ES2949172T3

ES2949172T3 - Método de encapsulamiento de un ácido nucleico en un hospedante de nanopartículas lipídicas

Info

Publication number: ES2949172T3
Application number: ES15747627T
Authority: ES
Inventors: Keith Bowman; Noah Gardner; Travis Jeannotte; Chandra Vargeese
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2014-07-16
Filing date: 2015-07-10
Publication date: 2023-09-26
Anticipated expiration: 2035-07-10
Also published as: EP4223285A3; EP3169309B1; JP2020183411A; US10342761B2; JP6778175B2; CN106794141B; CN106794141A; EP4223285A2; JP2017523965A; US20190321295A1; EP3169309A1; JP7091393B2; WO2016010840A1; US20170196809A1

Abstract

Las nanopartículas de ácido nucleico encapsuladas de tamaño de partícula uniformemente pequeño se producen intersectando una o más corrientes de ácido nucleico con una o más corrientes de lípidos. Las nanopartículas de ácido nucleico encapsuladas incluyen un ácido nucleico encapsulado dentro de un huésped de nanopartículas lipídicas. Se obtienen tamaños de partículas uniformemente pequeños intersectando una corriente de ácido nucleico acuoso y una corriente de lípidos en un disolvente orgánico a altas velocidades lineales y con concentraciones totales de disolvente orgánico inferiores al 33%. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método de encapsulamiento de un ácido nucleico en un hospedante de nanopartículas lipídicas

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere generalmente a composiciones de nanopartículas de ácido nucleico encapsuladas, y a procedimientos y sistemas para producir nanopartículas de ácido nucleico encapsuladas de tamaño de partícula uniformemente pequeño.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El suministro de agentes biológicamente activos (incluyendo compuestos terapéuticamente relevantes) a sujetos a menudo se ve obstaculizado por dificultades para que los compuestos alcance la célula o el tejido diana. En particular, el tráfico de muchos agentes biológicamente activos en células vivas está muy restringido por los sistemas complejos de membrana de las células. Estas restricciones pueden dar lugar a la necesidad de usar concentraciones mucho mayores de agentes biológicamente activos de lo que es deseable para lograr un resultado, lo que aumenta el riesgo de efectos tóxicos y efectos secundarios. Una solución a este problema es utilizar moléculas transportadoras específicas y composiciones transportadoras a las que se permita la entrada selectiva en la célula. Se pueden usar vehículos lipídicos, polímeros biodegradables y diversos sistemas conjugados para mejorar el suministro de agentes biológicamente activos a las células.

Una clase de agentes biológicamente activos que es particularmente difícil de suministrar a las células es una sustancia bioterapéutica (que incluye nucleósidos, nucleótidos, polinucleótidos, ácidos nucleicos y derivados, tales como agentes de ARNm y ARNi). En general, los ácidos nucleicos son estables solo durante un tiempo limitado en células o plasma. El desarrollo de la interferencia de ARN, la terapia de iARN, la terapia de ARNm, los fármacos de ARN, la terapia antisentido y la terapia génica, entre otros, ha aumentado la necesidad de un medio eficaz para introducir agentes de ácido nucleico activo en las células. Por estos motivos, las composiciones que pueden estabilizar y suministrar agentes a base de ácido nucleico en células son de interés particular.

Los enfoques mejor estudiados para mejorar el transporte de ácidos nucleicos extraños a células implican el uso de vectores víricos o formulaciones con lípidos catiónicos. Pueden usarse vectores víricos para transferir genes eficientemente a algunos tipos celulares, pero en general no pueden usarse para introducir moléculas sintetizadas químicamente en células.

Un enfoque alternativo es usar composiciones de suministro que incorporan lípidos catiónicos que, por una parte, interactúan con un agente biológicamente activo, y por otra parte, interactúan con un sistema de membrana. Se informa que dichas composiciones proporcionan liposomas, micelas, lipoplejos, o nanopartículas lipídicas, según la composición y el método de preparación (para revisiones, véanse Felgner, 1990, Advanced Drug Delivery Reviews, 5, 162-187; Felgner, 1993, J. Liposome Res., 3, 3-16; Gallas, 2013, Chem. Soc. Rev., 42, 7983-7997; Falsini, 2013, J. Med. Chem. dx.doi.org/10.1021/jm400791q; y referencias allí).

Desde la primera descripción de los liposomas en 1965 por Bangham (J. Mol. Biol. 13, 238-252), ha habido un interés sostenido y un esfuerzo en desarrollar sistemas de transporte basados en lípidos para el suministro de agentes biológicamente activos (Allen, 2013, Advanced Drug Delivery Reviews, 65, 36-48). El proceso de introducir ácidos nucleicos funcionales en células cultivadas usando liposomas con carga positiva se describió por primera vez en Philip Felgner et al. Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU., 84, 7413-7417 (1987). El procedimiento se demostró posteriormente in vivo por K. L. Brigham y col., Am. J.Med. Sci., 298, 278-281 (1989). Más recientemente, se han desarrollado formulaciones de nanopartículas lipídicas con eficacia demostrada in vitro e in vivo. (Falsini, 2013, J. Med. Chem. dx.doi.org/10.1021/jm400791q; Morrissey, 2005, Nat. Biotech., 23, 1002-1007; Zimmerman, 2006, Nature, 441, 111-114.; Jayaraman, 2012, Angew. Chem. Int, Ed., 51, 8529-8533.)

Las formulaciones lipídicas son vehículos atractivos ya que pueden proteger a las moléculas biológicas de la degradación mejorando al mismo tiempo su captación celular. De las diversas clases de formulaciones lipídicas, se usan habitualmente formulaciones que contienen lípidos catiónicos para suministrar polianiones (p. ej., ácidos nucleicos). Dichas formulaciones pueden formarse usando lípidos catiónicos solo y que incluyen opcionalmente otros lípidos y anfífilos tales como fosfatidiletanolamina. Se conoce bien en la técnica que tanto la composición de la formulación lipídica así como su método de preparación afectan a la estructura y el tamaño del agregado resultante (Leung, 2012, J. Phys Chem. C, 116, 18440-18450).

Se han informado varias técnicas para encapsular un ácido nucleico en una nanopartícula lipídica, incluyendo la diálisis con detergente, la extrusión, el mezclamiento a alta velocidad, y la dilución por etapas. Belliveau et al., Molecular Therapy-Nucleic Acids (2012) 1:e37 describen la síntesis microfluídica de nanopartículas de ARNip encapsuladas (véase el resumen). Sin embargo, los enfoques existentes para el encapsulamiento de ácidos nucleicos tienen bajas tasas de encapsulamiento o falta de escalabilidad, producen nanopartículas que carecen de un alto grado de uniformidad, y/o no logran tamaños de partícula promedio menores que 80 nm. Por lo tanto, existe la necesidad de nuevos métodos para encapsular ácidos nucleicos en una nanopartícula lipídica que produzcan un alto grado de encapsulamiento, sea escalable, y produzcan nanopartículas de tamaño uniforme con un diámetro de partícula promedio menor que 80 nm.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se describe en las reivindicaciones adjuntas. La presente invención se refiere a un método mejorado para encapsular un ácido nucleico en un hospedante de nanopartículas lipídicas. El método es escalable, y proporciona la formación de nanopartículas de ácido nucleico encapsuladas que tienen tamaños de partícula promedio pequeños (por ejemplo, < 80 nm), uniformidad mejorada del tamaño de partícula, y un alto grado de encapsulamiento del ácido nucleico (por ejemplo, >90%). Las nanopartículas producidas por los procedimientos de la invención poseen estabilidad a largo plazo.

Un primer aspecto de la invención proporciona un método para encapsular un ácido nucleico en un hospedante de nanopartículas lipídicas para proporcionar una nanopartícula de ácido nucleico encapsulada según la reivindicación 1. Este método implica mezclar una corriente de lípido con dos corrientes de ácido nucleico en un punto de intersección configurado como un conector en cruz, en el que las dos corrientes de ácido nucleico entran en el conector en cruz desde direcciones opuestas a 180° entre sí, y una corriente de lípido entra en el conector en cruz a 90° con respecto a las dos corrientes de ácido nucleico; hacer fluir las corrientes mixtas en una primera dirección fuera del conector en cruz sustancialmente en la misma dirección que la corriente de un lípido y 90° con respecto a los dos ácidos nucleicos; y mezclar los componentes de la primera corriente mixta para proporcionar una primera disolución de salida de nanopartículas de ácido nucleico encapsuladas. La corriente de lípido comprende una mezcla de uno o más lípidos en un disolvente orgánico (por ejemplo, etanol). Cada corriente de ácido nucleico comprende una mezcla de uno o más ácidos nucleicos en una disolución acuosa. En el punto de intersección de las corrientes de lípido y ácido nucleico, cada corriente se caracteriza por una velocidad lineal. La una o más corrientes de nanopartículas lipídicas tienen una velocidad lineal combinada mayor o igual a 1,5 metros/segundo. Igualmente, las dos corrientes de ácido nucleico tienen una velocidad lineal combinada mayor o igual a 1,5 metros/segundo. La disolución acuosa y el disolvente orgánico son miscibles, y una de la disolución acuosa o la disolución orgánica contiene un amortiguador. La concentración final de disolvente orgánico tras mezclar las corrientes de lípido y de ácido nucleico está en una cantidad que minimiza la agregación (menos del 33%).

En ciertas realizaciones, la concentración final de disolvente orgánico en la primera disolución de salida es 20% a 25%. En ciertas realizaciones según el primer aspecto, las corrientes mixtas de lípido y ácido nucleico se diluyen con un disolvente de dilución para proporcionar la primera disolución de salida. En otras realizaciones según el primer aspecto, la velocidad lineal combinada de la o las corrientes de ácido nucleico combinadas es 3 a 14 metros/segundo, y la velocidad lineal combinada de la o las corrientes de lípido es 1,5 a 7 metros/segundo.

En algunas realizaciones, la primera disolución de salida se procesa adicionalmente mediante dilución, incubación, concentración, y diálisis. En ciertas realizaciones según el segundo aspecto, la disolución dializada también puede filtrarse de forma estéril. Las nanopartículas de ácido nucleico encapsuladas producidas por los procedimientos del segundo aspecto tienen estabilidad a largo plazo.

En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas encapsuladas producidas por los procedimientos de la invención tienen un diámetro promedio menor que 80 nm. En ciertas realizaciones, las nanopartículas tienen un diámetro promedio de 30 a 80 nM. En realizaciones preferidas, las nanopartículas tienen un diámetro promedio de menos de 70 nm (por ejemplo, 40-70 nm).

Un segundo aspecto de la invención proporciona una composición de nanopartículas de ácido nucleico encapsuladas según la reivindicación 23. Esta composición comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una nanopartícula de ácido nucleico encapsulada, comprendiendo la nanopartícula de ácido nucleico encapsulada un hospedante de nanopartícula lipídica y un ácido nucleico, encapsulándose el ácido nucleico en el hospedante de nanopartícula lipídica, en la que la nanopartícula de ácido nucleico encapsulada tiene un diámetro promedio de 40 nm a 70 nm y un índice de polidispersión de menos de 0,1 según lo determinado por dispersión de luz dinámica, y en la que la relación de hospedante de nanopartícula lipídica a ácido nucleico es 18,5:1.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La FIG. 1 ilustra un diagrama de flujo de un procedimiento ejemplar para preparar y procesar nanopartículas de ácido nucleico encapsuladas.

La FIG. 2 ilustra un sistema representativo para producir nanopartículas de ácido nucleico encapsuladas.

La FIG. 2a ilustra una realización alternativa de una cámara de dilución para uso en el sistema de la FIG. 2

Las FIGS. 3a, 3b y 3c ilustran cámaras de mezclamiento alternativas descritas aquí para uso en el sistema de la FIG. 2.

La FIG. 4a es una imagen obtenida mediante microscopía crioelectrónica que ilustra la uniformidad de partículas para nanopartículas lipídicas encapsuladas con ARNip producidas usando una cámara de mezclamiento en forma de cruz y el procedimiento y los materiales descritos en el Ejemplo 2 de Procedimiento.

La FIG. 4b es una imagen obtenida por microscopía crioelectrónica que ilustra la uniformidad de las partículas para las nanopartículas lipídicas encapsuladas con ARNip producidas usando una cámara de mezclamiento en forma de T descrita aquí, y el procedimiento y los materiales descritos en el Ejemplo 2 de Procedimiento.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

1.0 General

La presente invención proporciona procedimientos para producir nanopartículas de ácido nucleico encapsuladas con tamaños de partículas uniformemente pequeños. Mostrado en la FIG. 1 es un diagrama de flujo representativo que describe en general las etapas de una realización de la invención. En la etapa 100, una corriente de lípido se mezcla en un primer punto de intersección con dos corrientes de ácido nucleico para proporcionar una primera corriente mixta. A continuación, la primera corriente mixta se hace fluir (etapa 110) para permitir la asociación de las corrientes individuales de la corriente mixta, después de lo cual tiene lugar el procedimiento de ensamblaje de nanopartículas lipídicas y el encapsulamiento del ácido nucleico. Dependiendo de los parámetros particulares escogidos para las corrientes iniciales de ácido nucleico, la corriente mixta puede diluirse opcionalmente además con medios acuosos (etapa 120) para obtener la primera disolución de salida (etapa 130). Alternativamente, la etapa de dilución opcional 120 se puede omitir, y la primera corriente de salida se puede obtener directamente de la corriente mixta circulante mediante el uso de una o unas corrientes de ácido nucleico apropiadamente diluidas en la etapa 100. La primera disolución de salida obtenida en la etapa 130 contiene nanopartículas de ácido nucleico encapsuladas.

Se puede realizar un procesamiento adicional de la primera disolución de salida para eliminar el disolvente orgánico, y así proporcionar las nanopartículas de ácido nucleico encapsuladas como una formulación que tiene estabilidad a largo plazo. Inicialmente, la primera disolución de salida se incuba (etapa 140) durante un período de tiempo (por ejemplo, 60 minutos) a temperatura ambiente, seguido de dilución con medios acuosos (por ejemplo, agua, amortiguador de citrato) (etapa 150), concentración y diálisis (etapa 160), y finalmente filtración estéril (etapa 170). La etapa de dilución 150 puede diluir la concentración de disolvente orgánico al doble. La concentración puede ser por filtración de flujo tangencial.

Sorprendentemente, se ha descubierto que se obtienen partículas pequeñas y uniformes mezclando/intersecando una o más corrientes de lípido con una o más corrientes de ácido nucleico, en el que las corrientes de lípido combinadas y las corrientes de ácido nucleico combinadas, cada una, mantienen una velocidad lineal mayor que 1,5 metros/segundo, y la concentración final de disolvente orgánico al mezclar las corrientes es menor que 33% en volumen. Mantener el disolvente orgánico por debajo del 33% inhibe la agregación de las nanopartículas, mientras que los elevados caudales de la invención mantienen el tamaño de las partículas pequeño y uniforme. Los procedimientos proporcionan un encapsulamiento eficiente de ácidos nucleicos.

En algunas realizaciones, la velocidad lineal combinada de las dos corrientes de ácido nucleico es 1,5 a 14 metros/segundo, y la velocidad lineal de la corriente de lípido es 1,5 a 7 metros/segundo. En otras realizaciones, la velocidad lineal combinada de las dos corrientes de ácido nucleico es 3 a 14 metros/segundo, y la velocidad lineal de la corriente de lípido es 1,5 a 4,5 metros/segundo. En otras realizaciones, la velocidad lineal combinada de las dos corrientes de ácido nucleico es 8 a 14 metros/segundo, y la velocidad lineal de la corriente de lípido es 1,5 a 4,5 metros/segundo. En otras realizaciones, la velocidad lineal combinada de las dos corrientes de ácido nucleico es 3 a 8 metros/segundo, y la velocidad lineal de la corriente de lípido es 1,5 a 4,5 metros/segundo. En otras realizaciones, la velocidad lineal combinada de las dos corrientes de ácido nucleico es 9 a 14 metros/segundo, y la velocidad lineal de la corriente de lípido es 3 a 4 metros/segundo. En otras realizaciones, la velocidad lineal combinada de las dos corrientes de ácido nucleico es 11 a 14 metros/segundo, y la velocidad lineal de la corriente de lípido es 3 a 4 metros/segundo. En otras realizaciones, la velocidad lineal combinada de las dos corrientes de ácido nucleico es 9 a 11 metros/segundo, y la velocidad lineal de la corriente de lípido es 3 a 4 metros/segundo. En otras realizaciones, la velocidad lineal combinada de las dos corrientes de ácido nucleico es 6 a 8 metros/segundo, y la velocidad lineal de la corriente de lípido es 3 a 4 metros/segundo. En aún otras realizaciones, la velocidad lineal combinada de las dos corrientes de ácido nucleico es 10,2 metros/segundo, y la velocidad lineal de la corriente de lípido es 3,4 metros/segundo. En otras realizaciones, la velocidad lineal combinada de las dos corrientes de ácido nucleico es 6,8 metros/segundo, y la velocidad lineal de la corriente de lípido es 3,4 metros/segundo. En aún otras realizaciones, la velocidad lineal combinada de las dos corrientes de ácido nucleico es 13,6 metros/segundo, y la velocidad lineal de la corriente de lípido es 3,4 metros/segundo. En aún otras realizaciones, la velocidad lineal combinada de las dos corrientes de ácido nucleico es 3,4 metros/segundo, y la velocidad lineal de la corriente de lípido es 1,7 metros/segundo. En otras realizaciones, la velocidad lineal combinada de las dos corrientes de ácido nucleico es 3 metros/segundo, y la velocidad lineal de la corriente de lípido es 1,5 metros/segundo. En otras realizaciones, la velocidad lineal combinada de las dos corrientes de ácido nucleico es 14 metros/segundo, y la velocidad lineal de la corriente de lípido es 7 metros/segundo.

2.0 Ácidos nucleicos

Los ácidos nucleicos adecuados para uso con la invención incluyen: composiciones de ADN o ARN antisentido, composiciones quiméricas de ADN:ARN, alozimas, aptámeros, ribozima, señuelos y análogos de los mismos, plásmidos y otros tipos de vectores de expresión, y moléculas pequeñas de ácido nucleico, agentes de iARN, ácido nucleico de interferencia corto (ARNip), ácido ribonucleico mensajero" (ARN mensajero, ARNm), ARN bicatenario (ARNbc), micro-ARN (miARN), y moléculas de ARN de horquilla corto (ARNhc), ácido nucleico peptídico (PNA), un ribonucleótido de ácido nucleico bloqueado (LNA), morfolinonucleótido, ácido nucleico de treosa (TNA), ácido nucleico de glicol (GNA), ARNisip (ARN de interferencia segmentado internamente pequeño), ARNia (ARN de interferencia asimétrico) y ARNip con 1, 2 o más pérdidas de emparejamiento entre la cadena sentido y antisentido para células y/o tejidos relevantes, tal como en un cultivo celular, sujeto u organismo. Dichos compuestos pueden estar purificados o parcialmente purificados, pueden aparecer de forma natural o sintética y pueden estar químicamente modificados. En una realización, el agente biológicamente activo es un agente de iARN, ácido nucleico interferente pequeño (ANip), ARN interferente pequeño (ARNip), ARN bicatenario (ARNbc), micro-ARN (miARN) o una molécula a Rn en horquilla corta (ARNhc). En una realización, el agente biológicamente activo es un agente de iARN útil para mediar la interferencia de ARN (iARN).

Un "ácido ribonucleico" (ARN) es un polímero de nucleótidos ligados por un enlace fosfodiéster, donde cada nucleótido contiene ribosa o una modificación de la misma como el componente de azúcar. Cada nucleótido contiene una adenina (A), una guanina (G), una citosina (C), un uracilo (U) o una modificación de los mismos como base. La información genética en una molécula de ARNm está codificada en la secuencia de las bases nucleotídicas de la molécula ARNm, que están dispuestas en codones que consisten en tres bases nucleotídicas cada uno. Cada codón codifica un aminoácido específico del polipéptido, excepto para los codones de parada, que terminan la traducción (síntesis de proteínas). En una célula viva, el ARNm se transporta a un ribosoma, el sitio de síntesis de proteínas, donde proporciona la información genética para la síntesis de proteínas (traducción). Para una descripción más completa, véase, Alberts B et al. (2007) Molecular Biology of the Cell, quinta edición, Garly Science.

En eucariotas, el ARNm se transcribe in vivo en los cromosomas mediante la enzima celular ARN polimerasa. Durante o después de la transcripción in vivo, se añade una caperuza 5' (también denominada caperuza de ARN, caperuza de 7-metilguanosina de ARN o caperuza de m7G de ARN) in vivo al extremo 5' del ARNm. La caperuza 5' es el resto de 7-metilguanosina terminal que está ligado a través de un enlace 5'-5'-trifosfato al primer nucleótido transcrito. Además, la mayoría de moléculas de ARNm eucariotas tienen un resto de poliadenililo ("cola de poli(A)") en el extremo 3' de la molécula de ARNm. In vivo, la célula eucariota añade la cola de poli(A) después de la transcripción, con frecuencia a una longitud de aproximadamente 250 restos de adenosina. Por tanto, un ARNm eucariota maduro habitual tiene una estructura que comienza en el extremo 5' con un nucleótido de caperuza de ARNm seguido de una región 5' no traducida (5'UTR) de nucleótidos, después una fase abierta de lectura que comienza con un codón de inicio que es un triplete AUG de bases nucleotídicas, que es la secuencia codificante de una proteína, y que termina con un codón de parada que puede ser un triplete UAA, UAG o UGA de bases nucleotídicas, después una región 3' no traducida (3'UTR) de nucleótidos y que termina con una cola de poliadenosina. Aunque los elementos del ARNm eucariota maduro habitual se producen de forma natural en una célula eucariota in vivo, los mismos elementos o elementos estructural y funcionalmente equivalentes pueden producirse in vitro usando los métodos de biología molecular. Por consiguiente, cualquier ARN que tenga la estructura similar a un ARNm eucariota maduro habitual puede actuar como ARNm y está dentro del alcance de la expresión "ácido ribonucleico mensajero".

La molécula de ARNm tiene en general un tamaño que puede encapsularse en una nanopartícula lipídica de la invención. Aunque el tamaño de una molécula de ARNm varía en la naturaleza dependiendo de la identidad de la especie de ARNm que codifica una proteína en particular, un tamaño promedio para una molécula de ARNm es el tamaño promedio del ARNm de 500-10.000 bases.

La expresión "ácido desoxirribonucleico" (ADN), como se usa aquí, se refiere a un ácido nucleico polimérico que transporta la información genética en las células de organismos vivos y muchos virus. In vivo, el ADN es capaz de autorreplicarse y de sintetizar ARN. El ADN consiste en dos largas cadenas de nucleótidos retorcidas en una doble hélice y unidas por enlaces de hidrógeno entre las bases complementarias adenina (A) y timina (T) o citosina (C) y guanina (G). La secuencia de los nucleótidos determina las características hereditarias individuales. Véase The American Heritage® Dictionary of the English Language, cuarta edición (actualizado en 2009). Houghton Mifflin Company.

Cada uno de los nucleótidos de un polímero de ADN está unido por un enlace de fosfodiéster en dirección 5' a 3'. Cada nucleótido contiene desoxirribosa o una modificación de la misma como componente de azúcar. Cada nucleótido contiene una adenina (A), una guanina (G), una citosina (C), una timina (T) o una modificación de las mismas como base.

La mayoría de las moléculas de ADN existentes in vivo son hélices bicatenarias, que consisten en dos polímeros largos en formación antiparalela, siendo una cadena 3' (tres prima) y la otra 5' (cinco prima). En esta formación de doble cadena, las bases se emparejan mediante enlaces de hidrógeno, con la adenina uniéndose a la timina y la guanina uniéndose a la citosina, lo que da como resultado una estructura de doble hélice. Otras moléculas de ADN son monocatenarias, aunque las moléculas de ADN monocatenario tienen el potencial de convertirse en bicatenarias si coinciden con otra molécula de ADN o ARN monocatenario con una secuencia nucleotídica complementaria. Para una descripción más completa, véase, Alberts B et al. (2007) Molecular Biology of the Cell, quinta edición, Garly Science.

La secuencia de las bases nucleotídicas a lo largo de la cadena de desoxirribosa que codifica la información genética. Para la síntesis de proteínas, la información genética se copia en la secuencia nucleotídica de una molécula de ARNm en un procedimiento denominado transcripción, cuando se crea la molécula de ARNm.

El ADN puede existir en al menos dos formas, que tienen diferentes tamaños. La primera forma de ADN es un polímero de gran tamaño llamado cromosoma. Un cromosoma contiene la información genética de muchas o la mayoría de las proteínas de una célula y también contiene información por la que la célula puede controlar la replicación de la molécula de ADN. Una célula bacteriana puede contener uno o más cromosomas. Una célula eucariota contiene normalmente más de un cromosoma celular, cada cromosoma.

La segunda forma de ADN es de menor tamaño. Muchas moléculas de ADN de la segunda forma tienen un tamaño tal que pueden encapsularse en una nanopartícula lipídica de la invención. Algunas de estas formas más cortas de ADN pueden tener un tamaño que permita codificar útilmente las proteínas. Algunos ejemplos de estas segundas formas de ADN, más cortas y útiles, incluyen plásmidos y otros vectores. Para una descripción más completa, véase, Alberts B et al. (2007) Molecular Biology of the Cell, quinta edición, Garly Science.

Un plásmido es una pequeña molécula de ADN que está físicamente separada del ADN cromosómico y puede replicarse independientemente del ADN cromosómico dentro de una célula. Los plásmidos comúnmente existen in vivo como moléculas de ADN bicatenarias circulares pequeñas. En la naturaleza, los plásmidos portan genes que se pueden transcribir y traducir a proteínas que pueden beneficiar la supervivencia de un organismo (por ejemplo resistencia a antibióticos). En la naturaleza, los plásmidos pueden transmitirse con frecuencia de un organismo a otro por transferencia horizontal de genes. Los plásmidos artificiales o recombinantes se utilizan ampliamente en biología molecular, ya que sirven para permitir la replicación de secuencias de ADN recombinantes y la expresión de proteínas útiles dentro de los organismos hospedadores. Los tamaños de plásmidos pueden variar de 1 a alrededor de 25 kilopares de bases. Un plásmido recombinante puede hacerse de manera recombinante para que tenga un tamaño tal que pueda encapsularse en una nanopartícula lipídica de la invención.

En biología molecular, un vector es una molécula de ADN utilizada como vehículo para portar de manera artificial material genético de una célula o de una reacción bioquímica in vitro a otra célula, donde el ADN puede replicarse y/o expresarse. Un vector que contiene ADN extraño se denomina recombinante. Entre los tipos de vectores útiles están los plásmidos y los vectores víricos. La inserción de un vector en la célula diana suele denominarse transformación en el caso de las células bacterianas, transfección en el caso de las células eucariotas, aunque la inserción de un vector vírico suele denominarse transducción.

Los vectores víricos son generalmente virus recombinantes que portan ADN o ARN vírico modificado que se ha convertido en no infeccioso, pero que todavía contiene promotores víricos y también el transgén, permitiendo así la traducción del transgén a través de un promotor vírico. Los vectores virales a menudo se diseñan para la incorporación permanente del inserto en el genoma del hospedante, y por lo tanto dejan marcadores genéticos distintos en el genoma del hospedante después de incorporar el transgén. Un vector vírico puede recombinarse para que tenga un tamaño tal que pueda encapsularse en una nanopartícula lipídica de la invención.

Un "agente de iARN" es una composición o compuesto capaz de mediar en la interferencia de ARN. La expresión "interferencia de ARN" (iARN) es una técnica de silenciamiento génico dirigida, postranscripcional, que usa un agente de iARN para degradar el ARN mensajero (ARNm) que contiene una secuencia que es igual o muy similar al agente de iARN. Véase: Zamore y Haley 2005 Science 309: 1519-1524; Zamore et al. 2000 Cell 101: 25-33; Elbashir et al. 2001 Nature 411: 494-498; y Kreutzer et al., Publicación PCT WO 00/44895; Fire, Publicación PCT WO 99/32619; Mello y Fire, Publicación Pc T WO 01/29058; y similares.

Como se usa en el presente documento, iARN es equivalente a otros términos usados para describir la interferencia de ARN específica de secuencia, tal como el silenciamiento génico postranscripción, la inhibición de la traducción, la inhibición de la transcripción o la epigenética. Por ejemplo, las formulaciones que contienen lípidos de la invención pueden usarse junto con moléculas de ANip para silenciar epigenéticamente genes en el nivel postranscripcional y/o en el nivel pretranscripcional. En un ejemplo no limitante, la modulación de la expresión génica por moléculas de ANip puede resultar de la escisión mediada por Anip del ARN (ya sea ARN codificante o no codificante) mediante RISC o, como alternativa, inhibición de la traducción como se conoce en la técnica. En otra realización, la modulación de la expresión génica por ANip puede resultar de la inhibición transcripcional, tal como se informa, por ejemplo, en Janowski et al. 2005 Nature Chemical Biology 1: 216-222.

Los agentes de iARN incluyen, entre otros, ARNip o ANip, microARN (miARN), ARNhc, oligonucleótidos de interferencia cortos, y moléculas de ácido nucleico de interferencia cortas modificadas químicamente. Las expresiones "ARN de interferencia corto" (ARNip) o "ácido nucleico de interferencia corto" (ANip), o similares, como se usan aquí, se refieren a cualquier molécula capaz de inhibir o reducir la expresión génica o la replicación viral mediando la interferencia de ARN (iRNA) o el silenciamiento génico de una manera específica de secuencia. Los ARNip pueden generarse mediante escisión con ribonucleasa III a partir de un ARN bicatenario más largo (ARNbc) que es homólogo o específico de la diana génica silenciada. También pueden obtenerse artificialmente mediante diversos métodos conocidos en la técnica.

Los agentes de iARN de la presente descripción pueden dirigirse contra cualquier gen diana y comprender cualquier secuencia, y pueden tener varios formatos, componentes, sustituciones y/o modificaciones.

El agente de iARN generalmente comprende dos cadenas, una cadena antisentido (o guía) y una cadena codificante (o pasajero); la cadena antisentido se incorpora al RISC (complejo de silenciamiento de interferencia de ARN) y se dirige contra la secuencia correspondiente de un ARNm diana. La secuencia (o una parte de la misma) de la cadena antisentido coincide con la del ARNm diana. Pueden estar presentes algunos desajustes (generalmente no más de 1-3 por secuencia de 15 nt) sin que impidan la actividad de iARN específico de la diana. La cadena codificante y la antisentido pueden ser moléculas separadas, o pueden estar conectadas por un enlazador o bucle (para formar, por ejemplo, un ARNhc). La cadena antisentido es generalmente un 49-mero o es más corta, a menudo un 19-mero a 25-mero. La cadena codificante puede tener la misma longitud que la cadena antisentido, o más corta o más larga. Como se muestra aquí, la cadena antisentido puede ser tan corta como 18-mero, y la cadena codificante puede ser tan corta como 14-mero.

El ARNip canónico tiene dos cadenas de ARN, cada una de 21 unidades, con una región bicatenaria de 19 pb (par de bases) y dos salientes de 2 nt (nucleótidos). Elbashir et al. 2001 Nature 411: 494-498; Elbashir et al. 2001 EMBO J. 20: 6877-6888. Los salientes se pueden reemplazar por un dinucleótido tal como dTdT, TT, UU, U (2'-OMe) dT, U (2'-OMe) U (2'-OMe), T(2'-OMe) T (2 '-OMe), T(2'-OMe) dT, o similares. El saliente actúa para proteger al agente de iARN de la escisión por nucleasas, mientras que no interfiere con la actividad de iARN ni contribuye al reconocimiento de la diana. Elbashir et al. 2001 Nature 411: 494-498; Elbashir et al.2001 EMBO J.20: 6877-6888; y Kraynack et al. 2006 RNA 12:163-176. Los salientes nucleotídicos 3'-terminales adicionales incluyen dT (desoxitimidina), 2'-O,4'-C-etilen timidina (eT), y fosfato de 2-hidroxietilo (hp). También se pueden realizar sustituciones con 4-tiouracilo y 5-bromouracilo. Parrish et al.

2000 Molecular Cell 6: 1077-1087. Los salientes nucleotídicos se pueden reemplazar por caperuzas de extremo 3' no nucleotídicas, siempre que dichas caperuzas sean capaces de proteger los extremos de la escisión y permitir la actividad de iARN de la molécula. Véase, por ejemplo, las Patentes U.S. Núms. 8.097.716; 8.084.600; 8.404.831; 8.404.832; y 8.344.128; y la solicitud de Patente U.S. Num. 61/886.739.

En cualquiera de las cadenas, una o más posiciones pueden ser reemplazadas por un espaciador. Estos incluyen, sin limitación, un azúcar, alquilo, cicloalquilo, ribitol u otro tipo de nucleótido abásico, 2'-desoxi-ribitol, diribitol, 2'-metoxietoxiribitol (ribitol con 2'-MOE), alquilo de C^3-6, o 4-metoxibutano-1,3-diol (5300). En algunas moléculas, se puede introducir un espacio en la cadena codificante, produciendo dos cadenas codificantes más cortas; esto se denomina ARNisip. Documento WO 2007/107162 de Wengels y Kjems. También se pueden introducir uno o más desajustes y protuberancias entre la cadena codificante y la antisentido. Solicitud de Patente U.S. Núm. 2009/0209626 de Khvorova.

Los agentes de iRNA se pueden construir a partir de RNA, como en el ARNip canónico. Sin embargo, los nucleótidos de ARN se pueden sustituir o modificar en diversos agentes de iARN. En una o más posiciones, un nucleótido de ARN puede reemplazarse por ADN, un ácido nucleico peptídico (PNA), un ácido nucleico bloqueado (LNA), un morfolino nucleótido, un ácido nucleico de treosa (TNA), un ácido nucleico de glicol (GNA), un ácido nucleico de arabinosa (ANA), ácido nucleico de 2'-fluoroarabinosa (FANA), ácido ciclohexeno nucleico (CeNA), ácido nucleico de anhidrohexitol (HNA), o ácido nucleico desbloqueado (UNA). Particularmente en la región semilla (aproximadamente las posiciones 2-7 de la cadena antisentido y las posiciones correspondientes de la cadena codificante), los nucleótidos en una o ambas cadenas se pueden reemplazar por ADN. Toda la región semilla se puede reemplazar por ADN, formando un híbrido ADN-ARN capaz de mediar en la interferencia del ARN. Yamato et al. 2011. Cancer Gene Ther. 18: 587-597.

Los nucleótidos de ARN pueden sustituirse con otros componentes (como se describe anteriormente) y/o modificarse. Se pueden realizar modificaciones y/o sustituciones en el azúcar, fosfato y/o base. En diversos aspectos, el agente de iARN comprende una modificación en 2' del azúcar, por ejemplo 2'-amino, 2'-C-alilo, 2'-desoxi, 2'-desoxi-2'-fluoro (2'-F), 2'-O-metilo (2'-OMe), 2'-O-metoxietilo (2'-O-MOE), 2'-O-aminopropilo (2'-O-AP), 2'-O-dimetilaminoetilo (2'-O-DMAOE), 2'-O-dimetilaminopropilo (2'-O-DMAP), 2'-O-dimetilaminoetiloxietilo (2'-O-DMAEOE), o 2'-O-N-metilacetamido (2'-O-NMA); en la técnica se conocen otras modificaciones de ARN. Véase, por ejemplo, Usman y Cedergren 1992 TIBS. 17: 34; Usman et al. 1994 Nucleic Acids Symp. Ser. 31: 163; Burgin et al. 1996 Biochemistry 35: 14090. En algunas realizaciones, los dos nucleótidos de ARN en el extremo 3' de una o ambas cadenas se modifican con un 2'-MOE, formando una pinza 2'-MOE. Patentes U.S. Núms. 8.097.716; y 8.084.600.

Uno o más fosfatos del esqueleto de azúcar-fosfato pueden reemplazarse, por ejemplo, por un enlazador internucleosídico modificado. Esto puede incluir, sin limitación, fosforotioato, fosforoditioato, fosforamidato, boranofosfonoato, un enlazador de amida, y un compuesto de fórmula (Ia):

en la que R³se selecciona de O-, S^-, NH², BH³, CH³, alquilo de C^1-6, arilo de C^6-10, alcoxi de C^1-6, y aril C^{6 - io}-oxi, en el que alquilo de C^1-6y arilo de C^6-10no están sustituidos o están opcionalmente sustituidos independientemente con 1 a 3 grupos seleccionados independientemente de halo, hidroxilo y NH²; y R⁴se selecciona de O, S, NH o CH².

La base también se puede modificar o sustituir, por ejemplo, con 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-iodoruracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroximetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wybutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo, (acp3)w, y 2,6-diaminopurina. En ciertos aspectos, el agente de iARN puede comprender una base nitrogenada no natural, en el que la base nitrogenada no natural es difluorotolilo, nitroindolilo, nitropirrolilo, o nitroimidazolilo. En la técnica se conocen muchas otras modificaciones. Véanse, por ejemplo, Usman et al. 1992 TIBS 17:34; Usman et al. 1994 Nucl. Acids Symp. Ser. 31: 163; Burgin et al. 1996 Biochem. 35: 14090.

Por ejemplo, una o más posiciones pueden estar representadas por 2'-O-metilcitidina-5'-fosfato, 2'-O-metiluridina-5'-fosfato. En resumen, una cualquiera o más posiciones pueden estar representadas por cualquier modificación o sustitución conocida en la técnica, incluyendo, sin limitación, nucleótidos modificados con 2'-O-metilo, un nucleósido que comprende un grupo fosforotioato en 5', un nucleósido terminal unido a un derivado de colesterilo o grupo bisdecilamida del ácido dodecanoico, un nucleósido bloqueado, un nucleósido abásico, un nucleósido modificado con 2'-desoxi-2'-fluoro, un nucleósido modificado con 2'-amino, un nucleósido modificado con 2'-alquilo, un morfolino nucleósido, un ribonucleótido desbloqueado (por ejemplo, un monómero de nucleótido acíclico, como se describe en el documento WO 2008/147824), un fosforamidato o una base no natural que comprende un nucleósido, o cualquier combinación de los mismos.

Cualquiera de estos diversos formatos, componentes, sustituciones y/o modificaciones se puede mezclar y emparejar o combinar de diferentes maneras para formar agentes de iARN para cualquier diana y que comprendan cualquier secuencia. Por ejemplo, la presente descripción se refiere a un agente de iARN que comprende dos cadenas, en el que una o ambas cadenas es un 18-mero que termina en el extremo 3' en un enlazador internucleosídico modificado o de fosfato, y además comprende, en orden 5' a 3', un espaciador, un segundo enlazador de internucleosídico modificado o de fosfato, y una caperuza de extremo 3'. En otra realización, la presente descripción se refiere a un agente de iARN que comprende una cadena codificante y una antisentido, en el que la cadena antisentido comprende, en orden 5 a 3, un 18-mero que termina en el extremo 3' en un enlazador internucleosídico modificado o de fosfato, y comprende además, en orden 5' a 3', un espaciador, un segundo enlazador internucleosídico modificado o de fosfato, y una caperuza de extremo 3'; y en el que la cadena codificante comprende, en orden 5' a 3', un 14-mero (o más largo) que termina en el extremo 3' en un enlazador internucleosídico modificado o de fosfato, y comprende además, en orden 5' a 3', un espaciador, un segundo enlazador internucleosídico modificado o de fosfato, y una caperuza de extremo 3'.

En diversas realizaciones de la presente descripción, el agente de iARN puede dirigirse contra cualquier gen diana y tener cualquier secuencia, y puede tener cualquier formato, componente, sustitución y/o modificación como se describe aquí o como se conoce en la técnica.

La expresión "inhibidor de iARN" es cualquier molécula que puede modular negativamente (p. ej., reducir o inhibir) la función o actividad de interferencia de ARN en una célula o paciente. Un inhibidor de iARN puede regular negativamente, reducir o inhibir iARN (p. ej., escisión mediada por iARN de un polinucleótido diana, inhibición de la traducción o silenciamiento de la transcripción) mediante interacción con o interferencia con la función de cualquier componente de la vía de iARN, incluyendo componentes proteicos tales como RISC o componentes de ácido nucleico tales como miARN o ARNip. Un inhibidor de iARN puede ser una molécula de ANip, una molécula antisentido, un aptámero o una molécula pequeña que interactúa con o interfiere con la función de RISC, un miARN o un ARNip o cualquier otro componente de la vía de iARN en una célula o paciente. Al inhibir la iARN (p. ej., escisión mediada por iARN de un polinucleótido diana, inhibición de la traducción o silenciamiento de la transcripción), se puede usar un inhibidor de iARN para modular (p. ej., regular positivamente o regular negativamente) la expresión de un gen diana. En una realización, se usa un inhibidor de ARN para regular positivamente la expresión génica al interferir con (p. ej., reducir o prevenir) la regulación negativa endógena o la inhibición de la expresión génica a través de inhibición de la traducción, silenciamiento de la transcripción o escisión mediada por RISC de un polinucleótido (p. ej., ARNm). Al interferir con mecanismos de represión, silenciamiento o inhibición endógenos de la expresión génica, los inhibidores de iARN de la invención pueden usarse, por lo tanto, para regular positivamente la expresión génica para el tratamiento de enfermedades o afecciones resultantes de una pérdida de función. La expresión "inhibidor de iARN" se usa indistintamente con el término "ANip" en diversas realizaciones del presente documento.

La expresión "ácido nucleico enzimático", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico que tiene complementariedad en una región de unión a sustrato para una diana génica específica y también tiene una actividad enzimática que actúa para escindir de forma específica un ARN diana, inactivando de este modo la molécula de ARN diana. Las regiones complementarias permiten suficiente hibridación de la molécula de ácido nucleico enzimático con el ARN diana y, de este modo, permiten la escisión. Se prefiere una complementariedad del 100 %, pero también puede ser útil una complementariedad tan baja como del 50-75 % en la presente invención (véase, por ejemplo, Werner y Uhlenbeck, 1995, Nucleic Acids Research, 23, 2092-2096; Hammann et al., 1999, Antisense and Nucleic Acid Drug Dev., 9, 25-31). Los ácidos nucleicos pueden modificarse en la base, el azúcar y/o los grupos fosfato. La expresión ácido nucleico enzimático se usa indistintamente con expresiones tales como ribozimas, ARN catalítico, ARN enzimático, ADN catalítico, aptazima o ribozima de unión a aptámero, ribozima regulable, oligonucleótidos catalíticos, nucleozima, ADNzima, enzima de ARN, endorribonucleasa, endonucleasa, minizima, enzima de plomo, oligozima o enzima de ADN. Toda esta terminología describe moléculas de ácido nucleico con actividad enzimática. Las características clave de una molécula de ácido nucleico enzimático son que tiene un sitio de unión a sustrato específico que es complementario de una o más de las regiones de ácido nucleico diana y que tiene secuencias de nucleótidos en o en torno al sitio de unión a sustrato que transmite una actividad de escisión y/o ligamiento de ácido nucleico a la molécula (véase, por ejemplo, Cech et al., patente de los Estados Unidos 4.987.071; Cech et al., 1988, 260 JAMA 3030). Las ribozimas y moléculas de ácido nucleico enzimático de la invención se pueden modificar químicamente, por ejemplo, como se describe en la técnica y en otra parte del presente documento.

La expresión "ácido nucleico antisentido", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico no enzimático que se une a ARN diana por medio de interacciones ARN-ARN o ARN-ADN o ARN-APN (ácido nucleico proteico; Egholm et al., 1993 Nature 365, 566) y altera la actividad del ARN diana (para una revisión, véase Stein y Cheng, 1993 Science 261, 1004 y Woolf et al., patente de EE.UU. 5,849,902). El ADN antisentido puede sintetizarse químicamente o expresarse mediante el uso de un vector de expresión de ADN monocatenario o equivalente del mismo. Las moléculas antisentido de la invención pueden modificarse químicamente, por ejemplo, como se describe en la técnica.

La expresión "región activadora de RNasa H", como se usa en el presente documento, se refiere a una región (generalmente mayor o igual a 4-25 nucleótidos de longitud, preferentemente de 5-11 nucleótidos de longitud) de una molécula de ácido nucleico capaz de unirse a un ARN diana para formar un complejo no covalente que es reconocido por la enzima RNasa H celular (véase, por ejemplo, Arrow et al., patente de los Estados Unidos 5.849.902; Arrow et al., patente de los Estados Unidos 5.989.912). La enzima RNasa H se une al complejo de molécula de ácido nucleico-ARN diana y escinde la secuencia de ARN diana.

La expresión "quimera antisentido 2-5A", como se usa en el presente documento, se refiere a un oligonucleótido antisentido que contiene un resto de adenilato ligado en 2'-5' fosforilado en 5'. Estas quimeras se unen a ARN diana de una manera específica de secuencia y activan una ribonucleasa dependiente de 2-5A que, a su vez, escinde el ARN diana (Torrence et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1300; Silverman et al., 2000, Methods Enzymol., 313, 522-533; Player y Torrence, 1998, Pharmacol. Ther., 78, 55-113). Las moléculas quiméricas antisentido 2-5A pueden modificarse químicamente, por ejemplo, como se describe en la técnica.

La expresión "oligonucleótidos formadores de triples cadenas", como se usa en el presente documento, se refiere a un oligonucleótido que puede unirse a un ADN bicatenario de una manera específica de secuencia para formar una hélice tricatenaria. Se ha mostrado que la formación de dicha estructura de hélice triple inhibe la transcripción del gen diana (Duval-Valentin et al., 1992 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 504; Fox, 2000, Curr. Med. Chem., 7, 17-37; Praseuth et. al., 2000, Biochim. Biophys. Acta, 1489, 181-206). Las moléculas oligonucleotídicas formadoras de triples cadenas de la invención pueden modificarse químicamente, por ejemplo, como se describe en la técnica.

La expresión "ARN señuelo", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ARN o aptámero que está diseñado para unirse preferentemente a un ligando predeterminado. Dicha unión puede dar lugar a la inhibición o activación de una molécula diana. El ARN señuelo o aptámero puede competir con una diana de unión de origen natural para la unión de un ligando específico. De forma análoga, a ARN señuelo puede estar diseñado para unirse a un receptor y bloquear la unión de una molécula efectora, o puede estar diseñado para unirse a un receptor de interés y evitar la interacción con el receptor. Las moléculas señuelo de la invención pueden modificarse químicamente, por ejemplo, como se describe en la técnica.

La expresión "ADN monocatenario" (ADNmc), como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido desoxirribonucleico de origen natural o sintético que comprende una única cadena lineal, por ejemplo, un ADNmc puede ser una secuencia génica con sentido o antisentido o EST (marcador de secuencia expresado).

El término "alozima", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico enzimático alostérica, incluyendo, por ejemplo, patentes de EE.UU. n.° 5.834.186, 5.741.679, 5.589.332, 5.871.914, y publicaciones PCT n.° WO 00/24931, WO 00/26226, WO 98/27104 y WO 99/29842.

El término "aptámero", como se usa en el presente documento, se entiende como una composición polinucleotídica que se une específicamente a una molécula diana, en donde el polinucleótido tiene una secuencia que difiere de una secuencia normalmente reconocida por la molécula diana en una célula. Como alternativa, un aptámero puede ser una molécula de ácido nucleico que se une a una molécula diana donde la molécula diana no se une de forma natural a un ácido nucleico. La molécula diana puede ser cualquier molécula de interés. Las moléculas de aptámeros de la invención pueden modificarse químicamente, por ejemplo, como se describe en la técnica.

3.0 Lípidos

3.1 Lípidos catiónicos

Los lípidos catiónicos adecuados para uso en la composición lipídica incluyen, pero no se limitan a, cloruro de N,N-dioleil-N,N-dimetilamonio (DODAC), bromuro de N,N-diestearil-N,N-dimetilamonio (DDAB), cloruro de N-(1 -(2,3-dioleiloxi)propil)N,N,N-trimetilamonio (DOTAP), cloruro de N-(1-(2,3dioleiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA), N,N-dimetil-2,3-dioleiloxi)propilamina (DODMA), 1,2-dioleoil-3-dimetilamonio-propano (DODAP), 1,2-dioleoilcarbamil-3-dimetilamoniopropano (DOCDAP), 1,2-dilineoil-3-dimetilamoniopropano (DLINDAP), trifluoroacetato de dioleoiloxi-N-[2-espermincarboxamido)etil}-N,N-dimetil-1propanaminio (DOSPA), dioctadecilamidoglicilespermina (DOGS), DC-Chol, bromuro de 1,2dimiristiloxipropil-3-dimetil-hidroxietilamonio (DMRIE), 3-dimetilamino-2-(colest-5-en-3beta-oxibutan-4-oxi)-1-(cis,cis-9, 12-octadecadienoxi)propano (CLinDMA), 2-[5'-(colest-5-en-3~-oxi)-3'-oxapentoxi)-3-dimetil1-1-(cis,cis-9', 12'-octadecadienoxi)propano (CpLinDMA), N,N-dimetil-3,4-dioleiloxibencilamina (DM^oB^a), 1,2-N,N'-dioleilcarbamil-3-dimetilaminopropano (DOcarbDAP) y/o mezclas de los mismos.

Otros lípidos catiónicos adecuados se describen en la Solicitud Provisional U.S. Serie No. 61/918.927. Un lípido adecuado es un compuesto, o sal del mismo, de fórmula (I):

en la que n y p son cada uno, independientemente, 1 o 2; R¹es heterociclilo, heterociclil-alquilo de C^1-8o heterociclil-alcoxi de C^1-8, cada uno de los cuales puede estar opcionalmente sustituido con 1, 2 o 3 grupos, seleccionados independientemente de alquilo de C^1-8, cicloalquilo de C^3-7, cicloalquil C^3-7-alquilo de C^1-8, heterociclilo, -[alquileno(C¹-C⁴)],-N(R')R", -O-[alquileno(C¹-C⁴)]^v-N(R')R", o -N(H)-[alquileno(C¹-C⁴)]^v-N(R')R", en el que dicho alquileno (C¹-C⁴) está opcionalmente sustituido con uno o más grupos R; v es 0, 1,2, 3 o 4; R es hidrógeno o -alquilo de C^1-8, o cuando v es 0, R está ausente; R' y R" son cada uno, independientemente, hidrógeno, -alquilo de C^1-8; o R' y R" se combinan con el nitrógeno al que están unidos, y opcionalmente incluyen otro heteroátomo seleccionado de N, O y S, para formar un heterociclo o heteroarilo de 5-8 miembros, opcionalmente sustituido con un -alquilo de C^1-8, hidroxi o cicloalquilo de C^1-8-; R²y R³son cada uno, independientemente, alquilo de C^12-22, alquenilo de C^12-22,

R⁴se selecciona de hidrógeno, alquilo de C¹

Otros lípidos catiónicos incluyen un compuesto, o sal del mismo, según la fórmula (II):

Otros lípidos catiónicos adecuados incluyen aquellos de fórmulas (I) y (II) en las que R4 es hidrógeno, o en las que R4 es

Otros lípidos catiónicos adecuados incluyen los lípidos anteriores en los que R1 se selecciona de:

Otros lípidos catiónicos adecuados incluyen los lípidos anteriores en los que R2 se selecciona de:

Otros lípidos catiónicos adecuados incluyen los lípidos anteriores en los que R3 se selecciona de

y

Otros lípidos adecuados según los lípidos anteriores incluyen aquellos en los que R2 y R3 son idénticos.

Los lípidos catiónicos específicos incluyen un compuesto seleccionado del grupo que consiste en (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-bis(octadeca-9,12-dienoato de 2-(((1,3-dimetilpirrolidin-3-carbonil)oxi)metil)propano-1,3-diílo; (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-bis(octadeca-9,12-dienoato) de 2-(((3-(4-metilpiperazin- 1-il)propanoil)oxi)metil)propano-1,3-diílo;

(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-bis(octadeca-9,12-dienoato) de 2-(((4-(pirrolidin-1-il)butanoil)oxi)metil)propano-1,3-diílo; (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-bis(octadeca-9,12-dienoato) de 2-(((4-(piperidin-1-il)butanoil)oxi)metil)propano-1,3-diílo; (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-bis(octadeca-9,12-dienoato) de 2-(((3-(dimetilamino)propanoil)oxi)metil)propano-1,3-diílo; (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-bis(octadeca-9,12-dienoato) de 2-((2-(dimetilamino)acetoxi)metil)propano-1,3-diílo;

(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-bis(octadeca-9,12-dienoato) de 2-(((3-(dietilamino)propanoil)oxi)metil)propano-1,3-diílo; (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-bis(octadeca-9,12-dienoato) de 2-(((1,4-dimetilpiperidin-4-carbonil)oxi)metil)propano-1,3-diílo; (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-bis(octadeca-9,12-dienoato) de 2-(((1-(ciclopropilmetil)piperidin-4-carbonil)oxi)metil)propano-1,3-diílo;

(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-bis(octadeca-9,12-dienoato) de 2-(((3-morfolinopropanoil)oxi)metil)propano-1,3-diílo;

(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-bis(octadeca-9,12-dienoato) de 2-(((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)metil)propano-1,3-diílo; bis(8-(octanoiloxi)octanoato) de 2-(((1,3-dimetilpirrolidin-3-carbonil)oxi)metil)propano-1,3-diílo;

(9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dienoato de 3-((4,4-bis(octiloxi)butanoil)oxi)-2-((((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)metil)propilo;

(9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dienoato de 3-((4,4-bis(octiloxi)butanoil)oxi)-2-((((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)metil)propilo;

(9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dienoato 3-((4,4-bis(octiloxi)butanoil)oxi)-2-(((((1 -etilpiperidin-3-il)metoxi)carbonil)oxi)metil)propilo;

bis(2-heptilundecanoato) de 2-((((2-(dietilamino)etoxi)carbonil)oxi)metil)propano-1,3-diílo;

(9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dienoato de 3-(((2-(dietilamino)etoxi)carbonil)oxi)-2-(((2-heptilundecanoil)oxi)metil)propilo;

bis(2-heptilundecanoato) de 2-((((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)metil)propano-1,3-diílo;

(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)-2-(((2-heptilundecanoil)oxi)metil)propilo;

(9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dienoato de 3-(((2-(dimetilamino)etoxi)carbonil)oxi)-2-(((3-octilundecanoil)oxi)metil)propilo;

bis(3-octilundecanoato) de 2-((((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)metil)propano-1,3-diílo;

(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)-2-(((3-octilundecanoil)oxi)metil)propilo;

(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)-2-(((9-pentiltetradecanoil)oxi)metil)propilo;

(9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dienoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)-2-(((5-heptildodecanoil)oxi)metil)propilo;

(9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dienoato de 3-(2,2-bis(heptiloxi)acetoxi)-2-((((2-(dimetilamino)etoxi)carbonil)oxi)metil)propilo; y

(9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dienoato de 3-((6,6-bis(octiloxi)hexanoil)oxi)-2-((((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)metil)propilo.

Otros lípidos catiónicos adecuados se describen en la Solicitud Provisional U.S. Serie No. 61/918.941. Un lípido adecuado es un compuesto, o sal del mismo, de fórmula (III):

En la que n es 0, 1,2, 3 o 4; p es 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8; L¹es -O- o un enlace; L²es -OC(O)- o -C(O)O-; R1 se selecciona de:

y

v es 0, 1, 2, 3 o 4; w es 0, 1,2 o 3; Cyl es heterociclo de 5-7 miembros que contiene nitrógeno opcionalmente sustituido con uno o dos grupos alquilo; cada uno de R y R' es, independientemente, hidrógeno o alquilo C^1-8; y R²se selecciona entre alquilo C^6-20opcionalmente sustituido con un hidroxilo, alquenilo C^15-19, alquil C^{m 2}-OC(O)-alquilo C^5-20, alquil C^1-12-C(O)O-alquilo C^5-20y

R³se selecciona entre: alquilo C^4-22, alquenilo C^12-22,

Otros lípidos catiónicos adecuados incluyen los de fórmula (IV), o sal de los mismos:

Otros lípidos catiónicos adecuados incluyen los de fórmula (V):

Otros lípidos catiónicos adecuados incluyen los de fórmulas (III) a (V), en las que R2 se selecciona de:

Otros lípidos catiónicos adecuados incluyen los de fórmulas (III) a (V), en las que R2 es:

Otros lípidos catiónicos adecuados incluyen los de fórmulas (III) a (V), en las que el compuesto es de fórmula (VI):

Otros lípidos catiónicos adecuados incluyen los de fórmulas (III) a (VI), en las que R3 se selecciona de:

Otros lípidos catiónicos adecuados incluyen los de fórmulas (III) a (VI), en las que R3 es

Otros lípidos catiónicos adecuados incluyen los de fórmulas (III) a (VI), en las que el compuesto es de fórmula (VII):

Otros lípidos catiónicos adecuados incluyen los de fórmulas (III) a (VII), en las que el compuesto es de fórmula (VIII):

Otros lípidos catiónicos adecuados incluyen los de fórmulas (III) a (VIII), en las que el compuesto es de fórmula (IX):

Otros lípidos catiónicos adecuados incluyen los de fórmulas (III) a (IX), en las que R1 se selecciona de:

Otros lípidos catiónicos adecuados incluyen los de fórmulas (III) a (IX), en las que R1 es

Otros lípidos catiónicos adecuados se seleccionan de:

dioctanoato de 2-(10-dodecil-3-etil-8,14-dioxo-7,9,13-trioxa-3-azaoctadecan-18-il)propano-1,3-diílo; dioctanoato de 2-(9-dodecil-2-metil-7,13-dioxo-6,8,12-trioxa-2-azaheptadecan-17-il)propano-1,3-diílo; dioctanoato de 2-(9-dodecil-2-metil-7,13-dioxo-6,8,12-trioxa-2-azapentadecan-15-il)propano-1,3-diílo; dioctanoato de 2-(10-dodecil-3-etil-8,14-dioxo-7,9,13-trioxa-3-azahexadecan-16-il)propano-1,3-diílo; dioctanoato de 2-(8-dodecil-2-metil-6,12-dioxo-5,7,11-trioxa-2-azaheptadecan-17-il)propano-1,3-diílo; dioctanoato de 2-(10-dodecil-3-etil-8,14-dioxo-7,9,13-trioxa-3-azanonadecan-19-il)propano-1,3-diílo; dioctanoato de 2-(9-dodecil-2-metil-7,13-dioxo-6,8,12-trioxa-2-azaoctadecan-18-il)propano-1,3-diílo; dioctanoato de 2-(8-dodecil-2-metil-6,12-dioxo-5,7,11-trioxa-2-azaoctadecan-18-il)propano-1,3-diílo; dioctanoato de 2-(10-dodecil-3-etil-8,14-dioxo-7,9,13-trioxa-3-azaicosan-20-il)propano-1,3-diílo; dioctanoato de 2-(9-dodecil-2-metil-7,13-dioxo-6,8,12-trioxa-2-azanonadecan-19-il)propano-1,3-diílo; 4.4- bis(octiloxi)butanoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;

4.4- bis((2-etilhexil)oxi)butanoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;

4.4- bis((2-propilpentil)oxi)butanoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;

4.4- bis((2-propilpentil)oxi)butanoato de 3-(((3-(etil(metil)amino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo; 4.4- bis((2-propilpentil)oxi)butanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo; 6.6- bis(octiloxi)hexanoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;

6.6- bis(hexiloxi)hexanoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;

6.6- bis((2-etilhexil)oxi)hexanoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;

8.8- bis(hexiloxi)octanoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;

8.8- dibutoxioctanoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;

8.8- bis((2-propilpentil)oxi)octanoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;

8.8- bis((2-propilpentil)oxi)octanoato de 3-(((3-(etil(metil)amino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo; 8.8- bis((2-propilpentil)oxi)octanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo; 3-octilundecanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;

3-octilundec-2-enoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;

7-hexiltridec-6-enoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;

9-pentiltetradecanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;

9- pentiltetradec-8-enoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;

5-heptildodecanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;

5-heptildodecanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)tridecilo;

5-heptildodecanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)undecilo;

succinato de 1,3-bis(octanoiloxi)propan-2-ilo y (3-(((2-(dimetilamino)etoxi)carbonil)oxi)pentadecilo); succinato de 1,3-bis(octanoiloxi)propan-2-ilo y (3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo); 10- octil decanodioato de 1-(3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo);

10-octil decanodioato de 1-(3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo);

10-octil decanodioato de 1-(3-(((3-(etil(metil)amino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo);

10-(2-etilhexil) decanodioato de 1-(3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo);

10-(2-etilhexil) decanodioato de 1-(3-(((3-(etil(metil)amino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo); 10-(octanoiloxi)decanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;

decanoato de 8-dodecil-2-metil-6,12-dioxo-5,7,11-trioxa-2-azanonadecan-19-ilo;

10-(octanoiloxi)decanoato de 3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;

10-(octanoiloxi)decanoato de 3-(((3-(etil(metil)amino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;

octadeca-9,12-dienoato de (9Z,12Z)-3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;

octadeca-9,12-dienoato de (9Z,12Z)-3-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;

octadeca-9,12-dienoato de (9Z,12Z)-3-(((3-(etil(metil)amino)propoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;

octadeca-9,12-dienoato de (9Z,12Z)-3-(((2-(dimetilamino)etoxi)carbonil)oxi)pentadecilo;

1.4- dimetilpiperidin-4-carboxilato de 1-((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienoiloxi)pentadecan-3-ilo;

4.4- bis((2-etilhexil)oxi)butanoato de 2-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)tetradecilo;

(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienoato de (12Z,15Z)-3-((3-(dimetilamino)propanoil)oxi)henicosa-12,15-dien-1-ilo; 3-octilundecanoato de (12Z,15Z)-3-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)henicosa-12,15-dien-1-ilo;

5-heptildodecanoato de (12Z,15Z)-3-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)henicosa-12,15-dien-1-ilo;

7-hexiltridecanoato de (12Z,15Z)-3-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)henicosa-12,15-dien-1-ilo;

9-pentiltetradecanoato de (12Z,15Z)-3-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)henicosa-12,15-dien-1-ilo;

3-(dimetilamino)propanoato de (12Z,15Z)-1-((((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi)carbonil)oxi)henicosa-12,15-dien-3-ilo;

2.2- bis(heptiloxi)acetato de (13Z,16Z)-4-(((2-(dimetilamino)etoxi)carbonil)oxi)docosa-13,16-dien-1-ilo;

2.2- bis(heptiloxi)acetato de (13Z,16Z)-4-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)docosa-13,16-dien-1-ilo;

3-((3-etil-10-((9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)-8,15-dioxo-7,9,14-trioxa-3-azaheptadecan-17-il)disulfanil)propanoato de 2,2-bis(heptiloxi)etilo;

heptadecan-9-il succinato de (13Z,16Z)-4-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)docosa-13,16-dien-1-ilo; (9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dienoato de 2-(((11Z, 14Z)-2-((3-(dimetilamino)propanoil)oxi)icosa-11, 14-dien-1-il)oxi)etilo;

(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-13-(octanoiloxi)tridecilo;

3-octilundecanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-13-(octanoiloxi)tridecilo;

5-heptildodecanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-13-hidroxitridecilo;

5-heptildodecanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-13-(octanoiloxi)tridecilo;

7-hexiltridecanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-13-(octanoiloxi)tridecilo;

9-pentiltetradecanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-13-hidroxitridecilo;

9- pentiltetradecanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-13-(octanoiloxi)tridecilo;

10- octil decanodioato de 1-(3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-13-(octanoiloxi)tridecilo);

10-(octanoiloxi)decanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-13-(octanoiloxi)tridecilo;

octadeca-9,12-dienoato de (9Z,12Z)-3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-5-octiltridecilo;

decanoato de 3-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-5-octiltridecilo;

octanoato de 5-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-7-octilpentadecilo;

octadeca-9,12-dienoato de (9Z,12Z)-5-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-7-octilpentadecilo; octanoato de 9-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-11-octilnonadecilo;

decanoato de 9-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)-11-octilnonadecilo;

(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienoato de 9-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)nonadecilo;

hexanoato de 9-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)nonadecilo;

3-octilundecanoato de 9-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)nonadecilo;

hexanoato de 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)nonadecilo;

3-octilundecanoato de 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)nonadecilo;

bis(octadeca-9,12-dienoato) de (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-((4-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo;

(9Z, 9'Z, 12Z, 12'Z)-bis(octadeca-9,12-dienoato) de 2-((4-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo;

(9Z,9'Z, 12Z, 12'Z, 15Z, 15'Z)-bis(octadeca-9,12,15-trienoato) de 2-((4-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi) hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo;

(Z)-dioleato de 2-((4-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo; ditetradecanoato de 2-((4-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo; ditetradecanoato de 2-((4-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo; ditetradecanoato de 2-((4-(((3-(etil(metil)amino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo; didodecanoato de 2-((4-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo; didodecanoato de 2-((4-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo; didodecanoato de 2-((4-(((3-(etil(metil)amino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo; bis(decanoato) de 2-((4-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo; bis(decanoato) de 2-((4-(((3-(etil(metil)amino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo; dioctanoato de 2-((4-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo; dioctanoato de 2-((4-(((3-(etil(metil)amino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo; dioctanoato de 2-(((13Z,16Z)-4-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)docosa-13,16-dienoil)oxi)propano-1,3-diílo;

dioctanoato de 2-(((13Z,16Z)-4-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)docosa-13,16-dienoil)oxi)propano-1,3-diílo; (9Z, 9'Z, 12Z, 12'Z)-bis(octadeca-9,12-dienoato) de 2-((2-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)tetradecanoil)oxi)propano-1,3-diílo;

(9Z, 9'Z, 12Z, 12'Z)-bis(octadeca-9,12-dienoato) de 2-((2-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)dodecanoil)oxi)propano-1,3-diílo;

bis(octadeca-9,12-dienoato) de (9Z,9'Z, 12Z, 12'Z)-2-((2-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)tetradecanoil)oxi)propano-1,3-diílo;

(9Z, 9'Z, 12Z, 12'Z)-bis(octadeca-9,12-dienoato) de 2-((2-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)dodecanoil)oxi)propano-1,3-diílo;

dioctanoato de 2-((2-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)tetradecanoil)oxi)propano-1,3-diílo;

4-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoato de 4,4-bis(octiloxi)butilo;

2-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)dodecanoato de 4,4-bis(octiloxi)butilo;

(9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dienoato de 10-dodecil-3-etil-14-(2-((9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dienoiloxi)etil)-8,13-dioxo-7,9-dioxa-3,14-diazahexadecan-16-ilo;

dioctanoato de 2-((4-(((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)-11-(octanoiloxi)undecanoil)oxi)propano-1,3-diílo; y

(9Z,9'Z, 12Z, 12'Z)-bis(octadeca-9,12-dienoato) de 2-(9-dodecil-2-metil-7,12-dioxo-6,8,13-trioxa-2-azatetradecan-14-il)propano-1,3-diílo.

Como se usa aquí, el término "alquilo" se refiere a una cadena hidrocarbonada ramificada o no ramificada, totalmente saturada, que tiene el número especificado de átomos de carbono. Por ejemplo, alquilo C^1-8se refiere a un grupo alquilo que tiene de 1 a 8 átomos de carbono. Por ejemplo, alquilo C^4-22se refiere a un grupo alquilo que tiene de 4 a 22 átomos de carbono. Por ejemplo, alquilo C^6-10se refiere a un grupo alquilo que tiene de 6 a 10 átomos de carbono. Por ejemplo, alquilo C^12-22se refiere a un grupo alquilo que tiene de 12 a 22 átomos de carbono. Los ejemplos representativos de alquilo incluyen, pero no se limitan a, metilo, etilo, n-propilo, /so-propilo, n-butilo, sec-butilo, /so-butilo, ferc-butilo, n-pentilo, isopentilo, neopentilo, n-hexilo, 3-metilhexilo, 2,2-dimetilpentilo, 2,3-dimetilpentilo, n-heptilo, n-octilo, n-nonilo, n-decilo, nundecanilo, n-dodecanilo, n-tridecanilo, 9-metilheptadecanilo, 1 -heptildecilo, 2-octildecilo, 6-hexildodecilo, 4-heptilundecilo, y similares.

Como se usa en el presente documento, el término "alquileno" se refiere a un grupo alquilo divalente como se ha definido anteriormente en el presente documento. Los ejemplos representativos de alquileno incluyen, pero no se limitan a, metileno, etileno, n-propileno, /so-propileno, n-butileno, sec-butileno, /so-butileno, ferc-butileno, n-pentileno, isopentileno, neopentileno, n-hexileno, 3-metilhexileno, 2,2-dimetilpentileno, 2,3-dimetilpentileno, n-heptileno, n-octileno, n-nonileno, ndecileno, y similares.

Como se usa aquí, el término "alquenilo" se refiere a una cadena hidrocarbonada ramificada o no ramificada, insaturada, que tiene el número especificado de átomos de carbono y uno o más dobles enlaces carbono-carbono dentro de la cadena. Por ejemplo, alquenilo C^12-22se refiere a un grupo alquenilo que tiene de 12 a 22 átomos de carbono con uno o más dobles enlaces carbono-carbono dentro de la cadena. En determinadas realizaciones, los grupos alquenilo tienen un doble enlace carbono-carbono dentro de la cadena. En otras realizaciones, los grupos alquenilo tienen más de un doble enlace carbono-carbono dentro de la cadena. Los grupos alquenilo pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes como se define en las fórmulas (I) o (III). Los ejemplos representativos de alquenilo incluyen, pero sin limitación, etilenilo, propenilo, butenilo, pentenilo, hexenilo y similares. Otros ejemplos de alquenilo incluyen, pero sin limitación: Z-octadec-9-enilo, Z-undec-7-enilo, Z-heptadeca-8-enilo, (9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienilo, (8Z,11Z)-heptadeca-8,11 -dienilo, (8Z,11Z,14Z)-heptadeca-8,11,14-trienilo, linolenilo, 2-octildeca-1-enilo, linoleílo y olelilo.

Como se usa en el presente documento, el término "alquenileno" se refiere a un grupo alquenilo divalente como se ha definido anteriormente en el presente documento. Los ejemplos representativos de alquenileno incluyen, pero sin limitación, etenileno, propenileno, butenileno, pentenileno, hexenileno y similares.

Como se usa en el presente documento, el término "alcoxi" se refiere a se refiere a cualquier resto alquilo unido a través de un puente oxígeno (es decir, un grupo -O-alquilo C^1-3en el que el alquilo C^1-3es como se define en el presente documento). Los ejemplos de tales grupos incluyen, pero sin limitación, metoxi, etoxi y propoxi.

Como se usa en el presente documento, el término "cicloalquilo" se refiere a un anillo de hidrocarburo monocíclico, bicíclico o tricíclico, saturado, que tiene el número especificado de átomos de carbono. Por ejemplo, cicloalquilo C^3-7se refiere a un anillo cicloalquilo que tiene de 3 a 7 átomos de carbono. Los grupos cicloalquilo pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes como se define en la fórmula (I). Los ejemplos representativos de cicloalquilo incluyen, pero sin limitación, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, biciclo[2.1.1 ]hexilo, biciclo[2.2.1]heptilo, adamantilo y similares.

Como se usa en el presente documento, el término "halo" se refiere a flúor, cloro, bromo y yodo.

Como se usa en el presente documento, el término "heterocíclico" se refiere a un anillo monocíclico o bicíclico, saturado o insaturado, de 4 a 12 miembros, que contiene de 1 a 4 heteroátomos. Los sistemas de anillos heterocíclicos no son aromáticos. Los grupos heterocíclicos que contienen más de un heteroátomo pueden contener heteroátomos diferentes. Son grupos heterocíclicos sistemas de anillos monocíclicos, espiro, condensados o puenteados. Los ejemplos de grupos heterocíclicos monocíclicos incluyen tetrahidrofuranoílo, dihidrofuranilo, 1,4-dioxanilo, morfolinilo, 1,4-ditianilo, azetidinilo, piperazinilo, piperidinilo, 1,3-dioxolanilo, imidazolidinilo, imidazolinilo, pirrolinilo, pirrolidinilo, tetrahidropiranilo, dihidropiranilo, 1,2,3,6-tetrahidropiridinilo, oxatiolanilo, ditiolanilo, 1,3-dioxanilo, 1,3-ditianilo, oxatianilo, tiomorfolinilo, 1,4,7-trioxa-10-azaciclododecanilo, azapanilo y similares. Los ejemplos de anillos heterocíclicos espiro incluyen, pero sin limitación, 1,5-dioxa-9-azaespiro[5.5]undecanilo, 1,4-dioxa-8-azaespiro[4.5]decanilo, 2-oxa-7-azaespiro[3.5]nonanilo y similares. Los sistemas de anillos heterocíclicos condensados tienen de 8 a 11 átomos en el anillo e incluyen grupos en donde un anillo heterocíclico está condensado con un anillo de fenilo. Los ejemplos de anillos heterocíclicos condensados incluyen, pero sin limitación, decahidroqunilinilo, (4aS,8aR)-decahidroisoquinolinilo, (4aS,8aS)-decahidroisoquinolinilo, octahidrociclopenta[c]pirrolilo, isoinolinilo, (3aR,7aS)-hexahidro-[1,3]dioxolo[4.5-c]piridinilo, octahidro-1H-pirrolo[3,4-b]piridinilo, tetrahidroisoquinolinilo y similares.

Como se usa en el presente documento, la expresión "heterociclilalquilo C¹-⁸" se refiere a un anillo heterocíclico como se ha definido anteriormente que está unido al resto de la molécula mediante un enlace sencillo o mediante un radical alquilo C^1-8como se ha definido anteriormente.

Como se usa en el presente documento, el término "heteroarilo" se refiere a un radical de anillo monocíclico, aromático, de 5 o 6 miembros, que comprende 1,2, 3 o 4 heteroátomos seleccionados individualmente entre nitrógeno, oxígeno y azufre. El radical heteroarilo puede estar unido mediante un átomo de carbono o un heteroátomo. Los ejemplos de heteroarilo incluyen, pero sin limitación, furilo, pirrolilo, tienilo, pirazolilo, imidazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, triazolilo, tetrazolilo, pirazinilo, piridazinilo, pirimidilo o piridilo.

Como se usa en el presente documento, la expresión "heteroarilalquilo C¹-⁸" se refiere a un anillo heteroarilo como se ha definido anteriormente que está unido al resto de la molécula mediante un enlace sencillo o mediante un radical alquilo C^1-8como se ha definido anteriormente.

3.2 Lípidos neutros

Los lípidos neutros adecuados para su uso en una composición lipídica de la invención incluyen, por ejemplo, una diversidad de lípidos neutros, no cargados o zwiteriónicos. Los ejemplos de fosfolípidos neutros adecuados para su uso en la presente invención incluyen, pero sin limitación: 5-heptadecilbenceno-1,3-diol (resorcinol), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), fosfocolina (DOPC), dimiristoilfosfatidilcolina (DMp C), fosfatidilcolina (PLPC), 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DAPC), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilcolina de huevo (EPC), dilauriloilfosfatidilcolina (DLPC), dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC), 1 -miristoil-2-palmitoil fosfatidilcolina (MPPC), 1-palmitoil-2-miristoil fosfatidilcolina (PMPC), 1-palmitoil-2-estearoil fosfatidilcolina (PSPC), 1,2-diaraquidoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DBPC), 1 -estearoil-2-palmitoil fosfatidilcolina (SPPC), 1,2-dieicosenoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DEPC), palmitoiloleoil fosfatidilcolina (POPC), lisofosfatidilcolina, dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE), dilinoleoilfosfatidilcolina diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE), dimiristoil fosfatidiletanolamina (DMPE), dipalmitoil fosfatidiletanolamina (DPPE), palmitoiloleoil fosfatidiletanolamina (POPE), lisofosfatidiletanolamina, y combinaciones de los mismos. En una realización, el fosfolípido neutro se selecciona entre el grupo que consiste en diestearoilfosfatidilcolina (DSPC) y dimiristoil fosfatidil etanolamina (DMPE).

3.3 Lípidos aniónicos

Los lípidos aniónicos adecuados para su uso en la presente invención incluyen, pero sin limitación, fosfatidilglicerol, cardiolipina, diacilfosfatidilserina, ácido diacilfosfatídico, N-dodecanoil fosfatidil etanoloamina, N-succinil fosfatidiletanolamina, hemisuccinato de N-glutaril fosfatidiletanolamina y colesterol (CHEMS) y lisilfosfatidilglicerol.

3.4 Lípidos auxiliares

Los lípidos auxiliares son lípidos que mejoran en cierta medida la transfección (por ejemplo, la transfección de la nanopartícula que incluye el agente biológicamente activo). El mecanismo por el que el lípido auxiliar mejora la transfección puede incluir, p. ej., mejorar la estabilidad de las partículas y/o mejorar la fusiogenicidad de la membrana. Los lípidos auxiliares incluyen esteroides y alquil resorcinoles. Los lípidos auxiliares adecuados para su uso en la presente invención incluyen, pero sin limitación, colesterol, 5-heptadecilresorcinol y hemisuccinato de colesterol.

3.4 Lípidos de circulación prolongada

Los lípidos de circulación prolongada son lípidos que aumentan el tiempo durante el cual las nanopartículas pueden existir in vivo (p. ej., en la sangre). Los lípidos de circulación prolongada adecuados para su uso en una composición lipídica de la invención incluyen, pero sin limitación, lípidos de circulación prolongada que tienen un grupo de cabeza hidrófilo unido a un resto lipídico. Los ejemplos de dichos lípidos de circulación prolongada incluyen compuestos de fórmula (XI), como se describe en el documento WO2011/076807,

o una sal o derivado farmacéuticamente aceptable de los mismos, en donde:

Z es un componente del grupo de cabeza hidrófilo seleccionado de PEG y polímeros a base de poli(oxazolina), poli(óxido de etileno), poli(alcohol vinílico), poli(glicerol), poli(N-vinilpirrolidona), poli[N-(2-hidroxipropil)metacrilamida], polisacáridos y poli(aminoácidos), en el que el polímero puede ser lineal o ramificado, y en el que el polímero puede estar opcionalmente sustituido;

en donde Z se polimeriza con n subunidades;

n es un grado de polimerización promediado entre 10 y 200 unidades de Z, en donde n está optimizado para diferentes tipos de polímeros;

L¹es un enlazador alquileno de C^1-10o heteroalquileno de C^1-10opcionalmente sustituido que incluye cero, uno, dos o más éter (por ejemplo, -O-), éster (por ejemplo, -C(O)O-), succinato (por ejemplo, -O(O)C-CH²-CH²-C(O)O-)), carbamato (por ejemplo, -OC(O)-NR'-), carbonato (por ejemplo, -OC(O)O-), cetona (por ejemplo, -C-C(O)-C-), carbonilo (por ejemplo, -C(O)-), urea (por ejemplo, -NRC(O)NR'-), amina (por ejemplo, -NR'-), amida (por ejemplo, -C(O)NR'-), imina (por ejemplo, -C(NR')-), tioéter (por ejemplo, -S-), xantato (por ejemplo, -OC(S)S-), y fosfodiéster (por ejemplo, -OP(O)²O-); cualquiera de los cuales puede estar sustituido por cero, uno o más grupos Z;

en donde R' se selecciona independientemente entre -H, -NH-, -NH², -O-, -S-, un fosfato o un alquileno C^1-10opcionalmente sustituido;

X¹y X²se seleccionan independientemente entre un carbono o un heteroátomo seleccionado entre -NH-, -O-, -S- o un fosfato;

A¹y A²se seleccionan independientemente entre un alquilo C⁶-³⁰, alquenilo C^6-30y alquinilo C⁶-³⁰, en donde A¹y A²pueden ser iguales o diferentes,

o en donde A¹y A², junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un esteroide opcionalmente sustituido.

Los lípidos de circulación prolongada específicos incluyen, pero sin limitación, los listados en la Tabla 1.

Tabla 1. Lípidos de circulación prolongada

Pueden encontrarse otros lípidos de circulación prolongada adecuados para su uso en una composición lipídica de la presente invención así como información sobre la bioquímica de dichos lípidos en Romberg et al., Pharmaceutical Research, Vol. 25, N.° 1,2008, págs. 55-71 y Hoekstra et al., Biochimica et Biophysica Acta 1660 (2004) 41-52.

En una realización, el lípido de circulación prolongada adecuado comprende un grupo seleccionado entre PEG (en algunas ocasiones denominado poli(óxido de etileno) y polímeros basados en poli(oxazolina), poli(alcohol vinílico), poli(glicerol), poli(N-vinilpirrolidona), poliaminoácidos y poli[N-(2-hidroxipropil)metacrilamida]. Se divulgan lípidos de PEG adecuados adicionales, p. ej., en el documento WO 2006/007712.

Los lípidos de circulación prolongada adecuados específicos incluyen conjugados de polietilenglicol-diacilglicerol o polietilenglicol-diacilglicamida (PEG-DAG), incluidos los que comprenden un grupo dialquilglicerol o dialquilglicamida que tiene una longitud de cadena alquilo que comprende independientemente de C⁴a C⁴⁰átomos de carbono saturados o insaturados. El grupo dialquilglicerol o dialquilglicamida puede comprender adicionalmente uno o más grupos alquilo sustituido. En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, el conjugado de PEG puede seleccionarse entre PEG-dilaurilglicerol, PEG-dimiristilglicerol (p Eg -DMG) (n.° de catálogo GM-020 de NOF, Tokio, Japón), PEG-dipalmitoilglicerol, PEG-diesterilglicerol, PEG-dilaurilglicamida, PEG-dimiristilglicamida, PEG-dipalmitoilglicamida y PEG-diesterilglicamida, PEG-colesterol (1-[8'-(Colest-5-en-3[beta]-oxi)carboxamido-3',6'-dioxaoctanil]carbamoil-[omega]-metil-poli(etilenglicol), PEG-DMB (3,4-Ditetradecoxilbencil-[omega]-metilpoli(etilenglicol)éter), 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N- [metoxi(polietilenglicol)-2000] (n.° de catálogo 880150P de Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama, EE.UU.).

En una realización, el lípido de circulación prolongada es S010, S024, S027, S031 o S033.

En otra realización, el lípido de circulación prolongada es S024.

A menos que se indique otra cosa, el término "PEG", como se usa en el presente documento, significa cualquier polímero de polietilenglicol u otro polialquileno. En una realización, PEG es un polímero de etilenglicol u óxido de etileno lineal o ramificado, opcionalmente sustituido. En una realización, PEG está sin sustituir. En una realización, el PEG está sustituido, p. ej., con uno o más grupos alquilo, alcoxi, acilo, hidroxi o arilo. En una realización, el término incluye copolímeros PEG tales como PEG-poliuretano o PEG-polipropileno (véase, p. ej., J. Milton Harris, Poly(ethylene glycol) chemistry: biotechnical and biomedical applications (1992)); en otra realización, el término no incluye copolímeros de PEG. En una realización, el PEG tiene un peso molecular de 130 a 50.000, en una sub-realización, 150 a 30.000, en una sub-realización, 150 a 20.000, en una sub-realización, 150 a 15.000, en una sub-realización, 150 a 10.000, en una sub-realización, 150 a 6.000, en una sub-realización, 150 a 5.000, en una sub-realización, 150 a 4.000, en una sub-realización, 150 a 3.000, en una sub-realización, 300 a 3.000, en una sub-realización, 1.000 a 3.000, y en una sub-realización, 1.500 a 2.500.

En ciertas realizaciones, el PEG es un "PEG-2K", también denominado "PEG 2000", que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 2000 daltons. PEG-2K se representa en el presente documento por la siguiente fórmula (XIIa), en donde n es 45, lo que significa que el grado de polimerización promediado comprende aproximadamente 45 subunidades. Sin embargo, se pueden usar otras realizaciones de PEG conocidas en la técnica, incluidas, por ejemplo, aquellas en las que el grado de polimerización promediado en número comprende 23 subunidades (n = 23) y/o 68 subunidades (n = 68).

Los compuestos preferidos de fórmulas (I)-(IX) para uso en los procedimientos de la invención son los Ejemplos 1-36 a continuación.

4.0 Nanopartículas de ácido nucleico encapsuladas

Por "nanopartícula lipídica" se entiende una partícula que comprende una pluralidad de (es decir, más de una) moléculas lipídicas asociadas físicamente entre sí por fuerzas intermoleculares. Las nanopartículas lipídicas pueden ser, por ejemplo, microesferas (incluyendo vesículas unilaminares y multilaminares, por ejemplo liposomas), una fase dispersa en una emulsión, micelas, o una fase interna en una suspensión.

La expresión "hospedante de nanopartículas lipídicas" se refiere a una pluralidad de moléculas lipídicas asociadas físicamente entre sí por fuerzas intermoleculares/interacciones electrostáticas para encapsular una o más moléculas de ácido nucleico, tal como un ARNip.

Ciertas realizaciones proporcionan una composición de nanopartículas de ácido nucleico encapsuladas que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una nanopartícula de ácido nucleico encapsulada. La nanopartícula de ácido nucleico encapsulada incluye un hospedante de nanopartículas lipídicas y un ácido nucleico que está encapsuladas en el hospedante de nanopartículas lipídicas. La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable", como se usa aquí, significa un diluyente inerte, no tóxico. Los materiales que pueden servir como vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, agua libre de pirógenos, agua desionizada, disolución salina isotónica, disolución de Ringer, y disoluciones amortiguadoras de fosfato. La nanopartícula de ácido nucleico encapsulada tiene un tamaño promedio de 40 a 70 nm y un índice de polidispersidad de menos de 0,1 según lo determinado por dispersión de luz dinámica, por ejemplo usando un Malvern Zetasizer Nano ZS. El hospedante de nanopartículas lipídicas comprende un lípido catiónico degradable, un polietilenglicol lipidado, colesterol, y componentes de 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina como se describe en otra parte aquí.

Las realizaciones de la presente invención proporcionan métodos para preparar una composición de nanopartículas de ácido nucleico encapsuladas que comprende un lípido catiónico y otro componente lipídico. Otra realización proporciona un método que usa un lípido catiónico y un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol. Otra realización proporciona un método que usa un lípido catiónico, un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol, y un lípido neutro, por ejemplo DSPC. Otra realización de la presente invención proporciona un método que usa un lípido catiónico, un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol, un lípido neutro, por ejemplo DSPC, y un lípido de circulación prolongada, por ejemplo S010, S024, S027, S031, o S033. Otra realización de la presente invención proporciona un método para encapsular un ácido nucleico en un hospedante de nanopartículas lipídicas, en el que la nanopartícula comprende un lípido catiónico, un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol, un lípido neutro, por ejemplo DSPC, un lípido de circulación prolongada, por ejemplo S010, S024, S027, S031, o S033, y el ácido nucleico es, por ejemplo, un A r N o ADN. Otra realización de la presente invención proporciona un método para usar un lípido catiónico, un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol, un lípido neutro, por ejemplo DSPC, y un lípido de circulación prolongada, por ejemplo S010, S024, S027, S031, o S033, en el que el ácido nucleico es, por ejemplo, ARNm, ARNip o ADN.

En algunas realizaciones de la invención, la o las disoluciones/corrientes lipídicas contienen un compuesto de lípido catiónico, un lípido auxiliar (colesterol), un lípido neutro opcional (DSPC) y un lípido de circulación prolongada (por ejemplo, S010, S024, S027, o S031). Cuando una formulación contiene cuatro componentes lipídicos, las relaciones molares de los lípidos pueden oscilar de 20 a 70 por ciento en moles para el lípido catiónico, con una diana de 40-60, el porcentaje en moles de lípido auxiliar oscila de 20 a 70, con una diana de 30 a 50, el porcentaje molar de lípido neutro oscila de 0-30, el porcentaje molar de lípido de PEG tiene un intervalo de 1 a 6, con una diana de 2 a 5.

En algunas realizaciones, la o las disoluciones/corrientes lipídicas contienen 30-60% de un compuesto de fórmula (III), 30-60% de colesterol / 5-10% de DSPC, y 1-5% de PEG-DMG, S010, S011, o S024.

Otra realización de la presente invención proporciona un método para encapsular un ácido nucleico en un hospedante de nanopartículas lipídicas usando un lípido catiónico y un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol, en una relación molar de lípidos de 40-55 lípido catiónico/40-55 lípido auxiliar. Otra realización proporciona un método que usa un lípido catiónico, un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol, y un lípido neutro, por ejemplo DSPC, en una relación molar de lípido de 40-55 lípido catiónico/40-55 lípido auxiliar 15-15 lípido neutro. Otra realización proporciona un método que usa un lípido catiónico, un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol, un lípido neutro, por ejemplo DSPC, y un lípido de circulación prolongada, por ejemplo S010, S024, S027, S031, o S033, en una relación molar de lípidos de 40-55 lípido catiónico/40-55 lípido auxiliar/5-15 lípido neutro/1-10 lípido de circulación prolongada.

Otra realización de la presente invención proporciona un método para encapsular un ácido nucleico en un hospedante de nanopartículas lipídicas usando un lípido catiónico y un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol, en una relación molar de lípidos de 40-50 lípido catiónico/40-50 lípido auxiliar. Otra realización proporciona un método que usa un lípido catiónico, un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol, y un lípido neutro, por ejemplo DSPC, en una relación molar de lípido de 40-50 lípido catiónico/40-50 lípido auxiliar 15-15 lípido neutro. Otra realización proporciona un método que usa un catiónico, un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol, un lípido neutro, por ejemplo DSPC, y un lípido de circulación prolongada, por ejemplo S010, S024, S027, S031, o S033, en una relación molar de lípidos de 40-50 lípido catiónico / 40

50 lípido auxiliar / 5-15 lípido neutro/ 1-5 lípido de circulación prolongada.

Otra realización de la presente invención proporciona un método para encapsular un ácido nucleico en un hospedante de nanopartículas lipídicas usando un lípido catiónico y un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol, en una relación molar de lípidos de 43-47 lípido catiónico/43-47 lípido auxiliar. Otra realización proporciona un método que usa un lípido catiónico, un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol, y un lípido neutro, por ejemplo DSPC, en una relación molar de lípido de 43-47 lípido catiónico/43-47 lípido auxiliar 17-12 lípido neutro. Otra realización proporciona un método que usa un catiónico, un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol, un lípido neutro, por ejemplo DSPC, y un lípido de circulación prolongada, por ejemplo S010, S024, S027, S031, o S033, en una relación molar de lípidos de 43-47 lípido catiónico / 43

47 lípido auxiliar / 7-12 lípido neutro/ 1-4 lípido de circulación prolongada.

Otra realización de la presente invención proporciona un método para encapsular un ácido nucleico en un hospedante de nanopartículas lipídicas usando un lípido catiónico y un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol, en una relación molar de lípidos de 45% de lípido catiónico y 44% de lípido auxiliar. Otra realización proporciona un método que usa un lípido catiónico, un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol, y un lípido neutro, por ejemplo DSPC, en una relación molar de lípidos de 45% de lípido catiónico, 44% de lípido auxiliar, y 9% de lípido neutro. Otra realización proporciona un método que usa un lípido catiónico, un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol, un lípido neutro, por ejemplo DSP^c, y un lípido de circulación prolongada, por ejemplo S010, S024, S027, S031, o S033, en una relación molar de lípidos de 45% de lípido catiónico,

44% de lípido auxiliar, 9% de lípido neutro, y 2% de lípido de circulación prolongada.

Una realización de la presente invención proporciona un método para preparar una composición de nanopartículas de ácido nucleico encapsuladas que comprende un compuesto de fórmula (I) y otro componente lipídico. Otra realización proporciona un método que usa un compuesto de fórmula (I) y un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol. Otra realización proporciona un método que usa un compuesto de fórmula (I), un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol, y un lípido neutro, por ejemplo DSPC. Otra realización de la presente invención proporciona un método que usa un compuesto de fórmula

(I), un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol, un lípido neutro, por ejemplo DSPC, y un lípido de circulación prolongada, por ejemplo S010, S024, S027, S031, o S033. Otra realización de la presente invención proporciona un método para encapsular un ácido nucleico en un hospedante de nanopartículas lipídicas, en el que la nanopartícula comprende un compuesto de fórmula (I), un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol, un lípido neutro, por ejemplo DSPC, un lípido de circulación prolongada, por ejemplo S010, S024, S027, S031, o S033, y el ácido nucleico es, por ejemplo, un ARN o ADN.

Otra realización de la presente invención proporciona un método para usar un compuesto de fórmula (I), un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol, un lípido neutro, por ejemplo DSPC, y un lípido de circulación prolongada, por ejemplo S010, S024, S027, S031, o S033, en el que el ácido nucleico es, por ejemplo, ARNm, ARNip o ADN.

Otra realización de la presente invención proporciona un método para encapsular un ácido nucleico en un hospedante de nanopartículas lipídicas usando un compuesto de cualquiera de las fórmulas (I)-(IX) y un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol, en una relación molar de lípidos de 40-55 compuesto de fórmula (I)/40-55 lípido auxiliar. Otra realización proporciona un método que usa un compuesto de cualquiera de las fórmulas (I)-(IX), un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol, y un lípido neutro, por ejemplo DSPC, en una relación molar de lípidos de 40-55 compuesto de cualquiera de las fórmulas (I)-(IX) / 40-55 lípido auxiliar 15-15 lípido neutro. Otra realización proporciona un método que usa un compuesto de cualquiera de las fórmulas (I)-(IX), un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol, un lípido neutro, por ejemplo DSPC, y un lípido de circulación prolongada, por ejemplo S010, S024, S027, S031, o S033, en una relación molar de lípidos de 40-55 compuesto de fórmula (I)/40-55 lípido auxiliar 15-15 lípido neutro/1-10 lípido de circulación prolongada.

Otra realización de la presente invención proporciona un método para encapsular un ácido nucleico en un hospedante de nanopartículas lipídicas usando un compuesto de cualquiera de las fórmulas (I)-(IX) y un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol, en una relación molar de lípidos de 40-50 compuesto de cualquiera de las fórmulas (I)-(IX) / 40-50 lípido auxiliar.

Otra realización proporciona un método que usa un compuesto de cualquiera de las fórmulas (I)-(IX), un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol, y un lípido neutro, por ejemplo DSPC, en una relación molar de lípidos de 40-50 compuesto de cualquiera de las fórmulas (I)-(IX) / 40-50 lípido auxiliar 15-15 lípido neutro. Otra realización proporciona un método que usa un compuesto de cualquiera de las fórmulas (I)-(IX), un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol, un lípido neutro, por ejemplo DSPc , y un lípido de circulación prolongada, por ejemplo S010, S024, S027, S031, o S033, en una relación molar de lípidos de 40-50 compuesto de cualquiera de las fórmulas (I)-(IX) / 40-50 lípido auxiliar / 5-15 lípido neutro / 1-5 lípido de circulación prolongada.

Otra realización de la presente invención proporciona un método para encapsular un ácido nucleico en un hospedante de nanopartículas lipídicas usando un compuesto de cualquiera de las fórmulas (I)-(IX) y un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol, en una relación molar de lípidos de 43-47 compuesto de cualquiera de las fórmulas (I)-(IX) / 43-47 lípido auxiliar.

Otra realización proporciona un método que usa un compuesto de cualquiera de las fórmulas (I)-(IX), un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol, y un lípido neutro, por ejemplo DSPC, en una relación molar de lípidos de 43-47 compuesto de cualquiera de las fórmulas (I)-(IX) / 43-47 lípido auxiliar 17-12 lípido neutro. Otra realización proporciona un método que usa un compuesto de cualquiera de las fórmulas (I)-(IX), un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol, un lípido neutro, por ejemplo DSPC, y un lípido de circulación prolongada, por ejemplo S010, S024, S027, S031, o S033, en una relación molar de lípidos de 43-47 compuesto de cualquiera de las fórmulas (I)-(IX) / 43-47 lípido auxiliar / 7-12 lípido neutro / 1-4 lípido de circulación prolongada.

Otra realización de la presente invención proporciona un método para encapsular un ácido nucleico en un hospedante de nanopartículas lipídicas usando un compuesto de cualquiera de las fórmulas (I)-(IX) y un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol, en una relación molar de lípidos de 45% de compuesto de cualquiera de las fórmulas (I)-(IX) y 44% de lípido auxiliar. Otra realización proporciona un método que usa un compuesto de cualquiera de las fórmulas (I)-(IX), un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol, y un lípido neutro, por ejemplo DSPC, en una relación molar de lípidos de 45% de compuesto de cualquiera de las fórmulas (I)-(IX), 44% de lípido auxiliar, y 9% de lípido neutro. Otra realización proporciona un método que usa un compuesto de cualquiera de las fórmulas (I)-(IX), un lípido auxiliar, por ejemplo colesterol, un lípido neutro, por ejemplo DSPC, y un lípido de circulación prolongada, por ejemplo S010, S024, S027, S031, o S033, en una relación molar de lípidos de 45% de compuesto de cualquiera de las fórmulas (I)-(IX), 44% de lípido auxiliar, 9% de lípido neutro, y 2% de lípido de circulación prolongada.

La relación de lípidos:ácido nucleico (por ejemplo, ARNip) en los procedimientos de la invención puede ser aproximadamente 15-20:1 (peso/peso). En ciertas realizaciones, la relación de lípidos:ácido nucleico es 17-19:1. En otras realizaciones, la relación de lípidos:ácido nucleico es 18,5:1

Las nanopartículas producidas por los procedimientos de la invención tienen un diámetro promedio/medio y una distribución de tamaños alrededor del valor promedio. Un intervalo más estrecho de tamaños de partículas corresponde a una distribución más uniforme de tamaños de partículas. El tamaño de partículas se puede determinar en el momento de la recolección de las nanopartículas, después de un tiempo de incubación, o después del procesamiento completo (por ejemplo, dilución, filtración, diálisis, etc.) de una formulación de nanopartículas. Por ejemplo, la determinación del tamaño de partículas generalmente se realiza después de un período de incubación de 60 minutos y/o después del procesamiento completo de la muestra. Los tamaños de partículas promedio se dan como un promedio de Z o un promedio numérico. Los promedios de Z se miden mediante la dispersión dinámica de luz en un Malvern Zetasizer. La muestra de nanopartículas se diluye en solución salina tamponada con fosfato (PBS) para que el índice de recuento sea de aproximadamente 200 - 400 kcts. Los datos se presentan como un promedio ponderado de la medición de intensidad. La dispersión dinámica de luz también proporciona un índice de polidispersidad (PDI) que cuantifica la anchura de la distribución de tamaños de partículas. Un PDI más grande se correlaciona con una distribución de tamaños de partículas más grande, y viceversa. Los promedios numéricos, por otro lado, se pueden determinar midiendo bajo un microscopio.

En algunas realizaciones, las nanopartículas de ácido nucleico encapsuladas producidas por los procedimientos de la invención tienen un diámetro promedio de 30 a 150 nm. En otras realizaciones, las partículas tienen un diámetro promedio de 30 a 40 nm. En otras realizaciones, las partículas tienen un diámetro promedio de 40 a 70 nm. En otras realizaciones, las partículas tienen un diámetro promedio de 65 a 80 nm. En otras realizaciones, las partículas tienen un promedio de Z de 50 a 80 nm y/o un promedio numérico de 40 a 80 nm. En aún otras realizaciones, las partículas tienen un promedio de Z de 50 a 70 nm y/o un promedio numérico de 40 a 65 nm. En todavía otras realizaciones, las partículas tienen un promedio de Z de 70 a 80 nm y/o un promedio numérico de 60 a 80 nm. El tamaño particular de las partículas obtenidas puede depender de la velocidad lineal de las corrientes de ácido nucleico y de lípido, el uso de una etapa de dilución opcional, y el ácido nucleico o los lípidos particulares usados. Mayores velocidades lineales y manteniendo la concentración de disolvente orgánico en la primera disolución de salida < 33% tienden a producir tamaños de partículas más pequeños.

En algunas realizaciones, las nanopartículas de ARNip encapsuladas producidas por los procedimientos de la invención tienen un diámetro promedio de 30 a 150 nm. En otras realizaciones, las partículas tienen un diámetro promedio de 30 a 40 nm. En otras realizaciones, las partículas tienen un diámetro promedio de 40 a 70 nm. En otras realizaciones, las partículas tienen un diámetro promedio de 65 a 80 nm. En otras realizaciones, las partículas tienen un promedio de Z de 50 a 80 nm y/o un promedio numérico de 40 a 80 nm. En aún otras realizaciones, las partículas tienen un promedio de Z de 50 a 70 nm y/o un promedio numérico de 40 a 65 nm. En todavía otras realizaciones, las partículas tienen un promedio de Z de 70 a 80 nm y/o un promedio numérico de 60 a 80 nm. En aún otras realizaciones, las nanopartículas de ARNip encapsuladas producidas por los procedimientos de la invención pueden tener diámetros promedio de 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, u 80 nm.

Al usar la dispersión dinámica de luz (por ejemplo, Malvern Zetasizer NanoZS), el índice de polidispersión (PDI) puede oscilar de 0 a 1,0. En ciertas realizaciones preferidas, el PDI es menor que 0,2. En otras realizaciones preferidas, el PDI es menor que 0,1.

Los procedimientos de la presente invención se pueden optimizar aún más por un experto en la técnica combinando lípidos catiónicos con el intervalo de pKa deseado, lípidos de circulación prolongada, lípidos auxiliares, y lípidos neutros, en formulaciones, incluyendo, por ejemplo, formulaciones de liposomas, formulaciones de nanopartículas lipídicas (LNP), y similares, para el suministro a células y tejidos específicos in vivo. En una realización, la optimización adicional se obtiene ajustando la proporción molar de lípido entre los diversos tipos de lípidos. En una realización, una optimización adicional se obtiene ajustando uno o más de: el tamaño de partículas deseado, la relación N/P, y/o los parámetros del procedimiento. Las diversas técnicas de optimización conocidas por los expertos en la materia que pertenecen a las realizaciones enumeradas anteriormente se consideran parte de esta invención.

5.0 Procedimientos para encapsular un ácido nucleico en un hospedante de nanopartículas lipídicas

Pueden emplearse los siguientes métodos para preparar nanopartículas lipídicas de la invención. Para lograr una reducción del tamaño y/o un aumento de la homogeneidad del tamaño en las partículas, el experto en la materia puede emplear las etapas del método que se detallan a continuación, experimentando con diferentes combinaciones. Además, el experto en la materia podría emplear sonicación, filtración u otras técnicas de dimensionamiento que se usan en formulaciones liposomales.

El procedimiento para obtener una composición de la invención normalmente comprende proporcionar una disolución acuosa, tal como amortiguador de citrato, que comprende un ácido nucleico en un primer reservorio, proporcionar un segundo reservorio que comprende una disolución orgánica, tal como un alcohol orgánico, por ejemplo, etanol, del o de los lípidos, y después mezclar la disolución acuosa con la disolución orgánica de lípidos. El primer reservorio está opcionalmente en comunicación fluida con el segundo reservorio. La etapa de mezclado se sigue opcionalmente de una etapa de incubación, una etapa de filtración o diálisis y una etapa de dilución y/o concentración. La etapa de incubación comprende dejar reposar la disolución de la etapa de mezclamiento en un recipiente durante 0 a 24 horas (preferiblemente 1 hora) a temperatura ambiente y opcionalmente protegida de la luz. En una realización, una etapa de dilución sigue a la etapa de incubación. La etapa de dilución puede implicar la dilución con tampón acuoso (p. ej., tampón citrato o agua pura), p. ej., usando un aparato de bombeo (p. ej., una bomba peristáltica). La etapa de filtración puede ser ultrafiltración o diálisis. La ultrafiltración comprende la concentración de la solución diluida seguida de diafiltración, p. ej., usando un sistema de bombeo adecuado (p. ej., un aparato de bombeo tal como una bomba peristáltica o equivalente) junto con una membrana de ultrafiltración adecuada (p. ej., cartuchos de fibra hueca GE o equivalente). La diálisis comprende el intercambio del disolvente (tampón) a través de una membrana adecuada (p. ej., membrana de piel de serpiente de 10,000).

En una realización, la etapa de mezclamiento proporciona una única fase transparente.

En una realización, después de la etapa de mezclamiento, el disolvente orgánico se elimina para proporcionar una suspensión de partículas, en la que el ácido nucleico está encapsulado por el o los lípidos.

La selección de un disolvente orgánico implicará normalmente la consideración de la polaridad del disolvente y la facilidad con la que el disolvente pueda eliminarse en las últimas etapas de la formación de partículas. El disolvente orgánico, que también se usa como agente solubilizante, está preferentemente en una cantidad suficiente para proporcionar una mezcla monofásica transparente de ácido nucleico y lípidos. Los disolventes orgánicos adecuados incluyen los descritos por Strickley, Pharmaceutical Res. (2004), 21, 201-230 para uso como codisolventes para formulaciones inyectables. Por ejemplo, el disolvente orgánico se puede seleccionar de uno o más (por ejemplo, dos) de etanol, propilenglicol, polietilenglicol 300, polietilenglicol 400, glicerina, dimetilacetamida (DMA), N-metil-2-pirrolidona (NMP), y dimetilsulfóxido (DMSO). Preferiblemente, el disolvente orgánico es etanol.

En el presente documento se divulga un aparato para preparar una composición de la presente invención. El aparato normalmente incluye al menos un depósito para contener una disolución acuosa que comprende un ácido nucleico, y otro o más depósitos para contener una disolución orgánica de lípidos. El aparato también incluye típicamente un mecanismo de bomba configurado para bombear las disoluciones acuosa y orgánica de lípidos a una región de mezclamiento o cámara de mezclamiento. En algunas realizaciones, la región de mezclamiento o la cámara de mezclamiento comprende un acoplamiento en cruz, o equivalente del mismo, que permite que las corrientes de fluido acuoso y orgánico se combinen como entrada al conector en cruz, y que las disoluciones acuosa y orgánica combinadas resultantes salgan del conector en cruz a un depósito de recogida o equivalente del mismo. En otras realizaciones, la región de mezclamiento o la cámara de mezclamiento comprende un acoplamiento en T o equivalente del mismo, que permite que las corrientes de fluido acuoso y orgánico se combinen como entrada al conector en T, y las disoluciones acuosa y orgánica combinadas resultantes salgan del conector en T hacia un depósito de recogida o equivalente del mismo.

Los procedimientos según la presente invención pueden entenderse mejor con referencia a la FIG. 2, que ilustra un sistema para uso en métodos ejemplares para formar nanopartículas de ácido nucleico encapsuladas. El aparato 1 contiene una cruz 16 que tiene conductos 12, 22 y 32 para recibir, respectivamente, una primera corriente de ácido nucleico 10, una segunda corriente de ácido nucleico 20, y una corriente de lípido 30. Las corrientes 10, 20 y 30 se pueden suministrar a los conductos 12, 22 y 32 bombeando las corrientes respectivas a través de un tubo adecuado que conduce desde uno o más depósitos que contienen una disolución de ácido nucleico y uno o más depósitos que contienen una disolución de lípidos (tubos y depósitos no mostrados). Los conductos 12, 22 y 32 en la FIG. 2 tienen diámetros internos aproximadamente iguales. Las corrientes 10, 20 y 30 se encuentran en el punto de intersección 14 para formar una corriente combinada 40. Debido a la geometría de la cruz 16, la corriente de lípido 30 fluye en una dirección sustancialmente igual a la corriente de lípido 30 y ortogonal a las corrientes de ácido nucleico 10 y 20, que fluyen en direcciones opuestas a 180° entre sí hacia el punto de intersección 14. La corriente combinada 40 fluye a través del conducto 42 hacia una cámara de proceso 70, cuyo cuerpo (72) puede tener un diámetro mayor que la etapa 42. La cámara de proceso 70 también puede tener diversas longitudes. Por ejemplo, la cámara de proceso 70 puede tener una longitud 100 a 2000 veces el diámetro de los conductos 12, 22 y 32, y un diámetro 4 veces el diámetro de los conductos 12, 22 y 32.

En la realización de la FIG. 2, la corriente mixta 40 interseca una corriente de dilución 50 que entra a través del conducto 52. La corriente de dilución 50 puede suministrarse a través de un tubo desde un depósito de dilución que contiene una disolución de dilución. En la FIG. 2, el conducto 52 tiene un diámetro 2 veces mayor que los conductos 12, 22 y 32. La corriente mixta 40 y la corriente de dilución 50 se cruzan en la cámara en T 54. La corriente producida por la intersección de la corriente mixta 40 y la corriente de dilución 50 es la primera disolución de salida 60 que contiene nanopartículas de ácido nucleico encapsuladas.

En ciertas realizaciones, la concentración de ácido nucleico en las dos corrientes de ácido nucleico es 0,1 a 1,5 mg/ml, y la concentración de lípidos en la corriente de lípido es 10 a 25 mg/ml. En otras realizaciones, la concentración de ácido nucleico en las dos corrientes de ácido nucleico es 0,2 a 0,9 mg/ml, y la concentración de lípidos en la corriente de lípido es 15 a 20 mg/ml. En otras realizaciones, la concentración de ácido nucleico en las dos corrientes de ácido nucleico es 0,225, 0,3, 0,33, o 0,45 a 0,675 mg/ml, y la concentración de lípidos en la corriente de lípido es 16-18 mg/ml. En otras realizaciones, la concentración de ácido nucleico en las dos corrientes de ácido nucleico es 0,225, 0,3, 0,33, 0,45, o 0,675 mg/ml, y la concentración de lípidos en la corriente de lípido es 16,7 mg/ml.

Las corrientes de lípido comprenden una mezcla de uno o más lípidos en un disolvente orgánico. El uno o más lípidos pueden ser una mezcla de un lípido catiónico, un lípido neutro, un lípido auxiliar, y un lípido de circulación prolongada, cada uno de los cuales puede estar presente en las mismas cantidades relativas descritas en cualquier otra parte aquí para la nanopartícula de ácido nucleico encapsulada final. El disolvente orgánico usado en la corriente lipídica es aquel capaz de solubilizar los lípidos, y que además es miscible con medios acuosos. Los disolventes orgánicos adecuados incluyen etanol, propilenglicol, polietilenglicol 300, polietilenglicol 400, glicerina, dimetilacetamida (DMA), N-metil-2-pirrolidona (NMP), y dimetilsulfóxido (DMSO). Preferiblemente, el disolvente orgánico comprende 80% o más de etanol. Preferiblemente, el disolvente orgánico comprende 90% o más de etanol. Más preferentemente, el disolvente orgánico es etanol. En ciertas realizaciones, la corriente de lípido comprende la disolución de amortiguador, tal como una disolución amortiguadora de citrato de sodio (por ejemplo, 25 mM).

La corriente de ácido nucleico comprende una mezcla de un ácido nucleico adecuado en una primera disolución acuosa. La primera disolución acuosa puede no incluir sales, o puede incluir al menos una sal. Por ejemplo, la primera disolución acuosa puede incluir un ácido nucleico adecuado en agua desionizada o destilada, sin sal añadida. En ciertas realizaciones, la primera disolución acuosa es una primera disolución amortiguadora que incluye al menos una sal tal como, por ejemplo, cloruro sódico y/o citrato sódico. En la primera disolución acuosa, el cloruro sódico puede estar presente en concentraciones que oscilan de 0 a 300 mM. En ciertas realizaciones, la concentración de cloruro sódico es 50, 66, 75, 100, o 150 mM. La primera disolución acuosa puede incluir citrato sódico en una concentración de 0 mM a 100 mM. La primera disolución amortiguadora tiene preferiblemente un pH de 4 a 6,5, más preferiblemente 4,5-5,5. En algunas realizaciones, el pH de la primera disolución amortiguadora es 5, y la concentración de citrato sódico es 25 mM. En otras realizaciones, el pH de la primera disolución amortiguadora es 6, y la concentración de citrato sódico es 100 mM. Preferiblemente, la primera disolución amortiguadora tiene un pH menor que el pKa del lípido catiónico. Para las realizaciones de la invención que no incluyen sal en la disolución acuosa, la corriente de lípido incluye la disolución amortiguadora. En ausencia de una sal (por ejemplo, citrato sódico) en la corriente de ácido nucleico o en la corriente de lípido, no se produce encapsulamiento.

Otros posibles amortiguadores incluyen, pero no se limitan a, acetato de sodio/ácido acético, Na₂HPO₄/ácido cítrico, hidrogenoftalato de potasio/hidróxido de sodio, hidrogenoftalato de disodio/dihidrogenoortofosfato de sodio, hidrogenoftalato de dipotasio/dihidrogenoortofosfato de potasio, dihidrogenoortofosfato de potasio/hidróxido de sodio.

En ciertas realizaciones, el disolvente orgánico comprende etanol, y la primera disolución de salida comprende etanol al 20-25%, ácido nucleico 0,15-0,25 mg/ml, y lípidos 3-4,5 mg/ml. En otras realizaciones, el disolvente orgánico comprende etanol, y la primera disolución de salida comprende etanol al 20%, ácido nucleico 0,15-0,2 mg/ml, y lípidos 3-3,5 mg/ml. En aún otras realizaciones, el disolvente orgánico comprende etanol, y la primera disolución de salida comprende etanol al 20%, ácido nucleico 0,18 mg/ml, y lípidos 3,3 mg/ml. En otras realizaciones, el disolvente orgánico comprende etanol, y la primera disolución de salida comprende etanol al 25%, ácido nucleico 0,2-0,25 mg/ml, y lípidos 4-4,5 mg/ml. En todavía otras realizaciones, el disolvente orgánico comprende etanol, y la primera disolución de salida comprende etanol al 25%, ácido nucleico 0,23 mg/ml, y lípidos 4,2 mg/ml.

En ciertas formas de realización según la FIG. 2, las corrientes de ácido nucleico 10 y 20 tienen una velocidad lineal combinada de 3 a 8 metros/segundo, la corriente de lípido 30 tiene una velocidad lineal de 1,5 a 4,5 metros por segundo, la relación en masa de lípidos:ácido nucleico es 15-20:1, y la concentración de disolvente orgánico en la disolución de salida 60 es menor que 33%. En realizaciones particulares, la relación en masa de lípidos:ácido nucleico es 15-20:1 o 17-19:1, y la concentración del disolvente orgánico en la disolución de salida 60 es 20-25%. En otras realizaciones particulares, la relación en masa de lípidos:ácido nucleico es 18,5:1, y la concentración del disolvente orgánico en la disolución de salida 60 es 25%. Se entiende que la selección de velocidades lineales para las corrientes de ácido nucleico y la corriente de lípido de los intervalos anteriores está limitada por el requisito de mantener la relación de lípidos a ácido nucleico como se define aquí. Por lo tanto, puede ser necesario ajustar otros parámetros (por ejemplo, la concentración de ácido nucleico (mg/ml)), el caudal (ml/min), para lograr la relación deseada de lípidos a ácido nucleico.

En otras realizaciones según la FIG. 2, las corrientes de ácido nucleico 10 y 20 tienen una velocidad lineal combinada de 6 a 8 metros/segundo, la corriente de lípido 30 tiene una velocidad lineal de 3 a 4 metros por segundo, la relación en masa de lípidos:ácido nucleico es 15-20:1, y la concentración de disolvente orgánico en la disolución de salida 60 es menor que 33%. En realizaciones particulares, la relación en masa de lípidos:ácido nucleico es 15-20:1 o 17-19:1, y la concentración del disolvente orgánico en la disolución de salida 60 es 20-25%. En otras realizaciones particulares, la relación en masa de lípidos:ácido nucleico es 18,5:1, y la concentración del disolvente orgánico en la disolución de salida 60 es 25%.

En una realización según la FIG. 2, las corrientes de ácido nucleico 10 y 20 tienen una velocidad lineal combinada de 6,8 metros/segundo, la corriente de lípido 30 tiene una velocidad lineal de 3,4 metros por segundo, cada corriente 10/20/30/50 tiene el mismo caudal (ml/min), la relación en masa de lípidos:ácido nucleico es 15-20:1, y la concentración de disolvente orgánico en la disolución de salida 60 es 25%. Al proporcionar volúmenes iguales de dos corrientes de ácidos nucleicos, una corriente de lípido y una corriente de dilución, la concentración total de disolvente orgánico derivado de la corriente de lípido (lípido en un 100% de disolvente orgánico) en la primera disolución de salida es 25%. En realizaciones particulares, la relación de masa de lípidos:ácido nucleico es 17-19:1. En otras realizaciones particulares, la relación de masa de lípidos:ácido nucleico es 18,5:1.

En realizaciones típicas de la invención, cada corriente de ácido nucleico 10/20 puede tener una concentración de ácido nucleico de 0,45 mg/ml y una velocidad lineal de 3,4 metros/segundo, la corriente de lípido 30 puede tener una concentración total de lípidos de 16,7 mg/ml y una velocidad lineal de 3,4 metros/segundo, y los caudales de las corrientes individuales son iguales. Por ejemplo, los conductos 12, 22 y 32 pueden tener diámetros internos de 0,5 mm, y las corrientes 10, 20 y 30 tienen cada una un caudal de 40 ml/min y una velocidad lineal correspondiente de 3,4 metros/segundo. Alternativamente, los conductos 12, 22 y 32 pueden tener diámetros internos de 1,0 mm, y las corrientes 10, 20 y 30 tienen cada una un caudal de 160 ml/min, mientras que las velocidades lineales correspondientes permanecen en 3,4 metros/segundo. En otra alternativa, los conductos 12, 22 y 32 pueden tener diámetros internos de 2,0 mm, y las corrientes 10, 20 y 30 tienen cada una un caudal de 640 ml/min, mientras que las velocidades lineales permanecen en 3,4 metros/segundo. Como es evidente a partir de los ejemplos anteriores, duplicar el diámetro del conducto y la corriente requiere un aumento de 4 veces en el caudal para mantener una velocidad lineal constante. En estos ejemplos, la corriente de dilución 50 tiene el mismo caudal que las corrientes 10, 20, y 30, aunque el diámetro 2 veces mayor del conducto 52 da como resultado una velocidad lineal un 50% más baja para la corriente de dilución en cada escala del procedimiento. Sorprendentemente, se ha descubierto que el procedimiento de la invención se puede escalar como se ha descrito anteriormente, conservando el mismo alto grado de encapsulamiento de ácido nucleico y tamaños de partículas pequeños y uniformes.

La velocidad lineal de las corrientes de ácido nucleico combinadas 10/20 con respecto a la corriente de lípido 30 está relacionada con las concentraciones de ácido nucleico y lípidos en las corrientes respectivas y los caudales (ml/min) de las corrientes individuales, incluida la corriente de dilución 50. Sin embargo, las concentraciones de ácido nucleico y lípidos no están limitadas a los valores específicos indicados anteriormente, y pueden ajustarse hacia arriba o hacia abajo, siempre que los caudales se ajusten correspondientemente, según sea necesario, para mantener en general la relación de lípidos: ácido nucleico 15-20:1. Por ejemplo, una disminución del 10% en la concentración de ácido nucleico de 0,45 mg/ml a 0,405 mg/ml estaría acompañada por un aumento de 1,11 veces en el caudal (ml/min) para mantener constante el suministro global de ácido nucleico. Manteniendo constante el diámetro de las corrientes de ácido nucleico, el aumento de 1,11 veces en el caudal en ml/min también da como resultado un aumento de 1,11 veces en la velocidad lineal en metros/segundo. Además, manteniendo constante el caudal de la corriente de dilución, la concentración total de disolvente orgánico de la corriente de lípido en la disolución de salida 60 disminuiría hasta 23,5%. Por supuesto, el caudal de la corriente de dilución 50 también podría reducirse para mantener la concentración de disolvente orgánico en un 25%, si así se desea. Eventualmente, una reducción suficiente en la concentración de ácido nucleico y el aumento correspondiente en el caudal de la corriente de ácido nucleico pueden obviar la necesidad de la corriente de dilución 50 para mantener la concentración de disolvente orgánico al 25% en la primera disolución de salida 60. Por el contrario, la concentración de ácido nucleico puede aumentarse (por ejemplo, hasta 0,9 mg/ml). Sin embargo, un aumento del doble de este tipo requeriría una disminución correspondiente en el o los caudales de la corriente de ácido nucleico y un aumento en el caudal de la corriente de dilución para mantener la concentración de disolvente orgánico en un 25% y la relación de lípidos:ácido nucleico en 15-20:1. Según los principios anteriores, se pueden realizar variaciones adicionales en la concentración de ácido nucleico o lípido, caudales o velocidades lineales de las corrientes 10, 20, 30, y 50.

En otras realizaciones de la invención, los caudales y/o las velocidades lineales de las corrientes de ácido nucleico 10/20 y la corriente de lípido 30 pueden reducirse o aumentarse juntas. Así, manteniendo un diámetro y una concentración constantes para cada corriente, las velocidades lineales de las corrientes de ácido nucleico combinadas pueden reducirse a 3,4 metros/segundo y la corriente de lípido a 1,7 metros/segundo. En otras realizaciones, la velocidad de las corrientes de ácido nucleico combinadas puede reducirse a 3 metros/segundo y la corriente de lípido a 1,5 metros/segundo. Asimismo, la velocidad de las corrientes de ácido nucleico combinadas puede elevarse a 14 metros/segundo y la corriente de lípido a 7 metros/segundo. Generalmente, el intervalo superior de velocidad está sujeto únicamente a las limitaciones mecánicas del equipo usado para bombear las corrientes. Los caudales/velocidades muy altos pueden dar como resultado una contrapresión que provoque fallo del equipo. En general, la velocidad de las corrientes de ácido nucleico combinadas según la FIG. 2 puede oscilar de 3 metros/segundo a 14 metros por segundo y para la corriente de lípido de 1,5 a 4,5 metros/segundo. Preferiblemente, la velocidad de la corriente de ácido nucleico combinado es de 6-8 metros/segundo, y para la corriente de lí pido 3-4 metros/segundo. En ciertas realizaciones, la velocidad combinada de las corrientes de ácido nucleico combinadas es 6,8 metros/segundo, y para la corriente de lípido 3,4 metros/segundo.

En algunas realizaciones de la invención, las concentraciones del ácido nucleico y los lípidos pueden reducirse o aumentarse juntas. Por ejemplo, aunque generalmente es deseable mantener las concentraciones lo más altas posible para un procedimiento más eficiente, es posible reducir las concentraciones del ácido nucleico a 0,045 mg/ml y las de lípidos a 1,67 mg/ml. Sin embargo, a concentraciones aún más bajas, la agregación de partículas tiende a aumentar.

En ciertas realizaciones según la FIG. 2, la concentración de ácido nucleico en las dos corrientes de ácido nucleico es 0,1 a 1,5 mg/ml, y la concentración de lípidos en la corriente de lípido es 10 a 25 mg/ml. En otras realizaciones, la concentración de ácido nucleico en las dos corrientes de ácido nucleico es 0,2 a 0,9 mg/ml, y la concentración de lípidos en la corriente de lípido es 15 a 20 mg/ml. En otras realizaciones, la concentración de ácido nucleico en las dos corrientes de ácido nucleico es 0,225, 0,3, 0,33, o 0,45 a 0,675 mg/ml, y la concentración de lípidos en la corriente de lípido es 16 18 mg/ml. En otras realizaciones, la concentración de ácido nucleico en las dos corrientes de ácido nucleico es 0,225, 0,3, 0,33, 0,45, o 0,675 mg/ml, y la concentración de lípidos en la corriente de lípido es 16,7 mg/ml. En general, las concentraciones de ácido nucleico más altas requieren un nivel de dilución correspondientemente mayor de la corriente de dilución 50 para mantener la concentración de ácido nucleico en la primera corriente de salida 60 en un intervalo preferido (por ejemplo, 0,15-0,25 mg/ml).

En otras realizaciones, la unión en T 54 en la FIG. 2 puede reemplazarse por una cruz 54a (FIG. 2a) de modo que dos corrientes de dilución 50a y 50b puedan cruzarse con la corriente mixta (por ejemplo, la corriente 40). Las corrientes de dilución 50a y 50b entran a través de los conductos 52a y 52b de la cruz 54a. El uso de dos corrientes de dilución en lugar de una única corriente de dilución permite un mayor factor de dilución de la corriente mixta 40. La mayor dilución resultante de la primera corriente de salida 60 puede proporcionar tamaños de partículas algo más pequeños. Por ejemplo, usando los caudales y velocidades de corriente de ácido nucleico/corriente de lípido descritos anteriormente con respecto a la FIG. 2, pero sustituyendo la cruz 54a de la FIG. 2a, puede duplicar el volumen de disolvente de dilución. La mayor dilución resultante de la primera corriente mixta 40 produce una primera corriente de salida 60 con una menor concentración de disolvente orgánico (por ejemplo, etanol) de la corriente de lípido. Por ejemplo, usando la cruz 54a, la concentración de disolvente orgánico en la primera disolución de salida puede reducirse hasta 20%. En otros aspectos, las concentraciones de ácido nucleico, las concentraciones de lípidos, los caudales, las velocidades, etc., se pueden variar usando la cruz 54a, tal como se describió anteriormente con respecto a la FIG. 2.

Alternativamente, la corriente mixta de cualquiera de las realizaciones anteriores puede simplemente diluirse en un conjunto de dilución que contenga un volumen equivalente de disolvente de dilución que el proporcionado por las corrientes de dilución 50, 50a, o 50b.

Como se describe aquí, la cruz 16 en la FIG. 2 puede reemplazarse por una cámara 86 en forma de T, como se muestra en la FIG. 3a. Los procedimientos que usan la cámara 86 tienen dos conductos de entrada 82 y 92 para una corriente de ácido nucleico 80 y una corriente de lípido 90. En los procedimientos que usan la cámara de mezclamiento 86, la corriente de ácido nucleico y la corriente de lípido tienen flujos opuestos a 180° entre sí. Usando la cámara 86, el caudal y la velocidad de la corriente de ácido nucleico individual puede ser el doble que la corriente de lípido para mantener la misma relación de lípido:ácido nucleico que se puede lograr usando la cruz 16, que usa dos corrientes de ácido nucleico. Por ejemplo, como se describe aquí, usando la cámara en T 86 (por ejemplo, conductos 82 y 92 de 0,5 mm de diámetro), una corriente de ácido nucleico que tiene ácido nucleico 0,45 mg/ml puede tener un caudal de 80 ml/min y una velocidad lineal de 6,8 metros/segundo, y la corriente de lípido puede tener una concentración de 16,7 mg/ml y una velocidad lineal de 3,4 metros/segundo. El empleo una corriente de dilución 50 como se muestra en la FIG. 2 a un caudal de 40 ml/min en el procedimiento que usa la cámara 86 da como resultado una concentración de disolvente orgánico en la primera disolución de salida del 25%. Sorprendentemente, se pueden obtener las mismas propiedades beneficiosas de uniformidad y tamaño de partículas pequeño usando la cámara en T 86 que se pueden obtener usando la cruz 16. El uso de la cámara en T 86 difiere al duplicar el caudal de la corriente de ácido nucleico en comparación con los caudales de la corriente de ácido nucleico individual en la FIG. 2. Los caudales generales de la corriente de ácido nucleico siguen siendo los mismos para ambos procedimientos, dando por lo tanto como resultado nanopartículas que tienen propiedades sustancialmente equivalentes.

Como se describe aquí, usando la cámara en T 86 y una corriente de dilución 50, la corriente de ácido nucleico 80 tiene una velocidad lineal de 3 a 8 metros/segundo, la corriente de lípido 90 tiene una velocidad lineal de 1,5 a 4,5 metros por segundo, la relación en masa de lípidos:ácido nucleico es 15-20:1, y la concentración de disolvente orgánico en la disolución de salida es menor que 33%. La relación en masa de lípidos:ácido nucleico puede ser 15-20:1 o 17-19:1, y la concentración del disolvente orgánico en la disolución de salida puede ser 20-25%. La relación en masa de lípidos:ácido nucleico puede ser 18,5:1, y la concentración del disolvente orgánico en la disolución de salida puede ser 25%.

Como se describe aquí, usando la cámara en T 86 y una corriente de dilución 50, la corriente de ácido nucleico 80 tiene una velocidad lineal de 6 a 8 metros/segundo, la corriente de lípido 90 tiene una velocidad lineal de 3 a 4 metros por segundo, la relación en masa de lípidos:ácido nucleico es 15-20:1, y la concentración de disolvente orgánico en la disolución de salida es menor que 33%. La relación en masa de lípidos:ácido nucleico puede ser 15-20:1 o 17-19:1, y la concentración del disolvente orgánico en la disolución de salida puede ser 20-25%. La relación en masa de lípidos:ácido nucleico puede ser 18,5:1, y la concentración del disolvente orgánico en la disolución de salida puede ser 25%.

Como se describe aquí, usando la cámara en T 86 y una corriente de dilución 50, la corriente de ácido nucleico 80 tiene una velocidad lineal de 6,8 metros/segundo, la corriente de lípido 90 tiene una velocidad lineal de 3,4 metros por segundo, la corriente 80 tiene el doble de caudal (ml/min) de la corriente 90 y la corriente de dilución 50, la relación en masa de lípidos:ácido nucleico es 15-20:1, y la concentración de disolvente orgánico en la disolución de salida es 25%. La relación en masa de lípidos:ácido nucleico puede ser 17-19:1. La relación en masa de lípidos:ácido nucleico puede ser 18,5:1.

Como se describe aquí, usando la cámara en T 86 sin una corriente de dilución 50, la corriente de ácido nucleico 80 tiene una velocidad lineal de 8 a 14 metros/segundo, la corriente de lípido 90 tiene una velocidad lineal de 1,5 a 4,5 metros por segundo, la relación en masa de lípidos:ácido nucleico es 15-20:1, y la concentración de disolvente orgánico en la disolución de salida menor que 33%.

La relación en masa de lípidos:ácido nucleico puede ser 15-20:1 o 17-19:1, y la concentración del disolvente orgánico en la disolución de salida puede ser 20-25%. La relación en masa de lípidos:ácido nucleico puede ser 18,5:1, y la concentración del disolvente orgánico en la disolución de salida puede ser 20 o 25%.

Como se describe aquí, usando la cámara en T 86 sin una corriente de dilución 50, la corriente de ácido nucleico 80 tiene una velocidad lineal de 9 a 11 metros/segundo, la corriente de lípido 90 tiene una velocidad lineal de 3 a 4 metros por segundo, la relación en masa de lípidos:ácido nucleico es 15-20:1, y la concentración de disolvente orgánico en la disolución de salida es menor que 33%. La relación en masa de lípidos:ácido nucleico puede ser 15-20:1 o 17-19:1, y la concentración del disolvente orgánico en la disolución de salida puede ser 20-25%. La relación en masa de lípidos:ácido nucleico puede ser 18,5:1, y la concentración del disolvente orgánico en la disolución de salida puede ser 25%.

Como se describe aquí, usando la cámara en T 86 sin una corriente de dilución 50, la corriente de ácido nucleico 80 tiene una velocidad lineal de 10,2 metros/segundo, la corriente de lípido 90 tiene una velocidad lineal de 3,4 metros por segundo, la corriente 80 tiene una velocidad de flujo triple (ml/min) de la corriente 90, la relación en masa de lípidos:ácido nucleico es 15-20:1, y la concentración de disolvente orgánico en la disolución de salida es 25%. La relación en masa de lípidos:ácido nucleico puede ser 17-19:1. La relación en masa de lí pidos: ácido nucleico puede ser 18,5:1.

Como se describe aquí, usando la cámara en T 86 sin una corriente de dilución 50, la corriente de ácido nucleico 80 tiene una velocidad lineal de 11 a 14 metros/segundo, la corriente de lípido 90 tiene una velocidad lineal de 3 a 4 metros por segundo, la relación en masa de lípidos:ácido nucleico es 15-20:1, y la concentración de disolvente orgánico en la disolución de salida es menor que 33%. La relación en masa de lípidos:ácido nucleico puede ser 15-20:1 o 17-19:1, y la concentración del disolvente orgánico en la disolución de salida puede ser 20-25%. En otras realizaciones particulares, la relación en masa de lípidos:ácido nucleico puede ser 18,5:1, y la concentración del disolvente orgánico en la disolución de salida puede ser 20%.

Como se describe aquí, usando la cámara en T 86 sin una corriente de dilución 50, la corriente de ácido nucleico 80 tiene una velocidad lineal de 13,6 metros/segundo, la corriente de lípido 90 tiene una velocidad lineal de 3,4 metros por segundo, la corriente 80 tiene el cuádruple de caudal (ml/min) de la corriente 90, la relación en masa de lípidos:ácido nucleico de 15-20:1, y la concentración de disolvente orgánico en la disolución de salida es 20%. La relación en masa de lípidos:ácido nucleico puede ser 17-19:1. La relación en masa de lípidos:ácido nucleico puede ser 18,5:1.

Como se discutió anteriormente en relación con la FIG. 2, la escala, las concentraciones, los caudales, y las velocidades lineales de la corriente de ácido nucleico 80 y la corriente de lípido 90 pueden variarse de manera similar usando la cámara en T 86. En particular, las concentraciones de ácido nucleico, concentraciones de lípidos, y concentraciones de etanol descritas aquí anteriormente en relación con la FIG. 2 también se aplican a las descripciones que emplean la cámara en T 86. Como se describe aquí, la concentración de ácido nucleico puede reducirse en un tercio (por ejemplo, de 0,45 a 0,3 mg/ml), y el caudal de la corriente de ácido nucleico puede aumentarse en un 50% (por ejemplo, de 80 ml/min a 120 ml/min) para mantener el mismo suministro global de ácido nucleico (36 mg/min). La velocidad lineal se incrementaría de manera similar a 10,2 metros/segundo. Debido a la mayor dilución de la corriente de ácido nucleico, se puede obtener una concentración del 25% de disolvente orgánico en la disolución de salida sin usar una corriente de dilución suplementaria. Al aumentar aún más el caudal de la corriente de ácido nucleico a 160 ml/min (velocidad de 13,6 metros/segundo para una corriente de 0,5 mm), la concentración de disolvente orgánico en la disolución de salida se reduce hasta 20%. En este último procedimiento, la velocidad de la corriente de ácido nucleico puede reducirse a 6,8 metros/segundo, y la velocidad de la corriente de lípido puede reducirse a 1,7 metros/segundo sin cambios significativos en el tamaño y la uniformidad de las partículas.

Como se describe aquí, aunque las diversas corrientes de ácido nucleico, lípido y dilución en las FIGS. 2 y 3 y descritas en general anteriormente se cortan en ángulo recto o de frente, estos ángulos no son críticos. Por ejemplo, la cámara en T 86 en la FIG. 3 puede ser reemplazada por una cámara 84 en forma de Y (FIG. 3b). O alternativamente, la orientación de la cámara en T se puede girar como se muestra en la cámara 94 (FIG. 3c). Aunque la FIG. 3c muestra la corriente de ácido nucleico 80 que se cruza con el flujo directo de la corriente de lípido 90, las posiciones de las corrientes de ácido nucleico y de lípido pueden estar invertidas en la FIG. 3c.

Como se describe aquí, el número de corrientes de ácido nucleico y de lípido se puede variar aún más con el ajuste apropiado de las concentraciones y los caudales. Por ejemplo, con un equipo adecuado, se pueden mezclar 2, 3 o 4 corrientes de lípido con 1, 2, 3 o 4 corrientes de ácido nucleico.

Los procedimientos de la invención descritos aquí proporcionan altas tasas de encapsulamiento de ácidos nucleicos. Generalmente, la tasa de encapsulamiento es >70%. En algunas realizaciones de la invención, se encapsula el 75% o más del ácido nucleico. En otras realizaciones, se encapsula el 80% o el 85% del ácido nucleico. En aún otras realizaciones, se encapsula el 90% o más del ácido nucleico. En otras realizaciones, se encapsula 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 del ácido nucleico.

Después de la formación de las nanopartículas de ácido nucleico encapsuladas como se describe aquí, la primera disolución de salida se puede incubar durante 60 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, la disolución se puede mezclar con un segundo disolvente de dilución para diluir la primera disolución de salida al doble para proporcionar una segunda disolución de salida. El segundo disolvente de dilución puede ser una tercera disolución amortiguadora o agua. La etapa de dilución puede llevarse a cabo mezclando la primera disolución de salida incubada con el segundo disolvente de dilución (agua) en un conector en T tal como la cámara en T 86 en la FIG. 3a. La primera disolución de salida incubada y el segundo disolvente de dilución pueden suministrarse al conector en T a cualquier caudal o velocidad adecuada, tal como, por ejemplo, 0,5 a 1 metro/segundo. Después de la etapa de dilución, la concentración de disolvente orgánico en la segunda disolución de salida se reduce a la mitad con respecto a la primera disolución de salida. Por tanto, en algunas realizaciones, la concentración de disolvente orgánico (por ejemplo, etanol) en la segunda disolución de salida es menor que 16,5%. En otras realizaciones, la concentración de disolvente orgánico (por ejemplo, etanol) en la segunda disolución de salida es 10-15%, 10-12,5%, 12,5%, o 10%. La segunda disolución de salida puede concentrarse mediante filtración de flujo tangencial y someterse a una diafiltración 15X con disolución salina amortiguada con fosfato (PBS) para eliminar el amortiguador de partida y el etanol, que se reemplazan por PBS. Después de la filtración de flujo tangencial, el conjunto de nanopartículas de ácido nucleico encapsuladas concentradas en PBS se puede recolectar y filtrar de forma estéril como se describe con más detalle en los Ejemplos a continuación. Las nanopartículas de ácido nucleico encapsuladas presentes en las formulaciones producidas por las etapas de procedimiento adicionales anteriores pueden almacenarse estables a 4°C durante más de 6 meses.

Según cada una de las realizaciones descritas aquí, existen realizaciones adicionales en las que el ácido nucleico es un ARNip. Por ejemplo, según las realizaciones descritas aquí, hay realizaciones adicionales en las que la corriente nucleica es una corriente de ARNip que comprende una mezcla de una o más moléculas de ARNip en una disolución amortiguadora y que tiene las velocidades lineales descritas aquí.

6.0 Ejemplos de Procedimiento - los ejemplos señalados con * están fuera del alcance de la invención

6.1 Formulaciones de lípidos de ARNip

Las nanopartículas lipídicas de ARNip encapsuladas se formaron mezclando disoluciones de lípidos disueltos en etanol con ARNip disuelto en un amortiguador de citrato mediante los sistemas y aparato que se muestran generalmente en las FIGS. 2-3b, y descritos en general anteriormente. Se usaron cámaras de mezclamiento que tenían conductos con diámetros internos de 0,5, 1,0, o 2,0 mm. Las cámaras de procesamiento tenían longitudes de 50 mm a 1000 mm. Las cámaras de dilución tenían conductos con diámetros internos equivalentes o de al menos 2 veces el de la cámara de mezclamiento de alrededor de 0,5 o 1,0 o 2,0 o 4,0 mm. La disolución lipídica contenía un lípido catiónico, un lípido auxiliar (colesterol), un lípido neutro (DSPC), y un lípido de circulación prolongada.

Las concentraciones de lípidos totales fueron 16,7 mg/ml o 25 mg/ml. La relación de lípidos totales a ARNip para estos experimentos fue alrededor de 18,3:1. La concentración de las disoluciones de ARNip fue 0,225, 0,3, 0,3375, o 0,45 mg/ml en un amortiguador de citrato de sodio:cloruro de sodio con pH 5. La concentración de NaCl fue 50 mM, 66 mM, 75 mM, o 100 mM. Los caudales y las velocidades lineales se variaron como se describe a continuación.

Para los experimentos de encapsulamiento de ARNip, los lípidos catiónicos y los lípidos de circulación prolongada (es decir, PEG lípido) usados se muestran en la siguiente Tabla.

Tabla 2

El ARNip usado para estos experimentos tenía secuencias y SEQ ID Nos. como se muestra en la siguiente Tabla. Tabla 3

6.2 Ejemplo de procedimiento 1 Encapsulamiento de ARNip

6.2.1 Preparación de mezcla de lípidos en etanol.

El siguiente es un ejemplo de ARNip encapsulado en una relación molar de amina lipídica catiónica a ARNip fosfato (N:P) de 4,5:1. Los lípidos (lípido catiónico, DSPC, colesterol, y PEG lipidado) en las cantidades que se muestran en la Tabla 4 se disuelven en 150 ml de etanol. Las relaciones molares de lípidos son 45:9:44:2, respectivamente. La mezcla se trató con ultrasonidos brevemente, se agitó suavemente durante 5 minutos y se mantuvo a 37 °C hasta su uso.

Tabla 4 Componentes de la mezcla de lípidos

6.2.2 Preparación de ARNip SEQ ID NO. 1 en amortiguador de citrato

El amortiguador para las corrientes de ARNip es cloruro de sodio 100 mM y citrato de sodio 25 mM a un pH de 5. Primero se confirma que el pH del amortiguador de citrato es 5,00. Si no es así, el pH se ajusta antes de proceder. Se descongela del almacenamiento a -80°C suficiente ARNip en agua para el encapsulamiento. El ARNip SEQ ID NO. 1 se añade a la disolución amortiguadora de citrato, y la concentración del ARNip disuelto se mide por densidad óptica a 260 nm en un espectrofotómetro UV. La concentración final del ARNip se ajusta a 0,45 mg/ml en 150 ml de amortiguador de citrato en un frasco de PETG estéril, y se mantiene a temperatura ambiente hasta su uso.

6.2.3 Encapsulamiento de ARNip en nanopartículas lipídicas

El encapsulamiento de ARNip se lleva a cabo usando un sistema como el que se muestra en general en la FIG. 2. Las jeringas estériles se cargan con un volumen igual (25 ml) de lípidos en etanol (jeringa (a)), ARNip en amortiguador de citrato (jeringas (b1) y (b2)), y agua sola (jeringa (c)). El tubo que sale de los racores Luer en la jeringa (a) que contiene 16,7 mg/ml de lípidos se conecta a la entrada central de una unión en cruz con un diámetro interno de 0,5 mm. Los tubos que salen de los racores Luer en las jeringas (b1) y (b2) que contienen ARNip a 0,45 mg/ml se conectan a las entradas laterales de la unión en cruz. El tubo es de etileno propileno fluorado (FEP) con un diámetro interno de 1,55 mm. Las jeringas (a), (b1) y (b2) se instalan en la bomba de jeringa A. El tubo que sale de la entrada central de la cruz opuesta a la entrada de lípidos se conecta a una unión en T con un diámetro interno de 1 mm (véase, por ejemplo, la FIG. 2, unión en T 54). El tubo que sale de un racor Luer en la jeringa (c) que contiene agua sola se conecta a la unión en T para permitir la dilución en línea de las nanopartículas lipídicas de ARNip, y la jeringa (c) se instala en la bomba de jeringa B. Tenga la línea de salida de la unión en T colocada sobre una botella de PETG estéril para la recolección de las nanopartículas lipídicas de ARNip diluidas. Es importante asegurarse de que todos los racores estén apretados en las jeringas. Las bombas de jeringa se configuran según el fabricante y el tamaño de jeringa adecuados y un caudal de 40 ml por minuto. Ponga en funcionamiento ambas bombas simultáneamente, y comience a recolectar material después de aproximadamente 0,5 segundos. Se recogerán aproximadamente 90 ml de nanopartículas lipídicas de ARNip encapsuladas, que contienen 25% de etanol en volumen, 0,23 mg/ml del ARNip, 4,2 mg/ml de los lípidos, y NaCl 50 mM. Después de un período de incubación de 60 min. tras el mezclamiento, los tamaños de las partículas se determinan usando un Malvern Zetasizer.

6.2.4 Dilución de nanopartículas lipídicas de ARNip

Se configura una unión en T de 1,0 mm de diámetro interno para diluir aún más la suspensión de nanopartículas lipídicas de ARNip. Esta etapa de dilución se realiza con dos jeringas en una bomba de jeringa. Una jeringa de 140 ml contiene las nanopartículas lipídicas de ARNip, y una segunda jeringa de 140 ml contiene agua. El caudal se ajusta a 25 ml por minuto. La corriente de ARNip y la corriente de agua entran en la unión en T a 180 grados entre sí. La suspensión de nanopartículas lipídicas de ARNip diluida se recoge en un frasco de PETG estéril. El volumen final será aproximadamente 280 ml, con una concentración de etanol de 12,5%.

6.2.5 Diálisis y concentración de nanopartículas lipídicas de ARNip por filtración de flujo tangencial

Por cada 50 mg de ARNip en el procedimiento de encapsulamiento, use un cartucho Vivaflow 50. Para un experimento de encapsulamiento de ARNip de 100 mg, use 2 cartuchos Vivaflow 50 conectados en serie. Los cartuchos de celulosa regenerados deben enjuagarse primero para eliminar cualquier disolución de almacenamiento del fabricante. Esto se hace llenando un depósito TFF vacío con 500 ml de agua DI y recirculando con una bomba peristáltica a un caudal de 115 ml/min. La línea de permeado no debe estar restringida, y el procedimiento de enjuague se completa cuando los 500 ml de agua se hacen pasar a través de la membrana.

Cargue la suspensión de nanopartículas lipídicas de ARNip en el depósito Minimate TFF. Concentre la mezcla mientras mantiene una presión general de 20-25 psi. El filtrado debe eluir a aproximadamente 4 ml por minuto durante toda la etapa de concentración. Este caudal se logra restringiendo la línea de permeado con una válvula de manguito hasta que se logre el caudal adecuado. Concentre hasta que el nivel de líquido en el depósito esté en la graduación de 15 ml. Diafiltre la suspensión concentrada de nanopartículas lipídicas de ARNip frente a 225 ml de 1x PBS libre de pirógenos y nucleasas. Aumente el caudal a 80 ml/min. Después de la diafiltración, reanude la concentración del material al volumen de retención del sistema TFF. Recoja la suspensión de nanopartículas lipídicas de ARNip del depósito. Es posible enjuagar el sistema TFF con 2 ml adicionales de 1x PBS y recolectar este lavado que contiene la suspensión de nanopartículas lipídicas de ARNip diluida, pero este lavado debe recolectarse por separado de la suspensión concentrada de nanopartículas lipídicas de ARNip. Almacene los materiales a 4°C hasta el análisis.

6.2.6 Etapa de filtración estéril

Las nanopartículas lipídicas de ARNip se filtran calentando aproximadamente 10 ml de la suspensión en un vial de vidrio que se coloca en un calentador de bloque de aluminio precalentado a 50°C durante 10 min. A continuación, se retira el vial, y la disolución se extrae con una jeringa y se filtra a través de un filtro de jeringa de PES de 0,22 |jm directamente en un vial estéril. Este producto final se almacena a 4°C.

6.2.7 Determinación del porcentaje de encapsulamiento (SYBR GOLD)

Para determinar la eficiencia de la formulación de ARNip en nanopartículas lipídicas, el porcentaje de encapsulamiento del ARNip se puede determinar midiendo la fluorescencia de sybr gold. Cuando se une a ARNip, sybr gold emite fluorescencia. La intensidad de la fluorescencia de sybr gold es proporcional a la cantidad de ARNip.

Se prepara una disolución patrón de lote de ARNip a aproximadamente 0,9 mg/ml en PBS. La concentración de lote de ARNip se verifica mediante medida de UV. El lote de ARNip se diluye con PBS a 8 jg/ml. Se realiza una dilución en serie para preparar disoluciones de ARNip de 4, 2, 1, 0,5 y 0,25 jg/ml. Se preparan 6 jg/m l de ARNip mezclando volúmenes iguales de disoluciones de 8 jg/m l y 4 jg/ml.

Para preparar las muestras de ensayo, se diluyen 10 j l de suspensión de nanopartículas lipídicas de ARNip con 990 j l de PBS (esta es ahora la disolución A). Nota: Esta primera etapa de dilución se aplica a las formulaciones con una concentración esperada de ARNip de ~3,6 mg/ml o menos. Si la concentración es mayor que ~3,6 mg/ml, la dilución debe ser mayor. Se diluyen 40 ul de la disolución A con 160 j l de PBS (esta es ahora la disolución 1).

Para medir el ARNip libre en una formulación, se prepara una disolución de sybr gold al 0,02% en PBS (por ejemplo, 3 j l de sybr gold en 15 ml de PBS) (disolución 2). En una placa negra de fondo transparente de 96 pocillos, se mezclan 10 j l de la disolución 1 con 190 j l de la disolución 2 para obtener la mezcla de muestra 1. En esta mezcla, sybr gold se unirá solo al ARNip no encapsulado (es decir, libre). No tendrá acceso al ARNip encapsulado en el liposoma.

Para medir el ARNip total en una formulación, se prepara una disolución de sybr gold al 0,02% y triton-x al 0,2% en PBS (por ejemplo, 3 j l de sybr gold en 15 ml de triton al 0,2% en PBS) (disolución 3). En una placa negra de fondo transparente de 96 pocillos, se mezclan 10 j l de la disolución 1 con 190 j l de la disolución 3 para proporcionar la mezcla de muestra 2. En esta mezcla, triton-x destruye los liposomas y expone el ARNip previamente encapsulado a la unión de sybr gold. Por lo tanto, sybr gold se unirá al ARNip no encapsulado (es decir, libre) y a todos los ARNip recién expuestos. El ARNip libre ARNip recién expuesto = ARNip total

Las disoluciones patrón descritas anteriormente (10 j l cada una) se mezclan con 190 j l de la disolución 2 para proporcionar mezclas patrón 1, o con 190 j l de la disolución 3 para proporcionar mezclas patrón 2.

La fluorescencia de todas las mezclas se mide en el espectrofotómetro SpectraMax M5 usando el software SoftMax pro 5.2 y los siguientes parámetros:

Los valores de intensidad de fluorescencia obtenidos de las mezclas patrón 1 se usan para crear la curva de calibración para el ARNip libre. A continuación, la intensidad de fluorescencia de una mezcla de muestra 1 se introduce en la ecuación proporcionada por la curva de calibración para ARNip libre. A continuación, la concentración encontrada de la muestra se multiplica por la magnitud de la dilución para obtener el ARNip libre en la formulación de nanopartículas lipídicas.

Los valores de intensidad de fluorescencia obtenidos de las mezclas patrón 2 se usan para crear la curva de calibración para el ARNip total. Después, la intensidad de fluorescencia de una mezcla de muestra 2 se inserta en la ecuación proporcionada por la curva de calibración para el ARNip total. La concentración encontrada de la muestra se multiplica entonces por la magnitud de la dilución para obtener el ARNip total en la formulación de nanopartículas lipídicas.

El ARNic encapsulado se calcula mediante la fórmula: [(ARNic total - ARNic libre)/(ARNic total)] x 100%

6.2.8 Determinación del porcentaje de encapsulamiento mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC)

Debido a que el tamaño del ARNip libre (5 nm) es diferente al tamaño de un liposoma (50-200 nm), eluirán en diferentes momentos en la columna de exclusión por tamaño. El ARNip libre eluye después de los liposomas. El tiempo de retención para el ARNip es ~17 minutos, mientras que el tiempo de retención para los liposomas es ~10 minutos. La detección del ARNip eluido se lleva a cabo mediante un detector UV con una longitud de onda de absorción establecida en 260 nm.

Se prepara lote de ARNip a aproximadamente 0,9 mg/ml en PBS. A una alícuota de 200 |jl de lote, se añaden 10 |jl de TRITON X-100. La concentración de lote de ARNip se verifica mediante medida de UV. Se realizan diluciones en serie para preparar patrones a 1/2, 1/4, 1/8, 1/16 y 1/32 de concentración del lote de ARNip. Se añaden 10 j l de TRITON X-100 a 200 j l de cada patrón. La concentración de cada patrón se verifica mediante medida de UV.

En un vial de HPLC, se añaden 25 j l de fórmula de nanopartículas lipídicas a 185 j l de PBS 1X (PBS 10X (FISHER, BP399) diluida con agua desionizada hasta 1X). La dispersión se agita suavemente con vórtex hasta homogeneidad (dispersión 1). En otro vial de HPLC, se añaden 25 j l de fórmula de nanopartículas lipídicas a 185 j l de TRITON-X al 20%. La dispersión se somete a vórtice suavemente hasta que se vuelve transparente y homogénea (dispersión 2).

La cromatografía de exclusión por tamaño se realiza en un HPLC AGILENT 1200 usando el software EMPOWER PRO. Los parámetros son:

Se inyectan 20 j l de patrones y dispersiones en la columna de exclusión por tamaño, fase móvil PBS 1x con pH ajustado a 7,7 que fluye a 1 ml/min durante 30 minutos. El material eluido es detectado por un detector UV con una longitud de onda de absorción de 260 nm.

De los patrones de ARNip, el pico a ~17 minutos representa el ARNip. De la dispersión 1, el pico a ~10 minutos representa la nanopartícula lipídica que contiene el ARNip encapsulado, y el pico a ~17 minutos representa el ARNip no encapsulado (es decir, libre).

En la dispersión 2, TRITON-X destruye la nanopartícula lipídica, lo que permite que el ARNip previamente encapsulado eluya junto con el ARNip ya libre a los 17 minutos. El pico a ~10 minutos desaparece, y sólo queda un pico en el cromatograma, es decir, el pico a los ~17 minutos, que representa tanto el ARNip no encapsulado (es decir, libre) como el ARNip recientemente libre. ARNip libre ARNip recientemente libre = ARNip total.

Los valores de área de pico obtenidos de los patrones de ARNip se usan para crear la curva de calibración de concentración de ARNip. El área integrada del pico a ~17 minutos en la dispersión 1 se inserta en la ecuación proporcionada por la curva de calibración para el ARNip libre para obtener la concentración del ARNip libre en la dispersión. A continuación, la concentración encontrada de la muestra se multiplica por la magnitud de la dilución para obtener el ARNip libre en la formulación de nanopartículas lipídicas.

El área integrada del pico a ~17 minutos en la dispersión 2 se inserta en la ecuación proporcionada por la curva de calibración para ARNip libre para obtener la concentración del ARNip total en la dispersión. A continuación, la concentración encontrada de la muestra se multiplica por la magnitud de la dilución para obtener el ARNip total en la formulación de nanopartículas lipídicas.

6.2.9 Análisis de partículas

El tamaño y la polidispersidad de las nanopartículas lipídicas de ARNip se analizan usando un Zetasizer Nano ZS de Malvern Instruments. Para ARNip formulado a una concentración de ARNip encapsulado de > 1 mg/ml, diluya 5 |jl de muestra con 115 j l de PBS 1x. Añada a una microcubeta desechable de pequeño volumen. Inserte la cubeta en el Zetasizer Nano ZS. Para la configuración de la máquina, establezca que el material sea látex de poliestireno, el dispersante sea agua, y la celda sea ZEN040. Mida la muestra a 25°C sin tiempo de espera. Registre Z-Ave (establecido como diámetro, en unidades nanométricas) y el índice de polidispersidad (PDI).

En la Tabla 5 se muestran los resultados obtenidos para las combinaciones de ARNip y nanopartículas lipídicas usando los procedimientos descritos anteriormente. Los porcentajes de encapsulamiento se determinaron usando el método de SEC.

Tabla 5. Resultados del encapsulamiento de nanopartículas lipídicas de ARNip

6.3 Ejemplo 2 de Procedimiento Efecto de la dilución

Usando el sistema sustancialmente como se muestra en la FIG. 2, dos corrientes de ácidos nucleicos acuosas con concentraciones de 0,45 mg/ml de ARNip SEQ ID NO: 1, NaCl 100 mM, y citrato de sodio 25 mM a un pH de 5 se introdujeron desde direcciones opuestas en una cámara de mezclamiento en forma de cruz que tenía conductos con diámetros internos de 0,5 mm con caudales de 40 ml/min cada uno. Simultáneamente, se introdujo una corriente de lípido en la cámara de mezclamiento en forma de cruz desde una dirección ortogonal a las dos corrientes de ácido nucleico a un caudal de 40 ml/min. La corriente de lípido estaba formada por 45% de lípido catiónico Al, 44% de colesterol, 9% de DSPC, y 2% de PEG-lípido B1 en etanol. La concentración total de lípidos fue 16,7 mg/ml. En un experimento, la corriente mezclada de la cámara de mezclamiento en forma de cruz se sometió a una etapa de dilución con agua usando una cámara en forma de T (diámetro interno de 1,0 mm) análoga a la cámara 54 en la FIG. 2. El agua se introdujo en la cámara en forma de T a un caudal de 40 ml/min. Se recogió la disolución resultante, y se analizó el tamaño y la uniformidad de las nanopartículas de ácido nucleico encapsuladas, con los resultados que se muestran en la entrada 1 en la Tabla 6. La disolución obtenida de la entrada 1 incluyó etanol al 25% en volumen, 0,23 mg/ml del ARNip, 4,2 mg/ml de los lípidos, y NaCl 50 mM. En un experimento separado que usa las mismas concentraciones, caudales, y cámara de mezclamiento inicial en forma de cruz, las corrientes mezcladas de la cámara de mezclamiento se diluyeron en un volumen de agua equivalente al volumen de dilución usado en la entrada 1. Estos resultados se muestran en la entrada 2 en la Tabla 6. Las concentraciones de la disolución recolectada fueron las mismas que en la entrada 1. A modo de comparación, se realizó otro experimento en las mismas condiciones de procedimiento pero sin ninguna etapa de dilución. Los resultados de este ejemplo comparativo se muestran en la entrada 3 en la Tabla 6. Sin ninguna etapa de dilución, la disolución recogida en la entrada 3 incluía etanol al 33%, 0,3 mg/ml de ARNip, 5,6 mg/ml de lípidos, y NaCl 66 mM. Z-Avg, #-Avg, y PDI para las entradas 1 y 2 fueron menores que la entrada 3, que carecía de la etapa de dilución. Z-Avg, #-Avg, y PDI en la Tabla se determinaron 60 minutos después del mezclamiento.

Tabla 6

Usando el mismo procedimiento y mezcla de lípidos que se describe para la entrada 1 en la Tabla 6, pero con el ARNip SEQ ID NO. 3, se produjeron las nanopartículas lipídicas de tamaño uniforme que se muestran en la FIG. 4a. Sustituyendo la cámara de mezclamiento en forma de cruz por la cámara de mezclamiento en forma de T de la FIG. 3a (0,5 mm de diámetro interno; que está fuera del alcance de la invención), al tiempo que se aumenta la concentración de ARNip SEQ ID. NO: 3 a 0,9 mg/ml, a un caudal de 40 mg/ml (la misma cantidad total de ARNip en la mitad del volumen), se produjeron nanopartículas lipídicas de tamaño menos uniforme como se muestra en la FIG. 4b. En el Ejemplo 4 de Procedimiento se describen procedimientos análogos que usan una cámara de mezclamiento en forma de T y ARNip a 0,9 mg/ml.

- 6.4 Ejemplo 3 de Procedimiento Efecto de caudales, velocidades, y concentraciones de disolución

En una serie de experimentos que usan una cámara de mezclamiento en forma de T análoga a la que se muestra en la FIG. 3a y que tiene un diámetro interno de 0,5 mm, se mezclaron una sola corriente de ácido nucleico y una sola corriente de lípido a diversos caudales/velocidades y concentraciones. Las corrientes de ácido nucleico y de lípido incluían los mismos constituyentes como se describieron anteriormente en el Ejemplo 2 de Procedimiento. No se usó ninguna etapa de dilución en estos ejemplos ya que las concentraciones iniciales de ARNip se ajustaron para obtener una concentración de disolución final igual a la entrada 1 en la Tabla 6. La concentración de lípidos en etanol en estos experimentos fue 16,7 mg/ml (1x) o 25 mg/ml (1,5x). Los resultados se muestran en la Tabla 7 a continuación, con Z-Avg, #-Avg, y PDI determinados 60 minutos después del mezclamiento.

Tabla 7

- 6.5 Ejemplo 4 de Procedimiento Efecto de caudales y velocidades

En una serie de experimentos que usan una cámara de mezclamiento en forma de T análoga a la que se muestra en la FIG. 3a (un diámetro interno de 0,5 mm) y usada en el Ejemplo 3 de Procedimiento, se mezclaron una sola corriente de ácido nucleico y una sola corriente de lípido desde direcciones opuestas a diversos caudales/velocidades lineales, y posteriormente se diluyeron con agua a un tubo de dilución en T de 1 mm de diámetro interno, como se muestra en general en la FIG. 2. El ARNip SEQ ID NO. 4, el lípido catiónico A1, el PEG lípido B1, el colesterol, y DSPC se usaron en el Ejemplo 4 de Procedimiento en las cantidades descritas anteriormente. La concentración total de lípidos en la corriente de etanol fue 16,7 mg/ml. La concentración de ARNip en la corriente de ácido nucleico fue 0,9 mg/ml. Los resultados de la Tabla 8 muestran que el aumento de la velocidad lineal disminuye el tamaño de partículas y el PDI.

Tabla 8

* 6.6 Ejemplo 5 de Procedimiento Efecto de la orientación de la cámara de mezclamiento en forma de T

La Tabla 9 muestra los resultados de dos experimentos que usan una cámara de mezclamiento alternativa (diámetro interno de 0,5 mm) análoga a la que se muestra en la FIG. 3c. En la entrada 1 se muestran los resultados obtenidos, en la que entra el ARNip desde la rama, y en la entrada 2 se muestran los resultados obtenidos, en la que entran los lípidos desde la rama. Para ambos experimentos, el ARNip y los lípidos fueron los mismos que los descritos anteriormente en el Ejemplo 2 de Procedimiento. El caudal de las corrientes de ARNip fue 120 ml/min, y caudal de las corrientes de lípido fue 40 ml/min. La concentración de ARNip fue 0,3 mg/ml en una disolución amortiguadora que contenía NaCl 66 mM. La concentración de los lípidos fue 16,7 mg/ml. Z-Avg, #-Avg, y PDI se determinaron 60 minutos después del mezclamiento.

Tabla 9

6.7 Ejemplo 6 de Procedimiento Efecto de las configuraciones de la cámara de mezclamiento

Se realizaron una serie de experimentos usando cámaras de mezclamiento que tenían diversas configuraciones de corrientes de ácido nucleico y lípidos, oscilando el número total de corrientes de 3 a 6. En cada caso, la cámara de mezclamiento tenía una cámara de 1 mm de diámetro interno, y las caudales se ajustaron para mantener el flujo combinado de 240 ml/min para las corrientes de ARNip y 80 ml/min para las corrientes de lípido. La concentración de ARNip en estos experimentos fue 0,3 mg/ml, y la concentración de lípidos fue 16,7 mg/ml. La velocidad lineal de las corrientes de ARNip combinadas fue 5,1 metros/segundo. La velocidad lineal de las corrientes lipídicas combinadas fue 1.7 metros/segundo. Cuando el número de flujos permite más de una disposición de corrientes, la Tabla 10 indica el ángulo entre las corrientes de lípido o de ARNip. Por ejemplo, en el caso de tres corrientes de lípido y tres corrientes de ARNip, cada corriente de lípido está separada de la siguiente corrientes de lípido por 60 grados (es decir, 3 corrientes de lípido adyacentes) o 120 grados (es decir, corrientes de lípido separadas por 120 grados con corrientes de ARNip intermedias, también separadas por 120 grados). Para los resultados experimentales resumidos en la Tabla 10, ARNip SEQ ID NO. 5 se usó con lípido catiónico A4, DSPC, colesterol, y Pe G lípido B1, en una relación de 45:9:44:2. Los resultados que se muestran en la Tabla 10 indican que se obtienen sustancialmente los mismos resultados para las diversas configuraciones de mezclamiento en las que los caudales/velocidades totales permanecieron constantes.

Tabla 10.

6.8 Ejemplo 7 de Procedimiento Encapsulamiento de ARNm

6.8.1 Materiales y reactivos

Tabla 11 Materiales y reactivos generales para el encapsulamiento de ARNm de leptina en nanopartículas lipídicas

TEV-hLeptina-GAopt-2xhBG-120A (SEQ ID NO: 6)

Elementos de secuencia:

UTR 5' del virus del grabado del tabaco (TEV): 14-154

Secuencia de Kozak óptima: 155-163

Aminoácidos 1-167 que codifican la leptina humana del n.° de referencia de proteínas NP_000221, codón de secuencia optimizado por GeneArt: 164-664

2 codones de parada: 665-670

2 copias de 3'UTR de beta-globina humana: 689-954

Cola de poliA de 120 nucleótidos: 961-1080

6.8.2 Preparación de mezcla de lípidos en etanol.

El siguiente es un ejemplo de ARNm encapsulado en una relación molar de amina lipídica catiónica a fosfato de ARNm (N:P) de 4:1. Los lípidos (lípido catiónico, DSPC, colesterol y PEG lipidado) se disuelven en etanol. Las relaciones molares de lípidos son 40:10:48:2, respectivamente. Por ejemplo, en la Tabla 12 están las cantidades y concentraciones finales de todos los componentes para un volumen de 63 ml de lípidos en etanol. El volumen de 63 ml representa 1,05 veces el volumen necesario para garantizar que el volumen diana esté disponible para cargar en la jeringa. La mezcla se pesa y se coloca en una botella estéril de 125 ml de tereftalato de polietileno modificado con glicol (PETG), y se añade etanol. La mezcla se trató con ultrasonidos brevemente, se agitó suavemente durante 5 minutos y se mantuvo a 37 °C hasta su uso.

Tabla 12 Componentes de la mezcla de lípidos

6.8.3 Preparación de ARNm en amortiguador de citrato

Primero se confirma que el pH del amortiguador de citrato es 6,00. Si no es así, el pH se ajusta antes de proceder. Se descongela del almacenamiento a -80°C suficiente ARNm en agua para el encapsulamiento, y se cambia de agua a amortiguador de citrato pH 6,0 mediante el uso de concentradores centrífugos Amicon Ultra-15. Se pueden cargar entre 10 y 12 mg de ARNm en cada concentrador, que se centrifuga durante 5 minutos a 4000 rpm a 4°C. Se aumenta el volumen mediante adición de amortiguador de citrato pH 6,0. Se recomienda un intercambio de >10 volúmenes con amortiguador de citrato pH 6,0 para lograr la condición de amortiguador deseada. La concentración del ARNm se mide por densidad óptica a 260 nm en un espectrofotómetro UV. La concentración final del ARNm se ajusta a 0,25 mg/ml en 126 ml de amortiguador de citrato en una botella de PETG estéril de 250 ml, y se mantiene a temperatura ambiente hasta su uso. El volumen de 126 ml representa 1,05 veces el volumen necesario para garantizar que el volumen diana esté disponible para cargar en la jeringa.

6.8.4 Encapsulamiento de ARNm en nanopartículas lipídicas

El encapsulamiento del ARNm se lleva a cabo usando un sistema como se muestra generalmente en la FIG. 2. Las jeringas estériles de 60 ml se cargan con un volumen igual (60 ml) de lípidos en etanol (jeringa (a)), ARNm en amortiguador de citrato (jeringas (b1) y (b2)), y amortiguador de citrato solo (jeringa (c)). El tubo que sale de los racores Luer de la jeringa (a) que contiene lípidos se une a la entrada central de una unión en cruz con un diámetro interno de 0,5 mm. Los tubos que salen de los racores Luer de las jeringas (b1) y (b2) que contienen ARNm a 0,25 mg/ml se conectan a las entradas laterales de la unión en cruz. El tubo es un tubo de PTFE con un diámetro interno de 0,8 mm. Las jeringas (a), (b1) y (b2) se instalan en la bomba de jeringa A. El tubo que sale de la entrada central de la cruz opuesta a la entrada de lípidos se conecta a una unión en T (véase, por ejemplo, FIG. 2, unión en T 54). El tubo que sale de un racor Luer en la jeringa (c) que contiene amortiguador de citrato solo se conecta a la unión en T para permitir la dilución en línea de las nanopartículas lipídicas de ARNm, y la jeringa (c) se instala en la bomba de jeringa B. Tenga la línea de salida de la unión en T colocada sobre una botella de PETG estéril de 500 ml para la recolección de las nanopartículas lipídicas de ARNm diluidas. Es importante asegurarse de que todos los racores estén apretados en las jeringas. En este experimento piloto no optimizado, las bombas de jeringa se configuraron según el fabricante y el tamaño de jeringa adecuados (BD, Plastipak, 60 ml) y un caudal de hasta 16 ml por minuto. Ponga en funcionamiento ambas bombas simultáneamente, y comience a recolectar material después de aproximadamente 0,5 segundos. Se recogerán aproximadamente 220-230 ml de nanopartículas lipídicas de ARNm encapsuladas.

6.8.5 Dilución de nanopartículas lipídicas de ARNm

Use una jeringa de 140 ml para aspirar 135 ml de la suspensión de nanopartículas lipídicas de ARNm. Transfiera los 85 95 ml restantes a una segunda jeringa de 140 ml. Prepare jeringas de 140 ml con los mismos volúmenes de amortiguador de citrato. Se monta otra unión en T para otra dilución de la suspensión de nanopartículas lipídicas de ARNm. Esta etapa de dilución se ejecuta con ambas jeringas en una sola bomba de jeringa. Las jeringas de 140 ml con volúmenes de 135 ml (una que contiene nanopartículas lipídicas, y la otra que contiene amortiguador de citrato) se procesan primero, y las jeringas de 140 ml con volúmenes más pequeños se procesan en segundo lugar. Es importante asegurarse de que todos los racores estén apretados en las jeringas. Para la primera ejecución, cambie la configuración de la bomba de jeringa al tamaño y fabricante correctos (140 ml, Sherwood-Monoject). El caudal se ajusta a 25 ml por minuto. Recoja la suspensión de nanopartículas lipídicas de ARNm diluida en botellas de PETG estériles de 500 ml. El volumen final será aproximadamente 440-460 ml.

6.8.6 Diálisis y concentración de nanopartículas lipídicas de ARNm por filtración de flujo tangencial

Por cada 15 mg de ARNm en el experimento de encapsulamiento, use un cartucho Vivaflow 50. Para un experimento de encapsulamiento de ARNm de 30 mg, use 2 cartuchos Vivaflow 50 conectados en serie. Los cartuchos de celulosa regenerados primero deben estar libres de pirógenos. Este procedimiento debe iniciarse el día anterior al encapsulamiento. Usando un sistema Minimate TFF, configure dos cartuchos Vivaflow 50 en serie y conecte la tubería. Cargue 500 ml de agua libre de nucleasas y libre de pirógenos en el depósito, y hágala pasar a través de los cartuchos a una presión de 20 psi. Cargue 100 ml de NaOH 0,1 M/NaCl 1,0 M en el depósito, y haga pasar 50 ml a través de los cartuchos. Deje reposar los 50 ml restantes en los cartuchos durante la noche. A la mañana siguiente, haga pasar los 50 ml restantes a través de los cartuchos a 20 psi. Cargue más agua libre de nucleasas y libre de pirógenos en el depósito, y haga pasar 50 ml a través de los cartuchos. Repita este lavado con agua dos veces más. Evalúe una alícuota del último enjuague con agua para detectar endotoxina y asegurarse de que esté por debajo de las cantidades detectables.

Cargue la suspensión de nanopartículas lipídicas de ARNm en el depósito Minimate TFF. Concentre la mezcla mientras mantiene una presión general de 20-25 psi. El filtrado debe eluir a aproximadamente 4 ml por minuto para comenzar, pero se ralentizará la velocidad. Concentre hasta que el nivel de líquido en el depósito esté en la graduación de 40 ml. Diafiltre la suspensión concentrada de nanopartículas lipídicas de ARNm frente a 300 ml de PBS 1x libre de pirógenos y nucleasas. Mantenga la presión de 20-25 psi. Después de la diafiltración, reanude la concentración del material justo por debajo de la marca de graduación de 10 ml en el depósito. Recoja la suspensión de nanopartículas lipídicas de ARNm del depósito. Es posible enjuagar el sistema TFF con 5 ml adicionales de PBS 1x y recolectar este lavado que contiene la suspensión de nanopartículas lipídicas de ARNm diluida, pero este lavado debe recolectarse por separado de la suspensión de nanopartículas lipídicas de ARNm concentrada. Almacene los materiales a 4°C hasta el análisis.

6.8.7 Porcentaje de encapsulamiento determinado en un formato de ensayo de placa de 384 pocilios

Para determinar la eficacia de la formulación de ARNm en nanopartículas lipídicas, se mide el porcentaje de encapsulamiento del ARNm usando un kit de ensayo de ARN Quant-IT ribogreen de Life Technologies. La suspensión de nanopartículas lipídicas de ARNm se analiza en amortiguador de TE libre de nucleasas para determinar la concentración de ARNm fuera de las nanopartículas lipídicas, y también se analiza en amortiguador de TE más detergente Triton X-100 al 0,75% para separar las nanopartículas lipídicas y determinar la concentración de ARNm en toda la suspensión de nanopartículas lipídicas. La relación de las dos concentraciones se usa para calcular el porcentaje de encapsulamiento.

Tanto en el amortiguador de TE como en el amortiguador de TE más el detergente Triton X-100 al 0,75%, prepare una disolución de ARN de 1000 ng/ml a partir del ARN patrón de lote de 100 |jg/ml proporcionado en el kit. Use este lote para generar curvas patrón tanto en el amortiguador de TE como en el amortiguador de TE más detergente Triton X-100 al 0,75% según la Tabla 13.

Tabla 13 Curva patrón para el kit de ensayo Quant-IT ribogreen

Prepare con cuidado muestras de nanopartículas lipídicas de ARNm tanto en amortiguador de TE como en amortiguador de Te más detergente Triton X-100 al 0,75% usando diluciones que oscilan de 400-2.000 veces. Para diluciones de dos etapas, asegúrese de realizar la primera etapa en PBS, en lugar de en TE o TE más Triton. Obtenga dos conjuntos de diluciones para cada muestra en cada condición de amortiguador, y analice cada conjunto de diluciones por triplicado para un total de 6 pocillos por condición de amortiguador por muestra de nanopartículas lipídicas de ARNm. Obtenga la curva patrón y las muestras de nanopartículas lipídicas de ARNm diluidas en 96 placas de pocillos profundos, asegurando un mezclamiento completo de las muestras a medida que se preparan. Se pueden preparar volúmenes más grandes de la curva patrón y almacenarlos en una placa sellada de 96 pocillos profundos a 4°C durante un máximo de 3 días para su uso posterior.

Añada 40 j l de patrones y muestras por pocillo a una placa de ensayo negra de 384 pocillos (Costar no tratada, #3573). Use una pipeta multicanal automatizada de 250 j l para aspirar 85 j l de la curva patrón, y dispense 40 j l en dos pocillos de la placa de ensayo. Aspire 125 j l de cada muestra diluida de nanopartículas lipídicas de ARNm, y dispense 40 j l en tres pocillos de la placa de ensayo.

Diluya el reactivo ribogreen del kit 240 veces en amortiguador de TE, y añada 60 j l a cada pocillo de la placa de ensayo. Use una pipeta multicanal automatizada de 125 j l para aspirar 125 j l de reactivo ribogreen diluido, y dispense 60 j l en cada pocillo de la curva patrón para cambiar las puntas entre las muestras de curva patrón de TE y T^emás detergente. Cambie las puntas entre cada muestra de nanopartículas lipídicas de ARNm diluida.

Mezcle las muestras en los pocilios pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Esto se puede hacer, por ejemplo, colocando la placa de ensayo negra de 384 pocillos en un robot Biomek FX y usando puntas XL de 30 μl. Después de mezclar, mida la fluorescencia usando un lector de microplacas de fluorescencia con excitación a 480 nm y emisión a 520 nm.

Reste el valor de fluorescencia del blanco de reactivo del valor de fluorescencia de cada muestra de ARN para generar una curva patrón de fluorescencia frente a la concentración de ARN para las condiciones de TE y TE más Triton X-100. Reste el valor de fluorescencia del blanco de reactivo del de cada una de las muestras, y después determine la concentración de ARN de cada una de las muestras a partir de la curva patrón apropiada. Determine el porcentaje de encapsulamiento de la muestra dividiendo la diferencia de concentraciones entre la muestra en TE más Triton X-100 y la muestra en amortiguador de TE solo entre la concentración de la muestra en TE más detergente Triton X-100.

6.8.8 Análisis de partículas

Las nanopartículas lipídicas de ARNm se analizan en tamaño y polidispersidad usando un Zetasizer Nano ZS de Malvern Instruments. Para ARNm formulado a una concentración de ARNm encapsulado de > 1 mg/ml, diluya 5 μl de muestra con 115 μl de PBS 1x. Añada a una microcubeta desechable de pequeño volumen (Brand, 9759200). Inserte la cubeta en el Zetasizer Nano ZS. Para la configuración de la máquina, establezca que el material sea látex de poliestireno, el dispersante sea agua, y la celda sea ZEN040. Mida la muestra a 25°C sin tiempo de espera. Registre Z-Ave (establecido como diámetro, en unidades nanométricas) y el índice de polidispersidad (PDI).

Tabla 14 Resultados del encapsulamiento de ARNm de leptina en (9Z.9'Z.12Z, 12'Z)-bis(octadeca-9,12-dienoato) de 2-(((1,3-dimetilpirrolidina-3-carbonil)oxi)metil)propano-1,3-diílo

La descripción anterior de los ejemplos y realizaciones de la invención es meramente de naturaleza ejemplar, y de este modo, las variaciones de los mismos no deben considerarse como una desviación del alcance de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para encapsular un ácido nucleico en un hospedante de nanopartícula lipídica para proporcionar una nanopartícula de ácido nucleico encapsulada, comprendiendo el método:

proporcionar dos corrientes de ácido nucleico, comprendiendo cada una de las dos corrientes de ácido nucleico una mezcla de un ácido nucleico en una primera disolución acuosa, y que tienen una velocidad lineal combinada mayor o igual a 1,5 metros/segundo;

proporcionar una corriente de lípido, comprendiendo la una corriente de lípido una mezcla de uno o más lípidos en un disolvente orgánico, y que tiene una velocidad lineal mayor o igual a 1,5 metros/segundo;

mezclar la una corriente de lípido con las dos corrientes de ácido nucleico en un primer punto de intersección configurado como un conector en cruz, en el que las dos corrientes de ácido nucleico entran en el conector en cruz desde direcciones opuestas a 180° entre sí, y la una corriente de lípido entra en el conector en cruz a 90° con respecto a las dos corrientes de ácido nucleico para proporcionar una primera corriente mixta;

hacer fluir la primera corriente mixta en una primera dirección fuera del conector en cruz sustancialmente en la misma dirección que la una corriente de lípido y 90° con respecto a los dos ácidos nucleicos; y

mezclar los componentes de la primera corriente mixta para proporcionar una primera disolución de salida que comprende la nanopartícula de ácido nucleico encapsulada;

en el que la primera disolución acuosa y el disolvente orgánico son miscibles, uno de la primera disolución acuosa o el disolvente orgánico contiene un amortiguador, y la concentración del disolvente orgánico en la primera disolución de salida es menor que 33%.

2. El método de la reivindicación 1, donde:

la primera disolución acuosa es una primera disolución amortiguadora que comprende una disolución acuosa de una sal de metal alcalino; y

el disolvente orgánico comprende un disolvente alcohólico.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, que comprende además:

diluir la primera corriente mixta con un disolvente de dilución seleccionado de una segunda disolución amortiguadora y agua, para proporcionar la primera corriente de salida.

4. El método de la reivindicación 3, donde:

la sal de metal alcalino se selecciona de uno o más de NaCl y citrato de sodio; y

el disolvente orgánico comprende etanol.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que:

la concentración del disolvente orgánico en la primera disolución de salida está entre 20 y 25%.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que:

la velocidad lineal de la una corriente de lípido está entre 1,5 y 4,5 metros/segundo; y

la velocidad lineal combinada de las dos corrientes de ácido nucleico está entre 3 y 14 metros/segundo.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3-6, en el que:

la velocidad lineal de la una corriente de lípido está entre 3 y 4 metros/segundo; y

la velocidad lineal combinada de las dos corrientes de ácido nucleico está entre 9 y 14 metros/segundo.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2-6, en el que la dilución de la primera corriente mixta con un disolvente de dilución comprende:

proporcionar una corriente de dilución, comprendiendo la corriente de dilución un disolvente acuoso seleccionado de una segunda disolución amortiguadora y agua; y

unir la primera corriente mixta con la corriente de dilución para proporcionar la primera corriente de salida;

en el que la velocidad lineal de la corriente de lípido está entre 3 y 4 metros/segundo; y la velocidad lineal combinada de las dos corrientes de ácido nucleico está entre 6 y 8 metros/segundo.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que comprende además incubar la primera disolución de salida para proporcionar una primera disolución de salida incubada.

10. El método de la reivindicación 9, que comprende además:

diluir la primera disolución de salida incubada con un segundo disolvente de dilución seleccionado de una tercera disolución amortiguadora y agua, para proporcionar una segunda disolución de salida; y

concentrar y dializar la segunda disolución de salida.

11. El método de la reivindicación 10, en el que la concentración comprende concentrar mediante filtración de flujo tangencial.

12. El método de la reivindicación 10 u 11, que comprende además filtrar de forma estéril la disolución dializada concentrada.

13. EI método de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que el ácido nucleico es un ARNip.

14. EI método de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que el ácido nucleico es un ARNm.

15. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en el que el hospedante de nanopartícula lipídica comprende uno o más de los lípidos seleccionados de bis(decanoato) de ((5-((dimetilamino)metil)-1,3-fenileno)bis(oxi))bis(octano-8,1-diílo); (9Z,9'Z, 12Z, 12'Z)-bis(octadeca-9,12-dienoato) de 2-((4-(((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)hexadecanoil)oxi)propano-1,3-diílo; (9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienoato de 3-((4,4-bis(octiloxi)butanoil)oxi)-2-((((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)metil)propilo; (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-bis(octadeca-9,12-dienoato) de ((5-((dimetilamino)metil)-1,3-fenileno)bis(oxi))bis(butano-4,1-diílo); PEG-dim i ri sti l gl i cerol; (158-hidroxi-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78,81,84,87,90,93,96,99,102,105,108,111,11 4,117,120,123,126,129,132,135,138,141,144,147,150,153,156-dopentacontaoxaoctapentacontahectil)carbamato de 2,3-bis(tetradeciloxi)propilo.

16. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-15, en el que la nanopartícula de ácido nucleico encapsulada tiene un diámetro de tamaño de partícula promedio de 30 nm a 80 nm.

17. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en el que la nanopartícula de ácido nucleico encapsulada tiene un diámetro de tamaño de partícula promedio de 40 nm a 70 nm y un índice de polidispersidad menor que 0,1 determinado por dispersión de luz dinámica.

18. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-17, en el que la relación en masa de lípidos:ácido nucleico es 15-20:1.

19. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-18, en el que la concentración de ácido nucleico en las dos corrientes de ácido nucleico es 0,1 a 1,5 mg/ml, y la concentración de lípidos en una corriente de lípido es 10 a 25 mg/ml.

20. El método de cualquiera de las reivindicaciones 9-19, en el que la concentración de etanol en la segunda disolución de salida es 10-15%.

21. El método de cualquiera de las reivindicaciones 8-20, en el que la unión de la primera corriente mixta con la corriente de dilución comprende la intersección de la primera corriente mixta con la corriente de dilución desde 90° con respecto a la dirección de la primera corriente mixta.

22. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-21, en el que más del 90% del ácido nucleico de las dos corrientes de ácido nucleico está encapsulado en la primera disolución de salida.

23. Una composición de nanopartícula de ácido nucleico encapsulada, que comprende:

un vehículo farmacéuticamente aceptable; y

una nanopartícula de ácido nucleico encapsulada, comprendiendo la nanopartícula de ácido nucleico encapsulada un hospedante de nanopartícula lipídica y un ácido nucleico, estando el ácido nucleico encapsulado en el hospedante de nanopartícula lipídica;

en la que la nanopartícula de ácido nucleico encapsulada tiene un tamaño de partícula promedio de 40 nm a 70 nm y un índice de polidispersidad menor que 0,1 según lo determinado por dispersión de luz dinámica; y

en la que la relación de hospedante de nanopartícula lipídica a ácido nucleico es 18,5: 1.

24. La composición de la reivindicación 23, en la que el hospedante de nanopartícula lipídica comprende un lípido catiónico degradable, un polietilenglicol lipidado, colesterol, y 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina.