ES2954366T3

ES2954366T3 - Terapia de ácido ribonucleico mensajero para la deficiencia de argininosuccinato sintetasa

Info

Publication number: ES2954366T3
Application number: ES18205194T
Authority: ES
Inventors: Michael Heartlein; Frank Derosa; Lianne Smith
Original assignee: Translate Bio Inc
Current assignee: Translate Bio Inc
Priority date: 2013-10-22
Filing date: 2014-10-22
Publication date: 2023-11-21
Anticipated expiration: 2034-10-22
Also published as: BR112016009014A2; EP3060303A1; EP4276176A3; MX2016005237A; CA2928188A1; BR112016009014B1; US11224642B2; AU2014340092A1; AU2019222931A1; EP3501605A1; JP2019163322A; EP3501605B1; EA201690590A1; US20220218803A1; WO2015061500A1; JP2023101756A; AU2014340092B2; JP2016534992A; ES2707966T3; US20150110859A1

Abstract

La presente invención proporciona, entre otras cosas, métodos para tratar la deficiencia de argininosuccinato sintetasa (ASD), incluida la administración a un sujeto que necesita tratamiento de una composición que comprende un ARNm que codifica la argininosuccinato sintetasa (ASS1) en una dosis eficaz y un intervalo de administración tal que al Al menos un síntoma o característica del TEA tiene una intensidad, gravedad o frecuencia reducida o su aparición se retrasa. En algunas realizaciones, el ARNm se encapsula en un liposoma que comprende uno o más lípidos catiónicos, uno o más lípidos no catiónicos, uno o más lípidos a base de colesterol y uno o más lípidos modificados con PEG. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Terapia de ácido ribonucleico mensajero para la deficiencia de argininosuccinato sintetasa

Antecedentes

La deficiencia de argininosuccinato sintetasa (ASD) es un trastorno genético metabólico recesivo autosómico caracterizado por una mutación en el gen para la enzima argininosuccinato sintetasa (ASS1), que afecta a su capacidad para unirse a la citrulina, aspartato y otras moléculas. Los defectos en la proteína ASS interrumpen el ciclo de la urea y evita que el hígado procese de forma apropiada el exceso de nitrógeno en urea. Una acumulación de amoniaco y otros subproductos del ciclo de la urea (como citrulina) es tóxica y cuando ocurre durante los primeros días de vida puede llevar a síntomas como falta de energía (letargia), mala alimentación, vómito, convulsiones y pérdida de conocimiento. Actualmente, no hay cura para la enfermedad y el patrón de tratamiento es a través de la gestión de la dieta, minimizar los alimentos que contienen altas cantidades de proteína, y suplementos dietéticos de arginina y fenilacetato.

La publicación internacional WO 2011/068810 describe composiciones y métodos de modulación de la expresión de un gen o la producción de una proteína mediante transfección de células diana con ácidos nucleicos. Las composiciones descritas en la publicación internacional WO 2011/068810 demuestran una alta eficacia de transfección y son capaces de mejorar enfermedades asociadas con deficiencias de proteína o enzima.

Compendio de la invención

La presente invención proporciona una composición que comprende un liposoma que encapsula un ARNm con codones optimizados que codifica una proteína argininosuccinato sintetasa (ASS1) humana que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 para el uso en el tratamiento de la deficiencia de argininosuccinato sintetasa (ASD), en donde el tratamiento comprende administrar a un sujeto que necesita tratamiento la composición a una dosis eficaz y un intervalo de administración de manera que el nivel de amoniaco en suero en el sujeto se reduce en comparación con el nivel de amonio de base antes de tratamiento, en donde (i) el componente lipídico del liposoma consiste en un lípido catiónico, un lípido no catiónico, un lípido basado en colesterol y un lípido PEGilado, (ii) el lípido catiónico constituye aproximadamente el 30-50% del liposoma en relación molar, y (iii) el liposoma tiene un tamaño menor que aproximadamente 100 nm. La administración del ARNm que codifica la proteína ASS1 humana, encapsulado dentro de dicho liposoma, dio por resultado una producción de proteína in vivo sostenida y altamente eficaz y reducción exitosa de niveles de amoniaco en plasma, un marcador de la enfermedad clínicamente relevante.

En algunas realizaciones, el lípido catiónico se selecciona del grupo que consiste en C12-200, MC3, DLinDMA, DLinkC2DMA, cKK-E12, ICE (basado en imidazol), HGT5000, HGT5001, DODAC, DDAB, DMRIE, DOSPA, DOGS, DODAP, DODMA y DMDMA, DODAC, DLenDMA, DMRIE, CLinDMA, CpLinDMA, DMOBA, DOcarbDAP, DLinDAP, DLincarbDAP, DLinCDAP, KLin-K-DMA, DLin-K-XTC2-DMA, HGT4003, y combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, el lípido catiónico es un compuesto de fórmula I-c1-a:

O una de sus sales farmacéuticamente aceptables, en donde:

Cada R2 es independientemente hidrógeno o alquilo C^1-3;

Cada q es independientemente 2 a 6;

Cada R' es independientemente hidrógeno o alquilo C^1-3;

y cada RL es independientemente alquilo C^8-12.

En algunas realizaciones, el lípido catiónico es cKK-E12:

En algunas realizaciones, el lípido no catiónico adecuado para la invención se selecciona de DSPC (1,2-diestearoilsn-glicero-3-fosfocolina), DPPC (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina), DOPE (1,2-dioleil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DOPC (1,2-dioleil-sn-glicero-3-fosfotidilcolina), DPPE (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DMPE (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina) y DOPG (,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-racglicerol)).

En algunas realizaciones, el lípido basado en colesterol se selecciona de colesterol, colesterol PEGilado y DC-Col (N,N-dimetil-N-etilcarboxamidocolesterol), 1,4-bis(3-N-oleilamino-propil)piperazina.

En algunas realizaciones, el lípido modificado con PEG comprende una cadena de poli(etilen)glicol de hasta 5 kDa de longitud unida covalentemente a un lípido con cadena(s) alquilo de longitud C⁶-C²⁰. En algunas realizaciones, el lípido modificado con PEG es una ceramida derivada como N-octanoil-esfingosina-1-[succinil(metoxipolietilenglicol)-2000]. En algunas realizaciones, el lípido modificado con PEG o PEGilado es colesterol PEGilado o dimiristoilglicerol (DMG)-PEG-2K.

En algunas realizaciones, un liposoma adecuado comprende una combinación seleccionada de cKK-E12, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K; C12-200, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K; HGT4003, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K; o ICE, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K.

En algunas realizaciones, el lípido catiónico (p. ej., cKK-E12, C12-200, ICE, y/o HGT4003) constituye aproximadamente el 30%, aproximadamente el 35%, aproximadamente el 40%, aproximadamente el 45%, aproximadamente el 50% del liposoma en relación molar.

En algunas realizaciones, la relación de lípido catiónico (p. ej., cKK-E12, C12-200, ICE o HGT4003) a lípido no catiónico (p. ej., DOPE) a lípido basado en colesterol (p. ej., colesterol) a lípido PEGilado (p. ej., DMG-PEG2K) puede estar entre aproximadamente 30-50:25-35:20-30:1-15, respectivamente. En algunas realizaciones, la relación de lípido catiónico (p. ej., cKK-E12, C12-200, ICE o HGT4003) a lípido no catiónico (p. ej., DOPE) a lípido basado en colesterol (p. ej., colesterol) a lípido PEGilado (p. ej., DMG-PEG2K) es aproximadamente 40:30:20:10, respectivamente. En algunas realizaciones, la relación de lípido catiónico (p. ej., cKK-E12, C12-200, ICE o HGT4003) a lípido no catiónico (p. ej., DOPE) a lípido basado en colesterol (p. ej., colesterol) a lípido PEGilado (p. ej., DMG-PEG2K) es aproximadamente 40:30:25:5, respectivamente. En algunas realizaciones, la relación de lípido catiónico (p. ej., cKK-E12, C12-200, ICE o HGT4003) a lípido no catiónico (p. ej., DOPE) a lípido basado en colesterol (p. ej., colesterol) a lípido PEGilado (p. ej., DMG-PEG2K) es aproximadamente 40:32:25:3, respectivamente. En algunas realizaciones, la relación de lípido catiónico (p. ej., cKk -E12, C12-200, ICE o HGT4003) a lípido no catiónico (p. ej., DOPE) a lípido basado en colesterol (p. ej., colesterol) a lípido PEGilado (p. ej., DMG-PEG2K) es aproximadamente 50:25:20:5.

En algunas realizaciones, el tamaño de un liposoma se determina por la longitud del diámetro más largo de la partícula de liposoma. En algunas realizaciones, un liposoma adecuado tiene un tamaño menor que aproximadamente 100 nm, 90 nm, 80 nm, 75 nm, 70 nm, 60 nm o 50 nm.

En algunas realizaciones, el ARNm se administra a una dosis que oscila de aproximadamente 0,1-5,0 mg/kg de peso corporal, por ejemplo aproximadamente 0,1-4,5, 0,1-4,0, 0,1-3,5, 0,1-3,0, 0,1-2,5, 0,1-2,0, 0,1-1,5, 0,1-1,0, 0,1-0,5, 0,1-0,3, 0,3-5,0, 0,3-4,5, 0,3-4,0, 0,3-3,5, 0,3-3,0, 0,3-2,5, 0,3-2,0, 0,3-1,5, 0,3-1,0, 0,3-0,5, 0,5-5,0, 0,5-4,5, 0,5-4,0, 0,5-3,5, 0,5-3,0, 0,5-2,5, 0,5-2,0, 0,5-1,5 o 0,5-1,0 mg/kg de peso corporal. En algunas realizaciones, el ARNm se administra a una dosis de o menos de aproximadamente 5,0, 4,5, 4,0, 3,5, 3,0, 2,5, 2,0, 1,5, 1,0, 0,8, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2 o 0,1 mg/kg de peso corporal.

En algunas realizaciones, la composición dada se administra de manera intravenosa.

En algunas realizaciones, las composiciones dadas se administran una vez al día, una vez a la semana, dos veces al mes, una vez al mes. En algunas realizaciones, las composiciones dadas se administran una vez cada 7 días, una vez cada 10 días, una vez cada 14 días, una vez cada 28 días o una vez cada 30 días.

La proteína ASS1 que codifica el ARNm se expresa en el hígado. La administración de la composición dada puede dar por resultado la expresión de un nivel de proteína ASS1 a o por encima de aproximadamente 100 ng/mg (p. ej., a o por encima de aproximadamente 200 ng/mg, 400 ng/mg, 500 ng/mg, 1000 ng/mg, 2000 ng/mg o 3000 ng/mg) de proteína total en el hígado.

La administración de la composición puede dar por resultado un nivel de proteína ASS1 aumentada en suero. En algunas realizaciones, la administración de la composición da por resultado un nivel de proteína ASS1 aumentado en suero en al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces o 5 veces en comparación con el nivel de proteína ASS1 de base en suero antes del tratamiento.

La administración de la composición puede dar por resultado un nivel reducido de citrulina en el sujeto en comparación con el nivel de base de citrulina antes del tratamiento. La administración de la composición puede dar por resultado un nivel reducido de citrulina en plasma en al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% en comparación con el nivel de base de citrulina en plasma antes del tratamiento. La administración de la composición puede dar por resultado un nivel reducido de citrulina en plasma a menos de aproximadamente 2000 pM, 1500 pM, 1000 pM, 750 pM, 500 pM, 250 pM, 100 pM, 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM, 50 pM, 40 pM o 30 pM.

En algunas realizaciones, administrar la composición dada da por resultado la reducción de los niveles de amoniaco a aproximadamente 3000 pmoles/L o menos, aproximadamente 2750 pmoles/L o menos, aproximadamente 2500 pmoles/L o menos, aproximadamente 2250 pmoles/L o menos, aproximadamente 2000 pmoles/L o menos, aproximadamente 1750 pmoles/L o menos, aproximadamente 1500 pmoles/L o menos, aproximadamente 1250 pmoles/L o menos, aproximadamente 1000 pmoles/L o menos, aproximadamente 750 pmoles/L o menos, aproximadamente 500 pmoles/L o menos, aproximadamente 250 pmoles/L o menos, aproximadamente 100 pmoles/L o menos, o aproximadamente 50 pmoles/L o menos en plasma o suero. En una realización particular, administrar la composición dada da por resultado la reducción de los niveles de amoniaco a aproximadamente 50 pmoles/L o menos en plasma o suero.

En algunas realizaciones, administrar la composición dada da por resultado un nivel de amoniaco reducido en una muestra biológica en al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, o al menos aproximadamente 95% en comparación con el nivel de base de amoniaco antes del tratamiento. La muestra biológica adecuada puede ser sangre completa, suero, plasma u orina.

En algunas realizaciones, el ARNm con codones optimizados comprende SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14 o SEQ ID NO:15 (que corresponden a secuencias de ARNm de ASS1 humana con codones optimizados). En algunas realizaciones, el ARNm comprende la secuencia 5' UTR de SEQ ID NO:4 (correspondiente a la secuencia 5' UTR X). En algunas realizaciones, el ARNm comprende la secuencia 3' UTR de SEQ ID NO:5 (correspondiente a una secuencia 3' UTR Y). En algunas realizaciones, el ARNm comprende la secuencia 3' UTR de la SEQ ID NO:6 (correspondiente a una secuencia 3' UTR Y). En algunas realizaciones, el ARNm con codones optimizados comprende la SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:8 (correspondientes a la secuencia de ARNm de ASS1 humana con codones optimizados con secuencias 5' UTR y 3' UTR).

En algunas realizaciones, el ARNm comprende uno o más nucleótidos modificados. En algunas realizaciones, el uno o más nucleótidos modificados comprenden pseudouridina, N-1-metil-pseudouridina, 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolo-pirimidina, 3-metiladenosina, 5-metilcitidina, C-5 propinil-citidina, C-5 propinil-uridina, 2-aminoadenosina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-yodouridina, C5-propinil-uridina, C5-propinil-citidina, C5-metilcitidina, 2-aminoadenosina, 7-desazaadenosina, 7-desazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, O(6)-metilguanina, y/o 2-tiocitidina. En algunas realizaciones, el ARNm no está modificado.

En realizaciones particulares, el ARNm comprende SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14 o SEQ ID NO:15.

En realizaciones particulares, el ARNm comprende SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:8.

Otras características, objetos y ventajas de la presente invención son evidentes en la descripción detallada, los dibujos y las realizaciones que siguen. Debería entenderse, sin embargo, que la descripción detallada, los dibujos y las realizaciones, aunque indican realizaciones de la presente invención, se dan solo a modo de ilustración, no de limitación. Diversos cambios y modificaciones serán evidentes para los expertos en la técnica.

Breve descripción de los dibujos

Los dibujos son solo con fines ilustrativos no como limitación.

La Figura 1 representa los niveles de proteína ASS1 ejemplares detectados por medio de ELISA después del tratamiento con nanopartículas lipídicas con base de cKK-E12 cargadas con ARNm de ASS1 humana en varias dosis.

Las Figuras 2A-2D representan electroinmunotransferencias ejemplares que comparan los niveles de proteína ASS1 humana en el hígado como una función de la dosis después de una única dosis intravenosa de nanopartículas lipídicas que encapsulan ARNm de ASS1 humana. Se sacrificaron los ratones CD1 a las 24 horas después de la administración y los hígados se recogieron y se analizaron como se describe anteriormente. La proteína ASS1 humana se detectó utilizando anticuerpo monoclonal de ratón 2H8. Se cargaron 50 microgramos de proteína hepática total en cada pocillo. La proteína ASS1 humana recombinante se cargó en cada gel como un control positivo (control R5).

La Figura 3 representa un gráfico ejemplar de niveles de proteína argininosuccinato sintetasa (ASS1) humana acumulada como se mide por medio de ELISA. La proteína detectada fue un resultado de su producción a partir de ARNm de ASS1 administrado de forma intravenosa por medio de una única dosis de nanopartículas lipídicas (1,0 mg/kg de ARNm de ASS1 encapsulado) en el tiempo.

Las Figuras 4A-4E representan electroinmunotransferencias ejemplares de los niveles de proteína ASS1 humana en el hígado en el tiempo después de una única dosis intravenosa de nanopartículas lipídicas que encapsulan ARNm de ASS1 humana (1,0 mg/kg de dosis).

Las Figuras 5A-5I representan la detección de ARN mensajero de ASS1 humana por medio de hibridación in situ en los hígados de los ratones tratados. El ARNm exógeno es observable durante al menos 7 días después de la administración después de una única dosis (1,0 mg/kg) de nanopartículas lipídicas con base de cKK-E12 cargadas con ARNm de ASS1. El ARNm de ASS1 humana es detectable en células sinusoidales además de en hepatocitos.

Las Figuras 6A-6I representan la tinción inmunohistoquímica ejemplar de los niveles de proteína ASS1 en el hígado de ratón en diversos puntos temporales después de la administración de 1 mg/kg de nanopartículas lipídicas cKK-E12 que contienen ARNm de ASS1. La proteína ASS1 humana es detectable en células sinusoidales además de en hepatocitos. La proteína ASS1 humana es detectable durante al menos una semana después de la administración de una única dosis de nanopartículas lipídicas cargadas con ARNm de ASS1.

Las Figura 7A-7B representan la tinción inmunohistoquímica a bajo aumento (4x) de los niveles de proteína de ASS1 en hígado de ratón 24 horas después de la administración de 1 mg/kg de liposomas de cKK-E12 que contienen ARNm de ASS1. Una comparación con el hígado de ratón no tratado (izquierda) demuestra la amplia distribución de la proteína ASS1 humana en todo el hígado.

La Figura 8 representa un gráfico ejemplar de los niveles de proteína argininosuccinato sintetasa (ASS1) humana como se mide por medio de ELISA. La proteína detectada fue un resultado de su producción a partir de ARNm de ASS1 administrado de forma intravenosa por medio de una única dosis de diversas nanopartículas lipídicas.

La Figura 9 representa la incorporación de 14C arginina en proteínas después de la transfección de ARNm de ASS1 en una línea celular KO en ASS1 (SK(-)) en comparación con una línea celular AS1 positiva que expresa de forma estable (SK(+), clon núm. 5). El control representa células SK (-) tratadas solo con lipofectamina.

La Figura 10 representa los niveles de proteína ASS1 humana en el hígado de rata 24 horas después de la administración de nanopartículas lipídicas cargadas con ARNm de ASS1.

La Figura 11 representa los niveles de amoniaco en plasma en ratones knockout en ASS1 a los que se administró 1,0 mg/kg de nanopartículas lipídicas cargadas con ARNm de ASS1 cada 14 días durante 30 días.

Definiciones

Para que la presente invención se entienda más fácilmente, ciertos términos se definen primero a continuación. A lo largo de la memoria se describen definiciones adicionales para los siguientes términos y otros términos. Las publicaciones y otros materiales de referencia referenciados en la presente memoria describen los antecedentes de la invención y proporcionan detalles adicionales con respecto a esta práctica.

Alquilo: como se utiliza en la presente memoria, “alquilo” se refiere a un radical de un grupo hidrocarbonado saturado de cadena lineal o ramificado que tiene de 1 a 15 átomos de carbono (“alquilo C _1-15”). En algunas realizaciones, un grupo alquilo tiene de 1 a 3 átomos de carbono (“alquilo C_1-3”). Ejemplos de grupos alquilo C_1-3incluyen metilo (C₁), etilo (C₂), n-propilo (C₃), e isopropilo (C₃). En algunas realizaciones, un grupo alquilo tiene de 8 a 12 átomos de carbono (“alquilo C_8-12”). Ejemplos de grupos alquilo C_8-12incluyen, sin limitación, n-octilo (C₈), n-nonilo (C₉), n-decilo (C₁₀), nundecilo (C₁₁), n-dodecilo (C₁₂) y similares. El prefijo “n-“ (normal) se refiere a grupos alquilo no ramificados. Por ejemplo, n-alquilo Cs se refiere a -(CH₂)₇CH₃, n-alquilo C₁₀se refiere a -(CH₂)₉CH₃, etc.

Aminoácido: como se utiliza en la presente memoria, el término “aminoácido”, en su sentido más amplio, se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que puede incorporarse en una cadena polipeptídica. En algunas realizaciones, un aminoácido tiene la estructura general H₂N-C(H)(R)-COOH. En algunas realizaciones, un aminoácido es un amino ácido que existe de manera natural. En algunas realizaciones, un aminoácido es un aminoácido sintético; en algunas realizaciones, un aminoácido es un d-aminoácido; en algunas realizaciones, un aminoácido es un l-aminoácido. “Aminoácido estándar” se refiere a cualquiera de los veinte l-aminoácidos estándar que se encuentran normalmente en péptidos que existen de manera natural. “Aminoácido no estándar” se refiere a cualquier aminoácido, distinto de los aminoácidos estándar, independientemente de si está preparado de forma sintética o se obtiene de una fuente natural. Como se utiliza en la presente memoria, “aminoácido sintético” abarca a los aminoácidos químicamente modificados, que incluyen aunque no se limitan a sales, derivados de aminoácidos (como amidas) y/o sustituciones. Los aminoácidos, incluyendo aminoácidos carboxi- y/o amino-terminales en péptidos, pueden modificarse por metilación, amidación, acetilación, protección de grupos y/o sustitución con otros grupos químicos que pueden cambiar la vida media circulante del péptido sin afectar de forma adversa su actividad. Los aminoácidos pueden participar en un enlace disulfuro. Los aminoácidos pueden comprender una o modificaciones posteriores a la traducción, como la asociación con una o más entidades químicas (p. ej., grupos metilo, grupos acetato, grupos acetilo, grupos fosfato, restos formilo, grupos isoprenoides, grupos sulfato, restos de polietilenglicol, restos lipídicos, restos carbohidrato, restos de biotina, etc.). El término “aminoácido” se utiliza intercambiablemente con “residuo aminoácido”, y puede referirse a un aminoácido libre y/o a un residuo aminoácido de un péptido. Será evidente a partir del contexto en que se utiliza el término si se refiere a un aminoácido libre o a un residuo de un péptido.

Animal: como se utiliza en la presente memoria, el término “animal” se refiere a cualquier miembro del reino animal. En algunas realizaciones, “animal” se refiere a seres humanos, en cualquier etapa de desarrollo. En algunas realizaciones, “animal” se refiere a animales no humanos, en cualquier etapa de desarrollo. En ciertas realizaciones, el animal no humano es un mamífero (p. ej., un roedor, un ratón, un rata, un conejo, un mono, un perro, un gato, una oveja, ganado bovino, un primate y/o un cerdo). En algunas realizaciones, los animales incluyen, pero no se limitan a, mamíferos, aves, reptiles, anfibios, peces, insectos y/o gusanos. En algunas realizaciones, un animal puede ser un animal transgénico, animal diseñado por ingeniería genética y/o un clon.

Aproximadamente o alrededor: como se utiliza en la presente memoria, el término “aproximadamente” o “alrededor”, como se aplica a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia enunciado. En ciertas realizaciones, el término “aproximadamente” o “alrededor” se refiere a un intervalo de valores que caen dentro de 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1 % o menos en cualquier dirección (mayor que o menor que) del valor de referencia enunciado a menos que se indique o sea evidente de otra forma a partir del contexto (excepto donde dicho número excedería al 100% de un valor posible).

Biológicamente activo: como se utiliza en la presente memoria, la frase “biológicamente activo” se refiere a una característica de cualquier agente que tiene actividad en un sistema biológico, y particularmente en un organismo. Por ejemplo, un agente que, cuando se administra a un organismo, tiene un efecto biológico en ese organismo, se considera que es biológicamente activo.

Administración: como se utiliza en la presente memoria, el término “administración” abarca la administración tanto local como sistémica. Por ejemplo, la administración de ARNm abarca situaciones en que un ARNm se administra a un tejido diana y la proteína codificada se expresa y se retiene dentro del tejido diana (también denominado como “distribución local” o “administración local”), y situaciones en que un ARNm se administra a un tejido diana y la proteína codificada se expresa y se secreta en el sistema circulatorio del paciente (p. ej., suero) y se distribuye sistemáticamente y se absorbe por otros tejidos (también denominado como “distribución sistémica” o “administración sistémica”).

Expresión: como se utiliza en la presente memoria, “expresión” de una secuencia de ácido nucleico se refiere a la traducción de un ARNm en un polipéptido, montar múltiples polipéptidos en una proteína intacta (p. ej., enzima) y/o modificación después de la traducción de un polipéptido o proteína totalmente montada (p. ej., enzima). En esta solicitud, los términos “expresión” y “producción”, y equivalente gramatical, se utilizan de forma intercambiable.

Funcional: como se utiliza en la presente memoria, una molécula biológica “funcional” es una molécula biológica en una forma en que muestra una propiedad y/o actividad por la que está caracterizada.

Vida media: como se utiliza en la presente memoria, el término “vida media” es el tiempo necesario para que una cantidad como una concentración o actividad de ácido nucleico o proteína caiga a la mitad de su valor como se mide al principio del periodo de tiempo.

Mejorar, aumentar o reducir: como se utiliza en la presente memoria, los términos “mejorar”, “aumentar” o “reducir”, o equivalentes gramaticales, indican valores que son relativos a una medida de base, como una medida en el mismo individuo antes del inicio del tratamiento descrito en la presente memoria, o una medida en un sujeto de control (o múltiples sujetos de control) en ausencia del tratamiento descrito en la presente memoria. Un “sujeto de control” es un sujeto aquejado de la misma forma de enfermedad que el sujeto que se trata, que es aproximadamente de la misma edad que el sujeto que se trata.

In vitro: como se utiliza en la presente memoria, el término “in vitro’’ se refiere a sucesos que se dan en un ambiente artificial, p. ej., en un tubo de ensayo o recipiente de reacción, en cultivo celular, etc., más que dentro de un organismo celular.

In vivo: como se utiliza en la presente memoria, el término “in vivo" se refiere sucesos que se dan dentro de un organismo multicelular, como un ser humano y un animal no humano. En el contexto de sistemas basados en células, el término puede utilizarse para referirse a sucesos que ocurren dentro de una célula viva (en oposición a, por ejemplo, sistemas in vitro).

Aislado: como se utiliza en la presente memoria, el término “aislado” se refiere a una sustancia y/o entidad que se ha separado (1) de al menos alguno de los componentes con los que estaba asociado cuando se produjo inicialmente (o en la naturaleza y/o en un montaje experimental), y/o (2) se produce, prepara, y/o fabrica por la mano del hombre. Las sustancias y/o entidades aisladas pueden separarse desde aproximadamente 10%, aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% o más de aproximadamente 99% de los demás componentes con los que estaban inicialmente asociados. En algunas realizaciones, los agentes aislados son puros en aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99%, o más de aproximadamente 99%. Como se utiliza en la presente memoria, una sustancia es “pura” si está sustancialmente libre de otros componentes. Como se utiliza en la presente memoria, el cálculo del porcentaje de pureza de sustancias y/o entidades aisladas no incluirían excipientes (p. ej., tampón, disolvente, agua etc.).

Distribución o administración local: como se utiliza en la presente memoria, los términos “distribución local”, “administración local” o equivalente gramatical, se refiere a administración o distribución específica al tejido. Típicamente, la distribución o administración local necesita una proteína (p. ej., enzima) codificada por ARNm que se traducen y expresan intracelularmente o con secreción limitada que evita que entren en el sistema circulatorio del paciente.

ARN mensajero (ARNm): como se utiliza en la presente memoria, el término “ARN mensajero (ARNm)” se refiere a un polinucleótido que codifica al menos un polipéptido. El ARNm como se utiliza en la presente memoria abarca ARN tanto modificado como no modificado. El ARNm puede contener una o más regiones codificantes o no codificantes. El ARNm puede purificarse a partir de fuentes naturales, producirse utilizando sistemas de expresión recombinante y purificarse opcionalmente, sintetizarse químicamente, etc. Donde sea apropiado, p. ej., en el caso de moléculas químicamente sintetizadas, el ARNm puede comprender análogos de nucleósido como análogos que tienen bases o azúcares modificadas químicamente, modificaciones del esqueleto, etc. Una secuencia de ARNm se presenta en la dirección 5' a 3' a menos que se indique lo contrario. En algunas realizaciones, un ARNm es o comprende nucleósidos naturales (p. ej., adenosina, guanosina, citidina, uridina); análogos de nucleósidos (p. ej., 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolo-pirimidina, 3-metiladenosina, 5-metilcitidina, C-5 propinil-citidina, C-5 propinil-uridina, 2-aminoadenosina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-yodouridina, C5-propinil-uridina, C5-propinil-citidina, C5-metilcitidina, 2-aminoadenosina, 7-desazaadenosina, 7-desazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, O(6)-metilguanina y 2-tiocitidina); bases químicamente modificadas; bases biológicamente modificadas (p. ej., bases metiladas); bases intercaladas; azúcares modificados (p. ej., 2'-fluororribosa, ribosa, 2'-desoxirribosa, arabinosa y hexosa); y/o grupos fosfato modificados (p. ej., fosforotioatos y uniones 5'-N-fosforamidita).

Ácido nucleico: como se utiliza en la presente memoria, el término “ácido nucleico”, en su sentido más amplio, se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que está incorporado o puede incorporarse a una cadena de polinucleótidos. En algunas realizaciones, un ácido nucleico es un compuesto y/o una sustancia que está incorporado o puede incorporarse a una cadena de polinucleótido por medio de una unión fosfodiéster. En algunas realizaciones, “ácido nucleico” se refiere a residuos individuales de ácidos nucleicos (p. ej., nucleótidos y/o nucleósidos). En algunas realizaciones, “ácido nucleico” se refiere a una cadena de polinucleótido que comprende residuos individuales de ácido nucleico. En algunas realizaciones, “ácido nucleico” abarca ARN además de ADN de hebra doble y/o sencilla y/o ADNc.

Paciente: como se utiliza en la presente memoria, el término “paciente” o “sujeto” se refiere a cualquier organismo al que puede administrarse una composición dada, p. ej., con fines experimentales, diagnósticos, profilácticos, cosméticos y/o terapéuticos. Los pacientes típicos incluyen animales (p. ej., mamíferos como ratones, ratas, conejos, primates no humanos y/o seres humanos). En algunas realizaciones, un paciente es un ser humano. Un ser humano incluye formas pre y posnatales.

Farmacéuticamente aceptable: el término “farmacéuticamente aceptable” como se utiliza en la presente memoria, se refiere a sustancias que, dentro del alcance del buen criterio médico, son adecuadas para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, proporcional a una relación beneficio/riesgo razonable.

Sal farmacéuticamente aceptable: las sales farmacéuticamente aceptables son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, S. M. Berge et al., describe sales farmacéuticamente aceptables en detalle en J. Pharmaceutical Sciences (1977) 66:1-19. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las derivadas de ácidos y bases inorgánicos y orgánicos adecuados. Ejemplos de sales de adición de ácido no tóxicas, farmacéuticamente aceptables, son sales de un grupo amino formado con ácidos inorgánicos como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico y ácido perclórico o con ácidos orgánicos como ácido acético, ácido oxálico, ácido maleico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succínico o ácido malónico o utilizando otros métodos utilizados en la técnica como intercambio iónico. Otras sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales de adipato, alginato, ascorbato, aspartato, bencenosulfonato, benzoato, bisulfato, borato, butirato, canforato, canforsulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, formiato, fumarato, glucoheptonato, glicerofosfato, gluconato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, hidroyoduro, 2-hidroxi-etanosulfonato, lactobionato, lactato, laurato, laurilsulfato, malato, maleato, malonato, metanosulfonato, 2-naftalensulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, p-toluensulfonato, undecanoato, valerato y similares. Las sales derivadas de bases apropiadas incluyen sales de metal alcalino, metal alcalinotérreo, de amonio y de N+(alquilo C1-4)4. Sales representativas de metal alcalino o alcalinotérreo incluyen, de sodio, litio, potasio, calcio, magnesio y similares. Sales farmacéuticamente aceptables adicionales incluyen, cuando sea apropiado, amonio no tóxico, amonio cuaternario, y cationes amina formados usando iones conjugados como haluro, hidróxido, carboxilato, sulfato, fosfato, nitrato, sulfonato y arilsulfonato. Sales farmacéuticamente aceptables adicionales incluyen sales formadas a partir de la cuaternización de una amina utilizando un electrófilo apropiado, p. ej., un haluro de alquilo, para formar una sal amino alquilada cuaternizada.

Distribución o administración sistémica: como se utiliza en la presente memoria, los términos “distribución sistémica”, “administración sistémica”, o equivalente gramatical, se refiere a un mecanismo o estrategia de administración o distribución que afecta a todo el cuerpo o a un organismo entero. Típicamente, la distribución o administración sistémica se consigue por medio del sistema circulatorio del cuerpo, p. ej., la corriente sanguínea. Comparado con la definición de “distribución o administración local”.

Sujeto: como se utiliza en la presente memoria, el término “sujeto” se refiere a un animal humano o no humano (p. ej., ratón, rata, conejo, perro, gato, ganado bovino, cerdo, oveja, caballo o primate). Un ser humano incluye formas pre- y posnatales. En muchas realizaciones, un sujeto es un ser humano. Un sujeto puede ser un paciente, lo que se refiere a un ser humano que se presenta a un proveedor médico para el diagnóstico o tratamiento de una enfermedad. El término “sujeto” se utiliza en la presente memoria intercambiablemente con “individuo” o “paciente”. Un sujeto puede estar aquejado de o ser susceptible a una enfermedad o trastorno pero puede o no presentar síntomas de la enfermedad o trastorno.

Sustancialmente: como se utiliza en la presente memoria, el término “sustancialmente” se refiere a la condición cualitativa de mostrar una extensión o grado total o casi total de una característica o propiedad de interés. Uno con experiencia ordinaria en las técnicas biológicas entenderá que los fenómenos biológicos y químicos raramente, si ocurre alguna vez, llegan a la compleción y/o continuar hasta la completitud o alcanzan o evitan un resultado absoluto. El término “sustancialmente” se utiliza por tanto en la presente memoria para capturar la falta potencial de completitud inherente a muchos fenómenos biológicos y químicos.

Tejidos diana: como se utiliza en la presente memoria, el término “tejidos diana” se refiere a cualquier tejido que está afectado por una enfermedad a tratar. En algunas realizaciones, los tejidos diana incluyen aquellos tejidos que presentan patología, síntomas o características asociadas con la enfermedad.

Cantidad terapéuticamente eficaz: como se utiliza en la presente memoria, el término “cantidad terapéuticamente eficaz” de un agente terapéutico significa una cantidad que es suficiente, cuando se administra a un sujeto que padece o es susceptible a una enfermedad, trastorno y/o condición, para tratar, diagnosticar, prevenir y/o retrasar el comienzo del (de los) síntoma(s) de la enfermedad, trastorno y/o condición. Se apreciará por aquellos con experiencia ordinaria en la técnica que una cantidad terapéuticamente eficaz se administra típicamente por medio de un régimen de dosificación que comprende al menos una dosis unitaria.

Tratar: como se utiliza en la presente memoria, el término “tratar”, “tratamiento” o “que trata” se refiere a cualquier método utilizado para aliviar, mejorar, mitigar, inhibir, prevenir, retrasar el comienzo de, reducir la gravedad de y/o reducir la incidencia, parcial o completamente, de uno o más síntomas o características de una enfermedad, trastorno y/o condición particular. El tratamiento puede administrarse a un sujeto que no muestra signos de una enfermedad y/o muestra solo signos tempranos de la enfermedad con el fin de disminuir el riesgo de desarrollar patología asociada con la enfermedad.

Descripción detallada

La presente invención proporciona una composición que comprende un liposoma que encapsula un ARNm con codones optimizados que codifica una proteína argininosuccinato sintetasa (ASS1) humana que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 para el uso en el tratamiento de deficiencia de argininosuccinato sintetasa (ASD), en donde el tratamiento comprende administrar a un sujeto que necesita tratamiento la composición a una dosis eficaz y un intervalo de administración de manera que el nivel de amoniaco en suero en el sujeto se reduce en comparación con el nivel de amoniaco de base antes del tratamiento, en donde (i) el componente lipídico del liposoma consiste en un lípido catiónico, un lípido no catiónico, un lípido basado en colesterol y un lípido PEGilado, (ii) el lípido catiónico constituye aproximadamente el 30-50% del liposoma en relación molar, y (iii) el liposoma tiene un tamaño menor de aproximadamente 100 nm. Como se utiliza en la presente memoria, el término “ liposoma” se refiere a cualquier vesícula de nanopartícula laminar o multilaminar. Un liposoma como se utiliza en la presente memoria puede formarse mezclando el lípido catiónico, el lípido no catiónico, el lípido basado en colesterol y el lípido PEGilado.

Deficiencia de argininosuccinato sintetasa (ASD)

La composición de la presente invención se utiliza para tratar un sujeto que está padeciendo de o es susceptible a la deficiencia de argininosuccinato sintetasa (ASD). ASD es un trastorno genético metabólico recesivo autosómico caracterizado por una mutación en el gen para la enzima argininosuccinato sintetasa (ASS1). Al menos 50 mutaciones que provocan la ASD tipo I se han identificado en el gen ASS1. La mayoría de estas mutaciones implican sustituciones de un solo aminoácido. Muchas de las mutaciones en el gen ASS1 afectan probablemente a la estructura de la proteína resultante y su capacidad para unirse a la citrulina, aspartato y otras moléculas. Unas pocas de las mutaciones en el gen ASS1 llevan a las producciones de una versión anormalmente corta de la enzima que no puede jugar su papel de forma eficaz en el ciclo de la urea.

Los defectos en la proteína ASS1 interrumpen el ciclo de la urea y evitan que el hígado procese apropiadamente el exceso de nitrógeno, que se genera cuando la proteína se utiliza para energía, en urea. Una acumulación de amoniaco y otros subproductos del ciclo de la urea (como la citrulina) es tóxica y cuando ocurre durante los primeros días de vida puede llevar a síntomas como falta de energía (letargia), mala alimentación, vómitos, convulsiones y pérdida de conocimiento. Estos problemas médicos pueden amenazar la vida en muchos casos.

Argininosuccinato sintetasa (ASS1)

La secuencia de ARNm de ASS1 humana que existe de manera natural y la secuencia correspondiente de aminoácidos se muestran en la tabla 1:

Tabla 1. ASS1 humana

En algunas realizaciones un ARNm adecuado puede ser una secuencia de hASSI con codones optimizados, como la secuencia mostrada a continuación:

AUGAGCAGCAAGGGCAGCGUGGUGCUGGCCUACAGCGGCGGCCUGGACACCAGCUGCAUCCUGGUGUGGCU GAAGGAGCAGGGCUACGACGUGAUCGCCUACCUGGCCAACAUCGGCCAGAAGGAGGACUUCGAGGAGGCCC GCAAGAAGGCCCUGAAGCUGGGCGCCAAGAAGGUGUUCAUCGAGGACGUGAGCCGCGAGUUCGUGGAGGAG UUCAUCUGGCCCGCCAUCCAGAGCAGCGCCCUGUACGAGGACCGCUACCUGCUGGGCACCAGCCUGGCCCGC CCCUGCAUCGCCCGCAAGCAGGUGGAGAUCGCCCAGCGCGAGGGCGCCAAGUACGUGAGCCACGGCGCCACC GGCAAGGGCAACGACCAGGUGCGCUUCGAGCUGAGCUGCUACAGCCUGGCCCCCCAGAUCAAGGUGAUCGCC CCC UGGCG CAUGCCCGAG U U CU ACAACCG CU U CAAGGGCCG CAACGACCUGAUGGAG U ACGCCAAGCAG CAC GGCAUCCCCAUCCCCGUGACCCCCAAGAACCCCUGGAGCAUGGACGAGAACCUGAUGCACAUCAGCUACGAGG CCGGCAUCCUGGAGAACCCCAAGAACCAGGCCCCCCCCGGCCUGUACACCAAGACCCAGGACCCCGCCAAGGCC CCCAACACCCCCG ACAU CCU GG AGAU CG AG U U CAAGAAGGGCG U G CCCG U G AAG G U GACCAACG U G AAGG AC GGCACCACCCACCAGACCAGCCUGGAGCUGUUCAUGUACCUGAACGAGGUGGCCGGCAAGCACGGCGUGGGC CGCAUCGACAUCGUGGAGAACCGCUUCAUCGGCAUGAAGAGCCGCGGCAUCUACGAGACCCCCGCCGGCACC AUCCUGUACCACGCCCACCUGGACAUCGAGGCCUUCACCAUGGACCGCGAGGUGCGCAAGAUCAAGCAGGGC CUGGGCCUGAAGUUCGCCGAGCUGGUGUACACCGGCUUCUGGCACAGCCCCGAGUGCGAGUUCGUGCGCCA CUGCAUCGCCAAGAGCCAGGAGCGCGUGGAGGGCAAGGUGCAGGUGAGCGUGCUGAAGGGCCAGGUGUACA UCCUGGGCCGCGAGAGCCCCCUGAGCCUGUACAACGAGGAGCUGGUGAGCAUGAACGUGCAGGGCGACUAC GAGCCCACCGACGCCACCGGCUUCAUCAACAUCAACAGCCUGCGCCUGAAGGAGUACCACCGCCUGCAGAGCA AGGUGACCGCCAAGUGA (SEQ ID NO:3)

Secuencias de ARNm ejemplares adicionales se describen en la sección de ejemplos posterior, por ejemplo, SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:8, ambas de las cuales incluyen regiones no traducidas 5' y 3' que enmarcan un ARNm que codifica ASS1 con codones optimizados.

En algunas realizaciones, el ARNm con codones optimizados de la presente invención tiene una secuencia de nucleótidos de al menos 50%, 55%, 60%, 65, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idénticas a SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO:15.

En algunas realizaciones, el ARNm con codones optimizados codifica una proteína de fusión que comprende la proteína ASS1 en toda la longitud condensada con otra proteína (p. ej., una fusión N o C terminal). En algunas realizaciones, la proteína condensada al ARNm que codifica la proteína ASS1 de longitud completa codifica una señal o una secuencia de direccionamiento celular.

Vehículos de administración

Como se utiliza en la presente memoria, los términos “vehículo de administración”, “vehículo de transferencia”, “nanopartícula” o equivalente gramatical, se utilizan intercambiablemente.

En algunas realizaciones, los ARNm que codifican una proteína ASS1 pueden administrarse por medio de un único vehículo de administración. En algunas realizaciones, los ARNm que codifican una proteína ASS1 puede administrarse por medio de uno o más vehículos de administración cada uno de una composición diferente.

Vehículos de administración liposomales

Como se utiliza en la presente memoria, los vehículos de administración liposomales, p. ej., nanopartículas lipídicas, están caracterizadas normalmente como vesículas microscópicas que tienen un espacio acuoso interior secuestrado de un medio externo mediante una membrana de una o más bicapas. Las membranas bicapa de los liposomas están formadas normalmente por moléculas anfifílicas, como lípidos de origen sintético o natural que comprenden dominios hidrófilos e hidrófobos espacialmente separados (Lasic, Trends Biotechnol., 16:307-321, 1998). Las membranas bicapa de los liposomas también pueden estar formadas por polímeros anfofílicos y tensioactivos (p. ej., polimerosomas, niosomas, etc.). En el contexto de la presente invención, el vehículo de administración liposomal sirve para transportar un ARNm deseado a una célula o tejido diana.

Lípidos catiónicos

Como se utiliza en la presente memoria, la frase “lípido catiónico” se refiere a cualquiera de un número de especies lipídicas que tienen una carga neta positiva a un pH seleccionado, como el pH fisiológico. Se han descrito varios lípidos catiónicos en la bibliografía, muchos de los cuales están disponibles comercialmente. Los lípidos catiónicos particularmente adecuados para el uso en las composiciones de la invención incluyen los descritos en las publicaciones de patente internacional WO 2010/053572 (y particularmente, C12-200 descrito en el párrafo [00225]) y WO 2012/170930. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención emplean unas nanopartículas lipídicas que comprenden un lípido catiónico ionizable descrito en la solicitud de patente provisional de EE.UU. 61/617.468, presentada el 29 de marzo de 2012, como, p. ej., (15Z,18Z)-N,N-dimetil-6-(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)tetracosa-15,18-dien-1-amina (HGT5000) y (15Z,18Z)-N,N-dimetil-6-((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)tetracosa-4,15,18-trien 1-amina (HGT5001) y (15Z,18Z)-N,N-dimetil-6-((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)tetracosa-5,15,18-trien-1-amina (HGT5002).

En algunas realizaciones, el liposoma dado incluye un lípido catiónico descrito en la publicación internacional WO 2013063468 y la solicitud provisional de EE.^uU. titulada “Lipid Formulations for Delivery of Messenger RNA” presentada al mismo tiempo que la presente solicitud en la misma fecha.

O una de sus sales farmacéuticamente aceptables, en donde:

Cada R²es independientemente hidrógeno o alquilo C_1-3;

Cada q es independientemente 2 a 6;

Cada R' es independientemente hidrógeno o alquilo C_1-3;

Y cada RL es independientemente alquilo C_8-12.

En algunas realizaciones, cada R²es independientemente hidrógeno, metilo o etilo. En algunas realizaciones, cada R2 es independientemente hidrógeno o metilo. En algunas realizaciones, cada R2 es hidrógeno.

En algunas realizaciones, cada q es independientemente 3 a 6. En algunas realizaciones, cada q es independientemente 3 a 5. En algunas realizaciones, cada q es 4.

En algunas realizaciones, cada R' es independientemente hidrógeno, metilo o etilo. En algunas realizaciones, cada R' es independientemente hidrógeno o metilo. En algunas realizaciones, cada R' es independientemente hidrógeno. En algunas realizaciones, cada RL es independientemente alquilo C8-12. En algunas realizaciones, cada R^_Les independientemente n-alquilo C_8-12. En algunas realizaciones, cada R^Les independientemente alquilo C_9-11. En algunas realizaciones, cada RL es independientemente n-alquilo C_9-11. En algunas realizaciones, cada R^Les independientemente alquilo C₁₀. En algunas realizaciones, cada RL es independientemente n-alquilo C₁₀.

En algunas realizaciones, cada R²es independientemente hidrógeno o metilo; cada q es independientemente 3 a 5; cada R' es independientemente hidrógeno o metilo; y cada RL es independientemente alquilo C_8-12.

En algunas realizaciones, cada R²es hidrógeno; cada q es independientemente 3 a 5; cara R' es hidrógeno; y cada RL es independientemente alquilo C_8-12.

En algunas realizaciones, cada R2 es hidrógeno; cada q es 4; cada R' es hidrógeno; y cada RL es independientemente alquilo C_8-12.

En algunas realizaciones, el lípido catiónico es un compuesto de fórmula I-g:

O una de sus sales farmacéuticamente aceptables, en donde cada RL es independientemente alquilo C^8-12. En algunas realizaciones, cada RL es independientemente n-alquilo C^8-12. En algunas realizaciones, cada RL es independientemente alquilo C^9-11. En algunas realizaciones, cada RL es independientemente n-alquilo C^9-11. En algunas realizaciones, cada RL es independientemente alquilo C¹⁰. En algunas realizaciones, cada RL es n-alquilo C¹⁰.

En realizaciones particulares, el liposoma dado incluye el lípido catiónico cKK-E12, o (3,6-bis(4-(bis(2-hidroxidodecil)amino)butil)piperazina-2,5-diona). La estructura de cKK-E12 se muestra a continuación:

En algunas realizaciones, el lípido catiónico puede ser cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio o “DOTMA”. (Feigner et al. (Proc. Nat'l Acad. Sci. 84, 7413 (1987); Patente de EE.UU. núm. 4.897.355). Otros lípidos catiónicos adecuados incluyen, por ejemplo, 5-carboxiespermilglicinadioctadecilamida o “DOGS”, 2,3-dioleiloxi-N-[2(espermina-carboxamido)etil]-N,N-dimetil-1-propanaminio o “DOSPA” (Behr et al. Proc. Nat.'l Acad. Sci. 86, 6982 (1989); patente de EE.UU. núm. 5.171.678; patente de EE.UU. núm. 5.334.761), 1,2-dioleoil-3-dimetilamonio-propano o “DODAP”, 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano o “DOTAP”.

Lípidos catiónicos ejemplares adicionales también incluyen 1,2-diesteariloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano o “DSDMA”, 1.2- dioleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano o “DODMA”, 1,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano o “DLinDMA”, 1.2- dilinoleniloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano o “DLenDMA”, cloruro de N-dioleil-N,N-dimetilamonio o “DODAC”, bromuro de N,N-diestearil-N,N-dimetilamonio o “DDAB”, bromuro de N-(1,2-dimiristiloxiprop-3-il)-N,N-dimetil-N-hidroxietilamonio o “DMRIE”, 3-dimetilamino-2-(colest-5-en-3-beta-oxibutan-4-oxi)-1-(cis,cis-9,12-octadecadienoxi)propano o “CLinDMA”, 2-[5'-(colest-5-en-3-beta-oxi)-3'-oxapentoxi)-3-dimetil-1-(cis,cis-9',1-2'-octadecadienoxi)propano o “CpLinDMA”, N,N-dimetil-3,4-dioleiloxibencilamina o “DMOBA”, 1,2-N,N'-dioleilcarbamil-3-dimetilaminopropano o “DOcarbDAP”, 2,3-dilinoleoiloxi-N,N-dimetilpropilamina o “DLinDAP”, 1.2- N,N'-dilinoleilcarbamil-3-dimetilaminopropano o “DLincarbDAP”, 1,2-dilinoleoilcarbamil-3-dimetilaminopropano o “DLinCDAP”, 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminometil-[1,3]-dioxolano o “DLin- -DMA”, 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano o “DLin -K-XT C2-D MA”, y 2-(2,2-di((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)-1,3-dioxolan-4-il)-N,N-dimetiletanamina (DLin-KC2-DMA)) (véase, la publicación internacional WO 2010/042877; Semple et al., Nature Biotech. 28:172-176 (2010)), o mezclas de los mismos. (Heyes, J., et al., J Controlled Release 107:276-287 (2005); Morrissey, DV., et al., Nat. Biotechnol. 23(8):1003-1007 (2005); Publicación PCT WO2005/121348A1). En algunas realizaciones, el lípido catiónico comprende al menos uno de un resto imidazol, dialquilamino o guanidinio.

En algunas realizaciones, el lípido catiónico puede elegirse de XTC (2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano), MC3 (4-(dimetilamino)butanoato de (6Z,9Z,28Z,31Z)-hetpatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-ilo), ALNY-100 ((3aR,5s,6aS)-N,N-dimetil-2,2-di((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienil)tetrahidro-3aH-ciclopenta[d][1,3]dioxol-5-amina), NC98-5 (4,7,13-tris(3-oxo-3-(undecilamino)propil)-N1,N16-diundecil-4,7,10,13-tetraazahexadecano-1,16-diamida), DODAP (1,2-dioleil-3-dimetilamonio propano), hGt4003 (publicación internacional WO 2012/170889), ICE (publicación internacional WO 2011/068810), HgT5000 (solicitud de patente provisional de EE.UU. núm. 61/617.468) o HGT5001 (cis o trans) (solicitud de patente provisional núm. 61/617.468), lipidoides de aminoalcohol como los descritos en la publicación internacional WO2010/053572, DOTAP (1,2-dioleil-3-trimetilamonio propano), DOTMA (1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamonio propano), DLinDMA (Heyes, J.; Palmer, L.; Bremner, K.; MacLachlan, I. “Cationic lipid saturation influences intracellular delivery of encapsulated nucleic acids” J. Contr. Rel. 2005, 107, 276-287), DLin-KC2-DMA (Semple, S.C. et al. “Rational design of cationic lipids for siRNA delivery” Nature Biotech. 2010, 28, 172 176), C12-200 (Love, K.T. et al. “Lipid-like materials for low-dose in vivo gene silencing” PNAS 2010, 107, 1864-1869).

En algunas realizaciones, el lípido catiónico (p. ej., cKK-E12) constituye aproximadamente 30-50% del liposoma por realización molar.

Lípidos no catiónicos/ayudantes

El liposoma dado contiene un lípido no catiónico (“ayudante”). Como se utiliza en la presente memoria, la frase “ lípido no catiónico” se refiere a cualquier lípido zwitteriónico o aniónico, neutro. Como se utiliza en la presente memoria, la frase “lípido aniónico” se refiere a cualquiera de un número de especies lipídicas que portan una carga negativa neta a un pH seleccionado, como pH fisiológico. Los lípidos no catiónicos incluyen, pero no se limitan a, diestearoilfosfatidilcolina (DSpC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), palmitoiloleoil-fosfatidiletanolamina (POPE), 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato de dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE-mal), dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE), dimiristoilfosfoetanolamina (DMPE), diestearoil-fosfatidil-etanolamina (DSPE), 16-O-monometil PE, 16-O-dimetil PE, 18-1-trans PE, y 1-estearoil-2-oleoil-fosfatidiletanolamina (SOPE)

En algunas realizaciones, el porcentaje de lípido no catiónico en el liposoma puede ser mayor que 5%, mayor que 10%, mayor que 20%, mayor que 30% o mayor que 40%.

Lípidos basados en colesterol

El liposoma dado comprende un lípido basado en colesterol. Por ejemplo, lípidos catiónicos basados en colesterol incluyen, por ejemplo, DC-Choi (N,N-dimetil-N-etilcarboxamidocolesterol), 1,4-bis(3-N-oleilamino-propil)piperazina (Gao, et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 179, 280 (1991); Wolf et al. BioTechniques 23, 139 (1997); patente de EE.UU. núm. 5.744.335) o ICE. En algunas realizaciones, el lípido basado en colesterol puede comprender una relación molar de aproximadamente 2% a aproximadamente 30%, o aproximadamente 5% a aproximadamente 20% del lípido total presente en un liposoma. En algunas realizaciones, el porcentaje de lípido basado en colesterol en la nanopartícula lipídica puede ser mayor que 5%, 10%, mayor que 20%, mayor que 30% o mayor que 40%.

Lípidos PEGilados

El liposoma dado comprende un lípido PEGilado. Por ejemplo, el uso de fosfolípidos modificados con polietilenglicol (PEG) y lípidos derivados como ceramidas derivadas (PEG-CER), que incluyen N-Octanoil-esfingosina-1-[succinil(metoxipolietilenglicol)-2000] (ceramida C8 PEG-2000) también se contempla. Los lípidos modificados con PEG contemplados incluyen, pero no se limitan a, una cadena de polietilenglicol de hasta 5 kDa de longitud unido de forma covalente a un lípido con cadena(s) alquilo de longitud C⁶-C²⁰. En algunas realizaciones, un lípido modificado con PEG o PEGilado es colesterol PEGilado o PEG-2K. La adición de dichos componentes puede evitar la agregación del complejo y puede también proporcionar unos medios para aumentar la vida en circulación y aumentar la distribución de la composición de ácido nucleico-lípido a la célula diana, (Klibanov et al. (1990) FEBS Letters, 268(1):235-237), o pueden seleccionarse para intercambiar rápidamente la formulación in vivo (véase la patente de EE.UU. núm.

5.885.613).

En algunas realizaciones, los lípidos intercambiables particularmente útiles son PEG-ceramidas que tienen cadenas acilo más cortas (p. ej., C¹⁴o C¹⁸). El fosfolípido modificado con PEG y lípidos derivados de la presente invención puede comprender una relación molar de aproximadamente 0% a aproximadamente 15%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 15%, aproximadamente 1% a aproximadamente 15%, aproximadamente 4% a aproximadamente 10% o aproximadamente 2% de los lípidos totales presentes en le liposoma.

La selección del lípido catiónico, el lípido no catiónico y/o el lípido modificado con PEG, además de la relación molar relativa de dichos lípidos entre sí, se basa en las características del (de los) lípido(s) seleccionado(s), la naturaleza de las células diana pretendidas, las características del ARNm a distribuir. Las consideraciones adicionales incluyen, por ejemplo, la saturación de la cadena alquilo, además del tamaño, carga, pH, pKa, fusogenicidad y toxicidad del (de los) lípido(s) seleccionado(s). Por consiguiente, las relacionen molares pueden ajustarse.

Como ejemplos no limitantes, una formulación adecuada de liposomas puede incluir una combinación seleccionada de cKK-E12, DOPE colesterol y DMG-PEG2K; C12-200, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K; HGT4003, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K; o ICE, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K.

El lípido catiónico (p. ej., cKK-E12, C12-200, ICE o HGT4003) constituye el 30-50% del liposoma por relación molar. En algunas realizaciones, el porcentaje del lípido catiónico (p. ej. cKK-E12, C12-200, ICE o HGT4003 es aproximadamente 30%, aproximadamente 35%, aproximadamente 40%, aproximadamente 45%, o aproximadamente 50% del liposoma por relación molar.

En algunas realizaciones, la relación de lípido catiónico a lípido no catiónico a lípido basado en colesterol a lípido PEGilado es aproximadamente 40:30:20:10, respectivamente. En algunas realizaciones, la relación de lípido catiónico a lípido no catiónico a lípido basado en colesterol a lípido(s) PEGilado(s) es aproximadamente 40:30:25:5, respectivamente. En algunas realizaciones, la relación de lípido catiónico a lípido no catiónico a lípido basado en colesterol a lípido PEGilado es aproximadamente 40:32:25:3, respectivamente. En algunas realizaciones, la relación de lípido catiónico a lípido no catiónico a lípido basado en colesterol a lípido PEGilado es aproximadamente 50:25:20:5.

Síntesis de ARNm

Los ARNm pueden sintetizarse según cualquiera de una variedad de métodos conocidos. Por ejemplo, los ARNm pueden sintetizarse por medio de transcripción in vitro (IVT). Brevemente, IVT se realiza típicamente con una plantilla de ADN lineal o circular que contiene un promotor, una acumulación de ribuonucleótido trifosfatos, un sistema tampón que puede incluir DTT e iones de magnesio, y una ARN polimerasa apropiada (p. ej., T3, T7 o SP6 ARN polimerasa), ADNasa I, pirofosfatasa y/o inhibidor de ARNasa. Las condiciones exactas variarán según la aplicación específica.

Por ejemplo, para la preparación de ARNm para el uso con la invención, una plantilla de ADN se transcribe in vitro. Una plantilla de ADN adecuada típicamente tiene un promotor, por ejemplo un promotor T3, T7 o SP6, para una transcripción in vitro, seguido por secuencia de nucleótidos deseada para el ARNm y a una señal de terminación.

La(s) secuencia(s) de ARNm deseada(s) puede(n) determinarse e incorporarse en una plantilla de ADN utilizando métodos estándar. Por ejemplo, comenzando desde la secuencia de aminoácidos deseada (SEQ ID NO.2), se realiza una traducción inversa virtual basada en el código genético degenerado. Un algoritmo de optimización se utiliza después para la selección de codones adecuados. Típicamente, el contenido de G/C puede optimizarse para lograr el mayor contenido de G/C posible por un lado, teniendo en cuenta lo más posible la frecuencia de los ARNt según la utilización del codón por otro lado. La secuencia optimizada de ARN puede establecerse y representarse, por ejemplo, con la ayuda de un dispositivo de presentación apropiado y compararse con la secuencia original (de tipo silvestre). También puede analizarse una estructura secundaria para calcular las propiedades de estabilización y desestabilización o, respectivamente, regiones del ARN.

ARNm modificado

El ARNm según la presente invención puede sintetizarse como ARNm no modificado o modificado. Típicamente, los ARNm se modifican para mejorar la estabilidad. Las modificaciones de ARNm pueden incluir, por ejemplo, modificaciones de los nucleótidos del ARN. Un ARNm modificado según la invención puede incluir por tanto, por ejemplo, modificaciones del esqueleto, modificaciones del azúcar o modificaciones de la base. En algunas realizaciones, los ARNm pueden sintetizarse a partir de nucleótidos que existen de manera natural y/o análogos de nucleótidos (nucleótidos modificados) que incluyen, pero no se limitan a, purinas (adenina (A), guanina (G)) o pirimidinas (timina (T), citosina (C), uracilo (U)), y como análogos de nucleótidos modificados o derivados de purinas y pirimidinas, como p. ej., 1-metil-adenina, 2-metil-adenina, 2-metiltio-N-6-isopentenil-adenina, N6-metil-adenina, N6-isopentenil-adenina, 2-tio-citosina, 3-metil-citosina, 4-acetil-citosina, 5-metil-citosina, 2,6-diaminopurina, 1-metilguanina, 2-metil-guanina, 2,2-dimetil-guanina, 7-metil-guanina, inosina, 1-metil-inosina, pseudouracilo (5-uracilo), dihidro-uracilo, 2-tio-uracilo, 4-tio-uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tio-uracilo, 5-(carboxihidrometil)-uracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromo-uracilo, 5-carboximetilaminometil-uracilo, 5-metil-2-tio-uracilo, 5-metil-uracilo, éster metílico de ácido N-uracil-5-oxiacético, 5-metilaminometil-uracilo, 5-metoxiaminometil-2-tio-uracilo, 5'-metoxicarbonilmetil-uracilo, 5-metoxi-uracilo, éster metílico de ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v), 1-metil-pseudouracilo, queosina, .beta.-D-manosil-queosina, wibutoxosina y fosforamidatos, fosforotioatos, nucleótidos peptídicos, metilfosfonatos, 7-desazaguanosina, 5-metilcitosina e inosina. La preparación de dichos análogos es conocida para un experto en la técnica p. ej. a partir de la patente de EE.UU. núm. 4.373.071, patente de EE.UU. núm. 4.401.796, patente de EE.UU. núm. 4.415.732, patente de EE.UU. núm. 4.458.066, patente de EE.UU. núm. 4.500.707, patente de EE.UU. núm. 4.668.777, patente de EE.UU. núm. 4.973.679, patente de EE.UU. núm. 5.047.524, patente de EE.UU. núm. 5.132.418, patente de EE.UU. núm. 5.153.319, patentes de EE.UU. núms. 5.262.530 y 5.700.642.

En algunas realizaciones, los ARNm que codifican ASS1 pueden contener modificaciones del esqueleto de ARN. Típicamente, una modificación de esqueleto es una modificación en que los fosfatos del esqueleto de los nucleótidos contenidos en el ARN se modifican químicamente. Modificaciones del esqueleto ejemplares incluyen, pero no se limitan a, modificaciones del grupo que consiste en metilfosfonatos, metilfosforamidatos, fosforamidatos, fosforotioatos (p. ej., citidina 5'-O-(1-tiofosfato)), boranofosfatos, grupos guanidinio cargados positivamente, etc., que significa la sustitución de la unión fosfodiéster por otros grupos aniónicos, catiónicos o neutros.

En algunas realizaciones, los ARNm que codifican ASS1 pueden contener modificaciones del azúcar. Una modificación típica del azúcar es una modificación química del azúcar de los nucleótidos que la contiene que incluye, pero no se limita a, modificaciones de azúcar elegidas del grupo que consiste en 2'-desoxi-2'-fluorooligorribonudeótido (2'-fluoro-2'-desoxicitdina 5'-trifosfato, 2'-fluoro-2'-desoxiuridina 5'-trifosfato), 2'-desoxi-2'-desamina-oligorribonucleótido (2'-amino-2'-desoxicitidina 5'-trifosfato, 2'-amino-2'-desoxiuridina 5'-trifosfato), 2'-O-alquiloligorribonucleótido, 2'-desoxi-2'-C-alquiloligorribonucleótido (2'-O-metilcitidina 5'-trifosfato, 2'-metiluridina 5'-trifosfato), 2'-C-alquiloligorribonucleótido, e isómeros de los mismos (2'-aracitidina 5'-trifosfato, 2'-arauridina 5'-trifosfato) o azidotrifosfatos (2'-azido-2'-desoxicitidina 5'-trifosfato, 2'-azido-2'-desoxiuridina 5'-trifosfato).

En algunas realizaciones, los ARNm que codifican ASS1 pueden contener modificaciones de las bases de los nucleótidos (modificaciones de base). Un nucleótido modificado que contiene una modificación de la base también se denomina un nucleótido modificado en la base. Ejemplos de dichos nucleótidos modificados en la base incluyen, pero no se limitan a, 2-amino-6-cloropurinarribósido 5'-trifosfato, 2-aminoadenosina 5'-trifosfato, 2-tiocitidina 5'-trifosfato, 2-tiouridina 5'-trifosfato, 4-tiouridina 5'-trifosfato, 5-aminoalilcitidina 5'-trifosfato, 5-aminoaliluridina 5'-trifosfato, 5-bromocitidina 5'-trifosfato, 5-bromouridina 5'-trifosfato, 5-yodocitidina 5'-trifosfato, 5-yodouridina 5'-trifosfato, 5-metilcitidina 5'-trifosfato, 5-metiluridina 5'-trifosfato, 6-azacitidina 5'-trifosfato, 6-azauridina 5'-trifosfato, 6-cloropurinarribósido 5'-trifosfato, 7-desazaadenosina 5'-trifosfato, 7-desazaguanosina 5'-trifosfato, 8-azaadenosina 5'-trifosfato, 8-azidoadenosina 5'-trifosfato, benzimidazolrribósido 5'-trifosfato, N1-metiladenosina 5'-trifosfato, N1-metilguanosina 5'-trifosfato, N6-metiladenosina 5'-trifosfato, O6-metilguanosina 5'-trifosfato, pseudouridina 5'-trifosfato, puromicina 5'-trifosfato o xantosina 5'-trifosfato.

Típicamente, la síntesis de ARNm incluye la adición de una “caperuza” en el extremo N-terminal (5') y una “cola” en el extremo C-terminal (3'). La presencia de la caperuza es importante para proporcionar resistencia a las nucleasas encontradas en la mayoría de células eucariotas. La presencia de una “cola” sirve para proteger al ARNm de la degradación de la exonucleasa.

Por consiguiente, en algunas realizaciones, los ARNm que codifican ASS1 incluyen una estructura de caperuza 5'. Una caperuza 5' se añade típicamente como sigue: primero, una fosfatasa de ARN terminal elimina uno de los grupos fosfato terminales del nucleótido 5', dejando dos fosfatos terminales, luego se añade guanosina trifosfato (GTP) a los fosfatos terminales por medio de una guanililo transferasa, produciendo una unión 5'5'5 trifosfato; y el 7-nitrógeno de la guanina se metila después mediante una metiltransferasa. Ejemplos de estructuras de caperuza incluyen, pero no se limitan a, m7G(5')ppp (5'(A,G(5')ppp(5')A y G(5')ppp(5')G.

En algunas realizaciones, los ARNm que codifican ASS1 incluyen una estructura de cola 3' poli(A). Una cola poli-A en el extremo 3' del ARNm incluye típicamente aproximadamente 10 a 300 nucleótidos de adenosina (SEQ ID NO:9) (p. ej., aproximadamente 10 a 200 nucleótidos de adenosina, aproximadamente 10 a 150 nucleótidos de adenosina, aproximadamente 10 a 100 nucleótidos de adenosina, aproximadamente 20 a 70 nucleótidos de adenosina, o aproximadamente 20 a 60 nucleótidos de adenosina). En algunas realizaciones, los ARNm incluyen una estructura de cola 3' poli(C). Una cola poli-C adecuada en el extremo 3' del ARNm incluye típicamente aproximadamente 10 a 200 nucleótidos de citosina (SEQ ID NO:10) (p. ej., aproximadamente 10 a 150 nucleótidos de citosina, aproximadamente 10 a 100 nucleótidos de citosina, aproximadamente 20 a 70 nucleótidos de citosina, aproximadamente 20 a 60 nucleótidos de citosina, o aproximadamente 10 a 40 nucleótidos de citosina). La cola poli-C puede añadirse a la cola poli-A o puede sustituir la cola poli-A.

En algunas realizaciones, los ARNm incluyen una región no traducida 5' y/o 3'. En algunas realizaciones, una región no traducida 5' incluye uno o más elementos que afectan a la estabilidad o traducción de un ARNm, por ejemplo, un elemento sensible al hierro. En algunas realizaciones, una región no traducida 5' puede ser de entre aproximadamente 50 y 500 nucleótidos de longitud.

En algunas realizaciones, una región no traducida 3' incluye una o más señales de poliadenilación, un sitio de unión para proteínas que afectan a la estabilidad de la posición de ARNm en la célula, o uno o más sitios de unión para miARN. En algunas realizaciones, una región no traducida 3' puede ser de entre 50 y 500 nucleótidos de longitud o más larga.

Estructura de la caperuza

En algunas realizaciones, los ARNm incluyen una estructura de caperuza 5'. Una caperuza 5' se añade típicamente como sigue: primero, una fosfatasa de ^aRⁿterminal elimina uno de los grupos fosfato terminales del nucleótido 5', dejando dos fosfatos terminales; luego se añade guanosina trifosfato (GTP) a los fosfatos terminales por medio de una guanililo transferasa, produciendo una unión trifosfato 5'5'5; y el 7-nitrógeno de la guanina se metila después mediante una metiltransferasa. Ejemplos de estructura de caperuza incluyen, pero no se limitan a, m7G(5')ppp (5'(A,G(5')ppp(5')A y G(5')ppp(5')G.

Las estructuras de caperuza que existen de manera natural comprenden una 7-metilguanosina que se une por medio de un puente trifosfato al extremo 5' del primer nucleótido transcrito, dando por resultado una caperuza de dinucleótido de m7G(5')ppp(5')N, donde N es cualquier nucleósido. In vivo, la caperuza se añade enzimáticamente. La caperuza se añade en el núcleo y se cataliza por la enzima guanililo transferasa. La adición de la caperuza al extremo terminal 5' del ARN se da inmediatamente después del inicio de la transcripción. El nucleós ido terminal es típicamente una guanosina, y está en la orientación inversa a todos los demás nucleótidos, es decir, G(5')ppp(5')GpNpNp.

Una caperuza común para el ARNm producido por la transcripción in vitro es m7G(5')ppp(5')G, que se ha utilizado como la caperuza de dinucleótido en la transcripción con T7 o SP6 ARN polimerasa in vitro para obtener ARN que tienen una estructura de caperuza en sus extremos 5'. El método prevalente para la síntesis in vitro de ARNm con caperuza emplea un dinucleótido preformado de la forma m7G(5')ppp(5')G (“m7GpppG”) como un iniciador de la transcripción.

Hasta la fecha, una forma normal de una caperuza de dinucleótido sintética utilizada en experimentos de traducción in vitro es el análogo de caperuza anti-inversión (“ARCA”) o ARCA modificado, que es generalmente un análogo de caperuza modificada en que el grupo OH 2' o 3' está sustituido con -OCH ³.

Los análogos de caperuza adicionales incluyen, pero no se limitan a, unas estructuras químicas seleccionadas del grupo que consiste en m7GpppG, m7GpppA, m7GpppC; análogos de caperuza no metilados (p. ej., GpppG); análogo de caperuza dimetilado (p. ej., m27GpppG), análogo de caperuza trimetilado (p. ej., m227GpppG), análogos de caperuza simétricos dimetilados (p. ej., m7Gpppm7G), o análogos de caperuza anti-inversión (p, ej., ARCA; m72OmeGpppG, m72dGpppG, m73OmeGpppG, m73dGpppG y sus derivados tetrafosfato) (véase, p. ej., Jemielity, J. et al., “Novel “anti-reverse” cap analogs with superior translational properties”, RNA, 9:1108-1122 (2003)).

En algunas realizaciones, una caperuza adecuada es un 7-metilguanilato (“m7G”) unido por medio de un puente trifosfato al extremo 5' del primer nucleótido transcrito, dando por resultado m7G(5')ppp(5')N, donde N es cualquier nucleósido. Una realización preferida de una caperuza m7G utilizada en realizaciones de la invención es m7G(5')ppp(5')G.

En algunas realizaciones, la caperuza es una estructura Cap0. Las estructuras Cap0 carecen de un residuo 2'-O-metilo de la ribosa unido a las bases 1 y 2. En algunas realizaciones, la caperuza es una estructura Cap1. Las estructuras capí tienen un residuo 2'-O-metilo en la base 2. En algunas realizaciones, la caperuza es una estructura Cap2. Las estructuras Cap2 tienen un residuo 2'-O-metilo unido a ambas bases 2 y 3.

Se conoce una variedad de análogos de caperuza m7G en la técnica, muchos de los cuales están disponibles comercialmente. Estos incluyen el m7GpppG descrito anteriormente, además de los análogos de caperuza ARCA 3'-OCH3 y 2'-OCH3 (Jemielity, J. et al., RNA, 9:1108-1122 (2003)). Análogos de caperuza adicionales para el uso en realizaciones de la invención incluyen análogos de dinucleósido tetrafosfato N7-bencilado (descrito en Grudzien, E. et al., RNA, 10:1479-1487 (2004)), análogos de caperuza de fosforotioato (descrito en Grudzien-Nogalska, E., et al., RNA, 13:1745-1755 (2007)), y análogos de caperuza (que incluyen los análogos de caperuza biotinilados) descritos en las patentes de e E.UU. núms. 8.093.367 y 8.304.529.

Estructura de la cola

Típicamente, la presencia de una “cola” sirve para proteger el ARNm de la degradación de la exonucleasa. La cola poli A se cree que estabiliza los mensajeros naturales y el ARN de sentido sintético. Por lo tanto, en ciertas realizaciones puede añadirse una larga cola poli A a una molécula de ARNm volviendo así al ARN más estable. Las colas poli A pueden añadirse utilizando una variedad de técnicas reconocidas en la técnica. Por ejemplo, pueden añadirse largas colas de poli A al ARN sintético o transcrito in vitro utilizando poli A polimerasa (Yokoe, et al., Nature Biotechnology. 1996; 14: 1252-1256). Un vector de transcripción puede codificar también largas colas poli A. Además, las colas poli A pueden añadirse por transcripción directamente desde productos de PCR. Poli A puede también estar ligada al extremo 3' de un ARN de sentido con ARN ligasa (véase, p. ej., Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2a Ed., ed. por Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: edición de 1991)).

En algunas realizaciones, los ARNm incluyen una estructura de cola 3' poli(A). Típicamente, la longitud de la cola poli A puede ser al menos de aproximadamente 10, 50, 100, 200, 300, 400 al menos 500 nucleótidos (SEQ ID NO:11). En algunas realizaciones, una cola poli A en el extremo 3' del ARNm típicamente incluye aproximadamente 10 a 300 nucleótidos de adenosina (SEQ ID NO:9) (p. ej., aproximadamente 10 a 200 nucleótidos de adenosina, aproximadamente 10 a 150 nucleótidos de adenosina, aproximadamente 10 a 100 nucleótidos de adenosina, aproximadamente 20 a 70 nucleótidos de adenosina, o aproximadamente 20 a 60 nucleótidos de adenosina). En algunas realizaciones, los ARNm incluyen una estructura de cola 3' poli(C). Una cola poli-C adecuada en el extremo 3' del ARNm típicamente incluyen aproximadamente 10 a 200 nucleótidos de citosina (SEQ ID NO:10) (p. ej., aproximadamente 10 a 150 nucleótidos de citosina, aproximadamente 10 a 100 nucleótidos de citosina, aproximadamente 20 a 70 nucleótidos de citosina, aproximadamente 20 a 60 nucleótidos de citosina, o aproximadamente 10 a 40 nucleótidos de citosina). La cola poli-C puede añadirse a la cola poli-A o puede sustituir a la cola poli-A.

En algunas realizaciones, la longitud de la cola poli A o poli C se ajusta al control de la estabilidad de una molécula de ARNm de sentido modificada de la invención y, por tanto, la transcripción de proteína. Por ejemplo, como la longitud de la cola poli A puede influir en la vida media de una molécula de ARNm de sentido, la longitud de la cola poli A puede ajustarse para modificar el nivel de resistencia del ARNm a las nucleasas y controlar así el curso del tiempo de la expresión del polinucleótido y/o la producción de polipéptido en una célula diana.

Región no traducida 5' y 3'

En algunas realizaciones, el ARNm incluye una región no traducida 5' y/o 3'. En algunas realizaciones, una región no traducida 5' incluye uno o más elementos que afectan a la estabilidad o traducción de un ARNm, por ejemplo, un elemento sensible al hierro. En algunas realizaciones, una región no traducida 5' puede ser de entre aproximadamente 50 y 500 nucleótidos de longitud.

En algunas realizaciones, una región no traducida 3' incluye una o más señales de poliadenilación, un sitio de unión para proteínas que afectan a la estabilidad de la posición del ARNm en una célula, o uno o más sitios de unión para miARN. En algunas realizaciones, una región no traducida 3' puede ser de entre 50 y 500 nucleótidos de longitud o más larga.

Las secuencias 3' y/o 5' UTR ejemplares pueden derivarse de moléculas de ARNm que son estables (p. ej., globina, actina, GAPDH, tubulina, histona o enzimas del ciclo del ácido cítrico) para aumentar la estabilidad de la molécula de ARNm de sentido. Por ejemplo, una secuencia 5' UTR puede incluir una secuencia parcial de un gen inmediatotemprano 1 (IE1) de CMV, o un fragmento del mismo para mejorar la resistencia a la nucleasa y/o mejorar la vida media del polinucleótido. También se contempla la inclusión de una secuencia que codifica la hormona de crecimiento humano (hGH), o un fragmento de la misma al extremo 3' o región no traducida del polinucleótido (p. ej., ARNm) para estabilizar más el polinucleótido. Generalmente, estas modificaciones mejoran la estabilidad y/o propiedades farmacocinéticas (p. ej., vida media) del polinucleótido respecto a sus contrapartes no modificadas, e incluyen, por ejemplo modificaciones hechas para mejorar dicha resistencia de los polinucleótidos a la digestión de la nucleasa in vivo.

Formación de liposomas

Los liposomas para el uso en composiciones dadas pueden prepararse mediante diversas técnicas que se conocen actualmente en la técnica. Por ejemplo, pueden prepararse vesículas multilaminares (MLV) según técnicas convencionales, como depositando un lípido seleccionado en la pared interna de un contenedor o recipiente adecuado disolviendo el lípido en un disolvente apropiado, y después evaporando el disolvente para dejar una película fina en el interior del recipiente o mediante secado por pulverización. Una fase acuosa puede añadirse entonces al recipiente con un movimiento formador de vértices que da por resultado la formación de MLV. Las vesículas unilaminares (ULV) pueden formarse entonces por homogeneización, sonicación o extrusión de las vesículas multilaminares. Además, las vesículas unilaminares pueden formarse mediante técnicas de eliminación detergente.

La composición de la invención comprende ARNm encapsulado en un liposoma. En algunas realizaciones, el ARNm está encapsulado en liposomas, que difieren en su composición lipídica, relación molar de componentes lipídicos, tamaño, carga (potencial Zeta), ligandos de direccionamiento y/o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el liposoma puede tener una composición diferente del lípido catiónico, el lípido neutro, lípido modificado con PEG y/o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones el uno o más liposomas pueden tener una relación molar diferente de lípido catiónico, lípido neutro, colesterol y lípido modificado con PEG utilizados para crear el liposoma.

El proceso de incorporación de un ARNm deseado en un liposoma se refiere a menudo como “carga”. Se describen métodos ejemplares en Lasic, et al., FEBS Lett., 312:255-258, 1992. Los ácidos nucleicos incorporados al liposoma pueden estar situados completa o parcialmente en el espacio interior del liposoma, dentro de la membrana bicapa del liposoma, o asociados con la superficie exterior de la membrana del liposoma. La incorporación de un ácido nucleico en liposomas también se refiere en la presente memoria como “encapsulación” en donde el ácido nucleico está totalmente contenido dentro del espacio interior del liposoma. El fin de incorporar un ARNm en un liposoma es a menudo proteger al ácido nucleico de un entorno que puede contener enzimas o compuestos químicos que degraden los ácidos nucleicos y/o sistemas o receptores que provocan la rápida excreción de los ácidos nucleicos. Por consiguiente, en algunas realizaciones, el liposoma es capaz de mejorar la estabilidad del ARNm contenido en él y/o facilitar la administración de ARNm a la célula o tejido diana.

Tamaño del liposoma

Los liposomas adecuados de acuerdo con la presente invención pueden hacerse en diversos tamaños de menos de aproximadamente 100 nm. En algunas realizaciones, los liposomas dados pueden hacerse más pequeños que los liposomas encapsulantes de ARNm conocidos anteriormente. En algunas realizaciones, el tamaño disminuido de los liposomas está asociado con la administración más eficaz del ARNm. La selección de un tamaño apropiado de liposoma puede tomar en consideración el sitio de la célula o tejido diana y en cierto grado la aplicación para la que el liposoma se está haciendo.

En algunas realizaciones, puede ser deseable limitar la transfección del ARNm a ciertas células o tejidos. Por ejemplo, para dirigirse a hepatocitos un liposoma puede dimensionarse de manera que sus dimensiones sean más pequeñas que los ventanajes de la capa endotelial que recubre los sinusoides hepáticos en el hígado; en dichos casos el liposoma podría penetrar fácilmente dichos ventanajes endoteliales para alcanzar los hepatocitos diana.

En algunas realizaciones, el tamaño de un liposoma está determinado por la longitud del diámetro más grande de la partícula de liposoma. En algunas realizaciones, un liposoma adecuado tiene un tamaño no mayor de 75 nm, o 50 nm. En algunas realizaciones, un liposoma adecuado tiene un tamaño que oscila de 10-75 nm, o 10-50 nm. En algunas realizaciones, un liposoma adecuado tiene un tamaño que oscila de aproximadamente 10-90 nm, 10-80 nm, 10-70 nm, 10-60 nm o 10-50 nm.

Una variedad de métodos alternativos conocidos en la técnica están disponibles para dimensionar una población de liposomas. Uno de dichos métodos de dimensionado se describen en la patente de EE.UU. núm. 4.737.323. Sonicar una suspensión de liposomas o mediante sonicación con baño o sonda produce una progresiva reducción de tamaño hasta una ULV pequeña de menos de aproximadamente 0,05 micrómetros de diámetro. La homogeneización es otro método que se basa en energía cortante para fragmentar los liposomas grandes en pequeños. En un procedimiento de homogeneización típico, las MLV se recirculan a través de un homogeneizador de emulsión estándar hasta que se observan los tamaños de liposoma seleccionados, típicamente entre aproximadamente 0,1 y 0,5 micrómetros. El tamaño de los liposomas puede determinarse por dispersión de luz cuasi-eléctrica (QELS) como se describe en Bloomfield, Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 10:421-150 (1981). El diámetro medio del liposoma puede reducirse por sonicación de liposomas formados. Los ciclos de sonicación intermitentes pueden alternarse con la evaluación QELS para guiar la síntesis eficaz de liposomas.

Composiciones farmacéuticas

Para facilitar la expresión de ARNm in vivo, los vehículos de administración como liposomas pueden formularse en combinación con uno o más ácidos nucleicos, vehículos, ligandos de direccionamiento o reactivos estabilizantes adicionales, o en composiciones farmacéuticas donde se mezcla con excipientes adecuados. Las técnicas para formulación y administración de fármacos pueden encontrarse en “Remington's Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Co., Easton, Pa., la última edición.

La composición que comprende el ARNm encapsulado liposomalmente dado puede administrase y dosificarse de acuerdo con la práctica médica actual, teniendo en cuenta la condición clínica del sujeto, el sitio y método de administración, el plan de administración, la edad del sujeto, sexo, peso corporal y otros factores relevantes para los médicos expertos en la técnica. La “cantidad eficaz” para los fines en la presente memoria pueden determinarse por dichas consideraciones relevantes como se sabe por aquellos con experiencia ordinaria en técnicas de investigación clínica experimental, farmacológica, clínica y médica. En algunas realizaciones, la cantidad administrada es eficaz para alcanzar al menos alguna estabilización, mejora o eliminación de síntomas y otros indicadores como se seleccionan como medidas apropiadas de progreso, regresión o mejora de la enfermedad por aquellos con experiencia ordinaria en la técnica. Por ejemplo, una cantidad y régimen de dosificación adecuados es uno que provoca al menos la producción temporal de proteína ASS1.

Las administraciones sencillas además de múltiples de una cantidad terapéuticamente eficaz del ARNm que codifica la proteína ASS1 se contemplan en la presente memoria. La composición puede administrarse a intervalos regulares, dependiendo de la naturaleza, gravedad y extensión de la ASD del sujeto.

En una realización, la composición de la presente invención se administra a un sujeto dos veces al día, diariamente o cada dos días. En una realización preferida, las composiciones de la presente invención se administran a un sujeto dos veces a la semana, una vez a la semana, una vez cada 7 días, una vez cada 10 días, una vez cada 14 días, una vez cada 28 días, una vez cada 30 días, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, o más preferiblemente una vez cada cuatro semanas, una vez al mes, una vez cada seis semanas, una vez cada ocho semanas, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, una vez cada cuatro meses, una vez cada seis meses, una vez cada ocho meses, una vez cada nueve meses o anualmente.

Como se utiliza en la presente memoria, el término “cantidad terapéuticamente eficaz” se determina en gran medida en base a la cantidad total del agente terapéutico contenido en la composición farmacéutica de la presente invención. Generalmente, una cantidad terapéuticamente eficaz es suficiente para alcanzar un beneficio significativo al sujeto (p. ej., tratar, modular, curar, prevenir y/o mejorar la ASD). Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz puede ser una cantidad suficiente para alcanzar un efecto terapéutico y/o profiláctico deseado. Generalmente, la cantidad de ARNm que codifica una proteína ASS1 administrado a un sujeto que lo necesita dependerá de las características del sujeto. Dichas características incluyen la condición, gravedad de la enfermedad, salud general, edad, sexo y peso corporal del sujeto. Una persona con experiencia ordinaria en la técnica será capaz fácilmente de determinar las dosificaciones apropiadas dependiendo de estos y otros factores relacionados. Además, los ensayos tanto objetivos como subjetivos pueden emplearse opcionalmente para identificar los intervalos óptimos de dosificación.

Una cantidad terapéuticamente efectiva se administra normalmente en un régimen de dosificación que puede comprender múltiples dosis unitarias. Para cualquier proteína terapéutica particular, una cantidad terapéuticamente eficaz (y/o una dosis unitaria apropiada dentro de un régimen de dosificación eficaz) puede variar, por ejemplo, dependiendo de la ruta de administración, o combinación con otros agentes farmacéuticos. Además, la cantidad (y/o dosis unitaria) específica terapéuticamente eficaz para cualquier paciente particular puede depender de una variedad de factores que incluyen el trastorno a tratar y la gravedad del trastorno; la actividad del agente farmacéutico específico empleado; la composición específica empleada; la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del paciente; el tiempo de administración, ruta de administración, y/o velocidad de excreción o metabolismo de la proteína específica empleada; la duración del tratamiento; y factores similares como se conoce bien en las técnicas médicas.

En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz oscila de aproximadamente 0,005 mg/kg de peso corporal a 500 mg/kg de peso corporal, p. ej., de aproximadamente 0,005 mg/kg de peso corporal a 400 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 0,005 mg/kg de peso corporal a 300 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 0,005 mg/kg de peso corporal a 200 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 0,005 mg/kg de peso corporal a 100 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 0,005 mg/kg de peso corporal a 90 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 0,005 mg/kg de peso corporal a 80 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 0,005 mg/kg de peso corporal a 70 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 0,005 mg/kg de peso corporal a 60 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 0,005 mg/kg de peso corporal a 50 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 0,005 mg/kg de peso corporal a 40 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 0,005 mg/kg de peso corporal a 30 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 0,005 mg/kg de peso corporal a 25 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 0,005 mg/kg de peso corporal a 20 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 0,005 mg/kg de peso corporal a 15 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 0,005 mg/kg de peso corporal a 10 mg/kg de peso corporal.

En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es mayor que aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal, mayor que aproximadamente 0,5 mg/kg de peso corporal, mayor que aproximadamente 1,0 mg/kg de peso corporal, mayor que aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal, mayor que aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal, mayor que aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, mayor que aproximadamente 15 mg/kg de peso corporal, mayor que aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, mayor que aproximadamente 30 mg/kg de peso corporal, mayor que aproximadamente 40 mg/kg de peso corporal, mayor que aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal, mayor que aproximadamente 60 mg/kg de peso corporal, mayor que aproximadamente 70 mg/kg de peso corporal, mayor que aproximadamente 80 mg/kg de peso corporal, mayor que aproximadamente 90 mg/kg de peso corporal, mayor que aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, mayor que aproximadamente 150 mg/kg de peso corporal, mayor que aproximadamente 200 mg/kg de peso corporal, mayor que aproximadamente 250 mg/kg de peso corporal, mayor que aproximadamente 300 mg/kg de peso corporal, mayor que aproximadamente 350 mg/kg de peso corporal, mayor que aproximadamente 400 mg/kg de peso corporal, mayor que aproximadamente 450 mg/kg de peso corporal, mayor que aproximadamente 500 mg/kg de peso corporal.

También se contemplan en la presente memoria composiciones farmacéuticas liofilizadas como se describe por ejemplo, en la solicitud provisional de los Estados Unidos núm. 61/494.882, presentada el 8 de junio de 2011. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas liofilizadas pueden reconstituirse antes de la administración o pueden reconstituirse in vivo. Por ejemplo, una composición farmacéutica liofilizada puede formularse en una forma de dosificación apropiada (p. ej., una forma de dosificación intradérmica como un disco, varilla o membrana) y administrarse de manera que la forma de dosificación se rehidrata con el tiempo in vivo por los fluidos corporales del individuo.

La composición puede administrarse a cualquier tejido deseado. En algunas realizaciones, el ARNm distribuido por el liposoma dado de la composición se expresa en el tejido en que se administró la composición. En algunas realizaciones, el ARNm distribuido se expresa en un tejido diferente al tejido en que se administró la composición. Los tejidos ejemplares en que el ARNm distribuido puede distribuirse y/o expresarse incluyen, pero no se limitan al hígado, riñón, corazón, bazo, suero, cerebro, músculo esquelético, nódulos linfáticos, piel y/o fluido cerebroespinal.

Según la presente invención, una dosis terapéuticamente eficaz, cuando se administra de forma regular, da por resultado niveles hepáticos de ASS1 aumentados. En algunas realizaciones, una dosis terapéuticamente eficaz, cuando se administra de forma regular, da por resultado un nivel reducido de citrulina en suero en comparación con el nivel de base de citrulina antes del tratamiento.

En algunas realizaciones, administrar la composición dada da por resultado la expresión aumentada de proteína ASS1 en el hígado en comparación con los niveles de base antes del tratamiento. En alguna realización, administrar las composiciones dadas da por resultado un nivel de proteína ASS1 a o por encima de aproximadamente 3000 ng/mg, a o por encima de aproximadamente 2000 ng/mg, a o por encima de aproximadamente 1000 ng/mg, a o por encima de aproximadamente 500 ng/mg, a o por encima de aproximadamente 400 ng/mg, a o por encima de aproximadamente 200 ng/mg o a o por encima de aproximadamente 100 ng/mg de proteína total en el hígado. En una realización particular, administrar las composiciones dadas da por resultado un nivel de proteína ASS1 a o por encima de 120 ng/mg de proteína total en el hígado.

En algunas realizaciones, administrar la composición dada da por resultado un nivel aumentado de proteína ASS1 en plasma o suero en comparación con el nivel de base antes del tratamiento. En algunas realizaciones, administrar la composición dada da por resultado un nivel aumentado de proteína ASS1 en plasma o suero en al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% en comparación con el nivel de base antes del tratamiento.

En algunas realizaciones, la administración de la composición da por resultado niveles reducidos de citrulina y/o amoniaco en el sujeto en comparación con los niveles de base antes del tratamiento. Típicamente, los niveles de base se miden inmediatamente antes del tratamiento. Típicamente, los niveles de citrulina y/o amoniaco se miden en una muestra biológica. Las muestras biológicas adecuadas incluyen, por ejemplo, sangre completa, plasma, suero, orina 0 fluido cerebroespinal.

En algunas realizaciones, la administración de la composición da por resultado un nivel reducido de citrulina en una muestra biológica (p. ej., una muestra de suero, plasma u orina) en al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% en comparación con el nivel de base de la citrulina inmediatamente antes del tratamiento. En algunas realizaciones, la administración de la composición da por resultado un nivel reducido de citrulina en plasma a menos de aproximadamente 2000 pM, 1500 pM, 1000 pM, 750 pM, 500 pM, 250 pM, 100 pM, 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM, 50 pM, 40 pM o 30 pM.

En algunas realizaciones, administrar la composición da por resultado niveles reducidos de amoniaco en una muestra biológica (p. ej., una muestra de suero, plasma u orina) en al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90% o al menos aproximadamente 95% en comparación con el nivel de base inmediatamente antes del tratamiento.

Administrar la composición puede dar por resultado la reducción en los niveles de amoniaco a aproximadamente 3000 pmoles/L o menos, aproximadamente 2750 pmoles/L o menos, aproximadamente 2500 pmoles/L o menos, aproximadamente 2250 pmoles/L o menos, aproximadamente 2000 pmoles/L o menos, aproximadamente 1750 pmoles/L o menos, aproximadamente 1500 pmoles/L o menos, aproximadamente 1250 pmoles/L o menos, aproximadamente 1000 pmoles/L o menos, aproximadamente 750 pmoles/L o menos, aproximadamente 500 pmoles/L o menos, aproximadamente 250 pmoles/L o menos, aproximadamente 100 pmoles/L o menos o aproximadamente 50 pmoles/L o menos en el plasma o suero. En una realización particular, administrar la composición da por resultado la reducción de niveles de amoniaco a aproximadamente 50 pmoles/L o menos en el plasma o suero.

Según diversas realizaciones, el ritmo de expresión de los ARNm distribuidos puede ajustarse para adaptarse a una necesidad médica particular. En algunas realizaciones, la expresión de la proteína codificada por el ARNm distribuido es detectable 1, 2, 3, 6, 12, 24, 48, 72 y/o 96 horas después de la administración de liposomas y/o composiciones dadas. En algunas realizaciones, la expresión de la proteína codificada por el ARNm distribuido es detectable 1 semana, dos semanas y/o 1 mes después de la administración.

Ejemplos

Mientras ciertas composiciones de la presente invención se han descrito con especificidad de acuerdo con ciertas realizaciones, los siguientes ejemplos sirven solo para ilustrar la invención y no tienen por objeto limitar la misma.

Ejemplo 1. Formulaciones ejemplares de liposomas para la distribución y expresión de ARNm de ASS1

Este ejemplo proporciona formulaciones ejemplares de liposomas para la administración y expresión eficaz de ARNm de ASS1 in vivo.

Materiales lipídicos

Las formulaciones descritas en la presente memoria incluyen una mezcla lipídica multi-componente de relaciones variables que emplean un lípido catiónico, lípidos ayudantes (p. ej., un lípido no catiónico y un lípido basado en colesterol) y un lípido PEGilado diseñado para encapsular ARNm que codifica proteína ASS1. Los lípidos catiónicos pueden incluir (pero no exclusivamente) DOTAP (1,2-dioleil-3-trimetilamonio propano), DODAP (1,2-dioleil-3-dimetilamonio propano), DOTMA (1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamonio propano), DLinDMA (Heyes, J.; Palmer, L.; Bremner, K.; MacLachlan, I. “Cationic lipid saturation influences intracellular delivery of encapsulated nucleic acids” J. Contr. Rel. 2005, 107, 276-287), DLin-KC2-DMA (Semple, S.C. et al. “Rational Design of Cationic Lipids for siRNA Delivery” Nature Biotech. 2010, 28, 172-176), C12-200 (Love, K.T. et al. “Lipid-like materials for low-dose in vivo gene silencing” PNAS 2010, 107, 1864-1869), cKk -E12 (3,6-bis(4-(bis(2-hidroxidodecil)amino)butil)piperazina-2,5-diona), HGT5000, HGT5001, HGT4003, ICE, basado en dialquilamino, basado en imidazol, basado en guanidinio, etc. Los lípidos ayudantes pueden incluir (pero no exclusivamente) DSPC (1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina), DPPC (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina), DOPE (1,2-dioleil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DOPC (1,2-dioleil-sn-glicero-3-fosfotidilcolina) DPPE (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DMPE (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DOPG (,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol)), colesterol, etc. Los lípidos PEGilados pueden incluir (pero no exclusivamente) una cadena de poli(etilen)glicol de hasta 5 kDa de longitud unida de forma covalente a un lípido con cadena(s) alquilo de C⁶-C²⁰de longitud.

El ARN mensajero de argininosuccinato sintetasa (ASS1) humana con codones optimizados se sintetizó mediante transcripción in vitro a partir de una plantilla de ADN plasmídico que codifica el gen, que fue seguido por la adición de una estructura de caperuza 5' (C apí) (Fechter, P.; Brownlee, G.G. “Recognition of mRNA cap structures by viral and cellular proteins” J. Gen. Virology 2005, 86, 1239-1249) y una cola poli(A) 3' de aproximadamente 250 nucleótidos de longitud (SEQ ID NO:12) como se determina por electroforesis en gel. Las regiones no traducidas 5' y 3' presentes en cada producto de ARNm se representan como X e Y, respectivamente y se definen como se indica (vide infra). ARNm de argininosuccinato sintetasa (ASS1) humana con codones optimizados ejemplares

Diseño de constructo:

X - SEQ ID NO:3-Y;

X-SEQ ID NO:13-Y;

X-SEQ ID NO:14-Y; y

X-SEQ ID NO:15-Y.

Secuencias 5' y 3' UTR

X (secuencia 5' UTR) = GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUC CGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG [SEQ ID NO.:4]

Y (Secuencia 3' UTR) = CGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAG CCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU [SEQ ID NO.:5]

O GGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGC CUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAAGCU (SEQ ID NO.:6)

Las secuencias de ARNm de ASS1 humana con codones optimizados ejemplares incluyen la SEQ ID NO:3 descrita en la sección de descripción detallada, y SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14 y s Eq ID NO:15 posteriores:

SEQ ID NO:13

AUGAGCUCAAAGGGAUCUGUGGUGCUGGCAUACUCGGGGGGAUUGGACACUUCAUGCAUACUUGUCUGGU UGAAGGAACAGGGCUACGACGUGAUCGCCUACCUGGCUAACAUCGGUCAAAAGGAGGACUUCGAGGAGGCC CGGAAGAAGGCCCUGAAGCUGGGCGCGAAGAAAGUGUUCAUCGAGGACGUGUCCCGGGAAUUUGUGGAAG AGUUCAUCUGGCCCGCCAUCCAAAGCAGCGCACUGUACGAGGAUAGAUACCUCCUCGGAACAUCCCUUGCCC GGCCAUGUAUUGCCAGGAAACAGGUGGAAAUCGCCCAGCGGGAAGGAGCCAAAUACGUGUCCCACGGGGCG ACCGGAAAGGGGAACGACCAAGUGCGCUUCGAGCUGUCGUGCUACUCCCUGGCACCGCAGAUUAAGGUCAU CGCGCCGUGGAGAAUGCCUGAAUUCUACAACCGCUUCAAGGGCCGCAACGAUCUGAUGGAAUACGCCAAGCA GCACGGCAUCCCGAUCCCCGUGACCCCUAAGAACCCUUGGUCAAUGGACGAGAAUCUGAUGCACAUCAGCUA CGAAGCGGGCAUCCUGGAGAACCCCAAGAAUCAAGCUCCGCCCGGACUGUACACUAAGACUCAGGAUCCCGC UAAGGCGCCCAACACUCCUGAUAUUUUGGAAAUCGAAUUCAAGAAGGGUGUCCCAGUGAAGGUCACCAACG UGAAGGACGGCACUACCCACCAGACCUCGCUGGAACUGUUUAUGUAUCUGAACGAGGUGGCCGGCAAACAU GGAGUCGGCAGAAUCGAUAUUGUGGAGAACCGCUUUAUUGGCAUGAAGUCCAGGGGGAUCUAUGAAACCC CGGCCGGAACCAUCCUCUACCACGCCCAUCUCGACAUUGAAGCGUUCACCAUGGACCGCGAGGUCCGCAAGA UUAAGCAGGGCCUGGGACUCAAGUUCGCCGAGCUCGUGUACACCGGUUUCUGGCAUUCCCCGGAAUGCGAA UUCGUGCGACACUGCAUUGCCAAGAGCCAGGAGCGGGUGGAAGGAAAGGUCCAGGUGUCCGUGCUGAAGG GUCAAGUGUACAUCCUGGGGCGGGAGUCCCCUCUUUCCCUGUACAACGAAGAACUGGUGUCGAUGAACGUG CAGGGAGACUACGAGCCGACCGACGCCACGGGUUUCAUUAACAUCAAUUCCCUGAGACUGAAGGAGUACCAC CGGCUCCAGUCCAAAGUCACCGCUAAGUGA (SEQ ID NO: 13),

SEQ ID NO:14 AUGAGCUCAAAAGGAUCGGUGGUGCUGGCAUACUCGGGAGGAUUGGACACUUCAUGUAUUCUUGUCUGGC UCAAGGAACAGGGCUACGACGUCAUUGCCUACCUGGCCAACAUCGGUCAGAAAGAGGACLIUCGAGGAAGCCA GAAAGAAGGCCCUGAAGCUGGGAGCCAAGAAGGUGUUCAUCGAGGACGUGUCCCGCGAAUUUGUGGAAGA AUUCAUCLIGGCCUGCCAUUCAAUCCLICCGCGCUCUACGAGGAUCGGUACCUUCUGGGAACUUCCUUGGCUC GCCCGUGCAUCGCCCGGAAACAAGUGGAGAUUGCACAGCGGGAAGGAGCUAAGUACGUGUCCCACGGGGCC ACUGGAAAGGGCAACGAUCAAGUGCGCUUCGAGCUGUCCUGCUACUCCCUGGCGCCACAGAUCAAGGUCAUC GCGCCGUGGCGGAUGCCCGAGUUCUAUAACCGCUUCAAGGGACGGAACGAUCUGAUGGAGUACGCCAAGCA GCACGGCAUUCCGAUACCCGUGACCCCCAAGAACCCUUGGAGCAUGGACGAGAACCUGAUGCAUAUCUCUUA CGAAGCCGGGAUUCUCGAAAACCCUAAGAAUCAGGCGCCGCCUGGCCUGUACACCAAAACCCAGGACCCCGCC AAGGCGCCGAACACGCCCGACAUCCUCGAAAUCGAGUUCAAGAAGGGGGUGCCAGUGAAGGUCACCAACGUG AAGGACGGAACCACCCAUCAGACCUCACUGGAACUCUUCAUGUACCUCAACGAGGUCGCAGGGAAGCACGGC GUGGGGAGAAUCGACAUCGUGGAAAACAGGUUCAUCGGCAUGAAGUCCCGGGGAALICUACGAAACACCCGC CGGGACUAUCCUCUACCACGCCCACCUGGACAUUGAGGCCUUCACCAUGGAUAGAGAAGUGCGCAAGAUUAA GCAGGGUCUGGGUCUGAAGUUCGCCGAGUUGGUCUACACCGGAUUCUGGCAUUCCCCUGAAUGCGAAUUC GUGCGCCACUGCAUUGCCAAGAGCCAGGAAAGAGUGGAGGGCAAAGUCCAAGUGUCGGUGCUGAAGGGCCA AGUGUACAUCCUGGGAAGGGAAAGCCCGCUCUCCCUGUACAACGAGGAACUGGUGUCGAUGAACGUCCAGG GCGAUUAUGAGCCGACUGACGCCACUGGUUUUAUCAAUAUCAACAGCCUGCGACUGAAGGAGUACCACCGG CUGCAGUCCAAGGUCACCGCUAAGUAG (SEQ ID NO:14),

SEQ ID NO:15 AUGAGCUCGAAAGGAUCCGUGGUUUUGGCAUACUCCGGUGGACUUGACACUUCAUGCAUUUUGGUUUGGC ÜCAAAGAACAGGGCUACGAUGUGAUCGCCÜACCUGGCGAACAUCGGACAGAAAGAGGACUUUGAAGAGGCC CGCAAGAAGGCACUGAAGCUGGGUGCCAAGAAAGUGUUUAUCGAGGAUGUGUCGAGAGAAUUCGUGGAAG AAUUCAUUÜGGCCAGCCAUÜCAAAGCÜCCGCGCÜGUACGAGGACAGAÜACCUCCUCGGCACCUCACUGGCCC GCCCUUGCAUCGCGCGCAAACAGGUCGAGAUCGCUCAAAGAGAAGGAGCUAAAUACGUGUCACACGGCGCCA CCGGAAAGGGAAAUGACCAAGUCCGCUUCGAGCUGUCUUGCUACUCACUCGCUCCGCAAAUCAAGGUCAUCG CACCGUGGAGGAUGCCCGAGUUCUACAACCGGUUCAAGGGGCGGAACGACCUGAUGGAGUACGCGAAGCAG CACGGUAUCCCGAUCCCUGUCACCCCAAAGAACCCCUGGAGCAUGGACGAAAAUCUGAUGCACAUCAGCUAC GAAGCAGGAAUCCUGGAGAACCCGAAAAAUCAAGCACCUCCUGGACUGUACACUAAGACCCAGGACCCAGCCA AGGCCCCGAAÜACCCCGGACAUCÜÜGGAAAUCGAGUUCAAGAAGGGGGUGCCAGUGAAGGUUACCAAUGUC AAGGAUGGGACCACUCACCAAACUAGCCUGGAACUGUUCAUGUACCUGAACGAAGUGGCUGGAAAACAUGG CGUGGGAAGAAUCGAUAUCGUGGAGAACCGCUUCAUCGGCAUGAAGUCAAGGGGAAUCUACGAAACUCCGG CCGGGACGAUACUGUAUCAUGCGCAUCUCGACAUUGAAGCCUUUACUAUGGAÜCGGGAAGUCCGAAAGAUC AAACAGGGCUUGGGCCUCAAGUUUGCCGAGCUGGUGUACACGGGAUUCUGGCACUCGCCGGAAUGCGAAUU CGUGCGCCACUGUAUUGCGAAGUCCCAGGAGCGCGUGGAAGGGAAGGUCCAAGUCUCCGUGCUCAAAGGAC AGGUCUACAUCCUUGGACGGGAGUCGCCCCUGUCGCUCUACAACGAAGAACUGGUGUCGAUGAACGUGCAG GGAGACUAUGAACCAACGGAÜGCUACUGGUUUCAUCAACAUCAAUUCGCUGCGGCUUAAGGAGUACCAUCG GCUGCAGUCCAAGGUCACCGCGAAGUAG (SEQ ID N0:15}.

Una secuencia de ARN mensajero de argininosuccinato sintetasa (ASS1) humana con codones optimizados de longitud completa ejemplar se muestra a continuación:

GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUC CGCGGCCGGGAACGGÜGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACGAUG AGCAGCAAGGGCAGCGUGGUGCUGGCCUACAGCGGCGGCCUGGACACCAGCUGCAUCCUGGUGUGGCUGAA GGAGCAGGGCUACGACGUGAUCGCCUACCUGGCCAACAUCGGCCAGAAGGAGGACUUCGAGGAGGCCCGCAA GAAGGCCCUGAAGCUGGGCGCCAAGAAGGUGÜUCAUCGAGGACGUGAGCCGCGAGUÜCGUGGAGGAGUUC AUCUGGCCCGCCAUCCAGAGCAGCGCCCUGUACGAGGACCGCUACCUGCUGGGCACCAGCCUGGCCCGCCCCU GCAUCGCCCGCAAGCAGGUGGAGAUCGCCCAGCGCGAGGGCGCCAAGUACGUGAGCCACGGCGCCACCGGCA AGGGCAACGACCAGGUGCGCUUCGAGCUGAGCUGCUACAGCCUGGCCCCCCAGAUCAAGGUGAUCGCCCCCU GGCGCAUGCCCGAGUUCUACAACCGCUUCAAGGGCCGCAACGACCÜGAUGGAGÜACGCCAAGCAGCACGGCA UCCCCAUCCCCG U GACCCCCAAGAACCCCU GGAGCAUGG ACG AG AACCUG AU GCACAU CAGCU ACGAGGCCGG CAUCCUGGAGAACCCCAAGAACCAGGCCCCCCCCGGCCUGUACACCAAGACCCAGGACCCCGCCAAGGCCCCCA ACACCCCCGACAUCCUGGAGAUCGAGUUCAAGAAGGGCGUGCCCGUGAAGGUGACCAACGUGAAGGACGGCA CCACCCACCAGACCAGCCUGGAGCUGUUCAUGUACCUGAACGAGGUGGCCGGCAAGCACGGCGUGGGCCGCA UCGACAUCGUGGAGAACCGCUUCAUCGGCAUGAAGAGCCGCGGCAUCUACGAGACCCCCGCCGGCACCAUCC UGUACCACGCCCACCUGGACAUCGAGGCCUUCACCAUGGACCGCGAGGÜGCGCAAGAUCAAGCAGGGCCUGG GCCUGAAGUUCGCCGAGCUGGUGUACACCGGCUUCUGGCACAGCCCCGAGUGCGAGUUCGUGCGCCACUGC AUCGCCAAGAGCCAGGAGCGCGUGGAGGGCAAGGUGCAGGUGAGCGUGCUGAAGGGCCAGGUGUACAUCCU GGGCCGCGAGAGCCCCCUGAGCCUGUACAACGAGGAGCUGGUGAGCAUGAACGUGCAGGGCGACUACGAGC CCACCGACGCCACCGGCUUCAUCAACAUCAACAGCCUGCG CCUGAAGGAGUACCACCG CCUGCAGAGCAAGGU GACCGCCAAGUGACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUC CAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU (SEQ ID NO:7).

En otro ejemplo, una secuencia de ARN mensajero de argininosuccinato sintetasa (ASS1) humana con codones optimizados de longitud completa se muestra a continuación:

GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUC CGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACGAUG AGCAGCAAGGGCAGCGUGGUGCUGGCCUACAGCGGCGGCCUGGACACCAGCUGCAUCCUGGUGUGGCUGAA GGAGCAGGGCUACGACGUGAUCGCCUACCUGGCCAACAUCGGCCAGAAGGAGGACUUCGAGGAGGCCCGCAA GAAGGCCCUGAAGCUGGGCGCCAAGAAGGUGUUCAUCGAGGACGUGAGCCGCGAGUUCGUGGAGGAGUUC AUCUGGCCCGCCAUCCAGAGCAGCGCCCUGUACGAGGACCGCUACCUGCUGGGCACCAGCCUGGCCCGCCCCU GCAUCGCCCGCAAGCAGGUGGAGAUCGCCCAGCGCGAGGGCGCCAAGUACGUGAGCCACGGCGCCACCGGCA AGGGCAACGACCAGGUGCGCUUCGAGCUGAGCUGCUACAGCCUGGCCCCCCAGAUCAAGGUGAUCGCCCCCU GGCGCAUGCCCGAGUUCUACAACCGCUUCAAGGGCCGCAACGACCUGAUGGAGUACGCCAAGCAGCACGGCA UCCCCAUCCCCGUGACCCCCAAGAACCCCUGGAGCAUGGACGAGAACCUGAUGCACAUCAGCUACGAGGCCGG CAUCCUGGAGAACCCCAAGAACCAGGCCCCCCCCGGCCUGUACACCAAGACCCAGGACCCCGCCAAGGCCCCCA ACACCCCCGACAUCCUGGAGAUCGAGUUCAAGAAGGGCGUGCCCGUGAAGGUGACCAACGUGAAGGACGGCA CCACCCACCAGACCAGCCUGGAGCUGUUCAUGUACCUGAACGAGGUGGCCGGCAAGCACGGCGUGGGCCGCA UCGACAUCGUGGAGAACCGCUUCAUCGGCAUGAAGAGCCGCGGCAUCUACGAGACCCCCGCCGGCACCAUCC UGUACCACGCCCACCUGGACAUCGAGGCCUUCACCAUGGACCGCGAGGUGCGCAAGAUCAAGCAGGGCCUGG GCCUGAAGUUCGCCGAGCUGGUGUACACCGGCUUCUGGCACAGCCCCGAGUGCGAGUUCGUGCGCCACUGC AUCGCCAAGAGCCAGGAGCGCGUGGAGGGCAAGGUGCAGGUGAGCGUGCUGAAGGGCCAGGUGUACAUCCU GGGCCGCGAGAGCCCCCUGAGCCUGUACAACGAGGAGCUGGUGAGCAUGAACGUGCAGGGCGACUACGAGC CCACCGACGCCACCGGCUUCAUCAACAUCAACAGCCUGCGCCUGAAGGAGUACCACCGCCUGCAGAGCAAGGU GACCGCCAAGUGAGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCC AGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAAGCU (SEQ ID N0:8).

Protocolos de formulación ejemplares

A. cKK-E12

Se mezclaron alícuotas de 50 mg/mL de disoluciones etanólicas de cKK-E12, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K y se diluyeron con etanol a 3 mL de volumen final. De forma separada, se preparó una disolución tamponada acuosa (citrato 10 mM/NaCl 150 mM, pH 4,5) de ARNm de ASS1 a partir de una disolución madre de 1 mg/mL. La disolución lipídica se inyectó rápidamente en la disolución acuosa de ARNm y se agitó para dar una suspensión final en 20% de etanol. La suspensión resultante de nanopartículas se filtró, se diafiltró con 1x PBS (pH 7,4), se concentró y se almacenó a 2-8°C. Concentración final = 0,64 mg/mL de ARNm de ASS1 (encapsulado). Zmedia = 78 nm (Dv(50) = 46 nm; Dv(90) = 96 nm).

B. C12-200

Se mezclaron alícuotas de 50 mg/mL de disoluciones etanólicas de C12-200, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K y se diluyeron con etanol a 3 mL de volumen final. De forma separada, se preparó una disolución tamponada acuosa (citrato 10 mM/NaCl 150 mM, pH 4,5) de ARNm de ASS1 a partir de disolución madre de 1 mg/mL. La disolución lipídica se inyectó rápidamente en la disolución acuosa de ARNm y se agitó para dar una suspensión final en 20% de etanol. La suspensión resultante de nanopartículas se filtró, se diafiltró con 1x PBS (pH 7,4), se concentró y se almacenó a 2-8°C. Concentración final = 0,82 mg/mL de ARNm de ASS1 (encapsulado). Zmedia = 86 nm (Dv(50) = 50 nm; Dv(90) = 101 nm).

C. HGT4003

Se mezclaron alícuotas de 50 mg/mL de disoluciones etanólicas de HGT4003, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K y se diluyeron con etanol a 3 mL de volumen final. De forma separada, se preparó una disolución tamponada acuosa (citrato 10 mM/NaCl 150 mM, pH 4,5) de ARNm de ASS1 a partir de una disolución madre de 1 mg/mL. La disolución lipídica se inyectó rápidamente en la disolución acuosa de ARNm y se agitó para dar una suspensión final en 20% de etanol. La suspensión resultante de nanopartículas se filtró, se diafiltró con 1x PBS (pH 7,4), se concentró y se almacenó a 2-8°C. Concentración final = 0,82 mg/mL de ARNm de ASS1 (encapsulado). Zmedia = 86 nm (Dv(50) = 50 nm; Dv(90) = 101 nm).

D. ICE

Se mezclaron alícuotas de 50 mg/mL de disoluciones etanólicas de ICE, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K y se diluyeron con etanol a 3 mL de volumen final. De forma separada, se preparó una disolución tamponada acuosa (citrato 10 mM/NaCl 150 mM, pH 4,5) de ARNm de ASS1 a partir de una disolución madre de 1 mg/mL. La disolución lipídica se inyectó rápidamente en la disolución de ARNm acuosa y se agitó para dar una suspensión final en 20% de etanol. La suspensión de nanopartículas resultante se filtró, se diafiltró con 1x PBS (pH 7,4), se concentró y se almacenó a 2-8°C. Concentración final = 0,91 mg/mL de ARNm de ASS1 (encapsulado). Zmedia = 81 nm (Dv(50) = 48 nm; Dv(90) = 96 nm).

E. HGT5001

Se mezclaron alícuotas de 50 mg/mL de disoluciones etanólicas de HGT5001, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K y se diluyeron con etanol a 3 mL de volumen final. De forma separada, se preparó una disolución tamponada acuosa (citrato 10 mM/NaCl 150 mM, pH 4,5) de ARNm de ASS1 a partir de una disolución madre de 1 mg/mL. La disolución lipídica se inyectó rápidamente en la disolución acuosa de ARNm y se agitó para dar una suspensión final en 20% de etanol. La suspensión resultante de nanopartículas se filtró, se diafiltró con 1x PBS (pH 7,4), se concentró y se almacenó a 2-8°C. Concentración final = 0,20 mg/mL de ARNm de ASS1 (encapsulado). Zmedia = 87,0 nm (Dv(50) = 75 nm; Dv(90) = 103 nm).

F. HGT5000

Se mezclaron alícuotas de 50 mg/mL de disoluciones etanólicas de HGT5000, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K y se diluyeron con etanol a 3 mL de volumen final. De forma separada, se preparó una disolución tamponada acuosa (citrato 10 mM/NaCl 150 mM, pH 4,5) de ARNm de ASS1 a partir de una disolución madre de 1 mg/mL. La disolución lipídica se inyectó rápidamente en la disolución acuosa de ARNm y se agitó para dar una suspensión final en 20% de etanol. La suspensión resultante de nanopartículas se filtró, se diafiltró con 1x PBS (pH 7,4), se concentró y se almacenó a 2-8°C. Concentración final = 0,20 mg/mL de ARNm de ASS1 (encapsulado). Zmedia = 81 nm (Dv(50) = 67 nm; Dv(90) = 97 nm).

G. DLinKC2DMA

Se mezclaron alícuotas de 50 mg/mL de disoluciones etanólicas de DLinKC2DMA, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K y se diluyeron con etanol a 3 mL de volumen final. De forma separada, se preparó una disolución tamponada acuosa (citrato 10 mM/NaCl 150 mM, pH 4,5) de ARNm de ASS1 a partir de una disolución madre de 1 mg/mL. La disolución lipídica se inyectó rápidamente en la disolución acuosa de ARNm y se agitó para dar una suspensión final en 20% de etanol. La suspensión resultante de nanopartículas se filtró, se diafiltró con 1x PBS (pH 7,4), se concentró y se almacenó a 2-8°C. Concentración final = 0,20 mg/mL de ARNm de ASS1 (encapsulado). Zmedia = 78 nm (Dv(50) = 60 nm; Dv(90) = 92 nm).

H. DODAP

Se mezclaron alícuotas de 50 mg/mL de disoluciones etanólicas de DODAP, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K y se diluyeron con etanol a 3 mL de volumen final. De forma separada, se preparó una disolución tamponada acuosa (citrato 10 mM/NaCl 150 mM, pH 4,5) de ARNm de ASS1 a partir de una disolución madre de 1 mg/mL. La disolución lipídica se inyectó rápidamente en la disolución acuosa de ARNm y se agitó para dar una suspensión final en 20% de etanol. La suspensión resultante de nanopartículas se filtró, se diafiltró con 1x PBS (pH 7,4), se concentró y se almacenó a 2-8°C. Concentración final = 0,20 mg/mL de ARNm de ASS1 (encapsulado). Zmedia = 84 nm (Dv(50) = 62 nm; Dv(90) = 92 nm).

I. DODMA

Se mezclaron alícuotas de 50 mg/mL de disoluciones etanólicas de DODMA, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K y se diluyeron con etanol a 3 mL de volumen final. De forma separada, se preparó una disolución tamponada acuosa (citrato 10 mM/NaCl 150 mM, pH 4,5) de ARNm de ASS1 a partir de una disolución madre de 1 mg/mL. La disolución lipídica se inyectó rápidamente en la disolución acuosa de ARNm y se agitó para dar una suspensión final en 20% de etanol. La suspensión resultante de nanopartículas se filtró, se diafiltró con 1x PBS (pH 7,4), se concentró y se almacenó a 2-8°C. Concentración final = 0,20 mg/mL de ARNm de ASS1 (encapsulado). Zmedia = 86 nm (Dv(50) = 69 nm; Dv(90) = 98 nm).

Ejemplo 2. Administración de nanopartículas de liposoma cargadas con ARNm de ASS1

Este ejemplo ilustra métodos ejemplares de administración de nanopartículas de liposoma cargadas con ARNm de ASS1 y métodos para analizar la proteína expresada en diversos tejidos diana in vivo.

Todos los estudios se realizaron usando ratones CD-1 machos de aproximadamente 6-8 semanas de edad al comienzo de cada experimento. Las muestras se introdujeron mediante una única inyección en bolo en la vena de la cola de una dosis total equivalente a 1,0 mg/kg (o especificada de otra forma) de ARNm de ASS1 encapsulado. Los ratones se sacrificaron y se perfundieron con solución salina en los puntos temporales designados.

Se cosecharon tejidos como hígado, bazo, riñón y corazón de cada ratón, se distribuyeron en partes separadas y se almacenaron en 10% de formalina tamponada neutra o se congelaron instantáneamente y se almacenaron a -80°C para el análisis.

Se realizó la eutanasia a todos los animales mediante asfixia con CO²en puntos temporales designados después de la administración de la dosis (±5%) seguido por toracotomía y recogida de la sangre cardiaca terminal. Se recogió la sangre completa (volumen máximo obtenible) por medio de punción cardiaca en los animales a los que se realizó la eutanasia en tubos separadores de suero, se dejó coagular a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos, se centrifugó a 22°C ± 5°C a 9300 g durante 10 minutos, y se extrajo el suero. Para recogidas de sangre intermedias, se recogió aproximadamente 40-50 pL de sangre completa por medio de punción en la vena facial o corte de la cola. Las muestras recogidas de animales sin tratamiento se utilizaron como niveles de base de ASS1 para la comparación para estudiar animales.

Análisis del ensayo por inmunoabsorción ligado a enzima (ELISA)-ELISA de ASS1 humana

Se siguieron los procedimientos ELISA estándar empleando IgG 2D1-2E12 anti-ASS1 de ratón como el anticuerpo de captura con IgG núm. 3285 anti-ASS1 de conejo como el anticuerpo secundario (detección) (Shire Human Genetic Therapies). Se utilizó IgG anti-conejo de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) para la activación de la disolución de sustrato 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB). La reacción de desactivó usando H²SO⁴2N después de 20 minutos. La detección se monitorizó por medio de absorción (450 nm) en un instrumento Molecular Device SpectraMax. El suero y los órganos de ratón no tratado y la proteína ASS1 humana se utilizaron como controles negativo y positivo, respectivamente.

Ejemplo 3. Expresión eficaz de proteína ASS1 in vivo

Este ejemplo demuestra que la administración de ARNm de ASS1 da por resultado la producción exitosa de proteína y eficacia clínica in vivo.

La producción de proteína ASS1 humana por medio de nanopartículas lipídicas cargadas con ARNm de hASS1 con codones optimizados se probó en ratones CD-1 como una única inyección en bolo intravenosa. La Figura 1 representa la cantidad de proteína ASS1 humana detectada por medio de ELISA cuando se trataron los ratones con nanopartículas lipídicas con base de cKK-E12 cargadas con ARNm de ASS1 humana a diversas dosis. Los ratones se sacrificaron veinticuatro horas después de la inyección y los órganos se cosecharon (como se describe anteriormente).

Como se muestra en la Figura 1, se consiguió una respuesta clara a la dosis cuando se midieron los niveles en el hígado de proteína ASS1 humana. El intervalo de dosificación fue de 0,10-2,0 mg/kg de ARNm de ASS1 humana encapsulado. Estos datos demuestran la capacidad de las nanopartículas lipídicas de acumularse en el hígado y la liberación de la carga de ARNm y del hígado de procesar este ARNm exógeno por medio de traducción para producir proteína ASS1 humana. Los valores brutos de proteína ASS1 humana como se mide por medio del análisis ELISA (como se representa en la Figura 1) se mostraron en la tabla 1 posterior.

Tabla 1

Se distribuyó ARNm de ASS1 humana con codones optimizados por medio de nanopartículas lipídicas con base de cKK-E12. Las dosis están basadas en ARNm de ASS1 encapsulado. Los valores se representan como un nanograma de proteína ASS1 humana por miligramo de proteína total en el hígado. BLD = por debajo del límite de detección para ELISA.

Mientras la sensibilidad de ELISA tiene limitaciones a valores más bajos, el análisis de electroinmunotransferencia permite la clara visualización de la proteína ASS1 humana a dosis más bajas (0,30 mg/kg) (Figuras 2A-2D).

Para entender más la capacidad de las nanopartículas lipídicas encapsuladas con ARNm de ASS1 para facilitar la distribución de ARNm a órganos seleccionados (hígado), se hizo un estudio farmacocinético monitorizando los niveles de proteína ASS1 humana en el hígado durante un periodo de tiempo de una semana. La Figura 3 representa la cantidad de proteína ASS1 humana detectada en el hígado en diversos puntos temporales después de la administración de nanopartículas lipídicas cargadas con ASS1 humana (cKK-E12). Esto se consiguió como una única dosis (1,0 mg/kg de ARNm encapsulado) dada de forma intravenosa.

En este caso se observó un nivel máximo en suero de proteína ASS1 humana a aproximadamente 24-48 horas después de la administración. Aún se observaron niveles medibles de proteína 1 semana después de la administración como se determinó tanto por ELISA como por electroinmunotransferencia (Figuras 3 y 4A-4E, respectivamente).

La detección directa del ingrediente farmacéutico activo (ARNm de ASS1) en los hígados de los ratones tratados se consiguió utilizando métodos basados en hibridación in situ (ISH). Como se demuestra en las Figuras 5A-5I, el ARN mensajero de ASS1 humana exógeno pudo detectarse en altos niveles en el punto temporal más temprano probado (30 minutos) y la señal permaneció fuerte durante 48 horas después de la dosificación. Además, el ARNm de ASS1 humana aún fue detectable 7 días después de la administración.

Además del ISH, la detección de la proteína ASS1 humana resultante se consiguió utilizando medios inmunohistoquímicos (IHC). Utilizando un anticuerpo monoclonal de ratón (02D2-2E12) para la unión específica, se observó fácilmente la proteína ASS1 humana diana en el citoplasma de los hepatocitos de hígados tratados. La señal se observó primero en hígados tratados débilmente en el espacio de 30 minutos pero claramente en el espacio de 3 horas después de la administración. Las Figuras 6A-6I muestran la tinción de la proteína ASS1 humana en hígados de ratón tratados como una función del tiempo después de la administración.

Además, se observa la amplia distribución en todo el hígado con fuerte detección de proteína ASS1 humana tanto en las células sinusoidales como en las células de hepatocito diana. Las Figuras 7A-7B representan una representación a bajo aumento de tinción IHC positiva para proteína ASS1 humana 24 horas después de la administración.

La administración de ARNm de ASS1 humana y la posterior producción de proteínas no está limitada a un único sistema de nanopartículas lipídicas. Se exploraron diversos sistemas de nanopartículas basadas en lípidos catiónicos por su capacidad de distribuir ARNm y producir la proteína deseada. Se investigó una selección de 10 sistemas lipídicos catiónicos diferentes utilizando ARNm de ASS1 humana como el analito de elección. El componente lipídico catióni

Las dosis de las formulaciones fueron todas de 1,0 mg/kg en base al ARNm encapsulado. Los valores están basados en muestras hepáticas 24 horas después de la administración.

Tabla 2

Los valores brutos de proteína ASS1 humana para diversos sistemas de nanopartículas basados en lípidos catiónicos como se mide por medio de análisis ELISA (como se representa en la Figura 9). Todas las dosis se administraron de forma intravenosa a 1,0 mg/kg. Los valores de proteína se representan como un nanograma de proteína ASS1 humana por miligramo de proteína hepática total. cKK-E12 (1) tuvo un menor porcentaje de lípido PEG que cKK-E12 (2) (3% frente a 5% de lípido PEG).

Aunque puede detectarse la producción de proteína por medio de nanopartículas lipídicas cargadas con ARNm, se determinó además si la proteína resultante está activa y puede funcionar apropiadamente. Para este fin, se realizaron estudios de actividad in vitro que midieron la incorporación de 14C arginina en proteínas celulares por medio de suplementación de 14C citrulina. La citrulina radioactiva se convirtió a 14C-argininosuccinato, y posteriormente a 14C-arginina, en presencia de proteína ASS1 activa. Comparando las células transfectadas con ARNm de ASS1 humana frente a células no tratadas, se pudo medir la actividad de la respectiva proteína ASS1 derivada de ARNm exógeno. La transfección de células SK (-) (línea celular knockout en proteína ASS1) con ARNm de ASS1 humana expuesta a medio agotado (sin arginina o leucina) dio por resultado un aumento en la radioactividad observada en comparación con las células SK (-) no tratadas. La actividad medida en estas células transfectadas fue comparable a una línea celular ASS1 positiva transfectada de forma estable (SK (+)).

Ejemplo 4. Niveles de proteína ASS1 humana después del tratamiento con nanopartículas lipídicas cargadas con ARNm de ASS1

Este ejemplo demuestra que la administración de ARNm de ASS1 da por resultado la producción exitosa de la proteína ASS1 en el hígado.

Los ratones CD-1 machos se administraron con una única dosis de 1,0 mg/kg de nanopartículas lipídicas (nanopartícula lipídica con base de cKK-E12 cargada con ARNm de ASS1) de forma intravenosa, o no tratada (es decir, control), como se describe anteriormente en el Ejemplo 2. Los ratones se sacrificaron y los órganos se recogieron 24 horas después de la administración. Los niveles de proteína argininosuccinato sintetasa (ASS1) humana en el hígado se midieron mediante ELISA. Estos datos demuestran los niveles aumentados de proteína ASS1 que fueron detectados respecto al control y que la proteína producida resultó de ARNm de ASS1 distribuido de forma intravenosa (Figura 10).

Ejemplo 5: Niveles de amoniaco en plasma después del tratamiento con nanopartículas lipídicas cargadas con ARNm de ASS1

Este ejemplo demuestra que la administración de ARNm de ASS1 da por resultado a una reducción exitosa de los niveles de amoniaco en plasma.

Los ratones knockout en ASS1 se administraron con 1,0 mg/kg de nanopartículas lipídicas de ARNm de ASS1 (nanopartículas lipídicas con base de cKK-E12 cargadas con ARNm de ASS1) o nanopartículas lipídicas vacías una vez cada 14 días durante 30 días como se describe anteriormente en el Ejemplo 2. Los ratones a los que se administró nanopartículas lipídicas vacías sirvieron como el vehículo de control. Los controles adicionales incluyeron ratones de tipo silvestre no tratados y ratones knockout en ASS1 no tratados. Antes de cada dosis en los días 1, 15 y 29, se recogieron muestras de plasma (es decir, antes de la dosis). Las muestras de plasma se recogieron también en el periodo de 24 horas después de cada dosis en los días 2, 16 y 30. Se recogieron muestras adicionales de plasma en los días 8 y 22. Los niveles de amoniaco en plasma se cuantificaron en todas las muestras y demostraron que los niveles de amoniaco en plasma se redujeron de forma reproducible durante al menos 24 horas después del tratamiento a niveles cercanos a los observados en ratones de tipo silvestre.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende un liposoma que encapsula un ARNm con codones optimizados que codifica una proteína argininosuccinato sintetasa (ASS1) humana que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 para su uso en el tratamiento de la deficiencia de argininosuccinato sintetasa (ASD), en donde el tratamiento comprende administrar a un sujeto que necesita un tratamiento la composición a una dosis eficaz y un intervalo de administración de manera que el nivel de amoniaco en suero del sujeto se reduzca en comparación con el nivel de amoniaco de base antes del tratamiento, en donde (i) el componente lipídico del liposoma consiste en un lípido catiónico, un lípido no catiónico, un lípido basado en colesterol y un lípido PEGilado, (ii) el lípido catiónico constituye aproximadamente 30-50% del liposoma mediante la relación molar, y (iii) el liposoma tiene un tamaño menor que aproximadamente 100 nm.

2. La composición para utilizar según la reivindicación 1, en donde:

(i) el lípido catiónico se selecciona del grupo que consiste en C12-200, MC3, DLinDMA, DLinkC2DMA, cKK-E12, ICE (basado en imidazol), HGT5000, HGT5001, DODAC, DDAB, DMRIE, DOSPA, DOGS, DODAP, DODMA y DMDMA, DODAC, DLenDMA, DMRIE, CLinDMA, CpLinDMA, DMOBA, DOcarbDAP, DLinDAP, DLincarbDAP, DLinCDAP, KLin-K-DMA, DLin-K-XTC2-DMA, HGT4003 y sus combinaciones, opcionalmente en donde el lípido catiónico comprende cKK-E12:

y/o

(ii) el lípido no catiónico se selecciona de DSPC (1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina), DPPC (1,2-dipalmitoil-snglicero-3-fosfocolina), DOPE (1,2-dioleil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DOPC (1,2-dioleil-sn-glicero-3-fosfotidilcolina) DPPE (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DMPE (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DOPG (,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol)); y/o

(iii) el lípido basado en colesterol es colesterol y/o colesterol PEGilado; y/o

(iv) el lípido modificado con PEG comprende una cadena de poli(etilen)glicol de hasta 5 kDa de longitud unido de forma covalente a un lípido con cadena(s) de alquilo de C⁶-C²⁰de longitud.

3. La composición para el uso según la reivindicación 2, en donde la relación molar de lípido catiónico:lípido no catiónico:colesterol:lípido PEGilado es aproximadamente (i) 40:30:20:10, (ii) 40:30:25:5 o (iii) 40:32:25:3.

4. La composición para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3, en donde el liposoma comprende una combinación seleccionada de:

cKK-E12, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K;

C12-200, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K;

HGT4003, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K; o

ICE, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K.

5. La composición para el uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el ARNm se administra a la dosis eficaz que oscila de 0,005 mg/kg de peso corporal-10 mg/kg de peso corporal, p. ej. que oscila de aproximadamente 0,1-5,0 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,1-3,0 mg/kg de peso corporal o de aproximadamente 0,1-1,0 mg/kg de peso corporal.

6. La composición para el uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la composición se administra de forma intravenosa, y/o se administra una vez a la semana, dos veces a la semana, dos veces al mes, una vez al mes o una vez cada 14 días.

7. La composición para el uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la proteína ASS1 se expresa en el hígado, y/o en donde la administración de la composición da por resultado:

(i) nivel aumentado de proteína ASS1 en suero; y/o

(ii) nivel reducido de citrulina en el sujeto en comparación con el nivel de citrulina de base antes del tratamiento; y/o (iii) reducción de los niveles de amoniaco a aproximadamente 50 pmoles/L o menos, aproximadamente 300 pmoles/L o menos o aproximadamente 1500 pmoles/L o menos, en el plasma.

8. La composición para el uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el contenido de G/C del ARNm se optimiza para conseguir el mayor contenido posible de G/C.

9. La composición para el uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde:

(i) el ARNm con codones optimizados comprende SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14 o SEQ ID NO:15, opcionalmente en donde el ARNm comprende además (a) la secuencia 5' UTR de SEQ ID NO:4 o (b) la secuencia 3' UTR de SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:6; y/o

(ii) el ARNm comprende la SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:8; y/o

(iii) el ARNm comprende uno o más nucleótidos modificados, opcionalmente en donde el uno o más nucleótidos modificados comprenden pseudouridina, N-1-metil-pseudouridina, 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolopirimidina, 3-metiladenosina, 5-metilcitidina, C-5 propinil-citidina, C-5 propinil-uridina, 2-aminoadenosina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-yodouridina, C5-propinil-uridina, C5-propinil-citidina, C5-metilcitidina, 2-aminoadenosina, 7-desazaadenosina, 7-desazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, O(6)-metilguanina, y/o 2-tiocitidina.