ES2878405T3 - Uso de inhibidores de flap para reducir la lesión mediada por neuroinflamación en el sistema nervioso central - Google Patents

Abstract

Un inhibidor de la proteína activadora de la 5-lipoxigenasa (FLAP) para su uso en el tratamiento de la neuroinflamación provocada por un evento de traumatismo craneoencefálico en un animal, en donde dicho inhibidor de FLAP es MK-591 y es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica de un animal; y dicho inhibidor de FLAP se administra a dicho animal en una cantidad y en un tiempo después de un evento de traumatismo craneoencefálico en donde dicha cantidad y dicho tiempo son suficientes para que dicho inhibidor de FLAP reduzca un nivel de leucotrienos producidos en el cerebro de dicho animal como resultado de dicho evento de traumatismo craneoencefálico.

Description

DESCRIPCIÓN

Uso de inhibidores de flap para reducir la lesión mediada por neuroinflamación en el sistema nervioso central Campo técnico

La presente invención se refiere en general a inhibidores de la proteína activadora de la 5-lipoxigenasa (FLAP) para su uso en un método de tratamiento de la neuroinflamación y la lesión mediada por la neuroinflamación resultante de diversos eventos de lesión cerebral tales como traumatismo craneoencefálico, ictus, esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer y trastorno de estrés postraumático.

Antecedentes de la invención

De acuerdo con los centros de control y prevención de enfermedades (CDC, del inglés 'Centers for Disease Control and Prevention'), solo en los Estados Unidos hay más de 2,5 millones de casos informados de traumatismo craneoencefálico (TBI) cada año. Se cree que más de 5 a 6 millones de casos de TBI en los Estados Unidos por año no se informan porque no se cree que sean lo suficientemente graves como para ser tratados en entornos hospitalarios, denominados como TBI leves (mTBI, del inglés 'mild TBI') y, por lo tanto, se tratan en entornos no hospitalarios o no se tratan en absoluto. Estas estadísticas no incluyen los muchos eventos de TBI, tanto mTBI como TBI más graves, que sufre el personal militar a diario en los múltiples conflictos en los que están implicados fuera de los Estados Unidos. Estas estadísticas tampoco incluyen los eventos de TBI sufridos por otros fuera de los Estados Unidos. Solo recientemente la comunidad médica se ha dado cuenta de que las consecuencias del llamado TBI leve pueden no ser leves a largo plazo. La investigación epidemiológica ha identificado a los mTBI como un importante problema de salud pública. Ha surgido evidencia de investigación clínica que sugiere que para algunos pacientes incluso el mTBI, además de un TBI más severo, puede conducir a síntomas físicos y neurocognitivos prolongados meses o años después de que ocurrió la lesión cerebral. La neuropatología del TBI humano se caracteriza por una lesión axonal difusa que conduce a alteraciones de la conectividad funcional de varias regiones del cerebro y una neuroinflamación prolongada como lo demuestran astrocitos reactivos, microglía activada y microhemorragias en regiones de materia gris y tractos de la materia blanca.

Las lesiones cerebrales agudas y crónicas y los trastornos degenerativos pueden activar las células cerebrales residentes, tales como los astrocitos y la microglía, y reclutar células inmunitarias periféricas para las regiones cerebrales lesionadas, lo que da como resultado una neuroinflamación amplificada y un agravamiento del daño cerebral. Los leucotrienos (LT) son potentes lípidos bioactivos que median la inflamación. Murphy R. C., et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 76:4275-4279, 1979. La biosíntesis de los leucotrienos se inicia por la lesión mecánica de las células y la escisión enzimática del ácido araquidónico (AA) de los glicerolfosfolípidos de la membrana. Folco, G. y Murphy R. C., Pharmacol. Rev. 58, 375-388, 2006. La acción enzimática de la 5-lipoxigenasa (5-LO) y la proteína activadora de la 5-lipoxigenasa (FLAP) convierte el AA en leucotrieno A⁴ (LTA⁴). El LTA⁴ se convierte rápidamente en leucotrieno B⁴ (LTB⁴) mediante LTA⁴-hidrolasa o a leucotrieno C⁴ (LTC⁴) mediante LTC⁴-sintasa. A continuación, el LTC⁴ se puede convertir en leucotrieno D⁴ (LTD⁴) y leucotrieno E⁴ (LTE⁴), y estos tres LT (LTC⁴, LTD⁴ y LTE⁴) se conocen colectivamente como cisteinil leucotrienos. Las acciones de los cisteinil leucotrienos se han estudiado principalmente en el contexto del asma, donde se sabe que inducen permeabilidad vascular, extravasación de moléculas grandes, estimulación de la liberación de citocinas y contracción del músculo liso bronquial. Boyce J. A., Immunol. Rev. 217, 168-185, 2007. Los leucotrienos son indetectables en el cerebro sano. Farias S., et al. J. Neurotraum. 26, 1977-1986, 2009. Sin embargo, después de un traumatismo craneoencefálico (TBI) o un ictus, los leucotrienos se sintetizan mediante un mecanismo transcelular que implica la infiltración de neutrófilos o microglía endógena y células cerebrales endógenas. Farias S., J. Neurochem. 103, 1310-1318, 2007; Farias S., et al. J. Neurotraum. 26, 1977-1986, 2009.

Es deseable proporcionar un método para mejorar la neuroinflamación y la neurodegeneración que acompaña a los eventos de lesiones cerebrales tales como TBI, ictus, esclerosis múltiple y enfermedad de Alzheimer. Además, algunas investigaciones recientes parecen sugerir que el trastorno de estrés postraumático (PTSD, del inglés 'posttraumatic stress disorder') puede tener un componente de neurodegeneración y, por lo tanto, también es un posible candidato para un método para reducir la neurodegeneración y la neuroinflamación. Sería beneficioso prevenir varios efectos físicos y efectos cognitivos secundarios de estos eventos de lesión cerebral.

C. Voight et al., (Neuropathology and Applied Neurobiology, vol. 38, n.° 4, 2012, páginas 354-356) describe el efecto de los inhibidores de leucotrienos sobre la evolución de las contusiones cerebrales. En particular, describe la administración del indol MK-886.

Hartig et al., (Brain Research, vol. 1498, 2012, páginas 69-84) describe el efecto de los inhibidores de la 5-lipoxigenasa sobre la distribución espacio-temporal de las células inflamatorias y la expresión neuronal de COX-2 después de un traumatismo craneoencefálico experimental en ratas. En particular, este documento evalúa el efecto del tratamiento con el indol MK-886 y un inhibidor de 5-LOX Boscari.

Santiago Farias et al., (Journal of Neurotrauma, vol. 26, n.° 11, 2009, páginas 1977-1986) describe que la reducción farmacológica de la formación de cisteinil leucotrienos después de una lesión cerebral (utilizando el indol MK-886) dio como resultado una reducción de los volúmenes de la lesión cerebral.

Chelsea E. Corser-Jensen et al. (Experimental Neurology, vol. 256, 1 de junio de 2014, páginas 7-16) describe investigaciones sobre la eficacia del indol MK-886 en el bloqueo de la síntesis de leucotrienos, daño cerebral secundario, disfunción sináptica y deterioro cognitivo después de un traumatismo craneoencefálico.

Sumario de la invención

La invención es como se define en las reivindicaciones adjuntas.

En particular, de acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un inhibidor de la proteína activadora de 5-lipoxigenasa (FLAP) para su uso en el tratamiento de la neuroinflamación provocada por un evento de traumatismo craneoencefálico en un animal, en donde dicho inhibidor de FLAP es MK-591 y es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica de un animal; y dicho inhibidor de FLAP se administra a dicho animal en una cantidad y en un tiempo después de un evento de traumatismo craneoencefálico en donde dicha cantidad y dicho tiempo son suficientes para que dicho inhibidor de FLAP reduzca un nivel de leucotrienos producidos en el cerebro de dicho animal como resultado de dicho evento de traumatismo craneoencefálico.

De acuerdo con un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona un inhibidor de la proteína activadora de 5-lipoxigenasa (FLAP) para su uso en un método de reducción del daño mediado por la neuroinflamación del sistema nervioso central resultante de un evento de traumatismo craneoencefálico en un animal en donde dicho inhibidor de FLAP es MK-591 y es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica de un animal; y dicho inhibidor de FLAP se administra a un animal en una cantidad y en un tiempo después de un evento de traumatismo craneoencefálico en donde dicha cantidad y dicho tiempo son suficientes para que dicho inhibidor de FLAP reduzca dicho daño mediado por la neuroinflamación del sistema nervioso central como resultado de dicho evento de traumatismo craneoencefálico en dicho animal.

De acuerdo con un tercer aspecto de la presente invención, se proporciona un inhibidor de la proteína activadora de 5-lipoxigenasa (FLAP) para su uso en el tratamiento de la neuroinflamación provocada por un evento de traumatismo craneoencefálico en un animal, en donde dicho inhibidor de FLAP es una quinolina-indol y es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica del animal y se administra a dicho animal por vía intranasal en una cantidad y en un tiempo después de un evento de traumatismo craneoencefálico en donde dicha cantidad y dicho tiempo es suficiente para que dicho inhibidor de FLAP reduzca un nivel de leucotrienos producidos en el cerebro de dicho animal como resultado de dicho evento de traumatismo craneoencefálico.

De acuerdo con un cuarto aspecto de la presente invención, se proporciona un inhibidor de la proteína activadora de 5-lipoxigenasa (FLAP) para su uso en un método de reducción del daño mediado por la neuroinflamación del sistema nervioso central resultante de un evento de traumatismo craneoencefálico en un animal, en donde dicho inhibidor de FLAP es una quinolina-indol y es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica del animal y se administra a un animal por vía intranasal en una cantidad y en un tiempo después de un evento de lesión cerebral, en donde dicha cantidad y dicho tiempo son suficientes para que dicho inhibidor de FLAP reduzca dicho daño mediado por la neuroinflamación del sistema nervioso central como resultado de dicho evento de traumatismo craneoencefálico en dicho animal.

La presente divulgación demuestra que la producción temprana de leucotrienos después de un traumatismo craneoencefálico (TBI) indica efectos adversos que incluyen la interrupción de la barrera hematoencefálica (BBB) y edema, eventos perjudiciales tempranos que conducen a una muerte celular adicional, lesión axonal y alteraciones neurológicas. Además, la presente divulgación describe y muestra que los eventos de lesión cerebral conducen a una neuroinflamación a largo plazo en múltiples regiones del cerebro. Los presentes inventores han utilizado dos modelos animales de lesión cerebral, específicamente un modelo de lesión por percusión hídrica de rata de TBI y un modelo de traumatismo craneoencefálico cerrado (CHI) de ratón de TBI leve. Los inventores creen que los resultados tienen implicaciones y sugieren tratamientos para otros eventos de lesiones cerebrales además del TBI, incluyendo el ictus, la esclerosis múltiple, la enfermedad de Alzheimer y el trastorno de estrés postraumático (PTSD). Los inventores también han descubierto que el bloqueo de la producción de leucotrienos mediante la administración de inhibidores de FLAP que llegan al sistema nervioso central (SNC) bloquea significativamente el edema, la interrupción de BBB, la muerte celular y la neuroinflamación, así como las deficiencias cognitivas y motoras que ocurren después de un TBI. Se sabe que los inhibidores de FLAP tienen varias vías factibles de administración periférica que incluyen la oral, intravenosa, supositorio e intraperitoneal y no han informado de toxicidad o efectos perjudiciales. Los inventores proporcionan evidencia de que una vía de administración intranasal, que pasa por alto la barrera hematoencefálica, da como resultado una administración rápida de inhibidores de FLAP al cerebro con relativamente menos fármaco administrado sistémicamente en la sangre y el sistema circulatorio. Por lo tanto, esta clase de agentes antiinflamatorios proporciona nuevos candidatos a fármacos prometedores para la terapia intervencionista después de un TBI, ictus, esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer y trastorno de estrés postraumático (PTSD). Actualmente no existe ningún tratamiento que mitigue el daño cerebral y la disfunción neurológica después de un TBI.

La presente divulgación describe además que cuando se administran inhibidores de FLAP antes de los eventos de lesión cerebral, mitigan la muerte celular, el edema y los déficits cognitivos. Por lo tanto, además de utilizar inhibidores de FLAP poco después de una lesión cerebral para bloquear o mitigar una lesión secundaria o después de situaciones neuroinflamatorias prolongadas, los inhibidores de FLAP tienen un papel preventivo potencial profiláctico en eventos de lesión cerebral tales como TBI, por el que las personas con alto riesgo de lesión en la cabeza, incluyendo atletas en deportes de alto contacto y personal militar en escenarios de combate, podrían recibir inhibidores de FLAP de forma crónica o antes de un evento que los predisponga al riesgo de traumatismo craneoencefálico o lesión cerebral. Los inhibidores de FLAP de segunda generación tienen semividas más largas y, por lo tanto, posiblemente podrían administrarse una vez al día para proteger contra lesiones cerebrales. Se cree que los inhibidores de FLAP de la presente divulgación también se pueden utilizar para tratar la neuroinflamación asociada al ictus, la esclerosis múltiple, la enfermedad de Alzheimer y el trastorno de estrés postraumático.

Un fármaco que bloquea o atenúa el daño cerebral secundario después de un TBI probablemente evitaría la mayoría de las muertes y discapacidades a largo plazo después de un TBI. La administración nasal de fármacos tiene varias ventajas importantes sobre otros métodos de administración de fármacos: 1) la administración nasal de fármacos evita la BBB, lo que aumenta la biodisponibilidad del cerebro y permite el uso de compuestos que no pueden atravesar la barrera hematoencefálica, 2) la administración nasal de fármacos limita la cantidad de fármaco que ingresa a la circulación sistémica, lo que reduce el potencial de toxicidad hepática y cardíaca, 3) la administración nasal de fármacos es muy rápida, un factor importante para la intervención del TBI, y 4) el método de administración nasal es rápido y simple, lo que lo hace muy adecuado para un entorno de uso profiláctico o para administrar el tratamiento poco después del evento de TBI.

En un ejemplo de la presente divulgación se describe un método para tratar la neuroinflamación provocada por un evento de lesión cerebral en un animal que comprende las etapas de: proporcionar un inhibidor de la proteína activadora de 5-lipoxigenasa (FLAP), en donde el inhibidor de FLAP puede atravesar la barrera hematoencefálica de un animal; administrar el inhibidor de FLAP al animal en una cantidad y en un tiempo antes de un evento de lesión cerebral o un tiempo después de un evento de lesión cerebral en donde la cantidad y el tiempo son suficientes para que el inhibidor de FLAP reduzca el nivel de leucotrienos producidos en el cerebro del animal como resultado del evento de lesión cerebral.

En un ejemplo de la presente divulgación se describe un método para reducir el daño mediado por la neuroinflamación del sistema nervioso central resultante de un evento de lesión cerebral en un animal que comprende las etapas de: proporcionar un inhibidor de la proteína activadora de 5-lipoxigenasa (FLAP), en donde el inhibidor de FLAP puede atravesar la barrera hematoencefálica de un animal; administrar el inhibidor de FLAP a un animal en una cantidad y en un tiempo antes de un evento de lesión cerebral o un tiempo después de un evento de lesión cerebral en donde la cantidad y el tiempo son suficientes para que el inhibidor de FLAP reduzca el daño mediado por la neuroinflamación del sistema nervioso central como resultado del evento de lesión cerebral en el animal.

En un ejemplo de la presente divulgación se describe un método para tratar la neuroinflamación provocada por un evento de lesión cerebral en un animal que comprende las etapas de: proporcionar un inhibidor de la proteína activadora de 5-lipoxigenasa (FLAP); administrar el inhibidor de FLAP al animal por vía intranasal en una cantidad y en un tiempo antes de un evento de lesión cerebral o un tiempo después de un evento de lesión cerebral en donde la cantidad y el tiempo son suficientes para que el inhibidor de FLAP reduzca el nivel de leucotrienos producidos en el cerebro del animal como resultado del evento de lesión cerebral.

En un ejemplo de la presente divulgación se describe un método para reducir el daño mediado por la neuroinflamación del sistema nervioso central resultante de un evento de lesión cerebral en un animal que comprende las etapas de: proporcionar un inhibidor de la proteína activadora de 5-lipoxigenasa (FLAP); administrar el inhibidor de FLAP a un animal por vía intranasal en una cantidad y en un tiempo antes de un evento de lesión cerebral o un tiempo después de un evento de lesión cerebral en donde la cantidad y el tiempo son suficientes para que el inhibidor de FLAP reduzca el daño mediado por la neuroinflamación del sistema nervioso central como resultado del evento de lesión cerebral en el animal.

Estas y otras características y ventajas de la presente divulgación resultarán más evidentes para los expertos en la materia a partir de la descripción detallada de varios ejemplos. Los dibujos que acompañan a la descripción detallada se describen a continuación.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un esquema que demuestra la biosíntesis transcelular de leucotrienos en el tejido cerebral inmediatamente después y en respuesta a un evento de lesión cerebral o neuroinflamación;

La figura 2A, panel izquierdo, muestra tinción con hematoxilina y eosina (H&E) de la corteza 6 horas después de un TBI tanto para el hemisferio izquierdo ipsilateral como para el hemisferio derecho contralateral;

La figura 2B, panel derecho, demuestra que los neutrófilos o monocitos contribuyen a la producción de leucotrienos inducida por lesiones en el cerebro después de un TBI como lo demuestran los efectos del tratamiento previo con vinblastina;

La figura 3A muestra los niveles de LTC4 en los hemisferios ipsilateral y contralateral de un animal tratado de forma simulada y uno tratado con TBI 1 hora después de la lesión por percusión hídrica;

La figura 3B muestra la evolución temporal de la síntesis de LTC4 en los hemisferios cerebrales izquierdo y derecho de animales sin tratar, simulados y con lesiones en la cabeza después de un TBI;

La figura 4 muestra que la administración del inhibidor de FLAP MK-886 antes de un TBI reduce marcadamente la producción de leucotrienos LTC4 en ambos hemisferios cerebrales;

La figura 5 muestra que la administración del inhibidor de FLAP MK-886 15 minutos después de un TBI bloquea completamente la síntesis de leucotrienos LTC4 inducida por la lesión;

La figura 6 muestra que el tratamiento previo con el inhibidor de FLAP MK-886 30 minutos antes de un TBI reduce el volumen de muerte celular medido 72 horas después del TBI;

El panel superior de la figura 7 muestra que el inhibidor de FLAP MK-886 administrado antes o después de un TBI atenúa el edema después del TBI, imágenes de MRI ponderadas en T2 representativas obtenidas 72 horas después de la FPI, la figura inferior muestra el análisis cuantitativo de MRI del edema cerebral normalizado medio calculado a partir de 5 cortes continuos de T2-MRI obtenidos de cada grupo de animales utilizando Fiji (NIH);

La figura 8 muestra que la administración del inhibidor de FLAP MK-88630 minutos después de un TBI reduce la permeabilidad de BBB en la región CA1 del hipocampo, la figura 8A es una imagen de fluorescencia representativa de la captación de EB (rojo) por las capas de células del hipocampo y la captación de DAPI (azul) en el hipocampo ipsilateral 5 horas después del TBI, la figura 8B es un aumento mayor de las imágenes de extravasación de EB en la capa de células del hipocampo CA1 ipsilaterales en animales que recibieron vehículo o MK-88615 minutos después de un TBI, y la figura 8C es un gráfico que muestra la cuantificación de las células EB+, la localización conjunta de EB-DAPI, en las regiones del hipocampo, Barra = 200 pm;

La figura 9 muestra que la administración del inhibidor de FLAP MK-886 30 minutos después de un TBI atenúa los déficits en la potenciación a largo plazo del hipocampo después del TBI, LTP medida en cortes de hipocampo de ratas simuladas (triángulos abiertos, n = 8) y ratas lesionadas con FPI inyectadas con vehículo (círculos cerrados, n = 7) o MK-88630 minutos después de la FPI (cuadrados rojos, n = 7), los datos se representan como un % de la pendiente fEPSP de control, cada punto de datos que se muestra es un promedio de seis mediciones de intervalo de 20 s, simulado n = 8, FPI n = 9, el recuadro representa un fEPSP simulado representativo;

La Figura 10. El inhibidor de FLAP MK-886 administrado 30 minutos después de un TBI mitiga las deficiencias inducidas por el TBI en la memoria y el aprendizaje en el laberinto acuático de brazos radiales en una prueba de perseverancia de tareas de inversión del día 2 medida como cambio en la perseverancia, duración en el brazo de meta anterior, en el nado 3 expresado como el porcentaje de perseverancia en los errores de rendimiento de la tarea de inversión de nado 1 y el día 2 (media /- EEM) realizados en los nados 11 a 15 de la tarea de inversión; La figura 11 muestra que el inhibidor de FLAP MK-886 mitiga los déficits motores provocados por un TBI cuando se administra 15 minutos después del TBI como se muestra por el rendimiento vestibulomotor mejorado en el cilindro giratorio;

La figura 12 es un sumario y esquema de una conexión propuesta entre leucotrienos y TBI en el modelo FPI de acuerdo con la presente divulgación;

La figura 13 muestra una comparación de la potencia de MK-886 en los triángulos lisos y MK-591 en los círculos lisos, en sangre completa humana sobre la producción de LTB4 y la producción de 5-HETE;

La figura 14 es un esquema que muestra un ejemplo de administración intranasal de inhibidores de FLAP;

La figura 15 muestra la localización cerebral del inhibidor de FLAP MK-591 en varias regiones frente al nivel en plasma a los 30 minutos después de la administración intranasal de MK-591;

La figura 16 muestra los niveles cerebrales y plasmáticos del inhibidor de FLAP MK-591 30 minutos después de la administración intraperitoneal;

La figura 17A muestra que los leucotrienos LTC4 y LTD4 inducen apoptosis neuronal, muerte celular programada, in vitro de una manera dependiente de la dosis, la figura 17B muestra células teñidas con DAPI y un anticuerpo contra la caspasa activa 9 (flechas) para verificar que las neuronas murieran por apoptosis intrínseca;

Las figuras 18A, 18B y 18C muestran comparaciones entre ratones operados de forma simulada y ratones en un modelo de traumatismo craneoencefálico cerrado (CHI) de ratón en términos de su apnea, reflejo de enderezamiento y latencia a la caída medidas como confirmación de un traumatismo craneoencefálico;

Las figuras 19A y 19B muestran comparaciones entre los niveles plasmáticos de dos marcadores para el TBI leve en ratones operados de forma simulada y en ratones de un modelo de traumatismo craneoencefálico cerrado (CHI) de ratón, los niveles se midieron en los tiempos indicados después de la lesión, los marcadores son proteína ácida fibrilar glial (GFAP) en mg/ml y ubiquitina carboxiterminal hidrolasa L-1 (UCHL-1) en pg/ml; La figura 20 muestra imágenes representativas de imágenes de resonancia magnética ponderadas en T2 de ratones operados de forma simulada y de ratones en un modelo de traumatismo craneoencefálico cerrado (CHI) de ratón a los 7 y 30 días después de la lesión (ddl), la barra de escala es de 2 mm, no se detectó edema;

La figura 21 muestra imágenes representativas de secciones de cerebro de ratones operados de forma simulada y de ratones en un modelo de traumatismo craneoencefálico cerrado (CHI) de ratón teñidas histoquímicamente para H&E a los 7 ddl e inmunohistoquímicamente para mieloperoxidasa (MPO) 30 ddl;

Las figuras 22A y B muestran imágenes representativas de secciones cerebrales coronales de ratones operados de forma simulada y de ratones en un modelo de traumatismo craneoencefálico cerrado (CHI) de ratón teñidas histoquímicamente para H&E, inmunohistoquímicamente para GFAP e inmunohistoquímicamente para la molécula adaptadora de unión a calcio ionizado 1 (Iba-1) a los 7 días y 30 ddl, respectivamente, la figura 22C es un esquema de una sección transversal coronal del cerebro de un ratón que muestra las regiones del cerebro que son de especial interés, a saber, la corteza cerebral (CTX, del inglés 'cerebral cortex'), cápsula externa (EC, del inglés 'external capsule'), región CA del hipocampo y circunvolución dentada (DG, del inglés 'dentate gyrus'); Las figuras 23A y 23B muestran imágenes representativas de secciones cerebrales corticales de ratones operados de forma simulada y de ratones en un modelo de traumatismo craneoencefálico cerrado (CHI) de ratón teñidas inmunohistoquímicamente para GFAP a los 7 y 30 ddl e inmunohistoquímicamente para la molécula adaptadora de unión a calcio ionizado 1 (Iba-1) a los 7 y 30 ddl, respectivamente, también se muestran a continuación las secciones teñidas representativas como gráficos que muestran el análisis cuantitativo de secciones similares a los 7 ddl a la izquierda y a los 30 ddl a la derecha para los mismos marcadores;

Las figuras 24A y 24B muestran imágenes representativas de secciones de cerebro de cápsula externa de ratones operados de forma simulada y de ratones en un modelo de traumatismo craneoencefálico cerrado (CHI) de ratón teñidas inmunohistoquímicamente para GFAP a los 7 y 30 ddl e inmunohistoquímicamente para Iba-1 a los 7 y 30 ddl, respectivamente, también se muestran a continuación las secciones teñidas representativas como gráficos que muestran el análisis cuantitativo de secciones similares a los 7 ddl a la izquierda y a los 30 ddl a la derecha para los mismos marcadores;

Las figuras 25A y 25B muestran imágenes representativas de secciones de cerebro de circunvolución dentada de ratones operados de forma simulada y de ratones en un modelo de traumatismo craneoencefálico cerrado (CHI) de ratón teñidas inmunohistoquímicamente para GFAP a los 7 y 30 ddl e inmunohistoquímicamente para Iba-1 a los 7 y 30 ddl, respectivamente, también se muestran a continuación las secciones teñidas representativas como gráficos que muestran el análisis cuantitativo de secciones similares después de 7 días a la izquierda y después de 30 días a la derecha para los mismos marcadores;

La figura 26A es un gráfico que muestra la potenciación a largo plazo (LTP) como la media de la pendiente inicial del registro de fEPSP representada en el tiempo normalizada a los valores de referencia previos a la estimulación de alta frecuencia (HFS, del inglés 'High Frequency Stimulation') del estrato radiactivo CA1 en respuesta a la estimulación de los colaterales de Schaffer de CA3 de ratones operados de forma simulada y de ratones en un modelo de traumatismo craneoencefálico cerrado (CHI) de ratón a los 7 ddl, la figura 26B muestra los valores promediados en tiempos de 58 a 60 minutos en las mismas muestras;

La figura 27 muestra imágenes representativas de secciones de corteza cerebral teñidas inmunohistoquímicamente de GFAP e Iba-1 de ratones operados de forma simulada y de ratones en un modelo de traumatismo craneoencefálico cerrado de ratón a los 7 días después de la lesión después de que los ratones recibieron vehículo (-) o MK591 (+) 5 mg/kg mediante inyección intraperitoneal una vez al día durante 6 días antes del sacrificio y después de la lesión;

La figura 28 muestra el análisis cuantitativo de la tinción inmunohistoquímica de GFAP e Iba-1 de la corteza, cápsula externa y circunvolución dentada de ratones operados de forma simulada y de ratones en un modelo de traumatismo craneoencefálico cerrado (CHI) de ratón, a los 7 ddl los ratones recibieron vehículo (-) o MK591 (+) a 5 mg/kg mediante inyección intraperitoneal una vez al día durante 6 días antes del sacrificio; y

la figura 29 muestra un esquema de la ruta de neuroinflamación sostenida que se cree que existe después de un TBI a partir de CHI, un modelo experimental de mTBI, basado en los resultados presentados en la presente divulgación.

Descripción detallada de una realización preferida

Las siguientes abreviaturas y términos se utilizan en toda la memoria descriptiva y las reivindicaciones y tienen los significados definidos a menos que se indique lo contrario: ácido araquidónico (^a A); 5-lipoxigenasa (5-LO); barrera hematoencefálica (BBB, del inglés 'blood-brain barrier'); Azul de Evan (EB, del inglés 'Evan's Blue'); potencial postsináptico excitador de campo (fEPSP, del inglés 'field excitatory post-synaptic potential'); proteína activadora de 5-lipoxigenasa (FLAP, del inglés '5-lipoxygenase activating protein'); lesión por percusión hídrica (FPI, del inglés 'fluid percussion injury'); potenciación a largo plazo (LTP, del inglés 'long-term potentiation'); laberinto acuático de brazos radiales (RAWM, del inglés 'radial arms water maze'); cromatografía líquida de fase inversa acoplada a espectrometría de masas en tándem (RP LC-MS/MS, del inglés 'reverse-phase liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry'); traumatismo craneoencefálico (TBI, del inglés 'traumatic brain injury'); sangre completa humana (HWB, del inglés 'human whole blood'); el término animal es un término general destinado a incluir a todos los miembros del reino animal, incluyendo todos los mamíferos, tales como, seres humanos, animales domesticados y animales no domesticados; traumatismo craneoencefálico cerrado (CHI, del inglés 'closed head injury') especialmente en referencia al modelo de ratón descrito en la presente memoria descriptiva; Hematoxilina y eosina (H&E); proteína ácida fibrilar glial (GFAP, del inglés 'glial fibrillary acidic protein'); ubiquitina carboxiterminal hidrolasa L-1 (UCHL-1, del inglés 'ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L-1'), mieloperoxidasa (MPO), molécula adaptadora de unión a calcio ionizada 1 (Iba-1, del inglés 'ionized calcium-binding adapter molecule 1'), miligramo (mg), mililitro (ml), picogramo (pg), nanogramo (ng), milímetro (mm), días después de la lesión (ddl).

La proteína activadora de la proteína 5-lipoxigenasa se descubrió a fines de la década de 1980 y principios de la de 1990 en pruebas de detección de inhibidores de leucotrienos. La acción enzimática de la 5-lipoxigenasa (5-LO) y la proteína activadora de la 5-lipoxigenasa (FLAP) convierte el ácido araquidónico (AA) de los glicerolfosfolípidos de membrana en leucotrieno A⁴ (LTA⁴). Esto inicia la cascada de leucotrienos en donde LTA⁴ se convierte rápidamente en leucotrieno B⁴ (LTB⁴) mediante LTA⁴-hidrolasa o a leucotrieno C⁴ (LTC⁴) mediante LTC⁴-sintasa. A continuación, el LTC⁴ se puede convertir en leucotrieno D⁴ (LTD⁴) y leucotrieno E⁴ (LTE⁴), y estos tres leucotrienos (LTC⁴, LTD⁴ , LTE⁴) se conocen colectivamente como cisteinil-leucotrienos.

Poco después del descubrimiento de FLAP, inhibidores de FLAP, incluyendo el indol MK-886, la quinolina BAY X1005 y la quinolina-indol MK-591 se desarrollaron y probaron en ensayos humanos de asma. B. S. Friedman, E. H. Bel, A. Buntinx, W. Tanaka, Y. H. Han, S. Shingo, R. Spector, P. Sterk, Oral leukotriene inhibitor (MK-886) blocks allergen-induced airway responses. Am. Rev. Respir. Dis. 147, 839-844 (1993); B. Dahlén, M. Kumlin, E. Ihre, O. Zetterstrom, S. E. Dahlén, Inhibition of allergen-induced airway obstruction and leukotriene generation in atopic asthmatic subjects by the leukotriene biosynthesis inhibitor BAYx 1005. Thorax 52, 342-347 (1997); Z. Diamant, M. C. Timmers, H. Van Der Veen, B. S. Friedman, M. De Smet, M. Depre, D. Hilliard, E. H. Bel, P. J. Sterk, The effect of MK-0591, a novel 5-lipoxygenase activating protein inhibitor, on leukotriene biosynthesis and allergen-induced airway responses in asthmatic subjects in vivo. J. Allergy Clin. Immun. 95, 42-51 (1995). Todos estos inhibidores de FLAP desarrollados inicialmente demostraron buenos perfiles de seguridad y eficacia para bloquear la producción de leucotrienos en pacientes con asma, pero se suspendieron cuando los antagonistas del receptor de leucotrienos zafirlukast (Accolate™), montelukast (Singulair™) y pranlukast (Onon™) y el inhibidor de 5-LO zileuton (Zyflo™) se comercializaron y aprobaron para el tratamiento del asma. El inhibidor de FLAP MK-886 es ácido 1-[(4-Clorofenil)metil]-3-[(1,1-dimetiletil)tio]-a,a-dimetil-5-(1-metiletil)-1H-indol-2-propanoico. El inhibidor de FLAP MK-591 es ácido (3-[1-(4-clorobencil)-3-(t-butiltio)-5-(quinolin-2-il-metoxi)-indol-2-il]-2,2-dimetilpropanoico. El inhibidor de FLAP BAY-X1005 es ácido (R)-a-ciclopentil-4-(2-quinolinilmetoxi)bencenoacético.

Desde el descubrimiento de los inhibidores de FLAP enumerados anteriormente, se han desarrollado otros y esta sigue siendo un área de mayor desarrollo de fármacos. Todos los inhibidores de FLAP pueden encontrar uso en ejemplos de la presente divulgación dependiendo de la vía de administración y los mencionados específicamente son simplemente ejemplos de compuestos adecuados y no son los únicos inhibidores de FLAP útiles. El inhibidor de FLAP para su uso de acuerdo con el primer y segundo aspecto de la invención es MK-581. El inhibidor de FLAP para su uso de acuerdo con el tercer y cuarto aspecto de la invención es un indol de quinolina.

En una realización de la presente invención, el inhibidor de FLAP se administra sistémicamente a través de una de las siguientes vías: una inyección intravenosa, una vía intraperitoneal, una vía oral o como supositorio. Cuando se administra por cualquiera de estas vías, un inhibidor de FLAP adecuado es aquel que es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica en un grado suficiente para proporcionar suficiente inhibidor de FLAP biodisponible a las regiones del cerebro para inhibir la FLAP lo suficiente como para conducir a una reducción de la neuroinflamación relacionada con los leucotrienos cerebrales. El coeficiente de reparto, como saben los expertos en la materia farmacéutica, del inhibidor de FLAP seleccionado preferentemente es suficiente para permitir la concentración en el sistema nervioso central y más específicamente en el cerebro en relación con la concentración en el sistema circulatorio y otros tejidos. Preferentemente, el inhibidor de FLAP tiene una concentración inhibidora media máxima (CI50) hacia FLAP de 10 nanomolar o menos, más preferentemente 5 nanomolar o menos.

En otra realización de la presente invención, el inhibidor de FLAP se administra por vía intranasal. Cuando se administra un inhibidor de FLAP por esta vía, el inhibidor de FLAP es capaz de eludir la barrera hematoencefálica y entrar al cerebro directamente a través de la mucosa nasal y mediante el desplazamiento a lo largo de las vías neurales olfativas y del trigémino a través de mecanismos extracelulares para acceder al cerebro. Para esta vía, la capacidad del inhibidor de FLAP para atravesar la barrera hematoencefálica no es necesaria ya que la vía evita la barrera hematoencefálica. El inhibidor de FLAP se prepara en un vehículo que puede comprender un lípido, uno o más aceites vegetales, fosfatidilserina o mezclas de los mismos. Esta vía permite el uso de inhibidores de FLAP no polares ya que se evita la barrera hematoencefálica.

Otros ejemplos de inhibidores de FLAP útiles en la presente divulgación además de MK-591 y MK-886 incluyen, por ejemplo: ácido 3-[3-terc-butilsulfanil-1-[4-(6-etoxipiridin-3-il)bencil]-5-(5-metilpiridin-2-ilmetoxi)-1H-indol-2-il]-2,2-dimetilpropiónico 11 cc (anteriormente AM803 ahora GSK-2190915 de GlaxoSmithKline); y 1-pentil-3-(2-yodobenzoil)indol (AM679 un cannabinoide).

La presente divulgación describe el uso de inhibidores de FLAP para mejorar la neurodegeneración secundaria mediada por la neuroinflamación asociada a eventos de lesión cerebral. Algunos de los eventos de lesiones cerebrales que se cree que mejoran con el uso de inhibidores de FLAP incluyen, a modo de ejemplo, traumatismo craneoencefálico (TBI), trastorno de estrés postraumático (PTSD), ictus, esclerosis múltiple, Parkinson y enfermedad de Alzheimer.

La figura 1 es un esquema que demuestra la biosíntesis transcelular de leucotrienos en tejido cerebral en respuesta inmediata a un evento de lesión cerebral, tal como un TBI. Las células dañadas y los axones de la lesión primaria filtran trifosfato de adenosina (ATP) y glutamato que se unen a los receptores de la microglía y, por lo tanto, inducen la entrada de calcio. La entrada de calcio activa la fosfolipasa A2 citosólica (cPLA², del inglés 'cytosolic phospholipase A2) dependiente del calcio. Esta fosfolipasa libera AA de los fosfolípidos de la membrana y el AA se convierte en ácido 5-hidroxieicosatetraenoico (5-HETE) y luego en LTA⁴ por la doble acción de la 5-LO y su proteína activadora, FLAP. El LTA⁴ producido se convierte, a continuación, mediante LTA⁴ hidrolasa a LTB⁴ , un potente mediador quimiotáctico que recluta neutrófilos, o es transportado fuera de la microglía y captado por astrocitos vecinos y posiblemente neuronas y se convierte en LTC⁴, LTD⁴y LTE⁴ a través de la acción de LTC⁴-sintasa. La producción temprana de leucotrienos promueve la inflamación, la interrupción de la BBB y edema que a su vez conduce a muerte celular adicional, lesión axonal y alteraciones neurológicas. Como se mostrará en la presente memoria descriptiva, el bloqueo de la producción de leucotrienos mediante inhibidores de FLAP como MK-886 bloquea significativamente el edema, la muerte celular y las alteraciones neurológicas. Como se muestra adicionalmente en la figura 1, la evolución temporal de la producción de LTC⁴ , trazo superior, y LTD⁴, trazo inferior, que se muestra en el gráfico de inserción, muestra un máximo dentro de las 4 horas posteriores a un TBI y después cae a cero a las 24 horas posteriores al TBI.

En la presente memoria descriptiva, como se describirá más detalle a continuación, se presentan dos modelos de TBI en dos especies, rata y ratón. En el modelo de rata, el evento de TBI se induce utilizando una lesión por percusión hídrica (FPI) lateral mientras que en el modelo de ratón se induce un evento de TBI utilizando una traumatismo craneoencefálico cerrado (CHI) mediante el uso de un dispositivo de pistón controlado electromagnéticamente, ImpactOne. Ambos modelos muestran el valor de los inhibidores de FLAp para su uso de acuerdo con la presente invención para mejorar los efectos de un TBI.

PROTOCOLOS EXPERIMENTALES

Animales

Se alojaron ratas macho adultas Sprague Dawley (de 9 a 11 semanas de edad, 250 a 300 g; Harlan Laboratories) individualmente en alojamientos controlados por temperatura y luz con acceso libre a alimentos y agua a voluntad. Se alojaron ratones machos adultos C57 B16/J (de 10 a 12 semanas de edad) individualmente en alojamientos controlados por temperatura y luz con acceso libre a comida y agua a voluntad. Todos los procedimientos descritos se realizaron según los protocolos aprobados por el University of Colorado Institutional Animal Care and Use Committee y de conformidad con los National Institutes of Health (NIH) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.

Modelo de traumatismo craneoencefálico (TBI) experimental: Lesión por percusión hídrica (FPI) lateral de rata La craneotomía y la lesión por percusión hídrica (FPI) lateral se realizaron utilizando un procedimiento previamente validado y publicado. Farias S., et al. J. Neurotraum. 26, 1977-1986, 2009; Frey L.C. et al. J. Neurosci. Methods 177, 267-272, 2009. A lo largo de la memoria descriptiva, los animales sometidos al presente protocolo se refieren a que tienen un TBI ya que el presente protocolo de tratamiento es un modelo de TBI. Resumiendo, las ratas se anestesiaron con isoflurano al 3-5 %, Isosol, VEDCO Inc., St. Joseph, MO, a través del cono de nariz y montadas en un marco de cabeza estereotáxica. Se realizó una craneotomía de 3 milímetros (mm) y se centró a 3 mm caudal al bregma y a 3,5 mm a la izquierda de la sutura sagital, manteniendo intacta la duramadre expuesta. Se incrustó un tornillo de soporte de acero en el cráneo en el lado contralateral. Un cubo Luer-Lock con un diámetro interior de 3,5 mm se centró sobre la craneotomía y se unió al cráneo con adhesivo de cianoacrilato y se tapó. Se vertió acrílico dental, Snap, Parkell, Inc., Edgewood, Nueva Jersey, alrededor del cubo y el tornillo. Después de aplicar el ungüento antibiótico endurecido con acrílico alrededor de la tapa y los animales fueron devueltos a sus jaulas. Al día siguiente, aproximadamente 15 a 20 horas después, los animales fueron anestesiados con isoflurano en una cámara de inducción, inmediatamente conectada al aparato FPI, y recibió un pulso de 20 milisegundos (ms) de solución salina estéril presurizada a 2,7 atmósferas (atm) de presión para simular un impacto de gravedad moderada en la superficie de la duramadre intacta a través de la craneotomía antes de despertar de la anestesia. Los animales con lesiones simuladas se sometieron a craneotomía y fueron anestesiados y conectados al aparato FPI, pero no recibieron el pulso de líquido. Todos los animales recibieron una inyección subcutánea del analgésico, buprenorfina, 0,05 miligramos/kilogramo (mg/kg) de Buprenex, antes de la craneotomía y las siguientes inyecciones cada 12 horas durante dos días. Se proporcionaron gránulos de comida humedecidos después de la lesión, y todos los animales se controlaron diariamente para comprobar su bienestar y cambios de peso.

Modelo experimental de traumatismo craneoencefálico leve (mTBI): traumatismo craneoencefálico cerrado (CHI) de ratón

Resumiendo, los ratones machos adultos se anestesiaron con isoflurano al 3-5 % a través de un cono nasal. El cráneo quedó expuesto mediante una incisión en la línea media del cuero cabelludo. A continuación, los ratones se montaron en un marco estereotáxico y se aplicó un impacto a la corteza parietal izquierda utilizando un dispositivo de pistón controlado electromagnéticamente ImpactOne. El ángulo se fijó en 20 °, el tamaño de la sonda era de 5 mm, la velocidad fue de 5 metros/segundo, el tiempo de permanencia fue de 100 milisegundos. Los ratones con lesiones simuladas se sometieron a los mismos procedimientos mediante montaje estereotáxico, sin embargo, no se produjo ningún impacto. Todos los animales recibieron una inyección subcutánea del analgésico, buprenorfina, 0,05 miligramos/kilogramo (mg/kg) de Buprenex, antes de la incisión del cuero cabelludo y las siguientes inyecciones cada 12 horas durante dos días. Se proporcionaron gránulos de comida humedecidos después de la lesión, y todos los animales se controlaron diariamente para comprobar su bienestar y cambios de peso.

Administración de vinblastina

Se sometieron dos grupos de cuatro ratas cada uno a FPI como se describió anteriormente. Cuatro días antes del FPI, cada animal se anestesió brevemente durante menos de 5 minutos con isoflurano al 3-3,5 % y se le administró NaCl al 0,9 %, 2 ml/kg i.v. (vehículo) o sulfato de vinblastina 0,5 mg/kg i.v. en un volumen idéntico. La disminución de neutrófilos se verificó mediante recuentos sanguíneos celulares (CBC, del inglés 'cell blood counts') completos en animales tratados con vinblastina 4 días después de la administración. Ambos grupos se sacrificaron mediante decapitación y los lípidos cerebrales se extrajeron 1 hora después de la FPI. Las cantidades de LTC4 formadas, medidas mediante RP LC-MS/MS y normalizadas por miligramo de proteína, se compararon entre grupos utilizando el análisis de varianza unidireccional y la prueba de Student-Newman-Keuls para comparaciones múltiples.

Administración intravenosa del inhibidor de FLAP MK-886 y vehículo

El inhibidor de FLAP indol MK-886 se preparó a una dosis de 2,5 miligramos/mililitro (mg/ml), disuelto en dimetilsulfóxido (DMSO) y después diluido con solución salina al 0,9% hasta DMSO al 10%. Las ratas se anestesiaron brevemente con isoflurano al 3-3,5 % y se administró MK-886 a una dosis de 6 mg/kg o vehículo por vía intravenosa (i.v.) mediante inyección en la vena de la cola. Se permitió que todos los animales se despertaran antes de someterse a procedimientos adicionales.

Medición de leucotrienos en cerebro de roedores

Extracción de lípidos de cerebro de rata. Las regiones cortical y del hipocampo de los hemisferios ipsilateral y contralateral se recogieron en 4 ml de metanol al 80 %, homogeneizado con un homogeneizador Dounce, y se añadieron patrones internos a los homogeneizados. El contenido de proteína se midió utilizando un ensayo de ácido bicinconínico (BCA, del inglés 'bicinchoninic acid assay') para la proteína para normalizar los niveles de lípidos a la cantidad de tejido. Las muestras se centrifugaron y se recogió el sobrenadante. Las muestras se diluyeron hasta una concentración final de metanol inferior al 15% y después se extrajeron los lípidos utilizando un cartucho de extracción en fase sólida, Estrato C18-E, 100 mg/1 ml, Phenomenex, Torrence CA. El eluido, 1 ml de metanol, se secó y se reconstituyó en 70 microlitros (jl) de disolvente A de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, del inglés 'High Performance Liquid Chromotography'), que es ácido acético 8,3 mM tamponado a pH 5,7 con NH⁴OH, más 20 ml de disolvente B, que es acetonitrilo/metanol, 65/35, v/v.

Cromatografía líquida de fase inversa acoplada a espectrometría de masas en tándem (RP LC-MSIMS) para la medición de leucotrienos. Una alícuota de cada muestra, 35 jl, se inyectó en un sistema de HPLC y se sometió a cromatografía de fase inversa utilizando una columna C18 (Columbus 150 * 1 mm, 5 jm Phenomenex) y se eluyó a un caudal de 50 jl/minuto con un gradiente lineal del 25 % al 100 % de disolvente B de fase móvil. El disolvente B se incrementó del 25 % al 85 % en 24 minutos, al 100 % en 26 minutos y se mantuvo al 100 % durante 12 minutos más. El efluente de la HPLC se conectó directamente a la fuente de electropulverización de un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo (Sciex API 2000, PE-Sciex, Thornhill, Ontario, Canadá) y los análisis de espectrometría de masas se realizaron en el modo de iones negativos utilizando monitorización de reacción múltiple (MRM) de las transiciones específicas, mlz 624 ^ 272 para LTC⁴, mlz 495 ^ 177 para LTD⁴, m/z 335 ^ 195 para LTB⁴, mlz 339 ^ 197 para d4-LTB⁴ y mlz 629 ^ 277 para d5-LTC⁴. La cuantificación se realizó utilizando una curva de dilución de isótopos estándar como se describió anteriormente, Farias et al., J. Neurochem. 103, 1310-1318, 2007, con estándares de referencia de leucotrienos y análogos de isótopos estables de Cayman Chemical, Ann Arbor, MI. Obtención de imágenes por resonancia magnética (MRI)

Adquisición. Todos los estudios de MRI se realizaron en las instalaciones de University of Colorado Animal Imaging Shared Resource (AISR). Las ratas del modelo FPI se sometieron a obtención de imágenes por MRI a las 72 horas después de la lesión, utilizando secuencias ponderadas en T2 y potenciadas con Gd ponderadas en T1. Los ratones se sometieron a obtención de imágenes por MRI a los 7 y 30 ddl, utilizando secuencias ponderadas en T2. Para todas las MRI, los animales se anestesiaron con isoflurano al 2,5 %. Los registros se realizaron utilizando un Bruker PharmaScan de 4,7 Tesla y se utilizó una bobina de jaula de pájaros en cuadratura con un diámetro interno de 38 mm, sintonizada a la frecuencia ¹H de 200,27 MHz, para la transmisión y recepción de RF. Se adquirieron imágenes axiales de MR ponderadas en T2 utilizando una secuencia RARE (adquisición rápida con mejora de la relajación) con los siguientes parámetros: FOV: 4,6 cm; TE/TR: 32/5000 ms; espesor del corte = 1,20 mm; distancia entre cortes 1,20 mm (sin hueco); número de cortes = 20; número de promedios = 4 por etapa de codificación de fase; tamaño de matriz = 128 * 256. Las imágenes de MR ponderadas en T1 se adquirieron utilizando una secuencia MSME (multicorte multieco), tanto antes como después de la administración de Multihance® 0,2 mmol/kg i.v. (TE/TR de 11,0/700 ms).

Análisis de MRI ponderada en T2. Por cada rata, se utilizaron cinco cortes, de 1,2 mm de espesor, que abarcaban toda el área de la lesión para calcular el edema cerebral relacionado con la FPI. El diámetro del hemisferio ipsilateral lesionado se midió desde la línea media hasta el punto más ancho de la corteza (Fiji/ImageJ, NIH). Después se calculó la diferencia entre los diámetros del hemisferio ipsilateral (ipsi) y contralateral (contra) y se normalizó al diámetro del hemisferio contralateral utilizando la fórmula:

{(diámetro ipsi - diámetro contra)/diámetro contra} * 100

Análisis de MRI ponderada en T1. Por cada rata, se analizaron todas las imágenes que mostraban una diferencia visible entre la hiperintensidad post-Gd ponderada en T1 ipsilateral y contralateral en las leptomeninges. No hubo hiperintensidad leptomeníngea detectable en las imágenes pre-Gd. Se utilizó el programa informático Fiji (ImageJ) para delinear y calcular el área de intensidad de píxeles en cada corte, que después se multiplicó por 1,2 mm, la distancia entre sucesivas imágenes de MR, para obtener una hiperintensidad post-Gd ponderada en T1 en volumen. Se sumaron los volúmenes de todos los cortes seleccionados de cada rata para obtener un volumen total de extravasación de Gd leptomeníngea para cada rata. El valor promedio entre todas las ratas dentro de un grupo se informó en mm3.

Procedimiento general para la fijación del cerebro antes de la tinción histoquímica

En los puntos temporales indicados, los animales se anestesiaron profundamente con pentobarbital sódico, 50 mg/kg i.p. y se perfundieron de manera transcardial con solución salina heparinizada enfriada con hielo seguido de paraformaldehído al 4 % recién preparado en solución salina tamponada con fosfato (PBS, del inglés 'phosphate buffered saline'). Se extrajeron los cerebros y se fijaron posteriormente en paraformaldehído/PBS al 4 % durante cuatro horas a 4 °C. Después se crioprotegieron los cerebros en sacarosa al 20 % en PBS a 4 °C, incluidos en compuesto O.C.T. de Sakura Finetek USA Inc., Torrance, CA y se almacenaron a -70 °C hasta que se seccionaron.

Análisis de administración y extravasación con azul de Evan

Una hora antes del FPI, las ratas recibieron una inyección intraperitoneal (i.p.) de 5 ml de solución azul de Evan (EB), 2 % p/v en solución salina. Seis horas después del FPI, las ratas se anestesiaron profundamente con pentobarbital sódico, 50 mg/kg i.p. y se perfundieron de manera transcardial con 200 ml de solución salina heparinizada helada, seguido de 100 ml de paraformaldehído al 4 % recién preparado en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se extrajeron los cerebros y se fijaron posteriormente en paraformaldehído/PBS al 4 % durante cuatro horas a 4 °C. Después se crioprotegieron los cerebros en sacarosa al 20 % en PBS a 4 °C, incluidos en compuesto O.C.T. de Sakura Finetek USA Inc., Torrance, CA y almacenados a -70 °C. Los cerebros completos se seccionaron de manera coronal a 30 pm, y se montaron cortes representativos que abarcan todo el hipocampo en incrementos de 270 pm de cada animal en portaobjetos y se cubrieron con Fluoromount-G que contiene 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), SouthernBiotech, Birmingham, AL. Se obtuvieron imágenes de regiones cerebrales positivas para EB utilizando un microscopio Zeiss Axioplan2 equipado con una lámpara HB0100w/2, una cámara Photometrics CoolSnapfx Roper Scientific y el programa informático IPLab BD Biosciences. Las imágenes de cada corte se cosieron juntas utilizando Fiji/ImageJ (NIH), y las células positivas a EB en las capas de células del hipocampo se cuantificaron utilizando una herramienta de contador de células.

Electrofisiología

Preparación del corte del hipocampo. Cuatro días después de la FPI o en los tiempos indicados en las figuras para los modelos animales CHI, se sacrificaron y los cerebros se extrajeron rápidamente y se sumergieron en tampón de corte helado que contiene sacarosa (NaCl 87 mM, KCl 2,5 mM, MgCh 7 mM, CaCh 0,5 Mm, NaH2PO41,25 mM, D-glucosa 25 mM, sacarosa 35 mM y NaHCO325 mM) durante 40 a 60 segundos para enfriar el interior del cerebro. Se hicieron cortes transversales de 400 pm de espesor utilizando un picador de tejidos McIlwain y los cortes se almacenaron individualmente para su recuperación, al menos 60 min. Después de la recuperación, se transfirió un solo corte a una cámara de registro y se superfundió con líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF, del inglés 'artificial cerebrospinal fluid') a un caudal total de 2 a 3 ml/min a 31 °C. El aCSF contenía lo siguiente: NaCl 126 mM, KCl 3,0 mM, MgSO41,0 mM, CaCh 2,0 mM, NaH2PO41,2 mM, D-glucosa 11 mM y NaHCO325,9 mM. Se colocó un electrodo estimulante de tungsteno bipolar en la ruta colateral de Schaffer (SC, del inglés 'Schaffer collateral') para evocar los potenciales postsinápticos excitadores del campo sináptico (fEPSP) registrados en el estrato radiactivo utilizando una micropipeta de vidrio cercana llena de aCSF.

Registros de referencia. Antes de cada ejecución experimental en un corte, se generó una curva de entrada-salida mediante el aumento del voltaje del estímulo y el registro de la respuesta sináptica hasta que se alcanzó un máximo o se observó evidencia de un pico de población en la respuesta de fEPSP. Además, se ejecutó una relación de pulsos emparejados (PPR, del inglés 'paired-pulse ratio') mediante la cual se administraron pares de estímulos a los axones CA3 en un intervalo intraestímulo de 50 ms. La PPR se cuantificó como {(amplitud del segundo fEPSP)/(amplitud del primer fEPSP)} * 100.

Medición de la potenciación a largo plazo. Las respuestas de fEPSP se provocaron con electrodos de tungsteno bipolares colocados en la capa de campo dendrítico CA3 a CA1. Los estímulos de prueba se administraron una vez cada 20 segundos con la intensidad del estímulo establecida en 40-50 % de la respuesta sináptica máxima. La estimulación de alta frecuencia (HFS) consistió en dos trenes de estímulos de 100 Hz que duraron 1 segundo cada uno, con un intervalo entre trenes de 20 segundos, a la intensidad del estímulo de control. Los registros de fEPSP se realizaron con una micropipeta de vidrio llena de líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) y se colocaron en el estrato radiactivo aproximadamente a 200-300 pm de la capa del cuerpo celular. Esta estimulación produjo una respuesta potenciada a largo plazo (LTP) que persistió durante más de 60 minutos en animales de control u operados de forma simulada. Las pendientes de fEPSP se calcularon como la pendiente medida entre el 10 y el 30 % desde el origen de la deflexión negativa inicial. Cada punto temporal que se muestra es un promedio de al menos seis mediciones de intervalo de 20 segundos.

Prueba de laberinto acuático de brazos radiales de ratas

El laberinto acuático de brazos radiales (RAWM) consta de seis brazos radiales de 50 centímetros (cm) que emanan de un área circular en un tanque de 160 cm de diámetro con agua a 20,5 °C, rodeado por 4 paredes, cada uno con un patrón único. Se colocó una plataforma de escape al final de uno de los brazos y se sumergió debajo de la superficie de agua negra opaca, pintura en polvo negra sin polvo no tóxica, Rich Art. Se manipularon las ratas, 2 minutos cada una, el día antes de la craneotomía y tres días después de la FPI. El entrenamiento el día 1 y 4 días después de la FPI consistió en colocar al animal en uno de los brazos y darle al animal un máximo de 60 segundos para encontrar la plataforma en el brazo de meta. Si el animal no encuentra la plataforma de escape en 60 segundos, se guía hasta el brazo de meta y se le permite permanecer en la plataforma durante 15 segundos. Se administraron quince ensayos con un intervalo entre ensayos de cinco minutos. El brazo de inicio de cada ensayo se determinó de forma pseudoaleatoria con tres secuencias aleatorias de los cinco brazos sin meta. Los brazos de inicio y meta eran diferentes para cada rata, pero ambiguo en relación con la ubicación del brazo de meta, para evitar preferencias de posición y lugar. La prueba, el día 2, el día siguiente consistió en 15 pruebas de natación. La plataforma permaneció en el brazo de meta el día 1 durante las primeras cinco pruebas y después se movió a un nuevo brazo para las pruebas 6 a 15. El brazo de inicio para cada prueba se determinó de forma pseudoaleatoria de modo que el animal no comenzó en el brazo de meta el día 1 hasta después de todos los demás brazos (prueba 10). Los vídeos de cada uno de los 30 ensayos por animal se analizaron utilizando el programa informático de seguimiento TopScan (Cleversys Inc.) para detectar errores y duración de la perseverancia. Los errores se definen como la entrada a un brazo que no es meta o la entrada a un brazo de meta sin llegar a la plataforma.

Administración intranasal del inhibidor de FLAP MK-591

Para administración intranasal y posterior recogida de tejido, se anestesiaron ratas con isoflurano al 3,5 % y se colocaron en posición supina sobre una almohadilla térmica. El inhibidor de FLAP de quinolina-indol MK-591, 60 microgramos (|jg) formulado con un vehículo lipídico se administró utilizando una pipeta P20. Específicamente, se formaron gotas de 4 j l en la punta de la pipeta y se bajaron a fosas nasales alternas cada dos minutos hasta que se administraron un total de ocho gotas de 4 jl. A los 30 minutos del inicio de la administración intranasal, se extrajo sangre del corazón y las ratas se perfundieron de manera transcardial con 60 ml de NaCl al 0,9 % enfriado en hielo seguido de 360 ml de paraformaldehído al 4 % a 15 ml/minuto. Los tejidos cerebrales se diseccionaron en regiones anatómicas en hielo, se pesaron, se congelaron instantáneamente en N2 líquido y se almacenaron a -70 °C hasta el análisis. Los niveles de MK-591 en tejidos y plasma se midieron mediante espectroscopía de masas en tándem. Histoquímica e inmunohistoquímica de ratón

Los ratones, simulados y tratados con CHI, se trataron como se describió anteriormente en el procedimiento general de fijación del cerebro para preparar los cerebros embebidos en parafina. Para la tinción histoquímica con H&E y para la tinción inmunohistoquímica con mieloperoxidasa (MPO), proteína ácido fibrilar glial (GFAP) y molécula adaptadora de unión a calcio ionizada 1 (Iba-1) las secciones tenían un grosor de 6 micrómetros. Los cortes teñidos se analizaron, cargaron y visualizaron con el programa informático Aperio ImageScope. La tinción se cuantificó utilizando el programa informático Aperio y su algoritmo de recuento de píxeles positivos de Image Scope, que compara la fracción de píxeles positivos fuertes con el píxel teñido total para una región de imagen designada. Análisis estadísticos

Todos los datos mostrados son media /- error estándar de la media a menos que se indique lo contrario. Los resultados se analizaron en SPSS 20 (IBM) o Prism 5.0 (GraphPad). Todos los análisis utilizaron pruebas t de Student de dos colas no emparejadas para dos grupos, y ANOVA unidireccional para dos o más grupos, seguidos de HSD de Tukey para comparaciones múltiples, a menos que se indique lo contrario. Las curvas de LTP I-O se analizaron con un ANOVA bidireccional de medidas repetidas. Las curvas de aprendizaje del día uno de RAWM se agruparon en grupos de tres nados y se analizaron con un ANOVA bidireccional de medidas repetidas seguido de un ANOVA unidireccional de cada punto temporal agrupado. La perseverancia RAWM entre las pruebas uno y tres de la tarea de inversión se expresó como un porcentaje del valor inicial (nado uno = 100 %; nado tres = nado tres/nado uno x 100) y se analizó con un ANOVA bidireccional de medidas repetidas dentro de los sujetos, seguido de una prueba t de Student de dos colas emparejada entre los dos ensayos. Alfa se estableció como p <0,05 para determinar la significación en todas las pruebas.

RESULTADOS EXPERIMENTALES EN MODELO FPI DE RATA

La figura 2A, panel izquierdo, muestra tinción con hematoxilina y eosina (H&E) de la corteza 6 horas después de un TBI tanto para el hemisferio izquierdo ipsilateral como para el hemisferio derecho contralateral en ratas sometidas al modelo FPI. La tinción H&E 6 horas después del TBI muestra que en el hemisferio ipsilateral hay evidencia de daño celular extenso, mientras que el hemisferio contralateral muestra más células inalteradas y mucho menos daño. La figura 2B, panel derecho, demuestra que los neutrófilos contribuyen a la producción de leucotrienos inducida por lesiones en el cerebro después de un TBI, como lo demuestran los efectos de la vinblastina. En el modelo de rata, después de un TBI, los niveles de LTC⁴ aumentan drásticamente en el hemisferio ipsilateral en comparación con los niveles en el hemisferio contralateral. Véanse las barras marcadas como - vinblastina. Cuando las ratas se agotan de neutrófilos por el tratamiento con vinblastina, 0,5 mg/kg i.v., antes del TBI experimental, la producción de leucotrienos en el hemisferio ipsilateral se reduce notablemente. La reducción de leucotrienos por la vinblastina se observa sólo en el hemisferio ipsilateral donde la barrera hematoencefálica se ha visto comprometida. Los datos representan 4 a 5 animales por grupo. Los resultados son el promedio ± EEM. **P <0,01.

La figura 3A muestra los niveles de LTC⁴ en los hemisferios ipsilateral y contralateral de un animal tratado de forma simulada y uno tratado con FPI 1 hora después del tratamiento medidos mediante RP LC-MS/MS. Los resultados muestran que el animal tratado de forma simulada tenía muy poco LTC⁴ y que no hay diferencias entre el hemisferio derecho e izquierdo. Los resultados para el animal tratado con FPI muestran que hay un aumento drástico en el nivel de LTC⁴ en los hemisferios ipsilateral y contralateral. El aumento en el hemisferio ipsilateral es mucho mayor que en el hemisferio contralateral.

La figura 3B muestra la evolución temporal de la síntesis de LTC⁴ en los hemisferios cerebrales izquierdo y derecho de animales sin tratar, simulados y con lesiones en la cabeza después de un TBI. Los leucotrienos se midieron mediante cromatografía de fase inversa acoplada a espectrometría de masas en tándem (RP-LC/MS/MS). LTC⁴ y LTD⁴ son indetectables en los cerebros sin trata y sin lesión. Los niveles de LTC⁴ en animales simulados no son significativamente diferentes de los animales sin lesión. Después del TBI experimental por FPI, los leucotrienos se producen rápidamente. Los niveles de LTC⁴ son 4 veces más elevados en el hemisferio cerebral izquierdo ipsilateral en comparación con el hemisferio cerebral derecho contralateral (14,35 /-2,31 pg/mg de proteína frente a 3,62 /-2,73 pg/mg de proteína). Se obtienen resultados similares para LTD⁴ (no mostrados) coherentes con el metabolismo de LTC⁴ a LTD⁴ por tejido neuronal. Los datos representan 4 a 5 animales por grupo. Los resultados son el promedio ± EEM. Diferencia significativa con el hemisferio homólogo de animales con lesiones simuladas. (***P <0,001; **P <0,01; *P <0,05). Diferencia significativa con el hemisferio contralateral (^###P <0,001).

Los resultados de la figura 3B indican que la producción de leucotrienos inducida por lesiones es muy rápida, alcanzando un máximo 1 a 3 horas después de un TBI y disminuyendo a niveles indetectables a las 24 horas. Para determinar la eficacia de la administración de MK-886 antes y después de la lesión para bloquear la formación de leucotrienos, a las ratas se les inyectó una dosis única de MK-886 a 6 mg/kg en solución salina estéril al 0,9 % con DMSO al 10% o el mismo volumen de vehículo 30 minutos antes o 15 minutos después del TBI. En puntos temporales posteriores a la lesión, los animales se sacrificaron y se midieron los niveles de LTC⁴ en las regiones del cerebro después de la extracción de lípidos y el análisis mediante RP LC-MS/MS. Los animales a los que se les administró una dosis única de MK-886 a 6 mg/kg, i.v. por la vena de la cola 30 minutos antes del TBI mostraron reducciones significativas en la producción de leucotrienos 1 hora después del TBI. Los niveles de LTC⁴ en los hemisferios izquierdos ipsilaterales de los animales lesionados tratados con MK-886 fueron un 85 % más bajos que los niveles en los animales lesionados tratados con vehículo. El nivel en los animales tratados con vehículo fue de 20,00 /- 2,71 pg/mg de proteína frente a 3,39 /- 0,42 pg/mg de proteína en los animales tratados con MK-886. Los niveles de LTC⁴ en los hemisferios derechos contralaterales de los animales lesionados tratados con MK-886 también fueron un 64 % más bajos que los de los animales lesionados tratados con vehículo. El nivel en los animales tratados con vehículo fue de 7,19 /- 0,63 pg/mg de proteína frente a 2,6 /- 0,80 pg/mg de proteína en los animales tratados con MK-886. La figura 4 muestra que la administración del inhibidor de FLAP MK-88630 minutos antes de un TBI reduce notablemente la producción de leucotrienos LTC⁴ en ambos hemisferios cerebrales. Los animales a los que se les administró una dosis única del inhibidor de FLAP MK-886, 6 mg/kg i.v. por la vena de la cola, 30 minutos antes de la FPI muestran reducciones significativas en la producción de leucotrienos medida 1 hora después de la lesión. Se utilizaron de cuatro a cinco animales en cada grupo. Los resultados son el promedio ± EEM. (***P <0,001 **P <0,01).

En otro experimento, las ratas recibieron una dosis única de MK-88615 minutos después del TBI. El nivel medio de LTC⁴ en el hemisferio ipsilateral, 23,41 /- 1,98 pg/mg de proteína, fue significativamente mayor (p <0,001, prueba t de Student) que en el hemisferio contralateral, 7,92 /- 1,02 pg/mg de proteína, de los animales tratados con vehículo. La administración de MK-88615 minutos después del TBI redujo los niveles de LTC⁴ por debajo del umbral detectable en los hemisferios ipsilateral y contralateral. La figura 5 muestra que la administración del inhibidor de FLAP MK-886 15 minutos después del TBI bloquea la síntesis de leucotrienos inducida por la lesión por debajo de niveles detectables. El análisis cuantitativo de los niveles de LTC⁴ en los hemisferios ipsilateral y contralateral en ratas inyectadas con vehículo (-) o MK-886 (+) 15 minutos después de la lesión se muestra en la figura 5. Los resultados muestran que MK-886 administrado 15 minutos después del TBI bloquea completamente el aumento de LTC⁴ esperado después del TBI. Después del tratamiento con MK-886 no hubo LTC⁴ detectable. Los valores son la media -/+ EEM, n = 4, n.d. = no detectable. *p <0,05, diferente del hemisferio ipsilateral, prueba de la t de Student.

Para investigar la cantidad relativa de producción de LTC⁴ en el hipocampo y la corteza ipsilateral lesionados, estas regiones del cerebro se diseccionaron de ratas lesionadas antes del análisis RP LC-MS/MS. LTC⁴ se detectó tanto en la corteza ipsilateral, 9,67 /-1,18 pg/mg de proteína como en el hipocampo, 6,05 /- 3,70 pg/mg de proteína, de animales tratados con vehículo. Similar a los resultados en hemisferios cerebrales completos, LTC4 era indetectable en la corteza ipsilateral y el hipocampo de animales tratados con MK-886. Estos resultados junto con los de la figura 4 demuestran que el inhibidor de FLAP, MK-886, bloquea de manera eficaz la biosíntesis de leucotrienos cuando se administra 30 minutos antes o 15 minutos después del TBI experimental.

La figura 6 muestra que la administración del inhibidor de FLAP MK-886 reduce el volumen de muerte celular determinado 72 horas después del TBI. A las ratas se les administró una dosis única del inhibidor de FLAP MK-886, 6 mg/kg i.v. por la vena de la cola, 30 minutos antes del TBI. Los animales tratados previamente muestran reducciones significativas en la muerte celular inducida por TBI cuando se miden 72 horas después. Los resultados se expresan como el promedio ± EEM. Diferencia significativa con los animales tratados con vehículo (*P <0,05).

En otro experimento, se utilizó MRI ponderada en T2 para investigar el efecto de los leucotrienos sobre el edema cerebral relacionado con TBI 72 horas después de un TBI en ratas. Las ratas se inyectaron con MK-88630 minutos antes, 15 minutos después o 60 minutos después del TBI. Se utilizaron como controles grupos adicionales de animales con lesiones simuladas e inyectados con vehículo. Los hemisferios cerebrales ipsilateral izquierdo y contralateral derecho de los animales simulados no mostraron hiperintensidad ponderada en T2 y eran simétricos en altura y anchura. Por el contrario, los cerebros de animales lesionados con TBI demostraron de manera coherente hiperintensidad ponderada en T2 e inflamación unilateral en el hemisferio ipsilateral en comparación con el hemisferio contralateral.

El edema hemisférico ipsilateral se cuantificó en relación con el hemisferio contralateral. Los animales simulados no mostraron diferencias entre los hemisferios en el edema cerebral normalizado (0,00 /- 0,03 %). Por el contrario, los animales lesionados que recibieron tratamiento con vehículo tenían significativamente más edema cerebral que los animales simulados, vehículo = 8,68 /-0,09 %, p <0,001, ANOVA unidireccional seguida de1HSD de Tukey. Los animales que recibieron MK-886 ya sea 30 minutos antes de la lesión o 15 minutos después de la lesión tuvieron una inflamación significativamente menor que los animales tratados con vehículo. Para los 30 minutos previos al TBI, el valor fue 4,12 /- 0,08 %, p = 0,004; para los 15 minutos después del TBI fue 4,26 /- 0,05 %, p = 0,028. Los animales inyectados con MK-886 60 min después del TBI no difirieron significativamente de los animales tratados con vehículo, 60 minutos después del TBI el valor fue de 8,98 /-1,0 %, p = 0,999. Estos resultados demuestran que el bloqueo de la producción de leucotrienos antes o poco después del TBI reduce la cantidad de edema cerebral relacionado con la lesión a las 72 horas.

La figura 7 muestra que el inhibidor de FLAP MK-886 atenúa el edema cuando se administra 30 minutos antes del TBI o 15 minutos después del TBI en ratas. El panel superior de imágenes son imágenes de MRI ponderadas en T2 representativas obtenidas 72 horas después de un evento de TBI. Los hemisferios ipsilateral izquierdo y contralateral derecho en el cerebro simulado sin TBI no muestran hiperintensidad de píxeles en T2 y son simétricos en forma y tamaño. Los cerebros de animales tratados con TBI demuestran hiperintensidad de píxeles en T2 principalmente en la corteza ipsilateral indicativa de contenido de agua e inflamación unilateral. Se calculó el análisis cuantitativo de MRI del edema cerebral normalizado medio a partir de 5 cortes continuos de T2-MRI obtenidos de cada animal utilizando Fiji (NIH). Los valores son la media /- EEM, simulado (n =4), vehículo (n=8), MK-886 administrado 30 minutos antes de la lesión (n = 10) y 15 minutos después de la lesión (n = 5). Barra = 5 mm. Los resultados muestran que MK-886 administrado ya sea 30 minutos antes o 15 minutos después de un TBI redujo significativamente el edema cerebral en comparación con TBI tratado sin MK-886. *p <0,05, diferente del grupo TBI con vehículo, no significativamente diferente del simulado, ANOVA unidireccional, seguido de1HSD de Tukey.

El efecto de los leucotrienos sobre la interrupción de BBB relacionada con TBI se evaluó utilizando MRI ponderada en T1 potenciada con Gd 72 horas después de un TBI en ratas. Las ratas se inyectaron por vía intravenosa con el agente potenciador del contraste, Gd, que se deposita en las regiones del cerebro donde la BBB se ha visto comprometida y se registra en las resonancias magnéticas ponderadas en T1. La extravasación de Gd, detectada por el aumento de la hiperintensidad de píxeles en las imágenes posteriores a Gd, se detectó exclusivamente en la región leptomeníngea ipsilateral (superficie) de animales lesionados por TBI. La presencia de Gd en esta región se debe muy probablemente al cizallamiento mecánico de los vasos sanguíneos en esta región altamente vascularizada del cerebro. Se cuantificó en cada animal el volumen total de extravasación de Gd, la hiperintensidad de píxeles posterior a Gd. El TBI aumentó la extravasación de Gd y MK-886 no tuvo ningún efecto cuando se administró 30 min antes de la lesión (p = 0,419), 15 min después de la lesión (p = 0,970) o 60 min después de la lesión (p = 0,994) (ANOVA unidireccional seguida de HSD de Tukey). Aunque MK-886 no tuvo un efecto aparente sobre la extravasación de Gd, la regulación de la permeabilidad de la BBB por los leucotrienos puede estar enmascarada por la lesión mecánica de los vasos sanguíneos en la superficie del cerebro.

Los inventores utilizaron fluorescencia de azul de Evan (EB) para evaluar la permeabilidad de la BBB en el modelo FPI de rata. EB (<1 kDa) es un colorante azo que tiene una fuerte afinidad por la albúmina sérica (67 kDa). El complejo EB-albúmina resultante se filtra hacia el parénquima tras la interrupción de la BBB. Se utilizó microscopía de fluorescencia para obtener imágenes de cortes de cerebro recogidos cinco horas después de la lesión, aprovechando las propiedades fluorescentes intrínsecas de EB, excitación a 620 nm y emisión a 680 nm. Este método es más sensible que las lecturas colorimétricas de EB de uso común en homogeneizados cerebrales, Uyama O., J. Cerebr. Blood F. Met. 8, 282-284, 1988, y se puede utilizar para localizar la permeabilidad de BBB. Como el complejo EB-albúmina se absorbe por las células próximas a los sitios de permeabilidad, este método permite la detección microscópica de la interrupción de la BBB. De acuerdo con esto, la señal de EB más brillante localizada conjuntamente con fluorescencia de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), lo que indica la absorción de colorante por las células. También se observó una tenue fluorescencia extracelular alrededor de los grupos de células positivas para EB. No de forma inesperada, la mayor densidad de células positivas para EB estaba en la corteza ipsilateral adyacente al sitio de la lesión y en el hipocampo ipsilateral, con algunas células dispersas en el tálamo y la sustancia negra. No se detectó EB en las regiones cerebrales contralaterales correspondientes. Dado que el hipocampo está relativamente distante del sitio de la lesión primaria y media en los procesos de memoria y aprendizaje, los inventores contaron las células EB positivas en el hipocampo como una medida de la interrupción de la BBB parenquimatosa. MK-886 administrado 15 minutos después del TBI redujo significativamente el número de células Eb positivas en la región CA1. El valor de TBI tratado con vehículo fue de 148,75 /- 45,65 mientras que el valor de TBI tratado con MK-886 fue de 69,25 /- 36,82, p = 0,035, prueba de la t de Student. Estos resultados indican que los leucotrienos pueden mediar en la permeabilidad de la BBB en regiones cerebrales selectivas vulnerables a lesiones y que los inhibidores de FLAP bloquean la interrupción de la BBB mediada por leucotrienos.

La figura 8 muestra que la administración del inhibidor de FLAP MK-886 30 minutos después del TBI en el modelo de FPI de rata reduce la permeabilidad de la BBB en la región CA1 del hipocampo. La figura 8A es una imagen de fluorescencia representativa de la captación de EB (rojo) por las capas de células del hipocampo y la captación de DAPI (azul) en el hipocampo ipsilateral 5 horas después del TBI. La figura 8B es un aumento mayor de imágenes de extravasación de EB en la capa de células del hipocampo CA1 ipsilaterales en animales que recibieron vehículo o MK-886 15 minutos después del TBI. La figura 8C es un gráfico que muestra la cuantificación de células EB+, la localización conjunta de EB-DAPI, en las regiones del hipocampo. Barra = 200 pm. Los valores son la media /-EEM; n = 4. *p <0,05, prueba de la t de Student. Se obtuvieron resultados similares cuando se administró el inhibidor de FLAP 30 minutos antes de la lesión, datos no mostrados.

Para examinar la integridad funcional del hipocampo después de un TBI, se registraron medidas electrofisiológicas de potenciación a largo plazo (LTP) en cortes de hipocampo de rata cuatro días después del TBI mediante el modelo FPI. La LTP es una medida de plasticidad sináptica y se cree que representa los mecanismos moleculares que subyacen al aprendizaje y la memoria. Las respuestas del potencial postsináptico excitador del campo sináptico (fEPSP) se provocaron mediante la estimulación de la ruta colateral de CA3 a CA1 Schaffer y el registro de la capa del campo dendrítico CA1. No hubo diferencia en las curvas de entrada-salida de fEPSP (F(4,381) = 0.5329, p = 0,992, ANOVA bidireccional de medidas múltiples), ni en las mediciones de la relación de pulsos emparejados entre animales simulados y lesionados con TBI, (T(22) = 1,883, p = 0,073, prueba de la t de Student), lo que indica niveles similares de transmisión sináptica basal para estos grupos. Esto es coherente con los hallazgos previos de los inventores de que no hubo pérdida sustancial de células del hipocampo por tinción con H&E y ningún cambio en los niveles de proteína de neurofilamento del hipocampo dentro de una semana del TBI. Los cortes de hipocampo de animales simulados presentaron una LTP robusta en respuesta a la estimulación de alta frecuencia (253,51 /-69,48 %, 58 a 60 min, últimos 3 puntos temporales registrados). Por el contrario, cortes de hipocampo de animales no inyectados lesionados por TBI no lograron expresar LTP (135,06 %+/-42,62 %, diferente de los animales simulados, p = 0,007 ANOVA unidireccional de todos los grupos seguido del HSD de Tukey). Similar a los animales no inyectados lesionados por TBI, los cortes de hipocampo de animales lesionados con TBI inyectados con vehículo tampoco mostraron LTP tras la estimulación de alta frecuencia. Sin embargo, los animales que recibieron una inyección de MK-886 ya sea 30 minutos antes o 30 minutos después del TBI demostraron una LTP normal. Ambos fueron significativamente diferentes de los animales inyectados con vehículo. El valor TBI con vehículo fue 130,86 % /- 55,63 %; el valor de TBI con MK-88630 minutos antes de la lesión fue 242,75 /- 76,94 %, p = 0,032; y el valor de TBI con MK-886 30 minutos después de la lesión fue de 256,13 /- 85,27 %, p = 0,007, ANO^vA unidireccional seguida del HSD de Tukey. Sin embargo, cuando MK-886 se administró 60 minutos después de la lesión, el fármaco no logró evitar los déficits de LTP observados en los animales tratados con vehículo, valor 145,46 /- 18,30, p = 0,994. Estos resultados indican que el bloqueo de la producción temprana de leucotrienos atenúa los déficits inducidos por lesiones en la plasticidad sináptica del hipocampo del animal después de la lesión y sugiere un margen de tiempo de menos de una hora después de la lesión para la eficacia del tratamiento con MK-886 en roedores, lo que probablemente se traduce en un margen de 2 a 3 horas después de la lesión en seres humanos.

La figura 9 muestra que la administración del inhibidor de FLAP MK-886 30 minutos después del TBI en el modelo de FPI de rata atenúa los déficits en la potenciación a largo plazo (LTP) del hipocampo después del TBI. La LTP se midió en cortes de hipocampo de ratas simuladas (triángulos blancos, n = 8) y ratas lesionadas con FPI inyectadas con vehículo (círculos negros, n = 7) o MK-88630 minutos después de la FPI (cuadrados rojos, n = 7). La respuesta media de LTP (media /- EEM de la pendiente de control) en todos los grupos medida a los 58 a 60 minutos después de la inducción de LTP. *p <0,05, **p <0,01, diferente de la FPI con vehículo, no significativamente diferente del simulado, ANOVA unidireccional seguida del HSD de Tukey.

Para verificar que los déficits inducidos por TBI en LTP reflejan deficiencias en el aprendizaje espacial y la memoria dependientes del hipocampo, las ratas simuladas y las lesionadas con TBI tratadas con fármaco o vehículo se analizaron en un laberinto acuático de brazos radiales (RAWM) cuatro y cinco días después del TBI. El RAWM tiene una ventaja sobre el laberinto acuático de Morris en la evaluación de los deterioros cognitivos en roedores, en que el número de entradas en un brazo que carece de la plataforma de escape se puede utilizar como una evaluación del aprendizaje, en lugar de una latencia para encontrar la plataforma, eliminando así los factores de confusión inducidos por las posibles diferencias en las velocidades de nado entre los grupos experimentales. Los animales tratados con simulación y con TBI recibieron una inyección de vehículo o MK-88630 minutos después de la lesión. El primer día de las pruebas de comportamiento, los animales completaron 15 pruebas de natación en las que utilizaron señales visuales para navegar por el laberinto y encontrar una plataforma de escape oculta en uno de los brazos, este brazo se llama brazo de meta. No hubo diferencias significativas en el aprendizaje de la tarea inicial entre los animales tratados con vehículo y MK-886 dentro del grupo simulado o dentro del grupo TBI (F(3,155) = 2,437, p = 0,083, ANOVA bidireccional de medidas repetidas) y sin diferencias significativas entre los grupos para cualquier grupo de 3 nados, (ANOVA unidireccional para cada grupo de natación). En el segundo día de pruebas de comportamiento, los animales completaron cinco pruebas de natación en el laberinto con el brazo de meta en la misma posición que el día anterior. Después, la plataforma de escape se trasladó a una nueva ubicación para diez pruebas más con el fin de evaluar la capacidad de los animales para aprender y recordar una nueva ubicación del brazo de meta, la tarea de inversión. En las tres primeras pruebas de la tarea de inversión, la perseverancia del brazo de meta anterior se midió como el porcentaje de la duración total de la natación en el brazo donde solía estar la plataforma. En el primer nado, no hubo diferencias en la perseverancia entre ninguno de los grupos (F(3,31) = 0,713, p = 0,522, ANOVA unidireccional). Ambos grupos simulados aprendieron rápidamente entre los nados 1 y 3 que la plataforma ya no estaba en el brazo de meta anterior. Asimismo, las ratas con traumatismo craneoencefálico tratadas con MK-886 pasaron menos tiempo en el brazo de meta anterior al nado 3 (interacción general, lesión (simulado frente a FPl) * fármaco (MK-886 frente a vehículo) * prueba (nado uno a nado tres), F(1,62) = 5,564, p = 0,025, dentro de los sujetos ANOVA bidireccional de medidas repetidas seguido de la prueba t de Student emparejada, simulado con vehículo, p = 0,001; simulado con MK-886, p = 0,006; FPI con MK-886, p = 0,035). Sin embargo, los animales con TBI que recibieron una inyección de vehículo no se dieron cuenta de que la ubicación de la plataforma había cambiado entre los nados 1 y 3 (p = 0,758). Las últimas cinco pruebas de natación de la tarea de inversión (nados 6 a 11) se utilizaron para evaluar el aprendizaje continuo. Las ratas con TBI tratadas con vehículo continuaron cometiendo significativamente más errores por nado que los animales simulados que recibieron fármaco o vehículo (TBI con vehículo = 2,33+/-1,21; simulado con vehículo = 0,755 /-0,705, p = 0,003; simulado con MK-886 = 0,850 /-0,583, p = 0,005; ANOVA unidireccional seguido de1HSD de Tukey). Los animales con TBI que recibieron MK-886 no difirieron de ninguno de los grupos simulados y fueron significativamente diferentes de los animales con TBI con vehículo (1,26 /-0,700, p = 0,044). Estos datos indican que MK-886 atenúa los déficits inducidos por lesiones de TBI en el aprendizaje espacial y la memoria.

La figura 10 muestra que el inhibidor de FLAP MK-886 administrado 30 minutos después del TBI mitiga los deterioros inducidos por el TBI en la memoria y el aprendizaje en el laberinto acuático de brazos radiales en el modelo de FPI de rata. En la perseverancia de la tarea de inversión del día 2, el cambio en la perseverancia, duración en el brazo de meta anterior, en nado 3 se expresa como el porcentaje de perseverancia en nado 1. *p <0,05, **p<0,01, ANOVA bidireccional de medidas repetidas dentro de los sujetos seguido de la prueba t de Student emparejada. Rendimiento de la tarea de inversión del día 2 como errores (media /- EEM) realizados en los nados 11 a 15 de la tarea de inversión. *p <0,05, **p <0,01, diferente de la FPI con vehículo, no hay diferencia con ninguno de los grupos simulados, ANOVA unidireccional seguida del HSD de Tukey.

Los resultados mostrados en la figura 11 demuestran que el inhibidor de FLAP MK-886 mitiga los déficits motores después del TBI en el modelo de FPI de rata. Cuando se administró MK-886 15 minutos después del TBI, los animales habían mejorado el rendimiento vestibulomotor en el cilindro giratorio en comparación con los animales tratados con vehículo. Para pruebas de cilindro giratorio, la rotación del cilindro se programó para acelerar de 0 a 50 rpm en el transcurso de 300 segundos. Se ejecutaron cuatro ensayos en cada punto temporal seleccionado después de la lesión y se registran el ensayo individual y los tiempos medios para cada animal. PT es un entrenamiento previo a la lesión. Los valores son la media -/+ EEM. n = 6 a 9. Los resultados muestran que los animales tratados con MK-886 tuvieron una mejor respuesta que los observados con animales tratados con vehículo durante las semanas 1 y 2. Finalmente, todos los grupos obtuvieron el mismo rendimiento relativo.

La figura 12 es un sumario y un esquema de una conexión propuesta entre leucotrienos y TBI de acuerdo con la presente divulgación basada en los resultados analizados anteriormente con respecto al modelo de FPI. Sin desear quedar ligado por esta teoría, con base en la evidencia actual presentada en la presente divulgación, la siguiente secuencia de eventos ocurre después de un TBI. La lesión cerebral primaria en el momento del trauma da como resultado una fuga de ATP de las células dañadas al espacio extracelular, hemorragia intraparenquimatosa y alteraciones focales en la permeabilidad axolémica. Después de la liberación, el ATP se une a la microglía provocando la entrada de calcio y la activación de la fosfolipasa A2 citosólica (cPLA²), que libera AA de los fosfolípidos de membrana. El AA se convierte a 5-HETE y después a LTA⁴ mediante 5-LO y FLA^p . A continuación, el LTA⁴ se convierte a LTB⁴, una potente molécula quimiotáctica que recluta neutrófilos, mediante LTA⁴ hidrolasa o es transportado fuera de la microglía y captado por astrocitos vecinos y posiblemente neuronas que producen los cys-LT (LTC⁴, LTD⁴y LTE⁴) a través de la acción de la LTC⁴-sintasa. La producción temprana de leucotrienos indica efectos adversos que incluyen infiltración de leucocitos, interrupción de la BBB y edema. Este último efecto parece estar mediado por canales de agua de acuaporina. Si no se controlan, estos eventos perjudiciales conducen a una mayor lesión axonal, muerte celular, déficits motores y deficiencias cognitivas.

La figura 13 muestra una comparación de la potencia in vitro de MK-886, triángulos lisos con línea de puntos, y de MK-591, círculos lisos con línea lisa en sangre humana completa. Los resultados corresponden a los efectos de estos dos inhibidores de FLAP en la producción de LTB4 y la producción de 5-HETE. Se sabe que los inhibidores de FLAP del ácido indol acético como MK-886 y MK-591 muestran una elevada unión a proteínas plasmáticas. Por lo tanto, las potencias de estos inhibidores de FLAP para bloquear los leucotrienos in vivo son aproximadamente 100 veces mayores que la afinidad de los inhibidores por la unión de FLAP. Los inventores desarrollaron un bioensayo que predice de cerca la potencia in vivo de los inhibidores de FLAP utilizando sangre humana completa. Resumiendo, la sangre completa se incuba con un ionóforo de calcio como A2387 o cimosano en ausencia o presencia de concentraciones crecientes de un inhibidor de FLAP. Después de incubar a 37 °C durante 30 minutos, las muestras se centrifugan y el sobrenadante de plasma se somete a cromatografía líquida de fase inversa acoplada a espectrometría de masas en tándem para cuantificar los niveles de producción de LTB4, 5-HETE y AA. Los valores CI50 del fármaco se determinan mediante análisis de regresión no lineal (GraphPad Prism). Los resultados demuestran que los inhibidores de FLAP MK-886 y MK-591 tenían la CI50 esperada e informada en presencia de proteína. Como era de esperar, ninguno de los inhibidores de FLAP afectó la producción de AA, datos no mostrados. Como los inhibidores de FLAP son fármacos poco solubles en agua, los inventores han demostrado que dichos fármacos hidrófobos se pueden formular en un vehículo que comprende uno o más aceites vegetales, tales como el aceite de oliva y la fosfatidilserina que se encuentran en la lista Generalmente Aceptado como Seguro (GRAS, del inglés 'Generally Accepted as Safe') y que dichos fármacos pueden administrarse rápidamente y dirigirse al cerebro y la médula espinal superior. Hanson L. R., et al. Drug Delivery 19(3): 149-54, 2012.

Los datos descritos anteriormente se generaron utilizando inyecciones i.v. o i.p. de los inhibidores de FLAP en ratas. La figura 14 muestra un esquema de un método de administración intranasal de inhibidores de FLAP. La administración intranasal de fármacos evita la BBB, mediante la administración de fármacos directamente desde la mucosa nasal al cerebro y la médula espinal superior a lo largo de las rutas nerviosas del trigémino y olfativas a través de un mecanismo extracelular, aumentando así la biodisponibilidad cerebral. La administración intranasal de fármacos limita la cantidad de fármaco que entra en la circulación sistémica, disminuyendo así las posibles consecuencias sistémicas adversas indeseables tales como, por ejemplo, la toxicidad hepática y cardíaca de un agente farmacológico. La administración de fármacos es muy rápida por esta vía, que llega al cerebro en 10 minutos, un factor importante para la intervención de TBI como lo muestran los datos anteriores, y el método de administración nasal es rápido y simple, lo que lo hace muy adecuado para una amplia variedad de entornos.

El inhibidor de FLAP MK-591 es más potente y tiene una t-i/2 más larga que MK-886. El MK-591 se formuló en una solución con vehículo lipídico como se describió anteriormente. La figura 15 muestra la localización cerebral del inhibidor de FLAP MK-591 en varias regiones del cerebro de rata frente al nivel en plasma 30 minutos después de la administración intranasal de MK-591. Las ratas se anestesiaron brevemente con isoflurano al 3,5 % y se administró MK-591 intranasal (60 microgramos/32 pl de vehículo lipídico) en ocho alícuotas de 4 pl en la mucosa nasal alternando entre cada fosa nasal. La cantidad de fármaco se determinó con el objetivo de alcanzar una concentración de fármaco de 200 nM que corresponde a 100X el valor de Kd para la unión a FLAP. A los 30 minutos posteriores a la dosificación, se extrajo sangre de animales anestesiados utilizando una aguja heparinizada y se separó el plasma de la sangre mediante centrifugación. A continuación, los animales se perfundieron con solución salina, aún bajo anestesia, para eliminar el fármaco en la sangre de la cerebrovasculatura. Después de la perfusión, los animales se sacrificaron y las regiones del cerebro se eliminaron rápidamente. Las muestras de tejido cerebral y de plasma se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C. Los niveles de fármaco en el plasma periférico y los tejidos cerebrales parenquimatosos se evaluaron utilizando una plataforma de espectroscopia de masas en tándem validada. Los valores se expresan en ng de MK-591/mg de tejido. El nivel más elevado de MK-591 se detectó en los bulbos olfativos, seguido por el hipocampo y la corteza. La concentración de MK-591 en la corteza fue de 200 nM, la concentración objetivo. Los niveles de fármaco en plasma fueron más bajos que la cantidad de fármaco que llega al cerebro. Estos resultados demuestran que es posible la administración intranasal del inhibidor de FLAP MK-591 y que se alcanzan rápidamente niveles fisiológicamente relevantes en varias regiones del cerebro.

La figura 16 muestra los niveles en plasma y hemisferio de cerebro de rata del inhibidor de FLAP MK-591 30 minutos después de la administración intraperitoneal. Se inyectó a las ratas por vía intraperitoneal MK-591 (10mg/kg en DMSO/solución salina al 20 %). A los 30 minutos posteriores a la dosificación, se extrajo sangre de animales anestesiados utilizando una aguja heparinizada y se separó el plasma de la sangre mediante centrifugación. A continuación, los animales se perfundieron con solución salina, aún bajo anestesia, para eliminar el fármaco en la sangre de la cerebrovasculatura. Después de la perfusión, los animales se sacrificaron y los hemisferios cerebrales se eliminaron rápidamente. Las muestras de tejido cerebral y de plasma se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C. Los niveles de fármaco en el plasma periférico y el cerebro se evaluaron utilizando una plataforma RP-LC/MS/MS en tándem validada. A diferencia del método intranasal, la mayor parte del fármaco se encontraba en el plasma, encontrándose niveles mucho más bajos en el tejido cerebral. Se utiliza la conversión de 1 ml = 1 mg. El volumen total de sangre fue de 2 ml (o 2 mg). El peso total del hemisferio cerebral (menos el cerebelo) es de 0,150 mg. Los valores se expresan en ng de MK-591/mg de tejido. Estos resultados demuestran el valor de la administración intranasal frente a la administración i.p. en términos de administrar rápidamente inhibidores de FLAP a las áreas afectadas por un TBI para tener un efecto máximo.

Los resultados de la figura 17A y 17B demuestran que los leucotrienos LTC⁴ y LTD⁴ inducen apoptosis neuronal, muerte celular programada, in vitro de una manera dependiente de la dosis. Las neuronas primarias cultivadas de ratas recién nacidas se incubaron en presencia de concentraciones crecientes de LTC⁴ o LTD⁴ durante 16 horas. El número de neuronas apoptóticas se determinó mediante el recuento del número de neuronas teñidas con DAPI que mostraban condensación nuclear y se expresaba como porcentaje del total de neuronas. Las neuronas también se tiñeron con anticuerpos contra la caspasa activa 9 (flechas) para determinar si las neuronas estaban muriendo por apoptosis intrínseca. Los resultados indicaron que los leucotrienos inducían la apoptosis intrínseca de las neuronas. Estos datos están de acuerdo con informes recientes de que los leucotrienos, además de sus efectos inflamatorios, estimulan la producción de p-amiloide mediante la regulación de la actividad de la secretasa. Se sabe que el pamiloide destruye neuronas mediante la inducción de la apoptosis. Estos resultados, junto con los datos anteriores, indican que los leucotrienos tienen acciones tanto proinflamatorias como neurotóxicas directas en el cerebro.

RESULTADOS EXPERIMENTALES EN MODELO CHI DE RATÓN

En una segunda especie, el ratón, se probó otro modelo de TBI para confirmar y ampliar los resultados informados anteriormente. En el modelo de traumatismo craneoencefálico cerrado (CHI) de ratón, se utiliza un pistón controlado electromagnéticamente para administrar un traumatismo craneoencefálico leve al animal sujeto, el proceso exacto utilizado se describe anteriormente en la sección de protocolos experimentales. En una primera serie de pruebas, se determinó el efecto del CHI en tres medidas de intensidad de la lesión. Las tres medidas son apnea, el tiempo de enderezamiento y la latencia a la caída. Las medidas de apnea y reflejo de enderezamiento se realizaron inmediatamente después del proceso de CHI. La medida de la apnea es el tiempo que tarda un sujeto en comenzar a respirar por sí mismo después del CHI, mientras que el tiempo de enderezamiento es el tiempo que tarda el sujeto en recuperar el reflejo de enderezamiento de pasar de estar acostado de lado a levantarse sobre las cuatro extremidades. La combinación de apnea y reflejo de enderezamiento es comparable a la pérdida del conocimiento en seres humanos después de un TBI. Las medidas de latencia a la caída se realizaron 1 hora después del CHI y mide el tiempo que un sujeto puede agarrarse y colgarse de una malla de alambre antes de caer. Los resultados se muestran en la figura 18, paneles A a C. En el panel 18A se presentan las medidas de apnea, como se esperaba, los ratones simulados no tenían apnea mientras que los ratones CHI tenían una medida de apnea promedio de más de 100 segundos. Asimismo, el reflejo de enderezamiento en los ratones simulados fue muy corto, mientras que los ratones CHI tuvieron un promedio de más de 500 segundos, un aumento de más de 7 veces. Con respecto a la latencia a la caída, los ratones CHI tuvieron una latencia a la caída mucho más corta, lo que indica que su fuerza de agarre se había reducido. Los ratones operados de forma simulada podían aguantar más de 7 veces más que los ratones CHI. Los resultados demuestran que los ratones sometidos al protocolo CHI presentan todos los signos de un evento de TBI leve (mTBI) y validan el protocolo. Los números y el grado de significación fueron los siguientes: medida de apnea **** p <0,0001 simulado n = 29 CHI n=66; reflejo de enderezamiento **** p <0,0001 simulado n = 29 CHI n = 66; latencia a la caída ** p <0,0056 simulado n = 29 CHI n = 66.

Utilizando el modelo CHI, una serie de ratones fueron operados de forma simulada o tratados con CHI y después, a intervalos de tiempo después del tratamiento, los ratones se anestesiaron y se recolectaron muestras de sangre mediante punción cardíaca utilizando una aguja de calibre 22. Las muestras se colocaron en tubos de microcentrífuga heparinizados. El plasma se preparó mediante centrifugación de la sangre completa a 7.000 rpm durante 15 minutos y se almacenó en los mismos tubos a -80 °C hasta su análisis utilizando kits Elisa disponibles comercialmente. Los dos biomarcadores seguidos en el plasma fueron la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) y la ubiquitina carboxiterminal hidrolasa L-1 (UCHL-1). Estos dos están asociados a eventos mTBI humanos, el GFAP es un indicador de la muerte de las células de astrocitos, mientras que el UCHL-1 está asociado a la muerte de las células neuronales. Los resultados de GFAP se muestran en la figura 19A y muestran que los niveles esperados son estables en los ratones simulados. Los ratones CHI muestran un nivel máximo de GFAP 1 hora después de la lesión y los niveles vuelven a los niveles basales dentro de las 12 horas posteriores a la lesión. Los ratones CHI también muestran niveles elevados de UCHL-1 que son máximos a las 2 horas después de la lesión y vuelven a los niveles basales a las 2 horas después de la lesión. Estas medidas confirman además que el modelo CHI está produciendo el mTBI esperado en los ratones sujetos. La simulación n = 3 a 5 ratones por punto temporal, el CHI n = 4 a 9 por punto temporal. La significación a 1 hora para GFAP fue ** p = 0,0014. La significación para el valor de 0,5 horas de UCHL-1 fue * p = 0,0193 y a la hora fue * p = 0,0223.

Para evaluar el edema causado por el protocolo CHI, los ratones se operaron de forma simulada o se trataron con CHI y, a continuación, 7 ddl o 30 ddl se sometieron a una MRI ponderada en T2. Ninguno de los ratones, ya sean simulados o CHI, mostraron cualquier hiperintensidad de píxeles ponderados en T2 en cualquier momento después de CHI, lo que indica que no hubo edema, lo que valida además que este es un modelo de mTBI adecuado. La ausencia de una MRI positiva también es común en la mayoría de los casos humanos de mTBI. La figura 20 muestra imágenes de MRI representativas de ratones operados de forma simulada y CHI a los 7 y 30 ddl, la barra de escala es de 2 mm.

Para examinar la neuroinflamación después de CHI, los ratones se sometieron al protocolo CHI y después se tiñeron varias regiones del cerebro para determinar la reactividad a H&E, mieloperoxidasa (MPO) un marcador de neutrófilos, GFAP un marcador de astrocitos reactivos e Iba-1 un marcador de microglía activada.

La figura 21 muestra ejemplos representativos de los resultados de la tinción para H&E a los 7 ddl o para MPO a los 30 ddl en ratones simulados y CHI. En todos los puntos temporales examinados, los resultados no mostraron evidencia de lesiones ni mostraron evidencia de infiltración de neutrófilos en las regiones. No hubo contusiones o pérdidas celulares por la tinción con H&E o alteración significativa de la barrera hematoencefálica según lo evaluado por la tinción con MPO. La falta de daño manifiesto después del CHI en los ratones imita lo que se ve normalmente en estudios humanos de mTBI. En este modelo no se detectó ningún daño cerebral manifiesto de las células inmunitarias infiltrantes en contraste con el modelo FPI. En estudios en seres humanos, generalmente no hay patología macroscópica, tal como una contusión o hemorragia, ya sea por tomografía computarizada o MRI convencional. Los resultados son coherentes con el CHI como un buen modelo para mTBI en seres humanos.

En contraste con la ausencia de cambios macroscópicos en los cerebros de los ratones CHI a nivel microscópico, hubo cambios a gran escala indicativos de neuroinflamación. Las figuras 22A y B muestran cortes de cerebro coronal representativos teñidos para H&E, GFAP o Iba-1 en ratones simulados y CHI a los 7 y 30 ddl. La figura 22C muestra las regiones de interés que incluyen: corteza cerebral (CTX), cápsula externa (EC), región CA del hipocampo y circunvolución dentada (DG). Las regiones que mostraron la mayor reactividad a GFAP e Iba-1 después del CHI fueron la CTX, la EC y la DG. Como se muestra en la figura 22A y B, hubo una tinción significativa para GFAP tanto a los 7 como a los 30 ddl en los ratones CHI en comparación con los ratones simulados. La mayor cantidad de tinción, como se esperaba, está en el hemisferio ipsilateral de CHI. Las regiones de la CTX, la EC y la DG son fundamentales para las funciones cerebrales de tipo ejecutivo, el aprendizaje y la memoria. La EC es un gran cordón de sustancia blanca que contiene fibras de asociación corticocorticales que se encargan de conectar una corteza cerebral a otra y es una vía para las fibras colinérgicas desde el prosencéfalo basal hasta la corteza cerebral. Esta región del cerebro también muestra alteraciones estructurales por imágenes de tensor de difusión después de mTBI en seres humanos. La DG es una subregión del hipocampo que media la neurogénesis y es fundamental para el aprendizaje y la memoria. Las células progenitoras neurales en la zona subgranular de la circunvolución dentada producen nuevas neuronas durante la edad adulta. Estudios recientes en seres humanos que utilizan técnicas de datación por radiocarbono indican que la neurogénesis ocurre a niveles significativos, aproximadamente 1.400 nuevas neuronas granulares se añaden diariamente durante la edad adulta. Estas neuronas granulares del recién nacido juegan un papel esencial en la separación de patrones de memoria y se cree que las deficiencias en la neurogénesis contribuyen a los trastornos de ansiedad al alterar la generalización de la memoria. Dichas deficiencias podrían ser la base de las respuestas patológicas al miedo observadas en los trastornos de ansiedad tales como el trastorno de estrés postraumático y el trastorno de pánico. Por lo tanto, la neuroinflamación en la circunvolución dentada, como se muestra en la presente divulgación, puede proporcionar un vínculo mecanicista entre TBI y PTSD.

La figura 23A muestra la tinción representativa para GFAP en la corteza de ratones simulados y CHI a los 7 y 30 ddl y por debajo de las muestras representativas hay un análisis cuantitativo de los resultados de múltiples ratones. Las secciones representativas muestran un aumento drástico de GFAP en los ratones CHI que se mantiene durante al menos 30 ddl. Los resultados cuantitativos muestran aumentos significativos en la positividad de GFAP medida a los 7 y 30 ddl. Los números y la significación fueron: 7 ddl simulado n = 7 CHI n = 8 y * p = 0,0188; 30 ddl simulado n = 7 y CHI n = 11 ** p = 0,0021. La figura 23B muestra la tinción representativa para Iba-1 en la corteza de ratones simulados y CHI a los 7 y 30 ddl y por debajo de las muestras representativas hay un análisis cuantitativo de los resultados de múltiples ratones. Las secciones representativas muestran un aumento drástico en Iba-1 en los ratones CHI que es muy elevado después de 7 ddl y aún elevado después de 30 ddl. Los datos cuantitativos muestran que a los 7 ddl hay un aumento significativo en la reactividad Iba-1 de los ratones CHI. Todavía hay una elevación a los 30 ddl, pero no fue estadísticamente significativo en este estudio. Los números y la significación fueron los siguientes: 7 ddl simulado n = 6 y CHI n = 7 * p = 0,0233; a los 30 ddl simulado n = 7 y CHI n = 9.

La figura 24A muestra la tinción representativa para GFAP en la cápsula externa de ratones simulados y CHI a los 7 y 30 ddl y por debajo de las muestras representativas hay un análisis cuantitativo de los resultados de múltiples ratones. Las secciones representativas muestran un aumento drástico de GFAP en los ratones CHI que se mantiene durante al menos 30 ddl. Los resultados cuantitativos muestran aumentos significativos en la positividad de GFAP medida a los 7 y 30 ddl. Los números y la significación fueron: 7 ddl simulado n = 7 CHI n = 8 y ** p = 0,0019; 30 ddl simulado n = 7 y CHI n = 11 ** p = 0,0021. La figura 24B muestra la tinción representativa para Iba-1 en la cápsula externa de ratones simulados y CHI a los 7 y 30 ddl y por debajo de las muestras representativas hay un análisis cuantitativo de los resultados de múltiples ratones. Las secciones representativas muestran un aumento drástico en Iba-1 en los ratones CHI que es muy elevado después de 7 ddl y todavía significativamente elevado después de 30 ddl. Los datos cuantitativos muestran que a los 7 ddl hay un aumento significativo en la reactividad Iba-1 de los ratones CHI. Todavía hay una elevación significativa a los 30 ddl. Los números y la significación fueron los siguientes: 7 ddl simulado n = 6 y CHI n = 7 * p = 0,0181; a los 30 ddl simulado n = 9 y CHI n = 11 * p = 0,0268.

La figura 25A muestra la tinción representativa para GFAP en la circunvolución dentada de ratones simulados y CHI a los 7 y 30 ddl y por debajo de las muestras representativas hay un análisis cuantitativo de los resultados de múltiples ratones. Las secciones representativas muestran un aumento significativo de GFAP en los ratones CHI que se resuelve a los 30 ddl. Los resultados cuantitativos muestran aumentos significativos en la positividad de GFAP medida a los 7 ddl y un retorno a los niveles simulados a los 30 ddl. Los números y la significación fueron: 7 ddl simulado n = 7 CHI n = 7 y *** p = 0,0003; 30 ddl simulado n = 7 y CHI n = 10. La figura 25B muestra la tinción representativa para Iba-1 en la circunvolución dentada de ratones simulados y CHI a los 7 y 30 ddl y por debajo de las muestras representativas hay un análisis cuantitativo de los resultados de múltiples ratones. Las secciones representativas muestran un aumento significativo en Iba-1 en los ratones CHI a los 7 ddl que se resuelve después de 30 ddl. Los datos cuantitativos muestran que a los 7 ddl hay un aumento significativo en la reactividad Iba-1 de los ratones CHI. Los datos también muestran que a los 30 ddl los niveles de GFAP vuelven a los encontrados en ratones simulados. Los números y la significación fueron los siguientes: 7 ddl simulado n = 6 y CHI n = 7 ** p = 0,0054; a los 30 ddl simulado n = 7 y CHI n = 9. La circunvolución dentada fue la única área que mostró resolución de la inflamación, al menos en términos del nivel de astrocitos reactivos y microglía activada, a los 30 días después de la lesión. Como esta es la única región que sufre neurogénesis, se especula que la neurogénesis activa puede desempeñar un papel en la reparación del cerebro, posiblemente mediante la creación de un ambiente rico en factores neurotróficos.

Para examinar el efecto de la neuroinflamación sobre el funcionamiento cognitivo, la potenciación a largo plazo, el mecanismo sináptico que se cree que subyace al aprendizaje y la memoria, se examinó a los 7 ddl cuando estaban presentes abundantes astrocitos reactivos y microglía, como se muestra en las figuras 23 a 25. Los resultados se presentan en las figuras 26A y 26B y se generaron como se describió anteriormente en el modelo FPI de rata. Los cortes de hipocampo de ratones CHI mostraron una potenciación significativamente menor después de la estimulación de alta frecuencia (HFS) en comparación con los cortes de ratones simulados como se muestra en las figuras 26A y 26B. El grado de deterioro de la potenciación a largo plazo (LTP) fue menor que el observado previamente en el presente modelo FPI de rata de TBI, coherente con la intensidad de la lesión que es mucho menor en el modelo CHI de ratón. Los números y la significación fueron los siguientes: simulado n = 7 CHI n = 12 y **** p <0,0001.

Como se ha analizado anteriormente, los inhibidores de FLAP fueron eficaces para bloquear el edema, la interrupción de BBB, la pérdida de células y deterioro cognitivo después de una lesión cerebral moderada por FPI. Para examinar si los inhibidores de FLAP son capaces de bloquear la neuroinflamación prolongada después de un mTBI, a los ratones simulados y CHI se les administró vehículo o MK-591 a 5 mg/kg, i.p., 1 vez al día durante 6 días después de la lesión. A los 7 ddl, los ratones se sacrificaron después de la perfusión cardíaca y se extrajeron los cerebros fijos, se seccionaron y se tiñeron inmunohistoquímicamente para GFAP e Iba-1. La figura 27 muestra la tinción representativa de la región cortical cerebral de 3 ratones simulados y 3 CHI que se trataron con vehículo (-) o con MK-591 (+). Hubo marcadamente menos tinción tanto de GFAP como de Iba-1 en ratones CHI que se habían inyectado con el inhibidor de FLAP MK-591. La cantidad de tinción de GFAP e Iba-1 en la corteza cerebral, la cápsula externa y la circunvolución dentada se cuantificó de los ratones simulados y CHI y los resultados se muestran en la figura 28. La administración de MK-591 durante 6 días una vez al día después del CHI bloqueó significativamente el aumento de la tinción de GFAP e Iba-1 en las 3 regiones de interés. Estos datos indican que los inhibidores de FLAP, no solo bloquean la inflamación mediada por leucotrienos poco después del TBI como se observa en el modelo de TBI de rata FPI, sino que también son eficaces para bloquear la neuroinflamación muchos días después de un solo CHI. Los valores en la figura 28 son la media /- EEM dentro de cada grupo y los datos se informan como el porcentaje de positividad por encima de la simulación para los grupos /- MK-591. Los números y la significación fueron los siguientes: - MK-591 simulado n = 7 CHI n = 8; MK-591 simulado n = 10 CHI n = 10, la significación fue * p <0,05 y ** p <0,01.

La figura 29 es una representación esquemática del papel de los leucotrienos en la neuroinflamación sostenida después de un mTBI como se muestra en el modelo CHI de la presente divulgación. El daño cerebral, por ejemplo, lesión axonal difusa, da como resultado la liberación de moléculas de los axones dañados, incluyendo ATP, que puede unirse a la microglía y provocar la entrada de calcio. El aumento del calcio intracelular activa la fosfolipasa 2 citoplásmica (cPLA²) que escinde los fosfolípidos de la membrana generando ácido araquidónico (AA) libre. Las enzimas 5-LO y FLAP convierten el AA en un precursor de LTA⁴ que se convierte a LTB⁴ , un potente mediador quimiotáctico que recluta células inmunitarias adicionales al área de la lesión. Alternativamente o adicionalmente el LTA⁴ se convierte en los cisteinil-leucotrienos LTC⁴, LTD⁴y LTE⁴ conocidos por su capacidad para estimular la liberación de citocinas y quimiocinas y aumentar la permeabilidad vascular en modelos de lesiones más intensas que implican infiltración de neutrófilos. Los leucotrienos pueden generar una respuesta inflamatoria a la lesión muy rápidamente, ya que las enzimas y sustratos para producir estos mediadores de lípidos ya están presentes en los tejidos, evitando así la necesidad de eventos transcripcionales o de traducción. Si es ininterrumpida, la respuesta inflamatoria en sí misma conduce a un mayor daño cerebral que actúa en un mecanismo de retroalimentación positiva para promover más inflamación. Los datos presentados en el presente documento apoyan la teoría de que el mTBI induce una respuesta neuroinflamatoria innata que implica células cerebrales endógenas independientes de la infiltración de células inmunitarias periféricas. La capacidad de los inhibidores de FLAP para bloquear esta respuesta se puede traducir a muchas enfermedades del cerebro humano que implican una mayor neuroinflamación o que podrían implicar una mayor neuroinflamación.

La presente divulgación está dirigida a prevenir los efectos adversos de los eventos de lesión cerebral, incluyendo la interrupción de la barrera hematoencefálica (BBB) y el edema, eventos perjudiciales tempranos que conducen a una muerte celular adicional, lesión axonal y alteraciones neurológicas. La presente divulgación también está dirigida a reducir la neuroinflamación a más largo plazo que se cree que subyace a muchos eventos de lesión cerebral. Los presentes inventores han utilizado dos modelos animales de lesión cerebral, específicamente un modelo de TBI de lesión por percusión hídrica en ratas y un modelo de mTBI de traumatismo craneoencefálico cerrado (CHI) en ratones; sin embargo, creen que los resultados tienen implicaciones para otros eventos de lesiones cerebrales, incluyendo el ictus, la esclerosis múltiple, la enfermedad de Alzheimer y el trastorno de estrés postraumático (PTSD). Los inventores han descubierto que el bloqueo de la producción de leucotrienos mediante la administración de inhibidores de FLAP antes o poco después de una lesión cerebral bloquea significativamente el edema, la interrupción de BBB, la muerte celular, las deficiencias cognitivas y motoras y la neuroinflamación a largo plazo que se produce después de un evento de lesión cerebral. Se cree que la vía de administración más eficaz de los inhibidores de FLAP es mediante un método de administración intranasal, aunque se pueden utilizar otras vías, incluyendo la oral, intravenosa, intraperitoneal y a través de supositorio. La administración de los inhibidores de FLAP proporciona una reducción drástica en la intensidad de una serie de eventos de destrucción celular posteriores a una lesión cerebral. Se espera que el uso de inhibidores de FLAP de manera profiláctica o poco después de una lesión cerebral mejore drásticamente la recuperación de la función cerebral completa y evite muchas de las consecuencias adversas asociadas a los eventos de lesión cerebral. Los presentes inventores plantean la hipótesis de que los resultados de la presente divulgación apoyan el uso de inhibidores de FLAP en muchos eventos de lesiones cerebrales que incluyen TBI, ictus, la esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer y trastorno de estrés postraumático. Los resultados sugieren que los inhibidores de FLAP pueden usarse tanto de manera profiláctica como después de un evento de lesión cerebral y seguir siendo efectivos. La dosis efectiva de cualquier inhibidor de FLAP estará determinada en parte por su CI50 y por su biodisponibilidad, ya que la capacidad de las proteínas plasmáticas para unirse a muchos inhibidores de FLAP puede reducir su biodisponibilidad. Como se analizó anteriormente, en condiciones cerebrales normales, no hay leucotrienos detectables en el cerebro ni hay evidencia de neuroinflamación. Después de muchos eventos de lesiones cerebrales, tales como TBI, hay un aumento drástico en los leucotrienos cerebrales y evidencia de neuroinflamación sostenida a más largo plazo. El uso de inhibidores de FLAP en el sistema nervioso central puede mejorar estos eventos asociados a la lesión cerebral y prevenir un daño adicional del SNC mediado por el aumento de leucotrienos y neuroinflamación como se muestra en la presente divulgación. Los inhibidores de FLAP son eficaces si se administran antes del evento de lesión cerebral y si se administran después del evento de lesión cerebral. Está demostrado que proporcionar el inhibidor de FLAP 15 minutos antes de un evento de lesión cerebral puede dar como resultado una reducción significativa del daño provocado por el evento de lesión cerebral. Se cree que los períodos de tiempo más largos entre la administración del inhibidor de FLAP y el evento de lesión cerebral son incluso más eficaces. Asimismo, el inhibidor de FLAP se puede proporcionar después de un evento de lesión cerebral y aún brindar protección contra los aumentos de leucotrienos y la neuroinflamación.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un inhibidor de la proteína activadora de la 5-lipoxigenasa (FLAP) para su uso en el tratamiento de la neuroinflamación provocada por un evento de traumatismo craneoencefálico en un animal, en donde dicho inhibidor de FLAP es MK-591 y es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica de un animal; y

dicho inhibidor de FLAP se administra a dicho animal en una cantidad y en un tiempo después de un evento de traumatismo craneoencefálico en donde dicha cantidad y dicho tiempo son suficientes para que dicho inhibidor de FLAP reduzca un nivel de leucotrienos producidos en el cerebro de dicho animal como resultado de dicho evento de traumatismo craneoencefálico.

2. Un inhibidor de la proteína activadora de la 5-lipoxigenasa (FLAP) para su uso en un método para reducir el daño mediado por la neuroinflamación del sistema nervioso central resultante de un evento de traumatismo craneoencefálico en un animal en donde dicho inhibidor de FLAP es MK-591 y es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica de un animal; y

dicho inhibidor de FLAP se administra a un animal en una cantidad y en un tiempo después de un evento de traumatismo craneoencefálico en donde dicha cantidad y dicho tiempo son suficientes para que dicho inhibidor de FLAP reduzca dicho daño mediado por la neuroinflamación del sistema nervioso central como resultado de dicho evento de traumatismo craneoencefálico en dicho animal.

3. Un inhibidor de la proteína activadora de la 5-lipoxigenasa (FLAP) para su uso en el tratamiento de la neuroinflamación provocada por un evento de traumatismo craneoencefálico en un animal, en donde

dicho inhibidor de FLAP es una quinolina-indol y es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica del animal y se administra a dicho animal por vía intranasal en una cantidad y en un tiempo después de un evento de traumatismo craneoencefálico en donde dicha cantidad y dicho tiempo son suficientes para que dicho inhibidor de FLAP reduzca un nivel de leucotrienos producidos en el cerebro de dicho animal como resultado de dicho evento de traumatismo craneoencefálico.

4. Un inhibidor de la proteína activadora de la 5-lipoxigenasa (FLAP) para su uso en un método para reducir el daño mediado por la neuroinflamación del sistema nervioso central resultante de un evento de traumatismo craneoencefálico en un animal,

en donde dicho inhibidor de FLAP es una quinolina-indol y es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica del animal y se administra a un animal por vía intranasal en una cantidad y en un tiempo después de un evento de lesión cerebral, en donde dicha cantidad y dicho tiempo son suficientes para que dicho inhibidor de FLAP reduzca dicho daño mediado por la neuroinflamación del sistema nervioso central como resultado de dicho evento de traumatismo craneoencefálico en dicho animal.

5. El inhibidor de FLAP para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 1, 2, 3 o 4, en donde dicho evento de traumatismo craneoencefálico es un traumatismo craneoencefálico cerrado.

6. El inhibidor de FLAP para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 1, 2, 3 o 4, en donde dicho animal es un ser humano.

7. El inhibidor de FLAP para su uso de acuerdo con la reivindicación 3 o la reivindicación 4, en donde dicho inhibidor de FLAP es MK-591.

8. El inhibidor de FLAP para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 1, 2, 3 o 4, en donde dicho inhibidor de FLAP se administra a dicho animal al menos 15 minutos o más después de dicho evento de traumatismo craneoencefálico.

9. El inhibidor de FLAP para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde dicho inhibidor de FLAP se administra a dicho animal al menos 1 vez al día durante al menos 6 días sucesivos después de dicho evento de traumatismo craneoencefálico.

10. El inhibidor de FLAP para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 2 o 4, en donde dicho daño mediado por la neuroinflamación del sistema nervioso central reducido por dicho inhibidor de FLAP comprende al menos uno de una mayor permeabilidad de la barrera hematoencefálica, muerte neuronal, apoptosis intrínseca de neuronas, edema y un déficit cognitivo.

11. El inhibidor de FLAP para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 3 o 4, en donde dicho inhibidor de FLAP se proporciona en un vehículo que comprende un vehículo lipídico, un aceite vegetal, fosfatidilserina o mezclas de los mismos.

12. El inhibidor de FLAP para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde dicho inhibidor de FLAP se administra mediante una vía seleccionada del grupo que consiste en una vía intravenosa, una vía intraperitoneal, una vía de supositorio y una vía oral.

13. El inhibidor de FLAP para su uso de acuerdo con 1 o 3, en donde los leucotrienos reducidos por dicho inhibidor de FLAP comprenden al menos uno de leucotrieno B⁴ , leucotrieno C⁴, leucotrieno D⁴, leucotrieno E⁴ , o una mezcla de los mismos.