ES2576986T3

ES2576986T3 - Microorganismos eucariotas para la producción de lípidos y antioxidantes

Info

Publication number: ES2576986T3
Application number: ES11170447.4T
Authority: ES
Inventors: Adam M. Burja; Helia Radianingtyas; Colin James Barrow; Anthony James Windust
Original assignee: DSM Nutritional Products AG
Current assignee: DSM Nutritional Products AG
Priority date: 2005-06-07
Filing date: 2006-06-07
Publication date: 2016-07-12
Anticipated expiration: 2026-06-07
Also published as: AU2006325040B2; JP2008541779A; ES2626018T3; US10435725B2; AU2006325040A1; PT2468847T; EP3467096B1; ES2451667T3; HK1245020B; US9719116B2; CN104745486A; EP2447356A1; US20150218603A1; WO2007069078A3; JP5886511B2; US20130344546A1; ES2909600T3; CN104745486B; EP3238543A1; US20090117194A1

Abstract

Un microorganismo eucariota que tiene una secuencia 18S, en el que la secuencia 18S tiene al menos una identidad del 98 % ó 99 % con la secuencia mostradaen SEQ ID NO: 1.

Description

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b) Clasificación

[0055] 71. El microorganismo eucariota puede ser del filo Labyrinthulomycota. El microorganismo eucariota puede ser de la clase Labyrinthulomycetes. El microorganismo eucariota puede ser de la subclase Thraustochytridae. El 5 microorganismo eucariota puede ser del orden Thraustochytriales. El microorganismo eucariota puede ser de la familia Thraustochytriaceae. El microorganismo eucariota puede ser del género Thraustochytrium. El microorganismo eucariota puede ser Thraustochytrium sp. El microorganismo eucariota puede ser Thraustochytrium aureum. El microorganismo eucariota puede ser Thraustochytrium roseum. El microorganismo eucariota puede ser Thraustochytrium striatum. El microorganismo eucariota puede ser del género Schizochytrium. El microorganismo eucariota puede ser Schizochytrium sp. El microorganismo eucariota puede ser una versión modificada de cualquiera de los microorganismos eucariotas enumerados. El microorganismo eucariota también puede comprender cualquier miembro actualmente desconocido o aislado de dicha clase, subclase, orden, familia o género de procariotas. Una combinación de microorganismos eucariotas puede ser cualquier combinación de cualquier organismo desvelado en el presente documento, incluyendo, uno o más de Thraustochytrium sp., Schizochytrium

15 sp., Thraustochytrium aureum, Thraustochytrium striatum y Thraustochytrium roseum.

[0056] 72. Los microorganismos eucariotas de la familia Thraustochytriaceae pueden ser cualquiera de los desvelados anteriormente. El microorganismo eucariota puede comprender el organismo que tiene el número de referencia PTA-6245 de la ATCC.

c) Genética

[0057] 73. El microorganismo eucariota puede tener la secuencia de ARNr 18S de la SEC ID Nº 1. El microorganismo eucariota puede tener una secuencia de ARNr 18S que tiene, por ejemplo, una homología de

25 aproximadamente el 90 %, o cualquier otra identidad desvelada en el presente documento, con la SEC ID Nº 1. El microorganismo eucariota puede tener una secuencia de ARNr 18S que se hibrida en condiciones rigurosas, o cualquier otra condición como se desvela en el presente documento, con la SEC ID Nº 1, o con una parte de la SEC ID Nº 1.

[0058] 74. La similitud/identidad de secuencia e hibridación de los ácidos nucleicos de los organismos pueden ser como se describe en el presente documento. Específicamente, la comparación de la SEC ID Nº 1 con las secuencias de ácidos nucleicos encontradas en la base de datos genómica, GenBank (Centro Nacional de Información sobre Biotecnología, National Institute of Health, Bethesda, MD, Estados Unidos) usando el algoritmo BLAST (herramienta de búsqueda de alineamiento local básica) identificó que la SEC ID Nº 1 estaba relacionada (91 % de similitud) con

35 varias especies de traustoquítridos eucariotas, estrechamente relacionadas con Thraustochytrium sp. CHN-1 [AB126669] (94, 5 % de similitud) y Thraustochytriidae sp. N1-27 [AB073308] (95, 5 % de similitud), y más estrechamente relacionada con Thraustochytrium striatum [AF265338] (97, 5 % de similitud).

3. (1) Similitudes de secuencia

[0059] 75. Se entiende que, como se analiza en el presente documento, el uso de los términos homología e identidad significan lo mismo que similitud. Por lo tanto, por ejemplo, si el uso de la palabra homología se utiliza entre dos secuencias no naturales se entiende que esta no indica necesariamente una relación evolutiva entre estas dos secuencias, sino que considera más bien la similitud o la relación entre sus secuencias de ácidos nucleicos.

45 Muchos de los métodos para determinar la homología entre dos moléculas evolutivamente relacionadas se aplican habitualmente a dos o más ácidos nucleicos o proteínas con el fin de medir la similitud de secuencia independientemente de si están relacionadas evolutivamente o no.

[0060] 76. En general, se entiende que un modo de definir cualquier variante y derivado conocidos o los que puedan surgir, de los genes y proteínas del presente documento, es mediante la definición de las variantes y derivados en términos de homología con secuencias específicas conocidas. Esta identidad de secuencias particulares desveladas en el presente documento también se desvela en otra parte del presente documento. En general, las variantes de ácidos nucleicos y proteínas que se desvelan en el presente documento tienen normalmente una homología de al menos aproximadamente 50, 55, 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89,

55 90, 91, 92, 93, 94; 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento con la secuencia indicada o la secuencia nativa. Los expertos en la materia comprenden fácilmente cómo determinar la homología de dos proteínas o ácidos nucleicos, tales como genes. Por ejemplo, la homología puede calcularse después de alinear las dos secuencias de modo que la homología esté a su nivel más alto.

[0061] 77. Otro modo de calcular la homología puede realizarse mediante algoritmos publicados. El alineamiento óptimo de secuencias puede realizarse por comparación mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman Adv. Appl. Math. 2:482, 1981, mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970, mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 85:2444, 1988, mediante implementaciones informatizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, 65 PASTA y TFASTA en el paquete informático de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 57=5 Science Dr.,

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nucleicos unido al otro ácido nucleico. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las condiciones de hibridación selectiva serían cuando al menos aproximadamente el 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 por ciento del ácido nucleico limitante está unido al ácido nucleico no limitante. Normalmente, el cebador no limitante está, por ejemplo, en un exceso de 10, 100 o 1000

5 veces. Este tipo de ensayo puede realizarse en condiciones en las que tanto el cebador limitante como no limitante, están, por ejemplo, 10, 100 o 1000 veces por debajo de su kd o en las que solamente una de las moléculas de ácido nucleico está 10, 100 o 1000 veces está por encima de su kd o en las que una o ambas moléculas de ácido nucleico están por encima de su kd.

[0067] 83. Otro modo de definir la hibridación selectiva es estudiando el porcentaje de cebador que se consigue manipular enzimáticamente en condiciones en las que se requiere hibridación para promover la manipulación enzimática deseada. Por ejemplo, en algunas realizaciones las condiciones de hibridación selectiva serían cuando al menos aproximadamente el 50, 55, 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 9 1, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 por ciento de los cebadores está manipulado enzimáticamente en

15 condiciones que promueven la manipulación enzimática, por ejemplo, si la manipulación enzimática es extensión de ADN, entonces las condiciones de hibridación selectiva serían cuando al menos aproximadamente el 50, 55, 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 por ciento de las moléculas cebadoras están extendidas. Las condiciones preferidas también incluyen las sugeridas por el fabricante o las indicadas en la técnica como apropiadas para realizar la manipulación enzimática.

[0068] 84. Al igual que con la homología, se entiende que hay diversos métodos desvelados en el presente documento para determinar el nivel de hibridación entre dos moléculas de ácido nucleico. Se entiende que estos métodos y condiciones pueden proporcionar diferentes porcentajes de hibridación entre dos moléculas de ácido nucleico, pero a no ser que se indique de otro modo sería suficiente cumplir los parámetros de cualquiera de los

25 métodos. Por ejemplo, si se requiere una hibridación del 80 % y siempre que la hibridación se produzca dentro de los parámetros requeridos en uno cualquiera de estos métodos, se considera desvelado en el presente documento.

[0069] 85. Se entiende que los expertos en la materia entienden que si una composición o método cumple uno cualquiera de estos criterios para determinar la hibridación bien en su conjunto o individualmente, es una composición o método que se desvela en el presente documento.

d) Composición de moléculas producidas

[0070] 86. Se entiende que los eucariotas desvelados en el presente documento tienen la capacidad de producir

35 diversos compuestos y composiciones. Los compuestos y composiciones pueden usarse como una firma, un modo de identificar el organismo. Por ejemplo, un modo de caracterizar un organismo es mediante el perfil lipídico que produce el organismo. Como se desvela en el presente documento, estos diversos perfiles lipídicos pueden usarse para caracterizar el organismo así como purificarse, manipularse y recogerse por diversas razones.

(1) Lípidos

[0071] 87. Se entiende que cada organismo puede producir algún perfil de ácidos grasos insaturados, como se desvela en el presente documento. Estos perfiles son característicos de los organismos. Mas adelante hay algunos ejemplos de perfiles de lípidos insaturados y otros de los organismos.

45 [0072] 88. El microorganismo eucariota puede producir, por ejemplo, un lípido o fracción de ácidos grasos de al menos aproximadamente 4 % en peso a 6 % en peso (por ejemplo, aproximadamente 5 % en peso), que comprende de aproximadamente 0 % en peso a aproximadamente 2 % en peso de ácido mirístico (por ejemplo, aproximadamente 1 % en peso), de aproximadamente 16 % en peso a aproximadamente 20 % en peso (por ejemplo, aproximadamente 18 % en peso) de ácido palmítico, de aproximadamente 0 % en peso a aproximadamente 2 % en peso (por ejemplo, aproximadamente 1 % en peso) de ácido palmitoleico, de aproximadamente 4 % en peso a aproximadamente 8 % en peso (por ejemplo, aproximadamente 6 % en peso) de ácido esteárico, de aproximadamente 30 % en peso a aproximadamente 34 % en peso (por ejemplo, aproximadamente 32 % en peso) de ácido oleico, de aproximadamente 40 % en peso a aproximadamente 44 % en

55 peso (por ejemplo, aproximadamente 42 % en peso) de ácido linoleico y de aproximadamente 0 % en peso a aproximadamente 3 % en peso (por ejemplo, aproximadamente 2 % en peso) de EPA n-3 por biomasa celular seca.

[0073] 89. El microorganismo eucariota también puede producir, por ejemplo, un lípido o fracción de ácidos grasos de al menos aproximadamente 1 % en peso a 3 % en peso (por ejemplo, aproximadamente 1,25 % en peso), que comprende de aproximadamente 2 % en peso a aproximadamente 4 % en peso (por ejemplo, aproximadamente 3 % en peso) de ácido mirístico, de aproximadamente 50 % en peso a aproximadamente 60 % en peso (por ejemplo, aproximadamente 55 % en peso) de ácido palmítico, de aproximadamente 2 % en peso a aproximadamente 4 % en peso (por ejemplo, aproximadamente 3 % en peso) de ácido palmitoleico, de aproximadamente 16 % en peso a aproximadamente 20 % en peso (por ejemplo, aproximadamente 18 % en peso) de ácido esteárico, de 65 aproximadamente 9 % en peso a aproximadamente 13 % en peso (por ejemplo, aproximadamente 11 % en peso) de

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ácido oleico, de aproximadamente 1 % en peso a aproximadamente 3 % en peso (por ejemplo, aproximadamente 2 % en peso) de ácido eicosadienoico, y de aproximadamente 6 % en peso a aproximadamente 10 % en peso (por ejemplo, aproximadamente 8 % en peso) de EPA n-3 por biomasa celular seca.

5 [0074] 90. El microorganismo eucariota, por ejemplo, tal como ONC-T18, puede producir al menos aproximadamente 30 % en peso, 40 % en peso, 50 % en peso, 60 % en peso, 70 % en peso u 80 % en peso (por ejemplo, aproximadamente 80 % en peso) de una composición lipídica por biomasa celular seca. Por ejemplo, el microorganismo eucariota puede producir una composición lipídica que comprende de aproximadamente 25 % a aproximadamente 40 % de un ácido graso omega 3, tal como DHA n-3 (por ejemplo, al menos 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 % o 60 % en peso) y de aproximadamente 0 % a aproximadamente 3 % del ácido graso omega 3, EPA, (por ejemplo, al menos 1 % o 2 % en peso) y de aproximadamente 4 % a aproximadamente 12 % de un ácido graso omega 6, tal comoDPAn-6 (por ejemplo, almenos4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% o10% en peso).

[0075] 91. Se entiende que la composición del lípido producido por el microorganismo eucariota puede manipularse

15 basándose en las condiciones de cultivo en las que existe el microorganismo eucariota. Cambiando diversos parámetros, como se desvela en el presente documento, las composiciones pueden manipularse para producir, por ejemplo, un mejor rendimiento de DHA o DPA. Por ejemplo, la manipulación puede no producir más gramos reales, sin embargo la manipulación puede producir una mejor relación de DHA o DPA con respecto a EPA y otros PUFA deseados, lo que puede ser deseable desde un punto de vista de la purificación. En el presente documento se analizan diversas condiciones.

[0076] 92. La Figura 10 muestra una ruta metabólica posible para los diversos PUFA producidos por el microorganismo eucariota desvelado, coherente con el rastreo de metabolitos de metil éster de ácidos grasos. Las proteínas que pueden identificarse dentro delas rutas que se desvelan en el presente documento son la poliquétido

25 sintasa, usando, por ejemplo, un estudio con cebador degenerativo, (Metz et al. (2001) Science 293: 290-3 y Kaulmann y Hertweck (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41: 1866-9). También pueden identificarse elongasas y desaturasas, usando, por ejemplo, un estudio con sonda de hibridación. También pueden identificarse ácido graso sintasas, usando, por ejemplo, un estudio con sonda de hibridación y/o con cebador degenerativo.

4. Crecimiento y cultivo

[0077] 93. Se realizó un estudio fenotípico en microplacas que incluía carbono; nitrógeno (nitrógeno peptídico); fósforo y azufre; osmolitos y pH.

35 [0078] 94. Se usó un método de matriz ortogonal (Taguchi) para determinar las configuraciones de medios óptimas y variaciones en la concentración de nitrógeno, carbono y sal (Joseph J & Piganatiells JR (1998) IIE Trans, 20:247254).

[0079] 95. Si se aumenta la agitación o el dO2, se aumenta la producción de biomasa y de TFA pero se reduce el DHA. Si se reduce la agitación o el dO2, se reduce la biomasa celular (g) y se reduce el TFA pero aumenta el DHA pero también se reduce C16:0, C16:1 y C18:1.

[0080] 96. Si se aumenta la temperatura, se aumenta la producción de biomasa y de TFA, pero se reduce el DHA. Si se reduce la temperatura, se reduce la biomasa celular (g) y se reduce el TFA, pero aumenta el DHA, pero se

45 reduce C16:0, C16:1 y C18:1.

[0081] 97. Puede obtenerse biomasa celular procedente del microorganismo eucariota desvelado inoculando un medio de agua marina artificial o natural adecuado, que contiene de aproximadamente 2 % a aproximadamente 100 % de agua marina. Este microorganismo eucariota puede utilizar diversos componentes nutricionales dentro de este medio. Son ejemplos de una fuente de carbono usada dentro del medio, hidratos de carbono tales como glucosa, fructosa, dextrosa, lactulosa, galactosa, maltotriosa, maltosa, lactosa, glucógeno, gelatina, almidón (de maíz o de trigo) así como derivados de azúcares, tales como acetato, m-inositol (procedente de agua de macerado de maíz), ácido galacturónico (procedente de pectina), L-fucosa (procedente de galactosa), gentiobiosa, glucosamina, a-D-glucosa-1-fosfato (procedente de glucosa), celobiosa (procedente de celulosa) dextrina 55 (procedente de maíz), y -ciclodextrina (procedente de almidón) y polioles tales como maltitol, eritritol, adonitol y ácidos oleicos tales como glicerol y tween-80 y amino azúcares tales como N-acetil-D-galactosamina, N-acetil-Dglucosamina y N-acetil--D-manosamina. Al mismo tiempo, son ejemplos de una fuente de nitrógeno fuentes de nitrógeno naturales tales como peptona, extracto de levadura, extracto de malta y harina de pescado, o una fuente de nitrógeno orgánica tal como glutamato sódico, aunque sin limitarse a las mismas. Adicionalmente, si fuera necesario, como nutrientes traza podrían usarse fosfatos, tales como fosfato de potasio y fosfato de sodio, sales inorgánicas tales como, sulfato de amonio, bicarbonato de sodio, ortovanato de sodio, cromato de potasio, molibdato de sodio, ácido selenioso, sulfato de níquel, sulfato de cobre, sulfato de cinc, cloruro de cobalto, cloruro de hierro, cloruro de manganeso y cloruro de calcio, junto con el compuesto quelante, ácido etilendiaminatetraacético, solo o junto con vitaminas tales como clorhidrato de pirodoxina, clorhidrato de tiamina, pantotenato de calcio, ácido p65 aminobenzoico, riboflavina, ácido nicotínico, biotina, ácido fólico y vitamina B12. Después de preparar el medio, el

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aproximadamente 40 % en peso de DHA n-3, de aproximadamente el 6 % en peso a aproximadamente el 10 % en peso de DPA n-6 y de aproximadamente 0 % en peso a aproximadamente 3 % en peso de EPA n-3.

[0101] 117. La composición lipídica puede comprender adicionalmente de aproximadamente 11 % en peso a

5 aproximadamente 15 % en peso (por ejemplo, aproximadamente 13 % en peso) de ácido mirístico, de ácido aproximadamente 7 % en peso a aproximadamente 11 % en peso (por ejemplo, aproximadamente 9 % en peso) de ácido pentadecanoico, de aproximadamente 37 % en peso a aproximadamente 41 % en peso (por ejemplo, aproximadamente 39 % en peso) de ácido palmítico, de aproximadamente 3 % en peso a aproximadamente 7 % en peso (por ejemplo, aproximadamente 5 % en peso) de ácido palmitoleico, de aproximadamente 0 a aproximadamente 3 % en peso (por ejemplo, aproximadamente 1 % en peso) de ácido esteárico, o de aproximadamente 1 % en peso a aproximadamente 4 % en peso (por ejemplo, aproximadamente 2 % en peso) de ácido oleico.

[0102] 118. La composición lipídica puede comprender DHA n-3 en concentraciones que superan 15 aproximadamente 400 mg de biomasa, DPA n-6 en concentración que supera 100 mg de biomasa.

[0103] 119. La composición lipídica puede comprender adicionalmente carotenoides. Los ejemplos de dichos carotenoides incluyen beta-caroteno, licopeno, astaxantina, zeaxantina, cantaxantina, equinenona, fenicoxantina, capsantina, luteína, achiote, beta-apo-8-carotenal y beta-apo-8-carotenal-éster.

[0104] 120. En un aspecto, la composición puede comprender al menos aproximadamente 24 % en peso de DHA n-3, aproximadamente 1 % en peso de DPA, aproximadamente 6 % de DPA n-6 y aproximadamente 1 % en peso de EPA n-3.

25 7. Composiciones que contienen las moléculas producidas por el microorganismo eucariota

[0105] 121. Un alimento, complemento, composición farmacéutica tanto para seres humanos como para animales (incluyendo marinos) puede comprender la composición (lípido, lípido con antioxidante y solo antioxidante).

[0106] 122. También se desvela una fórmula infantil que comprende la composición (lípido, lípido con antioxidante y solo antioxidante).

C. Métodos

35 1. Métodos para preparar lípidos

[0107] 123. Se desvelan métodos para preparar una composición lipídica, comprendiendo el método: cultivar un microorganismo eucariota que comprende uno o más microorganismos de la familia Thraustochytriaceae, y aislar la composición lipídica.

[0108] 124. Pueden emplearse diversos procedimientos en la recuperación de la biomasa celular resultante de la fermentación en diversos medios de cultivo, tales como mediante filtración o centrifugación. Las células pueden después lavarse, congelarse, liofilizarse o secarse por pulverización y conservarse en una atmósfera no oxidante para eliminar la presencia de oxígeno, antes de la incorporación en un alimento o producto alimentario procesado.

45 [0109] 125. También pueden extraerse lípidos celulares que contienen los PUFA DHA (n-3) , EPA y DPA (n-6) de la biomasa celular por métodos tales como extracción de fluido supercrítico, o mediante extracción con disolventes tales como cloroformo, hexano, cloruro de metileno, o metanol, y el extracto resultante se evapora a presión negativa para producir una muestra de material lipídico concentrado. Los PUFA omega-3 y omega-6 pueden concentrarse adicionalmente hidrolizando los lípidos y concentrando la fracción altamente insaturada empleando métodos tradicionales tales como aducción de urea o destilación fraccional, cromatografía en columna o por fraccionamiento de fluido supercrítico. Las células también pueden degradarse o lisarse y extraerse los lípidos en aceites vegetales o animales (por ejemplo, aceites de pescado). Los aceites extraídos pueden refinarse por procedimientos bien conocidos empleados habitualmente para refinar aceites vegetales (por ejemplo, por

55 refinamiento químico o físico). Estos procedimientos de refinamiento retiran impurezas de aceites extraídos antes de usarse o comercializarse como aceites comestibles. Después de refinar, los aceites pueden usarse directamente como un aditivo de pienso o alimento para producir productos enriquecidos con omega-3 y/u omega-6. Como alternativa, el aceite puede procesarse y purificarse adicionalmente como se indica posteriormente y después usarse en las aplicaciones anteriores y también en aplicaciones farmacéuticas.

[0110] 126. En otro proceso para la producción de aceites omega-3 u omega-6 enriquecidos (concentrados), la biomasa celular recogida (fresca o seca) pueden alterarse o permeabilizarse mediante técnicas bien conocidas tales como ultrasonido, métodos de alteración de cizallamiento líquido, molienda con perlas, prensa en alta presión, congelación-descongelación o digestión enzimática de la pared celular. Los lípidos de las células rotas se extraen

65 usando un disolvente o mezcla de disolvente tal como hexano, cloroformo, éter o metanol. El disolvente se retira y

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los lípidos se hidrolizan usando cualquiera de los métodos bien conocidos para convertir triglicéridos en ácidos grasos libres o ésteres de ácidos grasos que incluyen hidrólisis, básica, ácida o enzimática. Después de completarse la hidrólisis, los compuestos no saponificables se extraen en un disolvente tal como éter, hexano o cloroformo y se retiran. La solución restante se acidifica después por adición de un ácido, y el ácido graso libre se extrae en un

5 disolvente tal como hexano, éter o cloroformo. La solución de disolvente que contiene los ácidos grasos libres puede después enfriarse a una temperatura suficientemente baja para la cristalización de los compuestos no PUFA, que después pueden retirarse mediante filtración, centrifugación o sedimentación, dando como resultado la concentración de los compuestos de PUFA restantes y usarse como complementos nutricionales para seres humanos, como un aditivo alimentario o como aplicaciones farmacéuticas.

10 [0111] 127. Además, se desvela una composición lipídica preparada mediante el método descrito anteriormente.

[0112] 128. Los microorganismos de la familia Thraustochytriaceae pueden ser cualquiera de los microorganismos desvelados anteriormente.

15 a) Medio

[0113] 129. El medio heterótrofo puede comprender sal marina (artificial o natural), una o más fuentes de carbono y una o más fuentes de nitrógeno. La sal marina puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 2,0 a 20 aproximadamente 40,0 g l-1. La concentración de la fuente de carbono y nitrógeno usada en condiciones de cultivo convencionales (no para alta concentración, sino para una fermentación más rentable) se encuentra dentro del intervalo de 5 g l-1 a 0 g l-1 y de 4 g l-1 a 10 g l-1, respectivamente. Para fermentación de alta concentración, la concentración de la fuente de carbono y nitrógeno usada en condiciones de cultivo convencionales se encuentra en el intervalo de 100 g l-1 y 160 g l-1 y 40 g l-1 a 60 g l-1, respectivamente. Siendo la tendencia la de la acumulación de 25 aceite, el microorganismo eucariota se desarrolla en un medio de cultivo (como los descritos anteriormente) en el que el aporte de nitrógeno se limita después de aproximadamente 24 a aproximadamente 48 horas, mientras que el aporte de carbono permanece abundante. Este microorganismo eucariota continúa asimilando el carbono (en forma de azúcares sencillos) pero ya no puede experimentar división celular debido a una falta de nitrógeno para la generación de proteínas y ácidos nucleicos importantes. El resultado es que esos azúcares se convierten en aceites

30 de almacenamiento, de una manera muy similar a la que describe Ratledge C. (Lipid Tech. 16: 34-39, 2004) y la Figura 9 representa este fenómeno específico para este organismo.

[0114] 130. La fuente de nitrógeno puede ser una o más de peptona, extracto de levadura, extracto de malta, glutamato sódico. La fuente de nitrógeno también puede ser agua de macerado de maíz o extracto de semilla de

35 algodón. La fuente de nitrógeno puede comprender extracto de levadura y/o peptona o glutamato monosódico. Por ejemplo, la fuente de nitrógeno puede incluir, pero sin limitación, EMD™ YE-MSG, EMD™ YE, EMD™ Peptona-MSG, Sigma™ YE-MSG, Sigma™ YE, Fermtech™ YE-MSG, Fermtech™ YE, o harina de pescado (62 % de proteína). El extracto de levadura puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 2 g l-1. El glutamato monosódico puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 8 g l-1 .

40 [0115] 131. La fuente de carbono puede ser una o más de D-trehalosa, glicerol, ácido D-glucónico, ácido L-láctico, ácido D,L-málico, D-ribosa, Tween 20, D-fructosa, acetato, ácido acético, alfa-D-glucosa, maltosa, timidina, Lasparagina, D-xilosa, Tween 40, ácido α-ceto-glutárico, sacarosa, L-glutamina, Tween 80, beta-metil-D-glucósido, maltotriosa, adenosinina, ácido fumárico, ácido bromo succínico, L-serina, D-celobiosa, L-alanil-glicina, metil

45 piruvato, ácido L-málico, glicil-L-prolina, D-palcosa, L-lixosa, ácido pirúvico, alfa-D-lactosa, dextrina, D-arabinosa, 2desoxi-D-ribosa, gelatina, dextrosa, almidón, 3-0-beta-D-galactopiranosil-D-arabinosa, D-tagatosa, ácido 5-ceto-Dglucónico, ácido oxalomálico, ácido sórbico, L-ornitina y dihidroxi acetato. En un aspecto, la fuente de carbono puede ser ácido D, L-málico, D-fructosa, D-xilosa, ácido fumárico, D-celobiosa, ácido 5-ceto-D-glucónico, ácido pirúvico, alfa-D-lactosa, dextrina de maíz, gelatina, almidón de maíz o almidón de trigo. La fuente de carbono puede estar

50 presente en una cantidad de aproximadamente1 g l-1 a aproximadamente 60 g l-1 y hasta aproximadamente 200 g l-1.

[0116] 132. En un ejemplo, el medio puede comprender aproximadamente 5 g de D-glucosa, aproximadamente 2 g de peptona, y aproximadamente 2 g de extracto de levadura por litro de agua salada (natural o artificial). En otro, el medio puede comprender aproximadamente 60 g de D-glucosa, aproximadamente 10 g de extracto de levadura por

55 litro de agua salada (natural o artificial). En otro, el medio puede comprender aproximadamente 8 g de extracto de levadura, 32 g de MSG, 24 g de sal marina (natural y artificial) y 300 g de D-glucosa por litro.

[0117] 133. El medio puede comprender además fosfatos (por ejemplo, fosfato potásico y fosfatos sódicos). El medio puede comprender además sales inorgánicas (por ejemplo, sulfato de amonio, bicarbonato sódico, 60 ortovanadato sódico, cromato potásico, molibdato sódico, ácido selenioso, sulfato de níquel, sulfato de cobre, sulfato de cinc, cloruro de cobalto, cloruro de hierro, cloruro de manganeso). El medio puede comprender además un compuesto quelante (por ejemplo, EDTA). El medio puede comprender además vitaminas (por ejemplo, clorhidrato de piridoxina, clorhidrato de tiamina, pantotenato de calcio, ácido p-aminobenzoico, riboflavina, ácido nicotínico, biotina, ácido fólico y vitamina B12). El medio puede estar a un pH de aproximadamente 4, 0 a aproximadamente 6,

65 5.

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secuencia y ajustar las composiciones y métodos relacionados con una secuencia particular o con otras secuencias relacionadas. Pueden diseñarse cebadores y/o sondas para cualquier secuencia, dada la información desvelada en el presente documento y conocida en la técnica.

5 c) Cebadores y sondas

[0142] 158. Se desvelan composiciones que incluyen cebadores y sondas, que pueden interaccionar con los genes desvelados en el presente documento. En ciertas realizaciones, los cebadores se usan para dar soporte a las reacciones de amplificación de ADN. Normalmente los cebadores podrán extenderse de una manera específica de secuencia. La extensión de un cebador de una manera específica de secuencia incluye cualquier método en el que la secuencia y/o composición de la molécula de ácido nucleico con la que el cebador se hibrida, o se asocia de otro modo, dirige o influye en la composición o secuencia del producto producido por la extensión del cebador. La extensión del cebador de una manera específica de secuencia incluye por lo tanto, pero sin limitación, PCR, secuenciación de ADN, extensión de ADN, polimerización de ADN, transcripción de ARN o transcripción inversa. Se 15 prefieren técnicas y condiciones que amplifiquen el cebador de una manera específica de secuencia. En ciertos aspectos, los cebadores pueden usarse como sondas específicas de especie o género para el Thraustochytrium o Bacillus mencionados en el presente documento. En este caso, los cebadores se diseñarían para que fuesen específicos del microorganismo eucariota, realizando posteriormente reacciones de PCR. La presencia de especies diana se determinaría después mediante la formación de producto por PCR con éxito. En ciertos aspectos los cebadores también pueden usarse para reacciones de amplificación de ADN, tales como PCR o secuenciación directa. Se entiende que, en ciertos aspectos los cebadores también pueden extenderse usando técnicas no enzimáticas, en las que, por ejemplo, los nucleótidos u oligonucleótidos usados para extender el cebador se modifican de tal modo que reaccionarán químicamente con el cebador de una manera específica de secuencia. Normalmente los cebadores desvelados hibridan con el ácido nucleico o región del ácido nucleico o hibridan con el

25 complemento del ácido nucleico o complemento de una región del ácido nucleico.

d) Suministro de ácido nucleico

[0143] 159. En los métodos descritos anteriormente que incluyen la administración y captación de ADN exógeno en las células de un sujeto (es decir, transducción o transfección génica), los ácidos nucleicos desvelados pueden estar en forma de ADN o ARN desnudo, o los ácidos nucleicos pueden estar en un vector para suministrar los ácidos nucleicos a las células, por lo que el fragmento de ADN que codifica anticuerpos está bajo la regulación transcripcional de un promotor, como entendería bien un experto habitual en la materia. El vector puede ser una preparación disponible en el comercio, tal como un vector de adenovirus (Quantum Biotechnologies, Inc. (Laval,

35 Quebec, Canadá). El suministro del ácido nucleico o vector a células puede ser mediante diversos mecanismos. Como un ejemplo, el suministro puede ser mediante un liposoma, usando preparaciones de liposomas disponibles en el comercio tales como LIPOFECTIN, LIPOFECTAMINE (GIBCO-BRL, Inc., Gaithersburg, MD), SUPERFECT (Qiagen, Inc. Hilden, Alemania) y TRANSFECTAM (Promega Biotec, Inc., Madison, WI), así como otros liposomas desarrollados de acuerdo con procedimientos convencionales en la técnica. Además, el ácido nucleico o vector desvelado puede suministrarse in vivo por electroporación, cuya tecnología está disponible en Genetronics, Inc. (San Diego, CA) así como por medio de un aparato de sonoporación (ImaRx Pharmaceutical Corp., Tucson, AZ).

[0144] 160. Como un ejemplo, el suministro del vector puede ser mediante un sistema viral, tal como un sistema de vector retroviral que puede empaquetar un genoma retroviral recombinante (véase, por ejemplo, Pastan et al., Proc. 45 Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 4486, 1988; Miller et al., Mol. Cell. Biol. 6: 2895, 1986). El retrovirus recombinante puede usarse después para infectar y de este modo suministrar a las células infectadas ácido nucleico que codifica un anticuerpo (o fragmento activo del mismo) ampliamente neutralizador. El método exacto para introducir el ácido nucleico alterado en células de mamífero, no está, por supuesto, limitado al uso de vectores retrovirales. Otras técnicas están ampliamente disponibles para este procedimiento, incluyendo el uso de vectores adenovirales (Mitani et al., Hum. Gene Ther. 5: 941-948, 1994), vectores virales adenoasociados (AAV) (Goodman et al., Blood 84: 14921500, 1994), vectores lentivirales (Naidini et al., Science 272: 263-267, 1996), vectores retrovirales pseudotipificados (Agrawal et al., Exper. Hematol. 24: 738-747, 1996). También pueden usarse técnicas de transducción física, tales como suministro con liposomas y mecanismos mediados por receptores y otros por endocitosis (véase, por ejemplo, Schwartzenberger et al., Blood 87: 472-478, 1996). Las composiciones y métodos desvelados pueden usarse junto

55 con cualquiera de estos u otros métodos de transferencia de genes.

4. Sistemas de expresión

[0145] 161. Los ácidos nucleicos que se suministran a las células normalmente contienen sistemas de control de expresión. Por ejemplo, los genes insertados en sistemas virales y retrovirales habitualmente contienen promotores y/o potenciadores para ayudar a controlar la expresión del producto génico deseado. Un promotor generalmente es una secuencia o secuencias de ADN que actúan cuando están en una localización relativamente fija con respecto al sitio de inicio de la transcripción. Un promotor contiene elementos principales requeridos para la interacción básica de ARN polimerasa y factores de transcripción, y pueden contener elementos cadena arriba y elementos de

65 respuesta.

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[0146] 162. Se entiende que hay diversos sistemas de control de la transcripción que pueden usarse en los organismos desvelados en el presente documento, además de los sistemas generales analizados más adelante. Se entiende que los organismos desvelados en el presente documento pueden transfectarse y transformarse con diversos genes, tales como genes marcadores, como se analiza en el presente documento, o genes que tienen otros

5 atributos deseables, tales como características de crecimiento potenciadas o exclusivas.

a) Promotores y potenciadores virales

[0147] 163. Pueden obtenerse promotores preferidos que controlan la transcripción de vectores en células

10 hospedadoras de mamífero de diversas fuentes, por ejemplo, los genomas de virus tales como: polioma, virus de simio 40 (SV40), adenovirus, retrovirus, virus de la hepatitis B y más preferentemente citomegalovirus, o de promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, promotor de beta actina. Los promotores tempranos y tardíos del virus SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción de SV40 que también contiene el origen de replicación viral de SV40 (Tiers et al., Nature, 273: 113, 1978). El promotor temprano inmediato del

15 citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción de HindIII E (Greenway,

P.J. et al., Gene 18: 355-360, 1982). Por supuesto, los promotores de la célula hospedadora o de especies relacionadas también son útiles en el presente documento.

[0148] 164. Un potenciador generalmente se refiere a una secuencia de ADN que actúa a una distancia no fija del 20 sitio de inicio de la transcripción y puede estar en posición 5’ (Laimins, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 993, 1981)

o 3’ (Lusky, M.L., et al., Mol. Cell Bio. 3: 1108, 1983) de la unidad de transcripción. Además, los potenciadores pueden estar dentro de un intrón (Banerji, J.L. et al., Cell 33: 729, 1983) así como dentro de la propia secuencia codificante (Osborne, T.F., et al., Mol. Cell Bio. 4: 1293, 1984). Habitualmente tienen una longitud de entre 10 y 300 pb, y actúan en cis. Los potenciadores actúan para aumentar la transcripción de promotores cercanos. Los 25 potenciadores también contienen con frecuencia elementos de respuesta que actúan como mediadores en la regulación de la transcripción. Los promotores también pueden contener elementos de respuesta que actúan como mediadores en la regulación de la transcripción. Los potenciadores determinan, con frecuencia, la regulación de expresión de un gen. Aunque actualmente se conocen muchas secuencias potenciadoras de genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, alfafetoproteína e insulina), normalmente se usará un potenciador de un virus de célula

30 eucariota para la expresión general. Son ejemplos preferidos el potenciador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación (100-270 pb), el potenciador del promotor temprano del citomegalovirus, el potenciador del polioma en el lado tardío del origen de replicación y potenciadores de adenovirus.

[0149] 165. El promotor y/o potenciador puede activarse específicamente mediante luz o acontecimientos químicos

35 específicos que desencadenan su función. Los sistemas pueden regularse por reactivos tales como tetraciclina y dexametasona. También hay maneras de potenciar la expresión génica del vector viral por exposición a irradiación, tal como irradiación gamma, o fármacos alquilantes desde un punto de vista quimioterapéutico.

[0150] 166. En determinadas realizaciones, el promotor y/o la región potenciadora, pueden actuar como un promotor

40 y/o potenciador constitutivo para maximizar la expresión de la región de la unidad de transcripción que se va a transcribir. En determinadas construcciones el promotor y/o la región potenciadora pueden estar activos en todos los tipos de células eucariotas, incluso si solamente se expresan en un tipo de célula particular en un momento particular. Un promotor preferido de este tipo es el promotor de CMV (650 pb).Otros promotores preferidos son promotores de SV40, citomegalovirus (promotor de longitud completa) y el vector retroviral LTF.

45 [0151] 167. Se ha mostrado que todos los elementos reguladores específicos pueden clonarse y usarse para construir vectores de expresión que se expresan de manera selectiva en tipos de células específicas tales como células de melanoma. El promotor de proteínas acéticas fibrilares gliales (GFAP) se ha usado para expresar de manera selectiva genes en células de origen glial.

50 [0152] 168. Los vectores de expresión usados en células hospedadoras eucariotas (células de levadura, hongos, insectos, plantas, animales, seres humanos o células con núcleo) también pueden contener secuencias necesarias para la terminación de la transcripción que pueden afectar a la expresión del ARNm. Estas regiones se transcriben como segmentos poliadenilados en la parte no traducida del ARNm que codifica la proteína del factor tisular. Las

55 regiones no traducidas 3’ también incluyen sitios de terminación de la transcripción. Se prefiere que la unidad de transcripción también contenga una región de poliadenilación. Un beneficio de esta región es que aumenta la probabilidad de que la unidad transcrita se procese y se transporte como ARNm. La identificación y uso de señales de poliadenilación en construcciones de expresión está bien establecido. Se prefieren usar señales de poliadenilación homóloga en las construcciones de transgenes. En determinadas unidades de transcripción, la

60 región de poliadenilación deriva de la señal de poliadenilación temprana de SV40 y consiste en aproximadamente 400 bases. También se prefiere que las unidades transcritas contengan otras secuencias convencionales solas o en combinación con las secuencias anteriores que mejoran la expresión, o la estabilidad, de la construcción.

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[ ] DHA: [ ] EPA Lípidos totales Peso (g)

ONC-T21

ONC-T22: 22,72 3,26 47,58 0,60

ONC-T23

ONC-T24: 11,73 3,56 33,56 0,70

ONC-T25: 26,99 6,11 45,67 0,60

ONC-T26: 14,50 6,43 39,22 0,60

ONC-T27: 26,83 7,75 61,87 0,70

ONC-T28: 16,62 6,02 38,28 0,90

ONC-T29: 14,67 4,91 34,48 0,80

ONC-T30: 16,56 5,42 81,38 0,80

ONC-T31: 13,36 5,74 44,86 0,30

ONC-T32: 19,12 6,56 53,29 0,20

ONC-T33

ONC-T34: 18,92 5,98 53,36 0,60

ONC-T35

ONC-T36

ONC-T37: 35,69 11,06 82,73 0,10

ONC-T38: 22,73 10,94 51,56 0,10

ONC-T39

ONC-T40: 26,87 8,83 67,87 0,80

ONC-T41: 22,85 6,65 52,63 0,50

ONC-T42: 33,65 9,22 83,93 0,80

ONC-T43: 12,49 3,25 37,93 0,80

ONC-T44: 11,71 2,93 55,05 1,10

ONC-T45: 26,08 7,95 70,45 0,70

ONC-T46: 33,34 6,27 63,76 0,30

ONC-T47: 10,01 4,77 68,02 0,70

ONC-T48: 26,23 3,95 69,06 0,60

ONC-T49: 16,64 4,89 39,76 0,30

ONC-T50: 13,64 4,56 40,30 1,00

ONC-T51

ONC-T52: 26,57 4,55 41,36 0,60

ONC-T53: 11,40 3,56 29,20 0,70

ONC-T54: 10,34 3,18 29,31 0,70

ONC-T55

ONC-T56

ONC-T57

ONC-T58: 10,30 3,13 27,10 0,70

ONC-T59

ONC-T60: 27,71 7,01 66,84 0,30

ONC-T61: 15,72 5,62 52,56 0,40

ONC-T62

ONC-T63: 20,17 8,25 62,58 0,60

ONC-T64: 12,16 2,97 44,73 1,10

ONC-T65

ONC-T66

ONC-T67: 23,71 5,63 43,24 0,50

ONC-T68: 22,72 6,10 41,37 0,50

[0275] 291. Se entiende que, como en el caso de ONC-T18, como se describe en el presente documento, se desvela un conjunto de microbios productores de aceite, representado por sus capacidades productoras de aceite desveladas en el presente documento, tal como por un porcentaje de producción de DHA y aceite total, o por la

5 producción de DHA total, por ejemplo.

2. Ejemplo 2 Identificación de especies eucariotas de Thraustochytrium ONC-T18 usando técnicas genéticas

[0276] 292. Usando técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y cebadores que se dirigen al gen del

10 ARN ribosómico 18S, que es universal para todas las especies eucariotas, fue posible generar productos de PCR de los genes estructurales del microorganismo eucariota aislado de ONC-T18 (según el ejemplo 1). Después se secuenciaron los productos de la PCR y se designó la SEQ ID NO: 1 para las especies eucariotas (véase la figura

40

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10. Ejemplo 10: Multiplicador de peso seco de las células

[0292] 308. Thraustochytrium sp. ONC-T18 puede cultivarse para la producción de aceites omega 3 en diversas configuraciones de reactor hasta 100.000 l. Todas las fermentaciones comienzan con la preparación de un inóculo 5 de volumen final de 10-20 %, que se usa para establecer el cultivo de fermentación. Las configuraciones del medio inicial comprenden hasta 6 g/l de sal marina, 10 g/l de fuente de nitrógeno y 60 g/l de fuente de carbono, con la adición semicontinua de otra fuente de carbono 75 g/l después de 24 a 36 horas de fermentación inicial durante 72 a 96 horas adicionales y se realiza dentro del intervalo de temperatura de 18-25 ºC. Por ejemplo, usando el medio de sal marina 6 g/l, extracto de levadura 2 g/l, L-glutamato 8 g/l y D-glucosa 60 g/l (con una adición de 75 g/l añadido 10 después de 36 horas), cultivado a 25 ºC durante 96 horas, ONC-T18 pudo producir 40 g/l de peso seco de las células (dcw, dry cell weight), 80 % (dcw) de ácidos grasos totales (TFA)/fracción lipídica (entre C14:0 y C24:0) y 30 % de DHA (TFA). De forma similar, es posible aumentar el peso seco de las células multiplicando los componentes de medios, tanto de nitrógeno como de carbono, para obtener un efecto de multiplicación similar en la biomasa sin afectar al contenido de TFA o de DHA. Por ejemplo, usando el medio de sal marina 24 g/l, extracto de

15 levadura 8 g/l, L-glutamato 32 g/l y D-glucosa 300 g/l, cultivado a 25 ºC durante 312 horas, ONC-T18 pudo producir 80 g/l de peso seco de las células (dcw), 60 % (dcw) de ácidos grasos totales (TFA)/fracción lipídica (entre C14:0 y C24:0) y 38 % de DHA (TFA).

11. Ejemplo 11. Cultivo de Thraustochytrium sp. ONC-T18 en diversas fuentes de carbono (C) y nitrógeno (N) 20 alternativas y el efecto sobre el peso seco de las células y lípidos

[0293] 309. Se investigó el crecimiento de Thraustochytrium sp. ONC-T18 en diversas fuentes de nitrógeno y carbono de bajo coste. Específicamente, durante 72 horas a 25 ºC, se cultivaron 50 ml de ONC-T18 en matraces de 250 ml que contenían sales marinas artificiales 6 g/l. Las concentraciones de fuente de carbono y nitrógeno se

25 muestran más adelante con 2 g/l de cada fuente de nitrógeno enumerada, usadas junto con 8 g/l de L-glutamato (con la excepción de harina de pescado, en la que se usaron 4 g). Las fuentes de carbono se intercambiaron como se indica. Todos los experimentos se realizaron por triplicado; todas las extracciones para el análisis de metil éster de ácidos grasos, se realizaron por triplicado junto con inyecciones de CG por triplicado.

30 [0294] 310. Los resultados indican que Thraustochytrium sp. ONC-T18 produce biomasa seca de células óptima (es decir, mayor que la de los dos medios de control) cuando se cultiva en las fuentes de nitrógeno EMD de extracto de levadura y harina de pescado. Por el contrario, se descubrió que los lípidos eran menores que en el control, mientras que DHA era óptimo usando agua de macerado de maíz y peptona EMD. Finalmente, se descubrió que la fuente de carbono de dextrosa aumentaba el contenido de lípidos, mientras que la fructosa y la dextrosa producían

35 alto contenido de DHA en comparación con los controles.

TABLA 7. Cultivo de Thraustochytrium sp. ONC-T18

Medio (sal 6 g/l, cultivo de 72 h,cultivos de 50 ml): C (g/l) N (g/l) dcw/l medio (g) Lípido (mg/g) Lípido (g/l) DHA (mg/g) DHA (g/l) DHA (% de lípidos)

Fuentes de nitrógeno: Agua de macerado de maíz-MSG 60 10 11,36 371,97 4,33 111,64 1,244 29,72

Semilla de algodón-MSG: 60 10 9,99 297,08 2,70 45,20 0,500 16,94

EMD™YE-MSG: 60 10 15,49 343,96 5,02 70,68 0,786 20,70

EMD™YE: 60 10 35,79 189,01 6,76 37,14 0,448 19,65

EMD™YE Peptona-MSG: 60 10 11,70 379,48 4,19 83,50 0,926 23,33

Sigma™YE-MSG: 60 10 9,77 257,86 3,28 54,60 0,618 19,69

Sigma™YE: 60 10 10,39 341,98 3,53 58,30 0,629 17,01

Fermtech™YE-MSG: 60 10 13,99 269,53 3,82 56,97 0,664 21,10

Fermtech™YE: 60 10 17,07 243,23 4,15 48,01 0,530 19,74

Harina de pescado (62 % de proteína): 60 10 19,53 290,72 5,68 73,59 0,828 25,31

Fuentes de carbono: Fructosa 60 10 14,57 498,54 8,09 96,97 1,070 21,55

Dextrosa: 60 10 14,98 623,91 9,87 113,69 1,232 18,94

Dextrina de maíz: 60 10 4,65 89,69 0,39 25,69 0,278 26,75

Gelatina: 60 10 7,09 31,87 0,13 11,86 0,127 27,70

Almidón (maíz): 5 10 4,85 94,04 0,46 19,49 0,206 20,72

30: 10 3,13 90,07 0,28 23,78 0,256 26,40

Almidón (trigo): 5 10 8,03 86,96 0,47 17,62 6,185 17,76

30: 10 18,16 18,59 0,34 3,83 0,042 20,58

Medio de control (1): 60 10 16,92 487,59 8,25 70,87 0,768 13,25

Medio de control (2): 60 10 10,88 483,06 6,06 74,64 0,818 16,19

Abreviaturas: 47

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Claims

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