ES2961381T3 - Anticuerpos anti-GD2 - Google Patents

Abstract

En esta solicitud se describen anticuerpos Anti-GD2 quiméricos, humanizados, madurados por afinidad, con estabilidad mejorada y biespecíficos y fragmentos de los mismos. También se proporcionan métodos para usar anticuerpos individuales o composiciones de los mismos para la detección, prevención y/o tratamiento terapéutico de enfermedades relacionadas con GD2, en particular, neuroblastoma. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti-GD2

Introducción

La terapia con anticuerpos monoclonales (MoAb) es una modalidad de tratamiento aceptada para el cáncer; cinco MoAb han recibido la aprobación de la FDA para tumores sólidos en adultos, que incluyen el cáncer colorrectal y de mama, el cáncer de pulmón de células no pequeñas, el carcinoma de células escamosas y el melanoma (Boyiadzis y otros, 2008, Expert Opin Biol Ther 8, 1151-8; Yan y otros, 2008, Cancer J 14, 178-83). Sin embargo, esta modalidad sigue siendo insuficientemente explotada para el tratamiento de cánceres pediátricos. A diferencia de la quimioterapia o la radiación, la terapia con MoAb no es mielosupresora ni genotóxica, generalmente con pocas toxicidades a largo plazo. Estas son consideraciones críticas para los niños pequeños. Más importante aún, los MoAb son efectivos contra el cáncer metastásico en la sangre, la médula ósea y los huesos, que típicamente se encuentra en el neuroblastoma (NB) de alto riesgo. Como una clase de agentes, se han estudiado ampliamente la farmacocinética y la toxicidad de los anticuerpos IgG1 humanos o humanizados. Además, los anticuerpos pueden transportar cargas citotóxicas, ya sean de base inmunitaria, radioisótopos, toxinas o enzimas, lo que aumenta de esta manera las opciones de terapia dirigida.

El neuroblastoma (NB) es el tumor sólido extracraneal más frecuente en la infancia. En ~50 % de los casos, las estrategias curativas deben abordar tanto la masa de tejido blando como las metástasis en la médula ósea (BM). La quimioterapia de dosis intensiva mejora la resecabilidad del tumor y la irradiación posquirúrgica reduce el riesgo de recaída en el sitio primario a <10 % (Kushner y otros, 2001, J Clin Oncol 19, 2821-8). Sin embargo, la enfermedad de la BM, como lo demuestra la histología o la gammagrafía con metayodobencilguanidina (MIBG), a menudo persiste y presagia un resultado letal (Matthay y otros, 2003, J Clin Oncol 21, 2486-91; Schmidt y otros, 2008, Eur J Cancer 44, 1552-8). Además, la recaída osteomedular es común, a pesar de lograr una remisión casi completa después de la terapia de inducción. Los intentos de intensificar el tratamiento han tenido efectos secundarios tanto agudos como a largo plazo, ambos de grave preocupación para los pacientes jóvenes. Hay escasez de nuevos agentes prometedores y, hasta la fecha, pocas moléculas pequeñas específicas de diana/vía han demostrado un beneficio clínico importante en pacientes con NB, aunque se sigue en la acumulación de muchos ejemplos prometedores. Con una tasa de curación de <30 % en los límites de toxicidad entre los pacientes en etapa 4 diagnosticados a >18 meses de edad, hay un margen sustancial de mejora (Pearson y otros, 2008, Lancet Oncol 9, 247-56).

Varios factores hacen que el NB sea muy adecuado para la inmunoterapia dirigida con MoAb. En primer lugar, los MoAb median la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) altamente eficiente del N<b>en presencia de glóbulos blancos humanos. En segundo lugar, los MoAb inducen citotoxicidad mediada por el complemento (CMC) de las células de NB, que carecen del factor acelerador de la descomposición CD55 (Cheung y otros, 1988, J Clin Invest 81, 1122-8) y factor de restricción homólogo CD59 (Chen y otros, 2000, Cancer Res 60, 3013-8). La deposición del complemento en las células de NB mejora la ADCC mediante la activación del receptor iC3b en los neutrófilos (Kushner y Cheung, 1992, Blood 79, 1484-90, Metelitsa y otros, 2002, Blood 99, 4166-73), disponible incluso después de la quimioterapia mieloablativa o de dosis intensiva más el trasplante de células madre, si se administran factores estimulantes de colonias (Mackall, CL, 2000, Stem Cells 18, 10-8). En tercer lugar, el uso de la quimioterapia intensiva (estándar de atención para el NB) para lograr la remisión clínica provoca linfopenia e inmunosupresión prolongadas (Mackall y otros, 2000, Blood 96, 754-762), de manera que los pacientes tienen menos probabilidades de rechazar los MoAb murinos, quiméricos o humanizados (Kushner y otros, 2007, Pediatr Blood Cancer 48, 430-4).

GD2 es un disialogangliósido abundante en tumores de origen neuroectodérmico, que incluyen el neuroblastoma y el melanoma, con expresión muy restringida en tejidos normales. Se han probado clínicamente al menos dos familias de anticuerpos, es decir, 3F8 (Cheung y otros, 1985, Cancer Res 45, 2642-9) y 14.18 (Mujoo y otros, 1989, Cancer Res 49, 2857-61). El ch14.18 quimérico consiste en la región variable del MoAb 14.18 murino y las regiones constantes de la IgG1-K humana (Gillies y otros, 1989, J Immunol Methods 125, 191-202). Este demuestra ADCC y CMC de células de NB y melanoma in vivo (Barker y otros, 1991, Cancer Res 51, 144-9; Barker y Reisfeld, 1993, Cancer Res. 52, 362-7; Mueller y otros, 1990, PNAS USA 87, 5702-05 0. En base a las respuestas clínicas alentadoras en estudios de fase I, ch14.18 se probó en grandes estudios de fase II como terapia de consolidación para el NB en etapa 4 (estudios alemanes NB90 y NB97). Para los 166 pacientes de >12 meses en el momento del diagnóstico, aunque la supervivencia libre de eventos (EFS) fue similar en los pacientes que recibieron ch14.18 en comparación con los pacientes que recibieron quimioterapia de mantenimiento, la supervivencia general (OS) mejoró y se redujo la tasa de recaída de BM en pacientes tratados con ch14.18 (Simon y otros, 2004, J Clin Oncol 22, 3549 57). En 2001, el Grupo de Oncología Infantil (COG) inició un ensayo aleatorizado de fase III para estudiar la eficacia de la combinación de ch14.18 con GMCSF e IL-2 para prevenir la recaída de NB en pacientes en remisión completa (CR) después del trasplante autólogo de células madres (ASCT) (ClinicalTrials.gov NCT00026312) (Gilman y otros, J Clin Oncol 27:85-91, 2009), donde se encontró una mejora significativa en la supervivencia libre de progresión (PFS) y la OS a los 2 años (Yu y otros, N Engl J Med 363:1324-1334, 2010). 3F8, un MoAb IgG3 murino específico para GD2, induce la muerte celular y media ADCC y CMC eficientes contra el NB in vitro (Cheung y otros, 2007, arriba).

Entre los pacientes con enfermedad de la médula quimiorresistente, a pesar de la inducción con dosis intensivas más un régimen de rescate agresivo, el 80 % logró la remisión de la BM generalmente después de 1 a 2 ciclos de 5 días de terapia con anticuerpos más GM-CSF (Kushner y otros, 2007, Proc Amer Soc Clin Oncol 25, 526s). Dada la actividad de m3F8 contra la enfermedad de la médula quimiorresistente, el uso de m3F8 se amplió a pacientes en su primera remisión con resultados alentadores. Estos resultados clínicos favorables en niños podrían mejorarse si se administra m3F8 como terapia de mantenimiento durante los primeros 3-5 años de mayor riesgo de recurrencia. Sin embargo, la respuesta de anticuerpos humanos anti-ratón (HAMA) es un factor limitante cuando el sistema inmunológico se recupera una vez finalizada la quimioterapia. Una estrategia para reducir HAMA es quimerizar o humanizar 3F8. En la solicitud núm. WO 92/18629 A1 se describen anticuerpos que comprenden las CDR del anticuerpo murino m3F8 y las regiones constantes humanas. Los anticuerpos quiméricos obtenidos de esta manera retienen la especificidad de 3F8 por el gangliósido GD2. También inducen la destrucción mediada por ADCC y CDC de las células tumorales. También se describen composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos quiméricos derivados de 3F8 en el documento núm. Wo 92/18629 A1. Lo mismo se aplica al uso de estos anticuerpos para el tratamiento del cáncer. El documento núm. WO 92/18629 A1 no describe un anticuerpo humanizado y/o el uso médico de dicho anticuerpo.

Por lo tanto, existe la necesidad de un anticuerpo 3F8 quimérico y/o humanizado capaz de unirse a GD2 con alta afinidad, superior a m3F8, y capaz de mediar en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos, que permita de esta manera una terapia con anticuerpos a largo plazo para reducir la recurrencia de la enfermedad.

En la presente descripción se describen el diseño y el aislamiento de 3F8 quimérico (ch3F8-IgG1) y 3F8 humanizado (hu3F8-IgG1 y hu3F8-IgG4). Estos anticuerpos se hicieron mediante el uso de métodos recombinantes estándares y se seleccionaron para una alta expresión mediante líneas de células CHO-DG44 en medio sin suero. Se produjo una glicoforma especial de hu3F8-IgG1n (también llamada hu3F8-IgG1-MAGE1.5) mediante el uso de la línea de células CHO-Mage1.5. Esta glicoforma especial no tiene fucosa y solo manosa terminal y N-acetilglucosa o glucosa. Al medir mediante el uso de la resonancia de plasmones superficiales usada por los sistemas Biacore, el 3F8 quimérico y el 3F8 humanizado mantuvieron una K<d>similar a la de m3F8. Por el contrario de otros anticuerpos anti-GD2, m3F8, ch3F8-IgG1, ch3F8-IgG4, hu3F8-IgG1, hu3F8-IgG4 y hu3F8-IgG1n tuvieron una kdis sustancialmente más lenta, lo que se tradujo en una eliminación por lavado más lenta in vitro. Al igual que m3F8, tanto 3F8 quimérico como humanizado inhibieron el crecimiento celular in vitro, algo que no es típico de otros anticuerpos anti-GD2. Mediciones similares indicaron que los anticuerpos IgG1 quiméricos y humanizados tienen K<d>más favorables en comparación con 14.G2a. Tanto la ADCC de células mononucleares de sangre (PBMC) como la ADCC de neutrófilos (PMN) de ch3F8-IgG1, hu3F8-IgG1 y hu3F8-IgG1n fueron superiores (de 10 a >1000 veces) a las de m3F8, mientras que la CMC fue inferior. Esta superioridad se observó consistentemente en los ensayos de ADCC, independientemente de los donantes o si NK92 transfectadas con CD16 o CD32 humanos se usaron como citotóxicas. Para la ADCC mediada por CD16, hu3F8-IgG1n estuvo entre 10-40 veces mejor en comparación con hu3F8-IgG1. La actividad de PBMC-ADCC y CMC se redujo considerablemente con hu3F8-IgG4 en comparación con m3F8. La reactividad cruzada con otros gangliósidos fue similar a la de m3F8. Mediante el uso de anticuerpos marcados con 131I en biodistribución, las formas hu3F8 tenían relaciones entre tumor y tejido normal comparables a las de m3F8. Hu3F8-IgG1 mostró un efecto antitumoral superior contra xenoinjertos de NB en comparación con m3F8.

También se describen en la presente descripción nuevos anticuerpos hu3F8, hu3F8H3L3, que se han diseñado para tener perfiles de estabilidad mejorados mediante el uso de una estructura cristalina derivada experimentalmente de m3F8 en combinación con un análisis computacional mediante el uso de métodos de fuerza.

Resumen de la invención

Las estrategias de humanización comparten la premisa de que la sustitución de residuos de aminoácidos que son característicos de secuencias murinas con residuos que se encuentran en las posiciones correspondientes de los anticuerpos humanos reducirá la inmunogenicidad en seres humanos del anticuerpo resultante en seres humanos. Sin embargo, la sustitución de secuencias entre especies suele dar como resultado una reducción de la unión del anticuerpo a su antígeno y una pérdida de afinidad. Por lo tanto, la técnica de la humanización radica en equilibrar la sustitución de la secuencia murina original para reducir la inmunogenicidad con la necesidad de que la molécula humanizada conserve la unión suficiente al antígeno para ser terapéuticamente útil.

La presente invención proporciona anticuerpos 3F8 quiméricos y humanizados modificados y aislados, que tienen al menos una secuencia CDR derivada de m3F8, así como también composiciones de anticuerpos, glicoformas del anticuerpo, anticuerpos con estabilidad mejorada, anticuerpos con unión mejorada a receptores de Fc, anticuerpos con afinidad mejorada por GD2, anticuerpos biespecíficos modificados para expresar un segundo sitio de unión distinto o un acoplador de linfocitos T biespecífico, o el uso de los fragmentos Fv de cualquiera de los anticuerpos de la presente invención en la construcción de IgG modular para anticuerpos acopladores biespecíficos de linfocitos T (BiTE), anticuerpos triespecíficos o multiespecíficos. Estos anticuerpos y ácidos nucleicos codificantes o complementarios, vectores, células huésped, composiciones, formulaciones, dispositivos, animales transgénicos, plantas transgénicas relacionadas con los mismos, y métodos para elaborar y usar los mismos, como se describe y habilita en la presente descripción, en combinación con lo que se conoce en la técnica, son parte de la presente invención. El anticuerpo hu3F8-IgG1 de la invención tiene significativamente más actividades PMN-ADCC y PBMC-ADCC que m3F8 o cualquier otro anticuerpo anti-GD2 conocido (que incluyen 14G.2a, ch14.18 o ME361), con citotoxicidad mediada por el complemento (CMC) intacta, aunque menor que m3F8. Esta superioridad se observó consistentemente en los ensayos de ADCC independientemente de los donantes o si NK92 transfectadas con CD16 o CD32 humanos se usaron como citotóxicas. Esto fue importante ya que la ADCC es el mecanismo probado para los efectos antitumorales de MoAb en pacientes en general. Tanto hu3F8-IgG1 como hu3F8-IgG1n, una glicoforma de hu3F8-IgG1, mostraron un efecto antitumoral superior contra los xenoinjertos de neuroblastoma (NB) en comparación con m3F8. La forma IgG4 del anticuerpo mostró una función efectora reducida y es efectiva para bloquear los efectos secundarios del dolor de la terapia con anticuerpos anti-GD2. Hu3F8-IgG1-DEL con una triple mutación en la cadena pesada (o S239D/I332E/A330L) mostró una mayor afinidad por el receptor de Fc (FcR). El análisis de la interacción 3F8:GD2 dio como resultado el diseño de un anticuerpo 3F8 con mutación en la cadena pesada que produce las cadenas pesadas huH1I-gamma-1 y huH3I-gamma-1 calculadas termodinámicamente para conferir una mayor afinidad por GD2.

La presente invención proporciona al menos un anticuerpo quimérico modificado aislado, ch3F8, o humanizado, hu3F8, como se describe en la presente descripción. El anticuerpo de acuerdo con la presente invención incluye cualquier proteína o molécula peptídica que comprende al menos una región determinante de complementariedad (CDR) de una cadena pesada o ligera o una porción de unión al ligando de la misma, derivada de m3F8, en combinación con una región constante de la cadena pesada o la cadena ligera, una región de marco estructural, o cualquier porción de la misma, que puede incorporarse en un anticuerpo de la presente invención. En una modalidad, la invención se dirige a un anticuerpo hu3F8 que comprende una cadena ligera y una cadena pesada descritas en la presente descripción, cada una de las cadenas que comprende al menos parte de una región constante humana y al menos parte de una región variable derivada de m3F8 que tiene especificidad por GD2, dicho anticuerpo se une con alta afinidad a GD2 y media un efecto deseado, por ejemplo, inhibir el crecimiento celular in vitro, bloquear los efectos secundarios del dolor debido a la terapia con anticuerpos anti-GD2, por nombrar algunos. La invención también incluye fragmentos o un derivado de dicho anticuerpo, tal como una o más porciones de la cadena del anticuerpo, tales como las regiones constantes, de unión, de diversidad o variables de la cadena pesada, o las regiones constantes, de unión o variables de la cadena ligera. Los anticuerpos pueden ser de cualquier clase, tales como IgG, IgM o IgA, o cualquier subclase, tales como IgG1, IgG2a, IgG4 y otras subclases conocidas en la técnica. Los anticuerpos útiles en la presente invención también incluyen fragmentos de anticuerpos de unión al antígeno de los anticuerpos de la presente invención que incluyen, pero no se limitan a, Fab, Fab' y F(ab')2, Fd, Fv de cadena sencilla (scFv), anticuerpos de cadena sencilla, Fv unidos por disulfuro o estabilizados por disulfuro (sdFv o dsFv). La invención también incluye anticuerpos de dominio único que comprenden un dominio VL o VH. Además, los anticuerpos pueden producirse mediante cualquier método, tal como presentación en fagos, o producirse en cualquier organismo, huevo o línea de células, que incluyen bacterias, insectos, levaduras (hongos), mamíferos u otro tipo de célula o línea de células que produzcan anticuerpos con características deseadas, tales como anticuerpos humanizados. Los anticuerpos también pueden formarse al combinar una porción Fab y una región Fc de diferentes especies, o mantener las regiones determinantes de complementariedad y modificar las regiones de marco estructural a las de otra especie.

El anticuerpo puede comprender al menos una porción especificada de al menos una región determinante de complementariedad (CDR) (por ejemplo, CDR1, CDR2 o CDR3 de la región variable de la cadena pesada o ligera) derivada de un m3F8 o hu3F8 (como se definen dichos términos en la presente descripción), y/o al menos una región de marco estructural constante o variable o cualquier porción de la misma. La secuencia de aminoácidos del anticuerpo puede comprender además opcionalmente al menos una sustitución, inserción o eliminación especificada como se describe en la presente descripción o como se conoce en la técnica.

Los anticuerpos preferidos de la presente invención incluyen ch3F8-IgG1, ch3F8-IgG4, hu3F8-H1L1-IgG1, hu3F8-H2L2-IgG1, hu3F8-H1L2-IgG1, hu3F8-H2L1-IgG1, hu3F8-IgG4, hu3F8IgG1n, Hu3F8-IgG1-DEL, hu3F8H1L1S (interfaz de la cadena ligera de hu3F8-IgG1 mejorada), hu3F8H3L3 (estabilidad de la cadena ligera y pesada de hu3F8-IgG1 mejorada), hu3F8H3L3S (interfaz y estabilidad mejoradas), hu3F8H1-I-gamma-1 (afinidad de hu3F8-IgG1 mejorada), hu3F8H3-I-gamma-1 (estabilidad y afinidad de hu3F8-IgG1 mejoradas), así como también fragmentos y regiones de los mismos.

En una modalidad, la presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales quiméricos que tienen especificidad de unión por GD2, en donde el anticuerpo ch3F8-IgG1 comprende un dominio de la cadena pesada de SEQ ID NO:1 y un dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO:2. En otra modalidad, el anticuerpo ch3F8-IgG4 comprende el dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO:3 y un dominio de la cadena ligera de SEQ ID NO:2. Dichos anticuerpos quiméricos se derivan del anticuerpo 3F8 murino; en determinadas modalidades, los anticuerpos quiméricos comprenden una cadena pesada cuyas regiones determinantes de complementariedad (CDR) 1, 2 y 3 están definidas por los residuos de aminoácidos 31-35, 50-64 y 98-108, respectivamente, de SEQ ID NO:1. En determinadas modalidades, los anticuerpos quiméricos comprenden una cadena ligera cuyas CDR 1, 2 y 3 están definidas por los residuos de aminoácidos 24-34, 50-56 y 89-95, respectivamente, de SEQ ID NO:2. En determinadas modalidades, los anticuerpos quiméricos comprenden una cadena pesada cuyas regiones de marco estructural (FR) 1, 2, 3 y 4 están definidas por los residuos de aminoácidos 1-30, 36-49, 65-97 y 109-120, respectivamente, de la SEQ NO:1. En determinadas modalidades, los anticuerpos quiméricos comprenden una cadena ligera cuyas regiones de marco estructural (FR) 1, 2, 3 y 4 están definidas por los residuos de aminoácidos 1-23, 35-49, 57-88 y 96-108, respectivamente, de<s>E<q>ID NO:2.

En una modalidad, la presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales humanizados que tienen especificidad de unión por GD2, en donde el anticuerpo hu3F8-H1L1-IgG1 comprende un dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO:4 y un dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO:5, en donde hu3F8H2L2-IgG1 comprende el dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO:6 y el dominio variable de la cadena ligera de SEQ iD NO:7, en donde hu3F8-H1L1-IgG4 comprende el dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO:8 y el dominio variable de la cadena ligera de las SEQ ID NO:5 o 7. Dichos anticuerpos humanizados se derivan de la humanización del anticuerpo murino 3F8. En determinadas modalidades, los anticuerpos humanizados comprenden una cadena pesada cuyas regiones determinantes de complementariedad (CDR) 1, 2 y 3 están definidas por los residuos de aminoácidos 31-35, 50-64 y 98-108, respectivamente, de las SEQ ID NO:4, 6 u 8. En determinadas modalidades, los anticuerpos humanizados comprenden una cadena ligera cuyas CDR 1, 2 y 3 están definidas por los residuos de aminoácidos 24-34, 50-56 y 89-95, respectivamente, de las SEQ ID NO: 5 o 7.

La presente invención también se refiere a anticuerpos humanizados anti-GD2 modificados con una composición de carbohidratos modificada, hu3F8-IgG1n, con función efectora aumentada.

La presente invención también se refiere al anticuerpo Hu3F8-IgG1-DEL con una triple mutación DEL (S239D/A330L/I332E) en la cadena pesada de hu3F8-IgG1 o hu3F8-IgG1n. Hu3F8-IgG1-DEL comprende sustituciones en la cadena pesada que consisten en S239D, A330L e I332E de las SEQ ID NO: 4, 6 u 8.

La presente invención también se refiere a hu3F8H3L3 derivado del análisis computacional de la estructura cristalina y el ajuste de la secuencia de aminoácidos mediante retromutación y mutación directa para mejorar la estabilidad del anticuerpo. La secuencia de la cadena pesada de huH3 con estabilidad mejorada se describe en la SEQ ID NO:9, con la cadena ligera de huL3 en la SEQ ID NO:10. Estas mutaciones también pueden introducirse en una secuencia de la cadena pesada solas o en combinación con otras mutaciones de la cadena pesada descritas en la presente descripción.

Se añadió una mutación adicional para mejorar la estabilidad en la interfaz VH-VL en la posición 43 de la cadena ligera, lo que dio como resultado huL3S. Por lo tanto, huL3S comprende una sustitución que consiste en Ala43Ser de SEQ ID NO:10. Cuando este cambio a serina en la posición 43 se incorpora en la cadena ligera de hu3F8-IgG1, esa cadena ligera se denomina huLlS. De manera similar, huLlS comprende una sustitución que consiste en Ala43Ser de las SEQ ID NO: 5 o 7.

El modelado computacional mostró además que la sustitución de Gly en la posición 54 por Ile en la CDR3 de la cadena pesada cambiaría la forma del bolsillo de unión y aumentaría el contacto con el ligando GD2. La adición de esta mutación Gly54Ile a las regiones CDR de las secuencias de huH1-IgG1 y huH3-IgG1 dio como resultado huH1I-gamma1 y huH3I-gamma, respectivamente. Por lo tanto, huHI-gamma1 comprende una sustitución de Gly54Ile en las SEQ ID NO:4, 6 u 8. huH3I-gamma1 comprende una sustitución de Gly54Ile en la SEQ ID NO:9.

Los anticuerpos preferidos de la presente invención son aquellos que se unen a GD2 humano y realizan la función deseada, es decir, función efectora, bloqueo del dolor o inhibición del crecimiento celular. Los métodos preferidos para determinar la especificidad y la afinidad de los anticuerpos monoclonales mediante inhibición competitiva pueden encontrarse en Harlow y otros, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988. Al menos un anticuerpo de la invención se une al menos a un epítopo específico especificado de GD2 humano, subunidad, fragmento, porción o cualquier combinación de los mismos. El epítopo puede comprender al menos una región de unión al anticuerpo, epítopo que está compuesto preferentemente por al menos 1-5 residuos de azúcar o ceramida de al menos una porción de GD2.

En un aspecto, la presente invención proporciona al menos un anticuerpo anti-GD2 humanizado aislado, que comprende al menos una región variable de m3F8, y las secuencias de ácido nucleico que codifican la misma. En otro aspecto, la presente invención proporciona al menos un anticuerpo anti-GD2 de mamífero aislado, que comprende (i) todas las secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la cadena pesada derivadas de m3F8, y las secuencias de ácidos nucleicos que las codifican; o (ii) todas las secuencias de aminoácidos de CDR de la cadena ligera de m3F8 y las secuencias de ácidos nucleicos que las codifican.

En otro aspecto, la presente invención proporciona al menos un anticuerpo anti-GD2 de mamífero aislado, que comprende al menos una CDR de la cadena pesada o cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos derivada de m3F8, y las secuencias de ácidos nucleicos que las codifican.

En otro aspecto, la presente invención proporciona al menos un anticuerpo anti-GD2 quimérico, humanizado o injertado con CDR aislado, que comprende al menos una CDR de m3F8, en donde el anticuerpo se une específicamente al menos a un epítopo que comprende al menos 1-5 residuos de azúcar o ceramida de un epítopo de GD2 humano.

En otro aspecto más, la presente invención proporciona un inmunoconjugado de diagnóstico/detección o terapéutico que comprende un componente de anticuerpo que comprende cualquiera de los MoAb 3F8 o los fragmentos de los mismos de la presente invención, o una proteína de fusión de anticuerpos o un fragmento de la misma que comprende cualquiera de los anticuerpos 3F8 o los fragmentos de los mismos de la presente invención, en donde el componente de anticuerpo está unido a al menos un agente de diagnóstico/detección o al menos a un agente terapéutico.

Aún en otro aspecto, la presente invención proporciona un inmunoconjugado terapéutico que comprende un agente terapéutico que se selecciona del grupo que consiste en un radionúclido, átomos de boro, gadolinio o uranio, un inmunomodulador, tal como una citocina, un factor de crecimiento de células madre, una linfotoxina, tal como el factor de necrosis tumoral (TNF), un factor hematopoyético tal como una interleucina (IL), un factor estimulante de colonias (CSF) tal como el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) o el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), un interferón (IFN) tales como interferones alfa, beta o gamma, y un factor de crecimiento de células madre, un factor hematopoyético, eritropoyetina, trombopoyetina, un anticuerpo, una hormona, un antagonista hormonal, una enzima, un inhibidor de enzima, un agente terapéutico fotoactivo, un fármaco citotóxico, tales como agentes antimitóticos, alquilantes, antimetabolitos, inhibidores de la angiogénesis, apoptóticos, alcaloides, inhibidores de la COX-2 y antibióticos, una toxina citotóxica, tales como toxinas vegetales, microbianas y animales y variaciones sintéticas de las mismas, un inhibidor de la angiogénesis, un anticuerpo diferente y una combinación de los mismos.

En otro aspecto, la presente invención también proporciona un anticuerpo multivalente y multiespecífico o un fragmento del mismo que comprende uno o más sitios de unión al antígeno que tienen afinidad hacia un antígeno reconocido por el anticuerpo 3F8 y uno o más sitios de unión al hapteno que tienen afinidad hacia epítopos o haptenos además de GD2. Preferentemente, el anticuerpo 3F8 o el fragmento del mismo está quimerizado o humanizado. También se prefiere que el anticuerpo o fragmento del mismo sean completamente humano o esté quimerizado. En una modalidad, el anticuerpo multivalente y multiespecífico o el fragmento del mismo comprende un agente de diagnóstico/detección o terapéutico.

Se describe además un método para administrar un agente de diagnóstico/detección, un agente terapéutico o una combinación de los mismos a una diana, que comprende: (i) administrar a un sujeto un anticuerpo multivalente y multiespecífico o un fragmento del mismo de la presente invención; (ii) esperar una cantidad de tiempo suficiente para que una cantidad de la proteína de no unión se elimine del torrente sanguíneo del sujeto; y (iii) administrar a dicho sujeto una molécula portadora que comprende un agente de diagnóstico/detección, un agente terapéutico o una combinación de los mismos, que se une a un sitio de unión de dicho anticuerpo. El agente de diagnóstico/detección o dicho agente terapéutico se selecciona del grupo que comprende isótopos, colorantes, cromágenos, agentes de contraste, fármacos, toxinas, citocinas, enzimas, inhibidores de enzimas, hormonas, antagonistas hormonales, factores de crecimiento, radionúclidos, metales, liposomas, nanopartículas, ARN o ADN. La segunda especificidad también incluye hapteno(s) conjugado(s) con cualquiera del grupo de agentes descrito. Estos haptenos incluyen, pero no se limitan a, biotina y sus derivados, DOTA y sus derivados, DTPA y sus derivados, fluoresceína y sus derivados, histamina y sus derivados, deferoxamina y sus derivados).

En cualquiera de los métodos de la presente invención, el sujeto es preferentemente un mamífero, tal como un ser humano o una mascota doméstica.

Además se describe un método para tratar o identificar tejidos enfermos en un sujeto, que comprende: (A) administrar a dicho sujeto un anticuerpo biespecífico o un fragmento de anticuerpo que tiene al menos un brazo que se une específicamente a un marcador asociado a tejido enfermo y al menos otro brazo que se une específicamente a un conjugado dirigible, en donde dicho marcador asociado a tejido enfermo es un antígeno reconocido por el MoAb 3F8; (B) opcionalmente, administrar a dicho sujeto una composición de eliminación y permitir que dicha composición elimine de la circulación anticuerpos o fragmentos de anticuerpos no localizados; y (C) administrar a dicho sujeto un primer conjugado dirigible que comprende una porción portadora que comprende o lleva al menos un epítopo reconocible por al menos otro brazo de dicho anticuerpo biespecífico o fragmento de anticuerpo, y uno o más agentes de diagnóstico o terapéuticos conjugados. Preferentemente, al menos un brazo que se une específicamente a un tejido dirigido es un anticuerpo anti-GD2 humano, quimérico o humanizado o un fragmento de un anticuerpo anti-GD2 humano, quimérico o humanizado. Una modalidad preferida es el uso del MoAb 3F8 en aplicaciones tales como un anticuerpo quimérico, humanizado o humano, como se describe en la presente descripción.

En otro aspecto más, la presente descripción proporciona un método para detectar o tratar tumores que expresan un antígeno reconocido por un MoAb 3F8 en un mamífero, que comprende: (A) administrar una cantidad efectiva de un anticuerpo biespecífico o un fragmento de anticuerpo que comprende al menos un brazo que se une específicamente a un tejido dirigido y al menos otro brazo que se une específicamente a un conjugado dirigible, en donde dicho brazo que se une específicamente a un tejido dirigido es un anticuerpo 3F8 o un fragmento del mismo; y (B) administrar un conjugado dirigible. El conjugado dirigible puede seleccionarse del grupo que consiste en (i) DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2; (ii) Ac-Lys(HSG)D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2; (iii) DOTA -DAsp-D-Lys(HSG)-D-Asp-D-Lys(HSG)-NH2; (iv) DOTA -D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2; (v) DOTA -D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2; (vi) DOTA -D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2; (vii) DOTA -D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2; (viii) Ac-D-Phe-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Lys(DOTA)-NH2; (ix) Ac-D-Phe-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-NH2; (x) Ac-D-Phe-D-Lys(Bz-DTPA)-D-Tyr-D-Lys(Bz-DTPA)-NH2; (xi) Ac-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2; (xii) DOTA -D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2; (xiii) (Tscg-Cys)-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(DOTA)-NH2; (xiv) Tscg-D-Cys-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2; (xv) (Tscg-Cys)-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2; (xvi) Ac-D-Cys-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Ala-D-Lys(DOTA)-D-Cys-NH2; (xvii) Ac-D-Cys-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-NH2; (xviii) Ac-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2; (xix) Ac-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Lys(DOTA)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2; fluroresceína y sus derivados; desferrioxamina y sus derivados.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona un método de direccionamiento en donde el método comprende: (A) inyectar a un sujeto que se va a someter a dicho procedimiento con un anticuerpo biespecífico F(ab)2 o un fragmento F(ab')2, o un fragmento Fv de cadena sencilla, en donde el anticuerpo biespecífico o el fragmento tiene un primer sitio de unión al anticuerpo que se une específicamente a un antígeno reconocido por un MoAb 3F8 y tiene un segundo sitio de unión al anticuerpo que se une específicamente a un hapteno y permite que el fragmento de anticuerpo se acumule en los sitios diana; (B) opcionalmente eliminar fragmentos de anticuerpos no dirigidos mediante el uso de un agente de eliminación si el fragmento biespecífico no se elimina en gran medida de la circulación dentro de aproximadamente 24 horas después de la inyección, e inyectar un dextrano modificado con hapteno, o dendrímeros o polímeros, que eliminan rápidamente el anticuerpo no diana o los fragmentos en el hígado para su degradación (C) detectar la presencia del hapteno mediante imágenes nucleares o detección a corta distancia de niveles elevados de marcador acumulado en los sitios diana mediante el uso de escáneres o sondas, dentro de las horas posteriores a la primera inyección, y realizar dicho procedimiento, en donde dicha detección se realiza sin el uso de un agente de contraste o un agente de sustracción. En una modalidad preferida, el hapteno se marca con un radioisótopo de diagnóstico/detección, un agente potenciador de imágenes de MRI, un marcador fluorescente o un marcador quimioluminiscente. Los marcadores fluorescentes pueden incluir rodamina, fluoresceína, renografina, isotiocianato de fluoresceína, ficoeriterina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído y fluorescamina. Los marcadores quimioluminiscentes pueden incluir luminol, isoluminol, un éster de acridinio aromático, un imidazol, una sal de acridinio y un éster de oxalato. Los agentes potenciadores de imágenes de MRI incluyen gadolinio y sustancias ferromagnéticas. Las imágenes de la localización del anticuerpo-hapteno detectan células tumorales intactas que portan GD2, lo cual es fundamental para la estadificación del tumor, la medición de la respuesta del tumor al tratamiento, la detección de recaídas tempranas y la vigilancia del tumor. La detección intraoperatoria de la localización del anticuerpo-hapteno proporciona la ubicación precisa del tumor y descubre sitios ocultos de la enfermedad, para permitir la resección quirúrgica completa como parte de una terapia curativa para el cáncer.

También se considera en la presente invención un anticuerpo multivalente y multiespecífico o un fragmento del mismo que comprende uno o más sitios de unión al antígeno que tienen afinidad hacia un antígeno reconocido por el anticuerpo 3F8 y uno o más sitios de unión al hapteno que tienen afinidad hacia epítopos o haptenos en las células (linfocitos, células citotóxicas naturales, neutrófilos, células mieloides, células madre, células madre neurológicas, células madre mesenquimales, células leucémicas, linfocitos citotóxicos y linfocitos B). Estos anticuerpos biespecíficos o fragmentos pueden administrarse a través de diversas vías, que incluyen intravenosa, intratecal e intratumoral en mamíferos, que incluyen seres humanos, para dirigir células endógenas o células infundidas exógenamente a sitios o tejidos o células que portan el antígeno GD2. Alternativamente, las células pueden armarse ex vivo mediante el uso de estos anticuerpos biespecíficos o fragmentos antes de la administración a mamíferos, que incluyen los seres humanos.

También se considera en la presente invención el uso de secuencias de 3F8 o fragmentos de las mismas, para generar receptores de superficie quiméricos específicos para GD2 mediante el uso de métodos genéticos, para redirigir células (linfocitos, células citotóxicas naturales, neutrófilos, células mieloides, células madre, células madre neurológicas, células madre mesenquimales, células leucémicas, linfocitos citotóxicos y linfocitos B) hasta tejidos, órganos o tumores portadores de GD2, tanto para aplicaciones diagnósticas como terapéuticas.

La presente invención proporciona, en un aspecto, moléculas de ácidos nucleico aisladas que comprenden, se complementan o se hibridan con un polinucleótido que codifica los anticuerpos anti-GD2 específicos antes mencionados, que comprenden al menos una secuencia, un dominio, una porción o una variante especificados del mismo. En un aspecto más específico, la presente invención proporciona secuencias de nucleótidos que codifican anticuerpos de la presente invención en donde la cadena ligera de Hu3F8-H1L1-IgG1 (también abreviada como hu3F8-IgG1) está codificada por la SEQ ID NO:11 y la cadena pesada de Hu3F8-H1L1-IgG1 está codificada por la SEQ ID NO:12, en donde la cadena ligera de Hu3F8-H1L1-IgG4 está codificada por la SEQ ID NO:13 y la cadena pesada de Hu3F8-H1L1-IgG4 está codificada por la SEQ ID NO:14, en donde la cadena ligera L2 de Hu3F8-H1L2-IgG1 está codificada por la SEQ ID NO:15 y la cadena pesada H2 de Hu3F8-H2L2-IgG1 está codificada por la SEQ ID NO:16. Las cadenas pesada y ligera de hu3F8-H1L1-IgG1 son intercambiables con las cadenas pesada y ligera de hu3F8-H2L2-IgG1, que forman los anticuerpos anti-GD2 hu3F8-H1L2-IgG1 y hu3F8-H2L1-IgG1. En la presente descripción se proporcionan secuencias de nucleótidos adicionales en donde la cadena ligera de ch3F8-IgG1 está codificada por la SEQ ID NO:17 y la cadena pesada de ch3F8-IgG1 está codificada por la SEQ ID NO:18, en donde la cadena ligera de ch3F8-IgG4 está codificada por la SEQ ID NO:19 y la cadena pesada de ch3F8-IgG4 está codificada por la SEQ ID NO:20, y en donde la cadena ligera L3 de hu3F8H3L3-IgG1 está codificada por la SEQ ID NO:21 y la cadena pesada H3 está codificada por la SEQ ID NO:22.

La presente invención proporciona además vectores recombinantes que comprenden dichas moléculas de ácido nucleico del anticuerpo anti-GD2, células huésped que contienen dichos ácidos nucleicos y/o vectores recombinantes, así como también métodos para preparar y/o usar dichos ácidos nucleicos, vectores y/o células huésped del anticuerpo. Por tanto, la invención comprende un ácido nucleico aislado que codifica al menos un anticuerpo anti-GD2 de mamífero aislado o un fragmento del mismo; un vector de ácido nucleico aislado que comprende el ácido nucleico aislado, y/o una célula huésped procariota o eucariota que comprende el ácido nucleico aislado. La célula huésped puede ser opcionalmente al menos una que se selecciona de COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, CHO-S, DG44, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa, mieloma, o células de linfoma, o cualquier célula derivada, inmortalizada o transformada de las mismas. También se proporciona un método para producir al menos un anticuerpo anti-GD2, que comprende traducir el anticuerpo que codifica el ácido nucleico en condiciones in vitro, in vivo o in situ, de manera que el anticuerpo se exprese en cantidades detectables o recuperables, que incluyen métodos que usan vectores que permiten amplificar la expresión de proteínas mediante el uso de la selección de crecimiento y supervivencia bajo el control de vías metabólicas o enzimas que incluyen, pero no se limitan a, dhfr (dihidrofolato reductasa) o GS (glutamina sintasa).

La presente invención también proporciona al menos un método para expresar al menos un anticuerpo anti-GD2 mencionado anteriormente en una célula huésped, que comprende cultivar una célula huésped como se describe en la presente descripción en condiciones en donde al menos un anticuerpo anti-GD2 se expresa en cantidades detectables y/o recuperables.

La presente invención también proporciona al menos una composición que comprende (a) un anticuerpo anti-GD2 aislado que codifica un ácido nucleico y/o anticuerpo como se describe en la presente descripción; y (b) un portador o un diluyente adecuado. El portador o el diluyente pueden ser opcionalmente farmacéuticamente aceptable, de acuerdo con portadores o diluyentes conocidos. Opcionalmente, la composición puede comprender además al menos un compuesto, proteína o composición adicional. En algunas de estas composiciones, los anticuerpos quiméricos o humanizados se conjugan con un agente citotóxico (es decir, un agente que perjudica la viabilidad y/o las funciones de una célula) tal como un fármaco citotóxico, una toxina o un radionúclido.

La presente invención proporciona además al menos un anticuerpo anti-GD2 para su uso en un método o una composición, para administrar una cantidad terapéuticamente efectiva para modular o tratar al menos una afección relacionada con GD2 en una célula, tejido, órgano, animal o paciente y/o, antes, después o durante una afección relacionada, como se conoce en la técnica y/o como se describe en la presente descripción. Por tanto, la invención describe un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo de acuerdo con la invención para su uso en un método para tratar una afección relacionada con GD2 en una célula, tejido, órgano o animal, que comprende poner en contacto o administrar una composición que comprende una cantidad efectiva de al menos un anticuerpo anti-GD2 aislado o un fragmento del mismo de la invención con, o hacia la célula, tejido, órgano o animal. Opcionalmente, el método puede comprender además el uso de una cantidad efectiva de 0,001-50 mg/kilogramo de un anticuerpo anti-GD2 de la invención en las células, tejidos, órganos o animales. El método puede comprender además opcionalmente poner en contacto o administrar mediante al menos un modo que se selecciona de parenteral, subcutáneo, intramuscular, intravenoso, intraarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginoso, intracavitario, intracelial, intracerebeloso, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrico, intrahepático, intramiocárdico, intraóseo, intrapélvico, intrapericardíaco, intraperitoneal, intrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretiniano, intraespinal, intratecal, intra-Ommaya, intravítreo, intraocular, intrasinovial, intratorácico, intrauterino, intravesical, en bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal o transdérmico. El método puede comprender además opcionalmente administrar, antes, simultáneamente o después que el anticuerpo entre en contacto o se administre al menos una composición que comprende una cantidad efectiva de al menos un compuesto o una proteína o una célula que se selecciona de al menos uno de un marcador o un indicador detectable, un antagonista de TNF, un antirreumático, un relajante muscular, un narcótico, un fármaco antiinflamatorio no esteroide (NSAID), un analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueador neuromuscular, un antimicrobiano, un antipsoriático, un corticosteroide, un esteroide anabólico, una eritropoyetina, una inmunización, una inmunoglobulina, un anticuerpo o conjugados derivados de anticuerpos, un inmunosupresor, una hormona del crecimiento, un fármaco de sustitución hormonal, un radiofármaco, un antidepresivo, un antipsicótico, un estimulante, un medicamento para el asma, un beta agonista, un esteroide inhalado, una epinefrina o un análogo de la misma, un citotóxico u otro agente anticancerígeno, un antimetabolito tal como metotrexato, un agente antiproliferativo, una citocina, interleucina, factores de crecimiento, un antagonista de citocina y un anti-TNFa, glóbulos blancos, linfocitos T, células LAK, linfocitos TIL, células citotóxicas naturales (NK), monocitos, células NKT, linfocitos T modificados o células NK o monocitos o granulocitos.

Además, se describe al menos un método de anticuerpo anti-GD2 para diagnosticar al menos una afección relacionada con GD2 en una célula, tejido, órgano, animal o paciente y/o, antes, después o durante una afección relacionada, como se conoce en la técnica y/o como se describe en la presente descripción.

La presente invención también proporciona al menos una composición, dispositivo y/o método de administración para diagnosticar al menos una afección por anticuerpos anti-GD2, de acuerdo con la presente invención.

También se proporciona una composición que comprende al menos un anticuerpo anti-GD2 humanizado aislado y al menos un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. La composición puede comprender opcionalmente además una cantidad efectiva de al menos un compuesto o una proteína que se seleccionan de al menos uno de un marcador o un indicador detectable, un agente citotóxico u otro agente anticancerígeno, un antimetabolito tal como metotrexato, un agente antiproliferativo, una citocina o un antagonista de citocina, un antagonista del TNF, un antirreumático, un relajante muscular, un narcótico, un fármaco antiinflamatorio no esteroide (NTHE), un analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueador neuromuscular, un antimicrobiano, un antipsoriático, un corticosteroide, un esteroide anabólico, una eritropoyetina, una inmunización, una inmunoglobulina, un inmunosupresor, una hormona del crecimiento, un fármaco de sustitución hormonal, un radiofármaco; un antidepresivo, un antipsicótico, un estimulante, un medicamento para el asma, un agonista beta, un esteroide inhalado, una epinefrina o un análogo.

También se proporciona un dispositivo médico, que comprende al menos un anticuerpo anti-GD2 de mamífero aislado de la invención, en donde el dispositivo es adecuado para poner en contacto o administrar al menos un anticuerpo anti-GD2 mediante al menos un modo que se selecciona de parenteral, subcutáneo, intramuscular, intravenoso, intraarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginoso, intracavitario, intracelial, intracerebeloso, intracerebroventricular, intratecal, intra-Ommaya, intravítreo, intraocular, intracólico, intracervical, intragástrico, intrahepático, intramiocárdico, intraóstico, intrapélvico, intrapericardíaco, intraperitoneal, intrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretiniano, intraespinal, intrasinovial, intratorácico, intrauterino, intravesical, en bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal o transdérmico.

En un aspecto adicional, la descripción proporciona un kit que comprende al menos un anticuerpo anti-GD2 quimérico o humanizado o un fragmento de la descripción en forma liofilizada en un primer recipiente, y un segundo recipiente opcional que comprende agua estéril, agua amortiguada estéril o al menos un conservante que se selecciona del grupo que consiste en fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, alcohol bencílico, nitrito fenilmercúrico, fenoxietanol, formaldehído, clorobutanol, cloruro de magnesio, alquilparabeno, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, deshidroacetato de sodio y timerosal, manitol, sacarosa, manosa, otros azúcares, tween 80 o las mezclas de los mismos en un diluyente acuoso. En un aspecto, en el kit, la concentración de anticuerpo anti-GD2 o porción o variante especificada en el primer recipiente se reconstituye a una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 500 mg/ml con el contenido del segundo recipiente. En otro aspecto, el segundo recipiente comprende además un agente de isotonicidad. En otro aspecto, el segundo recipiente comprende además un amortiguador fisiológicamente aceptable. En un aspecto, la descripción proporciona un método para tratar al menos una afección caracterizada por GD2, que comprende administrar a un paciente que lo necesita una formulación proporcionada en un kit y reconstituida antes de la administración.

También se proporciona un artículo de fabricación para uso farmacéutico o de diagnóstico humano, que comprende material de empaque y un recipiente que comprende una solución o una forma liofilizada de al menos un anticuerpo anti-GD2 quimérico o humanizado aislado de la presente invención. El artículo de fabricación puede comprender opcionalmente tener el recipiente como un componente de un sistema o dispositivo de administración parenteral, subcutáneo, intramuscular, intravenoso, intraarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginoso, intracavitario, intracelial, intracerebeloso, intracerebroventricular, intratecal, intra-Ommaya, intravítreo, intraocular, intracólico, intracervical, intragástrico, intrahepático, intramiocárdico, intraóseo, intrapélvico, intrapericardíaco, intraperitoneal, intrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretiniano, intraespinal, intrasinovial, intratorácico, intrauterino, intravesical, en bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal o transdérmico.

Descripción detallada

En la descripción que sigue, se usan ampliamente varios términos usados en ADN recombinante e inmunología. Con el objetivo de proporcionar una comprensión más clara y consistente de la descripción y las reivindicaciones, que incluyen el alcance que debe darse a tales términos, se proporcionan las siguientes definiciones.

El término "anticuerpo" es una terminología reconocida en la técnica y pretende incluir moléculas o fragmentos activos de moléculas que se unen a antígenos conocidos. Los ejemplos de fragmentos activos de moléculas que se unen a antígenos conocidos incluyen fragmentos Fab y F(ab')2. Estos fragmentos activos pueden derivarse de un anticuerpo de la presente invención mediante varias técnicas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales purificados pueden escindirse con una enzima, tal como la pepsina, y someterse a filtración en gel por HPLC. La fracción apropiada que contiene fragmentos Fab puede entonces recogerse y concentrarse mediante filtración con membrana y similares. Para una descripción adicional de técnicas generales para el aislamiento de fragmentos activos de anticuerpos, véase, por ejemplo, Khaw, B. A. y otros, J. Nucl. Med. 23:1011-1019 (1982). El término "anticuerpo" también incluye anticuerpos biespecíficos y quiméricos.

Un anticuerpo, como se describe en la presente descripción, se refiere a una molécula de inmunoglobulina de longitud completa (es decir, de origen natural o formada mediante procesos recombinatorios de fragmentos de genes de inmunoglobulina normales) (por ejemplo, un anticuerpo IgG) o una porción inmunológicamente activa (es decir, que se une específicamente) de una molécula de inmunoglobulina, como un fragmento de anticuerpo.

Un fragmento de anticuerpo es una porción de un anticuerpo tal como F(ab').sub.2, F(ab).sub.2, Fab', Fab, Fv, sFv y similares. Independientemente de la estructura, un fragmento de anticuerpo se une al mismo antígeno que reconoce el anticuerpo intacto. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo monoclonal 3F8 se une a un epítopo reconocido por 3F8. El término "fragmento de anticuerpo" también incluye cualquier proteína sintética o modificada que actúa como un anticuerpo al unirse a un antígeno específico para formar un complejo. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos aislados que consisten en regiones variables, tales como los fragmentos "Fv" que consisten en regiones variables de las cadenas pesada y ligera, moléculas de polipéptidos de cadena sencilla recombinantes en las que las regiones variables ligeras y pesadas están conectadas por un enlazador peptídico ("proteínas scFv") y unidades de reconocimiento mínimo que consisten en los residuos de aminoácidos que imitan la región hipervariable.

El término "anticuerpo monoclonal" es una terminología reconocida en la técnica. Los anticuerpos monoclonales son anticuerpos monoespecíficos que son iguales porque están hechos por un tipo de célula inmunitaria que son todos clones de una célula madre única.

Existe una variedad de métodos en la técnica para la producción de anticuerpos monoclonales. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden prepararse por métodos de ADN recombinante, tales como los descritos en la patente de Estados Unidos núm. 4,816,567. En este contexto, el término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo derivado de un único clon eucariota, fago o procariota. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención pueden aislarse y secuenciarse fácilmente mediante el uso de procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante el uso de sondas oligonucleotídicas que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos murinos, o dichas cadenas de seres humanos, humanizadas u otras fuentes). Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, los cuales se transfectan después en las células huésped tales como células NS0, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO), células de levaduras, células de algas, huevos, o células de mieloma que de cualquier otra manera no producen proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. El ADN puede modificarse, además, por ejemplo, al sustituir la secuencia codificante de los dominios constantes de las cadenas pesada y ligera humanas de una especie deseada en lugar de las secuencias humanas homólogas (patente de Estados Unidos núm. 4,816,567; Morrison y otros, arriba) o al unir covalentemente a la secuencia codificante de inmunoglobulina la totalidad o la parte de la secuencia codificante de un polipéptido no inmunoglobulínico. Un polipéptido no inmunoglobulínico de ese tipo puede sustituirse por los dominios constantes de un anticuerpo de la invención, o puede sustituirse por los dominios variables de un sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo bivalente quimérico.

El término "epítopo" se reconoce en la técnica. Los expertos en la técnica generalmente entienden que se refiere a la región de un antígeno o antígenos que interactúa con un anticuerpo. Un epítopo de un péptido, una proteína o un antígeno de azúcar puede ser lineal o conformacional, o puede estar formado por secuencias de aminoácidos y/o azúcares contiguas o no contiguas del antígeno. La molécula GD2, como muchos carbohidratos, contiene muchos epítopos. Los epítopos o los azúcares reconocidos por los anticuerpos de la presente invención y las sustituciones conservadoras de estos azúcares que todavía se reconocen por el anticuerpo, el péptido de miméticos químicos del antígeno GD2 y los anticuerpos antiidiotípicos son una modalidad de la presente invención. Estos azúcares, o péptidos/productos químicos miméticos, o anticuerpos antiidiotípicos, ofrecen un método conveniente para eluir GD2 a MoAb o MoAb de GD2 en columnas de inmunoafinidad. Puede ser posible un mayor truncamiento de estos epítopos.

Un anticuerpo desnudo es generalmente un anticuerpo completo que no se conjuga con un agente terapéutico. Esto se debe a que la porción Fc de la molécula de anticuerpo proporciona funciones efectoras, tales como la fijación del complemento y la ADCC (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos), que ponen en acción mecanismos que pueden resultar en la lisis celular. Los anticuerpos desnudos incluyen anticuerpos tanto policlonales como monoclonales, así como también determinados anticuerpos recombinantes, tales como anticuerpos quiméricos, humanizados o humanos. Sin embargo, es posible que la porción Fc no sea necesaria para la función terapéutica, sino que un anticuerpo ejerza su efecto terapéutico a través de otros mecanismos, tales como la inducción del ciclo celular en reposo y la apoptosis. En este caso, los anticuerpos desnudos también incluyen los fragmentos de anticuerpos no conjugados definidos anteriormente.

Un anticuerpo quimérico es una proteína recombinante que contiene los dominios variables que incluyen las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un anticuerpo derivado de una especie, preferentemente un anticuerpo de roedor, mientras que los dominios constantes de la molécula de anticuerpo se derivan de los de un anticuerpo humano. Para aplicaciones veterinarias, los dominios constantes del anticuerpo quimérico pueden derivarse de los de otras especies, tales como un gato o un perro.

Un anticuerpo humanizado es una proteína recombinante en la que las CDR de un anticuerpo de una especie; por ejemplo, un anticuerpo de roedor se transfiere desde las cadenas variables pesada y ligera del anticuerpo de roedor a dominios variables pesados y ligeros humanos. El dominio constante de la molécula de anticuerpo se deriva del de un anticuerpo humano.

Un anticuerpo humano es un anticuerpo obtenido de ratones transgénicos que se han "modificado" para producir anticuerpos humanos específicos en respuesta a una exposición antigénica. En esta técnica, se introducen elementos del locus de las cadenas pesada y ligera humanas en cepas de ratones derivadas de líneas de células madre embrionarias que contienen alteraciones específicas de los loci endógenos de la cadena pesada y la cadena ligera. Los ratones transgénicos pueden sintetizar anticuerpos humanos específicos para antígenos humanos y los ratones pueden usarse para producir hibridomas secretores de anticuerpos humanos. Los métodos para obtener anticuerpos humanos a partir de ratones transgénicos se describen en Green y otros, Nature Genet. 7:13 (1994), Lonberg y otros, Nature 368:856 (1994), y Taylor y otros, Int. Immun. 6:579 (1994). También puede construirse un anticuerpo completamente humano mediante métodos de transfección genética o cromosómica, así como también tecnología de presentación en fagos, todos los cuales se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, McCafferty y otros, Nature 348:552-553 (1990) para la producción de anticuerpos humanos y fragmentos de los mismos in vitro, a partir de repertorios de genes de dominios variables de inmunoglobulina de donantes no inmunizados. En esta técnica, los genes de dominios variables del anticuerpo se clonan en estructura en un gen de la proteína de cubierta mayor o menor de un bacteriófago filamentoso y se muestran como fragmentos de anticuerpos funcionales en la superficie de la partícula del fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN monocatenario del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también dan como resultado la selección del gen que codifica el anticuerpo que exhibe esas propiedades. De esta forma, el fago imita algunas de las propiedades del linfocito B. La presentación en fagos puede realizarse en una variedad de formatos, para su revisión, véase, por ejemplo, Johnson y Chiswell, Current Opinion in Structural Biology 3:5564-571 (1993).

Los anticuerpos humanos también pueden generarse mediante linfocitos B activados in vitro. Véase las patentes de Estados Unidos núms. 5,567,610 y 5,229,275.

Un agente terapéutico es una molécula o un átomo que se administra por separado, simultáneamente o secuencialmente con un resto de anticuerpo o conjugado con un resto de anticuerpo, es decir, anticuerpo o fragmento de anticuerpo, o un subfragmento, y es útil en el tratamiento de una enfermedad. Los ejemplos de agentes terapéuticos incluyen anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, fármacos, toxinas, nucleasas, hormonas, inmunomoduladores, quelantes, compuestos de boro, agentes fotoactivos o colorantes y radioisótopos.

Un agente de diagnóstico es una molécula o un átomo que se administra conjugado con un resto de anticuerpo, es decir, anticuerpo o fragmento de anticuerpo, o subfragmento, y es útil para diagnosticar o detectar una enfermedad al localizar las células que contienen el antígeno. Los agentes de diagnóstico útiles incluyen, pero no se limitan a, radioisótopos, colorantes (tales como el complejo de biotina-estreptavidina), agentes de contraste, compuestos o moléculas fluorescentes y agentes potenciadores (por ejemplo, iones paramagnéticos) para imágenes por resonancia magnética (MRI). La patente de Estados Unidos núm. 6,331,175 describe la técnica de MRI y la preparación de anticuerpos conjugados con un agente potenciador de MRI. Preferentemente, los agentes de diagnóstico se seleccionan del grupo que consiste en radioisótopos, agentes potenciadores para su uso en imágenes por resonancia magnética y compuestos fluorescentes. Para cargar un componente de anticuerpo con metales radiactivos o iones paramagnéticos, puede ser necesario hacerlo reaccionar con un reactivo que tenga una cola larga a la que están unidos una multiplicidad de grupos quelantes para unir los iones. Dicha cola puede ser un polímero tal como una polilisina, un polisacárido u otra cadena derivatizada o derivatizable que tenga grupos colgantes a los que puedan unirse grupos quelantes tales como, por ejemplo, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), porfirinas, poliaminas, éteres corona, bis-tiosemicarbazonas, polioximas y grupos similares que se sabe que son útiles para este fin. Los quelatos se acoplan a los anticuerpos mediante el uso de químicas estándar. El quelato normalmente está unido al anticuerpo mediante un grupo que permite la formación de un enlace a la molécula con una pérdida mínima de la inmunorreactividad y una mínima agregación y/o entrecruzamiento interno. Se describen otros métodos y reactivos más inusuales para conjugar quelatos con anticuerpos en la patente de Estados Unidos núm. 4,824,659 de Hawthorne, titulada "Antibody Conjugates", expedida el 25 de abril de 1989. Las combinaciones de quelato-metal particularmente útiles incluyen 2-bencil-DTPA y sus análogos monometilo y ciclohexilo, usados con isótopos de diagnóstico para radioimagen. Los mismos quelatos, cuando forman complejos con metales no radiactivos, tales como manganeso, hierro y gadolinio, son útiles para MRI, cuando se usan junto con los anticuerpos de la invención. Los quelatos macrocíclicos tales como NOTA, DOTA y TETA son útiles con una variedad de metales y radiometales, más particularmente con radionúclidos de galio, itrio y cobre, respectivamente. Estos complejos de quelato-metal pueden hacerse muy estables al adaptar el tamaño del anillo al metal de interés. La invención abarca otros quelatos de tipo anillo, tales como los poliéteres macrocíclicos, que son de interés para unir nucleidos de forma estable, tales como 223Ra para RAIT.

Un inmunoconjugado es un conjugado de un componente de anticuerpo con un agente de diagnóstico o terapéutico. El agente de diagnóstico puede comprender un marcador radioactivo o no radioactivo, un agente de contraste (tal como para imágenes por resonancia magnética, tomografía computarizada o ultrasonido), y el marcador radioactivo puede ser un electrón gamma, beta, alfa, Auger, o isótopo emisor de positrones.

Un inmunomodulador es un agente terapéutico como se define en la presente invención que, cuando está presente, típicamente estimula a las células inmunitarias para que proliferen o se activen en una cascada de respuesta inmunitaria, tales como macrófagos, linfocitos B y/o linfocitos T. Un ejemplo de un inmunomodulador como se describe en la presente descripción es una citocina. Como entenderá el experto en la técnica, determinadas interleucinas e interferones son ejemplos de citocinas que estimulan la proliferación de linfocitos T u otras células inmunitarias.

Un vector de expresión es una molécula de ADN que comprende un gen que se expresa en una célula huésped. Típicamente, la expresión génica se coloca bajo el control de determinados elementos reguladores, que incluyen promotores constitutivos o inducibles, elementos reguladores específicos de tejidos y potenciadores. Se dice que un gen de este tipo está "vinculado operativamente a" los elementos reguladores.

Un huésped recombinante puede ser cualquier célula procariota o eucariota que contenga un vector de clonación o un vector de expresión. Este término también incluye aquellas células procariotas o eucariotas, así como también un animal transgénico, que se han modificado para contener el gen o los genes clonados en el cromosoma o el genoma de la célula huésped o las células de las células huésped.

Un anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo que puede unirse simultáneamente a al menos dos dianas que tienen una estructura diferente, por ejemplo, dos antígenos diferentes, dos epítopos diferentes en el mismo antígeno o un hapteno y un antígeno o un epítopo. Una especificidad sería, por ejemplo, un antígeno o un epítopo de linfocitos B, linfocitos T, células mieloides, plasma o mastocitos. Otra especificidad podría ser hacia un antígeno diferente en el mismo tipo de célula, tales como CD20, CD19, CD21, CD23, CD46, c D80, HLA-DR, CD74 o CD22 en linfocitos B. Los anticuerpos multiespecíficos y multivalentes son construcciones que tienen más de un sitio de unión y los sitios de unión son de diferente especificidad. Por ejemplo, un diacuerpo biespecífico, donde un sitio de unión reacciona con un antígeno y el otro con otro antígeno.

Un anticuerpo biespecífico es un anticuerpo que puede unirse simultáneamente a dos dianas que tienen una estructura diferente. Los anticuerpos biespecíficos (bsAb) y los fragmentos de anticuerpos biespecíficos (bsFab) tienen al menos un brazo que se une específicamente, por ejemplo, a GD2 y al menos otro brazo que se une específicamente a un conjugado dirigible que porta un agente de diagnóstico o terapéutico. Puede producirse una variedad de proteínas de fusión biespecíficas mediante el uso de ingeniería molecular. En una forma, la proteína de fusión biespecífica es divalente y consiste en, por ejemplo, un scFv con un único sitio de unión para un antígeno y un fragmento Fab con un único sitio de unión para un segundo antígeno. En otra forma, la proteína de fusión biespecífica es tetravalente y consiste en, por ejemplo, una IgG con dos sitios de unión para un antígeno y dos scFv idénticos para un segundo antígeno.

Los métodos recientes para producir MoAb biespecíficos incluyen MoAb recombinantes modificados que tienen residuos de cisteína adicionales para que se entrecrucen con más fuerza que los isotipos de inmunoglobulina más comunes. Véase, por ejemplo, FitzGerald y otros, Protein Eng. 10(10):1221-1225, 1997. Otro enfoque consiste en modificar proteínas de fusión recombinantes que unen dos o más segmentos de fragmentos de anticuerpos o anticuerpos de cadena sencilla diferentes con las especificidades dobles necesarias. Véase, por ejemplo, Coloma y otros, Nature Biotech. 15:159-163, 1997. Puede producirse una variedad de proteínas de fusión biespecíficas mediante el uso de ingeniería molecular.

Las proteínas de fusión biespecíficas que unen dos o más anticuerpos de cadena sencilla o fragmentos de anticuerpos diferentes se producen de manera similar. Pueden usarse métodos recombinantes para producir una variedad de proteínas de fusión. Un enlazador flexible conecta el scFv con la región constante de la cadena pesada del anticuerpo 3F8. Alternativamente, el scFv puede conectarse a la región constante de la cadena ligera de otro anticuerpo humanizado. Las secuencias enlazadoras apropiadas necesarias para la conexión en estructura de la cadena pesada Fd al scFv se introducen en los dominios V<l>y Vkappa mediante reacciones de PCR. Luego, el fragmento de ADN que codifica el scFv se liga en un vector de estadificación que contiene una secuencia de ADN que codifica el dominio CH1. La construcción scFv-CH1 resultante se escinde y se liga en un vector que contiene una secuencia de ADN que codifica la región V<h>de un anticuerpo 3F8. El vector resultante puede usarse para transfectar una célula huésped apropiada, tal como una célula de mamífero, para la expresión de la proteína de fusión biespecífica.

Los anticuerpos 3F8 y los fragmentos de los mismos de la presente invención también pueden usarse para preparar anticuerpos de cadena sencilla biespecíficos funcionales (bscAb), también llamados diacuerpos, y pueden producirse en células de mamífero mediante el uso de métodos recombinantes. Véase, por ejemplo, Mack y otros, Proc. Natl. Acad. Sci., 92: 7021-7025, 1995. Por ejemplo, los bscAb se producen al unir dos fragmentos Fv de cadena sencilla mediante un enlazador de glicina-serina mediante el uso de métodos recombinantes. Los dominios de la cadena ligera V y la cadena pesada V de dos anticuerpos de interés se aíslan mediante el uso de métodos de PCR estándar conocidos en la técnica. Los anticuerpos de cadena sencilla biespecíficos y las proteínas de fusión biespecíficas se incluyen dentro del alcance de la presente invención.

El uso final de los diacuerpos biespecíficos descritos en la presente descripción es para el direccionamiento previo a células positivas para GD2 para la posterior administración específica de agentes de diagnóstico/detección o terapéuticos. Estos diacuerpos se unen selectivamente a antígenos específicos, lo que permite una mayor afinidad y un tiempo de residencia más prolongado en la ubicación deseada. Además, los diacuerpos no unidos a antígenos se eliminan rápidamente del cuerpo y se minimiza la exposición de los tejidos normales. Los agentes de diagnóstico/detección y terapéuticos pueden incluir isótopos, fármacos, toxinas, citocinas, hormonas, factores de crecimiento, conjugados, radionúclidos y metales. Por ejemplo, el gadolinio metálico se usa para la obtención de imágenes por resonancia magnética (MRI). Los radionúclidos también están disponibles como agentes de diagnóstico y terapéuticos, especialmente aquellos en el intervalo de energía de 60 a 4000 keV.

La construcción dirigible puede tener una estructura diversa, pero se selecciona no sólo para evitar provocar respuestas inmunitarias, sino también para una rápida eliminación in vivo cuando se usa dentro del método de direccionamiento de bsAb. Los agentes hidrófobos son mejores para provocar respuestas inmunitarias fuertes, mientras que los agentes hidrófilos se prefieren para una rápida eliminación in vivo; por lo tanto, es necesario establecer un equilibrio entre lo hidrofobicidad y la hidrofilicidad. Esto se logra, en parte, al confiar en el uso de agentes quelantes hidrófilos para compensar la hidrofobicidad inherente de muchos restos orgánicos. Además, pueden elegirse subunidades de la construcción dirigible que tengan propiedades de solución opuestas, por ejemplo, péptidos, que contienen aminoácidos, algunos de los cuales son hidrófobos y algunos de los cuales son hidrófilos. Además de los péptidos, pueden usarse carbohidratos.

Pueden usarse péptidos que tengan tan solo dos residuos de aminoácidos, preferentemente de dos a diez residuos, si también están acoplados a otros restos tales como agentes quelantes. El enlazador debe ser un conjugado de bajo peso molecular, que tenga preferentemente un peso molecular inferior a 50 000 dalton y ventajosamente inferior a aproximadamente 20 000 dalton, 10 000 dalton o 5000 dalton, que incluyen los iones metálicos en los quelatos.

La presencia de restos de quelato hidrófilos en los restos enlazadores ayuda a asegurar una rápida eliminación in vivo. Además de su hidrofilicidad, los quelantes se eligen por sus propiedades de unión a metales y se modifican a voluntad ya que, al menos para aquellos enlazadores cuyo epítopo bsAb es parte del péptido o es un hapteno químico no quelato, el reconocimiento del quelato metálico complejo ya no es un problema.

Un quelante tal como DTPA, DOTA, TETA o NOTA o un péptido adecuado, al que puede conjugarse un marcador detectable, tal como una molécula fluorescente, o un agente citotóxico, tal como un metal pesado o un radionúclido. Por ejemplo, puede obtenerse un inmunoconjugado terapéuticamente útil al conjugar un agente fotoactivo o colorante con una proteína de fusión de anticuerpo. Se han usado composiciones fluorescentes, tales como fluorocromo y otros cromógenos, o colorantes, tales como porfirinas sensibles a la luz visible, para detectar y tratar lesiones al dirigir la luz adecuada a la lesión. En terapia, esto se ha denominado fotorradiación, fototerapia o terapia fotodinámica (Jori y otros (eds.), PHOTODYNAMIC THERAPY OF TUMORS AND OTHER DISEASES (Librería Progetto 1985); van den Bergh, Chem. Britain 22:430 (1986)). Además, los anticuerpos monoclonales se han acoplado a colorantes fotoactivados para lograr la fototerapia. Mew y otros, J. Immunol. 130:1473 (1983); ídem., Cancer Res. 45:4380 (1985); Oseroff y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8744 (1986); ídem., Photochem. Photobiol. 46:83 (1987); Hasan y otros, Prog. Clin. Biol. Res. 288:471 (1989); Tatsuta y otros, Lasers Surg. Med.

9:422 (1989); Pelegrin y otros, Cancer 67:2529 (1991). Sin embargo, estos estudios anteriores no incluyeron el uso de aplicaciones de terapia endoscópica, especialmente con el uso de fragmentos o subfragmentos de anticuerpos. De este modo, la presente invención contempla el uso terapéutico de inmunoconjugados que comprenden agentes fotoactivos o colorantes.

Los mismos quelantes, cuando forman complejos con metales no radiactivos, tales como Mn, Fe y Gd, pueden usarse para MRI, cuando se usan junto con los bsAb de la invención. Los quelantes macrocíclicos tales como NOTA (ácido 1,4,7-triaza-ciclononano-N,N',N"-triacético), DOTA y TETA (ácido p-bromoacetamido-benciltetraetilaminotetraacético) son útiles con una variedad de metales y radiometales, más particularmente con radionúclidos de Ga, Y y Cu, respectivamente.

Como se usa en la presente descripción, los términos "prevenir", "que previene" y "prevención" se refieren a la prevención de la aparición o la recurrencia de uno o más síntomas de un trastorno en un sujeto como resultado de la administración de un agente profiláctico o terapéutico.

Como se usa en la presente descripción, el término "en combinación" se refiere al uso de más de un agente profiláctico y/o terapéutico. El uso del término "en combinación" no restringe el orden en el que los agentes profilácticos y/o terapéuticos se administran a un sujeto con un trastorno. Un primer agente profiláctico o terapéutico puede administrarse antes de (por ejemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas o 12 semanas antes), concomitantemente con, o subsecuentemente a (por ejemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, o 12 semanas después) la administración de un segundo agente profiláctico o terapéutico a un sujeto con un trastorno.

Por "función efectora" como se usa en la presente descripción se entiende el evento bioquímico que resulta de la interacción de una región Fc de un anticuerpo con un ligando o receptor de Fc. Las funciones efectoras incluyen, pero no se limitan a, citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCP) y citotoxicidad mediada por el complemento (CMC). Las funciones efectoras incluyen aquellas que funcionan después de la unión de un antígeno y aquellas que funcionan con independencia de la unión al antígeno.

Por "célula efectora" como se usa en la presente descripción se entiende una célula del sistema inmunológico que expresa uno o más receptores de Fc y media una o más funciones efectoras. Las células efectoras incluyen, pero no se limitan a, monocitos, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, eosinófilos, mastocitos, plaquetas, linfocitos grandes granulares, células de Langerhans, células citotóxicas naturales (NK), linfocitos T, linfocitos B, y pueden ser de cualquier organismo que incluye, pero no se limitan a, seres humanos, ratones, ratas, conejos y monos.

Por "ligando de Fc" como se usa en la presente descripción se entiende una molécula, preferentemente un polipéptido, de cualquier organismo que se une a la región Fc de un anticuerpo para formar un complejo Fc-ligando. Los ligandos de Fc incluyen, pero no se limitan a, Fc-gamma-RIIA (CD32A), Fc-gamma-RIIB (CD32B), Fc-gamma-RIIIA (CD16A), Fc-gamma-RIIIB (CD16B), Fc-gamma-RI (CD64), Fc-épsilon-RII (CD23), FcRn, C1q, C3, proteína A estafilocócica, proteína G estreptocócica y Fc.gamma.R viral. Los ligandos de Fc pueden incluir moléculas no descubiertas que se unen a Fc.

En una modalidad específica preferida, la invención abarca una molécula que comprende una región Fc variante, en donde dicha región Fc variante comprende al menos una modificación de aminoácidos con relación a una región Fc de tipo silvestre, de manera que dicha molécula tiene una afinidad alterada por un FcyR, siempre y cuando dicha región Fc variante no tenga una sustitución en las posiciones que hacen un contacto directo con FcyR en base a un análisis cristalográfico y estructural de las interacciones Fc-FcyR como las descritas por Sondermann y otros, 2000 (Nature, 406: 267-273). Los ejemplos de posiciones dentro de la región Fc que hacen un contacto directo con FcyR son los aminoácidos 234-239 (región bisagra), los aminoácidos 265-269 (lazo B/C), los aminoácidos 297-299 (lazo C'/E) y los aminoácidos 327-332 del lazo (F/G). En algunas modalidades, las moléculas de la invención que comprenden las regiones Fc variantes comprenden la modificación de al menos un residuo que hace un contacto directo con un FcyR en base al análisis estructural y cristalográfico.

Un aspecto de la invención incluye el anticuerpo 3F8 con afinidades alteradas por receptores activadores y/o inhibidores, que tiene regiones Fc variantes con una o más modificaciones de aminoácidos, en donde dicha modificación de uno o más aminoácidos es una sustitución en la posición 239 con ácido aspártico, en posición 330 con leucina y en la posición 332 con ácido glutámico (Véase Ejemplo 13).

La invención abarca moléculas que comprenden una región Fc variante con adiciones, eliminaciones y/o sustituciones a uno o más aminoácidos en la región Fc de un anticuerpo de la presente invención para alterar la función efectora, o mejorar o disminuir la afinidad del anticuerpo por FcR. Estas mutaciones están dentro del conocimiento de un experto en la técnica. Por lo tanto, la invención abarca moléculas que comprenden regiones Fc variantes que se unen con mayor afinidad a uno o más FcyR. Tales moléculas median, preferentemente, la función efectora de manera más efectiva como se analiza más abajo. En otras modalidades, la invención abarca moléculas que comprenden una región Fc variante que se une con una afinidad más débil a uno o más FcyR. La reducción o la eliminación de una función efectora son convenientes en determinados casos, por ejemplo, en el caso de anticuerpos cuyo mecanismo de acción implica el bloqueo o el antagonismo, pero no la eliminación de las células que portan un antígeno diana. La reducción o la eliminación de una función efectora sería conveniente en casos de enfermedad autoinmunitaria donde podrían bloquearse los receptores activadores FcyR en las células efectoras (Este tipo de función estaría presente en las células huésped). En general, el aumento de la función efectora se dirigiría a células tumorales y extrañas.

Las variantes de Fc de la presente invención pueden combinarse con otras modificaciones de Fc, que incluyen, pero no se limitan a, modificaciones que alteran la función efectora. La invención abarca combinar una variante de Fc variante de la invención con otras modificaciones de Fc para proporcionar propiedades aditivas, sinérgicas, o novedosas en anticuerpos o fusiones de Fc. Preferentemente las variantes de Fc de la invención mejoran el fenotipo de la modificación con la que se combinan. Por ejemplo, si una variante de Fc de la invención se combina con un mutante conocido por unirse a FcyRIIIA con una afinidad superior que una molécula comparable que comprende una región Fc de tipo silvestre; la combinación con un mutante de la invención resulta en una mejoría mucho mayor en la afinidad de FcyRIIIA. En algunas modalidades, las variantes de Fc de la presente invención se incorporan en un anticuerpo o una fusión de Fc que comprende una o más glicoformas modificadas, es decir, una composición de carbohidratos que está unida covalentemente a una molécula que comprende una región Fc, en donde dicha composición de carbohidratos difiere químicamente del de una molécula original que comprende una región Fc.

La invención abarca anticuerpos con sitios de glicosilación modificados, preferentemente sin alterar la funcionalidad del anticuerpo, por ejemplo, la actividad de unión a GD2. Como se usa en la presente descripción, "sitios de glicosilación" incluyen cualquier secuencia de aminoácidos específica en un anticuerpo para el cual un oligosacárido (es decir, carbohidrato, que contiene dos o más azúcares simples unidos entre sí) se unirá específicamente y covalentemente. Las cadenas laterales de oligosacáridos se unen típicamente a la cadena principal de un anticuerpo mediante enlaces de N u O. La glicosilación con enlace de N se refiere a la unión de un resto de oligosacárido a la cadena lateral de un residuo de asparagina. La glicosilación con enlace de O se refiere a la unión de un resto de oligosacárido a un hidroxiaminoácido, por ejemplo, serina, treonina. Una glicoforma de Fc, hu3F8-H1L1-IgG1n que carecía de determinados oligosacáridos que incluyen fucosa y N-acetilglucosamina terminal se produjo en células CHO especiales y exhibió aumento de la función efectora de ADCC.

En algunas modalidades, la invención abarca métodos para modificar el contenido de carbohidratos de un anticuerpo de la invención mediante la adición o la eliminación de un sitio de glicosilación. Los métodos para modificar el contenido de carbohidratos de los anticuerpos se conocen bien en la técnica y se abarcan dentro de la invención, véase, por ejemplo, patente de Estados Unidos núm. 6,218,149; documento núm. EP 0 359 096 B1; publicación de Estados Unidos núm. US 2002/0028486; documento núm. WO 03/035835; publicación de Estados Unidos núm. 2003/0115614; patente de Estados Unidos núm. 6,218,149; patente de Estados Unidos núm. 6,472,511. En otras modalidades, la invención abarca métodos para modificar el contenido de carbohidratos de un anticuerpo de la invención mediante la eliminación de uno o más restos endógenos de carbohidrato del anticuerpo. En una modalidad específica, la invención abarca eliminar el sitio de glicosilación de la región Fc de un anticuerpo, mediante la modificación de la posición 297 de asparagina a alanina.

Las glicoformas modificadas pueden ser útiles para una variedad de propósitos, que incluyen, pero no se limitan a potenciar o reducir la función efectora. Las glicoformas modificadas pueden generarse por cualquier método conocido por un experto en la técnica, por ejemplo mediante el uso de cepas con expresión variante o modificada, por la coexpresión con una o más enzimas, por ejemplo DI N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTI11), al expresar una molécula que comprende una región Fc en varios organismos o líneas de células a partir de varios organismos, o la modificación de carbohidrato(s) después que la molécula que comprende la región Fc se ha expresado. Los métodos para generar glicoformas modificadas se conocen en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a los descritos en Umana y otros, 1999, Nat. Biotechnol 17:176-180; Davies y otros, 20017 Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields y otros, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa y otros, 2003, J Biol Chem 278:3466-3473) patente de Estados Unidos núm. 6,602,684; núm. de serie de Estados Unidos 10/277,370; núm. de serie de Estados Unidos 10/113,929; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02/30954A1; tecnología Potillegent™ (Biowa, Inc. Princeton, N.J.); tecnología de modificación de la glicosilación GlycoMAb™ (GLYCART biotechnology AG, Zurich, Suiza). Véase, por ejemplo, documento WO 00061739; documento EA01229125; documento US 20030115614; Okazaki y otros, 2004, JMB, 336: 1239-49.

Como se usa en la presente descripción, el término "derivado" en el contexto de polipéptidos o proteínas se refiere a un polipéptido o una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que se ha alterado por la introducción de sustituciones, eliminaciones o adiciones de residuos de aminoácidos. El término "derivado" como se usa en la presente descripción se refiere además a un polipéptido o una proteína que se ha modificado, es decir, por la unión covalente de cualquier tipo de molécula al polipéptido o la proteína. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, un anticuerpo puede modificarse, por ejemplo, mediante glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos bloqueadores/protectores conocidos, escisión proteolítica, unión a un ligando celular u otra proteína, etc. Un polipéptido o una proteína derivados puede producirse por modificaciones químicas mediante el uso de técnicas conocidas por los expertos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, la escisión química específica, la acetilación, la formilación, la síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Además, un polipéptido derivado o un derivado de proteína posee una función similar o idéntica a la del polipéptido o la proteína del que deriva.

Como se usa en la presente descripción, el término "fragmento" se refiere a un péptido o un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos 5 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 10 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 15 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 20 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 25 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 40 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 50 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 60 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 70 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 80 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 90 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 100 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 125 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 150 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 175 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 200 residuos de aminoácidos contiguos, o al menos 250 residuos de aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de otro polipéptido. En una modalidad específica, un fragmento de un polipéptido mantiene al menos una función del polipéptido.

Cantidad efectiva: Como se usa en la presente descripción, el término "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad de un compuesto, un conjugado o una composición determinados que es necesaria o suficiente para realizar un efecto biológico deseado. Una cantidad efectiva de un compuesto, un conjugado o una composición dados de acuerdo con los métodos de la presente invención sería la cantidad que logra este resultado seleccionado, y dicha cantidad puede determinarse de forma rutinaria por un experto en la técnica, mediante el uso de ensayos que se conocen en la técnica y/o que se describen en la presente descripción, sin necesidad de experimentación indebida. Por ejemplo, una cantidad efectiva para tratar o prevenir la metástasis del cáncer podría ser la cantidad necesaria para evitar la migración e invasión de una célula tumoral a través de la membrana basal o a través de una capa endotelial in vivo. El término también es sinónimo de "cantidad suficiente". La cantidad efectiva para cualquier aplicación particular puede variar en dependencia de factores tales como la enfermedad, el trastorno o la afección que se trata, la composición particular que se administra, la vía de administración, la talla del sujeto y/o la gravedad de la enfermedad o la afección. Un experto en la técnica puede determinar empíricamente la cantidad efectiva de un compuesto, un conjugado o una composición particular de la presente invención, de acuerdo con la guía proporcionada en la presente descripción, sin necesidad de experimentación indebida.

Tal como se usa en la presente descripción en relación con una cantidad medida, el término "aproximadamente" se refiere a la variación normal en esa cantidad medida que esperaría el experto que realiza la medición y ejerce un nivel de cuidado acorde con el objetivo de la medición y la precisión del equipo de medición usado. A menos que se indique de otra forma, "aproximadamente" se refiere a una variación de /-10 % del valor proporcionado.

Por un polipéptido "aislado" o un fragmento, una variante o un derivado del mismo, se entiende un polipéptido que no se encuentra en su medio natural. No se requiere ningún nivel particular de purificación. Por ejemplo, un polipéptido aislado puede eliminarse de su entorno nativo o natural. Los polipéptidos y las proteínas producidos de forma recombinante expresados en células huésped se consideran aislados para los fines de la invención, al igual que los polipéptidos nativos o recombinantes que se han separado, fraccionado o purificado parcial o sustancialmente mediante cualquier técnica adecuada.

También se incluyen como polipéptidos de la presente invención fragmentos, derivados, análogos o variantes de los polipéptidos anteriores y cualquier combinación de los mismos. Los términos "fragmento", "variante", "derivado" y "análogo" cuando se refieren a anticuerpos anti-GD2 o polipéptidos de anticuerpos incluyen cualquier polipéptido que conserve al menos algunas de las propiedades de unión al antígeno del correspondiente anticuerpo o polipéptido nativo, es decir, aquellos polipéptidos que conservan la capacidad de unirse a uno o más epítopos en GD2. Los fragmentos de polipéptidos de la presente invención incluyen fragmentos proteolíticos, así como también fragmentos de eliminación, además de fragmentos de anticuerpos específicos analizados en otra parte en la presente descripción. Las variantes de anticuerpos anti-GD2 y polipéptidos de anticuerpos útiles de acuerdo con la presente invención incluyen fragmentos como se describe anteriormente, y también polipéptidos con secuencias de aminoácidos alteradas debido a sustituciones, eliminaciones o inserciones de aminoácidos. Las variantes pueden ocurrir de forma natural o de origen no natural. Pueden producirse variantes de origen no natural mediante el uso de técnicas de mutagénesis conocidas en la técnica o aminoácidos no naturales. Los polipéptidos variantes pueden comprender sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoácidos conservadoras o no conservadoras. Los derivados de anticuerpos anti-GD2 y polipéptidos de anticuerpos útiles de acuerdo con la presente invención son polipéptidos que se han alterado para exhibir características adicionales que no se encuentran en el polipéptido nativo. Los ejemplos incluyen proteínas de fusión. Los polipéptidos variantes también pueden denominarse en la presente descripción "análogos de polipéptidos". Como se usa en la presente descripción un "derivado" de un anticuerpo anti-GD2 o polipéptido de anticuerpo se refiere a un polipéptido sujeto que tiene uno o más residuos químicamente derivatizados por reacción de un grupo lateral funcional. Se incluyen como "derivados" aquellos péptidos que contienen uno o más derivados de aminoácidos de origen natural de los veinte aminoácidos estándar. Por ejemplo, 4-hidroxiprolina puede sustituirse por prolina; 5-hidroxilisina puede sustituirse por lisina; 3-metilhistidina puede sustituirse por histidina; la homoserina puede sustituirse por serina; y la ornitina puede sustituirse por lisina.

Tratamiento: Como se usa en la presente descripción, los términos "tratamiento", "tratar", "tratado" o "que trata" se refieren a la profilaxis y/o la terapia, particularmente en donde el objetivo es prevenir o ralentizar (disminuir) un cambio o trastorno fisiológico indeseado, tal como la progresión de la esclerosis múltiple. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, alivio de los síntomas, diminución de la extensión de la enfermedad, estado de la enfermedad estable (es decir, no empeora), retraso o enlentecimiento de la progresión de la enfermedad, mejora o alivio del estado de la enfermedad, y remisión (ya sea parcial o total), detectable o indetectable. "Tratamiento" también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. Aquellos con necesidad de tratamiento incluyen aquellos que tienen ya una afección o un trastorno, así como también aquellos que tienden a padecer la afección o el trastorno o aquellos en los que la afección o el trastorno deben prevenirse. Por "sujeto" o "individuo" o "animal" o "paciente" o "mamífero" se entiende cualquier sujeto, particularmente un sujeto mamífero, para el que es conveniente un diagnóstico, un pronóstico o una terapia. Los sujetos mamíferos incluyen seres humanos y otros primates, animales domésticos, animales de granja y animales de zoológico, deporte o mascotas tales como perros, gatos, cobayas, conejos, ratas, ratones, caballos, ganado, vacas y similares.

Anticuerpos humanizados

En una modalidad, los anticuerpos proporcionados por la presente invención son anticuerpos monoclonales, que en una modalidad preferida son versiones humanizadas de anticuerpos anti-GD2 afines derivados de otras especies. Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo producido mediante la tecnología de ADN recombinante, en el que algunos o todos los aminoácidos de una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina humana que no son necesarios para la unión al antígeno (por ejemplo, las regiones constantes y las regiones de marco estructural de los dominios variables) se usan para sustituir los aminoácidos correspondientes de la cadena ligera o pesada del anticuerpo no humano afín. A manera de ejemplo, una versión humanizada de un anticuerpo murino contra un antígeno determinado tiene en sus cadenas pesada y ligera (1) las regiones constantes de un anticuerpo humano; (2) las regiones de marco estructural de los dominios variables de un anticuerpo humano; y (3) las CDR del anticuerpo murino. Cuando sea necesario, uno o más residuos en las regiones de marco estructural humanas pueden cambiarse a residuos en las posiciones correspondientes en el anticuerpo murino para conservar la afinidad de unión del anticuerpo humanizado al antígeno. Este cambio a veces se denomina "retromutación". De manera similar, pueden hacerse mutaciones directas para revertir a la secuencia murina por una razón deseada, por ejemplo, estabilidad o afinidad por el antígeno. Por ejemplo, para hu3F8-H1L1-IgG1 fueron necesarias retromutaciones en 19 posiciones en la secuencia de la cadena pesada y 17 posiciones en la cadena ligera para mantener la afinidad de unión in vitro. Generalmente, es menos probable que los anticuerpos humanizados provoquen una respuesta inmunitaria en seres humanos en comparación con los anticuerpos humanos quiméricos porque los primeros contienen considerablemente menos componentes no humanos.

Los métodos adecuados para preparar los anticuerpos humanizados de la presente invención se describen, por ejemplo, en Winter EP 0239400; Jones y otros, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann y otros, Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen y otros, Science 239: 1534-1536 (1988); Queen y otros, Proc. Nat. Acad. ScL USA 86:10029 (1989); patente de Estados Unidos núm. 6,180,370; y Orlandi y otros, Proc. Natl. Acad. Sd. USA 86:3833 (1989). Generalmente, el trasplante de CDR murinas (u otras no humanas) a un anticuerpo humano se logra de la siguiente manera. Los ADNc que codifican los dominios variables de las cadenas pesada y ligera se aíslan de un hibridoma. Las secuencias de ADN de los dominios variables, que incluyen las CDR, se determinan mediante secuenciación. Los ADN que codifican las CDR se insertan en las regiones correspondientes de las secuencias codificantes del dominio variable de la cadena ligera o pesada de un anticuerpo humano, unidas a segmentos génicos de la región constante humana de un isotipo deseado (por ejemplo, Yl para CH y K para C<l>), son genes sintetizados. Los genes de las cadenas pesada y ligera humanizados se coexpresan en células huésped de mamífero (por ejemplo, células CHO o NSO) para producir anticuerpo humanizado soluble. Para facilitar la producción a gran escala de anticuerpos, a menudo es conveniente seleccionar un expresor alto mediante el uso de un gen DHFR o un gen GS en la línea productora. Estas líneas de células productoras se cultivan en biorreactores, o sistemas de cultivo de fibras huecas, o tecnología WAVE, para producir cultivos en masa de anticuerpos solubles o para producir mamíferos transgénicos (por ejemplo, cabras, vacas u ovejas) que expresan el anticuerpo en la leche (véase, por ejemplo, patente de Estados Unidos núm. 5,827,690).

Mediante el uso de los enfoques descritos anteriormente, se generaron versiones humanizadas y quiméricas del anticuerpo 3F8. Los ADNc que codifican las regiones variables de 3F8 murino de las cadenas ligera y pesada se usaron para construir vectores para la expresión de quimeras murino-humanas en los que las regiones variables de 3F8 murino se unieron a regiones constantes de IgGl humana (para la cadena pesada) y kappa humana (para la cadena ligera), como se describe en los ejemplos en la presente descripción. Además, se generaron nuevas formas de hu3F8 con glicosilación variante para mejorar la unión al receptor de Fc y mejorar la afinidad al antígeno.

Para producir anticuerpos 3F8 humanizados, los dominios estructurales del aceptor humano se eligieron mediante coincidencia por homología con secuencias de la línea germinal humana. Mediante el uso de estas estructuras de aceptor humanas elegidas, se diseñaron los dominios variables de las cadenas ligera y pesada y se generaron y se expresaron varias variantes/versiones de cada uno, como se describe más abajo en los ejemplos.

En esta solicitud se describen las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de los MoAb de la invención. La invención proporciona además polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifican un anticuerpo de la invención o los fragmentos del mismo. La invención también abarca polinucleótidos que se hibridan en condiciones de hibridación estrictas o de menor rigurosidad con polinucleótidos que codifican un anticuerpo de la presente invención.

Los polinucleótidos ahora pueden obtenerse mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, si se conoce la secuencia de nucleótidos del anticuerpo, puede ensamblarse un polinucleótido que codifica el anticuerpo a partir de los oligonucleótidos sintetizados químicamente (por ejemplo, como se describió en Kutmeier y otros, BioTechniques 17:242 (1994)), lo que brevemente, implica la síntesis de oligonucleótidos que se solapan y que contienen las porciones de la secuencia que codifica el anticuerpo, la hibridación y la unión de esos oligonucleótidos, y después la amplificación por PCR de los oligonucleótidos unidos.

Alternativamente, un polinucleótido que codifica un anticuerpo puede generarse a partir de un ácido nucleico de una fuente adecuada. Si no se dispone de un clon que contiene un ácido nucleico que codifica un anticuerpo particular, pero se conoce la secuencia de la molécula de anticuerpo, puede sintetizarse químicamente u obtenerse a partir de una fuente adecuada un ácido nucleico que codifica la inmunoglobulina (por ejemplo, una biblioteca de ADNc de anticuerpos, o una biblioteca de ADNc generada a partir de, o ácido nucleico, preferentemente ARN poliA+, aislado de cualquier tejido o células que expresan el anticuerpo, tales como células de hibridoma seleccionadas para expresar un anticuerpo de la invención) por amplificación por PCR mediante el uso de cebadores sintéticos hibridables a los extremos 3' y 5' de la secuencia o por la clonación mediante el uso de una sonda de oligonucleótidos específica para la secuencia génica particular a identificar, por ejemplo, un clon de ADNc de una biblioteca de ADNc que codifica el anticuerpo. Los ácidos nucleicos amplificados generados por PCR pueden clonarse después en vectores de clonación replicables mediante el uso de cualquier método bien conocido en la técnica.

Una vez que se determina la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos correspondiente del anticuerpo, la secuencia de nucleótidos del anticuerpo puede manipularse mediante el uso de métodos bien conocidos en la técnica para la manipulación de secuencias de nucleótidos, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante, mutagénesis dirigida al sitio, PCR, etc. (véase, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook y otros, 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. y Ausubel y otros, eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y.), para generar anticuerpos que tienen una secuencia de aminoácidos diferente, por ejemplo para generar sustituciones, eliminaciones y/o inserciones de aminoácidos.

Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden estar en la forma de ARN, tales como ARNm, ARNhn, ARNt o cualquier otra forma, o en la forma de ADN, que incluyen, pero no se limitan a, ADNc y ADN genómico obtenidos mediante clonación o producidos sintéticamente, o cualquier combinación de los mismos. El ADN puede ser tricateranio, bicatenario o monocatenario, o cualquier combinación de los mismos. Cualquier porción de al menos una cadena de ADN o ARN puede ser la cadena codificante, también conocida como la cadena sentido, o puede ser la cadena no codificante, también conocida como cadena antisentido.

Las moléculas de ácido nucleico aisladas de la presente invención pueden incluir moléculas de ácido nucleico que comprenden un marco de lectura abierto (ORF), opcionalmente con uno o más intrones, por ejemplo, pero no se limitan a, al menos una porción especificada de al menos una CDR, como CDR1, CDR2 y/o CDR3 de al menos una cadena pesada o cadena ligera; moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia codificante de un anticuerpo anti-GD2 o una región variable; y moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos sustancialmente diferente de las descritas anteriormente pero que, debido a la degeneración del código genético, todavía codifican al menos un anticuerpo anti-GD2 como se describe en la presente descripción y/o como se conoce en la técnica.

La presente invención proporciona ácidos nucleicos aislados que se hibridan en condiciones de hibridación selectivas con un polinucleótido descrito en la presente descripción. Por tanto, los polinucleótidos de esta modalidad pueden usarse para aislar, detectar y/o cuantificar ácidos nucleicos que comprenden dichos polinucleótidos. Por ejemplo, los polinucleótidos de la presente invención pueden usarse para identificar, aislar o amplificar clones parciales o de longitud completa en una biblioteca depositada. En algunas modalidades, los polinucleótidos son secuencias genómicas o de ADNc aisladas, o de cualquier otra manera complementarias a, un ADNc de una biblioteca de ácidos nucleicos humanos o de mamífero.

Los ácidos nucleicos pueden comprender convenientemente secuencias además de un polinucleótido de la presente invención. Por ejemplo, puede insertarse un sitio de clonación múltiple que comprende uno o más sitios de restricción de endonucleasa en el ácido nucleico para ayudar en el aislamiento del polinucleótido. Además, pueden insertarse secuencias traducibles para ayudar en el aislamiento del polinucleótido traducido de la presente invención. Por ejemplo, una secuencia marcadora de hexahistidina proporciona un medio conveniente para purificar las proteínas de la presente invención. El ácido nucleico de la presente invención, que excluye la secuencia codificante, es opcionalmente un vector, adaptador o enlazador para la clonación y/o la expresión de un polinucleótido de la presente invención.

Pueden añadirse secuencias adicionales a dichas secuencias de clonación y/o expresión para optimizar su función en la clonación y/o la expresión, para ayudar en el aislamiento del polinucleótido o para mejorar la introducción del polinucleótido en una célula. El uso de vectores de clonación, vectores de expresión, adaptadores y enlazadores se conoce bien en la técnica. (Véase, por ejemplo, Ausubel, arriba; o Sambrook, arriba).

La presente invención proporciona además un vector que comprende cualquiera de las moléculas de ácido nucleico aisladas o purificadas descritas anteriormente, o los fragmentos de las mismas. Cualquiera de las moléculas de ácido nucleico anteriores, o los fragmentos de las mismas, puede clonarse en cualquier vector adecuado y puede usarse para transformar o transfectar cualquier huésped adecuado. La selección de vectores y los métodos para construirlos se conoce comúnmente por los expertos en la técnica y se describen en referencias técnicas generales (véase, en general, "Recombinant d Na Part D", Methods in Enzymology, Vol. 153, Wu y Grossman, eds., Academic Press (1987)). Convenientemente, el vector comprende secuencias reguladoras, tales como codones de iniciación y terminación de la transcripción y la traducción, que son específicas del tipo de huésped (por ejemplo, bacteria, hongo, planta o animal) en el que se va a introducir el vector, según sea apropiado y se tenga en cuenta en consideración si el vector es ADN o ARN. Preferentemente, el vector comprende secuencias reguladoras que son específicas del género del huésped. Con la máxima preferencia, el vector comprende secuencias reguladoras que son específicas de la especie del huésped.

Además del sistema de replicación y el ácido nucleico insertado, la construcción puede incluir uno o más genes marcadores, que permiten la selección de huéspedes transformados o transfectados. Los genes marcadores incluyen resistencia a biocidas, por ejemplo, resistencia a antibióticos, metales pesados, etc., complementación en un huésped auxotrófico para proporcionar prototrofia y similares.

Los vectores adecuados incluyen aquellos diseñados para la propagación y la expansión o para la expresión o ambos. Por ejemplo, se selecciona un vector de clonación del grupo que consiste en la serie pUC, la serie pBluescript (Stratagene, LaJolla, California), la serie pET (Novagen, Madison, Wisconsin), la serie pGEX (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) y la serie pEX (Clontech, Palo Alto, California). También pueden usarse vectores bacteriófagos, tales como áGt 10, AGT11, AZaplI (Stratagene), AEMBL4 y ANM1149. Los ejemplos de vectores de expresión en plantas incluyen pBI110, pBI101.2, pBI101.3, pBl121 y pBIN19 (Clontech). Los ejemplos de vectores de expresión animales incluyen pEUK-C1, pMAM y pMAMneo (Clontech). El sistema de clonación TOPO (Invitrogen, Carlsbad, California) también puede usarse de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

Un vector de expresión puede comprender un promotor nativo o no nativo vinculado operativamente a una molécula de ácido nucleico aislada o purificada como se describió anteriormente. La selección de promotores, por ejemplo, fuertes, débiles, inducibles, específicos a tejido y específicos al desarrollo, está dentro del conocimiento en la técnica. De manera similar, la combinación de una molécula de ácido nucleico, o un fragmento de la misma, como se describió anteriormente con un promotor, también está dentro de los conocimientos en la técnica.

Los vectores virales adecuados incluyen, por ejemplo, vectores retrovirales, vectores basados en parvovirus, por ejemplo, vectores basados en virus adenoasociados (AAV), vectores quiméricos adenovirales de Aa V y vectores basados en adenovirus, y vectores lentivirales, tales como vectores basados en virus del herpes simple (HSV). Estos vectores virales pueden prepararse mediante el uso de técnicas estándares de ADN recombinante que se describen en, por ejemplo, Sambrook y otros, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); y Ausubel y otros, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates y John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y. (1994).

Un vector retroviral se deriva de un retrovirus. El retrovirus es un virus de ARN capaz de infectar una amplia variedad de células huésped. Tras la infección, el genoma retroviral se integra en el genoma de su célula huésped y se replica junto con el<a>D<n>de la célula huésped, lo que produce de esta manera constantemente ARN viral y cualquier secuencia de ácido nucleico incorporada al genoma retroviral. Como tal, puede lograrse la expresión a largo plazo de uno o más factores terapéuticos cuando se usa retrovirus. Los retrovirus contemplados para su uso en la terapia génica son relativamente no patógenos, aunque existen retrovirus patógenos. Cuando se emplean retrovirus patógenos, por ejemplo, virus de inmunodeficiencia humana (VIH) o virus linfotróficos de linfocitos T humanos (HTLV), se debe tener cuidado al alterar el genoma viral para eliminar la toxicidad para el huésped. Adicionalmente, puede manipularse un vector retroviral para hacer que el virus tenga una replicación deficiente. Como tales, los vectores retrovirales se consideran particularmente útiles para la transferencia estable de genes in vivo. Los vectores lentivirales, tales como los vectores basados en VIH, son ilustrativos de vectores retrovirales usados para la administración de genes. A diferencia de otros retrovirus, se sabe que los vectores basados en el VIH incorporan sus genes pasajeros en células que no se dividen y, por lo tanto, pueden ser útiles en el tratamiento de formas persistentes de enfermedades.

Opcionalmente, la molécula de ácido nucleico aislada o purificada, o el fragmento de la misma, tras su unión con otra molécula de ácido nucleico, puede codificar una proteína de fusión. La generación de proteínas de fusión está dentro de los conocimientos habituales en la técnica y puede implicar el uso de enzimas de restricción o técnicas de clonación recombinante (véase, por ejemplo, Gateway.TM. (Invitrogen)). Véase, también, la patente de Estados Unidos núm. 5,314,995.

En vista de lo anterior, la presente invención también proporciona una composición que comprende una molécula de ácido nucleico aislada o purificada descrita anteriormente, opcionalmente en forma de un vector. La composición puede comprender otros componentes como se describe más detalladamente en la presente descripción.

También en vista de lo anterior, la presente invención proporciona una célula huésped que comprende una molécula de ácido nucleico aislada o purificada descrita anteriormente, opcionalmente en forma de un vector. Lo más preferible es que la célula de la presente invención exprese el vector, de manera que el oligonucleótido o el fragmento del mismo, sea transcrito y traducido eficientemente por la célula. Los ejemplos de células incluyen, pero no se limitan a, una célula humana, una línea de células humanas, E. coli (por ejemplo, E. coli TB-1, TG-2, DH5a, XL-Blue MRF' (Stratagene), SA2821 y Y1090), B. subtilis, P. aerugenosa, S. cerevisiae, N. crassa, células de insecto (por ejemplo, Sf9, Ea4) y otras establecidas en la presente descripción más abajo. La célula huésped puede estar presente en un huésped, que puede ser un animal, tal como un mamífero, en particular un ser humano.

El término "polipéptido" se usa en la presente descripción como un término genérico para referirse a la proteína nativa, los fragmentos, o los análogos de una secuencia de polipéptido. Por lo tanto, los fragmentos de proteínas nativas, y los análogos son especies del género polipéptido. Los polipéptidos de acuerdo con la invención comprenden las cadenas pesadas de las moléculas de inmunoglobulina representadas en las SEQ ID NO: 1, 2, 4, 7, 8 y las cadenas ligeras de las moléculas de inmunoglobulina representadas en las SEQ ID NO: 2, 5, 6, así como también las moléculas de anticuerpo formadas por combinaciones que comprenden la cadena pesada de las moléculas de inmunoglobulina con la cadena ligera de las moléculas de inmunoglobulina, tales como la cadena ligera de las moléculas de inmunoglobulina kappa, y viceversa, así como también fragmentos y análogos de las mismas.

En una modalidad específica, mediante el uso de técnicas de ADN recombinante de rutina, una o más de las CDR identificadas en la presente descripción pueden insertarse dentro de las regiones de marco estructural. Las regiones de marco estructural pueden ser de origen natural o regiones de marco estructural consenso y preferentemente regiones de marco estructural humanas (véase, por ejemplo, Chothia y otros, J. Mol. Biol. 278: 457-479 (1998) para un listado de regiones de marco estructural humanas). Preferentemente, el polinucleótido generado por la combinación de las regiones de marco estructural y las CDR codifica un anticuerpo que se une específicamente a GD2. Pueden hacerse una o más sustituciones de aminoácidos dentro de las regiones de marco estructural, y, preferentemente, las sustituciones de aminoácidos mejoran la unión del anticuerpo a su antígeno. Adicionalmente, tales métodos pueden usarse para realizar sustituciones o eliminaciones de aminoácidos de uno o más residuos de cisteína de la región variable que participan en un enlace disulfuro intracadena para generar moléculas de anticuerpo que carecen de uno o más enlaces disulfuro intracadena. La presente invención abarca otras alteraciones del polinucleótido y están dentro de los conocimientos de la técnica.

Los anticuerpos completamente humanos son particularmente convenientes para el tratamiento terapéutico de los pacientes humanos. Los anticuerpos humanos pueden hacerse por una variedad de métodos conocidos en la técnica que incluyen métodos de presentación en fagos descritos anteriormente mediante el uso de bibliotecas de anticuerpos derivados de secuencias de inmunoglobulina humana. Véase, además, las patentes de Estados Unidos núms. 4,444,887 y 4,716,111; y las publicaciones del PCT núms. WO 98/46645, WO 98/60433, WO 98/24893, WO 98/16664, WO 96/34096, WO 96/33735, y WO 91/10741. Las técnicas de Cole y otros, y Boerder y otros, están también disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole y otros, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Riss, (1985); y Boerner y otros, J. Immunol., 147(1):86-95, (1991)).

Los anticuerpos humanos producidos mediante el uso de otras técnicas pero que conservan las regiones variables del anticuerpo anti-GD2 de la presente invención son parte de esta invención. Los anticuerpos humanos pueden producirse además mediante el uso de ratones transgénicos que son incapaces de expresar inmunoglobulinas de ratón endógenas funcionales, pero que pueden expresar genes de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, los complejos de genes de las cadenas pesada y ligera humanas de inmunoglobulina pueden introducirse por recombinación homóloga o aleatoriamente en las células madre embrionarias de ratón. Alternativamente, la región variable, la región constante y la región de diversidad humana pueden introducirse en las células madre embrionarias de ratón adicionalmente a los genes de las cadenas pesada y ligera humanas. Los genes de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina de ratón pueden obtenerse no funcional por separado o simultáneamente con la introducción de loci de inmunoglobulina humana por recombinación homóloga. En particular, la eliminación homocigótica del gen de la región JH evita la producción de anticuerpos endógenos. Las células madre embrionarias modificadas se expanden y microinyectan en blastocistos para producir ratones quiméricos. Los ratones quiméricos se reproducen después para producir crías homocigotas que expresan anticuerpos humanos. Los ratones transgénicos se inmunizan de manera normal con un antígeno seleccionado, por ejemplo, todo o una porción de un polipéptido de la invención. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno pueden obtenerse de los ratones transgénicos inmunizados, mediante el uso de tecnología de hibridoma convencional. Los transgenes de inmunoglobulina humana albergados en los ratones transgénicos se reordenan durante la diferenciación de linfocitos B, y subsecuentemente experimentan el cambio de clase y la mutación somática. Por lo tanto, mediante el uso de una técnica de ese tipo, es posible producir anticuerpos IgG, IgA, IgM e IgE terapéuticamente útiles. Para una visión general de esta tecnología para producir anticuerpos humanos, véase Lonberg y Huszar, Int. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995). Para un análisis detallado de esta tecnología para producir anticuerpos humanos y anticuerpos humanos monoclonales y los protocolos para producir tales anticuerpos, véase, por ejemplo, las publicaciones del PCT núms. WO 98/24893; WO 92/01047; W<o>96/34096; WO 96/33735; la patente europea núm. 0 598 877; las patentes de Estados Unidos núms. 5,413,923; 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661,016; 5,545,806; 5,814,318; 5,886,793; 5,916,771; y 5,939,598. Adicionalmente, las compañías tales como Abgenix, Inc. (Freemont, California), Genpharm (San José, California) y Medarex, Inc. (Princeton, Nueva Jersey) pueden contratarse para proporcionar anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno seleccionado mediante el uso de una tecnología similar a la que se describió anteriormente.

También podrían producirse MoAb humanos al inmunizar ratones trasplantados con leucocitos, esplenocitos o médula ósea de sangre periférica humana (por ejemplo, técnicas de Trioma de XTL). Pueden generarse anticuerpos completamente humanos que reconocen un epítopo seleccionado mediante el uso de una técnica referida como la "selección guiada". En este enfoque un anticuerpo monoclonal no humano seleccionado, por ejemplo, un anticuerpo de ratón, se usa para guiar la selección de un anticuerpo completamente humano que reconoce el mismo epítopo. (Jespers y otros, Bio/technology 12:899-903 (1988)).

Como se usa en la presente descripción, un "anticuerpo anti-GD2", una "porción de anticuerpo anti-GD2" o un "fragmento de anticuerpo anti-GD2" y/o una "variante de anticuerpo anti-GD2" y similares incluyen cualquier proteína o péptido que contiene la molécula que comprende al menos una porción de una molécula de inmunoglobulina, que contiene al menos una región determinante de complementariedad (CDR) de una cadena pesada o ligera o una porción de unión al ligando de las mismas que se deriva de cualquiera de los anticuerpos monoclonales quiméricos o humanizados descritos en la presente descripción, en combinación con una región variable de la cadena pesada o de la cadena ligera, una región constante de la cadena pesada o la cadena ligera, una región de marco estructural, o cualquier porción de las mismas, de origen no murino, preferentemente de origen humano, que puede incorporarse en un anticuerpo de la presente invención. Alternativamente, el término "anticuerpo anti-GD2" se referirá colectiva o individualmente al anticuerpo quimérico ch3F8-IgG1, ch3F8-IgG4, anticuerpos monoclonales humanizados hu3F8-H1L1-IgG1, hu3F8H1L2-IgG1, hu3F8H2L1-IgG1, hu3F8-H2L2-IgG1, hu3F8-H1L1-IgG1n, hu3F8-H1L1-IgG4, hu3F8-H3L3, hu3F8-H1L1S, hu3F8-H3L3S, anticuerpos huH1-I-gamma-1, huH3-I-gamma-1, hu3F8-IgG1-DEL, así como también fragmentos y regiones de los mismos. Dicho anticuerpo es capaz de modular, disminuir, antagonizar, mitigar, aliviar, bloquear, inhibir, anular y/o interferir con al menos una función celular in vitro, in situ y/o in vivo, en donde dicha célula expresa GD2. Como ejemplo no limitante, un anticuerpo anti-GD2 adecuado, una porción especificada o una variante de la presente invención pueden unirse con alta afinidad a un epítopo de GD2 humano.

El término "anticuerpo" pretende abarcar además anticuerpos, fragmentos de digestión, porciones específicas y variantes de los mismos, que incluyen miméticos de anticuerpos o que comprenden porciones de anticuerpos que imitan la estructura y/o la función de un anticuerpo o un fragmento o una porción especificada del mismo, que incluyen anticuerpos de cadena sencilla y fragmentos de los mismos, que contienen cada uno al menos una CDR derivada de un anticuerpo anti-GD2. Los fragmentos funcionales incluyen fragmentos de unión al antígeno que se unen a un GD2 de mamífero. Por ejemplo, la invención abarca fragmentos de anticuerpos capaces de unirse a GD2 o porciones de los mismos, que incluyen, pero no se limitan a, Fab (por ejemplo, mediante digestión con papaína), Fab' (por ejemplo, mediante digestión con pepsina y reducción parcial) y F(ab')2 (por ejemplo, mediante digestión con pepsina), facb (por ejemplo, mediante digestión con plasmina), pFc' (por ejemplo, mediante digestión con pepsina o plasmina), Fd (por ejemplo, mediante digestión con pepsina, reducción parcial y reagregación), fragmentos Fv o scFv (por ejemplo, mediante técnicas de biología molecular) (véase, por ejemplo, Colligan, Immunology, arriba).

Los fragmentos de anticuerpos pueden producirse mediante técnicas de escisión enzimática, sintéticas o recombinantes, como se conocen en la técnica y/o como se describen en la presente descripción. Los anticuerpos pueden producirse, además, en una variedad de formas truncadas mediante el uso de los genes de anticuerpos en los cuales uno o más codones de parada se han introducido aguas arriba del sitio de parada natural. Por ejemplo, una combinación de genes que codifica una porción de la cadena pesada F(ab')2 puede diseñarse para incluir secuencias de ADN que codifican el dominio CH1 y/o la región bisagra de la cadena pesada. Las diversas porciones de anticuerpos pueden unirse químicamente mediante técnicas convencionales o pueden prepararse como una proteína contigua mediante el uso de técnicas de ingeniería genética.

Como se usan en la presente descripción, los anticuerpos "quiméricos" o anticuerpos "humanizados" o "injertados con CDR" incluyen cualquier combinación de los Ab anti-GD2 descritos en la presente descripción, o cualquier CDR derivada de los mismos combinados con una o más proteínas o péptidos derivados de un anticuerpo no murino, preferentemente, anticuerpo humano. De acuerdo con la invención, los anticuerpos quiméricos o humanizados incluyen aquellos en donde las CDR derivan de uno o más de los Ab anti-GD2 descritos en la presente descripción y al menos una porción o el resto del anticuerpo derivan de uno o más anticuerpos humanos. Por tanto, la parte humana del anticuerpo puede incluir la estructura, los dominios C<l>, C<h>(por ejemplo, C<h1>, C<h2>, C<h3>), las regiones bisagra, (V<l>, V<h>)) que son sustancialmente no inmunogénicos en humanos. No es necesario que las regiones del anticuerpo que se derivan de anticuerpos humanos tengan una identidad del 100 % con los anticuerpos humanos. En una modalidad preferida, se retienen tantos residuos de aminoácidos humanos como sea posible para que la inmunogenicidad sea insignificante, pero los residuos humanos pueden modificarse según sea necesario para soportar el sitio de unión al antígeno formado por las CDR y al mismo tiempo maximizar la humanización del anticuerpo. Dichos cambios o variaciones opcional y preferentemente retienen o reducen la inmunogenicidad en seres humanos u otras especies con relación a los anticuerpos no modificados. Se señala que un anticuerpo humanizado puede producirse por un animal no humano o una célula procariota o eucariota que sea capaz de expresar genes de inmunoglobulina humana funcionalmente reordenados (por ejemplo, cadena pesada y/o cadena ligera). Además, cuando el anticuerpo es un anticuerpo de cadena sencilla, puede comprender un péptido enlazador que no se encuentra en los anticuerpos humanos nativos. Por ejemplo, un Fv puede comprender un péptido enlazador, tal como de dos a aproximadamente veinte residuos de glicina u otros residuos de aminoácidos, preferentemente de 8-15 residuos de glicina u otros residuos de aminoácidos, que conecta la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera. Se considera que tales péptidos enlazadores son de origen humano.

La humanización de anticuerpos puede realizarse, por ejemplo, al sintetizar una biblioteca combinatoria que comprende las seis CDR de un anticuerpo monoclonal diana no humano fusionadas en estructura con un conjunto de estructuras humanas individuales. Puede usarse una biblioteca de estructuras humanas que contenga genes representativos de todos los genes de la línea germinal humana de las cadenas ligera y pesada conocidos. Las bibliotecas combinatorias resultantes pueden entonces seleccionarse para determinar su unión a los antígenos de interés. Este enfoque puede permitir la selección de las combinaciones más favorables de estructuras completamente humanas en términos de mantener la actividad de unión al anticuerpo parental. Los anticuerpos humanizados pueden optimizarse aún más mediante una variedad de técnicas.

La humanización de anticuerpos puede usarse para convertir anticuerpos de ratón u otros anticuerpos no humanos en anticuerpos "completamente humanos". El anticuerpo resultante contiene solo secuencia humana y ninguna secuencia de anticuerpo de ratón o no humano, al mantener al mismo tiempo una afinidad y especificidad de unión similares a las del anticuerpo inicial.

Para moléculas de anticuerpo de longitud completa, los genes de inmunoglobulina pueden obtenerse a partir de ADN genómico o ARNm de líneas de células de hibridoma. Las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos se clonan en un sistema de vector de mamífero. El ensamble se documenta con análisis de secuencia de doble cadena. La construcción de anticuerpo puede expresarse en otras líneas de células huésped humanas o de mamíferos. Luego, la construcción puede validarse mediante ensayos de transfección transitoria y análisis de inmunoelectrotransferencia del anticuerpo expresado de interés. Las líneas de células estables con la mayor productividad pueden aislarse y examinarse mediante el uso de métodos de ensayo rápidos.

Al menos un anticuerpo anti-GD2 de la presente invención puede producirse opcionalmente mediante una línea de células, una línea de células mixta, una célula inmortalizada o una población clonal de células inmortalizadas, como se conoce bien en la técnica. Véase, por ejemplo, Ausubel y otros, ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1987-2001); Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Harlow y Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). Colligan y otros, eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan y otros, Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001).

En un enfoque, un hibridoma se produce al fusionar una línea de células inmortales adecuada (por ejemplo, una línea de células de mieloma tal como, pero sin limitarse a, Sp2/0, Sp2/0-AG14, NSO, NS1, NS2, AE-1, L.5, >243, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SS1, Sp2 SA5, U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI, NIH 3T3, HL-60, MLA 144, NAMAIWA, NEURO 2A), o similares, o heteromilomas, productos de fusión de los mismos, o cualquier célula o célula de fusión derivadas de los mismos, o cualquier otra línea de células adecuada conocida en la técnica. Véase, por ejemplo, www.atcc.org,www.lifetech.com., y similares, con células que producen anticuerpos, tales como, pero sin limitarse a, células de bazo, sangre periférica, linfa, amígdala u otros sistemas inmunitarios o células que contienen linfocitos B aisladas o clonadas, o cualquier otra célula que exprese secuencias de CDR o estructuras o variables o constantes de las cadenas pesadas o ligeras, ya sea como ácido nucleico endógeno o heterólogo, como recombinante o endógeno, viral, bacteriano, algal, procariota, anfibio, insecto, reptil, peces, mamíferos, roedores, equinos, ovinos, caprinos, ovinos, primates, eucariotas, ADN genómico, ADNc, ADNr, ADN o ARN mitocondrial, A<d>N o ARN de cloroplasto, ARNhn, ARNm, ARNt, de cadena sencilla, doble o triple, hibridados, y similares o cualquier combinación de los mismos. Véase, por ejemplo, Ausubel, arriba, y Colligan, Immunology, arriba, capítulo 2.

También puede usarse cualquier otra célula huésped adecuada para expresar ácido nucleico heterólogo o endógeno que codifica un anticuerpo, fragmento específico o variante del mismo, de la presente invención. Las células fusionadas (hibridomas) o células recombinantes pueden aislarse mediante el uso de condiciones de cultivo selectivas u otros métodos conocidos adecuados, y clonarse mediante dilución limitante o clasificación celular, u otros métodos conocidos. Las células que producen anticuerpos con la especificidad deseada pueden seleccionarse mediante un ensayo adecuado (por ejemplo, ELISA).

Los anticuerpos de la presente invención también pueden prepararse mediante el uso de al menos un anticuerpo anti-GD2 que codifica ácido nucleico para proporcionar animales o mamíferos transgénicos, tales como cabras, vacas, caballos, ovejas y similares, que produzcan dichos anticuerpos en su leche. Estos animales pueden proporcionarse mediante el uso de métodos conocidos. Véase, por ejemplo, pero sin limitarse a, las patentes de Estados Unidos núms. 5,827,690; 5,849,992; 4,873,316; 5,849,992; 5,994,616, 5,565,362; 5,304,489, y similares.

Los anticuerpos de la presente invención pueden prepararse adicionalmente mediante el uso de al menos un ácido nucleico que codifica anticuerpo anti-GD2 para proporcionar plantas transgénicas y células vegetales cultivadas (por ejemplo, pero sin limitarse a, tabaco y maíz) que producen dichos anticuerpos, porciones o variantes específicas en las partes de plantas o en células cultivadas a partir de ellas. Como un ejemplo no limitante, se han usado con éxito hojas de tabaco transgénicas que expresan proteínas recombinantes para proporcionar grandes cantidades de proteínas recombinantes, por ejemplo, mediante el uso de un promotor inducible. Véase, por ejemplo, Cramer y otros, Curr. Top. Microbol. Immunol. 240:95-118 (1999) y las referencias citadas en esta. Además, se ha usado maíz transgénico para expresar proteínas de mamíferos a niveles de producción comercial, con actividades biológicas equivalentes a las producidas en otros sistemas recombinantes o purificadas a partir de fuentes naturales. Véase, por ejemplo, Hood y otros, Adv. Exp. Med. Biol. 464:127-147 (1999) y las referencias citadas en esta. Los anticuerpos también pueden producirse en grandes cantidades a partir de semillas de plantas transgénicas, que incluyen fragmentos de anticuerpos, tales como anticuerpos de cadena sencilla (scFv), que incluyen semillas de tabaco y tubérculos de patata. Véase, por ejemplo, Conrad y otros, Plant Mol. Biol. 38:101-109 (1998) y las referencias citadas en esta. Por tanto, los anticuerpos de la presente invención también pueden producirse mediante el uso de plantas transgénicas, de acuerdo con métodos conocidos. Véase también, por ejemplo, Fischer y otros, Biotechnol. Appl. Biochem. 30:99-108 (Octubre de 1999), Ma y otros, Trends Biotechnol. 13:522-7 (1995); Ma y otros, Plant Physiol. 109:341-6 (1995); Whitelam y otros, Biochem Soc. Trans. 22:940-944 (1994); y las referencias citadas en esta.

Un anticuerpo anti-GD2 puede recuperarse y purificarse a partir de cultivos celulares recombinantes mediante los métodos conocidos que incluyen, pero no se limitan a, purificación con proteína A, purificación con proteína G, precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacciones hidrófobas, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatita y cromatografía de lectina. La cromatografía líquida de alta resolución ("HPLC") puede emplearse para la purificación. Véase, por ejemplo, Colligan, Current Protocols in Immunology, o Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001), por ejemplo, capítulos 1, 4, 6, 8, 9 y 10.

Los anticuerpos de la presente invención incluyen productos purificados naturalmente, productos de procedimientos de síntesis química y productos producidos mediante técnicas recombinantes a partir de un huésped eucariótico, que incluyen, por ejemplo, células de levadura, plantas superiores, insectos y mamíferos. En dependencia del huésped empleado en un procedimiento de producción recombinante, el anticuerpo de la presente invención puede estar glicosilado o no glicosilado, se prefiere el glicosilado. Dichos métodos se describen en muchos manuales de laboratorio estándar, tales como Sambrook, arriba, Secciones 17,37-17,42; Ausubel, arriba, Capítulos 10, 12, 13, 16, 18 y 20, Colligan, Protein Science, arriba, Capítulos 12-14.

Los anticuerpos purificados pueden caracterizarse mediante, por ejemplo, ELISA, ELISPOT, citometría de flujo, inmunocitología, análisis de Biacore™, ensayo de exclusión cinética Sapidyne KinExA™, SDS-PAGE y inmunoelectrotransferencia, o mediante análisis HPLC, así como también mediante otros ensayos funcionales descritos en la presente descripción.

Un vector de expresión típico de mamífero contiene al menos un elemento promotor, que media en el inicio de la transcripción del ARNm, la secuencia codificante del anticuerpo y las señales necesarias para la terminación de la transcripción y la poliadenilación del transcrito. Los elementos adicionales incluyen potenciadores, secuencias de Kozak y secuencias intermedias flanqueadas por sitios donantes y aceptores para el corte y empalme de ARN. Puede lograrse una transcripción altamente eficiente con los promotores tempranos y tardíos de SV40, las repeticiones terminales largas (LTRS) de retrovirus, por ejemplo, RSV, HTLVI, VIHI y el promotor temprano del citomegalovirus (CMV). Sin embargo, también pueden usarse elementos celulares (por ejemplo, el promotor de actina humana). Los vectores de expresión adecuados para su uso en la práctica de la presente invención incluyen, por ejemplo, vectores tales como pIRES1neo, pRetro-Off, pRetro-On, PLXSN o pLNCX (Clonetech Labs, Palo Alto, California), pcDNA3.1 (+/-), pcDNA/Zeo (+/-) o pcDNA3.1/Hygro (+/-) (Invitrogen),<p>S<v>L y PMSG (Pharmacia, Uppsala, Suecia), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) y pBC12MI (ATCC 67109). Las células huésped de mamífero que podrían usarse incluyen células humanas Hela 293, H9 y Jurkat, células NIH3T3 y C127 de ratón, Cos 1, Cos 7 y CV 1, células QC1-3 de codorniz, células L de ratón y células de ovario de hámster chino (CHO).

Alternativamente, el gen puede expresarse en líneas de células estables que contienen el gen integrado en un cromosoma. La cotransfección con un marcador seleccionable tales como DHFR, GPT, neomicina o higromicina permite la identificación y el aislamiento de las células transfectadas.

El gen transfectado también puede amplificarse para expresar grandes cantidades del anticuerpo codificado. El marcador DHFR (dihidrofolato reductasa) es útil para desarrollar líneas de líneas de células que portan varios cientos o incluso miles de copias del gen de interés. Otro marcador de selección útil es la enzima glutamina sintasa (GS) (Murphy y otros, Biochem. J. 227:277-279 (1991); Bebbington y otros, Bio/Technology 10:169-175 (1992)). Mediante el uso de estos marcadores, las células de mamíferos se cultivan en medio selectivo y se seleccionan las células con mayor resistencia. Estas líneas de células contienen el gen o los genes amplificados integrados en un cromosoma. Las células de ovario de hámster chino (CHO) y NSO se usan a menudo para la producción de anticuerpos.

De acuerdo con la presente invención, los anticuerpos anti-GD2 comprenden cualquiera de los anticuerpos ch3F8-IgG1, ch3F8-IgG4, hu3F8-H1L1-IgG1, hu3F8-H1L2-IgG1, hu3F8-H2L1-IgG1, hu3F8-H2L2-IgG1, hu3F8-H1L1-IgG1n, hu3F8-H1L1-IgG4, hu3F8-H3L3, hu3F8-H1L1S, hu3F8-H3L3S, huH1I-gamma-1, huH3I-gamma-1, hu3F8-IgG1-DEL o un anticuerpo en el que la región variable o CDR se derivan de cualquiera de ch3F8-IgG1, ch3F8-IgG4, hu3F8-H1L1-IgG1, hu3F8-H1L2-IgG1, hu3F8-H2L1-IgG1, hu3F8-H2L2-IgG1, hu3F8-H1L1-IgG1n, hu3F8-H1L1-IgG4, hu3F8-H3L3, hu3F8-H1L1S, hu3F8-H3L3S, huH1I-gamma1, huH3I-gamma 1, hu3F8-IgG1-DEL y las regiones de marco estructural y constantes del anticuerpo se derivan de uno o más anticuerpos humanos. La región variable o las CDR derivadas del anticuerpo preferentemente tienen de aproximadamente 90 % a aproximadamente 100 % de identidad con la región variable o las CDR de cualquiera de ch3F8-IgG1, ch3F8-IgG4, hu3F8-H1L1-IgG1, hu3F8-H1L2-IgG1, hu3F8-H2L1-IgG1, hu3F8-H2L2-IgG1, hu3F8-H1L1-IgG1n, hu3F8-H1L1-IgG4, hu3F8-H3L3, hu3F8-H1L1S, hu3F8-H3L3S, huH1I-gamma1, huH3I-gamma1, hu3F8-IgG1-DEL aunque se contemplan todas y cada una de las modificaciones, que incluyen sustituciones, inserciones y eliminaciones, ya sea por mutación natural o por manipulación humana, siempre que el anticuerpo mantenga la capacidad de unirse a GD2. Las regiones de los anticuerpos quiméricos, humanizados o injertados con CDR que se derivan de anticuerpos humanos no necesitan tener una identidad de 100 % con los anticuerpos humanos. En una modalidad preferida, se retienen tantos residuos de aminoácidos humanos como sea posible para que la inmunogenicidad sea insignificante, pero los residuos humanos, en particular los residuos de la región de marco estructural, se sustituyen según sea necesario y como se enseña en la presente descripción más abajo de acuerdo con la presente invención. Tales modificaciones que se describen en la presente descripción son necesarias para respaldar el sitio de unión al antígeno formado por las CDR y al mismo tiempo maximizar la humanización del anticuerpo.

Las secuencias de aminoácidos que son sustancialmente iguales a las secuencias descritas en la presente descripción incluyen secuencias que comprenden sustituciones de aminoácidos conservadoras, así como también eliminaciones y/o inserciones de aminoácidos. Una sustitución de aminoácidos conservadora se refiere a la sustitución de un primer aminoácido por un segundo aminoácido que tiene propiedades químicas y/o físicas (por ejemplo, carga, estructura, polaridad, hidrofobicidad/hidrofilicidad) que son similares a aquellas del primer aminoácido. Las sustituciones conservadoras incluyen la sustitución de un aminoácido por otro dentro de los siguientes grupos: lisina (K), arginina (R) e histidina (H); aspartato (D) y glutamato (E); asparagina (N), glutamina (Q), serina (S), treonina (T), tirosina (Y), K, R, H, D y E; alanina (A), valina (V), leucina (L), isoleucina (I), prolina (P), fenilalanina (F), triptófano (W), metionina (M), cisteína (C) y glicina (G); F, W e Y; C, S y T.

Por supuesto, el número de sustituciones de aminoácidos que haría un experto en la técnica depende de muchos factores, que incluyen los descritos anteriormente. Generalmente, el número de sustituciones, inserciones o eliminaciones de aminoácidos para cualquier anticuerpo anti-GD2, fragmento o variante no será superior a 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, tal como 1-30 o cualquier intervalo o valor allí, como se especifica en la presente descripción.

Los aminoácidos en un anticuerpo anti-GD2 de la presente invención que son esenciales para su función pueden identificarse mediante métodos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis de exploración de alanina (por ejemplo, Ausubel, arriba, Capítulos 8, 15; Cunningham y Wells, Science 244:1081-1085 (1989)). El último procedimiento introduce mutaciones únicas de alanina en cada residuo de la molécula. Las moléculas mutantes resultantes luego se prueban para determinar su actividad biológica, tal como, pero sin limitarse a, al menos la unión a GD2. Los sitios que son críticos para la unión de anticuerpos también pueden identificarse mediante análisis estructurales como la cristalización, la resonancia magnética nuclear o el marcaje de fotoafinidad (Smith y otros, J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992) y de Vos y otros, Science 255:306-312 (1992)).

Un anticuerpo anti-GD2 puede comprender además opcionalmente un polipéptido de al menos uno de 70-100 % de los aminoácidos contiguos de las CDR derivadas de al menos una de las secuencias descritas en la presente descripción.

En una modalidad, la secuencia de aminoácidos de una cadena de inmunoglobulina, o la porción de la misma (por ejemplo, región variable, CDR) tiene aproximadamente un 70-100 % de identidad (por ejemplo, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 o cualquier intervalo o valor allí) a la secuencia de aminoácidos de al menos una secuencia en las Tablas 1-4.

En la presente descripción se proporcionan secuencias ilustrativas de regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera. Los anticuerpos de la presente invención, o las variantes especificadas de los mismos, pueden comprender cualquier número de residuos de aminoácidos contiguos de un anticuerpo de la presente invención, en donde ese número se selecciona del grupo de números enteros que consiste en 10-100 % del número de residuos contiguos en un anticuerpo anti-GD2. Opcionalmente, esta subsecuencia de aminoácidos contiguos es al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250 o más aminoácidos de longitud, o cualquier intervalo o valor del mismo. Además, el número de dichas subsecuencias puede ser cualquier número entero que se selecciona del grupo que consiste en 1 a 20, tal como al menos 2, 3, 4 o 5.

De acuerdo con la presente invención, las secuencias de ácidos nucleicos expuestas en las SEQ ID NO: 11-22 y las secuencias de aminoácidos deducidas de las regiones variables (cadena ligera y pesada) de los anticuerpos anti-GD2 se exponen en las SEQ ID NO:1-10. Cada una de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contiene tres CDR que se combinan para formar el sitio de unión al antígeno. Las tres CDR están rodeadas por cuatro regiones de marco estructural que funcionan principalmente para apoyar a las CDR. Las secuencias de las CDR dentro de las secuencias de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera pueden identificarse mediante alineación asistida por computadora de acuerdo con Kabat y otros, (1987) en Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4a edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de Estados Unidos, Imprenta del Gobierno de Estados Unidos, Washington, D.C., o mediante modelado molecular de las regiones variables, por ejemplo con el uso del programa ENCAD como se describió en Levitt (1983) J. Mol. Biol. 168:595.

Los genes humanos que codifican las regiones constantes (C) de los anticuerpos, los fragmentos y las regiones humanizados de la presente invención pueden derivarse de una biblioteca de hígado fetal humano, mediante métodos conocidos. Los genes de la región C humana pueden derivarse de cualquier célula humana, que incluyen aquellas que expresan y producen inmunoglobulinas humanas. La región C<h>humana puede derivarse de cualquiera de las clases o los isotipos conocidos de las cadenas H humanas, que incluyen gamma, mu, alfa, delta, épsilon y subtipos de las mismas, tales como G1, G2, G3 y G4. Dado que el isotipo de la cadena H es responsable de las diversas funciones efectoras de un anticuerpo, la elección de la región C<h>estará guiada por las funciones efectoras deseadas, tales como la fijación del complemento o la actividad en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Preferentemente, la región C<h>se deriva de gamma 1 (IgG1) o gamma 4 (IgG4).

La región C<l>humana puede derivarse de cualquier isotipo de cadena L humana, kappa o lambda, preferentemente kappa.

Los genes que codifican las regiones C de la inmunoglobulina humana se obtienen a partir de células humanas mediante técnicas de clonación estándar (Sambrook y otros, (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) y Ausubel y otros, eds. Current Protocols in Molecular Biology (1987-1993)). Los genes de la región C humana están fácilmente disponibles a partir de clones conocidos que contienen genes que representan las dos clases de cadenas L, las cinco clases de cadenas H y las subclases de las mismas.

Las secuencias de las regiones variables del anticuerpo pueden modificarse mediante inserciones, sustituciones y eliminaciones en la medida en que el anticuerpo quimérico mantenga la capacidad de unirse a GD2 humano. El experto habitual en la técnica puede determinar el mantenimiento de esta actividad al realizar los ensayos funcionales que se describen en la presente descripción más abajo. Las regiones variables pueden tener, por ejemplo, de aproximadamente 50 % a aproximadamente 100 % de homología con las regiones variables identificadas más abajo. En una modalidad preferida, las regiones variables del anticuerpo tienen de aproximadamente 80 % a aproximadamente 100 % de homología con las regiones variables identificadas más abajo. En una modalidad más preferida, las regiones variables tienen de aproximadamente 90 % a aproximadamente 100 % de homología con las regiones variables identificadas más abajo.

En un aspecto específico, los Mab anti-GD2 preferidos de la descripción comprenden regiones variables de la cadena ligera que tienen 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de homología de secuencia de aminoácidos con secuencias identificadas en la presente descripción y además comprenden regiones variables de la cadena pesada que tienen 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de homología de secuencia de aminoácidos con las secuencias identificadas en la presente descripción.

Preferentemente, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo o una porción específica o una variante del mismo de la presente invención se unen a GD2 humano y, de esta manera, neutraliza parcial o sustancialmente una proteína o un fragmento de GD2 y, de esta manera, inhibe las actividades mediadas a través de GD2. Como se usa en la presente descripción, el término "anticuerpo neutralizante" se refiere a un anticuerpo que puede inhibir la actividad dependiente de GD2 en aproximadamente 20-120 %, preferentemente en al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 % o más en dependencia del ensayo. La capacidad de un anticuerpo anti-GD2 para inhibir una actividad dependiente de GD2 se evalúa preferentemente mediante al menos un ensayo adecuado, como se describe en la presente descripción y/o como se conoce en la técnica.

Como se indicó, la invención también se refiere a anticuerpos, fragmentos de unión al antígeno, cadenas de inmunoglobulina y CDR que comprenden aminoácidos en una secuencia que es sustancialmente la misma que una secuencia de aminoácidos descrita en la presente descripción. Dichos anticuerpos anti-GD2 pueden incluir una o más sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoácidos, ya sea por mutaciones naturales o por manipulación humana, como se especifica en la presente descripción. Preferentemente, dichos anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno y los anticuerpos que comprenden tales cadenas o las CDR pueden unirse a GD2 humano con alta afinidad. Como apreciarán los expertos en la técnica, la presente invención incluye al menos un anticuerpo biológicamente activo de la presente invención. Los anticuerpos biológicamente activos tienen una actividad específica de al menos 20 %, 30 % o 40 %, y preferentemente al menos 50 %, 60 % o 70 %, y con la máxima preferencia al menos 80 %, 90 % o 95 %-100 % de esta del anticuerpo nativo (no sintético), endógeno o relacionado y conocido. Los expertos en la técnica conocen bien los métodos para analizar y cuantificar medidas de actividad enzimática y especificidad de sustrato.

En otro aspecto, la invención se refiere a anticuerpos humanos y fragmentos de unión al antígeno, como se describe en la presente descripción, que se modifican mediante la unión covalente de un resto orgánico. Dicha modificación puede producir un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno con propiedades farmacocinéticas mejoradas (por ejemplo, mayor vida media sérica in vivo). El resto orgánico puede ser un grupo polimérico hidrófilo lineal o ramificado, un grupo de ácido graso o un grupo éster de ácido graso. En modalidades particulares, el grupo polimérico hidrófilo puede tener un peso molecular de aproximadamente 800 a aproximadamente 120000 dalton y puede ser un polialcanoglicol (por ejemplo, polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol (PPG)), polímero de carbohidrato, polímero de aminoácido o polivinilpirrolidona, y el ácido graso o el grupo éster de ácido graso puede comprender de aproximadamente ocho a aproximadamente cuarenta átomos de carbono.

Los anticuerpos modificados y los fragmentos de unión al antígeno de la invención pueden comprender uno o más restos orgánicos que están unidos covalente, directa o indirectamente al anticuerpo. Cada resto orgánico que está unido a un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de la invención puede ser independientemente un grupo polimérico hidrófilo, un grupo de ácido graso o un grupo éster de ácido graso. Como se usa en la presente descripción, el término "ácido graso" abarca ácidos monocarboxílicos y ácidos dicarboxílicos. Un "grupo polimérico hidrófilo", como se usa el término en la presente descripción, se refiere a un polímero orgánico que es más soluble en agua que en octano, por ejemplo, polilisina. Por tanto, la invención abarca un anticuerpo modificado mediante la unión covalente de polilisina. Los polímeros hidrófilos adecuados para modificar anticuerpos de la invención pueden ser lineales o ramificados e incluyen, por ejemplo, polialcanoglicoles (por ejemplo, PEG, monometoxi-polietilenglicol (mPEG), PPG y similares), carbohidratos (por ejemplo, dextrano, celulosa, oligosacáridos, polisacáridos y similares), polímeros de aminoácidos hidrófilos (por ejemplo, polilisina, poliarginina, poliaspartato y similares), óxidos de polialcano (por ejemplo, óxido de polietileno, óxido de polipropileno y similares) y polivinilpirrolidona. Preferentemente, el polímero hidrófilo que modifica el anticuerpo de la invención tiene un peso molecular de aproximadamente 800 a aproximadamente 150000 dalton como entidad molecular separada. Por ejemplo, pueden usarse PEG5000 y PEG20000, en donde el subíndice es el peso molecular promedio del polímero en dalton. El grupo polimérico hidrófilo puede estar sustituido con uno a aproximadamente seis grupos alquilo, ácido graso o éster de ácido graso. Los polímeros hidrófilos que están sustituidos con un ácido graso o un grupo éster de ácido graso pueden prepararse al emplear métodos adecuados. Por ejemplo, un polímero que comprende un grupo amino puede acoplarse a un carboxilato del ácido graso o éster de ácido graso, y puede acoplarse un carboxilato activado (por ejemplo, activado con N,N-carbonil diimidazol) sobre un ácido graso o un éster de ácido graso acoplados a un grupo hidroxilo en un polímero.

Los ácidos grasos y los ésteres de ácidos grasos adecuados para modificar los anticuerpos de la invención pueden estar saturados o pueden contener una o más unidades de insaturación. Los ácidos grasos que son adecuados para modificar los anticuerpos de la invención incluyen, por ejemplo, n-dodecanoato, n-tetradecanoato, n-octadecanoato, n-eicosanoato, n-docosanoato, n-triacontanoato, n-tetracontanoato, cis-.delta.9-octadecanoato, todos cis-.delta.5,8,11,14-eicosatetraenoato, ácido octanodioico, ácido tetradecanodioico, ácido octadecanodioico, ácido docosanodioico y similares. Los ésteres de ácidos grasos adecuados incluyen monoésteres de ácidos dicarboxílicos que comprenden un grupo alquilo inferior lineal o ramificado. El grupo alquilo inferior puede comprender de uno a aproximadamente doce, preferentemente de uno a aproximadamente seis átomos de carbono.

Los anticuerpos humanos modificados y los fragmentos de unión al antígeno pueden prepararse mediante el uso de métodos adecuados, tales como mediante la reacción con uno o más agentes modificadores. Un "agente modificador", como se usa el término en la presente descripción, se refiere a un grupo orgánico adecuado (por ejemplo, polímero hidrófilo, un ácido graso, un éster de ácido graso) que comprende un grupo activador. Un "grupo activador" es un resto químico o un grupo funcional que puede, en condiciones apropiadas, reaccionar con un segundo grupo químico que forma de esta manera un enlace covalente entre el agente modificador y el segundo grupo químico. Por ejemplo, los grupos activadores reactivos con amina incluyen grupos electrófilos tales como tosilato, mesilato, halo (cloro, bromo, fluoro, yodo), ésteres de N-hidroxisuccinimidilo (NHS) y similares. Los grupos activadores que pueden reaccionar con tioles incluyen, por ejemplo, maleimida, yodoacetilo, acrilolilo, disulfuros de piridilo, tiol del ácido 5-tiol-2-nitrobenzoico (TNB-tiol) y similares. Un grupo funcional aldehído puede acoplarse a moléculas que contienen amina o hidrazida, y un grupo azida puede reaccionar con un grupo fósforo trivalente para formar enlaces fosforamidato o fosforimida. Se conocen en la técnica métodos adecuados para introducir grupos activadores en moléculas (véase, por ejemplo, Hernanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, California (1996)). Un grupo activador puede estar unido directamente al grupo orgánico (por ejemplo, polímero hidrófilo, ácido graso, éster de ácido graso), o a través de un resto enlazador, por ejemplo, un grupo C1-C12 divalente en donde uno o más átomos de carbono pueden reemplazarse por un heteroátomo tal como oxígeno, nitrógeno o azufre. Los restos enlazadores adecuados incluyen, por ejemplo, tetraetilenglicol, —(CH2)3—, --NH--, por nombrar algunos. Los agentes modificadores que comprenden un resto enlazador pueden producirse, por ejemplo, al hacer reaccionar una mono-Boc-alquildiamina (por ejemplo, mono-Boc-etilendiamina, mono-Boc-diaminohexano) con un ácido graso en presencia de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) para formar un enlace amida entre la amina libre y el carboxilato de ácido graso. El grupo protector Boc puede eliminarse del producto mediante tratamiento con ácido trifluoroacético (TFA) para exponer una amina primaria que puede acoplarse a otro carboxilato como se describe, o puede hacerse reaccionar con anhídrido maleico y ciclar el producto resultante para producir un derivado de maleimido activado del ácido graso. (Véase, por ejemplo, Thompson y otros, documento núm. WO 92/16221).

Los anticuerpos modificados de la invención pueden producirse al hacer reaccionar un anticuerpo humano o un fragmento de unión al antígeno con un agente modificador. Por ejemplo, los restos orgánicos pueden unirse al anticuerpo de una manera no específica al sitio al emplear un agente modificador reactivo con amina, por ejemplo, un éster NHS de PEG. También pueden prepararse anticuerpos humanos modificados o fragmentos de unión al antígeno al reducir los enlaces disulfuro (por ejemplo, enlaces disulfuro intracadena) de un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno. El anticuerpo reducido o el fragmento de unión al antígeno pueden hacerse reaccionar luego con un agente modificador reactivo con tiol para producir el anticuerpo modificado de la invención. Los anticuerpos humanos modificados y los fragmentos de unión al antígeno que comprenden un resto orgánico que está unido a sitios específicos de un anticuerpo de la presente invención pueden prepararse mediante el uso de métodos adecuados, tales como proteólisis inversa (Fisch y otros, Bioconjugate Chem., 3:147-153 (1992); Werlen y otros, Bioconjugate Chem., 5:411-417 (1994); Kumaran y otros, Protein Sci. 6(10):2233-2241 (1997); Itoh y otros, Bioorg. Chem., 24(1): 59-68 (1996); Capellas y otros, Biotechnol. Bioeng., 56(4):456-463 (1997)), y los métodos descritos en Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, California. (1996).

Los anticuerpos de la invención pueden unirse a GD2 humano con un amplio intervalo de afinidades (K<d>) como se muestra más abajo.

La afinidad o la avidez de un anticuerpo por un antígeno pueden determinarse experimentalmente mediante el uso de cualquier método adecuado. (Véase, por ejemplo, Berzofsky y otros, "Antibody-Antigen Interactions," en Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: Nueva York, N.Y. (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H.

Freeman and Company: Nueva York, N.Y. (1992); y los métodos descritos en la presente descripción). La afinidad medida de una interacción particular antígeno-anticuerpo puede variar si se mide bajo condiciones diferentes (por ejemplo, concentración de sal, pH). Por lo tanto, las mediciones de la afinidad y otros parámetros de unión al antígeno se llevan a cabo preferentemente con las soluciones estandarizadas de anticuerpo y antígeno, y un amortiguador estandarizado, tal como el amortiguador descrito en la presente descripción.

Los anticuerpos anti-GD2 útiles en los métodos y las composiciones de la presente invención se caracterizan por unirse a GD2 y preferentemente tener baja toxicidad. En particular, es útil en la presente invención un anticuerpo, fragmento específico o variante de la invención, en el que los componentes individuales, tales como la región variable, la región constante y la estructura, individualmente y/o colectivamente, opcionalmente y preferentemente poseen baja inmunogenicidad. Los anticuerpos que pueden usarse en la invención se caracterizan opcionalmente por su capacidad para tratar pacientes durante períodos prolongados con un alivio mensurable de los síntomas y una toxicidad baja y/o aceptable. Una inmunogenicidad baja o aceptable y/o una alta afinidad, así como también otras propiedades adecuadas, pueden contribuir a los resultados terapéuticos conseguidos. "Baja inmunogenicidad" se define en la presente descripción como el aumento de respuestas HAHA, HACA o HAMA significativas en menos de aproximadamente 75 %, o preferentemente menos de aproximadamente 50 % de los pacientes tratados y/o el aumento de títulos bajos en el paciente tratado (Elliott y otros, Lancet 344:1125-1127 (1994)).

También pueden usarse anticuerpos biespecíficos, heteroespecíficos, heteroconjugados o similares que sean anticuerpos monoclonales, humanizados, que tengan especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes. En el presente caso, una de las especificidades de unión es para al menos una proteína GD2, la otra es para cualquier otro antígeno. Los métodos para preparar anticuerpos biespecíficos se conocen en la técnica.

Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la coexpresión de dos pares de cadenas pesadas-cadenas ligeras de inmunoglobulina, donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades (Milstein y Cuello, Nature 305:537 (1983)). Debido a la distribución aleatoria de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulinas, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpo diferentes, de las cuales sólo uno tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que se realiza habitualmente mediante las etapas de cromatografía de afinidad, es bastante engorrosa, y los rendimientos del producto son bajos. Se describen procedimientos similares, por ejemplo, en el documento núm. WO 93/08829, las patentes de Estados Unidos núms. 6,210,668, 6,193,967, 6,132,992, 6,106,833, 6,060,285, 6,037,453, 6,010,902, 5,989,530, 5,959,084, 5,959,083, 5,932,448, 5,833,985, 5,821,333, 5,807,706, 5,643,759, 5,601,819, 5,582,996, 5,496,549, 4,676,980, los documentos núms. WO 91/00360, WO 92/00373, EP 03089, Traunecker y otros, EMBO J. 10:3655 (1991), Suresh y otros, Methods in Enzymology 121:210 (1986); Chan y Carter, 2010, Nature Rev. 10, 301-316; Weiner y otros, 2010, Nature Rev. 10, 317-327

En determinadas modalidades, los anticuerpos que se unen a GD2 pueden usarse en forma no conjugada. En otras modalidades, los anticuerpos que se unen a GD2 pueden conjugarse, por ejemplo, con un marcador detectable, un fármaco, un profármaco o un isótopo.

En determinados métodos de la invención que se describen con más detalle más abajo, tales como métodos para detectar la expresión de GD2 en células o tejidos como una medida del potencial metastásico de las células tumorales, o como una forma de identificar carcinomas in situ (por ejemplo, DCIS o LCIS) en los tejidos, los anticuerpos anti-GD2 se conjugan con uno o más marcadores detectables. Para tales usos, los anticuerpos pueden marcarse de manera detectable mediante unión covalente o no covalente de un agente de contraste de resonancia magnética nuclear cromogénico, enzimático, radioisotópico, isotópico, fluorescente, tóxico, quimioluminiscente u otro marcador.

Los ejemplos de marcadores cromogénicos adecuados incluyen diaminobencidina y ácido 4-hidroxiazo-benceno-2-carboxílico.

Los ejemplos de marcadores enzimáticos adecuados incluyen malato deshidrogenasa, nucleasa estafilocócica, A-5-esteroide isomerasa, alcohol deshidrogenasa de levadura, a-glicerol fosfato deshidrogenasa, triosa fosfato isomerasa, peroxidasa, fosfatasa alcalina, asparaginasa, glucosa oxidasa, p-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, glucoamilasa y acetilcolina esterasa.

Los ejemplos de marcadores radioisotópicos adecuados incluyen 3H,

111In, 1251, 1311, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 57To, 58Co, 59Fe, 75Se, 152Eu, 90Y, 67Cu, 217Ci, 211At, 212Pb, 47Sc, 1 un isótopo preferido donde se usan imágenes in vivo ya que evita el problema de la deshalogenación de los anticuerpos de unión a GD2 marcados con 125I o 131I por el hígado. Además, este radionucleótido tiene una energía de emisión gamma más favorable para la obtención de imágenes (Perkins y otros, Eur. J. Nucl. Med. 70:296-301 (1985); Carasquillo y otros, J. Nucl. Med. 25:281-287 (1987)). Por ejemplo, 111In acoplado a anticuerpos monoclonales con 1-(P-isotiocianatobencil)-DPTA ha mostrado poca absorción en tejidos no tumorales, particularmente en el hígado, y por lo tanto mejora la especificidad de la localización del tumor (Esteban y otros, J.

Nucl. Med. 28:861-870 (1987)).

Los ejemplos de marcadores isotópicos no radiactivos adecuados incluyen 157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Tr y 56Fe.

Los ejemplos de marcadores fluorescentes adecuados incluyen un marcador 152Eu, un marcador de fluoresceína, un marcador de isotiocianato, un marcador de rodamina, un marcador de ficoeritrina, un marcador de ficocianina, un marcador de aloficocianina, un marcador de proteína fluorescente verde (GFP), un marcador de o-ftaldehído y un marcador de fluorescamina.

Los ejemplos de marcadores de toxina adecuados incluyen toxina diftérica, ricina y toxina del cólera.

Los ejemplos de marcadores quimioluminiscentes incluyen un marcador de luminol, un marcador de isoluminol, un marcador de éster de acridinio aromático, un marcador de imidazol, un marcador de sal de acridinio, un marcador de éster de oxalato, un marcador de luciferina, un marcador de luciferasa y un marcador de aequorina.

Los ejemplos de agentes de contraste de resonancia magnética nuclear incluyen núcleos de metales pesados tales como Gd, Mn y hierro.

Las técnicas típicas para unir los marcadores descritos anteriormente a los anticuerpos anti-GD2 se proporcionan en Kennedy y otros, Clin. CMm. Acta 70:1-31 (1976), y Schurs y otros, Clin. CMm. Acta 81:1-40 (1977). Las técnicas de acoplamiento mencionadas en este último son el método del glutaraldehído, el método del peryodato, el método de la dimaleimida y el método del éster de m-maleimidobencil-N-hidroxisuccinimida.

Para su uso en determinados enfoques terapéuticos tales como la ablación de células tumorales residuales después de la cirugía o la prevención de metástasis, los anticuerpos anti-GD2 de la invención pueden conjugarse con uno o más fármacos, profármacos o isótopos. Dichos conjugados preferidos comprenden uno o más ligandos, por ejemplo, uno o más anticuerpos o fragmentos, derivados o variantes de los mismos, que se unen a GD2, conjugados con uno o más agentes citotóxicos; dichos conjugados son útiles para su uso en los métodos de tratamiento y prevención de metástasis tumorales proporcionados por la invención. De acuerdo con determinadas modalidades de la invención, el anticuerpo anti-GD2 se conjuga con un agente citotóxico. Los agentes citotóxicos, por ejemplo, quimioterapéuticos, útiles en la generación de conjugados de anticuerpo anti-GD2-agente citotóxico se conocen bien en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, paclitaxel, melfalán, doxorrubicina, metotrexato, 5-fluorouracilo, etopósido, mecloretamina, ciclofosfamida, bleomicina, venenos para microtúbulos y acetogeninas anonáceas. Otros agentes quimioterapéuticos adecuados para su uso de acuerdo con este aspecto de la invención se conocen bien y resultarán familiares para el experto habitual en la técnica.

El uso de conjugados de uno o más anticuerpos anti-GD2 y una o más toxinas de molécula pequeña, como una calicheamicina, una maitansina (Patente de Estados Unidos núm. 5,208,020), un tricoteno, y CC1065, también se contemplan en la presente descripción. En una modalidad de la invención, el anticuerpo anti-GD2 se conjuga a una o más moléculas de maitansina (por ejemplo, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 moléculas de maitansina por anticuerpo anti-GD2). La maitansina puede, por ejemplo, convertirse a May-SS-Me que puede reducirse a May-SH3 y reaccionar con el anticuerpo anti-GD2 modificado (Chari y otros, Cancer Research 52: 127 131 (1992)) para generar un conjugado maitansinoide-anticuerpo anti-GD2.

Alternativamente, el anticuerpo anti-GD2 puede conjugarse con una o más moléculas de calicheamicina. Los antibióticos de la familia calicheamicina son capaces de producir roturas en el ADN bicatenario a concentraciones subpicomolares. Análogos estructurales de calicheamicina que pueden usarse (Hinman y otros, Cancer Research 53: 3336-3342 (1993) y Lode y otros, Cancer Research 58: 2925- 2928 (1998)).

Las toxinas enzimáticamente activas y los fragmentos de las mismas que pueden usarse para producir conjugados con uno o más anticuerpos anti-GD2 incluyen cadena A de difteria, fragmentos activos no enlazantes de toxina de difteria, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y tricotecenos. Véase, por ejemplo, el documento núm. WO 93/21232 publicado en idioma inglés el 28 de octubre de 1993. Los maitansinoides también pueden conjugarse con uno o más anticuerpos anti-GD2.

La presente invención contempla además un anticuerpo anti-GD2 conjugado con un compuesto con actividad nucleolítica (por ejemplo, una ribonucleasa o un ADN endonucleasa tal como una desoxirribonucleasa; ADNasa). También están disponibles una variedad de isótopos radiactivos para la producción de anticuerpo anti-GD2 radioconjugado para su uso en métodos terapéuticos de la invención. Los ejemplos incluyen 211At, 131I, 1251, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P e isótopos radiactivos de Lu.

Los conjugados del anticuerpo anti-GD2 y los agentes citotóxicos se preparan mediante el uso de una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol)propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil)cidohexano-I-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tal como dimetilo adipimidato HCl), ésteres activos (tal como disuccinimidil suberato), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos his-azido (tales como bis (p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como tolueno 2,6-diisocianato), y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina puede prepararse como se describe en Vitetta y otros, Science 238: 1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietileno triaminapentaacético marcado con 14carbono (MX-DTPA) es un agente quelante ilustrativo para la conjugación del radionucleótido al anticuerpo anti-GD2. Véase el documento núm. WO 94/11026. El enlazador puede ser un "enlazador escindible" que facilita la liberación del fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, puede usarse un enlazador lábil al ácido, un enlazador sensible a peptidasa, un enlazador dimetilo o enlazador que contiene disulfuro (Chari y otros, Cancer Research 52:127-131 (1992)).

Alternativamente, una proteína de fusión que comprende el ligando de anticuerpo anti-GD2 y un agente citotóxico puede fabricarse, por ejemplo, mediante técnicas recombinantes o síntesis de péptidos.

La presente invención también proporciona al menos una composición de anticuerpos anti-GD2 que comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis o más anticuerpos anti-GD2 de los mismos, como se describe en la presente descripción y/o como se conoce en la técnica que se proporcionan en una composición, mezcla o forma de origen no natural. Dichas composiciones comprenden composiciones de origen no natural que comprenden al menos una o dos variantes, dominios, fragmentos o variantes específicas de longitud completa con eliminación C y/o N terminal, de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-GD2 que se selecciona del grupo que consiste en 70-100 % de los aminoácidos contiguos de las regiones CDR de los anticuerpos descritos en la presente descripción, o fragmentos, dominios o variantes específicos de los mismos. Las composiciones de anticuerpos anti-GD2 preferidas incluyen al menos uno o dos fragmentos, dominios o variantes de longitud completa como al menos una CDR o LBR que contiene porciones de las secuencias de anticuerpos anti-GD2 descritas en la presente descripción. Otras composiciones preferidas comprenden 40-99 % de al menos uno de 70-100 % de una región CDR de un Ab anti-GD2 descrito en la presente descripción. Dichos porcentajes de composición son en peso, volumen, concentración, molaridad o molalidad como soluciones, mezclas, suspensiones, emulsiones o coloides líquidos o secos, como se conoce en la técnica o como se describe en la presente descripción.

Las composiciones de anticuerpos anti-GD2 de la presente invención pueden comprender además al menos una de cualquier cantidad adecuada y efectiva de una composición o una composición farmacéutica que comprende al menos un anticuerpo anti-GD2 para una célula, tejido, órgano, animal o paciente que necesite dicha modulación, tratamiento o terapia, que opcionalmente comprende además al menos uno que se selecciona de al menos un antagonista de TNF (por ejemplo, pero sin limitarse a, un anticuerpo o un fragmento de TNF, un receptor o un fragmento de TNF soluble, proteínas de fusión del mismo, o un antagonista de TNF de molécula pequeña), un antirreumático (por ejemplo, metotrexato, auranofina, aurotioglucosa, azatioprina, etanercept, tiomalato de oro y sodio, sulfato de hidroxicloroquina, leflunomida, sulfasalzina), un relajante muscular, un narcótico, un fármaco antiinflamatorio no esteroide (NSAID), un analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueador neuromuscular, un antimicrobiano (por ejemplo, aminoglucósido, un antifúngico, un antiparasitario, un antiviral, un carbapenem, una cefalosporina, una fluoroquinolona, un macrólido, una penicilina, una sulfonamida, una tetraciclina, otro antimicrobiano), un antipsoriático, un corticosteroide, un esteroide anabólico, un agente relacionado con la diabetes, un mineral, un nutricional, un agente tiroideo, una vitamina, una hormona relacionada con el calcio, un antidiarreico, un antitusivo, un antiemético, un antiulceroso, un laxante, un anticoagulante, una eritropoyetina (por ejemplo, epoetina alfa), un filgrastim (por ejemplo, G-CSF, Neupogen), un sargramostim (GM-CSF, Leukine), una inmunización, una inmunoglobulina, un inmunosupresor (por ejemplo, basiliximab, ciclosporina, daclizumab), una hormona del crecimiento, un fármaco de sustitución hormonal, un modulador del receptor de estrógeno, un midriático, un ciclopléjico, un agente alquilante, un antimetabolito, un inhibidor mitótico, un radiofármaco, un antidepresivo, un agente antimaníaco, un antipsicótico, un ansiolítico, un hipnótico, un simpaticomimético, un estimulante, donepezilo, tacrina, un medicamento para el asma, un agonista beta, un esteroide inhalado, un inhibidor de leucotrienos, una metilxantina, una cromolina, una epinefrina o un análogo, domasa alfa (Pulmozyme), una citocina o un antagonista de citocina y terapias celulares. Los ejemplos no limitantes de dichas citocinas incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de IL-1 a IL-34. Las dosificaciones adecuadas se conocen bien en la técnica. Véase, por ejemplo, Wells y otros, eds., Pharmacotherapy Handbook, 2a edición, Appleton y Lange, Stamford, Conn. (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edición, Tarascon Publishing, Loma Linda, California. (2000).

Dichos anticancerígenos o antiinfecciosos también pueden incluir moléculas de toxina que están asociadas, unidas, coformuladas o coadministradas con al menos un anticuerpo de la presente invención. Opcionalmente, la toxina puede actuar para destruir selectivamente la célula o el tejido patológico. La célula patológica puede ser un cáncer u otra célula. Dichas toxinas pueden ser, pero no se limitan a, toxinas o fragmentos de toxinas purificados o recombinantes que comprenden al menos un dominio citotóxico funcional de la toxina, por ejemplo, que se selecciona de al menos uno de ricina, toxina diftérica, una toxina venenosa o una toxina bacteriana. El término toxina también incluye tanto endotoxinas como exotoxinas producidas por cualquier bacteria o virus de origen natural, mutante o recombinante que pueda provocar cualquier afección patológica en seres humanos y otros mamíferos, que incluyen el shock por toxinas, que puede provocar la muerte. Dichas toxinas pueden incluir, pero no se limitan a, enterotoxina termolábil (LT) de E. coli enterotoxigénica, enterotoxina termoestable (ST), citotoxina de Shigella, enterotoxinas de Aeromonas, toxina-1 del síndrome de shock tóxico (TSST-1), enterotoxina A estafilocócica (SEA), B (SEB) o C (SEC), enterotoxinas estreptocócicas y similares. Dichas bacterias incluyen, pero no se limitan a, cepas de una especie de E. coli enterotoxigénica (ETEC), E. coli enterohemorrágica (por ejemplo, cepas del serotipo 0157:H7), especies de Staphylococcus (por ejemplo, Staphylococcus aureus, Staphylococcus pyogenes), especies de Shigella (por ejemplo, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii y Shigella sonnei), especies de Salmonella (por ejemplo, Salmonella typhi, Salmonella cholerasuis, Salmonella enteritidis), especies de Clostridium (por ejemplo, Clostridium perfringens, Clostridium dificile, Clostridium botulinum), especies de Camphlobacter (por ejemplo, Camphlobacter jejuni, Camphlobacter fetus), especies de Heliobacter (por ejemplo, Heliobacter pylori), especies de Aeromonas (por ejemplo, Aeromonas sobria, Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae), Pleisomonas shigelloides, Yersina enterocolitica, especies de Vibrios (por ejemplo, Vibrios cholerae, Vibrios parahemolyticus), especies de Klebsiella, Pseudomonas aeruginosa y Streptococci. Véase, por ejemplo, Stein, ed., INTERNAL MEDICINE, 3a edición, págs. 1-13, Little, Brown y Co., Boston, (1990); Evans y otros, eds., Bacterial Infections of Humans: Epidemiology and Control, 2a. Ed., págs. 239-254, Plenum Medical Book Co., Nueva York (1991); Mandell y otros, Principles and Practice of Infectious Diseases, 3d. Ed., Churchill Livingstone, Nueva York (1990); Berkow y otros, eds., The Merck Manual, 16a edición, Merck and Co., Rahway, N.J., 1992; Wood y otros, FEMS Microbiology Immunology, 76:121-134 (1991); Marrack y otros, Science, 248:705-711 (1990).

Los compuestos, las composiciones o las combinaciones de anticuerpo anti-GD2 de la presente invención pueden comprender además al menos uno de cualquier auxiliar adecuado, tales como, pero sin limitarse a, diluyente, aglutinante, estabilizador, amortiguadores, sales, disolventes lipófilos, conservante, adyuvante o similares. Se prefieren auxiliares farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos no limitantes y los métodos para preparar dichas soluciones estériles se conocen bien en la técnica, tales como, pero sin limitarse a, Gennaro, Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edición, Mack Publishing Co. (Easton, Pensilvania) 1990. Pueden seleccionarse de forma rutinaria portadores farmacéuticamente aceptables que sean adecuados para el modo de administración, solubilidad y/o estabilidad del anticuerpo anti-GD2, el fragmento o la composición variante como bien se conoce en la técnica o como se describe en la presente descripción.

Los excipientes y los aditivos farmacéuticos útiles en la presente composición incluyen, pero no se limitan a, proteínas, péptidos, aminoácidos, lípidos y carbohidratos (por ejemplo, azúcares, que incluyen monosacáridos, di, tri, tetra y oligosacáridos; azúcares derivatizados tales como alditoles, ácidos aldónicos, azúcares esterificados y similares; y polisacáridos o polímeros de azúcar), que pueden estar presentes solos o en combinación, que comprenden solos o en combinación 1-99,99 % en peso o volumen. Los excipientes proteicos ilustrativos incluyen albúmina sérica tal como albúmina sérica humana (HSA), albúmina humana recombinante (rHA), gelatina, caseína y similares. Los componentes representativos de aminoácidos/anticuerpos, que también pueden funcionar con capacidad amortiguadora, incluyen alanina, glicina, arginina, betaína, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, lisina, leucina, isoleucina, valina, metionina, fenilalanina, aspartamo y similares. Un aminoácido preferido es la glicina.

Los excipientes de carbohidratos adecuados para su uso en la invención incluyen, por ejemplo, monosacáridos tales como fructosa, maltosa, galactosa, glucosa, D-manosa, sorbosa y similares; disacáridos, tales como lactosa, sacarosa, trehalosa, celobiosa y similares; polisacáridos, tales como rafinosa, melecitosa, maltodextrinas, dextranos, almidones y similares; y alditoles, tales como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol, sorbitol (glucitol), mioinositol y similares. Los excipientes de carbohidratos preferidos para su uso en la presente invención son manitol, trehalosa y rafinosa.

Las composiciones de anticuerpo anti-GD2 también pueden incluir un amortiguador o un agente de ajuste del pH; típicamente, el amortiguador es una sal preparada a partir de un ácido o base orgánica. Los amortiguadores representativos incluyen sales de ácidos orgánicos tales como sales de ácido cítrico, ácido ascórbico, ácido glucónico, ácido carbónico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido acético o ácido ftálico; Tris, clorhidrato de trometamina o amortiguadores fosfato. Los amortiguadores preferidos para su uso en las presentes composiciones son sales de ácidos orgánicos tales como citrato.

Adicionalmente, las composiciones de anticuerpo anti-GD2 de la invención pueden incluir excipientes/aditivos poliméricos tales como polivinilpirrolidonas, ficoles (un azúcar polimérico), dextratos (por ejemplo, ciclodextrinas, tales como 2-hidroxipropil-p-ciclodextrina), polietilenglicoles, agentes saborizantes, agentes antimicrobianos, edulcorantes, antioxidantes, agentes antiestáticos, surfactantes (por ejemplo, polisorbatos tales como "TWEEN 20" y "TWEEN 80"), lípidos (por ejemplo, fosfolípidos, ácidos grasos), esteroides (por ejemplo, colesterol) y agentes quelantes (por ejemplo, EDTA).

Estos y otros excipientes y/o aditivos farmacéuticos conocidos adecuados para su uso en las composiciones de anticuerpo anti-GD2, porciones o variantes de acuerdo con la invención se conocen en la técnica, por ejemplo, como se enumeran en "Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19a edición, Williams & Williams, (1995), y en "Physician's Desk Reference", 52a edición, Medical Economics, Montvale, N.J. (1998). Los materiales portadores o excipientes preferidos son carbohidratos (por ejemplo, sacáridos y alditoles) y amortiguadores (por ejemplo, citrato) o agentes poliméricos.

Como se indicó anteriormente, la invención proporciona formulaciones estables, que es preferentemente un amortiguador fosfato con solución salina o una sal elegida, así como también soluciones y formulaciones conservadas que contienen un conservante, así como también formulaciones conservadas de usos múltiples adecuadas para uso farmacéutico o veterinario, que comprenden al menos un anticuerpo anti-GD2 en una formulación farmacéuticamente aceptable. Las formulaciones conservadas contienen al menos un conservante conocido u opcionalmente que se selecciona del grupo que consiste en al menos un fenol, m-cresol, p-cresol, o cresol, clorocresol, alcohol bencílico, nitrito fenilmercúrico, fenoxietanol, formaldehído, clorobutanol, cloruro de magnesio (por ejemplo, hexahidrato), alquilparabeno (metilo, etilo, propilo, butilo y similares), cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, deshidroacetato de sodio y timerosal, o las mezclas de los mismos en un diluyente acuoso. Puede usarse cualquier concentración o mezcla adecuadas como se conoce en la técnica, tal como 0,001-5 %, o cualquier intervalo o valor del mismo, tales como, pero sin limitarse a, 0,001, 0,003, 0,005, 0,009, 0,01, 0,02, 0,03, 0,05, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,3, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, o cualquier intervalo o valor en el mismo. Los ejemplos no limitantes incluyen, sin conservantes, 0,1-2 % de m-cresol (por ejemplo, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,9, 1,0 %), 0,1-3 % de alcohol bencílico (por ejemplo, 0,5, 0,9, 1,1, 1,5, 1,9, 2,0, 2,5 %), 0,001-0,5 % de timerosal (por ejemplo, 0,005, 0,01), 0,001-2,0 % de fenol (por ejemplo, 0,05, 0,25, 0,28, 0,5, 0,9, 1,0 %), 0,0005 1,0 % de alquilparabeno(s) (por ejemplo, 0,00075, 0,0009, 0,001, 0,002, 0,005, 0,0075, 0,009, 0,01, 0,02, 0,05, 0,075, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,75, 0,9, 1,0 %), y similares.

Como se indicó anteriormente, la invención proporciona un artículo de fabricación que comprende material de empaque y al menos un vial que comprende una solución de al menos un anticuerpo anti-GD2 con los amortiguadores y/o los conservantes prescritos, opcionalmente en un diluyente acuoso, en donde dicho material de empaque comprende una etiqueta que indica que dicha solución puede mantenerse durante un período de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54, 60, 66, 72 horas o más. La invención comprende además un artículo de fabricación, que comprende material de empaque, un primer vial que comprende al menos un anticuerpo anti-GD2 liofilizado y un segundo vial que comprende un diluyente acuoso de amortiguador o conservante prescrito, en donde dicho material de empaque comprende una etiqueta que indica a un paciente para reconstituir al menos un anticuerpo anti-GD2 en el diluyente acuoso para formar una solución que pueda mantenerse durante un período de veinticuatro horas o más.

Al menos un anticuerpo anti-GD2 de la presente invención puede producirse por medios recombinantes, que incluyen a partir de células de mamífero o preparaciones transgénicas, o puede purificarse a partir de otras fuentes biológicas, como se describe en la presente descripción o como se conoce en la técnica.

El intervalo de al menos un anticuerpo anti-GD2 en el producto de la presente invención incluye cantidades que producen tras la reconstitución, si es en un sistema húmedo/seco, concentraciones de aproximadamente 1,0 microgramos/ml a aproximadamente 1000 mg/ml, aunque concentraciones más bajas y más altas son operables y dependen del vehículo de administración previsto, por ejemplo, las formulaciones de solución diferirán de los métodos de parche transdérmico, pulmonar, transmucoso, osmótico o de microbomba.

Preferentemente, el diluyente acuoso comprende además opcionalmente un conservante farmacéuticamente aceptable. Los conservantes preferidos incluyen aquellos que se seleccionan del grupo que consiste en fenol, mcresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, alcohol bencílico, alquilparabeno (metil, etil, propil, butil y similares), cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, deshidroacetato de sodio y timerosal, o las mezclas de los mismos. La concentración de conservante usada en la formulación es una concentración suficiente para producir un efecto antimicrobiano. Dichas concentraciones dependen del conservante seleccionado y las determina fácilmente el experto en la técnica.

Opcional y preferentemente pueden añadirse al diluyente otros excipientes, por ejemplo, agentes de isotonicidad, amortiguadores, antioxidantes, potenciadores de conservantes. Generalmente se usa un agente de isotonicidad, tal como la glicerina, en concentraciones conocidas. Preferentemente se añade un amortiguador fisiológicamente tolerado para proporcionar un mejor control del pH. Las formulaciones pueden cubrir un amplio intervalo de pH, tales como de aproximadamente pH 4 a aproximadamente pH 10, e intervalos preferidos de aproximadamente pH 5 a aproximadamente pH 9, y un intervalo más preferido de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 8,0. Preferentemente, las formulaciones de la presente invención tienen un pH entre aproximadamente 6,8 y aproximadamente 7,8. Los amortiguadores preferidos incluyen amortiguadores de fosfato, con la máxima preferencia fosfato de sodio, particularmente solución salina amortiguada con fosfato (PBS).

Para reducir la agregación pueden añadirse opcionalmente a las formulaciones o las composiciones otros aditivos, tales como solubilizantes farmacéuticamente aceptables como Tween 20 (monolaurato de polioxietileno (20) sorbitán), Tween 40 (monopalmitato de polioxietileno (20) sorbitán), Tween 80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitán), Pluronic F68 (copolímeros en bloque de polioxietileno y polioxipropileno), y PEG (polietilenglicol) o surfactantes no iónicos tales como polisorbato 20 u 80 o poloxámero 184 o 188, polilos Pluronic®, otros copolímeros de bloque y quelantes tales como EDTA y EGTA. Estos aditivos son particularmente útiles si se usa una bomba o un recipiente de plástico para administrar la formulación. La presencia de un surfactante farmacéuticamente aceptable mitiga la propensión de la proteína a agregarse.

Las formulaciones de la presente invención pueden prepararse mediante un proceso que comprende mezclar al menos un anticuerpo anti-GD2 y un conservante que se selecciona del grupo que consiste en fenol, m-cresol, pcresol, o-cresol, clorocresol, alcohol bencílico, alquilparabeno (metilo, etilo, propilo, butilo y similares), cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, deshidroacetato de sodio y timerosal o las mezclas de los mismos en un diluyente acuoso. La mezcla de al menos un anticuerpo anti-GD2 y el conservante en un diluyente acuoso se lleva a cabo mediante el uso de procedimientos convencionales de disolución y mezcla. Para preparar una formulación adecuada, por ejemplo, se combina una cantidad medida de al menos un anticuerpo anti-GD2 en solución amortiguada con el conservante deseado en una solución amortiguada en cantidades suficientes para proporcionar la proteína y el conservante en las concentraciones deseadas. Un experto en la técnica reconocería las variaciones de este proceso. Por ejemplo, el orden en que se añaden los componentes, si se usan aditivos adicionales, la temperatura y el pH al que se prepara la formulación, son factores que pueden optimizarse para la concentración y el medio de administración usados.

Las formulaciones reivindicadas pueden proporcionarse a los pacientes como soluciones transparentes o como viales dobles que comprenden un vial de al menos un anticuerpo anti-GD2 liofilizado que se reconstituye con un segundo vial que contiene agua, un conservante y/o excipientes, preferentemente un amortiguador fosfato y/o solución salina y una sal elegida, en un diluyente acuoso. Un vial de solución única o un vial doble que requiere reconstitución pueden reutilizarse varias veces y pueden ser suficientes para uno o varios ciclos de tratamiento del paciente y, por lo tanto, pueden proporcionar un régimen de tratamiento más conveniente que el disponible actualmente.

Los artículos de fabricación reivindicados en la presente son útiles para la administración durante un período de inmediatamente a veinticuatro horas o más. En consecuencia, los artículos de fabricación actualmente reivindicados ofrecen ventajas significativas al paciente. Opcionalmente, las formulaciones de la invención pueden almacenarse de forma segura a temperaturas de aproximadamente 2 °C a aproximadamente 40 °C y retener la actividad biológica de la proteína durante períodos prolongados de tiempo, por lo tanto, lo que permite una etiqueta en el empaque que indique que la solución puede conservarse y/o usarse durante un período de 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72 o 96 horas o más. Si se usa diluyente conservado, dicha etiqueta puede incluir el uso hasta por 1-12 meses, medio año, un año y medio y/o dos años.

Las soluciones de al menos un anticuerpo anti-GD2 en la invención pueden prepararse mediante un proceso que comprende mezclar al menos un anticuerpo en un diluyente acuoso. La mezcla se lleva a cabo mediante el uso de procedimientos convencionales de disolución y mezcla. Para preparar un diluyente adecuado, por ejemplo, se combina una cantidad medida de al menos un anticuerpo en agua o amortiguador en cantidades suficientes para proporcionar la proteína y opcionalmente un conservante o amortiguador en las concentraciones deseadas. Un experto en la técnica reconocería las variaciones de este proceso. Por ejemplo, el orden en que se añaden los componentes, si se usan aditivos adicionales, la temperatura y el pH al que se prepara la formulación, son factores que pueden optimizarse para la concentración y el medio de administración usados.

Los productos reivindicados pueden proporcionarse a los pacientes como soluciones transparentes o como viales dobles que comprenden un vial de al menos un anticuerpo anti-GD2 liofilizado que se reconstituye con un segundo vial que contiene el diluyente acuoso. Ya sea un vial de solución única o un vial doble que requiere reconstitución puede reutilizarse varias veces y puede ser suficiente para uno o varios ciclos de tratamiento del paciente y, por lo tanto, proporciona un régimen de tratamiento más conveniente que el disponible actualmente.

Los productos reivindicados pueden proporcionarse indirectamente a los pacientes al proporcionar a farmacias, clínicas u otras instituciones e instalaciones similares, las soluciones transparentes o los viales dobles que comprenden un vial de al menos un anticuerpo anti-GD2 liofilizado que se reconstituye con un segundo vial que contiene el diluente acuoso. La solución transparente en este caso puede tener un tamaño de hasta un litro o incluso mayor, que proporciona un depósito grande del cual pueden recuperarse porciones más pequeñas de al menos una solución de anticuerpo única o varias veces para transferirlas a viales más pequeños y proporcionarse por la farmacia o clínica a sus clientes y/o pacientes.

Los dispositivos reconocidos que comprenden estos sistemas de vial único incluyen aquellos dispositivos inyectores de pluma para administrar una solución, tales como BD Pens, BD Autojector®, Humaject®, por ejemplo, tal como lo fabrican o desarrollan Becton Dickensen (Franklin Lakes, Nueva Jersey), Disetronic (Burgdorf, Suiza; Bioject, Portland, Oregón; National Medical Products, Weston Medical (Peterborough, Reino Unido), Medi-Ject Corp (Minneapolis, Minnesota). Los dispositivos reconocidos que comprenden un sistema de vial doble incluyen aquellos sistemas de inyector-pluma para reconstituir un fármaco liofilizado en un cartucho para administrar la solución reconstituida, tal como HumatroPen®.

Los productos actualmente reivindicados incluyen material de empaque. El material de empaque proporciona, además de la información requerida por las agencias reguladoras, las condiciones bajo las cuales puede usarse el producto. El material de empaque de la presente invención proporciona instrucciones al paciente para reconstituir al menos un anticuerpo anti-GD2 en el diluyente acuoso para formar una solución y usar la solución durante un período de 2-24 horas o más para el producto húmedo/seco en dos viales. Para el producto en solución en un solo vial, la etiqueta indica que dicha solución puede usarse durante un período de 2-24 horas o más. Los productos actualmente reivindicados son útiles para uso de productos farmacéuticos humanos.

Las formulaciones de la presente invención pueden prepararse mediante un proceso que comprende mezclar al menos un anticuerpo anti-GD2 y un amortiguador seleccionado, preferentemente un amortiguador de fosfato que contiene solución salina o una sal elegida. La mezcla de al menos un anticuerpo y el amortiguador en un diluyente acuoso se lleva a cabo mediante el uso de procedimientos convencionales de disolución y mezcla. Para preparar una formulación adecuada, por ejemplo, se combina una cantidad medida de al menos un anticuerpo en agua o amortiguador con el agente amortiguador deseado en agua en cantidades suficientes para proporcionar la proteína y el amortiguador en las concentraciones deseadas. Un experto en la técnica reconocería las variaciones de este proceso. Por ejemplo, el orden en que se añaden los componentes, si se usan aditivos adicionales, la temperatura y el pH al que se prepara la formulación, son factores que pueden optimizarse para la concentración y el medio de administración usados.

Las formulaciones estables o conservadas reivindicadas pueden proporcionarse a los pacientes como soluciones transparentes o como viales dobles que comprenden un vial de al menos un anticuerpo anti-GD2 liofilizado que se reconstituye con un segundo vial que contiene un conservante o amortiguador y excipientes en un diluyente acuoso. Ya sea un vial de solución única o un vial doble que requiere reconstitución puede reutilizarse varias veces y puede ser suficiente para uno o varios ciclos de tratamiento del paciente y, por lo tanto, proporciona un régimen de tratamiento más conveniente que el disponible actualmente.

Al menos un anticuerpo anti-GD2, ya sea en las formulaciones o soluciones estables o presentadas descritas en la presente descripción, puede administrarse a un paciente de acuerdo con la presente descripción a través de una variedad de métodos de administración que incluyen inyección SC o IM; transdérmico, pulmonar, transmucoso, implante, bomba osmótica, cartucho, microbomba u otros medios apreciados por el experto en la técnica, como se conoce bien en la técnica.

En una modalidad de la presente invención, las composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo anti-GD2 de la descripción facilitan la administración de anticuerpos humanizados a un organismo, preferentemente un animal, preferentemente un mamífero. Los mamíferos particulares incluyen animales bovinos, caninos, equinos, felinos, ovinos y porcinos, primates no humanos y seres humanos. Se prefieren particularmente los seres humanos.

Sería conveniente usar un anticuerpo quimérico o humano neutralizante de alta afinidad contra GD2 en enfermedades en las que se expresa GD2, por ejemplo, GD2 se expresa en >50 % de los melanomas (Zhang y otros, 1997, Int. J. Cancer. 73, 42-49), el 88 % de los osteosarcomas (Heiner y otros, 1987, Cancer Res. 47, 5377 5388), y el 93 % de los sarcomas de tejidos blandos, que incluyen liposarcoma, fibrosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, leiomiosarcoma y sarcoma de células fusiformes (Chang y otros, 1992, Cancer 70, 633-638), así como también en tumores cerebrales (Longee y otros, 1991, Acta Neuropathol. 82, 45-54). Se han probado anticuerpos anti-GD2 en pacientes con melanoma (Saleh y otros, 1992, Hum. Antibodies Hybridomas 3, 19-24; Cheung y otros, 1987, J. Clin. Oncol. 5, 1430-1440; Choi y otros, 2006, Cancer Immunol. Immunother. 55, 761-774), sarcomas (Choi y otros, 2006, arriba; Yeh y otros, 1992, Quinto Congreso de Asia y Oceanía de Medicina y Biología Nuclear, pág.

104), cáncer de pulmón de células pequeñas (Grant y otros, 1996, Eur. J. Nucl. Med. 23, 145-149), tumores cerebrales (Arbit y otros, 1995, Eur. J. Nucl. Med. 22, 419-426), mediante inyección iv, así como también mediante terapia compartimental mediante el uso de depósitos de Ommaya (Kramer y otros, 2007, J. Clin. Oncol. 25, 5465 5470). GD2 también es una diana tumoral para el retinoblastoma (Chantada y otros, 2006, J. Pediatr. Hematol. Oncol. 28, 369-373) y las células leucémicas de linfocitos T infectadas con HTLV-1 (Furukawa y otros, 1993, PNAS USA 90, 1972-1976). En un aspecto preferido, puede usarse un anticuerpo anti-GD2 de la descripción para tratar el neuroblastoma. Los anticuerpos anti-GD2 o los derivados de los mismos pueden usarse como agente único o en combinación con otros agentes terapéuticos. Además, estos Mab pueden usarse como quimiosensibilizadores de manera que su uso puede aumentar la eficacia terapéutica de los agentes citotóxicos. Estos anticuerpos pueden usarse como radiosensibilizadores, de manera que su uso puede mejorar la eficacia de la radiación. También pueden usarse en combinación con otros agentes inmunomoduladores de tumores tales como IL-2, IL-12 y/o IFNalfa. Adicionalmente, los anticuerpos anti-GD2 pueden usarse en combinación con otros anticuerpos monoclonales tales como anti-TNF-alfa, IL-12/IL-23, IL-2, receptor GpIIb/IIIa, CD52, CD20, proteínas RSV, receptor HER2/neu y similares; así como también con anticuerpos comercialmente aprobados, que incluyen Rituxan, Herceptin, Mylotarg, Campath, Zevalin, Bexxar, Erbitux, Avastin y Vectibix.

Por lo tanto, la presente invención también proporciona su uso en un método para tratar al menos una enfermedad relacionada con GD2, en una célula, tejido, órgano, animal o paciente, como se conoce en la técnica o como se describe en la presente descripción, mediante el uso de al menos un anticuerpo anti-GD2 de la presente invención.

La presente invención incluye su uso en un método para tratar al menos una enfermedad maligna en una célula, tejido, órgano, animal o paciente, que incluyen, pero no se limitan a, al menos uno de: mieloma múltiple, leucemia, leucemia aguda, leucemia aguda, leucemia linfoblástica (ALL), ALL de linfocitos B, linfocitos T o FAB, leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mieloide crónica (CML), leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia de células pilosas, síndrome mielodisplásico (MDS), un linfoma, enfermedad de Hodgkin, un linfoma maligno, linfoma no Hodgkin, linfoma de Burkitt, mieloma múltiple, sarcoma de Kaposi, carcinoma colorrectal, carcinoma de células renales, carcinoma de páncreas, carcinoma de próstata, carcinoma nasofaríngeo, histiocitosis maligna, síndrome paraneoplásico/hipercalcemia maligna, tumores sólidos, adenocarcinomas, sarcomas, melanoma maligno, hemangioma, enfermedad metastásica, resorción ósea relacionada con el cáncer, dolor óseo relacionado con el cáncer; la supresión de la metástasis del cáncer; la mejora de la caquexia por cáncer; y el tratamiento de enfermedades inflamatorias tales como glomerulonefritis proliferativa mesangial y similares. Dicho método puede usarse opcionalmente en combinación con, mediante administración antes, simultáneamente o después de la administración de dicho anticuerpo GD2, radioterapia, un agente antiangiogénico, un agente quimioterapéutico, un inhibidor de farnesil transferasa o similares.

La presente descripción también proporciona un método para modular o tratar al menos una enfermedad relacionada con el sistema inmunológico mediada por GD2, en una célula, tejido, órgano, animal o paciente que incluye, pero no se limitan a, al menos una de artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis reumatoide juvenil de inicio sistémico, artritis psoriásica, espondilitis anquilosante, úlcera gástrica, artropatías seronegativas, osteoartritis, enfermedad inflamatoria intestinal, colitis ulcerosa, lupus eritematoso sistémico, síndrome antifosfolípido, iridociclitis/uveítis/neuritis óptica, fibrosis pulmonar idiopática, vasculitis sistémica/granulomatosis de Wegener, sarcoidosis, procedimientos de reversión de orquitis/vasectomía, enfermedades alérgicas/atópicas, asma, rinitis alérgica, eczema, dermatitis alérgica de contacto, conjuntivitis alérgica, neumonitis por hipersensibilidad, trasplantes, rechazo de trasplantes de órganos, enfermedad de injerto contra huésped, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, síndrome de sepsis, sepsis por grampositivas, sepsis por gramnegativas, sepsis con cultivos negativos, sepsis por hongos, fiebre neutropénica, urosepsis, meningococemia, traumatismo/hemorragia, quemaduras, exposición a radiaciones ionizantes, pancreatitis aguda, síndrome de dificultad respiratoria del adulto, artritis reumatoide, hepatitis inducida por el alcohol, patologías inflamatorias crónicas, sarcoidosis, patología de Crohn, anemia falciforme, diabetes, nefrosis, enfermedades atópicas, reacciones de hipersensibilidad, rinitis alérgica, fiebre del heno, rinitis perenne, conjuntivitis, endometriosis, asma, urticaria, anafilaxia sistémica, dermatitis, anemia perniciosa, enfermedad hemolítica, trombocitopenia, rechazo de injerto de cualquier órgano o tejido, rechazo de trasplante de riñón, rechazo de trasplante de corazón, rechazo de trasplante de hígado, rechazo de trasplante de páncreas, rechazo de trasplante de pulmón, rechazo de trasplante de médula ósea (BMT), rechazo de aloinjerto de piel, rechazo de trasplante de cartílago, rechazo de injerto de hueso, rechazo de trasplante de intestino delgado, rechazo de implante de timo fetal, rechazo de trasplante de paratiroides, rechazo de xenoinjerto de cualquier órgano o tejido, rechazo de aloinjerto, reacciones de hipersensibilidad a antirreceptores, enfermedad de Graves, enfermedad de Raynoud, diabetes tipo B resistente a la insulina, asma, miastenia gravis, citotoxicidad mediada por anticuerpos, reacciones de hipersensibilidad tipo III, lupus eritematoso sistémico, síndrome POEMS (polineuropatía, organomegalia, endocrinopatía, gammapatía monoclonal y síndrome de cambios cutáneos), polineuropatía, organomegalia, endocrinopatía, gammapatía monoclonal, síndrome de cambios cutáneos, síndrome antifosfolípido, pénfigo, esclerodermia, enfermedad mixta del tejido conectivo, enfermedad de Addison idiopática, diabetes mellitus, hepatitis crónica activa, cirrosis biliar primaria, vitíligo, vasculitis, síndrome de cardiotomía posinfarto de miocardio, hipersensibilidad tipo IV, dermatitis de contacto, neumonitis por hipersensibilidad, rechazo de aloinjerto, granulomas debidos a organismos intracelulares, sensibilidad a fármacos, metabólica/idiopática, enfermedad de Wilson, hemacromatosis, deficiencia de alfa-1-antitripsina, retinopatía diabética, tiroiditis de Hashimoto, osteoporosis, evaluación del eje hipotalámico-pituitario-suprarrenal, cirrosis biliar primaria, tiroiditis, encefalomielitis, caquexia, fibrosis quística, enfermedad pulmonar neonatal crónica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), linfohistiocitosis hematofagocítica familiar, afecciones dermatológicas, psoriasis, alopecia, síndrome nefrótico, nefritis, nefritis glomerular, insuficiencia renal aguda, hemodiálisis, uremia, toxicidad, preeclampsia, terapia con okt3, terapia anti-cd3, terapia con citocinas, quimioterapia, radioterapia (por ejemplo, que incluyen, pero sin limitarse a astenia, anemia, caquexia y similares), intoxicación crónica por salicilatos, apnea del sueño, obesidad, insuficiencia cardíaca, sinusitis, enfermedad inflamatoria intestinal y similares. Véase, por ejemplo, Merck Manual, 12a-17a ediciones, Merck & Company, Rahway, N.J. (1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999), Pharmacotherapy Handbook, Wells y otros, eds., segunda edición, Appleton y Lange, Stamford, Connecticut. (1998, 2000).

La presente descripción también proporciona un método para modular o tratar al menos una enfermedad infecciosa en una célula, tejido, órgano, animal o paciente, que incluyen, pero sin limitarse a, al menos una de: infección bacteriana aguda o crónica, procesos infecciosos o parasitarios agudos y crónicos, que incluyen infecciones bacterianas, virales y fúngicas, infección por VIH/neuropatía por VIH, meningitis, hepatitis (A, B o C, o similares), artritis séptica, peritonitis, neumonía, epiglotitis, e. coli 0157:h7, síndrome urémico hemolítico/púrpura trombocitopénica trombolítica, malaria, dengue hemorrágico, leishmaniasis, lepra, síndrome de shock tóxico, miositis estreptocócica, gangrena gaseosa, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium intracelular, neumonía por Pneumocystis carinii, enfermedad inflamatoria pélvica, orquitis/epididimitis, legionella, enfermedad de Lyme, influenza A, virus de Epstein-Barr, síndrome hemafagocítico asociado a vitales, encefalitis vital/meningitis aséptica y similares;

Cualquiera de dichos métodos puede comprender opcionalmente administrar una cantidad efectiva de al menos una composición o una composición farmacéutica que comprende al menos un anticuerpo anti-GD2 a una célula, tejido, órgano, animal o paciente que necesita dicha modulación, tratamiento o terapia.

La presente invención para su uso en cualquier método puede comprender administrar una cantidad efectiva de una composición o una composición farmacéutica que comprende al menos un anticuerpo anti-GD2 a una célula, tejido, órgano, animal o paciente que necesita dicha modulación, tratamiento o terapia. Dicho método puede comprender además opcionalmente la coadministración o la terapia de combinación para tratar tales enfermedades inmunitarias o enfermedades malignas, en donde la administración de dicho al menos un anticuerpo anti-GD2, porción específica o variante del mismo, comprende además administrar, antes simultáneamente, y/o después, al menos uno que se selecciona de al menos un antagonista de TNF (por ejemplo, pero sin limitarse a, un anticuerpo o un fragmento de TNF, un receptor o un fragmento de TNF soluble, proteínas de fusión del mismo, o una molécula pequeña de antagonista de TNF), un anticuerpo contra IL-18 o un fragmento, antagonista de IL-18 de molécula pequeña o proteína de unión al receptor de iL-18, un anticuerpo contra IL-1 (que incluye tanto IL-1 alfa como IL-1 beta) o un fragmento, un antagonista soluble del receptor de IL-1, un antirreumático (por ejemplo, metotrexato, auranofina, aurotioglucosa, azatioprina, etanercept, tiomalato de oro y sodio, sulfato de hidroxicloroquina, leflunomida, sulfasalazina, radioterapia, un agente antiangiogénico, un agente quimioterapéutico, un relajante muscular Thalidomidea, un narcótico, un fármaco antiinflamatorio no esteroide (NSAID), un analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueador neuromuscular, un antimicrobiano (por ejemplo, aminoglucósido, un antifúngico, un antiparasitario, un antiviral, un carbapenem, una cefalosporina, una fluoroquinolona, un macrólido, una penicilina, una sulfonamida, una tetraciclina, otro antimicrobiano), un antipsoriático, un corticosteroide, un esteroide anabólico, un agente relacionado con la diabetes, un mineral, un nutricional, un agente tiroideo, una vitamina, una hormona relacionada con el calcio, una eritropoyetina (por ejemplo, epoetina alfa), un filgrastim (por ejemplo, G-CSF, Neupogen), un sargramostim (GM-CSF, Leukine), una inmunización, una inmunoglobulina, un inmunosupresor (por ejemplo, basiliximab, ciclosporina, daclizumab), una hormona del crecimiento, un fármaco de sustitución hormonal, un modulador del receptor de estrógeno, un midriático, un ciclopléjico, un agente alquilante, un antimetabolito, un inhibidor mitótico, un radiofármaco, un antidepresivo, un agente antimaníaco, un antipsicótico, un ansiolítico, un hipnótico, un simpaticomimético, un estimulante, donepezilo, tacrina, un medicamento para el asma, un agonista beta, un esteroide inhalado, un inhibidor de leucotrienos, una metilxantina, un cromolín, una epinefrina o un análogo, domasa alfa (Pulmozyme), una citocina o un antagonista de citocina. Las dosificaciones adecuadas se conocen bien en la técnica. Véase, por ejemplo, Wells y otros, eds., Pharmacotherapy Handbook, 2a edición, Appleton y Lange, Stamford, Conn. (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edición, Tarascon Publishing, Loma Linda, California. (2000).

Los antagonistas de TNF adecuados para composiciones, terapia de combinación, coadministración, dispositivos y/o métodos de la presente invención (que comprenden además al menos un anticuerpo, porción especificada y variante del mismo, de la presente invención), incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos anti-TNF, fragmentos de unión al antígeno de los mismos y moléculas receptoras que se unen específicamente a TNF; compuestos que previenen y/o inhiben la síntesis de TNF, la liberación de TNF o su acción sobre las células diana, tales como talidomida, tenidap, inhibidores de la fosfodiesterasa (por ejemplo, pentoxifilina y rolipram), agonistas del receptor de adenosina A2b y potenciadores del receptor de adenosina A2b; compuestos que previenen y/o inhiben la señalización del receptor de TNF, tales como inhibidores de la proteína cinasa activada por mitógenos (MAP); compuestos que bloquean y/o inhiben la escisión de TNF de membrana, tales como inhibidores de metaloproteinasas; compuestos que bloquean y/o inhiben la actividad de TNF, tales como inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (ECA) (por ejemplo, captopril); y compuestos que bloquean y/o inhiben la producción y/o síntesis de TNF, tales como inhibidores de MAP cinasa.

La presente invención para su uso en cualquier método puede comprender un método para tratar un trastorno mediado por GD2 o un trastorno caracterizado por la expresión de GD2, que comprende administrar una cantidad efectiva de una composición o una composición farmacéutica que comprende al menos un anticuerpo anti-GD2 a una célula, tejido, órgano, animal o paciente que necesita dicha modulación, tratamiento o terapia. Dicho método puede comprender además opcionalmente la coadministración o terapia de combinación para tratar tales enfermedades inmunitarias, en donde la administración de dicho al menos un anticuerpo anti-GD2, porción específica o variante del mismo, comprende además administrar, antes, simultáneamente y/o después, al menos un agente como se describió anteriormente.

Típicamente, el tratamiento de afecciones patológicas se efectúa al administrar una dosificación o cantidad efectiva de al menos una composición de anticuerpo anti-GD2 que totaliza, en promedio, un intervalo de al menos aproximadamente 0,01 a 500 miligramos de al menos un anticuerpo anti-GD2 por kilogramo de paciente por dosis, y preferentemente de al menos aproximadamente 0,1 a 100 miligramos de anticuerpo/kilogramo de paciente por administración única o múltiple, en dependencia de la actividad específica contenida en la composición. Alternativamente, la concentración sérica efectiva puede comprender una concentración sérica de 0,1-5000 ug/ml por administración única o múltiple. Los médicos conocen las dosificaciones adecuadas y, por supuesto, dependerán del estado patológico particular, de la actividad específica de la composición que se administra y del paciente particular que se somete al tratamiento; en algunos casos, para lograr la cantidad terapéutica deseada, puede ser necesario proporcionar una administración repetida, es decir, administraciones individuales repetidas de una dosis medida o monitorizada particular, donde las administraciones individuales se repiten hasta que se logra la dosis o efecto diario deseado.

Las dosis preferidas pueden incluir opcionalmente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 y/o 100-500 mg/kg/administración, o cualquier intervalo, valor o fracción de los mismos, o para lograr una concentración sérica de 0,1, 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,5, 1,9, 2,0, 2,5, 2,9, 3,0, 3,5, 3,9, 4,0, 4,5, 4,9, 5,0, 5,5, 5,9, 6,0, 6,5, 6,9, 7,0, 7,5, 7,9, 8.0, 8,5, 8,9, 9,0, 9,5, 9,9, 10, 10,5, 10,9, 11, 11,5, 11,9, 20, 12,5, 12,9, 13,0, 13,5, 13,9, 14,0, 14,5, 4,9, 5,0, 5,5, 5,9, 6.0, 6,5, 6,9, 7,0, 7,5, 7,9, 8,0, 8,5, 8,9, 9,0, 9,5, 9,9, 10, 10,5, 10,9, 11, 11,5, 11,9, 12, 12,5, 12,9, 13,0, 13,5, 13,9, 14, 14,5, 15, 15,5, 15,9, 1,6, 16,5, 16,9, 17, 17,5, 17,9, 18, 18,5, 18,9, 19, 19,5, 19,9, 20, 20,5, 20,9, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, y/o 5000 |jg/ml de concentración sérica por administración única o múltiple, o cualquier intervalo, valor o fracción de los mismos.

Alternativamente, la dosificación administrada, por supuesto, variará en dependencia de factores conocidos, tales como las características farmacodinámicas del agente en particular y su modo y vía de administración, la edad, la salud y el peso del receptor, la naturaleza y la ampliación de los síntomas, el tipo de tratamiento concomitante, la frecuencia del tratamiento, y el efecto deseado. Normalmente, una dosificación de ingrediente activo puede ser de aproximadamente 0,1 a 100 miligramos por kilogramo de peso corporal. Normalmente, de 0,1 a 50, y preferentemente de 0,1 a 10 miligramos por kilogramo por administración o en forma de liberación sostenida, es efectiva para obtener los resultados deseados.

Como ejemplo no limitante, el tratamiento de seres humanos o animales puede proporcionarse como una dosificación única o periódica de al menos un anticuerpo de la presente invención de 0,1 a 100 mg/kg, tales como 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/kg, por día, en al menos uno de los días 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40, o alternativamente o adicionalmente, al menos una de las semanas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 o 52, o alternativamente o adicionalmente, al menos uno de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 años, o cualquier combinación de los mismos, mediante el uso de dosis únicas, en infusión o repetidas.

Las formas de dosificación (composición) adecuadas para la administración interna generalmente contienen de aproximadamente 0,1 miligramos a aproximadamente 500 miligramos de ingrediente activo por unidad o recipiente. En estas composiciones farmacéuticas, el ingrediente activo normalmente estará presente en una cantidad aproximadamente de 0,5-99,999 % en peso en base al peso total de la composición.

Para la administración parenteral, el anticuerpo puede formularse como una solución, una suspensión, una emulsión o un polvo liofilizado en asociación, o proporcionarse por separado, con un vehículo parenteral farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de tales vehículos son agua, solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa y albúmina sérica humana al 1-10 %. También pueden usarse liposomas y vehículos no acuosos tales como aceites fijos. El vehículo o el polvo liofilizado pueden contener aditivos que mantienen la isotonicidad (por ejemplo, cloruro de sodio, manitol) y la estabilidad química (por ejemplo, amortiguadores y conservantes). La formulación se esteriliza mediante técnicas conocidas o adecuadas.

Los portadores farmacéuticos adecuados se describen en la edición más reciente de Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, un texto de referencia estándar en el campo.

Las formulaciones para la administración parenteral pueden contener como excipientes comunes, agua estéril o solución salina, polialquilenglicoles tales como polietilenglicol, aceites de origen vegetal, naftalenos hidrogenados y similares. Pueden prepararse suspensiones acuosas u oleosas para la inyección mediante el uso de un emulsionante o humidificador apropiado y un agente de suspensión, de acuerdo con métodos conocidos. Los agentes para inyección pueden ser un agente diluyente no tóxico y no administrable por vía oral, tal como una solución acuosa o una solución o suspensión inyectable estéril en un solvente. Como vehículo o solvente que puede usarse, se permiten agua, solución de Ringer, solución salina isotónica, etc.; como un solvente ordinario o un solvente de suspensión, pueden usarse aceite no volátil estéril. Para estos fines puede usarse cualquier tipo de aceite y ácido graso no volátil, que incluyen aceites grasos o ácidos grasos naturales o sintéticos o semisintéticos; mono, di o triglicéridos naturales o sintéticos o semisintéticos. La administración parental se conoce en la técnica e incluye, pero no se limitan a, medios de inyecciones convencionales, un dispositivo de inyección sin aguja a presión de gas como se describió en la patente de Estados Unidos núm. 5,851,198, y un dispositivo perforador láser como se describió en la patente de Estados Unidos núm. 5,839,446.

La descripción se refiere además a la administración de al menos un anticuerpo anti-GD2 por vía parenteral, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intrarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavitaria, intracelial, intracerebelosa, intracerebroventricular, intratecal, intra-Ommaya, intraocular, intravítrea, intracólica, intracervical, intragástrica, intrahepática, intramiocárdica, intraósea, intrapélvica, intrapericárdica, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretiniana, intraespinal, intrasinovial, intratorácica, intrauterina, intravesical, en bolo, vaginal, rectal, bucal, medios sublinguales, intranasales o transdérmicos. Puede prepararse al menos una composición de anticuerpo anti-GD2 para su uso parenteral (subcutáneo, intramuscular o intravenoso) o cualquier otra administración particularmente en la forma de soluciones o suspensiones líquidas; para su uso en la administración vaginal o rectal particularmente en formas semisólidas tales como, pero sin limitarse a, cremas y supositorios; para la administración bucal o sublingual tales como, pero sin limitarse a, en la forma de comprimidos o cápsulas; o por vía intranasal tales como, pero sin limitarse a, en la forma de polvos, gotas o aerosoles nasales o determinados agentes; o transdérmicamente tales como sin limitarse a un sistema de administración en gel, pomada, loción, suspensión o parche con potenciadores químicos tales como dimetilsulfóxido para modificar la estructura de la piel o aumentar la concentración del fármaco en el parche transdérmico (Junginger y otros, en "Drug Permeation Enhancement"; Hsieh, D. S., Eds., págs. 59-90, Marcel Dekker, Inc. Nueva York 1994), o con agentes oxidantes que permiten la aplicación sobre la piel de formulaciones que contienen proteínas y péptidos (Documento núm. w O 98/53847), o aplicaciones de campos eléctricos para generar vías de transporte transitorias tales como la electroporación, o para aumentar la movilidad de fármacos cargados a través de la piel como la iontoforesis, o la aplicación de ultrasonido tales como la sonoforesis (Patentes de Estados Unidos núms. 4,309,989 y 4,767,402).

Para la administración pulmonar, preferentemente al menos una composición de anticuerpo anti-GD2 se administra en un tamaño de partícula efectivo para alcanzar las vías respiratorias inferiores del pulmón o los senos paranasales. De acuerdo con la invención, al menos un anticuerpo anti-GD2 puede administrarse mediante cualquiera de una variedad de dispositivos nasales o de inhalación conocidos en la técnica para la administración de un agente terapéutico por inhalación. Estos dispositivos capaces de depositar formulaciones en aerosol en la cavidad sinusal o en los alvéolos de un paciente incluyen inhaladores de dosis medidas, nebulizadores, generadores de polvo seco, pulverizadores y similares. También se conocen en la técnica otros dispositivos adecuados para dirigir la administración pulmonar o nasal de anticuerpos. Todos estos dispositivos pueden usar formulaciones adecuadas para la administración de anticuerpos en un aerosol. Dichos aerosoles pueden estar compuestos de soluciones (tanto acuosas como no acuosas) o partículas sólidas. Los inhaladores de dosis medidas como el inhalador de dosis medida Ventolin®, típicamente usan un gas propulsor y requieren activación durante la inspiración (Véase, por ejemplo, documentos núms. WO 94/16970, WO 98/35888). Los inhaladores de polvo seco tales como Turbuhaler™ (Astra), Rotahaler® (Glaxo), Diskus®(Glaxo), los dispositivos comercializados por Inhale Therapeutics, por nombrar algunos, usan la activación por respiración de un polvo mezclado (Patente de Estados Unidos núm. 4,668,218 Astra, documentos núms. EP 237507 Astra, WO 97/25086 Glaxo, WO 94/08552 Dura, patente de Estados Unidos núm. 5,458,135 Inhale, documento núm. WO 94/06498 Fisons). Los nebulizadores como el nebulizador Ultravent® (Mallinckrodt) y el nebulizador Acorn II® (Marquest Medical Products) (Patente de Estados Unidos núm. 5,404,871 Aradigma, documento núm. WO 97/22376), producen aerosoles a partir de soluciones, mientras que los inhaladores de dosis medidas, los inhaladores de polvo seco, etc. generan aerosoles de partículas pequeñas. Estos ejemplos específicos de dispositivos de inhalación disponibles comercialmente pretenden ser representativos de dispositivos específicos adecuados para la práctica de esta invención, y no pretenden limitar el alcance de la invención. Preferentemente, una composición que comprende al menos un anticuerpo anti-GD2 se administra mediante un inhalador de polvo seco o un pulverizador. Hay varias características convenientes de un dispositivo de inhalación para administrar al menos un anticuerpo de la presente invención. Por ejemplo, la administración mediante el dispositivo de inhalación es ventajosamente fiable, reproducible y precisa. Opcionalmente, el dispositivo de inhalación puede suministrar pequeñas partículas secas, por ejemplo, menos de aproximadamente 10 pm, preferentemente aproximadamente 1-5 pm, para una buena capacidad de respiración.

Puede producirse un aerosol que incluye una composición proteica de anticuerpo GD2 al forzar una suspensión o una solución de al menos un anticuerpo anti-GD2 a través de una boquilla bajo presión. El tamaño y la configuración de la boquilla, la presión aplicada y la velocidad de alimentación del líquido pueden elegirse para lograr la salida y el tamaño de partícula deseados. Una electropulverización puede generarse, por ejemplo, mediante un campo eléctrico en relación con una alimentación por capilar o por boquilla. Ventajosamente, las partículas de al menos una composición proteica de anticuerpo anti-GD2 administrada mediante un pulverizador tienen un tamaño de partícula inferior a aproximadamente 10 pm, preferentemente en el intervalo de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 5 pm, y con la máxima preferencia de aproximadamente 2 pm a aproximadamente 3 pm.

Las formulaciones de al menos una composición proteica de anticuerpo anti-GD2 adecuada para su uso con un pulverizador incluyen típicamente una composición proteica de anticuerpo en una solución acuosa a una concentración de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 100 mg de al menos una composición proteica de anticuerpo anti-GD2 por ml de solución o mg/g, o cualquier intervalo o valor en el mismo, por ejemplo, pero sin limitarse a, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/ml o mg/g. La formulación puede incluir agentes tales como un excipiente, un amortiguador, un agente de isotonicidad, un conservante, un surfactante y, preferentemente, zinc. La formulación también puede incluir un excipiente o un agente para la estabilización de la composición proteica de anticuerpo, tal como un amortiguador, un agente reductor, una proteína en masa o un carbohidrato. Las proteínas en masa útiles para formular composiciones proteicas de anticuerpos incluyen albúmina, protamina o similares. Los carbohidratos típicos útiles en la formulación de composiciones proteicas de anticuerpos incluyen sacarosa, manitol, lactosa, trehalosa, glucosa o similares. La formulación de la composición proteica de anticuerpo también puede incluir un surfactante, que puede reducir o prevenir la agregación inducida por la superficie de la composición proteica de anticuerpo provocada por la atomización de la solución para formar un aerosol. Pueden emplearse diversos surfactantes convencionales, tales como ésteres y alcoholes de ácidos grasos de polioxietileno y ésteres de ácidos grasos de polioxietilenosorbitol. Las cantidades generalmente variarán entre 0,001 y 14 % en peso de la formulación. Los surfactantes especialmente preferidos para los fines de esta invención son monooleato de polioxietilensorbitán, polisorbato 80, polisorbato 20 o similares. También pueden incluirse en la formulación agentes adicionales conocidos en la técnica para la formulación de una proteína tales como anticuerpos GD2, o porciones o variantes específicas.

La composición proteica de anticuerpo puede administrarse mediante un nebulizador, tal como un nebulizador de chorro o un nebulizador ultrasónico. Típicamente, en un nebulizador de chorro, se usa una fuente de aire comprimido para generar un chorro de aire de alta velocidad a través de un orificio. A medida que el gas se expande más allá de la boquilla, se genera una región de baja presión que atrae una solución de composición proteica de anticuerpo a través de un tubo capilar conectado a un depósito de líquido. La corriente de líquido del tubo capilar se corta en filamentos inestables y gotas a medida que sale del tubo, lo que genera el aerosol. Puede emplearse una variedad de configuraciones, velocidades de flujo y tipos de deflectores para lograr las características de rendimiento deseadas de un nebulizador de chorro determinado. En un nebulizador ultrasónico, se usa energía eléctrica de alta frecuencia para generar energía mecánica vibratoria, que emplea típicamente un transductor piezoeléctrico. Esta energía se transmite a la formulación de la composición proteica de anticuerpo, ya sea directamente o a través de un fluido de acoplamiento, lo que genera un aerosol que incluye la composición proteica de anticuerpo. Ventajosamente, las partículas de la composición proteica de anticuerpo administradas por un nebulizador tienen un tamaño de partícula inferior a aproximadamente 10 pm, preferentemente en el intervalo de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 5 pm, y con la máxima preferencia de aproximadamente 2 pm a aproximadamente 3 pm.

Las formulaciones de al menos un anticuerpo anti-GD2 adecuadas para su uso con un nebulizador, ya sea de chorro o ultrasónico, típicamente incluyen una concentración de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 100 mg de al menos una proteína del anticuerpo anti-GD2 por ml de solución. La formulación puede incluir agentes tales como un excipiente, un amortiguador, un agente de isotonicidad, un conservante, un surfactante y, preferentemente, zinc. La formulación también puede incluir un excipiente o un agente para la estabilización de al menos una composición proteica de anticuerpo anti-GD2, tal como un amortiguador, un agente reductor, una proteína en masa o un carbohidrato. Las proteínas en masa útiles para formular al menos una composición proteica de anticuerpo anti-GD2 incluyen albúmina, protamina o similares. Los carbohidratos típicos útiles para formular al menos un anticuerpo anti-GD2 incluyen sacarosa, manitol, lactosa, trehalosa, glucosa o similares. Al menos una formulación de anticuerpo anti-GD2 también puede incluir un surfactante, que puede reducir o prevenir la agregación inducida por la superficie de al menos un anticuerpo anti-GD2 provocada por la atomización de la solución para formar un aerosol. Pueden emplearse diversos surfactantes convencionales, tales como ésteres y alcoholes de ácidos grasos de polioxietileno y ésteres de ácidos grasos de polioxietileno y sorbital. Las cantidades generalmente variarán entre 0,001 y 4 % en peso de la formulación. Los surfactantes especialmente preferidos para los fines de esta invención son monooleato de polioxietileno sorbitán, polisorbato 80, polisorbato 20 o similares. También pueden incluirse en la formulación agentes adicionales conocidos en la técnica para la formulación de una proteína tal como una proteína de anticuerpo.

En un inhalador de dosis medida (MDI), un propulsor, al menos un anticuerpo anti-GD2 y cualquier excipiente u otro aditivo están contenidos en un recipiente como una mezcla que incluye un gas comprimido licuado. El accionamiento de la válvula dosificadora libera la mezcla como un aerosol, que contiene preferentemente partículas en el intervalo de tamaño de menos de aproximadamente 10 pm, preferentemente de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 5 pm, y con la máxima preferencia de aproximadamente 2 pm a aproximadamente 3 pm. El tamaño de partícula de aerosol deseado puede obtenerse al emplear una formulación de composición proteica de anticuerpo producida mediante diversos métodos conocidos por los expertos en la técnica, que incluyen molienda por chorro, secado por pulverización, condensación en punto crítico o similares. Los inhaladores de dosis medidas preferidos incluyen los fabricados por 3M o Glaxo y que emplean un propulsor de hidrofluorocarburo.

Las formulaciones de al menos un anticuerpo anti-GD2 para su uso con un dispositivo inhalador de dosis medida generalmente incluirán un polvo finamente dividido que contiene al menos un anticuerpo anti-IL-6 como una suspensión en un medio no acuoso, por ejemplo, suspendido en un propulsor con la ayuda de un surfactante. El propulsor puede ser cualquier material convencional empleado para este propósito, tal como un clorofluorocarburo, un hidroclorofluorocarburo, un hidrofluorocarburo o un hidrocarburo, que incluye triclorofluorometano, diclorodifluorometano, diclorotetrafluoroetanol y 1,1,1,2-tetrafluoroetano, HFA-134a (hidrofluoroalcano-134a), HFA-227 (hidrofluoroalcano-227), o similares. Preferentemente el propulsor es un hidrofluorocarburo. El surfactante puede elegirse para estabilizar al menos un anticuerpo anti-GD2 como una suspensión en el propulsor, para proteger el agente activo contra la degradación química, y similares. Los surfactantes adecuados incluyen trioleato de sorbitán, lecitina de soja, ácido oleico o similares. En algunos casos se prefieren las soluciones en aerosol que usan solventes tales como el etanol. También pueden incluirse en la formulación agentes adicionales conocidos en la técnica para la formulación de una proteína.

Un experto habitual en la técnica reconocerá que los métodos de la presente invención pueden lograrse mediante la administración pulmonar de al menos una composición de anticuerpo anti-GD2 a través de dispositivos no descritos en la presente descripción.

Las formulaciones para la administración oral se basan en la coadministración de adyuvantes (por ejemplo, resorcinoles y surfactantes no iónicos tales como el polioxietileno oleil éter y el n-hexadecilpolietileno éter) para aumentar artificialmente la permeabilidad de las paredes intestinales, así como también la coadministración de inhibidores enzimáticos (por ejemplo, inhibidores de tripsina pancreática, diisopropilfluorofosfato (DFF) y trasilol) para inhibir la degradación enzimática. El compuesto constituyente activo de la forma de dosificación de tipo sólido para la administración oral puede mezclarse con al menos un aditivo, que incluye sacarosa, lactosa, celulosa, manitol, trehalosa, rafinosa, maltitol, dextrano, almidones, agar, arginatos, quitinas, quitosanos, pectinas, goma tragacanto, goma arábiga, gelatina, colágeno, caseína, albúmina, polímero sintético o semisintético y glicérido. Estas formas de dosificación también pueden contener otro tipo o tipos de aditivos, por ejemplo, agente diluyente inactivo, lubricante tales como estearato de magnesio, parabeno, agente conservante tales como ácido sórbico, ácido ascórbico, alfatocoferol, antioxidante tales como cisteína, desintegrador, aglutinante, espesante, agente amortiguador, agente edulcorante, agente aromatizante, agente perfumante, etc.

Las tabletas y las píldoras pueden transformarse en preparaciones con cubierta entérica. Las preparaciones líquidas para la administración oral incluyen preparaciones en emulsión, jarabe, elixir, suspensión y solución permitidas para uso médico. Estas preparaciones pueden contener agentes diluyentes inactivos normalmente usados en dicho campo, por ejemplo, agua. Los liposomas también se han descrito como sistemas de administración de fármacos para insulina y heparina (Patente de Estados Unidos núm. 4,239,754). Más recientemente, se han usado microesferas de polímeros artificiales de aminoácidos mixtos (proteinoides) para administrar productos farmacéuticos (Patente de Estados Unidos núm. 4,925,673). Además, se conocen en la técnica los compuestos portadores descritos en la patente de Estados Unidos núm. 5,879,681 y la patente de Estados Unidos No. 5,5,871,753 que se usan para administrar los agentes biológicamente activos por vía oral.

Para la absorción a través de superficies mucosas, las composiciones y los métodos de administración de al menos un anticuerpo anti-GD2 incluyen una emulsión que comprende una pluralidad de partículas submicrónicas, una macromolécula mucoadhesiva, un péptido bioactivo y una fase continua acuosa, que promueve la absorción a través de superficies mucosas que logra mucoadhesión de las partículas de la emulsión (Patente de Estados Unidos núm. 5,514,670). Las superficies mucosas adecuadas para la aplicación de las emulsiones de la presente invención pueden incluir vías de administración corneal, conjuntival, bucal, sublingual, nasal, vaginal, pulmonar, estomacal, intestinal y rectal. Las formulaciones para la administración vaginal o rectal, por ejemplo, supositorios, pueden contener como excipientes, por ejemplo, polialquilenglicoles, vaselina, manteca de cacao y similares. Las formulaciones para la administración intranasal pueden ser sólidas y contener como excipientes, por ejemplo, lactosa o pueden ser soluciones acuosas u oleosas de gotas nasales. Para la administración bucal, los excipientes incluyen azúcares, estearato de calcio, estearato de magnesio, almidón pregelinatinado y similares (patente de Estados Unidos núm. 5,849,695).

Para la administración transdérmica, al menos un anticuerpo anti-GD2 se encapsula en un dispositivo de administración tal como un liposoma o nanopartículas poliméricas, micropartículas, microcápsulas o microesferas (denominadas colectivamente micropartículas a menos que se indique de cualquier otra manera). Se conocen varios dispositivos adecuados, que incluyen micropartículas hechas de polímeros sintéticos tales como polihidroxiácidos tales como ácido poliláctico, ácido poliglicólico y copolímeros de los mismos, poliortoésteres, polianhídridos y polifosfacenos, y polímeros naturales tales como colágeno, poliaminoácidos, albúmina y otras proteínas, alginato y otros polisacáridos, y las combinaciones de los mismos (Patente de Estados Unidos núm. 5,814,599).

A veces puede ser conveniente administrar los compuestos de la presente invención al sujeto durante períodos de tiempo prolongados, por ejemplo, durante períodos de una semana a un año o más a partir de una única administración. Pueden usarse diversas formas de dosificación de liberación lenta, de depósito o de implante. Por ejemplo, una forma de dosificación puede contener una sal no tóxica farmacéuticamente aceptable de los compuestos que tiene un bajo grado de solubilidad en fluidos corporales, por ejemplo, (a) una sal de adición de ácido con un ácido polibásico tales como ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido tánico, ácido pamoico, ácido algínico, ácido poliglutámico, ácidos naftaleno mono o disulfónicos, ácido poligalacturónico y similares; (b) una sal con un catión metálico polivalente tales como zinc, calcio, bismuto, bario, magnesio, aluminio, cobre, cobalto, níquel, cadmio y similares, o con un catión orgánico formado a partir de, por ejemplo, N,N'-dibenciletilendiamina o etilendiamina; o (c) combinaciones de (a) y (b), por ejemplo, una sal de tanato de zinc. Adicionalmente, los compuestos de la presente invención o, preferentemente, una sal relativamente insoluble como las que se acaban de describir, pueden formularse en un gel, por ejemplo, un gel de monoestearato de aluminio con, por ejemplo, aceite de sésamo, adecuado para inyección. Las sales particularmente preferidas son las sales de zinc, las sales de tanato de zinc, las sales de pamoato y similares. Otro tipo de formulación de depósito de liberación lenta para inyección contendría el compuesto o la sal dispersada para encapsularse en un polímero no antigénico, no tóxico y de degradación lenta tal como un polímero de ácido poliláctico/ácido poliglicólico, por ejemplo, como se describió en la patente de Estados Unidos núm. 3,773,919. Los compuestos o, preferentemente, las sales relativamente insolubles tales como las descritas anteriormente también pueden formularse en gránulos de silastic de matriz de colesterol, particularmente para su uso en animales. En la literatura se conocen formulaciones adicionales de liberación lenta, de depósito o de implante, por ejemplo, liposomas gaseosos o líquidos (Patente de Estados Unidos núm. 5,770,222 y "Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems", J. R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc., N.Y., 1978). Otras características de la invención serán evidentes en el curso de las siguientes descripciones de modalidades ilustrativas, que se brindan para la ilustración de la invención y no pretenden limitar la misma.

En los siguientes ejemplos, se usaron los siguientes materiales y métodos.

Materiales y métodos

Cultivo celular y tejidos humanos. La línea de células de neuroblastoma humano LAN-1 se proporcionó por el Dr. Robert Seeger (Hospital Infantil de Los Ángeles, Los Ángeles, CA) y NB1691 por el Dr. Peter Houghton (Hospital de Investigación Infantil St. Jude, Memphis, TN). NK-92MI se obtuvo de la Colección americana de cultivos tipo (ATCC), Manassas, VA. Todas las líneas de células se cultivaron en F10 [medio RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal al 10 % (Hyclone, South Logan, UT), glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 ug/ml a 37 °C en una incubadora a 5 % de CO2. Los tejidos normales, así como también las muestras de tumores sólidos de diferentes tipos histológicos obtenidos en el Memorial Sloan-Kettering Cancer Center (MSKCC), se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los pacientes y/o sus tutores de acuerdo con las directrices de la junta de revisión institucional de MSKCC.

Anticuerpos monoclonales. El 3F8 murino era un anticuerpo IgG3 de ratón con cadena ligera kappa (Cheung y otros, 1985, Cancer Res 45, 2642-9). Los anticuerpos monoclonales 3F8 (IgG3 de ratón, kappa), 5F11 (IgM de ratón, kappa) y 8H9 (IgG1 de ratón, kappa) reactivos con el neuroblastoma se han descrito previamente (Cheung y otros, 1985, arriba; Cheung y otros, 2004, J Nucl Med 45, 867-77; Modak y otros, 2001, Cancer Res 61, 4048-54). Se produjeron como ascitis y se purificaron mediante cromatografía de afinidad: proteína A (GE Healthcare, Piscataway, Nueva Jersey) para 3F8, proteína G para 8H9 y C1q-sefarosa (Pierce, Rockford, IL) para 5F11. Estos anticuerpos tenían >90 % de pureza mediante SDS-PAGE. Los fragmentos F(ab')2 se prepararon mediante digestión con pepsina como se informó anteriormente (Cheung y otros, 1988, J Clin Invest 81, 1122-28). El hibridoma anti-GD2 ME361 y TIB114 (N.S.7), un hibridoma que secreta un anticuerpo de control IgG3, se obtuvieron de ATCC. El 14.G2a se adquirió de BD Biosciences, San José, CA. El 14.18 quimérico fue amablemente se proporcionó por el Dr. Stephen Gillies de Lexigen Pharmaceuticals, Lexington, MA. El MAB1027 (MoAb anti-B7-H3) se adquirió de R&D System, Minneapolis, MN. El anticuerpo IgG3 de ratón S220-51 específico para GD2 se adquirió de Northstar Bioproducts, Cape Cod, MA.

Construcción de las líneas productoras de anticuerpos hu3F8-IgG1, hu3F8-IgG4, ch3F8-IgG1 y ch3F8-IgG4. En base a los homólogos humanos de m3F8, se injertaron secuencias CDR de cadenas pesadas y ligeras de m3F8 en la estructura de IgG1 humana y se optimizaron. A partir de dos genes de cadena pesada y dos de cadena ligera, se diseñaron cuatro versiones de hu3F8. Estos genes hu3F8 se sintetizaron y se optimizaron para células CHO (Blue Heron Biotechnology, Bothhell, WA o Genscript, Piscataway, NY). Mediante el uso del vector bluescript (Eureka, CA), estos genes de cadenas pesada y ligera de hu3F8 se transfectaron en células DG44 y se seleccionaron con G418 (InVitrogen, CA). Cuando se transfecta en células Mage1.5 CHO (Eureka, CA), se producen glicoformas de IgG especiales. De manera similar, se injertaron secuencias de VH y VL de ratón en estructuras de IgG1 e IgG4 humanas para producir los anticuerpos recombinantes ch3F8-IgG1 y ch3F8-IgG4.

Purificación de hu3F8 y ch3F8. Se cultivaron líneas productoras de Hu3F8 y ch3F8 en medio sin suero Opticho (InVitrogen, CA) y se recogió el sobrenadante maduro. La columna de afinidad de proteína A se equilibró previamente con amortiguador citrato de sodio 25 mM con NaCl 0,15 M, pH 8,2. El hu3F8 unido se eluyó con amortiguador de ácido cítrico/citrato de sodio 0,1 M, pH 3,9 y se alcalinizó (relación v/v 1:10) en citrato de sodio 25 mM, pH 8,2. Se pasó a través de una membrana Sartobind-Q y se concentró hasta 5-10 mg/ml en citrato de sodio 25 mM, NaCl 0,15 M, pH 8,2. Se realizaron estudios de estabilidad en hu3F8-IgG1 en citrato de sodio 25 mM, NaCl 0,15 M, pH 8,2 frente a PBS, pH 7,4, en presencia o ausencia de 0,7 mg/ml de tween 80 (Sigma).

SDS-PAGE. Se analizaron 2 |jg de cada una de las proteínas mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras mediante el uso de un sistema de gel listo para Tris-Glicina al 4-15 % (Bio-Rad, Hercules, CA). Se usó el estándar teñido previamente Invitrogen SeeBlue Plus2 como marcador del peso molecular de proteínas. Después de la electroforesis, el gel se tiñó mediante el uso del reactivo de tinción azul GelCode de PIERCE. El gel se escaneó mediante el uso de Bio-Rad Fluor-S MultiImager (Bio-Rad) y la intensidad de la banda se cuantificó con el programa Quantity One (Bio-Rad).

Cuantificación de hu3F8 y ch3F8 por ELISA. Las placas de microtitulación se recubrieron con GD2 a 20 ng por pocillo. Se añadieron 150 j l por pocillo de BSA al 0,5 % en PBS (diluyente) a cada placa durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente para bloquear el exceso de sitios de unión y luego se lavaron al menos tres veces con PBS. Se usó un lote purificado de hu3F8-IgG1 (concentración madre 1 mg/ml) para construir una curva estándar que comenzaba con 0,5 ug/ml seguido de diluciones al doble. Se añadieron 100 j l de estándar y muestras (también diluidas 2 veces) a cada pocillo y se incubaron durante 2,5 horas a 37 °C. Después de lavar las placas 5 veces con PBS, se añadieron 100 |jl de IgG anti-humana de cabra (H+L) (Jackson Research Laboratory) diluidos a 1:3500 en diluyente a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a 4 °C. La reacción de color ELISA se desarrolló con cromógeno OPD (Sigma) con el sustrato peróxido de hidrógeno durante 30 minutos a RT en la oscuridad. Las reacciones se detuvieron con H2SO45 N y la OD se leyó con lector de placas ELISA MRX (Dynex) a 490. En base a la curva estándar, la cuantificación de los sobrenadantes de hu3F8 se calculó en pg/ml o pg/mg de proteína.

La cinética de unión in vitro en el biosensor Biacore T-100 (Biacore AB de GE Healthcare, Uppsala, Suecia), el chip sensor CM5 (Research grade) y los reactivos relacionados se adquirieron en Biacore USA (Piscataway, Nueva Jersey). Los gangliósidos GM1 eran de ALEXIS Biochemicals (AX<x>O<r>A LLC, San Diego, CA) y GD2 de Advanced ImmunoChemical (Long Beach, CA). Se disolvió GM1 (0,5 mg/ml) en etanol al 90 %, metanol al 10 % (v/v) y se disolvió GD2 (0,5 mg/ml) en etanol. Los gangliósidos se inmovilizaron directamente en el chip sensor CM5 mediante interacción hidrófoba. La superficie de referencia se inmovilizó con GM1. GM1 se diluyó 1:1 con etanol al 100 % y luego se diluyó 1/5 en amortiguador HBS-E (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM y EDTA 3 mM). Se inyectó Gm 1 diluido (50 jg/ml) (300 jl) a una velocidad de flujo de 15 jl/min durante 20 min. Se siguió un lavado exhaustivo con NaOH 10 mM (típicamente cinco lavados de 20 j l a una velocidad de flujo de 5 jl/min) hasta que se obtuvo una línea base estable. La superficie activa se inmovilizó con GD2 y GM1 en una relación 1:1. GD2 y GM1 se diluyeron 1:1 con etanol al 100 % y se mezclaron en una relación 1:1. La mezcla de GD2 y GM1 se diluyó 1/5 en amortiguador HBS-E (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM y EDTA 3 mM). Se inyectó una mezcla diluida de GD2 y GM1 (50 jg/ml) (300 jl) a una velocidad de flujo de 15 jl/min durante 20 min. Se siguió un lavado exhaustivo con NaOH 10 mM (típicamente cinco lavados de 20 j l a una velocidad de flujo de 5 jl/min) hasta que se obtuvo una línea base estable.

Los MoAb anti-GD2 purificados se diluyeron en amortiguador HBS-E que contenía NaCl 250 mM en concentraciones variables (50 ~ 1600 nM) antes del análisis. 2. Se inyectaron muestras (60 jl) sobre la superficie del sensor a una velocidad de flujo de 30 jl/min durante 2 min. Una vez completada la fase de asociación, se controló la disociación en amortiguador HBS-E que contenía NaCl 250 mM durante 300 segundos a la misma velocidad de flujo. Al final de cada ciclo, la superficie se regeneró mediante el uso de 50 j l de NaOH 20 mM a una velocidad de flujo de 50 jl/min durante 1 min y 100 j l de MgCl24 M a una velocidad de flujo de 50 jl/min durante 2 min. Las curvas del biosensor obtenidas después de la inyección de las muestras sobre GD2 inmovilizado se restaron de las curvas de control obtenidas con las muestras inyectadas sobre GM1 inmovilizado antes del análisis cinético. Los datos se analizaron mediante el modelo de analito bivalente y la configuración de parámetros se predeterminó para las constantes de velocidad mediante el uso del programa de evaluación Biacore T-100, y la asociación aparente con la constante de velocidad (kas, ka1), la constante de velocidad de disociación (kdis, kd 1) y la constante de equilibrio de disociación (Ko=kd1/ka1).

Hu3F8 y ch3F8 se caracterizaron además con anticuerpos antiidiotípicos anti-3F8 de rata (Cheung y otros, 1993, Int J Can 54, 499-505). Estos anticuerpos IgG1 de rata también se digirieron en fragmentos Fab y se purificaron mediante el uso de un kit de preparación de Fab (Pierce Protein Research Products, Thermo Fisher Scientific). Sus reactividades de ch3F8 y hu3F8 se analizaron mediante ELISA y BIACORE.

El ELISA para la reactividad cruzada con otros gangliósidos GD2, GM2, GD1a, GD1b, GT1b, así como también GD3, GM3, GM1, GD1a se recubrieron a 20 ng por pocillo en etanol al 90 %. Después del secado al aire, los pocillos se bloquearon con BSA al 0,5 % en PBS a 150 j l por pocillo durante 1 hora a RT antes de lavarlos 3 veces en PBS. Los anticuerpos se añadieron por triplicado a 1 ug/ml (100 j l por pocillo) en BSA al 0,5 %. Para la resta del fondo, se usaron pocillos con (1) sin antígeno y (2) sin muestra. Después de la incubación durante 2 horas a 37 °C y el lavado con PBS 5 veces, se usaron HRP-anti-IgG de ratón obtenido en cabra (Jackson Laboratory, diluido a 1:1000) para anticuerpos de ratón (por ejemplo, 3F8) o HRP-anti-IgG humana obtenido en cabra (Jackson Laboratory, 1:1000) para anticuerpos humanizados. Después de una incubación adicional durante 1 hora a 4 °C y un lavado adicional, se leyó la OD mediante el uso de un lector de placas ELISA MRX (Dynex) a 490 y la reactividad cruzada se expresó como % de unión máxima a GD2.

Biotinilación del anticuerpo. Se disolvió éster de N-hidroxisuccinimida de biotina (brazo largo) (BNHS, Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) en dimetilsulfóxido (DMSO) a una concentración de 50 mg/ml. El reactivo de biotinilación se añadió en una relación en peso de 1/10 de reactivo al anticuerpo. Con agitación ocasional, la mezcla de reacción se incubó a RT durante 2 horas. El anticuerpo biotinilado se dializó en PBS a RT durante 4 horas o a 4 °C durante la noche. La inmunorreactividad del anticuerpo biotinilado se comparó con la del anticuerpo nativo y garantizó que la EC50 estuviera dentro del 20 % entre sí.

Reactividad cruzada del tejido mediante inmunotinción. Se cortaron secciones congeladas de 5-7 micrones de espesor mediante el uso de un criostato y se fijaron con 250 j l de acetona a -20 °C durante 30 minutos. Después de lavar los portaobjetos con PBS, los portaobjetos se expusieron a peróxido de hidrógeno al 0,1 % recién preparado durante 15 minutos a RT. Después del lavado, se añadió una solución de bloqueo de avidina (kit de bloqueo avidinabiotina VECTOR) y se incubó durante 20 minutos a RT. Después del lavado, se añadió una gota de una solución de bloqueo de biotina (kit de bloqueo avidina-biotina VECTOR) y se incubó durante 20 minutos a RT. Después de un lavado adicional, se añadieron >100 j l de suero bloqueador (10 % de suero de caballo recién diluido en PBS) y se incubaron durante 1 hora a RT. Esta etapa puede ser más larga. Nota: No debe reusarse el suero. Después de aspirar el suero bloqueador de cada portaobjetos, se añadieron 100 |jl de MOPC21 biotinilado 1 pg/ml (control negativo) o anticuerpo biotinilado diluido en suero de caballo al 1 % y se incubaron durante 1 hora a RT. Después del lavado, se añadieron 100 j l de complejo avidina-biotina [ABC] (kit Vectastain ABC, VECTOR) a una dilución 1:100 en PBS y se incubaron durante 30 minutos a RT. Después del lavado, se añadieron 200 j l del colorante (kit de sustrato de peroxidasa DAB, VECTOR) a cada sección y se dejó que se desarrollara el color durante 2 minutos (hasta que se logró la intensidad de tinción deseada en base al desarrollo del color en el estándar). Las secciones se lavaron con agua corriente del grifo durante 5 minutos y se contratiñeron con hematoxilina de Myer concentrada, y se realizaron más lavados con agua corriente del grifo durante 5 minutos. Los portaobjetos se deshidrataron secuencialmente en alcohol etílico al 75 %, luego al 95 % y luego al 100 %. La etapa de deshidratación final fue en xileno o sustituto de xileno. Se añadió una gota de Cytoseal fresco y luego se selló la sección con un cubreobjetos.

Citotoxicidad directa. Se probaron los anticuerpos para determinar su efecto directo sobre el crecimiento y la supervivencia de las células tumorales en ausencia de suero humano o células efectoras humanas. Las dianas tumorales se disociaron con EDTA 2 mM o tripsina-EDTA, se lavaron y se sembraron en placas de fondo plano de 96 pocillos en F10 de 1,2 x 103 a 3,5 x 104 por pocillo. Después de la incubación durante 24 horas en una incubadora de CO2 a 37 °C, con 5 % de CO2, se añaden a cada pocillo concentraciones crecientes de anticuerpos en F10. Los pocillos de control recibieron F10 solo. Después de la incubación durante 72 horas a 37 °C en 5 % de CO2, se añadió reactivo WST-8 a cada pocillo y se incubó en la oscuridad en una incubadora de CO2 a 37 °C durante 2-6 horas. La OD se leyó a 450 nm y 690 nm mediante el uso de un lector de placas ELISA MRX (Dynex). El ensayo WST-8 se validó mediante el uso de recuento celular directo mediante el uso de azul tripán (Sigma) o Beckman Coulter Counter (Beckman Coulter, Brea, CA).

Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) por liberación de 51cromo. Las células diana se separaron con EDTA 2 mM en PBS libre de Ca2+ Mg2+ y se lavaron en medio de ternero al 10 % (Gibco) en RPMI 1640 (F10).

100 jC i de 51Cr se incubó con 106 células diana en un volumen final de 250 j l y se incubaron durante 1 hora a 37 °C con una suave resuspensión del sedimento a intervalos de 15 minutos. Luego las células se lavaron y se resuspendieron en 250 j l de F10 y se incubaron durante 30 minutos a 37 °C. Después del lavado, se contaron las células y se determinó la viabilidad con azul tripán (Sigma) y se sembraron rápidamente en placas con fondo en U de 96 pocillos. Se recogió sangre periférica de voluntarios normales en tubos heparinizados. La sangre se mezcló con dextrano al 3 %/PBS y se mantuvo a RT durante 20 minutos para sedimentar los glóbulos rojos. Luego, los glóbulos blancos se recogieron y se separaron en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y granulocitos (PMN) para PBMC-ADCC y PMN-a Dc C, respectivamente. Las células se lavaron en F10, se contaron y se determinó la viabilidad. P<b>M<c>-ADCC se realizó en presencia de 10 U/ml de IL-2 y PMN-ADCC en 2 ng/ml de GMCSF. El volumen final de ADCC fue de 250 jl/pocillo. Los anticuerpos se diluyeron en F10 a partir de 1 pg/ml en diluciones de 3 o 5 veces. Las placas se centrifugaron a 500 rpm para centrifugado rápido a RT y luego se incubaron en una incubadora con 5 % de CO2 a 37 °C durante 4 horas. Se recogió el 51Cr liberado en el sobrenadante de ADCC para el recuento gamma. La liberación total se determinó mediante el uso de SDS al 10 % y la liberación espontánea de fondo se determinó solo con F10 sin efectores. Generalmente se usó una relación E:T de 50:1. De manera similar, los ensayos de ADCC se llevaron a cabo mediante el uso de células NK92-MI transfectadas de manera estable con los receptores de Fc CD16 o CD32 humanos. A diferencia de las PBMC o PMN, no se necesitaron citocinas en el ensayo. La relación E:T se mantuvo generalmente en 20:1.

(experim en tal — fondo)

% tisis específica = x 100 %

(total — fondo)

Yodación de anticuerpos. Se realizó la yodación mediante el uso de 124I y 131I mediante el uso del método yodogénico (Divgi y otros, 2007, Lancet Oncol. 8, 304-10). Se recubrió un vial de vidrio con 50 jg de yodógeno y se añadieron 100 jg de IgG en amortiguador fosfato 50 mM (pH 7,4) junto con 1 mCi de 124I (o 131I). El yodo 124 se produjo in situ mediante un ciclotrón en MSKCC. Se mezcló 10 mCi de 124I (0,02^0,05 ml) en NaOH 0,05 M con 1 mg de MoAb (-0,5 ml), 0,063 ml de base Tris 1 M y 0,4 ml de fosfato de sodio 0,2 M, pH 7,4 en el vial de reacción. Se dejó que la reacción transcurriera en hielo durante 15 minutos antes de eliminar la solución y purificarla mediante cromatografía de exclusión por tamaño con una columna de exclusión por tamaño P6 y un eluyente de BSA al 1 % en PBS.

Radioinmunoensayo (RIA)

Se usó el método de Lindmo para estimar la inmunorreactividad (Lindmo y otros, 1984, J Immunol Methods 72, 77 89). El MoAb radiomarcado se diluyó con BSA al 1 % hasta que 50 j l contenían aproximadamente 15000-20 000 cpm (aproximadamente 1-1,5 pCi/3 ml). Se añadieron 50 j l a 500 j l de BSA al 0,5 % que contenían 6,25, 3,75, 2,5, 2,2, 1,9 millones de células tumorales y se mezclaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de centrifugar a 1500 rpm durante 5 minutos, se eliminó el sobrenadante y se lavó con 1 ml de BSA al 0,5 % enfriado con hielo. Después de otra centrifugación a 1500 rpm durante 5 minutos se contaron los sedimentos celulares en el contador gamma. Se restaron los recuentos de fondo en ausencia de células o anticuerpos yodados y se estimó la inmunorreactividad mediante el método de Lindmo (Lindmo y otros, 1984, arriba).

Biodistribución de MoAb en ratones xenoinjertados. Se usaron ratones atímicos lampiños xenoinjertados con tumores de neuroblastoma sc LAN1 para estudiar la farmacocinética/biodistribución y las propiedades antitumorales. Los tumores se midieron con un calibrador. Los experimentos comenzaron cuando los tumores sc alcanzaron ~200 mg. Se inyectaron por vía intravenosa ~100 pCi de anticuerpo radioyodado por ratón y los animales se sacrificaron normalmente a las 48 horas, y sus órganos se extrajeron y se contaron en un contador gamma (Packard Instruments, Perkin Elmer). Estos órganos incluían piel, hígado, bazo, riñón, suprarrenal, estómago, intestino delgado, intestino grueso, vejiga, fémur, músculo, tumor, corazón, pulmón, columna y cerebro. En base a pCi acumulado en el órgano y el peso del órgano, se calculó el % de dosis inyectada (ID)/g de ratón. También se calcularon las relaciones entre tumor y tejido normal de % ID/g.

Análisis de azúcar

Los análisis de anticuerpos de monosacáridos y oligosacáridos se realizaron por el Centro de Investigación de Carbohidratos Complejos, Atenas, GA. El análisis de monosacáridos se analizó mediante HPAEC. El perfil de N-glicano se llevó a cabo mediante MALDI-MS.

Ejemplo 1

Secuencias de aminoácidos de IgG1 quimérica y cuatro IgG1 humanizadas. Las CDR de las cadenas pesada y ligera de m3F8 se injertaron en estructuras de IgG1 humana en base a su homología con las estructuras humanas de IGG HV3-33 e IGKV3-15, respectivamente. A partir de dos diseños de cadena pesada y dos de cadena ligera, se sintetizaron genes y se expresaron cuatro versiones de hu3F8 en células DG44. Las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera humanas quiméricas se muestran en las SEQ ID NO:1 y 2, respectivamente, la secuencia de la cadena pesada humanizada huH1-gammal en la SEQ ID NO:4, huH2-gamma1 en la SEQ ID NO: 6 y las secuencias de la cadena ligera humanizada huLl-kappa en la SEQ ID NO:5 y huL2-kappa en la SEQ ID NO:7. Cuando se expresan como IgG completa, las cuatro hu3F8-IgG1 se denominan hu3F8-H1L1-IgG1, hu3F8-H1L2-IgG1, hu3F8-H2L2-IgG1 y hu3F8-H2L1-IgG1. Se realizaron construcciones adicionales mediante el reemplazo de las secuencias de la cadena pesada de m3F8 y hu3F8-H1L1-IgG1 con la estructura de IgG4 humana (cadena pesada quimérica gamma4, SEQ ID NO:4 y cadena pesada gamma 4 de 3F8 humanizado, SEQ ID NO:8) transfectadas en células DG44 mediante el uso de los vectores bluescript. En otro conjunto de experimentos, la secuencia hu3F8-H1L1-IgG1 se transfectó en una línea de células MAGE1.5 CHO especial seleccionada para una firma de glicosilación especial (Véase Materiales y Métodos). Tanto el 3F8 quimérico como el humanizado se purificaron mediante el uso de cromatografía de afinidad de proteína A estándar.

En el gel SDS, los anticuerpos quiméricos y humanizados migraron como IgG con cadenas pesadas y ligeras del tamaño apropiado; y mediante HPLC todos eluyeron como IgG completa con <10 % de formación de agregados (datos no mostrados). Mediante ELISA, todos se unieron a GD2 con similar avidez. Mediante análisis FACS (LAN-1, datos no mostrados), los anticuerpos mostraron una concentración óptima de anticuerpos (~0,1 -1 pg/millón de células) más allá de la cual la intensidad de fluorescencia media (MFI) disminuyó debido a la muerte celular a concentraciones de anticuerpos más altas. Con el melanoma M14, la muerte celular no se produjo con un exceso de anticuerpos superior a 1 |jg por millón de células (datos no mostrados). La IgG4 tendía a tener un MFI más bajo debido a la reactividad preferencial del segundo anticuerpo fluorescente con la IgG1 humana. En comparación con las otras construcciones de hu3F8, hu3F8-H1L1-IgG1 fue la más estable después de la congelación y la descongelación, al conservar su unión a las células tumorales mediante FACS y ELISA (datos no mostrados). Según el análisis de azúcar, hu3F8-IgG1n tenía principalmente manosa y algo de N-acetil-glucosamina, por el contrario de hu3F8-IgG1 y hu3F8-IgG4 que contenían relaciones molares casi iguales de fucosa y N-acetil-glucosamina (Tabla 1).

Ejemplo 2

Mediciones de avidez por SPR (BIACORE)

Con GD2 recubierto sobre chips CM5, la cinética de unión de anticuerpos (kas, kdis y K<d>) se compararon mediante resonancia de plasmones superficiales mediante el uso de BIACORE T-100 con baja densidad de GD2 a baja densidad de GD2 (Tabla 2). Ambas kdis y K<d>mejoraron proporcionalmente para todos los anticuerpos con alta densidad de GD2 (datos no mostrados). Los sensorgramas de anticuerpos representativos a diferentes concentraciones de anticuerpos se compararon tanto con baja densidad de GD2 (datos no mostrados) como con alta densidad de GD2 (datos no mostrados) en los chips CM5 de BIACORE.

Tabla 1: Com osición de monosacáridos

continuación

La kdis lenta de anticuerpos se tradujo en una eliminación por lavado más lenta cuando los anticuerpos reaccionaron con células tumorales positivas para GD2. Aquí, las células LAN-1 (datos no mostrados) o las células M14 (datos no mostrados) reaccionaron con anticuerpos monoclonales y se lavaron varias veces en amortiguador de lavado. Con cada lavado, los anticuerpos restantes en la superficie celular se detectaron mediante el uso de un anticuerpo secundario anti-ratón obtenido en cabra marcado con FITC. El MFI se expresó como por ciento del valor inicial (es decir, después del primer lavado). En las células LAN-1, los anticuerpos 3F8 y anti-B7-H3 8H9 tuvieron una eliminación por lavado lenta (~80 % de retención después de 10 lavados) en comparación con 14.G2a (~30 % de retención, datos no mostrados). De manera similar para las células tumorales M14, por el 5to lavado, hubo una diferencia sustancial en la retención de anticuerpos en las células tumorales. Mientras que 3F8, 3F8-(Fab')2 y hu3F8-IgG1 (todos con kdis lenta) tuvieron >80 % de retención, otros anticuerpos anti-GD2 14.G2a (mIgG2a), ME361 (mIgG2a) y S220-51 (mIgG3) (todos con kdis rápida de BIACORE) se filtraron a <30 %. Hu3F8-IgG1, hu3F8-IgG4, ch3F8-IgG1 y ch3F8-IgG4 también reaccionaron específicamente con anticuerpos antiidiotípicos anti-3F8 de rata (Cheung y otros, 1993, Inter J Cancer 54, 499-505) y sus fragmentos Fab con alta avidez en ELISA y por SPR (Véase Métodos).

Ejemplo 3

Reactividad cruzada con otros antígenos.

En estudios de reactividad cruzada, hu3F8-H1L1-IgG1 tuvo un perfil similar al de ch3F8-IgG1 y m3F8 (Tabla 3). Hubo un nivel bajo de reactividad cruzada con GDlb expresado como por ciento de OD mediante ELISA con relación a la OD de GD2 en fase sólida. No hubo reactividad cruzada de m3F8, hu3F8 o 14.G2a con N-CAM humana (Patel y otros, 1989, Br. J. Cancer 60, 861-866) ya sea mediante inmunoelectrotransferencias o mediante SPR (datos no mostrados).

T l 2: in i ni n F im ri h m niz r PR BIA RE-T1

Ejemplo 4

Citotoxicidad directa

Cuando estos anticuerpos se añadieron a células de neuroblastoma in vitro, indujeron la muerte celular directa y desaceleraron el crecimiento celular in vitro. Cuando se analizaron con WST-8 en un sistema de cultivo de 3 días, m3F8 y hu3F8 tuvieron una potencia similar cuando se compararon sus EC50 (véase la Tabla 4), por el contrario de 14.G2a, que fue aproximadamente 10 veces más débil.

T l : R ivi r z n r n li i r ELI A

Ejemplo 5

Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos

Los cuatro anticuerpos hu3F8 IgG1 (H1L1, H1L2, H2L1, H2L2) se compararon en ensayos de ADCC mediante el uso de PBMC voluntarias (datos no mostrados) y PMN voluntarias (datos no mostrados) como efectores. Aparte de H1L2, los tres hu3F8 tenían PBMC-ADCC comparables. Pero lo más importante es que todos fueron superiores a m3F8 por un factor de >10-100.

T l 4: i xi i ir l n r l m LAN-1 n r n i ni r

Hu3F8-H1L1-IgG1 (abreviado como hu3F8-IgG1) fue el más estable in vitro y fue elegido para una mayor caracterización. Ch3F8-IgG1, hu3F8-IgG1, hu3F8-IgG1n, 14.G2a y m3F8 se compararon en ensayos de ADCC contra LAN-1 mediante el uso de PBMC (datos no mostrados) o PMN (datos no mostrados) como efectores. Las potencias ADCC de estos anticuerpos se calcularon como la relación (EC50 para 3F8)/(EC50 para MoAb) (Tabla 5). Con relación a m3F8, hu3F8-IgG1 fue 217 veces más fuerte en PBMC-ADCC y 19 veces más fuerte en PMN-ADCC. Para hu3F8-IgG1n, fue 3901 veces y 5 veces, respectivamente. Además, la citotoxicidad máxima lograda con 3F8 quimérico y humanizado fue sustancial y consistentemente mayor que la de m3F8 o 14.G2a, independientemente de si era PBMC-ADCC o PMN-ADCC.

Para examinar la capacidad de MoAb en ADCC para FcR individual de forma aislada (en ausencia de FcR inhibidor), probamos ADCC mediante el uso de células NK92. Las células NK92 no portan FcR humano en su superficie celular. Cuando se transfectan con CD16 y CD32 humanos, podrían mediar en ADCC eficiente. Cuando estas células efectoras se probaron contra dianas de neuroblastoma<l>AN-1, hu3F8-IgG1n fue sustancialmente (~10 veces) más eficiente que hu3F8-IgG1, que a su vez fue más eficiente (12 veces) que m3F8 en CD16-ADCC (datos no mostrados). Por el contrario, con CD32 como FcR, la potencia fue casi 10 veces mayor para hu3F8-IgG1 en comparación con la de hu3F8-IgG1n (datos no mostrados). Se observaron tendencias similares cuando se usó el melanoma M14 como diana. Hu3F8-IgG1n fue ~10 veces más eficiente que hu3F8-IgG1 o ch3F8-IgG1, que a su vez fueron ~20 veces más eficientes que m3F8 o 14G.2a (datos no mostrados) en CD16-ADCC. Por el contrario, hu3F8-IgG1, hu3F8-IgG1n y ch3F8-IgG1 fueron similares cuando CD32 fue el FcR, todos >10 veces más eficientes que m3F8 en CD32-ADCC (Tabla 6). Los anticuerpos de la subclase IgG4 tenían <3 % de actividad de CMC, actividad mínima de CD16-ADCC, pero mejor C32-ADCC que m3F8.

Ejemplo 6

Citotoxicidad mediada por el complemento

En la lisis mediada por el complemento humano (CMC), las diferentes formas de hu3F8 IgG1 (H1L1, H1L2, H2L1 y H2L2) fueron comparables en eficiencia (Tabla 6). Ch3F8 y hu3F8 fueron entre un 40-60 %, mientras que 14G.2a y ch14.18 fueron 4-12 % tan eficientes en CMC como m3F8 (Tabla 6).

Tabla 5: Potencia relativa de anticuer os en ADCC CMC contra el neuroblastoma LAN-1

Ejemplo 7

Direccionamiento a xenoinjertos de neuroblastoma humano

Hu3F8-IgG1, hu3F8-IgG1n y hu3F8-IgG4 se marcaron radioactivamente con 131I con inmunorreactividad comparable de alrededor de 40-45 % (Tabla 7). Se compararon sus biodistribuciones a las 48 horas con la de 131I-m3F8 en ratones portadores de xenoinjertos de neuroblastoma sc LAN-1. La captación del tumor cuando se midió por % ID/g fue comparable entre hu3F8-IgG1 (29,6 %) y m3F8 (28,6 %), ambos casi el doble que los de hu3F8-IgG1n y hu3F8-IgG4 (datos no mostrados). Las relaciones entre tumor y tejido normal fueron comparables entre estos 4 anticuerpos para xenoinjertos NB LAN-1. En comparación, con el melanoma M14, tanto el % ID/g como las relaciones entre tumor y tejido normal de los tres anticuerpos hu3F8 fueron similares a las de m3F8 (datos no mostrados).

Tabla 6: Potencia relativa de anticuer os en ADCC CMC contra melanoma M14

Ejemplo 8

Tratamiento de xenoinjertos de neuroblastoma

Los ratones xenoinjertados con neuroblastoma humano establecido LAN-1 (0,5-1 cm de diámetro) se trataron con m3F8 o hu3F8-H1L1-IgG1 iv dos veces por semana durante 4 semanas. Se monitoreó la respuesta del tumor y la supervivencia de los ratones. El retraso en el crecimiento del tumor dependió de la dosis de anticuerpo hu3F8-H1L1-IgG1 (200 |jg > 100 |jg > 20 pg, datos no mostrados). La supervivencia de los ratones que recibieron 100-200 |jg fue significativamente mayor (p=0,003) que la de los ratones que recibieron control de PBS o m3F8 (datos no mostrados).

Tabla 7: RIA de^ anticuer os marcados con 1311 en estudios de biodistribución

Análisis

El anticuerpo anti-GD2 es una terapia comprobada para el neuroblastoma positivo a GD2 (Yu y otros, N Engl J Med 363:1324-1334, 2010). El anticuerpo murino 14.18 y sus derivados (14.G2a y ch14.18) han proporcionado puntos de referencia para futuras mejoras de la terapia con anti-GD2. Elegimos el anticuerpo IgG3 murino m3F8 para el desarrollo clínico debido a su kdis 10 veces más lenta durante la unión a GD2 en comparación con 14.G2a o ch14.18. Entre los pacientes con neuroblastoma metastásico quimiorresistente en la médula ósea, m3F8 más GMCSF indujeron remisiones completas del 80 % (Kushner y otros, 2001, J Clin Oncol 19, 4189-94). Sin embargo, los anticuerpos humanos anti-ratón (HAMA) pueden disminuir el efecto del anticuerpo murino al neutralizar su capacidad para unirse a su antígeno, al bloquear el efecto directo del anticuerpo y al acelerar la eliminación del anticuerpo de la circulación. La ingeniería genética para cambiar las estructuras de IgG murinas a humanas debería reducir la respuesta de HAMA. Ch14.18 y hu14.18 (ambos derivados de VH y VL de 14.G2a) tienen una inmunogenicidad mínima en los pacientes. Por lo tanto, probamos las formas quiméricas y humanizadas de 3F8 como posibles anticuerpos anti-GD2 de próxima generación

Un criterio para una quimerización y humanización exitosa es la conservación de la afinidad durante la ingeniería genética. Esto es particularmente incierto con el injerto de CDR en el proceso de humanización. La conservación de una kdis lenta en ch3F8 y hu3F8 fue tranquilizadora. Pero lo que es más importante, la conservación y la mejora de la función efectora in vitro, así como también el direccionamiento a tumores in vivo más las propiedades terapéuticas in vivo, podrían ser fundamentales. Tanto ch3F8-IgG1 como hu3F8-IgG1 mostraron PBMC-ADCC >200 veces más eficientes que m3F8, mientras que PMN-ADCC fueron >20 veces. Además, la glicoforma especial hu3F8-IgG1n tenía PBMC-ADCC >3500 veces más eficiente y PMN-ADCC 5 veces más eficiente que las de m3F8. En marcado contraste, para CMC, ch3F8 y hu3F8 tenían una menor capacidad de activación del complemento que m3F8.

Esta gran mejora en ADCC es muy conveniente dada la evidencia reciente de su papel en los efectos antitumorales de los anticuerpos monoclonales en pacientes. Entre los pacientes con linfoma tratados con rituximab, tanto el FcR2A como el FcR3A de alta afinidad demostraron tener una mejor respuesta y ventaja en la supervivencia (Weng y Levy, 2003, J Clin Oncol 21, 3940-7). Mientras que el receptor de alta afinidad FcR3A se tradujo en una mejora <10 en ADCC in vitro (Niwa y otros, 2004, Clin Cancer Res 10, 6248-55), la respuesta general y el tiempo hasta la progresión mejoraron en un 200 % (Weng y Levy, 2003, arriba). Cuando el cáncer de mama metastásico se trató con Herceptin, los pacientes con FcR3A de alta afinidad tuvieron una mejor respuesta general (83 % frente a 35 %, p=0,03) y una supervivencia libre de progresión más prolongada (p=0,005) (Musolino y otros, 2008, J Clin Oncol 26, 1789-96). Para el cáncer colorrectal metastásico tratado con Cetuximab, los pacientes con FcR2A y FcR3A de baja afinidad tuvieron relaciones de riesgo comparables a los de los pacientes con KRAS mutado (Bibeau y otros, 2009, J clin Oncol 27, 1122-9). Con 3F8 murino, se demostró que los pacientes con el receptor de FcR3A de alta afinidad por m3F8 en células mieloides tenían una mejor supervivencia (Cheung y otros, 2006, J Clin Oncol 24, 2885-90).

Si bien la afinidad de unión y las funciones efectoras son fundamentales para las aplicaciones terapéuticas, la reactividad cruzada puede plantear problemas de toxicidad inesperados. Demostramos que estas formas quiméricas y humanizadas de 3F8 tenían patrones de reactividad cruzada comparables a los de 3F8 murino, tanto mediante ensayos ELISA con gangliósidos purificados, así como también mediante inmunohistoquímica en un panel de tejidos humanos normales (datos no mostrados). Al igual que m3F8, tanto la forma quimérica como la humanizada de 3F8 mostraron niveles bajos de reactividad con GD1b en comparación con GD2. Se ha demostrado que GD1b es un gangliósido altamente prevalente entre los tumores de neuroblastoma, especialmente cuando se diferencia por retinoides (Hettmer y otros, 2004, Br J Cancer 91, 389-97; Gong y otros, 2002, Brain 125, 2491-506). Esto puede ser relevante ya que el ácido cis-retinoico se administra de forma rutinaria a pacientes sometidos a inmunoterapia por neuroblastoma de alto riesgo. Sin embargo, los anticuerpos anti-GD1b también se han asociado con neuropatías atáxicas sensoriales (Gong y otros, 2002, arriba). Sin embargo, el perfil de seguridad de m3F8 (con reactividad cruzada similar a GD1b) sin neuropatías sensoriales permanentes o tardías en más de 500 pacientes fue tranquilizador.

La citotoxicidad mediada por el complemento (CMC) es inusualmente efectiva contra el neuroblastoma humano (Saarinen y otros, 1985, Proc Amer Assoc Cancer Res 26, 291) debido a su baja expresión de CD55 (Cheung y otros, 1987, Proc Natl Am Assoc Cancer Res 28, 387) y CD59 (Chen y otros, 2000, arriba). Todos los anticuerpos anti-GD2 median una citotoxicidad mediada por el complemento eficiente, y m3F8 parece particularmente eficiente. Sin embargo, los estudios de rituximab han sugerido un papel negativo de la activación del complemento en la regulación negativa de ADCC (Wang y otros, 2009, Blood 114, 5322-30). En estudios clínicos, una mayor actividad del complemento C1qA se asoció con una respuesta menos favorable a la terapia con rituximab (Racila y otros, 2008, Clin Cancer Res 14, 6697-703). Para los anticuerpos anti-GD2, se pensaba que la activación del complemento era responsable de los efectos secundarios del dolor (Navid y otros, Curr Cancer Drug Targets 10:200-209, 2010) de ahí la versión mutada del dominio Fc-CH2 (hu14.18K322A) actualmente en ensayo clínico. Dadas estas consideraciones, probablemente no sea conveniente un exceso de CMC. Es tranquilizador que tanto ch3F8 como hu3F8 tuvieran una CMC ligeramente menos eficiente.

Ejemplo 9

Uso de anticuerpos para bloquear los efectos secundarios del dolor agudo

Se planteó la hipótesis de que el anticuerpo con kdis lenta, pero sin actividad ADCC o CMC podría usarse para bloquear GD2 en las fibras nerviosas que rodean el espacio perivascular. El tratamiento térmico de 3F8 (HM3F8) elimina sus actividades ADCC y CMC sin afectar su unión a GD2 (Kushner y otros, 2011, J Clin Oncol 29, 11681174). Cuando a las ratas se les inyectó previamente 3F8 tratado térmicamente, su respuesta de dolor a una inyección posterior de un exceso de 5-10 moles de 3F8 nativo se redujo sustancialmente. Más importante aún, el efecto antitumoral no se vio comprometido. En un ensayo clínico de fase I (IRB-05015, NCT00450307), 30 pacientes con neuroblastoma (NB) resistente recibieron uno o dos ciclos de 3F8 más factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos en el ámbito ambulatorio. La dosificación de 3F8 comenzó con 20 mg/m2/d y aumentó en 20 mg/m2/d en ausencia de toxicidad limitante de la dosis (DLT). La medicación previa incluyó analgésicos, antihistamínicos e infusiones de 2 mg/m2 de HM3F8 durante 5 minutos. El uso de opioides se comparó con un grupo de control contemporáneo tratado con 3F8 a 20 mg/m2/d, pero no HM3F8. El aumento de la dosis se detuvo a 160 mg/m2/d debido a limitaciones en el suministro de fármacos; incluso a través de este nivel de dosificación, los requisitos analgésicos fueron similares a los controles históricos y no hubo DLT. Los requerimientos de analgésicos en niveles de dosificación de 3F8 hasta 80 mg/m2/d fueron significativamente menores en comparación con los controles. La actividad anti-NB se produjo en todas las dosis. Este aumento múltiple de la dosis de 3F8 fue factible y sugirió que HM3F8 podría modificar la toxicidad sin mitigar la actividad anti-NB.

Potencial de bloqueo del dolor de hu3F8-IgG4

En base a los resultados clínicos de HM3F8, planteamos la hipótesis de que las fibras del dolor perivascular pueden bloquearse preferentemente con una pequeña dosis de un anticuerpo desprovisto de función CMC o ADCC. Aunque el calentamiento de m3F8 destruye sus funciones CMC y ADCC (al tiempo que conserva la unión), el hu3F8 modificado con calor conserva las funciones CMC y ADCC casi completas. La incapacidad de hu3F8-IgG4 para activar CMC y ADCC en diferentes líneas de células de NB tales como Lan1, NMB7, SKNLP, BE(1)N y SHEP1 (Tabla 8 y datos no mostrados) hace que esta subclase de anticuerpos sea una alternativa viable para HM3F8. A diferencia del calentamiento, con efectos desconocidos sobre la estructura y la inmunogenicidad de los anticuerpos, hu3F8-IgG4 es una proteína modificada. Además de la ausencia de funciones CMC y ADCC, la subclase IgG4 tiene propiedades bioquímicas únicas. Típicamente inducidos por estimulación crónica de antígenos, se sabe que interfieren con la formación de complejos inmunitarios por otros isotipos de anticuerpos, que amortigua de esta manera las reacciones inflamatorias (Losen y otros, 2008, Ann N Y Acad Sci 1132, 174-9). Lo más importante es que tiene una capacidad natural para reducirse a monovalencia, lo que pierde de esta manera su capacidad de competir con hu3F8-IgG1 después de un período de horas en sangre (van der Neut Kolfschoten y otros, 2007, Science 317, 1554-7). Dicha monovalencia se deriva de su propiedad conocida de intercambiar brazos Fab mediante el intercambio de una cadena pesada y una cadena ligera unida (media molécula) con un par de cadenas pesadas y ligeras de otra molécula de IgG4, lo que da como resultado una monovalencia hacia el antígeno específico en cuestión (por ejemplo, GD2).

Modelo de alodinia de rata El modelo de rata se usó para probar la capacidad de hu3F8-IgG4 para bloquear los efectos secundarios del dolor (protocolo MSK núm. 09-05-010). Tanto m3F8 (un activador eficiente del complemento de rata, Bergman y otros, 2000, Cancer Immunol Immunother 49, 259-66) como hu3F8 se usaron para inducir alodinia. Se administró Hu3F8-IgG4 (0,1, 0,25 o 0,5 mg/kg) como inyección iv 30 minutos antes de m3F8 iv (5 mg/kg), o hu3F8-IgG1 (5 mg/kg), o ch14.18 (5 mg/kg). Otros grupos reciben m3F8 modificado térmicamente (HM3F8) o anticuerpos de control en lugar de hu3F8-IgG4. Se usó el método de filamentos de Von Frey para evaluar el dolor basal antes y después de la inyección de MoAb (Chassaing y otros, 2006, Br J Clin Pharmacol 61, 389-97; Benani y otros, 2003, Eur J Neurosci 18, 2904-14).

Efecto de hu3F8-IgG4 en la biodistribución y la eficacia de 131I-hu3F8-IgG1. Se plantaron tumores de neuroblastoma (LAN-1) por vía subcutánea en grupos de ratones inmunodeficientes hembras NOD/SCID/IL2-gcnul° (n=10 por grupo) con IgG sérica baja. A los ratones se les inyectó IgG humana a 1 g/kg en 24 h antes del experimento. Se administraron Hu3F8-IgG4 (0,1, 0,25 o 0,5 mg/kg) o huIgG4 de control (0,1, 0,25 o 0,5 mg/kg), o HM3F8 (0,5 mg/kg), o solución salina como inyección iv, se marcó con trazas 30 minutos antes de m3F8, o hu3F8-IgG1 o ch14.18 (5 mg/kg) con MoAb marcado con 131I respectivo (50 pCi/ratón). Se recogió sangre de la cola a las 1, 3, 6, 12, 24, 36, 48 y 96 h. En estudios de biodistribución, los ratones se sacrificaron en 2 momentos (24 h y 48 h después de la inyección con 131I-MoAb) para los recuentos de tejido. Los órganos principales se extrajeron y se contaron en un contador gamma con un volumen conocido del inyectado y los datos se expresaron como un porcentaje de ID/g de tejido. El análisis farmacocinético se llevó a cabo mediante análisis no compartimental de los datos de concentración sérica-tiempo mediante el uso del programa WinNonlin (Pharsight Corp., Mountain View, CA). En conjuntos separados de experimentos, los ratones xenoinjertados se trataron de manera similar, pero sin marcador en traza de 131I, y su respuesta del tumor sc se midió con el tiempo durante 2 meses.

La capacidad de hu3F8-IgG4 para bloquear la alodinia en la rata puede compararse con la del m3F8 tratado térmicamente. En base a las curvas de respuesta a la dosis del anticuerpo bloqueador usado (mientras se mantiene la exposición con m3F8 nativo, o hu3F8-IgG1 o ch14.18, todos a 5 mg/kg), puede derivarse una potencia relativa en el bloqueo de la alodinia en la rata. Anticipamos que hu3F8-IgG4 será equivalente o más eficiente en comparación con 3F8 tratado térmicamente para bloquear la alodinia. Estos estudios proporcionarán fundamentos preclínicos para la transición de hu3F8-IgG4 a un ensayo clínico.

Ejemplo 10

Optimización de la secuencia de la estructura de hu3F8 para una mayor estabilidad.

En el proceso de humanización de anticuerpos murinos, los residuos estructurales en posiciones estructuralmente importantes a menudo se mutan nuevamente a la secuencia murina para conservar tanto la estabilidad del anticuerpo como la unión al antígeno (Honegger, A, 2008, Engineering Antibodies for Stability and Efficient Folding, En: Therapeutic Antibodies. Handbook of Experimental Pharmacology, 181).

Materiales y Métodos

Modelo estructural del dominio variable de m3F8

Se generó un modelo de homología del dominio variable de m3F8 mediante el uso de MODELER (Eswar y otros, 2006, Curr Prot Bioinfor, Suplemento 15, 5.6.1-5.6.30) en Discovery Studio (Accerlys, San Diego, CA). Se eligió la estructura cristalina del Fab del anticuerpo contra el antígeno de malaria AMA1 (Código 2Q8A de Protein Data Bank) como una plantilla para la cadena ligera variable (84 % de identidad). Se eligió la estructura cristalina del Fab del anticuerpo 13G5 (Código 2GJZ de Protein Data Bank) como la plantilla para la cadena pesada variable.

Estructura cristalina del fragmento Fab de m3F8.

Se generaron fragmentos Fab de m3F8 mediante digestión con papaína mediante el uso de un kit de preparación de Fab estándar (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). El m3F8 purificado se concentró a 12 mg/ml en HEPES 20 mM pH 6,5 y se cristalizó en una gota colgante por difusión de vapor a 16 °C contra un depósito que contenía reactivo Hampton Index D9 que contenía Tris 0,1 M pH 8,5, PEG 3350 al 25 % p/v (Hampton Research, Aliso Viejo, CA). La gota se formó al mezclar 1 pl de solución de proteína y 1 pl de solución de depósito. Los cristales se protegieron con un crioprotector que contenía glicerol al 25 %, Tris 0,1 M, pH 8,5, PEG 3350 al 25 % p/v. Los datos se recopilaron en Argonne Advanced Photon Source Beamline 24IDC. Los cristales pertenecen al grupo espacial C2 y se difractan con una resolución de 1,7 A.

La estructura de Fab se resolvió por la sustitución molecular mediante el uso de Phaser (CCP4 suite) (McCoy y otros, 2007, J Appl Crystallogr 40, 658-674) y la entrada PDB 2AJU como modelo de búsqueda (Qin y otros, 2008, J Biol Chem 283, 29473-84). El mejor modelo de sustitución molecular se perfeccionó mediante el uso de Refmac5 (Murshudov y otros, 1997, Acta Crystallogr. D: Biol. Crystallogr 53, 240-255), el ajuste manual se realizó con O (The CCP4 suite: programs for protein crystallography. Acta Crystallogr., D: Biol. Crystaollogr. 50 (1994) 760-763), al añadir solvente con Arp-Warp (Lamzin y Wilson, 1993, Acta Crystallogr, D: Biol. Crystallogr. 49, 129-147). El modelo final contenía dos cadenas polipeptídicas de m3F8 Fab y 585 moléculas de solvente.

Análisis computacional de la estructura cristalina de m3F8.

En base a las plantillas humanas IgHV3-33-HC e IGKV3-15-LC, cada mutación humanizante que se introduciría en la estructura de m3F8 se analizó mediante el uso de métodos de química computacional. La estructura cristalina de m3F8 se simuló mediante el uso de campos de fuerza CHARMm (Química en Mecánica Molecular de Harvard) (Brooks y otros, 2009, J. Comp Chem 30, 1545-1615), y el efecto de cada mutación puntual se calculó a partir de la diferencia entre la energía libre de plegado de la estructura mutada y la proteína natural. Se usó la aproximación generalizada de Born para tener en cuenta el efecto del solvente y todos los términos electrostáticos se calcularon como una suma de interacciones coulombianas y contribuciones polares a la energía de solvatación. Para cada mutación puntual se calculó una suma ponderada de los términos de van der Waals, electrostático, de entropía y no polares. Todos los cálculos se realizaron mediante el uso de Discovery Studio 3.0 (Accelrys, San Diego, CA).

Resultados

Para la secuencia de la cadena pesada de hu3F8-H1L1, se usó la secuencia de la cadena pesada de IgG humana de IgHV3-33-HC como una plantilla y se realizaron retromutaciones en las posiciones 5, 9, 16, 19, 20, 24, 28, 29, 30, 40, 48, 49, 67, 71, 76, 78, 81, 86 y 92. Para la cadena ligera de hu3F8-H1L1, se usó la secuencia de la cadena ligera de IgG humana de IGKV3-15-LC como una plantilla y se realizaron retromutaciones en las posiciones 1, 7, 9, 15, 19, 21, 22, 43, 45, 58, 60, 67, 70, 73, 78, 80 y 87. Las retromutaciones se dedujeron en base a los modelos de homología de m3F8 e implicaron determinar si las mutaciones influirían en el plegado de los lazos de CDR o afectarían la estabilidad de la cadena principal (mutaciones que involucran a Gly y Pro).

Para verificar la precisión del modelo de homología y mejorar aún más la estrategia de humanización, la estructura cristalina de m3F8 se resolvió a 1,7 A (datos no mostrados). El modelo de homología de la región variable de m3F8 se superpuso con la estructura cristalina resuelta (datos no mostrados). El modelo de homología para la mayor parte de la región de marco estructural fuera de la CDR coincidía estrechamente con la estructura cristalina derivada experimentalmente. Sin embargo, se observaron diferencias notables en la región CDR, particularmente en los lazos H3, H2 y L3. El modelo de homología tampoco logró predecir con precisión ninguna de las interacciones en la interfaz VH-VL, que son cruciales para la estabilidad de la estructura Fv. Hay 6 pares de aminoácidos que forman enlaces de hidrógeno en la interfaz VH-VL y dos pares de aminoácidos que participan en interacciones pi (Tabla 10). Una vez resuelta la estructura cristalina de m3F8, se aplicó un análisis computacional para determinar el efecto energético de cada mutación humanizante en base a las plantillas de IgHV3-33-HC e IGKV3-15-LC. Se calculó la diferencia en la energía libre de plegado para cada mutación. En base a este análisis, se encontró que cinco de las mutaciones humanizantes eran desestabilizadoras para el plegado general de m3F8 (véase Tabla 9). Estas incluyen las posiciones 11 y 21 de la cadena pesada, y las posiciones 1, 10, 12, 40 y 97 de la cadena ligera. También se determinó que las mutaciones humanizantes que involucran a Pro y Gly en la cadena ligera en las posiciones 40 y 97, respectivamente, afectarían significativamente la flexibilidad de la cadena principal. Estas cinco mutaciones desestabilizadoras, además de las dos mutaciones Gly/Pro, se consideraron candidatas para la retromutación y se incluyen en la secuencia de hu3F8-H3L3 (SEQ ID NO:9 y 10). El análisis computacional de la estructura cristalina de m3F8 también identificó cinco mutaciones humanizantes que tendrían efectos neutrales en la estabilidad de los anticuerpos (datos no mostrados). Estas mutaciones se encuentran en las posiciones 24 y 56 de la cadena ligera y en las posiciones 20, 58 y 92 de la cadena pesada. Estas mutaciones no se incluyeron en la secuencia de hu3F8-H1L1 (SEQ ID NO:4 y 5), que se basó en el modelo de homología, pero se incluyen en el diseño de hu3F8-H3L3.

Se realizó un análisis de la interfaz VH-VL de la estructura cristalina de m3F8 para conservar cada uno de los enlaces de hidrógeno y las interacciones pi en hu3F8 (Tabla 10). De los 15 aminoácidos que participan en las interacciones de la interfaz, 14 se conservaron en el diseño de hu3F8-H1L1 y hu3F8-H3L3. La única interacción que falta involucra a Ser43 en la cadena ligera. Esta mutación se añadió al diseño de hu3F8-L1 y hu3F8-L3 para generar Hu3F8-L1S y Hu3F8-L3S.

Estas estructuras de estabilidad mejoradas no habrían sido posibles con el estado actual de la técnica, que implica el uso de modelos de homología para diseñar estructuras humanizadas estables. Fue necesario el uso de una estructura cristalina de m3F8 derivada experimentalmente en combinación con el análisis computacional mediante el uso de métodos de campo de fuerza para diseñar nuevos anticuerpos con perfiles de estabilidad mejorados.

Tabla 9. Análisis com utacional de mutaciones humanizantes en la estructura cristalina de m3F8 Fv

Tabla 10. Interacciones im ortantes entre aminoácidos en la interfaz VH-VL de la estructura cristalina de m3F8 Fv

continuación

Ejemplo 11

Anticuerpo 3F8 de mayor afinidad en base al análisis computacional de la interacción 3F8:GD2

La estructura cristalina de m3F8 se usó como una plantilla para estudios computacionales para determinar los detalles moleculares del reconocimiento del antígeno. El antígeno GD2 está compuesto por un grupo principal de pentasacárido unido a una cola lipídica de ceramida. En ausencia de un complejo conjunto de 3F8:GD2 derivado experimentalmente, se intentó el acoplamiento computacional solo con el grupo principal del pentasacárido de GD2, donde el resto de ceramida se reemplazó por un grupo metilo. La molécula de pentasacárido de GD2 presentó un desafío importante para los estudios de acoplamiento, dado el estado del campo en el acoplamiento computacional. En primer lugar, el acoplamiento de grandes ligandos flexibles es difícil de predecir con precisión. El grupo principal de GD2 tiene más de 30 enlaces giratorios. No existe ningún protocolo de acoplamiento establecido que sea preciso para un ligando con un grado tan alto de flexibilidad. En segundo lugar, el grupo principal de GD2 es una molécula de carbohidrato y hay pocos informes sobre la precisión de los estudios de acoplamiento cuando se aplican métodos de campo de fuerza a moléculas de carbohidrato. En tercer lugar, el grupo principal de GD2 es una clase especial de carbohidratos ya que contiene dos grupos cargados que se encuentran en sus restos de ácido siálico. No se ha demostrado que ningún método de acoplamiento establecido prediga con precisión la conformación de unión de carbohidratos tan grandes, flexibles y cargados.

Un algoritmo de acoplamiento que se ha demostrado que es confiable para predecir la conformación de unión de oligosacáridos (aunque no contienen residuos siálicos cargados) es GLIDE (Agostino y otros, 2009, J Chem Inf Model 49, 2749-60). El informe mostró que GLIDE superó a AutoDock, GOLD y FlexX en la predicción de la conformación de unión de oligosacáridos a los anticuerpos en comparación con las estructuras cocristalinas derivadas experimentalmente. Se debe señalar que ninguno de los antígenos probados era más grande que un tetrasacárido. Otro algoritmo de acoplamiento prometedor en la literatura fue CDOCKER (Wu y otros, 2003, J. Comp Chem 24, 1549), un algoritmo de acoplamiento basado en CHARMm que demostró superar a DOCK, FlexX y GOLD en la predicción precisa de la conformación de acoplamiento de ligandos con 8 o más enlaces giratorios (Erickson y otros, 2004, J Med Chem 47, 45-55). Se debe señalar que los oligosacáridos no se analizaron en el estudio y que los ligandos probados eran mucho más pequeños y menos flexibles que el grupo principal de GD2 (>30 enlaces giratorios).

Se realizó una comparación directa entre GLIDE y CDOCKER en ligandos de acoplamiento similares a GD2 (oligosacáridos que contienen ácido siálico) mediante el uso de tres casos de prueba disponibles del banco de datos de proteínas (código PDB 2HRL: Siglec-7 en complejo con GT1b; código PDB 3BWR: virus simio VP1 en complejo con GM1; y código PDB 3HMY: Toxina tetánica HCR/T en complejo con GT2). En los dos de los tres casos de prueba, CDOCKER pudo predecir con precisión el modo de unión correcto del oligosacárido respectivo (dentro de una desviación cuadrática media de 2 Ángstom).

GLIDE acopló incorrectamente dos de los tres casos de prueba (desviación cuadrática media >2 Ángstom) y no pudo encontrar una posición acoplada en el tercer caso de prueba. (véase la Tabla 11). Según este análisis, CDOCKER superó a GLIDE en el acoplamiento de oligosacáridos cargados. GLIDE falló en cada uno de los casos (véase Tabla 11). Luego se usó CDOCKER para acoplar el grupo principal del pentasacárido de GD2 al bolsillo de unión al antígeno de la estructura cristalina de m3F8. Luego se minimizó la energía de la estructura acoplada superior mediante el uso de campos de fuerza CHARMm. El análisis indicó 14 aminoácidos que interactúan directamente con el grupo principal de GD2 (Tabla 12). Cada una de estas posiciones se mutó luegoin s ilicoa todos los aminoácidos posibles y se calcularon las energías de interacción basadas en CHARMm. Los mutantes con la máxima interacción se enumeran en la Tabla 13. En base a este enfoque, se predijo que una mutación (Gly54Ile en la cadena pesada) para aumentar significativamente la energía de interacción. El modelado computacional mostró que la sustitución de Gly en la posición 54 por Ile en la CDR3 de la cadena pesada cambiaría la forma del bolsillo de unión y aumentaría el contacto con el ligando GD2. Este análisis se usó para añadir la mutación de la cadena pesada Gly54Ile a las regiones CDR de las secuencias de huH1-gamma1 y huH3-gamma1 para generar huH1I-gamma1 y huH3I-gamma respectivamente.

Métodos de acoplamiento

El acoplamiento GLIDE se realizó mediante el uso de Schrodinger Suite 2009 (Schrodinger, Nueva York, NY). Se usaron campos de fuerza OPLS para parametrizar las proteínas y los ligandos. Las posiciones de los ligandos superiores se agruparon dentro de una desviación cuadrática media de 2,0 Á y se calificaron mediante GlideScore. Las mediciones de energía de interacción y acoplamiento de CDOCKER se realizaron mediante el uso de Discovery Studio 3.0 (Accelrys, San Diego, CA). Se usaron campos de fuerza CHARMm para parametrizar las proteínas y los ligandos. Las posiciones de los ligandos superiores se agruparon dentro de una desviación cuadrática media de 2,0 A y se calificaron mediante CDOCKER Interaction Energy.

Tabla 11. Comparación de los algoritmos de acoplamiento GLIDE frente a CDOCKER en la predicción de complejos

Ejemplo 12

Mejora de las funciones efectoras al mejorar las afinidades por el antígeno y el receptor de Fc (FcR)

El MoAb anti-GD2 es una terapia comprobada para el neuroblastoma metastásico (NB) quimiorresistente, y ch14.18 proporciona un punto de referencia para MoAb de próxima generación. La combinación de MoAb anti-GD2 de ratón 3F8 (m3F8) y el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GMCSF) ha inducido consistentemente la remisión completa de la médula ósea en el 80 % de los pacientes con NB refractario primario. Entre los pacientes tratados en la primera remisión parcial completa/muy buena (CR/VGPR), esta combinación más 13-cis-Tabla 12. Los residuos de aminoácidos 3F8 que interactúan directamente con GD2 en base a CDOCKER y el ácido retinoico de minimización de energía CHARMm mejoraron la PFS al 51 % ± 7 % y la OS al 80 % ± 5 % en los últimos 5 años. Los análisis de resultados han demostrado repetidamente la importancia de la afinidad de FcR en base a los polimorfismos genéticos en la terapia con MoAb de NB y otros tumores sólidos. Mejorar las afinidades por el antígeno y por FcR sin sacrificar la especificidad debería mejorar la eficacia de MoAb in vitro e in vivo.

Tabla 12. Residuos de aminoácidos 3F8 que interactúan directamente con GD2 en base a la minimización de ener ía CDOCKER CHARMm

Tabla 13. Principales mutantes de CDR a partir de análisis mutacionalin s ilicode residuos que interactúan de 3F8 n l r rin i l D2

Métodos:

El 3F8 quimérico (ch3F8) y el 3F8 humanizado (hu3F8) de la subclase huIgG1 se construyeron mediante ingeniería genética, se expresaron en células CHO y se purificaron mediante cromatografía de afinidad con proteína A. Se produjo una glicoforma de Fc de hu3F8 (hu3F8n o hu3F8-MAGE1.5) que carecía de fucosa y N-acetilglucosamina en células CHO MAGE1.5 especiales. Las afinidades de estas formas de MoAb por GD2 y FcR se compararon mediante el uso de BIACORE T-100. Las funciones efectoras se probaron mediante el uso de ensayos de citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC) y de citotoxicidad mediada por el complemento (CMC), y sus potencias se derivaron de la EC50 de MoAb. Estas estrategias se aplicaron a MoAb contra otros sistemas de antígenos tumorales (B7-H3, HER-2, CSPG4, LI CAM) con potencial clínico. Resultados:

Ch3F8 y hu3F8 mantuvieron una K<d>similar a la de m3F8, todos comparten una kdis 10 veces más lenta, en comparación con 14G.2a o chl4.18, lo que resulta en una K<d>más favorable y mayor tiempo de residencia. M3F8, ch3F8 o hu3F8 inhibieron la proliferación de líneas de células de NB in vitro, mientras que otros anticuerpos anti-GD2 resultaron inefectivos. En células mononucleares de sangre periférica (PBMC)-ADCC, granulocitos (PMN)-ADCC o CMC, ch3F8 y hu3F8 fueron más de 10 veces más fuertes que chl4.18. PBMC-ADCC de hu3F8n fue 10 veces más eficiente que hu3F8 y >100 veces más potente que m3F8. Mientras 131I-hu3F8 en los estudios de biodistribución mostró relaciones entre tumor y tejido normal comparables a las de 131I-m3F8, hu3F8 demostró un efecto antitumoral superior contra los xenoinjertos de NB. Aunque podrían sacarse conclusiones similares para los anticuerpos quiméricos y humanizados específicos para otros sistemas de antígenos tumorales, la naturaleza del epítopo/antígeno tumoral fue fundamental para determinar la eficiencia de la destrucción del tumor.

Conclusiones:

Mientras kdis (o K<d>) para el antígeno o FcR mejoraron individualmente las funciones efectoras, en conjunto sus efectos parecieron multiplicativos para el MoAb anti-GD2 3F8. Las estrategias futuras dirigidas a mejorar ambas afinidades deberían ampliar aún más la eficacia clínica de MoAb observada hasta ahora.

Ejemplo 13

Modificación adicional de Fc para mejorar la unión de FcR:

Se han preparado Hu3F8-IgG1-DEL con la triple mutación DEL (S239D/A330L/I332E) (Lazar y otros, 2006, PNAS USA 103, 4005-10) en la cadena pesada con un aumento sustancial de la afinidad por FcR3A y FcR2A, pero también por FcR2B (véanse los datos de BIACORE en la Tabla 14). Sin embargo, la relación A/I para las señales activadoras frente a las inhibidoras de hu3F8-IgGn es 196 para CD16-158V, en comparación con 30 para hu3F8-IgG1-DEL, lo que se ha postulado que tiene ventajas clínicas (Nimmerjahn y Ravetch, Immunol Rev, 236:265-275, 2010).

Tabla 14: Actividad relativa. Se determinó la K<d>al hacer fluir los anticuerpos sobre FcR recombinante en un chip CM5 mediante el uso de BIACORE T-100. Todos los valores se normalizaron para la unión de hu3F8-IgG1 a FcRIII-

158F.

ADCC mediada por CD16 en neuroblastoma LAN-1.

Se añadieron células efectoras NK92-CD16 a dianas tumorales de neuroblastoma LAN1 en una relación efector:diana de 5:1 a diferentes concentraciones de anticuerpos en un ensayo de liberación de 51Cr de 4 horas. El aumento de la afinidad por FcR se tradujo en un aumento de la potencia de ADCC mediada por CD16 o CD32. Para ADCC mediada por CD16 (datos no mostrados), hu3F8-IgG1-DEL y hu3F8-IgG1n fueron equivalentes.

Lisis mediada por el complemento de neuroblastoma LAN-1.

Se añadió complemento humano a dianas tumorales de neuroblastoma LAN-1 en una dilución final de complemento sérico de 1:100, a concentraciones crecientes de anticuerpos en un ensayo de liberación de 51Cr de 4 horas. En la lisis mediada por el complemento (CMC, datos no mostrados), hu3F8-IgG1-DEL no fue peor que hu3F8-IgG1 o hu3F8-IgG1n. Cuando la triple mutación en la cadena pesada de IgG se combinó con hu3F8-IGg1n, no hubo ninguna mejora adicional en ADCC.

Ejemplo 15

Interacción de linfocitos T y efectoras in vivo

Las células T o linfocitos T son WBC que desempeñan un papel clave en la inmunidad mediada por células. Pueden distinguirse de otros tipos de linfocitos, tales como los linfocitos B y las células citotóxicas naturales (NK) por la presencia de un receptor especial en su superficie celular llamado receptores de linfocitos T (TCR). También portan un marcador de superficie único llamado CD3. T significa timo, que es el principal órgano responsable de la maduración de los linfocitos T. Existen varios subconjuntos de linfocitos T, cada uno con una función distinta. Los linfocitos T colaboradores (linfocitos TH) ayudan a otros WBC en procesos inmunológicos, que incluyen la maduración de los linfocitos B para secretar anticuerpos y la activación de los linfocitos T citotóxicos y macrófagos. Se les ha dado el nombre de linfocitos T CD4+ porque portan la proteína CD4. Cuando se activan, los linfocitos T colaboradores se dividen rápidamente y se secretan citocinas para regular o ayudar a la respuesta inmunitaria. Estas células pueden diferenciarse en varios subtipos (por ejemplo, TH1, TH2, TH3, TH17 o TFH) que secretan diferentes citocinas para modular la respuesta inmunitaria. En algunos modelos de tumores, los linfocitos T CD4+ también son suficientes para suprimir el crecimiento del cáncer. Aunque las señales de activación habituales provienen de las células presentadoras de antígenos (APC), los linfocitos T CD4+ pueden activarse cuando su superficie CD3 está reticulada por anticuerpos. Los linfocitos T citotóxicos (CTL) destruyen las células infectadas viralmente y las células tumorales, y también son responsables del rechazo de trasplantes o injertos. Se denominan linfocitos T CD8+ porque expresan la glicoproteína CD8 de superficie. Actúan contra dianas al reconocer los antígenos asociados con las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase I, que están ausentes o son bajos en muchos tumores humanos. Los linfocitos T de memoria son linfocitos T específicos al antígeno que persisten durante mucho tiempo después de que el virus o las células tumorales mueren. Pueden expandirse rápidamente a grandes cantidades cuando se les expone al antígeno tumoral, lo que fortalece de este modo al sistema inmunológico con "memoria" contra los cánceres. Los linfocitos T citotóxicos naturales (células NKT) son un tipo especial de linfocitos T que unen el sistema inmunológico adaptativo con el sistema inmunológico innato. A diferencia de los linfocitos T convencionales que reconocen los antígenos peptídicos en el MHC, las células NKT reconocen el antígeno glicolipídico presentado por una molécula llamada CD1d. Una vez activadas, estas células pueden realizar funciones similares a las de los linfocitos Th y Tc (es decir, producción de citocinas y liberación de moléculas citolíticas/citotóxicas). Se sabe que reconocen y eliminan las células tumorales. Los linfocitos T<y>§ (linfocitos T gamma delta) representan un pequeño subconjunto de linfocitos T que portan un TCR en su superficie. La mayoría de los linfocitos T tienen un TCR compuesto por dos cadenas de glicoproteínas llamadas cadenas de TCR a y p. Sin embargo, en los linfocitos T y§, el TCR está formado por una cadena y y una cadena 8. Representan sólo el 5 % del total de linfocitos T, pero son más abundantes en la mucosa intestinal (y se denominan linfocitos intraepiteliales, IEL). Se desconocen los antígenos que activan los linfocitos T y8; sin embargo, los linfocitos T<y>8 no están restringidos al MHC y probablemente reconocen proteínas completas en lugar de péptidos en el MHC.

Los ensayos de inmunoterapia adoptiva realizados en 1986 mediante el uso de células citotóxicas activadas por linfocinas (LAK) y linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) informaron respuestas de los tumores ocasionales en pacientes. Las infusiones de linfocitos de donantes han mostrado aún más éxito en pacientes con leucemia mielógena crónica después de un alotrasplante de células madre o en pacientes con enfermedad linfoproliferativa asociada a EBV (PTLD) postrasplante. En tumores sólidos, CTL tuvo éxito en el tratamiento del melanoma maligno durante la fase linfopénica generada por altas dosis de quimioterapia. Los anticuerpos biespecíficos se producen al fusionar dos hibridomas para generar moléculas de inmunoglobulina híbridas con dos sitios de unión. Los anticuerpos no sólo vinculan los tumores a los linfocitos T; entrecruzan el CD3 en los linfocitos T e inician la cascada de activación. De esta manera, la citotoxicidad basada en TCR se redirige a las dianas tumorales deseadas, sin pasar por las restricciones del MHC. La interacción de linfocitos T activados policlonalmente (ATC) con anti-CD3 * anti-TAA (anticuerpo BsAb o BITE) combina la especificidad de direccionamiento de MoAb (por ejemplo, hu3F8 donde TAA es GD2) con la citotoxicidad de los linfocitos T mediada por perforina/granzima no restringida por MHC. BsAb o BiTE pueden armar linfocitos T activados expandidos ex vivo antes de la infusión en un paciente. Esta estrategia convierte cada ATC en un CTL específico (Thakur y Lum, 2010, Curr Opin Mol Ther 12, 340-349; Grabert y otros, 2006, Clin Cancer Res 12, 569-576).

Los tumores evaden los linfocitos T mediante una serie de mecanismos: expresión baja o nula de MHC (por ejemplo, en NB), descarrilamiento de la señalización de los linfocitos T, disminución de la presentación de péptidos tumorales en el MHC, ausencia de moléculas coestimuladoras e inducción de linfocitos T reguladores que inhibe CTL y las respuestas humorales. Dado que la destrucción llevada a cabo por ATC armado con BsAb o BiTE no está restringida por MHC, esta estrategia debería superar algunos de estos mecanismos de escape de tumores. Los tumores secretan TGF-p, lo que cambia la respuesta inmunitaria de los linfocitos T a un tipo Th2, lo que regula negativamente la secreción de interleucina 2 (IL-2) e IFN-<y>, mientras que regula positivamente la IL-10 y la IL-6, lo que conduce a la supresión inmunitaria. Los linfocitos T redirigidas por BsAb o BiTE pueden evitar estos efectos negativos de las citocinas reguladoras, ya que los ATC armados lisan las dianas tumorales de manera independiente de la IL-2. Los pacientes tratados con linfocitos T armados con BsAb o BiTE dirigidos a sus tumores tienen niveles elevados de TNF-a e IFN-<y>, lo que debería desplazar los linfocitos T hacia una respuesta Th1. Además, los linfocitos T citotóxicos destruyen a través de su ligando Fas (FasL) que activa los receptores Fas (CD95) en las células tumorales. Desafortunadamente, FasL en las células tumorales también puede inducir la apoptosis de los linfocitos T. La estimulación de TCR a través de la cascada de CD3 protege a las células CD8+ del suicidio mediado por CD95. Los ATC armados resisten la muerte celular inducida por CD95 mediante la reticulación del TCR con BsAb o BiTE. La capacidad de los linfocitos T para destruir en serie, es decir, un linfocito T que destruye dianas tumorales consecutivas, prolifera durante el proceso y pasa a los vasos linfáticos y tejidos blandos aumentó la posibilidad de atrapar células de NB mientras hacen metástasis fuera del espacio de la médula para formar unas masas de tumor. Estudios recientes que usan BsAb o BiTE dirigidos a cánceres humanos se han mostrado prometedores.

Cada vez hay más pruebas, particularmente de análisis de pacientes que han recibido trasplantes alogénicos de células hematopoyéticas, que respaldan el potencial de los linfocitos T para suprimir o erradicar los linfomas y determinadas formas de leucemia (O'Reilly y otros, 2010, Semin Immunol 22, 162-172). Sin embargo, no hay datos convincentes que respalden el papel de los linfocitos T en el control de los tumores sólidos en niños. Esto es consistente con el hecho de que algunos de estos tumores no expresan alelos HLA de clase I o II heredados (por ejemplo, neuroblastoma) (Raffaghello y otros, 2005, Oncogene 24, 4634-4644; Wolfl y otros, 2005, Cancer Immunol Immunother 54, 400-406) o expresan sólo alelos de clase I y en niveles bajos (por ejemplo, rabdomiosarcomas) (Prados y otros, 2006, Neoplasma 53, 226-231). Además, la expresión de moléculas coestimuladoras críticas tales como B7.1 e ICAM-1 suele ser baja o indetectable. Como un resultado, la capacidad de estos tumores para provocar respuestas de linfocitos T es pobre y el potencial de los linfocitos T efectores para interactuar con los tumores a través del receptor de linfocitos T mediante la unión a los antígenos tumorales presentados por los alelos HLA es limitado. Además, las terapias más efectivas disponibles actualmente para el neuroblastoma, el rabdomiosarcoma, el sarcoma de Ewing y los tumores desmoplásicos de células redondas pequeñas emplean agentes alquilantes inmunosupresores, particularmente ciclofosfamida en dosis que inducen linfopenia T profunda. Los anticuerpos bifuncionales permiten el acoplamiento dirigido de los linfocitos T y la explotación de sus funciones efectoras a través de la activación mediada por CD3 no restringido por HLA en lugar de sus TCR restringidos por HLA específicos al antígeno. Los estudios de determinados anticuerpos monoclonales bifuncionales específicos para<c>D3 y un antígeno tumoral tales como CD-19, HER-2 NEU o CEA han demostrado la capacidad de estos anticuerpos para unir linfocitos T citotóxicos a células tumorales que expresan el otro antígeno diana (Bargou y otros, 2008, Science 321, 974-977; Topp y otros, 2009, Blood (A<s>H Annual Meeting Abstracts) 114, 840; Kiewe y otros, 2006, Clin Cancer Res 12, 3085-3091; Lutterbuese y otros, 2009, J Immnother 32, 341-352). Una vez que ambos receptores de anticuerpos se activan, se inicia una respuesta de linfocitos T citotóxicos contra las células tumorales. La respuesta de los linfocitos T implica la formación de una sinapsis citotóxica entre el receptor de los linfocitos T y la célula tumoral, así como también la inducción de la apoptosis de las células tumorales mediada por perforina y granzima (Offner y otros, 2006, Mol Immunol 43, 763-771; Brischwein y otros, 2006, Mol Immunol 43, 1129-1143). El acoplamiento de CD3 también activa los linfocitos T, al inducir la proliferación y la generación de citocinas efectoras que potencian el efecto antitumoral (Brischwein y otros, 2006, arriba; Brischwein y otros, 2007, J Immunother 30, 798-807). Sorprendentemente, los linfocitos T activados regulan positivamente una proteína antiapoptótica c-FLIP que las protege de los efectos citotóxicos del TNF y el ligando Fas generados durante la activación de los linfocitos T (Dreir y otros, 2002, Int J Cancer 100, 690-697). Como un resultado, se magnifica la respuesta de los linfocitos T. Como una consecuencia, los niveles de picogramos del anticuerpo bifuncional pueden ejercer efectos antitumorales significativos in vitro (Lutterbuese y otros, 2009, arriba; Brandl y otros, 2007, Cancer Immunol Immunother 56, 1551-1563) e in vivo, como se muestra en modelos animales preclínicos y particularmente en los resultados de ensayos clínicos iniciales del biespecífico CD3/CD19 en el tratamiento de los linfomas de linfocitos B y ALL (Topp y otros, 2009, supra; Kiewe y otros, 2006, arriba). Se ha planteado la hipótesis de que las respuestas de linfocitos T inducidas también pueden reclutar linfocitos T vírgenes y estimular la generación de linfocitos T específicos a tumores en los sitios del tumor (Koehne y otros, 2002, Blood 99, 1730-1740). Los anticuerpos biespecíficos también pueden usarse para redireccionar otras células efectoras además de los linfocitos T. Estas células efectoras incluyen células NK, linfocitos B, células dendríticas, monocitos, macrófagos, neutrófilos, células madre mesenquimales, células madre neurales y otras células madre, tejidos u órganos que expresan GD2. Cuando el tejido es tumoral, estas células efectoras pueden explotarse para destruir o depositar proteínas (por ejemplo, citocinas, anticuerpos, enzimas o toxinas), isótopos radiactivos para el diagnóstico o la terapia. Cuando el tejido es un órgano normal, las células efectoras pueden explotarse de manera similar para administrar proteínas o isótopos para el diagnóstico o la terapia.

El MoAb biespecífico puede estar compuesto por dominios variables dobles, con un dominio que tiene un dominio variable anti-3F8 y el otro dominio que se elige de un grupo que consiste en anti-OKT3 para redirigir los linfocitos T para la citotoxicidad tumoral, o DOTA-metal, C8.2.5 para el direccionamiento previo de múltiples etapas, o Clon 35, CD137, para ADCC con anti-41BB-scFv como agonista, o con CD137, 41BBL para ADC con 41 BBL como agonista. Una mutación N297A en el dominio CH2 da como resultado una aglicosilación que no conduce a la unión de FcR o C1q. La secuencia de aminoácidos de (hu3F8-LC)-(huOKT3-scFv) donde el huOKT3-scFv está estabilizado con disulfuro se muestra en la SEQ ID NO:23. La secuencia de aminoácidos de hu3F8-LC)-(C8.2.5-scFv) (en base a Orcutt y otros, 2010, Protein Eng Design and Selection 23, 221) con disulfuro de C8.2.5-scFv estabilizado se muestra en la SEQ ID NO:24.

Pueden usarse anticuerpos biespecíficos (anti-GD2 y anti-DOTA) en una primera etapa de un direccionamiento previo de múltiples etapas, seguido de una eliminación de la sangre mediante el uso de DOTA(metal)-Dextrano como agente de limpieza, y en una tercera etapa se introducen agentes terapéuticos conjugados con DOTA(metal) tales como DOTA(metal)-metal radiactivo, DOTA(metal)-nanopartículas, DOTA(metal-liposomas, DOTA(metal)-fármacos,

DOTA(metal)-ADN, DOTA(metal)-ARN y DOTA(metal)-toxinas. Dado que C8.2.5 tiene diferentes afinidades para cada tipo de complejo DOTA-metal, la afinidad del C8.2.5 predirigido por el agente de limpieza y el ligando DOTA puede controlarse con precisión.

La secuencia de aminoácidos de 3F8, hu3F8 y sus variantes puede usarse para construir el receptor de antígeno quimérico (CAR) como se demostró previamente para otros anticuerpos anti-GD2 (Krause y otros, 1998, J Exp Med 188, 619-626). La estrategia CAR de redirigir las células efectoras inmunitarias es independiente de la interacción MHC-péptido-TCR y permite que las células reaccionen contra una gran variedad de antígenos de la superficie celular (Davies y Maher, 2010, Achivum immunologiae et therapiae experimentalis 58, 165-178). Se han usado varios métodos en el diseño de CAR, y la mayoría de ellos emplean el dominio de unión al antígeno de un anticuerpo monoclonal en la forma de un fragmento variable de cadena sencilla (scFv) para el reconocimiento del antígeno. Los receptores activadores de linfocitos T iniciales se originaron a partir de estudios que permitieron a los investigadores dilucidar el papel de la cadena CD3Z (Irving y Weiss, 1991, Cell 64, 891-901; Romeo y otros, 1992, Cell 68, 889-897). En estudios posteriores, los scFv de interés se fusionaron a la cadena CD3Z (Eshhar y otros, 1993, PNAS USA 90, 720-724) o F<ce>RI<y>(Weijtens y otros, 1996, J Immunol 157, 836-843), y se encontró que ambos eran suficientes para la activación de los linfocitos T. Si bien esto sentó las bases para la construcción de CAR, la incorporación de moléculas coestimuladoras se produjo después de que se descubrió que los CAR de primera generación eran capaces de inducir la proliferación de linfocitos T sólo hasta 2-3 divisiones celulares, seguida rápidamente por la muerte celular (Gong y otros, 1999, Neoplasia 1, 123-127). Al expresar CD80 en la célula tumoral diana, los investigadores pudieron demostrar que las células que expresan CAR podrían reestimularse, lo que lleva a mayores aumentos en el número de linfocitos T. Los primeros CAR que incorporaron la molécula coestimuladora CD28 junto con la cadena CD3Z mostraron grandes mejoras con respecto a aquellos que expresaban la cadena CD3Z sola (Krause y otros, 1998, supra; Haynes y otros, 2002, Blood 100, 3155-3163; Maher y otros, 2002, Nature Biotech 20, 70-75); esto incluyó un aumento absoluto en el número de linfocitos T, así como también un aumento en la producción de IL-2. Desde entonces, varios otros grupos comenzaron a usar otras moléculas coestimuladoras, ya sea en combinación con CD3Z solo o con CD3Z y CD28. Estas moléculas de señalización adicionales incluyen 4-1 Bb (Wang y otros, 2007, Human Gene Ther 18, 712-725; Brentjens y otros, 2007, Clin Cancer Res 13, 5426-5432; Imai y otros, 2004, Leukemia 18, 676-684; Finney y otros, 2004, J Immunol 172, 104-113), DAP10 (Brentjens y otros, 2007, arriba), OX40 (Brentjens y otros, 2007, supra; Finney y otros, 2004, arriba; Wilkie y otros, 2008, J Immunol 180, 4901-4909; Nguyen y Geiger, 2003, Gene Therapy 10, 594-604; Pule y otros, 2005, Mol Ther 12, 933-941) y ICOS (Finney y otros,2004, arriba), y se han aplicado en el contexto de los linfocitos T así como también las células NK (Daldrup-Link y otros, 2005, Eropean radiology 15, 4-13; Imai y Campana, 2004, J Biol Reg Homeostatic Ag 18, 62-71; Roberts y otros, 1998, J Immunol 375-384; Kruschinski y otros, 2008, PNAS USA 105, 17481-17486; Pegram y otros, 2008, J Immunol 181, 3449-3455). Si bien los CAR de primera generación son los únicos que se han probado en la clínica hasta el momento, las comparaciones tantoin v itrocomoin v ivohan demostrado una clara superioridad con los CAR de segunda y tercera generación (Haynes y otros, 2002, arriba; Brentjens y otros, 2007, arriba; Teng y otros, 2004, Human Gene Ther 15, 699-708; Haynes y otros, 2002, J Immunol 169, 5780-5786; Kowolik y otros, 2006, Cancer Res 66, 10995-11004; Loskog y otros, 2006, Leukemia 20, 1819-1928; Moeller y otros, 2004, Cancer Gene Therapy 11, 371-379; Vera y otros, 2006, Blood 108, 3890-3897).

Actualmente, la mayoría de los investigadores usan linfocitos T periféricos humanos en masa, sin embargo, otros recientemente han comenzado a usar linfocitos T específicos a EBV (Rossig y otros, 2002, Blood 99, 2009-2016), células progenitoras linfoides (Zakrzewski y otros, 2006, Nature Med 12, 1039-1047; Zakrzewski y otros, 2008, Nature Biotech 26, 453-461), y células de la médula ósea sin fraccionar (Papapetrou y otros, 2009, J clin Invest 119, 157-168; Wang y otros, 1998, Nature Med 4, 168-172). Las líneas de células citotóxicas de leucemia (por ejemplo, NK92, NK92MI, KHYG-1) que son citolíticas y fáciles de cultivar también pueden proporcionar un suministro continuo de células efectoras que expresan CAR para pruebas preclínicas y clínicas. NK92MI es una línea de células NK humanas derivada de un linfoma no Hodgkin y transducida con ADNc de IL-2 humana; estudios previos han demostrado sus fuertes capacidades citotóxicas en modelos de ratón (Tam y otros, 1999, J Hematol 8, 281-290; Korbelik y Sun, 2001, Inter J Cancer 93, 269-274). Además, las células NK92 también se han usado en el entorno clínico y se ha demostrado que son seguras después de varios estudios de fase I en pacientes con carcinoma de células renales y melanoma (Arai y otros, 2008, Cytotherapy 10, 625-632). Por su facilidad de mantenimientoin v itroy con tiempos de duplicación relativamente cortos, estas células son efectoras ideales para diversos ensayos de citotoxicidad para probar una variedad de enfoques de direccionamiento. Si bien los estudios que usan la línea de células NK92 dependiente de IL-2 original han mostrado toxicidades mínimas tanto en ratones como en seres humanos, las células NK92MI transducidas con IL-2 pueden tener un mayor potencial leucemogénico. Un método mediante el cual los investigadores intentan evitar la leucemogénesis en ratones SCID mediante el uso de células NK92 es irradiar los efectores con 3000 cGy antes de la inoculación. En los ensayos clínicos de fase I, esto es suficiente para evitar que las células NK92MI proliferen sin control dentro del paciente inmunodeprimido. Un mecanismo de seguridad alternativo es el que implica el empleo de genes suicidas. Un ejemplo común es el uso del gen de la timidina cinasa del herpesvirus, que actúa destruyendo una célula que expresa el gen mediante la administración de aciclovir o ganciclovir (Helene y otros, 1997, J Immunol 5079-5082).

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo capaz de unirse a GD2, en donde el anticuerpo humanizado comprende cualquiera de los siguientes:

(a) un dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 4 y un dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 5;

(b) un dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 4 y un dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 7;

(c) un dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 6 y un dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 7;

(d) un dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 6 y un dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 5;

(e) un dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 8 y un dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 5;

(f) un dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 8 y un dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 7; o

(g) un dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 9 y un dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 10.

2. El anticuerpo humanizado o fragmento del mismo capaz de unirse a GD2 de acuerdo con la reivindicación 1, seleccionado de los incisos (a), (c), (e) o (g).

3. Un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo humanizado comprende un dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 4 y un dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 5.

4. Un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 2, para su uso en un método para tratar o prevenir una afección médica caracterizada por la expresión de GD2, en donde dicha afección médica caracterizada por la expresión de GD2 se elige del grupo que consiste en: neuroblastoma, melanoma, sarcoma, tumor cerebral, carcinoma, osteosarcoma, liposarcoma, fibrosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, leimiosarcoma, sarcoma de células fusiformes, cáncer de pulmón de células pequeñas, retinoblastoma, leucemia de linfocitos T infectados con HTLV-1 y otros tumores positivos a GD2.

5. Una composición que comprende un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

6. Una composición de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo se conjuga con un agente citotóxico.

7. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3.

8. Un vector recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 7.

9. Una célula huésped que comprende el vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 8.

10. Un método para la producción de un anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 a 3, que comprende: (i) cultivar la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 9 en un medio de cultivo en condiciones que permitan la expresión del anticuerpo o el fragmento del mismo y (ii) separar el anticuerpo o fragmento del mismo del medio de cultivo.