ES2609039T3

ES2609039T3 - Nuevas composiciones inmunogénicas para la prevención y tratamiento de enfermedad meningocócica

Info

Publication number: ES2609039T3
Application number: ES10182364.9T
Authority: ES
Inventors: Gary W. Zlotnick; Leah D. Fletcher; John Farley; Liesel A. Bernfield; Robert J Zagursky; Benjamin J. Metcalf
Original assignee: Wyeth Holdings LLC
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 2001-10-11
Filing date: 2002-10-11
Publication date: 2017-04-18
Anticipated expiration: 2022-10-11
Also published as: EP1442047A4; EP2341063A2; US8101194B2; CA2918207A1; BRPI0212999B8; PT2343308E; CN105617372A; EP2348034B1; FR17C1042I2; DK2371838T3; CN102836426B; CA2849427C; LU92786I2; CA2918207C; EP1442047A2; EP2332961A2; US9757444B2; EP2348035A2; EP2371838B1; ES2603531T3

Abstract

Una composición que comprende: al menos una proteína recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene identidad de secuencia mayor de 95 % con la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 226, 224 y 228.

Description

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SEQ ID NO 53: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa de M98 250732.

SEQ ID NO 54: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250732. SEQ ID NO 55: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa de M98 250771 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 56: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250771 preparada

usando una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 57: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de M98 250771 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 58: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250771 preparada

usando una secuencia líder P4. SEQ ID NO 59: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa de M98 250771.

SEQ ID NO 60: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250771.

SEQ ID NO 61: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa de CDC1135 cuando se combina con una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 62: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1135 preparada usando

una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 63: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de CDC1135 cuando se combina con una secuencia líder P4. SEQ ID NO 64: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1135 preparada usando

una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 65: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa de CDC1135. SEQ ID NO 66: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC 1135. SEQ ID NO 67: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa de M97 252153 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 68: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252153 preparada usando una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 69: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de M97 252153 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 70: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252153 preparada usando una secuencia líder P4. SEQ ID NO 71: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa M97 252153. SEQ ID NO 72: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252153. SEQ ID NO 73: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa CDC1610 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 74: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1610 preparada usando una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 75: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de CDC1610 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 76: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1610 preparada usando una secuencia líder P4. SEQ ID NO 77: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa CDC 1610.

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SEQ ID NO 78: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1610.

SEQ ID NO 79: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC 1492 cuando se combina con una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 80: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1492 preparada usando

una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 81: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de CDC 1492 cuando se combina con una secuencia líder P4. SEQ NO 82: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC 1492 preparada usando

una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 83: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC 1492. SEQ ID NO 84: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1492. SEQ ID NO 85: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa L8 M978 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 86: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa L8 M978 preparada usando una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 87: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de L8 M978 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 88: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa L8 M978 preparada usando una secuencia líder P4. SEQ ID NO 89: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa L8 M978. SEQ ID NO 90: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa L8 M978. SEQ ID NO 91: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa M97 252988 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 92: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252988 preparada usando una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 93: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de M97 252988 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 94: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252988 preparada usando una secuencia líder P4. SEQ ID NO 95: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa M97 252988. SEQ ID NO 96: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252988. SEQ ID NO 97: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa M97 252697 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 98: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252697 preparada usando una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 99: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de M97 252697 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 100: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252697 preparada usando una secuencia líder P4. SEQ ID NO 101: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa M97 252697. SEQ ID NO 102: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252697.

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SEQ ID NO 103: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa 6557 cuando se combina con una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 104: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 6557 preparada usando una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 105: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de 6557 cuando se combina con una secuencia líder P4. SEQ ID NO 106: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 6557 preparada usando una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 107: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 6557.

SEQ ID NO 108: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 6557. SEQ ID NO 109: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 2996 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 110: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 2996 preparada usando

una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 111: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de 2996 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 112: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 2996 preparada usando

una secuencia líder P4. SEQ ID NO 113: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 2996.

SEQ ID NO 114: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 2996.

SEQ ID NO 115: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252976 cuando se combina con una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 116: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252976 preparada

usando una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 117: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la proteína 2086 madura de M97 252976 cuando se combina con una secuencia líder P4. SEQ ID NO: 118: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252976 preparada

usando una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 119: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252976. SEQ ID NO 120: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252976. SEQ ID NO 121: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa M97 251854 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 122: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 251854 preparada usando una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 123: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de M97 251854 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 124: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 251854 preparada usando una secuencia líder P4. SEQ ID NO 125: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa M97 251854. SEQ NO 126: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 251854. SEQ ID NO 127: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa CDC1521 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

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SEQ NO 128: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC 1521 preparada usando

una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 129: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de CDC1521 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 130: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC 1521 preparada

usando una secuencia líder P4. SEQ ID NO 131: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1521.

SEQ ID NO: 132: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC 1521.

SEQ NO 133: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250622 cuando se combina con una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 134: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250622 preparada

usando una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 135: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de M98 250622 cuando se combina con una secuencia líder P4. SEQ NO 136: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250622 preparada

usando una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 137: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250622. SEQ ID NO 138: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250622. SEQ ID NO 139: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa 870446 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ NO 140: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 870446 preparada usando una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 141: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de 870446 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 142: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 870446 preparada usando una secuencia líder P4. SEQ ID NO 143: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa 870446. SEQ ID NO 144: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 870446. SEQ ID NO 145: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa M97 253248 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 146: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 253248 preparada usando una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 147: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de M97 253248 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 148: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 253248 preparada usando una secuencia líder P4. SEQ ID NO 149: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa M97 253248. SEQ ID NO 150: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 253248. SEQ NO 151: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa M98 250809 cuando se combina con una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 152: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250809 preparada usando una secuencia líder nativa.

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SEQ ID NO 177: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de A4 Sanford; M97 251836 PARTE; M97 251957; M97 251985; M97 252060; M97 251870; M97 251994; M98 250024; M97 251905; M97 251876; M97 251898; o M97 251830 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 178: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa A4 Sanford; M97 251836 PARTE; M97 251957; M97 251985; M97 252060; M97 251870; M97 251994; M98 250024; M97 251905; M97 251876; M97 251898; o M97 251830 preparada usando una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 179: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa A4 Sanford; M97 251836 PARTE; M97 251957; M97 251985; M97 252060; M97 251870; M97 251994; M98 250024; M97 251905; M97 251876; M97 251898; o M97 251830.

SEQ ID NO 180: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa A4 Sanford; M97 251836 PARTE; M97 251957; M97 251985; M97 252060; M97 251870; M97 251994; M98 250024; M97 251905; M97 251876; M97 251898; o M97 251830.

SEQ ID NO 181: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos parcial para la proteína 2086 madura de la cepa CDC937 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 182: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC937 preparada usando una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 183: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos parcial para la proteína 2086 madura de CDC937 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 184: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC937 preparada usando una secuencia líder P4.

SEQ NO 185: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos parcial para la proteína 2086 madura de la cepa CDC937.

SEQ ID NO 186: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC937.

SEQ ID NO 187: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos parcial para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252097 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 188: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252097 preparada usando una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 189: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos parcial para la proteína 2086 madura de M97 252097 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 190: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252097 preparada usando una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 191: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos parcial para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252097.

SEQ ID NO 192: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252097.

SEQ ID NO 193: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 870227 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 194: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 870227 preparada usando una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 195: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de 870227 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 196: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 870227 preparada usando una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 197: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 870227.

SEQ ID NO 198: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 870227.

SEQ ID NO 199: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa H355 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

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SEQ ID NO 200: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa H355 preparada usando

una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 201: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de H355 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 202: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa H355 preparada usando

una secuencia líder P4. SEQ ID NO 203: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa H355.

SEQ ID NO 204: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa H355.

SEQ ID NO 205: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa H44_76 cuando se combina con una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 206: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa H44_76 preparada usando

una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 207: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa H44_76 preparada usando una secuencia líder P4. SEQ ID NO 208: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa H44_76.

SEQ ID NO 209: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de H44_76 cuando se combina con una secuencia líder P4. SEQ ID NO: 210: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 de la cepa H44_76. SEQ ID NO 211: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa 8529 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 212: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 8529 preparada usando una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 213: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de 8529 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 214: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 8529 preparada usando una secuencia líder P4. SEQ ID NO 215: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa 8529. SEQ ID NO: 216: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 8529. SEQ ID NO 217: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa 6940 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 218: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 6940 preparada usando una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 219: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de 6940 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 220: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 6940 preparada usando una secuencia líder P4. SEQ ID NO 221: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa 6940. SEQ NO 222: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 6940. SEQ ID NO 223: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa M982 cuando se combina con una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 224: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M982 preparada usando una secuencia líder nativa.

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SEQ ID NO 225: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de M982 cuando se combina con una secuencia líder P4. SEQ ID NO 226: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M982 preparada usando una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 227: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M982.

SEQ ID NO 228: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M982. SEQ ID NO 229: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 880049 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 230: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 880049 preparada usando

una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 231: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de 880049 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 232: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 880049 preparada usando

una secuencia líder P4. SEQ ID NO 233: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 880049.

SEQ ID NO 234: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 880049. SEQ ID NO 235: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de las cepas M97 253524, M97 251885 y M97 251926 cuando se combina con una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 236: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de las cepas M97 253524, M97

251885 y M97 251926 preparada usando una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 237: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de las cepas M97 253524, M97 251885 y M97 251926 cuando se combina con una secuencia líder P4. SEQ ID NO 238: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de las cepas M97 253524, M97

251885 y M97 251926 preparada usando una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 239: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa las cepas M97 253524, M97 251885 y M97 251926. SEQ ID NO 240: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de las cepas M97 253524, M97

251885 y M97 251926.

SEQ ID NO 241: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250670 cuando se combina con una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 242: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250670 preparada

usando una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 243: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de M98 250670 cuando se combina con una secuencia líder P4. SEQ ID NO 244: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250670 preparada

usando una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 245: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250670. SEQ ID NO 246: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250670. SEQ ID NO 247: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa CDC1573 cuando se combina con una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 248: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1573 preparada usando una secuencia líder nativa.

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SEQ ID NO 249: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de CDC1573 cuando se combina con una secuencia líder P4. SEQ ID NO 250: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC 1573 preparada usando una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 251: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC 1573.

SEQ ID NO 252: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1573. SEQ ID NO 253: secuencia de ácido nucleico parcial que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 de una cepa de Neisseria lactamica.

SEQ ID NO 254 a 259: secuencias de aminoácidos asociadas con las proteínas de la familia de proteínas 2086. SEQ ID NO 260 a 278: secuencias de aminoácidos asociadas con las proteínas de la Subfamilia A de 2086. SEQ ID NO 279 a 299: secuencias de aminoácidos asociadas con las proteínas de la Subfamilia B de 2086. SEQ ID NO 300: es la secuencia consenso de aminoácidos correspondiente a la familia de proteínas 2086

(“proteínas 2086”) de acuerdo con una realización de la presente invención.

SEQ ID NO 301: es la secuencia consenso de aminoácidos correspondiente a la Subfamilia A de proteínas 2086 de acuerdo con una realización de la presente invención. SEQ ID NO 302: es la secuencia consenso de aminoácidos correspondiente a la Subfamilia B de proteínas 2086

de acuerdo con una realización de la presente invención.

SEQ ID NO 303: secuencia de ácido nucleico para un cebador inverso con un sitio de restricción BamHI (Compuesto Nº 4623). SEQ ID NO 304: secuencia de ácido nucleico para un cebador directo con un sitio de restricción NdeI

(Compuesto Nº 4624). SEQ ID NO 305: secuencia de ácido nucleico para un cebador directo (Compuesto Nº 4625). SEQ ID NO 306: secuencia de ácido nucleico para un cebador directo (Compuesto Nº 5005). SEQ ID NO 307: secuencia de ácido nucleico para un cebador inverso (Compuesto Nº 5007). SEQ ID NO 308: secuencia de ácido nucleico para un cebador inverso con un sitio de restricción BglII

(Compuesto Nº 5135).

SEQ ID NO 309: secuencia de ácido nucleico para un cebador directo con un sitio de restricción BamHI (Compuesto Nº 5658). SEQ ID NO 310: secuencia de ácido nucleico para un cebador inverso con un sitio de restricción SphI

(Compuesto Nº 5660).

SEQ ID NO 311: secuencia de ácido nucleico para un cebador directo con un sitio de restricción BamHI (Compuesto Nº 6385). SEQ NO 312: secuencia de ácido nucleico para un cebador directo con sitios de restricción BamHI y NdeI

(Compuesto Nº 6406). SEQ ID NO 313: secuencia de ácido nucleico para un cebador directo (Compuesto Nº 6470). SEQ ID NO 314: secuencia de ácido nucleico para un cebador inverso (Compuesto Nº 6472). SEQ ID NO 315: secuencia de ácido nucleico para un cebador directo con un sitio de restricción BamHI

(Compuesto Nº 6473).

SEQ ID NO 316: secuencia de ácido nucleico para un cebador directo con sitios de restricción BglII y NdeI (Compuesto Nº 6474). SEQ ID NO 317: secuencia de ácido nucleico para un cebador directo (Compuesto Nº 6495). SEQ ID NO 318: secuencia de ácido nucleico para un cebador inverso (Compuesto Nº 6496). SEQ ID NO 319: secuencia de ácido nucleico para un cebador inverso con un sitio de restricción SphI

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(Compuesto Nº 6543).

SEQ ID NO 320: secuencia de ácido nucleico para un cebador inverso con un sitio de restricción BglII (Compuesto Nº 6605).

SEQ ID NO 321: secuencia de ácido nucleico para un cebador directo con sitios de restricción BglII y NdeI (Compuesto Nº 6721).

SEQ NO 322: secuencia de ácido nucleico para la secuencia líder P4.

SEQ ID NO 323: secuencia de ácido nucleico para la variante de líder 2086 nativa 1.

SEQ ID NO 324: secuencia de ácido nucleico para la variante de líder 2086 nativa 2.

SEQ ID NO 325: secuencia de ácido nucleico para la variante de líder 2086 nativa 3.

SEQ ID NO 326: secuencia de ácido nucleico para la variante de líder 2086 nativa 4.

SEQ ID NO 327: es la secuencia de aminoácidos de P4431.

SEQ ID NO 328: es la secuencia de aminoácidos de P5136.

SEQ ID NO 329: es una secuencia de aminoácidos de acuerdo con una realización de la presente invención.

Descripción detallada de la invención

Una nueva clase de antígenos con actividad bactericida con funcionalidad cruzada con el serogrupo B de Neisseria meningitidis evitaría la necesidad de un enfoque de PorA multivalente para la inmunización contra la infección. Dicho antígeno se ha identificado inesperadamente y se describe y reivindica en el presente documento. La presencia de dicho antígeno se observó por primera vez en una mezcla compleja de proteínas de membrana externa solubles (sOMP) de una cepa meningocócica. La actividad bactericida de este antígeno se siguió mediante una serie de etapas de fraccionamiento y purificación de proteínas hasta que la mezcla de proteínas de interés contenía solamente algunas proteínas. Las proteínas principales de esta mezcla se identificaron por secuenciación de aminoácidos N terminal y mapeo de péptidos. La proteína de interés que mostraba actividad bactericida se identificó como proteína ORF2086, una proteína lipidada (también denominada más específicamente LP2086). La “proteína ORF2086” se refiere a una proteína codificada por la fase abierta lectura 2086 (ORF2086) de una especie de

Neisseria.

Como se describe en el presente documento, se han identificado nuevos candidatos a composición inmunogénica basándose en la proteína ORF2086 de una especie de Neisseria (también denominada “proteína 2086” o proteína “ORF2086” usados de forma intercambiable en el presente documento, o P2086 para las proteínas no lipidadas y LP2086 para versión lipidada de las proteínas) aisladas de N. meningitidis combinando fraccionamiento celular, la extracción de detergente diferencial, la purificación de proteínas con la preparación de antisueros, y un ensayo de actividad bactericida utilizando múltiples cepas. Como alternativa a las composiciones inmunogénicas potenciales y diagnósticos desvelados en las referencias citadas anteriormente, la presente divulgación se refiere a composiciones y procedimientos para tratar y/o prevenir la infección meningocócica mediante el uso de proteínas, partes inmunogénicas de las mismas y equivalentes biológicos de las mismas, así como genes que codifican dichos polipéptidos, partes equivalentes, anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a las mismas.

De acuerdo con una realización de la presente invención, se identificaron inesperadamente agentes inmunogénicos basados en una proteína 2086 como se define en las reivindicaciones adjuntas, incluyendo polipéptidos aislados, como candidatos inmunogénicos basándose en la capacidad de dichos agentes para mostrar reactividad cruzada o ausencia de especificidad de cepa. En particular, se identificaron candidatos que demostraron inesperadamente la capacidad de (1) inducir anticuerpos bactericidas para múltiples cepas de Neisseria y/o gonocócicas; (2) reaccionar con la superficie de múltiples cepas; (3) conferir protección pasiva contra una exposición en vivo; y/o (4) evitar la colonización. En consecuencia, la presente invención proporciona composiciones inmunogénicas que comprenden dichos agentes inmunogénicos, incluyendo polipéptidos aislados, y/o equivalentes biológicos de los mismos, así como procedimientos para usarlos contra la infección por N. meningitidis. (Véase, Ejemplo 1 en el presente documento para la metodología usada en la identificación de la proteína 2086).

Como se usa en el presente documento, la expresión “no específico de cepa” se refiere a la característica de un antígeno para inducir una respuesta inmunitaria eficaz contra más de una cepa de N. meningitidis, (por ejemplo, cepas meningocócicas heterólogas). La expresión de “reactividad cruzada” como se usa en el presente documento se usa de forma intercambiable con la expresión “no específico de cepa”. La expresión “antígeno de N. meningitidis no específico de cepa inmunogénico” como se usa en el presente documento, describe un antígeno que puede aislarse de N. meningitidis, aunque también puede aislarse de otra bacteria (por ejemplo, otras cepas de Neisseria, tales como cepas gonocócicas, por ejemplo), o prepararse usando tecnología recombinante.

Las proteínas 2086 de la presente invención incluyen proteínas lipidadas y no lipidadas. Además, la presente

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Proteínas, partes inmunogénicas y equivalentes biológicos

Las proteínas 2086 proporcionadas por la presente invención son proteínas aisladas. El término “aislado” significa alterado por la mando del hombre del estado natural. Si una composición o sustancia “aislada” aparece en la naturaleza, se ha cambiado o retirado de su ambiente original, o ambas. Por ejemplo, un polipéptido o un polinucleótido presente de forma natural en un animal vivo no está “aislado”, pero el mismo polipéptido o polinucleótido separado de los materiales coexistentes de su estado natural está “aislado”, como se emplea el término en el presente documento. En consecuencia, como se usa en el presente documento, la expresión “proteína aislada” abarca proteínas aisladas de una fuerte natural y proteínas preparadas usando tecnología recombinante, así como dichas proteínas cuando se combinan con otros antígenos y/o aditivos, tales como vehículos, tampones, adyuvantes, etc. farmacéuticamente aceptables, por ejemplo.

Una proteína 2086, parte inmunogénica de la misma y/o un equivalente biológico de la misma, desvelada en el presente documento comprende cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos:

ADIGxGLADA (SEQ ID NO: 254), en la que x es cualquier aminoácido;

IGxGLADALT (SEQ ID NO: 255), en la que x es cualquier aminoácido;

SLNTGKLKND (SEQ ID NO: 256);

SLNTGKLKNDKxSRFDF (SEQ ID NO: 257, en la que x es cualquier aminoácido);

SGEFQxYKQ (SEQ ID NO: 258), en la que x es cualquier aminoácido; o

IEHLKxPE (SEQ ID NO: 259), en la que x es cualquier aminoácido. Una proteína de Subfamilia A de 2086, parte inmunogénica de la misma y/o un equivalente biológico de la misma, comprende cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos, desveladas en el presente documento:

GGGVAADIGx (SEQ ID NO: 260), en la que x es cualquier aminoácido;

SGEFQIYKQ (SEQ ID NO: 261);

HSAVVALQIE (SEQ ID NO: 262);

EKINNPDKID (SEQ ID NO: 263);

SLINQRSFLV (SEQ ID NO: 264);

SGLGGEHTAF (SEQ ID NO: 265);

GEHTAFNQLP (SEQ ID NO: 266);

SFLVSGLGGEH (SEQ ID NO: 267);

EKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLP (SEQ ID NO: 268);

GKAEYHGKAF (SEQ ID NO: 269);

YHGKAFSSDD (SEQ ID NO: 270);

GKAEYHGKAFSSDD (SEQ ID NO: 271);

IEHLKTPEQN (SEQ ID NO: 272);

KTPEQNVELA (SEQ ID NO: 273);

IEHLKTPEQNVELA (SEQ ID NO: 274);

AELKADEKSH (SEQ ID NO: 275);

AVILGDTRYG (SEQ ID NO: 276);

AELKADEKSHAVILGDTRYG (SEQ ID NO: 277); o

EEKGTYHLAL (SEQ ID NO: 278). Una proteína de Subfamilia B de 2086, parte inmunogénica de la misma y/o equivalente biológico de la misma, comprende cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos, desveladas en el presente documento:

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LITLESGEFQ (SEQ ID NO: 279);

SALTALQTEQ (SEQ ID NO: 280);

FQVYKQSHSA (SEQ ID NO: 281);

LITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQ (SEQ ID NO: 282);

IGDIAGEHTS (SEQ ID NO: 283);

EHTSFDKLPK (SEQ ID NO: 284);

IGDIAGEHTSFDKLPK (SEQ ID NO: 285);

ATYRGTAFGS (SEQ ID NO: 286);

DDAGGKLTYT (SEQ ID NO: 287);

IDFAAKQGHG (SEQ ID NO: 288);

KIEHLKSPEL (SEQ ID NO: 289);

ATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNV (SEQ ID NO: 290);

HAVISGSVLY (SEQ ID NO: 291);

KGSYSLGIFG (SEQ ID NO: 292);

VLYNQDEKGS (SEQ ID NO: 293);

HAVISGSVLYNQDEKGSYSLGIFG (SEQ ID NO: 294);

AQEVAGSAEV (SEQ ID NO: 295);

IHHIGLAAKQ (SEQ ID NO: 296);

VETANGIHHI (SEQ ID NO: 297);

AQEVAGSAEVETANGIHHIGLAAKQ (SEQ ID NO: 298); o

VAGSAEVETANGIHHIGLAAKQ (SEQ ID NO: 299). La proteína 2086 comprende la siguiente secuencia consenso y/o partes inmunogénicas de la misma desveladas en el presente documento. Secuencia Consenso de Proteína 2086 (SEQ ID NO: 300):

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En la secuencia consenso anterior, la “x” representa cualquier aminoácido, la región de la posición del aminoácido 5 a la posición de aminoácido 9 es cualquiera de 0 a 5 aminoácidos, la región de la posición de aminoácido 67 a la posición de aminoácido 69 es cualquiera de 0 a 3 aminoácidos, y la posición del aminoácido 156 es cualquiera de 0 a 1 aminoácidos. La región de la posición del aminoácido 5 a la posición de aminoácido 9 preferentemente comprende 0, 4 o 5 aminoácidos. La región de la posición de aminoácido 67 a la posición de aminoácido 69 preferentemente comprende 0 o 3 aminoácidos. Debería observarse particularmente que esta secuencia consenso ilustra la alta variabilidad de las proteínas 2086. Como teoría, sin pretender quedado ligado a la misma, se cree que esta alta variabilidad proporciona la reactividad cruzada ventajosa e inesperada.

De acuerdo con una implementación de la presente invención, las proteínas 2086 se caracterizan como inmunogénicas, no patógenas y no específicas de cepa. Estas proteínas muestran inesperadamente inmunogenicidad mientras que son de aproximadamente el 2 % a aproximadamente el 40 % no conservadas.

Como se usa en el presente documento, la expresión “no conservada” se refiere al número de aminoácidos que pueden experimentar inserciones, sustituciones y/o deleciones como un porcentaje del número total de aminoácidos

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(continuación)

Condición de rigurosidad: Híbrido polinucleotídico Longitud del híbrido (pb)I Temperatura de hibridación y tampónH Temperatura de lavado y tampónH

F: ARN: ARN < 50 TF; SSC1x Tf; SSC1x

G: ADN:ADN > 50 65EC; SSC4x -o42EC; SSC4x, formamida al 50 % 65EC; SSC1x

H: ADN:ADN < 50 TH; 4xSSC TH; SSC4x

I: ADN:ARN > 50 67EC; SSC4x -o45EC; SSC4x, formamida al 50 % 67EC; SSC1x

J: ADN:ARN < 50 TJ; SSC4x TJ; SSC4x

K: ARN: ARN > 50 70EC; SSC4x -o50EC; SSC4x, formamida al 50 % 67EC; SSC1x

L: ARN: ARN < 50 TL; 2xSSC TL; SSC2x

M: ADN:ADN > 50 50EC; SSC4x -o40EC; SSC6x, formamida al 50 % 50EC; SSC2x

N: ADN:ADN <50 TN; SSC6x TN; SSC6x

O: ADN:ARN > 50 55EC; SSC4x -o42EC; SSC6x, formamida al 50 % 55EC; SSC2x

P: ADN:ARN < 50 TP; SSC6x TP; SSC6x

Q: ARN: ARN > 50 60EC; SSC4x -o-45EC; SSC6x, formamida al 50 % 60EC; SSC2x

R: ARN: ARN < 50 TR; SSC4x TR; SSC4x

pbI: La longitud del híbrido es la anticipada para la región o regiones hibridadas de los polinucléotidos que hibridan. Cuando se hibrida un polinucleótido con un polinucleótido diana de secuencia desconocida, se supone que la longitud del híbrido es la del polinucleótido que hibrida. Cuando se hibridan polinucleótidos de secuencia conocida, la longitud del híbrido puede determinarse alineando las secuencias de los polinucleótidos e identificando la región o las regiones de complementariedades de secuencia óptimas.

tampónH: SSPE (SSPE1x es NaCl 0,15 M, NaH2PO4 10 mM y EDTA 1,25 mM, pH 7,4) puede sustituir a SSC (SSC1x es NaCl 15 M y citrato sódico 15 M) en los tampones de hibridación y lavado; se realizan lavados durante 15 minutos después de completarse la hibridación.

TB hasta TR: La temperatura de hibridación para híbridos que se anticipa que son de menos de 50 pares de bases de longitud debería ser de 5-10EC menos que la temperatura de fusión (Tm) del híbrido, cuando Tm se determina de acuerdo con las siguientes ecuaciones. Para híbridos de menos de 18 pares de bases de longitud, Tm(EC) = 2(nº de bases A + T) + 4(nº de bases G +C). Para híbridos entre 18 y 49 pares de bases de longitud, Tm(EC) = 81,5 + 16,6 (log10[Na+]) + 0,41(% G+C) – (600/N), en la que N es el número de bases en el híbrido, y [Na+] es la concentración de iones de sodio en el tampón de hibridación ([Na+]) para SSC1x = 0,165 M).

Se proporcionan ejemplos adicionales de condiciones de rigurosidad para la hibridación de polinucleótidos en Sambrook, J., E.F. Fritsch, y T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, capítulos 9 y 11, y Current Protocols in Molecular Biology, 1995, F.M. Ausubel y col., eds., John Wiley & Sons, Inc., secciones 2.10 y 6.3-6.4.

También se desvelan en el presente documento polinucleótidos que son completamente complementarios de estos polinucleótidos que también proporcionan secuencias antisentido.

Los polinucleótidos de la invención se preparan de muchas maneras (por ejemplo, por síntesis química, de bibliotecas de ADN, del organismo en sí mismo) y pueden tomar diversas formas (por ejemplo, monocatenarias, bicatenarias, vectores, sondas, cebadores). El término “polinucleótido” incluye ADN y ARN y también sus análogos, tales como los que contienen cadenas principales modificadas.

Proteínas de fusión

También se desvelan en el presente documento proteínas de fusión. Una “proteína de fusión” se refiere a una proteína codificada por dos genes fusionados, con frecuencia no relacionados, o fragmentos de los mismos. Por ejemplo, proteínas de fusión que comprenden diversas partes de región constante de moléculas de inmunoglobulina junto con otra proteína inmunogénica o parte de la misma. En muchos casos, el empleo de una región Fc de inmunoglobulina como parte de una proteína de fusión es ventajoso para su uso en terapia y diagnóstico dando como resultado, por ejemplo, propiedades farmacocinéticas mejoradas (véase, por ejemplo, documento EP 0 232 262 A1). Por otro lado, para algunos usos sería deseable poder suprimir la parte Fc después de que la proteína de fusión se haya expresado, detectado y purificado. Los polinucleótidos 2086 de la invención se usan para la producción recombinante de polipéptidos de la presente invención, el polinucleótido puede incluir la secuencia

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Purificación parcial de fracciones de proteínas de membrana externa de meningococos que inducen anticuerpos bactericidas heterólogos:

Se suspendieron 100 g de peso húmedo de las células, hasta un volumen cinco veces el peso húmedo, con HEPES-NaOH 10 mM, pH 7,4, Na2EDTA 1 mM y se lisaron por pase a través de un microfluidificador 110Y equipado con 5 una cámara a 124,07 Mpa. El lisado celular se clasificó y la envoltura celular se aisló por centrifugación a 300.000 x g durante 1 hora a 10 ºC. Las envolturas celulares se lavaron 2X con el mismo tampón por suspensión con un homogeneizador seguido de centrifugación como anteriormente. Las envolturas celulares se extrajeron después con 320 ml de Triton X-100 1 % (p/v) en HEPES-NaOH 10 mM, pH 7,4, MgCl2 1 mM. En referencia a la Tabla III posterior, los resultados de la extracción con detergente diferencial secuencial usando Triton X-100 y Zwittergent 310 14 seguido de inmunización de ratones, permitió a los inventores determinar que los extractos de Triton extraían óptimamente el candidato o los candidatos de interés. Este extracto de Triton X-100, que inducía respuestas de anticuerpos bactericidas contra 4 de las cinco cepas enumeradas en la tabla III, se fraccionó después por isoelectroenfoque preparatorio (IEF) en una unidad BioRad Rotophor. Las concentraciones de anfolito fueron del 1 %, pH 3-10, mezclado con 1 %, pH 4-6. Como se muestra en la Tabla III, se ha descubierto que varias fracciones 15 inducen una respuesta bactericida heteróloga. Las fracciones obtenidas de IEF, que se centraron en el intervalo de pH 5,5-7,0, indujeron una respuesta heteróloga a la mayoría de las cepas como se determina por el ensayo bactericida. Las fracciones de IEF agrupadas se concentraron y se retiraron los anfolitos por precipitación con etanol. Se consiguió una purificación adicional adsorbiendo algunas de las proteínas obtenidas en el intervalo de pH de aproximadamente 5,5-7,8 en una columna de intercambio aniónico y comparando la actividad bactericida

20 obtenida de inmunizar a los ratones con las proteínas adsorbidas y no adsorbidas. En referencia de nuevo a la Tabla II, aunque muchas proteínas se adsorbieron en la resina de intercambio aniónico, las proteínas que no se adsorbieron por la columna indujeron más anticuerpos bactericidas heterólogos.

TABLA III

CB50 de la cepa diana

Procedimiento: Fracción H44/76 880049 H355 539* M982

sOMP sin LOS: 1.000 215 450 NC 50

Detergente Extracciones: Extracto citoplasmático 200 NT NT NT NT

TX-100: >800 >800 >800 >800 <25

Zwittergent 3-12: 400 >25 100 400 <25

Zwittergent 3-14: <25 NT NT NT NT

Zw.3-14 + NaCl: <25 NT NT NT NT

Sarcosilo: <25 NT NT NT NT

Zw.3-14 + calor: <25 NT NT NT NT

IEF Preparatorio: Fracciones 1-3 (pH 2,3-3,9) 50 NT NT NT NT

Fracción 4 (pH 4,1): >800 <25 100 <25 NT

Fracción 5 (pH 4,3): >800 <25 100 200 NT

Fracción 6 (pH 4,5): 400 NT NT NT NT

Fracción 7 (pH 4,8): <25 NT NT NT NT

Fracciones 8-9 (pH 5,0-5,3): <25 NT NT NT NT

Fracciones 10-17 (pH 5,5-7,8): >800 200 <800 <800 NT

Intercambio aniónico: Adsorbida 400 NT 100 100 NT

No adsorbida: >6.400 NT <800 <800 NT

NT: no ensayado *El aislado clínico 539 es una cepa homóloga de 8529, aislada del mismo brote

25 Como se muestra en la FIG. 1A, estaban presentes dos proteínas principales en la fracción no adsorbida como se 34

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completa con la secuencia señal de lipoproteína intacta y se basaron en un análisis de la secuencia de Sanger para

N. meningitidis A ORF 2086, (cebador 5’ CT ATT CTG CAT ATG ACT AGG AGC y cebador 3’ -GCGC GGATCC TTA CTG CTT GGC GGC AAG ACC), que son SEQ ID NO 304 (Compuesto Nº 4624) y SEQ ID NO 303 (Compuesto Nº 4623), respectivamente (véase también Tabla IV en el presente documento). El gen 2086 gene se

5 amplificó por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) [termociclador ABI 2400, Applied Biosystems, Foster City, CA] de la cepa N. meningitidis 8529. El producto amplificado de tamaño correcto se ligó y clonó en pCR2.1-TOPO (Invitrogen). El ADN plasmídico se digirió por restricción con Ndel y BamHI, se purificó en gel y se ligó en el vector pET-27b(+) (Novagen).

Se sintetizaron cebadores oligonucleotídicos descritos en el presente documento en un sintetizador de

10 oligonucleótidos PerSeptive Biosystems, Applied Biosystems, Foster City CA, usando química de cianoetilfosforamidita, Applied Biosystems, Foster City CA. Los cebadores usados para amplificación por PCR de las familias génicas de ORF 2086 se enumeran en la Tabla IV, que muestra ejemplos no limitantes de cebadores de la presente invención.

TABLA IV: CEBADORES

SEQ ID NO. (CompuestoNº): Cebado r Secuencia Sitios de restricción

303 (4623): Inverso BamHI

304 (4624): Directo CTATTCTGCATATGACTAGGAGC NdeI

305 (4625): Directo AGCAGCGGAGGCGGCGGTGTC

306 (5005): Directo TGCCGATGCACTAACCGCACC

307 (5007): Inverso CGTTTCGCAACCATCTTCCCG

308 (5135): Inverso BglII

309 (5658): Directo GCGGATCCAGCGGAGGGGGTGGTGTCGCC BamHI

310 (5660): Inverso SphI

311 (6385): Directo GCGGATCCAGCGGAGGCGGCGGAAGC BamHI

312 (6406): Directo BglII y NdeI

313 (6470): Directo CTATTCTGCGTATGACTAG

314 (6472): Inverso GTCCGAACGGTAAATTATCGTG

315 (6473): Directo GCGGATCCAGCGGAGGCGGCGGTGTCGCC BamHI

316 (6474): Directo BglII y NdeI

317 (6495): Directo GACAGCCTGATAAACC

318 (6496): Inverso GATGCCGATTTCGTGAACC

319 (6543): Inverso GCGCATGCCTACTGTTTGCCGGCGATG SphI

320 (6605): Inverso BglII

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resultado negativo previamente por exploración por PCR de 2086. Todas las cepas de N. meningitidis disponibles (n=88) se exploraron por PCR con estos cebadores 2086 internos de nueva identificación (identificados por los números de compuestos 6495 y 6496; SEQ ID NO: 159 y 160, respectivamente). Solamente el 30 % de las cepas

N. meningitidis que habían dado resultado negativo previamente por PCR para 2086 fueron positivas para PCR en

5 esta exploración. El conjunto de genes amplificados a partir de las cepas previamente negativas para PCR (30 %) debería representar un nuevo tipo de gen 2086 o una segunda familia de genes 2086 y se designan en el presente documento Subfamilia A 2086. El conjunto de genes 2086 amplificados a partir del 70 % de las cepas con los cebadores derivados de 8529 se designa en el presente documento Subfamilia B.

La Subfamilia A de los genes 2086 se ejemplifica por la SEQ ID NO: 1-173 de números impares sin limitación. La 10 Subfamilia B de los genes 2086 se ejemplifica, sin limitación, por las SEQ ID NO: 175-251 de números impares.

Las cepas de N. meningitidis usadas para estudios de amplificación por PCR se seleccionaron a partir de las siguientes tablas, Tabla VI-A y Tabla VI-B. Las cepas enumeradas en las tablas se proporcionan como ejemplos de cepas de N. meningitidis, sin limitación. Las cepas enumeradas en la Tabla VI-A se clasifican en la Subfamilia A de proteína 2086 y las cepas enumeradas en la Tabla VI-B se clasifican en la Subfamilia B de proteína 2086. Las cepas

15 enumeradas en cada tabla se agrupan por serosubtipo. Las cepas están disponibles de las siguientes cuatro fuentes como se indica en la tabla: MPHL-Manchester Public Health Laboratory, Manchester, Reino Unido; RIVM, Bilthoven, Países Bajos; University of Iowa, College of Medicine, Department of Microbiology, Iowa City, IA; y Walter Reed Army Institute of Research, Washington, D.C.

TABLA VI-A

Cepa: Serosubtipo Fuente

M97 251854: B:4z, PI:4 MPHL

M98 250622: B:2b, PI:10 MPHL

M98 250572: B:2b, PI:10 MPHL

M98 250771: B:4z, PI.22,14 MPHL

M98 250732: B:4z, PI.22,14a MPHL

M98 250809: B:15, PI:7,16 MPHL

M97 252697: B:1, PI:6, P1.18,25 MPHL

M97 252988: B:4, PI:6, P1.18,25,6 MPHL

M97 252976: B:4, PI:6, P1.18,25 MPHL

M97 252153: B:4, PI:6, P1.18,25 MPHL

M97 253248: B:15,PI:7, NT, 16 MPHL

CDC1610: P1:NT 4(15), P1.18-7,16-14 CDC

CDC1521: P1.6,3 2b(4) CDC

CDC1034: P1.7 4(15) CDC

L8: P1.7,1 15(4) Walter Reed

CDC1492: P1.7,1 4(15) CDC

870446: P1.12a,13 RIVM

CDC2369: P1.(9),14 CDC

6557: P1.(9),14, P1.22a,14a RIVM

2996: P1.5,2, P1.5a,2c RIVM

NmB: P1.5,2, P1.5a,2c UIOWA

L3: P1.5,2 Walter Reed

B16B6: P1.5,2 RIVM

CDC1135: CDC

L5: P1.NT, P1.21-6,1 Walter Reed

L4: P1.21,16 Walter Reed

W135: Walter Reed

C11: C:16, P1.7,1 CDC

Y: Walter Reed

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TABLA VI-B

Cepa: Serosubtipo Fuente

M98 250670: B:1, PI:4 MPHL

M98 250024: B:1, PI:4 MPHL

M97 253524: B:1, PI:4 MPHL

M97 252060: B:1, PI:4 MPHL

M97 251870: B:4z, PI:4 MPHL

M97 251836: B:4z, PI:4 MPHL

M97 251830: B:4z, PI:4 MPHL

M97 251905: B:4z, PI:4 MPHL

M97 251898: B:4z, PI:4 MPHL

M97 251885: B:4z, PI:4 MPHL

M97 251876: B:4z, PI:4 MPHL

M97 251994: B:4z, PI:4 MPHL

M97 251985: B:4z, PI:4 MPHL

M97 251957: B:4z, PI:4 MPHL

M97 251926: B:4z, PI:4 MPHL

M97 252045: B:4z, PI:4 MPHL

M97 252038: B:4z, PI:4 MPHL

M97 252026: B:4z, PI:4 MPHL

M97 252010: B:4z, PI:4 MPHL

M97 252098: B:4z, PI:4 MPHL

M97 252083: B:4z, PI:4 MPHL

M97 252078: B:4z, PI:4 MPHL

M98 250735: B:4z, PI:15 MPHL

M98 250797: B:4z, PI:15 MPHL

M98 250768: B:4z, PI:15 MPHL

M98 250716: B:2b, PI:10 MPHL

M98 250699: B:4z,PI:10 MPHL

M98 250393: B:4z,PI:10 MPHL

M98 250173: B:4z,PI:10 MPHL

M97 253462: B:4z, PI:14 MPHL

M98 250762: B:15, PI:7,16 MPHL

M98 250610: B:15, PI:7,16 MPHL

M98 250626: B:15, PI:7,16 MPHL

M97 250571: B:15, PI:16 MPHL

M97 252097: B:15, PI:16, PI.7b,16 MPHL

M97 253092: B:1, PI:6 MPHL

M97 252029: B:15,PI:7, NT MPHL

M97 251875: B:15,PI:7, NT MPHL

CDC1127: PI.7,16 4(15) CDC

CDC982: PI.7,16 4(15) CDC

CDC1359: PI.7,16 4(15) CDC

CDC798: PI.7,16 15(4) CDC

CDC1078: PI.7,16 15(4) CDC

CDC1614: PI.7,16 15(4) CDC

CDC1658: PI.7,16 15(4) CDC

H44/76: PI.7,16 15(4) RIVM

CDC1985: P1.7,13 4(15) CDC

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TABLA XII

Cepa diana: Subfamilia de P2086 Serosubtipo de la cepa diana Homología de A.A.a Título de ELISA de células completasb Título de CB50 c

539: B P1.7-2,3 100 >1.458.000 3.200

H44/76: B P1.7,16 100 >1.458.000 3.200

H355: B P1.19,15 100 >1.458.000 3.200

CDC937: B P1.7-2,3-4 100 >1.458.000 >800

M97252097: B P1.7-2,16 100 >1.458.000 >800

870227: B P1.5-2,10 100 >1.458.000 <25

6940: B P1.18,25,6 97 900.162 >800

M982: B P1.22,9 94 435.909 200

880049: B P1.7-2,4 92 349.912 400

CDC1573: B P1.7-1,1 87 102.508 25

870446: A P1.12-1,13 71 389.829 800

M98250771: A P1.22,14 62 139.397 <25

NmB: A P1.5-1,2-2 71 <2.000 <25

Procedimiento de vacunación: se inmunizaron ratones Swiss-Webster hembra de 6-8 semanas de edad con 10 ug de rLP2086-8529+20 ug de QS-21 en la semana 0 y la semana 4. Se realizaron análisis de datos en el sangrado de 5 exsanguinación de la semana 6.

a Homología de aminoácidos de P2086 en comparación con rLP2086-8529.

b Títulos de puntos finales expresados como el recíproco de la dilución a absorbancia = 0,1

c Títulos de CB50 representados como el recíproco de la dilución de antisuero que reduce el recuento de células viables en 50 %. Los sueros de ratón normal de la semana 0 tuvieron títulos de CB50 de <10

10 La Tabla XIII muestra la inmunogenicidad de un miembro de la Subfamilia B, rLP2086-2996, ensayado frente a cepas homólogas y heterólogas.

TABLA XIII

Cepa diana: Subfamilia de P2086 Serosubtipo de cepa diana Homología de A.A.a Título de ELISA de células completasb Título de CB50 c

NmB: A P1.5-1,2-2 99,6 8.979 <25

870446: A P1.12-1,13 99 <1.458.000 >800

M97 252697: A P1.18,25,6 98 320.732 >800

6557: A P1.22-1,14-1 98 17.319 <25

M98 250732: A P1.22,14-1 89 241.510 >800

M98 250771: A P1.22,14 89 447.867 800

H44/76: B P1.7,16 72 56.386 <25

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TABLA XIX

Variantes de rLP2086 de Subfamilia -Caracterización

rLP2086-8529: rLP2086-M982 rLP2086-80049 rLP2086-CDC1573

Medio de cultivo: Apollon (Sanford) Apollon HySoy HySoy

Solubilidad: Urea 4 M ⇒Z3-12 rTX-100 ⇒Z3-12 rTX-100 ⇒Z3-12 rTX-100

Etapas de purificación: TMAE S Fractogel TMAE S Fractogel TMAE S Fractogel TMAE SEC

Pureza (%): 96 96 90 93

Rendimiento (mg/g de sedimento celular): 0,2 (fermentador) 1,6 (fermentador) 0,4 1,0

Tamaño: SEC (Z3-12) 95.000 110.000 150.000 100.000 120.000

EM: 27.785 (822 lípido) 27.719 (711 lipid) 28.044 (819 lípido) 28.385 (823 lípido)

Punto medio de transición de desnaturalización térmica (TM) ºC: 70 °C 75 °C 62 °C NT

Proteína disponible (mg): Urea – 34 mg Sarc – 36 mg Grupo 1 – 47 mg Grupo 2 – 17 mg 3,6 mg 4,9 mg

Homología de secuencia de 8529 (%): 100 94 92 87

La Tabla XX a continuación proporciona los resultados de ensayos bactericidas en suero fluorescentes para la Subfamilia A de 2086.

TABLA XX

Descripción: 250771 870446 6557 NMB M98 250732 M97 252697

rLP2086-252988, 10 g: >800 (99 %)* >800 (99 %)* <25 - >800 (99 %)* >800 (93 %)*

rLP2086-C11, 10 g: 200 >880 (91 %)* <25 - 200 400

rLP2086-250771, 10 g: >800 (92 %)* >800 (99 %)* <25 - >800 (96 %)* >800 (84 %)*

rLP2086-870446, 10 g: 400 >800 (99 %)* <25 - 400 400

rLP2086-2996, 10 g: 800 >800 (99 %)* <25 - >800 (93 %)* >800 (72 %)*

rLP2086-8529 + rLP2086-2996, 10 g: 800 >800 (99 %)* <25 - >800 (80 %)* >800 (72 %)*

rLP2086-8529 + rP1,22a,14a + rP1,5a,2c, 10 g: - 800 200 >800 (98 %)* - -

rLP2086-8529 +rLP2086-2996 + rP1,22a,14a +rP1,5a,2c, 10 g: 400 >800 (99 %)* 200 >800 (99 %)* 400 >800 (88 %)*

Vesículas de NMB/rLP2086-8529, 20 g: - 100 - 400 - -

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Claims

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