ES2539370T3 - Proceso para separación líquido/sólido de un caldo de fermentación de hidrolizado de biomasa lignocelulósica - Google Patents

Abstract

Un proceso para separar una fracción líquida de un caldo de fermentación de hidrolizado de biomasa lignocelulósica que comprende: a) proporcionar un caldo de fermentación de hidrolizado de biomasa lignocelulósica que comprende un producto diana seleccionado del grupo constituido por etanol, butanol y 1,3-propanodiol; b) opcionalmente, retirar el producto diana del caldo de fermentación de hidrolizado de biomasa lignocelulósica de (a), produciendo un caldo empobrecido; c) tratar térmicamente el caldo de (a) o el caldo empobrecido de (b) a una temperatura y durante un tiempo suficientes para producir un caldo o caldo empobrecido que tiene una resistencia de la torta de filtración reducida al menos aproximadamente un 20% en comparación con el caldo inicial respectivo de (a) o el caldo empobrecido de (b); y d) hacer pasar el caldo tratado o caldo empobrecido de (c) a través de un filtro, separando con ello una fracción líquida de una fracción sólida.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

E11717903

11-06-2015

glicosidasas útiles en el método presente pueden clasificarse por el componente de la biomasa que hidrolizan las mismas. Las glicosidasas útiles para el presente método incluyen glicosidasas hidrolizantes de la celulosa (por ejemplo, celulasas, endoglucanasas, exoglucanasas, celobiohidrolasas, β-glucosidasas), glicosidasas hidrolizantes de hemicelulosa (por ejemplo, xilanasas, endoxilanasas, exoxilanasas, β-xilosidasas, arabinoxilanasas, manasas, 5 galactasas, pectinasas, glucuronidasas), y glicosidasas hidrolizantes del almidón (por ejemplo, amilasas, α-amilasas, β-amilasas, glucoamilasas, α-glucosidasas, isoamilasas). Adicionalmente, puede ser útil añadir otras actividades a la asociación de enzimas de sacarificación tales como peptidasas (EC 3.4.x.y), lipasas (EC 3.1.1.x y 3.1.4.x), ligninasas (EC 1.11.1.x), y feruloil-esterasas (EC 3.1.1.73) para coadyuvar a la liberación de polisacáridos de otros componentes de la biomasa. Es bien conocido en la técnica que los microorganismos que producen enzimas 10 hidrolizantes de polisacáridos exhiben a menudo una actividad, tal como degradación de la celulosa, que es catalizada por varias enzimas o por un grupo de enzimas que tienen especificidades de sustrato diferentes. Así, una "celulasa" de un microorganismo puede comprender un grupo de enzimas, todas las cuales pueden contribuir a la actividad de degradación de la celulosa. Preparaciones comerciales o no comerciales de enzimas, tales como celulasa, pueden comprender numerosas enzimas que dependen del esquema de purificación utilizado para obtener

15 la enzima.

Pueden obtenerse comercialmente enzimas de sacarificación, tales como Spezyme® CP celulasa, Multifect® xilanasa, Accelerase® 1500, y Accellerase® DUET (Danisco U.S. Inc., Genencor International, Rochester, NY). Adicionalmente, las enzimas de sacarificación pueden no ser puras y proporcionarse como un tipo de extracto de células o preparación de células enteras. Las enzimas pueden producirse utilizando microorganismos

20 recombinantes que se han modificado por ingeniería genética para expresar enzimas de sacarificación múltiples.

De particular valor en la presente invención son clases de glicosido-hidrolasas, tales como las familias GH3, GH39, GH43, GH51, GH10, y GH11. Las GHs son un grupo de enzimas que hidrolizan el enlace glicosídico entre dos o más carbohidratos, o entre un carbohidrato y un resto distinto de carbohidrato. Las familias de GHs se han clasificado sobre la base de semejanza de secuencia y están disponibles en la base de datos de enzimas con 25 actividad de carbohidrato CAZy) (Cantarel et al. (2009) Nucleic Acids Res. 37 (edición de la Base de Datos): D233238). Estas enzimas son capaces de actuar sobre cierto número de sustratos y son eficaces en el proceso de sacarificación. La familia de glicosido-hidrolasas 3 ("GH3") tienen varias actividades conocidas: β-glucosidasa (EC: 3.2.1.21); β-xilosidasa (EC: 3.2.1.37); N-acetil-β-glucosaminidasa (EC: 3.2.1.52); glucan-β-1,3-glucosidasa (EC: 3.2.1.58); celodextrinasa (EC: 3.2.1.74); exo-1,3-1,4-glucanasa (EC: 3.2.1); y β-galactosidasa (EC 3.2.1.23). Las 30 enzimas de la familia 39 de Glicosido-hidrolasas ("GH39") tienen actividad de α-L-iduronidasa (EC: 3.2.1.76) o βxilosidasa (EC: 3.2.1.37). Las enzimas de la familia 43 de glicosido-hidrolasas ("GH43") tienen las actividades siguientes: L-α-arabinofuranosidasa (EC 3.2.1.55); β-xilosidasa (EC 3.2.1.37); endoarabinanasa (EC 3.2.1.99); y galactan-1,3-β-galactosidasa (EC 3.2.1.145). Las enzimas de la familia 51 de glicosido-hidrolasas ("GH51") tienen actividad de L-α-arabinofuranosidasa (EC 3.2.1.55) o endoglucanasa (EC 3.2.1.4). La familia 10 de glicosido

35 hidrolasas ("GH10") se describen más detalladamente en Schmidt et al., 1999, Biochemistry 38:2403-2412 y Lo Leggio et al., 2001, FEBS Lett 509: 303-308), y la familia 11 de glicosido-hidrolasas ("GH11") se describen más detalladamente en Hakouvainen et al., 1996, Biochemistry 35:9617-24.

Particularmente útiles en una asociación de enzimas son las glicosil-hidrolasas (GH) Xyn3, Fv3A, Fv51A and Fv43D. Xyn3 (SEQ ID NO:1) es una xilanasa de la familia GH10 de Trichoderma reesei, Fv3A (SEQ ID NO:2) es una enzima

40 de la familia GH3 de Fusarium verticillioides, Fv43D (SEQ ID NO:3) es una enzima de la familia GH43 de Fusarium verticillioides, y Fv51A (SEQ ID NO:4) es una enzima de la familia GH51 de Fusarium verticillioides.

Estas enzimas pueden aislarse de su organismo hospedador natural, o expresarse en un organismo hospedador modificado por ingeniería genética para producción. Por ejemplo, un gen quimérico que contiene un promotor activo en una célula hospedadora de expresión de diana, una secuencia que codifica una GH dada anteriormente, y una 45 señal de terminación se expresa a partir de un vector plasmídico o se integra en el genoma de una célula hospedadora de expresión de diana utilizando métodos estándar conocidos por un experto en la técnica. Una secuencia codificante utilizada puede optimizarse en codones para el hospedador específico utilizado para expresión. Células hospedadoras de expresión utilizadas típicamente incluyen bacterias, tales como Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, Pseudomonas y Streptomyces, levaduras tales como Saccharomyces, 50 Schizosaccharomyces, Candida, Hansenula, Pichia, Kluyveromyces, y Phaffia, y hongos filamentosos tales como Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysoporium, Coprinus, Coriolus, Corynascus, Chaertomium, Cryptococcus, Filobasidium, Fusarium, Gibberella, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Mucor, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Scytaldium, Schizophyllum, Sporotrichum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium,

55 Trametes, y Trichoderma.

Un experto en la técnica conocería el modo de determinar la cantidad eficaz de enzimas a utilizar en una asociación y ajustar las condiciones para actividad enzimática óptima. Un experto en la técnica podría conocer también el modo de optimizar las clases de actividades enzimáticas requeridas en una asociación para obtener la sacarificación óptima de un producto de pretratamiento dado en las condiciones seleccionadas. Un ejemplo de sacarificación se

60 describe en US20070031918 A1.

E11717903

11-06-2015

Antes de la fermentación, la mezcla de sacarificación puede concentrarse por evaporación, por ejemplo, para aumentar la concentración de azúcares fermentables.

Opcionalmente, el líquido en el producto de sacarificación puede separarse de los sólidos en un método por lotes o continuo. Opcionalmente, el líquido o el producto de sacarificación completo pueden esterilizarse antes de la 5 fermentación. Dependiendo del o de los biocatalizadores utilizados durante la fermentación y del pH utilizado durante la sacarificación, el pH puede ajustarse al adecuado para la fermentación.

Un hidrolizado de biomasa lignocelulósica que contiene azucares fermentables se incluye en el medio de fermentación típicamente como un porcentaje del medio, proporcionando la totalidad o una porción de la fuente de carbono para crecimiento del biocatalizador y obtención del producto. El hidrolizado en un medio de fermentación de 10 hidrolizado de biomasa lignocelulósica es al menos aproximadamente 25% del volumen total, y puede ser al menos aproximadamente 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más. Ejemplos del hidrolizado utilizado como 40% u 80% del medio de fermentación se dan en el Ejemplo 9 de US 20070031918 A1. Dependiendo de la concentración de azúcares fermentables en el hidrolizado, pueden añadirse azúcares adicionales al medio. Por ejemplo, cuando un hidrolizado que contiene aproximadamente 80 g/L de 15 glucosa y aproximadamente 50 g/L de xilosa se incluye al 40% del medio de fermentación, pueden añadirse glucosa y xilosa adicionales a las concentraciones finales deseadas de azúcares. Además de hidrolizado, el medio de fermentación puede contener otros nutrientes, sales y factores requeridos para crecimiento y producción por el biocatalizador específico a utilizar para la obtención del producto, como es bien conocido por un experto en la técnica. Los suplementos pueden incluir, por ejemplo, extracto de levadura, aminoácidos específicos, fosfato,

20 fuentes de nitrógeno, sales, y elementos traza. Pueden incluirse también componentes requeridos para la obtención de un producto específico producido por un biocatalizador específico, tales como un antibiótico para mantener un plásmido o un cofactor requerido en una reacción catalizada por enzimas. En los medios de fermentación utilizados en esta memoria, el hidrolizado es el 90% del volumen total.

Alternativamente a la preparación de hidrolizado, la adición del mismo al medio de fermentación, seguido por la

25 realización de la fermentación, puede utilizarse un proceso simultáneo de sacarificación y fermentación (SSF) para producir un caldo de fermentación de hidrolizado de biomasa lignocelulósica. En este proceso, se producen azúcares a partir de la biomasa a medida que los mismos son metabolizados por el biocatalizador de producción.

Fermentación del Biocatalizador y Productos Diana

Los azúcares fermentables en el medio de fermentación de hidrolizado de biomasa lignocelulósica son

30 metabolizados por biocatalizadores adecuados a fin de obtener los productos diana. Los azúcares se ponen en contacto con un biocatalizador en un proceso de fermentación en el que el biocatalizador se deja crecer en condiciones en las que se obtiene un producto diana producido por el biocatalizador. La temperatura y/o el gas del espacio de cabeza pueden ajustarse para la fermentación, dependiendo de las condiciones útiles para el o los biocatalizadores particulares en uso. La fermentación puede ser aerobia o anaerobia. Estas y otras condiciones que

35 incluyen temperatura y pH se ajustan para el biocatalizador particular utilizado.

Típicamente, el biocatalizador se modifica por ingeniería genética a fin de obtener un producto diana, pero el mismo puede obtener naturalmente un producto diana. Productos diana que pueden obtenerse por fermentación utilizando un biocatalizador incluyen, por ejemplo, ácidos, alcoholes, alcanos, alquenos, aromáticos, aldehídos, cetonas, biopolímeros, proteínas, péptidos, aminoácidos, vitaminas, antibióticos, y productos farmacéuticos. Los alcoholes 40 incluyen, pero sin carácter limitante, metanol, etanol, propanol, isopropanol, butanol, etilenglicol, propanodiol, butanodiol, glicerol, eritritol, xilitol, sorbitol, y 1,3-propanodiol. Los ácidos incluyen, pero sin carácter limitante, ácido acético, ácido láctico, ácido propiónico, ácido 3-hidroxipropiónico, ácido butírico, ácido glucónico, ácido itacónico, ácido cítrico, ácido succínico y ácido levulínico. Los aminoácidos incluyen ácido glutámico, ácido aspártico, metionina, lisina, glicina, arginina, treonina, fenilalanina y tirosina. Productos diana adicionales incluyen metano,

45 etileno, acetona y enzimas industriales. Productos particularmente adecuados son etanol y butanol, con inclusión de isobutanol, 2-butanol, y 1-butanol.

La fermentación de azúcares en productos diana puede llevarse a cabo por uno o más biocatalizadores apropiados en fermentaciones de una sola etapa o multietápicas. Los biocatalizadores pueden ser microorganismos seleccionados de bacterias, hongos filamentosos y levaduras. Los biocatalizadores pueden ser microorganismos de

50 tipo salvaje o microorganismos recombinantes, e incluyen, por ejemplo, Escherichia, Zymomonas, Saccharomyces, Candida, Pichia, Streptomyces, Bacillus, Lactobacillus, y Clostridium. En otra realización, los biocatalizadores pueden seleccionarse del grupo constituido por Escherichia coli, Zymomonas mobilis, Bacillus stearo-thermophilus, Saccharomyces cerevisiae, Clostridia thermocellum, Thermoanaerobacterium saccharolyticum, y Pichia stipitis recombinantes.

55 Muchos biocatalizadores utilizados en fermentación para la obtención de productos diana han sido descritos, y otros pueden descubrirse, producirse por mutación, o modificarse genéticamente por medios recombinantes. Cualquier biocatalizador que utiliza azúcares fermentables en un medio de hidrolizado de biomasa lignocelulósica puede utilizarse para obtener uno o más productos diana que se sabe produce(n) el mismo, y producir por tanto un caldo de hidrolizado de biomasa lignocelulósica para procesamiento utilizando el presente proceso. Particularmente útiles

E11717903

11-06-2015

para producción en medio de fermentación de hidrolizado de biomasa lignocelulósica son productos alcohol que pueden utilizarse como combustibles tales como butanol y etanol.

La fermentación de carbohidratos a acetona, butanol y etanol (fermentación ABE) por Clostridia solventotogénica es bien conocida (Jones y Woods (1986) Microbiol. Rev. 50:484-524). Un proceso de fermentación para producción de 5 niveles altos de butanol, produciendo también acetona y etanol, utilizando una cepa mutante de Clostridium acetobutylicum se describe en US 5.192.663. El uso de una cepa mutante de Clostridium beijerinckii para producir niveles elevados de butanol, produciendo también acetona y etanol, se describe en US 6.358.717. La producción de metanol por levadura modificada genéticamente se da a conocer por ejemplo en US 20070092957 A1. Cepas modificadas genéticamente de E. coli han sido utilizadas también como biocatalizadores para producción de etanol

10 (Underwood et al., (2002) Appl. Environ. Microbiol. 68:6263-6272). Se ha producido etanol por Zymomonas modificadas genéticamente en medios de fermentación de hidrolizado de biomasa lignocelulósica (US 20070031918 A1). Cepas modificadas genéticamente de Zymomonas mobilis con producción mejorada de etanol se describen en US 2003/0162271 A1 y US 2009/0246846 A1.

En US 4.504.250 se dan a conocer microorganismos recombinantes que producen 1,3-propanodiol.

15 Cepas recombinantes de E. coli han sido utilizadas como biocatalizadores en fermentación para producir 1,3propanodiol (US 6.013.494, US 6.514.733, y ácido adípico (Niu et al., (2002) Biotechnol. Prog. 18: 201-211).

Para crecer satisfactoriamente y conducir a una producción elevada de producto en un caldo de fermentación de hidrolizado de biomasa lignocelulósica, puede seleccionarse o modificarse por ingeniería genética un biocatalizador a fin de tener mayor tolerancia a los inhibidores presentes en el hidrolizado de biomasa tales como acetato. Por 20 ejemplo, la mejora de la utilización de xilosa y producción de etanol en condiciones estresantes tales como las encontradas en un caldo de fermentación de hidrolizado de biomasa lignocelulósica por Zymomonas se describe en la Publicación de Solicitud de Patente US del mismo propietario y también en tramitación US 20110014670. En dicho documento se da a conocer el crecimiento continuo de células de Zymomonas en un medio que contiene xilosa, acetato, acetato de amonio, y etanol, y el aislamiento de cepas de Zymomonas mejoradas que utilizan xilosa tales

25 como ZW705.

Proceso Para Tratamiento de un Caldo de Fermentación de Hidrolizado de Biomasa Lignocelulósica

En el presente proceso, se aplica un tratamiento térmico a un caldo de fermentación de hidrolizado de biomasa lignocelulósica antes de su filtración para separar corrientes líquida y sólida. El caldo de fermentación de hidrolizado de biomasa lignocelulósica puede tratarse directamente después de la fermentación, o después de un paso de 30 separación de producto. Por ejemplo, el producto diana (etanol o butanol) es producido por un biocatalizador y puede retirarse de un caldo de fermentación de hidrolizado de biomasa lignocelulósica antes del presente tratamiento. El butanol puede retirarse del caldo de fermentación por extracción del medio de fermentación por ejemplo por destilación con arrastre de gas, o utilizando un agente de extracción orgánico inmiscible con el agua y separando la fase orgánica que contiene butanol de la fase acuosa como se da a conocer en WO 2009/149270. En

35 este caso se produce un caldo empobrecido, que es un caldo de fermentación de hidrolizado de biomasa lignocelulósica con producto separado. El etanol puede separarse o retirarse del caldo de fermentación por destilación, típicamente utilizando una columna de cerveza. En este caso se produce una corriente de hez total a partir de la destilación del caldo de fermentación de hidrolizado de biomasa lignocelulósica. La hez total es por tanto un tipo de caldo empobrecido.

40 El caldo de fermentación de hidrolizado de biomasa lignocelulósica o caldo empobrecido tal como hez total procedente de una columna de destilación, se trata térmicamente en condiciones en las que la resistencia de la torta de filtración del caldo o caldo empobrecido, tal como hez total, se reduce al menos un 20% aproximadamente. El caldo o caldo empobrecido, tal como hez total, se trata a una temperatura que está comprendida entre aproximadamente 70ºC y aproximadamente 150ºC durante un tiempo comprendido entre aproximadamente 30

45 segundos y 210 minutos. Se utilizan tiempos más largos con temperaturas más bajas en el intervalo, utilizándose tiempos más cortos con temperaturas más altas dentro del intervalo. Por ejemplo, en los ejemplos de esta memoria, el calentamiento de la hez total a 70ºC durante 60 minutos fue suficiente para permitir la resistencia de la torta de filtración en un 24%; el calentamiento a 110ºC durante 30 segundos fue suficiente para reducir la resistencia de la torta de filtración en un 21%; y un tratamiento de 30 segundos a 145ºC redujo la resistencia de la torta de filtración

50 un 45%. Son particularmente útiles temperaturas comprendidas entre aproximadamente 95ºC y aproximadamente 150ºC, siendo eficaces tiempos más cortos tales como entre aproximadamente 30 segundos y 30 minutos. Para un tratamiento corto, son particularmente útiles temperaturas entre aproximadamente 110ºC y aproximadamente 150ºC durante tiempos comprendidos entre aproximadamente 30 segundos y 2 minutos. El tratamiento del caldo de fermentación de hidrolizado de biomasa lignocelulósica y otros tipos de caldo empobrecido pueden estar

55 comprendidos en intervalos de temperatura similares durante tiempos similares, por reducción de la resistencia de la torta de filtración al menos un 20% aproximadamente.

El tratamiento térmico puede llevarse a cabo en cualquier sistema capaz de mantener la temperatura durante el tiempo deseado. Por ejemplo, el calentamiento puede realizarse en una vasija provista de camisa de calentamiento

o en un cambiador de calor con mantenimiento subsiguiente en una vasija o bucle de tubos.

E11717903

11-06-2015

Un experto en la técnica, con conocimiento de los resultados en los ejemplos que se proporcionan en esta memoria, puede determinar una temperatura y un tiempo dentro de los intervalos dados que son apropiados para un proceso global específico. Por ejemplo, un tratamiento de 30 segundos a 110ºC hasta 145ºC puede realizarse fácilmente utilizando un bucle de tubos con tiempo de residencia, que permite utilizar un proceso continuo, y no se requiere 5 vasija encamisada alguna, lo que hace esta disposición particular económicamente atractiva. Alternativamente, si se desea una temperatura inferior tal como la utilización de 95ºC a 100ºC, que es la temperatura de la hez total procedente de una destilación atmosférica, entonces podría utilizarse un tiempo de aproximadamente 15 a 30 minutos. Como en este caso, si la temperatura de la hez total o el caldo es igual o superior a la temperatura deseada debido a un paso de proceso previo, puede no ser necesaria aplicación adicional alguna de calor; la temperatura se

10 mantiene durante el tiempo deseado manteniendo el caldo o la hez total en una vasija aislada durante el periodo de tiempo requerido.

El tiempo requerido para reducir la resistencia de la torta de filtración al menos aproximadamente 20%, a una temperatura dada, puede variar también dependiendo del pH del caldo, el caldo empobrecido, o la hez total durante el tratamiento. Se consigue una reducción mayor en la resistencia de la torta de filtración a pH inferior, siendo 15 particularmente útil un pH de 6 o más bajo. Dependiendo del biocatalizador utilizado en la fermentación, el pH del caldo de fermentación de hidrolizado de biomasa lignocelulósica puede encontrarse ya a pH 6 o más bajo. Alternativamente, el pH del caldo, el caldo empobrecido, o la hez total del caldo puede ajustarse para alcanzar un pH de aproximadamente 6, 5, 4, ó 3 antes de o durante el tratamiento térmico. Es particularmente útil mezclar o agitar el caldo o la hez total durante el ajuste del pH para distribución uniforme del ácido de ajuste del pH. Adicionalmente,

20 puede utilizarse mezcladura durante el tratamiento térmico para control uniforme de la temperatura. La mezcladura, que puede ser continua o discontinua, se realiza típicamente por un sistema de agitación tal como uno que utilice hélices.

El potencial zeta es una medida del grado de repulsión entre partículas adyacentes de carga similar en una /dispersión, que por consiguiente es una indicación de la estabilidad de una dispersión coloidal. Se encontró que la 25 reducción del pH de la hez total procedente de la destilación de un caldo de fermentación de hidrolizado de biomasa lignocelulósica educe la magnitud del potencial zeta. Sin embargo, la reducción en la magnitud del potencial zeta observada, desde -21,85 mV a pH 7 hasta -16,17 mV a pH 5,5, y a -12,58 mV a pH 3,9 (Ejemplo 2 de esta memoria), no es indicativa de un cambio a coagulación rápida o floculación que ocurre a un potencial zeta de aproximadamente +/-5 mV e inferior. Así, la reducción del potencial zeta observada no puede explicar el cambio

30 acusado entre la resistencia de la torta de filtración.

En el presente proceso, no se añade agente de procesamiento alguno, tal como un agente floculante, al caldo de fermentación de hidrolizado de biomasa lignocelulósica, caldo empobrecido, o hez total. El material termotratado se filtra para separar una fracción líquida, o hez fluida, y una fracción sólida. Pueden utilizarse diversos dispositivos de filtración tales como un filtro de cinta, prensa de cinta, prensa de tornillo, filtro de tambor, filtro de disco, filtro de

35 Nucha, filtro-prensa, o centrífuga filtrante. La filtración puede favorecerse por ejemplo por aplicación de vacío, presión, o fuerza centrífuga. Es particularmente útil un filtro-prensa. El caldo, caldo empobrecido, o hez total se enfría típicamente, tal como a aproximadamente 65ºC, antes de hacerlo pasar a través de un filtro-prensa.

La fracción de sólidos, o torta húmeda, puede quemarse para suministrar energía al proceso de producción. La torta húmeda puede secarse antes de la combustión, por ejemplo por secado al aire, a fin de reducir la humedad.

40 Tratamiento Ulterior del Líquido para Reciclo

Una corriente de producto puede retirarse después de la filtración líquido/sólido de un caldo de fermentación de hidrolizado de biomasa lignocelulósica tratado térmicamente. Por ejemplo, la corriente líquida puede extraerse o destilarse para generar una corriente de producto, tal como destilación a fin de producir una corriente de producto etanol y un líquido remanente.

45 Después de la filtración, quedan en la fracción líquida sólidos disueltos y suspendidos. La totalidad o una porción de la fracción líquida pueden reciclarse para uso directamente como retorno. Como retorno, el líquido puede añadirse en cualquier punto en el proceso en el que se necesite agua fresca, tal como en pretratamiento, sacarificación, o producción de siembra de biocatalizador. El resto, o la totalidad, de la fracción líquida pueden purificarse ulteriormente por evaporación produciendo agua que puede reciclarse y un jarabe. La evaporación de la fracción

50 líquida de la hez fluida puede utilizarse para producir un jarabe con al menos aproximadamente 40% de sólidos. La corriente líquida de hez fluida tiene un contenido muy bajo de sólidos suspendidos, que son inferiores a 1000 ppm, ó 0,1%. Debido a la baja concentración de sólidos suspendidos en la hez fluida, la misma mantiene una viscosidad baja en un paso de evaporación subsiguiente. La viscosidad se mantiene por debajo de aproximadamente 100 centipoise a lo largo de la evaporación, permitiendo la evaporación de aproximadamente 40% de sólidos o más. El

55 jarabe resultante con al menos aproximadamente 40% de sólidos puede quemarse para proporcionar energía, sin paso de secado adicional alguno requerido. Los jarabes que se producen típicamente en procesos de etanol con trituración en seco de granos de maíz tienen aproximadamente 35% o menos de sólidos y no proporcionan más energía que la que se utiliza en el secado cuando se queman los mismos.

E11717903

11-06-2015

La evaporación puede realizarse en cualquier sistema de evaporación, tal como película de caída, película ascendente, circulación forzada, placas o sistemas de recompresión de vapor mecánicos y térmicos. La evaporación puede ser continua o por lotes y puede utilizar un evaporador multi-efecto. El agua evaporada puede reciclarse en el proceso de fermentación del hidrolizado de biomasa lignocelulósica global.

5 Ejemplos

La presente invención se define adicionalmente en los Ejemplos que siguen.

El significado de las abreviaturas utilizadas es como sigue: "s" es segundo, "min" significa minuto(s), "h" o "hr" significa hora(s), "μL" significa microlitro(s), "mL" significa mililitro(s), "L" significa litro(s), "m" es metro, "nm" significa nanómetro(s), "mm" significa milímetro(s), "cm" significa centímetro(s), "μm" significa micrómetro(s), "mM" significa

10 milimolar, "M" significa molar, "mmol" significa milimol(es), "μmol" significa micromol(es), "g" significa gramo(s), "μg" significa microgramo(s), "mg" significa miligramo(s), "kg" es kilogramo, "rpm" significa revoluciones por minuto, "C" es centígrado, "ppm" significa partes por millón, "cP" es centipoise, "NTU" son unidades nefelométricas de turbidez, y "psi" significa libras por pulgada cuadrada.

Métodos generales

15 Enzimas de Sacarificación

Accelerase® 1500 (A1500) y Xilanasa Multifect® se obtuvieron de Danisco U.S. Inc., Genencor, International (Rochester, NY).

Cepa de Producción de Celulasa y Hemicelulasa

Cepa 229: Una cepa de Trichoderma reesei, derivada de RL-P37 (Sheir-Neiss y Montenecourt, 1984, Appl.

20 Microbiol. Biotechnol. 20:46-53) por mutagénesis y selección para producción alta de celulasa, se sometió a cotransformación con la casete de expresión de β-glucosidasa (promotor cbh1, gen 1 de β-glucosidasa de T. reesei, terminador cbh1, y marcador amdS), y la casete de expresión de endoxilanasa (promotor cbh1, xyn3 de T. reesei, y terminador cbh1) utilizando transformación mediada con PEG (Penttila et al., 1987, Gene 61(2): 155-64). Se aislaron numerosos transformantes y se examinaron respecto a producción de β-glucosidasa y endoxilanasa. Un solo

25 transformante, al que se hace referencia como cepa #229 de T. reesei, se utilizó en ciertos estudios descritos en esta memoria.

Cepa H3A: La cepa #229 de T. reesei se co-transformó con la casete de expresión Fv3A de β-xilosidasa (promotor cbh1, gen Fv3A, terminador cbh1, y marcador alsR), la casete de expresión Fv43D de β-xilosidasa (promotor egl1, gen Fv43D, terminador Fv43D nativo), y la casete de expresión de α-arabinofuranosidasa Fv51A (promotor egl1, gen

30 Fv51A, terminador nativo Fv51A) utilizando electroporación. Los transformantes se seleccionaron sobre placas de agar Vogels que contenían clorimurón-etilo. Se aislaron numerosos transformantes y se examinaron respecto a producción de β-xilosidasa y L-α-arabinofuranosidasa. Se aisló la cepa H3A de expresión integrada de T. reesei, que expresa recombinantemente T. reesei β-glucosidasa 1, T. reesei xyn3, Fv3A, Fv51A, y Fv43D.

La proteína extracelular producida durante la fermentación de la cepa H3A se separó de la masa de células por

35 centrifugación, se concentró por ultrafiltración con membrana a través de una membrana Millipore de peso molecular de corte 10 kD y se ajustó el pH a 4,8. La proteína total se determinó utilizando un método Biuret modificado como fue modificado por Weichselbaum utilizando Seroalbúmina Bovina como calibrador (Weichselbaum, 1960, Amer. J. Clin. Path. 16:40; Gornall et al., 1949 J. Biol. Chem 177:752). Esta preparación de proteína extracelular H3A, denominada en esta memoria proteína H3A, se utilizó como preparación de combinación de celulasa y hemicelulasa

40 que realizaba la hidrólisis de carbohidratos complejos durante la SSF.

Preparación de biocatalizador e inóculo

Origen de las cepas de Zymomonas mobilis utilizadas en la fermentación

Un caldo de fermentación de hidrolizado de biomasa lignocelulósica que se procesa como en estos ejemplos puede producirse utilizando biocatalizadores alternativos. En estos ejemplos se utilizan cepas ilustrativas y se describen a

45 continuación. Como alternativa, puede utilizarse la cepa ZW658, depositada como ATCC #PTA-7858 para producir un caldo de fermentación de hidrolizado de biomasa lignocelulósica para procesamiento.

La cepa ZW705 de Zymomonas mobilis se produjo a partir de la cepa ZW801-4 por métodos detallados en la Publicación de Patente de Estados Unidos U.S. 20110014670, como se detalla brevemente a continuación. Cultivos de la cepa ZW801-4 de Z. mobilis se dejaron crecer en condiciones de estrés como sigue. ZW801-4 es una cepa 50 recombinante de Z. mobilis que utiliza xilosa que fue descrita en US 7.741.119. La cepa ZW801-4 se derivó de la cepa ZW800, que se derivaba de la cepa ZW658, todo ello como se describe en US 7.741.119. ZW658 se construyó por integración de dos operones, PgapxilAB y Pgaptaltkt, que contienen cuatro genes que utilizan xilosa que codifican xilosa-isomerasa, xiluloquinasa, transaldolasa y transcetolasa, en el genoma de ZW1 (ATCC #31821) por eventos de transposición secuenciales, seguido por adaptación en medios selectivos que contenían xilosa. ZW658

imagen6

imagen7

imagen8

E11717903

11-06-2015

Tabla 2. Mazorca, Lotes de Pretratamiento y de Fermentación

Mazorca, % de humedad

Lote de pretratamiento % en peso final de sólidos Lote de fermentación

5,9

SSL 9 53,1 7

5,9

SSL 10 65,7 7

5,9

SSL 11 71,3 7

5,9

SSL 12 71,9 7

5,9

SSL 13 69,8 8

5,9

SSL 14 67,6 8

5,9

SSL 15 68,9 8

5,2

SSL 18 65,1 9

5,2

SSL 19 68,1 9

5,2

SSL 20 68,1 9

8,0

SSL 24 61,1 10

8,0

SSL 25 66,7 10

8,0

SSL 26 67,8 10

Operaciones de Sacarificación para FRF 6-10

La sacarificación se llevó a cabo en un Biostato Sartorius D200 de 200 L durante 72 horas excepto el lote #9, que se mantuvo 24 horas. La carga de sólidos era 20% a 25%. El pH de la biomasa de mazorcas pretratada se ajustó a 5,3

5 con H2SO4. Las enzimas añadidas eran una asociación de A1500, Xyn3, Fv3A, Fv51A, y Fv43D que se añadió a 21,3 mg proteína/g glucano + xilano para #6-9, excepto en la operación #6 en la que se empleó Xilanasa Multifect® en sustitución de Xyn3, y en la operación #10 en el que se utilizó extracto de H3A (descrito en los Métodos Generales) a 14 mg/g glucano + xilano. La sacarificación se realizó a 47ºC.

Preparación del Cultivo de Siembra

10 Se dejaron crecer 2 mL de la cepa de stock ZW705 congelada (cepa descrita en los Métodos Generales) en MRM3G6 (10 g/L de extracto de levadura BBL, 2 g/L KH2PO4, 1 g/L MgSO4*7H2O, 60 g/L glucosa) a 33ºC, sin sacudidas durante 8 horas como cultivo de reactivación. Frascos de sacudidas que contenían 1 L de medio MRM3G10 (igual que MRM3G6 pero con 100 g/L de glucosa) se inocularon con 20 mL de cultivo de reactivación, y se incubaron a 33ºC con agitación mediante sacudidas durante 13-16 horas. El cultivo se mantuvo hasta DO600 entre

15 1,5 y 3,1. Se utilizó cantidad suficiente de cultivo en los frascos de sacudidas para inocular fermentadores de siembra de 10 L hasta DO600 inicial de 0,1 (FRF 7-10) o 0,35 (FRF 6).

Fermentaciones de siembra en MaxSMG20 o MaxSMG15 (20 g/L extracto de levadura, 2 g/L KH2PO4, 5 g/L MgSO4*7H2O, 10 mM sorbitol, y 200 g/L glucosa). Las fermentaciones de siembra se realizaron a 33ºC y pH 5,8 (FRF 6 & 7) ó 5,5 (FRF 8-10). La siembra se cosechó después de la primera observación de reducción de la glucosa

20 a menos de 85 g/L, midiéndose la glucosa por utilización de un Analizador de Bioquímica YSI 2700 SELEC T™ (YSI Life Sciences; Yellow Springs, OH).

Fermentación

Los lotes de fermentación enumerados en la Tabla 2 se ejecutaron en un Biostato Sartorius D200 de 200 L que contenía 180 L de hidrolizado de biomasa y 20 L de cultivo de siembra ZW705. El pH se ajustó a 5,8 con NaOH. Las

25 operaciones se mantuvieron a 30ºC-33ºC durante 80 horas (FRF 6,7), 90 horas (FRF 8,10) o 120 horas (FRF 9).

Ejemplo 2

Efecto del Tratamiento Térmico de la Hez Total Sobre la Resistencia de la Torta de Filtración

Las preparaciones de caldo de fermentación de hidrolizado de biomasa lignocelulósica FRF 6, 7 y 8 se destilaron cada una en un dispositivo a escala de laboratorio (Métodos Generales) por destilación continua a la presión 30 atmosférica, con un tiempo de residencia en la columna de aproximadamente 8 min. Las muestras de hez total resultantes, con pH de 6, se utilizaron en ensayos de tratamiento térmico. El tratamiento térmico se efectuó a temperaturas diferentes (70ºC, 80ºC, 95ºC) por mantenimiento de la temperatura especificada en el pote de destilación por lotes Oldershaw de 2 L de vidrio de placa 10, descrito en Métodos Generales. A lo largo del tratamiento térmico se tomaron muestras del pote de destilación por lotes. Cada muestra se filtró y se determinó la

E11717903

11-06-2015

resistencia específica de la torta de filtración. Las operaciones de filtración en el equipo Filtratest descrito en Métodos Generales se utilizaron para determinar el cambio en filtrabilidad. Se realizaron un total de más de 25 tratamientos térmicos utilizando hez total de la producción de etanol celulósico. El cambio en la resistencia de la torta de filtración en función de la temperatura se muestra en la Tabla 3. La tabla establece una selección representativa de los datos disponibles. Las operaciones A y B utilizaron hez total de FRF 8, y la operación C utilizó hez total de FRF 6.

Tabla 3. Cambio en la Resistencia de la Torta de Filtración de Muestras de Hez Total Calentadas Durante Tiempos Variables y a Temperaturas Diferentes Utilizando un Filtratest

pH 6

% de probabilidad de resistencia de la torta con el tiempo a la temperatura de tratamiento

Temp.

OPERACIÓN 0 min 30 min 60 min 90 min 120 min 180 min 210 min

70°C

A 0% -8% -24% -27% -25% -32% -34%

80°C

B 0% -24% -41% -42% -44% -49% -54%

95°C

C 0% -53% nd* nd nd nd -73%

*nd = no determinado

0 min se refiere a la primera muestra (muestra inicial) del tratamiento térmico, que es la papilla de hez total sin tratar.

10 El porcentaje indica el cambio relativo en la resistencia específica de la torta comparada con la muestra inicial. Después de 30 min de tratamiento térmico se observaron cambios espectaculares en la filtrabilidad, que eran mayores a temperatura más alta. Después de 210 min de tiempo de tratamiento térmico, la operación a 70ºC exhibía una resistencia específica de la torta reducida en un 34% frente a 73% para el caso de 95ºC.

El lote de fermentación FRF 7 se trató térmicamente a 95ºC durante 210 min, y los resultados se dan en la Tabla 4.

15 Se alcanzó una reducción en la resistencia específica de la torta de 39% utilizando el filtro-prensa de 460 mm. El tratamiento térmico se realizó en la vasija encamisada de 50 galones (189,3 litros) con calentamiento por recirculación de aceite, descrita en Métodos Generales.

Tabla 4. Cambio en la Resistencia de la Torta de Filtración de la Muestra de Hez total Calentada Utilizando el Filtro-Prensa de 460 mm

pH 6

Temp.

OPERACIÓN 0 min 210 min

95°C

D 0% -39%

20 Ejemplo 3

Efecto del pH y el Tratamiento Térmico Sobre la Resistencia de la Torta de Filtración de Hez total

Para este ejemplo, se realizaron varias operaciones con ajuste del pH del caldo de fermentación antes de la destilación, con destilación subsiguiente seguida por tratamiento térmico y filtración. Muestras del caldo de fermentación de FRF 10 descrito en el Ejemplo 1 se ajustaron a pH 5, 6, ó 7 antes de la destilación. La destilación se

25 realizó como se describe en el Ejemplo 1. La hez total procedente de la columna de destilación se mantuvo a 95ºC durante tiempos variables y se filtró como en el Ejemplo 1, presentándose los resultados en la Tabla 5. Los porcentajes son los cambios relativos en la resistencia específica de la torta comparada con la muestra de 0 min a pH 7. Se realizaron varias operaciones de test; la tabla muestra un ejemplo representativo.

Como puede verse en la columna de 0 min (muestra sin tratamiento térmico), el ajuste del pH solo generó una 30 diferencia en resistencia específica de la torta de 42%. El tratamiento térmico mejoraba adicionalmente la eficiencia.

En el caso de pH 5 y 180 min o 210 min, se alcanzó repetidas veces una reducción de 70% en la resistencia específica de la torta de filtración.

Tabla 5. Cambio en la resistencia de la torta de filtración de muestras de hez total calentada de caldo de fermentación ajustado en pH, calentadas durante tiempos variables a 95ºC

95°C

pH

RUN 0 min 30 min 90 min 120 min 180 min 210 min

pH7

E 0% -10% -20% -32% -48% -52%

pH6

F -34% -38% -49% -52% -55%

E11717903

11-06-2015

95°C

pH5

G -42% -62% -62% -66% -70% -70%

El filtrado del caldo de fermentación que estaba ajustado a pH 6 se ajustó en pH utilizando ácido sulfúrico. Los resultados de la observación visual fueron que la muestra inicialmente clara se volvía cada vez más turbia a medida que se reducía el pH. Para cada pH enumerado en la Tabla 6, se ensayó la turbidez como se describe en Métodos Generales. Los resultados en la Tabla 6 muestran que la turbidez aumentaba a medida que se reducía el pH. La materia previamente disuelta precipitaba a medida que disminuía el pH.

Tabla 6. Turbidez del Filtrado de Hez total a pH Variable

pH

NTU

5,8

132

5,2

137

4,9

170

4,5

220

4,1

313

3,6

408

La hez total del caldo de fermentación que se ajustó a pH 7 se ajustó en pH por pasos utilizando ácido sulfúrico. Para cada pH enumerado en la Tabla 7, se ensayó en el potencial zeta. Los resultados de la Tabla 7 muestran que la hez se volvía más inestable electrocinéticamente a medida que disminuía el pH, pero no hasta un nivel que se

10 espera soporte la coagulación o floculación rápidas (potencial zeta de 0 a +/-5 mV).

Tabla 7. Potencial zeta del filtrado de hez total a pH variable

pH

Potencial Zeta (mV)

7,0

-21,85

6,6

-18,28

5,5

-16,17

4,7

-15,03

3,9

-12,58

Ejemplo 4

Tratamiento Térmico de la Hez Total Utilizando Temperatura Alta y Tiempo Corto

Para estos experimentos se realizó en lugar de un tratamiento térmico a temperatura relativamente baja y durante 15 tiempo largo, un tratamiento térmico a temperatura elevada y tiempo corto.

La hez total se trató en el dispositivo de Alta Temperatura y Tiempo Corto (HTST) descrito en Métodos Generales. Las muestras se mantuvieron durante 30 s a 110ºC o 145ºC y se determinó para cada muestra el cambio relativo en la resistencia específica de la torta como se describe en el Ejemplo 1. Los resultados en la Tabla 8 muestran que el tiempo corto a temperatura elevada era apto para alcanzar la misma magnitud de reducción de la resistencia que las

20 operaciones durante largo tiempo a baja temperatura. Ya a 110ºC durante 30 s se consiguió un 21% de reducción en la resistencia. A 145ºC durante 30 s se observó una reducción de 45% en la resistencia de la torta.

Tabla 8. Cambio en la Resistencia de la Torta de Filtración de las Muestras de Hez total Calentadas Durante Tiempo Corto a Temperatura Elevada

30 s

RT

110° C 145°C

0%

-21% -45%

Ejemplo 5 25 Efecto del Tratamiento Térmico Sobre la Resistencia de la Torta de Filtración del Caldo de Fermentación 17

E11717903

11-06-2015

Para este ejemplo se realizó una operación con tratamiento térmico de caldo de fermentación FRF 7 seguido por filtración. Se utilizó el dispositivo de destilación por lotes Oldershaw 2 L de vidrio de placa 10 descrito en Métodos Generales en modo de reflujo total para realizar el tratamiento térmico sin retirada de destilado alguno.

El caldo de fermentación FRF 7 se retiró del almacenamiento a aproximadamente 5ºC; se cargaron 769 gramos en

5 el pote de lotes de 2 L, y dicho material se calentó luego a 93ºC. El pote se mantuvo en el punto de ebullición de 93ºC del caldo de fermentación que contenía etanol durante 150 min. Una vez completado el tratamiento térmico, el material termotratado en el pote se vació a una botella provista de tapón para transporte al instrumento Filtratest para las medidas de filtración. La botella se transportó dentro de un vaso Dewar provisto de tapa para mantener la temperatura de la muestra antes del test de filtración. Se proporcionó también una muestra del caldo de

10 fermentación FRF 7 correspondiente no tratado térmicamente, como la muestra de 0 min.

Cada muestra se filtró y se determinó la resistencia específica de la torta de filtración. Se utilizaron operaciones de filtración en el equipo Filtratest descrito en Métodos Generales para determinar el cambio en filtrabilidad. El cambio en resistencia de la torta de filtración se da en la Tabla 9.

Tabla 9. Cambio en la Resistencia de la Torta de Filtración de la Muestra de Caldo de Fermentación Calentado 15 Utilizando un Filtratest

Temp.

RUN 0 min 150 min

93°C

H 0% -95%

El porcentaje indica el cambio relativo en la resistencia específica de la torta comparado con la muestra inicial. Después de 150 min de tiempo de tratamiento térmico a 93ºC, la resistencia específica de la torta se redujo en 95%.

Ejemplo 6

Producción de Caldo de Fermentación de Hidrolizado de Biomasa Lignocelulósica a Escala Semiindustrial

20 Pretratamiento

Se utilizó un pretratador a escala semiindustrial (aproximadamente 370 L) 7 se utilizó para pretratar un lote de forraje de maíz que se había molido a aproximadamente 1/8" (3,125 mm). El forraje se cargó al reactor y se aplicó vacío a la vasija hasta alcanzar 0,1 bar (10 kilopascal) absoluto antes de la introducción de solución de hidróxido de amonio para dar aproximadamente 8% en peso de NH3 con relación al peso seco de biomasa. Se añadió vapor

25 hasta alcanzar una temperatura de aproximadamente 140ºC. Esta temperatura se mantuvo durante 30 minutos. Al final del pretratamiento, el reactor se despresurizó de manera controlada hasta alcanzar la presión atmosférica, y se aplicó subsiguientemente vacío para llevar de nuevo la presión en la vasija a aproximadamente 0,1 bar (10 kilopascal) absoluto. Los trozos de forraje pretratados que salían del reactor tenían aproximadamente 65% en peso de biomasa seca.

30 Sacarificación

La sacarificación para producir hidrolizado de biomasa se llevó a cabo en una vasija de sacarificación de 1000 L. La carga de sólidos era 25%. El pH de la biomasa de forraje de maíz pretratada se ajustó a 5,3 con H2SO4 al 5% en peso. La mezcla de enzimas de añadió a 14 mg proteína/g glucano + xilano. Las enzimas de sacarificación eran una mezcla de celulasas y hemicelulasas expresadas en una cepa de Trichoderma reesei derivada de RL-P37 (Sheir

35 Neiss y Montenecourt (1984) Appl. Microbiol. Biotechnol. 20:46-53), similar a la preparación de la cepa H3A descrita en Métodos Generales, que podría utilizarse también. La sacarificación se realizó a 47ºC durante 72 horas produciendo hidrolizado de biomasa.

Preparación del Cultivo de Siembra

Se cultivaron 2 mL de stock de la cepa AR3 7-31 de Zymomonas mobilis congelada en MRM3G6 (10 g/L extracto

40 de levadura BBL, 2 g/L KH2PO4, 1 g/L MgSO4*7H2O, 60 g/L glucosa) a 33ºC, sin sacudidas durante 8 horas como un cultivo de reactivación. Un matraz de sacudidas de 2 L que contenía 1,5 L de medio MRM3G10 (igual que MRM3G6 pero con 100 g/L de glucosa) se inoculó con 10 mL de cultivo de reactivación, y se incubó a 33ºC con sacudidas durante 14-16 horas. El crecimiento se mantuvo hasta una DO600 entre 1,5 y 3,1. El cultivo completo del matraz de sacudidas se utilizó para inocular un fermentador de siembra de 100 L hasta una DO600 inicial de aproximadamente

45 0,05.

La fermentación de siembra se llevó a cabo en un fermentador de 100 L con 10 g/L de extracto de levadura, 2 g/L KH2PO4, 5 g/L MgSO4*7H2O, 10 mM sorbitol, y 150 g/L glucosa. La fermentación de siembra se realizó a 33ºC y pH 5,5. La siembra se recogió después de la primera observación de reducción de la glucosa a menos de 50 g/L, realizándose la medición de glucosa utilizando un Analizador de Bioquímica SELEC T™ YSI 2700 (YSI Life

50 Sciences; Yellow Springs, OH).

Claims (1)

1. imagen1