ES2619938T3 - Quimeras de fibronectina: factor de crecimiento - Google Patents

Abstract

Un complejo proteico aislado en forma de una proteína quimérica sintética, que comprende una secuencia de aminoácidos de: (i) un factor de crecimiento, o al menos un dominio de dicho factor de crecimiento que es capaz de unirse a un receptor del factor de crecimiento afín; y (ii) uno o más dominios de tipo III de fibronectina (FN), en el que el uno o más dominios de tipo III de FN consiste en los aminoácidos 1266-1536 de la secuencia de FN expuesta en la SEQ ID NO: 1, o los aminoácidos 1447- 1536 de la secuencia de FN expuesta en la SEQ ID NO: 1, o los aminoácidos 1173-1536 de la secuencia de FN expuesta en la SEQ ID NO: 1, donde uno o más dominios de tipo III de FN comprenden un dominio de unión a integrina.

Description

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DESCRIPCION

Quimeras de fibronectina: factor de crecimiento Campo de la invencion

Esta invencion se refiere a complejos proteicos que tienen dominios respectivos que permiten la union a y la activacion tanto de un receptor del factor de crecimiento como de un receptor de la integrina para la fibronectina. En realizaciones particulares, esta invencion se refiere a protemas quimericas que comprenden factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento similar a la insulina I (IGF-I), el factor de crecimiento similar a la insulina II (IGF- II), el factor de crecimiento epidermico (EGF), el factor de crecimiento de fibroblastos basico (bFGF) o los dominios de union al receptor del factor de crecimiento de queratinocitos (KGF) y un dominio de union al receptor de la integrina de la fibronectina (FN). Mas particularmente, esta invencion se refiere a complejos proteicos que estimulan la migracion celular y a composiciones y metodos que promueven o inducen la migracion y/o proliferacion celular. Estas composiciones y metodos tienen uso en la curacion de heridas, ingeniena de tejidos, tratamientos cosmeticos y terapeuticos tales como el reemplazo de piel y la reposicion de la piel y el tratamiento de quemaduras donde se requiere la migracion y/o proliferacion de celulas epiteliales. En otras realizaciones, la invencion proporciona el tratamiento proporcionado por la presente invencion relacionado con la prevencion o inhibicion de las metastasis de celulas cancerosas, particularmente en relacion con el cancer de mama.

Antecedentes de la invencion

Se conocen varios factores de crecimiento peptfdicos implicados en una amplia variedad de procesos celulares, incluyendo la hiperplasia, la smtesis de ADN, la diferenciacion, la progresion del ciclo celular y la inhibicion de la apoptosis e incluyen los factores de crecimiento similares a la insulina (IGF, p.ej., IGF-I e IGF-II) (Jones & Clemmons, 1995, Endocrine Rev. 16 3; Wood & Yee, 2000, J. Mammary Gland Biology and Neoplasia 5 1), EGF (Heldin et al., 1981, Science 4 1 122), bFGF (Taraboletti. et al., 1997, Cell Growth. Differ. 8 471), and KGF (Marchese et al., 1990, J. Cell Physiol. 144 326). Estos efectos estan mediados a traves de la union a sus receptores de superficie celular unidos a tirosina-quinasa afines, el receptor de IGF tipo 1 (IGF-IR), el receptor de EGF, el receptor de bFGF y el receptor de KGF, respectivamente. El IGF tambien estan estrictamente regulado por una familia de protemas de union espedficas, denominadas IGFBP, cuya funcion principal es la de unir los IGF libres y con ello moderar su semivida, especificidad y actividad (Clemmons, 1998, Mol. Cell. Endocrinol. 140 19).

La fibronectina es una glicoprotema adhesiva de alta masa molecular que se encuentra en todos los vertebrados. La fibronectina desempena un papel en la adhesion celular, la morfologfa celular y la arquitectura de la superficie. Su funcion principal parece ser su participacion en la migracion celular durante el desarrollo, reparacion de tejidos y cicatrizacion de heridas, regulacion del crecimiento celular y diferenciacion (Alitalo & Vaheri, 1982, Adv. Cancer Res. 37 1 1 1; Yamada, 1983, Annu. Rev. Biochem. 62 761; Hynes, 1985, Annu. Rev. Cell Biol. 1 67). El polimorfismo de la fibronectina se debe a patrones de corte y empalme alternativos en tres regiones (ED-A, ED-B y IIICS) del unico transcrito primario de la fibronectina (Petersen et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 137; Schwarzbauer et al., 1983, Cell 35 421; Komblihtt et al., 1984, Nucleic Acids Res. 12 5853). La composicion exacta de fibronectina depende del tipo de tejido y/o de las condiciones celulares. En los seres humanos, hay potencialmente 20 formas diferentes de fibronectina, la mayor parte derivadas de corte y empalme alternativo de alguno de los 3 tipos de modulos (Potts y Campbell, 1994, Curr. Opin. Cell Biol. 6648). La expresion de las variantes de corte y empalme de la fibronectina parece estar regulada en el desarrollo y es espedfica del tejido

La fibronectina tiene la capacidad de unir diversas moleculas extracelulares, que incluyen heparina, colageno y acido hialuronico. La fibronectina organiza las interacciones celula-celula y la interaccion celular con la matriz extracelular mediante la union a los diferentes componentes de la matriz extracelular y a los receptores de fibronectina unidos a la membrana (integrinas) en las superficies celulares.

Sin embargo, las contribuciones relativas de los factores de crecimiento y la fibronectina, y sus respectivos dominios, presentes en los complejos proteicos, en terminos de la estimulacion de respuestas biologicas tales como la migracion y/o la proliferacion celular, siguen siendo diffciles de determinar.

Sumario de la invencion

Los presentes inventores han descubierto que los complejos proteicos en forma de quimeras sinteticas que comprenden factores de crecimiento tales como IGF-I, IGF-II, EGF, bFGF o KGF y FN estimulan la migracion y/o la proliferacion celular mediante la union y co-activacion sinergica de receptores de los factores de crecimiento y receptores de integrina de union a FN afines.

Por lo tanto, la invencion se refiere en general a complejos proteicos aislados que comprenden un dominio de union a un receptor de un dominio de un factor de crecimiento y por lo menos un dominio de fibronectina que es capaz de unirse a un receptor de integrina, en el que el complejo proteico aislado puede co-activar el receptor del factor de crecimiento y de la integrina y para provocar de esta manera una respuesta biologica.

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En un primer aspecto, la invencion proporciona un complejo proteico aislado en forma de una protema quimerica sintetica que comprende una secuencia de aminoacidos de:

(i) un factor de crecimiento, o al menos un dominio de un factor de crecimiento que es capaz de unirse a un receptor del factor de crecimiento afm; y

(ii) uno o mas dominios de tipo III de FN, en el que uno o mas dominios de tipo III de FN consiste en los aminoacidos 1266-1536 de la secuencia de FN expuesta en la SEQ ID NO: 1, o los aminoacidos 1447-1536 de la secuencia de FN expuesta en la SEQ ID NO: 1, o los aminoacidos 1173-1536 de la secuencia de FN expuesta en la SEQ ID NO: 1, donde uno o mas dominios de tipo III de FN comprenden un dominio de union a integrina.

Preferentemente, de acuerdo con los aspectos antes mencionados el factor de crecimiento es IGF-I, IGF-II, EGF, bFGF o KGF.

Preferentemente, el dominio de union a integrina es un dominio de union a la integrina a1 o un dominio de union a la integrina a4.

Este aspecto de la invencion tambien contempla una secuencia de aminoacidos de uno o mas fragmentos de fibronectina adicionales en la protema quimerica sintetica.

En un segundo aspecto, la invencion proporciona un acido nucleico aislado que codifica el complejo proteico aislado del primer aspecto.

En un tercer aspecto, la invencion proporciona una construccion genetica que comprende el acido nucleico aislado del segundo aspecto unido operativamente a una o mas secuencias reguladoras en un vector de expresion.

Preferentemente, la construccion genetica es una construccion de expresion.

En un cuarto aspecto, la invencion proporciona una celula hospedadora que comprende la construccion genetica del tercer aspecto.

En un quinto aspecto, la invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende el complejo proteico aislado del primer aspecto y un vehmulo, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable.

Este aspecto de la invencion puede comprender la celula hospedadora del cuarto aspecto, celula que expresa dicha protema(s) sintetica.

En un sexto aspecto, la invencion proporciona un metodo in vitro para promover la migracion celular que incluye la etapa de utilizar una protema sintetica para unirse tanto a un receptor del factor de crecimiento como a un receptor de la integrina.

Preferentemente, el receptor del factor de crecimiento es IGF-IR, el receptor de EGF, el receptor de bFGF o el receptor de KGF.

Preferentemente, el receptor de la integrina es una integrina a1 o a4.

Dicha protema sintetica dicho es de acuerdo con el primer aspecto de la invencion.

En un septimo aspecto, la invencion proporciona un complejo proteico aislado de acuerdo con el primer aspecto de la invencion, para su uso en la curacion de heridas o quemaduras en un animal, preferentemente un ser humano.

Se apreciara tambien que el metodo del septimo aspecto puede abarcar metodos de tratamiento profilacticos y terapeuticos.

En un octavo aspecto, la invencion proporciona un biomaterial que comprende el complejo proteico aislado del primer aspecto.

En realizaciones particulares el biomaterial puede ser un implante quirurgico, protesis, andamio, aposito para heridas o quemaduras o similares adecuadamente impregnados, recubiertos o de otra manera que comprende un complejo proteico aislado de la invencion.

Breve descripcion de las figuras

Figura 1. Secuencia de aminoacidos de (A) fibronectina humana (SEQ ID NO: 1), (B) IGF-I maduro (SEQ ID NO: 2), (C) IGF-II maduro (SEQ ID NO: 3), (D) EGF maduro (SEQ ID NO: 4), (E) bFGF maduro (SEQ ID NO: 5), (F) KGF maduro (SEQ ID NO: 6) y (G) secuencias de enlace preferidas (SeQ ID NOs: 7-12).

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Figura 2. Los complejos proteicos de IGF-I, IGFBP y FN estimulan la migracion de celulas de cancer de mama. Las celulas MCF-10A fueron sembradas en soportes Transwell que habfan sido recubiertos con FN (1 |jg/ml) y concentraciones crecientes de IGF-I preunido en presencia de IGFBP-3 o 5. Se permitio la migracion celular durante 5 horas. El numero de celulas que atraviesan la membrana en respuesta a cada tratamiento se expreso como porcentaje de las que emigran sobre FN solamente (SFM). Los datos de MCF-10 se reunen a partir de tres experimentos con tratamientos ensayados en cuatro pocillos en cada experimento repetido. Las barras de error indican el EEM. MSS = Medios sin suero.

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion ha surgido del descubrimiento de que quimeras sinteticas que comprenden factores de crecimiento tales como IGF-I, IGF-II, EGF, bFGF o KGF y FN se unen y ejercen su efecto biologico sobre la migracion celular a traves de sus receptores de factores de crecimiento afines y del receptor de integrina de union a FN expresados por las celulas sensibles. Mas particularmente, este suceso de union doble estimula sinergicamente la migracion y/o proliferacion celular. Estas moleculas quimericas de cadena sencilla, biologicamente activas, estables comprenden al menos el dominio mmimo o region de un factor de crecimiento capaz de unirse a su receptor afm en combinacion con uno o mas dominios de tipo III de FN que comprenden al menos un dominio de union a integrina de FN.

Este descubrimiento ha llevado a los presentes inventores a proporcionar un complejo proteico aislado que comprende al menos el dominio mmimo o region de IGF-I, IGF-II, EGF, bFGF o KGF, por ejemplo, capaz de unirse a sus receptores afines, en combinacion con el dominio de union a integrina de FN. Aun mas particularmente, se puede producir una unica protema contigua que comprende estos dominios.

Tales complejos proteicos, en forma de una unica protema sintetica, unen o co-ligan coordinadamente sus receptores afines y el receptor de la integrina de union a FN y por lo tanto son agentes utiles para promover la migracion y/o la proliferacion celular y la curacion de heridas. Analogamente, se puede usar la prevencion de la co- ligacion del receptor de integrina de union a FN para prevenir la metastasis de las celulas cancerosas.

A lo largo de toda esta memoria, a menos que se indique lo contrario, “comprende" y “que comprende" se utilizan en sentido amplio en vez de en sentido estricto, de modo que un numero entero o un grupo de numeros enteros indicados pueden incluir uno o mas de otros numeros enteros o grupos de enteros no indicados.

En el contexto particular de los dominios de union al receptor del factor de crecimiento y dominios de union a integrina, un dominio tal comprendera una secuencia de aminoacidos del dominio, junto con otros aminoacidos, adicionales deseados.

Se entendera tambien que un dominio de este tipo puede “consistir esencialmente en” la secuencia de aminoacidos del dominio, junto con no mas de diez, preferentemente no mas de cinco o incluso mas preferentemente no mas de cuatro, tres, dos o uno aminoacidos adicionales.

Se entendera tambien que un dominio de este tipo puede “consistir en” la secuencia de aminoacidos del dominio, en ausencia de cualquiera de los aminoacidos adicionales.

Para los fines de esta invencion, por “aislado” se entiende material que ha sido retirado de su estado natural o de otra manera se ha sometido a manipulacion humana. El material aislado puede estar sustancialmente o esencialmente libre de componentes que normalmente lo acompanan en su estado natural, o puede ser manipulado con el fin de estar en un estado artificial junto con los componentes que normalmente lo acompanan en su estado natural. El material aislado puede estar en forma nativa, de smtesis qmmica o recombinante.

Tal como se usa en la presente memoria, por “sintetico” se entiende que no ocurre de forma natural, pero que se realiza a traves de la intervencion tecnica humana. En el contexto de las protemas y acidos nucleicos sinteticos, esto abarca moleculas producidas por tecnicas recombinantes, de smtesis qmmica o combinatorias como se conocen bien en la tecnica.

Por “protema” se entiende un polfmero de aminoacidos. Los aminoacidos pueden ser aminoacidos naturales o no naturales, D-aminoacidos o L-aminoacidos como se conocen bien en la tecnica. El termino “proterna” tambien incluye y abarca los terminos tales como “glicoprote^na’’, “lipoprote^na" y similares, como se utilizan comunmente en la tecnica.

Un “peptido” es una protema que tiene menos de cincuenta (50) aminoacidos.

Un “polipeptido” es una protema que tiene cincuenta (50) o mas aminoacidos.

Como se ha descrito anteriormente, la presente invencion proporciona, en un aspecto particular, un complejo proteico aislado en forma de una protema quimerica sintetica que comprende una secuencia de aminoacidos de:

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(i) un factor de crecimiento, o al menos un dominio de un factor de crecimiento que es capaz de unirse a un receptor del factor de crecimiento afm; y

(ii) uno o mas dominios de tipo III de FN, en el que uno o mas dominios de tipo III de FN consiste en los aminoacidos 1266-1536 de la secuencia de FN expuesta en la SEQ ID NO: 1, o los aminoacidos 1447-1536 de la secuencia de FN expuesta en la SEQ ID NO: 1, o los aminoacidos 1173-1536 de la secuencia de FN expuesta en la SEQ ID NO: 1, donde uno o mas dominios de tipo III de FN comprenden un dominio de union a integrina.

Como se usa en la presente memoria, una “prote^na quimerica", comprende una secuencia contigua de aminoacidos, siendo los aminoacidos derivados de un dominio de union al receptor de la integrina de fibronectina, opcionalmente, los dominios adicionales de la fibronectina, y un factor de crecimiento o al menos un dominio de union al receptor de un factor de crecimiento.

Como se usa en la presente memoria, un “factor de crecimiento" es una protema biologicamente activa que es capaz de regular el crecimiento, la diferenciacion, la supervivencia y/o la migracion celular in vitro y/o in vivo.

Los ejemplos de factores de crecimiento incluyen, pero no se limitan a, IGF (Jones & Clemmons, 1995, Endocrine Rev. 16 3; Wood & Yee, 2000, J. Mammary Gland Biology and Neoplasia 5 1; Keiss et al., 1994, Hormone Research 41 66), tales como IGF-I (UniProtKB/Swiss-Prot: N.° P05019, protema madura que comprende los restos de aminoacidos 49-118 de la secuencia completa) y el IGF-II (UniProtKB/Swiss-Prot: N.° P01344, protema madura que comprende los restos de aminoacidos 25-91 de la secuencia completa), VEGF (Neufeld et al., 1999, FASEB J. 13 922), PDGF (Heldin, 1992, EMBO J. 11 4251-4259), EGF (Heldin et al., 1981, Science 4 1122-23; UniProtKB/Swiss- Prot: N.° P01133, protema madura que comprende los restos de aminoacidos 971-1023 de la secuencia completa), factor de crecimiento de fibroblastos (FgF; Nurcombe et al., 2000, J. Biol. Chem. 275 30009-30018), bFGF (Taraboletti et al., 1997, Cell Growth. Differ. 8 471-479; UniProtKB/Swiss-Prot: N.° P09038, protema madura comprende los restos de aminoacidos 143-288 de la secuencia completa), osteopontina (Nam et al., 2000, Endocrinol. 141 1100), trombospondina-1 (Nam et al., 2000, supra), tenascina-C (Arai et al, 1996, J. Biol. Chem. 271 6099), PAI-1 (Nam et al., 1997, Endocrinol. 138 2972), plasminogeno (Campbell et al., 1998, Am. J. Physiol. 275 E321), fibrinogeno (Campbell et al., 1999, J. Biol. Chem 274 30215), fibrina (Campbell et al., 1999, supra), transferrina (Weinzimer et al., 2001, J. Clin. Endocrinol. Metab. 86 1806) y KGF (Marchese et al., 1990, J. Cell Physiol. 144 326-32; UniProtKB/Swiss-Prot: N.° P21781, protema madura que comprende los restos de aminoacidos 32-194 de la secuencia completa).

Los complejos proteicos aislados en forma de protemas quimericas sinteticas de la invencion comprenden un factor de crecimiento o al menos un dominio de un factor de crecimiento que es capaz de unirse a un receptor del factor de crecimiento afm.

En este contexto, por “dominio" se entiende al menos la porcion o region de un factor de crecimiento que es capaz de unirse a un receptor del factor de crecimiento afm. Generalmente, aunque no exclusivamente, el receptor del factor de crecimiento afm se expresa por una celula y la union o ligacion de dicho receptor del factor de crecimiento afm por dicho al menos un dominio de un factor de crecimiento provoca una respuesta celular tal como el crecimiento, diferenciacion, supervivencia y/o migracion celular.

Con respecto en particular al IGF-I, dicho dominio comprende adecuadamente el resto de aminoacido 24, que no es un residuo de leucina.

Generalmente, dicho resto es tirosina.

Con respecto en particular al IGF-II, dicho dominio comprende adecuadamente el resto de aminoacido 27, que no es un residuo de leucina.

Generalmente, dicho resto es tirosina.

Con respecto en particular al IGF-I, en una realizacion, dicho dominio consiste en los restos 1 a 70 del IGF-I.

En otra realizacion, dicho dominio consiste en los restos 4 a 70 del IGF-I.

Tambien se entendera que otro componente de los complejos proteicos aislados de la invencion es uno o mas dominios de tipo III de fibronectina (FN), en el que uno o mas dominios de tipo III de FN consiste en los aminoacidos 1266-1536 de la secuencia de FN expuesta en la SEQ ID NO: 1, o los aminoacidos 1447-1536 de la secuencia de FN expuesta en la SEQ ID NO: 1, o los aminoacidos 1173-1536 de la secuencia de FN expuesta en la SEQ ID NO: 1, donde uno o mas dominios de tipo III de FN comprenden un dominio de union a integrina.

Preferentemente, el dominio de union a integrina es un dominio de union a integrina a1 o un dominio de union a integrina a4.

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Aunque no se desea estar ligado por ninguna teona en particular, se propone que las protemas quimericas sinteticas son capaces de co-ligar y co-activar un receptor afm de dicho factor de crecimiento y un receptor de la integrina para la fibronectina para de ese modo estimular, inducir, aumentar, o de lo contrario, promover la migracion celular.

Una ventaja de las protemas quimericas de acuerdo con la invencion es que se producen facilmente por medios de smtesis qmmica o recombinantes y se espera que sean mas estables in vivo, ya que no se basan en el mantenimiento de las interacciones protema-protema que se requieren en los complejos de oligo-protemas asociados no covalentemente.

En este sentido, aunque los complejos proteicos aislados que comprenden dominios de union al receptor de IGF-I tambien comprendenan un IGFBp, se propone que, de acuerdo con el modo de accion antes mencionado, preferentemente un IGFBP no esta presente en una quimera sintetica IGF-I/FN.

En otras realizaciones, la invencion proporciona complejos proteicos aislados, tales como en forma de protemas quimericas sinteticas, que comprenden IGF-I, IGF-II, EGF, bFGF o KGF y uno o mas dominios de tipo III de FN, en el que el uno o mas dominios de tipo III de FN consiste en los aminoacidos 1266-1536 de la secuencia de FN expuesta en la SEQ ID NO: 1 o los aminoacidos 1447-1536 de la secuencia de FN expuesta en la SEQ ID NO: 1, o los aminoacidos 1173-1536 de la secuencia de FN expuesta en la SEQ ID NO: 1, donde uno o mas dominios de tipo III de FN comprenden un dominio de union a integrina.

Preferentemente, el dominio de union a integrina es un dominio de union a integrina a1 o un dominio de union a integrina a4.

El dominio de union a integrina de fibronectina comprende adecuadamente una secuencia RGD. La secuencia RGD esta localizada en los dominios 8 a 10 de tipo iIi de fibronectina (aminoacidos 1266-1536 de la secuencia de fibronectina). Mas espedficamente, la secuencia RGD esta presente en el dominio 10 de tipo III de fibronectina, definido por los aminoacidos 1447-1536 de la secuencia de fibronectina, aunque los sitios de union de la integrina secundarios pueden estar presentes en la region del dominio 8-10 mas grande.

En consecuencia, en una realizacion particular, la quimera sintetica comprende un fragmento de fibronectina que comprende una secuencia RGD, en la que el fragmento comprende o consiste en los aminoacidos 1447-1536 de una secuencia de aminoacidos de fibronectina.

En otra realizacion particular, la quimera sintetica comprende un fragmento de fibronectina que comprende una secuencia RGD, comprendiendo o consistiendo dicho fragmento en una secuencia de aminoacidos de los aminoacidos 1266-1536 de una secuencia de aminoacidos de fibronectina.

En otra realizacion particular mas, la quimera sintetica comprende un fragmento de fibronectina que comprende una secuencia de RGD de acuerdo con las realizaciones mencionadas anteriormente, en la que dicha quimera sintetica comprende ademas al menos 10, 20, 50, 100, 200, 300, 500, 800 o 1000 aminoacidos de una secuencia de aminoacidos de fibronectina, por ejemplo, N-terminal del resto 1266 y/o C-terminal del resto 1536. Por lo tanto, dicha quimera sintetica puede incluir los dominios de tipo I y/o tipo II de fibronectina, tal como, por ejemplo, un fragmento de fibronectina que comprende o consiste en al menos 6, al menos 10, al menos 20, al menos 50, al menos 100, al menos 150, al menos 200, o la totalidad de los aminoacidos 50-273 de una secuencia de aminoacidos de fibronectina.

En este contexto, por “fragmento” se entiende un dominio, sub-secuencia o porcion de la fibronectina. El fragmento constituye preferentemente menos de 500, menos de 400, menos de 300 o mas preferentemente aproximadamente 80-280 aminoacidos contiguos de una secuencia de fibronectina madura. Tambien se contemplan varios fragmentos de fibronectina.

En otra realizacion particular mas, la quimera sintetica comprende un fragmento de fibronectina que comprende o que consiste en una secuencia de aminoacidos de los aminoacidos 1173 a 1536 de una secuencia de aminoacidos de fibronectina.

Se apreciara que la numeracion de la secuencia de fibronectina anterior se hace con referencia a la secuencia de fibronectina mostrada en la Figura. 1. Esta secuencia de fibronectina se deriva de la base de datos de protemas UniProtKB, numero de acceso de la protema P02751. Los dominios y regiones de la fibronectina se exponen en la Tabla I.

Preferentemente, las quimeras sinteticas que comprenden fibronectina o un fragmento que comprende un dominio de union a integrina no comprenden una secuencia de aminoacidos de IGFBP.

Preferentemente, las protemas quimericas sinteticas como se han descrito anteriormente en la presente memoria comprenden adicionalmente una “secuencia de enlazadod’ situada entre y contigua con una secuencia de factor de crecimiento y una secuencia de aminoacidos de fibronectina.

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En una realizacion, dicha secuencia de enlazador comprende uno o mas restos de glicina y uno o mas restos de serina.

Se pueden seleccionar ejemplos particulares de secuencias de enlazador entre; Gly4 Ser (SEQ ID NO:7); Gly4 Ser3 (SEQ ID NO:8); (Gly4 Ser)3 (SeQ ID NO:9) y (Gly4 Ser)4 (SEQ ID NO: 10), aunque sin limitacion a los mismos.

En otra realizacion, la secuencia de enlazador incluye un sitio de reconocimiento de escision de la plasmina (Sakiyama-Elbert et al., 2001, FASEB 15 1300), tal como segun la secuencia:

Leu Ile Lys Met Lys Pro (SEQ ID NO: 11)

En otra realizacion mas, la secuencia de enlazador incluye un sitio de reconocimiento de escision de la colagenasa-3 (Kim & Healy, 2003, Biomacromolecules 4 1214), tal como segun la secuencia:

Gln Pro Gln Gly Leu Ala Lys (SEQ ID NO: 12)

Los fragmentos biologicamente activos de las protemas quimericas sinteticas de la invencion y/o fragmentos biologicamente activos de los dominios de union al receptor del factor de crecimiento particulares y dominios de union a la integrina ilustrados en la presente memoria pueden ser utiles.

Dicho “fragmento biologicamente activo” puede tener no menos de 10 %, preferentemente no menos de 25 %, mas preferentemente no menos de 50 % e incluso mas preferentemente no menos de 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de una actividad biologica de una protema de la que se deriva.

Dicho “fragmento biologicamente activo” puede tener en otra alternativa no menos de 10 %, preferentemente no menos de 25 %, mas preferentemente no menos de 50 % e incluso mas preferentemente no menos de 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, o 95 % de una secuencia de aminoacidos contigua con una protema de la que se deriva.

Tambien se contemplan complejos proteicos variantes de la invencion.

Generalmente, y en relacion a las protemas, una protema “variante" tiene uno o mas aminoacidos que han sido sustituidos por diferentes aminoacidos. Se entiende bien en la tecnica que algunos aminoacidos se pueden cambiar por otros con propiedades muy similares, sin cambiar la naturaleza de la actividad de la protema (sustituciones conservadoras).

Se apreciara que uno o mas restos de aminoacidos de una secuencia de referencia, como un factor de crecimiento, un dominio de union al receptor de un factor de crecimiento, un dominio de union a integrina de fibronectina, IGFBP, o uno o mas restos correspondientes presentes en una protema quimerica sintetica, puede ser modificado o eliminado, o anadirse secuencias adicionales, sin alterar sustancialmente la actividad biologica del complejo proteico aislado de la invencion.

En una realizacion, una variante de protema comparte al menos 70 %, preferentemente al menos 80 % o 85 % y mas preferentemente al menos 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoacidos de referencia.

Preferentemente, la identidad de secuencia se mide en por lo menos 60 %, mas preferentemente en al menos 75 %, mas preferentemente en al menos 90 % o mas preferentemente mas de al menos 95 %, 98 % o sustancialmente toda la longitud de la secuencia de referencia.

Con el fin de determinar el porcentaje de identidad de secuencia, la alineacion optima de las secuencias de aminoacidos y/o nucleotidos puede ser llevada a cabo por implementaciones informatizadas de algoritmos (programa Geneworks de Intelligenetics; GAP, BESTFIT, fAsTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, version 7.0, Genetics Computer Group, WI, EE.UU.) o mediante inspeccion y la mejor alineacion (es decir, lo que tiene como resultado el mayor porcentaje de homologfa sobre la ventana de comparacion) generada por cualquiera de los diversos metodos seleccionados. Tambien puede hacerse referencia a la familia BLAST de programas como, por ejemplo, se divulga por Altschul et al., 1997, Nucl. Acids Res. 25 3389.

En otro ejemplo, “identidad de secuencia” puede ser entendida como el “porcentaje de coincidencia” calculado por el programa de ordenador DNASIS (Version 2.5 para Windows, disponible de Hitachi Software Engineering Co., Ltd., South San Francisco, California, EE.UU.).

Una discusion detallada del analisis de secuencias se puede encontrar en la unidad 19.3 de CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Eds. Ausubel et al. (John Wiley & Sons Inc NY, 1995- 1999).

La invencion contempla tambien los derivados de un dominio de union al receptor de un factor de crecimiento, un dominio de union a integrina de fibronectina o un complejo proteico aislado que comprende el mismo.

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Tal como se usa en la presente memoria, las protemas “derivadas” de la invencion se han modificado, por ejemplo, mediante adicion, conjugacion o formacion de complejos con otros restos qmmicos o mediante tecnicas de modificacion post-traduccion como se conocen bien en la tecnica.

Las “adiciones” de amino acidos pueden incluir la fusion de los polipeptidos o variantes de los mismos con otros polipeptidos o protemas. La otra protema puede, a modo de ejemplo, ayudar en la purificacion de la protema. Por ejemplo, estas incluyen una etiqueta de polihistidina, protema de union a maltosa, protema fluorescente verde (GFP), protema A, o glutation S-transferasa (GST).

Otros derivados contemplados por la invencion incluyen, pero no se limitan a, modificacion de las cadenas laterales, incorporacion de aminoacidos no naturales y/o sus derivados durante la smtesis de peptidos, polipeptidos o protemas y el uso de reticulantes y otros metodos que imponen restricciones conformacionales en los polipeptidos, fragmentos y variantes de la invencion. Los ejemplos de modificaciones de la cadena lateral contempladas por la presente invencion incluyen modificaciones de grupos amino tales como mediante acilacion con antndrido acetico, acilacion de grupos amino con antndrido succmico y antndrido tetrahidroftalico, amidinacion con metilacetimidato, carbamoilacion de grupos amino con cianato, piridoxilacion de lisina con piridoxal-5-fosfato seguido de reduccion con NaBK4, alquilacion reductora por reaccion con un aldetndo seguido de reduccion con NaBK4 y trinitrobencilacion de grupos amino con acido 2, 4, 6-trinitrobenceno (TNBS).

El grupo carboxilo puede modificarse por activacion de carbodiimida a traves de la formacion de O-acilisourea seguido de derivatizacion posterior, a modo de ejemplo, a una amida correspondiente.

El grupo guanidina de restos de arginina puede ser modificado por la formacion de productos de condensacion heterodclicos con reactivos tales como 2,3-butanodiona, fenilglioxal y glioxal.

Los grupos sulfhidrilo pueden ser modificados por metodos tales como oxidacion con acido performico a acido cisteico, la formacion de derivados mercuriales utilizando acido 4-cloromercurifenilsulfonico, 4-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol, cloruro de fenilmercurio y otros mercuriales, la formacion de disulfuros mixtos con otros compuestos de tiol, la reaccion con maleimida, antndrido maleico u otra maleimida sustituida, carboximetilacion con acido yodoacetico o yodoacetamida y carbamoilacion con cianato a pH alcalino.

Los restos de triptofano pueden modificarse, por ejemplo, mediante alquilacion del anillo de indol con bromuro de 2- hidroxi-5-nitrobencilo o haluros de sulfonilo o por oxidacion con N-bromosuccinimida.

Los restos de tirosina se pueden modificar por nitracion con tetranitrometano para formar un derivado de 3- nitrotirosina.

El anillo de imidazol de un residuo de histidina se puede modificar mediante N-carbetoxilacion con pirocarbonato de dietilo o mediante alquilacion con derivados de acido yodoacetico.

Los ejemplos de incorporacion de aminoacidos no naturales y derivados durante la smtesis de peptidos incluyen, pero no se limitan a, el uso de acido 4-amino butmco, acido 6-aminohexanoico, acido 4-amino-3-tiidroxi-5- fenilpentanoico, acido 4-amino-3-hidroxi-6-metilheptanoico, t-butilglicina, norleucina, norvalina, fenilglicina, ornitina, sarcosina, 2-tienil alanina y/o isomeros D de aminoacidos.

Un ejemplo de metodos adecuados para la derivatizacion qmmica de las protemas se proporciona en el Capttulo 15 de CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds. Coligan et al., John Wiley & Sons NY (1995-2001).

Los complejos aislados de protemas y los componentes de las protemas individuales de los mismos, (inclusive los fragmentos, variantes, derivados, y homologos) se pueden preparar por cualquier procedimiento adecuado conocido por los expertos en la tecnica.

Las protemas de la invencion pueden ser producidas por smtesis qmmica. Las tecnicas de smtesis qmmica son bien conocidas en la tecnica, aunque el experto en la materia puede referirse al Capttulo 18 de CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds. Coligan et al., John Wiley & Sons NY (1995-2001) para consultar ejemplos de la metodologfa adecuada.

Las protemas se pueden preparar de forma alternativa como protemas recombinantes.

Aunque la produccion de protemas recombinantes es bien conocida en la tecnica, el experto en la materia puede consultar los protocolos estandar como se describe por ejemplo en Sambrook et al., MOLECULAR CLONING. A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 1989), en particular, en las secciones 16 y 17; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Eds. Ausubel et al., (John Wiley & Sons, Inc. 1995-1999), en particular, en los capttulos 10 y 16; y CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds. Coligan et al., (John Wiley & Sons, Inc. 1995-1999), en particular, en los Capttulos 1, 5 y 6.

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La protema recombinante se puede producir mediante un metodo que incluye las etapas de:

(i) preparar una construccion de expresion que comprende un acido nucleico que codifica dicha protema, unida operativamente a una o mas secuencias de nucleotidos reguladoras en un vector de expresion;

(ii) transfectar o transformar una celula hospedadora con la construccion de expresion; y

(iii) expresar la protema recombinante en dicha celula hospedadora.

Un “vector de expresion” puede ser un vector extra-cromosomico de autorreplicacion tal como un plasmido, o un vector que se integra en un genoma hospedador.

Por “unida operativamente” u “operativamente conectada” se entiende que dicha secuencia(s) de nucleotidos reguladora esta/estan situada(s) en relacion con el acido nucleico recombinante de la invencion para iniciar, regular o controlar de otro modo la transcripcion del acido nucleico, o la traduccion de una protema codificada por el acido nucleico.

Las secuencias de nucleotidos reguladoras seran generalmente apropiadas para la celula hospedadora usada para la expresion. Numerosos tipos de vectores de expresion apropiados y secuencias reguladoras adecuadas son conocidos en la tecnica para una variedad de celulas hospedadoras.

Generalmente, dichas una o mas secuencias de nucleotidos reguladoras pueden incluir, pero no se limitan a, secuencias promotoras, secuencias ffder o de senal, sitios de union ribosomicos, secuencias de inicio y terminacion de la transcripcion, secuencias de inicio y terminacion de la traduccion, secuencias donadoras/aceptoras de corte y empalme y secuencias intensificadoras o activadoras.

Los promotores constitutivos (tales como CMV, RSV, adenovirus, SV40 y promotores del factor de elongacion humano) y promotores inducibles/reprimibles (tales como promotores reprimibles por tet y promotores inducibles por IPTG, metalotionina o ecdisona) son bien conocidos en la tecnica y se contemplan por la invencion. Se apreciara tambien que los promotores pueden ser promotores hffbridos que combinan elementos de mas de un promotor.

La construccion de expresion tambien puede incluir una pareja de fusion (normalmente proporcionada por el vector de expresion) de manera que la protema recombinante de la invencion se expresa como un polipeptido de fusion con dicha pareja de fusion. La principal ventaja de las parejas de fusion es que facilitan la identificacion y/o purificacion de dicha protema de fusion.

Los ejemplos bien conocidos de parejas de fusion incluyen, pero no se limitan a, glutation-S-transferasa (GST), la porcion Fc de la IgG humana, protema de union a maltosa (MBP) y hexahistidina (HISa), los cuales son particularmente utiles para el aislamiento de la protema de fusion mediante cromatograffa de afinidad. Para los fines de la purificacion de protemas de fusion mediante cromatograffa de afinidad, matrices relevantes para la cromatograffa de afinidad son resinas conjugadas con glutation, amilosa, mquel o cobalto, respectivamente. Muchas de estas matrices estan disponibles en forma de “kit”, tales como el sistema QIAexpress™ (Qiagen) util con parejas de fusion (HISa) y el sistema de purificacion de Pharmacia GST.

En algunos casos, las parejas de fusion tambien tienen sitios de escision de la proteasa, como para el Factor Xa o trombina, que permiten a la correspondiente proteasa digerir parcialmente la protema de fusion de la invencion y de este modo liberar el polipeptido recombinante de la invencion de la misma. A continuacion, la protema liberada se puede aislar de la pareja de fusion mediante la consiguiente separacion cromatografica.

Las parejas de fusion incluyen tambien dentro de su alcance “etiquetas de epftopo”, las cuales son generalmente secuencias cortas de peptidos para las que esta disponible un anticuerpo espedfico. Los ejemplos bien conocidos de etiquetas de epftopo para las cuales estan facilmente disponibles anticuerpos monoclonales espedficos incluyen etiquetas c-myc, hemaglutinina y FLAG.

Las celulas hospedadoras adecuadas para la expresion pueden ser procariotas o eucariotas, tales como Escherichia coli (DH5a, por ejemplo), celulas de levadura, celulas Sf9 utilizados con un sistema de expresion de baculovirus, celulas CHO, COS, CV-1, NIH 3T3 y celulas 293, aunque sin limitacion a los mismos.

Las construcciones de expresion tambien pueden incluir una o mas secuencias de nucleotidos marcador de seleccion que confieren resistencia a la celula hospedadora transformada a un agente de seleccion. Los marcadores de seleccion utiles para los fines de seleccion de bacterias transformadas incluyen bla, kanR y tetR, mientras que las celulas eucariotas transformadas pueden ser seleccionadas por marcadores, tales como higromicina, G418 y puromicina, aunque sin limitacion a los mismos.

Con respecto a la introduccion de material genetico en las celulas hospedadoras, los terminos “transformacion” y “transfeccion” se utilizan generalmente para describir la introduccion de material genetico en una celula hospedadora. Hay muchos metodos bien conocidos para introducir material genetico extrano en una celula hospedadora, incluyendo, pero sin limitarse a, precipitacion con fosfato de calcio, electroporacion, administracion

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con lipofectamina, lipofectina y otros agentes lipofilos, precipitacion con fosfato calcico, transfeccion por DEAE- dextrano, bombardeo de micropartmulas, microinyeccion y fusion de protoplastos.

La invencion proporciona un acido nucleico aislado que codifica una protema quimerica sintetica de la invencion, incluyendo variantes y homologos de la misma.

La expresion “acido nucleico” como se utiliza en la presente memoria designa ARNm, ARN, ARNc, ARNi y ADN de cadena sencilla o de doble cadena, inclusive ADNc y ADN genomico y los tnbridos ADN-ARN.

Un “polinucleotido” es un acido nucleico que tiene ochenta (80) o mas nucleotidos contiguos, mientras que un “oligonucleotido” tiene menos de ochenta (80) nucleotidos contiguos.

Una “sonda” puede ser un oligonucleotido o polinucleotido de cadena sencilla o de doble cadena, convenientemente etiquetado con el fin de detectar secuencias complementarias, por ejemplo, en la transferencia Northern o Southern.

Un “cebador” generalmente es un oligonucleotido de cadena sencilla, que tiene preferentemente 15-50 nucleotidos contiguos, que es capaz de hibridar con un “molde” de acido nucleico complementario y que se extiende de una manera dependiente del molde por la accion de una ADN polimerasa tal como Taq polimerasa, ADN polimerasa dependiente de ARN o Sequenase™.

Los acidos nucleicos sinteticos de la invencion pueden ser producidos por metodos de smtesis qmmica o por metodos recombinantes que utilizan tecnicas de amplificacion de la secuencia de acido nucleico, o una combinacion de los mismos, como son bien conocidos en la tecnica.

Los cebadores y oligonucleotidos sintetizados qmmicamente, los sintetizadores y tecnologfas asociadas utiles de acuerdo con la presente invencion estan generalmente disponibles en la mayona de laboratorios o se pueden comprar de fuentes comerciales.

Las tecnicas de amplificacion de acido nucleico adecuadas son bien conocidas por la persona experta e incluyen la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) y la reaccion en cadena de la ligasa (LCR) como se describe por ejemplo en el capttulo 15 de Ausubel et al. supra; amplificacion por desplazamiento de cadena (SDA), como por ejemplo se describe en la patente US-5.422.252; replicacion por cfrculo rodante (RCR), como por ejemplo se describe en Liu et al., 1996, J. Am. Chem. Soc. 118 1587, la Solicitud internacional WO 92/01813 y la Solicitud internacional WO 97/19193; amplificacion basada en la secuencia de acido nucleico (NASBA), como se describe por ejemplo por Sooknanan et al., 1994, Biotechniques 17 1077 y amplificacion por la Q-p replicasa, como se describe por Tyagi et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 5395, aunque sin limitarse a las mismas.

Una tecnica de amplificacion de la secuencia de acido nucleico preferida es la PCR. Como se usa en la presente memoria, un “producto de amplificacion” se refiere a un producto de acido nucleico generado por una tecnica de amplificacion de acido nucleico.

En la produccion y expresion de acidos nucleicos de la invencion, tambien se apreciara que se puede aprovechar la redundancia de la secuencia de codon, de manera que los acidos nucleicos ilustrados en la presente memoria pueden modificarse facilmente sin cambiar una secuencia de aminoacidos codificada por el mismo.

En realizaciones particulares, los acidos nucleicos se pueden optimizar de acuerdo con el “uso de codones” preferido de una celula hospedadora para ser utilizado para la expresion recombinante, como es bien conocido en la tecnica. Esto puede “disenar” efectivamente un acido nucleico para la expresion optima en un organismo particular, o celulas del mismo, donde el uso del codon preferencial afecta a la expresion de protemas.

Por lo tanto, la invencion incluye acidos nucleicos sinteticos que son homologos a los acidos nucleicos ilustrados en la presente memoria.

En una realizacion, los homologos de acido nucleico comparten al menos 70 %, preferentemente al menos 80 %, mas preferentemente al menos 90 % y aun mas preferentemente al menos 95% de identidad de secuencia con un acido nucleico que codifica una cualquiera de las construcciones de protema quimericas sinteticas descritas en la presente memoria.

Preferentemente, la identidad de secuencia se mide en al menos 70 %, mas preferentemente al menos 80 %, incluso mas preferentemente al menos 90 %, 95 % o ventajosamente en sustancialmente la longitud completa del acido nucleico que codifica de la invencion.

En otra realizacion, los homologos de acido nucleico hibridan con un acido nucleico que codifica una cualquiera de las construcciones de protema quimerica sintetica descritas en la presente memoria en condiciones de alta rigurosidad.

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“Hibridar" e “hibridacion" se usan en la presente memoria para denotar el apareamiento de secuencias de nucleotidos al menos parcialmente complementarios para producir un duplex de ADN-ADN, ARN-ARN o ADN-ARN. Las secuencias hibridadas se producen mediante apareamiento de bases entre purinas y pirimidinas complementarias como es bien conocido en la tecnica.

A este respecto, se apreciara que las purinas modificadas (por ejemplo, inosina, metilinosina y metiladenosina) y las pirimidinas modificadas (tiouridina y metilcitosina) tambien pueden participar en el apareamiento de bases.

“Rigurosidad" como se usa en la presente memoria, se refiere a condiciones de temperatura y fuerza ionica y a la presencia o ausencia de ciertos disolventes organicos y/o detergentes durante la hibridacion. Cuanto mayor es la rigurosidad, mayor sera el nivel requerido de complementariedad entre las secuencias de nucleotidos que hibridan.

“Condiciones rigurosas" designa a aquellas condiciones en las que solo el acido nucleico que tiene una alta frecuencia de bases complementarias se hibridara.

La referencia en la presente memoria a condiciones de alta rigurosidad incluye y abarca:

(i) de al menos aproximadamente 31 % v/v a al menos aproximadamente 50 % v/v de formamida y de al menos aproximadamente 0,01 M a al menos aproximadamente 0,15 M de sal para hibridacion a 42 °C, y al menos aproximadamente 0,01 M a al menos aproximadamente 0,15 M de sal para el lavado a 42 °C;

(ii) 1 % de BSA, EDTA 1 mM, NaHPO4 0,5 M (pH 7,2), 7 % de SDS para la hibridacion a 65 °C y (a) 0,1 x SSC, 0,1 % de SDS; o (b) 0,5 % de BSA, EDTA 1 mM, NaHPO4 40 mM (pH 7,2), 1 % de SDS para el lavado a una temperatura por encima de 65 °C durante aproximadamente una hora y

(iii) 0,2 x SSC, 0,1 % de SDS para el lavado en o por encima de 68 °C durante aproximadamente 20 minutos.

En general, el lavado se lleva a cabo a Tm = 69,3 + 0,41 (G + C) % -12 °C. En general, el valor de Tm de un duplex de ADN disminuye en aproximadamente 1 °C con cada incremento de 1 % en el numero de bases coincidentes.

No obstante, las anteriores condiciones rigurosas se conocen bien en la tecnica, tal como se describe en los capftulos 2.9 y 2.10 de Ausubel et al., supra y, en particular, en las paginas 2.9.1 a traves 2.9.20.

Tambien se contemplan anticuerpos contra una protema quimerica sintetica de la invencion, incluidas las protemas quimericas, o fragmentos, variantes y/o derivados de las mismas. Los anticuerpos de la invencion pueden ser policlonales o monoclonales. Protocolos aplicables a la produccion, purificacion y uso de anticuerpos bien conocidos se pueden encontrar, por ejemplo, en el Capttulo 2 de Coligan et al., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (John Wiley & Sons NY, 1991-1994) y Harlow, E. & Lane, D. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.

Generalmente, dichos anticuerpos se unen a o se conjugan con un polipeptido, fragmento, variante o derivado de la invencion. Por ejemplo, los anticuerpos pueden comprender anticuerpos policlonales. Tales anticuerpos se pueden preparar por ejemplo mediante la inyeccion de un polipeptido, fragmento, variante o derivado de la invencion en una especie de produccion, que puede incluir ratones o conejos, para obtener antisueros policlonales. Los metodos para producir anticuerpos policlonales son bien conocidos para los expertos en la tecnica. Protocolos a modo de ejemplo que pueden usarse se describen por ejemplo en Coligan et al., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, supra y en Harlow & Lane, 1988, supra.

En lugar de los antisueros policlonales obtenidos en la especie de produccion, los anticuerpos monoclonales se pueden producir usando el metodo estandar como, por ejemplo, descrito por Kohler y Milstein (1975, Nature 256, 495), o por modificaciones mas recientes del mismo como, por ejemplo, el descrito en Coligan et al., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, supra inmortalizando bazo u otras celulas productoras de anticuerpos derivados de una especie de produccion que ha sido inoculada con uno o mas de los polipeptidos, fragmentos, variantes o derivados de la invencion.

Dichos anticuerpos pueden comprender fragmentos Fc o Fab de los anticuerpos policlonales o monoclonales a los que se ha hecho referencia anteriormente. Como alternativa, los anticuerpos pueden comprender anticuerpos Fv de cadena sencilla (scFv) contra las protemas de la invencion. Tales scFv se pueden preparar, por ejemplo, de acuerdo con los metodos descritos, respectivamente, en la patente US-5.091.513, en la Patente Europea 239,400 o en el artmulo de Winter y Milstein (1991, Nature 349 293).

Los marcadores pueden estar asociados con el anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

El marcador puede ser seleccionado de un grupo que incluye un cromogeno, un catalizador, una enzima, un fluoroforo, una molecula quimioluminiscente, un ion lantanido tales como europio (Eu34), un radioisotopo y un marcador visual directo. En el caso de un marcador visual directo, se puede usar una partmula metalica o no metalica coloidal, una partmula de colorante, una enzima o un sustrato, un polfmero organico, una partmula de latex, un liposoma u otra vesmula que contiene una sustancia para la produccion de senales y similares.

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En las patentes US-4.366.241. US-4.843.000 y US-4.849.338 se divulgan un gran numero de enzimas utiles como marcadores. Marcadores de enzimas utiles en la presente invencion incluyen fosfatasa alcalina, peroxidasa de rabano picante, luciferasa, b-galactosidasa, glucosa oxidasa, lisozima, malato deshidrogenasa, y similares. El marcador de enzima puede ser utilizado solo o en combinacion con una segunda enzima en la solucion.

A modo de ejemplo, el fluoroforo puede ser isotiocianato de fluorescema (FITC), verde Oregon, isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITL), aloficocianina (APC) y R-ficoeritrina (RPE), aunque sin limitarse a los mismos.

La invencion tambien proporciona composiciones farmaceuticas que comprenden un complejo proteico aislado de la invencion, incluidas las variantes y derivados del mismo.

Dicho complejo proteico aislado puede estar en cualquier forma, incluidas las protemas quimericas sinteticas de la invencion, aunque sin limitarse a las mismas.

Las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden usarse para promover o de otra manera facilitar la migracion celular, la regeneracion de tejidos y la cicatrizacion de heridas. Como alternativa, las composiciones farmaceuticas pueden administrarse para prevenir las metastasis tumorales mediante la prevencion o inhibicion de la migracion de celulas tumorales a un sitio secundario.

La composicion se puede usar en tratamientos terapeuticos o profilacticos segun sea necesario. Por ejemplo, las composiciones farmaceuticas se pueden aplicar en forma de preparaciones terapeuticas o cosmeticas para la reparacion de la piel, cicatrizacion de heridas, curacion de quemaduras y otros tratamientos dermatologicos.

En este sentido, las composiciones farmaceuticas se pueden administrar en asociacion con, o como un componente de, un biomaterial, biopolfmero, material inorganico tal como hidroxiapatita o derivados de los mismos, implantes quirurgicos, protesis, apositos para heridas o quemaduras, compresas, vendajes o similares adecuadamente impregnados, recubiertos o que de otra manera comprenden la composicion farmaceutica.

Adecuadamente, la composicion farmaceutica comprende un vetuculo, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable adecuado.

Preferentemente, el vetuculo, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable es adecuado para administracion a mairnferos y mas preferentemente, a los seres humanos.

Por “veh^culo, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable” se entiende una carga solida o lfquida, diluyente o sustancia encapsulante que puede utilizarse de manera segura en la administracion sistemica. Dependiendo de la via particular de administracion, se puede utilizar una variedad de vetuculos, bien conocidos en la tecnica. Estos vetuculos pueden seleccionarse de un grupo que incluye azucares, almidones, celulosa y sus derivados, malta, gelatina, talco, sulfato de calcio, aceites vegetales, aceites sinteticos, polioles, acido algmico, soluciones tamponadas con fosfato, emulsionantes, solucion salina isotonica y sales tales como sales de acidos minerales incluyendo clorhidratos, bromuros y sulfatos, acidos organicos tales como acetatos, propionatos y malonatos y agua libre de pirogenos.

Una referencia util que describe vehfculos, diluyentes y excipientes farmaceuticamente aceptables es Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. N.J. USA, 1991).

Cualquier ruta segura de administracion puede ser empleada para proporcionar a un paciente la composicion de la invencion. Por ejemplo, se puede emplear la oral, rectal, parenteral, sublingual, bucal, intravenosa, intra-articular, intramuscular, intradermica, subcutanea, por inhalacion, intraocular, intraperitoneal, intracerebroventricular, transdermica, y similares.

Las formas farmaceuticas incluyen comprimidos, dispersiones, suspensiones, inyecciones, soluciones, jarabes, pastillas, capsulas, supositorios, aerosoles, parches transdermicos y similares. Estas formas farmaceuticas pueden incluir tambien la inyeccion o implantacion de dispositivos de liberacion controlada disenados espedficamente para este fin u otras formas de implantes modificados para actuar adicionalmente de esta manera. La liberacion controlada del agente terapeutico puede efectuarse mediante el recubrimiento de la misma, por ejemplo, con polfmeros hidrofobos que incluyen resinas acnlicas, ceras, alcoholes alifaticos superiores, acidos polilactico y poliglicolico y ciertos derivados de celulosa tales como hidroxipropilmetilcelulosa. Ademas, la liberacion controlada puede efectuarse mediante el uso de otras matrices de polfmero, liposomas y/o microesferas.

Las composiciones anteriores se pueden administrar de una manera compatible con la formulacion de dosificacion y en tal cantidad que sea farmaceuticamente eficaz. La dosis administrada a un paciente, en el contexto de la presente invencion, debe ser suficiente para provocar una respuesta beneficiosa en un paciente durante un penodo de tiempo apropiado. La cantidad de agente(s) a administrar puede depender del sujeto a tratar, incluida la edad, sexo, peso y estado general de salud del mismo, factores que dependeran del juicio del medico.

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Con respecto a las composiciones farmaceuticas para la cicatrizacion de heridas, se hace referencia en particular a la patente US-5.936.064 y a la Publicacion Internacional WO 99/62536.

Las composiciones farmaceuticas de la invencion tambien pueden incluir vectores de expresion tales como vectores virales tales como vaccinia y vectores virales utiles en terapia genica. Estos ultimos incluyen adenovirus y virus asociados a adenovirus (AAV) tales como los descritos en Braun-Falco et al. (1999, Gene Ther. 6432), vectores retrovirales y lentivrales tales como los descritos en Buchshacher et al. (2000, Blood 95 2499) y vectores derivados del virus del herpes simple y citomegalovirus. Una vision general de los vectores virales utiles en la terapia genica se proporciona en Stone et al. (2000, J. Endocrinol. 164 103).

La presente invencion tambien puede utilizar los vectores de expresion espedficos que dirigen la expresion de genes a las celulas epidermicas, como se describe en la patente US-5.958.764 y para aplicaciones de cicatrizacion de heridas, como se describe en la patente US-5.962.427.

La invencion proporciona un complejo proteico aislado para su uso en la curacion de heridas o quemaduras en un animal. Esto puede incluir en particular el tratamiento terapeutico y/o profilactico de mairnferos, y mas particularmente, de seres humanos.

Sin embargo, los usos terapeuticos de acuerdo con la invencion tambien pueden ser aplicables a marnfferos como animales domesticos y de comparua, animales de produccion, tales como caballos, camellos y galgos, animales de granja, animales de laboratorio y animales utilizados como fuente de celulas, organos y tejidos para xenotrasplantes.

Tambien se contemplan metodos de tratamiento cosmetico donde los complejos proteicos aislados, incluidas las protemas quimericas sinteticas de la invencion, se administran para mejorar o aumentar la calidad de la piel o el aspecto de la piel.

Tales tratamientos pueden incluir la prevencion o restauracion de trastornos de la piel tales como la psoriasis y la cicatrizacion hipertrofica que resultan de la proliferacion celular de la piel aberrante.

Como alternativa, se contemplan metodos de tratamiento mediante los cuales se previene o inhibe la metastasis tumoral mediante el bloqueo de la migracion de celulas tumorales a un sitio secundario. Ademas, tambien se contemplan los metodos de tratamiento del cancer mediante el bloqueo de la proliferacion celular.

En realizaciones particulares, los tratamientos terapeuticos y/o profilacticos pueden utilizar un complejo proteico aislado, incluidas las protemas quimericas sinteticas de la invencion, en asociacion con, o como un componente de, un biomaterial, biopolfmero, material inorganico tal como fluorohidroxiapatita, implante quirurgico, protesis, apositos para heridas o quemaduras, compresas, vendajes o similares adecuadamente impregnados, recubiertos o de lo contrario que comprende el complejo proteico aislado.

Tales metodos incluyen la administracion de las composiciones farmaceuticas como se define anteriormente y puede ser por medio de la inyeccion de microagujas en sitios de tejido espedficos, como se describe en la Patente US-6.090.790, cremas topicas, lociones o apositos selladores aplicados a las heridas, quemaduras o ulceras, tales como los descritos en la Patente US-6.054.122 o implantes que liberan la composicion tal como se describe en la publicacion internacional WO 99/47070.

La terapia genica tambien es aplicable en este sentido, tal como de acuerdo con los metodos expuestos en la patente US-5.929.040 y US- 5.962.427.

Tambien existen metodos mediante los cuales las celulas de la piel pueden ser geneticamente modificadas para el proposito de crear sustitutos de la piel, tales como mediante la expresion del factor de crecimiento deseado disenado por ingeniena genetica (Supp et al., 2000, J. Invest. Dermatol. 1145). Un ejemplo de una revision de este campo se proporciona en Bevan et al. (Biotechnol. Gent. Eng. Rev. 16 231).

Tambien se contempla la “siembra” de un receptor con celulas transfectadas o transformadas, tal como se describe en la publicacion internacional WO 99/11789.

Estos metodos se pueden utilizar para estimular la migracion celular y por lo tanto facilitar o acelerar la curacion de heridas y quemaduras, reparar lesiones de la piel tales como ulceras, reemplazo de tejidos e injerto, tal como por cultivo in vitro de piel autologa, reepitelizacion de los organos internos como el rinon y el pulmon y la reparacion del tejido nervioso danado.

La terapia de reemplazo de la piel se ha convertido en bien conocida en la tecnica y puede emplear el uso de lmeas de celulas epiteliales/queratinocitos co-cultivadas, por ejemplo, como se describe en Kehe et al. (1999, Arch. Dermatol. Res. 291 600) o el cultivo in vitro de celulas epidermicas primarias (normalmente autologas), dermicas y/o queratinocitos. Estas tecnicas tambien pueden utilizar biomateriales disenados y “andamios” sinteticos polimericos.

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Se proporcionan ejemplos de revisiones del campo, en general en Terskilch y Vasiliev (1999, Int. Rev. Cytol. 188 41) y Eaglestein y Falanga (1998, Cutis 62 1).

Mas en particular, la produccion de mucosa oral de sustitucion util en cirugfa craneofacial se describe en Izumi et al. (2000, J. Dent. Res. 79 798). Los queratinocitos y fibroblastos dermicos fetales se pueden expandir in vitro para producir piel para injertos para tratar lesiones de la piel, como se describe en Fauza et al. (J. Pediatr. Surg. 33 357), mientras que los sustitutos de la piel de los elementos dermicos y epidermicos cultivados in vitro en biomateriales derivados del acido hialuronico han demostrado ser potencialmente utiles en el tratamiento de quemaduras (Zacchi et al., 1998, J. Biomed. Mater. Res. 40 187).

Se contemplan tambien estructuras en andamio de polfmeros para el proposito de facilitar el diseno de la piel de sustitucion, como por ejemplo se describe en Sheridan et al. (2000, J. Control Release 14 91) y Fauza et al. (1998, supra), como son las microesferas como agentes para la aplicacion de celulas de la piel a las heridas y quemaduras (LaFrance and Armstrong, 1999, Tissue Eng. 5 153).

Tambien se contempla el uso de complejos proteicos aislados, incluidas las protemas quimericas sinteticas de la invencion, para identificar, cribar, disenar o de otra manera producir agonistas o antagonistas de complejos que comprenden un factor de crecimiento y fibronectina, tales como complejos IGF-I:FN, IGF-II:FN, EGF:FN, bFGF:FN, GF:Fn, or IGF-I:IGFBP:FN. Tales agentes pueden ser un “mimetico”. El termino “mimetico" se utiliza en la presente memoria para referirse a moleculas que estan disenados para parecerse a determinadas regiones funcionales de las protemas o peptidos, e incluye dentro de su alcance los terminos “agonista”, “analogo” y “antagonista" como se conocen bien en la tecnica.

Los agonistas pueden ser producidos de modo que imitan la union de los receptores del factor de crecimiento afines y los receptores de FN mediante complejos IGF-I:FN, IGF-II:FN, EGF:FN, bFGF:FN, KGF:FN, o IGF-I:IGFBP:FN. Tales moleculas pueden tener utilidad como estimuladores de la migracion celular tal como se requiere para la curacion de heridas, regeneracion de la piel y similares.

En otra alternativa, los antagonistas se pueden producir para prevenir o inhibir la union de los receptores de factores de crecimiento afines y los receptores de la integrina mediante complejos IGF-I:FN, IGF-II:FN, EGF:FN, bFGF:FN, KGF:FN o IGFII:IGFBP:FN. Tales moleculas pueden tener utilidad como inhibidores de la migracion y/o la proliferacion celular y de este modo constituyen agentes antitumorales utiles y tambien en tratamientos de trastornos de la piel tales como la psoriasis y la cicatrizacion hipertrofica que resultan de la proliferacion celular aberrante.

Los mimeticos, agonistas, antagonistas y analogos anteriormente mencionados pueden ser peptidos, polipeptidos u otras moleculas organicas, preferentemente moleculas organicas pequenas, preferentemente, con una actividad biologica y semivida deseadas.

La busqueda en bases de datos estructurales asistida por ordenador es cada vez mas utilizada como un procedimiento para identificar mimeticos. Los metodos de busqueda en bases de datos, los cuales, en principio, pueden ser adecuados para la identificacion de compuestos mimeticos, se pueden encontrar en la Publicacion Internacional WO 94/18232 (relacionada con la produccion de mimeticos de antfgenos del VIH), Patente US- 5.752.019 y la Publicacion Internacional WO 97/41526 (relacionada con la identificacion de mimeticos de EPO).

Otros metodos incluyen una variedad de tecnicas bioffsicas que identifican interacciones moleculares. Estas permiten el cribado de moleculas candidatas en funcion de si dicha molecula candidata afecta a la formacion de complejos, por ejemplo, IGF-I:FN, IGF-II:FN, EGF:FN, bFGF:FN, KGF:FN o IGF-IGFBP-FN. Los metodos aplicables a las tecnicas potencialmente utiles tales como ensayos de union de radioligando competitivo (vease en Upton et al., 1999, supra un metodo correspondiente), ultracentrifugacion analftica, microcalorimetna, resonancia de plasmon de superficie y metodos basados en biosensores opticos se proporcionan en el Capttulo 20 de CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds. Coligan et al., (John Wiley & Sons, 1997).

Para que la presente invencion pueda ser entendida y puesta en practica mas facilmente, el experto en la materia debe consultar los siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplos

EJEMPLO 1

IGF-I, IGFBP y FN estimulan la migracion celular

Las celulas MCF-10A fueron sembradas en soportes Transwell que habfan sido recubiertos con FN (1 pg/ml) y concentraciones crecientes de IGF-I preunido en presencia de IGFBP-3 o 5. Se permitio la migracion celular durante 5 horas. El numero de celulas que atraviesan la membrana en respuesta a cada tratamiento se expreso como porcentaje de las que emigran sobre FN solamente (SFM). Los datos de MCF-10 se reunen a partir de tres experimentos con tratamientos ensayados en cuatro pocillos en cada experimento repetido y se muestra en la Fig. 2.

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Las barras de error indican el EEM. MSS = Medios sin suero. IGF-I:FN, IGF-I:IGFBP-3:FN and IGF-I:IGFBP-5:FN fueron capaces de estimular significativamente el aumento de la migracion por encima del de los pocillos de control con FN solo (respuestas de 153,7 +/- 7,3 %, 192,5 +/- 6,8 % y 187,5 +/- 6,5 % de los pocillos de control de FN, respectivamente) (p <0,05). La respuesta de las celulas MCF7-10A a los tratamientos con IGF-I:IGFBP-3:FN e IGF- I:IGFBP-5:FN tambien fue significativamente mayor que la obtenida con cualquiera de IGFBP o IGF-I solo con FN (p <0,05). Estos datos indican que las respuestas maximas se producen cuando estan presentes los complejos IGF- I:IGFBP-3/5:FN trimericos. Esto sugiere que las quimeras que contienen IGF-I ligado a FN activan las integrinas de union a FN y el receptor del factor de crecimiento afm.

EJEMPLO 2

Protemas quimericas sinteticas fibronectina : factor de crecimiento

En la presente memoria se proporcionan ejemplos de protemas quimericas sinteticas de la invencion, en forma de quimeras FN : factor de crecimiento (p.ej., iGf-I, IGF-II, EGF, bFGF y KGF).

Las protemas quimericas sinteticas incluyen cualquiera de longitud completa o formas truncadas de FN fusionados con un factor de crecimiento, con o sin modificaciones de restos de aminoacidos. Ademas, la FN y los factores de crecimiento pueden estar fusionados con o sin los diversos enlazadores peptidicos.

Se han disenado una serie de construcciones de expresion quimericas en las que diferentes longitudes de la protema FN estan unidas a las protemas IGF-I, IGF-II, EGF, bFGF o KGF de longitud completa maduras o al menos un dominio de las protemas IGF-I, IGF-II, EGF, bFGF o KGF capaces de unirse a un receptor del factor de crecimiento afm. En cada caso, los segmentos de FN estan preferentemente unidos a la secuencia de IGF-I, IGF-II, EGF, bFGF o KGF traves de un enlazador, por ejemplo, un enlazador Gly4 Ser (SEQ ID NO:7), un enlazador Gly4 Ser3 (SEQ ID NO:8), un enlazador (Gly4 Ser)3 (SeQ ID NO:9) o un enlazador (Gly4 Ser)4 (SEQ ID NO: 10).

Los ejemplos de protemas quimericas sinteticas incluyen, pero no se limitan a:

A) Dominio 8 de tipo III de FN [Enlazador] Factor de crecimiento (IGF-I, IGF-II, EGF, bFGF o KGF); b) Dominios 8-9 de tipo III de Fn [Enlazador] Factor de crecimiento (IGF-I, IGF-II, EGF, bFGF o KGF);

C) Dominios 8-10 de tipo III de FN [Enlazador] Factor de crecimiento (IGF-I, IGF-II, EGF, bFGF o KGF);

d) Dominio 9 de tipo IiI de FN [Enlazador] Factor de crecimiento (IGF-I, IGF-II, EGF, bFGF o KGF);

e) Dominios 9-10 de tipo III de FN [Enlazador] Factor de crecimiento (IGF-I, IGF-II, EGF, bFGF o KgF);

f) Dominio 10 de tipo III de FN [Enlazador] Factor de crecimiento (IgF-I, IGF-II, EGF, bFGF o KGF);

G) Dominios 1-5 de tipo I de FN [Enlazador] Dominio 8 de tipo III de FN [Enlazador] Factor de crecimiento (IGF-I, IGF-II, EGF, bFGF o KGF);

H) Dominios 1-5 de tipo I de FN [Enlazador] Dominios 8-9 de tipo III de FN [Enlazador] Factor de crecimiento (IGF-I, IGF-II, EGF, bFGF o KGF);

I) Dominios 1-5 de tipo I de FN [Enlazador] Dominios 8-10 de tipo III de FN [Enlazador] Factor de crecimiento (IGF-I, IGF-II, EGF, bFGF o KGF);

J) Dominios 1-5 de tipo I de FN [Enlazador] Dominio 9 de tipo III de FN [Enlazador] Factor de crecimiento (IGF-I, IGF-II, EGF, bFGF o KGF);

K) Dominios 1-5 de tipo I de FN [Enlazador] Dominios 9-10 de tipo III de FN [Enlazador] Factor de crecimiento (IGF-I, IGF-II, EGF, bFGF o KGF);

L) Dominios 1-5 de tipo I de FN [Enlazador] Dominio 10 de tipo III de FN [Enlazador] Factor de crecimiento (IGF-I, IGF-II, EGF, bFGF o KGF);

M) Dominios 4-5 de tipo I de FN [Enlazador] Dominio 8 de tipo III de FN [Enlazador] Factor de crecimiento (IGF-I, IGF-II, EGF, bFGF o KGF);

N) Dominios 4-5 de tipo I de FN [Enlazador] Dominios 8-9 de tipo III de FN [Enlazador] Factor de crecimiento (IGF-I, IGF-II, EGF, bFGF o KGF);

O) Dominios 4-5 de tipo I de FN [Enlazador] Dominios 8-10 de tipo III de FN [Enlazador] Factor de crecimiento (IGF-I, IGF-II, EGF, bFGF o KGF);

P) Dominios 4-5 de tipo I de FN [Enlazador] Dominio 9 de tipo III de FN [Enlazador] Factor de crecimiento (IGF-I, IGF-II, EGF, bFGF o KGF);

Q) Dominios 4-5 de tipo I de FN [Enlazador] Dominios 9-10 de tipo III de FN [Enlazador] Factor de crecimiento (IGF-I, IGF-II, EGF, bFGF o KGF);

R) Dominios 4-5 de tipo I de FN [Enlazador] Dominio 10 de tipo III de FN [Enlazador] Factor de crecimiento (IGF- I, IGF-II, EGF, bFGF o KGF).

Las secuencias de ADN de los genes de FN, IGF-I, IGF-II, EGF, bFGF y KGF humanos (SEQ ID NOs: 1-6, respectivamente) pueden ser optimizadas para la expresion en el codon de Spodoptera frugiperda. Las secuencias de codificacion pueden ser clonadas en un vector de expresion que incorpora una etiqueta de afinidad de polihistidina para facilitar la purificacion de las quimeras (p.ej., el vector de expresion pIB/V5-His (Invitrogen)). Una secuencia de nucleotidos que codifica un enlazador de aminoacidos como se ha descrito anteriormente puede ser insertada a traves de mutagenesis de sitio dirigido por PCR. La adicion de una Asn al extremo C terminal de la

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secuencia de enlazador puede ser utilizada para generar un motivo Asn-Gly, siendo Gly siendo el primer aminoacido de la protema del factor de crecimiento. Este motivo permite la escision inducida por hidroxilamina de la protema del factor de crecimiento de las quimeras.

Las construcciones resultantes codificaran varias longitudes de la protema FN unidas por un enlazador a las protemas IGF-I, IGF-II, EGF, bFGF o KGF maduras de longitud completa o al menos un dominio de las protemas IGF-I, IGF-II, EGF, bFGF o KGF capaces de unirse a un receptor del factor de crecimiento afm. La secuencia de ADN de todas las construcciones se puede verificar para asegurarse de que se mantiene la fidelidad de las secuencias de ADN deseadas.

Se pueden usar clones en el vector pIB/V5-His para transfectar celulas de insecto Sf9 y la protema secretada transitoriamente expresada se detecta en el medio acondicionado, tal como se evaluo por inmunotransferencia. Brevemente, las muestras se resuelven en SDS-PAGE en condiciones reductoras y las protemas se transfieren a una membrana de nitrocelulosa utilizando un metodo de transferencia semi-seco. La membrana se pone en contacto con anticuerpos policlonales anti-FN y las especies de protemas diana son visualizadas a continuacion usando quimioluminiscencia potenciada.

La purificacion de las protemas quimericas se basa en la cromatograffa de afinidad Ni-NTA Superflow Agarosa (QlAGEN, Australia) realizada de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las protemas quimericas se controlan durante todo el proceso de purificacion mediante SDS-PAGE y analisis de transferencia Western usando un anticuerpo policlonal anti-FN (Calbiochem).

Se pueden usar celulas, tales como celulas MCF-10A, celulas MCF-7 y celulas epiteliales humanas aisladas, queratinocitos y fibroblastos para examinar los efectos de las protemas quimericas sinteticas sobre la migracion y/o proliferacion celular. Por ejemplo, la migracion celular puede evaluarse usando ensayos de migracion Transwell™, mientras que la proliferacion celular se puede determinar usando ensayos de proliferacion celular bien conocidos para un experto en la materia.

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   REIVINDICACIONES

   1. Un complejo proteico aislado en forma de una protema quimerica sintetica, que comprende una secuencia de aminoacidos de:

   (i) un factor de crecimiento, o al menos un dominio de dicho factor de crecimiento que es capaz de unirse a un receptor del factor de crecimiento afrn; y

   (ii) uno o mas dominios de tipo III de fibronectina (FN), en el que el uno o mas dominios de tipo III de FN consiste en los aminoacidos 1266-1536 de la secuencia de FN expuesta en la SEQ ID NO: 1, o los aminoacidos 14471536 de la secuencia de FN expuesta en la SEQ ID NO: 1, o los aminoacidos 1173-1536 de la secuencia de FN expuesta en la SEQ ID NO: 1, donde uno o mas dominios de tipo III de FN comprenden un dominio de union a integrina.
2. 2. El complejo proteico aislado de la reivindicacion 1, en el que dicho factor de crecimiento se selecciona de factor crecimiento similar a la insulina I (IGF-I), factor de crecimiento similar a la insulina II (IGF-II), factor de crecimiento epidermico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos basico (bFGF) y factor de crecimiento de queratinocitos (KGF).
3. 3. El complejo proteico aislado de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que el dominio de union a integrina

   es un dominio de union a integrina a1 o un dominio de union a integrina a4.
4. 4. El complejo proteico aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, el cual no comprende una secuencia

   de aminoacidos de IGFBP.
5. 5. El complejo proteico aislado de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende ademas un fragmento adicional de FN.
6. 6. El complejo proteico aislado de la reivindicacion 5, en el que el fragmento adicional de FN comprende los

   aminoacidos 50-273 de la secuencia de FN expuesta en la SEQ ID NO: 1 o los aminoacidos 184-273 de la

   secuencia de FN expuesta en la SEQ ID NO: 1.
7. 7. El complejo proteico aislado de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende ademas al menos una secuencia de enlazador.
8. 8. El complejo proteico aislado de la reivindicacion 7, en el que la secuencia de enlazador comprende un sitio de escision de la proteasa y/o se selecciona del grupo que consiste en:

   (i) Gly4 Ser (SEQ ID NO:7);

   (ii) Gly4 Sera (SEQ ID NO:8);

   (iii) (Gly4 Ser)3 (SEQ ID NO:9);

   (iv) (Gly4 Ser)4 (SEQ ID NO:10);

   (v) Leu Ile Lys Met Lys Pro (SEQ ID NO:11) y

   (vi) Gln Pro Gln Gly Leu Ala Lys (SEQ ID NO:12).
9. 9. Un acido nucleico aislado que codifica el complejo proteico aislado de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
10. 10. Una construccion genetica que comprende el acido nucleico aislado de la reivindicacion 9 unido operativamente a una o mas secuencias de nucleotidos reguladoras en un vector, siendo preferentemente la construccion una construccion de expresion y estando el acido nucleico aislado unido operativamente a un promotor.
11. 11. Una celula hospedadora que comprende la construccion genetica de la reivindicacion 9 o la reivindicacion 10.
12. 12. Una composicion farmaceutica que comprende el complejo proteico aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 y un vehfculo, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable.
13. 13. Un implante quirurgico, estructura en andamio o protesis impregnados, recubiertos o tratados de otra manera que comprenden el complejo proteico aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, o un aposito para heridas o quemaduras, que comprende el complejo proteico aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8.
14. 14. Un metodo in vitro para promover la migracion y/o proliferacion celular, que incluye la etapa de utilizar el complejo proteico aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para unir tanto un receptor del factor de crecimiento como un receptor de integrina expresado por una celula para de ese modo inducir, aumentar o favorecer de otro modo la migracion y/o proliferacion de dicha celula.
15. 15. El complejo proteico aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para su uso en la curacion de heridas o quemaduras en un animal, en el que preferentemente el animal es un ser humano.