ES2828739T3 - Anticuerpos que se unen a la proteína tirosina fosfatasa beta humana (HPTP-beta) y sus usos - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en oclusión venosa, retinopatía diabética, degeneración macular y desprendimiento crónico de retina, que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y un anticuerpo monoclonal aislado que se une a la proteína tirosina fosfatasa beta humana (HPTPβ), en donde el anticuerpo monoclonal aislado se une al dominio extracelular de HPTPβ, en donde el anticuerpo monoclonal aislado es un anticuerpo monoclonal intacto producido por la línea celular de hibridoma ATCC Núm. PTA-7580, o una forma humanizada del mismo.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos que se unen a la proteína tirosina fosfatasa beta humana (HPTP-beta) y sus usos

Campo de la invención

Esta invención se refiere a anticuerpos y a fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a la proteína tirosina fosfatasa beta humana (HPTPbeta) y sus usos.

Antecedentes de la invención

La angiogénesis, el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos a partir de la vasculatura preexistente, juega un papel importante en una amplia gama de procesos fisiológicos y patológicos (Nguyen, LL y otros, Int. Rev. Cytol., 204, 1-48, (2001)). La angiogénesis es un proceso complejo, mediado por la comunicación entre las células endoteliales que recubren los vasos sanguíneos y su entorno circundante. En las primeras etapas de la angiogénesis, las células del tejido o tumorales producen y secretan factores de crecimiento proangiogénicos en respuesta a estímulos ambientales como la hipoxia. Estos factores se difunden a las células endoteliales cercanas y estimulan los receptores que conducen a la producción y secreción de proteasas que degradan la matriz extracelular circundante. Las células endoteliales activadas comienzan a migrar y proliferar en el tejido circundante hacia la fuente de estos factores de crecimiento (Bussolino, F., Trends Biochem. Sci., 22, 251-256, (1997)). Las células endoteliales dejan de proliferar y se diferencian en estructuras tubulares, que es el primer paso en la formación de vasos sanguíneos maduros y estables. Posteriormente, las células periendoteliales, como los pericitos y las células del músculo liso, se incorporan al vaso recién formado en un paso adicional hacia la maduración del vaso.

La angiogénesis está regulada por un equilibrio de factores proangiogénicos y anti-angiogénicos que ocurren naturalmente. El factor de crecimiento del endotelio vascular, el factor de crecimiento de fibroblastos y la angiopoyetina representan algunos de los muchos factores de crecimiento proangiogénicos potenciales. Estos ligandos se unen a sus respectivos receptores tirosina quinasas en la superficie de la célula endotelial y transducen señales que promueven la migración y proliferación celular. Si bien se han identificado muchos factores reguladores, los mecanismos moleculares que impulsan este proceso aún no se comprenden completamente.

Hay muchos estados patológicos provocados por una angiogénesis persistente no regulada o regulada incorrectamente. En tales estados de enfermedad, la angiogénesis no regulada o regulada incorrectamente puede causar una enfermedad particular o exacerbar una condición patológica existente. Por ejemplo, la neovascularización ocular se ha implicado como la causa más común de ceguera y subyace en la patología de aproximadamente 20 enfermedades oculares. En ciertas condiciones previamente existentes, como la artritis, los vasos sanguíneos capilares recién formados invaden las articulaciones y destruyen el cartílago. En la diabetes, los nuevos capilares formados en la retina invaden el humor vítreo, provocando hemorragia y ceguera.

Tanto el crecimiento como la metástasis de los tumores sólidos también pueden ser dependientes de la angiogénesis, Folkman y otros "Tumor Angiogenesis", Capítulo 10, 206-32, en The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn y otros, Editorial, W.B. Saunders, (1995). Se demostró que los tumores que se agrandan a más de 2 mm de diámetro deben obtener su propio suministro de sangre y lo hacen induciendo el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos capilares. Después de que estos nuevos vasos sanguíneos se incrustan en el tumor, proporcionan nutrientes y factores de crecimiento esenciales para el crecimiento del tumor, así como un medio para que las células tumorales entren en la circulación y hagan metástasis en sitios distantes, como el hígado, los pulmones o los huesos (Weidner, New Eng. J. Med., 324, 1, 1-8 (1991)). Cuando se usan como fármacos en animales portadores de tumores, los inhibidores naturales de la angiogénesis pueden prevenir el crecimiento de tumores pequeños (O'Reilly y otros, Cell, 79, 315-28 (1994)). En algunos protocolos, la aplicación de tales inhibidores conduce a la regresión y latencia del tumor incluso después de la interrupción del tratamiento (O'Reilly y otros, Cell, 88, 277-85 (1997)). Además, el suministro de inhibidores de la angiogénesis a ciertos tumores puede potenciar su respuesta a otros regímenes terapéuticos (véase, por ejemplo, Teischer y otros, Int. J. Cancer, 57, 920-25 (1994)).

Aunque muchos estados patológicos son estimulados por la angiogénesis persistente no regulada o regulada incorrectamente, algunos estados patológicos pueden tratarse aumentando la angiogénesis. El crecimiento y la reparación de tejidos son eventos biológicos en los que se producen la proliferación celular y la angiogénesis. Por tanto, un aspecto importante de la reparación de heridas es la revascularización del tejido dañado mediante angiogénesis.

Las heridas crónicas que no se curan son una de las principales causas de morbilidad prolongada en la población humana anciana. Este es especialmente el caso de pacientes postrados en cama o diabéticos que desarrollan úlceras cutáneas graves que no cicatrizan. En muchos de estos casos, el retraso en la curación es el resultado de un suministro de sangre inadecuado, ya sea como resultado de una presión continua o de un bloqueo vascular. La mala circulación capilar debido a la aterosclerosis de las pequeñas arterias o la estasis venosa contribuye a la falla en la reparación del tejido dañado. Tales tejidos a menudo se infectan con microorganismos que proliferan sin ser atacados por los sistemas de defensa innatos del cuerpo que requieren tejido bien vascularizado para eliminar eficazmente los organismos patógenos. Como resultado, la mayoría de las intervenciones terapéuticas se centran en restaurar el flujo sanguíneo a los tejidos isquémicos, lo que permite que los nutrientes y los factores inmunológicos accedan al sitio de la herida.

Las lesiones ateroscleróticas en vasos grandes pueden causar isquemia tisular que podría mejorarse modulando el crecimiento de vasos sanguíneos en el tejido afectado. Por ejemplo, las lesiones ateroscleróticas en las arterias coronarias pueden causar angina e infarto del miocardio que podrían prevenirse si se pudiera restaurar el flujo sanguíneo estimulando el crecimiento de arterias colaterales. De manera similar, las lesiones ateroscleróticas en las arterias grandes que irrigan las piernas pueden causar isquemia en el músculo esquelético lo cual limita la movilidad y, en algunos casos, requiere amputación, lo cual también puede prevenirse mejorando el flujo sanguíneo con la terapia angiogénica.

Otras enfermedades como la diabetes y la hipertensión se caracterizan por una disminución en el número y densidad de vasos sanguíneos pequeños como arteriolas y capilares. Estos vasos sanguíneos pequeños son importantes para el suministro de oxígeno y nutrientes. Una disminución en el número y la densidad de estos vasos contribuye a las consecuencias adversas de la hipertensión y la diabetes, que incluyen claudicación, úlceras isquémicas, hipertensión acelerada e insuficiencia renal. Estos trastornos comunes y muchas otras dolencias menos comunes, como la enfermedad de Burgers, podrían mejorarse aumentando el número y la densidad de los vasos sanguíneos pequeños mediante la terapia angiogénica.

Por tanto, existe una necesidad continua de identificar reguladores de la angiogénesis.

En vista de lo anterior, existe la necesidad de identificar objetivos bioquímicos en el tratamiento de trastornos mediados por angiogénesis. Sin embargo, la angiogénesis implica la acción de múltiples factores de crecimiento y sus receptores tirosina quinasas afines (RTK), Yancopoulos y otros, Nature, 407, 242-248, 2000). El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), por ejemplo, es importante para la diferenciación de células endoteliales en nuevos vasos sanguíneos en la vasculatura embrionaria. Además, VEGF mejora el desarrollo de vasos sanguíneos en la vasculatura adulta. La administración de VEGF exógeno mejora el desarrollo de la vasculatura colateral y mejora el flujo sanguíneo a los tejidos isquémicos.

Hasta la fecha, se han identificado tres VEGF RTK, VEGFR1 (FLT-1), VEGFR2 (KDR) y VEGFR3 (FLT-4). Aunque estos receptores están muy conservados, según la caracterización bioquímica y la actividad biológica, cada uno tiene funciones específicas y no superpuestas. De los tres receptores, se cree que VEGFR2 desempeña el papel predominante en la mediación de las acciones de VEGF en la vasculatura en desarrollo y durante la angiogénesis en adultos. Sin embargo, tanto VEGFR1 como VEGFR3 son necesarios para el desarrollo normal de la vasculatura embrionaria y también pueden ser importantes para la angiogénesis en tejidos adultos. Después de la unión y dimerización de VEGF, un cambio conformacional en el dominio quinasa de VEGFR2 potencia su actividad quinasa dando como resultado la "autofosforilación" del otro miembro del par en residuos de tirosina específicos. Estos eventos de autofosforilación sirven para mejorar aún más la actividad quinasa y proporcionan puntos de anclaje para la asociación de moléculas de señalización intracelular.

Sin embargo, la activación de una única vía angiogénica puede no ser suficiente para producir vasos persistentes y funcionales que proporcionen una perfusión adecuada al tejido isquémico. Estos hallazgos, junto con el hecho de que múltiples RTK están involucradas en el ensamblaje de la vasculatura embrionaria, indican que los objetivos bioquímicos que modulan múltiples vías angiogénicas tendrán ventajas sobre la administración de un solo factor de crecimiento.

Las proteínas tirosina fosfatasas (PTP) comprenden una gran familia de enzimas estrechamente relacionadas que desfosforilan proteínas que contienen residuos de fosfotirosina. La evidencia reciente sugiere que una función de las PTP es limitar la fosforilación y activación de los RTK. Por ejemplo, se demostró que HCPTPA, una proteína tirosina fosfatasa de bajo peso molecular se asocia con VEGFR2 y regula negativamente su activación en células endoteliales cultivadas y su actividad biológica en ensayos de angiogénesis (Huang y otros, Journal of Biological Chemistry, 274.

38183-38185, 1999).

Además de VEGFR2, la señalización de entrada desde otro RTK. Tie-2, el receptor de las angiopoyetinas (Ang1 y Ang2), también es importante. La deleción del gen Ang1 o Tie-2 en ratones puede resultar en letalidad embrionaria secundaria a anomalías en la vasculatura en desarrollo (Yancopoulos y otros, Nature, 407, 242-248. 2000). Además, la sobreexpresión de Ang1 en la piel aumenta la vascularización de la piel y la administración de Ang1 exógena aumenta el flujo sanguíneo al músculo esquelético isquémico (Suri y otros, Science, 282, 468-471, 1998). Además, la inhibición de la activación de Tie-2 inhibe la angiogénesis y limita la progresión tumoral en modelos animales de cáncer (Lin y otros, J Clin. Invest., 100, 2072-2078, 1997). Además de sus actividades angiogénicas, la activación de Tie-2 mediante la administración exógena de Ang1 bloquea la fuga vascular mediada por VEGF y los efectos proinflamatorios, pero mejora sus efectos angiogénicos (Thurston y otros, Nature Medicine, 6, 460-463, 2000). Por lo tanto, los objetivos biológicos que modulan tanto la señalización de VEGFR2 como de Tie-2 pueden brindar terapias proangiogénicas o antiangiogénicas superiores.

Se sugirió la HPTPbeta (descrita por primera vez en Kruegar y otros, EMBO J., 9, (1990)) para modular la actividad del receptor de angiopoyetina de tipo tirosina quinasa Tie-2, por ejemplo, el documento WO00/65085). También se sugiere HPTPbeta para regular las actividades de VEGFR2, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Pub. Núm.

2004/0077065.

Sería conveniente desarrollar anticuerpos, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal humanizado, que regule selectivamente la actividad de HPTPbeta y, por lo tanto, mejore la señalización angiogénica, estimule el crecimiento de los vasos sanguíneos (angiogénesis) y/o aumente el flujo sanguíneo en el tejido isquémico, o reduzca la señalización angiogénica, reduzca el crecimiento de los vasos sanguíneos y/o disminuya el flujo sanguíneo al tejido afectado. En la presente descripción se describen anticuerpos y fragmentos de los mismos que se unen a HPTPbeta y regulan la señalización de células angiogénicas, que a su vez, regula la angiogénesis.

Resumen de la invención

La invención se define por las reivindicaciones. La presente invención proporciona una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en oclusión venosa, retinopatía diabética, degeneración macular y desprendimiento crónico de retina, que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y un anticuerpo monoclonal aislado que se une a la proteína tirosina fosfatasa beta humana (HPTPp), en donde el anticuerpo monoclonal aislado se une al dominio extracelular de HPTPp, en donde el anticuerpo monoclonal aislado es un anticuerpo monoclonal intacto producido por la línea celular de hibridoma ATCC Núm. PTA-7580, o una forma humanizada del mismo.

También se describen anticuerpos que se unen a la proteína tirosina fosfatasa beta humana HPTPbeta y de esa manera regulan la señalización de las células angiogénicas, que a su vez, regula la angiogénesis.

También se describe un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a la proteína tirosina fosfatasa beta humana, donde dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo regula la señalización de células angiogénicas, que a su vez, regula la angiogénesis.

También se describe un anticuerpo que se une a la porción del extremo N de la proteína tirosina fosfatasa beta humana.

También se describe un anticuerpo que se une a la primera repetición FN3 de la proteína tirosina fosfatasa beta humana.

También se describe un anticuerpo que se une a la primera repetición FN3 de la proteína tirosina fosfatasa beta humana, en donde la primera repetición FN3 de la proteína tirosina fosfatasa beta humana tiene la secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 11, o una porción de la misma.

También se describe un anticuerpo en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

También se describe un anticuerpo en donde el anticuerpo es el anticuerpo monoclonal R15E6 (hibridoma de ratón, células de bazo de Balbc (células B) depositadas con 30 American Type Culture Collection (ATCC), P.O. caja 1549. Manassas, VA 20108 Estados Unidos el 04 de mayo de 2006, asignado ATCC Núm. PTA-7580).

También se describe un anticuerpo que tiene las mismas, o sustancialmente las mismas, características biológicas de R15E6.

También se describe un anticuerpo, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno son humanizados. También se describe un anticuerpo, en donde el anticuerpo comprende residuos de la región de unión al antígeno del anticuerpo monoclonal R15E6 y es humanizado.

También se describe un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo, en donde el fragmento comprende regiones variables de cadena pesada y ligera.

También se describe un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo, en donde el fragmento de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste en un fragmento Fv, un fragmento Fab, un fragmento Fab' y un fragmento F(ab')2. También se describe un método para tratar un trastorno regulado por angiogénesis en un sujeto, que comprende: identificar un sujeto que necesita la regulación de la angiogénesis; y administrar al sujeto una cantidad efectiva de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a HPTPbeta y regula la angiogénesis.

También se describe un método para tratar un trastorno regulado por angiogénesis en un sujeto, en donde el trastorno regulado por angiogénesis es un trastorno de angiogénesis elevada, y se selecciona del grupo que consiste en retinopatía diabética, degeneración macular, cáncer, anemia falciforme, sarcoide, sífilis, pseudoxantoma elástico, enfermedad de Paget, oclusión de venas, oclusión de arterias, enfermedad carotídea obstructiva, uveítis/vitritis crónica, infecciones por micobacterias. Enfermedad de Lyme, lupus eritematosis sistémico, retinopatía del prematuro, enfermedad de Eales, enfermedad de Behcet, infecciones que provocan retinitis o coroiditis, presunta histoplasmosis ocular, enfermedad de Best, miopía, fosas ópticas, enfermedad de Stargardt, pars planitis, desprendimiento crónico de retina, síndrome de hiperviscosidad, toxoplasmosis, traumatismos y complicaciones post-láser, enfermedades asociadas a rubeosis y vitreorretinopatía proliferativa.

También se describe un método para tratar un trastorno regulado por angiogénesis en un sujeto, en donde el trastorno regulado por angiogénesis es un trastorno de angiogénesis elevada, y se selecciona del grupo que incluye, pero no se limita a, retinopatía diabética, degeneración macular, cáncer, artritis reumatoide, hemangiomas. Enfermedad de Osler-Weber-Rendu o telangiectasia hemorrágica hereditaria y tumores sólidos o transmitidos por la sangre.

También se describe un método para tratar un trastorno regulado por angiogénesis en un sujeto, en donde el trastorno regulado por angiogénesis es un trastorno de angiogénesis reducida, y se selecciona del grupo que consiste en enfermedades inflamatorias del intestino tales como enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa, psoriasis, sarcoidosis, enfermedad artritis reumatoide, hemangiomas, enfermedad de Osler-Weber-Rendu o telangiectasia hemorrágica hereditaria, tumores sólidos o de transmisión sanguínea y síndrome de inmunodeficiencia adquirida.

También se describe un método para tratar un trastorno regulado por angiogénesis en un sujeto, en donde el trastorno regulado por angiogénesis es un trastorno de angiogénesis reducida y se selecciona del grupo que incluye, entre otros, isquemia miocárdica o de músculo esquelético, accidente cerebrovascular, enfermedad de las arterias coronarias, enfermedad vascular periférica, enfermedad de las arterias coronarias, enfermedad cerebrovascular, neuropatía diabética y cicatrización de heridas.

También se describe un método para tratar un trastorno regulado por angiogénesis en un sujeto, en donde el trastorno regulado por angiogénesis es un trastorno de angiogénesis reducida y se selecciona del grupo que consiste en isquemia del músculo esquelético e isquemia miocárdica, accidente cerebrovascular, enfermedad arterial coronaria, enfermedad vascular periférica, enfermedad de las arterias coronarias.

También se describe un método para tratar un trastorno de angiogénesis reducida en un sujeto, en donde el trastorno de angiogénesis reducida es una enfermedad vascular periférica.

También se describe un método para tratar un trastorno de angiogénesis reducida en un sujeto, en donde el trastorno de angiogénesis reducida es enfermedad de las arterias coronarias.

También se describe una composición farmacéutica que comprende: un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a la proteína tirosina fosfatasa beta humana; y un portador farmacéuticamente aceptable.

También se describe una composición farmacéutica que comprende: un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a la proteína tirosina fosfatasa beta humana, en donde el anticuerpo es el anticuerpo monoclonal R15E6; y un portador farmacéuticamente aceptable.

También se describe una composición farmacéutica, que comprende: un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a la proteína tirosina fosfatasa beta humana, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal que tiene las mismas, o sustancialmente las mismas, características biológicas de R15E6; y un portador farmacéuticamente aceptable.

También se describe una composición farmacéutica, que comprende: un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a la proteína tirosina fosfatasa beta humana, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno es humanizado: y un portador farmacéuticamente aceptable.

También se describe una composición farmacéutica, que comprende: un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a la proteína tirosina fosfatasa beta humana, en donde el anticuerpo comprende residuos de la región de unión al antígeno del anticuerpo monoclonal R15E6 y es humanizado; y un portador farmacéuticamente aceptable.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Diseño y producción de la proteína HPTPp ECD. (Panel A) Representación esquemática de la proteína de fusión HPTPp de longitud completa y el dominio extracelular de HPTPp-6His. (Panel B) Tinción de plata de la elución con imidazol de una columna de Ni-NTA cargada con sobrenadante de células HEK293 transfectadas con un vector que dirige la expresión de pECD-6His. Se detecta una única banda de alto peso molecular compatible con la proteína del dominio extracelular 6His de HPTPp.

Figura 2. R15E6 reconoce HPTPp endógena en células endoteliales. (Panel A) Los lisados de células endoteliales se inmunoprecipitan con un anticuerpo de control (carril 1), con R15E6 (carril 2) o con una mezcla de anticuerpos anti-Tie2 y anti-VEGFR2 (carril 3). Los inmunoprecipitados se resuelven mediante SDS-PAGE, se transfieren a una membrana de PVD y se ensayan mediante transferencia western con una mezcla de anticuerpos R15E6, anti-Tie2 y anti-VEGFR2. Se observa una única banda principal de alto peso molecular consistente con HPTPp con R15E6 (carril 2) y no con el anticuerpo de control (carril 1) o la mezcla de anti-Tie2 y anti-VEGFR2 (carril 3). (Panel B) Las células endoteliales se someten a análisis FACS con R15E6 (pico blanco) o un control sin anticuerpo primario (pico negro). El fuerte cambio en la fluorescencia indica que R15E6 se une a HPTPp en la superficie de las células endoteliales intactas.

Figura 3. R15E6 mejora la activación del receptor Tie2 en HUVEC. La activación de Tie2 se mide en células endoteliales humanas como se describe en el Ejemplo 4. La dosis de R15E6 mejora de forma dependiente la activación de Tie2 tanto basal como inducida por Ang1.

Figura 4. R15E6 mejora la sobrevivencia de HUVEC. La sobrevivencia de las células endoteliales humanas en ausencia de suero se mide como se describe en el Ejemplo 4. De acuerdo con sus efectos sobre la activación de Tie2, la dosis de R15E6 mejora de manera dependiente la sobrevivencia de las células endoteliales tanto en condiciones basales como inducidas por Ang1 (Panel A). Además, R15E6 también mejora de manera dependiente de la dosis la sobrevivencia de las células endoteliales mediada por VEGF y FGF (paneles B y C). Un anticuerpo de control no mejora la sobrevivencia de las células endoteliales (Panel D).

Figura 5. R15E6 mejora la migración de HUVEC. La migración de células endoteliales humanas se mide como se describe en el Ejemplo 4. R15E6 mejora de forma dependiente de la dosis la migración de células endoteliales tanto basal como inducida por VEGF.

Figura 6. R15E6 mejora la morfogénesis capilar en el ensayo HUVEC/Brote en perlas La morfogénesis capilar de las células endoteliales humanas se mide en el ensayo de brote en perlas como se describe en el Ejemplo 4. R15E6 mejora la morfogénesis capilar de células endoteliales tanto basal como inducida por VEGF.

Figura 7. El análisis de transferencia western localiza el epítopo de unión de R15E6 en la repetición FN3 del extremo N del dominio extracelular de HPTPp. (Panel A) Por análisis western, R15E6 se une a todos las mutantes de deleciones del extremo C, lo que demuestra que el epítopo de unión se ubica en las 2 repeticiones FN3 del extremo N. (Panel B) El análisis de proteínas quiméricas de ratón/humano localiza además el epítopo de unión de R15E6 en la repetición de FN3 de extremo N de HPTPp.

Figura 8. El análisis de MSD confirma la localización del epítopo de unión de R15E6 a la repetición FN3 del extremo N del dominio extracelular de HPTPp. (Panel A) Por análisis de MSD, R15E6 se une a todos las mutantes de deleciones del extremo C confirmando que el epítopo de unión se ubica en las 2 repeticiones FN3 del extremo N. (Panel B) El análisis de proteínas quiméricas de ratón/humano confirma además la localización del epítopo de unión de R15E6 a la repetición FN3 del extremo N de HPTPp.

Figura 9. El análisis de MSD demuestra que el fragmento Fab R15E6 monovalente también se une a la repetición FN3 del extremo N de HPTPp. (Panel A) De manera similar al anticuerpo R15 E6 intacto, el fragmento Fab R15E6 se une a todas las mutantes de deleción del extremo C, lo que confirma que el epítopo de unión se ubica en las 2 repeticiones FN3 del extremo N. (Panel B) El análisis de proteínas quiméricas de ratón/humano localiza además el epítopo de unión del fragmento Fab R15E6 en la repetición FN3 del extremo N de HPTPp.

Figura 10. El fragmento Fab monovalente de R15E6 no mejora la activación de Tie2 y bloquea la activación de Tie2 por R15E6 intacto.

Figura 11. El fragmento Fab de R15E6 inhibe de forma potente la sobrevivencia de las células endoteliales. (Panel A) En comparación con un fragmento Fab de control, el fragmento Fab R15E6 inhibe de forma potente la sobrevivencia de las células endoteliales. (Panel B) El efecto inhibitorio del fragmento Fab de R15E6 se rescata por competencia con R15E6 intacto.

Figura 12. El fragmento Fab R15E6 inhibe la migración de células endoteliales mediada por VEGF.

Descripción del listado de secuencias

Cada una de las secuencias de nucleótidos y proteínas de la lista de secuencias, junto con los números de acceso de Genbank o Derwent correspondientes, cuando corresponda, y las especies de las que se deriva, se muestran en la Tabla I.

Tabla I

continuación

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos que se unen a HPTPbeta y sus usos como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Pueden usarse técnicas estándar para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótidos y cultivo y transformación de tejidos (por ejemplo, electroporación, lipofección). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se pueden realizar de acuerdo con las especificaciones del fabricante o como se logra comúnmente en la técnica o como se describe en la presente descripción. Las técnicas y procedimientos se realizan generalmente de acuerdo con métodos convencionales conocidos en la técnica y como se describe en varias referencias generales y más específicas que se citan y discuten a lo largo de la presente especificación. A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura utilizada en relación con los procedimientos y técnicas de laboratorio de química analítica, química orgánica sintética y química médica y farmacéutica descritas en la presente descripción son las conocidas y comúnmente utilizadas en la técnica. Pueden usarse técnicas estándar para síntesis químicas, análisis químicos, preparación, formulación y administración farmacéutica y tratamiento de pacientes.

Los siguientes términos, a no ser que se indique lo contrario, se entenderá que tienen los siguientes significados:

"Proteína" se usa en la presente descripción de manera intercambiable con péptido y polipéptido. HPTPbeta es proteína tirosina fosfatasa humana como se define en la lista de secuencias. En algunas de las modalidades, se utilizan varios fragmentos de HPTPbeta. Los homólogos, ortólogos, fragmentos, variantes y mutantes de la proteína y el gen HPTPbeta, como se describe a continuación, se consideran dentro del alcance del término "HPTPbeta".

Por "fragmento" se entiende una parte de la secuencia de nucleótidos o proteína. Los fragmentos pueden retener la actividad biológica de la proteína nativa. Los fragmentos de una secuencia de nucleótidos también son útiles como sondas de hibridación y cebadores o para regular la expresión de un gen, por ejemplo, ARNip antisentido o micro ARN. Se puede preparar una porción biológicamente activa aislando una porción de una de las secuencias de nucleótidos de la invención, expresando la porción codificada (por ejemplo, mediante expresión recombinante in vitro) y evaluando la actividad de la proteína codificada.

Un experto en la técnica también reconocería que los genes y proteínas de especies distintas de las enumeradas en la lista de secuencias, particularmente especies de vertebrados, pueden ser útiles. Dichas especies incluyen, pero no se limitan a, ratones, ratas, cobayas, conejos, perros, cerdos, cabras, vacas, monos, chimpancés, ovejas, hámsteres y pez cebra. Un experto en la técnica reconocería además que utilizando sondas de las secuencias de especies conocidas, se podrían obtener ADNc o secuencias genómicas homólogas a la secuencia conocida a partir de la misma especie o de especies alternativas mediante métodos de clonación conocidos. Se contempla que tales homólogos y ortólogos sean útiles en la práctica de la invención.

Por "variantes" se entienden secuencias similares. Por ejemplo, las variantes conservadoras pueden incluir aquellas secuencias que, debido a la degeneración del código genético, codifican la secuencia de aminoácidos de uno de los polipéptidos de la invención. Las variantes alélicas de origen natural y las variantes de corte y empalme pueden identificarse mediante el uso de técnicas conocidas, por ejemplo, mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), análisis de polimorfismo de nucleótido único (SNP) y técnicas de hibridación. Para aislar ortólogos y homólogos, generalmente se utilizan condiciones de hibridación estrictas, dictadas por secuencias específicas, longitud de secuencia, contenido de guanina citosina (GC) y otros parámetros. Las secuencias de nucleótidos variantes también incluyen secuencias de nucleótidos derivadas sintéticamente, por ejemplo, derivadas usando mutagénesis dirigida al sitio. Las variantes pueden contener secuencias adicionales del locus genómico solas o en combinación con otras secuencias.

Las moléculas también incluyen proteínas acortadas y/o mutadas en las que se han eliminado o modificado regiones de la proteína no necesarias para la unión o señalización del ligando. De manera similar, pueden mutarse para modificar sus actividades de unión o señalización de ligando. Tales mutaciones pueden implicar mutaciones no conservadoras, deleciones o adiciones de aminoácidos o dominios proteicos. Las proteínas variantes pueden o no retener la actividad biológica. Tales variantes pueden resultar, por ejemplo, del polimorfismo genético o de la manipulación humana.

También se contemplan en la presente descripción proteínas de fusión. Mediante el uso de métodos conocidos, un experto en la técnica podría preparar proteínas de fusión de las proteínas de la invención; que, aunque diferente de la forma nativa, pueden ser útiles. Por ejemplo, la pareja de fusión puede ser una secuencia de polipéptido señal (o líder) que cotraduccionalmente o postraduccionalmente dirige el movimiento de la proteína desde su sitio de síntesis a otro sitio (por ejemplo, el líder del factor a de levadura). Alternativamente, puede añadirse para facilitar la purificación o identificación de la proteína de la invención (por ejemplo, poli-His, péptido Flag o proteínas fluorescentes).

El término "antígeno" se refiere a una molécula o una porción de una molécula capaz de unirse a un agente de unión selectiva, como un anticuerpo, y además es capaz de usarse en un animal para producir anticuerpos capaces de unirse a un epítopo de ese antígeno. Un antígeno puede tener uno o más epítopos.

El término "epítopo" incluye cualquier determinante antigénico, preferentemente un determinante polipeptídico, capaz de unirse específicamente a una inmunoglobulina o un receptor de células T. En ciertas modalidades, los determinantes de epítopos incluyen agrupaciones de superficie químicamente activas tales como aminoácidos, azúcares, lípidos, fosforilo o sulfonilo y, en ciertas modalidades, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas. Un epítopo es una región de un antígeno que es reconocida por un anticuerpo. En determinadas modalidades, se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando reconoce preferentemente su antígeno objetivo en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas. También se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando presenta una mayor afinidad por el antígeno que otras moléculas relacionadas y/o no relacionadas.

El término "anticuerpo" (Ab) como se usa en la presente descripción incluye anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), anticuerpos de cadena simple, por ejemplo, anticuerpos de llama y camello, fragmentos de anticuerpos, por ejemplo, regiones variables y/o fragmentos de región constante, siempre que muestren una actividad biológica deseada, por ejemplo, actividad de unión a antígeno. El término "inmunoglobulina" (Ig) se usa indistintamente con "anticuerpo" en la presente descripción.

Un "anticuerpo aislado" es uno que se ha identificado y/o separado y/o recuperado de su entorno natural.

La unidad básica de anticuerpo de cuatro cadenas es una glicoproteína heterotetramérica compuesta por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas (un anticuerpo IgM consta de 5 unidades de heterotetrámero básico junto con un polipéptido adicional llamado cadena J, y por lo tanto, contienen 10 sitios de unión al antígeno, mientras que los anticuerpos IgA secretados pueden polimerizar para formar conjuntos polivalentes que comprenden 2-5 de las unidades básicas de 4 cadenas junto con la cadena J). En el caso de las IgG, la unidad de cuatro cadenas es generalmente de aproximadamente 150 kilo Daltons (kDa). Cada cadena L está unida a una cadena H por un enlace disulfuro covalente, mientras que las dos cadenas H están unidas entre sí por uno o más enlaces disulfuro, dependiendo del isotipo de la cadena H. Cada cadena H y L también tiene puentes disulfuro intracatenarios regularmente espaciados. Cada cadena H tiene en el extremo N, un dominio variable (VH) seguido de tres dominios constantes (C^h) para cada una de las cadenas a y y y cuatro dominios C^h para los isotipos p y £. Cada cadena L tiene en el extremo N, un dominio variable (V^l) seguido de un dominio constante (C^l) en su otro extremo. El V^l está alineado con el V^h y el C^l está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada (C^h1 ). Se cree que determinados residuos de aminoácidos forman una interfaz entre los dominios variables de cadena ligera y cadena pesada. El emparejamiento de V^h y V^l juntos forma un único sitio de unión al antígeno. Para conocer la estructura y propiedades de las diferentes clases de anticuerpos, véase, por ejemplo, Basic and Clinical Immunology, 8a edición, Daniel P. Stites, Abba I. Terr y Tristram G. Parslow (editorial), Appleton & Lange, 1994, página 71 y Capítulo 6.

La cadena L de cualquier especie de vertebrado puede asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, llamados kappa y lambda, basándose en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. En dependencia de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas (CH) las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases o isotipos. Hay cinco clases de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, que tienen cadenas pesadas designadas a, ó, £, y y p, respectivamente. Las clases y y a se dividen además en subclases sobre la base de diferencias relativamente menores en la secuencia y función de CH por ejemplo, los seres humanos expresan las siguientes subclases: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2.

Los miembros de la familia Camelidae, por ejemplo, llama, camello y dromedarios, contienen un tipo único de anticuerpo, que carecen de cadenas ligeras y además carecen del dominio C^h1 (Muyldermans, S., Rev. Mol.

Biotechnol., 74, 277-302 (2001)). La región variable de estos anticuerpos de cadena pesada se denomina V ^hh o VHH, y constituye el fragmento de unión a antígeno intacto más pequeño disponible (15 kDa) derivado de una inmunoglobulina funcional.

El término "variable" se refiere al hecho de que ciertos segmentos de los dominios variables difieren ampliamente en la secuencia entre los anticuerpos. El dominio V media la unión del antígeno y define la especificidad de un anticuerpo particular por su antígeno. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a lo largo de la extensión de 110 aminoácidos de los dominios variables. En cambio, las regiones V consisten en tramos relativamente invariantes llamados regiones marco (FR) de 15-30 aminoácidos separados por regiones más cortas de extrema variabilidad llamadas "regiones hipervariables" que tienen cada una de 9-12 aminoácidos de longitud. Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cada uno cuatro FR, que adoptan en gran medida una configuración de hoja p, conectadas por tres regiones hipervariables, que forman bucles que conectan y, en algunos casos, forman parte de la estructura de hoja p. Las regiones hipervariables de cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad mediante las FR y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos. Los dominios constantes no participan directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero exhiben varias funciones efectoras, como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).

El término "región hipervariable" cuando se usa en la presente descripción se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable generalmente comprende residuos de aminoácidos de una "región determinante de complementariedad" o "CDR" (por ejemplo, alrededor de los residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en V^l, y alrededor de 1-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en V^h; Kabat y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ta Edición Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) y/o aquellos residuos de un "bucle hipervariable".

El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente descripción se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores. A diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales que incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes epítopos, cada anticuerpo monoclonal es dirigido contra un solo epítopo, es decir, un solo determinante antigénico. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque pueden sintetizarse sin contaminarse con otros anticuerpos. El modificador "monoclonal" no debe interpretarse como que requiera la producción del anticuerpo por ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales útiles en la presente invención pueden prepararse mediante la metodología de hibridomas o pueden prepararse mediante el uso de métodos de ADN recombinante en células bacterianas, animales eucariotas o células vegetales (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Núm. 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse de bibliotecas de anticuerpos de fagos, usando las técnicas disponibles, por ejemplo, Clackson y otros, Nature, 352:624-628 (1991).

Los anticuerpos monoclonales de la presente incluyen anticuerpos "quiméricos" en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpos particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como los fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada (véase la patente de Estados Unidos 4,816,567 y Morrison y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81,6851-6855 (1984)).

Un "fragmento de anticuerpo" comprende una porción de un anticuerpo multimérico, preferentemente la región de unión al antígeno o variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen Fab, Fab'. F(ab')2, dímeros y trímeros de conjugados Fab, Fv, scFv, minicuerpos; dia-, tria- y tetracuerpos; anticuerpos lineales (véase Hudson y otros, Nature Med. 9, 129-134 (2003)).

"Fv" es el fragmento mínimo de anticuerpo que contiene un sitio completo de unión al antígeno. Este fragmento consta de un dímero de un dominio de región variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en asociación estrecha no covalente. Del plegamiento de estos dos dominios emanan seis bucles hipervariables (3 bucles cada uno de la cadena H y L) que aportan los residuos de aminoácidos para la unión del antígeno y confieren especificidad de unión al antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende sólo tres CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno y, por lo tanto, se incluye en la definición de Fv.

"Fv monocatenario" también abreviado como "sFv" o "scFv" son fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominios de anticuerpos V^h y V^l conectados en una única cadena polipeptídica. Preferentemente, el polipéptido sFv comprende además un polipéptido conector entre los dominios V^h y V^l que permite que el sFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno.

Los términos "dia-, tria- y tetracuerpos" se refieren a fragmentos pequeños de anticuerpo preparados mediante la construcción de fragmentos sFv con conectores cortos (alrededor de 5-10 residuos) de manera que se consigue el apareamiento de los dominios V entre los dominios V ^h y V^l entre cadenas pero no dentro de la cadena, lo que da como resultado un fragmento multivalente.

El término "anticuerpo humanizado" o "anticuerpo humano" se refiere a anticuerpos que comprenden secuencias de regiones variables de cadena pesada y ligera de una especie no humana (por ejemplo, un ratón) pero en las que al menos una parte de la secuencia VH y/o VL se ha modificado para que sea más "similar al humano", es decir, más similar a las secuencias variables de la línea germinal humana. Un tipo de anticuerpo humanizado es un anticuerpo injertado con CDR, en donde se introducen secuencias de CDR humanas en secuencias de VH y VL no humanas para reemplazar las correspondientes secuencias de CDR no humanas. Medios para preparar quimérico. Los expertos en la técnica conocen anticuerpos humanizados e injertados con CDR (véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Núm. 4,816,567 y 5,225,539). Un método para producir anticuerpos humanos emplea el uso de animales transgénicos, tal como un ratón transgénico. Estos animales transgénicos contienen una parte sustancial del genoma productor de anticuerpos humanos insertado en su propio genoma y la producción de anticuerpos endógenos del propio animal se vuelve deficiente para la producción de anticuerpos. Los métodos para generar tales animales transgénicos se conocen en la técnica. Tales animales transgénicos se pueden generar mediante el uso de tecnología XenoMouseRTM o mediante el uso de un enfoque de "minilocus". Los métodos para generar XenoMiceRTM se describen en las Patentes de Estados Unidos Núm. 6,162,963, 6,150,584, 6,114,598 y 6,075,181. Los métodos para generar animales transgénicos mediante el uso del enfoque de "minilocus" se describen en la patente de Estados Unidos Núm.

5,545,807, 5,545,806 y 5,625,825 y WO 93/12227.

La humanización de un anticuerpo no humano se ha convertido en una rutina en los últimos años y ahora está dentro del conocimiento de un experto en la técnica. Varias empresas ofrecen servicios para preparar un anticuerpo humanizado, por ejemplo, Xoma, Aries, Medarex, PDL y Cambridge Antibody Technologies. Los protocolos de humanización se describen ampliamente en la literatura técnica, por ejemplo, Kipriyanov y Le Gall, Molecular Biotechnol, vol. 26, páginas. 39-60 (2004), Humana Press, Totowa, Nueva Jersey; Lo, Methods Mol. Biol., Vol. 248, páginas. 135-159 (2004), Humana Press, Totowa, Nueva Jersey; Wu y otros J. Mol. Biol. 294, 151-162 (1999).

En determinadas modalidades, los anticuerpos pueden expresarse en líneas celulares distintas de las líneas celulares de hibridoma. Las secuencias que codifican anticuerpos particulares pueden usarse para la transformación de una célula hospedero adecuada de mamífero mediante métodos conocidos para introducir polinucleótidos en una célula hospedero, que incluyen, por ejemplo, empaquetar el polinucleótido en un virus (o en un vector viral) y transducir una célula hospedero con el virus (o vector), o mediante procedimientos de transfección conocidos en la técnica, como se ejemplifica en las Patentes de Estados Unidos Núm. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 y 4,959,455. El procedimiento de transformación utilizado puede depender del hospedero a transformar. Los métodos para la introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamíferos se conocen en la técnica e incluyen; pero no se limitan a, transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación del polinucleótido(s) en liposomas, mezcla de ácido nucleico con lípidos cargados positivamente y microinyección directa del ADN en núcleos.

Una molécula de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de una región constante de cadena pesada, una región variable de cadena pesada, una región constante de cadena ligera o una región variable de cadena ligera de un anticuerpo, o un fragmento del mismo en una combinación adecuada si se desea, es/son insertados en un vector de expresión apropiado utilizando técnicas de ligación estándar. La región constante de la cadena pesada o de la cadena ligera del anticuerpo se puede unir al extremo C de la región variable apropiada y se liga en un vector de expresión. El vector se selecciona típicamente para que sea funcional en la célula hospedero particular empleada (es decir, el vector es compatible con la maquinaria de la célula hospedero de manera que pueda producirse la amplificación del gen y/o la expresión del gen). Para una revisión de los vectores de expresión, consulte Methods Enzymol. vol. 185 (Goeddel, edición), 1990, Academic Press.

Los anticuerpos y fragmentos descritos en la presente descripción se unen a HPTPbeta y regulan la angiogénesis. Como se definió anteriormente, el término anticuerpo se usa para indicar un fragmento de unión a antígeno. Los usos de tales anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno se describen con más detalle a continuación.

Ensayos de selección utilizando modelos de angiogénesis in vitro e in vivo

Los anticuerpos se pueden seleccionar en ensayos de angiogénesis que se conocen en la técnica. Dichos ensayos incluyen ensayos in vitro que miden reporteros del crecimiento de vasos sanguíneos en células cultivadas o la formación de estructuras vasculares a partir de explantes de tejido y ensayos in vivo que miden el crecimiento de vasos sanguíneos directa o indirectamente (Auerbach, R., y otros (2003). Clin Chem 49, 32-40, Vailhe. B. y otros (2001). Lab Invest 81, 439-452).

Modelos in vitro de angiogénesis

La mayoría de estos ensayos emplean explantes de tejido o células endoteliales cultivadas y miden el efecto de los agentes sobre las respuestas de las células "angiogénicas" o sobre la formación de estructuras de tipo capilar sanguíneo. Los ejemplos de ensayos de angiogénesis in vitro incluyen, pero no se limitan a, migración y proliferación de células endoteliales, formación de tubos capilares, brote endotelial, ensayo de explante de anillo aórtico y ensayo del arco aórtico en pollo.

Modelos in vivo de angiogénesis

En estos ensayos, los agentes o anticuerpos se administran local o sistémicamente en presencia o ausencia de factores de crecimiento (es decir, VEGF o angiopoyetina 1) y el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos se mide por observación directa o midiendo un marcador reportero como el contenido de hemoglobina o un indicador fluorescente. Los ejemplos de angiogénesis incluyen, pero no se limitan a, el ensayo de membrana corioalantoidea de pollo, el ensayo de angiogénesis corneal y el ensayo de tapón MATRIGEL™.

Tratamiento de trastornos regulados por angiogénesis

El término "regular" se define como en sus significados aceptados en el diccionario. Por tanto, el significado del término "regular" incluye, pero no se limita a, regular a la alta o regular a la baja, fijar, traer orden o uniformidad, gobernar o dirigir por varios medios. En un aspecto, puede usarse un anticuerpo en un método para el tratamiento de un "trastorno de angiogénesis elevada" o "trastorno de angiogénesis reducida". Como se usa en la presente descripción, un "trastorno de angiogénesis elevada" es uno que implica angiogénesis elevada o no deseada en la manifestación biológica de la enfermedad, trastorno y/o afección; en la cascada biológica que conduce al trastorno; o como síntoma del trastorno. De manera similar, el "trastorno de angiogénesis reducida" es uno que implica angiogénesis deseada o reducida en las manifestaciones biológicas. Esta "participación" de la angiogénesis en un trastorno de angiogénesis elevada/reducida incluye, pero no se limita a, lo siguiente:

(1) La angiogénesis como "causa" del trastorno o manifestación biológica, ya sea que el nivel de angiogénesis esté elevado o reducido genéticamente, por infección, por autoinmunidad, trauma, causas biomecánicas, estilo de vida o por algunas otras causas.

(2) La angiogénesis como parte de la manifestación observable de la enfermedad o trastorno. Es decir, la enfermedad o trastorno puede medirse en términos de angiogénesis aumentada o reducida. Desde un punto de vista clínico, la angiogénesis indica la enfermedad; sin embargo, la angiogénesis no tiene por qué ser el "sello distintivo" de la enfermedad o trastorno.

(3) La angiogénesis es parte de la cascada bioquímica o celular que da como resultado la enfermedad o trastorno. A este respecto, la regulación de la angiogénesis puede interrumpir la cascada y puede controlar la enfermedad. A continuación se describen ejemplos no limitantes de trastornos regulados por angiogénesis que se pueden tratar mediante la presente invención.

Los anticuerpos descritos en la presente descripción pueden usarse para tratar enfermedades asociadas con neovascularización retiniana/coroidea que incluyen, pero no se limitan a, retinopatía diabética, degeneración macular, cáncer, anemia de células falciformes, sarcoide, sífilis, pseudoxantoma elástico, enfermedad de Paget, oclusión de vena, arteria. oclusión, enfermedad carotídea obstructiva, uveítis/vitritis crónica, infecciones por micobacterias, enfermedad de Lyme, lupus eritematosis sistémico, retinopatía del prematuro, enfermedad de Eales, enfermedad de Behcet, infecciones que provocan retinitis o coroiditis, presunta histoplasmosis ocular, enfermedad de Best, miopía, pitsia óptica, enfermedad de Stargardt, pars planitis, desprendimiento crónico de retina, síndromes de hiperviscosidad, toxoplasmosis, traumatismos y complicaciones post-láser. Otras enfermedades incluyen, pero no se limitan a, enfermedades asociadas con rubeosis (neovascularización del iris) y enfermedades causadas por la proliferación anormal de tejido fibrovascular o fibroso que incluyen todas las formas de vitreorretinopatía proliferativa, estén o no asociadas con diabetes.

Los anticuerpos descritos en la presente descripción pueden usarse para tratar enfermedades asociadas con la inflamación crónica. Las enfermedades con síntomas de inflamación crónica incluyen enfermedades inflamatorias del intestino como la enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa, psoriasis, sarcoidosis y artritis reumatoide. La angiogénesis es un elemento clave que tienen en común estas enfermedades inflamatorias crónicas. La inflamación crónica depende de la formación continua de brotes capilares para mantener la afluencia de células inflamatorias. La afluencia y presencia de las células inflamatorias producen granulomas y, por tanto, mantienen el estado inflamatorio crónico. La inhibición de la angiogénesis evitaría la formación de granulomas y aliviaría la enfermedad.

La enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa se caracterizan por inflamación crónica y angiogénesis en varios sitios del tracto gastrointestinal. La enfermedad de Crohn se caracteriza por una inflamación granulomatosa crónica en todo el tracto gastrointestinal que consiste en nuevos brotes capilares rodeados por un cilindro de células inflamatorias. La prevención de la angiogénesis inhibe la formación de brotes y previene la formación de granulomas. La enfermedad de Crohn se presenta como una enfermedad inflamatoria transmural crónica que afecta con mayor frecuencia el íleon distal y el colon, pero también puede ocurrir en cualquier parte del tracto gastrointestinal desde la boca hasta el ano y el área perianal. Los pacientes con enfermedad de Crohn generalmente tienen diarrea crónica asociada con dolor abdominal, fiebre, anorexia, pérdida de peso e hinchazón abdominal. La colitis ulcerosa es también una enfermedad crónica, inespecífica, inflamatoria y ulcerosa que surge en la mucosa del colon y se caracteriza por la presencia de diarrea sanguinolenta.

Las enfermedades inflamatorias del intestino también presentan manifestaciones extraintestinales como lesiones cutáneas. Tales lesiones se caracterizan por inflamación y angiogénesis y pueden ocurrir en muchos sitios distintos del tracto gastrointestinal. Los anticuerpos descritos en la presente descripción pueden ser capaces de tratar estas lesiones previniendo la angiogénesis, reduciendo así el influjo de células inflamatorias y la formación de lesiones.

La sarcoidosis es otra enfermedad inflamatoria crónica que se caracteriza por ser un trastorno granulomatoso multisistémico. Los granulomas de esta enfermedad pueden formarse en cualquier parte del cuerpo y, por lo tanto, los síntomas dependen del sitio de los granulomas y de si la enfermedad está activa. Los granulomas son creados por los brotes capilares angiogénicos que proporcionan un suministro constante de células inflamatorias.

Los anticuerpos descritos en la presente descripción también pueden tratar las afecciones inflamatorias crónicas asociadas con la psoriasis. La psoriasis, una enfermedad de la piel, es otra enfermedad crónica y recurrente que se caracteriza por pápulas y placas de varios tamaños. La prevención de la formación de nuevos vasos sanguíneos necesarios para mantener las lesiones características conduce al alivio de los síntomas.

La artritis reumatoide es una enfermedad inflamatoria crónica caracterizada por una inflamación inespecífica de las articulaciones periféricas. Se cree que los vasos sanguíneos del revestimiento sinovial de las articulaciones sufren angiogénesis. Además de formar nuevas redes vasculares, las células endoteliales liberan factores y especies reactivas de oxígeno que conducen al crecimiento del pannus y la destrucción del cartílago. Los factores involucrados en la angiogénesis pueden contribuir activamente y ayudar a mantener el estado de inflamación crónica de la artritis reumatoide. Otras enfermedades que pueden tratarse de acuerdo con la presente invención son hemangiomas, enfermedad de Osler-Weber-Rendu o telangiectasia hemorrágica hereditaria, tumores sólidos o transmitidos por sangre y síndrome de inmunodeficiencia adquirida.

Los anticuerpos descritos en la presente descripción también pueden usarse para tratar un "trastorno de angiogénesis reducida". Como se usa en la presente descripción, un "trastorno de angiogénesis reducida" es aquel en donde la angiogénesis se consideraría beneficiosa para tratar una enfermedad, trastorno y/o afección. El trastorno se caracteriza por tejido que sufre o corre el riesgo de sufrir daño isquémico, infección y/o mala cicatrización, que se produce cuando el tejido está privado de un suministro adecuado de sangre oxigenada debido a una circulación inadecuada. Como se usa en la presente descripción, "tejido" se usa en el sentido más amplio, para incluir, pero sin limitarse a, lo siguiente: tejido cardíaco, tal como miocardio y ventrículos cardíacos; tejido eréctil; músculo esquelético; tejido neurológico, como el del cerebelo; órganos internos, como cerebro, corazón, páncreas, hígado, bazo y pulmón; o área generalizada del cuerpo como miembros enteros, un pie o apéndices distales como dedos de manos o pies.

Métodos de vascularización del tejido isquémico.

Los anticuerpos pueden usarse en un método de vascularización de tejido isquémico. Como se usa en la presente descripción, "tejido isquémico" significa tejido que está privado de un flujo sanguíneo adecuado. Los ejemplos de tejido isquémico incluyen, pero no se limitan a, tejido que carece de un suministro sanguíneo adecuado como resultado de infartos de miocardio y cerebrales, isquemia mesentérica o de extremidades, o el resultado de una oclusión o estenosis vascular. En un ejemplo, la interrupción del suministro de sangre oxigenada puede deberse a una oclusión vascular. Dicha oclusión vascular puede ser causada por arteriosclerosis, traumatismos, procedimientos quirúrgicos, enfermedades y/u otras etiologías. Se encuentran disponibles técnicas de rutina estándar para determinar si un tejido tiene riesgo de sufrir daño isquémico por una oclusión vascular indeseable. Por ejemplo, en la enfermedad del miocardio, estos métodos incluyen una variedad de técnicas de imagenología (por ejemplo, metodologías de radiotrazadores, rayos X y MRI) y pruebas fisiológicas. Por tanto, la inducción de la angiogénesis es un medio efectivo para prevenir o atenuar la isquemia en los tejidos afectados por una oclusión vascular o en riesgo de serlo. Además, el tratamiento del músculo esquelético y la isquemia miocárdica, accidente cerebrovascular, enfermedad de las arterias coronarias, enfermedad vascular periférica, enfermedad de las arterias coronarias está completamente contemplado.

Una persona experta en la técnica del uso de técnicas estándar puede medir la vascularización del tejido. Los ejemplos no limitantes de medición de la vascularización en un sujeto incluyen SPECT (tomografía computarizada por emisión de fotón único); PET (tomografía por emisión de positrones); MRI (imágenes por resonancia magnética); y combinación de los mismos, midiendo el flujo sanguíneo al tejido antes y después del tratamiento. La angiografía se puede utilizar como evaluación de la vascularización macroscópica. La evaluación histológica se puede utilizar para cuantificar la vascularización a nivel de los vasos pequeños. Estas y otras técnicas se describen en Simons, y otros, “Clinical trial in coronary angiogenesis”, Circulation, 102, 73-86 (2000).

Métodos de reparación de tejidos.

Los anticuerpos pueden usarse en un método para reparar tejido. Como se usa en la presente descripción, "reparar tejido" significa promover la reparación, regeneración, crecimiento y/o mantenimiento de tejido, incluyendo, pero sin limitarse a, reparación de heridas o ingeniería de tejidos. Un experto en la técnica apreciará que se requiere la formación de nuevos vasos sanguíneos para la reparación del tejido. A su vez, el tejido puede resultar dañado por, entre otros, lesiones o afecciones traumáticas que incluyen artritis, osteoporosis y otros trastornos esqueléticos y quemaduras. El tejido también puede resultar dañado por lesiones debidas a procedimientos quirúrgicos, irradiación, laceración, productos químicos tóxicos, infecciones virales o bacterianas, o quemaduras. El tejido que necesita reparación también incluye las heridas que no cicatrizan. Ejemplos de heridas que no cicatrizan incluyen úlceras cutáneas que no cicatrizan como resultado de patología diabética; o fracturas que no se curan fácilmente.

Los anticuerpos también pueden usarse en la reparación de tejidos en el contexto de procedimientos dirigidos de regeneración de tejidos (GTR). Los expertos en la técnica utilizan actualmente dichos procedimientos para acelerar la cicatrización de heridas después de procedimientos quirúrgicos invasivos.

Los anticuerpos pueden usarse en un método para promover la reparación de tejidos caracterizado por un mayor crecimiento de tejido durante el proceso de ingeniería de tejidos. Tal como se usa en la presente descripción, "ingeniería de tejidos" se define como la creación, diseño y fabricación de dispositivos prostéticos biológicos, en combinación con materiales sintéticos o naturales, para el aumento o reemplazo de tejidos y órganos corporales. Por tanto, los presentes métodos pueden usarse para aumentar el diseño y el crecimiento de tejidos humanos fuera del cuerpo para su posterior implantación en la reparación o sustitución de tejidos enfermos. Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser útiles para promover el crecimiento de reemplazos de injertos de piel que se usan como terapia en el tratamiento de quemaduras.

Los anticuerpos descritos en la presente descripción pueden incluirse en dispositivos que contienen células o que no contienen células los cuales inducen la regeneración de tejidos humanos funcionales cuando se implantan en un sitio que requiere regeneración. Como se discutió previamente, la regeneración de tejido dirigida por biomaterial puede usarse para promover el recrecimiento óseo, por ejemplo, en la enfermedad periodontal. Por tanto, los anticuerpos pueden usarse para promover el crecimiento de tejidos reconstituidos ensamblados en configuraciones tridimensionales en el sitio de una herida u otro tejido que necesita tal reparación.

En otro aspecto de la ingeniería de tejidos, los anticuerpos pueden incluirse en dispositivos externos o internos que contienen tejidos humanos diseñados para reemplazar la función de los tejidos internos enfermos. Este enfoque implica aislar las células del cuerpo, colocarlas con matrices estructurales e implantar el nuevo sistema dentro del cuerpo o usar el sistema fuera del cuerpo. Por ejemplo, se pueden incluir anticuerpos en un injerto vascular revestido de células para promover el crecimiento de las células contenidas en el injerto. Se prevé que los métodos de la invención pueden usarse para aumentar la reparación, regeneración e ingeniería de tejidos en productos tales como cartílago y hueso, tejidos del sistema nervioso central, músculos, hígado y células de islotes pancreáticos (productoras de insulina).

Formulaciones farmacéuticas y métodos de uso

Los anticuerpos descritos en la presente descripción pueden administrarse a individuos para tratar o prevenir enfermedades o trastornos que son regulados por genes y proteínas de la invención. El término "tratamiento" se usa en la presente descripción significando que la administración de un compuesto de la presente invención mitiga una enfermedad o un trastorno en un hospedero. Por tanto, el término "tratamiento" incluye evitar que se produzca un trastorno en un hospedero, particularmente cuando el hospedero está predispuesto a contraer la enfermedad, pero aún no ha sido diagnosticado con la enfermedad; inhibir el trastorno; y/o aliviar o revertir el trastorno. En la medida en que los métodos descritos en la presente descripción estén dirigidos a prevenir trastornos, se entiende que el término "prevenir" no requiere que el estado patológico sea frustrado por completo. (Véase Webster's Ninth Collegiate Dictionary.) En realidad, como se usa en la presente descripción, el término prevención se refiere a la capacidad del experto en la técnica para identificar una población que es susceptible a trastornos, de modo que la administración de los compuestos de la presente invención puede ocurrir antes del inicio de una enfermedad. El término no implica que la enfermedad se evite por completo. Los compuestos identificados por los métodos de selección descritos en la presente descripción pueden administrarse junto con otros compuestos.

La seguridad y la eficacia terapéutica de los compuestos identificados pueden determinarse mediante procedimientos estándar que utilizan tecnologías in vitro o in vivo. Pueden preferirse los compuestos que presentan índices terapéuticos altos, aunque los compuestos con índices terapéuticos más bajos pueden ser útiles si el nivel de efectos secundarios es aceptable. Los datos obtenidos de las técnicas toxicológicas y farmacológicas in vitro e in vivo pueden usarse para formular el intervalo de dosis.

La efectividad de un compuesto puede evaluarse adicionalmente en modelos animales o en ensayos clínicos de pacientes con angiogénesis no regulada o regulada incorrectamente.

Como se usa en la presente descripción, "portador farmacéuticamente aceptable" pretende incluir todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción y similares, compatibles con la administración farmacéutica. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, tales medios pueden usarse en las composiciones de la invención. También se pueden incorporar compuestos activos suplementarios en las composiciones. Una composición farmacéutica se formula para que sea compatible con su vía de administración prevista. Los ejemplos de vías de administración incluyen administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica (tópica), transmucosal y rectal. Las soluciones o suspensiones usadas para aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metil parabenos; antioxidantes como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; tampones como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad como cloruro de sodio o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases, como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede encerrarse en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis múltiples hechos de vidrio o plástico.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (cuando sean solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, CREMOPHOR EL™ (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que puede inyectarse fácilmente. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos como bacterias y hongos. El portador puede ser un solvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos puede lograrse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol y cloruro de sodio en la composición. Puede conseguirse una absorción prolongada de las composiciones inyectables incluyendo en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Pueden prepararse soluciones inyectables estériles incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un portador estéril que contiene un medio básico de dispersión y los otros ingredientes requeridos. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son el secado al vacío y la liofilización que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución previamente esterilizada filtrada del mismo.

La administración sistémica también puede ser por medios transmucosales o transdérmicos. Para la administración transmucosal o transdérmica, se utilizan en la formulación penetrantes apropiados para la barrera a permear. Tales penetrantes son generalmente conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, para la administración transmucosal, detergentes, sales biliares y derivados del ácido fusídico. La administración transmucosal se puede lograr usando aerosoles nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en pomadas, pomadas, geles o cremas como se conoce generalmente en la técnica.

Los compuestos también se pueden preparar en forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorios convencionales tales como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para administración rectal.

En una modalidad, los compuestos activos se preparan con portadores que protegerán al compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes y sistemas de administración microencapsulados. Pueden usarse polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como acetato de vinilo etileno, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de tales formulaciones resultarán evidentes para los expertos en la técnica. Los materiales también pueden obtenerse comercialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals. Inc. Las suspensiones liposomales (que incluyen liposomas dirigidos a células infectadas que contienen anticuerpos monoclonales contra antígenos virales) también pueden usarse como portadores farmacéuticamente aceptables. Estos pueden prepararse de acuerdo con métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la Patente de Estados Unidos Núm. 4,522,811.

Es especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en forma de unidad de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. "Forma de unidad de dosificación", como se usa en la presente descripción, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para el sujeto a tratar, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación de las formas unitarias de dosificación viene dictada y depende directamente de las características únicas del compuesto activo y del efecto terapéutico particular que se desea lograr, y de las limitaciones inherentes en la técnica de la composición de dicho compuesto activo para el tratamiento de individuos.

Ejemplos

Ejemplo 1. Producción de la proteína del dominio extracelular HPTPp.

Métodos: Se clona HPTPp de longitud completa a partir de una biblioteca de placenta humana de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Origene). El clon es idéntico a un clon de cDNA previamente informado (número de acceso de Genbank X54131) excepto que no contiene la repetición de FNIII núm. 5. Un cDNA que codifica el dominio extracelular soluble (ECD) de HPTPp completo se clona mediante PCR a partir del cDNA de longitud completa (ver secuencia a continuación) que codifica ^{a A} 1-1534 con una His-His-His-His-His-His-Gly (6His-Gly) añadida en el extremo C (SEQ ID NO: 1). El cDNA resultante se clona en vectores de expresión de mamíferos para la expresión transitoria (pShuttle-CMV) o estable (pcDNA3.1(-)) en células HEK293. Para obtener HPTPp ECD (pECD) purificada, las células HEK293 transfectadas con un vector de expresión de pECD se incuban en OptiMEM sin suero (Gibco) durante 24 horas en condiciones normales de crecimiento. A continuación, se recupera el medio acondicionado, se centrifuga para eliminar los residuos (1000 rpm x 5 minutos) y se añade 1 ml de agarosa Ni-NTA (Qiagen) lavada (500 pl de material empaquetado) a cada 10 ml de medio aclarado y se deja agitar durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, la mezcla se carga en una columna y se lava con 20 volúmenes de solución de NaH2PO4 50 mM, NaCl 300 mM, Imidazol 20 mM, pH 8. La proteína del dominio extracelular HPTPp purificada (SEQ ID NO: 2) se eluye luego en seis fracciones con 200 pL/elución en NaH2PO450 mM, NaCl 300 mM, Imidazol 250 mM, pH 8. Las fracciones se analizan para determinar el contenido de proteínas usando electroforesis en gel de poliacrilimida-SDS desnaturalizante reductor y se detectan mediante tinción de plata (Invitrogen) y se confirman mediante espectrometría de masas.

Resultados: Para desarrollar un anticuerpo contra el dominio extracelular de HPTPp, se generan vectores de expresión que dirigen la expresión de una proteína del dominio extracelular de HPTPp marcada con 6-His (Figura 1, Panel A). Posteriormente, la proteína del dominio extracelular de HPTPp marcada con 6-His se purifica hasta casi homogeneidad (Figura 1, Panel B) a partir del medio acondicionado de células HEK293 transfectadas con el vector de expresión.

Ejemplo 2. Generación de anticuerpos monoclonales contra el dominio extracelular de HPTPp.

Métodos: Para la producción del inmunógeno del dominio extracelular HPTPp, la proteína del dominio extracelular de HPTPp-6His purificada se conjuga con tiroglobulina porcina (Sigma) usando química de acoplamiento EDC (Hockfield, S. y otros, (1993) Cold Spring Habor Laboratory Press. Volumen 1 páginas 111-201, Inmunocitoquímica). El conjugado de tiroglobulina-dominio extracelular de HPTPp resultante se dializa frente a PBS, pH 7,4. Los ratones adultos Balb/c se inmunizan luego por vía subcutánea con el conjugado (100-200 pg) y el adyuvante completo de Freund en una mezcla 1:1. Después de 2-3 semanas, se inyecta a los ratones por vía intraperitoneal o subcutánea con adyuvante incompleto de Freund y el conjugado en una mezcla 1:1. La inyección se repite a las 4-6 semanas. Los sueros se recogen de ratones 7 días después de la tercera inyección y se analizan para determinar la inmunorreactividad al antígeno del dominio extracelular de HPTPp mediante ELISA y transferencia de Western. Los ratones que muestran una buena respuesta al antígeno son reforzados por una única inyección intraesplénica con 50 pl de proteína de dominio extracelular HPTPp purificada mezclada 1:1 con hidróxido de alumbre usando una aguja extra larga de calibre 31 (Goding, J. W., (1996) Monoclonal Antibodies: Principles and Practices. Tercera edición, Academic Press Limited. página 145). En resumen, los ratones se anestesian con avertina al 2,5 % y se crea una incisión de 1 centímetro en la piel y la pared oblicua izquierda del cuerpo. La mezcla de antígenos se administra insertando la aguja desde la parte posterior hasta la parte anterior del bazo en una inyección longitudinal. Se sutura la pared del cuerpo y se sella la piel con dos pequeños clips metálicos. Los ratones se controlan para una recuperación segura. Cuatro días después de la cirugía, se extrae el bazo del ratón y se preparan suspensiones de células individuales para fusionarlas con células de mieloma de ratón para la creación de líneas celulares de hibridoma (Spitz, M., (1986) Methods In Enzymology, Volumen 121. Editores John J, Lagone y Helen Van Vunakis. Páginas 33-41 (Academic Press, Nueva York, ^{N y ) ) .} Los hibridomas resultantes se cultivan en medio modificado de Dulbeccos (Gibco) complementado con suero de ternero fetal al 15 % (Hyclone) e hipoxatina, aminopterina y timidina.

La detección de hibridomas positivos comienza 8 días después de la fusión y continúa durante 15 días. Los hibridomas que producen anticuerpos de dominio extracelular anti-HPTPp se identifican mediante ELISA en dos conjuntos de placas de 96 pocillos: uno recubierto con el dominio extracelular HPTPp etiquetado con histidina y otro recubierto con una proteína MurA bacteriana etiquetada con histidina como control negativo. El anticuerpo secundario es una IgG anti-ratón de burro marcado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Jackson Immunoresearch). La inmunorreactividad se controla en los pocillos usando el desarrollo de color iniciado por tabletas ABTS disueltas en tampón TBS, pH 7,5. Las mezclas de reacción de HRP individuales se terminan añadiendo 100 microlitros de SDS al 1 % y leyendo la absorbancia a 405 nm con un espectrofotómetro. Los hibridomas que producen anticuerpos que interactúan con el dominio extracelular-6His de HPTPp y no con la proteína murA-6His se utilizan para análisis adicionales. Se realizan diluciones limitantes (0,8 células por pocillo) dos veces en clones positivos en placas de 96 pocilios, con la clonalidad definida para tener más del 99 % de los pocilios con reactividad positiva. Los isotipos de anticuerpos se determinan mediante la tecnología iso-strip (Roche). Para obtener un anticuerpo purificado para una evaluación adicional, los sobrenadantes del cultivo de tejidos se purifican por afinidad usando columnas de proteína A o proteína G.

Resultados: Se aíslan cinco anticuerpos monoclonales inmunorreactivos a la proteína del dominio extracelular de HPTPp y se les asigna la siguiente nomenclatura, R15E6, R12A7, R3A2, R11C3, R15G2 y R5A8.

El anticuerpo monoclonal R15E6 se deposita en la American Type Culture Collection (ATCC), P.O. Caja 1549, Manassas, VA 20108 Estados Unidos el 04 de mayo de 2006.

Ejemplo 3. R15E6 se une a HPTPp endógena en células endoteliales humanas.

A. R15E6 se une a HPTPp endógena como se demuestra por inmunoprecipitación y transferencia western.

Materiales: células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC), medio EGM y solución neutralizante de tripsina de Cambrex; OPTIMEM I (Gibco), albúmina de suero bovino (BSA; Santa Cruz), solución salina tamponada con fosfato (PBS; Gibco), factores de crecimiento que incluyen angiopoyetina 1 (Angl). factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) (R&D Systems), anticuerpo monoclonal Tie2 (Universidad de Duke/P&GP), anticuerpo policlonal receptor 2 de VEGF (VEGFR2) (Whitaker y otros), agarosa de proteína A/G (Santa Cruz), sistema de transferencia/electroforesis en gel prefabricado de tris-glicina (6-8 %) (Invitrogen), membranas de PVDF (Invitrogen), tampón de lisis (20 mm Tris-HCl, 137 mm NaCl, 10 % glicerol, 1 % triton-X-100, e Dt A 2 mM, NaOV 1 mM, NaF 1 mM, PMSF 1 mM, leupeptina 1 pg/ml, pepstatina 1 pg/ml).

Método: Las HUVEC se tratan de manera previa durante 30 min con anticuerpo (en OPTIMEM) u OPTIMEM I solo. Después de la eliminación del tratamiento previo, las células se tratan con Ang1 (100 ng/ml) durante 6 minutos en PBS+BSA al 0,2 % y se lisan en tampón de lisis. Los lisados se procesan directamente en un gel de Tris-Glicina o se inmunoprecipitan con 2-5 pg/ml de anticuerpo Tie-2 o 10 pg/ml de anticuerpo R15E6 y proteína A/G agarosa. Las muestras inmunoprecipitadas se lavan Ix con tampón de lisis y se hierven durante 5 min en tampón de muestra 1x. Las muestras se resuelven en un gel de Tris-Glicina, se transfieren a una membrana de PVDF y se detectan mediante transferencia western utilizando los anticuerpos indicados (pTYR Ab (PY99, Santa Cruz), Tie-2, VEGFR2 y/o R15E6).

Resultados: Por IP/transferencia western, R15E6 reconoce una banda principal de alto peso molecular consistente con el tamaño de HPTPp (Figura 2, Panel A, Carril 2). Las bandas de menor peso molecular, menos intensas, probablemente representan formas precursoras menos glicosiladas de HPTPp. Una inmunoprecipitación (IP) con control, IgG no inmune no muestra bandas en el intervalo de peso molecular de HPTPp (Figura 2, Panel A, Carril 1), y una IP combinada Tie2/VEGFR2 muestra bandas del peso molecular esperado (Figura 2, Panel A, Carril 3). Este resultado demuestra que R15E6 reconoce y es específico para HPTPp.

B. R15E6 se une a HPTPp endógena como lo demuestra el análisis FACS

Materiales: HUVEC, medio EGM y solución neutralizante de tripsina de Cambrex; Anticuerpo secundario marcado con Alexafluor 488 de Molecular Probes; Solución salina equilibrada de Hanks (Gibco); Citómetro de flujo FACSCAN y programa CellQuest de Becton Dickenson.

Método: Las HUVEC se tratan con tripsina, se tratan con solución neutralizante de tripsina y se lavan con HBSS. Se añade anticuerpo R15E6 (0,6 pg) a 250 000 células en 50 pl de HBSS y se incuba en hielo durante 20 minutos. Las células se lavan con 1 ml de HBSS seguido de la adición de 2 pg de anticuerpo secundario conjugado con fluorescencia durante 20 minutos en hielo. Las células se lavan y se resuspenden en 1 ml de HBSS y luego se analizan en el citómetro de flujo FACSCAN con el programa CellQuest. Las células de control se tratan únicamente con anticuerpo secundario conjugado con fluorescencia.

Resultados: Por análisis FACS, HUVEC intactas, R15E6 causa un cambio robusto (>90 % de las células) en la señal de fluorescencia en comparación con el anticuerpo secundario solo (Figura 2, Panel B). Este resultado indica que R15E6 se une a HPTPp endógeno presentado en la superficie de células endoteliales intactas.

Ejemplo 4. R15E6 mejora la activación de Tie2 y promueve múltiples respuestas angiogénicas (sobrevivencia de células endoteliales, migración y morfogénesis capilar).

A. R15E6 mejora la fosforilación de Tie2 en ausencia y presencia de la angiopoyetina 1 (Ang1), el ligando de Tie2.

Métodos: Las HUVEC se cultivan en medio en ausencia de suero como se describió anteriormente en presencia o ausencia de diversas concentraciones de R15E6 y con o sin Ang1 añadida. Los lisados se preparan, se inmunoprecipitan con un anticuerpo Tie2, se resuelven mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y se transfieren a una membrana de PVDF. A continuación, las proteínas inmunoprecipitadas unidas a la membrana se someten a transferencia western en serie con un anticuerpo antifosfotirosina para cuantificar la fosforilación de Tie2 seguido de un anticuerpo de Tie2 para cuantificar el Tie2 total. La fosforilación de Tie2 se expresa como la relación entre la señal de antifosfotirosina y la señal de Tie2 total.

Resultados: R15E6 mejora la fosforilación de Tie2 tanto en ausencia como en presencia de Ang1 (Figura 3). Este resultado indica que la unión de R15E6 a HPTPp en la superficie de las células endoteliales modula su función biológica dando como resultado una activación mejorada de Tie2 en ausencia o presencia de ligando.

B. R15E6 mejora la sobrevivencia de las células endoteliales en ausencia y en presencia de factores de crecimiento endoteliales.

Materiales: HUVEC, medio EGM y solución neutralizante de tripsina de Cambrex; DMEM (Cell Gro), BSA deslipidizado (BD Falcon), Ensayo de ATP Cell Titer Glo (Promega), Factores de crecimiento (Ang1, VEGF 165 y FGF) (R&D Systems), lector de placas Victor V Multilabel (Perkin Elmer Wallac).

Método: Las HUVEC se siembran en placas a 10000 células/pocillo, se privan de suero en DMEM/BSA al 0,2 % y se tratan durante 72 h en presencia o ausencia de factor de crecimiento (Ang1, VEGF o FGF), con o sin varias concentraciones de anticuerpo R15E6. Después de 72 horas, las células se lavan con DMEM y las células sobrevivientes se cuantifican midiendo los niveles de ATP utilizando el ensayo de luminiscencia Cell Titer Glo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega).

Resultados: De acuerdo con los resultados del ensayo de activación Tie2, R15E6 mejora la sobrevivencia de las células endoteliales en ausencia de factor de crecimiento añadido a concentraciones entre 0,5 y 5 nM (Figura 4, Panel A). De manera similar, R15E6 mejora la sobrevivencia de las células endoteliales mediada por Ang1 (Figura 4, Panel A) así como la sobrevivencia celular mediada por VEGF y FGF (Figura 4, Paneles B y C). No se observa una sobrevivencia mejorada con un anticuerpo monoclonal de control (Figura 4, Panel D). Estos resultados demuestran que la unión de R15E6 a HPTPp en la superficie de la célula endotelial mejora la sobrevivencia de las células endoteliales basales así como la sobrevivencia celular mediada por múltiples vías angiogénicas (Ang1, VEGF y FGF).

C. R15E6 mejora la migración de células endoteliales en ausencia y en presencia de VEGF.

Materiales: HUVEC, medio EGM y solución neutralizante de tripsina de Cambrex; EBM-rojo de fenol libre (PRF-EBM, Cambrex), BSA deslipidizado (BD Falcon), sistema de migración de células endoteliales BD Falcon Biocoat (BD Falcon), Calceína AM (Molecular Probes); Factores de crecimiento (VEGF 165) (R&D Systems), lector de placas Victor V Multilabel (Perkin Elmer Wallac).

Método: Las HUVEC se resuspenden en PRF-EBM BSA al 0,1 % y se cultivan en placas a 50000 células/transwell (BD Bioscience, tamaño de poro de 3 pm). El factor de crecimiento/R15E6 se coloca en el pocillo inferior de la cámara transwell y se incuba 4-22 h. Las células que migran a través de la membrana se detectan marcando con 4 pg/ml de Calceína AM durante 90'. La fluorescencia se mide usando un instrumento Victor V (485/535).

Resultados: De acuerdo con los resultados del estudio de sobrevivencia, R15E6 mejora la migración de células endoteliales tanto basal como mediada por VEGF (Figura 5).

D. R15E6 mejora el brote de células endoteliales y la morfogénesis capilar en ausencia y en presencia de factores de crecimiento endotelial.

Materiales: medios HUVEC y EGM de Cambrex; Perlas Cytodex y colágeno tipo I de Sigma; PBS de Dulbecco y medios M199 de Gibco; VEGF de R&D.

Método: El pase 4 de HUVEC (2x106 células) se cultivan con 5 mg de perlas Cytodex en 10 ml de EGM en placas bacteriológicas tratadas con cultivo no tisular de 100 mm durante 48 horas con agitación ocasional. Las perlas recubiertas de células se transfieren a un tubo cónico de 50 ml y se resuspenden en 380 pl de D-PBS. Los geles de colágeno se preparan añadiendo 71,4 pl de perlas recubiertas de células a 2,8 ml de una solución de matriz que consta de 3 mg/ml de colágeno en medio M199 suplementado con NaOH 0,005 N, HEPES 20 mM y NaHCÜ3 26 mM. Trescientos cincuenta microlitros de las perlas se dispensan en un pocillo en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos y se permite a la matriz solidificar durante 1 hora a 37 °C/5 % de CO2. Se añade un ml de medio EGM con o sin VEGF (10 ng/ml) o R15E6 (7,5 pg/ml) por pocillo y se regresa a la incubadora. Después de 48 horas, un observador ciego visualiza los brotes con un microscopio invertido de contraste de fase y observa 50 perlas por pocillo, en pozos triplicados, para detectar la presencia de brotes de células endoteliales. Los resultados se expresan como el número de brotes por perla.

Resultados: de acuerdo con los resultados de los otros ensayos, R15E6 también mejora la morfogénesis capilar mediada por VEGF y la línea de base en el ensayo de germinación de perlas endoteliales (Figura 6).

Ejemplo 5. El epítopo de unión para R15E6 está en la repetición FN3 del extremo N del dominio extracelular de HPTPp humano.

A. El análisis de transferencia western de mutantes recombinantes de deleciones del extremo C y proteínas quiméricas de ratón/humano muestra que el epítopo de unión a R15E6 está en la repetición FN3 del extremo N del dominio extracelular de HPTPp.

Métodos: las células HEK293 se transfectan con vectores de expresión que codifican la mutante de deleción de HPTPp indicada o la quimera de ratón/humano. A continuación, las células transfectadas se incuban en OptiMEM durante 24 horas más, después de las cuales se recolecta el medio acondicionado que contiene el dominio extracelular HPTPp indicado y se almacena para uso futuro o se usa inmediatamente para estudios de transferencia western o ECL (ver más abajo). Para el análisis de transferencia western, se resuelven por PAGE 20 pl de medio acondicionado que contiene la proteína HPTPp indicada o ninguna proteína recombinante (Simulación, vector vacío transfectado), se transfieren a una membrana PVDF y se ensayan con R15E6.

Resultados: mediante análisis de transferencia western, R15E6 se une a todas las mutantes de deleción del extremo C de HPTPp (Figura 7A), lo que indica que el epítopo de unión está dentro de las dos primeras repeticiones de FN3 del extremo N. R15E6 no se une al dominio extracelular de HPTPp murino (SEQ ID NO: 7) que demuestra especificidad por la proteína humana (Figura 7B carril 6 frente al carril 2). La sustitución de las repeticiones murinas FN3 1ra o 1ra y 2da del extremo N con las secuencias humanas restauró la unión de R15E6 (Figura 7B carriles 3 y 5). Por el contrario, reemplazar sólo la 2da repetición murina de FN3 con la secuencia humana no logra restaurar la unión (Figura 7B carril 4). Tomados en conjunto, estos hallazgos localizan el epítopo de unión de R15E6 a la repetición FN3 del extremo N (-100 aminoácidos) de HPTPp de humano.

B. El análisis ECL (electroquimioluminiscente) de mutantes de deleciones de los extremos y proteínas quiméricas de ratón/humano confirma que el epítopo de unión a R15E6 está en la repetición FN3 del extremo N del dominio extracelular de HPTPp.

Métodos: Los sobrenadantes que contienen la proteína HPTPp indicada se recubren en una placa de 96 pocillos de MSD (Meso Scale Discovery) de alta unión, se dejan secar y se bloquean con BSA al 3 % durante 1 h. A continuación, la proteína se incuba con el anticuerpo monoclonal R15E6 o el fragmento Fab R15E6 (10 nM o 1,5 pg/ml) durante 1 h, se lava y se incuba con un anticuerpo de cabra anti-ratón con una etiqueta MSD-Tag (10 nM) para 1 h. El exceso de anticuerpo se lava y se añade tampón de lectura MSD. La emisión de luz se mide utilizando el lector Sector 2400 (MSD). MSD utiliza detección electroquimioluminiscente para detectar eventos de unión en matrices con patrones. La tecnología de Meso Scale Discovery utiliza microplacas patentadas MULTI-ARRAY™ y MULTI-Sp OT™ con electrodos integrados en la parte inferior de la placa. Los electrodos de MSD están hechos de carbono y los reactivos biológicos se pueden unir al carbono simplemente por adsorción pasiva y retienen un alto nivel de actividad biológica. Los ensayos MSD utilizan etiquetas electroquimioluminiscentes para una detección ultrasensible. Estos marcadores electroquimioluminiscentes emiten luz cuando se estimulan electroquímicamente. El proceso de detección se inicia en los electrodos integrados ubicados en la parte inferior de las microplacas de MSD y solo se excitan las etiquetas cercanas al electrodo y se detecta la luz a 620 nm.

Resultados: de acuerdo con los estudios de transferencia western, R15E6 se une a todas las proteínas de deleciones del extremo C de HPTPp mediante análisis de MSD (Figura 8A). También en consonancia con el análisis de transferencia western, R15E6 no se une al dominio extracelular de HPTPp murino, pero la unión se restaura reemplazando la repetición FN3 del extremo N murina con el dominio FN3 del extremo N humana (Figura 8B). Estos datos confirman que el epítopo de unión de R15E6 se encuentra en la repetición FN3 del extremo N de HPTPp humana. Como se esperaba, el epítopo de unión del fragmento Fab R15E6 monovalente también podría mapearse en la repetición FN3 más cercana al extremo N de HPTPp humana (Figura 9).

Ejemplo 6. Un fragmento Fab monovalente de R15E6 bloquea la activación de Tie2 mediada por R15E6 e inhibe la sobrevivencia y migración de las células endoteliales.

Métodos: Se realizan ensayos de activación de Tie2 y de sobrevivencia y migración de células endoteliales como se describió anteriormente en el ejemplo 4. Los fragmentos Fab R15E6 monovalentes se preparan como se describió previamente. El R15E6 purificado se dializa en Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0, que contiene EDTA 2 mM y ditiotreitol 1 mM. Se activa papaína (Pierce) a 1 -2 mg/ml en el tampón mencionado anteriormente durante 15 minutos a 37 °C. Se incuba R15E6 a 10 mg/ml con papaína en el mismo tampón usando una relación enzima: sustrato de 1:100, durante 1 hora a 37 °C. La digestión se termina mediante la adición de yodoacetamida (concentración final 20 mM, y se mantiene en hielo durante 1 h, protegida de la luz. El material digerido con papaína se dializa durante toda la noche contra solución salina tamponada con fosfato, para eliminar la yodoacetamida. El grado de digestión se controla mediante SDS-PAGE con la desaparición de la cadena pesada gamma (PM 55,000 kDa) y la aparición del fragmento Fc de gamma (PM 27,000 kDa) y cadenas ligeras (PM 22,000-25,000 kDa).

Resultados: a diferencia del anticuerpo R15E6 intacto, los fragmentos Fab no mejoran la activación de Tie2 (Figura 10). Además, en presencia de un exceso de fragmento Fab, se bloquea la activación de Tie2 mediada por R15E6 (Figura 10). Sorprendentemente, el fragmento Fab de R15E6 inhibe notablemente la sobrevivencia de las células

Claims (5)

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en oclusión venosa, retinopatía diabética, degeneración macular y desprendimiento crónico de retina, que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y un anticuerpo monoclonal aislado que se une a la proteína tirosina fosfatasa beta humana (HPTPp), en donde el anticuerpo monoclonal aislado se une al dominio extracelular de HPTPp, en donde el anticuerpo monoclonal aislado es un anticuerpo monoclonal intacto producido por la línea celular de hibridoma ATCC Núm. PTA-7580, o una forma humanizada del mismo.

2. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la enfermedad es la oclusión de una vena.

3. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la enfermedad es la retinopatía diabética.

4. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la enfermedad es la degeneración macular.

5. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la enfermedad es el desprendimiento crónico de retina.