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CN106456624A - Flap抑制剂的降低中枢神经系统内的神经炎症介导的损伤的应用 - Google Patents

Flap抑制剂的降低中枢神经系统内的神经炎症介导的损伤的应用 Download PDF

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CN106456624A CN201580018167.3A CN201580018167A CN106456624A CN 106456624 A CN106456624 A CN 106456624A CN 201580018167 A CN201580018167 A CN 201580018167A CN 106456624 A CN106456624 A CN 106456624A
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brain
inhibitor
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Abstract

本发明提供在阿尔茨海默氏病、多发性硬化、中风和创伤后应激障碍中，通过减弱或预防脑损伤或者在脑损伤后的长期的神经炎症所带来的白三烯‑介导的事件，减弱或预防中枢神经系统内的脑损伤介导的损害的方法。该方法包括在脑损伤事件前或脑损伤事件后的至少一种5‑脂氧合酶活化蛋白(FLAP)抑制剂的给药。该方法发现中枢神经系统中的白三烯的产生与创伤性脑损伤(TBI)、中风、多发性硬化、阿尔茨海默氏病、创伤后应激障碍以及其他脑损伤的治疗相关。FLAP抑制剂优选地通过经鼻腔给药，且优选地在潜在的脑损伤事件前预防性给确切的高危群体给药。

Description

FLAP抑制剂的降低中枢神经系统内的神经炎症介导的损伤的 应用
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年2月4日提交的61/935,763号美国临时申请和2015年2月4日提交的14/613,658号美国实用申请的权益。
技术领域
本发明大体涉及通过5-脂氧合酶活化蛋白(FLAP)抑制剂的给药治疗由各种脑损伤事件(例如创伤性脑损伤、中风、多发性硬化、阿尔茨海默氏病和创伤后应激障碍)造成的神经炎症和神经炎症介导的损伤的方法。
背景技术
根据疾病控制与预防中心(CDC)的统计，每年单是美国就报道有超过250万创伤性脑损伤(TBI)的病例。据信，每年美国超过5百万-6百万的TBI病例没有报道，因为这些病例的严重程度被认为不需要到医院进行治疗，被称为轻度TBI(mTBI)，因此，这些病例在非医院环境下进行治疗或根本不进行任何治疗。这些统计数据没有包括在日常处于美国外的许多冲突中的军人身上发生的许多TBI事件(无论是mTBI还是更严重的TBI)。这些统计数据也没有包括美国境外的其他人身上发生的TBI事件。医学界最近才认识到，所谓的轻度TBI的后果长期看来并不是轻度的。流行病学研究已经确定，mTBI是一个主要的公共健康问题。临床研究证据已经表明，在脑损伤发生几个月到几年后，除了更严重的TBI之外，对于一些患者甚至是mTBI可导致长期的身体和神经认知症状。人TBI的神经病理学的特点是，借助于反应性星形胶质细胞、激活的小胶质细胞以及灰质区和白质束的微出血的佐证，弥漫性轴突损伤导致各脑区的功能连接的改变和长期的神经炎症。
急性和慢性脑损伤和退行性疾病可激活常驻脑细胞(如星形胶质细胞和小胶质细胞)并募集周边的免疫细胞至受损的脑区，导致扩大神经炎症和恶化脑损害。白三烯(LT)是介导炎症的有效的生物活性脂质。墨菲RC等，美国科学院院报(Proc Natl Acad Sci USA)，76：4275-4279页，1979年。通过细胞的机械损伤和来自于膜甘油磷脂的花生四烯酸(AA)的酶法消解，导致开始生物合成白三烯。弗尔科G和墨菲RC，药理学评述(Pharmacol Rev)，58，375-388页，2006年。5-脂氧合酶(5-LO)和5-脂氧合酶活化蛋白(FLAP)的酶促作用将AA转化成白三烯A4(LTA4)。该LTA4很快通过LTA4水解酶转化为白三烯B4(LTB4)或通过LTC4合酶转化为白三烯C4(LTC4)。然后LTC4可转化为白三烯D4(LTD4)和白三烯E4(LTE4)，这三种白三烯(LTC4，LTD4，LTE4)被统称为半胱氨酰白三烯。半胱氨酰白三烯的作用最初在哮喘领域被研究，其中，已知它们能够引起血管渗透性、外渗大分子、刺激细胞因子的释放和收缩支气管平滑肌。博伊斯JA，免疫学评述(Immunol.Rev)，217，168-185页，2007年。白三烯在健康的大脑是检测不到的。法里亚斯S等，神经创伤期刊(J，Neurotraum)，26，1977-1986页，2009年。但是，在创伤性脑损伤(TBI)或中风后，白三烯通过涉及浸润嗜中性粒细胞或内源性小胶质细胞和内源性脑细胞的跨细胞机制合成。法里亚斯S，神经化学期刊(J，Neurochem)，103，1310-1318页，2007年；法里亚斯S等，神经创伤期刊(J，Neurotraum)，26，1977-1986页，2009年。
人们迫切需要一种能够改善伴随脑损伤事件(如TBI、中风、多发性硬化和阿尔茨海默氏病)的神经炎症和神经退行性疾病的方法。此外，最近的一些研究似乎表明，创伤后应激障碍(PTSD)可具有神经退行性疾病构成，因此，其也是用于降低神经退行性疾病和神经炎症的方法的潜在候选。预防这些脑损伤事件的一系列的继发性物理效应和认知影响是十分有利的。
发明内容
本发明论证，在创伤性脑损伤(TBI)后的早期产生的白三烯标志着包括血脑屏障(BBB)破坏和水肿的不良反应、导致额外的细胞死亡的早期不利事件、轴突损伤和神经损伤。另外，本发明公开并示出，脑损伤事件导致多个脑区内的长期的神经炎症。本申请的发明人使用脑损伤的两种动物模型，具体为TBI的大鼠液压冲击损伤模型和轻度TBI的小鼠闭合性颅脑损伤(CHI)模型。发明人认为，对于除了包括中风、多发性硬化、阿尔茨海默氏病和创伤后应激障碍(PTSD)的TBI之外的其他脑损伤事件，该结果能够给出指导和治疗建议。发明人还发现，通过到达中枢神经系统(CNS)的FLAP抑制剂的给药来阻滞白三烯的生成，显著地阻滞了TBI后发生的水肿、BBB破坏、细胞死亡、神经炎症以及认知和运动障碍。已知FLAP抑制剂具有几种可行的外周给药途径(包括口服、静脉、栓剂和腹腔)，而且没有报道其具有毒性或有害作用。发明人证明，绕过血脑屏障的鼻腔给药途径，使得FLAP抑制剂迅速地递送给大脑，相对于全身递送进入血液和循环系统而言涉及较少的药物。因此，这类抗炎剂有希望用于介入TBI、中风、多发性硬化、阿尔茨海默氏病和创伤后应激障碍(PTSD)后的治疗。目前还没有治疗能够减轻TBI后的脑损伤和神经机能障碍。
本发明进一步公开，当FLAP抑制剂在脑损伤事件前给药，它们减轻细胞死亡、水肿和认知缺陷。因此，除了在脑损伤后不久使用FLAP抑制剂以阻滞或减轻继发性损伤或者在长期患神经炎症后使用FLAP抑制剂，FLAP抑制剂在脑损伤事件(如TBI)中作为潜在的预防药而具有预防作用，具有高风险的头部损伤的群体(包括从事高度的身体接触运动的运动员和处于战斗场中的军人)可以长期地服用FLAP抑制剂或者在预期他们易患头部创伤或脑损伤的事件前服用FLAP抑制剂。第二代FLAP抑制剂具有较长的半衰期，因此可能每天给药一次就可以防止其免受脑损伤。据信，本发明的FLAP抑制剂可用于治疗与中风、多发性硬化、阿尔茨海默氏病和创伤后应激障碍相关的神经炎症。
阻滞或减弱TBI后的继发性脑损伤的药物很可能会防止TBI后的大多数死亡和长期残疾。与其他药物递送方式相比，药物通过鼻腔给药具有几大优势：1)鼻腔给药绕过BBB，从而增加大脑生物利用度并允许使用不能穿过血脑屏障的化合物，2)鼻腔给药限制了药物进入体循环的量，从而减少对肝脏和心脏潜在的毒性，3)鼻腔给药非常迅速，这是介入TBI的一个关键因素，以及4)鼻腔给药的方法快捷而简单，使其非常适用于预防用途或者在TBI事件后立刻服药治疗。
在一个实施例中，本发明提供一种治疗动物的由脑损伤事件导致的神经炎症的方法，包括以下步骤：提供5-脂氧合酶活化蛋白(FLAP)抑制剂，其中，所述FLAP抑制剂能够跨越动物的血脑屏障；一定量的所述FLAP抑制剂在脑损伤事件前或脑损伤事件后的时间对所述动物给药，其中，所述量和所述时间足以使所述FLAP抑制剂降低由于所述脑损伤事件而在所述动物的大脑中产生的白三烯的水平。
在一个实施例中，本发明提供一种降低动物的由脑损伤事件造成的中枢神经系统神经炎症介导的损害的方法，包括以下步骤：提供5-脂氧合酶活化蛋白(FLAP)抑制剂，其中，所述FLAP抑制剂能够跨越动物的血脑屏障；一定量的所述FLAP抑制剂在脑损伤事件前或脑损伤事件后的时间对所述动物给药，其中，所述量和所述时间足以使所述FLAP抑制剂降低所述动物的由脑损伤事件造成的中枢神经系统神经炎症介导的损害。
在一个实施例中，本发明提供一种治疗动物的由脑损伤事件导致的神经炎症的方法，包括以下步骤：提供5-脂氧合酶活化蛋白(FLAP)抑制剂；一定量的所述FLAP抑制剂在脑损伤事件前或脑损伤事件后的时间通过鼻腔途径对所述动物给药，其中，所述量和所述时间足以使所述FLAP抑制剂降低由于所述脑损伤事件而在所述动物的大脑中产生的白三烯的水平。
在一个实施例中，本发明提供一种降低动物的由脑损伤事件造成的中枢神经系统神经炎症介导的损害的方法，包括以下步骤：提供5-脂氧合酶活化蛋白(FLAP)抑制剂；一定量的所述FLAP抑制剂在脑损伤事件前或脑损伤事件后的时间通过鼻腔途径对所述动物给药，其中，所述量和所述时间足以使所述FLAP抑制剂降低所述动物的由脑损伤事件造成的中枢神经系统神经炎症介导的损害。
附图说明
对于本领域的技术人员来说，结合优选实施例的详细描述，本发明的这些和其它特征以及优点将变得更加显而易见。伴随详细描述的附图描述如下。
图1是紧接着脑损伤事件或神经炎症并响应该脑损伤事件或神经炎症而在脑组织中跨细胞地生物合成白三烯的原理图；
图2A(左图)是在TBI后6h利用苏木精和伊红(H&E)对同侧左脑半球和对侧右脑半球的皮质的染色的示意图；
图2B(右图)证明嗜中性粒细胞或单核细胞有助于在TBI后在脑中产生损伤引起的白三烯，其通过长春花碱的预治疗的效果进行佐证；
图3A示出假致伤动物1h后和TBI致伤动物1h后(通过液压冲击损伤)的同侧脑半球和对侧脑半球内的LTC4的水平；
图3B示出空白动物、假致伤动物和TBI后头部损伤动物的左脑半球和右脑半球内的合成LTC4的进程；
图4示出FLAP抑制剂MK-886在TBI前的给药显著地减少两个脑半球内产生的白三烯LTC4；
图5示出FLAP抑制剂MK-886在TBI后15min的给药完全阻滞损伤引起的白三烯LTC4的合成；
图6示出FLAP抑制剂MK-886在TBI前30min的预治疗降低TBI后72h测定的细胞死亡的体积；
图7的上图示出FLAP抑制剂MK-886在TBI前或后的给药减轻TBI后的水肿，FPI后72h获得的典型的T2加权的MRI图像，下图示出通过使用Fiji(NIH)从各动物组获得的5个连续的T2-MRI切片计算的平均归一化脑肿胀的MRI定量分析；
图8示出FLAP抑制剂MK-886在TBI后30min的给药减少海马CA1区的BBB渗透性，图8A是在TBI后5h，进入海马细胞层的EB(红色)和进入同侧海马的DAPI(蓝色)的典型的荧光图像，图8B是在TBI后15min，接受赋形剂或者MK-886的动物的同侧CA1海马细胞层的EB外渗的图像的放大图，以及图8C是在海马区的EB+细胞的量的EB-DAPI荧光共定位分析，柱＝200μm；
图9示出FLAP抑制剂MK-886在TBI后30min的给药减弱TBI，LTP后的海马的长时程增强的不足，通过测量来自于假致伤大鼠(空心三角形，n＝8)、在FPI后30min注射赋形剂(实心圆，n＝7)或MK-886(红色正方形，n＝7)的FPI损伤大鼠的海马切片，数据被表示为对照fEPSP斜率的a％，所示的每个数据点是由每隔20s测量的六个数据的平均值，假致伤n＝8，FPI n＝9，插图描绘一个典型的假致伤fEPSP；
图10示出FLAP抑制剂MK-886在TBI后30min的给药减轻在径向臂水迷宫的学习和记忆中的TBI-引起的障碍，在第2天反向任务的坚持性测试中，第3次游泳的坚持性(在前目标臂内的持续时间)变化表示为在第1次游泳中的坚持性的百分比，以及第2天反向任务的成绩表现为在反向任务的第11次-第15次游泳中所犯的错误数(平均+/-SEM)；
图11示出FLAP抑制剂MK-886在TBI后15min的给药减轻由TBI引起的运动缺陷，表现为在转棒上具有改进的平衡运动性能；
图12是根据本发明的FPI模型中的白三烯和TBI之间的关系的概要和示意图；
图13示出MK-886(实心三角形)与MK-591(实心圆形)对人全血中产生的LTB4和5-HETE的效力的比较；
图14是示出FLAP抑制剂的鼻内递送的一个例子的示意图；
图15示出FLAP抑制剂MK-591在鼻腔给药(MK-591)30min后的在大脑几个区域中的水平与在血浆中的水平；
图16示出FLAP抑制剂MK-591在腹腔给药30min后的在大脑和血浆中的水平；
图17A示出白三烯LTC4和LTD4在体外以剂量依赖的方式引起神经细胞凋亡、细胞程序性死亡，图17B示出利用DAPI和活性胱天蛋白酶9(箭头)的抗体染色的细胞，从而验证神经元由于内在细胞凋亡而死亡；
图18A，18B和18C示出假手术小鼠和小鼠闭合性颅脑损伤(CHI)模型中的小鼠在证实创伤性脑损伤的措施(呼吸暂停、翻正反射和掉落等待时间)方面的比较；
图19A和19B示出假手术小鼠和小鼠闭合性颅脑损伤(CHI)模型中的小鼠的轻度TBI的两个标记物的血浆水平之间的比较，该水平的测量在损伤后标注下的时间进行，标记物为以mg/ml计的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和以pg/ml计的泛素羧基末端水解酶(UCHL)；
图20示出假手术小鼠和小鼠闭合性颅脑损伤(CHI)模型中的小鼠在损伤7天和30天后(dpi)的典型的T2加权的MRI图像，基准尺为2mm，没有检测到水肿；
图21示出在7dpi组化地利用H&E和在30dpi免疫组化地利用髓过氧化物酶(MPO)对假手术小鼠和小鼠闭合性颅脑损伤(CHI)模型中的小鼠的脑切片染色的典型图像；
图22A和图22B示出在7dpi和30dpi组化地利用H&E、在7dpi和30dpi免疫组化地利用GFAP、在7dpi和30dpi免疫组化地利用离子钙接头蛋白抗原1(Iba-1)分别对假手术小鼠和小鼠闭合性颅脑损伤(CHI)模型中的小鼠的冠状脑切片染色的典型图像；图22C是小鼠大脑的冠状横截面视图，示出特别关注的区域，即大脑皮质层(CTX)、外囊(EC)、海马CA区和齿状回(DG)；
图23A和23B示出在7dpi和30dpi免疫组化地利用GFAP、在7dpi和30dpi免疫组化地利用离子钙接头蛋白抗原1(Iba-1)分别对假手术小鼠和小鼠闭合性颅脑损伤(CHI)模型中的小鼠的皮质脑切片染色的典型图像，下方也示出了典型的染色切片的图，该图示出利用相同的标记物对7dpi(左边)和30dpi(右边)的相似切片进行定量分析；
图24A和24B示出在7dpi和30dpi免疫组化地利用GFAP、在7dpi和30dpi免疫组化地利用Iba-1分别对假手术小鼠和小鼠闭合性颅脑损伤(CHI)模型中的小鼠的外囊脑切片染色的典型图像，下方也示出了典型的染色切片的图，该图示出利用相同的标记物对7dpi(左边)和30dpi(右边)的相似切片进行定量分析；
图25A和25B示出在7dpi和30dpi免疫组化地利用GFAP、在7dpi和30dpi免疫组化地利用Iba-1分别对假手术小鼠和小鼠闭合性颅脑损伤(CHI)模型中的小鼠的齿状回脑切片染色的典型图像，下方也示出了典型的染色切片的图，该图示出利用相同的标记物对7dpi(左边)和30dpi(右边)的相似切片进行定量分析；
图26A示出，响应于7dpi对假手术小鼠和小鼠闭合性颅脑损伤(CHI)模型中的小鼠的CA3的Schaffer侧枝的刺激，CA1辐射层的长时程增强(LTP)的图，其是随着时间绘制的归一化至预高频刺激(HFS)基线的fEPSP记录的最初的斜率的平均值，图26B示出相同的样品在58-60min的平均值；
图27示出在7dpi免疫组化地利用GFAP和Iba-1分别对假手术小鼠和小鼠闭合性颅脑损伤模型中的小鼠的大脑皮质切片染色的典型图像，该小鼠在死亡前和损伤后的6天内的每天腹腔注射接受5mg/kg的赋形剂(-)或MK591(+)；
图28示出在7dpi利用GFAP和Iba-1免疫组化地对假手术小鼠和小鼠闭合性颅脑损伤(CHI)模型中的小鼠的皮层、外囊和齿状回染色的定量分析，该小鼠在死亡前的6天内每天腹腔注射接受5mg/kg的赋形剂(-)或MK591(+)；
图29示出持续的神经炎症的通路，根据本发明所呈现的结果，该通路据信存在于CHI(mTBL的实验模型)所带来的TBI中。
具体实施方式
本文的说明书和权利要求中包括以下缩写和术语，除非另有说明，这些缩写和术语具有确定的含义：花生四烯酸(AA)；5-脂氧合酶(5-LO)；血脑屏障(BBB)；伊文思蓝(EB)；场兴奋性突触后电位(fEPSP)；5-脂氧合酶活化蛋白(FLAP)；液压冲击损伤(FPI)；长时程增强(LTP)；径向臂水迷宫(RAWM)；反相液相色谱耦合串联质谱(RP LC-MS/MS)；创伤性脑损伤(TBI)；人全血(HWB)；术语动物是指包括动物界的所有成员的上位概念，包括所有的哺乳动物，例如，人，家养动物和非家养动物的总称；闭合性颅脑损伤(CHI)，特别是本说明书中所描述的小鼠模型；苏木精和伊红(H&E)；胶质纤维酸性蛋白(GFAP)；泛素羧基末端水解酶L1(UCHL-1)，髓过氧化物酶(MPG)，离子钙接头蛋白抗原1(Iba-1)，毫克(mg)，毫升(ml或mL)，皮克(pg)，纳克(ng)，毫米(mm)，损伤后天数(dpi)。
蛋白5-脂氧合酶活化蛋白在20世纪80年代后期和90年代早期被发现，筛选为白三烯抑制剂。5-脂氧合酶(5-LO)和5-脂氧合酶活化蛋白(FLAP)的酶促作用将来自于膜甘油磷脂的花生四烯酸(AA)转化成白三烯A4(LTA4)。这就启动了白三烯的级联，其中，LTA4很快被LTA4水解酶转化为白三烯B4(LTB4)或被LTC4合酶转化为白三烯C4(LTC4)。然后LTC4可转化为白三烯D4(LTD4)和白三烯E4(LTE4)，这三种白三烯(LTC4，LTD4，LTE4)被统称为半胱氨酰白三烯。
FLAP发现后不久，FLAP抑制剂(包括吲哚MK-886、喹啉BAY X1005，和喹啉-吲哚MK-591)被发现并在哮喘的人体试验中进行测试。B.S.Friedman，E.H.Bel，A.Buntinx，W.Tanaka，Y.H.Han，S.Shingo，R.Spector，P.Sterk，口服白三烯抑制剂(MK-886)阻滞过敏原引起的气道反应，Am.Rev,Respir,Dis.147，839-844页，1993年；B.Dahlen，M.Kumlin，E.Ihre，O.S.E.Dahlén，在过敏性哮喘患者中通过白三烯生物合成抑制剂BAYX1005抑制过敏原引起的气道阻塞和白三烯的生成，Thorax 52，342-347页，1997年；Z.Diamant，M.C.Timmers，H.Van Der Veen，B.S.Friedman,M.De Smet，M.Depre，D.Hilliard，E.H.Bel，P.J.Sterk，一种新型的5-脂氧合酶活化蛋白抑制剂MK-0591在哮喘患者体内的白三烯生物合成和过敏原引起的气道反应中的作用，J.Allergy Clin,Immun，95，42-51页，1995年。所有这些最初发现的FLAP抑制剂在阻滞哮喘患者的白三烯的产生上显示出良好的安全性和功效，但是，当白三烯受体拮抗剂zafirlukast(AccolateTM)、montelukast(SingulairTM)、pranlukast(OnonTM)和5-LO抑制剂zileuton(ZyfloTM)进入市场并批准用于治疗哮喘时，这些FLAP抑制剂的发展进入停滞阶段。该FLAP抑制剂MK-886是1-[(4-氯苯基)甲基]-3-[(1,1-二甲基乙基)硫代]-α,α-二甲基-5-(1-甲基乙基)-1H-吲哚-2-丙酸。FLAP抑制剂MK-591是(3-[1-(4-氯苄基)-3-(叔丁基硫代)-5-(喹啉-2-基-甲氧基)-吲哚-2-基]-2,2-二甲基丙酸。FLAP抑制剂BAY-X1005是(R)-α-环戊基-4-(2-喹啉甲氧基)苯乙酸。
由于上面列出的FLAP抑制剂的发现已经比较成熟，其有希望成为进一步药物开发的领域。根据本发明的给药的途径，所有的FLAP抑制剂都可以在本发明中找到应用，那些具体提及的抑制剂仅仅是合适的化合物的例子，其并不是唯一有用的FLAP抑制剂。在本发明的一个实施例中，FLAP抑制剂通过下列途径之一进行全身给药：静脉注射、腹腔途径、口服途径或者作为栓剂。当通过这些途径中的任一种进行给药的时候，合适的FLAP抑制剂能够跨越血脑屏障，其程度足以向大脑区域提供足够抑制FLAP的生物可利用的FLAP抑制剂，从而降低大脑中的神经炎症相关的白三烯。正如药学领域的技术人员所公知的那样，所选的FLAP抑制剂的分配系数优选为使得相对于循环系统和其它组织中的浓度，在中枢神经系统(更具体地在大脑中的浓度)中具有足够的浓度。优选地，FLAP抑制剂针对FLAP的半抑制浓度(IC50)为10nmol或更低，更优选为5nmol或更低。
在本发明的另一实施例中，FLAP抑制剂经由鼻内途径给药。当FLAP抑制剂通过这个途径给药时，FLAP抑制剂能够绕过血脑屏障，并经由鼻粘膜直接进入大脑，其沿着三叉和嗅觉神经通路通过胞外机制传递以由此进入大脑。对于这条途径，FLAP抑制剂不需要跨越血脑屏障的能力，因为这条路径避开了血脑屏障。FLAP抑制剂在载体内制备，该载体可包括脂质、一种或多种植物油、磷脂酰丝氨酸或它们的混合物。这条途径由于避开了血脑屏障而允许使用非极性的FLAP抑制剂。
除了MK-591和MK-886之外，本发明中的有用的FLAP抑制剂的其他例子包括，例如：3-[3-叔丁基磺酰基-1-[4-(6-乙氧基吡啶基-3-基)苄基]-5-(5-甲基吡啶基-2-甲氧基)-1H-吲哚-2-基]-2,2-二甲基丙酸11cc(葛兰素史克的原AM803，现GSK-2190915)；1-戊烷基-3-(2-碘苯甲酰)吲哚(AM679，大麻素)。
本发明直指使用FLAP抑制剂以减轻与脑损伤事件相关的继发性神经炎症介导的神经退行性疾病。据信，使用FLAP抑制剂可减轻一些脑损伤事件，作为示例地包括：创伤性脑损伤(TBI)、创伤后应激障碍(PTSD)、中风、多发性硬化、帕金森症和阿尔茨海默氏病。
图1是立即响应脑损伤事件(例如TBI)而在脑组织中跨细胞地生物合成白三烯的原理图。来自于原发性损伤的受损细胞和轴突渗出三磷酸腺苷(ATP)和谷氨酸，其与小胶质细胞受体结合并由此引起钙的内流。该钙的内流激活钙依赖性胞浆型磷脂酶A2(cPLA2)。该磷脂酶使得AA从膜磷脂中释放出来，该AA被转化为5-羟基二十碳四烯酸(5-HETE)，然后在5-LO及其活化蛋白FLAP的双重作用下转化为LTA4。所产生的LTA4然后通过LTA4水解酶转化成LTB4，其是一种募集嗜中性粒细胞的有效的趋化介质，或者LTA4被运出小胶质细胞并进入相邻的星形胶质细胞和可能的神经元，并且通过LTC4合酶的作用转化为LTC4、LTD4和LTE4。早期产生的白三烯加剧了炎症、BBB破坏和水肿，进而导致了更多的细胞死亡、轴突损伤和神经系统障碍。正如将在本说明书中示出的那样，通过FLAP抑制剂(如MK-886)阻滞白三烯的产生可以显著地阻滞水肿、细胞死亡和神经功能障碍。如图1中进一步所示，插图中示出的上曲线是生成LTC4的时间进程，下曲线是生成LTD4的时间进程，其在TBI接下来的4h内达到峰值，随后在TBI后24h降至0。
在本说明书中，正如下面更全面描述的那样，我们使用了两个物种(大鼠和小鼠)的两个TBI模型。在大鼠模型中，TBI事件通过使用侧方液压冲击损伤(FPI)引起，而在小鼠模型中，TBI事件通过电磁控制活塞装置(ImpactOne)使用闭合性颅脑损伤(CHI)引起。两个模型均显示本发明在减轻TBI影响上的价值。
实验规程
动物
成年雄性SD大鼠(9-11周龄，250-300克；Harlan实验室)被单独饲养在自由获取食物和水的温控和光控的笼舍中。成年雄性C57B16/J小鼠(10-12周龄)被单独饲养在自由获取食物和水的温控和光控的笼舍中。所描述的所有程序均在University of ColoradoInstitutional Animal Care and Use Committee批准的规程下操作，并遵守Nationalinstitutes of Health(NIH)的Guide for the Care and Use of Laboratory Animals。
创伤性脑损伤(TBI)模型实验：大鼠的侧方液压冲击损伤(FPI)
开颅手术和侧方液压冲击损伤(FPI)通过使用已经经过验证并公布的程序进行。Farias S等，J.Neurotraum，26，1977-1986页，2009年；Frey LC等，J.Neurosci.Methods，177，267-272页，2009年。因为该治疗规程是一个TBI模型，受该规程规范的动物被称为具有TBI。简而言之，大鼠用3-5％的异氟烷(Isosol,VEDCO inc.,St.Joseph,MO)通过鼻锥麻醉，并固定在立体定向头架上。开颅创建一个3毫米(mm)的骨孔，开颅中心位于前囟后3mm，左矢状缝旁3.5mm，保持暴露的硬膜完整。一个钢支架螺丝钉埋入对侧的头骨中。内径为3.5mm的Luer锁轮毂围绕着开颅手术的中心设置，其通过氰基丙烯酸胶粘剂和螺帽与头骨结合。牙科用丙烯酸(Snap，Parkell，Inc.，Edgewood，NJ)倒在轮毂和螺丝钉周围。在丙烯酸硬化后，围绕着螺帽涂上抗生素软膏，并将动物放回到它们的笼子中。第二天，大约15-20h后，在诱导箱内利用异氟烷麻醉该动物，并将它立即连到FPI装置上，使其在从麻醉中苏醒前接受20ms脉冲的加压的无菌盐水的2.7个大气压(atm)的压力，以在开颅手术后的完整的硬脑膜的表面模拟中等程度的冲击。假致伤动物进行开颅手术和麻醉并连到FPI装置上，但是它们并没有接受流体脉冲。在开颅手术前，所有的动物接受皮下注射镇痛药、叔丁啡、0.05mg/kgBuprenex，并且在随后的两天每12h进行注射。在损伤后喂食湿润的食物，并且每天监测所有动物的健康和体重变化。
轻度创伤性脑损伤(mTBI)模型实验：小鼠的闭合性颅脑损伤(CHI)
简单地说，成年雄性小鼠用3-5％的异氟烷通过鼻锥麻醉。由沿中线切口头皮暴露出头骨。然后将小鼠固定至立体定位架，利用电磁控制活塞装置ImpactOne冲击左侧顶叶皮层。角度设定为20°，探针尺寸为5mm，速度为5m/s，停顿时间为100ms。假致伤小鼠经历同样的过程直到固定到立体定位架，但是它们并没有接受冲击。在切开头皮前，所有的动物接受皮下注射镇痛药、叔丁啡、0.05mg/kg Buprenex，并且在随后的两天每12h进行注射。在损伤后喂食湿润的食物，并且每天监测所有动物的健康和体重变化。
长春花碱给药
两组大鼠(每组四只)接受上述FPI。在FPI前四天，利用3-3.5％的异氟烷对每只动物短暂麻醉少于5min，并利用NaCl(0.9％，2ml/kg，赋形剂)进行IV给药，或者利用长春花碱硫酸盐(0.5mg/kg)IV给药相同体积。在给药4天后，长春花碱治疗的动物的嗜中性粒细胞的消耗通过全血细胞计数(CBC)进行验证。两组均通过断头处死，在FPI后1h提取脑脂质。所形成的LTC4的量通过RP LC-MS/MS进行测量，并且通过每mg蛋白归一化，使用单因素方差分析进行比较，以及使用Student-Newman-Keuis法进行多重对比。
静脉注射FLAP抑制剂MK-886和赋形剂
吲哚FLAP抑制剂MK-886通过以2.5mg/ml的剂量，溶解于二甲基亚砜(DMSO)中制备，然后用0.9％的盐水稀释至10％的DMSO。将大鼠简单地利用3-3.5％的异氟烷进行麻醉，6mg/kg剂量的MK-886或者赋形剂通过尾静脉注射静脉给药(IV)。在接受其他的程序前，所有动物允许保持清醒。
啮齿动物的大脑中的白三烯的测量
大鼠脑脂质的提取。将来自同侧和对侧脑半球的皮质和海马区收集到4ml的80％甲醇中，用Dounce匀浆器进行匀浆，并向该匀浆中加入内标物。蛋白含量使用双金鸡宁酸法(BCA)进行蛋白测定，以将脂质水平归一化为组织的量。样品沉淀并收集上清液。样品稀释至低于15％的最终的甲醇浓度，然后用固相萃取柱(Strata C18-E，100mg/1ml，Phenomenex，Torrence CA)萃取脂质。洗出液(1ml的甲醇)蒸干，并在70μl的高效液相色谱(HPLC)溶剂A(8.3mM的乙酸利用NH4OH缓冲至pH5.7)，加上20ml的溶剂B(体积比为65/35的乙腈-甲醇)中再生。
反相液相色谱-耦合串联质谱(RP LC-MS/MS)测量白三烯。将每个样品等分为35μl，注入HPLC系统并利用C18柱(Columbus 150x1mm，5μm Phenomenex)进行反相层析，利用流动相溶剂B以50μl/min的流速进行25％-100％的线性梯度洗脱。溶剂B通过24min从25％提高到85％，通过26min提高到100％，并在接下来的12min保持在100％。HPLC的流出物直接连接到三重质谱仪(Sciex API 2000，PE-Sciex，Thornhill，Ontario，Canada)的电喷雾源，在负离子模式下使用特定转变的多反应监测(MRM)进行质谱分析，m/z624→272的是LTC4，m/z495→177的是LTD4，m/z335→195的是LTB4，m/z339→197的是d4-LTB4，以及m/z629→277的是d5-LTC4。使用前述的标准同位素稀释曲线进行定量。Farias等，J.Neurochem.，103，1310-1318页，2007年，从Cayman Chemical，Ann Arbor，MI参照白三烯标准和稳定的同位素类似物。
磁共振成像(MRI)
采集。所有MRI研究在University of Colorado Animal Imaging SharedResource(AISR)进行。FPI模型的大鼠在损伤后72h进行MRI成像，使用T2-加权和Gd-增强的T1加权序列。小鼠在7dpi和30dpi进行MRI成像，使用T2加权序列。对于所有的MRI，动物用2.5％的异氟烷进行麻醉。使用4.7 Tesla Bruker PharmaSean进行扫描，具有38mm内径的正交鸟笼线圈(调谐到200.27MHz的1H频率)被用于RF传输和接收。使用RARE(快速采集弛豫增强)序列来获得T2加权轴向MR扫描，该序列具有以下参数：FOV：4.6cm；TE/TR：32/5000ms；切片厚度＝1.20mm；切片间距1.20mm(无间隙)；切片数量＝20；平均数量＝4/相编码步骤；矩阵尺寸＝128x256。在0.2mmol/kg的通过IV给药前或后，使用MSME(多层多回波)序列(11.0/700ms的TE/TR)获得T1加权的MR图像。
T2-加权的MRI分析。对于各大鼠，跨越损伤的整个区域的5个切片(1.2mm厚)被用于计算FPI-相关的脑肿胀。受损的同侧脑半球的直径从中线(Fiji/ImageJ，NIH)到皮质的最宽处进行测量。然后，同侧(ipsi)和对侧(contra)脑半球的直径之间的差值通过使用以下公式计算并归一化到对侧脑半球的直径中：
{(同侧脑半球的直径-对侧脑半球的直径)/对侧脑半球的直径}×100
T1-加权的MRI分析。对于各大鼠，对软脑膜中的展示出同侧和对侧的T1-加权的后-Gd高信号之间的可见区别的所有的图像进行分析。在前-Gd图像中检测不到软脑膜的高信号。Fiji(ImageJ)软件被用来描绘并计算每个切片中的像素强度的面积，然后将其乘以1.2mm(连续的MR图像之间的距离)以得到T1-加权的后-Gd高信号的体积。各大鼠的所有的被选的切片的体积相加以得到每只大鼠的软脑膜的Gd外渗的总体积。各组中的所有大鼠的平均值以mm3被报告。
组化染色前的脑组织固定的通用操作流程
在指定的时间点，经腹腔注射50mg/kg戊巴比妥钠对动物进行深度麻醉，用冰冷的肝素化生理盐水经心灌注，然后利用新鲜制备的4％多聚甲醛的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)进行固定。取出大脑，在4℃的4％多聚甲醛/PBS中保持4h进行后固定。大脑随后在4℃的20％蔗糖的PBS中脱水直至沉底，包埋OCT混合物(Sakura Finetek USA Inc.，Torrance，CA)，并在-70℃保存直到切片。
伊文思蓝的给药和外渗分析
FPI前1h，大鼠经腹腔(IP)注射5ml含2％w/v伊文思蓝(EB)溶液的生理盐水。FPI后6h，经腹腔注射50mg/kg戊巴比妥钠对动物进行深度麻醉，用200ml冰冷的肝素化生理盐水经心灌注，然后利用100ml新鲜制备的含4％多聚甲醛的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)进行固定。取出大脑，在4℃的4％多聚甲醛/PBS中保持4h进行后固定。大脑随后在4℃的20％蔗糖的PBS中脱水直至沉底，包埋OCT混合物(Sakura Finetek USA Inc.，Torrance，CA)，并在-70℃保存。全脑冠状切片30μm，并且典型的跨越每只动物的270μm增量的整个海马切片被安装到载玻片，并用含4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的Fluoromount-G(SouthernBiotech，Birmingham，AL)盖玻片覆盖。EB-阳性脑区域的图像通过Zeiss Axioplan2显微镜(配备有HB0100w/2灯、Photometrics CoolSnapfx camera Roper Scientific和IPLab softwareBD Biosciences)进行拍摄。每个切片的图像使用Fiji/ImageJ(NIH)缝合在一起，并且使用细胞计数器量化海马细胞层的EB-阳性细胞。
电生理
制备海马切片。FPI后四天处死动物，或者在CHI模型动物的附图中所指示的时间处死动物，将大脑迅速地取出并浸入冰冷的含蔗糖的切割缓冲液(87mM NaCl，2.5mM KCl，7mM MgCl2，0.5mM的CaCl2，1.25mM NaH2PO4，25mM D-葡萄糖，35mM蔗糖，和25mM的NaHCO3)中40-60s以冷却大脑的内部。使用McIlwain组织切片机进行横切片(厚度400μm)，切片单独存储孵育至少60min。孵育后，单张切片被转移到记录槽，并在31℃下利用2-3ml/min的体积流速的人工脑脊液(aCSF)进行灌流。该aCSF含有：126mM NaCl，3.0mM KCl，1.0mM MgSO4，2.0mM的CaCl2，1.2mM NaH2PO4，11mM D-葡萄糖，和25.9mM的NaHCO3。双极钨刺激电极被放置在Schaffer侧枝(SC)通路，以诱发突触的场兴奋性突触后电位(fEPSP)，该fEPSP通过辐射层中的内充有aCSF的附近的玻璃微穿刺针记录。
基线记录。在对切片进行每个实验前，通过增加激励电压和记录突触响应生成输入输出曲线，直到获得某个最大值，或者在fEPSP响应上观察到的群体峰电位。此外，运行双脉冲比值(PPR)，由此，刺激对以50ms的刺激内间隔作用于CA3轴突。PPR通过{(第2个脉冲刺激诱发的fEPSP的幅度)/(第1个脉冲刺激诱发的fEPSP的幅度)}×100进行计算。
长时程增强的测量。放置在CA3-CA1树突场层中的双极钨电极诱发fEPSP响应。测试刺激被设置为每20s递送一次刺激强度，该强度设置为最大突触响应的40-50％。高频刺激(HFS)由两串100Hz的控制刺激强度的刺激(每串刺激持续1s)组成，串间间隔为20s。fEPSP通过放置在细胞体层的约200-300μm的辐射层中的内充有人工脑脊液(aCSF)的玻璃微穿刺针记录。这种刺激在对照动物或假手术动物上产生持续60min以上的长时程增强(LTP)响应。通过从初始负偏转原点的10-30％之间测量的斜率来计算fEPSP的斜率。示出的每个时间点是至少6个20s间隔的测量值的平均值。
大鼠的径向臂水迷宫测试
径向臂水迷宫(RAWM)由六个50cm的径向臂组成，该径向臂从直径为160cm的中央区辐射伸出，其构成的水槽内容置20.5℃的水，4个壁面环绕，每个径向臂具有独特的模式。逃生平台位于其中一个径向臂的末端并且淹没在黑色不透明的水(non-toxic Dust FreeBlack Powder Paint，Rich Art)下。在开颅前一天和FPI后三天，对大鼠进行引导，每只大鼠2min。第1天和FPI后的第4天的试验包括：将动物放置于其中一个臂内，给动物最多60s以找到目标臂中的平台。如果动物没有在60s内找到逃逸平台，将大鼠引导到目标臂并使它在平台上停留15s。进行15次训练，训练之间的间隔为5min。每次训练的开始臂以伪随机的方式确定，其为5个非目标臂中的3个随机序列。开始臂和目标臂对于每只大鼠是不同的，但相对目标臂的位置是不确定的，以避免位置和方向性偏倚。第2天(进行15次训练的接下来的一天)进行测试。前5次训练的平台设置在第一天中的目标臂中，然后在第6-15次训练中将平台移动至新的臂。每次训练的开始臂以伪随机的方式确定，借此，直到动物跑完所有其他的臂后(训练10)，动物才从第1天的目标臂中开始。每只动物的30次训练的每次的视频通过使用TopScan(Cleversys Inc.)跟踪软件分析其错误次数和坚持性持续时间。错误是指进入非目标臂或进入目标臂但没有达到平台。
FLAP抑制剂MK-591的鼻腔给药
为了进行鼻腔给药和随后的组织收集，利用3.5％异氟烷对大鼠进行麻醉，并将其放在加热垫上呈仰卧位置。配以脂质载体的60μg的喹啉-吲哚FLAP抑制剂MK-591通过F20移液枪给药。具体而言，枪头上形成4μl的液滴，每2min将该液滴滴入交替的鼻孔中，直到总共8个4μl的液滴给药完成。在开始鼻腔给药后的30min，从心脏收集血液，以15ml/min的速度用60ml冰冷的0.9％NaCl和360ml的4％多聚甲醛经心灌注大鼠。脑组织在冰上分割成解剖区域、称重、液氮速冻、-70℃保存直到分析。组织和血浆中的MK-591的水平通过串联质谱法进行测定。
小鼠组化和免疫组化
小鼠、假致伤小鼠和CHI治疗小鼠通过上述的脑组织固定的通用过程以制备包埋石蜡的大脑。对于H&E的组化染色和髓过氧化物酶(MPO)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和离子钙接头蛋白抗原1(Iba-1)的免疫组化染色，切片厚度为6μm。使用Aperio ImageScope软件扫描、上传和查看染色切片。使用Aperio软件和它的Positive Pixel Count Algorithm ofImage Scope(将强阳性像素的分数与指定图像区域的总染色像素相比)进行染色量化。
统计分析
除非另有说明，所有显示的数据为平均值+/-平均值的标准差。结果通过SPSS20(IBM)或者Prism5.0(GraphPad)进行分析。除非另有说明，所有的分析通过：两组数据使用双尾非配对T检验，两组或更多组数据使用单因素ANOVA后利用Tukey的HSD进行多重比较。LTP I-O曲线通过双因素重复测定ANOVA进行分析。RAWM的第一天的学习曲线折叠成三次游泳的组，通过双因素重复测定ANOVA后对每个折叠时间点进行单因素ANOVA。反转任务的第一次训练和第三次训练之间的RAWM坚持性表示为初始值的百分比(第一次游泳＝100％；第三次游泳＝第三次游泳/第一次游泳×100)，其通过受试者内的双因素重复测定ANOVA后利用两次训练之间的双尾配对T检验进行分析。Alpha被设定为p<0.05以确定所有试验的显著性。
大鼠FPI模型的实验结果
图2A(左图)示出，在TBI后6h利用苏木精和伊红(H&E)对FPI模型的大鼠的同侧左脑半球和对侧右脑半球的皮质的染色。该TBI后6h的H&E染色表明，在同侧脑半球具有大量的细胞损伤的迹象，而在对侧脑半球显示为更为完整的细胞和少得多的损伤。图2B(右图)证明，嗜中性粒细胞有助于在TBI后的大脑中产生损伤引起的白三烯，其通过长春花碱的效果进行佐证。在大鼠模型中，相比于在对侧脑半球的水平，同侧脑半球在TBI后的LTC4的水平显著地升高。参见标记为-长春花碱的柱。如果在TBI实验前通过0.5mg/kg长春花碱IV治疗耗尽大鼠的嗜中性粒细胞，同侧脑半球中的白三烯的产量显著降低。通过长春花碱减少的白三烯仅见于血脑屏障被削弱的同侧脑半球。数据代表每组4-5只动物。结果是平均值+/-SEM。**P<0.01。
图3A示出通过RP LC-MS/MS测定的假致伤动物1h后和FPI损伤动物1h后的同侧脑半球和对侧脑半球内的LTC4的水平。结果表明，假致伤动物具有很少的LTC4，而且右脑半球和左脑半球之间没有差异。FPI致伤动物的相应结果则显示：同侧脑半球和对侧脑半球内的LTC4的水平均显著提高。在同侧脑半球内的增加量比在对侧脑半球内的增加量高得多。
图3B示出空白动物、假致伤动物和TBI后头部损伤动物的左脑半球和右脑半球内的合成LTC4的进程。反相液相色谱耦合串联质谱(RP LC-MS/MS)被用来测定白三烯。空白的未受伤的大脑中未检测出LTC4和LTD4。假致伤动物的LTC4水平与未受伤的动物的LTC4水平并没有显著区别。在通过FPI进行TBI实验后，白三烯迅速产生。同侧的左脑半球内的LTC4水平(14.35+/-2.31pg/mg蛋白)是对侧的右脑半球内的LTC4水平(3.62+/-2.73pg/mg蛋白)的4倍高。类似的结果同样适用于LTD4(未示出)，其与LTC4通过神经元组织代谢形成LTD4保持一致。数据代表每组4-5只动物。结果是平均值+/-SEM。假致伤动物的同源脑半球的显著性差异(***P<0.001；**P<0.01；*P<0.05)。对侧脑半球的显著性差异(###P<0.001)。
图3B的结果表明，损伤引起的白三烯的产生是非常迅速的，在TBI后1-3h达到峰值，并在24h下降到无法检测的水平。为了确定MK-886在损伤前和损伤后的给药对阻滞白三烯的形成上的功效，在TBI前30min或TBI后15min，利用单剂量为0.9％无菌盐水和10％DMSO中的6mg/kg的MK-886或相同体积的赋形剂进行注射。在损伤后的时间点，动物被处死，提取脂质并通过RP LC-MS/MS分析测定脑区域中的LTC4水平。单剂量为6mg/kg的MK-886在TBI前30min通过尾静脉注射对动物IV给药，结果显示，在TBI后1h显著降低白三烯的产生。利用MK-886治疗的损伤动物的同侧左脑半球内的LTC4水平比利用赋形剂治疗的损伤动物的LTC4水平低85％。利用赋形剂治疗的动物的水平为20.00+/-2.71pg/mg蛋白，而利用MK-886治疗的动物的水平为3.39+/-0.42pg/mg蛋白。利用MK-886治疗的损伤动物的对侧右脑半球内的LTC4水平比利用赋形剂治疗的损伤动物的LTC4水平低64％。利用赋形剂治疗的动物的水平为7.19+/-0.63pg/mg蛋白，而利用MK-886治疗的动物的水平为2.6+/-0.8pg/mg蛋白。图4示出FLAP抑制剂MK-886在TBI前30min的给药显著地降低了两个脑半球内产生的白三烯LTC4。单剂量为6mg/kg的FLAP抑制剂MK-886在FPI前30min通过尾静脉注射对动物IV给药，结果显示，在损伤后1h测定的白三烯的产生显著降低。每组使用4-5只动物。结果是平均值+/-SEM。(***P<0.001；**P<0.01)。
在另一实验中，单剂量的MK-886在TBI后15min注入大鼠。利用赋形剂治疗的动物的同侧脑半球内的平均LTC4水平(23.41+/-1.98pg/mg蛋白)显著高于(P<0.001，T检验)对侧脑半球内的LTC4水平(7.92+/-1.02pg/mg蛋白)。MK-886在TBI后15min的给药将同侧脑半球和对侧脑半球内的LTC4水平均降至检测阈值以下。图5示出FLAP抑制剂MK-886在TBI后15min的给药将损伤引起的白三烯LTC4的合成阻滞至低于检测水平。图5示出在损伤后15min注射赋形剂(-)或者MK-886(+)的大鼠的同侧脑半球和对侧脑半球内的白三烯LTC4水平的定量分析。结果显示，MK-886在TBI后15min的给药完全阻滞了预期中的由TBI带来的LTC4水平的上升。在经过MK-886治疗后，LTC4就检测不到了。数值是平均值-/+SEM，n＝4，n.d.＝检测不到。*p<0.05，与同侧脑半球不同，T检验。
为了调查损伤的同侧皮质和海马内产生的LTC4的相对量，这些脑区在RP LC-MS/MS分析之前从损伤的大鼠解剖下来。利用赋形剂治疗的动物的同侧皮质内的LTC4为9.67+/-1.18pg/mg蛋白，而海马内的LTC4为6.05+/-3.70pg/mg蛋白。与全脑半球的结果类似，利用MK-886治疗的动物的同侧皮质和海马内检测不到LTC4。这些结果连同图4的结果证明，在进行TBI实验前30min或者TBI实验后15min给药，该FLAP抑制剂MK-886有效地阻滞了白三烯的生物合成。
图6示出FLAP抑制剂MK-886的给药降低了TBI后72h测定的细胞死亡的体积。单剂量为6mg/kg的FLAP抑制剂MK-886在TBI前30min通过尾静脉注射对大鼠IV给药。在72h后进行测定，预治疗的动物的由TBI引起的细胞死亡显著减少。结果表示为±平均值±SEM。利用赋形剂治疗的动物的显著性差异(*P<0.05)。
在另一实验中，T2-加权MRI被用来研究大鼠在TBI后72h的白三烯对TBI相关的脑水肿的功效。在TBI前30min、TBI后15min或TBI后60min，利用MK-886注射大鼠。假致伤动物和注射赋形剂的动物的其他组作为对照。假致伤动物的同侧左脑半球和对侧右脑半球未见T2-加权高信号，且其高度和宽度对称。相反地，与对侧脑半球相比，TBI损伤动物的大脑的同侧脑半球始终表现出T2-加权高信号和单侧的肿胀。
相对于对侧脑半球的同侧脑半球的水肿被量化。与正常的大脑肿胀(0.00+/-0.03％)相比，假致伤动物的脑半球之间没有区别。相反地，与假致伤动物相比，通过赋形剂治疗的损伤动物具有显著多的脑肿胀，赋形剂＝8.68+/-0.09％，p<0.001，单因素ANOVA后Tukey的HSD。与通过赋形剂治疗的动物相比，MK-886在损伤前30min或损伤后15min给药的动物具有显著少的肿胀。TBI前30min的数值为4.12+/-0.08％，p＝0.004；TBI后15min的数值为4.26+/-0.05％，p＝0.028。与通过赋形剂治疗的动物相比，TBI后60min利用MK-886注射的动物没有显著区别，TBI后60min的数值为8.98+/-1.0％，p＝0.999。这些结果表明，在TBI之前或者TBI之后不久的对白三烯的产生的阻滞降低72h处的损伤相关的脑肿胀的量。
图7示出FLAP抑制剂MK-886在TBI前30min或TBI后15min对大鼠的给药减轻水肿。上图是TBI事件后72h获得的典型的T2加权的MRI图像。无TBI的假致伤的大脑的同侧左脑半球和对侧右脑半球并不显示出T2像素高信号，且在形状和大小上对称。通过TBI致伤的动物的大脑主要在同侧皮质中显示出标志着水含量和单侧肿胀的T2像素高信号。通过使用Fiji(NIH)从各动物获得的5个连续的T2-MRI切片计算的平均归一化脑肿胀的MRI定量分析。数值是平均值+/-SEM，假致伤(n＝4)。赋性剂(n＝8)，MK-886在损伤前30min给药(n＝10)，MK-886在损伤后15min给药(n＝5)。柱＝5mm。结果表明，与不利用MK-886治疗的TBI组相比，MK-886在TBI前30min或者后15min的给药显著地降低脑肿胀。*p<0.05，与赋性剂TBI组不同，与假致伤没有显著不同，单因素ANOVA后Tukey的HSD。
在大鼠TBI后72h，用Gd-增强的T1-加权MRI来评估白三烯对TBI相关的BBB破坏的作用。给大鼠静脉注射反向增强剂Gd(沉积在BBB破坏的脑区并便于T1-加权MRI扫描)。通过后-Gd图像中的像素高信号的升高来检测Gd外渗，该外渗在TBI损伤动物的同侧软脑膜区域(表面)被专门检测。Gd在该区域存在的最大可能是由于大脑的这个高度血管化的区域中的血管被机械剪切。每只动物中的Gd外渗的总体积(后-Gd像素高信号)被量化。TBI导致Gd外渗加剧，而且，MK-886在损伤前30min(p＝0.419)、损伤后15min(p＝0.970)或者损伤后60min(p＝0.994)(单因素ANOVA，后Tukey的HSD)的给药对其没有影响。虽然MK-886对Gd外渗没有明显的影响，但是白三烯对BBB渗透性的调节可能被大脑表面的血管的机械性损伤而屏蔽。
本发明利用伊文思蓝(EB)的荧光来评估大鼠FPI模型中的BBB渗透性。EB(<lkDa)是对血清白蛋白具有很强亲和力(67kDa)的偶氮染料。所得的EB-白蛋白复合物在BBB破坏后进入主质。荧光显微镜被用来对脑切片(来自于损伤后5h)进行成像，利用EB的内在荧光特性(在620nm激发，在680nm发射)。这种方法比常用的脑匀浆中EB的比色读数(Uyama O，J.Cerebr.Blood F.Met.，8，282-284页，1988年)的灵敏度更高，并且可以用于定位BBB渗透性。由于EB-白蛋白复合物分布在渗透点附近的细胞中，这种方法可以进行BBB破坏的微检测。与此相一致地，最亮的EB信号利用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)荧光协同定位，说明细胞被染色。围绕着EB-阳性细胞簇可以观察到微弱的细胞外荧光。不意外的是，EB阳性细胞的最大密度位于邻近损伤部位的同侧皮层和同侧海马中，还有一些细胞零星地位于丘脑和黑质体中。在相应的对侧脑区中没有检测到EB。由于海马相对于主损伤部位位置较远且介导记忆和学习过程，发明人对海马内的EB阳性细胞进行计数来衡量主质的BBB破坏。MK-886在TBI后15min的给药显著地减少CA1区域的EB-阳性细胞的数目。利用赋形剂治疗TBI的值是148.75+/-45.65，而利用MK-886治疗TBI的值是69.25+/-36.82，p＝0.035，T检验。这些结果表明，在易受损伤的选择的脑区内，白三烯可以介导BBB渗透性，FLAP抑制剂阻滞白三烯介导的BBB破坏。
图8示出在大鼠FPI模型中，FLAP抑制剂MK-886在TBI后30min的给药降低了海马CA1区的BBB渗透性。图8A是在TBI后5h，进入海马细胞层的EB(红色)和进入同侧海马的DAPI(蓝色)的典型的荧光图像。图8B是在TBI后15min，接受赋形剂或者MK-886的动物的同侧CA1海马细胞层的EB外渗的图像的放大图。图8C是在海马区的EB阳性细胞(EB+细胞)的量的EB-DAPI荧光共定位分析，柱＝200μm。数值是平均值+/-SEM；n＝4。*p<0.05，T检验。FLAP抑制剂在损伤前30min的给药得到相似的结果，数据没有示出。
为了检查TBI后的海马的功能完整性，长时程增强(LTP)的电生理测量被记录在TBI(通过FPI模型)后4天的大鼠海马切片中。LTP被用来衡量突触可塑性，且被认为能代表学习和记忆的分子机制。通过刺激CA3-CA1的Schaffer侧枝通路并记录CA1树突场层，诱发突触的场兴奋性突触后电位(fEPSP)响应。假致伤动物和TBI损伤动物之间的fEPSP的输入-输出曲线没有差异(F(4381)＝0.5329，p＝0.992，双因素重复测定ANOVA)，而且假致伤动物和TBI损伤动物之间的成对脉冲比测量也没有差异(T(22)＝1.883，p＝0.073，T检验)，表明这些组的基础突触传递的水平相似。这与发明人以前的研究结果一致：在TBI一周内，通过H&E染色没有实质性的海马细胞损失，且海马神经丝蛋白水平没有变化。响应于高频刺激(253.51+/-69.48％，58-60min，持续3个记录时间点)，假致伤动物的海马切片显示出强劲的LTP。相反地，未注射的TBI损伤动物的海马切片并不表达LTP(135.06％+/-42.62％，与假致伤动物不同，p＝0.007，所有组的单因素ANOVA后Tukey的HSD)。类似于未注射的TBI损伤动物，注入赋形剂的TBI损伤动物的海马切片也未能在高频刺激后表现出LTP。然而，在TBI前30min或TBI后30min接受MK-886注射的动物表现出正常的LTP。两者均显著不同于注射赋形剂的动物。TBI赋形剂的数值为130.86％+/-55.63％；MK-886在损伤前30min给药的TBI的数值为242.75+/-76.94％，p＝0.032；MK-886在损伤后30min给药的TBI的数值为256.13+/-85.27％，p＝0.007，单因素ANOVA后Tukey的HSD。但是，如果MK-886在损伤后60min给送，药物不能防止在赋形剂治疗的动物中观察到的LTP不足，数值为145.46+/-18.30，p＝0.994。这些结果表明，阻滞白三烯的早期产生减弱了损伤后的动物在海马突触可塑性中的损伤引起缺陷，并建议在啮齿类动物损伤后的1h的时间窗口内利用MK-886进行治疗，对于人来说，该时间窗口很可能是2-3h。
图9示出在大鼠FPI模型中，FLAP抑制剂MK-886在TBI后30min的给药减弱TBI后的海马的长时程增强(LTP)的不足。通过来自于假致伤大鼠(空心三角形，n＝8)、在FPI后30min注射赋形剂(实心圆，n＝7)或MK-886(红色正方形，n＝7)的FPI损伤大鼠的海马切片来检测LTP。各组的平均LTP响应(平均值+/-SEM对照斜率)在引起LTP后58-60min进行测定。*p<0.05，**P<0.01，与FPI赋形剂不同，与假致伤没有显著区别，单因素ANOVA后Tukey的HSD。
为了验证TBI引起的LTP不足在海马依赖型空间学习和记忆上的障碍的反映，利用药物或赋形剂治疗的假致伤大鼠和TBI损伤大鼠在TBI后4-5天进行径向臂水迷宫(RAWM)测试。与Morris水迷宫相比，RAWM在评估啮齿类动物的认知障碍上具有优势，因为进入没有逃生平台的臂的数目可被用于评估学习，而不是找到平台的等待时间，从而消除由实验组之间的游泳速度差异引起的误差。在损伤后30min，利用赋形剂或MK-886注射假致伤动物和TBI治疗动物。在行为试验的第一天，动物完成15次游泳训练，在训练中，它们利用视觉线索探索迷宫以找到其中一个臂中的隐藏的逃生平台，这个臂被称为目标臂。在初始任务学习中的赋形剂动物和MK-886治疗动物(在假致伤组内或在TBI组内)之间并没有显著差异(F(3155)＝2.437，p＝0.083，双因素重复测定ANOVA)，而且在任意3次游泳群组的组之间也没有显著差异(每次游泳群组单因素ANOVA)。在行为试验的第二天，动物在迷宫内完成5次游泳训练，目标臂的位置与前一天相同。然后，逃生平台在后10次训练中被转移到新的位置(反向任务)，以评估动物学习和记忆新目标臂位置的能力。在反向任务的前3次训练中，前目标臂的坚持性通过在原来具有平台的臂内所花费的总游泳时间的百分比来计算。在第1次游泳时，任何组之间的坚持性均没有显著差异(F(331)＝0.713，p＝0.522，单因素ANOVA)。两个假致伤组均很快地在第1次游泳和第3次游泳之间认识到：平台已经不再位于前目标臂内。同样地，利用MK-886治疗的TBI大鼠通过第3次游泳在前目标臂中花费更少的时间(整体联动，损伤(假致伤/FPI)×药物(MK-886/赋形剂)×训练(第1次游泳-第3次游泳)，F(162)＝5.564，p＝0.025，在受试者内双因素重复测定ANOVA后T检验，假赋形剂，p＝0.001；假MK-886，p＝0.006；FPI MK-886，p＝0.035)。但是，注射赋形剂的TBI动物未能认识到：平台位置在第1次游泳和第3次游泳之间已经变化(P＝0.758)。反向任务的最后5次游泳训练(第6次游泳-第11次游泳)被用于评估继续学习。与给予药物或赋形剂的假致伤动物相比，赋形剂治疗的TBI大鼠继续在每次游泳中犯显著较多的错误(TBI赋形剂＝2.33+/-1.21；假致伤赋形剂＝0.755+/-0.705，p＝0.003；假致伤MK-886＝0.850+/-0.583，p＝0.005；单因素ANOVA后Tukey的HSD)。给予MK-886的TBI动物与任一个假致伤组并没有不同，但是与TBI-赋形剂动物显著不同(1.26+/-0.700，p＝0.044)。这些数据表明，MK-886减弱TBI损伤引起的空间学习和记忆的缺陷。
图10示出在大鼠FPI模型中，FLAP抑制剂MK-886在TBI后30min的给药减轻在径向臂水迷宫的学习和记忆中的TBI-引起的障碍。在第2天的反向任务的坚持性测试中，第3次游泳的坚持性(在前目标臂内的持续时间)变化表示为在第1次游泳中的坚持性的百分比。*p<0.05，**p<0.01，双因素重复测定ANOVA后T检验。第2天反向任务的成绩表现为在反向任务的第11次-第15次游泳中所犯的错误数(平均值+/-SEM)。*p≤0.05，**p<0.01，与FPI赋形剂不同，与任一假致伤组不具有区别，单因素ANOVA后Tukey的HSD。
在图11所示的结果表明，在大鼠FPI模型中，FLAP抑制剂MK-886减轻TBI后的运动障碍。与赋形剂治疗的动物相比，在TBI后15min MK-886给药的动物在转棒上具有改进的平衡运动性能。在转棒测试中，棒的旋转被设定为在300s的进程中从0加速到50rpm。损伤后的每次所选时间点进行4次训练，每只动物的各次训练和平均时间被记录下来。PT是损伤前的培训。数值是平均值-/+SEM。n＝6-9。结果表明，与那些利用赋形剂治疗的动物相比，MK-886治疗的动物在第1周和第2周内具有更好的响应。最终，所有组的表现趋于相同。
图12是基于上述相对于FPI模型所讨论的结果，根据本发明的白三烯和TBI之间的关系的概要和示意图。不拘泥于理论，根据本发明目前呈现的证据，TBI后的事件按照以下顺序产生。创伤时的原发性脑损伤导致ATP从受损细胞漏出进入细胞外空间、脑主质出血和轴膜渗透性的局限性改变。在释放后，ATP与小胶质细胞结合导致钙离子内流和胞浆型磷脂酶A2(cPLA2)的激活，它将AA从膜磷脂中释放出来。AA被转化为5-HETE，然后由5-LO和FLAP转化为LTA4。LTA4然后通过LTA4水解酶被转化为LTB4，其是一种募集嗜中性粒细胞的有效的趋化介质，或者LTA4被运出小胶质细胞并进入相邻的星形胶质细胞和可能的神经元，并且通过LTC4酶的作用转化为半胱氨酰白三烯(LTC4、LTD4和LTE4)。早期产生的白三烯的副作用包括白细胞浸润、BBB破坏和水肿。水肿看来介入水通道蛋白水通道。如果未加抑制，这些有害的事件进一步导致轴突损伤、细胞死亡、运动缺陷和认知障碍。
图13示出在人全血中的MK-886(实心三角形虚线)与MK-591(实心圆形实线)的体外效力的比较。结果是这两种FLAP抑制剂对LTB4的产生和5-HETE的产生的影响。已知吲哚乙酸FLAP抑制剂(如MK-886、MK-591)显示出高的血浆蛋白结合性。因此，与抑制剂和FLAP结合的亲和力相比，这些FLAP抑制剂在体内阻滞白三烯的效力高100倍。发明人开发了一种生物测定方法，它使用人全血精确地预测FLAP抑制剂的体内效力。简言之，在FLAP抑制剂的浓度未升高或升高的情况下，将全血与钙离子载体(如A2387或酵母聚糖)一起孵育。在37℃下孵育30min后，将样品离心，并将血浆上清液利用反相液相色谱耦合串联质谱来定量LTB4、5-HETE和AA的生成。药物的IC50通过非线性回归分析(GraphPadPrism)进行测定。结果表明，FLAP抑制剂MK-886和MK-591在蛋白质的存在下具有预期的和报告的IC50。正如预期的那样，FLAP抑制剂并不影响AA生成，数据未示出。当FLAP抑制剂是水溶性差的药物时，发明人已经表明，这种疏水性的药物可配制在载体中，该载体包含一种或多种植物油(如橄榄油)和公认为安全(GRAS)列表中找到的磷脂酰丝氨酸，这些药物然后可以快速地传递并靶向至大脑和上部脊髓。Hanson LR等，Drug Delivery，19(3)，149-54页，2012年。
如上所述的数据是利用FLAP抑制剂IV或IP注射大鼠产生的。图14是示出FLAP抑制剂的鼻内递送的方法的示意图。鼻内药物递送绕过血脑屏障，直接从鼻粘膜递送药物至大脑和上部脊髓，其沿着三叉和嗅觉神经通路通过胞外机制传递，从而增加大脑的生物利用度。鼻腔给药限制药物进入体循环的量，从而降低药物试剂的非期望的对身体的副作用(例如肝脏和心脏毒性)。通过这条途径，药物的输送是非常迅速的(10min内到达大脑)，干预TBI的关键因素正如上面所述的数据，而且鼻腔给药的方法十分快速和简单，使得它非常适合于各种环境。
与MK-886相比，FLAP抑制剂MK-591更有效且具有更长的t1/2。MK-591在脂质载体溶液中的配制如上所述。图15示出在鼻腔给药(MK-591)30min后的FLAP抑制剂MK-591在大鼠的几个脑区中的水平与在血浆中的水平。大鼠用3.5％的异氟烷短暂麻醉，MK-591(60μg/32μl脂质载体)的鼻腔给药包括：8个4μl的等分试样被交替滴入每只鼻孔之间的鼻粘膜。通过药物浓度达到200nM的目标来确定药物的量，该浓度相当于与FLAP结合的Kd值的100倍。在单剂药给药30min后，使用肝素针从麻醉动物收集血液，通过离心从血液中分离血浆。然后，在依然麻醉的状态下用生理盐水灌注动物，以从脑血管的血液中除去药物。在灌注后处死动物，并迅速地取出脑区。血浆和脑组织样品均在液氮中冷冻，随后储存在-80℃下。外周血浆和主质脑组织中的药物水平通过确证的串联质谱平台进行评估。数值表示为MK-591的ng数/mg组织。MK-591的最高水平出现在嗅球中，接下来是海马和皮质。MK-591在皮质中的浓度为200nM(目标浓度)。与到达大脑的药物量相比，药物在血浆中的水平较低。这些结果表明，FLAP抑制剂MK-591的鼻内递送是可能的，而且在各种脑区迅速实现生理水平。
图16示出FLAP抑制剂MK-591在腹腔给药30min后的的大鼠的大脑半球和血浆水平。利用MK-591(20％的DMSO/生理盐水溶液中10mg/kg)腹腔注射大鼠。在单剂药给药30min后，使用肝素针从麻醉动物收集血液，通过离心从血液中分离血浆。然后，在依然麻醉的状态下用生理盐水灌注动物，以从脑血管的血液中除去药物。在灌注后处死动物，并迅速地取出脑半球。血浆和脑组织样品均在液氮中冷冻，随后储存在-80℃下。外周血浆和大脑中的药物水平通过确证的串联的RP-LC/MS/MS平台进行评估。与鼻内方法不同的是，大多数药物存在于血浆中，脑组织中的药物水平低得多。利用1ml＝1mg进行换算。血液的总体积为2ml(或2mg)。大脑半球(减去小脑)的总重量为0.150mg。数值利用MK-591的ng数/mg组织表示。这些结果表明，与IP给药相比，鼻内递送在将FLAP抑制剂传递至TBI影响区域的方面具有最大效果。
图17A和图17B的结果表明，白三烯LTC4和LTD4在体外以剂量依赖的方式引起神经细胞凋亡、细胞程序性死亡。来自于新生大鼠的原代培养神经元在LTC4或LTD4的浓度递增的情况下温育16h。通过对表现出核缩合的DAPI-染色神经元的计数来确定凋亡神经元的数量，并表示为总神经元的百分比。通过活性胱天蛋白酶9(箭头)的抗体对神经元的染色来确定神经元由于内在细胞凋亡而死亡。结果表明，白三烯引起神经元的内在细胞凋亡。这些数据与最近报道的“白三烯(除了它们的抗炎作用)通过调节分泌酶活性而刺激β-淀粉样蛋白的产生”相一致。已知β-淀粉样蛋白通过引起凋亡而杀死神经元。结合上述数据的这些结果表明，白三烯在大脑中同时具有促炎症和直接神经毒性的作用。
小鼠CHI模型的实验结果
在第二个物种(小鼠)中，测试另一TBI模型以确认并扩展上面报告的结果。在小鼠闭合性颅脑损伤(CHI)的模型中，电磁控制的活塞被用来使受试者动物接收轻度TBI，所使用的具体过程如上面的实验规程部分中所述。在第一组试验中利用三个损伤严重程度的措施来确定CHI的效果。这三个措施是呼吸暂停、翻正时间和掉落等待时间。呼吸暂停和翻正反射措施在CHI过程后立即进行。呼吸暂停的措施是指受试者在CHI后开始自主呼吸的时间，而翻正时间是指受试者从侧躺到四肢站立的重新翻正反射所花的时间。呼吸暂停和翻正反射的组合相当于人在TBI后的意识丧失。掉落等待时间措施在CHI后1h进行，并测量受试者在摔倒前可以抓住金属丝网和悬吊在金属丝网上的时间长短。结果如图18A-图18C所示。在图18A中示出呼吸暂停措施，正如预期的那样，假致伤小鼠没有出现呼吸暂停，而CHI小鼠的平均呼吸暂停时间超过100s。同样地，假致伤小鼠的翻正反射非常短，而CHI小鼠的平均时间超过500s，增加了7倍。至于掉落等待时间，CHI小鼠的掉落等待时间显著变短，表明它们的抓握能力已经下降。假手术小鼠可以悬挂的时间比CHI小鼠长7倍。结果表明，经过CHI规程的小鼠表现出轻度TBI(mTBI)事件的所有表征，并且验证了规程。数目和显著性程度如下：呼吸暂停措施****p<0.0001，假手术n＝29，CHI n＝66；翻正反射****p<0.0001，假手术n＝29，CHI n＝66；掉落等待时间**p<0.0056，假手术n＝29，CHI n＝66。
使用CHI模型，一些小鼠进行假手术或CHI致伤，然后在致伤后的时间间隔对小鼠进行麻醉，并使用22gauge针头通过心脏穿刺收集血液样品。将样品放置在肝素微量离心管。通过以7000rpm进行15min的离心从全血中制备血浆，并在-80℃存储，直至使用市售Elisa试剂盒进行分析。随在血浆中的两种生物标志物是胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和泛素羧基末端水解酶L-1(UCHL-1)。这两种生物标志物与人mTBI事件相关联，GFAP指示着星形胶质细胞的死亡，而UCHL-1与神经元细胞死亡相关联。GFAP的结果示于图19A，正如预期的那样，假手术小鼠的水平保持稳定。CHI小鼠在损伤后1h显示出峰值GFAP水平，且该水平在损伤后12h内恢复到基础水平。CHI小鼠还表现出UCHL-1水平的升高，该水平在损伤后2h达到最大，通过损伤后2h回到基础水平。这些措施进一步确认，CHI模型在受试小鼠上产生期望的mTBI。每个时间点假手术n＝3-5只小鼠，每个时间点CHI n＝4-9。在1h的GFAP的显著性是**p＝0.0014。在0.5h的UCHL-1的显著性是*p＝0.0193，并且在1h是*p＝0.0223。
为了评价CHI规程导致的水肿，小鼠或者进行假手术或者进行CHI致伤，然后在7dpi或30dpi将小鼠进行T2加权MRI。无论是假手术小鼠还是CHI小鼠，所有的小鼠均没有在CHI后的任何时间表现出任何T2加权像素高信号，这表明没有发生水肿，进一步验证这是一个合适的mTBI模型。在人mTBI的大多数病例中，没有阳性MRI是非常常见的。图20示出假手术小鼠和CHI小鼠在7dpi和30dpi的典型MRI图像，基准尺为2mm。
为了检查CHI带来的神经炎症，小鼠接受CHI规程，然后各个脑区利用H&E、髓过氧化物酶(MPO，嗜中性粒细胞的标志物)、GFAP(反应性星形胶质细胞的标志物)和Iba-1(激活的小胶质细胞的标志物)进行染色。
图21示出在7dpi利用H&E染色或者在30dpi利用MPO染色假手术小鼠和CHI小鼠的典型例子的结果。在检查的所有时间点，没有任何证据显示出病变，也没有证据表明在该区域的嗜中性粒细胞浸润。通过H&E染色显示没有发生挫伤或细胞损失，通过MPO染色评估没有发生显著血脑屏障破坏。在CHI后没有在小鼠身上发生明显损害，这些都是人mTBI研究中常见的。与FPI模型相反，这个模型中的浸润免疫细胞并没有观察到明显损伤。通过CT或传统MRI扫描人的mTBI的研究中，其一般没有病理，如挫伤或者出血。这些结果与“CHI是人的mTBI的良好模型”相一致。
在CHI小鼠的大脑中并没有宏观变化，与此相反，微观水平上具有标志着神经炎症的大规模改变。图22A和图22B示出在7dpi和30dpi利用H&E、GFAP、Iba-1对假手术小鼠和CHI小鼠的冠状脑切片染色的典型图像。图22C示出关注的区域，包括：大脑皮质层(CTX)、外囊(EC)、海马CA区和齿状回(DG)。CHI后显示出GFAP和Iba-1的最高反应活性的区域是CTX、EC和DG。如图22A和图22B所示，相比于假手术小鼠，在7dpi和30dpi均在CHI小鼠中具有显著的GFAP染色。正如预期的那样，染色的最大量出现在CHI的同侧脑半球。CTX、EC和DG区域是行使典型的大脑功能、学习和记忆的关键。EC是含有皮层间(corticocortical)关联纤维(负责连接大脑的一个皮质到其它皮质)的大白质束，它是用于从基底前脑到大脑皮质的胆碱能纤维的路径。大脑的这个区域还示出了人mTBI后的弥散张量成像的结构改变。DG是介导神经发生的子区域，其是学习和记忆的关键。齿状回的颗粒下区的神经祖细胞通过成年产生新的神经元。使用放射性碳测年技术的对人的最近的研究表明，神经发生的水平非常巨大，在成年后每天增加约1400新颗粒神经元。这些新生颗粒神经元在记忆模式分离中发挥重要作用，而且，神经障碍被认为通过削弱记忆的规律化而导致焦虑症。这种障碍隐藏在焦虑症中可见的病态恐惧反应中，如创伤后应激障碍和恐慌症。因此，如在本发明中所示的齿状回中的神经炎症可能在TBI和PTSD之间建立机械连结。
图23A示出在7dpi和30dpi利用GFAP对假手术小鼠和CHI小鼠的皮质的典型染色，下方示出典型的样品，对多只小鼠的结果进行定量分析。典型的切片示出CHI小鼠中的GFAP的明显增加，该增加持续了至少30dpi。定量结果显示，在7dpi和30dpi测定的GFAP阳性显著升高。数目和显著性为：7dpi假手术n＝7，CHI n＝8，*p＝0.0188；30dpi假手术n＝7，CHI n＝11，**p＝0.0021。图23B示出在7dpi和30dpi利用Iba-1对假手术小鼠和CHI小鼠的皮质的典型染色，下方示出典型的样品，对多只小鼠的结果进行定量分析。典型的切片示出CHI小鼠中的Iba-1的明显增加，其在7dpi的时候非常高，在30dpi依然升高。定量结果显示，在7dpi，CHI小鼠具有显著升高的Iba-1反应性。在30dpi依然升高，但在本研究中，该升高并不显著。数目和显著性为：7dpi假手术n＝6，CHI n＝7，*p＝0.0233；30dpi假手术n＝7，CHI n＝9。
图24A示出在7dpi和30dpi利用GFAP对假手术小鼠和CHI小鼠的外囊的典型染色，下方示出典型的样品，对多只小鼠的结果进行定量分析。典型的切片示出CHI小鼠中的GFAP的明显增加，该增加持续了至少30dpi。定量结果显示，在7dpi和30dpi测定的GFAP阳性显著升高。数目和显著性为：7dpi假手术n＝7，CHI n＝8，**p＝0.0019；30dpi假手术n＝7，CHI n＝11，**p＝0.0021。图24B示出在7dpi和30dpi利用Iba-1对假手术小鼠和CHI小鼠的外囊的典型染色，下方示出典型的样品，对多只小鼠的结果进行定量分析。典型的切片示出CHI小鼠中的Iba-1的明显增加，其在7dpi的时候非常高，在30dpi依然明显升高。定量结果显示，在7dpi，CHI小鼠具有显著升高的Iba-1反应性。在30dpi依然明显升高。数目和显著性为：7dpi假手术n＝6，CHI n＝7，*p＝0.0181；30dpi假手术n＝9，CHI n＝11，*p＝0.0268。
图25A示出在7dpi和30dpi利用GFAP对假手术小鼠和CHI小鼠的齿状回的典型染色，下方示出典型的样品，对多只小鼠的结果进行定量分析。典型的切片示出CHI小鼠中的GFAP的明显增加，其在30dpi消退。定量结果显示，在7dpi测定的GFAP阳性显著升高，而在30dpi回到假手术水平。数目和显著性为：7dpi假手术n＝7，CHI n＝7，***p＝0.0003；30dpi假手术n＝7，CHI n＝10。图25B示出在7dpi和30dpi利用Iba-1对假手术小鼠和CHI小鼠的齿状回的典型染色，下方示出典型的样品，对多只小鼠的结果进行定量分析。典型的切片在7dpi示出CHI小鼠中的Iba-1的明显增加，而在30dpi消退。定量结果显示，在7dpi，CHI小鼠具有显著升高的Iba-1反应性。数据还显示在30dpi，Iba水平回落到假手术小鼠水平。数目和显著性为：7dpi假手术n＝6，CHI n＝7，**p＝0.0054；30dpi假手术n＝7，CHI n＝9。至少在反应性星形胶质细胞和激活的小胶质细胞的水平方面，齿状回是唯一的在损伤后30天示出炎症消退的区域。因为齿状回是经历神经发生的唯一区域，推测激活神经发生可能通过创建一个富含神经元营养因子的环境而具有大脑修复的功能。
为了检查神经炎症对认知功能的影响，当丰富的反应性星形胶质细胞和小胶质细胞出现的时候，在7dpi测定长时程增强(认为是隐藏的学习和记忆突触机制)，如图23-图25所示。结果如图26A和图26B所示，并且其产生与上述的大鼠FPI模型相似。与假手术小鼠的切片相比，CHI小鼠的海马切片在高频刺激(HFS)后显示出显著减少的高信号，如图26A和26B所示。长时程增强(LTP)的程度不足比我们在之前的TBI的大鼠FPI模型中观察到不足要少，与损伤的严重程度相一致，小鼠CHI模型中的损伤程度小的多。数目和显著性如下：假手术n＝7，CHI n＝12，****p<0.0001。
如上所述，在轻度FPI脑损伤后，FLAP抑制剂有效地阻滞水肿、BBB破坏、细胞损失和认知障碍。为了检测FLAP抑制剂是否能够在mTBI后阻滞慢性神经炎症，假手术小鼠和CHI小鼠通过IP注射5mg/5kg的赋形剂或MK-591，损伤后6天，每天给药1次。在7dpi，小鼠经心灌注后被处死，固定的大脑被除去，切片，并利用GFAP和Iba-1进行免疫组化染色。图27示出用赋形剂治疗(-)或用MK-591(+)治疗的3假手术和3CHI小鼠的大脑皮质区域的典型染色。在已被注射FLAP抑制剂MK-591的CHI小鼠中，GFAP和Iba-1的染色均显著减少。在假手术小鼠和CHI小鼠的大脑皮质、外囊和齿状回中的GFAP和Iba-1的染色的量被量化，结果如图28所示。在CHI接下来的6天，每天给药MK-591一次，显著阻滞在3个关注区域的GFAP和Iba-1染色的升高。这些数据表明，FLAP抑制剂不仅在TBI后不久阻滞白三烯介导的炎症，就像TBI的大鼠FPI模型中观察到的那样，而且它们在单一CHI后很多天的对神经炎症的阻滞依然有效。图28中的数值是在每个组内的平均值+/-SEM，数据被报告为上述的假手术组+/-MK-591的阳性的百分比。数目和显著性如下：-MK-591假手术n＝7，CHI n＝8；+MK-591假手术n＝10，CHI n＝10，显著性是*p<0.05和**p<0.01。
图29是本发明的CHI模型中所示出的mTBI后的持续的神经炎症中的白三烯的作用的示意图。脑损伤(例如弥漫性轴突损伤)导致从受损轴突中释放包括ATP的分子，该ATP能够结合小胶质细胞并导致钙离子内流。细胞内的钙离子的增加激活钙依赖性胞浆型磷脂酶A2(cPLA2)，其切割膜磷脂产生游离的花生四烯酸(AA)。酶5-LO和FLAP将AA转化为前体LTA4，LTA4被转化为LTB4，其是一种募集其他免疫细胞到损伤区域的有效的趋化介质。可替代地或附加地，LTA4被转化为半胱氨酰LTC4、LTD4和LTE4，已知它们在涉及嗜中性粒细胞浸润的更严重的损伤模型中刺激细胞因子和趋化因子的释放，增加血管渗透性。白三烯可以在损伤的炎症反应中非常迅速地上升，因为用于产生这些脂质介体的酶和底物已经存在于组织中，从而规避对转录或翻译事件的需要。如果持续不断地话，炎症反应本身导致进一步的脑损伤，其在正反馈机制中引起更多的炎症。本发明的支持这一理论的数据是，mTBI引起固有的神经炎性响应(涉及内源性脑细胞，不依赖于外围免疫细胞浸润)。FLAP抑制剂阻滞这一响应的能力可平移至许多涉及增强的神经炎症或可能涉及增强神经炎症的人脑疾病。
本发明涉及预防包括血脑屏障(BBB)破坏和水肿的脑损伤事件、导致额外的细胞死亡的早期不利事件、轴突损伤和神经障碍的不利影响。本发明还涉及减少据信隐藏在许多脑损伤事件中的长期的神经炎症。发明人已使用两种大脑损伤的动物模型，特别是大鼠的液压冲击损伤TBI模型和小鼠的闭合性颅脑损伤(CHI)mTBI模型；然而，据信，该结果对其他脑损伤事件，包括中风、多发性硬化、阿尔茨海默氏病和创伤后应激障碍(PTSD)具有指导意义。发明人发现，通过在脑损伤事件前或不久后的FLAP抑制剂的给药阻滞白三烯的产生，其显著阻滞水肿、BBB破坏、细胞死亡、认知和运动障碍和在脑损伤事件后发生的长期神经炎症。FLAP抑制剂的给药的最有效的途径被认为是经由鼻内递送的方法，虽然其它途径也可以使用，包括口服、静脉、腹腔和通过栓剂。FLAP抑制剂的给药显著地降低了一系列脑损伤后的细胞破坏事件的严重性。预防性地或在脑损伤后不久地使用该FLAP抑制剂有望显著改善全脑功能恢复，并防止许多与脑损伤事件相关的不良后果。发明人认为，本发明的结果可使FLAP抑制剂应用于许多脑损伤事件，包括TBI、中风、多发性硬化、阿尔茨海默氏病、创伤后应激障碍。本发明指出，在脑损伤事件之前预防性地使用FLAP抑制剂，和在脑损伤事件之后使用FLAP抑制剂均是有效的。任何FLAP抑制剂的有效剂量都将部分地由它的IC50和它的生物利用度来决定，因为血浆蛋白与许多FLAP抑制剂的结合能力可能降低它们的生物利用度。如上所述，正常大脑条件下，大脑中检测不到白三烯，也没有证据表明存在神经炎症。在许多脑损伤事件(如TBI)之后，大脑中的白三烯急剧上升，而且证据表明存在长期的持续的神经炎症。在中枢神经系统中使用FLAP抑制剂可改善这些脑损伤有关的事件，并防止本发明所述的由白三烯的上升和神经炎症而介导的进一步的CNS损伤。在脑损伤事件之前，和在脑损伤事件之后使用FLAP抑制剂均是有效的。事实表明，在脑损伤事件之前15min使用FLAP抑制剂，可以显著减少由脑损伤事件导致的损害。FLAP抑制剂的给药时间与脑损伤事件之间的较长的时间周期被认为是更有效的。类似地，可以在脑损伤事件后使用FLAP抑制剂，并且仍然提供对抗白三烯增加和神经炎症的保护。
前面已经根据有关法律标准描述了本发明，因此描述是示例性的，而在本质上不具有限制性。所公开的实施例的变型和修改对于本领域的技术人员来说可以是显而易见的并落入本发明的范围之内。因此，本发明的法律保护的范围应当通过研究以下权利要求来进行确定。

Claims (40)

1.一种治疗动物的由脑损伤事件导致的神经炎症的方法，其特征在于，包括以下步骤：
提供5-脂氧合酶活化蛋白(FLAP)抑制剂，其中，所述FLAP抑制剂能够跨越动物的血脑屏障；
一定量的所述FLAP抑制剂在脑损伤事件前或脑损伤事件后的时间对所述动物给药，其中，所述量和所述时间足以使所述FLAP抑制剂降低由于所述脑损伤事件而在所述动物的大脑中产生的白三烯的水平。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脑损伤事件选自：创伤性脑损伤、中风、多发性硬化、阿尔茨海默氏病和创伤后应激障碍。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述动物是人。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述FLAP抑制剂选自：吲哚FLAP抑制剂、喹啉FLAP抑制剂、喹啉-吲哚FLAP抑制剂或它们的混合物。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述FLAP抑制剂选自：MK-886、MK-591和它们的混合物。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述FLAP抑制剂的给药的途径选自：静脉途径、腹腔途径、栓剂途径和口服途径。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述FLAP抑制剂在所述脑损伤事件前的至少15min或更早的时间对所述动物给药。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述FLAP抑制剂在所述脑损伤事件后的至少15min或更晚的时间对所述动物给药。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述FLAP抑制剂在所述脑损伤事件接下来的至少连续6天内的每天对所述动物给药至少1次。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过所述FLAP抑制剂降低的白三烯包括白三烯B4、白三烯C4、白三烯D4、白三烯E4或它们的混合物中的至少一种。
11.一种降低动物的由脑损伤事件造成的中枢神经系统神经炎症介导的损害的方法，其特征在于，包括以下步骤：
提供5-脂氧合酶活化蛋白(FLAP)抑制剂，其中，所述FLAP抑制剂能够跨越动物的血脑屏障；
一定量的所述FLAP抑制剂在脑损伤事件前或脑损伤事件后的时间对所述动物给药，其中，所述量和所述时间足以使所述FLAP抑制剂降低所述动物的由脑损伤事件造成的中枢神经系统神经炎症介导的损害。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述脑损伤事件选自：创伤性脑损伤、中风、多发性硬化、阿尔茨海默氏病和创伤后应激障碍。
13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述动物是人。
14.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述FLAP抑制剂选自：吲哚FLAP抑制剂、喹啉FLAP抑制剂、喹啉-吲哚FLAP抑制剂或它们的混合物。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述FLAP抑制剂选自：MK-886、MK-591和它们的混合物。
16.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述FLAP抑制剂的给药的途径选自：静脉途径、腹腔途径、栓剂途径和口服途径。
17.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述FLAP抑制剂在所述脑损伤事件前的至少15min或更早的时间对所述动物给药。
18.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述FLAP抑制剂在所述脑损伤事件后的至少15min或更晚的时间对所述动物给药。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述FLAP抑制剂在所述脑损伤事件接下来的至少连续6天内的每天对所述动物给药至少1次。
20.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，通过所述FLAP抑制剂降低的所述中枢神经系统神经炎症介导的损害包括血脑屏障渗透性增加、神经元死亡、内在的神经细胞凋亡、水肿和认知缺陷中的至少一种。
21.一种治疗动物的由脑损伤事件导致的神经炎症的方法，其特征在于，包括以下步骤：
提供5-脂氧合酶活化蛋白(FLAP)抑制剂；
一定量的所述FLAP抑制剂在脑损伤事件前或脑损伤事件后的时间通过鼻腔途径对所述动物给药，其中，所述量和所述时间足以使所述FLAP抑制剂降低由于所述脑损伤事件而在所述动物的大脑中产生的白三烯的水平。
22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述脑损伤事件选自：创伤性脑损伤、中风、多发性硬化、阿尔茨海默氏病和创伤后应激障碍。
23.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述动物是人。
24.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述FLAP抑制剂选自：吲哚FLAP抑制剂、喹啉FLAP抑制剂、喹啉-吲哚FLAP抑制剂或它们的混合物。
25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述FLAP抑制剂选自：MK-886、MK-591和它们的混合物。
26.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述FLAP抑制剂在所述脑损伤事件前的至少15min或更早的时间对所述动物给药。
27.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述FLAP抑制剂在所述脑损伤事件后的至少15min或更晚的时间对所述动物给药。
28.根据权利要求27所述的方法，其特征在于，所述FLAP抑制剂在所述脑损伤事件接下来的至少连续6天内的每天对所述动物给药至少1次。
29.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，通过所述FLAP抑制剂降低的白三烯包括白三烯B4、白三烯C4、白三烯D4、白三烯E4或它们的混合物中的至少一种。
30.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述FLAP抑制剂位于载体内，该载体包括脂质载体、植物油、磷脂酰丝氨酸或它们的混合物。
31.一种降低动物的由脑损伤事件造成的中枢神经系统神经炎症介导的损害的方法，其特征在于，包括以下步骤：
提供5-脂氧合酶活化蛋白(FLAP)抑制剂；
一定量的所述FLAP抑制剂在脑损伤事件前或脑损伤事件后的时间通过鼻腔途径对所述动物给药，其中，所述量和所述时间足以使所述FLAP抑制剂降低所述动物的由脑损伤事件造成的中枢神经系统神经炎症介导的损害。
32.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，所述脑损伤事件选自：创伤性脑损伤、中风、多发性硬化、阿尔茨海默氏病和创伤后应激障碍。
33.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，所述动物是人。
34.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，所述FLAP抑制剂选自：吲哚FLAP抑制剂、喹啉FLAP抑制剂、喹啉-吲哚FLAP抑制剂或它们的混合物。
35.根据权利要求34所述的方法，其特征在于，所述FLAP抑制剂选自：MK-886、MK-591和它们的混合物。
36.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，所述FLAP抑制剂在所述脑损伤事件前的至少15min或更早的时间对所述动物给药。
37.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，所述FLAP抑制剂在所述脑损伤事件后的至少15min或更晚的时间对所述动物给药。
38.根据权利要求37所述的方法，其特征在于，所述FLAP抑制剂在所述脑损伤事件接下来的至少连续6天内的每天对所述动物给药至少1次。
39.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，通过所述FLAP抑制剂降低的中枢神经系统神经炎症介导的损害包括血脑屏障渗透性增加、神经元死亡、内在的神经细胞凋亡、水肿和认知缺陷中的至少一种。
40.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，所述FLAP抑制剂位于载体内，该载体包括脂质载体、植物油、磷脂酰丝氨酸或它们的混合物。
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