ES2560864T3

ES2560864T3 - Sistema de alta sensibilidad y métodos de análisis de la troponina

Info

Publication number: ES2560864T3
Application number: ES07754941.8T
Authority: ES
Inventors: Philippe Goix; Robert Puskas; John Todd; Richard Livingston; Douglas Held; Alan H. Wu
Original assignee: University of California; Singulex Inc
Current assignee: University of California; Singulex Inc
Priority date: 2006-04-04
Filing date: 2007-04-04
Publication date: 2016-02-23
Anticipated expiration: 2027-04-04
Also published as: EP2016394A2; EP2386858A1; ES2703813T3; EP2386858B1; CN101438146A; EP2472258A2; JP2015004691A; AU2007313488A1; EP2002260A4; CA2648385C; CA2648382A1; WO2008048371A9; EP2002260A2; CN101438146B; EP2016394A4; US9977031B2; CA2648382C; EP4357783A2; ES2550004T3; CA2648385A1

Abstract

Un método para determinar la presencia o ausencia de una única molécula de troponina, o un fragmento o complejo de la misma, en una muestra, que comprende: i) marcar dicha molécula, fragmento o complejo con una etiqueta que comprende una unidad estructural fluorescente; y ii) detectar la presencia o ausencia de dicha etiqueta haciendo pasar dicha etiqueta a través de una única molécula de detección, en donde la detección de la presencia de dicha etiqueta indica la presencia de dicha única molécula, fragmento o complejo de troponina en dicha muestra; y en donde dicha detección es capaz de detectar dicha única molécula de troponina en un límite de detección de menos 3 pg/mL con un coeficiente de variación (CV) de 10% o menos.

Description

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DESCRIPCION

Sistema de alta sensibilidad y metodos de analisis de la troponina Antecedentes de la invencion

Cada ano en los Estados Unidos, unos seis millones de personas se presentan a los servicios de urgencias con dolor toracico. Aunque solo del 15% al 20% de estos pacientes son diagnosticados en ultima instancia, con un smdrome coronario agudo (ACS), aproximadamente la mitad son admitidos para su evaluacion. Por el contrario, 2% de los pacientes con ACS son erroneamente dados de alta. Como los pacientes con ACS tienen un riesgo relativamente alto de eventos cardiovasculares adversos en el corto plazo, hay una clara necesidad de herramientas objetivas precisas con los cuales se puedan identificar

Los marcadores utilizados actualmente para el dano cardiaco sufren desventajas que limitan su utilidad clmica. Los ensayos enzimaticos cardiacos han servido de base para determinar si hay o no dano al musculo cardiaco. Desafortunadamente, el ensayo estandar de la creatina quinasa-MB (CK-MB) no es confiable en la exclusion del infarto hasta las 10 a 12 horas despues de la aparicion de dolor toracico. El diagnostico precoz tendna ventajas muy espedficas con respecto a la terapia fibrinolttica y determinacion de prioridades.

Resumen de la invencion

De acuerdo con lo anterior, la presente invencion prove un metodo para determiner la presencia o ausencia de una unica molecula de troponina o un fragmento o complejo de la misma en una muestra, que comprende i) marcar la molecula, fragmento, o complejo, con una etiqueta que comprende una unidad estructural fluorescente; y ii) detectar la presencia o ausencia de la etiqueta, haciendo pasar la etiqueta por medio de una unica molecula de deteccion, en donde la deteccion de la presencia de la etiqueta indica la presencia de la unica molecula, fragmento, o complejo de troponina en la muestra, y en donde la deteccion es capaz de detectar la molecula unica de troponina a un lfmite de deteccion de menos de 3 pg/mL con un coeficiente de variacion (CV) de 10% o menos. Aspectos adicionales del metodo de la invencion se definen en las reivindicaciones 2 a 6. En algunas realizaciones de los metodos de la invencion, la troponina es isoforma cardiaca de troponina. La tropotonina puede ser tropotonina I cardiaca (cTnl) o troponina C cardiaca (cTnC); preferiblemente cTnI. La unidad estructural fluorescente puede ser capaz de emitir al menos aproximadamente 200 fotones cuando se simula por un emisor de luz laser a la longitud de onda de excitacion de la unidad estructural, cuando el laser se enfoca en un punto de no menos de aproximadamente 5 micras de diametro que contiene la unidad estructural, y donde la energfa total dirigida en el punto por el laser no es mas de aproximadamente 3 microjulios. La unidad estructural fluorescente puede incluir opcionalmente una molecula que contiene al menos un sistema de anillo de indolio sustituido en el cual, el sustituyente en el carbono 3 del anillo de indolio contiene un grupo qmmicamente reactivo o un grupo de sustancias conjugadas. La unidad estructural fluorescente puede incluir un colorante. Ejemplos de tales colorantes incluyen, pero no se limitan a, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 680 y Alexa Fluor 700. Una unidad estructural fluorescene preferidapuede incluir Alexa Fluor 647. La unidad estructural fluorescente puede incluir opcionalmente una molecula que contiene al menos un sistema de anillo de indolio sustituido en el cual el sustituyente en el carbono 3 del anillo de indolio contiene un grupo qmmicamente reactivo o un grupo de sustancias conjugadas. En algunas realizaciones de los metodos de la invencion, la etiqueta incluye ademas un asociado de union de la molecula de troponina, fragmento, o complejo. En algunas realizaciones de los metodos de la invencion, el asociado de union incluye un anticuerpo espedfico para la molecula de troponina, fragmento, o complejo. El anticuerpo puede ser espedfico para una region espedfica de la molecula de troponina; preferiblemente el anticuerpo es espedfico para una region que comprende los aminoacidos desde 27-41 de la troponina I cardiaca. El anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal. Los metodos pueden incluir ademas la captura de troponina o complejo de troponina sobre un soporte solido. El soporte solido puede ser una placa de microtitulacion o perlas paramagneticas. El soporte solido puede incluir un asociado de captura espedfico para la troponina o el complejo de troponina que esta unido al soporte solido. La union del asociado de captura con el soporte solido puede ser no covalente o covalente. Cuando es covalente, la union covalente del asociado de captura es tal que el asociado de captura esta unido al soporte solido en una orientacion espedfica. La orientacion espedfica puede servir para maximizar la union espedfica de la troponina o el complejo de troponina con el asociado de captura. El asociado de captura puede comprender un anticuerpo; opcionalmente un anticuerpo monoclonal, opcionalmente el anticuerpo es espedfico para los aminoacidos 87-91 de la troponina I cardiaca; o el anticuerpo es espedfico para los aminoacidos 41-49 de la troponina I cardiaca. La muestra puede ser una muestra de sangre, suero o de plasma; preferiblemente una muestra de suero. El detector de una unica molecula puede incluir incluye: a) una fuente de radiacion electromagnetica para estimular la unidad estructural fluorescente; b) una celda de flujo capilar para pasar la unidad estructural fluorescente; c) una fuente de fuerza motriz para mover la unidad estructural fluorescente en la celda de flujo capilar; d) un espacio de interrogacion definida dentro de la celda de flujo capilar para recibir la radiacion electromagnetica emitida desde la fuente electromagnetica; e) un detector de radiacion electromagnetica operativamente conectado al espacio de interrogacion para medir una caractenstica electromagnetica de la unidad estructural fluorescente estimulada; y f) una lente del objetivo del microscopio situada entre el espacio de interrogacion y el detector, donde la lente es una lente de alta abertura numerica.

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La presente invencion tambien provee un metodo como se define en la reivindicacion 7. Aspectos opcionales o preferidos se establecen en las reivindicaciones 8 a 13. La etapa ii) puede incluir un analisis tal como comparando la concentracion o la serie de concentraciones con un valor normal para la concentracion, comparando la concentracion o la serie de concentraciones con un nivel de umbral predeterminado, comparando la concentracion o series de las concentraciones con un valor de referencia, y determinar una velocidad de cambio de la concentracion para la serie de concentraciones. Se describen aqm metodos en los que la etapa ii) incluye comparar la concentracion de troponina en la muestra con una concentracion umbral predeterminada, y determinar un diagnostico, pronostico, o metodo de tratamiento si la concentracion de la muestra es mayor que el nivel umbral. La concentracion umbral puede ser determinada por la determinacion de una concentracion del percentil 99° de la troponina en un grupo de individuos normales, y el establecimiento de la concentracion umbral en la concentracion de percentil 99°. Al menos se puede tomar una muestra durante o despues de una prueba de esfuerzo cardiaco. La troponina cardiaca se puede seleccionar del grupo que consiste en troponina I cardiaca y la troponina T cardiaca; preferiblemente troponina I cardiaca. La concentracion de troponina cardiaca puede ser una concentracion de la troponina cardiaca total. La concentracion de troponina cardiaca puede ser una concentracion de un complejo de troponina cardiaca, fragmento de troponina cardiaca, la troponina cardiaca fosforilada, la troponina cardiaca oxidada, o una combinacion de los mismos. La concentracion de troponina cardiaca puede ser comparada con la troponina cardiaca total. Se describen aqm metodos para el diagnostico, el pronostico, o metodo de tratamiento del infarto de miocardio. Un diagnostico, pronostico, o metodo de tratamiento puede comprender la estratificacion del riesgo para el nivel de riesgo del infarto de miocardio. La concentracion o la serie de concentraciones puede ser determinada en o cerca del momento que el individuo se presenta a un profesional de la salud con uno o mas smtomas indicativos de isquemia miocardica o infarto o la posibilidad del mismo. El o los smtomas pueden ser dolor toracico, presion en el pecho, dolor en el brazo, EKG anormal, los niveles de enzimas anormales, o falta de aire. La concentracion puede ser determinada por un metodo que incluye la deteccion de moleculas unicas de troponina o complejos, o fragmentos de la misma. La marcacion de la troponina o un complejo de troponina puede ser una etiqueta que comprende una unidad estructural fluorescente. La unidad estructural fluorescente puede ser capaz de emitir al menos aproximadamente 200 fotones cuando se simula por un emisor de luz laser en la longitud de onda de excitacion de la unidad estructural, cuando el laser se enfoca en un punto de 5 micras de diametro que contiene la unidad estructural, y donde la energfa total dirigida en el punto por el laser es no mas de aproximadamente 3 microjulios. La unidad estructural fluorescente puede incluir una molecula que contiene al menos un sistema de anillo de indolio sustituido en el cual el sustituyente en el carbono 3 del anillo de indolio contiene un grupo qmmicamente reactivo o un grupo de sustancias conjugadas. Tal unidad estructural fluorescente puede incluir un colorante seleccionado del grupo que consiste en Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 680 o Alexa Fluor 700; preferiblemente la unidad estructural fluorescente comprende Alexa Fluor 647. La etiqueta puede comprender ademas un asociado de union para la troponina. El asociado de union puede comprender un anticuerpo espedfico para la troponina. El anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal. Se describen aqm metodos que incluyen ademas la captura de troponina o complejo de troponina sobre un soporte solido. El soporte solido puede ser una placa de microtitulacion o perlas paramagneticas. El soporte solido puede incluir un asociado de captura espedfico para la troponina o el complejo de troponina que esta unido al soporte solido. La union del asociado de captura con el soporte solido puede ser no covalente o covalente. Una union covalente del asociado de captura es tal que el asociado de captura esta unido al soporte solido en una orientacion espedfica. La orientacion espedfica puede servir para maximizar la union espedfica de la troponina o el complejo de troponina con el asociado de captura. Se describe aqm un metodo en el que la etapa i) puede implicar ademas la evaluacion de otro indicador para el individuo., y la etapa ii) puede implicar determinar un diagnostico, pronostico, o metodo de tratamiento en el individuo, basado en la concentracion de troponina y la evaluacion del otro indicador del marcador no-troponina en la muestra, o en las concentraciones en la serie de muestras. El otro indicador puede ser un indicador clmico de infarto o isquemia miocardica. El otro indicador puede ser la concentracion de uno o mas marcadores no-troponina en la muestra o la serie de muestras. El uno o mas marcadores pueden ser marcadores de isquemia cardiaca, o marcadores de inflamacion y de inestabilidad de la placa. Por ejemplo, el uno o mas marcadores de isquemia cardiaca pueden ser creatina quinasa (CK) y su banda miocardica (MB) de la unidad estructural miocardica CK, aspartato aminotransferasa, lactato deshidrogenasa (LDH), a-hidroxibutirato deshidrogenasa, la mioglobina, el glutamato oxaloacetato transaminasa, glucogeno fosforilasa BB, acidos grasos libres no unidos, protema de union a acidos grasos de corazon (H-FABP), albumina modificada por isquemia, miosina de cadena ligera 1, o miosina de cadena ligera 2. Los uno o mas marcadores pueden incluir uno o mas marcadores espedficos de dano miocardico. El diagnostico, el pronostico, o metodo de tratamiento es un diagnostico, pronostico, o metodo de tratamiento de una condicion que no es infarto de miocardio. La condicion puede ser toxicidad cardiaca. La toxicidad cardiaca puede estar asociada con la administracion de un farmaco para el individuo. La condicion puede ser seleccionada del grupo que consiste en fiebre reumatica aguda, amiloidosis, trauma cardiaco (incluyendo contusion, ablacion, ritmo, coccion, cardioversion, cateterizacion y cirugfa cardiaca), lesion por reperfusion, insuficiencia cardiaca congestiva, insuficiencia renal en fase terminal, enfermedad de almacenamiento de glucogeno tipo II (enfermedad de Pompe), trasplante de corazon, hemoglobinopatfa con hemosiderosis transfusional, hipertension, incluyendo la hipertension gestacional, hipotension, a menudo con arritmias, hipotiroidismo, miocarditis, pericarditis, la cirugfa no cardiaca post- operatoria, embolia pulmonar, y la sepsis.

Tambien, se describe en este documento una composicion para la deteccion de una isoforma de troponina incluyendo un asociado de union con la isoforma de troponina unida a una unidad estructural fluorescente, donde la unidad estructural fluorescente es capaz de emitir al menos aproximadamente 200 fotones cuando se simula por un emisor de luz laser a la longitud de onda de excitacion de la unidad estructural, cuando el laser se enfoca en un 5 punto de no menos de aproximadamente 5 micras de diametro que contiene la unidad estructural, y donde la energfa total dirigida en el punto por el laser es no mas de aproximadamente 3 microjulios. En tales composiciones, el asociado de union puede comprender un anticuerpo para la isoforma de troponina. En algunos casos, el anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal. La isoforma de troponina puede ser una isoforma cardiaca seleccionada del grupo que consiste de cTnl y cTnT; preferiblemente la isoforma cardiaca es cTnI. El 10 anticuerpo puede ser espedfico para una region espedfica de la molecula de troponina espedfica, por ejemplo, para

una region que comprende los aminoacidos 27-41 de la troponina I cardiaca. En las composiciones descritas, la unidad estructural fluorescente puede comprender una molecula que comprende al menos un sistema de anillo de indolio sustituido en el cual el sustituyente en el carbono 3 del anillo de indolio contiene un grupo qmmicamente reactivo o un grupo de sustancias conjugadas. La unidad estructural fluorescente puede incluir un colorante que 15 puede ser Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 680 o Alexa Fluor 700; preferiblemente la unidad estructural fluorescente comprende Alexa Fluor 647.

Tambien se describe en este documento una composicion que comprende un conjunto de estandares para determinar una concentracion de una troponina cardiaca, donde al menos uno de los estandares esta a una concentracion de troponina cardiaca de menos de aproximadamente 10 pg/mL.

20 Ademas se describe en este documento un kit que contiene una composicion que incluye un anticuerpo para la

troponina cardiaca unido a una unidad estructural de colorante fluorescente, donde la unidad estructural es capaz de emitir al menos aproximadamente 200 fotones cuando se simula por un emisor de luz laser a la longitud de onda de excitacion de la unidad estructural, cuando el laser se enfoca en un punto de no menos de aproximadamente 5 micras de diametro que contiene la unidad estructural, y donde la energfa total dirigida en el punto por el laser es no 25 mas de aproximadamente 3 microjulios, donde la composicion se envasa en un embalaje apropiado. En tales kits, la troponina cardiaca es la troponina I cardiaca o la troponina T cardiaca; por ejemplo la troponina I cardiaca. Tambien, en tales kits, los kits incluyen ademas las instrucciones. En otros kits, los kits incluyen ademas una composicion que contiene un anticuerpo de captura para la troponina I cardiaca unido a un soporte solido. El soporte solido puede comprender una placa de microtitulacion o micropartfculas paramagneticas. Los kits pueden incluir ademas un 30 componente seleccionado del grupo que consiste en solucion reguladora de lavado, solucion reguladora de ensayo, solucion reguladora de elucion, y el diluyente del calibrador. Tambien, los kits pueden incluir ademas un estandar para la troponina cardiaca.

Breve descripcion de los dibujos

35 Figuras 1A y 1B. Diagrama esquematico de la configuracion de los componentes de un analizador de partfcula unica. La figura 3A muestra un analizador que incluye una fuente electromagnetica y un detector electromagnetico; La figura 3B muestra un analizador que incluye dos fuentes electromagneticas y un detector electromagnetico.

Figuras 2A y 2B. Diagramas esquematicos de una celda de flujo capilar para un analizador de partfcula unica. La figura 4A muestra la celda de flujo de un analizador que incluye una fuente electromagnetica; y la figura 4B muestra 40 la celda de flujo de un analizador que incluye dos fuentes electromagneticas.

Figuras 3A y 3B. Diagramas esquematicos que muestran el posicionamiento convencional (A) y confocal (B) de la optica del detector y el laser de un analizador de partfcula unica. La figura 3A muestra la configuracion de un analizador que tiene una fuente electromagnetica y un detector electromagnetico; La figura 3B muestra la configuracion de un analizador que tiene dos fuentes electromagneticas y dos detectores electromagneticos.

45 Figura 4. Curva estandar linealizada para el rango de las concentraciones de cTnI.

Figura 5. Umbral biologico (concentracion de corte) para cTnI esta en una concentracion de cTnI de 7pg/mL, segun lo establecido en el percentil 99° con un CV correspondiente del 10%.

Figura 6. Correlacion de los resultados del ensayo de cTnI determinado utilizando el sistema de analisis de la especificacion con las mediciones estandar proporcionadas por el Instituto Nacional de Estandares y Tecnologfa (R2 50 = 0.9999).

Figura 7. Deteccion de cTnI en muestras de suero de serie de pacientes que se presentaron en la sala de urgencias con dolor toracico. Las mediciones realizadas con el sistema de analisis de la especificacion se compararon con las mediciones realizadas con un ensayo disponible comercialmente.

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Figura 8. Distribucion de las concentraciones biologicas normales de cTnl (No isquemia) y las concentraciones de cTnl en muestras de suero de pacientes con dolor toracico.

Las caractensticas novedosas de la invencion se exponen con particularidad en las reivindicaciones adjuntas. Una mejor comprension de las caractensticas y ventajas de la presente invencion se obtendra por referencia a la siguiente descripcion detallada que expone las realizaciones ilustrativas, en las que se utilizan los principios de la invencion y los dibujos adjuntos de los cuales:

Descripcion detallada

Resumen

I. Introduccion

II. Troponina cardiaca

III. Etiquetas para la troponina cardiaca

A. Asociados de union para troponina

1. Anticuerpos

2. Anticuerpos de reaccion con cruzamiento

B. Unidades estructurales fluorescentes para ser utilizadas con asociados de union

1. Colorantes

2. Puntos cuanticos

C. Composiciones asociado de enlace-unidad estructural fluorescente

IV. Analisis de alta sensibilidad de troponina cardiaca

A. Muestra

B. Preparacion de la muestra

C. Deteccion de la troponina y determinacion de la concentracion

V. Instrumentos y sistemas apropiados para el analisis de alta sensibilidad de troponina

A. Aparato/Sistema

B. Analizador de partfculas unicas

1. Fuente de radiacion electromagnetica

2. Celda de flujo capilar

3. Fuerza motriz

4. Detectores

C. Sistema de muestreo

D. Sistema de preparacion de la muestra

E. Recuperacion de la muestra

VI. Metodos que utilizan el analisis de alta sensibilidad de troponina cardiaca

A. Muestras

B. Determinacion de diagnostico, pronostico, o metodo de tratamiento

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1. Infarto agudo de miocardio

2. Condiciones distintas de AMI a. Toxicidad cardiaca

C. Metodos comerciales

VII. Composiciones

VIII. Kits

I. Introduccion

La memoria descriptiva describe composiciones y metodos para la deteccion altamente sensible de la troponina, por ejemplo, la troponina cardiaca. La liberacion en la sangre de las isoformas cardiacas de troponina, que son unicas para el musculo cardiaco (troponina I y/o T cardiaca) es indicativa del dano al musculo cardiaco, y provee la base para su uso como marcadores de diagnostico o pronostico, o para ayudar en la determinacion del tratamiento.

El complejo de troponina en el musculo se compone de troponina I, C y T. La troponina C existe como dos isoformas, una del musculo cardiaco y de contraccion lenta y uno de los musculos de contraccion rapida; porque se encuentra practicamente en todos los musculos estriados, su uso como un marcador espedfico es limitado. Por el contrario, la troponina I y T se expresan como diferentes isoformas en musculo de contraccion lenta, contraccion rapida y cardiaco. Las isoformas cardiacas unicas de la troponina I y T les permiten distinguirse inmunologicamente de las otras troponinas del musculo esqueletico. Por lo tanto, la liberacion en la sangre de troponina I y T cardiaca es indicativa de dano al musculo cardiaco, y provee la base para su uso como marcadores de diagnostico o pronostico, o para ayudar en la determinacion del tratamiento.

Los marcadores utilizados actualmente para el dano cardiaco sufren desventajas que limitan su utilidad clmica. Ensayos enzimaticos cardiacos han servido de base para determinar si hay o no dano al musculo cardiaco. Desafortunadamente, el ensayo estandar de la creatina quinasa-MB (CK-MB) no es confiable en la exclusion de infarto hasta las 10 a 12 horas despues de la aparicion de dolor toracico. El diagnostico precoz tendna ventajas muy espedficas con respecto a la terapia fibrinolttica y la determinacion de prioridades.

Debido a que el nivel de troponina encontrado en la circulacion de los individuos sanos es muy bajo, y las troponinas cardiacas espedficas no proceden de fuentes extra-cardiacas, las troponinas son marcadores muy sensibles y espedficos de lesion cardiaca. Ademas del infarto de corazon, un numero de otras condiciones puede causar dano al musculo del corazon, y la deteccion precoz de tales danos resultana util para los clmicos. Sin embargo, los metodos actuales de deteccion y cuantificacion de la troponina cardiaca no poseen suficiente sensibilidad para detectar la liberacion de troponina cardiaca en la sangre, hasta que los niveles hayan alcanzado las concentraciones anormalmente altas, por ejemplo, 0.1 ng/mL o mayor.

Los metodos y composiciones descritos en este documento incluyen de esta manera metodos y composiciones para la deteccion altamente sensible y cuantificacion de la troponina cardiaca, y composiciones y metodos para el diagnostico, pronostico y/o determinacion del tratamiento basado en dicha deteccion y cuantificacion altamente sensible.

II. Troponina cardiaca

Cuando las dos formas unicas de troponina cardiaca, la troponina I cardiaca (cTnI) y la troponina cardiaca (cTnT) son liberadas en la sangre a partir del musculo cardiaco, pueden existir varias especies de cada una en la sangre. Estas incluyen varios complejos de las dos formas, entre sf y/o con la troponina C cardiaca (cTnC). Ademas, las dos formas estan sujetas a la degradacion proteolftica practicamente inmediata, resultando en una variedad de fragmentos. Tambien, pueden existir diversas formas fosforiladas y oxidadas de las troponinas en la sangre. Vease, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 6,991,907. A menos que se especifique lo contrario, "troponina cardiaca", como se usa en este documento, abarca todas las formas de troponina cardiaca.

En algunos casos, la especificacion describe metodos y composiciones para la deteccion y/o determinacion de la concentracion de troponina cardiaca total, i.e., la suma de la totalidad o una parte sustancial de la troponina cardiaca en una muestra, por ejemplo, muestra de sangre, suero o plasma, si esta libre, en complejo, un fragmento proteolttico, fosforilado, oxidado, o modificado de otro modo. En algunas realizaciones de la invencion como se especifica en las reivindicaciones, la troponina cardiaca es cTnI, en otras, es cTnT, y, en incluso otras realizaciones de la invencion como se especifica en las reivindicaciones, la troponina cardiaca es cTnI y cTnT. Sera apreciado que una medicion total absoluta no tiene por que ser alcanzada, siempre y cuando una relacion constante del total se determina, que puede ser comparado con los valores estandar. Tambien se apreciara que si una forma de troponina es un constituyente menor de los niveles totales, bajos o ausencia de deteccion de esa forma no afectara

apreciablemente las medidas de troponina total. Por lo tanto, como se usa en este documento, la "troponina cardiaca total" se refiere a una medicion que esta destinada a medir todas o sustancialmente todas las formas de una troponina cardiaca particular, por ejemplo, toda la cTnI, o toda la cTnT, en una muestra, donde la consistencia muestra-a-muestra es tal que las conclusiones clmicamente relevantes se pueden extraer de las comparaciones de 5 las muestras con estandares, o la comparacion de una muestra con otra.

En algunos casos, la memoria descriptiva describe metodos y composiciones para la deteccion y/o determinacion de la concentracion de una o mas de las diversas formas de troponina en la muestra como una entidad separada, por ejemplo, cTnI en complejo, cTnI libre, cTnI turbia (por ejemplo, oxidada o fosforilada), o cTnT en complejo, cTnT libre, cTnT turbia (por ejemplo, oxidada o fosforilada), y, por lo general, puede proporcionar una concentracion de 10 esa forma en la muestra. En estos ultimos casos, relaciones o valores absolutos se pueden determinar por las diferentes entidades. Por lo tanto, en algunos casos, la especificacion describe metodos de deteccion y, por lo general, determinando la concentracion de, una o mas formas de troponina en complejo, o uno o mas fragmentos de la troponina, o una o mas formas oxidadas o fosforiladas de troponina. En algunos casos, se detecta mas de una forma, y las concentraciones de las diversas formas se pueden determinar por ejemplo, mediante la realizacion de 15 ensayos multiplexados en una sola muestra para las diferentes entidades, o mediante la realizacion de ensayos separados en alfcuotas a partir de las mismas o muestras similares. Se pueden obtener las relaciones de las concentraciones de las diversas formas. Por ejemplo, una relacion de la concentracion de una forma particular, por ejemplo, se puede determinar, un fragmento, complejo, o forma modificada, de la troponina cardiaca con la concentracion de la troponina cardiaca total. Estas relaciones y/o valores absolutos pueden proporcionar informacion 20 clmica significativa. Por ejemplo la relacion relativa de fragmentos de la troponina cardiaca puede indicar el tiempo

transcurrido desde la liberacion en la sangre y por lo tanto, indirectamente, la duracion de tiempo desde, por ejemplo, un infarto de miocardio. Vease, por ejemplo la Patente de los Estados Unidos No. 6,991,907.

III. Etiquetas para la troponina cardiaca

En algunos casos, la especificacion describe los metodos y composiciones que incluyen etiquetas para la deteccion 25 altamente sensible y la cuantificacion de la troponina cardiaca.

Un experto en el arte reconocera que muchas de las estrategias se pueden utilizar para moleculas diana etiquetadas para permitir su deteccion o discriminacion en una mezcla de partfculas. Las etiquetas se pueden unir por cualquier medio conocido, incluyendo metodos que utilizan las interacciones no espedficas o espedficas de la etiqueta y diana. Las etiquetas pueden proporcionar una senal detectable o afectar a la movilidad de la partfcula en un campo 30 electrico. Ademas, la marcacion se puede llevar a cabo directamente o a traves de asociados de union.

En algunos casos, la etiqueta comprende un asociado de union con la troponina unida a una unidad estructural fluorescente.

A. Asociados de union para la troponina

Se puede utilizar cualquier asociado de union apropiado con la especificidad requerida para que la forma de 35 troponina cardiaca sea detectada. Por ejemplo, se puede utilizar un asociado de union espedfico para todas o sustancialmente todas las formas de cTnI o se puede utilizar un asociado de union espedfico para todas o sustancialmente todas las formas de cTnT; por lo general, tales asociados de union se unen a una region de la troponina cardiaca que es comun a todas o la mayona de las diferentes formas probables que se encuentren en una muestra. En algunos casos, se puede utilizar un asociado de union espedfico a una o mas particulares formas de 40 troponina cardiaca, por ejemplo, un asociado de union a una cTnI en complejo, cTnI libre, cTnI enturbiado (por ejemplo, oxidada o fosforilada), o cTnT en complejo, cTnT libre, cTnT turbia (por ejemplo, oxidada o fosforilada). Los asociados de union son conocidos en la tecnica e incluyen, por ejemplo, aptameros, lectinas, y los receptores. Un tipo util y versatil del asociado de union es un anticuerpo.

1. Anticuerpos

45 En algunos casos, el asociado de union es un anticuerpo espedfico para la troponina cardiaca. El termino "anticuerpo", como se usa en este documento, es un termino amplio y se usa en su sentido ordinario, incluyendo, sin limitacion, para referirse a anticuerpos de origen natural asf como anticuerpos de origen no natural, incluyendo, por ejemplo, anticuerpos de cadena sencilla , anticuerpos bifuncionales, quimericos y humanizados, asf como fragmentos de union a antfgeno de los mismos. En algunos casos, el anticuerpo es espedfico para cTnI. En algunos 50 casos, el anticuerpo es espedfico para cTnT. En algunos casos, la etiqueta incluye anticuerpos tanto para cTnI como para cTnT. El anticuerpo puede ser espedfico para todas o sustancialmente todas las formas de la troponina cardiaca; por ejemplo, todas o sustancialmente todas las formas de cTnI, o todas o sustancialmente todas las formas de cTnT. En algunos casos, se puede usar un anticuerpo espedfico para una o mas formas particulares de troponina cardiaca, por ejemplo, un asociado de union para una cTnI en complejo, cTnI libre, cTnI turbia (por 55 ejemplo, oxidada o fosforilada), o cTnT en complejo, cTnT libre, cTnT turbia (por ejemplo, oxidada o fosforilada). Las mezclas de anticuerpos tambien estan abarcadas por la especificacion, por ejemplo, las mezclas de anticuerpos

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para cTnl y cTnT, o mezclas de anticuerpos para las diversas formas de la troponina (libres, en complejo, etc.), o mezclas de las mezclas.

Se apreciara que la eleccion del epttopo o region de troponina a la que se eleva el anticuerpo determinara su especificidad, por ejemplo, para la troponina total para ciertos fragmentos, para la troponina en complejo, para la troponina modificada, y similares. En algunos casos, el anticuerpo es espedfico para una region espedfica de aminoacidos de la troponina cardiaca. En algunos casos, el anticuerpo es espedfico para los aminoacidos 27-41 de la troponina I cardiaca humana. Ambos anticuerpos monoclonales y policlonales son utiles como asociados de union. En algunos casos, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal. En algunos casos, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunos casos, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal espedfico para los aminoacidos 27-41 de la troponina I cardiaca humana. En algunos casos, este anticuerpo no se ve afectado por la heparina, la fosforilacion, la oxidacion y la formacion de complejos de troponina, y no presentan reaccion con cruzamiento con la troponina I del musculo esqueletico.

Los metodos para producir anticuerpos estan bien establecidos. Las secuencias espedficas cardiacas para la troponina I y troponina T se describen en FEBS Lett. 270,57-61 (1990) and Genomics 21, 311-316 (1994). Un experto en el arte reconocera que muchos procedimientos estan disponibles para la produccion de anticuerpos, por ejemplo, como se describe en Antibodies, A Laboratory Manual, Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988), Cold Spring Harbor, N.Y. Un experto en el arte apreciara tambien que los fragmentos de union o fragmentos Fab que imitan anticuerpos tambien se pueden preparar a partir de la informacion genetica mediante diversos procedimientos (Antibody Engineering: A Practical Approach (Borrebaeck, C., ed.), 1995, Oxford University Press, Oxford; J. Immunol. 149,3914-3920 (1992)). Los metodos para producir anticuerpos a las diversas formas de las troponinas en complejo, fragmentos, fosforiladas, y oxidadas se describen en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,579,687; 6,991,907; y en la Solicitud de la Patente de los Estados Unidos No. 20050164317. Un peptido sintetico compuesto por 14 aminoacidos que imita una secuencia espedfica de troponina I cardiaca y los metodos usados para preparar anticuerpos para el peptido se describen en la Solicitud de la Patente Internacional No. PCT/US94/05468. Los anticuerpos monoclonales y policlonales para las troponinas cardiacas libres y en complejo tambien estan disponibles comercialmente (HyTest, HyTest Ltd.,Turku Finland; Abcam Inc., Cambridge, MA, UsA, Life Diagnostics, Inc., West Chester, PA, USA; Fitzgerald Industries International, Inc., Concord, MA 01742-3049 USA; BiosPacific, Emeryville, CA).

En algunos casos, el anticuerpo es un anticuerpo de mamffero, por ejemplo, anticuerpo policlonal de cabra anti-cTnI. El anticuerpo puede ser espedfico para regiones espedficas de la cTnI, por ejemplo, los aminoacidos 27-41 de troponina I cardiaca humana. Pares de asociados de union de captura y asociados de union de deteccion, por ejemplo, pares de anticuerpos de captura y deteccion, se pueden utilizar en los casos descritos en este documento. Por lo tanto, en algunos casos, se utiliza un protocolo de ensayo heterogeneo en el cual, por lo general, se utilizan dos asociados de union, por ejemplo, dos anticuerpos. Un asociado de union es un asociado de captura, por lo general inmovilizado sobre un soporte solido, y el otro asociado de union es un asociado de union de deteccion, por lo general con una etiqueta detectable unida. En algunos casos, el elemento de asociado de union de captura de un par es un anticuerpo que es espedfico para todas o sustancialmente todas las formas de troponina cardiaca. Un ejemplo es un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, espedfico para troponina I cardiaca (cTnI) libre aa 41-49 y cTnI que forman complejos con otros componentes de troponina. Preferiblemente, este anticuerpo no se ve afectado por la formacion de complejos de troponina, la heparina, la fosforilacion, y la oxidacion, y no presentan reaccion con cruzamiento con troponina I del musculo esqueletico. Por lo tanto, se piensa que el anticuerpo se une a una cTnI total. Otro ejemplo es un anticuerpo monoclonal, espedfico para la troponina I cardiaca (cTnI) aa 87-91 y no presentan reaccion con cruzamiento con la troponina I del musculo esqueletico. Tales anticuerpos estan disponibles de BiosPacific, Emeryville, CA. Otros pares de anticuerpos son conocidos o pueden ser disenados.

Anticuerpos de reaccion con cruzamiento. En algunos casos es util usar un anticuerpo que reacciona con cruzamiento con una variedad de especies, ya sea como un anticuerpo de captura, un anticuerpo de deteccion, o ambas cosas. Tales casos incluyen la medicion de la toxicidad del farmaco determinando, por ejemplo, la liberacion de troponina cardiaca en la sangre como marcador de dano cardiaco. Un anticuerpo de reaccion con cruzamiento permite que se hagan estudios de toxicidad en una especie, por ejemplo, una especie no humana, y la transferencia directa de los resultados para estudios o las observaciones clmicas de otra especie, por ejemplo, seres humanos, utilizando el mismo anticuerpo o par de anticuerpos en los reactivos de los ensayos, disminuyendo asf la variabilidad entre ensayos. Por lo tanto, en algunos casos, uno o mas de los anticuerpos para su uso como un asociado de union con el marcador, por ejemplo, la troponina cardiaca, tal como la troponina I cardiaca, puede ser un anticuerpo de reaccion con cruzamiento. En algunos casos, el anticuerpo reacciona con cruzamiento con el marcador, por ejemplo, troponina cardiaca, a partir de al menos dos especies seleccionadas del grupo constituido por humano, mono, perro, y raton. En algunos casos el anticuerpo reacciona con cruzamiento con el marcador por ejemplo, troponina cardiaca, de todo el grupo constituido por humano, mono, perro, y raton.

En algunos casos, el asociado de union, por ejemplo, el anticuerpo, se une a una unidad estructural fluorescente. La fluorescencia de la unidad estructural, sera suficiente para permitir la deteccion en un detector de una unica

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molecula, tal como los detectores de una unica molecula descritos en este documento. Una "unidad estructural fluorescente", como se usa ese termino en este documento, incluye una o mas entidades fluorescentes cuya fluorescencia total es tal que la unidad estructural se puede detectar en los detectores de una unica molecula descritos en este documento. Por lo tanto, una unidad estructural fluorescente puede comprender una unica entidad (por ejemplo, un punto cuantico o molecula fluorescente) o una pluralidad de entidades (por ejemplo, una pluralidad de moleculas fluorescentes). Se apreciara que cuando "unidad estructural", como se usa ese termino en este documento, se refiere a un grupo de entidades fluorescentes, por ejemplo, una pluralidad de moleculas de colorante fluorescente, cada entidad individual puede estar unida al asociado de union por separado o las entidades pueden ser unidas entre sf, siempre y cuando las entidades como un grupo proporcionan suficiente fluorescencia para ser detectadas.

Por lo general, la fluorescencia de la unidad estructural implica una combinacion de eficiencia cuantica y la falta de fotoblanqueo suficiente que la unidad estructural es detectable por encima de los niveles de fondo en un detector de una unica molecula, con la consistencia necesaria para el nivel deseado de deteccion, la exactitud y la precision del ensayo. Por ejemplo, en algunos casos, la fluorescencia de la unidad estructural fluorescente es tal que permite la deteccion y/o cuantificacion de la troponina a un nivel de deteccion de menos de aproximadamente 3, 2, o 1 pg/mL y con un coeficiente de variacion de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% o menos, por ejemplo, aproximadamente 10% o menos, en los instrumentos descritos en este documento. En algunos casos, la fluorescencia de la unidad estructural fluorescente es tal que permite la deteccion y/o cuantificacion de la troponina en un lfmite de deteccion de menos de aproximadamente 3 pg/mL y con un coeficiente de variacion de menos de aproximadamente 10%, en los instrumentos descritos en este documento. "Lfmite de deteccion", como se usa ese termino en este documento, incluye la concentracion mas baja a la que se puede identificar una muestra como que contiene una molecula de la sustancia de interes, por ejemplo, el primer valor distinto de cero. Se puede definir por la variabilidad de ceros y la pendiente de la curva estandar. Por ejemplo, el lfmite de deteccion de un ensayo se puede determinar realizando una curva estandar, determinando el valor de cero de la curva estandar, y adicionando 2 desviaciones estandar a ese valor. Una concentracion de la sustancia de interes que produce una senal igual a este valor es el "lfmite inferior de deteccion" de concentracion.

Por otra parte, la unidad estructural tiene propiedades que son consistentes con su uso en el ensayo de eleccion. En algunos casos, el ensayo es un inmunoensayo, en donde la unidad estructural fluorescente se une a un anticuerpo; la unidad estructural debe tener propiedades tales que no se agregan con otros anticuerpos o protemas, o experimenta no mas agregacion que es consistente con la exactitud y la precision requerida del ensayo. En algunos casos, las unidades estructurales fluorescentes que son preferidas son las unidades estructurales fluorescentes, por ejemplo, moleculas de colorante que tienen una combinacion de 1) coeficiente de absorcion alto; 2) rendimiento cuantico alto; 3) fotoestabilidad alta (fotoblanqueo bajo); y 4) compatibilidad con la marcacion de la biomolecula de interes (por ejemplo, protema) de modo que se puede analizar usando los analizadores y sistemas descritos en este documento (por ejemplo, no causa la precipitacion de la protema de interes, o precipitacion de una protema a la cual la unidad estructural se ha unido).

Las unidades estructurales fluorescentes, por ejemplo, una unica molecula de colorante fluorescente o una pluralidad de moleculas de colorantes fluorescentes, que son utiles en algunos casos descritos en este documento pueden ser definidos en terminos de sus caractensticas de emision de fotones cuando es estimulado por la radiacion EM. Por ejemplo algunos casos utilizan una unidad estructural de colorante fluorescente, por ejemplo, una unica molecula de colorante fluorescente o una pluralidad de moleculas de colorantes fluorescentes, que es capaz de emitir una media de al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800, 900, o 1000, fotones cuando se simula por un emisor de luz laser a la longitud de onda de excitacion de la unidad estructural, cuando el laser se enfoca en un punto de no menos de aproximadamente 5 micras de diametro que contiene la unidad estructural, y en donde la energfa total dirigida en el punto por el laser es no mas de aproximadamente 3 microjulios. Se apreciara que la energfa total se puede conseguir por muchas diferentes combinaciones de potencia de salida del laser y la duracion del tiempo de exposicion de la unidad estructural de colorante. Por ejemplo, un laser de una potencia de salida de 1 mW se puede utilizar durante 3 ms, 3 mW durante 1 ms, 6 mW durante 0.5 ms, 12 mW durante 0.25 ms, y asf sucesivamente.

En algunos casos utilizan una unidad estructural de colorante fluorescente, por ejemplo, una unica molecula de colorante fluorescente o una pluralidad de moleculas de colorantes fluorescentes, que es capaz de emitir una media de al menos aproximadamente 50 fotones cuando se simula por un emisor de luz laser a la longitud de onda de excitacion de la unidad estructural, cuando el laser se enfoca en un punto de no menos de aproximadamente 5 micras de diametro que contiene la unidad estructural, y en donde la energfa total dirigida en el punto por el laser es no mas de aproximadamente 3 microjulios. Algunos casos utilizan una unidad estructural de colorante fluorescente, por ejemplo, una unica molecula de colorante fluorescente o una pluralidad de moleculas de colorantes fluorescentes, que es capaz de emitir una media de al menos aproximadamente 100 fotones cuando se simula por un emisor de luz laser a la longitud de onda de excitacion de la unidad estructural, cuando el laser se enfoca en un punto de no menos de aproximadamente 5 micras de diametro que contiene la unidad estructural, y en donde la energfa total dirigida en el punto por el laser es no mas de aproximadamente 3 microjulios. Algunos casos utilizan una unidad estructural de colorante fluorescente, por ejemplo, una unica molecula de colorante fluorescente o una pluralidad de moleculas de colorantes fluorescentes, que es capaz de emitir una media de al menos

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aproximadamente 150 fotones cuando se Simula por un emisor de luz laser a la longitud de onda de excitacion de la unidad estructural, cuando el laser se enfoca en un punto de no menos de aproximadamente 5 micras de diametro que contiene la unidad estructural, y en donde la energfa total dirigida en el punto por el laser es no mas de aproximadamente 3 microjulios. Algunos casos utilizan una unidad estructural de colorante fluorescente, por ejemplo, una unica molecula de colorante fluorescente o una pluralidad de moleculas de colorantes fluorescentes, que es capaz de emitir una media de al menos aproximadamente 200 fotones cuando se simula por un emisor de luz laser a la longitud de onda de excitacion de la unidad estructural, cuando el laser se enfoca en un punto de no menos de aproximadamente 5 micras de diametro que contiene la unidad estructural, y en donde la energfa total dirigida en el punto por el laser es no mas de aproximadamente 3 microjulios. Algunos casos utilizan una unidad estructural de colorante fluorescente, por ejemplo, una unica molecula de colorante fluorescente o una pluralidad de moleculas de colorantes fluorescentes, que es capaz de emitir una media de al menos aproximadamente 300 fotones cuando se simula por un emisor de luz laser a la longitud de onda de excitacion de la unidad estructural, cuando el laser se enfoca en un punto de no menos de aproximadamente 5 micras de diametro que contiene la unidad estructural, y en donde la energfa total dirigida en el punto por el laser es no mas de aproximadamente 3 microjulios. Algunos casos utilizan una unidad estructural de colorante fluorescente por ejemplo, una unica molecula de colorante fluorescente o una pluralidad de moleculas de colorantes fluorescentes, que es capaz de emitir una media de al menos aproximadamente 500 fotones cuando se simula por un emisor de luz laser a la longitud de onda de excitacion de la unidad estructural, cuando el laser se enfoca en un punto de no menos de aproximadamente 5 micras de diametro que contiene la unidad estructural, y en donde la energfa total dirigida en el punto por el laser es no mas de aproximadamente 3 microjulios.

En algunos casos, la unidad estructural fluorescente comprende una media de al menos aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 entidades fluorescentes, por ejemplo, moleculas fluorescentes. En algunos casos, la unidad estructural fluorescente comprende una media de no mas de aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, u 11 entidades fluorescentes, por ejemplo, moleculas fluorescentes. En algunos casos, la unidad estructural fluorescente comprende una media de aproximadamente 1 a 11, o aproximadamente 2 a 10, o aproximadamente 2 a 8, o

aproximadamente 2 a 6, o aproximadamente 2 a 5, o aproximadamente 2 a 4, o aproximadamente 3 a 10, o

aproximadamente 3 a 8, o aproximadamente 3 a 6, o aproximadamente 3 a 5, o aproximadamente 4 a 10, o

aproximadamente 4 a 8, o aproximadamente 4 a 6, o aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, o mas de aproximadamente 6

entidades fluorescentes. En algunos casos, se unen la unidad estructural fluorescente comprende una media de aproximadamente 2 a 8 unidades estructurales fluorescentes. En algunos casos, una media de aproximadamente 2 a 6 entidades fluorescentes. En algunos casos, la unidad estructural fluorescente comprende una media de aproximadamente 2 a 4 entidades fluorescentes. En algunos casos, la unidad estructural fluorescente comprende una media de aproximadamente 3 a 10 entidades fluorescentes. En algunos casos, la unidad estructural fluorescente comprende una media de aproximadamente 3 a 8 entidades fluorescentes. En algunos casos, la unidad estructural fluorescente comprende una media de aproximadamente 3 a 6 entidades fluorescentes. Por "media" se quiere decir que, en una muestra dada que es una muestra representativa de un grupo de etiquetas descritas en este documento, donde la muestra contiene una pluralidad de las unidades de unidades estructurales fluorescentes del asociado de union, la relacion molar de la entidad fluorescente particular de la que la unidad estructural fluorescente se comprende, con el asociado de union, tal como se determina mediante metodos analfticos estandar, corresponde al numero o rango de numeros especificado. Por ejemplo, en casos en los cuales la etiqueta comprende un asociado de union que es un anticuerpo y una unidad estructural fluorescente que comprende una pluralidad de moleculas de colorantes fluorescentes de una absorbancia espedfica, se puede usar un ensayo espectrofotometrico en el cual se diluye una solucion de la etiqueta a un nivel apropiado y la absorbancia a 280 nm se toma para determinar la molaridad de la protema (anticuerpo) y se toma una absorbancia a, por ejemplo, 650 nm (para Alexa Fluor 647) para determinar la molaridad de la molecula de colorante fluorescente. La relacion de este ultima molaridad con la primera representa el numero medio de entidades fluorescentes (moleculas de colorante) en la unidad estructural fluorescente unida a cada anticuerpo.

1. Colorantes

Algunos casos utilizan unidades estructurales fluorescentes que comprenden moleculas de colorantes fluorescentes. Algunos casos utilizan una molecula de colorante fluorescente que es capaz de emitir una media de al menos aproximadamente 50 fotones cuando se simula por un emisor de luz laser a la longitud de onda de excitacion de la molecula, donde el laser se enfoca en un punto de no menos de aproximadamente 5 micras de diametro que contiene la molecula, y en donde la energfa total dirigida en el punto por el laser es no mas de aproximadamente 3 microjulios. Algunos casos utilizan una molecula de colorante fluorescente que es capaz de emitir una media de al menos aproximadamente 75 fotones, cuando se simula por un emisor de luz laser a la longitud de onda de excitacion de la molecula, donde el laser se enfoca en un punto de no menos de aproximadamente 5 micras de diametro que contiene la molecula, y en donde la energfa total dirigida en el punto por el laser es no mas de aproximadamente 3 microjulios. Algunos casos utilizan una molecula de colorante fluorescente que es capaz de emitir una media de al menos aproximadamente 100 fotones cuando se simula por un emisor de luz laser a la longitud de onda de excitacion de la molecula, donde el laser se enfoca en un punto de no menos de aproximadamente 5 micras de diametro que contiene la molecula, y en donde la energfa total dirigida en el punto por el laser es no mas de aproximadamente 3 microjulios. Algunos casos utilizan una molecula de colorante fluorescente que es capaz de emitir una media de al menos aproximadamente 150 fotones cuando se simula por un emisor de luz

laser a la longitud de onda de excitacion de la molecula, cuando el laser se enfoca en un punto de no menos de aproximadamente 5 micras de diametro que contiene la molecula, y en donde la energfa total dirigida en el punto por el laser es no mas de aproximadamente 3 microjulios. Algunos casos utilizan una molecula de colorante fluorescente que es capaz de emitir una media de al menos aproximadamente 200 fotones cuando se simula por un emisor de luz 5 laser a la longitud de onda de excitacion de la molecula, cuando el laser se enfoca en un punto de no menos de aproximadamente 5 micras de diametro que contiene la molecula, y en donde la energfa total dirigida en el punto por el laser es no mas de aproximadamente 3 microjulios.

Una lista no exhaustiva de las entidades fluorescentes utiles para su uso en las unidades estructurales fluorescentes 10 descritas en este documento se da en la Tabla 1, a continuacion. En algunos casos, la entidad fluorescente se selecciona del grupo que consiste en Alexa Flour 488, 532, 647, 700, 750, fluorescema, B-ficoeritrina, aloficocianina, PBXL-3, y Qdot 605.

TABLA 1

ENTIDADES FLUORESCENTES

colorante: Ex(nm) E(M) -1 Em(nm) Mw

Bfmano: 380 5,700 458 282.31

Dapoxil: 373 22,000 551 362.83

Acido dimetilamino cumarina-4- acetico: 375 22,000 470 344.32

Azul de marina: 365 19,000 460 367.26

Acido 8-anilino naftaleno-1- sulfonico: 372 480

Cascada azul: 376 23,000 420 607.42

Alexa Fluor 405: 402 35,000 421 1028.26

Cascada azul: 400 29,000 420 607.42

Cascada amarilla: 402 24,000 545 563.54

Azul Padfico: 410 46,000 455 339.21

PyMPO: 415 26,000 570 582.41

Alexa 430: 433 15,000 539 701.75

Atto-425: 438 486

NBD: 465 22,000 535 391.34

Alexa 488: 495 73,000 519 643.41

Fluorescema: 494 79,000 518 376.32

Oregon Green 488: 496 76,000 524 509.38

Atto 495: 495 522

Cy2: 489 150,000 506 713.78

DY-480-XL: 500 40,000 630 514.60

DY-485-XL: 485 20,000 560 502.59

DY-490-XL: 486 27,000 532 536.58

DY-500-XL: 505 90,000 555 596.68

DY-520-XL: 520 40,000 664 514.60

Alexa Fluor 532: 531 81,000 554 723.77

BODIPY 530/550: 534 77,000 554 513.31

6-HEX: 535 98,000 556 680.07

6-JOE: 522 75,000 550 602.34

Rodamina 6G: 525 108,000 555 555.59

Atto-520: 520 542

Cy3B: 558 130,000 572 658.00

Alexa Fluor 610: 612 138,000 628

Alexa Fluor 633: 632 159,000 647 ca. 1200

Alexa Fluor 647: 650 250,000 668 ca. 1250

BODIPY 630/650: 625 101,000 640 660.50

Cy5: 649 250,000 670 791.99

Alexa Fluor 660: 663 110,000 690

Alexa Fluor 680: 679 184,000 702

Alexa Fluor 700: 702 192,000 723

Alexa Fluor 750: 749 240,000 782

B-ficoeritrina: 546,565 2,410,000 575 240,000

R-ficoeritrina: 480,546,565 1,960,000 578 240,000

Aloficocianina: 650 700,000 660 700,000

PBXL-1: 545 666

PBXL-3: 614 662

Atto-tec

: Nombre Ex (nm) Em (nm) QY h(ns)

: Atto 425 436 486 0.9 3.5

: Atto 495 495 522 0.45 2.4

: Atto 520 520 542 0.9 3.6

: Atto 560 561 585 0.92 3.4

: Atto 590 598 634 0.8 3.7

: Atto 610 605 630 0.7 3.3

: Atto 655 665 690 0.3 1.9

: Atto 680 680 702 00 CO o

Dyomics Fluors

Etiqueta Ex(nm) Absorbancia molar * [I • mol-1 • cm-1] Em (nm) peso molecular # [g • mol-1]

DY-495/5: 495 70,000 520 489.47

DY-495/6: 495 70,000 520 489.47

DY-495X/5: 495 70,000 520 525.95

DY-495X/6: 495 70,000 520 525.95

DY-505/5: 505 85,000 530 485.49

DY-505/6: 505 85,000 530 485.49

DY-505X/5: 505 85,000 530 523.97

DY-505X/6: 505 85,000 530 523.97

DY-550: 553 122,000 578 667.76

DY-555: 555 100.000 580 636.18

DY-610: 609 81.000 629 667.75

DY-615: 621 200.000 641 578.73

DY-630: 636 200.000 657 634.84

DY-631: 637 185.000 658 736.88

DY-633: 637 180.000 657 751.92

DY-635: 647 175.000 671 658.86

DY-636: 645 190.000 671 760.91

DY-650: 653 170.000 674 686.92

DY-651: 653 160.000 678 888.96

DYQ-660: 660 117,000 - 668.86

DYQ-661: 661 116,000 - 770.90

DY-675: 674 110.000 699 706.91

DY-676: 674 145.000 699 807.95

DY-680: 690 125.000 709 634.84

DY-681: 691 125.000 708 736.88

DY-700: 702 96.000 723 668.86

DY-701: 706 115.000 731 770.90

DY-730: 734 185.000 750 660.88

DY-731: 736 225.000 759 762.92

DY-750: 747 240.000 776 712.96

DY-751: 751 220.000 779 814.99

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DY-776: 771 147.000 801 834.98

DY-780-OH: 770 70.000 810 757.34

DY-780-P: 770 70.000 810 957.55

DY-781: 783 98.000 800 762.92

DY-782: 782 102.000 800 660.88

EVOblue-10: 651 101.440 664 389.88

EVOblue-30: 652 102.000 672 447.51

Puntos cuanticos: Qdot 525, 565, 585, 605, 655, 705, 800

Los colorantes apropiados para su uso como se describe en este documento incluyen colorantes de carbocianina modificados. La modificacion de colorantes de carbocianina incluye la modificacion de un anillo de indolio del

colorante de carbocianina para permitir un grupo reactivo o sustancia conjugada en la posicion numero 3. La

modificacion del anillo de indolio provee conjugados de colorantes que son de manera uniforme y sustancialmente mas fluorescentes en las protemas, acidos nucleicos y otros biopolfmeros, que los conjugados marcados con colorantes de carbocianina estructuralmente similares unidos a traves del atomo de nitrogeno en la posicion numero uno. Ademas de tener una emision de fluorescencia mas intensa que los colorantes estructuralmente similares a longitudes de onda practicamente identicas, y la disminucion de artefactos en sus espectros de absorcion sobre la conjugacion con biopoKmeros, los colorantes de carbocianina modificados tienen mayor fotoestabilidad y superior absorbancia (coeficientes de extincion) en las longitudes de onda de absorbancia pico que los colorantes de

estructura similar. Por lo tanto, los colorantes de carbocianina modificados resultan en una mayor sensibilidad en los

ensayos que utilizan los colorantes modificados y sus conjugados. Los colorantes modificados preferidos incluyen compuestos que tienen al menos un sistema de anillo de indolio sustituido en el cual el sustituyente en el carbono 3 del anillo de indolio contiene un grupo qmmicamente reactivo o una sustancia conjugada. Otros compuestos colorantes incluyen compuestos que incorporan una unidad estructural del anillo aza-benzazolio y al menos una unidad estructural sulfonato. Los colorantes de carbocianina modificados que se pueden utilizar para detectar partmulas unicas en diversos casos descritos en este documento se describen en la Patente de los Estados Unidos 6,977,305. Por lo tanto, en algunos casos las etiquetas descritas en este documento utilizan un colorante fluorescente que incluye un sistema de anillo de indolio sustituido en el cual el sustituyente en el carbono 3 del anillo de indolio contiene un grupo qmmicamente reactivo o un grupo de sustancias conjugadas.

En algunos casos, la etiqueta comprende una unidad estructural fluorescente que incluye uno o mas colorantes Alexa (Molecular Probes, Eugene, OR). Los colorantes Alexa se revelan en las Patentes de los Estados Unidos 6,977,305; 6,974,874; 6,130,101; y 6,974,305. Algunos casos utilizan un colorante seleccionado del grupo que consiste en Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 610, Alexa Fluor 680, Alexa Fluor 700, y Alexa Fluor 750. Algunos casos utilizan un colorante seleccionado del grupo que consiste en Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 700 y Alexa Fluor 750. Algunos casos utilizan la molecula de Alexa Fluor 647, que tiene un maximo de absorcion entre aproximadamente 650 y 660 nm y un maximo de emision entre aproximadamente 660 y 670 nm. El colorante Alexa Fluor 647 se usa solo o en combinacion con otros colorantes Alexa Fluor.

Ademas, los compuestos fluorescentes organicos disponibles en la actualidad se pueden mejorar haciendolos menos hidrofobos mediante la adicion de grupos hidrofilos tales como polietileno. Alternativamente, los compuestos fluorescentes organicos sulfonados actualmente como el colorante Alexa Fluor 647 pueden volverse menos acidos haciendolos zwitterionicos. Las partmulas tales como anticuerpos que se marcan con los compuestos fluorescentes modificados son menos propensas a unirse no espedficamente a superficies y protemas en inmunoensayos, y por lo tanto permiten que los ensayos tengan mayor sensibilidad y menor fondo. Los metodos para modificar y mejorar las propiedades de los colorantes fluorescentes con el fin de aumentar la sensibilidad de un sistema que detecta las partmulas unicas son conocidos en la tecnica. Preferiblemente, la modificacion mejora el desplazamiento de Stokes, manteniendo un alto rendimiento cuantico.

2. Puntos cuanticos

En algunos casos, la unidad estructural de etiqueta fluorescente que se utiliza para detectar una molecula en una muestra usando los sistemas de analisis descritos en este documento es un punto cuantico. Los puntos cuanticos (QD), tambien conocidos como nanocristales semiconductores o atomos artificiales, son cristales de semiconductores que contienen en cualquier lugar entre 100 a 1,000 electrones y oscilan de 2-10 nm. Algunos QD pueden tener entre 10-20 nm de diametro. Los QD tienen altos rendimientos cuanticos, que los hace particularmente utiles para aplicaciones opticas. Los QD son fluoroforos que presentan fluorescencia formando excitones, que se pueden considerar del estado excitado de fluoroforos tradicionales, pero tienen una vida util mucho mas larga de

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hasta 200 nanosegundos. Esta propiedad ofrece QD con fotoblanqueo bajo. El nivel de energfa de los QD se puede controlar cambiando el tamano y la forma del QD, y la profundidad del potencial de los QD. Una de las caractensticas opticas de QD excitonicos pequenos es la coloracion, que se determina por el tamano del punto. Cuanto mayor sea el punto, es mas rojo, o mas hacia el extremo rojo del espectro de la fluorescencia. Cuanto mas pequeno sea el punto, mas azul o mas hacia el extremo azul esta. La energfa de banda prohibida que determina la energfa y por lo tanto el color de la luz fluorescente es inversamente proporcional al cuadrado del tamano del QD. Los QD mas grandes tienen mas niveles de energfa estan estrechamente espaciados, lo que permite al QD absorber fotones que contienen menos energfa, i.e., aquellos mas cerca del extremo rojo del espectro. Debido a que la frecuencia de emision de unos puntos depende de la banda prohibida, por lo tanto, es posible controlar la longitud de onda de salida de un punto con una precision extrema. En algunos casos, la protema que se detecta con el sistema de analisis de una partfcula unica esta marcada con un QD. En algunos casos, el analizador de partfcula unica se utiliza para detectar una protema marcada con un QD y el uso de un filtro para permitir la deteccion de diferentes protemas en diferentes longitudes de onda.

Los QD tienen una amplia excitacion y propiedades de emision estrechas que cuando se utiliza con filtracion del color requieren solo una unica fuente electromagnetica para el analisis multiplex de multiples dianas en una unica muestra para resolver senales individuales. Por lo tanto, en algunos casos, el sistema de analisis comprende uno laser de onda continua y partmulas que son cada una marcadas con un solo QD. Los QD preparados de forma coloidal son de libre flotacion y se puede unir a una variedad de moleculas a traves de grupos funcionales de coordinacion de metal. Estos grupos incluyen, pero no se limitan a tiol, amina, nitrilo, fosfina, oxido de fosfina, acido fosfonico, acidos carboxflicos u otros ligandos. Mediante la union de moleculas apropiadas a la superficie, los puntos cuanticos se pueden dispersar o disolver en casi cualquier solvente o incorporar en una variedad de pelmulas inorganicas y organicas. Los puntos cuanticos (QD) pueden ser acoplados a estreptavidina directamente a traves de una reaccion de acoplamiento de ester de maleimida o a anticuerpos a traves de una reaccion de acoplamiento maleimida-tiol. Esto produce un material con una biomolecula unida covalentemente en la superficie, que produce conjugados con actividad espedfica alta. En algunos casos, la protema que se detecta con el analizador de partmula unica se marca con un punto cuantico. En algunos casos el punto cuantico tiene entre 10 y 20 nm de diametro. En otros casos, el punto cuantico tiene entre 2 y 10 nm de diametro. Los puntos cuanticos utiles incluyen QD 605, QD 610, QD 655 y Qd 705. Un punto cuantico preferido particularmente es QD 605.

C. Composiciones de asociado de union-unidad estructural fluorescente (etiquetas)

Las etiquetas descritas en este documento contienen generalmente un asociado de union, por ejemplo, anticuerpo, unido a una unidad estructural fluorescente para proporcionar la fluorescencia requisito para la deteccion y cuantificacion en los instrumentos descritos en este documento. Cualquier combinacion apropiada de asociado de union y unidad estructural fluorescente en los detectores de una unica molecula descrita en este documento se pueden usar como una etiqueta como se describe en este documento. Algunos casos proporcionan una etiqueta para una molecula de troponina cardiaca, o fragmento, complejo, forma fosforilada, u oxidada del mismo, donde la etiqueta incluye un anticuerpo a una troponina cardiaca y una unidad estructural fluorescente. El anticuerpo puede ser cualquier anticuerpo como se ha descrito anteriormente, por ejemplo, un anticuerpo para cTnT o cTnI. En algunos casos, el anticuerpo es un anticuerpo para cTnI. En algunos casos, el anticuerpo es espedfico para una region espedfica de la troponina cardiaca, por ejemplo, espedfica a los aminoacidos 27-41 de cTnI humana. Algunos casos proporcionan composiciones que comprenden una unidad estructural fluorescente unida a un anticuerpo anti-cTnl, por ejemplo, un anticuerpo policlonal tal como un anticuerpo policlonal de cabra de los designados G129C disponible de BiosPacific, Emeryville. Una unidad estructural fluorescente puede estar unida de tal manera que la etiqueta sea capaz de emitir una media de al menos aproximadamente 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800, 900, o 1000, fotones cuando se simula por un emisor de luz laser en la longitud de onda de excitacion de la unidad estructural, cuando el laser se enfoca en un punto de no menos de aproximadamente 5 micras de diametro que contiene la etiqueta, y en donde la energfa total dirigida en el punto por el laser no es mas que aproximadamente 3 microjulios. En algunos casos, la unidad estructural fluorescente puede ser una unidad estructural fluorescente que es capaz de emitir una media de al menos aproximadamente 50, 100, 150, o 200 fotones cuando se simula por un emisor de luz laser a la longitud de onda de excitacion de la unidad estructural, donde el laser se centra en un punto de no menos de aproximadamente 5 micras de diametro que contiene la unidad estructural, y en donde la energfa total dirigida en el punto por el laser es no mas de aproximadamente 3 microjulios. La unidad estructural fluorescente puede ser una unidad estructural fluorescente que incluye una o mas moleculas de colorante con una estructura que incluye un sistema de anillo de indolio sustituido en el cual el sustituyente en el carbono 3 del anillo de indolio contiene un grupo qdmicamente reactivo o un grupo de sustancias conjugadas. La composicion de etiqueta puede incluir una unidad estructural fluorescente que incluye una o mas moleculas de colorante seleccionadas del grupo que consiste en Alexa Fluor 488, 532, 647, 700, o 750. La composicion de etiqueta puede incluir una unidad estructural fluorescente que incluye una o mas moleculas de colorante seleccionadas del grupo constituido por Alexa Fluor 488, 532, 700, o 750. La composicion de etiqueta puede incluir una unidad estructural fluorescente que incluye una o mas moleculas de colorante que son Alexa Fluor 488. La composicion de etiqueta puede incluir una unidad estructural fluorescente que incluye una o mas moleculas de colorante que son Alexa Fluor 555. La composicion de etiqueta puede incluir una unidad estructural fluorescente que incluye una o mas moleculas de colorante que son Alexa Fluor 610. La composicion de etiqueta puede incluir una unidad estructural fluorescente que incluye una o mas moleculas de colorante que son Alexa Fluor

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647. La composicion de etiqueta puede incluir una unidad estructural fluorescente que incluye una o mas moleculas de colorante que son Alexa Fluor 680. La composicion de etiqueta puede incluir una unidad estructural fluorescente que incluye una o mas moleculas de colorante que son Alexa Fluor 700. La composicion de etiqueta puede incluir una unidad estructural fluorescente que incluye una o mas moleculas de colorante que son Alexa Fluor 750.

Algunos ejemplos proporcionan una composicion para la deteccion de la troponina I cardiaca que incluye una molecula de AlexFluor, por ejemplo, una molecula de Alexa Fluor seleccionada de los grupos descritos, tales como una molecula de Alexa Fluor 647 unida a un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo policlonal de cabra anti-cTnl, espedfico para los aminoacidos 27-41 de cTnl humana. Algunos casos proporcionan una composicion para la deteccion de troponina I cardiaca que incluye una media de 1 a 11, o aproximadamente 2 a 10, o aproximadamente 2 a 8, o aproximadamente 2 a 6, o aproximadamente 2 a 5, o aproximadamente 2 a 4 , o aproximadamente 3 a 10, o aproximadamente 3 a 8, o aproximadamente 3 a 6, o aproximadamente 3 a 5, o aproximadamente 4 a 10, o aproximadamente 4 a 8, o aproximadamente 4 a 6, o aproximadamente 2, 3, 4 , 5, 6, o mas de aproximadamente 6 moleculas de Alexa Fluor 647, molecula unida a un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo policlonal de cabra anti- cTnl, espedfico para los aminoacidos 27-41 de cTnl humana. Algunos casos proporcionan una composicion para la deteccion de troponina I cardiaca que incluye una media de 1 a 11, o aproximadamente 2 a 10, o aproximadamente 2 a 8, o aproximadamente 2 a 6, o aproximadamente 2 a 5, o aproximadamente 2 a 4 , o aproximadamente 3 a 10, o aproximadamente 3 a 8, o aproximadamente 3 a 6, o aproximadamente 3 a 5, o aproximadamente 4 a 10, o aproximadamente 4 a 8, o aproximadamente 4 a 6, o aproximadamente 2, 3, 4 , 5, 6, o mas de aproximadamente 6 Alexa Fluor 647 moleculas molecula unida a un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo policlonal de cabra anti-cTnl, espedfico para los aminoacidos 27-41 de cTnl humana. Algunos casos proporcionan una composicion para la deteccion de la troponina I cardiaca que incluye una media de aproximadamente 2 a 10 moleculas de Alexa Fluor 647, molecula unida a un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo policlonal de cabra anti-cTnl, espedfico para los aminoacidos 27-41 de cTnl humana. Algunos casos proporcionan una composicion para la deteccion de la troponina I cardiaca que incluye una media de aproximadamente 2 a 8 moleculas de Alexa Fluor 647, molecula unida a un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo policlonal de cabra anti-cTnl, espedfico para los aminoacidos 27-41 de cTnl humana. Algunos casos proporcionan una composicion para la deteccion de la troponina l cardiaca que incluye una media de aproximadamente 2 a 6 moleculas de Alexa Fluor 647, molecula unida a un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo policlonal de cabra anti-cTnl, espedfico para los aminoacidos 27-41 de cTnl humana. Algunos casos proporcionan una composicion para la deteccion de la troponina l cardiaca que incluye una media de aproximadamente 2 a 4 moleculas de Alexa Fluor 647, molecula unida a un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo policlonal de cabra anti-cTnl, espedfico para los aminoacidos 27-41 de cTnl humana. Algunos casos proporcionan una composicion para la deteccion de la troponina l cardiaca que incluye una media de aproximadamente 3 a 8 moleculas de Alexa Fluor 647, molecula unida a un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo policlonal de cabra anti- cTnl, espedfico para los aminoacidos 27-41 de cTnl humana. Algunos casos proporcionan una composicion para la deteccion de la troponina l cardiaca que incluye una media de aproximadamente 3 a 6 moleculas de Alexa Fluor 647, molecula unida a un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo policlonal de cabra anti-cTnl, espedfico para los aminoacidos 27-41 de cTnl humana. Algunos casos proporcionan una composicion para la deteccion de la troponina l cardiaca que incluye una media de aproximadamente 4 a 8 moleculas de Alexa Fluor 647, molecula unida a un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo policlonal de cabra anti-cTnl, espedfico para los aminoacidos 27-41 de cTnl humana.

La union de la unidad estructural fluorescente, o entidades fluorescentes que componen la unidad estructural fluorescente, con el asociado de union, por ejemplo, anticuerpo, puede ser por cualquier medio apropiado; tales metodos son bien conocidos en la tecnica y metodos de ejemplo se dan en los Ejemplos. En algunos casos, despues de la union de la unidad estructural fluorescente con el asociado de union para formar una etiqueta para su uso en los metodos descritos en este documento, y antes de la utilizacion de la etiqueta para la marcacion de la protema de interes, es util llevar a cabo una etapa de filtracion. Por ejemplo, una etiqueta de anticuerpo-colorante se puede filtrar antes de su uso, por ejemplo, a traves de un filtro de 0.2 micras, o cualquier filtro apropiado para la eliminacion de los agregados. Otros reactivos para su uso en los ensayos descritos en este documento tambien se pueden filtrar, por ejemplo, a traves de un filtro de 0.2 micras, o cualquier filtro apropiado. Sin pretender estar ligado a ninguna teona, se cree que dicha filtracion elimina una parte de los agregados de, por ejemplo, las etiquetas anticuerpo-colorante. Como tales agregados se uniran como una unidad a la protema de interes, pero en caso de liberacion en solucion reguladora de elucion que probablemente desagregar, pueden resultar los falsos positivos; i.e., varias etiquetas se detectan a partir de un agregado que se ha unido a una unica molecula de protema de interes. lndependientemente de la teona, se ha encontrado que la filtracion reduce los falsos positivos en el posterior ensayo y mejora la exactitud y precision.

lV. Analisis de alta sensibilidad de troponina cardiaca

La especificacion provee un metodo para determinar la presencia o ausencia de una unica molecula de troponina cardiaca o un fragmento o complejo de la misma en una muestra, mediante i) la marcacion de la molecula, fragmento, o complejo, si esta presente, con una etiqueta; y ii) la deteccion de la presencia o ausencia de la etiqueta, donde la deteccion de la presencia de la etiqueta indica la presencia de la unica molecula, fragmento, o complejo de troponina cardiaca en la muestra. Como se usa en este documento, "molecula de troponina cardiaca" incluye una molecula que contiene sustancialmente toda la secuencia de aminoacidos de origen natural del tipo particular de

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troponina cardiaca, incluyendo formas modificadas despues de la traduccion, por ejemplo, formas fosforiladas, asf como formas oxidadas o de otra manera alteradas qmmicamente. Como se usa en este documento, un "fragmento" de una molecula incluye una molecula de troponina cardiaca que contiene menos de la secuencia de aminoacidos de origen natural completa, incluyendo modificaciones como para la molecula completa. Como se usa en este documento, un "complejo" de una molecula de troponina cardiaca incluye una molecula de troponina cardiaca o un fragmento que se asocia con una o mas otras moleculas o sustancias, por ejemplo, que se asocia con una o mas otras moleculas de troponina cardiaca. El metodo es capaz de detectar la troponina en un lfmite de deteccion de menos de aproximadamente 3, 2, 1, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2. o 0.1 pg/ml. El metodo es capaz de detectar la troponina en un lfmite de deteccion de menos de aproximadamente 3 pg/mL. En algunos casos, el metodo es capaz de detectar la troponina en un lfmite de deteccion de menos de aproximadamente 1 pg/mL. Los lfmites de deteccion se pueden determinar mediante el uso del apropiado material estandar de referencia del Instituto Nacional de Estandares y de Tecnologfa, por ejemplo, cTnl estandar.

Los metodos tambien proporcionan metodos para determinar una concentracion de troponina cardiaca en una muestra mediante la deteccion de moleculas unicas de la troponina en la muestra. La "deteccion" de una unica molecula de troponina incluye la deteccion de la molecula directamente o indirectamente. En el caso de deteccion indirecta, las etiquetas que corresponden a moleculas unicas de troponina cardiaca, por ejemplo, se puede detectar una etiqueta que se ha unido a las moleculas unicas de la troponina cardiaca.

Los tipos de troponina cardiaca para la deteccion son como se describen en este documento, por ejemplo, cTnT, cTnl, la troponina cardiaca total (por ejemplo, cTnl total o cTnT total) o libre, en complejo, o fragmentos de la troponina cardiaca. En algunas realizaciones, se detecta y/o cuantifica la troponina cardiaca total. En algunas realizaciones, se detecta cTnT total. En algunas realizaciones, se detecta y/o cuantifica cTnl total.

A. Muestra

La muestra puede ser cualquier muestra apropiada. Por lo general, la muestra es una muestra biologica, por ejemplo, un fluido biologico. Tales fluidos incluyen, sin limitacion, condensado de aire exhalado (EBC), lfquido de lavado broncoalveolar (BAL), sangre, suero, plasma, orina, lfquido cefalorraqrndeo, lfquido pleural, lfquido sinovial, lfquido peritoneal, lfquido amniotico, lfquido gastrico, lfquido linfatico, lfquido intersticial, homogeneizado de tejido, extractos de celulas, saliva, esputo, heces, secreciones fisiologicas, lagrimas, moco, sudor, leche, semen, lfquido seminal, secreciones vaginales, lfquido de ulceras y otras erupciones superficiales, ampollas y abscesos, y extractos de tejidos, incluyendo biopsias de tejidos normales, malignas y sospechosas o cualesquier otros constituyentes del cuerpo que pueden contener la partfcula diana de interes. Otras muestras similares, tales como cultivo de celulas o tejidos o caldo de cultivo tambien son de interes.

En algunas realizaciones, la muestra es una muestra de sangre. En algunas realizaciones, la muestra es una muestra de plasma. En algunas realizaciones, la muestra es una muestra de suero.

B. Preparacion de la muestra

En general, cualquier metodo de preparacion de la muestra se puede usar para producir una etiqueta que corresponde a una molecula de troponina cardiaca que se desea medir, donde la etiqueta es detectable en los instrumentos descritos en este documento. Como se conoce en la tecnica, la preparacion de muestras en la cual se adiciona una etiqueta a una o mas partfculas se puede realizar en un formato homogeneo o heterogeneo. En algunos casos, la preparacion de la muestra se establece en un formato homogeneo. En el sistema de analisis que emplea un formato homogeneo, la etiqueta no unida no se elimina de la muestra. Vease, por ejemplo, la Solicitud de la Patente de los Estados Unidos No. 11/048,660, publicada como US2006/0078998 A1. En algunos casos, la partfcula o partfculas de interes se etiquetan mediante la adicion de anticuerpo o anticuerpos marcados que se unen a la partfcula o partfculas de interes.

En algunos casos, se utiliza un formato de ensayo heterogeneo, donde, por lo general, se emplea una etapa para retirar la etiqueta no unida. Tales formatos de ensayo son bien conocidos en la tecnica. Un formato de ensayo particularmente util es un ensayo de tipo sandwich, por ejemplo, un inmunoensayo de tipo sandwich. En este formato, la molecula de interes, por ejemplo, marcador de un estado biologico, es capturado, por ejemplo, sobre un soporte solido, utilizando un asociado de union de captura. Las moleculas no deseadas y otras sustancias pueden entonces opcionalmente ser lavadas, seguido por la union de una etiqueta que comprende un asociado de union de deteccion y una etiqueta detectable, por ejemplo, unidad estructural fluorescente. Otras lavados eliminan la etiqueta no unida, luego se libera la etiqueta detectable, por lo general, aunque no necesariamente todavfa unida al asociado de union de deteccion. En casos alternativos, se adicionan la muestra y la etiqueta al asociado de union de captura sin un lavado en el medio, por ejemplo, al mismo tiempo. Otras variaciones seran evidentes para un experto en el arte.

En algunos casos, el metodo para la deteccion de partfculas de troponina utiliza un ensayo de sandwich con anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos monoclonales como asociados de union de captura. El metodo comprende la union de moleculas de troponina en una muestra con un anticuerpo de captura que esta inmovilizado en una

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superficie de union, y la union del anticuerpo de deteccion con la molecula de troponina para formar un complejo "sandwich". El anticuerpo de deteccion comprende una etiqueta fluorescente detectable, tal como se describe en este documento, que se detecta, por ejemplo, usando los analizadores de una unica molecula descritos en este documento. Tanto los anticuerpos de captura como de deteccion se unen espedficamente a la troponina. Muchos ejemplos de inmunoensayos sandwich son conocidos, y algunos se describen en la Patente de los Estados Unidos No. 4,168,146 de Grubb et al. y la Patente de los Estados Unidos No. 4,366,241 de Tom et al.. Otros ejemplos espedficos para la troponina cardiaca se describen en los Ejemplos.

El asociado de union de captura puede estar unido a un soporte solido, por ejemplo, una placa de microtitulacion o perlas paramagneticas. En algunos casos, la invencion provee un asociado de union para una troponina cardiaca unido a una perla paramagnetica. Se puede utilizar cualquier asociado de union apropiado que es espedfico para el tipo de troponina cardiaca que se desea capturar. El asociado de union puede ser un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo puede ser espedfico para troponina cardiaca (cTnl o cTnT) libre o para la troponina cardiaca que forma complejo, troponina cardiaca modificada, o fragmentos de la troponina cardiaca, como se describe en este documento, o espedfico a todas o practicamente todas las formas de troponina cardiaca, por ejemplo, cTnl o cTnT, que probablemente se encuentran en la muestra de interes. La produccion y fuentes de anticuerpos para la troponina cardiaca se describen en este documento. Los anticuerpos preferidos para medir la troponina total son aquellos que no se afectan sustancialmente por la heparina, la fosforilacion, la oxidacion y la formacion de complejos de troponina, y que no presentan reaccion con cruzamiento con troponina del musculo esqueletico, por ejemplo, la troponina I. En algunos casos, el anticuerpo es espedfico para una region espedfica de una troponina cardiaca. En algunos casos, la region incluye los aminoacidos 41 - 49 de la troponina I cardiaca humana. En algunos casos, la region incluye los aminoacidos 87 - 91 de la troponina I cardiaca humana. Tales anticuerpos son bien conocidos en la tecnica y estan disponibles en, por ejemplo, BiosPacific, Emeryville, CA. Un ejemplo de un anticuerpo de captura util en los casos de la invencion es un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, que reacciona con la troponina I cardiaca (cTnl) libre aa de 41 - 49 y cTnl formar complejos con otros componentes de troponina. Preferiblemente, este anticuerpo no se ve afectada por la heparina, la fosforilacion, la oxidacion y la formacion de complejos de troponina, y no presentan reaccion con cruzamiento con troponina del musculo esqueletico I. Un anticuerpo a modo de ejemplo de este tipo es el Clon de Anticuerpo Monoclonal Numero A34650228P, disponible de BiosPacific, Emeryville, CA. Otro ejemplo de un anticuerpo de captura util en los casos de la invencion es un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, que reacciona con la troponina I cardiaca (cTnI) libre aa 87-91 y cTnI que forma complejos con otros componentes de troponina. Preferiblemente, este anticuerpo no se ve afectado por la heparina, la fosforilacion, la oxidacion y la formacion de complejos de troponina, y no presenta reaccion con cruzamiento con troponina I del musculo esqueletico. Un anticuerpo a modo de ejemplo de este tipo es el Clon de Anticuerpo Monoclonal Numero A34440228P, disponible de BiosPacific, Everyville, Ca. Se apreciara que los anticuerpos identificados en este documento, tan utiles como un anticuerpo de captura tambien pueden ser utiles como anticuerpos de deteccion, y viceversa.

La union del asociado de union, por ejemplo, anticuerpo, al soporte solido puede ser covalente o no covalente. En algunos casos, la union es no covalente. Un ejemplo de una union no covalente bien conocida en la tecnica es las interacciones con biotina-avidina/estreptavidina. Por lo tanto, en algunos casos, un soporte solido, por ejemplo, una placa de microtitulacion o una perla paramagnetica, se une al asociado de union de captura, por ejemplo, el anticuerpo, a traves de union covalente, por ejemplo, interacciones de biotina-avidina/estreptavidina. En algunos casos, la union es covalente. Por lo tanto, en algunos casos, un soporte solido, por ejemplo, una placa de microtitulacion o una perla paramagnetica, se une al asociado de union de captura, por ejemplo, el anticuerpo, a traves de union covalente. La union covalente en la cual la orientacion del anticuerpo de captura es tal que es especialmente util, que la captura de la molecula de interes sea optimizada. Por ejemplo, en algunos casos un soporte solido, por ejemplo, se puede utilizar una placa de microtitulacion o una micropartfcula paramagnetica, en donde la union del asociado de union, por ejemplo, anticuerpo, es una union orientada, por ejemplo, una union orientada covalente.

Un protocolo de ejemplo para la union orientada de un anticuerpo a un soporte solido es de la siguiente manera: IgG se disuelve en solucion reguladora de acetato de sodio 0.1 M, pH 5.5 a una concentracion final de 1 mg/mL. Se adiciona un volumen igual de peryodato de sodio 20 mM enfriado con hielo en acetato de sodio 0.1 M, pH 5.5. La IgG se deja oxidar por A hora en hielo. El exceso de reactivo de peryodato se inactivo mediante la adicion de un volumen de 0.15 de glicerol 1M. Los subproductos de bajo peso molecular de la reaccion de oxidacion se eliminan por ultrafiltracion. La unidad estructural IgG oxidada se diluyo a una concentracion apropiada (por lo general de 0.5 microgramos de IgG por mL) y se hizo reaccionar con placas multipozos activadas con hidrazina durante al menos dos horas a temperatura ambiente. La IgG sin unir se elimina por medio del lavado de la placa multipozos con solucion salina regulada con borato u otra solucion reguladora apropiada. La placa se puede secar durante el almacenamiento, si se desea. Un protocolo similar se puede seguir para microperlas si el material de la microperla es apropiado para dicha union.

En algunos casos, el soporte solido es una placa de microtitulacion. En algunos casos, el soporte solido es una perla paramagnetica. Una perla paramagnetica de ejemplo es la estreptavidina C1 (Dynal, 650.01-03). Otras perlas apropiadas seran evidentes para los expertos en el arte. Los metodos para la union de anticuerpos con las perlas paramagneticas son bien conocidos en la tecnica. En los Ejemplos se da una ilustracion.

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La troponina cardiaca de interes se pone en contacto con el asociado de union de captura, por ejemplo, el anticuerpo de captura inmovilizado sobre un soporte solido. Alguna preparacion de la muestra se puede utilizar; por ejemplo, preparacion de suero de muestras de sangre o procedimientos de concentracion antes de que la muestra se ponga en contacto con el anticuerpo de captura. Los protocolos para la union de las protemas en inmunoensayos son bien conocidos en la tecnica y se incluyen en los Ejemplos.

El tiempo permitido para la union variara dependiendo de las condiciones; sera evidente que los tiempos mas cortos de union son deseables en algunos entornos, especialmente en un entorno clmico. El uso de, por ejemplo, perlas paramagneticas puede reducir el tiempo requerido para la union. En algunos casos, el tiempo permitido para la union de la protema de interes con el asociado de union de captura, por ejemplo, anticuerpo, es menor que aproximadamente 12, 10, 8, 6, 4, 3, 2, o 1 hora, o menos de aproximadamente 60, 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, o 5 minutos. En algunos casos, el tiempo permitido para la union de la protema de interes con el asociado de union de captura, por ejemplo, anticuerpo, es menos de aproximadamente 60 minutos. En algunos casos, el tiempo permitido para la union de la protema de interes con el asociado de union de captura, por ejemplo, anticuerpo, es menor que aproximadamente 40 minutos. En algunos casos, el tiempo permitido para la union de la protema de interes con el asociado de union de captura, por ejemplo, anticuerpo, es menos de aproximadamente 30 minutos. En algunos casos, el tiempo permitido para la union de la protema de interes con el asociado de union de captura, por ejemplo, anticuerpo, es menos de aproximadamente 20 minutos. En algunos casos, el tiempo permitido para la union de la protema de interes con el asociado de union de captura, por ejemplo, anticuerpo, es menos de aproximadamente 15 minutos. En algunos casos, el tiempo permitido para la union de la protema de interes con el asociado de union de captura, por ejemplo, anticuerpo, es menos de aproximadamente 10 minutos. En algunos casos, el tiempo permitido para la union de la protema de interes con el asociado de union de captura, por ejemplo, anticuerpo, es menos de aproximadamente 5 minutos.

En algunos casos, despues de la union de las partmulas de troponina con el asociado de union de captura, por ejemplo, anticuerpo de captura, las partmulas que se pueden haber unido inespedficamente, asf como otras sustancias no deseadas en la muestra, se retiran lavando, dejando sustancialmente solo partmulas de troponina unidas espedficamente. En otros casos, no se utiliza el lavado entre las adiciones de la muestra y la etiqueta; se apreciara que esto reduce aun mas el tiempo de preparacion de la muestra. Por lo tanto, en algunos casos, el tiempo permitido para la union de la protema de interes con el asociado de union de captura, por ejemplo, anticuerpo, y la union de la etiqueta con la protema de interes, es menos de aproximadamente 12, 10, 8, 6, 4, 3, 2, o 1 hora, o menos de aproximadamente 60, 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, o 5 minutos. En algunos casos, el tiempo permitido para la union de la protema de interes con el asociado de union de captura, por ejemplo, anticuerpos, y la union de la etiqueta con la protema de interes, es menos de 60 minutos. En algunos casos, el tiempo permitido para la union de la protema de interes con el asociado de union de captura, por ejemplo, anticuerpo, y la union de la etiqueta con la protema de interes, es menos de 40 minutos. En algunos casos, el tiempo permitido para la union de la protema de interes con el asociado de union de captura, por ejemplo, anticuerpo, y la union de la etiqueta con la protema de interes, es menos de aproximadamente 30 minutos. En algunos casos, el tiempo permitido para la union de la protema de interes con el asociado de union de captura, por ejemplo, anticuerpo, y la union de la etiqueta con la protema de interes, es menos de aproximadamente 20 minutos. En algunos casos, el tiempo permitido para la union de la protema de interes con el asociado de union de captura, por ejemplo, anticuerpo, y la union de la etiqueta con la protema de interes, es menos de 15 minutos. En algunos casos, el tiempo permitido para la union de la protema de interes con el asociado de union de captura, por ejemplo, anticuerpo, y la union de la etiqueta con la protema de interes, es menos de aproximadamente 10 minutos. En algunos casos, el tiempo permitido para la union de la protema de interes con el asociado de union de captura, por ejemplo, anticuerpo, y la union de la etiqueta con la protema de interes, es menos de aproximadamente 5 minutos.

Algunos reactivos de diagnostico de inmunoensayo incluyendo los anticuerpos de captura y de senal utilizados para medir los analitos diana se pueden derivar de los sueros de animales. Los anticuerpos heterofilos humanos endogenos, o anticuerpos anti-humanos de animales, que tienen la capacidad de unirse a las inmunoglobulinas de otras especies, estan presentes en el suero o plasma de mas del 10% de los pacientes. Estos anticuerpos heterofilos circulantes pueden interferir con las mediciones de inmunoensayo. En inmunoensayos de tipo sandwich, estos anticuerpos heterofilos pueden tender un puente de los anticuerpos de captura y deteccion (diagnostico), produciendo de este modo una senal de falsos positivos, o pueden bloquear la union de los anticuerpos de diagnostico, produciendo de ese modo una senal de falsos negativos. En inmunoensayos competitivos, los anticuerpos heterofilos se pueden unir al anticuerpo analttico e inhibir su union a la troponina. Tambien se pueden ya sea bloquear o aumentar la separacion del complejo de troponina-anticuerpo de la troponina libre, especialmente cuando se utilizan anticuerpos antiespecies en los sistemas de separacion. Por lo tanto, el impacto de estas interferencias de anticuerpos heterofilos es diffcil de predecir. Por lo tanto, sena ventajoso bloquear la union de cualquier anticuerpo heterofilo. En algunos casos, el inmunoensayo incluye la etapa de cafda de la muestra de anticuerpos heterofilos usando uno o mas bloqueadores de anticuerpos heterofilos. Los metodos para la eliminacion de anticuerpos heterofilos a partir de muestras que se van a probar en inmunoensayos son conocidos e incluyen: el calentamiento de la muestra en un solucion reguladora de acetato de sodio, pH 5.0, durante 15 minutos a 90 °C y centrifugacion a 1200g durante 10 minutos, o los anticuerpos heterofilos se pueden precipitar utilizando polietilenglicol (PEG); inmunoextraccion de la interferencia de las inmunoglobulinas heterofilas a partir de la muestra utilizando la protema A o protema G; o la adicion de IgG de raton no inmune. Los casos de los metodos descritos en

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este documento contemplan la preparacion de la muestra antes del analisis con el detector de unica molecula. La idoneidad del metodo de tratamiento previo se puede determinar. Los bioqmmicos para minimizar la interferencia del inmunoensayo causada por los anticuerpos heterofilos estan disponibles comercialmente. Por ejemplo, un producto llamado MAK33, que es un anticuerpo monoclonal IgG1 para h-CK-MM, se puede obtener de Boehringer Mannheim. El producto MAK33 plus contiene una combinacion de IgG1 e IgG1-Fab. El polyMAK33 contiene IgG1-Fab polimerizada con IgG1 y el Polymac 2b/2a contiene IgG2a-Fab polimerizada con IgG2b. Una segunda fuente comercial de productos bioqmmicos para neutralizar los anticuerpos heterofilos es un reactivo inhibidor de la inmunoglobulina comercializado por Bioreclamation Inc, East Meadow, NY. Este producto es una preparacion de inmunoglobulinas (IgG e IgM) de multiples especies, principalmente IgG2a murino, IgG2b, e IgG3 de ratones Balb/c. En algunos casos el anticuerpo heterofilo puede ser inmunoextrafdo de la muestra utilizando metodos conocidos en la tecnica, por ejemplo cafda de la muestra del anticuerpo heterofilo mediante la union del anticuerpo que interfiere con la protema A o G. En algunos casos, el anticuerpo heterofilo se neutraliza usando uno o mas bloqueadores de anticuerpos heterofilos. Los bloqueadores de los heterofilos se pueden seleccionar del grupo que consiste de bloqueadores de anticuerpos heterofilos anti-isotipo, bloqueadores de anticuerpos heterofilos anti-idiotipo, y bloqueadores de anticuerpos heterofilos anti-anti-idiotipo. En algunos casos se puede utilizar una combinacion de bloqueadores de anticuerpos heterofilos.

La etiqueta se adiciona ya sea con o despues de la adicion de la muestra y el lavado. Los protocolos para la union del anticuerpo y otras inmunoetiquetas con las protemas y otras moleculas son bien conocidos en la tecnica. Si la etapa de union de la etiqueta es independiente de union de captura, el tiempo permitido para la union de la etiqueta puede ser importante, por ejemplo, en el ambito clmico. En algunos casos, el tiempo permitido para la union de la protema de interes con la etiqueta, por ejemplo, anticuerpo-colorante, es menos de aproximadamente 12, 10, 8, 6, 4, 3, 2, o 1 hora, o menos de aproximadamente 60, 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, o 5 minutos. En algunos casos, el tiempo permitido para la union de la protema de interes con la etiqueta, por ejemplo, anticuerpo-colorante, es menos de aproximadamente 60 minutos. En algunos casos, el tiempo permitido para la union de la protema de interes con la etiqueta, por ejemplo, anticuerpo-colorante, es menos de aproximadamente 40 minutos. En algunos casos, el tiempo permitido para la union de la protema de interes con la etiqueta, por ejemplo, anticuerpo-colorante, es menos de aproximadamente 30 minutos. En algunos casos, el tiempo permitido para la union de la protema de interes con la etiqueta, por ejemplo, anticuerpo-colorante, es menos de aproximadamente 20 minutos. En algunos casos, el tiempo permitido para la union de la protema de interes con la etiqueta, por ejemplo, anticuerpo-colorante, es menos de aproximadamente 15 minutos. En algunos casos, el tiempo permitido para la union de la protema de interes con la etiqueta, por ejemplo, anticuerpo-colorante, es menos de aproximadamente 10 minutos. En algunos casos, el tiempo permitido para la union de la protema de interes con la etiqueta, por ejemplo, anticuerpo-colorante, es menos de aproximadamente 5 minutos. El exceso de etiqueta se elimina mediante el lavado.

La etiqueta luego se eluye de la protema de interes. Las soluciones reguladoras de elucion preferidas son eficaces en la liberacion de la etiqueta sin generar un fondo significativo. Tambien es util si la solucion reguladora de elucion es bacteriostatica. Las soluciones reguladoras de elucion de uso incluyen un agente caotropico, por ejemplo, urea o un compuesto de guanidinio; una solucion reguladora, por ejemplo, solucion salina regulada con borato; un portador de protema, por ejemplo, una albumina, tal como albumina humana, bovina, o pescado, o una IgG, para recubrir la pared del tubo capilar en el instrumento de deteccion; y un surfactante, por ejemplo, un detergente ionico o no ionico, seleccionado de manera que produzca un fondo relativamente bajo, por ejemplo, Tween 20, Triton X-100, o SDS.

La almuota de elucion de solucion reguladora/etiqueta que es muestreada en el detector de una unica molecula se conoce como la "muestra en procesamiento", para distinguirla de la muestra original que se obtuvo de un individuo.

En otro ejemplo, el ensayo de union en fase solida puede emplear un formato de ensayo de union competitiva. Uno de dichos metodos comprende a) union competitiva con un anticuerpo de captura inmovilizado sobre una superficie de union i) una partmula de troponina en una muestra y ii) un analogo marcado de la partmula de troponina que comprende un marcador detectable (el reactivo de deteccion) y b) medir la cantidad de la etiqueta utilizando un analizador de partmula unica. Otro de tales metodos comprende a) union competitiva con un anticuerpo que tiene un marcador detectable (el reactivo de deteccion) i) una partmula de troponina en una muestra y ii) un analogo de la partmula de troponina que esta inmovilizado sobre una superficie de union (el reactivo de captura) y b) medir la cantidad de la etiqueta utilizando un analizador de partmula unica. Un "analogo de una troponina" se refiere, en este documento, a una especie que compite con la troponina por la union con un anticuerpo de captura. Ejemplos de inmunoensayos competitivos se describen en la Patente de los Estados Unidos No. 4,235,601 de Deutsch et al., la Patente de los Estados Unidos No. 4,442,204 de Liotta, y la Patente de los Estados Unidos No. 5,208,53 de Buechler et al.

C. Deteccion de la troponina y determinacion de la concentracion

Despues de la elucion, la etiqueta se pasa a traves de un detector de una unica molecula en, por ejemplo, la solucion reguladora de elucion. Una muestra en procesamiento puede contener no etiqueta, una sola etiqueta, o una pluralidad de etiquetas. El numero de etiquetas corresponde o es proporcional (si se utilizan diluciones de muestras o unidades estructurales) al numero de moleculas de troponina cardiaca capturada durante la etapa de captura.

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Puede ser utilizado cualquier detector apropiado de una unica molecula capaz de detectar la etiqueta utilizada con la protema de interes. Los detectores apropiados de una unica molecula se describen en este documento. Normalmente, el detector sera parte de un sistema que incluye un muestreador automatico para el muestreo de las muestras preparadas, y, opcionalmente, un sistema de recuperacion para recuperar las muestras.

En algunos casos, la muestra en procesamiento se analiza en un analizador de molecula unica que utiliza un sistema de flujo capilar, y que incluye una celda de flujo capilar, un laser para iluminar un espacio de interrogacion en el capilar a traves del cual se hace pasar la muestra en procesamiento, un detector para detectar la radiacion emitida desde el espacio de interrogacion, y una fuente de fuerza motriz para mover una muestra en procesamiento a traves del espacio de interrogacion. En algunos casos, el analizador de molecula unica comprende ademas una lente objetivo del microscopio que recoge la luz emitida desde la muestra en procesamiento a medida que pasa a traves del espacio de interrogacion, por ejemplo, una alta abertura numerica del objetivo del microscopio. En algunos casos, el laser y el detector estan en una configuracion confocal. En algunos casos, el laser es un laser de onda continua. En algunos casos, el detector es un detector de fotodiodos en avalancha. En algunos casos, la fuente de fuerza motriz es una bomba para proporcionar la presion. Algunos casos proporcionan un sistema de analisis que incluye un sistema de muestreo capaz de muestrear automaticamente una pluralidad de muestras proporcionando una comunicacion del lfquido entre un recipiente de muestra y el espacio de interrogacion. En algunos casos, el espacio de interrogacion tiene un volumen entre aproximadamente 0.001 y 500 pL, o entre aproximadamente 0.01 pL y 100 pL, o entre aproximadamente 0.01 pL y 10 pL, o entre aproximadamente 0.01 pL y 5 pL, o entre aproximadamente 0.01 pL y 0.5 pL, o entre aproximadamente 0.02 pL y aproximadamente 300 pL, o entre aproximadamente 0.02 pL y aproximadamente 50 pL o entre aproximadamente 0.02 pL y aproximadamente 5 pL o entre aproximadamente 0.02 pL y aproximadamente 0.5 pL o entre aproximadamente 0.02 pL y aproximadamente 2 pL, o entre aproximadamente 0.05 pL y aproximadamente 50 pL, o entre aproximadamente 0.05 pL y aproximadamente 5 pL, o entre aproximadamente 0.05 pL y aproximadamente 0.5 pL, o entre aproximadamente 0.05 pL y aproximadamente 0.2 pL ,o entre aproximadamente 0.1 pL y aproximadamente 25 pL. En algunos casos, el espacio de interrogacion tiene un volumen entre aproximadamente 0.004 pL y 100 pL. En algunos casos, el espacio de interrogacion tiene un volumen entre aproximadamente 0.02 pL y 50 pL. En algunos casos, el espacio de

interrogacion tiene un volumen entre aproximadamente 0.001 pL y 10 pL. En algunos casos, el espacio de

interrogacion tiene un volumen entre aproximadamente 0.01 pL y 5 pL. En algunos casos, el espacio de

interrogacion tiene un volumen entre aproximadamente 0.02 pL y aproximadamente 5 pL. En algunos casos, el espacio de interrogacion tiene un volumen entre aproximadamente 0.05 pL y 5 pL En algunos casos, el espacio de interrogacion tiene un volumen entre aproximadamente 0.05 pL y 10 pL. En algunos casos, el espacio de interrogacion tiene un volumen entre aproximadamente 0.5 pL y aproximadamente 5 pL. En algunos casos, el espacio de interrogacion tiene un volumen entre aproximadamente 0.02 pL y aproximadamente 0.5 pL.

En algunos casos, el detector de molecula unica utilizado en los metodos de la invencion utiliza un sistema de flujo capilar, e incluye una celda de flujo capilar, un laser de onda continua para iluminar un espacio de interrogacion en el capilar a traves del cual se hace pasar la muestra en procesamiento, una lente de objetivo del microscopio de alta abertura numerica que recoge la luz emitida desde la muestra en procesamiento a medida que pasa a traves del espacio de interrogacion, un detector de fotodiodo en avalancha para detectar la radiacion emitida desde el espacio de interrogacion, y una bomba para proporcionar la presion para mover una muestra en procesamiento a traves del espacio de interrogacion, donde el espacio de interrogacion es entre aproximadamente 0.02 pL y aproximadamente 50 pL. En algunos casos, el detector de una unica molecula utilizada en los metodos de la invencion utiliza un sistema de flujo capilar, e incluye una celda de flujo capilar, un laser de onda continua para iluminar un espacio de interrogacion en el capilar a traves del cual se hace pasar la muestra en procesamiento, una lente de objetivo del microscopio de alta abertura numerica que recoge la luz emitida desde la muestra en procesamiento a medida que pasa a traves del espacio de interrogacion en donde la lente tiene una abertura numerica de al menos aproximadamente 0.8, un detector de fotodiodos en avalancha para detectar la radiacion emitida desde el espacio de interrogacion, y una bomba para proporcionar la presion para mover una muestra en procesamiento a traves del espacio de interrogacion, donde el espacio de interrogacion es entre aproximadamente 0.004 pL y aproximadamente 100 pL. En algunos casos, el detector de una unica molecula utilizada en los metodos de la invencion utiliza un sistema de flujo capilar, e incluye una celda de flujo capilar, un laser de onda continua para iluminar un espacio de interrogacion en el capilar a traves del cual se hace pasar la muestra en procesamiento, una lente de objetivo del microscopio de alta abertura numerica que recoge la luz emitida desde la muestra en procesamiento a medida que pasa a traves del espacio de interrogacion en donde la lente tiene una abertura numerica de al menos aproximadamente 0.8, un detector de fotodiodo en avalancha para detectar la radiacion emitida desde el espacio de interrogacion, y una bomba para proporcionar la presion para mover una muestra en procesamiento a traves del espacio de interrogacion, donde el espacio de interrogacion es entre aproximadamente 0.05 pL y aproximadamente 10 pL. En algunos casos, el detector de una unica molecula utilizada en los metodos de la invencion utiliza un sistema de flujo capilar, e incluye una celda de flujo capilar, un laser de onda continua para iluminar un espacio de interrogacion en el capilar a traves del cual se hace pasar la muestra en procesamiento, una lente de objetivo del microscopio de alta abertura numerica que recoge la luz emitida desde la muestra en procesamiento a medida que pasa a traves del espacio de interrogacion en donde la lente tiene una abertura numerica de al menos aproximadamente 0.8, un detector de fotodiodo en avalancha para detectar la radiacion emitida desde el espacio de interrogacion, y una bomba para proporcionar la presion para mover una muestra en procesamiento a traves del espacio de interrogacion, donde el espacio de interrogacion es entre aproximadamente 0.05 pL y aproximadamente

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5 pL. En algunos casos, el detector de una unica molecula utilizada en los metodos de la invencion utiliza un sistema de flujo capilar, e incluye una celda de flujo capilar, un laser de onda continua para iluminar un espacio de interrogacion en el capilar a traves del cual se hace pasar la muestra en procesamiento, una lente de objetivo del microscopio de alta abertura numerica que recoge la luz emitida desde la muestra en procesamiento a medida que pasa a traves del espacio de interrogacion en donde la lente tiene una abertura numerica de al menos aproximadamente 0.8, un detector de fotodiodos en avalancha para detectar la radiacion emitida desde el espacio de interrogacion, y una bomba para proporcionar la presion para mover una muestra en procesamiento a traves del espacio de interrogacion, donde el espacio de interrogacion es entre aproximadamente 0.5 pL y aproximadamente 5 pL.

En algunos casos, el detector de una unica molecula es capaz de determinar una concentracion de una molecula de interes en una muestra donde la muestra puede variar en concentracion en un intervalo de al menos aproximadamente 100 veces, o 1000 veces, o 10,000 veces, o 100,000 veces, o 300,00 veces, o 1,000,000 veces, o 10,000,000 veces, o 30,000,000 veces.

En algunos casos, los metodos de la invencion utilizan un detector de una unica molecula capaz de detectar una diferencia de menos de aproximadamente 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, o 10% en la concentracion de un analito entre una primera muestra y una segunda muestra que se introducen en el detector, cuando el volumen de la primera muestra y dicha segunda muestra introducida en el analizador es menos de aproximadamente 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, o 1 ul, y en donde el analito esta presente en una concentracion de menos de aproximadamente 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10 , 5, 4, 3, 2, o 1 femtomolar. En algunos casos, los metodos de la invencion utilizan un detector de una unica molecula capaz de detectar una diferencia de menos de aproximadamente 50% en la concentracion de un analito entre una primera muestra y una segunda muestra que se introducen en el detector, cuando el volumen de la primera muestra y dicha segunda muestra introducida en el analizador es menos de aproximadamente 100 ul, y en donde el analito esta presente en una concentracion de menos de aproximadamente 100 femtomolar. En algunos casos, los metodos de la invencion utilizan un detector de una unica molecula capaz de detectar una diferencia de menos de aproximadamente 40% en la concentracion de un analito entre una primera muestra y una segunda muestra que se introducen en el detector, cuando el volumen de la primera muestra y dicha segunda muestra introducida en el analizador es menos de aproximadamente 50 ul, y en donde el analito esta presente en una concentracion de menos de aproximadamente 50 femtomolar. En algunos casos, los metodos de la invencion utilizan un detector de una unica molecula capaz de detectar una diferencia de menos de aproximadamente 20% en la concentracion de un analito entre una primera muestra y una segunda muestra que se introducen en el detector, cuando el volumen de la primera muestra y dicha segunda muestra introducida en el analizador es menos de aproximadamente 20 ul, y en donde el analito esta presente en una concentracion de menos de aproximadamente 20 femtomolar. En algunos casos, los metodos de la invencion utilizan un detector de una unica molecula capaz de detectar una diferencia de menos de aproximadamente 20% en la concentracion de un analito entre una primera muestra y una segunda muestra que se introducen en el detector, cuando el volumen de la primera muestra y dicha segunda muestra introducida en el analizador es menos de aproximadamente 10 ul, y en donde el analito esta presente en una concentracion de menos de aproximadamente 10 femtomolar. En algunos casos, los metodos de la invencion utilizan un detector de una unica molecula capaz de detectar una diferencia de menos de aproximadamente 20% en la concentracion de un analito entre una primera muestra y una segunda muestra que se introducen en el detector, cuando el volumen de la primera muestra y dicha segunda muestra introducida en el analizador es menos de aproximadamente 5 ul, y en donde el analito esta presente en una concentracion de menos de aproximadamente 5 femtomolar.

Los sistemas y detector de unica molecula se describen con mas detalle a continuacion. Otros casos de analizadores de una unica molecula utiles en los metodos de la invencion, tales como detectores con mas de una ventana de interrogacion, los detectores utilizan flujo electrocinetico o electroforetico, y similares, se pueden encontrar en la Solicitud de la Patente de los Estados Unidos No. 11/048,660, publicada como US2006/0078998 A1.

El instrumento se puede lavar entre los ensayos. Se puede utilizar una solucion reguladora de lavado que mantiene las concentraciones de sal y de surfactante de la muestra, en algunos casos para mantener el acondicionamiento del capilar; i.e., para mantener la superficie del capilar relativamente constante entre las muestras para reducir la variabilidad.

Una caractenstica que contribuye a la sensibilidad extremadamente alta de los instrumentos y los metodos de la invencion es el metodo de deteccion y de recuento de etiquetas, que, en algunos casos, estan unidas a moleculas unicas para ser detectadas o, mas generalmente, corresponden a una unica molecula que se detecta. En resumen, la muestra en procesamiento que fluye a traves del capilar se divide de manera efectiva en una serie de eventos de deteccion, sometiendo un espacio de interrogacion dado del capilar a la radiacion EM a partir de un emisor de luz laser a una longitud de onda de excitacion apropiada para la unidad estructural fluorescente utilizada en la etiqueta durante un penodo de tiempo predeterminado, y la deteccion de fotones emitidos durante ese tiempo. Cada penodo de tiempo predeterminado es un "intervalo". Si el numero total de fotones detectado en un intervalo dado excede un nivel de umbral predeterminado, se registra un evento de deteccion para ese intervalo, i.e., se ha detectado una etiqueta. Si el numero total de fotones no esta en el nivel de umbral predeterminado, ningun evento de deteccion se registra. En algunos casos, concentracion de la muestra en procesamiento es suficientemente diluida que, para un

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gran porcentaje de eventos de deteccion, el evento de deteccion representa solo una etiqueta que pasa a traves de la ventana, que corresponde a una unica molecula de interes en la muestra original, es decir, pocos eventos de deteccion representan mas de una etiqueta en un solo intervalo. En algunos casos, otros refinamientos se aplican para permitir mayores concentraciones de etiqueta en la muestra en procesamiento para que sea detectada con precision, i.e., concentraciones en las que la probabilidad de que dos o mas etiquetas se detecten como un unico evento de deteccion ya no es insignificante.

A pesar de que otros tiempos del intervalo se pueden utilizar, en algunos casos se seleccionan en el rango de aproximadamente 1 microsegundo a aproximadamente 5 ms. En algunos casos, el tiempo del intervalo es mas de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 750, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, o 5000 microsegundos.. En algunos casos, el tiempo del intervalo es menos de aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80,90, 100, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 750, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, o 5000 microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 1 a 1000 microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 1 a 750 microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 1 a 500 microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 1 a 250 microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 1 a 100 microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 1 a 50 microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 1 a 40 microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 1 a 30 microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 1 a 500 microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 1 a 20 microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 1 a 10 microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 1 a 500 microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 1 a 5 microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 5 a 500 microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 5 a 250 microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 5 a 100 microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 5 a 50microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 5 a 20 microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 5 a 10 microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 10 a 500 microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 10 a 250 microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 10 a 100 microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 10 a 50 microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 10 a 30 microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 10 a 20 microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 5 microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 5 microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 6 microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 7 microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 8 microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 9 microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 10

microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 11 microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 12 microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 13 microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 14

microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 5 microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 15 microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 16 microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 17

microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 18 microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 19 microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 20 microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 25

microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 30 microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 40 microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 50 microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 100 microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 250 microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 500 microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 750 microsegundos. En algunos casos, el tiempo del intervalo es aproximadamente 1000 microsegundos.

En algunos casos, el nivel de ruido de fondo se determina a partir de la media del nivel de ruido, o la media cuadratica del ruido. En otros casos, se elige un valor de ruido tipico o un valor estadfstico. En la mayona de los casos, se espera que el ruido siga una distribucion de Poisson. Por lo tanto, en algunos casos, determinar la concentracion de un complejo de partfculas de etiqueta en una muestra comprende determinar el nivel de ruido de fondo.

Por lo tanto, a medida que una etiqueta fluye a traves de la celda de flujo capilar, es irradiada por el haz de laser para generar una rafaga de fotones. Los fotones emitidos por la etiqueta se discriminan de la luz de fondo o emision de ruido de fondo, considerando que solo las rafagas de fotones tienen energfa por encima de un nivel de energfa umbral predeterminado que representa la cantidad de ruido de fondo que esta presente en la muestra. El ruido de fondo comprende por lo general baja emision de frecuencia producida, por ejemplo, por la fluorescencia intrmseca de las partfculas no etiquetados que estan presentes en la muestra, la solucion reguladora o diluyente usados en la

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preparacion de la muestra para el analisis, la dispersion Raman y el ruido electronico. En algunos casos, el valor asignado al ruido de fondo se calcula como la media de la senal de ruido de fondo detectado en una pluralidad de intervalos, que son mediciones de las senales de fotones que son detectadas en un espacio de interrogacion durante un penodo de tiempo predeterminado. As^ en algunos casos, el ruido de fondo se calcula para cada muestra como un numero espedfico para esa muestra.

Teniendo en cuenta el valor del ruido de fondo, se puede asignar el nivel de energfa de umbral. Como se discutio anteriormente, el valor umbral se determina para discriminar senales verdaderas (debido a la fluorescencia de una etiqueta) del ruido de fondo. Se debe tener cuidado en la eleccion de un valor de umbral de tal manera que, se reduce al mmimo el numero de falsas senales positivas de ruido aleatorio, mientras que el numero de senales verdaderas que se rechazan tambien se minimiza. Los metodos para elegir un valor de umbral incluyen determinar un valor fijo por encima del nivel de ruido y calcular un valor de umbral basado en la distribucion de la senal de ruido. En un caso, el umbral se fija en un numero fijo de desviaciones estandar por encima del nivel de fondo. Suponiendo una distribucion de Poisson del ruido, usando este metodo se puede estimar el numero de senales de falsos positivos durante el transcurso de tiempo del experimento. En algunos casos, el nivel de umbral se calcula como un valor de 4 sigma por encima del ruido de fondo. Por ejemplo, dado un nivel medio de ruido de fondo de 200 fotones, el sistema de analisis establece un nivel de umbral de 4V200 por encima de la media del nivel de fondo/ruido de 200 fotones, que es 256 fotones. Por lo tanto, en algunos casos, determinar la concentracion de una etiqueta en una muestra incluye establecer el nivel de umbral por encima del cual las senales de fotones representan la presencia de una etiqueta. Por el contrario, las senales de fotones que tienen un nivel de energfa que no es mayor que la del nivel de umbral indican la ausencia de una etiqueta.

Se toman muchas mediciones de intervalo para determinar la concentracion de una muestra, y la ausencia o presencia de una etiqueta se confirma para cada medicion de intervalo. Normalmente, 60,000 mediciones o mas se pueden hacer en un minuto (por ejemplo, en los casos en los que el tamano del intervalo es de 1 ms para tamanos del intervalo mas pequenos el numero de mediciones es proporcionalmente mayor, por ejemplo, 6,000,000 mediciones por minuto para un tamano intervalo de 10 microsegundos). Por lo tanto, ninguna medicion unica es crucial y el metodo provee un alto margen de error. Los intervalos que se determinan como que no contienen una etiqueta ("no" intervalos) se descuentan y solo las mediciones hechas en los intervalos que se determinan como que contienen etiqueta ("sP' intervalos) se cuentan para determinar la concentracion de la etiqueta en la muestra en procesamiento. Descontando las mediciones realizadas en el "no" intervalos o intervalos que estan desprovistos de etiqueta, aumenta la relacion senal-ruido y la exactitud de las mediciones. Por lo tanto, en algunos casos, determinar la concentracion de una etiqueta en una muestra comprende detectar las mediciones de intervalo que reflejan la presencia de una etiqueta.

La relacion de senal-ruido o la sensibilidad del sistema de analisis se pueden aumentar minimizando el tiempo que se detecta el ruido de fondo, durante una medicion del intervalo en la que se detecta un complejo de partfcula- etiqueta. Por ejemplo, en una medicion del intervalo que dura 1 milisegundo, durante el cual se detecta un complejo de partfcula-etiqueta cuando pasa a traves de un espacio de interrogacion en 250 microsegundos, 750 microsegundos del 1 milisegundo se gastan para detectar la emision de ruido de fondo. La relacion senal-ruido se puede mejorar disminuyendo el tiempo del intervalo. En algunos casos, el tiempo del intervalo es 1 milisegundo. En otros casos, el tiempo del intervalo es de 750, 500, 250 microsegundos, 100 microsegundos, 50 microsegundos, 25 microsegundos o 10 microsegundos. Otros tiempos del intervalo son como se describen en este documento.

Otros factores que afectan las medidas son el brillo o penumbra de la unidad estructural fluorescente, la velocidad de flujo, y la potencia del laser. Varias combinaciones de los factores relevantes que permiten la deteccion de la etiqueta seran evidentes para los expertos en el arte. En algunos casos, el tiempo del intervalo se ajusta sin cambiar la velocidad de flujo. Se apreciara por los expertos en el arte que a medida que disminuye el tiempo del intervalo, la salida de potencia del laser dirigida al espacio de interrogacion debe aumentar para mantener una energfa total constante aplicada al espacio de interrogacion durante el tiempo del intervalo. Por ejemplo, si el tiempo del intervalo se disminuye de 1000 microsegundos a 250 microsegundos, como una primera aproximacion, la salida de potencia del laser se debe aumentar aproximadamente cuatro veces. Estos ajustes permiten para la deteccion del mismo numero de fotones en unos 250 ms como el numero de fotones contados durante los 1000 ms, dados los ajustes anteriores, y permiten un analisis mas rapido de la muestra con menores fondos y por lo tanto una mayor sensibilidad. Ademas, las velocidades de flujo se pueden ajustar con el fin de acelerar el procesamiento de la muestra. Estos numeros son meramente ejemplares, y el profesional experto puede ajustar los parametros segun sea necesario para lograr el resultado deseado.

En algunos casos, el espacio de interrogacion abarca la seccion transversal completa de la corriente de muestra. Cuando el espacio de interrogacion abarca la seccion transversal completa de la corriente de muestra, solo se necesitan el numero de etiquetas contado y el volumen que pasa a traves de una seccion transversal de la corriente de muestra en una longitud fija de tiempo, para calcular la concentracion de la etiqueta en la muestra en procesamiento. En algunos casos, el espacio de interrogacion se puede definir para que sea menor que el area de la seccion transversal de corriente de la muestra, por ejemplo, mediante el espacio de interrogacion que se define por el tamano del punto iluminado por el rayo laser. En algunos casos, el espacio de interrogacion se puede definir mediante el ajuste de las aberturas 306 (Figura 1A) o 358 y 359 (Figura 1B) del analizador y la reduccion del

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volumen iluminado que es reflejado por la lente del objetivo al detector. En los casos en los que el espacio de interrogacion se define para ser mas pequeno que el area de la seccion transversal de la corriente de la muestra, la concentracion de la etiqueta se puede determinar por interpolacion de la senal emitida por el complejo a partir de una curva estandar que se genera usando una o mas muestras de concentraciones estandar conocidas. En aun otros casos, la concentracion de la etiqueta se puede determinar mediante la comparacion de las partfculas medidas con un estandar de etiqueta interno. En casos, en los que se analiza una muestra diluida, el factor de dilucion se tiene en cuenta en el calculo de la concentracion de la molecula de interes en la muestra de partida.

Como se discutio anteriormente, cuando el espacio de interrogacion abarca la seccion transversal completa de la corriente de muestra, solo el numero de etiquetas contado que pasa a traves de una seccion transversal de la corriente de muestra en una longitud fija de tiempo (intervalo) y el volumen de la muestra que fue interrogado en el intervalo, se necesitan para calcular la concentracion de la muestra. El numero total de etiquetas contenidas en los "sP' intervalos se determina y se relaciona con el volumen de la muestra representada por el numero total de intervalos utilizados en el analisis para determinar la concentracion de etiquetas en la muestra en procesamiento. Por lo tanto, en un caso, determinar la concentracion de una etiqueta en una muestra en procesamiento comprende determinar el numero total de etiquetas detectadas "sP' intervalos y relacionar el numero total de etiquetas detectadas con el volumen total de la muestra que se analizo. El volumen total de la muestra que se analiza es el volumen de la muestra que se pasa a traves de la celda de flujo capilar y a traves del espacio de interrogacion en un intervalo de tiempo especificado. Alternativamente, la concentracion del complejo de etiqueta en una muestra se determina por interpolacion de la senal emitida por la etiqueta en un numero de intervalos a partir de una curva estandar que se genera determinando la senal emitida por las etiquetas en el mismo numero de intervalos de muestras estandar que contiene concentraciones conocidas de la etiqueta.

En algunos casos, el numero de etiquetas individuales que se detecta en un intervalo esta relacionado con la concentracion relativa de la partfcula en la muestra en procesamiento. A concentraciones relativamente bajas, por ejemplo a concentraciones inferiores a cerca de 10-16 M el numero de etiquetas es proporcional a la senal de fotones que se detecta en un intervalo. Por lo tanto, a bajas concentraciones de etiqueta se provee la senal de fotones como una senal digital. A concentraciones relativamente altas, por ejemplo a concentraciones mayores de aproximadamente 10 -16 M, la proporcionalidad de la senal de fotones con una etiqueta se pierde como la probabilidad de dos o mas etiquetas que cruzan el espacio de interrogacion en aproximadamente el mismo momento y que se cuenta como uno se vuelve significativa. Por lo tanto, en algunos casos, las partfculas individuales en una muestra de una concentracion mayor que aproximadamente 10'16 M se resuelven por la disminucion de la longitud de tiempo de la medicion del intervalo.

Alternativamente, en otros casos, el total de la senal de foton que es emitida por una pluralidad de partfculas que estan presentes en cualquier intervalo se detecta. Estos ejemplos permiten detectores de una unica molecula de la invencion en donde el rango dinamico es al menos 3, 3.5, 4, 4.5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, o mas de 8 logs.

El "rango dinamico", tal como se usa ese termino en este documento, se refiere al rango de concentraciones de la muestra que puede ser cuantificado por el instrumento sin necesidad de dilucion u otro tratamiento para alterar la concentracion de las muestras sucesivas de diferentes concentraciones, donde las concentraciones se determinan con una precision apropiada para el uso previsto. Por ejemplo, si una placa de microtitulacion contiene una muestra de una concentracion 1 femtomolar para un analito de interes en un pozo, una muestra de concentracion 10,000 femtomolar para un analito de interes en otro pozo, y una muestra de concentracion 100 femtomolar para el analito en un tercer pozo, asf, un instrumento con un rango dinamico de al menos 4 logs y un lfmite inferior de cuantificacion de 1 femtomolar es capaz de cuantificar con precision la concentracion de todas las muestras sin la necesidad de tratamiento adicional para ajustar la concentracion, por ejemplo, la dilucion. La precision se puede determinar por metodos estandar, por ejemplo, usando una serie de estandares de concentraciones que abarcan todo el rango dinamico y la construccion de una curva estandar. Las medidas estandar de ajuste de la curva estandar resultante se puede usar como una medida de precision, por ejemplo, un r2 mayor que aproximadamente 0.7, 0.75, 0.8, 0.85, 0.9, 0.91, 0.92, 0.93, 0.94, 0.95, 0.96, 0.97, 0.98, o 0.99.

El aumento de rango dinamico se logra mediante la alteracion de la forma en que se analizan los datos procedentes del detector, y/o mediante el uso de un atenuador entre el detector y el espacio de interrogacion. En el extremo inferior del rango, en donde la muestra en procesamiento es suficientemente diluida tal que cada evento de deteccion, i.e., cada rafaga de fotones por encima de un nivel de umbral en un intervalo (los "fotones de eventos"), probablemente representa solo una etiqueta, se analizan los datos para contar eventos de deteccion como moleculas unicas. Es decir, cada intervalo se analiza como un simple "sP' o "no" por la presencia de etiqueta, como se describio anteriormente. Para una muestra en procesamiento mas concentrada, donde la probabilidad de que dos o mas etiquetas que ocupan un solo intervalo llega a ser significativa, el numero de fotones de eventos en un numero significativo de intervalos se encuentra que es sustancialmente mayor que el numero esperado para una sola etiqueta, por ejemplo, el numero de fotones de eventos en un numero significativo de intervalos corresponde a dos veces, tres veces, o mas, que el numero de fotones de eventos esperados para una sola etiqueta. Para estas muestras, el instrumento cambia su metodo de analisis de datos a uno que integra el numero total de fotones de eventos para los intervalos de la muestra en procesamiento. Este total sera proporcional al numero total de etiquetas que estaba en todos los intervalos. Para una muestra en procesamiento aun mas concentrada, donde muchas

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etiquetas estan presentes en la mayona de los intervalos, el ruido de fondo se convierte en una porcion insignificante de la senal total de cada intervalo, y el instrumento cambia su metodo de analisis de datos a uno que cuenta los fotones totales por intervalo (incluyendo el fondo). Un aumento aun mas en el rango dinamico se puede lograr mediante el uso de un atenuador entre la celda de flujo y el detector, cuando las concentraciones son tales que la intensidad de luz que llega al detector de otra manera supera la capacidad del detector para contar los fotones con precision, i.e., saturan el detector.

El instrumento puede incluir un sistema de analisis de datos que recibe la entrada del detector y determina el metodo de analisis apropiado para la muestra que se esta realizando, y los valores de salidas basados en dicho analisis. El sistema de analisis de datos puede promover instrucciones de salida a usar o no usar un atenuador, si un atenuador esta incluido en el instrumento.

Utilizando dichos metodos, el rango dinamico del instrumento se puede aumentar claramente. Por lo tanto, en algunos casos, el instrumento es capaz de medir concentraciones de las muestras sobre un rango dinamico de mas de aproximadamente 1000 (3 log), 10,000 (4 log), 100,000 (5 log), 350,000 (5.5 log), 1,000,000 (6 log), 3,500,000 (6.5 log), 10,000,000 (7 log), 35,000,000 (7.5 log), o 100,000,000 (8 log). En algunos casos, el instrumento es capaz de medir concentraciones de las muestras sobre un rango dinamico de mas de aproximadamente 100,000 (5 log). En algunos casos, el instrumento es capaz de medir concentraciones de las muestras sobre un rango dinamico de mas de aproximadamente 1,000,000 (6 log). En algunos casos, el instrumento es capaz de medir concentraciones de las muestras sobre un rango dinamico de mas de aproximadamente 10,000,000 (7 log). En algunos casos, el instrumento es capaz de medir las concentraciones de las muestras en un rango dinamico desde aproximadamente 1-10 femtomolar hasta al menos aproximadamente 1000; 10,000; 100,000; 350,000; 1,000,000; 3,500,000; 10,000,000, o 35,000,000 femtomolar.. En algunos casos, el instrumento es capaz de medir las concentraciones de las muestras en un rango dinamico desde aproximadamente 1-10 femtomolar hasta al menos aproximadamente 10,000 femtomolar. En algunos casos, el instrumento es capaz de medir las concentraciones de las muestras en un rango dinamico desde aproximadamente 1-10 femtomolar hasta al menos aproximadamente 100,000 femtomolar. En algunos casos, el instrumento es capaz de medir las concentraciones de las muestras en un rango dinamico desde aproximadamente 1-10 femtomolar hasta al menos aproximadamente 1,000,000 femtomolar. En algunos casos, el instrumento es capaz de medir las concentraciones de las muestras en un rango dinamico desde aproximadamente 1-10 femtomolar hasta al menos aproximadamente 10,000,000.

En algunos casos, un sistema de analisis o analizador descrito en este documento es capaz de detectar un analito, por ejemplo, un biomarcador en un lfmite de deteccion de menos de 1 nanomolar o 1 picomolar, o 1 femtomolar, o 1 attomolar, o 1 zeptomolar. En algunos casos, el sistema de analisis o analizador es capaz de detectar un cambio en la concentracion del analito, o de multiples analitos, por ejemplo, un biomarcador o biomarcadores, de una muestra a otra muestra de menos de aproximadamente 0.1, 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, o 80% cuando el biomarcador esta presente a una concentracion de menos de 1 nanomolar o 1 picomolar, o 1 femtomolar, o 1 attomolar, o 1 zeptomolar, en las muestras, y cuando el tamano de cada una de las muestras es menos de aproximadamente 100, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 2, 1, 0.1, 0.01, 0.001, o 0.0001 ul. En algunos casos, el sistema de analisis o analizador es capaz de detectar un cambio en la concentracion del analito a partir de una primera muestra a una segunda muestra de menos de aproximadamente 20%, cuando el analito esta presente en una concentracion de menos de aproximadamente 1 picomolar, y cuando el tamano de cada una de las muestras es menos de aproximadamente 50 |iL. En algunos casos, el sistema de analisis o analizador es capaz de detectar un cambio en la concentracion del analito a partir de una primera muestra a una segunda muestra de menos de aproximadamente 20%, cuando el analito esta presente en una concentracion de menos de aproximadamente 100 femtomolar, y cuando el tamano de cada una de las muestras es menos de aproximadamente 50 |iL. En algunos casos, el sistema de analisis o analizador es capaz de detectar un cambio en la concentracion del analito a partir de una primera muestra a una segunda muestra de menos de aproximadamente 20%, cuando el analito esta presente en una concentracion de menos de aproximadamente 50 femtomolar, y cuando el tamano de cada una de las muestras es menos de aproximadamente 50 |iL. En algunos casos, el sistema de analisis o analizador es capaz de detectar un cambio en la concentracion del analito a partir de una primera muestra a una segunda muestra de menos de aproximadamente 20%, cuando el analito esta presente en una concentracion de menos de aproximadamente 5 femtomolar, y cuando el tamano de cada una de las muestras es menos de aproximadamente 50 |iL. En algunos casos, el sistema de analisis o analizador es capaz de detectar un cambio en la concentracion del analito a partir de una primera muestra a una segunda muestra de menos de aproximadamente 20%, cuando el analito esta presente en una concentracion de menos de aproximadamente 5 femtomolar, y cuando el tamano de cada una de las muestras es menos de aproximadamente 5 |iL. En algunos casos, el sistema de analisis o analizador es capaz de detectar un cambio en la concentracion del analito a partir de una primera muestra a una segunda muestra de menos de aproximadamente 20%, cuando el analito esta presente en una concentracion de menos de aproximadamente 1 femtomolar, y cuando el tamano de cada una de las muestras es menos de aproximadamente 5 |iL.

Los metodos de la invencion utilizan instrumentos analfticos de alta sensibilidad, por ejemplo, detectores de una unica molecula. Dichos detectores de una unica molecula incluyen ejemplos como se describen mas adelante.

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A. Aparato/Sistema

En un aspecto, los metodos descritos en este documento utilizan un sistema de analisis capaz de detectar una partfcula unica en una muestra. En un caso, el sistema de analisis es capaz de detectar una partfcula unica de una partfcula marcada con fluorescencia en donde el sistema de analisis detecta la energfa emitida por una etiqueta fluorescente excitada en respuesta a la exposicion por una fuente de radiacion electromagnetica cuando la partfcula unica esta presente en un espacio de interrogacion definido dentro de una celda de flujo capilar conectado de forma fluida al sistema de muestreo del sistema de analisis. En un caso adicional del sistema de analisis, la partfcula unica se mueve a traves del espacio de interrogacion de la celda de flujo capilar por medio de una fuerza motriz. En otro caso del sistema de analisis, un sistema de muestreo automatico puede ser incluido en el sistema de analisis para la introduccion de la muestra en el sistema de analisis. En otro caso del sistema de analisis, un sistema de preparacion de la muestra puede ser incluido en el sistema de analisis para la preparacion de una muestra. En un caso adicional, el sistema de analisis puede contener un sistema de recuperacion de la muestra para la recuperacion de al menos una porcion de la muestra despues de que el analisis se completa.

En un caso, el sistema de analisis consta de una fuente de radiacion electromagnetica para excitar una partfcula unica marcada con una etiqueta fluorescente. En un caso, la fuente de radiacion electromagnetica del sistema de analisis es un laser. En un caso adicional, la fuente de radiacion electromagnetica es un laser de onda continua.

En un caso tfpico, la fuente de radiacion electromagnetica excita una unidad estructural fluorescente unida a una etiqueta a medida que la etiqueta pasa a traves del espacio de interrogacion de la celda de flujo capilar. En algunos casos, la unidad estructural de etiqueta fluorescente incluye una o mas moleculas de colorante fluorescente. En algunos casos, la unidad estructural de etiqueta fluorescente es un punto cuantico. Cualquier unidad estructural fluorescente como se describe en este documento se puede utilizar en la etiqueta.

Una etiqueta se expone a la radiacion electromagnetica cuando la etiqueta pasa a traves de un espacio de interrogacion situado dentro de la celda de flujo capilar. El espacio de interrogacion esta conectado por lo general de manera fluida a un sistema de muestreo. En algunos casos, la etiqueta pasa a traves del espacio de interrogacion de la celda de flujo capilar debido a una fuerza motriz para avanzar la etiqueta a traves del sistema de analisis. El espacio de interrogacion se posiciona de tal manera que recibe la radiacion electromagnetica emitida desde la fuente de radiacion. En algunos casos, el sistema de muestreo es un sistema de muestreo automatizado capaz de muestrear una pluralidad de muestras sin la intervencion de un operador humano.

La etiqueta pasa a traves del espacio de interrogacion y emite una cantidad detectable de energfa cuando es excitado por la fuente de radiacion electromagnetica. En una realizacion, un detector de radiacion electromagnetica esta conectado operativamente al espacio de interrogacion. El detector de radiacion electromagnetica es capaz de detectar la energfa emitida por la etiqueta, por ejemplo, por la unidad estructural fluorescente de la etiqueta.

En un caso adicional del sistema de analisis, el sistema incluye ademas un mecanismo de preparacion de la muestra, donde una muestra se puede preparar parcial o completamente para el analisis por el sistema de analisis. En algunos casos del sistema de analisis, la muestra se desecha despues de que se analiza por el sistema. En otros casos, el sistema de analisis incluye ademas un mecanismo de recuperacion de la muestra mediante el cual al menos una parte, o, alternativamente, la totalidad o sustancialmente la totalidad, de la muestra se puede recuperar despues del analisis. En tal caso, la muestra se puede devolver al origen de la muestra. En algunos casos, la muestra puede ser devuelta a pozos de microtitulacion en una placa de microtitulacion de la muestra. Por lo general, el sistema de analisis ademas consiste en un sistema de adquisicion de datos para la recopilacion y notificacion de la senal detectada.

B. Analizador de partfculas unicas

Como se muestra en la figura 1A, se describe en este documento un ejemplo de un sistema 300 de analisis. El sistema 300 de analisis incluye una fuente 301 de radiacion electromagnetica, un espejo 302, una lente 303, una celda 313 de flujo capilar, una lente 305 de objetivo microscopico, una abertura 306, una lente 307 del detector, un filtro 308 del detector, un detector 309 de foton unico, y un procesador 310 conectado operativamente al detector.

En funcionamiento, la fuente 301 de radiacion electromagnetica esta alineada de manera que su salida 311 se refleja fuera de una superficie 312 frontal del espejo 302. La lente 303 enfoca el haz 311 en un solo espacio de interrogacion (un ejemplo ilustrativo de un espacio 314 de interrogacion se muestra en la figura 2A) en la celda 313 de flujo capilar. La lente 305 de objetivo del microscopio recoge la luz a partir de partfculas de la muestra y forma imagenes del haz sobre la abertura 306. La abertura 306 afecta la unidad estructural de luz emitida por la muestra en el espacio de interrogacion de la celda 313 de flujo capilar que se puede recoger. La lente 307 del detector recoge la luz que pasa a traves de la abertura 306 y enfoca la luz sobre un area activa del detector 309 despues de su paso por los filtros 308 del detector. Los filtros 308 del detector minimizan las senales de ruido aberrantes debido a la dispersion de la luz o la luz ambiental mientras maximiza la senal emitida por la unidad estructural fluorescente excitada unida a la partfcula. El procesador 310 procesa la senal de luz, procedente de la partfcula de acuerdo con los metodos descritos en este documento.

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En un caso, la lente 305 del objetivo del microscopio tiene una alta abertura numerica del objetivo del microscopio. Como se usa en este documento, "lente de alta abertura numerica" incluye una lente con una abertura numerica de igual o mayor que 0.6. La abertura numerica es una medida del numero de rayos de luz de formacion de imagenes altamente difractadas capturadas por el objetivo. Una abertura numerica mas alta permite que los rayos oblicuos cada vez mas entren en la lente del objetivo y por lo tanto producen una imagen mas altamente resuelto. Ademas, el brillo de una imagen aumenta con una abertura numerica superior. En el sistema de analisis, se puede utilizar lentes de alta abertura numerica estan disponibles comercialmente de una variedad de vendedores, y cualquier lente que tenga una abertura numerica igual o mayor que aproximadamente 0.6. En algunos casos, la lente tiene una abertura numerica de aproximadamente 0.6 a aproximadamente 1.3. En algunos casos, la lente tiene una abertura numerica

de aproximadamente: CD O a aproximadamente 1.0. En algunos casos , la lente tiene una abertura numerica de

aproximadamente: 0.7 a aproximadamente 1.2. En algunos casos, la lente tiene una abertura numerica de

aproximadamente: 0.7 a aproximadamente 1.0. En algunos casos, la lente tiene una abertura numerica de

aproximadamente: 0.7 a aproximadamente 0.9. En algunos casos, la lente tiene una abertura numerica de

aproximadamente: 0.8 a aproximadamente 1.3. En algunos casos, la lente tiene una abertura numerica de

aproximadamente: 0.8 a aproximadamente 1.2. En algunos casos, la lente tiene una abertura numerica de

aproximadamente 0.8 a aproximadamente 1.0. En algunos casos, la lente tiene una abertura numerica de al menos aproximadamente 0.6. En algunos casos, la lente tiene una abertura numerica de al menos aproximadamente 0.7. En algunos casos, la lente tiene una abertura numerica de al menos aproximadamente 0.8. En algunos casos, la lente tiene una abertura numerica de al menos aproximadamente 0.9. En algunos casos, la lente tiene una abertura numerica de al menos aproximadamente 1.0. En algunos casos, la abertura de la lente 305 de objetivo del microscopio es aproximadamente 1.25. En un caso, donde se utiliza una lente 305 de objetivo del microscopio de 0.8, se puede utilizar una lente Nikon 60X/0.8 NA Achromat (Nikon, Inc., USA)..

En algunos casos, la fuente 301 de radiacion electromagnetica es un laser que emite luz en el espectro visible. En todos los casos, la fuente de radiacion electromagnetica se ajusta de tal manera que la longitud de onda del laser se ajuste de manera que sea de una longitud de onda suficiente para excitar la etiqueta fluorescente unida a la partfcula. En algunos casos, el laser es un laser de onda continua con una longitud de onda de 639 nm. En otros casos, el laser es un laser de onda continua con una longitud de onda de 532 nm. En otros casos, el laser es un laser de onda continua con una longitud de onda de 422 nm. En otros casos, el laser es un laser de onda continua con una longitud de onda de 405 nm. Se puede utilizar cualquier laser de onda continua con una longitud de onda apropiada para excitar una unidad estructural fluorescente tal como se utiliza en los metodos y composiciones descritos en este documento.

En un sistema 300 de analisis de partfcula unica, ya que cada partmula pasa a traves del haz 311 de la fuente de radiacion electromagnetica, la parttcula entra en un estado excitado. Cuando la partfcula se relaja de su estado excitado, se emite una rafaga detectable de luz. El ciclo de excitacion-emision se repite muchas veces por cada partmula en la longitud de tiempo que toma para que pase a traves del haz permitiendo que el sistema 300 de analisis detecte decenas a miles de fotones para cada partmula a medida que pasan a traves de un espacio 314 de interrogacion. Los fotones emitidos por partmulas fluorescentes son registrados por el detector 309 (Figura 1A) con un retardo de tiempo indicativo del tiempo para que el complejo de etiqueta de partmulas pase a traves del espacio de interrogacion. La intensidad de fotones se registra por el detector 309 y el tiempo de muestreo se divide en intervalos, que son, segmentos de tiempo, arbitrarios, uniformes con anchos de canal de tiempo libremente seleccionables. El numero de senales contenidas en cada intervalo evaluado. Uno o una combinacion de varios metodos de analisis estadfsticos se emplean con el fin de determinar cuando una partfcula se encuentra presente. Tales metodos incluyen determinar el ruido de lmea de base del sistema de analisis y el ajuste de una intensidad de senal para la etiqueta fluorescente en un nivel estadfstico por encima del ruido de lmea de base para eliminar falsas senales positivas a partir del detector.

La fuente 301 de radiacion electromagnetica se enfoca sobre una celda 313 de flujo capilar del sistema 300 de analisis, donde la celda 313 de flujo capilar esta conectada de forma fluida al sistema de muestra. Un espacio 314 de interrogacion se muestra en la figura 2A. El haz 311 de la fuente 301 de radiacion electromagnetica de longitud continua de la figura 1A es opticamente enfocada a una profundidad especificada dentro de la celda 313 de flujo capilar. El haz 311 se dirige hacia la celda 313 de flujo capilar llena de muestra en un angulo perpendicular a la celda 313 de flujo capilar. El haz 311 se opera a una longitud de onda predeterminada que se selecciona para excitar una etiqueta fluorescente particular, utilizada para marcar la partmula de interes. El tamano o el volumen del espacio 314 de interrogacion se determina por el diametro del haz 311 junto con la profundidad a la que el haz 311 se centra. Alternativamente, el espacio de interrogacion se puede determinar mediante el analisis de una muestra de calibracion de concentracion conocida a traves del sistema de analisis.

Cuando se detectan moleculas unicas en la concentracion de la muestra, el tamano del haz y la profundidad de foco necesario para la deteccion de moleculas unicas se fija y de esta manera definen el tamano del espacio 314 de interrogacion. El espacio 314 de interrogacion esta configurado de tal manera que, con una concentracion de la muestra apropiada, solo una partmula se encuentra presente en el espacio 314 de interrogacion durante cada intervalo de tiempo durante el cual se hacen las observaciones en tiempo. Se apreciara que el volumen de interrogacion de deteccion tal como se define por el haz no es de forma perfectamente esferica, y por lo general tiene una forma de "pajarita". Sin embargo, para los fines de definicion, "volumenes" de espacios de interrogacion se

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definen en este documento como el volumen abarcado por una esfera de un diametro igual al diametro de punto enfocado del haz. El punto enfocado del haz 311. En algunos casos, el diametro del punto enfocado del haz es de aproximadamente 1 a aproximadamente 5, 10, 15, o 20 micras, o aproximadamente 5 a aproximadamente 10, 15, o 20 micras, o aproximadamente 10 a aproximadamente 20 micras, o aproximadamente 10 a aproximadamente 15 micras. En algunos casos, el diametro del punto enfocado del haz es de aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 , 19, o 20 micras. En algunos casos, el diametro del punto enfocado del haz es de aproximadamente 5 micras. En algunos casos, el diametro del punto enfocado del haz es de aproximadamente 10 micras. En algunos casos, el diametro del punto enfocado del haz es de aproximadamente 12 micras. En algunos casos, el diametro del punto enfocado del haz es de aproximadamente 13 micras. En algunos casos, el diametro del punto enfocado del haz es de aproximadamente 14 micras. En algunos casos, el diametro del punto enfocado del haz es de aproximadamente 15 micras. En algunos casos, el diametro del punto enfocado del haz es de aproximadamente 16 micras. En algunos casos, el diametro del punto enfocado del haz es de aproximadamente 17 micras. En algunos casos, el diametro del punto enfocado del haz es de aproximadamente 18 micras. En algunos casos, el diametro del punto enfocado del haz es de aproximadamente 19 micras. En algunos casos, el diametro del punto enfocado del haz es aproximadamente 20 micras.

En una instancia alternativa del sistema de analisis de partfcula unica, puede usarse mas de una fuente de radiacion electromagnetica para excitar las partfculas marcadas con marcadores fluorescentes de diferentes longitudes de onda. En otro caso alternativo, se puede utilizar mas de un espacio de interrogacion en la celda de flujo capilar. En otro caso alternativo, se pueden emplear multiples detectores para detectar longitudes de onda de emision diferentes de las etiquetas fluorescentes. Una ilustracion que incorpora cada uno de estos casos alternativos de un sistema de analisis se muestra en la figura 1B. Estos ejemplos se muestran en la anterior Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 11/048,660, publicada como US2006/078998 A1.

En algunos casos del sistema 300 de analisis, se requiere una fuerza motriz para mover una partfcula a traves de la celda 313 de flujo capilar del sistema 300 de analisis. En un caso, la fuerza motriz puede ser una forma de presion. La presion usada para mover una partfcula a traves de la celda de flujo capilar puede ser generada por una bomba. En algunas realizaciones, se puede utilizar una bomba de HPLC Scivex, Inc. En algunos casos donde se utiliza una bomba como una fuerza motriz, la muestra puede pasar a traves de la celda de flujo capilar a una velocidad de 1 |iL/min a aproximadamente 20 |iL/min, o aproximadamente 5 |iL/min a aproximadamente 20 |iL/min. En algunos casos, la muestra puede pasar a traves de la celda de flujo capilar a una velocidad de aproximadamente 5 |iL/min. En algunos casos, la muestra puede pasar a traves de la celda de flujo capilar a una velocidad de aproximadamente 10 |iL/min. En algunos casos, la muestra puede pasar a traves de la celda de flujo capilar a una velocidad de aproximadamente 15 |iL/min. En algunos casos, la muestra puede pasar a traves de la celda de flujo capilar a una velocidad de aproximadamente 20 |iL/min. En algunos casos, se puede utilizar una fuerza electrocinetica para mover la partfcula a traves del sistema de analisis. Este metodo ha sido descrito previamente en la anterior Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 11/048,660, publicada como US2006/078998 A1.

En un caso del sistema 300 de analisis, el detector 309 del sistema de analisis detecta los fotones emitidos por la etiqueta fluorescente. En un caso, el detector de fotones es un fotodiodo. En un caso adicional, el detector es un detector de fotodiodo en avalancha. En algunos casos, los fotodiodos pueden ser fotodiodos de silicio con una longitud de onda de deteccion de 190 nm y 1100 nm. Cuando se utilizan fotodiodos de germanio, la longitud de onda de la luz detectada es entre 400 nm a 1700 nm. En otros casos, cuando se utiliza un fotodiodo de arseniuro de indio y galio, la longitud de onda de la luz detectada por el fotodiodo es entre 800 nm y 2600 nm. Cuando se utilizan como detectores fotodiodos de sulfuro de plomo, la longitud de onda de la luz detectada es entre 1000 nm y 3500 nm.

En algunos casos, la optica de la fuente 301 de radiacion electromagnetica y la optica del detector 309 estan dispuestas en una configuracion optica convencional. En tal configuracion, la fuente de radiacion electromagnetica y el detector estan alineados en diferentes planos focales. La configuracion del laser y la optica del detector del sistema de analisis como se muestra en las Figuras 1A y 1B es la de una configuracion optica convencional.

En algunos casos, la optica de la fuente de radiacion electromagnetica y la optica del detector estan dispuestas en una configuracion optica confocal. En tal configuracion, la fuente 301 de radiacion electromagnetica y el detector 309 estan alineadas en el mismo plano focal. La configuracion confocal hace el analizador mas robusto debido a que la fuente 301 de radiacion electromagnetica y la optica del detector 309 no necesitanan ser realineadas si el sistema de analisis se mueve. Esta configuracion tambien hace el uso del analizador mas simplificado, ya que elimina la necesidad de volver a alinear los componentes del sistema de analisis. La configuracion confocal para el analizador 300 (Figura 1A) y el analizador 355 (Figura 1B) se muestran en las Figuras 3A y 3B respectivamente. La figura 3A muestra que el haz 311 a partir de una fuente 301 de radiacion electromagnetica se enfoca por el objetivo 315 del microscopio, para formar un espacio 314 de interrogacion (Figura 2A) dentro de la celda 313 de flujo capilar. Para separar la luz fluorescente de la luz laser, se utiliza un espejo 316 dicroico, que refleja la luz laser, pero deja pasar la luz fluorescente. El filtro 317 que se coloca en frente del detector elimina cualquier luz no fluorescente en el detector. En algunos casos, un sistema de analisis configurado en una configuracion confocal puede comprender dos o mas espacios de interrogacion. Dicho metodo se ha revelado previamente en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 11/048,660, publicada como US2006/078998 A1.

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El laser puede ser un laser de colorante sintonizable, tal como un laser de helio-neon. El laser se puede configurar para emitir una longitud de onda de 632.8 nm. Alternativamente, la longitud de onda del laser se puede configurar para emitir una longitud de onda de 543.5 nm o 1523 nm. Alternativamente, el laser electromagnetico puede ser un laser de iones de argon. En tal caso, el laser de iones de argon puede ser operado como un laser de gas continuo en aproximadamente 25 diferentes longitudes de onda en el espectro visible, la longitud de onda ajustada entre 408.9 y 686.1 nm, pero en su ajuste de rendimiento optimo entre 488 y 514.5 nm.

1 Fuente de radiacion electromagnetica

En algunos casos, se puede utilizar el sistema de analisis de una etiqueta quimioluminiscente. En tal caso, puede que no sea necesario utilizar una fuente de EM para la deteccion de la partfcula. En otro caso, la etiqueta extrmseca o caractenstica intrmseca de la partfcula es una caractenstica o etiqueta que interactua con la luz, tal como una etiqueta fluorescente o una etiqueta de dispersion de luz. En tal caso, una fuente de radiacion EM se utiliza para iluminar la etiqueta y/o la partfcula. Se prefieren las fuentes de radiacion EM para la excitacion de las etiquetas fluorescentes.

En algunos casos, el sistema de analisis consta de una fuente 301 de radiacion electromagnetica. Cualquier numero de fuentes de radiacion se puede usar en cualquier sistema 300 de analisis. Multiples fuentes de radiacion electromagnetica se han descrito previamente en la anterior Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 11/048,660, publicada como US2006/0078998 A1. En algunos casos, todas las fuentes de radiacion continua de onda electromagnetica (EM) emiten radiacion electromagnetica a las mismas longitudes de onda. En otros casos, diferentes fuentes emiten diferentes longitudes de onda de radiacion EM.

En un caso, la(s) fuente(s) de EM 301, 351, 352 son laseres de onda continua que producen longitudes de onda de entre 200 nm y 1000 nm. Tales fuentes EM tienen la ventaja de ser pequenas, duraderas y relativamente economicas. Ademas, por lo general tienen la capacidad de generar senales fluorescentes mas grandes que otras fuentes de luz. Ejemplos espedficos de fuentes EM de onda continua apropiadas incluyen, pero no se limitan a: los laseres de los tipos de argon, cripton, helio-neon, helio-cadmio, asf como, los laseres de diodo sintonizables (regiones de rojo a infrarrojos), cada uno con la posibilidad de duplicacion de frecuencia. Los laseres proporcionan iluminacion continua con ningun accesorio electronico o dispositivo mecanico, tales como obturadores, para interrumpir su iluminacion. En un caso donde se utiliza un laser de onda continua, una fuente de radiacion electromagnetica de 3 mW puede ser de energfa suficiente para excitar una etiqueta fluorescente. Un haz de un laser de onda continua de dicha salida de energfa puede tener entre 2 a 5 |im de diametro. El tiempo de exposicion de la partfcula al haz de laser con el fin de ser expuesto a 3mW puede ser un penodo de tiempo de aproximadamente 1 mseg. En casos alternativos, el tiempo de exposicion al haz de laser puede ser igual a o menos de aproximadamente 500 |iseg. En un caso alternativo, el tiempo de exposicion puede ser igual o menos de aproximadamente 100 |iseg. En un caso alternativo, el tiempo de exposicion puede ser igual o menos de aproximadamente 50 |iseg. En un caso alternativo, el tiempo de exposicion puede ser igual o menos de aproximadamente 10 |iseg.

Los LED son otra fuente de iluminacion de alta fiabilidad, de bajo coste. Los recientes avances en LED ultra- brillantes y colorantes de seccion transversal de alta absorcion y rendimiento cuantico apoyan la aplicabilidad de los LED a la deteccion de una partfcula unica. Tales laseres se pueden utilizar solos o en combinacion con otras fuentes de luz tales como lamparas de arco de mercurio, lamparas de arco elementales, lamparas halogenas, descargas de arco, descargas de plasma, diodos emisores de luz, o combinacion de estos.

En otros casos, la fuente de EM podna ser en la forma de un laser de onda de pulso. En tal caso, el tamano del pulso del laser es un factor importante. En tal caso, el tamano, el punto de enfoque, y la energfa total emitida por el laser es importante y debe ser de suficiente energfa como para ser capaz de excitar la etiqueta fluorescente. Cuando se utiliza un laser de pulso, puede ser necesario un pulso de duracion mas larga. En algunos casos se puede usar un pulso de laser de 2 nanosegundos. En algunos casos se puede usar un pulso de laser de 5 nanosegundos. En algunos casos se puede utilizar un pulso entre 2 y 5 nanosegundos.

La intensidad del laser optima depende de las caractensticas fotoblanqueo de los colorantes individuales y la longitud de tiempo requerido para atravesar el espacio de interrogacion (incluyendo la velocidad de la partfcula, la distancia entre espacios de interrogacion si hay mas de uno se utiliza y el tamano de el o los espacios de interrogacion). Para obtener una senal maxima, es deseable iluminar la muestra a la intensidad mas alta que no resultara en el fotoblanqueo de un alto porcentaje de los colorantes. La intensidad preferida es una tal, que no mas del 5% de los colorantes se blanqueen en el momento en el que la partfcula ha atravesado el espacio de interrogacion.

La potencia del laser se ajusta en funcion del tipo de moleculas de colorante que necesitan ser estimuladas y la longitud de tiempo que las moleculas de colorante se estimulan, y/o la velocidad con la que las moleculas de colorante pasan a traves de la celda de flujo capilar. La potencia del laser se define como la velocidad a la cual la energfa es entregada por el haz y se mide en unidades de Julios/segundo, o Watts. Se apreciara que cuanto mayor es la potencia de salida del laser, menor puede ser el tiempo que el laser ilumina la partfcula, mientras que provee

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una cantidad constante de energfa para el espacio de interrogacion, mientras que la partfcula pasa a traves del espacio. Por lo tanto, en algunos casos, la combinacion de potencia y el tiempo de iluminacion laser es tal que la energfa total recibida por el espacio de interrogacion durante el tiempo de iluminacion es mas de aproximadamente 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, o 100 microjulios. En algunos casos, la combinacion de potencia del laser y tiempo de iluminacion es tal que la energfa total recibida por el espacio de interrogacion durante el tiempo de iluminacion es menos de aproximadamente 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, o 110 microjulios. En algunos casos, la combinacion de potencia del laser y tiempo de iluminacion es tal que la energfa total recibida por el espacio de interrogacion durante el tiempo de iluminacion es entre aproximadamente 0.1 y 100 microjulios. En algunos casos, la combinacion de potencia del laser y tiempo de iluminacion es tal que la energfa total recibida por el espacio de interrogacion durante el tiempo de iluminacion es entre aproximadamente 1 y 100 microjulios. En algunos casos, la combinacion de potencia del laser y tiempo de iluminacion es tal que la energfa total recibida por el espacio de interrogacion durante el tiempo de iluminacion es entre aproximadamente 1 y 50 microjulios. En algunos casos, la combinacion de potencia del laser y tiempo de iluminacion es tal que la energfa total recibida por el espacio de interrogacion durante el tiempo de iluminacion es entre aproximadamente 2 y 50 microjulios. En algunos casos, la combinacion de potencia del laser y tiempo de iluminacion es tal que la energfa total recibida por el espacio de interrogacion durante el tiempo de iluminacion es entre aproximadamente 3 y 60 microjulios. En algunos casos, la combinacion de potencia del laser y tiempo de iluminacion es tal que la energfa total recibida por el espacio de interrogacion durante el tiempo de iluminacion es entre aproximadamente 3 y 50 microjulios. En algunos casos, la combinacion de potencia del laser y tiempo de iluminacion es tal que la energfa total recibida por el espacio de interrogacion durante el tiempo de iluminacion es entre aproximadamente 3 y 40 microjulios. En algunos casos, la combinacion de potencia del laser y tiempo de iluminacion es tal que la energfa total recibida por el espacio de interrogacion durante el tiempo de iluminacion es entre aproximadamente 3 y 30 microjulios. En algunos casos, la combinacion de potencia del laser y tiempo de iluminacion es tal que la energfa total recibida por el espacio de interrogacion durante el tiempo de iluminacion es aproximadamente 1 microjulios. En algunos casos, la combinacion de potencia del laser y tiempo de iluminacion es tal que la energfa total recibida por el espacio de interrogacion durante el tiempo de iluminacion es aproximadamente 3 microjulios. En algunos casos, la combinacion de potencia del laser y tiempo de iluminacion es tal que la energfa total recibida por el espacio de interrogacion durante el tiempo de iluminacion es aproximadamente 5 microjulios. En algunos casos, la combinacion de potencia del laser y tiempo de iluminacion es tal que la energfa total recibida por el espacio de interrogacion durante el tiempo de iluminacion es aproximadamente 10 microjulios. En algunos casos, la combinacion de potencia del laser y tiempo de iluminacion es tal que la energfa total recibida por el espacio de interrogacion durante el tiempo de iluminacion es aproximadamente 15 microjulios. En algunos casos, la combinacion de potencia del laser y tiempo de iluminacion es tal que la energfa total recibida por el espacio de interrogacion durante el tiempo de iluminacion es aproximadamente 20 microjulios. En algunos casos, la combinacion de potencia del laser y tiempo de iluminacion es tal que la energfa total recibida por el espacio de interrogacion durante el tiempo de iluminacion es aproximadamente 30 microjulios. En algunos casos, la

combinacion de potencia del laser y tiempo de iluminacion es tal que la energfa total recibida por el espacio de interrogacion durante el tiempo de iluminacion es aproximadamente 40 microjulios. En algunos casos, la

combinacion de potencia del laser y tiempo de iluminacion es tal que la energfa total recibida por el espacio de interrogacion durante el tiempo de iluminacion es aproximadamente 50 microjulios. En algunos casos, la

combinacion de potencia del laser y tiempo de iluminacion es tal que la energfa total recibida por el espacio de interrogacion durante el tiempo de iluminacion es aproximadamente 60 microjulios. En algunos casos, la

combinacion de potencia del laser y tiempo de iluminacion es tal que la energfa total recibida por el espacio de interrogacion durante el tiempo de iluminacion es aproximadamente 70 microjulios. En algunos casos, la

combinacion de potencia del laser y tiempo de iluminacion es tal que la energfa total recibida por el espacio de interrogacion durante el tiempo de iluminacion es aproximadamente 80 microjulios. En algunos casos, la

combinacion de potencia del laser y tiempo de iluminacion es tal que la energfa total recibida por el espacio de interrogacion durante el tiempo de iluminacion es aproximadamente 90 microjulios. En algunos casos, la

combinacion de potencia del laser y tiempo de iluminacion es tal que la energfa total recibida por el espacio de interrogacion durante el tiempo de iluminacion es aproximadamente 100 microjulios.

En algunos casos, la salida de potencia del laser se establece en al menos aproximadamente 1 mW, 2 mW, 3mW, 4mW, 5 mW, 6, mW, 7 mW, 8 mW, 9 mW, 10 mW, 13 mW, 15 mW, 20 mW, 25 mW, 30 mW, 40 mW, 50 mW, 60 mW, 70 mW, 80 mW, 90 mW, 100 mW, o mas de 100 mW. En algunos casos, la salida de potencia del laser se establece en al menos aproximadamente 1 mW. En algunos casos, la salida de potencia del laser se establece en al menos aproximadamente 3 mW. En algunos casos, la salida de potencia del laser se establece en al menos

aproximadamente: 5 mW. En algunos casos, la salida de potencia del laser se establece en al menos

aproximadamente: 10 mW. En algunos casos, la salida de potencia del laser se establece en al menos

aproximadamente: 20 mW. En algunos casos, la salida de potencia del laser se establece en al menos

aproximadamente: 30 mW. En algunos casos, la salida de potencia del laser se establece en al menos

aproximadamente: 40 mW. En algunos casos, la salida de potencia del laser se establece en al menos

aproximadamente: 50 mW. En algunos casos, la salida de potencia del laser se establece en al menos

aproximadamente 60 mW. aproximadamente 90 mW.: En algunos casos, la salida de potencia del laser se establece en al menos

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El tiempo que el laser ilumina el espacio de interrogacion se puede establecer en no menos de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 150, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, o 1000 microsegundos. El tiempo que el laser ilumina el espacio de interrogacion se puede establecer en no mas de aproximadamente 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 150, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, o 2000 microsegundos. El tiempo que el laser ilumina el espacio de interrogacion se puede ajustar entre aproximadamente 1 y 1000 microsegundos. El tiempo que el laser ilumina el espacio de interrogacion se puede ajustar entre 5 y 500 microsegundos. El tiempo que el laser ilumina el espacio de interrogacion se puede ajustar entre aproximadamente 5 y 100 microsegundos. El tiempo que el laser ilumina el espacio de interrogacion se puede ajustar entre aproximadamente 10 y 100 microsegundos. El tiempo que el laser ilumina el espacio de interrogacion se puede ajustar entre aproximadamente 10 y 50 microsegundos. El tiempo que el laser ilumina el espacio de interrogacion se puede ajustar entre aproximadamente 10 y 20 microsegundos. El tiempo que el laser ilumina el espacio de interrogacion se puede ajustar entre 5 y 50 microsegundos. El tiempo que el laser ilumina el espacio de interrogacion se puede ajustar entre aproximadamente 1 y 100 microsegundos. En algunos casos, el tiempo que el laser ilumina el espacio de interrogacion es de aproximadamente 1 microsegundo. En algunos casos, el tiempo que el laser ilumina el espacio de interrogacion es de aproximadamente 5

microsegundos. En algunos casos, el tiempo que el laser ilumina el espacio de interrogacion es de unos 10

microsegundos. En algunos casos, el tiempo que el laser ilumina el espacio de interrogacion es de unos 25

microsegundos. En algunos casos, el tiempo que el laser ilumina el espacio de interrogacion es de unos 50

microsegundos. En algunos casos, el tiempo que el laser ilumina el espacio de interrogacion es de aproximadamente 100 microsegundos. En algunos casos, el tiempo que el laser ilumina el espacio de interrogacion es de aproximadamente 250 microsegundos. En algunos casos, el tiempo que el laser ilumina el espacio de interrogacion es de aproximadamente 500 microsegundos. En algunos casos, el tiempo que el laser ilumina el espacio de interrogacion es de aproximadamente 1000 microsegundos.

Por ejemplo, el tiempo que el laser ilumina el espacio de interrogacion se puede ajustar a 1 milisegundo, 250 microsegundos, 100 microsegundos, 50 microsegundos, 25 microsegundos o 10 microsegundos con un laser que provee una potencia de salida de 3 mW, 4 mW, 5 mW, o mas de 5 mW. En algunos casos, una etiqueta se ilumina con un laser que provee una potencia de salida de 3 mW e ilumina la etiqueta durante unos 1000 microsegundos. En otros casos, una etiqueta es iluminada por menos de 1000 milisegundos con un laser que provee una potencia de salida de no mas de aproximadamente 20 mW. En otros casos, la etiqueta se ilumina con una salida de potencia del laser de 20 mW por menos de o igual a aproximadamente 250 microsegundos. En algunos casos, la etiqueta se ilumina con una potencia de salida del laser de aproximadamente 5 mW por menos de o igual a aproximadamente 1.000 microsegundos.

2. Celda de flujo capilar

La celda de flujo capilar esta conectada de forma fluida al sistema de muestra. En un caso, el espacio 314 de interrogacion de un sistema de analisis, se determina por el area de la seccion transversal del haz 311 correspondiente y por un segmento del haz dentro del campo de vision del detector 309. En un caso del sistema de analisis, el espacio 314 de interrogacion tiene un volumen, como se define en este documento, entre aproximadamente 0.01 y 500 pL, o entre aproximadamente 0.01 pL y 100 pL, o entre aproximadamente 0.01 pL y 10 pL, o entre aproximadamente 0.01 pL y 1 pL, o entre aproximadamente 0.01 pL y 0.5 pL, o entre aproximadamente 0.02 pL y aproximadamente 300 pL, o entre aproximadamente 0.02 pL y aproximadamente 50 pL o entre aproximadamente 0.02 PL y aproximadamente 5 pL o entre aproximadamente 0.02 pL y aproximadamente 0.5 pL o entre aproximadamente 0.02 pL y aproximadamente 2 pL, o entre aproximadamente 0.05 pL y aproximadamente 50 pL, o entre aproximadamente 0.05 pL y aproximadamente 5 pL, o entre aproximadamente 0.05 pL y aproximadamente 0.5 pL, o entre aproximadamente 0.05 pL y aproximadamente 0.2 pL, o entre aproximadamente 0.1 pL y aproximadamente 25 pL. En algunos casos, el espacio de interrogacion tiene un volumen entre aproximadamente 0.01 pL y 10 pL. En algunos casos, el espacio 314 de interrogacion tiene un volumen entre aproximadamente 0.01 pL y 1 pL. En algunos casos, el espacio 314 de interrogacion tiene un volumen entre aproximadamente 0.02 pL y aproximadamente 5 pL. En algunos casos, el espacio 314 de interrogacion tiene un volumen entre aproximadamente 0.02 pL y aproximadamente 0.5 pL. En algunos casos, el espacio 314 de interrogacion tiene un volumen entre aproximadamente 0.05 pL y aproximadamente 0.2 pL. Otros volumenes de espacio util de interrogacion son como se describen en este documento. Se debe entender por un experto en el arte que el espacio 314 de interrogacion se puede seleccionar para un maximo rendimiento del analizador. Aunque se han mostrado muy pequenos espacios de interrogacion para minimizar el ruido de fondo, los grandes espacios de interrogacion tienen la ventaja de que las muestras de baja concentracion se pueden analizar en un plazo de tiempo razonable. En casos en los que se utilizan dos espacios de interrogacion 370 y 371, se pueden utilizar volumenes tales como los descritos en este documento para un unico espacio 314 de interrogacion.

En un caso, los espacios de interrogacion son lo suficientemente grandes para permitir la deteccion de partfculas en concentraciones que vanan de aproximadamente 1000 femtomolar (fM) a aproximadamente 1 zeptomolar (zM). En un caso, los espacios de interrogacion son lo suficientemente grandes para permitir la deteccion de partfculas en concentraciones que van desde aproximadamente 1000 fM a aproximadamente 1 attomolar (aM). En un caso, los espacios de interrogacion son lo suficientemente grandes para permitir la deteccion de partfculas en concentraciones que van desde aproximadamente 10 fM a aproximadamente 1 attomolar (aM). En muchos casos,

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los grandes espacios de interrogacion permiten la deteccion de partfculas en concentraciones de menos de aproximadamente 1 fM sin dispositivos o tecnicas de pre-concentracion adicional. Un experto en el arte reconocera que el tamano del espacio de interrogacion mas apropiado depende de la luminosidad de las partfculas para ser detectado, el nivel de senal de fondo, y la concentracion de la muestra que se va a analizar.

El tamano del espacio 314 de interrogacion puede ser limitado por el ajuste de la optica del analizador. En un caso, el diametro del haz 311 se puede ajustar para variar el volumen del espacio 314 de interrogacion. En otro caso, el campo de vision del detector 309 se puede variar. Por lo tanto, la fuente 301 y el detector 309 se pueden ajustar de manera que las partfculas unicas se iluminaran y se detectan dentro del espacio 314 de interrogacion. En otro caso, la anchura de la abertura 306 (Figura 1A) que determina el campo de vision del detector 309, es variable. Esta configuracion permite alterar el espacio de interrogacion, en tiempo casi real, para compensar las muestras mas o menos concentradas, lo que garantiza una baja probabilidad de que dos o mas partfculas esten a la vez dentro de un espacio de interrogacion. Se pueden realizar alteraciones similares para dos o mas espacios 370 y 371 de interrogacion.

En otro caso, el espacio de interrogacion se puede definir mediante el uso de una muestra de calibracion de concentracion conocida que se pasa a traves de la celda de flujo capilar antes de que la muestra real sea analizada. Cuando se detecta solo una partfcula unica a la vez en la muestra de calibracion como la muestra se pasa a traves de la celda de flujo capilar, la profundidad de foco junto con el diametro del haz de la fuente de radiacion electromagnetica determina el tamano del espacio de interrogacion en la celda de flujo capilar.

Las limitaciones ffsicas a los espacios de interrogacion tambien se pueden proporcionar por una pared solida. En un caso, la pared es una o mas de las paredes de una celda 313 de flujo (Figura 2A), cuando el lfquido de muestra esta contenida dentro de un capilar. En un caso, la celda esta hecha de vidrio, pero se pueden utilizar otras sustancias transparentes a la luz en el rango de aproximadamente 200 a aproximadamente 1,000 nm o superior, tal como cuarzo, sflice fundida, y materiales organicos tales como teflon, nylon, plasticos, tales como cloruro de polivinilo, poliestireno y polietileno, o cualquier combinacion de los mismos. Aunque otras formas de seccion transversal (por ejemplo, rectangular, cilmdrica) se pueden usar, en un caso la celda 313 de flujo capilar tiene una seccion transversal cuadrada. En otro ejemplo, el espacio de interrogacion puede ser definida al menos en parte por un canal (no mostrado) grabado en un chip (no mostrado). Consideraciones similares se aplican a los casos en los que se utilizan dos espacios de interrogacion (370 y 371 en la Fig. 2B).

El espacio de interrogacion esta banado en un lfquido. En un caso, el lfquido es acuoso. En otros casos, el lfquido es no acuoso o una combinacion de lfquidos acuosos y no acuosos. Ademas el lfquido puede contener agentes para ajustar el pH, composicion ionica, o agentes de tamizado, tales como macropartfculas solubles o polfmeros o geles. Se contempla que las valvulas u otros dispositivos pueden estar presentes entre los espacios de interrogacion para interrumpir temporalmente la conexion del lfquido. Los espacios de interrogacion interrumpidos temporalmente se considera que estan conectados por lfquido.

En otro caso de la invencion, un espacio de interrogacion es el espacio de interrogacion solo presente dentro de la celda 313 de flujo que esta limitada por el tamano de un flujo laminar del material de muestra dentro de un volumen de diluyente, tambien llamado flujo de cubierta. En estos y otros ejemplos, el espacio de interrogacion puede ser definido por el flujo de cubierta solo o en combinacion con las dimensiones de la fuente de iluminacion o el campo de vision del detector. El flujo de cubierta se puede configurar de muchas maneras, incluyendo: El material de la muestra es el material interior en un flujo laminar concentrico, con el volumen del diluyente en el exterior; el volumen del diluyente esta en un lado del volumen de muestra; el volumen de diluyente esta en dos lados del material de la muestra; el volumen de diluyente esta en varios lados del material de muestra, pero no encierra completamente el material de muestra; el volumen de diluyente rodea completamente el material de muestra; el volumen de diluyente rodea completamente el material de muestra concentricamente; el material de muestra es el material interior en una serie discontinua de gotas y el volumen diluyente rodea completamente cada gota de material de la muestra.

En algunos casos, los detectores de una unica molecula de la invencion comprenden no mas de un espacio de interrogacion. En algunos casos, se utilizan multiples espacios de interrogacion. Multiples espacios de interrogacion se han descrito previamente en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 11/048,660, publicada como US2006/0078998 A1. Un experto en el arte reconocera que en algunos casos el analizador contendra 2, 3, 4, 5, 6 o mas espacios de interrogacion distintos.

3. Fuerza motriz

En un caso del sistema de analisis, las partfculas se mueven a traves del espacio de interrogacion por una fuerza motriz. En algunos casos, la fuerza motriz para las partfculas en movimiento es la presion. En algunos casos, la presion es suministrada por una bomba, y la fuente de presion de aire, una fuente de vacfo, una centnfuga, o una combinacion de los mismos. En algunos casos, la fuerza motriz para las partfculas en movimiento es una fuerza electrocinetica. El uso de una fuerza electrocinetica como una fuerza motriz ha sido revelado previamente en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 11/048,660, publicada como US2006/0078998 A1.

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En un caso, la presion se puede utilizar como una fuerza motriz para mover las pardculas a traves del espacio de interrogacion de la celda de flujo capilar. En un caso adicional, la presion se suministra para mover la muestra por medio de una bomba. Bombas apropiadas son conocidas en la tecnica. En un caso, las bombas fabricadas para aplicaciones de HPLC, como las fabricadas por Scivax, Inc., se pueden utilizar como fuerza motriz. En otros casos, las bombas fabricadas para aplicaciones de microfluidos se pueden utilizar cuando se bombean volumenes mas pequenos de muestra. Tales bombas se describen en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,094,594,5,730,187,6,033,628, y 6,533,553, que revelan los dispositivos que pueden bombear volumenes de lfquido en el rango de nanolitros o picolitros. Preferiblemente todos los materiales dentro de la bomba que entran en contacto con la muestra estan hechos de materiales altamente inertes, por ejemplo, polieteretercetona (PEEK), sflice fundida, o zafiro.

Una fuerza motriz es necesaria para mover la muestra a traves de la celda de flujo capilar para empujar la muestra a traves del espacio de interrogacion para el analisis. Tambien se requiere una fuerza motriz para empujar una muestra de lavado a traves de la celda de flujo capilar despues de que la muestra se ha pasado a traves. Tambien se requiere una fuerza motriz para empujar la muestra de vuelta a cabo en un recipiente de recuperacion de la muestra, cuando se emplea la recuperacion de la muestra. Las bombas estandar vienen en una variedad de tamanos, y el tamano apropiado se puede elegir para adaptarse a los requisitos esperados de tamano de la muestra y el flujo. En algunos casos, se utilizan bombas separadas para el analisis de la muestra y para el lavado del sistema. La bomba de analisis puede tener una capacidad de aproximadamente 0.000001 mL a aproximadamente 10 mL, o aproximadamente 0.001 mL a aproximadamente 1 mL, o aproximadamente 0.01 mL a aproximadamente 0.2 mL, o aproximadamente 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, o 0.5 mL. Las bombas de lavado pueden ser de mayor capacidad que las bombas de analisis. Las bombas de lavado pueden tener un volumen de aproximadamente 0.01 mL a aproximadamente 20 mL, o aproximadamente 0.1 mL a aproximadamente 10 mL, o aproximadamente 0.1 mL a aproximadamente 2 mL, o aproximadamente o aproximadamente 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, o 10 mL. Estos tamanos de bomba son solo ilustrativos, y los expertos en el arte apreciaran que el tamano de la bomba puede ser elegido de acuerdo con la aplicacion, tamano de la muestra, la viscosidad de lfquido que se va a bombear, las dimensiones de tubos, velocidad de flujo, temperatura y otros factores bien conocidos en la tecnica. En algunos casos, las bombas del sistema son impulsados por motores paso a paso, que son faciles de controlar con mucha precision con un microprocesador.

En los casos preferidos, las bombas de lavado y analisis se utilizan en serie, con valvulas de retencion especiales para controlar la direccion del flujo. La tubena esta disenada de modo que cuando la bomba de analisis extrae la muestra maxima, la muestra no alcanza la propia bomba. Esto se logra mediante la eleccion del ID y la longitud de la tubena entre la bomba de analisis y el capilar de analisis tal que el volumen del tubo sea mayor que el volumen de eyeccion de la bomba de analisis.

4. Detectores

En un caso, se detecta la luz (por ejemplo, la luz en el rango ultravioleta, visible o infrarrojo) emitida por una etiqueta fluorescente despues de la exposicion a la radiacion electromagnetica. El detector 309 (Figura 1A), o detectores (364, 365, Figura 1B), es capaz de capturar la amplitud y duracion de las rafagas de fotones a partir de un complejo de unidad estructural-etiqueta fluorescente, y convertir adicionalmente la amplitud y la duracion de la rafaga de fotones a senales electricas. Los dispositivos de deteccion, tales como camaras CCD, camaras del modulo de entrada de video y camaras Streak se pueden utilizar para producir imagenes con senales contiguas. En otro caso, se pueden utilizar dispositivos tales como un bolometro, un fotodiodo, una matriz de fotodiodos, fotodiodos en avalancha, y fotomultiplicadores que producen senales secuenciales. Tambien se puede utilizar cualquier combinacion de los detectores anteriormente mencionados. En un caso, se utilizan fotodiodos en avalancha para la deteccion de fotones.

Utilizando la optica espedfica entre un espacio 314 de interrogacion (Figura 2A) y su correspondiente detector 309 (Figura 1A), pueden ser detectadas varias caractensticas distintivas de la radiacion electromagnetica emitida incluyendo: longitud de onda de emision, intensidad de emision, tamano de rafaga, duracion de la rafaga, y la polarizacion de fluorescencia. En algunos casos, el detector 309 es un fotodiodo que se utiliza en polarizacion inversa. Un fotodiodo situado en polarizacion inversa por lo general tiene una resistencia muy alta. Esta resistencia se reduce cuando la luz de una frecuencia apropiada brilla en la union P/N. Por lo tanto, un diodo polarizado en sentido inverso se puede utilizar como un detector mediante el control de la ejecucion actual a traves de este. Los circuitos basados en este efecto son mas sensibles a la luz que los basados en el sesgo cero.

En un caso del sistema de analisis, el fotodiodo puede ser un fotodiodo en avalancha, que puede ser operado con mucho mayor polarizacion inversa de fotodiodos convencionales, permitiendo asf que cada portador de foto- generado para ser multiplicado por ruptura en avalancha, lo que resulta en el aumento de intervalo dentro del fotodiodo, lo que aumenta la capacidad de respuesta efectiva (sensibilidad) del dispositivo. La eleccion del fotodiodo se determina por la longitud de onda de energfa o emision emitida por la pardcula marcada con fluorescencia. En algunos casos, el fotodiodo es un fotodiodo de silicio que detecta la energfa en el rango de 190 - 1100 nm; en otro caso, el fotodiodo es un fotodiodo de germanio que detecta la energfa en el rango de 800 - 1700 nm; en otro caso, el fotodiodo es un fotodiodo de arseniuro de indio y galio que detecta la energfa en el rango de 800 - 2600 nm; y aun

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en otros casos, el fotodiodo es un fotodiodo sulfuro de plomo que detecta la energfa en el rango de entre menos de 1000 nm a 3500 nm. En algunos casos, el fotodiodo en avalancha es un detector de foton unico disenado para detectar energfa en el rango de longitud de onda 400 nm a 1100 nm. Los detectores de foton unico estan disponibles comercialmente (por ejemplo, Perkin Elmer, Wellesley, MA).

En algunos casos el detector es un detector de fotodiodo en avalancha que detecta energfa entre 300 nm y 1700 nm. En un caso, los fotodiodos en avalancha de silicio se pueden utilizar para detectar las longitudes de onda entre 300 nm y 1100 nm. Los fotodiodos de indio arsenico de galio se pueden utilizar para detectar longitudes de onda entre 900 nm y 1700 nm. En algunos casos, un sistema de analisis puede comprender al menos un detector; en otros casos, el sistema de analisis puede comprender al menos dos detectores, y cada detector puede ser elegido y configurado para detectar energfa de la luz en un rango de longitud de onda espedfica. Por ejemplo, dos detectores separados se pueden utilizar para detectar partfculas que han sido etiquetadas con diferentes etiquetas, que tras la excitacion con una fuente de EM, emitiran fotones con energfa en diferentes espectros. En un caso, un sistema de analisis puede comprender un primer detector que puede detectar energfa fluorescente en el rango de 450-700 nm, tal como la emitida por un colorante verde (por ejemplo, Alexa 546); y un segundo detector que puede detectar energfa fluorescente en el rango de 620-780 nm, tal como la emitida por un colorante rojo lejano (por ejemplo, Alexa 647). Tambien se puede utilizar, los detectores de deteccion de la energfa fluorescente en el rango de 400-600 nm tal como la emitida por los colorantes azules (por ejemplo, Hoechst 33342), y para la deteccion de energfa en el rango de 560-700 nm, tal como la emitida por los colorantes rojos (Alexa 546 y Cy3).

Un sistema que comprende dos o mas detectores se puede utilizar para detectar partfculas unicas que son cada una etiquetadas con dos o mas etiquetas que emiten luz en diferentes espectros. Por ejemplo, dos detectores diferentes pueden detectar un anticuerpo que ha sido etiquetado con dos etiquetas de colorantes diferentes. Alternativamente, un sistema de analisis que comprende dos detectores se puede utilizar para detectar partfculas de diferentes tipos, cada tipo se etiqueta con moleculas de colorante diferentes, o con una mezcla de dos o mas moleculas de colorante. Por ejemplo, dos detectores diferentes se pueden usar para detectar dos tipos diferentes de anticuerpos que reconocen dos protemas diferentes, cada tipo que se esta etiquetado con una etiqueta de colorante diferente o con una mezcla de dos o mas moleculas de colorante de la etiqueta. Mediante la variacion de la relacion de las dos o mas moleculas de colorante de la etiqueta, dos o mas tipos de partfculas diferentes se pueden detectar individualmente utilizando dos detectores. Se entiende que tres o mas detectores se pueden utilizar.

Se debe entender por un experto en el arte que uno o mas detectores se pueden configurar en cada espacio de interrogacion, ya sea uno o mas espacios de interrogacion se definen dentro de una celda de flujo, y que cada detector puede estar configurado para detectar cualquiera de las caractensticas de la radiacion electromagnetica emitida enumeradas anteriormente. El uso de multiples detectores, por ejemplo, para multiples espacios de interrogacion, se ha revelado previamente en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 11/048,660, publicada como US2006/0078998 A1. Una vez que una partfcula se etiqueta para que sea detectable (o si la partfcula posee una caractenstica intnnseca que la haga detectable), cualquier mecanismo de deteccion apropiado conocido en la tecnica se puede utilizar, por ejemplo una camara CCD, una camara de modulo de entrada de video, una camara Streak, un bolometro, un fotodiodo, una matriz de fotodiodos, fotodiodos en avalancha, y fotomultiplicadores que producen senales secuenciales, y combinaciones de los mismos. Diferentes caractensticas de la radiacion electromagnetica se pueden detectar incluyendo: longitud de onda de emision, intensidad de emision, tamano de rafaga, duracion de la rafaga, la polarizacion de fluorescencia, y cualquier combinacion de los mismos.

C. Sistema de muestreo

En un caso adicional, el sistema de analisis puede incluir un sistema de muestreo para preparar la muestra para su introduccion en el sistema de analisis. El sistema de muestreo incluido es capaz de muestrear automaticamente una pluralidad de muestras y proporcionar una comunicacion de lfquido entre un recipiente de muestra y un primer espacio de interrogacion.

En algunos casos, el sistema de analisis de la invencion incluye un sistema de muestreo para la introduccion de una alfcuota de una muestra en el analizador de partfcula unica para el analisis. Se puede utilizar cualquier mecanismo que pueda introducir una muestra. Las muestras se pueden elaborar utilizando ya sea una succion de vacfo creado por una bomba o por la presion aplicada a la muestra que empujana el lfquido en el tubo, o por cualquier otro mecanismo que sirve para introducir la muestra en el tubo de muestreo. Generalmente, pero no necesariamente, el sistema de muestreo introduce una muestra de volumen de muestra conocido en el analizador de partfcula unica; en algunos casos donde se detecta la presencia o ausencia de una partfcula o partfculas, el conocimiento preciso del tamano de la muestra no es cntico. En casos preferidos el sistema de muestreo provee muestreo automatizado para una sola muestra o una pluralidad de muestras. En los casos donde se introduce una muestra de volumen conocido en el sistema, el sistema de muestreo provee una muestra para el analisis de mas de aproximadamente 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000, 1500, o 2000 |iL.. En algunos casos el sistema de muestreo provee una muestra para el analisis de menos de aproximadamente 2000, 1000, 500,200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 2, 1, 0.1, 0.01, o 0.001 |iL. En algunos casos el sistema de muestreo provee una muestra para el analisis de entre aproximadamente 0.01 y 1500 |iL, o aproximadamente 0,1 y 1000 |iL, o aproximadamente 1 y 500 |iL, o aproximadamente 1 y 100 |iL, o aproximadamente 1 y 50 |iL, o

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En algunos casos, el sistema de muestreo provee un tamano de la muestra que se puede variar de muestra a muestra. En estos casos, el tamano de la muestra puede ser cualquiera de los tamanos de las muestras descritos en este documento, y se pueden cambiar con cada muestra, o con conjuntos de muestras, si se desea.

Exactitud del volumen de la muestra, y precision del volumen muestra a muestra del sistema de muestreo, se requiere para el analisis que nos ocupa. En algunos casos, la precision del volumen de muestreo se determina por las bombas utilizadas, por lo general representados por un CV de menos de aproximadamente 50, 40, 30, 20, 10, 5,4, 3, 2, 1, 0.5, 0.1, 0.05, o 0.01% de volumen de muestra. En algunos casos, la precision muestra a muestra del sistema de muestreo esta representada por un CV de menos de aproximadamente 50, 40, 30, 20, 10, 5,4, 3, 2, 1, 0.5, 0.1, 0.05, o 0.01% de volumen de muestra. En algunos casos, la precision intraensayo del sistema de muestreo esta representada por un CV de menos de aproximadamente 10, 5, 1, 0,5, o 0.1%. En algunos casos, la precision intraensayo del sistema de muestreo muestra un CV de menos de aproximadamente 5%. En algunos casos, la precision inter-ensayo del sistema de muestreo esta representada por un CV de menos de aproximadamente 10, 5, o 1%. En algunos casos, la precision inter-ensayo del sistema de muestreo muestra un CV de menos de aproximadamente 5%.

En algunos casos, el sistema de muestreo provee el traslado de la muestra, la ventaja de que no se requiere una etapa de lavado adicional entre muestras. Por lo tanto, en algunos casos, el traslado de muestra es menos de aproximadamente 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.04, 0.03, 0.02, 0.01, 0.005, o 0.001%. En algunos casos, el traslado de la muestra es menos de aproximadamente 0.02%. En algunos casos, el traslado de la muestra es menos de aproximadamente 0.01%.

En algunos casos el muestreador provee un bucle de muestra. En estos casos, multiples muestras se toman en tubos de forma secuencial y cada uno se separa de los demas por un "tapon" de solucion reguladora. Las muestras por lo general se leen una tras otra sin drenaje intermedio. El drenaje se realiza una vez al final del bucle. En los casos donde se utiliza un "tapon" de solucion reguladora, el tapon se puede recuperar expulsando el tapon de solucion reguladora en un pozo separado de una placa de microtitulacion.

El sistema de muestreo se puede adaptar para su uso con equipos de ensayo estandar, por ejemplo, una placa de microtitulacion de 96 pozos, o, preferiblemente, una placa de 384 pozos. En algunos casos el sistema incluye un posicionador de una placa de 96 pozos y un mecanismo para sumergir el tubo de muestra dentro y fuera de los pozos, por ejemplo, un mecanismo que provee el movimiento a lo largo de los ejes X, Y, y Z. En algunos casos, el sistema de muestreo provee multiples tubos de muestreo a partir del cual las muestras se pueden almacenar y extraer de, cuando se inicio la prueba. En algunos casos, todas las muestras de los multiples tubos se analizan en un detector. En otros casos, multiples detectores de una unica molecula pueden estar conectados a los tubos de muestra. Las muestras se pueden preparar mediante las etapas que incluyen operaciones realizadas en la muestra en los pozos de la placa antes del muestreo por el sistema de muestreo, o de la muestra se pueden preparar dentro del sistema de analisis, o alguna combinacion de ambos.

D. Sistema de preparacion de la muestra

La preparacion de la muestra incluye las etapas necesarias para preparar una muestra cruda para su analisis. Estas etapas pueden incluir, a modo de ejemplo, una o mas etapas de: etapas de separacion tales como centrifugacion, filtracion, destilacion, cromatograffa; concentracion, lisis celular, alteracion del pH, adicion de solucion reguladora, adicion de diluyentes, adicion de reactivos, calentamiento o enfriamiento, adicion de etiqueta, union de etiqueta, la reticulacion con la iluminacion, separacion de etiqueta no unida, inactivacion y/o eliminacion de compuestos que interfieren y cualquier otra de las etapas necesarias para que la muestra sea preparada para el analisis mediante el analizador de partfculas unicas. En algunos casos, la sangre se trata para separar plasma o suero. Las etapas adicionales de etiquetado, eliminacion de etiqueta no unida, y/o de dilucion tambien se pueden realizar en la muestra de suero o plasma.

En algunos casos, el sistema de analisis incluye un sistema de preparacion de la muestra que lleva a cabo todos o algunos de los procesos necesarios para proporcionar una muestra lista para el analisis por el analizador de partfcula unica. Este sistema puede realizar cualquiera o todas las etapas indicadas anteriormente para la preparacion de la muestra. En algunos casos las muestras se procesan parcialmente por el sistema de preparacion de la muestra del sistema de analisis. Por lo tanto, en algunos casos, una muestra puede ser parcialmente procesada fuera del primer sistema de analisis. Por ejemplo, la muestra se puede centrifugar primero. Entonces, la muestra puede ser parcialmente procesada en el interior del analizador por un sistema de preparacion de la muestra. El procesamiento en el interior del analizador incluye la marcacion de la muestra, mezclando la muestra con una solucion reguladora y otras etapas de procesamiento que seran conocidas para alguien en el arte. En

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algunos casos, una muestra de sangre se procesa fuera del sistema de analisis para proporcionar una muestra de suero o plasma, que se introduce en el sistema de analisis y, ademas se procesa por un sistema de preparacion de la muestra para etiquetar la partmula o partmulas de interes y, opcionalmente, para eliminar la etiqueta no unida. En otros casos la preparacion de la muestra puede incluir inmunocafda de la muestra para eliminar las partmulas que no son de interes o para eliminar las partmulas que pueden interferir con el analisis de la muestra. En aun otros casos, la muestra se puede someter a cafda de partmulas que pueden interferir con el analisis de la muestra. Por ejemplo, la preparacion de muestras puede incluir la cafda de los anticuerpos heterofilos, que son conocidos para interferir con inmunoensayos que utilizan anticuerpos no humanos para detectar directa o indirectamente una partmula de interes. Del mismo modo, otras protemas que interfieren con las mediciones de las partmulas de interes pueden ser retiradas de la muestra usando anticuerpos que reconocen las protemas que interfieren.

En algunos casos, la muestra se puede someter a extraccion en fase solida antes de ser ensayadas y analizadas. Por ejemplo, una muestra de suero que se ensayo para cAMP primera se puede someter a extraccion en fase solida usando una columna C18 al que se une. Otras protemas tales como proteasas, lipasas y fosfatasas se lavan de la columna, y la cAMP se eluye esencialmente libre de protemas que pueden degradar o interferir con las mediciones de cAMP. La extraccion en fase solida se puede utilizar para eliminar la matriz basica de una muestra, lo que puede disminuir la sensibilidad del ensayo. En aun otros casos, las partmulas de interes presentes en una muestra pueden ser concentradas por secado o liofilizacion de una muestra y la solubilizacion de las partmulas en un volumen menor que el de la muestra original. Por ejemplo, una muestra de aliento condensado exhalado (EBC) se puede secar y se resuspenden en un pequeno volumen de una solucion reguladora apropiado para mejorar la deteccion de la partmula de interes.

En algunos casos el sistema de analisis provee un sistema de preparacion de la muestra que provee la preparacion completa de la muestra a ser analizada en el sistema, tales como la preparacion completa de una muestra de sangre, una muestra de saliva, una muestra de orina, una muestra de lfquido cerebroespinal, una muestra de linfa, una muestra de BAL, una muestra de condensado de aire exhalado (EBC), una muestra de biopsia, una muestra forense, una muestra de bioterrorismo, y similares. En algunos casos el sistema de analisis provee un sistema de preparacion de la muestra que provee algunas o la totalidad de la preparacion de la muestra. En algunos casos, la muestra inicial es una muestra de sangre que se procesa adicionalmente por el sistema de analisis. En algunos casos, la muestra es una muestra de suero o plasma que se procesa adicionalmente por el sistema de analisis. La muestra de suero o plasma se puede procesar adicionalmente, por ejemplo, poniendola en contacto con una etiqueta que se une a una partmula o partmulas de interes; la muestra puede entonces ser utilizada con o sin eliminacion de etiqueta no unida.

En algunos casos, se lleva a cabo la preparacion de muestras, ya sea fuera del sistema de analisis o en el componente de la preparacion de muestras del sistema de analisis, en una o mas placas de microtitulacion, tal como una placa de 96 pozos. Depositos de reactivos, soluciones reguladoras, y similares pueden estar en comunicacion fluida intermitente con los pozos de la placa por medio de tubos u otras estructuras apropiadas, como son bien conocidos en la tecnica. Las muestras se pueden preparar por separado en placas de 96 pozos o tubos. El aislamiento de la muestra, la union de la etiqueta y, si fuera necesario, etapas de separacion de la etiqueta, se pueden hacer en una placa. En algunos casos, las partmulas preparadas entonces son liberadas de la placa y las muestras se mueven en tubos para el muestreo en el sistema de analisis de muestras. En algunos casos, todas las etapas de la preparacion de la muestra se realizan en una placa y el sistema de analisis adquiere muestra directamente de la placa. Aunque este caso se describe en terminos de una placa de 96 pozos, se apreciara que cualquier recipiente se puede utilizar para contener una o mas muestras y apropiados para la preparacion de la muestra. Por ejemplo, se pueden utilizar placas de microtitulacion estandar de 384 o 1536 pozos. De manera mas general, en algunos casos, el sistema de preparacion de la muestra es capaz de contener y preparar mas de aproximadamente 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 500, 1000, 5000, o l0,000 muestras. En algunos casos, se pueden tomar muestras de multiples muestras para su analisis en multiples sistemas analizadores. Por lo tanto, en algunos casos, 2 muestras, o mas de aproximadamente 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15, 20, 50, o 100 muestras son muestreadas desde el sistema de preparacion de la muestra y se ejecutan en paralelo en multiples sistemas de analisis de la muestra.

Los sistemas de microfluidos tambien se pueden usar para la preparacion de la muestra y como sistemas de preparacion de muestras que son parte de sistemas de analizadores, especialmente para muestras sospechosas de contener concentraciones suficientes altas de partmulas, que la deteccion requiera muestras mas pequenas. Los principios y tecnicas de manipulacion de microfluidos son conocidos en la tecnica. Vease, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Nos. 4,979,824; 5,770,029; 5,755,942; 5,746,901; 5,681,751; 5,658,413; 5,653,939; 5,653,859; 5,645,702; 5,605,662; 5,571,410; 5,543,838; 5,480,614, 5,716,825; 5,603,351; 5,858,195; 5,863,801; 5,955,028; 5,989,402; 6,041,515; 6,071,478; 6355,420; 6,495,104; 6,386,219; 6,606,609; 6,802,342;6, 749,734; 6,623,613; 6,554,744; 6,361,671; 6,143,152; 6,132,580; 5,274,240; 6,689,323; 6,783,992; 6,537,437; 6,599,436; 6,811,668 y solicitud de patente PCT publicada No. WO9955461(A1). Las muestras se pueden preparar en serie o en paralelo, para usar en un sistema de analisis unico o multiple.

Preferiblemente, la muestra comprende una solucion reguladora. La solucion reguladora se puede mezclar con la muestra fuera del sistema de analisis, o puede ser proporcionada por el mecanismo de preparacion de la muestra.

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Mientras que cualquier solucion reguladora apropiada se puede utilizar, la solucion reguladora preferible tiene un fondo bajo de fluorescencia, es inerte a la partmula marcada de forma detectable, puede mantener el pH de trabajo y, en los casos en donde la fuerza motriz es electrocinetica, tiene la fuerza ionica apropiada para electroforesis. La concentracion de la solucion reguladora puede ser cualquier concentracion apropiada, tal como en el rango de aproximadamente 1 a aproximadamente 200 mM. Cualquier sistema de solucion reguladora se puede utilizar siempre y cuando se provea la solubilidad, la funcion y la capacidad de deteccion de las moleculas de interes. Preferiblemente, para la aplicacion mediante bombeo, la solucion reguladora se selecciona del grupo que consiste en fosfato, gliclina, acetato, citrato, acidulado, carbonato/bicarbonato, imidazol, trietanolamina, amida de glicina, borato, MES, Bis-Tris, ADA, aces, PIPES, MOPSO, Bis-Tris propano, BES, MOPS, TES, HEPES, DIPSO, MOBS, TAPSO, Trizma, HEPPSO, POPSO, TEA, EPPS, Tricina, Gly-Gly, Bicina, HEPBS, TAPS, AMPD, TABS, AMPSO, CHES, CAPSO, AMP, CAPS, y CABS. La solucion reguladora tambien se puede seleccionar entre el grupo que consiste en Gly-Gly, bicina, tricina, acido 2-morfolina etanosulfonico (MES), acido 4-morfolina propanosulfonico (MOPS) y 2-amino-2-metil-1-propanol clorhidrato (AMP). Una solucion reguladora util es Tris/borato 2 mM a pH 8.1, pero tambien son aceptables Tris/glicina y Tris/HCl. Otras soluciones reguladoras son como se describen en este documento.

Las soluciones reguladoras utiles para la electroforesis se revelan en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 11/048,660, publicada como US2006/0078998 A1

E. Recuperacion de la muestra

Una caractenstica muy util de los casos de los analizadores y sistemas de analisis descritos en este documento es que la muestra se puede analizar sin consumirla. Esto puede ser especialmente importante cuando los materiales de muestra son limitados. La recuperacion de la muestra tambien permite hacer otros analisis o volver a analizarla. Las ventajas de esta caractenstica para aplicaciones donde el tamano de la muestra es limitado y/o donde es deseable la capacidad para volver a analizar la muestra, por ejemplo, aplicaciones de diagnostico clmico, forenses, deteccion de farmacos, y aplicaciones de diagnostico clmico, seran evidentes para los expertos en el arte.

Por lo tanto, en algunos casos, el sistema de analisis descrito en este documento provee un sistema de recuperacion de la muestra para la recuperacion de la muestra despues del analisis. En estos casos, el sistema incluye mecanismos y metodos por los cuales la muestra se introduce en el analizador, se analiza y luego regresa, por ejemplo, por el mismo camino, hasta el portador de la muestra, por ejemplo, el tubo de muestra. Debido a que ninguna de las muestras se destruye y puesto que no entra en ninguna de las valvulas u otros tubos, sigue sin contaminar. Ademas, debido a que todos los materiales en el trayecto de la muestra son altamente inertes, por ejemplo, PEEK, sflice fundida, o zafiro, hay poca contaminacion de la trayectoria de la muestra. El uso de las bombas controladas con motor de pasos (en particular la bomba de analisis) permite un control preciso de los volumenes extrafdos e impulsados de regreso. Esto permite la recuperacion completa o casi completa de la muestra con poca o ninguna dilucion por la solucion reguladora de lavado. Por lo tanto, en algunos casos, mas de aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, o 99.9% de la muestra se recupero despues del analisis. En algunos casos, la muestra recuperada es sin diluir. En algunos casos, la muestra recuperada se diluye menos de aproximadamente 1.5 veces, 1.4 veces, 1.3 veces, 1.2 veces, 1.1 veces, 1.05 veces, 1.01 veces, 1.005 veces o 1.001 veces.

Para el muestreo y/o recuperacion de la muestra, se puede utilizar cualquier mecanismo para el transporte de una muestra de lfquido de un recipiente de muestra al analizador. En algunos casos el extremo de entrada del capilar de analisis se ha conectado a una longitud corta de tubo, por ejemplo, tubo de PEEK que puede ser sumergido en un recipiente de muestra, por ejemplo, un tubo de ensayo o pozo de muestra, o puede ser mantenido por encima de un recipiente de residuos. Cuando se lava, para limpiar la muestra anterior del aparato, este tubo se coloca por encima del recipiente de residuos para atrapar los residuos de lavado. Cuando se extrae una muestra, el tubo se introduce en el pozo de muestra o tubo prueba. Normalmente la muestra se extrae de forma rapida, y luego se expulsa lentamente mientras se observan las partmulas dentro de la muestra. Alternativamente, en algunos casos, la muestra se extrae lentamente durante al menos parte del ciclo de extraccion; la muestra puede ser analizada mientras se extrae lentamente. Esto se puede seguir por un rapido retorno de la muestra y un lavado rapido. En algunos casos, la muestra puede ser analizada tanto en el ciclo de entrada (introduccion) como de salida (extraccion), lo que mejora la estadfstica de recuento, por ejemplo, de muestras pequenas y diluidas, asf como confirman los resultados, y similares. Si se desea guardar la muestra, puede ser impulsada hacia atras hacia el mismo pozo de la muestra de donde viene, o a otro. Si no se desea guardar la muestra, el tubo se coloca sobre el recipiente de residuos.

VI. Metodos que utilizan el analisis de alta sensibilidad de troponina cardiaca

Los metodos de la presente invencion hacen posible la medicion de los niveles de troponina cardiaca en concentraciones muy inferiores que las medidas previamente. Aunque la troponina cardiaca es un marcador aceptado para el dano del musculo cardiaco, su utilidad ha sido limitada por el hecho de que, con los metodos actuales de analisis, solo es detectable despues de haberse producido un dano considerable en el musculo cardiaco, debido a la falta de sensibilidad de los metodos actuales. The Joint European Society of

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Cardiology/American College of Cardiology committee for the Redefinition of Myocardial Infarction ha recomendado que un aumento de la concentracion de troponina cardiaca se define como una medida superior del percentil 99° de la distribucion de las concentraciones de troponina cardiaca en el grupo de referencia, un umbral muy bajo. Se recomienda una imprecision total de (CV) en el lfmite de decision de <10%. Sin embargo, la imprecision analttica obtenida con inmunoensayos actualmente disponibles para las troponinas cardiacas no es uniforme, sobre todo en el rango de baja concentracion. Ademas, los ensayos que estan disponibles actualmente carecen de sensibilidad suficiente para detectar los niveles de troponina en sujetos no clmicos (normales), y no se ha definido un verdadero valor de referencia o un nivel de troponina definido en una poblacion normal. Los sistemas de analisis descritos en este documento han demostrado ser capaces de detectar sistematicamente los niveles de cTnl a concentraciones de menos de 3 pg/mL con una imprecision total de menos de 10% (ver ejemplos). Por lo tanto, se describen en este documento los metodos para el diagnostico, pronostico o metodos de tratamiento basados en la deteccion de alta sensibilidad de troponina cardiaca en las personas.

Algunos ejemplos proveen un metodo para determinar un diagnostico, pronostico, o metodo de tratamiento en un individuo mediante i) la determinacion de una concentracion de troponina cardiaca en una muestra o determinar las concentraciones de troponina cardiaca en una serie de muestras del individuo, donde la concentracion se determina mediante un ensayo de troponina cardiaca con un lfmite de deteccion para la troponina cardiaca en dicha muestra de menos de aproximadamente 50, 40, 30, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 pg/mL, por ejemplo, menos de aproximadamente 20 pg/mL; y ii) la determinacion de un diagnostico, pronostico, o metodo de tratamiento en dicho individuo, basado en la concentracion en la muestra, o en las concentraciones en la serie de muestras. El metodo para determinar la concentracion de troponina cardiaca incluye cualquier metodo apropiado con la sensibilidad requerida, por ejemplo, los metodos descritos en este documento. En algunos casos, los metodos utilizan un metodo para determinar una concentracion de troponina cardiaca en la muestra, donde el metodo comprende detectar moleculas unicas de troponina o complejos, o fragmentos de la misma.

En algunos casos, la concentracion umbral de la troponina se determina por analisis de muestras, por ejemplo, muestras de sangre, suero, o plasma, a partir de una poblacion aparentemente sana para la troponina cardiaca, por ejemplo, troponina I cardiaca, y determinar el nivel en el cual 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, o 99.9% de la cafda de la poblacion por debajo de ese nivel (concentracion). Este valor es el valor umbral. En algunas realizaciones, tal como se especifica en las reivindicaciones, el valor umbral se fija en el percentil 99°. En algunos casos, el analisis se realiza usando un metodo con un nivel de deteccion para la troponina cardiaca de menos de aproximadamente 50, 20, 10, 5, o 1 pg/mL, por ejemplo, menos de aproximadamente 5 pg/mL.

En algunos casos, la invencion provee un metodo para determinar un diagnostico, pronostico, o metodo de tratamiento en un individuo mediante la comparacion de un valor para una concentracion de troponina cardiaca en una muestra del individuo con un valor normal o un rango de los valores normales para la troponina cardiaca, donde el valle normal o rango de valores normales se determina mediante un ensayo de troponina cardiaca con un lfmite de deteccion para la troponina cardiaca en dicha muestra de menos de aproximadamente 50, 40, 30, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 pg/mL, por ejemplo, menos de aproximadamente 20 pg/mL; y ii) determinar un diagnostico, pronostico, o metodo de tratamiento en dicho individuo, basada en la comparacion.

En algunas realizaciones, tal como se especifica en las reivindicaciones, la troponina cardiaca es la troponina I cardiaca o troponina T cardiaca. En algunas realizaciones, la troponina cardiaca es la troponina T cardiaca. En algunas realizaciones, la troponina cardiaca es la troponina I cardiaca. El metodo puede utilizar la troponina total de, por ejemplo, cTnI total, o cTnT, o cTnI total + cTnT, como se describe en la presente memoria, para determinar un diagnostico, pronostico, o metodo de tratamiento. En algunos casos, el metodo puede utilizar la concentracion de la troponina cardiaca libre, en complejo, o fragmentos de la troponina cardiaca, o una comparacion de estos (por ejemplo, una relacion), para determinar un diagnostico, pronostico, o metodo de tratamiento.

A. Muestras

La muestra o una serie de muestras puede ser cualquier muestra apropiada; como se especifica en las reivindicaciones, la(s) muestra(s) sera(n) sangre, suero o plasma. En algunas realizaciones, la muestra o una serie de muestras son muestras de suero. El individuo puede ser un animal, por ejemplo, mairnfero, por ejemplo, humano.

Una sola muestra se puede tomar, o se pueden tomar una serie de muestras. Si se toma una serie de muestras, se pueden tomar en cualquier intervalo apropiado, por ejemplo, intervalos de minutos, horas, dfas, semanas, meses o anos. En un marco clmico agudo, por lo general se tomara una serie de muestras en el transcurso de horas y dfas, con las muestras separadas por una cuestion de horas. Cuando un individuo es seguido por penodos mas largos, intervalos de muestra pueden ser meses o anos. El diagnostico, pronostico, o metodo de tratamiento se puede determinar a partir de una sola muestra, o de una o mas de una serie de muestras, o de cambios en la serie de muestras, por ejemplo, un aumento en la concentracion a una cierta velocidad puede indicar una condicion severa mientras que aumento a un ritmo mas lento o ningun aumento puede indicar una condicion relativamente benigna o menos graves. La velocidad de cambio se puede medir en el transcurso de las horas, dfas, semanas, meses o anos. La velocidad de cambio en un individuo dado, en algunos casos, puede ser mas relevante que un valor absoluto. En un contexto agudo, una velocidad de cambio extremadamente rapida, por ejemplo, un "pico", puede indicar un

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evento cardiaco inminente, en progreso o reciente. En otros contextos, el aumento de los valores en un penodo de d^as, semanas, meses o anos en un individuo puede indicar el progreso y el empeoramiento de dano cardiaco, por ejemplo, dano cardiaco debido a una condicion cardiaca (por ejemplo, la hipertrofia cardiaca o insuficiencia cardiaca congestiva) o dano cardiaco debido a una condicion no cardiaca (por ejemplo, la toxicidad de la exposicion al farmaco).

En algunas realizaciones, se toma al menos una muestra durante o despues de una prueba de esfuerzo cardiaco. Por ejemplo, una muestra se puede tomar antes de la prueba de esfuerzo, y una o mas muestras tomadas durante la prueba. Las desviaciones en los niveles de troponina cardiaca entre la muestra antes de la prueba y la(s) muestra(s) tomada(s) durante la prueba puede proporcionar informacion de diagnostico o pronostico, por ejemplo, indican la probabilidad de enfermedad de arteria coronaria u otra patologfa asociada con el musculo cardiaco. Se pueden realizar otras comparaciones, asf como las comparaciones de ninguna de las muestras a niveles normales o de umbral, o determinacion de una velocidad de cambio en la concentracion de troponina cardiaca en las muestras, todos los cuales pueden proporcionar informacion util con respecto a la salud cardiaca y cardiovascular, asf como otras condiciones como se describe en este documento.

En algunos casos, se toma al menos una muestra en o cerca del momento en el cual, los individuos estan presentes con un profesional de la salud con uno o mas smtomas indicativos de una condicion que puede implicar dano cardiaco. Los contextos en los cuales un individuo puede estar presente con un profesional de la salud incluyen, pero no se limitan a, la atencion ambulatoria, cuidados de urgencia, cuidados cnticos, cuidados intensivos, unidad de vigilancia, paciente ingresado en el hospital, paciente no hospitalizado, consultorio medico, clmica medica, contexto de respuesta de emergencia, incluyendo una ambulancia y situaciones de deteccion de salud. En algunos casos, una o mas muestras se toman del individuo y se someten a ensayo para la troponina cardiaca localmente, i.e., en o cerca del entorno en donde se toman las muestras. Por ejemplo, un individuo que se presenta a un hospital puede tener una o mas muestras tomadas que se someten a ensayo para la troponina cardiaca en el hospital. En algunos casos, una o mas muestras se toman a partir del individuo y se someten al analisis de troponina cardiaca en un laboratorio CLIA. En algunos casos, el individuo muestra uno o mas smtomas compatibles con el smdrome coronario agudo. En algunos casos, el individuo muestra uno o mas smtomas compatibles con AMI. Estos smtomas incluyen, pero no se limitan a, dolor toracico, presion en el pecho, dolor en el brazo, EKG anormal, niveles de enzimas anormales, y falta de aliento.

B. Determinacion de diagnostico, pronostico, o metodo de tratamiento

En algunos casos, la etapa ii) incluye la comparacion de dicha concentracion o una serie de concentraciones con un valor normal para dicha concentracion, comparar dicha concentracion o serie de concentraciones con un nivel de umbral predeterminado, comparar dicha concentracion o serie de concentraciones con un valor de referencia, o determinar una velocidad de cambio de la concentracion de dicha serie de concentraciones.

En algunos casos, la etapa ii) comprende la comparacion de dicha concentracion de troponina en dicha muestra con una concentracion umbral predeterminada, y determinar un diagnostico, pronostico, o metodo de tratamiento si la concentracion de la muestra es mayor que el nivel de umbral. La concentracion umbral se puede determinar, por ejemplo, determinando la concentracion de percentil 99° de la troponina en un grupo de individuos, y el establecimiento de dicha concentracion umbral en dicha concentracion de percentil 99°. Un ejemplo de esto se da en los Ejemplos.

Los valores normales, los valores de umbral, la velocidad de cambio, las relaciones de los valores, y otros indicadores de diagnostico y pronostico utiles pueden ser establecidos por metodos bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, estos valores se pueden determinar mediante la comparacion de muestras de una poblacion del estudio y una poblacion de control, donde la poblacion del estudio muestra el estado biologico para el cual el diagnostico, pronostico, o metodo de tratamiento, se desea y la poblacion de control no presenta el estado biologico. En algunos casos, un estudio longitudinal se puede realizar, por ejemplo, la poblacion del estudio puede ser un subconjunto de la poblacion de control que, con el tiempo, muestra el estado biologico. Se apreciara que los datos de una pluralidad de estudios se pueden usar para determinar un valor de consenso o rango de valores para el normal, y para los niveles de pronostico o de diagnostico.

En el desarrollo de la prueba de diagnostico o pronostico, los datos para uno o mas marcadores potenciales se pueden obtener a partir de un grupo de sujetos. El grupo de sujetos se divide en al menos dos grupos, y preferiblemente el primer grupo y el segundo grupo cada uno tiene un numero aproximadamente igual de sujetos. El primer grupo incluye a sujetos que han sido confirmados como que tienen una enfermedad o, mas en general, que estan en un primer estado de condicion. Por ejemplo, este primer grupo de pacientes puede ser aquellos que han tenido recientemente una incidencia de la enfermedad, o pueden ser los que tienen un tipo espedfico de enfermedad, como AMI. La confirmacion del estado de condicion se puede hacer a traves de una prueba mas rigurosa y/o costosa, como la MRI o CT. A partir de ahora, los sujetos en este primer grupo se conocen como "enfermos". El segundo grupo de sujetos no es mas que aquellos que no entran en el primer grupo. Los sujetos en este segundo grupo pueden ser "no enfermos"; es decir, sujetos normales. Alternativamente, los sujetos en este segundo grupo se pueden seleccionar por mostrar un smtoma o una constelacion de smtomas que imitan los

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smtomas presentados por los sujetos "enfermos". En incluso otra alternativa, este segundo grupo puede representar los que estan en un momento diferente de incidencia de la enfermedad. Preferiblemente, los datos para el mismo grupo de marcadores estan disponibles para cada paciente. Este grupo de marcadores puede incluir todos los marcadores candidatos que pueden ser sospechosos de ser relevante para la deteccion de una enfermedad o condicion particular. No se requiere relevancia actual conocida. Ejemplos de las composiciones, los metodos y sistemas descritos en este documento pueden ser usados para determinar cual de los marcadores candidatos son mas relevantes para el diagnostico de la enfermedad o condicion. Los niveles de cada marcador en los dos grupos de sujetos pueden ser distribuidos a traves de un amplio rango, por ejemplo, en forma de una distribucion gaussiana. Sin embargo, no se requiere un ajuste de distribucion.

1. Infarto agudo de miocardio

Los metodos de la invencion son especialmente utiles en el diagnostico, pronostico y/o la seleccion del tratamiento en pacientes con sospecha de infarto agudo de miocardio (AMI). Las mediciones de troponina cardiaca individuales

0 en serie en pacientes con sospecha de AMI proporcionan informacion de pronostico creciente que mejora el pronostico e indica la intervencion terapeutica temprana y apropiada para minimizar el riesgo de resultados adversos.

Por lo tanto, la especificacion describe un metodo para diagnosticar, predecir y/o prevenir o tratar AMI en un individuo mediante el analisis de una muestra del individuo, por ejemplo, una muestra de sangre, muestra de plasma, y/o muestra de suero, para troponina cardiaca, por ejemplo, cTnI, y la deteccion de una concentracion de troponina cardiaca en la muestra a un lfmite de deteccion de menos de aproximadamente 3, 2, o 1 pg/mL, en donde la concentracion de troponina cardiaca en la muestra indica o predice aMi. La troponina cardiaca puede ser cTnI o cTnT, y puede ser troponina, total o una medida de una forma particular, por ejemplo, libre, en forma de complejo, o fragmento; en algunas realizaciones, se utiliza una relacion de una o mas formas de la troponina, como se describe en este documento. En algunos casos, la cTnI total se mide en la muestra o una serie de muestras. En algunos casos, la cTnT total se mide en la muestra o una serie de muestras. En algunos casos, la cTnI total + cTnT se mide en la muestra o una serie de muestras. En algunos casos, el nivel de troponina cardiaca se determina en o cerca del momento en que el individuo esta presente con a un profesional de la salud con smtomas indicativos de AMI. Estos smtomas incluyen, pero no se limitan a, dolor toracico, presion en el pecho, dolor en el brazo, EKG anormal, los niveles de enzimas anormales, y falta de aliento.

1 En algunos casos, se toma una serie de medidas, y un aumento en la concentracion de troponina cardiaca en las muestras indica, predice, o provee una base para el pronostico del AMI. En algunos casos, un aumento de mas del 50%, mas de 100%, mas de 150%, mas de 200%, mas de 250%, mas de 300%, mas de 400%, o mas de 500% del valor de referencia indica, predice, o provee una base para pronostico del AMI. En algunos casos, un nivel de troponina cardiaca de por encima de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, o 50 pg/mL en una sola muestra indica, predice, o provee una base para el pronostico del AMI, independientemente de los niveles de referencia, si se obtienen. En algunos casos, un nivel de troponina cardiaca de aproximadamente 110, o aproximadamente 5-15, o aproximadamente 10-50, aproximadamente de 10-200, aproximadamente 10-100, o aproximadamente 10-40, o aproximadamente 15-50, o aproximadamente 15-40, o aproximadamente de 20-200, aproximadamente 20-150, aproximadamente 20-100, aproximadamente 20-50, o aproximadamente 20-40, o aproximadamente 20-30 pg/mL indica, predice, o provee una base para el pronostico de AMI.

En algunos casos el diagnostico o pronostico incluye la estratificacion para el individuo, basada en la concentracion de troponina cardiaca en la muestra o una serie de muestras. Tal estratificacion puede estar basada en la concentracion de troponina cardiaca en muestras individuales, la presencia de aumentos y/o el tamano de los aumentos a partir de los valores de referencia en una serie de muestras, las relaciones de las diferentes formas de la troponina cardiaca, los valores absolutos para las diferentes formas de troponina cardiaca, la velocidad de cambio en la concentracion para la troponina cardiaca o para una o mas formas de la troponina cardiaca en una serie de muestras, el cambio en relaciones de las diferentes formas de troponina cardiaca en el tiempo en una serie de muestras, y cualquier otra informacion basada al menos en parte de la concentracion de troponina cardiaca en la muestra o una serie de muestras. La estratificacion puede estar basada en los valores obtenidos a partir de poblaciones de sujetos normales y enfermos, como se describe en este documento. El tratamiento apropiado tambien se puede determinar basandose en la estratificacion del individuo.

En algunos casos, la concentracion de troponina cardiaca se determina en combinacion con uno o mas otros marcadores, por ejemplo, se considera que los marcadores de isquemia miocardica, infarto de miocardio o marcadores de accidente cerebrovascular, y las concentraciones de cada marcador determinan el diagnostico, pronostico, o metodo de tratamiento. Como sera evidente para los expertos en el arte, otras indicaciones clmicas por lo general tambien se tendran en cuenta, por ejemplo, EKG, los smtomas, la historia, y similares. Se pueden construir algoritmos apropiados para el diagnostico, pronostico, o tratamiento con base en las combinaciones de tales marcadores y las indicaciones clmicas en combinacion con niveles de troponina.

Los marcadores utiles en combinacion con la troponina cardiaca en los metodos de la invencion incluyen, pero no se limitan a la creatina quinasa (CK) y su banda miocardica (MB) de la unidad estructural miocardica CK, aspartato

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aminotransferasa, lactato deshidrogenasa (LDH), a-hidroxibutirato deshidrogenasa, mioglobina, transaminasa glutamate oxaloacetato, glucogeno fosforilasa BB, acidos grasos libres no unidos, protema de union de acidos grasos del corazon (H-FABP), la albumina modificada por isquemia, la miosina de cadena ligera 1, la miosina de cadena ligera 2. Los marcadores de la inflamacion y la inestabilidad de la placa util en combinacion con la troponina cardiaca en los metodos de la invencion incluyen pero no se limitan a la protema C-reactiva, recuento de globulos blancos, ligando CD40 soluble, mieloperoxidasa, protema-1 quimioatrayente de monocitos, colina de sangre total, y protema plasmatica A asociada con el embarazo. Otros marcadores de la inflamacion se pueden detectar, e incluyen combinaciones de IL-8, IL-1p, IL6, IL10, TNF, e IL-12p70, asf como otras citoquinas o marcadores que seran evidentes para los expertos en el arte.

En algunos casos, la troponina cardiaca, por ejemplo, cTnl, se mide conjuntamente, por ejemplo, en la misma muestra, o en muestras del mismo individuo tomadas en o cerca del mismo momento, con un marcador seleccionado del grupo que consta de creatina quinasa (CK) y su banda miocardica (MB) de la unidad estructural miocardica CK, aspartato aminotransferasa, lactato deshidrogenasa (LDH), a hidroxibutirato deshidrogenasa, mioglobina, transaminasa oxaloacetato glutamato, glucogeno fosforilasa BB, acidos grasos libres no unidos, protema de union a acidos grasos de corazon ( H-FABP), albumina modificada por isquemia, miosina de cadena ligera 1, y miosina de la cadena ligera 2. En algunos casos la troponina cardiaca, por ejemplo, cTnl, se mide junto con CK-MB, por ejemplo, en la misma muestra, o en muestras procedentes del mismo individuo tomadas en o cerca del mismo momento.

En algunos casos, la troponina cardiaca, sola o en combinacion con otros marcadores o signos clmicos, medidos como se describe en este documento, se utiliza para determinar el reinfarto. En algunos casos, la troponina cardiaca, sola o en combinacion con otros marcadores o signos clmicos, medidos como se describe en este documento, se utiliza para determinar las caractensticas de un infarto, por ejemplo, el tamano, o la duracion desde el infarto. En este ultimo caso, los fragmentos de la troponina producidos por proteolisis en la sangre pueden ser comparados con la troponina total, cuanto mayor es la relacion de fragmentos, mayor es el tiempo transcurrido desde el infarto.

2. Condiciones distintas de AMI

Tambien se describen en este documento metodos de diagnostico, pronostico y tratamiento con base en la concentracion de troponina cardiaca en una muestra que son utiles en condiciones distintas de AMI.

Muchas condiciones incluyen dano cardiaco potencial o real, y la capacidad de medir la troponina cardiaca en los niveles descritos en este documento permite la deteccion temprana de dicho dano y la intervencion temprana. El conocimiento de la concentracion de troponina cardiaca como se mide por los metodos y composiciones de la invencion es util en el diagnostico, el pronostico, y la determinacion del tratamiento para tales condiciones. Las condiciones incluyen intervenciones percutaneas coronarias, cirugfa cardiaca, insuficiencia cardiaca, fiebre reumatica aguda, la amiloidosis, trauma cardiaco (incluyendo contusion, ablacion, ritmo, interrupcion, cardioversion, cateterismo y la cirugfa cardiaca), lesion por reperfusion, cardiotoxicidad de la terapia del cancer, insuficiencia cardiaca congestiva, la insuficiencia renal cronica, enfermedad de almacenamiento de glucogeno de tipo II (enfermedad de Pompe), trasplante de corazon, hemoglobinopatfa con hemosiderosis por transfusion, hipertension, incluyendo hipertension gestacional, hipotension, a menudo con arritmias, hipotiroidismo, miocarditis, pericarditis, cirugfa no cardiaca post-operatoria, embolia pulmonar, y sepsis.

En estos casos, los niveles de troponina se pueden determinar de forma concomitante con los niveles de marcador(es) que son espedficos para la enfermedad no cardiaca u otros smtomas o signos clmicos de la enfermedad; la concentracion y/o informacion de marcador(es) con respecto a otros smtomas o signos clmicos se combina con la informacion con respecto a las concentraciones de troponina cardiaca, determinaron como se describe en este documento, para determinar un diagnostico, pronostico y/o metodo de tratamiento. Por ejemplo, los casos de la invencion pueden emplear, ademas de la determinacion de la concentracion de troponina cardiaca, determinacion de la concentracion de uno o mas de los polipeptidos anteriormente mencionados, u otros marcadores de protemas utiles en el diagnostico, pronostico, o la diferenciacion de la enfermedad. En algunos casos, se provee un panel de marcadores para la enfermedad, en donde el panel incluye la concentracion de troponina cardiaca, como se describe en este documento, y al menos en otro marcador para la enfermedad. El panel puede incluir, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, o mas o marcadores individuales, que incluyen uno o mas troponinas cardiacas, por ejemplo, la cTnI total. El analisis de un marcador individual o subconjuntos de marcador se puede llevar a cabo por un experto en el arte para optimizar la sensibilidad o especificidad clmica en diversos entornos clmicos. Estos incluyen, pero no se limitan a, la atencion ambulatoria, cuidados de urgencia, cuidados intensivos, terapia intensiva, unidad de supervision, paciente internado en el hospital, paciente no hospitalizado, consultorio medico, clmica medica, y situaciones de deteccion de salud. Ademas, un experto en el arte puede utilizar un solo marcador o un subconjunto de los marcadores en combinacion con un ajuste del umbral de diagnostico en cada uno de los ajustes antes mencionados para optimizar la sensibilidad y especificidad clmicas.

a. La toxicidad cardiaca Los metodos de la invencion son especialmente utiles en la determinacion y el seguimiento de la toxicidad cardiaco que resulta de un tratamiento, por ejemplo, toxicidad cardiaca del tratamiento farmacologico.

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Asf, por ejemplo, la especificacion provee un metodo de evaluacion de la toxicidad cardiaca de un tratamiento mediante la medicion de troponina cardiaca en un individuo mediante i) la determinacion de una concentracion de troponina cardiaca en una muestra o determinar las concentraciones de troponina cardiaca en una serie de muestras procedentes del individuo, donde al menos una de las muestras se toma de la persona durante o despues de un tiempo cuando el individuo esta recibiendo el tratamiento, donde la concentracion o concentraciones se determina mediante un ensayo de troponina cardiaca con un lfmite de deteccion para la troponina cardiaca en dicha muestra de menos de aproximadamente 50, 40, 30, 10, 5, 4,3,2 o 1 pg/mL, por ejemplo, menos de aproximadamente 20 pg/mL; y ii) la evaluacion del grado de toxicidad cardiaca del tratamiento en base a dicha concentracion o concentraciones. En algunos casos, el tratamiento es un tratamiento farmacologico. En algunos casos, el tratamiento es un tratamiento no farmacologico. El metodo para determinar la concentracion de troponina cardiaca incluye cualquier metodo apropiado con la sensibilidad requerida, por ejemplo, los metodos descritos en este documento. En algunos casos, los metodos utilizan un metodo para determinar una concentracion de troponina cardiaca en la muestra, donde el metodo comprende detectar moleculas individuales de troponina o complejos, o fragmentos de los mismos.

Especialmente utiles son los metodos de determinacion de la toxicidad cardiaca utilizando los anticuerpos de reaccion con cruzamiento descritos en este documento, i.e., los anticuerpos que reaccionan con troponina a partir de al menos dos especies, tales como humanos y otras especies, tales como rata, perro, raton, o mono. Tales anticuerpos se pueden usar en estudios con animales de la toxicidad del farmaco, donde el individuo para el que se evaluo la toxicidad es, por ejemplo, un mairnfero, tal como una rata, raton, perro, mono, u otro animal utilizado en tales estudios. La toxicidad en varias especies se puede comparar directamente cuando el anticuerpo utilizado en el ensayo es el mismo anticuerpo, reduciendo asf la variabilidad.

Se apreciara que los metodos de la invencion pueden ser usados en conjuncion con farmacos espedficos cuyos efectos secundarios incluyen la cardiotoxicidad con el fin de controlar la toxicidad cardiaca. Por lo tanto, la especificacion provee metodos para el seguimiento de la toxicidad cardiaca en un individuo que esta recibiendo un farmaco que se sabe que causa toxicidad cardiaca determinando la concentracion de troponina cardiaca en una o mas muestras obtenidas del individuo, donde la concentracion o concentraciones se determina por un ensayo de troponina cardiaca con un lfmite de deteccion para la troponina cardiaca en dicha muestra o muestras de menos de aproximadamente 50, 40, 30, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 pg/mL, por ejemplo, menos de aproximadamente 20 pg/mL; y ii) evaluar el grado de toxicidad cardiaca del tratamiento con farmacos en base a dicha concentracion o concentraciones. En algunos casos el metodo incluye ademas una etapa iii) determinar si continuar o no con el tratamiento farmacologico basado en la evaluacion de la etapa ii). Los farmacos cuyos efectos secundarios incluyen toxicidad cardiaca son bien conocidos en la tecnica.

C. Metodos comerciales

Se describen en este documento sistemas y metodos (incluyendo metodos comerciales) para el establecimiento de los marcadores de la troponina cardiaca que se pueden usar para diagnosticar, pronosticar, o determinar un metodo de tratamiento de un estado biologico o una condicion en un organismo, la preparacion de diagnosticos basados en tales marcadores y diagnosticos de mercadeo/comercializacion y servicios que utilizan tales diagnosticos. El estado biologico puede ser de infarto agudo de miocardio, o dano cardiaco debido a la toxicidad de los farmacos, o los estados no-AMI como se describe en este documento.

En un caso, los metodos comerciales en el presente documento comprenden: el establecimiento de uno o mas marcadores de troponina cardiaca utilizando un metodo que comprende: el establecimiento de un rango de concentraciones para dicho marcador o marcadores en muestras biologicas obtenidas a partir de una primera poblacion mediante la medicion de las concentraciones del marcador o marcadores en las muestras biologicas mediante la deteccion de moleculas unicas del marcador o marcadores en un nivel de deteccion de menos de aproximadamente 50, 20, 10, 5, o 1 pg/mL; y la comercializacion del uno o mas marcadores establecidos en la etapa anterior, por ejemplo, en un producto de diagnostico. El producto de diagnostico en este documento puede incluir uno o mas anticuerpos que se une espedficamente al marcador de la troponina cardiaca y una unidad estructural fluorescente que es capaz de emitir una media de al menos aproximadamente 200 fotones cuando se simula por un emisor de luz laser a la longitud de onda de excitacion de la unidad estructural, cuando el laser se enfoca en un punto de no menos de aproximadamente 5 micras de diametro que contiene la unidad estructural, y en donde la energfa total dirigida en el punto por el laser es no mas de aproximadamente 3 microjulios.

En un caso, los metodos comerciales en el presente documento comprenden: el establecimiento de un rango de valores normales para un marcador de troponina cardiaca utilizando un sistema que comprende: el establecimiento de un rango de concentraciones para dicho marcador de troponina cardiaca en muestras biologicas obtenidas a partir de una primera poblacion mediante la medicion de la concentraciones del marcador de las muestras biologicas mediante la deteccion de moleculas unicas del marcador a un nivel de deteccion menos de aproximadamente 3 pg/mL, opcionalmente menos de aproximadamente 1 pg/mL; y proporcionar un servicio de diagnostico para determinar si un organismo tiene o no tiene un estado o condicion de interes, por ejemplo, el AMI, la toxicidad cardiaca debido al tratamiento farmacologico, o una condicion no-AMI. Un servicio de diagnostico en este documento puede ser proporcionado por un laboratorio aprobado por CLIA que esta autorizado en la empresa o el

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negocio en sr Los servicios de diagnostico en este documento pueden ser prestados directamente a un proveedor del cuidado de la salud, un asegurador del cuidado de la enfermedad, o un paciente. As^ los metodos comerciales en este documento pueden generar ingresos por la venta, por ejemplo, de servicios de diagnostico o productos de diagnostico.

Los metodos comerciales en este documento tambien contemplan la prestacion de servicios de diagnostico, por ejemplo, para proveedores de cuidados de salud, aseguradores, pacientes, etc. El negocio en este documento puede proporcionar servicios de diagnostico a traves de un contrato con un laboratorio de servicios o el establecimiento de un laboratorio de servicio (bajo Clinical Laboratory Improvement Amendment (CLIA) u otra aprobacion reglamentaria). Dicho laboratorio de servicio, entonces se puede llevar a cabo los procedimientos revelados en este documento para identificar si un marcador de troponina cardiaca se encuentra dentro de una muestra.

VII. Composiciones

La memoria descriptiva describe composiciones utiles en la deteccion y cuantificacion de la troponina cardiaca. Las composiciones incluyen asociados de union con la troponina cardiaca que se marcan con etiquetas apropiadas para la deteccion por los metodos de la invencion, pares de asociados de union en donde uno o ambos de los asociados de union se marcan con etiquetas apropiadas para la deteccion por medio de los metodos de la invencion, soportes solidos a los que asociados union de captura estan unidos, en algunos casos tambien con asociados de union de deteccion.

Los casos de ejemplo incluyen una composicion para la deteccion de la troponina cardiaca que incluye un asociado de union con la troponina cardiaca unida a una unidad estructural fluorescente, donde la unidad estructural fluorescente es capaz de emitir una media de al menos aproximadamente 200 fotones cuando se simula por un emisor de luz laser a la longitud de onda de excitacion de la unidad estructural, cuando el laser se enfoca en un punto de no menos de aproximadamente 5 micras de diametro que contiene la unidad estructural, y en donde la energfa total dirigida en el punto por el laser es no mas de aproximadamente 3 microjulios. En algunos casos, el asociado de union incluye un anticuerpo para la troponina cardiaca. En algunos casos, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal. En algunos casos, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunos casos, el anticuerpo es un anticuerpo de reaccion con cruzamiento, por ejemplo, un anticuerpo que reacciona con cruzamiento con troponina cardiaca de por lo menos dos especies, por ejemplo, al menos dos especies seleccionadas del grupo que consiste de humano, mono, perro, y raton. En algunos casos el anticuerpo reacciona con cruzamiento con troponinas cardiacas de todos humanos, mono, perro, y raton. En algunos casos, la troponina cardiaca se selecciona del grupo que consiste de cTnI y cTnT. En algunos casos, la troponina cardiaca es cTnI. En algunos casos, la troponina cardiaca es cTnT. El anticuerpo puede ser espedfico a una region espedfica de la molecula de troponina, por ejemplo, espedfico para una region que comprende los aminoacidos 27-41 de la troponina I cardiaca. La unidad estructural fluorescente puede contener una o mas moleculas que comprende al menos un sistema de anillo de indolio sustituido en donde el sustituyente en el carbono 3 del anillo de indolio contiene un grupo qmmicamente reactivo o un grupo de sustancia conjugada. La composicion de etiqueta puede incluir una unidad estructural fluorescente que incluye una o mas moleculas de colorante seleccionadas del grupo que consiste en Alexa Fluor 488, 532, 647, 700, o 750. La composicion de etiqueta puede incluir una unidad estructural fluorescente que incluye una o mas moleculas de colorante seleccionadas del grupo constituido por Alexa Fluor 488, 532, 700, o 750. La composicion de etiqueta puede incluir una unidad estructural fluorescente que incluye una o mas moleculas de colorante que son Alexa Fluor 488. La composicion de etiqueta puede incluir una unidad estructural fluorescente que incluye una o mas moleculas de colorante que son Alexa Fluor 555. La composicion de etiqueta puede incluir una

unidad estructural fluorescente que incluye una o mas moleculas de colorante que son Alexa Fluor 610. La

composicion de etiqueta puede incluir una unidad estructural fluorescente que incluye una o mas moleculas de colorante que son Alexa Fluor 647. La composicion de etiqueta puede incluir una unidad estructural fluorescente que incluye una o mas moleculas de colorante que son Alexa Fluor 680. La composicion de etiqueta puede incluir una

unidad estructural fluorescente que incluye una o mas moleculas de colorante que son Alexa Fluor 700. La

composicion de etiqueta puede incluir una unidad estructural fluorescente que incluye una o mas moleculas de colorante que son Alexa Fluor 750.e

En algunos casos, la especificacion describe una composicion que incluye un conjunto de estandares para la determinacion de una concentracion de una troponina cardiaca, en donde al menos uno de los estandares esta a una concentracion de troponina cardiaca menos de aproximadamente 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, o 1 pg/mL. En algunos casos, la especificacion describe una composicion que incluye un conjunto de estandares para determinar una concentracion de una troponina cardiaca, en donde al menos uno de los estandares esta a una concentracion de troponina cardiaca de menos de aproximadamente 20 pg/mL. En algunos casos, la especificacion describe una composicion que incluye un conjunto de estandares para la determinacion de una concentracion de una troponina cardiaca, en donde al menos uno de los estandares esta a una concentracion de troponina cardiaca menos de aproximadamente 10 pg/mL. En algunos casos, la especificacion describe una composicion que incluye un conjunto de estandares para la determinacion de una concentracion de una troponina cardiaca, en donde al menos uno de los estandares esta a una concentracion de troponina cardiaca de menos de aproximadamente 5 pg/mL. En algunos casos, la especificacion describe una composicion que incluye un conjunto de estandares para determinar una

concentracion de una troponina cardiaca, en donde al menos uno de los estandares esta a una concentracion de troponina cardiaca de menos de aproximadamente 1 pg/mL.

Otras composiciones son como se describen en este documento.

VIII. Kits

5 La especificacion describe adicionalmente kits. Los kits descritos en este documento incluyen una o mas composiciones utiles para la deteccion sensible de la troponina cardiaca, como se describe en este documento, en un embalaje apropiado. En algunos casos los kits descritos en este documento proporcionan etiquetas, por ejemplo, asociado de union tal como un anticuerpo que es espedfico para troponina cardiaca, donde el asociado de union esta unido a una unidad estructural fluorescente. En algunos casos los kits descritos en este documento 10 proporcionan pares de asociados de union, por ejemplo, pares de anticuerpos, que son espedficos para la troponina cardiaca, donde al menos uno de los asociados de union es una etiqueta para una troponina cardiaca, como se describe en este documento. En algunos casos, los asociados de union, por ejemplo, anticuerpos, se proporcionan en recipientes separados. En algunos casos, los asociados de union, por ejemplo, anticuerpos, se proporcionan en el mismo recipiente. En algunos casos, uno de los asociados de union, por ejemplo, anticuerpo, se inmoviliza sobre 15 un soporte solido, por ejemplo, una placa de microtitulacion o una perla paramagnetica. En algunos de estos casos, el otro asociado de union, por ejemplo, anticuerpo, se marca con una unidad estructural fluorescente tal como se describe en este documento.

Los asociados de union, por ejemplo, anticuerpos, soportes solidos, y etiquetas fluorescentes para los componentes de los kits puede ser cualquier tipo de componentes apropiados tal como se describe en este documento.

20 Los kits pueden incluir adicionalmente reactivos utiles en los metodos descritos en este documento, por ejemplo, soluciones reguladoras y otros reactivos usados en las reacciones, lavados, soluciones reguladoras u otros reactivos de union para el preacondicionamiento del instrumento en el cual se realizaran los ensayos, y las soluciones reguladoras de elucion u otros reactivos para realizar las muestras a traves del instrumento.

Los kits pueden incluir uno o mas estandares, por ejemplo, los estandares para el uso en los ensayos descritos en 25 este documento, tales como los estandares altamente purificados de por ejemplo, recombinante, cTnl humana o cTnT humana, o diversos fragmentos, complejos, y similares, de los mismos. Los kits pueden incluir ademas instrucciones.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustracion y no a modo de limitar la divulgacion restante.

30 A menos que se especifique lo contrario, se analizaron muestras de procesamiento en los Ejemplos en un detector de molecula unica (SMD) como se describe en este documento, con los siguientes parametros: Laser: laser diodo de arsenito de galio de onda continua de longitud de onda de 639 nm (Blue Sky Research, Milpitas, CA), enfocado a un tamano de punto de aproximadamente 2 micras (espacio de interrogacion de 0.004 pL como se define en este documento); velocidad de flujo = 5 microlitros/min a traves de un capilar de sflice fundida de ID de 100 micras 35 cuadradas y OD de 300 micras cuadradas; configuracion no confocal de lentes (vease, por ejemplo, la Fig. 1A); centrando la lente de abertura numerica 0.8 (Olympus); detector de fotodiodos en avalancha de silicio (Perkin Elmer, Waltham, MA).

Ejemplo 1. Ensayos sandwich de biomarcadores: troponina I cardiaca (cTnI)

El ensayo: El proposito de este ensayo fue detectar la presencia de Troponina I cardiaca (cTnI) en suero humano. El 40 formato de ensayo fue un inmunoensayo de tipo sandwich de dos etapas basado en un anticuerpo de captura monoclonal de raton y un anticuerpo de deteccion policlonal de cabra. Se requieren diez microlitros de muestra. El intervalo de trabajo del ensayo es de 0 - 900 pg/mL con un lfmite analftico tfpico de deteccion de 1 - 3 pg/mL. El ensayo requiere aproximadamente cuatro horas de tiempo de banco para completar.

Materiales: los siguientes materiales se utilizan en el procedimiento descrito a continuacion: Placa de ensayo: Nunc 45 Maxisorp, producto 464718, 384 pozos, claro, recubiertos de forma pasiva con anticuerpo monoclonal, BiosPacific A34440228P Lote # A0316 (5 |ig/mL en carbonato de sodio 0.05 M pH 9.6, durante la noche a temperatura ambiente); se bloqueo con 5% de sacarosa, BSA al 1% en PBS, y se almaceno a 4 °C. Para la curva estandar, se utilizo Troponina I cardiaca humana (BiosPacific Cat # J34000352). El diluyente para las concentraciones estandar fue suero humano que fue sometido a inmunocafda de la cTNI endogena, se dividio en alfcuotas y se almaceno a - 50 20 °C. La dilucion de los estandares se hizo en un 96 pozos, conica, polipropileno, (Nunc producto # 249 944). Se

usaron los siguientes soluciones reguladoras y soluciones: (a) solucion reguladora de ensayo: BBS con 1% de BSA y 0.1% de Triton X-100; (b) solucion de bloqueo pasivo en solucion reguladora de ensayo que contiene 2 mg/mL de IgG de raton, (Equitech Bio); 2 mg/mL de IgG de cabra, (Equitech Bio); y 2 mg/mL de MAK33 poli, Roche # 11939661; (c) anticuerpo de deteccion (Ab): la afinidad del anticuerpo policlonal de cabra purificado a Peptido 3,

(BiosPacific G129C), que fue marcado con un colorante fluorescente Alexa Fluor 647, y se almaceno a 4 °C; diluyente de anticuerpo de deteccion: 50% de solucion reguladora de ensayo, 50% de solucion de bloqueo pasivo; solucion reguladora de lavado: solucion salina reguladora de borato Solucion reguladora de Triton (BBST) (borato 1.0 M, cloruro de sodio 15.0 M, Triton X-100al 10%, pH 8.3); solucion reguladora de elucion: BBS con urea 4 M, 5 Triton X-100 al 0.02%e y BSA al 0.001%.

Preparacion de anticuerpos marcados con Alexa Fluor 647: el anticuerpo de deteccion G-129-C se conjugo con Alexa Fluor 647, disolviendo en primer lugar 100 ug de G-129-C en 400uL de la solucion reguladora de acoplamiento (NaHCO3 0.1M). La solucion de anticuerpo se concentro luego a 50 ul mediante la transferencia de la solucion en filtro YM-30 y sometiendo la solucion y el filtro de la centrifugacion. A continuacion, el filtro YM-30 y el anticuerpo se 10 lavaron tres veces mediante la adicion de 400ul de la solucion reguladora de acoplamiento. El anticuerpo se recupero mediante la adicion de 50 □ al filtro, invirtiendo el filtro, y centrifugando durante 1 minuto a 5,000 x g. La solucion del anticuerpo resultante fue 1-2 ug/ul. Se reconstituyo Alexa Fluor 647 NHS ester, mediante la adicion de 20 ul de DMSO a un vial de Alexa Fluor 647, esta solucion se almaceno a -20 °C hasta por un mes. Se adicionaron 3uL de solucion stock de Alexa Fluor 647 a la solucion de anticuerpo, que despues se mezclan y se incuban en la 15 oscuridad durante una hora. Despues de una hora, se adicionaron 7.5ul de tris 1m a la solucion de anticuerpo Alexa Fluor 647 y se mezclaron. La solucion se ultrafiltra con YM-30 para eliminar los componentes de bajo peso molecular. El volumen del material retenido, que contema el anticuerpo conjugado con Alexa Fluor 647, se ajusto a 200-400 □ mediante la adicion de PBS. 3uL de NaN3 al 10% se adicionaron a la solucion, la solucion resultante se transfirio a una unidad de centnfuga Ultrafree 0.22 y se centrifugo durante 2 minutos a 12,000 x g. El filtrado que 20 contiene el anticuerpo conjugado se recogio y se utilizo en los ensayos.

Procedimiento: preparacion de muestras y estandar de cTnl y analisis:

La curva estandar se preparo de la siguiente manera: se prepararon patrones de trabajo (0 - 900 pg/mL) por medio de diluciones en serie de las soluciones stock de cTnl en diluyente estandar o para lograr un rango de concentraciones de cTnl de entre 1.2 pg/mL -4.3 |ig/mL.

25 Se adicionaron a cada pozo 10 |iL de solucion de bloqueo pasivo y 10 |iL de estandar o de la muestra. Los estandares se realizaron por cuadruplicado. La placa se sello con pelfcula de sellado Axyseal, se centrifugo durante 1min a 3000 RPM, y se incubo durante 2 horas a 25 °C con agitacion. La placa se lavo cinco veces, y se centrifugo hasta que el rotor alcanzo 3000 RPM en una posicion invertida sobre una toalla de papel. Se preparo una dilucion de trabajo 1 nM de anticuerpo de deteccion, y se adicionaron 20 |iL de anticuerpo de deteccion a cada pozo. La placa 30 se sello y se centrifugo, y el ensayo se incubo durante 1 hora a 25 °C con agitacion. Se anadieron 30 |iL de solucion reguladora de elucion por pozo, la placa se sello y se incubo durante el ensayo A hora a 25 °C. La placa se almaceno durante hasta 48 horas a 4 °C antes del analisis, o la muestra se analizo inmediatamente.

Para el analisis, se adquirieron 20 |iL por pozo a 40 |iL/minuto, y se analizaron 5 |iL a 5 |iL/minuto. Se analizaron los datos en funcion de un umbral de 4 sigma. Se registro la senal en bruto frente a la concentracion de los estandares. 35 Un ajuste lineal se realizo para el rango de concentracion bajo, y se realizo un ajuste no lineal para la curva estandar completa. El lfmite de deteccion (LoD) se calculo como lOd = (3 x desviacion estandar de ceros)/pendiente del ajuste lineal.

Las concentraciones de las muestras se determinaron a partir de la ecuacion (no lineal o lineal) apropiada para la senal de la muestra.

40 Una alfcuota se bombeo en el analizador. Se midieron los anticuerpos marcados individualmente durante el flujo capilar ajustando el volumen de interrogacion de tal manera que se detecto la emision de solamente 1 etiqueta fluorescente en un espacio definido siguiendo la excitacion laser. Con cada senal que representa un evento digital, esta configuracion permite sensibilidades analtticas extremadamente altas. Senal fluorescente total se determina como una suma de los eventos digitales individuales. Cada molecula contada es un punto de datos positivo con 45 cientos de miles de eventos DMC /muestra. El lfmite de deteccion del ensayo de cTnl de la invencion se determino por el metodo de la media + 3 SD.

Resultados: Los datos para una curva estandar cTnl tfpica medida por cuadruplicado utilizando el protocolo de ensayo se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2

50 Curva estandar para cTnl

cTnl (pg/mL): Senal Desviacion estandar % CV

0: 233 25 10.8

1.5625: 346 31 8.9

3.125: 463 35 7.5

6.25: 695 39 5.6

12.5: 1137 61 5.3

25: 1988 139 7.0

50: 3654 174 4.8

100: 5493 350 6.4

200: 8264 267 3.2

400: 9702 149 1.5

800: 9976 50 0.5

La sensibilidad del sistema de analisis se probo en 15 analisis y se encontro de forma rutinaria que detecta niveles sub femtomol/l (FM) de calibrador, como se muestra por los datos en la Tabla 3. La precision fue del 10% a 4 y 12 pg/mL de cTnI.

5

Tabla 3

Sensibilidad Instrumento

Calibrador (FM): Cuenta senal CV

0: 11

12: 302 9

60: 1341 8

300: 4784 7

La curva estandar linealizada para los rangos de concentraciones de cTnl se muestra en la figura 5.

El lfmite analftico de deteccion (LoD) se determino a traves de 15 ensayos secuenciales. El LoD fue la media de las 10 determinaciones intra-ensayo 0 std + 3 SD (n = 4). La media de LoD fue de 1.7 pg/mL (rango 0.4 a 2.8 pg/mL).

La recuperacion de la muestra se determino mediante el analisis de muestras de suero que habfan sido sometidas a inmunocafda de cTnl y se reforzaron con cantidades conocidas de cTnI. La Tabla 4 muestra los datos de recuperacion de la muestra por el sistema analizado mas de 3 dfas.

Tabla 4

15 Recuperacion de la Muestra

Pico (pg/mL): Recuperacion (media) Desviacion Estandar % CV

5: 5.7 0.9 16

15: 13.7 0.2 2

45: 43 0.6 2

135: 151 6.2 4

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La linealidad del ensayo se determino en el suero humano agrupado que se reforzo con cTnl y se diluyo con diluyente estandar. Los resultados en 56, muestran las diluciones y el % de la senal esperada para la dilucion correspondiente.

Tabla 5

Ensayo de linealidad

Dilucion de suero: % de lo esperado

1:2: 79

1:4: 87

1:8: 96

Estos datos muestran que el sistema de analisis de la invencion permite realizar el inmunoensayo altamente sensible inducido por laser para concentraciones sub-femtomolares de cTnI.

Ejemplo 2: Ensayos basados en Sandwich-Perla para Tnl:

Los ensayos descritos anteriormente utilizan el mismo formato de placa de microtitulacion donde se utiliza la superficie de plastico para inmovilizar las moleculas diana. El sistema de analisis de partfcula unica tambien es compatible con los ensayos realizados en solucion utilizando micropartfculas o perlas para conseguir la separacion de entidades unidas de no unidas.

Materiales: se obtienen micropartfculas MyOne Estreptovidina C1 (MP) de Dynal (650.01-03, 10 mg/mL de stock). Las soluciones reguladoras utilizadas en el ensayo incluyen: 10X solucion salina reguladora de borato Solucion reguladora Triton (BBST) (borato 1.0 M, cloruro de sodio 15.0 M, Triton X-100 al 10%, pH 8.3); solucion reguladora de ensayo (2 mg/mL de IgG de cabra normal, 2 mg/mL de IgG de raton normal, y 0.2 mg/mL de MAB-33-IgG- polfmero en 0.1 M de Tris (pH 8.1), EDTA 0.025 M, NaCl 0.15 M, BSA al 0.1%, Triton X-100 al 0.1%, NaNs al 0.1% y, almacenada a 4°C); y solucion reguladora de elucion (BBS con urea 4 M, 0.02% de Triton X-100, y 0.001% de BsA, se almacena a 2-8C). Los anticuerpos utilizados en el ensayo basado en perlas sandwich incluyen: Bio-Ab (A34650228P (BiosPacific) con 1-2 biotinas por IgG) y Det-AB (G-129-C (BiosPacific) conjugado con A647, 2-4 compuestos fluorescentes por IgG). El estandar es la troponina I cardiaca humana recombinante (BiosPacific, cat # J34120352). El diluyente calibrador es 30 mg/mL de BSA en TBS wEDTA.

Recubrimiento de las micropartfculas: 100 ul de la solucion stock de MP se colocan en un tubo Eppendorf. Las MP se lavan tres veces con 100 ul de solucion reguladora de lavado BBST, mediante la aplicacion de un iman, eliminando el sobrenadante, eliminando el iman, y se resuspendieron en solucion reguladora de lavado. Despues de los lavados las MP se resuspenden en 100 ul de solucion reguladora de ensayo y se adicionaron 15 ug de Bio-Ab. La mezcla se incuba a continuacion durante una hora a temperatura ambiente con mezcla constante. Las MP se lavaron cinco veces con solucion reguladora de lavado 1 mL, como se describio anteriormente. Despues de los lavados de las MP se resuspenden en 15 mL de solucion reguladora de ensayo (o 100 ul para almacenar a 4 °C).

Preparacion de estandar y muestras: El estandar se diluye con diluyente calibrador para preparar la curva estandar apropiada (por lo general 200 pg/mL a 0.1 pg/mL). Muestras de suero y plasma congelado necesitan ser centrifugadas 10 minutos a temperatura ambiente a 13K rpm. El suero/plasma aclarado se retira con cuidado para evitar la adopcion de cualquier posible pelet o flotador y se pone en tubos nuevos. 50 ul de cada estandar o muestra se colocan con pipeta en los pozos apropiados.

Captura diana: 150 ul de MP (despues de la resuspension a 15 mL en solucion reguladora de ensayo + NaCl 400 mM) se adicionan a cada pozo. La mezcla se incubo en JitterBug, 5 a temperatura ambiente durante 1 hr.

Lavado y Deteccion: La placa se coloca en un iman y el sobrenadante se elimina despues de asegurarse de que todas las MP sean capturadas por el iman. 250 ul de solucion reguladora de lavado se adicionan despues de quitar la placa del iman. La placa se coloca entonces sobre el iman y el sobrenadante se elimina despues de asegurarse de que todas las MP son capturadas por el iman. Se adicionan 20 ul de Det-Ab por pozo (Det-Ab a 500 ng/mL se diluye en solucion reguladora de ensayo + NaCl 400 mM)). La mezcla se incubo en JitterBug, 5 a temperatura ambiente durante 30 min.

Lavado y elucion: La placa se coloca en un iman y se lava tres veces con solucion reguladora de lavado. El sobrenadante se elimina despues de asegurarse que todas las MP sean capturadas por el iman y se adicionaron 250 ul de solucion reguladora de lavado. Despues de los lavados las muestras se transfieren a una nueva placa de

5

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40

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50

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96 pozos. A continuacion, la nueva placa se coloca en el iman y el sobrenadante se elimina despues de asegurarse de que todas las MPs sean capturadas por el iman. A continuacion se adicionan 250 ul de solucion reguladora de lavado despues de quitar la placa del iman. A continuacion, la placa se coloca sobre el iman y el sobrenadante se elimina despues de asegurarse de que todas las MP sean capturadas por el iman. A continuacion se adicionan 20 ul de solucion reguladora de elucion y la mezcla se incuba en JitterBug, 5 a temperature ambiente durante 30 min.

Las MP se filtran y transfieren a la placa de 384 pozos: El estandar y las muestras se transfieren a una placa de filtro de 384 pozos colocada en la parte superior de una placa de ensayo de 384 pozos. A continuacion, la placa se centrifugo a temperatura ambiente a 3000 rpm con un rotor de placa. La placa del filtro se retira y se adicionan los calibradores apropiados. La placa se cubre y esta lista para ser analizada en SMD.

SMD: Una alfcuota se bombea en el analizador. Los anticuerpos marcados individualmente se miden durante el flujo capilar definiendo el volumen de interrogacion de tal manera que se detecta la emision de solamente 1 molecula fluorescente en un espacio definido siguiendo la excitacion con laser. Donde cada senal representa un evento digital, esta configuracion permite sensibilidades analfticas extremadamente altas. La senal fluorescente total se determina como una suma de los eventos digitales individuales. Cada molecula de contado es un punto de datos positiva con cientos de miles de DMC eventos/muestra. El lfmite de deteccion del ensayo de cTnl de la invencion se determina por el metodo de la media +3 SD.

Ejemplo 3. Rango de concentracion de cTnl en una poblacion de sujetos no enfermos normales.

Se establecio un rango de referencia o rango normal para las concentraciones de cTnl en suero humano utilizando muestras de suero de 88 sujetos aparentemente sanos (no enfermos). Se llevo a cabo un inmunoensayo de tipo sandwich como se describe en el Ejemplo 1 y se conto el numero de senales o eventos como se describio anteriormente usando el sistema de analisis de una partfcula unica de la invencion. La concentracion de troponina I en suero se determino mediante la correlacion de las senales detectadas por el analizador con la curva estandar como se describe anteriormente. Todos los ensayos se realizaron por cuadruplicado.

De acuerdo con las recomendaciones del actual European and American Cardiology Societies (ESC/ACC), los ensayos de troponina deben cuantificar con precision el percentil 99° de los valores normales con una imprecision de ensayo (CV) de menos de 10%, con el fin de distinguir de forma fiable entre pacientes con ACS y los pacientes sin cardiopatfa isquemica y la estratificacion del riesgo de eventos cardiacos adversos. El ensayo mostro que el umbral biologico (concentracion de corte) para la Tnl esta a una concentracion de Tnl de 7og/mL, que se establece en el percentil 99° con un CV correspondiente del 10% (Figura 5). Un nivel de CV de 10% de los puntos del perfil de precision a una concentracion de TnI de 4 y 12 pg/mL.

Ademas, el ensayo se correlaciona bien con las mediciones del estandar de troponina I, proporcionadas por el Instituto Nacional de Estandares y Tecnologfa (Figura 6).

El ensayo de la invencion es suficientemente sensible y preciso para cumplir los requisitos de ESC/ACC, y es el ensayo mas sensible para la troponina I cardiaca en comparacion con ensayos tales como los descritos por Koerintervalo et al.(Ann Clin Biochem, 42:19-23 (2005). El ensayo de la invencion tiene una sensibilidad 10-20 veces mayor que el de los ensayos disponibles en la actualidad, que ha determinado que el rango de umbral biologico es 111 a 333 pg/mL de cTnI.

Ejemplo 4. Deteccion de la pronta liberacion de TnI en la circulacion de los pacientes con infarto agudo del miocardio (AMI)

Estudio 1: Se obtuvieron 47 muestras en serie de 18 pacientes que se presentaban dolor toracico en el servicio de urgencias (ED). Estos pacientes todos ternan los EKG elevado sin-ST, y se diagnosticaron con AMI. La concentracion de cTnI en las muestras iniciales de los 18 pacientes se determino de acuerdo con un ensayo comercial en el momento de la admision a la sala de emergencias que era <350 pg/mL (10% punto de corte), y 12 fueron <100 pg/mL de percentil (99 %). Estas muestras fueron analizadas en posteriormente con el mismo ensayo comercial, y se determinaron como prueba positiva para cTnI. Las mismas muestras de suero tambien se analizaron para TnI de acuerdo con el ensayo de la invencion como se describe en los Ejemplos 1 y 3, y los resultados se compararon con los resultados obtenidos usando el ensayo comercial.

Se extrajo sangre por primera vez en el momento en el que el paciente se presenta con dolor toracico (muestra 1), y, posteriormente, a intervalos entre 4-8 horas (la muestra 2 a las 12 horas; la muestra 3 a las 16 horas; la muestra 4 a 24 horas; la muestra 5 a 30 horas; la muestra 6 a las 36 horas; la muestra 7 a 42 horas, y la muestra 8 a las 48 horas). El suero se analizo por los metodos de la invencion y por un metodo comercial actual, y los resultados obtenidos se muestran en la figura 7. El analizador de la invencion detecta TnI en el momento que el paciente se presento con dolor toracico (muestra 1), mientras que el ensayo comercial primero detecta cTnI en un momento muy posterior (la muestra 6 a las 36 horas). La concentracion de TnI en la muestra 3 excede el nivel de umbral biologico que se establecio usando el analizador de la invencion (7 pg/mL, vease la figura 5), e indico que la muestra 3 es positiva para TnI para sugerir la incidencia de un evento cardiaco. El umbral biologico para el ensayo comercial se

encuentra entre 111 y 333 pg/mL de Tnl. En consecuencia, la muestra 3 no habna sido considerada para indicar un posible evento cardiaco.

Ademas, los metodos de la presente invencion permiten el diagnostico y posible intervencion mucho antes, basandose en los niveles de troponina cardiaca, como se evidencia por los resultados para la primera muestra 5 tomada de los pacientes. En los 3 casos que teman valores iniciales, del ensayo comercial de cTnl entre 100 y 350 ng/mL, todos fueron positivos para cTnl por los metodos analfticos de la invencion (i.e., cTnl sobre 7 pg/mL). En los 12 casos que teman valores de cTnl comerciales iniciales de menos de 100 pg/mL, se determino que 5 eran positivos para un evento cardiovascular de acuerdo con el ensayo de la invencion (i.e., cTnl sobre 7 pg/mL). El uso prospectivo del ensayo de la invencion habna detectado 53% mas de casos de AMI, que el ensayo comercial actual 10 cuando la muestra de admision se evaluo.

Estudio 2: 50 muestras de suero adicionales, que dieron negativas de acuerdo con el ensayo comercial, se ensayaron usando el analizador y el ensayo de la invencion. Los resultados se muestran en la figura 8. De las 50 muestras, 36 estaban dentro del 99 % y se determino que dentro del rango normal establecido por el ensayo de la invencion. Sin embargo, se determino que las 14 muestras restantes que estaban dentro del rango comercial 15 "normal" o no enfermo, probado por encima del umbral biologico establecido por la invencion.

Por lo tanto, el ensayo de cTnl de alta sensibilidad de la invencion permite la deteccion de dano miocardico en pacientes cuando los niveles sericos de cTnl estan por debajo de los valores de umbral por la tecnologfa disponible en el mercado. El uso del ensayo de cTnl altamente sensible y precisa de la invencion permite la deteccion de AMl antes que con los ensayos de cTnl existentes, y de ese modo provee la oportunidad de diagnostico apropiado e 20 intervencion medica temprana para mejorar el resultado.

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Reivindicaciones

1. Un metodo para determinar la presencia o ausencia de una unica molecula de troponina, o un fragmento o complejo de la misma, en una muestra, que comprende:

i) marcar dicha molecula, fragmento o complejo con una etiqueta que comprende una unidad estructural fluorescente; y

ii) detectar la presencia o ausencia de dicha etiqueta haciendo pasar dicha etiqueta a traves de una unica molecula de deteccion, en donde la deteccion de la presencia de dicha etiqueta indica la presencia de dicha unica molecula, fragmento o complejo de troponina en dicha muestra; y

en donde dicha deteccion es capaz de detectar dicha unica molecula de troponina en un lfmite de deteccion de menos 3 pg/mL con un coeficiente de variacion (CV) de 10% o menos.
2. El metodo de la reivindicacion 1, en donde la troponina es una isoforma cardiaca de la troponina.
3. El metodo de la reivindicacion 1, en donde dicha etiqueta comprende ademas un asociado de union para dicha molecula, fragmento o complejo de troponina.
4. El metodo de la reivindicacion 3, en donde dicho asociado de union comprende un anticuerpo espedfico para dicha molecula, fragmento o complejo de troponina.
5. El metodo de la reivindicacion 1 que comprende ademas la captura de dicha troponina, fragmento o complejo sobre un soporte solido.
6. El metodo de la reivindicacion 2, en donde la isoforma cardiaca de la troponina es la troponina I cardiaca (cTnl).
7. Un metodo para detectar el dano cardfaco en un individuo que comprende

(i) determinar una concentracion de troponina cardiaca, fragmento o complejo en una muestra o determinar la concentracion o la troponina cardiaca en una serie de muestras de dicho individuo, en donde dicha concentracion se determina por un ensayo de troponina cardiaca con un lfmite de deteccion para dicha troponina cardiaca en dicha muestra de menos de 3 pg/mL con un coeficiente de variacion (CV) de 10% o menos; y

(ii) detectar dano cardfaco en dicho individuo, con base en dicha concentracion en dicha muestra, o en dichas concentraciones en dichas series de muestras.
8. El metodo de la reivindicacion 7, en donde la etapa (ii) comprende un analisis seleccionado del grupo que consiste en comparar dicha concentracion o serie de concentraciones con un valor normal para dicha concentracion, comparar dichas concentraciones o serie de concentraciones con un nivel de umbral predeterminado, comparar dicha concentracion o serie de concentraciones con un valor de referencia, y determinar una velocidad de cambio de la concentracion de dicha serie de concentraciones.
9. El metodo de la reivindicacion 8, en donde la etapa (ii) comprende comparar dicha concentracion de troponina en dicha muestra con una concentracion umbral predeterminada, y detectar dano cardfaco si la concentracion de la muestra es mayor que el nivel umbral.
10. El metodo de la reivindicacion 7, en donde dicha concentracion o serie de concentraciones se determina en o cerca al momento en el que el individuo se presenta a un profesional de la salud con uno o mas smtomas indicativos de isquemia del miocardio o infarto o la posibilidad del mismo.
11. El metodo de la reivindicacion 7 que comprende marcar dicha troponina, fragmento, o un complejo con una etiqueta que comprende una unidad estructural fluorescente.
12. El metodo de la reivindicacion 7, en donde la etapa (i) comprende ademas la evaluacion de un indicador no troponina para dicho individuo, y la etapa (ii) comprende la deteccion de dano cardfaco en dicho individuo, basado en dicha concentracion de troponina y una evaluacion de dicho indicador de no-troponina en dicha muestra, o de dichas concentraciones en dichas series de muestras.
13. El metodo de la reivindicacion 12, en donde dicho otro indicador es un indicador clmico de la isquemia del miocardio o infarto.