-Pro-NH-CH2CH^ valmistus 5 ml:aan bromivedyn 25-prosenttista jääetikkahappoliuosta liuotetaan 200 mg tuotetta Z-Nle-Arg(NO2)-Pro-NH-CHgCH^, ja liuosta sekoitetaan huoneenlämmössä 40 minuuttia, minkä jälkeen lisätään 50 ml kuivaa eetteriä. Muodostunut sakka otetaan talteen suodattamalla, pestään eetterillä ja kuivataan. Sakka kaadetaan tuotetta Amberlite IRA-410 (vapaa muoto) sisältävään pylvääseen, jonka halkaisija on 1 cm ja pituus on 5 cm, ja käytetään kehittimenä metanolin 40-prosenttista vesiliuosta bromivedyn poistamiseksi. Metanoii haihdutetaan pois-valuvasta nesteestä tislaamalla ja jäännös lyofiloidaan, jolloin saadaan 120 mg jauhetta. Seokseen, jossa on 20 ml dikloorimetaania ja 5 ml dimetyyliformamidia, liuotetaan edellä juuri valmistettu jauhe ja 44,7 mg tuotetta Z-(D)-Ala-OH. Liuos jäähdytetään 0 °C:een, ja lisätään siihen 40 mg H0NB:a ja 46 mg DCC:a. Seosta sekoitetaan huoneenlämmössä 12 tuntia. Erottunut disykloheksyylikarbamidi poistetaan suodattamalla ja suodos haihdutetaan kuiviin alennetussa paineessa. Jäännös liuotetaan 120 mljaan etyyliasetaattia. Liuos pestään natriumbikarbonaatin 4-prosenttisella vesiliuoksella ja vedellä, ja kuivataan vedettömän natriumsulfaatin avulla, sekä haihdutetaan kuiviin alennetussa paineessa. Jäännös liuotetaan pieneen määrään etanolia ja saostetaan eetterin avulla, minkä jälkeen toistetaan tämä seostaminen, jolloin haluttu yhdiste saadaan jauheena.

Saanto 132 mg. (Oi = -48,5° (c= 0,5, metanoli)

Yhdisteen C^0H^yOgNg alkuaineanalyysi

Laskettu C, 54.45; H, 7.16; N, 19.05

Todettu C, 54.48; H, 7.23; N, 18.72

Rf1= 0.79, Rf2= 0.92, Rf4= 0.66.

(c) Tuotteen (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-(D)-Ala-Nle-Arg-Pro-NHCH2CHg valmistus 5 ml:aan bromivedyn 25-prosenttista jääetikkahappoliuosta liuotetaan 100 mg tuotetta Z-(D)-Ala-Nle-Arg(N02)-Pro-NH-CH2CH3, ja liuosta sekoitetaan huoneenlämmössä 50 minuuttia, minkä jälkeen lisätään 40 ml kuivaa eetteriä. Muodostunut sakka erotetaan suodattamalla, pestään eetterillä ja kuivataan natriumhydroksidin avulla alennetussa paineessa. Tuote liuotetaan 40-prosenttiseen vesiliuokseen ja kaadetaan tuotetta Amberlite CG-45 (vapaa muoto) sisältävään pylvää- 24 60553 seen bromivedyn poistamiseksi. Metanoli poistetaan poisvaluvasta nesteestä tislaamalla alennetussa paineessa, ja jäännös lyofiloidaan. Lyofilisaatti ja 100 mg tuotetta (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH liuotetaan 4 ml:aan dimetyyliformamidia. lisätään 45 mg H0NB:a, jäähdytetään seos -5...-7 °C:een, ja lisätään 40 mg DCC:a. Seosta sekoitetaan 5 tuntia, jolloin samalla jäähdytetään jään avulla ja tämän jälkeen sekoitetaan sitä 10 tuntia huoneenlämmössä. Dimetyyliforma-raidi poistetaan haihduttamalla ja jäännökseen lisätään 30 ml etyyliasetaattia. Seos suodatetaan ja suodatuskakku kuivataan. Tuote liuotetaan 2 ml saan vedetöntä fluorivetyä, jossa on 0,05 ml anisolia ja 0,05 ml merkaptoetanolia, minkä jälkeen liuosta sekoitetaan 0 °C: ssa 40 minuuttia. Pluorivety poistetaan tislaamalla alennetussa paineessa, ja jäännös liuotetaan 10 mlsaan vettä. Liukenemattomat komponentit poistetaan suodattamalla, ja suodos kaadetaan tuotetta Amberlite IRA-410 (asetaattimuoto) sisältävään pylvääseen, jonka halkaisija on 1 cm ja pituus on 5 cm, jolloin tuote muuttuu asetaa-tiksi. Poisvaluva neste kaadetaan karboksimetyyliselluloosaa sisältävän pylvään läpi, jonka halkaisija on 1.5 cm ja pituus on 30 cm, ja pylväs gradienttieluoidaan 400 mls 11a 0,005 M ammoniumasetaattia ja 400 ml:11a 0,2 M ammoniumasetaattia. Fraktiot 290 ml...320 ml, joilla on maksimiabsorptio ultravioletti-absorptiospketrissä, kootaan ja lyofiloidaan, jolloin saadaan kuohkea jauhe. Saanto 105 mg.

Rf1= 0.063, Rf2= 0.360 (Cx = -46.0° (c= 0.3, 5# etikkahapon vesiliuos)

Aminohappoanalyysi (hydrolyysi 5.7N kloorivetyhapon avulla, jolloin läsnä on tioglykolihappoa):

Glu, 1.10; His, 1.02; Trp, 0.91; Ser, 0.98;

Tyr, 1.00; Ala, 1.00; Nle, 1.02; Arg, Ο.98; Pro, 0.97; etyyliamiini 1.04 (saanto 84#).

Esimerkki 7

Tuotteen (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-(D)-Ala-Ile-Arg-Pro-NHCI^CH-j valmistus 3 g BOC-Pro-hartsia (proliinipitoisuus 0,34 millimoolia/g) syötetään peptidin automaattiseen syntetisoimisreaktoriin (APS-ÖOO, valmistaja Shimidzu Seisakusho, Ltd., Japani), ja paisutetaan dikloorimetaanilla 12 tuntia, minkä jälkeen aminohappoja lisätään seuraavasti: 25 6 0 5 5 3

Dikloorimetaania (3 minuuttia x 3 kertaa) —> 50-prosenttista tri- fluorietikkahappo/dikloorimetaania (10 min ja 30 min., 2 kertaa)-> dikloorimetaania (3 min x 3 kertaa) —V etanolia (3 min x 3 kertaa)—* 10-prsenttista trietyyliamiini/kloroformia (10 min.) —)· kloroformia (3 min. x 3 kertaa) —} dikloorimetaania (3 min. x 2 kertaa) —) BOC-aminohappoa -^ anhydridia (valmistettu tavalliseen tapaan BOC-aminohaposta ja DCCssta) (30 min. ja 60 min., 2 kertaa) -» asetylointi (dikloorimetaania, trietyyliamiinia ja etikkahappoanhydri- diä) (1 tunti) -> dikloorimetaania (3 min. x 3 kertaa). (Käytetään ainoastaan tuotetta (Pyr)Crlu-OH, koska siinä ei ole BOC-ryhmää, ja kondensaatiorpaktio suoritetaan dimetyyliformamidissa DCC:n avulla).

Lopuksi hartsi pestään etanolilla, kloroformilla, dimetyyliformami-dilla ja eetterillä tässä mainitussa järjestyksessä sekä kuivataan. Saanto 4,12 g. Käytetään seuraavia BOC-aminohappoja: BOC-Arg(Tos), BOC-Ile, B0C-(D)-Ala, BOC-Phe, BOC-Ser (Bzl), BOC-Trp, BOC-Iiis (Tos).

3 g edellä selitetyllä tavalla valmistettua hartsia suspendoidaan 20 ml:aan dimetyyliformamidia, ja liuos kyllästetään etyyliamiinilla 20 °C:ssa. Seosta sekoitetaan 40 tuntia huoneenlämmössä. Hartsi erotetaan suodattamalla ja suodos haihdutetaan kuiviin alennetussa paineessa. Jäännös hierretään eetterin avulla, jolloin saadaan jauheena raakaa tuotetta (Pyr)Glu-His(Tos)-Trp-Ser(Bzl)-Phe-(D)-Ala-Ile-Arg(Tos)-Pro-NH-CH2CH^. Saanto 720 mg. Tämä jauhe liuotetaan etyyliasetaatin, pyridiinin, etikkahapon ja veden 60:20:6:10 seokseen, ja liuos kaadetaan piihappogeeliä sisältävään pylvääseen, jonka Halkaisija on 3 cm ja pituus on 20 cm, ja joka on liuotettu samalla liuotinseoksella. Pylväs eluoidaan samalla liuotinseoksella. Fraktiot, joiden Rf-arvo on 0,4, kun suoritetaan ohutkerroskromato-grafointi piihappogeelin avulla metanolin ja kloroformin 15:85 seosta käyttäen, kootaan ja haihdutetaan kuiviin alennetussa paineessa. Jäännös hierretään etyyliasetaatin avulla ja saatu jauhe otetaan talteen suodattamalla. Saanto; 240 mg. Jauhe liuotetaan 5 ml:aan fluorivetyä, jossa on 0,05 ml tioglykolihappoa ja 0,2 ml anisolia, ja liuosta sekoitetaan 0 °C:ssa tunnin ajan. Fluorivety poistetaan (laihduttamalla ja jäännös liuotetaan 10 ml:aan vettä. Liuos kaadetaan tuotetta Amberlite IRA-410 (asetaattimuoto) sisältävään pylvääseen, jonka halkaisija on 1 cm ja pituus on 10 cm. Poisvaluvu liuos 26 60553 puhdistetaan saattamalla se menemään kahdesti tuotetta Ainberlite XAD-2 sisältävän pylvään läpi, jonka halkaisija on 2 cm ja pituus on 10 cm, kahdesti karboksimetyyliselluloosaa sisältävän pylvään läpi, jonka halkaisija on 1,9 cm ja pituus on 10 cm, ja kerran tuotetta Sephadex LH-20 sisältävän pylvään läpi, jonka halkaisija on 1 cm ja pituus on 60 cm, minkä jälkeen lopuksi lyofiloidaan ja saadaan kuohkeata jauhetta.

Saanto 42 mg. Rf1= 0.071, Rf2= 0.37

Aminohappoanalyysi (hydrolyysi kloorivetyhapon avulla, jolloin läsnä on tioglykolihappoa).

Glu, 1.01; His, 0.93; Trp, 0.92; Ser, 0.99; Phe, 1.00;

Ala, 1.03; Ile, 0.98; Arg, 1.00; Fro, 1.08; etyyliamiini 1.04 (saanto 88$)

Esimerkki 8

Tuotte en (Pyr)Glu-Tyr-Trp-S er-Tyr-(D)-Ala-Leu-Arg-Pro-NHCHgCH^ valmistus (a) Tuotteen B0C-Tyr-(0Bzl)-(D)-Ala-0Bzl valmistus 100 ml:aan asetonitriiliä liuotetaan 11.1 g tuotetta BOC-Tyr-(OBzl)-OH ja 10,9 g tuotetta (D)-Ala-0Bzl-p-tolueenisu2fonaatti. Liuos jäähdytetään 0 °C;een, ja lisätään siihen 6.8 g DCC:a, 4,5 g H0NB:a ja 4,34 ml trietyyliamiinia. Seosta sekoitetaan huoneenlämmössä 10 tuntia, minkä jälkeen saostunut karbamidiyhdiste poistetaan suodattamalla. Suodos tislataan ja jäännös uutetaan 200 ml:11a etyyliasetaattia. Uutos pestään natriumbikarbonaatin 5-prosenttisella vesi-liuoksella, kloorivetyhapon 0,1N vesiliuoksella sekä vedellä tässä mainitussa järjestyksessä, ja kuivataan natriumsulfaatin avulla. Etyyliasetaatti poistetaan tislaamalla ja jäännös kiteytetään petrolieetteristä ja kiteytetään tämän jälkeen uudelleen etyyliasetaatin ja petrolieetterin seoksesta. Saanto 13.6 g· Sulamispiste: 113...114 °C; (¾ )^1 = + 18,4° (c=, metanoli), Rf=0.76. Yhdisteen a^ua in e analyysi

Laskettu C, 69.90; H, 6.81; N, 5.26#

Todettu C, 69.72; H, 6.75; N, 5.42# 27 6 0 5 5 3 (b) Tuotteen BOC-Ser-Tyr-(OBzl)-(D)-Ala-OBzl valmistus 100 mitään trifluorietikkahappoa liuotetaan 11 g tuotetta BOC-Tyr (0Bzl)-(D)-Ala-0Bzl. Liuoksen annetaan seistä huoneenlämmössä 30 minuuttia, minkä jälkeen liuotin poistetaan tislaamalla alennetussa paineessa.

Jäännös kuivataan natriumhydroksidin avulla alennetussa paineessa kuivauskaapissa.

Toisaalta liuotetaan 4,1 g tuotetta BOC-Ser ja 4,0 g 2,4-di-nitro-fenolia 50 mitään tetrahydrofuraania. Tämä liuos jäähdytetään 0 °C; een, minkä jälkeen siihen lisätään 4,5 g DCCta ja sekoitetaan 0 °Ct ssa 2 tuntia.

Saostunut disykloheksyylikarbamidi poistetaan suodattamalla ja aikaisemmin valmistettu amiinikomponentti (H-Tyr-(OBzl)-(D)-Ala-0BZ1) liuotetaan suodokseen. Liuos jäähdytetään 0 °Cteen ja lisätään siihen tiputtaen 4,2 ml triatyyliamiinia. Liuosta sekoitetaan huoneenlämmössä 5 tuntia, minkä jälkeen tetrahydrofuraani poistetaan tislaamalla alennetussa paineessa.

Jäännös liutetaan 200 mitään etyyliasetaattia, ja liuos pestään natriumbikarbonaatin 5-prosenttisella vesiliuoksella, kloorivety-hapon 0,IN vesiliuoksella ja vedellä tässä mainitussa järjestyksessä, minkä jälkeen kuivataan natriumsulfaatin avulla. Etyyliasetaatti poistetaan tislaamalla, ja jäännös kiteytetään petrolieetteristä sekä kiteytetään tämän jälkeen uudelleen etyyliasetaatin ja petroli-eetterin seoksesta. Saanto 9.7 g.

Rf^= 0.5 T f (C* )p^"= -4.1° (c=l, metanoli); sulamispiste: 124...125 °c.

Alkuaineanalyysi, yhdiste C-^H^OgN^

Laskettu C, 65.89; H, 6.67; N, 6.78$

Todettu C, 65.82; H, 6.59; N, 6.50$ (c) Tuotteen BOC-Ser-Tyr-iDj-Ala-Leu-ArgiNO^J-Pro-NHCH^CH^ valmistus 100 ml:aan metanolia liuotetaan 2,16 g tuotetta BOC-Ser-Tyr(OBzl)^D).

28 60553

Ala-OBzl, minkä jälkeen pelkistetään katalyyttisesti 4 tuntia palladiummustan avulla. Tämän jälkeen katalyytti poistetaan suodattamalla. Metanoli poistetaan tislaamalla ja jäännös liuotetaan 10 ml: aan dimetyyliformamidia. Tähän liuokseen liuotetaan 1,6 g tuotetta H-Leu-ArgiNOpJrPro-NHCHoCH-j ja 690 mg H0NB:a. Liuos jäähdytetään O ^ 0 C:een, minkä jälkeen siihen lisätään 795 mg DCC:a, jolloin samalla sekoitetaan. Seosta sekoitetaan 2 tuntia 0 °C:ssa ja tämän jälkeen 5 tuntia huoneenlämmössä. Saostunut karbamidiyhdiste poistetaan suodattamalla ja dimetyyliformamidi poistetaan tislaamalla alennetussa paineessa. Jäännös uutetaan 50 ml:11a n-butanolia ja pestään natriumbikarbonaatin 5-prosenttisella vesiliuoksella, 0.1N kloori-vetyhapolla ja vedellä tässä mainitussa järjestyksessä, n-butanoli poistetaan tislaamalla ja jäännös muutetaan kiinteään muotoon eetterin avulla ja saostetaan etanolin ja eetterin seoksesta. Saanto 2.25 g. Rf^=0.30; sulamispiste: 149. ».151 °C (hajoaa); (0< )^= -2o.6° (c=l, metanoli)

Yhdisteen C^gH^O^^n* 3/2^0 alkuaineanalyysi

Laskettu C, 51.75; H, 7.35; N, 17.02#

Todettu C, 51.89; H, 7.30; N, 16.72# (d) Tuotteen Z-Tyr(Z)-Trp-0Bzl valmistus

Dioksaanin ja etyyliasetaatin seokseen (50 ml ja 10 ml) liuotetaan 9.0 g tuotetta Z-Tyr-(Z)-0H ja 10,2 g tuotetta Trp-OBzl-p-tolueeni-sulfonaatti. Liuos jäähdytetään 0 °C:een ja lisätään siihen 3.93 g H0NB:a, 4,33 g DCC:a ja 3,0 ml trietyyliamiinia. Seosta sekoitetaan 5 tuntia, minkä jälkeen saostunut karbamidiyhdiste poistetaan suodattamalla. Liuotin poistetaan tislaamalla alennetussa paineessa, ja jäännös uutetaan 200 mltlla etyyliasetaattia. Uutos pestään natriumbikarbonaatin 5-prosenttisella vesiliuoksella, IN kloorivetyhapolla ja vedellä tässä mainitussa järjestyksessä, minkä jälkeen kuivataan natriumsulfaatin avulla. Etyyliasetaatti poistetaan tislaamalla, ja jäännös kiteytetään petrolieetteristä sekä kiteytetään uudelleen etyyliasetaatin ja petrolieeetterin seoksesta. Saanto 13 g.

Rf^= 0.88; sulamispiste: 103°·.·104 °C; (Ot )j^ = -4*7° (c=l, metanoli)

Yhdisteen ^3^39^8^3 alkuaineanalyysi

Laskettu C, 71.16; H, 5.42; N, 5.79#

Todettu C, 71.11; H, 5.29; N, 5.76# 60553 29 (e) Tuotteen Ζ-(Pyr)Glu-Tyr-Trp valmistus 100 ml:aan metanolia liuotetaan 5*8 g tuotetta Z-Tyr(Z)Trp-OBzl ja pelkistetään katalyyttisesti 5 tuntia pailadiummustan läsnäollessa. Tämän jälkeen katalyytti poistetaan suodattamalla, ja metanoli poistetaan tislaamalla alennetussa paineessa. Jäännös liuotetaan 20 ml: aan dimetyyliformamidia, ja lisätään 3,i9 g tuotetta Z-(I:yr)Glu-ONB ja 1,12 ml trietyyliamiinia. Seosta sekoitetaan 12 tuntia huoneenlämmössä, minkä jälkeen dimetyyliformamidi poistetaan tislaamalla. Jäännökseen lisätään 100 ml etyyliasetaattia ja 100 ml vettä. Vesi-kerros tehdään happameksi IN kloorivetyhapon avulla ja uutetaan 100 ml: 11a n-butanolia. Uutos pestään vedellä ja n-butanoli poistetaan tislaamalla. Jäännös hierretään eetterin avulla jauheen saamiseksi. Tämä saostetaan uudelleen etanolin ja eetterin seoksesta. Saanto 4.5 g. Rf^=0.63; sulamispiste 165°. ..169 °C (hajoaa); (oc)p1= -4.8° (c=0.5, metanoli)

Yhuisteen C^HjgOgN^'I^O alkueaineanalyysi

Laskettu C, 62.85; H, 5.43; N, 8.89#

Todettu C, 62.96; H, 5-35; N, Ö.76?6 (f) Tuotteen (Pyr)Glu-Tyr-Trp-Ser-Tyr-(D)-Ala-Leu-Arg-Pro-NHCH2CHj valmistus 20 mlsaan metanolia liuotetaan 184 mg tuotetta Z4Pyr)-Glu-Tyr-Trp ja hydrogenoidaan 3 tuntia palladiummustan läsnäollessa. Katalyytti erotetaan suodattamalla, minkä jälkeen metanoli poistetaan tislaamalla alennetussa paineessa ja jäännös liuotetaan 2 ml:aan dimetyyliformamidia. Toisaalta käsitellään 316 mg tuotetta BOC-Ser-Tyr-(L»)-Ala-Leu-Arg(N02)-Pro-NHCH2CH-j 10 ml:lla trifluorietikkahappoa 40 minuuttia, jolloin läsnä on 0.36 ml IN kloorivetyhappoa. Trifluorietikka-happo poistetaan tislaamalla ja jäännös hierretään eetterin avulla ja kuivataan perusteellisesti natriumbydroksidin avulla kuivaus-kaapissa. Tämä jauhe ja 81 mg H0NB:a liuotetaan edellä valmistettuun dimetyyliformamidiliuokseen, minkä jälkeen jäähdytetään -2 °C: een. Tämän jälkeen lisätään 93 mg DCC:a ja 0,05 ml N-etyylimorfo-liinia, ja saatua seosta sekoitetaan 2 tuntia 0 °C:ssa ja sitten yli yön nuoneenlämmössä. Muodostunut karbamidiyhdiste poistetaan suodattamalla, ja suodokseen lisätään 50 ml eetteriä. Sakka otetaan talteen suodattamalla. Saanto· 350 mg. Tämä tuote sijoitetaan 7 g:aan 30 60553 piihappogeeliä, ja käytetään kehittimenä Rf^:n raukaista liuotin-seosta. Runsaasti haluttua yhdistettä sisältävät fraktiot kootaan ja liuotin poistetaan tislaamalla. JäännöBtä hierretään etyyliasetaatin avulla. Saanti: 270 mg. 150 mg suuruista osaa tätä tuotetta käsitellään 4 ml:11a vedetöntä fluorivetyä, jossa on 0.1 ml anisolia ja 0.1 ml 2-merkaptoetanolia, tunnin ajan ö °C:ssa, minkä jälkeen fluorivety poistetaan tislaamalla alennetussa paineessa. Jäännös kuivataan natriumhydroksidin avulla kuivauskaapissa. Jäännös uutetaan 50 ml:11a vettä ja uutos kaadetaan tuotetta Amberlite IRA-410 (asetaattimuoto) sisältävän pylvään läpi, jonka halkaisija on 1 cm ja pituus on 5 cm. Pylväästä valuva neste ja pesuvedet kootaan ja kaadetaan karboksymetyyliselluloosaa sisältävään pylvääseen, jonka halkaisija on 1,5 cm ja pituus on 19 cm. Eluointi suoritetaan soveltamalla suoraviivaista gradienttimenetelmää, jossa käytetään 2Ö0 ml 0,005N ammoniumasetaattia...280 ml 0.15N ammoniumasetaattia. Fraktiot 110 ml·...210 ml kootaan ja lyofiloidaan, jolloin saadaan 95 mg haluttua tuotetta. Rf^=0.35; (¾ = -39.O0 (c=0.5, 5% etikkahappo); aminohappoanalyysi (hydro- lyysi 5·7Ν suolahapon avulla, kun läsnä on 4% tioglykolihappoa 110 °C: ssa); Arg, 1.07; Trp, 1.03; Ser, 0.89; Glu, 1.00; Pro, 1.00;

Ala, 1.00; Leu, 1.00; Tyr, 2.00; etyyliamiini, 1.05 (saanto 81%)

Esimerkki 9

Tuotteen (Pyr)Glu-p-NH2“Phe-Trp-Ser-Tyr-(D)-Ala-Leu-Arg-Pro-NH-C^-CH^ valmistus (a) Tuotteen BOC-p-IK^-Phe-OH valmistus

Seokseen, jossa on 40 ml natriumhydroksidin IN vesiliuosta ja 150 ml dimetyyliformamidia, liuotetaan 6,3 g tuotetta p-N02~Pde-0H ja 13.3 g t-butyylipentakloorifenyylikarbonaattia. Lisätään 5 ml txäetyyli-amiinia, minkä jälkeen liuoksen annetaan reagoida huoneenlämmössä 48 tuntia. Liuotin poistetaan tislaamalla ja jäännös liuotetaan veteen, minkä jälkeen uutetaan eetterillä. Vesikerroksen pH säädetään arvoon 3 sitruunahapon avulla, minkä jälkeen uutetaan etyyliasetaatilla. Orgaaninen kerros kuivataan vedettömän magnesiumsulfaatin avulla ja liuotin poistetaan tislaamalla. Jäännös hierretään petrolieetterin avulla ja otetaan talteen suodattamalla. Tuote puhdistetaan piihappogeeliä sisältävän pylväskromatografoinnin 60553 31 avulla, ja haluttua tuotetta sisältävät fraktiot kootaan ja tislataan liuottimen poistamiseksi. Jäännös kiteytetään eetterin ja petroli-eetterin seoksesta. Saanto: 3.8 g. Sulamispiste 103...104 °C.

(cv -32.0° (c= 0.75, dimetyyliformamidi); Rf4= O.bl.

Yhdisteen alkuaineanalyysi

Laskettu C, 54.19; H, 5.85; K, 9.03$

Todettu C, 54,21; H, 5.8b; N, 9.21$ (b) Tuotteen BOC-p-NI^-Phe-OH valmistus 80 mliaan me anolia liuotetaan 2,0 g tuotetta BOC-p-rK^-Pbe-OH ja pelkistetään katalyyttisesti huoneenlämmössä 8 tuntia käyttämällä katalyyttina palladiummustaa. Katalyytti poistetaan suodattamalla ja liuotin poistetaan haihduttamalla. Jäännös hierretään petroli-eetterin avulla ja otetaan talteen suodattamalla. Saatu tuote kiteytetään uudelleen etyyliasetaatin ja petrolieetterin seoksesta.

Saanto? 1,5 g, sulamispiste: 121 °C; (e* )^= - 2.2.° (c=1.0, dimetyyliformamidi); Rf4=0.40 Yhdisteen alkuaineanalyysi

Laskettu C, 59.98; H, 7.19; N, 9.59$

Todettu C, 59.47; H, 7-20; N, 9,71$ (c) Tuotteen BOC-p-NH-Z-Phe valmistus 120 ml:aan natriumbikarbonaatin IN vesiliuosta liuotetaan 1.5 g tuotetta BOC-pNHg-Phe-OH. Jäähdytetään jään avulla, sekoitetaan voimakkaasti ja lisätään 1.1 g bentsyylioksikarbonyylikloridia.

Reaktion kuluessa lisätään vielä 30 ml vettä, ja reaktion annetaan jatkua 3 tuntia. Tämän jälkeen reaktioseokseen lisätään IN kloori-vetyhappoa pH:n säätämiseksi arvoon 2, ja muodostunut öljymäinen sakka uutetaan etyyliasetaatilla. Etyyliasetaattikerros kootaan, pestään vedellä ja kuivataan vedettömän magnesiumsulfaatin avulla. Liuotin poistetaan tislaamalla ja jäännös hierretään petrolieetterin avulla, jolloin saadaan raaka tuote. Tämä tuote kiteytetään uudelleen eetterin ja petrolieetterin seoksesta. Saanto: 1.Ö4 g. Sulamispiste: 156...157 °C; ((y )^= “3.34° (c= 0.7, dimetyyliformamidi);

Rf4= 0.67.

Yhdisteen ^22^26®6®2 alkuaineanalyysi 32 60553

Laskettu C, 63.75; H, 6.32; N, 6.7o$

Todettu C, 03.76; H, 6.25; N, b.db$ (d) Tuotteen BOC-Trp-Ser-Tyr-(D)-Ala-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH3 valmistus 5 ml jaan dimetyyliformamidia liuotetaan 466 mg tuotetta H-Ser-Tyr- (D)-Ala-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH3, minkä jälkeen lisätään 370 mg tuotetta BOC-Trp-ONB. Liuoksen annetaan reagoida, huoneenlämmössä 3 tuntia. Liuotin poistetaan tislaamalla ja jäännökseen lisätään etyyliasetaattia. Muodostunut jauhe otetaan talteen suodattamalla ja keitetään etyyliasetaatissa, minkä jälkeen jäähdytetään ja annetaan reaktioseoksen seistä. Sakka otetaan talteen suodattamalla. Saanto: 590 mg. Sulamispiste l89...1yO °C (hajoaa); (oi = -43.6° (c=0.6, dimetyyliformamidi); Rf^=0.32 Yhdisteen ^5οΗ73^13Ν13*alkuaineanalyysi

Laskettu C, 54,53; H, 7.06; N,Ib.55$

Todettu C, 54.34; H, 6.90; N, 16.54$ (e) Tuotteen BOC-p-NH-Z-Phe-Trp-Ser-Tyr-(D)-Ala-Leu-Arg-(N02)-Fro-NH-CH2-CH3 valmistus

Merkaptoetanolin läsnäollessa käsitellään 560 mg tuotetta BOC-Trp-Ser-Tyr-(D)-Ala-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH3 5 ml:11a trifluori-etikkahappoa huoneenlämmössä 30 minuuttia, minkä jälkeen lisätään eetteriä. Muodostunut sakka otetaan talteen suodattamalla ja kuivataan natriumhydroksidin avulla kuivauskaapissa.

Tuote liuotetaan 5 ml:aan dimetyyliformamidia, ja liuos neutraloidaan 0.1 ml:lla N-etyylimorfoliinia.

Tähän liuokseen lisätään tuotteen BOC-p-NH-Z-Phe-ONB dimetyyliforma-midiliuosta, jota tuotetta on valmistettu käyttämällä 217 mg tuotetta BOC-p-NH-Z-lPhe ja 145 mg H0NB:a sekä soveltamalla DCC-prosessia. Seoksen annetaan reagoida huoneenlämmössä 12 tuntia, minkä jälkeen liuotin poistetaan tislaamalla. Jäännökseen lisätään etyyliasetaattia ja muodostunut kiinteä aine otetaan talteen suodattamalla. Saanto: 513 mg. Sulamispiste: 115. ..120 °c (hajoaa); ((X = -29.7° (c=0.b, dimetyyliformamidi); Rf4_ 0.37 J3 60553

Yhdisteen · 2H20 alkuaineanalyysi

Laskettu C, 58.29; H, b.65; K, 15.22#

Todettu C, 5Ö.1Ö;H6.69; n, 14.81# (f) Tuotteen (Pyr)Glu-p-NH2-Phe-Trp-Ser-Tyr-(D)-Ala-Leu-Arg(N02)-rro-NH-CH2*-CH^ valmistus

Merkaptoetanolin läsnollessa käsitellään 47 mg tuotetta B0C-p-NH2~ Z-Phe-Trp-Ser-Tyr-(D)-Ala-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH:j huoneenlämmössä 30 minuuttia, minkä jälkeen lisätään eetteriä. Muodostunut sakka otetaan talteen suodattamalla ja kuivataan natriumhydroksidin avulla kuivauskaapissa. Tuote liuotetaan 6 ml:aan diraetyyliformami-dia, ja liuos neutraloidaan 0.045 ml:11a N-etyylimorfoliinia. Lisätään 185 mg tuotetta IB0Ci:(Pyr)-Glu-0Su, minkä jälkeen liuoksen annetaan reagoida huoneenlämmössä 48 tuntia. Liuotin poistetaan tislaamalla ja jäännös hierretään etyyliasetaatin avulla. Muodostunut jauhe otetaan talteen suodattamalla. Tällä tavalla saadaan 425 mg tuotetta: IBOC-(Pyr)Glu-p-NH-Phe-Trp-Ser-Tyr-(D)-Ala-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2-CH^; Rf^=0.28. 375 mg suuruinen osa tätä tuotet ta saatetaan reagoimaan vedettömän fluorivedyn kanssa (5 ml), jolloin läsnä on merkaptometanolia ja anisolia, 0 °C:ssa tunnin ajan. Fluori-vety poistetaan tislaamalla, minkä jälkeen jäännös liuotetaan veteen ja uutetaan eetterillä. Vesiliuos kaadetaan tuotetta Amberlite IRA-410 (asetaattimuoto) sisältävään pylvääseen, jonka halkaisija on 0.9 cm ja pituus on 15 cm, ja pylväästä valuva neste ja pesuvedet kootaan ja lyofiloidaan. Tuote liuotetaan 0.005M ammoiniumasetaatti-puskuria ja kaadetaan karboksimetyyliselluloosaa sisältävään pylvääseen, jonka halkaisija on 1.8 cm ja pituus on 19 cm. Bluointi suoritetaan soveltamalla suoraviivaista gradienttimenetelmää ja käyttämällä 300 ml 0.005M ammoiniumasetaattipuskuria ja 300 ml 0.2 M ammoniumasetaattipuskuria. Fraktiot 90 ml...140 ml kootaan ja lyofiloidaan. Saanto· 170 mg. (0()^= -41.8° (c=0.56, 5# etikkahappo);

Rf 0J6

Yhdisteen CggHygOj^N·^.3CH^C00H.4H20 alkuaineanalyysi Laskettu C, 53.77; H, 6.91; N, 14.70#

Todettu C, 54,09; H, 6,58; N, 14,84#

Aminohappoanalyysi (hydrolyysi 5.7N kloorivetyhapon avulla, jossa on 4# tioglykolihappoa 110 °C:ssa 24 tuntia):

Arg, 0.97; Trp, 0.84; p-NH2-Phe, 0.97; Ser, l.oOjGlu, 1.00; 34 60553

Pro, 0.99; Ala, 1.02; Leu, 1,02; Tyr, 1,00; etyyliamiini 1.00 Esimerkki 10

Tuotteen (Pyr)Glu-Trp-Trp-Ser-Tyr-(D)-Ala-Leu-Arg-Pro-NH-CHgCH^ valmistus (a) Tuotteen Z-(Pyr)Glu-Trp-QBzl valmistus

Liuokseen, jossa on 1.7 g tuotetta Z-(Pyr)Glu-0NB ja 2.1 g tuotetta H-trp-OBzl-p-tolueenisulfonaatti 50 ral:ssa asetonitriiliä, lisätään 0.61 ml trietyyliamiinia, ja seosta sekoitetaan 12 tuntia huoneenlämmössä. Seaktioseos haihdutetaan kuiviin alennetussa paineessa. Jäännös liuotetaan 100 ml:aan etyyliasetaattia, pestään IN kloori-vetyhapolla ja natriumbikarbonaatin 5-prosenttisella vesiliuoksella, kuivataan vedettömän natriumsulfaatin avulla ja haihdutetaan kuiviin. Jäännös kiteytetään petrolieetteristä ja kiteytetään uudelleen etyyliasetaatin ja petrolieetterin seoksesta. Saanto 1.7 g; sulamispiste 129...130 °C; (Oi )^= +3.1° (c=l,0, dimetyyliformamidi);

Rf4=0.42

Yhdisteen alkuaineanalyysi

Laskettu G, 69.00; H, 5.42; N, 7.79$

Todettu C, 6o,ö5; H, 5.48; N, 7.53$ (b) Tuotteen B0C-Trp-Ser-Tyr~(D)-Ala-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH^CH^ valmistus 670 mg tuotetta BOC-Ser-Tyr-(D)-Ala-Leu-Arg(N02)-Pro-NH-CH2CH^ käsitellään 10 ml:lla trifluorietikkahappoa huoneenlämmössä 20 minuuttia, ja saatuun liuokseen lisätään 50 ml kuivaa eetteriä, jolloin saauaan hienoa kiinteätä ainetta, joka kuivataan natriumhydroksidihelmien avulla alipaineessa. Saatu jauhe liuotetaan 5 ml:aan dimetyyli-formamidia, ja tähän liuokseen lisätään 0.11 ml trietyyliamiinia sekä tuotetta BOC-Trp-ONB, joka valmistetaan DCC-menetelmän avulla käyttämällä 343 mg tuotetta BOC-Trp-OH ja 150 mg HONB:a. Seosta sekoitetaan 12 tuntia huoneenlämmössä, ja muodostunut tuote saoste-taan lisäämällä 50 ml etyyliasetaattia. Sakka otetaan taiteen suodattamalla ja pestään vedellä, sekä puhdistetaan kiteyttämällä uudelleen dietyyliformamidin ja etyyliasetaatin seoksesta. Saanto: 72o mg; 1K 60553 35 sulamispiste 190...193 °C; (W = -42.4° (c= 0.5, dimetyyliforma-rnidi); Rf4=0.27,

Yhdisteen γβΟρ^Ν^jH20 alkuaineanalyysi

Laskettu G, 55.49; H, 6.98; N, 16.32$

Todettu C, 55.14; H, 7.16; N, 16.76$ (c) Tuotteen (Pyr)Glu-Trp-Trp-Ser-Tyr-(D)-Ala-Leu-Arg-Pro-NH-CI^CH^ valmistus 215 mg edellä valmistettua tuotetta Z-(Pyr)Glu-Trp-OBzl liuotetaan 50 ml:aan metanolia, minkä jälkeen hydrogenoidaan 3 tuntia käyttämällä katalyyttina palladiummustaa. Liuos suodatetaan katalyytin poistamiseksi ja haihdutetaan kuiviin. Jäännös pestään eetterillä ja kootaan suodattamalla, jolloin saadaan vastaava vapaa happo.

426 mg tuotetta BOC-Trp-Ser-Tyr-^-Ala-Leu-ArgiNOgi-fro-NH-CH^CHj käsitellään 5 ml:lla trifluorietikkahappoa, jossa on 0.1 ml 2-mer-kaptoetanolia ja 0.4 ml N kloorivetyhappoa, 30 minuuttia huoneenlämmössä, ja tähän liuokseen lisätään kuivaa eetteriä, jolloin saadaan hieno valkoinen jauhe, joka otetaan talteen suodattamalla ja kuivataan natriumhydroksidihelmien avulla alipaineessa vastaavan vapaan emäksen saamiseksi.

Saatu jauhe liuotetaan 2 ml:aan dimetyyliformamidia, jossa on O.06 ml N-etyylimorfoliinia, ja tähän liuokseen lisätään edellä selitetty vapaa happo ja 102 mg H0NB:a. Seos jäähdytetään 0 °C:een, ja lisätään siihen 110 mg DCC:a. Liuosta sekoitetaan 2 tuntia 0 °C:ssa ja vielä 10 tuntia huoneenlämmössä. Reaktioseos suodatetaan muodostuneen disykloheksyylikarbamidin poistamiseksi, ja suodos laimennetaan etyyliasetaatilla siten, että muodostuu hieno kiinteä aine, joka kootaan suodattamalla ja saadaan täten raaka tuote.

Saatu raaka suojattu nonapeptidiamidi puhdistetaan piihappogeexiä sisältävän pylvään avulla käyttämällä liuotinjärjestelmänä etyyliasetaatin, pyridiinin, etikkahapon ja veden seosta 60:20:6:10.

Puhdasta tuotetaa sisältävät fraktiot (tarkastetaan ohutkerroakromato-grafoimalla) yhdistetään ja haihdutetaan kiinteää aineen saamiseksi. Tätä kiinteätä ainetta (250 mg) käsitellään 5 ml:11a fluorivetyä, jossa on 0.1 ml anisolia ja 0.1 ml 2-merkaptoetanolia, bO minuuttia ,, ¢0553

Jo 0 °C:s8a, minkä jälkeen fluorivety poistetaan alipaineessa. Jäännös liuotetaan 20 ml:aan vettä ja kaadetaan tuotetta Aniberlite CG-410 (asetaattimuoto) sisältävän pylvään läpi, jonka halkaisija on 1 cm ja pituus on 10 cm. Pylväs pestään perusteellisesti vedellä. Eluaat- ti ja pesunesteet yhdistetään ja kromatografoidaan karboksimetyyli- selluloosaa sisältävässä pylväässä, jonka halkaisija on 1,2 cm ja pituus 30 cm, käyttämällä gradienttieluointia (ammoniumasetaatti- puskuria, pH = 6,8, v,005 M/0,15 M = 300 ml/3000 ml). Puhdas peptidi eluoituu fraktioihin 160...260 ml, jotka yhdistetään ja lyofiloidaan vakiopainoon. Saanto 100 mg; (oi )^= - 47.2° (c=0.25, 5$ etikkahappo) 1 2

Rf = 0.31, Rf = 0.76. Aminohappoanalyysi: His, 0.96; Arg, l,ul;

Trp, 1,89; Glu, 0.92; Ser, 0.96; Pro, 1.11; Ala, 1.00; Leu, 1.02; Tyr, 1.05 (saanto 85$).

t