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KR101698362B1 - Ｖｅｇｆ－ａ 수용체 상호작용을 억제하는 결합 단백질 - Google Patents

Ｖｅｇｆ－ａ 수용체 상호작용을 억제하는 결합 단백질 Download PDF

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KR101698362B1
KR101698362B1 KR1020117009012A KR20117009012A KR101698362B1 KR 101698362 B1 KR101698362 B1 KR 101698362B1 KR 1020117009012 A KR1020117009012 A KR 1020117009012A KR 20117009012 A KR20117009012 A KR 20117009012A KR 101698362 B1 KR101698362 B1 KR 101698362B1
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마이클 토비아스 스텀프
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몰리큘라 파트너스 아게
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Abstract

본 발명은 VEGF-A에 특이적인 결합 단백질, 특히 VEGFR-2에 대한 VEGF-Axxx 결합을 억제하는 결합 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것이다. 이러한 결합 단백질의 예는 소망하는 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 단백질이다. 상기 결합 단백질은 암 및 기타 병리 상태, 예컨대 연령-관련 황반변성과 같은 안질환을 치료하는데 효과적이다.

Description

ＶＥＧＦ－Ａ 수용체 상호작용을 억제하는 결합 단백질{Binding proteins inhibiting the VEGF-A receptor interaction}
본 발명은 VEGF-A에 특이적인 재조합 결합 단백질뿐만 아니라 이러한 VEGF-A 결합 단백질을 암호화하는 핵산, 이러한 단백질을 포함하는 약학적 조성물, 및 종양 및 안질환의 치료에서 이러한 단백질의 용도에 관한 것이다.
기존의 혈관으로부터 새로운 혈관이 성장하는 혈관신생(angiogenesis)은 종양 성장 및 안질환, 특히 연령-관련 황반변성(age-related mascular degeneration; AMD) 또는 당뇨병성 황반부종(DME)과 같은 눈 신생혈관생성 질병을 비롯한 몇몇 병리 상태에서 주요한 과정이다(Carmeliet, P., Nature 438, 932-936, 2005). 혈관 내피 성장인자(Vascular endothelial growth factor: VEGF)는 내피세포에서 VEGF 수용체(VEGFR) 티로신 키나아제를 활성화하는 것에 의해 혈관신생과 림프혈관신생을 자극한다(Ferrara, N., Gerber, H. P. and LeCouter, J., Nature Med. 9, 669-676, 2003).
포유류 VEGF 패밀리는 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D (FIGF로 공지됨) 및 태반 성장 인자(PIGF, PGF로도 공지됨)로 지칭되는 5개의 당단백질로 이루어진다. VEGF-A는 항혈관신생 요법에 효과적인 표적인 것으로 밝혀져 있다(Ellis, L. M. and Hicklin, D. J., Nature Rev. Cancer 8, 579-591, 2008). VEGF-A 리간드는 VEGFR-1(FLT1으로도 공지됨), VEGFR-2(KDR로도 공지됨) 및 VEGFR-3(FLT4로도 공지됨)으로 표시되는 3개의 구조적으로 유사한 유형의 III 수용체 티로신 키나아제에 결합하여 활성화한다. VEGF 리간드는 이들 티로신 키나아제 수용체 각각에 대하여 뚜렷한 결합 특이성을 가지고 있어, 이들의 다양한 작용성에 기여한다. 리간드 결합에 반응하여, VEGFR 티로신 키나아제는 뚜렷한 다운스트림 시그널링(downstream signaling) 경로의 네트워크를 활성화한다. VEGFR-1 및 VEGFR-2는 혈관 내피에서 주로 발견되는 반면에, VEGFR-3은 림프성 내피에서 주로 발견된다. 이들 수용체는 모두 세포외 도메인(extracellular domain), 단일 막횡단(transmembrane) 영역 및 키나아제-삽입 도메인에 의해 중단된 콘센서스(concensus) 티로신 키나아제 서열을 갖는다. 최근에, 신경 안내(neuronal guidance) 매개체의 세마포린/콜랩신 패밀리에 대한 수용체로서 원래 확인된 뉴로필린(NRP-1)이 VEGF-A에 대한 이소폼(isoform) 특이적 수용체로서 작용하는 것으로 밝혀졌다.
VEGF-A 유전자 내의 8개 엑손으로부터 스플라이싱(splicing)에 의해 생성된 VEGF-A의 다양한 이소폼이 공지되어 있다. 모든 이소폼은 엑손 1-5 및 말단 엑손, 엑손 8을 함유한다. 헤파린 결합 도메인을 암호화하는 엑손 6 및 7은 포함되거나 배제될 수 있다. 이에 의해 이들의 아미노산 수에 따라서 VEGF-A165, VEGF-A121, VEGF-A189 등으로 명명된 단백질 패밀리가 생성된다. 그러나, 엑손 8은 뉴클레오티드 서열에 2개의 3' 스플라이스 부위를 함유하고 있어, 길이는 동일하지만 C-말단 아미노산 서열이 상이한 2개 패밀리의 이소폼을 생성하도록 세포에 의해 사용될 수 있다(Varey, A.H.R. et al., British J. Cancer 98, 1366-1379, 2008). 이소폼의 혈관신생촉진(pro-angiogenic) 패밀리인 VEGF-Axxx("xxx"는 성숙 단백질의 아미노산 수를 지칭함)는 엑손 8 중의 가장 근위(proximal) 서열을 사용하는 것에 의해 생성된다(엑손 8a의 봉입체 초래). 더욱 최근에 기재된 항혈관신생 VEGF-Axxxb 이소폼은 근위 스플라이스 부위로부터의 유전자를 따라 66 bp 더 떨어진 원위(distal) 스플라이스 부위를 사용하는 것에 의해 생성된다. 그에 의해 엑손 8a를 잘라내어 VEGF-Axxxb 패밀리를 암호화하는 mRNA 서열의 생산을 초래한다. VEGF-A165는 우세한 혈관신생촉진 이소폼이며 다양한 인간 고형 종양에서 흔히 과발현된다. VEGF-A165b는 최초로 확인된 엑손 8b-암호화된 이소폼이었고 또 항혈관신생 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다(Varey et al., 앞의 인용문헌 참고; Konopatskaya, O. et al., Molecular Vision 12, 626-632, 2006). 그것은 VEGF-A의 내생성 억제 형태이며, VEGF-A 유도된 증식과 내피세포의 이동을 감소시킨다. 이것은 VEGFR-2에 결합될 수 있지만, VEGF-A165b 결합은 수용체 인산화 또는 다운스트림 시그널링 경로의 활성화를 초래하지 않는다.
항체에 의한 리간드 또는 수용체의 중화 및 VEGF-A 수용체 활성화 및 티로신 키나아제 억제제에 의한 시그널링을 차단하는 것을 비롯하여 VEGF-A 시그널링을 억제하기 위한 몇 가지 방법이 존재한다. VEGF-A 표적화된 요법은 AMD, DME, 신장세포 암종 및 간세포 암종에서 단일제로서 효과적인 것으로 밝혀진 반면에, 전이성 대장암, 비-소세포 폐암 및 전이성 유방암 환자에 대해서는 화학요법과 조합될 때에만 효과적이다(Narayanan, R. et al., Nat Rev. Drug Discov. 5, 815-816, 2005; Ellis and Hicklin, 앞의 인용 문헌 참고).
항체 이외에, 리간드 또는 수용체를 중화하기 위해 기타 결합 도메인이 사용될 수 있다(Skerra, A., J. MoI. Recog. 13, 167-187, 2000; Binz, H. K., Amstutz, P. and Pluckthun, A., Nat. Biotechnol. 23, 1257-1268, 2005). 이러한 신규 클래스의 결합 도메인은 고안된 반복 도메인을 기초로 한다(WO 02/20565호; Binz, H. K., Amstutz, P., Kohl, A., Stumpp, M. T., Briand, C, Forrer, P., Grutter, M. G., and Pluckthun, A., Nat. Biotechnol. 22, 575-582, 2004). WO 02/20565호는 얼마나 큰 반복 단백질 라이브러리가 작성될 수 있는가와 이들의 일반적 용도를 기재한다. 그럼에도 불구하고, WO 02/20565호는 VEG F-Axxx에 대하여 결합 특이성을 갖는 반복 도메인의 선택뿐만 아니라 VEGF-Axxx에 특이적으로 결합하는 반복 도메인의 구체적인 반복 서열 모티프(motif)도 개시하지 않는다.
현재 이용할 수 있는 요법에 의한 VEGF-A 표적화는 모든 환자 또는 모든 질병(예컨대, EGFR-발현 암)에 효과적인 것은 아니다. VEGF-A 표적화된 요법과 관련된 치료 효과는 복잡하고 아마도 복수의 메카니즘을 포함할 것이라는 것이 점점 분명해지고 있다(Ellis and Hicklin, 앞의 인용문헌 참고). 예컨대, bevacizumab (Avastin®) 또는 ranibizumab(Lucentis®)과 같은 시판되는 항-VEGF 약물(WO 96/030046호, WO 98/045331호 및 WO 98/045332호 참조) 또는 VEGF-Trap®(WO 00/075319호)과 같은 임상 개발중인 약물은 VEGF-A의 혈관신생촉진 및 항혈관신생 형태를 구별하지 않으므로, 양쪽 모두를 억제한다. 그 결과, 이들은 혈관신생을 억제할 뿐만 아니라 필수 생존 인자, 즉 VEGF-Axxxb의 건강한 조직도 빼앗아 세포독성 및 투여량 제한하는 부작용을 초래하며, 이는 다시 효능을 제한한다. 현재의 항-VEGF-A 요법에 일반적인 부작용은 위장관 천공, 출혈, 고혈압, 혈전색전성 질병 및 단백뇨이다(Kamba, T. and McDonald, D. M., Br. J. Cancer 96, 1788-95, 2007). 따라서, 암 및 기타 병리 상태를 치료하기 위한 개선된 항혈관신생제가 요청되고 있다.
본 발명의 기술적 과제는 암 및 기타 병리 상태, 예컨대 AMD 또는 DME와 같은 안질환의 개선된 치료를 위하여 VEGF-Axxx에 대하여 결합 특이성을 갖는 반복 도메인과 같은 신규 항혈관신생제를 확인하는 것이다. 상기 기술적 과제의 해결은 특허청구범위에 기재된 구체예를 제공하는 것에 의해 달성된다.
발명의 요약
본 발명은 결합 도메인을 포함하는 결합 단백질에 관한 것으로, 상기 결합 도메인은 VEGFR-2에 대한 VEGF-Axxx 결합을 억제하고 또 상기 결합 도메인은 가열 언폴딩(thermal unfolding)시 40℃ 이상의 미드포인트(midpoint) 변성온도(Tm)를 갖고 또 PBS 중 37℃에서 1일 동안 배양하면 10 g/L이하의 농도에서 5%(w/v) 미만의 불용성 응집물을 형성한다. 더욱 자세하게는, 본 발명은 적어도 1개의 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것으로, 상기 반복 도메인은 10-7 M 미만의 Kd로 VEGF-Axxx와 결합하여 VEGFR-2에 대한 VEGF-Axxx 결합을 억제한다. 특히 이러한 결합 단백질은 10 nM 미만의 IC50 값으로 HUVEC 스페로이드(spheroid)의 스프라우팅(sprouting)을 억제하며, 또 이러한 결합 단백질은 VEGF-Axxx과의 상호작용에 대한 해리 상수 Kd와 비교하여 VEGF-Axxxb와의 상호작용에 대한 해리상수 Kd가 적어도 10배 더 높다.
특히, 본 발명은 반복 도메인, 예컨대 안키린 반복 도메인, 특히
Figure 112011029420306-pct00001
(서열번호: 1) (여기서, 1, 2, 3, 4, 5, 6 및 7은 각각 서로 독립적으로 A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기를 나타냄)의 안키린 반복 서열 모티프를 갖는 반복 모듈을 포함하는 안키린 반복 도메인인, VEGF-A에 대한 특이성을 갖는 결합 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 안키린 반복 도메인과 적어도 70%의 아미노산 서열 동일성을 갖거나, 또는 본 발명의 안키린 반복 모듈과 적어도 70%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 반복 모듈을 포함하는, VEGF-A에 대한 결합 특이성을 갖는 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것으로, 상기 안키린 반복 모듈의 아미노산 잔기의 1 이상은 안키린 반복 단위의 배열 상에서 상응하는 위치에서 발견되는 아미노산 잔기에 의해 교환된다.
본 발명은 또한 1 이상의 부가적 잔기, 예컨대, VEGFR-2 또는 상이한 표적에 결합하는 잔기, 라벨링 잔기, 단백질 정제를 용이하게 하는 잔기, 또는 개선된 약물동력학을 제공하는 잔기, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 잔기에 결합하는 본 발명의 재조합 결합 단백질을 포함하는 결합 단백질에도 관한 것이다. 특정 구체예에서, 부가적 잔기는 단백질성 잔기이다. 특정의 다른 구체예에서, 부가적 잔기는 비-단백질성 중합체 잔기이다.
본 발명은 또한 본 발명의 재조합 결합 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 및 상술한 결합 단백질 또는 핵산 분자 1 이상을 포함하는 약학적 조성물에도 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 결합 단백질을 사용하여 암 및 기타 병리 상태, 예컨대 AMD 또는 DME와 같은 안질환을 치료하는 방법에도 관한 것이다.
도 1은 선택되어 고안된 안키린 반복 단백질의 특정의 개 VEGF-A164 결합을 도시한다.
선택된 클론과 개 VEGF-A164(VEGF) 및 음성 대조군 단백질(MBP, 대장균 말토오스 결합 단백질)과의 상호작용은 조 추출물 ELISA에 의해 나타낸다. 비오티닐화된 개 VEGF-A164 및 MBP는 뉴트래비딘(NeutrAvidin) 상에 고정화되었다. 번호는 개 VEGF-A164 또는 상응하는 인간 VEGF-A165에 대하여 리보솜 표시에서 선택된 단일 DARPin 클론을 지칭한다. A = 흡수. 흰색 막대는 개 VEGF-A164에 대한 결합을 나타내고 또 흑색 막대는 MBP에 대한 비-특이적 배경 결합을 도시한다.
도 2는 선택된 DARPin에 의한 스페로이드 성장 억제를 도시한다.
스페로이드 성장 억제 에세이에서 스프라우트(sprout)의 길이는 다양한 농도의 (a) DARPin #30(서열번호: 29), VEGF-Axxx에 대한 특이성을 갖는 DARPin, 또는 (b) DARPin NC, VEGF-Axxx에 대한 특이성을 갖지 않는 음성 대조군 DARPin 존재하에서 나타내었다.
도 3은 VEGF-A 이소폼의 특정 인식을 도시한다.
VEGF-A 이소폼에 대한 결합 단백질의 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석.
(a) 및 (b): Avastin®의 SPR 분석. 250 nM의 Avastin®를 고정된 개 VEGF-A164 (a) 또는 개 VEGF-A164b (b)를 갖는 유동 세포에 100초 동안 적용한 다음 완충 유동액으로 세정하였다.
(c) 및 (d): DARPin #27 (서열번호: 16)의 SPR 분석. 250 nM의 DARPin #27을 고정된 개 VEGF-A164 (c) 또는 개 VEGF-A164b (d)를 갖는 유동 세포에 100초 동안 적용한 다음 완충 유동액으로 세정하였다. RU = 공명 단위.
도 4는 토끼 눈에서 인간 VEGF-A165의 효율적 억제를 도시한다.
Lucentis®과 비교하여 눈에서 인간 VEGF-A165 억제에서 DARPin의 효능을 나타내기 위한 혈관 누수 토끼 모델. 제1일에서 PBS, DARPin #30 또는 Lucentis®을 유리체내 주사(intravitreal injection)에 의해 각 토끼의 1개 눈에 적용하였다(처리된 눈). 제4일 또는 제30일에서 각 토끼의 양쪽 눈에 500 ng의 인간 VEGF-A165을 유리체내 주사에 의해 처리하였다. 나트륨 플루오로세인을 정맥 주사한 지 1시간 후에 모든 눈의 유리체 및 망막에서 플루오로세인 함량을 측정하는 것에, VEGF-A165를 주사한 지 48시간 후 모든 눈을 평가하였다.
R = 처리된 눈/미처리 눈의 플루오로세인 측정치의 비율. 표준 편차는 오차 바로 표시한다. 4-PBS = PBS(대조군)을 주사한 지 4일 후의 비율; 4-D = DARPin #30을 주사한지 4일 후의 비율; 30-D = DARPin #30을 주사한지 30일 후의 비율; 4-L = Lucentis®을 주사한 지 4일 후의 비율; 30-L = Lucentis®을 주사한 지 30일 후의 비율.
발명의 상세한 설명
포유류 VEGF-A는 다르게 스플라이싱된 다음 2개 패밀리의 이소폼으로 존재한다: (i) 엑손 8의 근위(proximal) 스플라이싱에 의해 생성된 혈관신생촉진 "VEGF-Axxx" 이소폼 및 (ii) 엑손 8의 원위(distal) 스플라이싱에 의해 생성된 항혈관신생 "VEGF-Axxxb" 이소폼. 바람직하게는, 본 발명에 따른 결합 도메인은 개, 토끼, 원숭이 또는 인간 기원의 혈관신생촉진 VEGF-Axxx에 대하여 특이적이다. 더욱 바람직하게는, 본 발명에 따른 결합 도메인은 인간 기원의 혈관신생촉진 VEGF-Axxx에 대하여 특이적이다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 결합 도메인은 인간 VEGF-A165에 대하여 특이적이다.
용어 "단백질"은 폴리펩티드를 지칭하며, 폴리펩티드의 적어도 일부는 그의 폴리펩티드 사슬 내부에서 및/또는 사이에서 2차, 3차 또는 4차 구조를 형성하는 것에 의해 소정의 3차원 배열을 갖거나 습득할 수 있다. 단백질이 2 이상의 폴리펩티드를 포함하면, 개별 폴리펩티드 사슬은 비공유적으로 또는 2개 폴리펩티드 사이의 예컨대 디설피드 결합에 의해 공유적으로 결합될 수 있다. 2차 또는 3차 구조를 형성하는 것에 의하여 소정의 3차원 배열을 개별적으로 갖거나 습득할 수 있는 단백질의 일부를 "단백질 도메인"이라 칭한다. 이러한 단백질 도메인은 당업자에게 잘 알려져 있다.
재조합 단백질, 재조합 단백질 도메인 등에 사용된 바와 같은 용어 "재조합"은 상기 폴리펩티드가 관련 분야의 당업자에 의해 잘 공지된 재조합 DNA 기술을 이용하는 것에 의해 제조되는 것을 의미한다. 예컨대, 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 DNA 분자(예컨대 유전자 합성에 의해 생성됨)는 박테리아 발현 플라스미드(예컨대 pQE30, Qiagen)에 클로닝(cloned)될 수 있다. 이렇게 작성된 재조합 발현 플라스미드가 박테리아(예컨대 대장균)에 삽입되면, 상기 박테리아는 상기 재조합 DNA에 의해 암호화된 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 상응하게 생성된 폴리펩티드를 재조합 폴리펩티드라 칭한다.
용어 "폴리펩티드 태그"는 폴리펩티드/단백질에 부착된 아미노산 서열을 지칭하며, 이때 상기 아미노산 서열은 상기 폴리펩티드/단백질의 정제, 검출 또는 표적화에 유용하거나, 또는 상기 아미노산 서열은 폴리펩티드/단백질의 이화학적 거동을 개선시키거나, 또는 상기 아미노산 서열은 이팩터(effector) 작용을 보유한다. 결합 단백질의 개별 폴리펩티드 태그, 잔기 및/또는 도메인은 서로 직접적으로 또는 폴리펩티드 링커를 통하여 각각에 연결될 수 있다. 이들 폴리펩티드 태그는 당해 분야에 잘 공지되어 있으며 또 당업자들이 충분히 입수할 수 있다. 폴리펩티드 태그의 예는 소형 폴리펩티드 서열, 예컨대, His, myc, FLAG, 또는 Strep-tag 또는 상기 폴리펩티드/단백질의 검출을 허용하는 효소(예컨대 알칼리성 포스파타아제와 같은 효소)와 같은 잔기, 또는 표적화에 사용될 수 있는 잔기(이뮤노글로불린 또는 그의 단편과 같은) 및/또는 이팩터 분자이다.
용어 "폴리펩티드 링커"는 예컨대, 2개의 단백질 도메인을 연결할 수 있는 아미노산 서열, 폴리펩티드 태그 및 단백질 도메인, 단백질 도메인 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 비-폴리펩티드 잔기 또는 2개의 서열 태그를 지칭한다. 이러한 부가적 도메인, 태그, 비-폴리펩티드 잔기 및 링커는 당해 분야의 당업자에게 잘 공지되어 있다. 그 예의 목록은 특허출원 WO 02/20565호의 상세한 설명에 제공되어 있다. 이러한 링커의 특별한 예는 가변 길이의 글리신-세린-링커이며; 바람직하게는, 상기 링커는 2 내지 16개 아미노산 길이를 갖는다.
본 발명의 내용에서, 용어 "폴리펩티드"는 복수개, 즉 펩티드 결합을 통하여 연결된 2 이상의 아미노산의 1 이상의 사슬로 이루어진 분자에 관한 것이다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 펩티드 결합을 통하여 연결된 8개 이상의 아미노산으로 이루어진다.
용어 "결합 단백질"은 아래에 자세하게 설명한 바와 같이 1개 이상의 결합 도메인을 포함하는 단백질이다. 바람직하게는, 상기 결합 단백질은 4개 이하의 결합 도메인을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 상기 결합 단백질은 2개 이하의 결합 도메인을 포함한다. 가장 바람직하게는, 상기 결합 단백질은 오직 1개의 결합 도메인을 포함한다. 또한, 이러한 결합 단백질은 결합 도메인이 아닌 부가적 단백질 도메인, 다중체화 잔기, 폴리펩티드 태그, 폴리펩티드 링커 및/또는 비-단백질성 중합체 분자를 포함할 수 있다. 다중체화 잔기의 예는 기능적 이뮤노글로불린 Fc 도메인을 제공하기 위하여 짝을 이루는 이뮤노글로불린 중쇄 불변 영역, 및 2개의 폴리펩티드 사이의 분자간 디설피드 결합을 형성하는 유리 티올을 포함하는 로이신 지퍼 또는 폴리펩티드이다. 비-단백질성 중합체 분자의 예는 히드록시에틸 전분(HES), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌이다.
용어 "페길화된(PEGylated)"은 PEG 잔기가 예컨대 본 발명의 폴리펩티드에 공유결합으로 부착되어 있는 것을 의미한다.
용어 "결합 도메인"은 동일한 "폴드(fold)"(3차원 배열)을 단백질 스카폴드( scafold)로서 나타내고 또 이하에 정의된 바와 같은 소정 특성을 갖는 단백질 도메인을 의미한다. 이러한 결합 도메인은 추론적으로 얻어질 수 있거나, 또는 가장 흔히 당해 분야에 공지된 다양한 단백질 엔지니어링 기술 수법에 의해 얻어질 수 있다(Skerra, 2000, 앞의 인용문헌 참고; Binz et al., 2005, 앞의 인용문헌 참고). 예컨대, 소정 특성을 갖는 결합 도메인은 (a) 동일 폴드를 이하에 더욱 자세하게 정의된 단백질 스카폴드로서 나타내는 단백질 도메인의 다양한 콜렉션을 제공하는 단계; 및 (b) 상기 다양한 콜렉션을 스크리닝하거나 및/또는 상기 다양한 콜렉션으로부터 선택하는 것에 의해 상기 소정 특성을 갖는 적어도 1개의 단백질 도메인을 얻는 단계를 포함하는 방법에 의해 얻을 수 있다. 단백지 도메인의 다양한 콜렉션은 사용되는 스크리닝 및/또는 선택계에 따라서 몇 가지 방법에 의해 제공될 수 있고 또 파아지 발현 또는 리보솜 발현과 같은 당해 분야의 당업자에게 잘 공지된 방법을 이용하는 것을 포함할 수 있다.
용어 "단백질 스카폴드"는 아미노산 삽입, 치환 또는 결실이 고도로 용인되는 노출된 표면적을 갖는 단백질을 의미한다. 본 발명의 결합 도메인을 생성하기 위해 사용될 수 있는 단백질 스카폴드의 예는 단일쇄 Fv 또는 Fab 단편, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 단백질 A, 피에리스 브라시카에(Pieris brassicae)으로부터 얻은 빌린(bilin) 결합 단백질 또는 기타 리포칼린, 안키린 반복 단백질 또는 기타 반복 단백질, 및 인간 피브로넥틴과 같은 항체 또는 그의 단편이다. 단백질 스카폴드는 당해 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다(Binz et al., 2005, 앞의 인용문헌 참고; Binz et al., 2004, 앞의 인용문헌 참고).
용어 "소정 특성"은 표적에 대한 결합, 표적의 블로킹, 표적-매개된 반응의 활성화, 효소 활성, 및 관련된 추가의 특성과 같은 특성을 지칭한다. 소망하는 특성의 유형에 따라서, 당업자는 소망하는 특성을 갖는 결합 도메인을 스크리닝 및/또는 선별을 실시하기 위하여 포맷 및 필요 단계를 확인할 수 있을 것이다. 바람직하게는, 상기 소정 특성은 표적에 결합하는 것이다.
바람직하게는, 본 발명의 결합 단백질은 Fab 또는 scFv 단편과 같은 항체 또는 그의 단편이 아니다. 항체 및 그의 단편은 당업자에게 잘 공지되어 있다.
또한 바람직하게는, 본 발명의 상기 결합 도메인은 항체 및/또는 피브로넥틴 유형 III 도메인에 존재하는 바와 같은 이뮤노글로불린 폴드를 포함하지 않는다. 이뮤노글로불린 폴드는 2개 β-시트로 배열된 약 7개의 안티-페러럴 β-스트랜드의 2-층 샌드위치로 이루어진 보통의 모든-β 단백질 폴드이다. 이뮤노글로불린 폴드는 당업자에게 잘 공지되어 있다. 예컨대, 이뮤노글로불린 폴드를 포함하는 이러한 결합 도메인은 WO 07/080392호 또는 WO 08/097497호에 기재되어 있다.
더욱 바람직하게는, 본 발명의 결합 도메인은 VEGFR-1 또는 VEGFR-2에서 볼 수 있는 것과 같은 이뮤노글로불린-유사 도메인을 포함하지 않는다. 이러한 결합 도메인은 WO 00/075319호에 기재되어 있다.
바람직한 결합 도메인은 항혈관신생 효과를 갖는 결합 도메인이다. 결합 도메인의 항혈관신생 효과는 실시예 2에 기재된 HUVEC 스페로이드의 스프라우팅 에세이와 같이 당업자에게 잘 공지된 에세이에 의해 측정될 수 있다.
70 내지 300개 아미노산, 특히 100 내지 200 아미노산을 포함하는 결합 도메인이 또한 바람직하다.
유리 Cys 잔기를 갖지 않는 결합 도메인이 또한 바람직하다. 유리 Cys 잔기는 디설피드 결합 형성에 관여하지 않는다. Cys 잔기를 갖지 않는 결합 도메인이 더욱 더 바람직하다.
본 발명의 바람직한 결합 도메인은 반복 도메인 또는 바람직하게는 WO 02/20565호에 기재된 바와 같은 고안된 반복 도메인이다.
특히 바람직한 결합 도메인은 바람직하게는 WO 02/20565호에 기재된 바와 같은 고안된 안키린 반복 도메인(Binz, H. K. et al., 2004, 앞의 인용문헌 참고)이다. 고안된 안키린 반복 도메인의 예는 실시예에 나타내어져 있다.
반복 단백질에 대한 이후에 나타낸 정의는 특허 출원 WO 02/20565호에 기재된 정의를 기초로 한다. 특허 출원 WO 02/20565호는 또한 반복 단백질 특징, 수법 및 적용의 일반적 기재를 더 함유한다.
용어 "반복 단백질"은 1개 이상의 반복 도메인을 포함하는 단백질을 지칭한다. 바람직하게는, 상기 반복 단백질 각각은 4개 이하의 반복 도메인을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 상기 반복 단백질 각각은 2개 이하의 반복 도메인을 포함한다. 가장 바람직하게는, 상기 반복 단백질 각각은 오직 1개의 반복 도메인을 포함한다. 또한, 상기 반복 단백질은 부가적 비-반복 단백질 도메인, 폴리펩티드 태그 및/또는 폴리펩티드 링커를 포함할 수 있다.
용어 "반복 도메인"은 2개 이상의 연속적 반복 단위(모듈)를 구조 단위로 포함하는 단백질 도메인을 지칭하며, 이때 상기 구조 단위는 동일 폴드를 갖고, 또 긴밀하게 포개어 져서 예컨대, 조인트 소수성 코어를 갖는 초헬릭스 구조를 생성한다.
용어 "고안된 반복 단백질" 및 "고안된 반복 도메인"은 특허 출원 WO 02/20565호에 설명된 발명적 과정의 결과로서 얻어진 반복 단백질 또는 반복 도메인을 지칭한다. 고안된 반복 단백질 및 고안된 반복 도메인은 합성이며 천연으로부터 얻지 않는다. 이들은 상응하게 고안된 핵산의 발현에 의해 얻어지는 인간이 만든 단백질 또는 도메인이다. 바람직하게는, 상기 발현은 박테리아 세포와 같은 진핵세포 또는 원핵세포에서 실시하거나, 또는 무-세포 시험관내 발현계를 이용하여 실시할 수 있다.
용어 "구조 단위"는 폴리펩티드 사슬을 따라 서로 인접하는 2차 구조의 2 이상의 절편 사이의 3차원 상호작용에 의해 형성된 폴리펩티드의 국속적으로 배열된 부분을 지칭한다. 이러한 구조 단위는 구조 모티프를 나타낸다. 용어 "구조 모티프"는 적어도 1개의 구조 단위에 존재하는 2차 구조 요소의 3차원 배열을 지칭한다. 구조 모티프는 당업자에게 잘 알려져 있다. 구조 단위 단독은 소정의 3차원 배열을 얻을 수 없다; 그러나, 예컨대 반복 도메인 중의 반복 모듈로서 이들의 연속 배열은 인접 단위의 상호 안정화를 초래하여, 초헬릭스 구조를 초래한다.
용어 "반복 단위"는 1 이상의 천연 산출 반복 단백질의 반복 서열 모티프를 포함하는 아미노산 서열을 지칭하며, 상기 "반복 단위"는 복수의 카피(copy)에서 발견되며, 또 단백질의 폴드를 결정하는 모든 상기 모티프에 공통되는 소정의 폴딩 토폴로지(topology)를 나타낸다. 이러한 반복 단위는 프레임워크 잔기 및 상호작용 잔기를 포함한다. 이러한 반복 단위의 예는 아마딜로(armadillo) 반복 단위, 로이신이 풍부한 반복 단위, 안키린 반복 단위, 테트라트리코펩티드 반복 단위, HEAT 반복 단위, 및 로이신이 풍부한 변종 반복 단위이다. 2 이상의 이러한 반복 단위를 함유하는 천연 산출 단백질을 "천연 산출 반복 단백질"이라 칭한다. 반복 단백질의 개별 반복 단위의 아미노산 서열은 서로에 대하여 비교할 때 상당 수의 돌연변이, 치환, 부가 및/또는 결실을 가질 수 있는 반면에, 단복 단위의 일반적인 패턴, 또는 모티프는 실질적으로 여전히 보유할 수 있다.
용어 "프레임워크 잔기"는 반복 단위의 아미노산 잔기, 또는 반복 모듈의 상응하는 아미노산 잔기에 관한 것으로, 폴딩 토폴로지에 기여하며, 즉 상기 반복 단위(또는 모듈)의 폴드에 기여하거나 또는 인접 단위(또는 모듈)와의 상호작용에 기여한다. 이러한 기여는 반복 단위(모듈) 중의 다른 잔기와의 상호작용, 또는 α-헬릭스 또는 β-시트, 또는 선형 폴리펩티드 또는 루프를 형성하는 아미노산 스트레치에서 발견되는 것과 같은 폴리펩티드 골격 형성에 대한 영향일 수 있다.
용어 "표적 상호작용 잔기"는 반복 단위의 아미노산 잔기, 또는 표적 물질과의 상호작용에 기여하는 반복 모듈의 상응하는 아미노산 잔기를 지칭한다. 이러한 기여는 예컨대 표적 물질과의 직접적인 상호작용, 또는 상기 표적과의 직접적인 상호작용성 잔기의 상호작용을 허용하거나 또는 개선하기 위한 반복 단위(모듈)의 폴리펩티드의 구조를 안정화하는 것에 의한 다른 직접적인 상호작용성 잔기에 대한 영향일 수 있다. 이러한 프레임워크 및 표적 상호작용 잔기는 X-선 결정학, NMR 및/또는 CD 분광학과 같은 이화학적 방법에 의해 얻은 구조적 데이터의 분석에 의해, 또는 구조 생물학 및/또는 생물정보학의 당업자에게 잘 알려진 공지의 관련 구조 정보와 비교하는 것에 의해 확인될 수 있다.
바람직하게는, 반복 서열 모티프의 추론에 사용된 반복 단위는 상동 반복 단위이며, 상기 반복 단위는 동일 구조 모티프를 포함하고 또 상기 반복 단위의 프레임워크 잔기의 70% 이상이 서로 상동이다. 바람직하게는, 상기 반복 단위의 프레임워크 잔기의 80% 이상이 상동이다. 가장 바람직하게는, 상기 반복 단위의 프레임워크 잔기의 90% 이상이 상동이다. Fasta, Blast 또는 Gap과 같이 폴리펩티드 사이의 상동성 %를 결정하는 컴퓨터 프로그램은 당업자에게 공지되어 있다. 또한 바람직하게는, 반복 서열 모티프의 추론에 사용된 상기 반복 단위는 예컨대 실시예 1에 기재된 바와 같이 표적 상에서 선택된 반복 도메인으로부터 얻어지며 동일한 표적 특이성을 갖는 상동 반복 단위이다.
용어 "반복 서열 모티프"는 1 이상의 반복 단위로부터 추론된 아미노산 서열을 지칭한다. 바람직하게는, 상기 반복 단위는 동일 표적에 대하여 결합 특이성을 갖는 반복 도메인으로부터 얻은 것이다. 이러한 반복 서열 모티프는 프레임워크 잔기 위치 및 표적 상호작용 잔기 위치를 포함한다. 상기 프레임워크 잔기 위치는 반복 단위의 프레임워크 잔기의 위치에 상응한다. 마찬가지로, 상기 표적 상호작용 잔기 위치는 반복 단위의 표적 상호작용 잔기의 위치에 상응한다. 반복 서열 모티프는 고정된 위치 및 임의 위치를 포함한다. 용어 "고정 위치"는 반복 서열 모티프 중의 아미노산 위치를 지칭하고, 상기 위치는 특정 아미노산에 설정된다. 가장 흔히, 이러한 고정 위치는 프레임워크 잔기의 위치 및/또는 특정 표적에 대하여 특이적인 표적 상호작용 잔기의 위치에 상응한다. 용어 "임의 위치"는 반복 서열 모티프 중의 아미노산 위치를 지칭하며, 상기 아미노산 위치에 2 이상의 아미노산이 허용되며, 예컨대 보통 20개 천연 산출 아미노산 중의 어떤 것이 허용되거나, 또는 시스테인 이외의 아미노산, 또는 글리신, 시스테인 및 프롤린 이외의 아미노산과 같이 20개 천연 산출 아미노산의 대부분이 허용된다. 가장 흔히, 이러한 임의 위치는 표적 상호작용 잔기의 위치에 상응한다. 그러나, 프레임워크 잔기의 일부 위치도 임의적일 수 있다.
용어 "폴딩 토폴로지"는 상기 반복 단위의 3차 구조를 지칭한다. 폴딩 토폴로지는 α-헬릭스 또는 β-시트, 또는 선형 폴리펩티드 또는 루프를 형성하는 아미노산 스트레치의 적어도 일부를 형성하는 아미노산의 스트레치, 또는 α-헬릭스, β-시트 및/또는 선형 폴리펩티드/루프의 임의 조합에 의해 결정될 것이다.
용어 "연속"은 반복 단위 또는 반복 모듈이 탄뎀(tandem; 2쌍)으로 배열된 배열을 지칭한다. 고안된 반복 단백질에는, 적어도 2개, 통상 약 2 내지 6개, 특히 적어도 약 6개, 주로 20개 이상의 반복 단위가 존재한다. 대부분의 경우에서, 반복 단위는 고도의 서열 동일성(상응하는 위치에서 동일 아미노산 잔기) 또는 서열 유사성(아미노산 잔기가 상이하지만 유사한 이화학적 특성을 가짐)을 나타낼 것이고, 또 아미노산 잔기의 일부는 천연 산출 단백질에서 발견되는 상이한 반복 단위에 강하게 보존되는 중요한 잔기일 수 있다. 그러나, 천연 산출 단백질에서 발견되는 상이한 반복 단위 사이에서 아미노산 삽입 및/또는 결실, 및/또는 치환에 의한 고도의 서열 변이성은 공통되는 폴딩 토폴로지가 유지되는 한 가능할 것이다.
X-선 결정학, NMR 또는 CD 분광학과 같은 이화학적 수단에 의해 반복 단백질의 폴딩 토폴로지를 직접 측정하는 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 반복 단위 또는 반복 서열 모티프를 확인하고 결정하기 위한 방법 또는 상동성 서치와 같이 반복 단위 또는 모티프를 포함하는 관련 단백질의 패밀리를 확인하기 위한 방법(BLAST 등)은 생물정보학 분야에서 잘 확립되어 있고, 또 당해 분야의 당업자에게 잘 공지되어 있다. 초기 반복 서열 모티프의 규정하는 단계는 반복적 공정을 포함할 수 있다.
용어 "반복 모듈"은 천연 산출 반복 단백질의 반복단위로부터 최로로 유도된, 고안된 반복 도메인의 반복된 아미노산 서열을 지칭한다. 반복 도메인에 포함된 각 반복 모듈은 천연 산출 반복 단백질의 패밀리 또는 서브패밀리의 1 이상의 반복 단위로부터 유도되며, 예컨대 아마딜로(armadillo) 반복 단백질 또는 안키린 반복 단백질의 패밀리로부터 유도된다.
"반복 모듈"은 상응하는 반복 모듈의 모든 카피에 존재하는 아미노산 잔기에 의한 위치("고정 위치") 및 상이하거나 또는 "임의"의 아미노산 잔기에 의한 위치("임의 위치")를 포함할 수 있다.
용어 "캡핑(capping) 모듈"은 반복 도메인의 N- 또는 C-말단 반복 모듈에 융합된 폴리펩티드를 지칭하며, 상기 캡핑 모듈은 상기 반복 모듈과 긴밀한 3차 상호작용을 형성하여서 연속적 반복 모듈과 접촉하지 않는 측면에서 상기 반복 모듈의 소수성 코어를 용매로부터 차단하는 캡(cap)을 제공한다. 상기 N- 및/또는 C-말단 캡핑 모듈은 반복 단위에 인접한 천연 산출 반복 단백질에서 발견되는 캡핑 단위 또는 기타 도메인으로부터 유도될 수 있다. 용어 "캡핑 단위"는 천연 산출의 폴딩된 폴리펩티드를 지칭하며, 상기 폴리펩티드는 반복 단위에 N- 또는 C-말단적으로 융합된 특정 구조 단위를 정의하며, 상기 폴리펩티드는 상기 반복 단위와 긴밀한 3차 상호작용을 형성하여, 한 면에서 상기 반복 단위의 소수성 코어를 용매로부터 차단하는 캡을 제공한다. 이러한 캡핑 단위는 상기 반복 서열 모티프에 대하여 서열 유사성을 가질 수 있다. 캡핑 모듈 및 캡핑 반복은 WO 02/020565호에 기재되어 있다. 예컨대, 서열번호: 21의 N-말단 캡핑 모듈은 위치 1 내지 32의 아미노산에 의해 암호화된다. 위치 5에서 글리신 또는 아스파테이트 잔기를 갖는 N-말단 캡핑 모듈이 또한 바람직하다.
용어 "표적"은 핵산 분자, 폴리펩티드 또는 단백질, 탄수화물, 또는 기타 천연 산출 분자와 같은 개별 분자와 이러한 개별분자의 일부, 또는 이러한 분자의 2 이상의 복합체를 지칭한다. 표적은 전체 세포 또는 조직 샘플일 수 있거나, 또는 비-천연 분자 또는 잔기일 수 있다. 바람직하게는, 표적은 천연 산출 또는 비-천연 폴리펩티드 또는 예컨대 천연 또는 비천연 인산화, 아세틸화, 또는 메틸화에 의해 변형된 것과 같이 화학적 변형을 함유하는 폴리펩티드이다. 본 발명의 특정 적용에서, 표적은 VEGF-Axxx 또는 VEGFR-2이다.
용어 "콘센서스 서열"은 다수의 반복 단위의 구조적 및/또는 서열 정렬에 의해 얻은 아미노산 서열을 지칭한다. 2 이상의 구조적 및/또는 서열 정렬된 반복 단위를 사용하고 또 정렬에서 갭(gap)을 허용함으로써, 각 위치에서 가장 빈번한 아미노산 잔기를 결정할 수 있다. 콘센서스 서열은 각 위치에서 가장 빈번하게 나타나는 아미노산을 포함하는 서열이다. 단일 위치에서 2 이상의 아미노산이 평균 이상으로 나타나는 경우, 콘센서스 서열은 이들 아미노산의 서브세트를 포함할 수 있다. 상기 2 이상의 반복 단위는 단일 반복 단백질에 포함된 반복단위로부터, 또는 2 이상의 상이한 반복 단백질로부터 취할 수 있다.
콘센서스 서열 및 이들을 결정하는 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다.
"콘센서스 아미노산 잔기"는 콘센서스 서열 중의 특정 위치에서 발견되는 아미노산이다. 2 이상의, 예컨대 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기가 상기 2 이상의 반복 단위에서 유사한 확률로 나타난다면, 콘센서스 아미노산은 가장 빈번하게 나타나는 아미노산 중의 하나이거나 또는 상기 2 이상의 아미노산 잔기의 조합일 수 있다.
비-천연 산출 결합 단백질 또는 결합 도메인도 또한 바람직하다.
용어 "비-천연 산출"은 합성을 의미하거나 천연이 아닌 것을 의미하며, 더욱 자세하게는, 상기 용어는 인간의 손으로부터 제조된 것을 의미한다. 용어 "비-천연 산출 결합 단백질" 또는 "비-천연 산출 결합 도메인"은 상기 결합 단백질 또는 상기 결합 도메인이 합성(즉, 아미노산으로부터 화학합성에 의해 제조) 또는 재조합이고 또 천연으로부터 얻은 것이 아닌 것을 의미한다. "비-천연 산출 결합 단백질" 또는 "비-천연 산출 결합 도메인"은 상응하게 고안된 핵산의 발현에 의해 얻어진 인간이 제조한 단백질 또는 도메인을 각각 의미한다. 바람직하게는, 상기 발현은 진핵세포 또는 박테리아 세포에서 실시되거나, 또는 무-세포 시험관내 발현계를 사용하는 것에 의해 실시된다. 또한, 상기 용어는 상기 결합 단백질 또는 상기 결합 도메인의 서열이 예컨대 GenBank, EMBL-Bank 또는 Swiss-Prot에 있는 서열 데이터베이스에서 비-인공적 서열 엔트리로서 존재하지 않는 것을 의미한다. 이들 데이터베이스 및 기타 유사한 서열 데이터베이스는 당업자에게 잘 공지되어 있다.
본 발명은 결합 도메인을 포함하는 결합 단백질에 관한 것으로, 상기 결합 도메인은 VEGFR-2에 대한 VEGF-Axxx 결합을 억제하고 또 상기 결합 도메인은 가열 언폴딩(thermal unfolding)시 40℃ 이상의 미드포인트(midpoint) 변성온도(Tm)를 갖고 또 포스페이트 완충 염수(PBS) 중 37℃에서 1일 동안 배양하면 10 g/L 이하의 농도에서 5%(w/v) 미만의 불용성 응집물을 형성한다.
결합 도메인은 VEGF-Axxx 와 VEGFR-2 사이의 분명한 해리 상수(Kd)가 102배 이상, 바람직하게는 103배 이상, 더욱 바람직하게는 104배 이상, 더더욱 바람직하게는 105배 이상, 가장 바람직하게는 106배 이상으로 증가하도록 VEGF-Axxx에 결합하거나 또는 VEGFR-2에 결합하는 것에 의해 VEGFR-2에 대한 VEGF-Axxx 결합을 억제할 수 있다. 바람직하게는, VEGF-Axxx 또는 VEGFR-2에 대한 결합 도메인의 상호작용에 대한 Kd는 10-7M 미만, 바람직하게는 10-8M 미만, 더욱 바람직하게는 10-9M 미만, 더욱 바람직하게는 10-10M 미만, 및 가장 바람직하게는 10-11M 미만이다. 표면 플라스몬 공명(SPR)계 기술과 같이 단백질-단백질 상호작용의 해리 상수를 결정하는 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다.
바람직한 결합 도메인은 VEGF-Axxx에 결합한다. 더욱더 바람직한 것은 인간 VEGF-A165에 결합하는 결합도메인이다.
용어 "PBS"는 137 mM NaCl, 10 mM 포스페이트 및 2.7 mM KCl을 함유하고 pH가 7.4인 포스페이트 완충 수용액을 의미한다.
바람직하게는, 상기 결합 단백질 및/또는 결합 도메인은 가열 언폴딩시 45℃ 이상, 더욱 바람직하게는 50℃ 이상, 더더욱 바람직하게는 55℃ 이상, 또 가장 바람직하게는 60℃ 이상의 미드포인트 변성온도(Tm)를 갖는다. 본 발명의 결합 단백질 또는 결합 도메인은 생리학적 조건하에서 소정의 2차 및 3차 구조를 보유한다. 이러한 폴리펩티드의 가열 언폴딩은 그의 3차 및 2차 구조의 손실을 초래하며, 이는 예컨대 원편광 2색성(circular dichroism, CD) 측정에 의해 측정될 수 있다. 가열 언폴딩시 결합 단백질 또는 결합 도메인의 미드포인트 변성온도는 온도를 10℃에서 100℃로 서서히 증가시키는 것에 의해 상기 단백질 또는 도메인을 열변성시킬 때 생리학적 완충액 중에서 협업 전이(cooperative transition)의 미드포인트에서 온도에 상응한다. 가열 언폴딩시 미드포인트 변성온도의 결정은 당업자에게 잘 알려져 있다. 가열 언폴딩시 결합 단백질 또는 결합 도메인의 미드포인트 변성온도는 상기 폴리펩티드의 열 안정성의 지표이다.
5일 이상 동안, 바람직하게는 10일 이상 동안, 더욱 바람직하게는 20일 이상 동안, 더욱더 바람직하게는 40일 이상 동안, 가장 바람직하게는 100일 이상 동안 PBS 중 37℃에서 배양될 때, 20 g/L 이하, 바람직하게는 40 g/L 이하, 더욱 바람직하게는 60 g/L 이하, 더더욱 바람직하게는 80 g/L 이하, 및 가장 바람직하게는 100 g/L 이하의 농도로 5%(w/w) 미만의 불용성 응집물을 형성하는 결합 단백질 및/또는 결합 도메인이 또한 바람직하다. 불용성 응집물의 형성은 불용성 응집물 형성시 현저히 증가하는 육안 석출, 겔 여과 또는 다이나믹 광 산란의 출현에 의해 검출될 수 있다. 불용성 응집물은 10'OOO x g에서 10분 동안 원심분리하는 것에 의해 단백질 샘플로부터 제거될 수 있다. 바람직하게는, 결합 단백질 및/또는 결합 도메인은 PBS 중 37℃의 상기 배양 조건하에서 2%, 1%, 0.5%, 0.2%, 0.1%, 또는 0.05% (w/w) 미만의 불용성 응집물을 형성한다. 불용성 응집물의 %는 가용성 단백질로부터 불용성 응집물을 분리한 다음 표준 정량 방법에 의해 가용성 및 불용성 분획 중의 단백질 양을 측정하는 것에 의해 측정될 수 있다.
100 mM 디티오트레이톨(DTT)을 함유하는 PBS 중 37℃에서 1 시간 또는 10시간 동안 배양할 때 그의 천연의 3차원 구조를 상실하지 않는 결합 단백질 및/또는 결합 도메인이 또한 바람직하다.
특정 일 구체예로서 본 발명은 VEGFR-2에 대한 VEGF-Axxx 결합을 억제하고 또 지시된 또는 바람직한 미드포인트 변성온도를 가지며 또 상기 정의한 바와 같은 비-응집 특성을 갖는 결합 도메인을 포함하고, 100 nM 미만의 IC50 값으로 HUVEC 스페로이드의 스프라우팅을 억제하는 결합 단백질에 관한 것이다.
용어 "HUVEC"는 정상 인간 제대혈관으로부터 단리될 수 있고 또 VEGF-A 자극에 대해 감응성인 인간 제대혈관 내피 세포를 의미한다.
실시예 2에 기재된 것과 같은 HUVEC 스페로이드의 스프라우팅을 측정하는 에세이는 당업자에게 잘 공지되어 있다.
IC50 값은 HUVEC 스페로이드의 스프라우팅과 같은 실험으로 결정된 변수의 시험관내 50% 억제에 필요한 결합 단백질 또는 결합 도메인과 같은 물질의 농도이다. IC50 값은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다(Korff T. and Augustin H. G., J. Cell Biol. 143(5), 1341-52, 1998).
10 nM 미만, 바람직하게는 1 nM 미만, 더욱 바람직하게는 0.1 nM 미만, 가장 바람직하게는 0.05 nM 미만의 IC50 값으로 HUVEC 스페로이드의 스프라우팅을 억제하는 결합 단백질 및/또는 결합 도메인이 바람직하다. .
ranibizumab(Lucentis®, 제넨테크사의 등록상표명), bevacizumab(Avastin®, 제넨테크사의 등록상표명), aflibercept(VEGF Trap®, 리제네론사의 등록상표명), 또는 pegaptanib(Macugen®, 파이저사의 등록상표명)의 상응하는 IC50 값보다 낮은 IC50 값으로 HUVEC 스페로이드의 스프라우팅을 억제하는 단량체성 결합 단백질 및/또는 결합 도메인이 또한 바람직하다.
특히 본 발명은 VEGFR-2에 대한 VEGF-Axxx 결합을 억제하고 또 지시된 또는 바람직한 미드포인트 변성온도를 가지고 또 상기 정의된 비-응집 특성을 갖는 결합 도메인을 포함하고, VEGF-Axxxb에 대한 상기 결합 도메인의 상호작용에 대한 Kd가 상응하는 VEGF-Axxx에 대한 상기 결합 도메인의 상호작용에 대한 Kd와 비교하여 적어도 10배 더 높은 결합 단백질에 관한 것이다.
바람직하게는, VEGF-Axxxb에 대한 상기 결합 도메인의 상호작용에 대한 Kd는 상응하는 VEGF-Axxx에 대한 상기 결합 도메인의 상호작용에 대한 Kd와 비교하여 적어도 102배 이상, 바람직하게는 103배 이상, 더욱 바람직하게는 104배 이상, 더더욱 바람직하게는 105배 이상, 가장 바람직하게는 106배 이상 더 높다.
또한 바람직하게는, VEGF-Axxxb에 대한 상기 결합 도메인의 상호작용에 대한 Kd는 103 nM 이상이고 또 VEGF-Axxx에 대한 상기 결합 도메인의 상호작용에 대한 Kd는 10 또는 1 nM 미만이다.
VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PIGF 또는 PDGF에 대한 바람직한 결합 도메인의 상호작용에 대한 Kd는 1 nM 이상, 바람직하게는 10 nM 이상, 더욱 바람직하게는 102 nM 이상, 더 더욱 바람직하게는 103 nM 이상, 가장 바람직하게는 lO4 nM 이상이다.
바람직하게는, VEGF-Axxx는 개 VEGF-A164 또는 원숭이 VEGF-A165 또는 인간 VEGF-A165이고, 및 VEGF-Axxxb는 개 VEGF-A164b 또는 원숭이 VEGF-A165b 또는 인간 VEGF-A165b이다.
다른 바람직한 구체예는 VEGFR-2에 대한 VEGF-Axxx 결합을 억제하고 또 반복 도메인 또는 고안된 반복 도메인인 결합 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질이다. 이러한 반복 도메인은 VEGF-Axxx에 대한 결합에 참여할 1, 2, 3 또는 그 이상의 내부 반복 모듈을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 반복 도메인은 1개의 N-말단 캡핑 모듈, 2 내지 4개의 내부 반복 모듈, 및 1개의 C-말단 캡핑 모듈을 포함한다. 바람직하게는, 상기 결합 도메인은 안키린 반복 도메인 또는 고안된 안키린 반복 도메인이다.
안키린 반복 도메인 또는 상기 고안된 안키린 반복 도메인이 안키린 반복 서열 모티프
Figure 112011029420306-pct00002
(서열번호: 1) (서열번호: 1 중에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6 및 7은 각각 서로 독립적으로 A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기를 나타냄)를 갖는 반복 모듈을 포함하는 재조합 결합 단백질이 바람직하다.
특히 바람직한 것은 상기 안키린 반복 도메인 또는 상기 고안된 안키린 반복 도메인이 안키린 반복 서열 모티프
Figure 112011029420306-pct00003
(서열번호: 2)를 갖는 반복 모듈을 포함하는 재조합 결합 단백질이며, 서열번호 2 중에서,
1은 F, T, N, R, V, A,I, K, Q, S 및 Y로 이루어진 군으로부터, 바람직하게는 F, T, N, R 및 V로 이루어진 군으로부터, 더욱 바람직하게는 F 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기이고;
2는 W, Y, H 및 F로 이루어진 군, 바람직하게는 W, Y 및 H로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
3은 M, I, F 및 V로 이루어진 군, 바람직하게는 M 및 I로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
4는 H, A, K, G, L, M, N, T, V, W 및 Y로 이루어진 군으로부터, 바람직하게는 H, A 및 K로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기이며;
5는 E, Y, F, V, H, I, L, N 및 R로 이루어진 군, 바람직하게는 E, Y, F, V 및 H로 이루어진 군으로부터, 더욱 바람직하게는 E, Y, F 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
6은 A, N, Y, H 및 R로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기임.
안키린 반복 도메인 또는 상기 고안된 안키린 반복 도메인이 안키린 반복 서열 모티프
Figure 112011029420306-pct00004
(서열번호: 3)를 갖는 반복 모듈을 포함하는 재조합 결합 단백질이 더욱 바람직하며, 서열번호 3 중에서,
1은 T, E, A, D, F, K, N, Q, R, S, W 및 Y로 이루어진 군으로부터, 바람직하게는 T 및 E로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
2는 V, F, Y, A, H, I, K, R, T 및 W로 이루어진 군으로부터, 바람직하게는 V, F 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
3은 S, A, N, F 및 M으로 이루어진 군으로부터, 바람직하게는 S, A 및 N, 더욱 바람직하게는 S 및 A로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
4는 Y, F, S 및 W로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
5는 A, S, L 및 Y로 이루어진 군으로부터, 바람직하게는 A 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
6은 D, N, M, A, I, K 및 Y로 이루어진 군으로부터, 바람직하게는 D, N 및 M, 더욱 바람직하게는 D 및 N로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
7은 A, Y, H, N 및 D로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고; 또
8은 아미노산 잔기 T 또는 A임.
안키린 반복 도메인 또는 상기 고안된 안키린 반복 도메인이 안키린 반복 서열 모티프
Figure 112011029420306-pct00005
(서열번호: 4)를 갖는 반복 모듈을 포함하는 재조합 결합 단백질이 더욱 바람직하며, 서열번호 4 중에서,
1은 K, T 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
2는 아미노산 잔기 N 또는 M이며;
3은 아미노산 잔기 T 또는 F이고;
4는 아미노산 잔기 S 또는 A이며;
5는 아미노산 잔기 H 또는 R이고;
6은 A, Y, H 및 N로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이며; 또
7은 아미노산 잔기 A 또는 T임.
안키린 반복 도메인 또는 상기 고안된 안키린 반복 도메인이 서열번호: 3의 안키린 반복 서열 모티프를 갖는 반복 모듈을 포함하며, 상기 반복 모듈 앞에는 서열번호: 2의 안키린 반복 서열 모티프를 갖는 반복 모듈이 위치하고 및/또는 그 뒤를 이어 서열번호: 4의 안키린 반복 서열 모티프를 갖는 반복 모듈이 위치하는 재조합 결합 단백질이 더욱더 바람직하다.
안키린 반복 도메인 또는 고안된 안키린 반복 도메인이 안키린 반복 서열 모티프
Figure 112011029420306-pct00006
(서열번호: 5)를 갖는 반복 모듈을 포함하는 재조합 결합 단백질이 더욱 바람직하고, 서열번호: 5 중에서
1은 A, N, R, V, Y, E, H, I, K, L, Q, S 및 T로 이루어진 군으로부터, 바람직하게는 A, N, R, V 및 Y로 이루어진 군, 더욱 바람직하게는 A 및 R로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기이고;
2는 S, A, N, R, D, F, L, P, T 및 Y로 이루어진 군으로부터, 바람직하게는 S, A, N 및 R로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
3은 T, V, S, A, L 및 F로 이루어진 군으로부터, 바람직하게는 T, V, S, A 및 L로 이루어진 군, 더욱 바람직하게는 T, V 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기이고;
4는 W, F 및 H로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
5는 P, I, A, L, S, T, V 및 Y로 이루어진 군으로부터, 바람직하게는 P 및 I로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
6은 W, F, I, L, T 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
7은 아미노산 잔기 L 또는 P이고; 또
8은 A, H, N 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기임.
안키린 반복 도메인 또는 고안된 안키린 반복 도메인이 안키린 반복 서열 모티프
Figure 112011029420306-pct00007
(서열번호:6)를 갖는 반복 모듈을 포함하는 재조합 결합 단백질이 더욱 바람직하고, 서열번호: 6 중에서
1은 H, Q, A, K, R, D, I, L, M, N, V 및 Y로 이루어진 군으로부터, 바람직하게는 H, Q, A 및 R로 이루어진 군, 더욱 바람직하게는 A 및 R로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기이고;
2는 Y, F 및 H로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
3은 Q, F 및 T로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
4는 W, M, G, H, N 및 T로 이루어진 군으로부터, 바람직하게는 W 및 M로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
5는 T, A, M, L 및 V로 이루어진 군으로부터, 바람직하게는 T, A 및 M으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
6은 I, L, V, D 및 T로 이루어진 군으로부터, 바람직하게는 I, L 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이며; 또
7은 A, H, N 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기임.
안키린 반복 도메인 또는 고안된 안키린 반복 도메인이 서열번호: 6의 안키린 반복 서열 모티프를 갖는 반복 모듈을 포함하고, 이때 상기 반복 모듈 앞에는 서열번호:5의 안키린 반복 서열 모티프를 갖는 반복 모듈이 위치하는 재조합 결합 단백질이 더욱더 바람직하다.
안키린 반복 도메인 또는 고안된 안키린 반복 도메인이 안키린 반복 서열 모티프
Figure 112011029420306-pct00008
(서열번호: 7)를 갖는 반복 모듈을 포함하는 재조합 결합 단백질이 더욱 바람직하고, 서열번호: 7 중에서
1은 K, M, N, R 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
2는 Y, H, M 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
3은 F, L, M 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
4는 R, H, V, A, K 및 N으로 이루어진 군으로부터, 바람직하게는 R, H, V 및 A로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
5는 F, D, H, T, Y, M 및 K로 이루어진 군으로부터, 바람직하게는 F, D, H, T 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고; 또
6은 A, H, N 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기임.
안키린 반복 도메인 또는 고안된 안키린 반복 도메인이 안키린 반복 서열 모티프
Figure 112011029420306-pct00009
(서열번호: 8)를 갖는 반복 모듈을 포함하는 재조합 결합 단백질이 더욱 바람직하고, 서열번호: 8 중에서
1은 T, A, H, I, N 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
2는 F, I, Q, R, V 및 N으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
3은 A, G, N, Q 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
4는 아미노산 잔기 W 또는 Y이며;
5는 A, S, T 및 M으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
6은 N, V, S, F, M 및 W로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
7은 A, H, N 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고; 또
8은 아미노산 잔기 T 또는 A임.
안키린 반복 도메인 또는 고안된 안키린 반복 도메인이 안키린 반복 서열 모티프
Figure 112011029420306-pct00010
(서열번호: 9)를 갖는 반복 모듈을 포함하는 재조합 결합 단백질이 더욱 바람직하고, 서열번호: 9 중에서
1은 K, A, V 및 N로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
2는 N, I 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
3은 T, F, Y 및 W로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
4는 W, D 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
5는 아미노산 잔기 S 또는 A이고;
6은 D, I 및 M으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
7은 L, T 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고; 또
8은 A, H, Y 및 N으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기임.
안키린 반복 도메인 또는 고안된 안키린 반복 도메인이 서열번호: 8의 안키린 반복 서열 모티프를 갖는 반복 모듈을 포함하는 재조합 결합 단백질이 더욱더 바람직하며; 상기 반복 모듈 앞에는 서열번호: 7의 안키린 반복 서열 모티프를 갖는 반복 모듈이 위치하고 및/또는 그 뒤를 이어 서열번호: 9의 안키린 반복 서열 모티프를 갖는 반복 모듈이 존재한다.
안키린 반복 도메인 또는 고안된 안키린 반복 도메인이 안키린 반복 서열 모티프
Figure 112011029420306-pct00011
(서열번호: 10)를 갖는 반복 모듈을 포함하는 재조합 결합 단백질이 더욱 바람직하고, 서열번호: 10 중에서
1은 L, S 및 T로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
2는 G, S 및 C로 이루어진 군으로부터, 바람직하게는 G 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
3은 아미노산 잔기 S 또는 A이고;
4는 Q, S, M 및 N으로 이루어진 군으로부터, 바람직하게는 Q 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
5는 L, M 및 Q로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고; 또
6은 A, H, N, Y 및 D로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기임.
안키린 반복 도메인 또는 고안된 안키린 반복 도메인이 안키린 반복 서열 모티프
Figure 112011029420306-pct00012
(서열번호: 11)를 갖는 반복 모듈을 포함하는 재조합 결합 단백질이 더욱 바람직하고, 서열번호: 11 중에서
1은 Y, H, F, I, L 및 W로 이루어진 군으로부터, 바람직하게는 Y 및 H로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
2는 M, D, I, L 및 V로 이루어진 군으로부터, 바람직하게는 M 및 D로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
3은 G, S 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
4는 아미노산 잔기 W 또는 F이고;
5는 A, G 및 T로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
6은 아미노산 잔기 D 또는 W이고;
7은 아미노산 잔기 L 또는 F이며; 또
8은 A, H, N 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기임.
안키린 반복 도메인 또는 고안된 안키린 반복 도메인이 서열번호: 11의 안키린 반복 서열 모티프를 갖는 반복 모듈을 포함하는 재조합 결합 단백질이 더욱더 바람직하며; 상기 반복 모듈 앞에는 서열번호: 10의 안키린 반복 서열 모티프를 갖는 반복 모듈이 위치한다.
안키린 반복 도메인 또는 고안된 안키린 반복 도메인이 안키린 반복 서열 모티프
Figure 112011029420306-pct00013
(서열번호: 12)를 갖는 반복 모듈을 포함하는 재조합 결합 단백질이 더욱 바람직하고, 서열번호: 12 중에서
1은 K, S, I, N, T 및 V로 이루어진 군으로부터, 바람직하게는 K 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
2는 K, N, W, A, H, M, Q 및 S로 이루어진 군으로부터, 바람직하게는 K 및 N으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
3은 F, Q, L, H 및 V로 이루어진 군으로부터, 바람직하게는 F, Q 및 L으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
4는 아미노산 잔기 F 또는 T이며;
5는 아미노산 잔기 Q 또는 H이고;
6은 아미노산 잔기 Y 또는 S이며;
7은 N, H, Y 및 M으로 이루어진 군으로부터, 바람직하게는 N 및 H로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고; 또
8은 A, H, N 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기임.
안키린 반복 도메인 또는 고안된 안키린 반복 도메인이 안키린 반복 서열 모티프
Figure 112011029420306-pct00014
(서열번호: 13)를 갖는 반복 모듈을 포함하는 재조합 결합 단백질이 더욱 바람직하고, 서열번호: 13 중에서
1은 F, Y, H 및 W로 이루어진 군으로부터, 바람직하게는 F, Y 및 H로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
2는 I, M, D 및 V로 이루어진 군으로부터, 바람직하게는 I, M 및 D로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
3은 아미노산 잔기 F 또는 L이고;
4는 아미노산 잔기 L 또는 P이며;
5는 H, L 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고; 또
6은 A, H, N, C 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기임.
안키린 반복 도메인 또는 고안된 안키린 반복 도메인이 서열번호: 13의 안키린 반복 서열 모티프를 갖는 반복 모듈을 포함하는 재조합 결합 단백질이 더욱더 바람직하며; 상기 반복 모듈 앞에는 서열번호: 12의 안키린 반복 서열 모티프를 갖는 반복 모듈이 위치한다.
다른 바람직한 구체예는 VEGF-Axxx에 대한 결합 특이성을 갖는 적어도 1개의 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질로서, 상기 반복 도메인은 VEGF-Axxx와 결합하기 위해 서열번호: 16, 22, 23, 29, 30 및 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 반복 도메인, 또는 서열번호:16, 22, 23, 29, 30, 33, 34, 36, 39 및 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 반복 도메인과 경쟁한다.
용어 "결합하기 위해 경쟁"한다는 것은 본 발명의 2개의 상이한 결합 도메인이 동일 표적에 대하여 동시에 결합할 수 없지만, 양자 모두 동일 표적에 개별적으로는 결합할 수 있는 것을 의미한다. 따라서, 이러한 2개의 결합 도메인은 상기 표적에 대해 결합하기 위해 경쟁한다. 2개의 결합 도메인이 표적에 대해 결합하기 위해 경쟁하는지 여부를 결정하기 위한 경쟁적 ELISA 또는 경쟁적 SPR 측정(예컨대 바이오라드사가 제조한 프로테온 인스트루먼트를 이용하는 것에 의함)과 같은 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다.
VEGF-Axxx와 결합하기 위해 선택된 반복 단백질과 경쟁하는 재조합 결합 단백질은 경쟁적 효소-결합된 면역흡착성 에세이(ELISA)와 같은 당업자에게 잘 공지된 방법에 의해 확인될 수 있다.
다른 바람직한 구체예는 서열번호: 14 내지 33로 이루어진 군으로부터 선택된, 또는 서열번호: 14 내지 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 VEGF-Axxx에 대한 결합 특이성을 갖는 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질이다.
VEGF-Axxx에 대한 결합 특이성을 갖는 반복 도메인이 상기 반복 도메인 군으로부터 선택된 반복 도메인과 적어도 70% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 재조합 결합 단백질이 또한 바람직하다. 바람직하게는, 상기 아미노산 서열 동일성은 적어도 75%, 더욱 바람직하게는 80%, 더욱 바람직하게는 85%, 더욱 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95%이다.
VEGF-Axxx에 대한 결합 특이성을 갖는 반복 도메인이 상기 반복 도메인 군으로부터 선택된 반복 도메인과 적어도 70% 아미노산 서열 동일성을 갖는 반복 모듈을 포함하는 재조합 결합 단백질이 또한 바람직하다. 바람직하게는, 상기 아미노산 서열 동일성은 적어도 75%, 더욱 바람직하게는 80%, 더욱 바람직하게는 85%, 더욱 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95%이다.
본 발명에 따른 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질의 더욱 바람직한 구체예로서, 상기 반복 도메인의 반복 모듈의 1 이상의 아미노산 잔기는 반복 단위의 정렬 상에서 상응하는 위치에서 발견되는 아미노산 잔기에 의해 교환된다. 바람직하게는, 30% 이하의 아미노산 잔기가 교환되며, 더욱 바람직하게는, 20% 이하, 더욱더 바람직하게는 10% 이하의 아미노산 잔기가 교환된다. 가장 바람직하게는, 이러한 반복 단위는 천연 산출 반복 단위이다. 더욱더 바람직하게는, 상기 반복 도메인은 VEGF-A 또는 VEGFR-2에 대한 결합 특이성을 갖는다.
특히 다른 구체예로서, 30% 이하의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 20% 이하, 더욱더 바람직하게는 10% 이하의 아미노산 잔기는 반복 단위의 상응하는 위치에서 발견되지 않는 아미노산에 의해 교환된다.
다른 구체예로서, 본 명세서에 개시된 VEGF-Axxx 결합 단백질 또는 도메인은 예컨대 VEGFR-2(예컨대 VEGFR-2 결합 폴리펩티드)에 결합하는 잔기; PIGF, 인간 혈청 알부민, 세포성 수용체(예컨대 Her2), 이뮤노글로불린(예컨대 IgGI), 사이토카인(예컨대 TNF-알파 또는 인터루킨) 또는 이중-특이성 결합제를 생성하는 성장 인자와 같은 상이한 표적에 결합하는 잔기; 라벨링 잔기(예컨대 플루오로세인, 또는 방사능 추적자와 같은 형광 라벨); 단백질 정제(예컨대 His- 또는 strep-tag와 같은 소형 펩티드 태그)를 용이하게 하는 잔기; 개선된 치료 효능을 위한 이팩터 기능을 제공하는 잔기(예컨대 항체-의존적 세포-매개된 세포독성을 제공하는 항체의 Fc 부분; 슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 외독소 A(ETA)와 같은 독성 단백질 잔기; 또는 메이탄시노이드 또는 DNA 알킬화제와 같은 소형 분자 독성제) 또는 개선된 약물동력학을 제공하는 잔기를 비롯한 1 이상의 부가적 잔기에 공유 결합할 수 있다. 개선된 약물동력학은 감지된 치료 필요성에 따라 평가될 수 있다. 흔히 단백질이 투여 후 혈청 중에 유용하게 잔존하는 시간을 증가시키는 것에 의해 생체이용성을 증가시키고 및/또는 투여 기간을 증가시키는 것이 바람직하다. 일부 경우에서, 시간 경과에 따른 단백질의 혈청 농도의 연속성을 개선하는 것이 바람직하다(예컨대, 투여 직후의 단백질의 혈청 농도와 다음 투여를 하기 바로 전의 혈청 농도의 차이를 감소시킴). 혈액으로부터 단백질을 느리게 제거하는 경향이 있는 잔기는 히드록시에틸 전분(HES), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 당(예컨대 시알산), 잘 용인되는 단백질 잔기(예컨대 Fc 단편 또는 혈청 알부민), 및 항체 Fc 단편 또는 혈청 알부민과 같이 풍부한 혈청 단백질에 대한 특이성과 친화성을 갖는 결합 도메인 또는 펩티드를 포함한다. 본 발명의 재조합 결합 단백질은 포유류(예컨대 마우스(mouse), 래트(rat), 또는 인간)에서 폴리펩티드의 제거율을 비변성 폴리펩티드에 대하여 3배 이상 더 크게 감소시키는 잔기에 부착될 수 있다.
1 이상의 폴리에틸렌 글리콜 잔기는 결합 단백질 중의 상이한 위치에 부착될 수 있고, 또 이러한 부착은 아민, 티올 또는 기타 적합한 반응기와의 반응에 의해 달성될 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜 잔기의 부착(페길화: PEGylation)은 부위-특이적일 수 있고, 적합한 반응기를 단백질에 도입하여 페길화가 우선적으로 생기는 부위를 생성할 수 있거나, 또는 결합 단백질 내에 원래 존재할 수 있다. 티올 기는 시스테인 잔기 내에 존재할 수 있고; 또 아민 기는 폴리펩티드의 N-말단에서 발견되는 1차 아민 또는 예컨대 리신 또는 아르기닌과 같은 아미노산의 측쇄에 존재하는 아민기일 수 있다. 바람직한 구체예로서, 결합 단백질은 예컨대 말레이미드 기능을 갖는 폴리에틸렌 글리콜 유도체와 반응에 의해 소정 위치에서 시스테인 잔기를 갖도록 변형되어 시스테인 상에서 부위 특이적 페길화를 허용할 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜 잔기는 분자량에서 다양할 수 있고(즉, 약 1 kDa 내지 약 100 kDa) 또 분기되거나 또는 선형일 수 있다. 바람직하게는, 폴리에틸렌 글리콜은 약 1 내지 약 50 kDa, 바람직하게는 약 10 내지 약 40 kDa, 더더욱 바람직하게는 약 15 내지 약 30 kDa, 가장 바람직하게는 약 20 kDa의 분자량을 갖는다.
다른 구체예로서, 본 발명은 특정 재조합 결합 단백질을 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다. 또한 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터도 고려된다.
1 이상의 상술한 결합 단백질, 특히 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질, 또는 특정 재조합 결합 단백질을 암호화하는 핵산분자, 및 경우에 따라 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물이 또한 고려된다. 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제는 당업자에게 공지되어 있고 또 이하에 자세하게 설명된다. 1 이상의 상술한 재조합 결합 단백질, 특히 단복 도메인을 포함하는 결합 단백질을 포함하는 진단용 조성물이 또한 고려된다.
본 발명의 결합 단백질은 VEGF 유도된 병리적 혈관신생, 혈관 누수(부종), 폐 고혈압, 종양 형성 및/또는 염증성 질병을 억제하거나 또는 예방한다. "억제한다"는 것은 상기 재조합 단백질이 상술한 병리를 어느 정도, 예컨대 10% 또는 20%, 더욱 바람직하게는 50%, 특히 70%, 80% 또는 90%, 또는 심지어 95% 방지하는 것을 의미한다.
용어 "부종"은 혈관 누수에 의해 유발된 상태를 의미한다. 염증 동안의 혈관확장 및 투과성 증가는 우세한 병리적 메카니즘일 수 있다. 예를 들어, 부종은 중풍 이후의 경색 팽창에 영향을 주며 또 암환자에서 목숨을 위협하는 두개내 고혈압을 초래할 수 있다. 또한 혈장 단백질의 분출은 잠재적 종양의 전이성 전파를 유발할 수 있고, 또 기도 막힘은 치명적인 천식 공격을 초래할 수 있다. 염증동안 생기는 혈관누수 증가는 호흡기 장애, 복수, 복강 경화(투석 환자에서), 접착형성(복부 수술) 및 전이성 전파를 초래할 수 있다.
용어 "혈관신생"은 새로운 혈관이 형성되는 기본적인 과정을 의미한다. 인간에서 일차적 혈관신생 기간은 배아 발생하는 최초 3개월 동안 걸릴 수 있지만, 혈관신생은 또한 근육 또는 지방 증가와 같은 조직 성장 기간 동안 및 월경 주기 및 임신 기간 동안의 정상적인 생리학적 과정으로도 생길 수 있다.
용어 "병리적 혈관신생"은 몇개의 질병 상태의 유지 및 진전되는 동안 혈관의 형성 및 성장을 지칭한다. 병리적 혈관신생의 특정 예는 혈관(아테롬성 동맥경화증, 혈관종, 혈관내피종), 뼈 및 관절(류마티스성 관절염, 활액막염, 뼈 및 연골 파괴, 골수염, 판누스 성장, 골증식체 형성, 신생물 및 전이), 피부(무사마귀, 화농성 육아종, 털 성장, 카포씨 육종, 흉터 켈로이드, 알레르기성 부종, 신생물), 간, 신장, 폐, 귀 및 기타 상피세포(간염, 사구체신염, 폐렴을 비롯한 염증성 및 감염성 과정; 및 천식, 비용종, 귓병, 이식 장애, 간 재생 장애, 신생물 및 전이), 자궁, 난소 및 태반(자궁내 피임기구, 난포 낭종 형성, 난소 과자극 증후군, 자궁내막증, 신생물에 의한 기능이상의 자궁 출혈), 뇌, 신경 및 눈(미숙아 망막증, 당뇨망막병증, 맥락막 및 기타 눈내부 질병, 백질연화증, 신생물 및 전이), 심장 및 업무 하중에 기인한 골격근, 지방 조직 (비만), 내분비 기관(갑상선염, 갑상선 확장, 췌장 이식 장애), 조혈 (AIDS에서 카포씨 증후군), 혈액종양(백혈병), 및 림프관(종양 전이, 림프증식 질병)에서 찾아 볼 수 있다.
용어 "허혈성 망막 질병"은 망막의 혈액 및 산소 공급이 감소하여서 망막의 주변 부분이 영양원을 상실하여 적절하게 작용하지 못하는 것을 의미한다. 허혈성 망막 질병의 특정 예는 망막병증이다. 망막병증으로 이끄는 공통되는 질병은 당뇨망막병증, 망막중심 정맥폐쇄, 경동맥의 협착증, 및 겸상적혈구 망막병증이다. 당뇨망막병증은 당뇨병 환자에서 시력 상실의 주요 원인이다. 허혈성 망막에서 새로운 혈관의 성장이 발생한다(신혈관신생). 이들 혈관은 흔히 망막 표면, 시신경 또는 홍채 상의 눈 전면에서 성장한다. 새로이 생긴 혈관은 필요한 영양분의 유동을 치환할 수 없고, 대신 유리질 출혈, 망막 박리 및 제어되지 않는 녹내장과 같은 많은 문제를 초래할 수 있다. 이들 문제는 새로이 생긴 혈관이 약해서 출혈하기 쉽기 때문에 생긴다. 초기 단계에서 발견되면, 증식성 당뇨망막병증은 때때로 범망막광응고술(panretinal photocoagulation)에 의해 잡힐 수 있다. 그러나, 일부 경우에서는 유리체절제술이 유일한 방법이다.
이러한 망막병증 이외에, 눈의 혈관 질병은 황반변성 및 당뇨병성 황반부종(DME)과 같은 눈 신생혈관생성 질병을 포함한다. 황반변성은 황반 아래의 맥락막 혈관의 신생 성장에 기인한다. 황반변성에는 2가지 유형이 있다: 건식 및 습식. 습식 황반변성은 모든 황반변성의 15%를 점하고, 거의 모든 습식 황반변성은 실명을 초래한다. 또한, 습식 황반변성은 거의 언제나 건식 황반변성에 기인한다. 1개의 눈이 습식 황반변성에 걸리면, 그 상태는 거의 언제나 다른 눈에 영향을 준다. 습식 황반변성은 노인에서 대부분 발견되기 때문에 연령-관련 습식 황반변성이라 흔히 불린다.
당뇨망막병증(DR) 및 DME는 대부분의 선진국의 노동연령 집단에서 실명의 주요 원인이다. 전세계적으로 당뇨병 환자 수의 증가는 DR 및 DME가 시력 손실과 그와 관련된 수년내에 올 기능 손상에 대한 주요 원인으로 계속될 것이라는 것을 제시한다. 단백질 키나아제 C-β 활성화, 증가된 혈관내피 성장 인자 생성, 산화적 스트레스, 및 세포내 소르비톨과 사슬연장된 글리코실화 최종 생성물의 축적을 비롯한 몇몇 생화학적 메카니즘은 DR/DME를 특징화하는 혈관 파괴에 기여할 수 있다. 이들 경로의 억제는 DR 및 DME를 중지시킬 가능성을 제공한다.
용어 "폐 고혈압"은 폐 동맥에서 혈압이 비정상적으로 높은 질병을 의미한다. 심장 또는 폐의 다른 질병이 없을 때, 이것은 일차적 폐 고혈압이라 불린다. 폐 세동맥의 확산 협소화는 혈액 흐름에 대한 저항성 증가에 반응하여 폐 고혈압에 이은 병리적 동맥 신생의 결과로 생긴다. 발병율은 100,000명 중 8명이다. 그러나, 폐 고혈압은 기종, 만성 기관지염 또는 미만성 간질성 섬유증(diffuse interstitial fibrosis)과 같은 만성 폐색성 폐 질병(COPD)의 복합증으로서 및 천식유사(asthmatiform) COPD에 걸린 환자에서 생길 수 있다. COPD의 발생은 10,000명 중 약 5명이다.
또한 본 발명의 결합 단백질은 염증 및 더욱 자세하게는 염증성 질병을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "염증"은 생존 조직의 손상에 대한 국소적 반응, 특히 작은 혈관의 국소적 반응, 이들의 내용 및 이들이 관련 구조를 의미한다. 혈관벽을 통하여 혈액 성분이 조직으로 통과하는 것은 염증의 표시이며, 이렇게 형성된 조직 콜렉션을 삼출물 또는 부종이라 칭한다. 생존 조직에 손상을 주는 유해 과정, 예컨대 박테리아에 의한 감염, 과열, 냉각, 파쇄와 같은 기계적 손상, 산, 알칼리, 조사(irradiation), 또는 바이러스에 의한 감염은 관련된 기관 또는 조직에 상관없이 염증을 초래할 수 있다. "염증성 질병"으로 분류된 질병 및 화상에서 폐렴, 나병, 결핵, 및 류마티스성 관절염에 이르는 범위의 조직 반응은 모두 "염증"이다.
본 발명에 따른 결합 단백질은 종양 형성을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 용어 "종양"은 뚜렷한 원인 없이 기존의 몸 세포로부터 생기는 비정상적 조직 덩어리를 의미하며, 목적하는 기능이 없으며, 또 자동적이고 제어되지 않는 성장 경향을 특징으로 한다. 종양은 염증성 또는 기타 팽윤과는 아주 상이한데, 이는 종양 중의 세포가 외관 및 기타 특징에서 비정상적이기 때문이다. 비정상 세포, 즉, 종양을 일반적으로 구성하는 세포의 종류는 다음 변형 중의 1 이상을 거치는 점에서 정상 세포와 상이하다: (1) 개별 세포의 비대, 또는 개별 세포 크기의 증대; (2) 주어진 영역에서 세포의 과다형성 또는 세포 수의 증가; (3) 역형성, 또는 어떤 세포의 더욱 원신적 또는 미분화된 유형으로 물리적 특징의 회귀. 종양은 양성, 예컨대 지방종, 혈관종, 골종, 연골종, 및 샘종일 수 있다. 악성 종양의 예는 암종 (유방암, 호흡기 및 위장관, 내분비선 및 비뇨생식계에서 암종), 육종(섬유 조직을 비롯한 결합조직, 비만(지방) 조직, 근육, 혈관, 뼈, 및 연골), 암육종(내피 조직 및 결합 조직에서), 백혈병 및 림프종, 신경 조직(뇌 포함)의 종양, 및 흑색종(착색된 피부 세포의 암)이다. 종양에 대한 본 발명의 결합 단백질의 사용은 조사, 광-다이나믹 요법, 화학요법 또는 수술과 같이 당해 분야에 공지된 기타 종양 요법과 조합하여 이용될 수 있다.
약학적 조성물은 상술한 결합 단백질 및 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함한다(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. [1980]). 당업자에게 공지된 적합한 담체, 부형제 또는 안정화제는 염수, 링거액, 덱스트로오스 용액, 헹크 용액, 고정유, 에틸 올레에이트, 염수 중의 5% 덱스트로오스, 등장성 및 화학적 안정성을 증가시키는 물질, 완충액 및 보존제이다. 다른 적합한 담체는 그 자체가 단백질, 다당류, 폴리젖산, 폴리글리콜산, 중합체성 아미노산 및 아미노산 공중합체와 같은 조성물을 수용하는 개체에 유용한 항체 생산을 유도하지 않는 담체를 포함한다. 약학적 조성물은 또한 항암제 또는 항혈관신생제(예컨대 인간 VEGF-Axxxb; 바람직하게는, 인간 VEGF-A165b)와 같은 부가적 활성제를 포함하는 조합 제형일 수 있다.
안질환을 치료하기 위해 바람직한 약학적 조성물은 상술한 결합 단백질 및 폴리소르베이트 20(예컨대 약 0.04%)과 같은 세제, 히스티딘, 포스페이트 또는 젖산과 같은 완충액 및 수크로오스 또는 트레할로오스와 같은 당을 포함한다. 바람직하게는, 이러한 조성물은 상술한 결합 단백질 및 PBS를 포함한다. 상기 약학적 조성물은 국소적으로 눈의 일부에 투여하거나 또는 예를 들어 결막하, 안구 주변 또는 안구 후방 공간에 또는 눈에 직접 주사되는 것에 의해 투여될 수 있다. 다르게는, 상기 조성물은 비경구적 투여에 의해 전신적으로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 상기 약학적 조성물은 유리체내 주사에 의해 눈에 적용될 수 있다. 또한 바람직하게는, 상기 약학적 조성물은 눈에 국소적으로 및 점적제(eye drop)로 투여될 수 있다. 점적제는 각막(눈의 중심에서 투명한 부분)에 투여되어 상기 분자가 눈으로 투과하게 한다. 눈의 후방에 영향을 주는 질병의 치료를 위해, 결막 아래 또는 안구 주변에 주사되면 상기 결합 단백질이 공막을 침투하는 것이 가장 바람직할 수 있다. 결합 단백질의 투여는 분자의 침투를 개선하기 위하여 눈의 표면을 조절하는 예비 단계 이후에 실시할 수 있다. 바람직하게는, 각각 상피세포와 같은 상피층은 상기 기재한 바와 같이 분자가 충분히 그리고 신속하게 침투하도록 침투 향상제에 의해 조절될 수 있다. 안질환에 대하여 본 발명의 결합 단백질을 사용하는 것은 광-다이나믹 요법과 같은 당해 분야에 공지된 기타 수법과 조합될 수 있다.
체내 투여를 위해 사용되는 제형은 무균 또는 멸균이어야 한다. 이것은 멸균 여과막을 통과시키는 여과에 의해 용이하게 달성할 수 있다.
서방성 제제가 제조될 수 있다. 본 발명의 일 구체예로서, 본 발명의 결합 단백질을 제공하기 위하여 안구내 이식물이 사용될 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 본 발명의 폴리펩티드를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 상기 매트릭스는 성형 물품 형태, 예컨대 필름, 또는 마이크로캡슐 형태이다. 서방성 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔(예컨대, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드, L-글루탐산과 감마-에틸-L- 글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, LUPRON DEPOT®(젖산-글리콜산 공중합체 및 로이프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 미소구체)과 같은 분해성 젖산-글리콜산 공중합체, 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다.
상기 약학적 조성물은 당업자의 지식의 범위 내에서 적합한 방법에 의해 투여될 수 있다. 바람직한 투여 경로는 비경구적이다. 비경구적 투여에서, 본 발명의 약물은 상기 정의한 바와 같은 약학적으로 허용되는 부형제와 조합된 용액, 현탁액 또는 에멀젼과 같은 단위 투여 주사가능 형태로 제형화될 것이다. 투여량 및 투여양식은 처리할 개인 및 특정 질병에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 약학적 조성물은 본 발명의 결합 단백질이 1 ㎍/kg 내지 20 mg/kg, 더욱 바람직하게는 10 ㎍/kg 내지 5 mg/kg, 가장 바람직하게는 0.1 내지 2 mg/kg의 투여량으로 제공되도록 투여된다. 바람직하게는, 볼루스(bolus) 투여로 제공된다. 연속적 주입도 이용될 수 있으며, 이는 삼투적 미니펌프를 통한 연속적 피하 전달을 포함한다. 약학적 조성물은 5 내지 20 ㎍/kg/분, 더욱 바람직하게는 7 내지 15 ㎍/kg/분의 투여량으로 주입될 수 있다. 특히, 상기 약학적 조성물은 본 발명의 결합 단백질이 주사당 0.1 mg 내지 10 mg, 더욱 바람직하게는 주사당 0.3 내지 6 mg, 가장 바람직하게는 주사당 1 mg 내지 4 mg의 투여량으로 제공되도록 눈에 주사에 의해 투여된다. 또한, 상기 약학적 조성물은 본 발명의 결합 단백질을 10 내지 120 mg/ml, 더욱 바람직하게는 20 내지 100 mg/ml, 가장 바람직하게는 40 내지 80 mg/ml의 농도로 함유하는 용액의 단일 점적을 눈에 투여하도록 눈에 점적제로 투여된다.
본 발명의 다른 구체예로서, 상기 기재한 바와 같이 VEGF-Axxx의 활성을 억제하는 결합 단백질은, VEGF-Axxx에 대해 상기 기재한 바와 같이 동일 억제 수준의 PIGF의 활성을 억제하는 결합 단백질 또는 소형 분자와 조합되어 사용될 수 있다. 상기 구체예는 VEGF-Axxx 수준이 증가하는 부위에서 PIGF가 혈관신생성인 것으로 밝혀진 사실을 기초로 한다. 또한, 상기 기재한 바와 같이 VEGF-Axxx의 활성을 억제하는 결합 단백질은 혈소판-유도된 성장 인자(PDGF), VEGF-C 또는 단백질의 VEGF 패밀리의 기타 구성원, 종양 괴사 인자 알파(TNF알파), 델타-리간드 유사 4(DII4), 인터루킨 6(IL-6), 뉴로필린 또는 안기오포이에틴 2(Ang2)의 활성을 억제하는 결합 단백질 또는 소형 분자와 조합되어 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 신규 치료 방법을 제공한다. 일 요지로서, 치료를 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의 본 발명의 결합 단백질, 특히 인간 VEGF-Axxx와 인간 VEGFR-2 사이의 상호작용을 억제하지만 인간 VEGF-Axxxb와 인간 VEGFR-2 사이의 상호작용은 억제하지 않고 VEGFR-2 매개된 혈관신생을 억제하는 결합 단백질을 투여하는 것을 포함하는 망막병증을 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명은 또한 세포에서 VEGF-A 생물학적 활성을 억제하거나 또는 VEGFR-2에 의해 매개된 생물학적 활성을 억제하는 상기 기재한 결합 단백질을 사용하는 방법에도 관한 것이다. 상기 세포는 생체내(in vivo)에 또는 생체 외(ex vivo)에 존재할 수 있고, 또 에컨대 살아있는 생물의 세포, 배양된 세포 또는 조직 샘플 중의 세포일 수 있다. 상기 방법은 상기 세포를 본 명세서에 기재된 VEGF-AA/EGFR-2 상호작용 억제성 결합 단백질과 그러한 생물학적 활성을 억제하기에 충분한 양 및 시간 동안 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.
본 발명은 VEGF-Axxx 또는 VEGFR-2의 억제에 반응하는 상태를 갖는 환자를 치료하기 위한 방법을 제공한다. 이러한 방법은 상기 환자에게 유효량의 상기 기재한 결합 단백질을 투여하는 것을 포함한다. 이러한 상태는 부적절한 혈관신생을 특징으로 하는 것일 수 있다. 이러한 상태는 과증식성 상태일 수 있다. 치료에 적합한 상태(또는 질병)의 예는 자가면역 질병, 염증성 질병, 망막병증(특히 증식성 망막병증) 및 암을 포함하며, 특히 상술한 질병 중의 하나이다. 본 명세서에 기재된 결합 단백질은 그러한 질병, 특히 자기면역 질병, 염증성 질병, 망막병증, 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택된 질병을 치료하기 위한 의약 제조를 위해 사용될 수 있다. 치료에 적합한 바람직한 상태(또는 질병)는 일차 전이성 신장세포 암종, 전이성 신장세포 암종, 재발된 다형성 교모세포종, 애주번트(adjuvant) 대장암, 애주번트 HER2-음성 유방암, 애주번트 HER2-양성 유방암, 애주번트 비-소세포 폐암, 확산 대형 B-세포 림프종, 일차 진전된 위암, 일차 HER2-음성 전이성 유방암, 일차 HER2-양성 전이성 유방암, 일차 전이성 난소암, 위장관 기질 종양, 고위험 카르씨노이드, 호르몬 불응성 전립선암, 새로 진단된 다형성 교모세포종, 전이성 머리암 및 목암, 재발된 백금-민감성 난소암, 이차 전이성 유방암, 확장기 소세포 폐 암, 이전에 치료된 CNS 전이를 갖는 비-편평, 비-소세포 폐암 및 재발된 다발성 골수종, 전립선암, 비-소세포 폐암(NSCLC), 대장암 및 췌장암, 진행된 난소암(AOC), 대증적 악성 복수를 갖는 AOC 환자 및 비-호지킨스 림프종이다.
본 발명에 따른 재조합 결합 단백질은 박테리오파아지(WO 90/02809호, WO 07/006665호) 또는 박테리아 세포(WO 93/10214호)의 표면상에서 디스플레이, 리보솜 디스플레이(WO 98/48008호), 플라스미드 상의 디스플레이(WO 93/08278호)와 같은 몇 가지 방법에 의해, 또는 공유 RNA-반복 단백질 하이브리드 작제물(WO 00/32823호), 또는 단백질 보충 에세이(WO 98/341 120호)와 같은 세포내 발현 및 선별/스크리닝을 이용하는 것에 의해 얻어지거나 및/또는 더욱 개발될 수 있다. 이러한 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명에 따른 재조합 결합 단백질의 선택/스크리닝에 사용된 안키린 반복 단백질의 라이브러리는 당업자에게 공지된 수법에 따라 얻을 수 있다(WO 02/020565호, Binz, H.K. 등, JMB, 332, 489-503, 2003, 및 Binz 등, 2004, 상기 인용문헌 참고). VEGF-Axxx 특이적 DARPins 선택을 위한 이러한 라이브러리의 사용은 실시예 1에 제시되어 있다. 유사하게, 상기 제시된 바와 같은 안키린 반복 서열 모티프는 VEGF-Axxx 특이적 DARPins를 선택 또는 스크리닝하기 위해 사용될 수 있는 안키린 반복 단백질의 라이브러리 작성을 위해 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 반복 도메인은 표준 재조합 DNA 기술(예컨대 WO 02/020565호, Binz et al., 2003, 상기 인용문헌 참고 및 Binz et al., 2004, 상기 인용문헌 참고)을 이용하여 본 발명에 따른 반복 모듈 및 적절한 캡핑 모듈로부터 모듈 조립될 수 있다(Forrer, P., et al., FEBS letters 539, 2-6, 2003).
본 발명은 실시예에 기재된 특정 구체예에 한정되지 않는다. 다른 공급원도 사용될 수 있고 또 이하에 기재된 일반적 개요를 따라 처리될 수 있다.
실시예
이하에 기재된 모든 출발 물질 및 시약은 당업자에게 공지된 것이고, 또 상업적으로 입수가능하거나 또는 공지 수법을 이용하여 제조할 수 있다.
물질
화학물질은 플루카 사(스위스 소재)로부터 구입하였다. 올리고뉴클레오티드는 미크로신쓰(Microsynth)(스위스 소재)로부터 입수하였다. 다르게 나타내지 않는 한, DNA 중합효소, 제한 효소 및 완충액은 뉴 잉글랜드 바이오랩스(미국 소재) 또는 퍼멘타스(리투아니아 소재)로부터 입수하였다. 클로닝 및 단백질 생산 균주는 대장균(E. coli) XL1-블루(스트라타진 제조, 미국 소재)였다. VEGF 변종은 R&D 시스템스(미국 미니아폴리스 소재)로부터 입수하거나 또는 중국 햄스터 난소 세포 또는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 제조한 다음 표준 수순에 따라 정제하였다(Rennel, E. S. et al., European J. Cancer 44, 1883-94, 2008; 인비트로겐사가 제조한 피치아(Pichia) 발현계). 비오티닐화된 VEGF 변종은 표준 비오티닐화 시약 및 방법(Pierce, USA)을 이용하여 정제된 VEGF 변종의 일급 아민에 비오틴 잔기를 커플링하는 것을 통하여 화학적으로 얻었다.
분자 생물학
다르게 나타내지 않는 한, 기재된 수순에 따라서 방법을 실시하였다(Sambrook J., Fritsch E. F. and Maniatis T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1989, New York).
고안된 안키린 반복 단백질 라이브러리
N2C 및 N3C 고안된 안키린 반복 단백질 라이브러리는 다음에 기재되어 있다(WO 02/20565; Binz et al. 2003, 상기 인용문헌 참고; Binz et al. 2004, 상기 인용문헌 참고). N2C 및 N3C에서 숫자는 N-말단 및 C-말단 캡핑 모듈 사이에 존재하는 임의 반복 모듈의 수를 기재한다. 반복 단위와 모듈 내부부의 위치를 결정하기 위해 사용된 명명법은 Binz et al. 2004, 인용문헌을 기본으로 하며, 반복 모듈과 반복 단위의 경계가 1개 아미노산 위치만큼 이동한 변이를 갖는다. 예컨대, Binz 등 2004 (상기 인용문헌 참고)의 반복 모듈의 위치 1은 현재 상세 설명의 반복 모듈의 위치 2에 상응하고 또 Binz 등 2004 (상기 인용문헌 참고)의 반복 모듈의 위치 33은 현재 상세 설명의 이하의 반복 모듈의 위치 1에 상응한다.
모든 DNA 서열은 서열결정화에 의해 확인하였고, 또 모든 기재된 단백질의 산출된 분자량은 중량 분광계에 의해 확인하였다.
실시예 1: VEGF-Axxx에 대한 결합 특이성을 갖는 반복 도메인을 포함하는 결합 단백질의 선택
리보솜 디스플레이(Hanes, J. and Pluckthun, A., PNAS 94, 4937-42, 1997)를 이용하여 VEGF-Axxx에 대한 결합 특이성을 갖는 다수의 고안된 안키린 반복 단백질(DARPins)은 Binz 등 2004(상기 인용문헌 참고)에 의해 기재된 N2C 또는 N3C DARPin 라이브러리로부터 선택하였다. 선택된 클론의 특이적(VEGF-Axxx) 및 비특이적(MBP, 대장균 말토오스 결합 단백질) 표적에 대한 결합은 조 추출물 ELISA에 의해 평가하며, 그에 의해 VEGF-Axxx 결합 단백질이 성공적으로 선택되었음이 밝혀졌다(도 1). 서열번호: 14 내지 40은 VEGF-Axxx에 대한 결합 특이성을 갖는 반복 도메인을 포함하는 선택된 결합 단백질의 아미노산 서열을 구성한다. 선택된 결합제의 서열 분석에 의해 특정의 선택된 결합제 패밀리에 고유한 특정 안키린 반복 서열 모티프가 밝혀졌다. VEGF-Axxx에 대한 결합 특이성을 갖는 반복 도메인에 존재하는 이러한 안키린 반복 서열 모티프는 서열번호: 1 내지 13에 제공되어 있다.
리보솜 디스플레이에 의한 VEGF-Axxx 특정 안키린 반복 단백질의 선택
VEGF-Axxx 특정 안키린 반복 단백질의 선택은 개 VEGF-A164 또는 인간 VEGF-A165를 표적 단백질로 하고, 고안된 안키린 반복 단백질의 라이브러리(WO 02/020565, Binz et al., 2003, 상기 인용문헌 참고 및 Binz et al., 2004, 상기 인용문헌 참고)와 확립된 수순(Zahnd, C, Amstutz, P. and Pluckthun, A., Nat. Methods 4, 69-79, 2007)을 이용하여 리보솜 디스플레이(Hanes and Pluckthun, 상기 인용문헌 참고)에 의해 실시하였다. 리보솜-디스플레이 선택 라운드는 개 또는 인간 VEGF 변종(뉴트래비딘 또는 스트렙트애비딘 상에 고정된 비오티닐화된 변종 포함) 상에서, 확립된 수순(Binz et al. 2004, 상기 인용문헌 참고)을 이용하여 N2C 및 N3C DARPin 라이브러리를 사용하여 실시하였다.
각 선택 라운드 이후 역전사(RT)-PCR 주기의 수는 40에서 30으로 일정하게 감소시켜 결합제 증강에 기인한 수율로 조절하였다. 개 VEGF에서 실시된 최초의 4번의 선택 라운드에 의해 나노몰 친화성 DARPins의 풀(pool)을 얻었으며, 이는 단일 클론의 ELISA 및 SPR 측정에 의해 밝혀졌다. 더욱 개선된 친화성을 갖는 DARPins을 찾기 위하여, 뉴트래비딘 또는 스트렙트애비딘 상에 고정화된 비오티닐화된 인간 또는 개 VEGF 상에서 부가적 오프-레이트(off-rate) 선택을 실시하여, 최초 2번째 및 3번째 리보솜-디스플레이 선택 라운드 이후의 풀을 취한 다음 인간 VEGF 상에서 온-레이트(on-rate) 선택 라운드를 실시하였다.
선택된 클론은 조 추출물 ELISA에 의해 밝혀진 바와 같이 VEGF-Axxx에 특이적으로 결합한다
VEGF-Axxx에 특이적으로 결합하는 개별 선택된 DARPins은 표준 수순을 이용하여 DARPin 발현 세포의 대장균 조 추출물을 사용하는 효소-결합된 면역흡착성 에세이(ELISA)에 의해 확인하였다. 선택된 클론은 pQE30(Qiagen) 발현 벡터에 클로닝하고, 대장균 XL1-Blue(스트라타진 제조)로 형질전환시킨 다음 1 ml 성장 배지(1% 글루코오스 및 100 ㎍/ml 암피실린을 함유하는 2YT)를 함유하는 96-딥-웰 플레이트(단일 웰 중의 각 클론) 중, 37℃에서 철야로 생장시켰다. 50 ㎍/ml 암피실린을 함유하는 새로운 2YT 1 ml를 새로운 96-딥-웰 플레이트 중의 철야 배양액 100 ㎕에 접종하였다. 37℃에서 2시간 동안 배양한 후, IPTG(1 mM 최종 농도)에 의해 발현을 유도하고 3시간 동안 지속시켰다. 세포를 수집하고, 100 ㎕ B-PERII (Pierce)에 재현탁시키고 또 실온에서 교반하면서 15분간 배양하였다. 이어, 900 ㎕의 PBS-TB(0.2% BSA, 0.1% Tween 20가 보충된 PBS, pH 7.4)를 부가하고 또 세포 부서러기를 원심분리에 의해 제거하였다. 100 ㎕의 각 용해된(lysed) 클론은 VEGF-Axxx 변종 또는 이들의 비오틴 잔기를 통하여 고정화된 미관련 MBP를 함유하는 뉴트래비딘 코팅된 MaxiSorp 플레이트의 웰에 부가하여 실온에서 1시간 동안 배양하였다. PBS-T(0.1% Tween 20이 보충된 PBS, pH 7.4)를 사용하여 광범위하게 세척한 후, 플레이트는 1차 항체로서 모노클로날 항-RGS(His)4 항체(34650, Qiagen) 및 이차 시약으로서 알칼리성 포스파타아제(A3562, Sigma)와 결합된 폴리클로날 염소 항-마우스 항체를 사용하여 표준 ELISA 과정을 이용하여 발색시켰다. 이나트륨 4-니트로페닐 포스페이트(4NPP, 플루카 제조)를 알칼리성 포스파타아제에 대한 기질로 사용하는 것에 의해 결합을 검출하였다. 발색은 405 nm에서 측정하였다. VEGF-Axxx에 대한 DARPins 결합을 확인하기 위하여 사용된 조 추출물 ELISA 예로부터 얻은 결과는 도 1에 도시한다. 이러한 조 세포 추출물 ELISA에 의한 수백 클론의 스크리닝에 의해 VEGF-Axxx에 대하여 특이성을 갖는 백개 이상의 상이한 DARPins이 밝혀졌다. 이들 결합 단백질을 선택하여 더 분석하였다. VEGF-Axxx에 특이적으로 결합하는 선택된 안키린 반복 도메인의 아미노산 서열의 예는 서열번호: 14 내지 40에 제공되어 있다.
VEGF-Axxx에 대한 결합 특이성을 갖는 선택된 반복 도메인으로부터 반복 서열 모티프의 추론
VEGF-Axxx에 대한 결합 특이성을 갖는 선택된 반복 도메인의 아미노산 서열은 당업자에게 공지된 서열 분석 도구에 의해 더욱 분석하였다(WO 02/020565호; Forrer et al., 2003, 상기 인용문헌 참고; Forrer, P., Binz, H. K., Stumpp, MT. and Pluckthun, A., ChemBioChem, 5(2), 183-189, 2004). 그럼에도 불구 하고, 천연 산출 반복 모티프를 사용하여 WO 02/020565호와 대조적으로, 여기서는 VEGF-Axxx에 대한 결합 특이성을 갖는 선택된 반복 도메인의 반복 단위로부터 반복 서열 모티프를 추론하였다. 따라서, 공통되는 반복 서열 모티프를 포함하는 선택된 반복 도메인의 패밀리가 결정되었다. VEGF-Axxx에 대한 결합 특이성을 갖는 반복 도메인에 존재하는 이러한 반복 서열 모티프는 서열번호: 1 내지 13에 제공되어 있다.
DARPins의 고 수준 및 용해성 발현
더욱 분석하기 위하여, 상기 기재한 바와 같이 조 세포 추출물 ELISA에서 특정 VEGF-Axxx 결합을 나타내는 선택된 클론을 대장균 XL1-blue 세포에서 발현시키고 또 표준 수순에 따라 이들의 Hig-tag를 사용하여 정제하였다. 1 리터 배양액(동일 배지)을 접종하기 위하여 정지상의 철야 배양액(LB, 1% 글루코오스, 100 mg/l 의 암피실린; 37℃) 25 ml를 사용하였다. A(600) = 0.7에서, 상기 배양액을 0.5 mM IPTG에 의해 유도하고 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 이 배양액을 원심분리하고 또 생성한 펠릿을 40 ml의 TBS500(50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, pH 8)에 재현탁시키고 또 또 초음파처리하였다. 용해물을 재원심분리하고, 생성한 상청액에 글리세롤(10% (v/v) 최종 농도) 및 이미다졸(20 mM 최종 농도)을 부가하였다. 제조사 (QIAgen, 독일)의 지시에 따라서 Ni-니트릴로트리아세트산 컬럼(2.5 ml 컬럼 부피) 상에서 단백질을 정제하였다. SDS-15% PAGE에 의해 산출된 바와 같이, 1 리터의 대장균 배양액으로부터 >95% 순도로 VEGF-Axxx에 대하여 결합 특이성을 갖는 고용해성 DARPins 200 mg 이하가 정제될 수 있었다. 이러한 정제된 DARPins은 더욱 특징화하기 위해 사용된다.
실시예 2: 스페로이드 성장 에세이에서 VEGF-Axxx에 대한 결합 특이성을 갖는 선택된 DARPins의 IC 50 값의 측정
콜라겐 매트릭스에 매립된 HUVEC 스페로이드에 대한 VEGF-Axxx의 부가는 스페로이드 스프라우팅을 초래한다. VEGF-Axxx의 억제제의 부가는 스프라우트 형성을 차단하여서, 스프라우트의 수와 길이가 통계적으로 정량될 수 있다. 상이한 농도의 억제제 및 일정한 양의 VEGF를 부가하는 것에 의해, IC50이 결정될 수 있다.
VEGF-Axxx 특이적 DARPins에 의한 스페로이드 스프라우팅 억제
스페로이드 성장 에세이는 표준 수순(Korff et al., 상기 인용문헌 참고)에 따라서 실시하였다. VEGF-Axxx에 대한 특이성을 갖는 DARPins를 선택하고 실시예 1에 기재된 바와 같이 >96% 순도로 정제하였다. 인간 제대혈관 세포는 단층 배양액에서 콘플루언시(confluency)에 도달할 때까지 성장시켰다. 트립신처리한 후, 세포 현탁액을 헹잉 드롭(hanging drop)에 위치시켜 스페로이드를 형성하며, 즉, 약 500개의 조직화되고 응집된 HUVEC를 얻었다. 이러한 스페로이드를 콜라겐 매트릭스에 매립하고 VEGF-A165에 의해 자극처리하여 스프라우트 성장을 개시하였다. 스프라우팅 억제제를 부가적으로 부가하여 스프라우팅 억제에 대한 이들의 효과를 관찰하였다. 스페로이드당 스프라우트 수 및 스프라우트 길이는 그래피칼 소프트웨어를 이용하여 정량하였다.
2개 예의 스페로이드 스프라우팅 에세이로부터 얻은 결과를 도 2a(VEGF-Axxx에 대한 결합 특이성을 갖는 DARPin #30) 및 도 2b(DARPin NC, VEGF-Axxx에 대한 결합 특이성을 갖지 않는 음성 대조군 DARPin; 예컨대 DARPin E3_5 (Binz et al., 2005, 상기 인용문헌 참고)에 도시한다. 상기 에세이에서 가장 잘 수행하는 DARPins은 10 내지 50 pM 범위의 IC50 값을 나타낸 반면에, Avastin®, Lucentis® 및 Macugen®은 150 내지 500 pM 범위의 평행 실험에서 IC50 값을 나타내었다.
실시예 3: 표면 플라스몬 공명 분석에 의한 Avastin®과 비교한 DARPin #27의 표적 특이성의 결정
개 VEGF-A164 또는 개 VEGF-A164b를 유동 세포에서 고정화시키고 또 고정화된 표적에 대한 DARPin #27(서열번호: 16) 및 Avastin®의 상호작용을 분석하였다.
표면 플라스몬 공명(SPR) 분석
SPR은 프로테온 인스트루먼트(BioRad)를 이용하여 측정하였다. 런닝(running) 완충액은 20 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl 및 0.005% Tween 20이었다. 약 1200 RU의 개 VEGF-A164 또는 개 VEGF-A164b를 GLC 칩(BioRad) 상에 고정화시켰다. 상호작용은 60 ㎕/분의 유량으로 5분 완충액 유동하고, 250 nM의 농도에서 100초간의 Avastin® 또는 DARPin #27 주입 및 수분간의 완충액 유동의 해리 측정으로 측정하였다. 코팅되지 않은 참조 세포의 신호는 상기 측정치로부터 차감하여 얻었다.
그 결과를 도 3a(개 VEGF-A164와의 Avastin 상호작용), 도 3b(개 VEGF-A164b와의 Avastin 상호작용), 도 3c(개 VEGF-A164와의 DARPin #27 상호작용) 및 도 3d (개 VEGF-A164b와의 DARPin #27 상호작용)에 도시한다. Avastin은 분명히 고정화된 VEGF 이소폼과 상호작용한 반면에, DARPin #27은 VEGF-A164와 상호작용할 뿐 VEGF-A164b와는 상호작용을 나타내지 않았다.
실시예 4: 혈관 누수 토끼 모델에서 VEGF-A165 억제에 있어서 DARPin #30의 체내 효능
인간 VEGF-A165의 유리체내 주사에 의해 유도된 혈관 누수를 억제하기 위한 효능을 시험하기 위하여 토끼의 눈에 페길화된 DARPin #30(서열번호: 29) 또는 Lucentis®을 유리체 주사하였다.
토끼에서 혈관 누수 억제 측정
제1일에, 각 토끼의 한쪽 눈에 PBS, 페길화된 DARPin #30(125 ㎍) 또는 동몰량의 Lucentis®(162 ㎍)를 유리체내 주사에 의해 주입하였다(처리된 눈). 제4일 또는 제30일에, 각 토끼의 상기 처리된 눈에 500 ng의 인간 VEGF-A165를 유리체내 주사에 의해 주입하였다. 나트륨 플루오로세인(50 mg/kg 동물 체중, 0.9% (w/v)염수 용액 중 10%(w/v))을 정맥 주사한지 1시간 후 모든 눈에서 플루오로세인 함량을 측정하는 것에 의해, VEGF-A165 주사한 지 48시간에 모든 동물의 양쪽 눈을 평가하였다. 처리된 눈 및 미처리 눈에서 형광량의 비율을 모든 동물에 대해 평가하였다. 비율 1은 처리된 눈에서 부가적 형광 누출의 부재에 상응하며, 1보다 큰 비율은 미처리 대조군 눈에서보다 처리된 눈에서 더 많은 형광 누출이 있음을 나타낸다.
페길화된 DARPin의 제조
단일 Cys 잔기 및 말레이미드 화학을 이용하는 것에 의한 단백질의 페길화는 당업자에게 잘 공지되어 있고 또 확립된 수순(예컨대 Pierce에 제시된 바와 같이)에 따라 실시할 수 있다. 표준 크로마토그래피 방법을 이용하여, 부가적 C-말단 링커(GGGSGGGSC, 서열번호: 41)를 포함하는 DARPin #30를 거의 균질에 가깝게 정제하였다. 이 단백질은 DTT를 사용하여 완전히 환원시키고 또 겔 여과에 의해 DTT를 제거하여 정제하고 또 완충액을 PBS로 교환하였다. PBS에 용해된 PEG-말레이미드(메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)-옥소프로필아미노-프로필 말레이미드; NOF, no. Sunbright ME-200MA)를, 실온에서 2-4시간 동안 약 15% 몰 과량의 PEG-말레이미드가 되도록 PBS 중의 DARPin와 혼합하였다. 페길화된 DARPin은 표준 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 비-반응성 DARPin 및 비-반응성 PEG 잔기로부터 분리하였다.
그 결과를 도 4에 도시한다. 페길화된 DARPin #30 및 Lucentis®는 유리체내 주사에 의해 이들이 적용된지 4일 후 VEGF-A165 유도된 혈관 누수로부터 토끼 눈을 보호할 수 있었다. 그럼에도 불구 하고, Lucentis®이 아니라 페길화된 DARPin #30 만이 유리체내 주사한지 30일까지 VEGF-A165 유도된 혈관 누수로부터 토끼 눈을 보호할 수 있었다.
<110> Molecular Partners AG Binz, Hans Kaspar Forrer, Patrik Stumpp, Michael Tobias <120> Binding Proteins inhibiting the VEGF-A receptor interaction <130> P368A <150> EP08168166.0 <151> 2008-11-03 <160> 41 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ankyrin repeat sequence motif <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 1 Xaa Asp Xaa Xaa Gly Xaa Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Xaa Xaa Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Xaa Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 2 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ankyrin repeat sequence motif <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 2 Xaa Asp Xaa Xaa Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Xaa Xaa Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Xaa Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 3 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ankyrin repeat sequence motif <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 3 Xaa Asp Xaa Xaa Gly Xaa Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Xaa Xaa Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Xaa Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Xaa <210> 4 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ankyrin repeat sequence motif <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 4 Xaa Asp Xaa Xaa Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Xaa Ala Asp Leu Gly 1 5 10 15 Xaa Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Xaa Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Xaa <210> 5 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ankyrin repeat sequence motif <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 5 Xaa Asp Xaa Xaa Gly Xaa Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Xaa Xaa Gly 1 5 10 15 His Xaa Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Xaa Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 6 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ankyrin repeat sequence motif <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 6 Xaa Asp Xaa Xaa Gly Xaa Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Xaa Xaa Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Xaa Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 7 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ankyrin repeat sequence motif <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 7 Xaa Asp Xaa Xaa Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Xaa Xaa Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Xaa Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 8 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ankyrin repeat sequence motif <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 8 Xaa Asp Xaa Xaa Gly Xaa Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Xaa Xaa Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Xaa Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Xaa <210> 9 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ankyrin repeat sequence motif <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 9 Xaa Asp Xaa Xaa Gly Xaa Thr Pro Leu His Leu Xaa Ala Xaa Xaa Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Xaa Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 10 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ankyrin repeat sequence motif <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 10 Xaa Asp Phe Lys Xaa Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Xaa Xaa Gly 1 5 10 15 His Xaa Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Xaa Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 11 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ankyrin repeat sequence motif <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (13)..(15) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 11 Xaa Asp Xaa Leu Xaa Xaa Thr Pro Leu His Leu Ala Xaa Xaa Xaa Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Xaa Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 12 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ankyrin repeat sequence motif <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 12 Xaa Asp Xaa Xaa Gly Xaa Thr Pro Leu Xaa Leu Ala Ala Xaa Xaa Gly 1 5 10 15 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Xaa Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 13 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ankyrin repeat sequence motif <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 13 Xaa Asp Xaa Xaa Gly Trp Thr Xaa Leu His Leu Ala Ala Asp Leu Gly 1 5 10 15 Xaa Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Xaa Gly Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala <210> 14 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ankyrin repeat domain <400> 14 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu 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Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Thr Asp Val Ser Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Thr Lys Asp Asn Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ser Ala Asp 100 105 110 Leu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp 115 120 125 Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile 130 135 140 Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala 145 150 155 <210> 16 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ankyrin repeat domain <400> 16 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Phe Asp Trp Met Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala His Glu Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Thr Asp Val Ser Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Thr Lys Asp Asn Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ser Ala Asp 100 105 110 Leu Gly Arg Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp 115 120 125 Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile 130 135 140 Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala 145 150 155 <210> 17 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ankyrin repeat domain <400> 17 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Phe Asp Trp Met Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala His Glu Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Thr Asp Val Asn 50 55 60 Ala Thr Asp Val Ser Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Thr Lys Asp Asn Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ser Ala Asp 100 105 110 Leu Gly His Leu Glu Ile Val 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Leu Lys Asn Gly Ala Asp 115 120 125 Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile 130 135 140 Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala 145 150 155 <210> 24 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ankyrin repeat domain <400> 24 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Arg Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Pro Trp Gly 35 40 45 His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Ala Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Val 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp 100 105 110 Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 25 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ankyrin repeat domain <400> 25 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Arg Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Pro Trp Gly 35 40 45 His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Ala Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Val 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp 100 105 110 Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 26 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ankyrin repeat domain <400> 26 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Thr 20 25 30 Ala Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Pro Trp Gly 35 40 45 His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala His Asp Tyr Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Thr Leu 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp 100 105 110 Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 27 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ankyrin repeat domain <400> 27 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Thr 20 25 30 Ala Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Val Ala Pro Trp Gly 35 40 45 His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Thr His Asp Tyr Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Thr Leu 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Arg Tyr Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp 100 105 110 Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 28 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ankyrin repeat domain <400> 28 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Thr 20 25 30 Ala Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro Met His Leu Ala Ala Pro Trp Gly 35 40 45 His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Gln Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Ile 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp 100 105 110 Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 29 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ankyrin repeat domain <400> 29 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Thr 20 25 30 Ala Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Val Pro Trp Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Ile 65 70 75 80 Gly His Gln Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp 100 105 110 Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 30 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ankyrin repeat domain <400> 30 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Val Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asp Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Ser Asp Phe Lys Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Gln Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Tyr Asp Met Leu Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Leu 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Arg Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp 100 105 110 Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 31 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ankyrin repeat domain <400> 31 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Val Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Ser Asp Phe Lys Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Gln Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Ser Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Phe Asp Leu Leu Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Leu 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp 100 105 110 Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 32 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ankyrin repeat domain <400> 32 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Val Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Leu Asp Phe Lys Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Ser Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala His Asp Met Leu Ser Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Gly Asp Leu 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Arg Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp 100 105 110 Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 33 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ankyrin repeat domain <400> 33 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Val Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Thr Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Gln Phe Gly Phe Thr Pro Leu Gln Leu Ala Ala Tyr Asn Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Phe Asp Ile Phe Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Leu 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Arg Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp 100 105 110 Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 34 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ankyrin repeat domain <400> 34 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Val Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Ser Asp Asn Gln Gly Thr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser His Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Asp Ala His Asp Asp Leu Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ser Ala Asp 65 70 75 80 Leu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp 85 90 95 Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile 100 105 110 Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 35 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ankyrin repeat domain <400> 35 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Thr Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Ser Asp Asn Gln Gly Thr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser His Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Asp Ala His Asp Asp Leu Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp 65 70 75 80 Leu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp 85 90 95 Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile 100 105 110 Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 36 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ankyrin repeat domain <400> 36 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Val Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asp Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Ser Asp Phe Lys Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Gln Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Tyr Asp Met Leu Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Leu 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Arg Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp 100 105 110 Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 37 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ankyrin repeat domain <400> 37 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Val Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Asp Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Ser Asp Phe Lys Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Gln Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Tyr Asp Met Leu Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Leu 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp 100 105 110 Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 38 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ankyrin repeat domain <400> 38 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Thr 20 25 30 Leu Asp Phe Lys Ser Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Ser Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala His Asp Met Leu Ser Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Gly Asp Leu 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp 100 105 110 Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 39 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ankyrin repeat domain <400> 39 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Ile Tyr Gly Arg Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Leu His Gly 35 40 45 His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Asn Asp Tyr Trp Gly Thr Thr Ser Leu His Leu Val Ala Ile Trp 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Val Asp Asp Ile Gly Gln Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala 100 105 110 Trp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp 115 120 125 Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile 130 135 140 Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala 145 150 155 <210> 40 <211> 158 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ankyrin repeat domain <400> 40 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Asn Asp Tyr Asp Gly Met Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Met Glu Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Asn Asp His Tyr Gly Phe Thr Pro Leu His Leu Ala Trp Thr Gly 65 70 75 80 Arg Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn 85 90 95 Ala Ala Asp Val Phe Gly Arg Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Thr Ser 100 105 110 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val 115 120 125 Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp 130 135 140 Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala 145 150 155 <210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> GS linker <400> 41 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Cys 1 5

Claims (25)

  1. 적어도 1개의 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질로서,
    상기 안키린 반복 도메인은 10-7M 미만의 Kd로 혈관 내피 성장인자-A165 (VEGF-A165)와 결합하여 VEGFR-2에 대한 VEGF-A165 결합을 억제하고,
    상기 안키린 반복 도메인은 안키린 반복 서열 모티프
    Figure 112016055986958-pct00028
    (서열번호: 5)를 갖는 반복 모듈을 포함하는,
    재조합 결합 단백질:
    서열번호: 5 중에서
    1은 A, N, R, V, Y, E, H, I, K, L, Q, S 및 T로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
    2는 S, A, N, R, D, F, L, P, T 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
    3은 T, V, S, A, L 및 F로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
    4는 W, F 및 H로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
    5는 P, I, A, L, S, T, V 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
    6은 W, F, I, L, T 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
    7은 아미노산 잔기 P이고; 또
    8은 A, H, N 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기임.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 안키린 반복 도메인은 10 nM 미만의 IC50 값으로 인간 제대혈관 내피 세포(Human umbilical vein endothelical cell: HUVEC) 스페로이드(spheroid)의 스프라우팅(sprouting)을 억제하는, 결합 단백질.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제 1항에 있어서, 상기 안키린 반복 도메인은
    Figure 112016055986958-pct00029
    (서열번호:6)의 안키린 반복 서열 모티프를 갖는 반복 모듈을 포함하며,
    상기 반복 모듈 앞에는 서열번호: 5의 안키린 반복 서열 모티프를 갖는 반복 모듈이 위치하며,
    상기 안키린 반복 서열 모티프
    Figure 112016055986958-pct00030
    (서열번호:6)에서
    1은 H, Q, A, K, R, D, I, L, M, N, V 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기이고;
    2는 Y, F 및 H로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
    3은 Q, F 및 T로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
    4는 W, M, G, H, N 및 T로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
    5는 T, A, M, L 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
    6은 I, L, V, D 및 T로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이며; 또
    7은 A, H, N 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기인,
    결합 단백질.
  11. 삭제
  12. 제 1항에 있어서, 상기 안키린 반복 도메인은 인간 VEGF-A165에 결합하기 위해 서열번호: 29의 안키린 반복 도메인과 경쟁하는, 결합 단백질.
  13. 제 1항에 있어서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열번호: 24 내지 26으로 이루어진 군으로부터 선택되는 결합 단백질.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 제 1항에 있어서, 공유결합으로 부착된 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 부가적으로 포함하는 결합 단백질.
  17. 삭제
  18. 제 1항, 제2항, 제10항, 제12항, 제13항 또는 제16항 중 어느 한 항에 따른 결합 단백질, 및 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하며, 안질환 또는 병리적 혈관신생 치료용 약학적 조성물.
  19. 제 18항에 있어서, 안질환 치료용 약학적 조성물.
  20. 제 18항에 있어서, 사람을 비롯한 포유류에서 병리적 혈관신생 치료용 약학적 조성물.
  21. 제 10항에 있어서, 서열번호: 6 중의 7이 아미노산 잔기 A인 결합 단백질.
  22. 제 1항에 있어서, 상기 안키린 반복 도메인이 2개 이상의 연속적 반복 모듈을 포함하는 결합 단백질.
  23. 제 1항에 있어서, 상기 안키린 반복 서열 모티프
    Figure 112016055986958-pct00031
    (서열번호: 5)에서,
    1은 A, N, R, V, Y, E, H, I, K, L, Q, S 및 T로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
    2는 S, A, N 및 R로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
    3은 T, V, S, A 및 L로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
    4는 W, F 및 H로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
    5는 P 및 I로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
    6은 W, F, I, L, T 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
    7은 아미노산 잔기 P이고; 또
    8은 A, H, N 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기인, 결합 단백질.
  24. 제 1항에 있어서, 상기 안키린 반복 서열 모티프
    Figure 112016055986958-pct00032
    (서열번호: 5)에서,
    1은 A, N, R, V 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
    2는 S, A, N 및 R로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
    3은 T, V 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
    4는 W, F 및 H로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
    5는 P 및 I로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
    6은 W, F, I, L, T 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
    7은 아미노산 잔기 P이고; 또
    8은 A, H, N 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기인, 결합 단백질.
  25. 제 1항에 있어서, 상기 안키린 반복 서열 모티프
    Figure 112016055986958-pct00033
    (서열번호: 5)에서,
    1은 A 및 R로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
    2는 S, A, N 및 R로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
    3은 T, V 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
    4는 W, F 및 H로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
    5는 P 및 I로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
    6은 W, F, I, L, T 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
    7은 아미노산 잔기 P이고; 또
    8은 A, H, N 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기인, 결합 단백질.

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