JP3249954B2 - 蛍光免疫分析方法及び装置 - Google Patents
蛍光免疫分析方法及び装置Info
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
- G01N21/648—Specially adapted constructive features of fluorimeters using evanescent coupling or surface plasmon coupling for the excitation of fluorescence
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
- G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
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- G—PHYSICS
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- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
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- G01N21/03—Cuvette constructions
- G01N21/05—Flow-through cuvettes
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、プラズモン共鳴による
二光子又はそれ以上の多光子励起を利用して抗原濃度を
定量する蛍光免疫分析方法及び装置に関する。
二光子又はそれ以上の多光子励起を利用して抗原濃度を
定量する蛍光免疫分析方法及び装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】免疫分析では、ある抗原に対して特異的
に結合する抗体を用い、試料内に存在しているごく微量
の抗原を高感度で分析している。従来から種々の免疫分
析法が知られているが、なかでも分析時間が短く高感度
で且つ廃液処理の困難な放射性物質を使用しない蛍光免
疫分析法が注目されている。蛍光免疫分析法では、蛍光
試薬を標識した抗体を用い、通常の光照射で溶液試料中
の抗原と結合した抗体が発する蛍光強度を測定し、測定
値から抗原濃度を定量している。
に結合する抗体を用い、試料内に存在しているごく微量
の抗原を高感度で分析している。従来から種々の免疫分
析法が知られているが、なかでも分析時間が短く高感度
で且つ廃液処理の困難な放射性物質を使用しない蛍光免
疫分析法が注目されている。蛍光免疫分析法では、蛍光
試薬を標識した抗体を用い、通常の光照射で溶液試料中
の抗原と結合した抗体が発する蛍光強度を測定し、測定
値から抗原濃度を定量している。
【０００３】また、簡便性や安定性に有利な表面プラズ
モン共鳴を利用する免疫分析法も採用されている。表面
プラズモン共鳴は、金属薄膜を蒸着した三角形ガラスプ
リズムに光を入射させると、共鳴角θR で反射光強度が
著しく低下する現象である。共鳴角θR は、金属薄膜の
表面に予め結合・固定化した抗体が溶液試料中の抗原に
結合することにより変化する。そこで、反射光強度が極
小になったときの共鳴角θR を測定することにより、抗
体と抗原との結合割合、ひいては抗原を分析する。蛍光
免疫分析法及び表面プラズモン共鳴を利用した免疫分析
法は、このような長所を活用して生化学分析，臨床分析
等の分野に応用されている。
モン共鳴を利用する免疫分析法も採用されている。表面
プラズモン共鳴は、金属薄膜を蒸着した三角形ガラスプ
リズムに光を入射させると、共鳴角θR で反射光強度が
著しく低下する現象である。共鳴角θR は、金属薄膜の
表面に予め結合・固定化した抗体が溶液試料中の抗原に
結合することにより変化する。そこで、反射光強度が極
小になったときの共鳴角θR を測定することにより、抗
体と抗原との結合割合、ひいては抗原を分析する。蛍光
免疫分析法及び表面プラズモン共鳴を利用した免疫分析
法は、このような長所を活用して生化学分析，臨床分析
等の分野に応用されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従来の蛍光免疫分析で
は、抗原と結合した蛍光標識抗体を励起する励起光によ
り、系内に存在する血清蛋白，酵素等の妨害物質が同時
に励起される。励起された妨害物質は、強い背景光を発
する蛍光発生源となり、測定感度を低下させる。妨害物
質の励起に起因する誤差要因は、蛍光標識試薬と妨害物
質の偏光特性の差を利用する方法，妨害物質に比較して
蛍光寿命が長い希土類系標識系抗体を用いる時間分解蛍
光分析法である程度解消される。しかし、感度の向上は
すでに限界に達しており、新規な蛍光標識試薬の開発に
よる感度の向上が困難な現状である。
は、抗原と結合した蛍光標識抗体を励起する励起光によ
り、系内に存在する血清蛋白，酵素等の妨害物質が同時
に励起される。励起された妨害物質は、強い背景光を発
する蛍光発生源となり、測定感度を低下させる。妨害物
質の励起に起因する誤差要因は、蛍光標識試薬と妨害物
質の偏光特性の差を利用する方法，妨害物質に比較して
蛍光寿命が長い希土類系標識系抗体を用いる時間分解蛍
光分析法である程度解消される。しかし、感度の向上は
すでに限界に達しており、新規な蛍光標識試薬の開発に
よる感度の向上が困難な現状である。
【０００５】そこで、既存の蛍光標識試薬を用いながら
更なる高感度分析を可能にする分光技術として、二光子
励起が考えられている（"p-Bis(o-methylstyryl)benzen
e asa Power-Squared Sensor for Two-Photon Absorpti
on Measurements between 537 and 694nm", S.M.Kenned
y and F.E. Lytle Anal. Chem., 1986, 58 2643-2647
，"Two-Photon induced fluorescence of biological
markers based on optic al fibers" A.Lago, A.T.Obei
dat, A.E.Kaplan, J.B.Khurgin, and P.L.Shkolnikov,
Opt.Lett.,1995, 20, 2054-2056等参照）。通常の一光
子励起では、蛍光標識試薬の電子の遷移エネルギに対応
する波長の光子を蛍光標識試薬が吸収することにより励
起状態を生起させる。他方、二光子励起では、蛍光標識
試薬が通常吸収する光の倍の波長をもつ二つの低エネル
ギ光子を同時に吸収させることにより一光子励起と同じ
励起状態が生成する。したがって、励起光の電場が強
く、局在化している個所が選択的に励起されるため、妨
害物質に起因する背景光の影響を大幅に低下させること
が可能になる。しかし、二光子励起の吸収断面積は、一
光子励起に比較して数十桁も小さい。その結果、蛍光標
識試薬を直接光照射して励起させる上では、極めて高価
な超短パルス光源の使用を余儀なくされる。そこで、二
光子励起の効率を格段に向上させ、蛍光免疫分析への応
用を可能にする手法が求められている。
更なる高感度分析を可能にする分光技術として、二光子
励起が考えられている（"p-Bis(o-methylstyryl)benzen
e asa Power-Squared Sensor for Two-Photon Absorpti
on Measurements between 537 and 694nm", S.M.Kenned
y and F.E. Lytle Anal. Chem., 1986, 58 2643-2647
，"Two-Photon induced fluorescence of biological
markers based on optic al fibers" A.Lago, A.T.Obei
dat, A.E.Kaplan, J.B.Khurgin, and P.L.Shkolnikov,
Opt.Lett.,1995, 20, 2054-2056等参照）。通常の一光
子励起では、蛍光標識試薬の電子の遷移エネルギに対応
する波長の光子を蛍光標識試薬が吸収することにより励
起状態を生起させる。他方、二光子励起では、蛍光標識
試薬が通常吸収する光の倍の波長をもつ二つの低エネル
ギ光子を同時に吸収させることにより一光子励起と同じ
励起状態が生成する。したがって、励起光の電場が強
く、局在化している個所が選択的に励起されるため、妨
害物質に起因する背景光の影響を大幅に低下させること
が可能になる。しかし、二光子励起の吸収断面積は、一
光子励起に比較して数十桁も小さい。その結果、蛍光標
識試薬を直接光照射して励起させる上では、極めて高価
な超短パルス光源の使用を余儀なくされる。そこで、二
光子励起の効率を格段に向上させ、蛍光免疫分析への応
用を可能にする手法が求められている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、このような要
求に応えるべく開発されたものであり、表面プラズモン
共鳴の電場増強効果及び電場局在化効果を利用して二光
子励起の確立を高くすることにより、励起効率を飛躍的
に向上させ、妨害物質に起因する背景光の影響を抑制
し、抗原濃度を高感度で定量することを目的とする。
求に応えるべく開発されたものであり、表面プラズモン
共鳴の電場増強効果及び電場局在化効果を利用して二光
子励起の確立を高くすることにより、励起効率を飛躍的
に向上させ、妨害物質に起因する背景光の影響を抑制
し、抗原濃度を高感度で定量することを目的とする。
【０００７】本発明の蛍光免疫分析方法は、その目的を
達成するため、抗体が固定された金属薄膜をもつ三角形
ガラスプリズムを回転テーブルに載置し、抗原を含む試
料溶液を三角形ガラスプリズムの金属薄膜側に供給して
抗原を抗体に結合させ、更に蛍光標識抗体を含む蛍光標
識試薬を供給して抗原に結合している抗体に蛍光標識抗
体を結合させた後、蛍光標識抗体が通常吸収する光の整
数倍の波長をもつ光を三角形ガラスプリズムのプリズム
側から同時入射させて蛍光標識抗体を二光子励起又は多
光子励起させ、反射率が最も小さくなる入射角で三角形
ガラスプリズムのプリズム側に入射したときに発生する
蛍光をスペクトル分析することを特徴とする。
達成するため、抗体が固定された金属薄膜をもつ三角形
ガラスプリズムを回転テーブルに載置し、抗原を含む試
料溶液を三角形ガラスプリズムの金属薄膜側に供給して
抗原を抗体に結合させ、更に蛍光標識抗体を含む蛍光標
識試薬を供給して抗原に結合している抗体に蛍光標識抗
体を結合させた後、蛍光標識抗体が通常吸収する光の整
数倍の波長をもつ光を三角形ガラスプリズムのプリズム
側から同時入射させて蛍光標識抗体を二光子励起又は多
光子励起させ、反射率が最も小さくなる入射角で三角形
ガラスプリズムのプリズム側に入射したときに発生する
蛍光をスペクトル分析することを特徴とする。
【０００８】この方法で使用する装置は、抗体が固定さ
れた金属薄膜を一面にもつ三角形ガラスプリズムと、該
三角形ガラスプリズムが載置される回転テーブルと、抗
原を含む試料溶液及び該抗原に対する蛍光標識抗体を含
む蛍光標識試薬を前記金属薄膜側に供給するフローセル
と、蛍光標識抗体が通常吸収する光の整数倍の波長をも
つ光を三角形ガラスプリズムのプリズム側から同時入射
させる励起光源と、前記抗体に結合した抗原に更に結合
した蛍光標識抗体が二光子励起又は多光子励起されたと
きに発する蛍光を分光分析する光検出器とを備えてい
る。
れた金属薄膜を一面にもつ三角形ガラスプリズムと、該
三角形ガラスプリズムが載置される回転テーブルと、抗
原を含む試料溶液及び該抗原に対する蛍光標識抗体を含
む蛍光標識試薬を前記金属薄膜側に供給するフローセル
と、蛍光標識抗体が通常吸収する光の整数倍の波長をも
つ光を三角形ガラスプリズムのプリズム側から同時入射
させる励起光源と、前記抗体に結合した抗原に更に結合
した蛍光標識抗体が二光子励起又は多光子励起されたと
きに発する蛍光を分光分析する光検出器とを備えてい
る。
【０００９】
【作用】表面プラズモンは、Ａｕ，Ａｇ，Ｃｕ，Ｐｔ，
Ｎｉ，Ａｌ等の金属薄膜を蒸着した三角形ガラスプリズ
ムに、プリズム側から所定の共鳴角θR で光を入射する
とき金属薄膜表面に形成される強い局所電場である。共
鳴角θR 付近では、入射光のほとんどが表面プラズモン
に変換される。表面プラズモンの電場が入射光とほぼ同
様な性質をもつため、電場中に置かれた蛍光標識試薬
は、直接光の吸収で励起する従来法と同様に励起され、
蛍光を発する。表面プラズモンによる励起は、電場増強
効果を呈することが最大の特徴である。すなわち、表面
プラズモンの電場強度が入射光の電場強度よりも増強さ
れ、特に近赤外領域では数百倍に達する。この電場増強
効果により、光を表面プラズモンに一旦変換すると、同
じ光源を用いた直接光励起に比較して極めて高い電場強
度が得られ、従来の直接光励起では困難であった二光子
励起が可能になる。
Ｎｉ，Ａｌ等の金属薄膜を蒸着した三角形ガラスプリズ
ムに、プリズム側から所定の共鳴角θR で光を入射する
とき金属薄膜表面に形成される強い局所電場である。共
鳴角θR 付近では、入射光のほとんどが表面プラズモン
に変換される。表面プラズモンの電場が入射光とほぼ同
様な性質をもつため、電場中に置かれた蛍光標識試薬
は、直接光の吸収で励起する従来法と同様に励起され、
蛍光を発する。表面プラズモンによる励起は、電場増強
効果を呈することが最大の特徴である。すなわち、表面
プラズモンの電場強度が入射光の電場強度よりも増強さ
れ、特に近赤外領域では数百倍に達する。この電場増強
効果により、光を表面プラズモンに一旦変換すると、同
じ光源を用いた直接光励起に比較して極めて高い電場強
度が得られ、従来の直接光励起では困難であった二光子
励起が可能になる。
【００１０】しかも、表面プラズモンの電場は、金属表
面に強く局在しており、金属表面からの距離に応じて指
数関数的に減衰する。この強度分布のため、金属表面以
外に存在する妨害物質が励起されず、誤差要因となる背
景光が排除される。したがって、表面プラズモン共鳴を
蛍光免疫分析に応用すると、金属表面に吸着固定されて
いる蛍光標識抗体のみが選択的に且つ高効率で励起さ
れ、妨害物質の影響が最少限に抑制される。更に、表面
プラズモンの電場がｐ−偏光としての特性をもつことか
ら、蛍光の偏光特性の差を利用して背景光を低減するこ
とも可能である。このように、表面プラズモンは、蛍光
免疫分析用の励起源として理想的な長所をもつ。しか
も、電場増強効果及び電場局在化効果を呈する表面プラ
ズモン共鳴と二光子励起又は多光子励起を組み合わせる
とき、一層大きな効果が得られる。すなわち、二光子励
起の吸収断面積は１０-48 〜１０-50 と極端に小さいた
め、超短パルスレーザ等による極めて高強度の励起光を
照射しなければ通常励起できない。他方、たとえば近赤
外光領域における表面プラズモン共鳴により誘導される
電場の強度は入射光の数百倍に達する。このような電場
強度が吸収断面積に重畳されると二桁以上も大きな遷移
確率での励起が可能になり、妨害物質に起因する背景光
の影響が排除される二光子又は多光子励起の長所が発揮
される。抗体の励起には二光子励起が最も好ましいが、
三光子励起以上の多光子励起によっても同様に背景光を
低減し高感度で蛍光を検出することが可能である。三光
子以上の励起においては、二光子励起よりも更に長波長
の光を用いて励起する。通常の直接光照射では、二光子
励起に比較して吸収断面積が更に小さくなるため励起が
極めて困難である。ここに、光源の波長が長波長化する
ほど電場強度が大きくなる表面プラズモン共鳴を加える
と、二光子励起よりも更に大きな遷移確率の増大効果が
得られる。
面に強く局在しており、金属表面からの距離に応じて指
数関数的に減衰する。この強度分布のため、金属表面以
外に存在する妨害物質が励起されず、誤差要因となる背
景光が排除される。したがって、表面プラズモン共鳴を
蛍光免疫分析に応用すると、金属表面に吸着固定されて
いる蛍光標識抗体のみが選択的に且つ高効率で励起さ
れ、妨害物質の影響が最少限に抑制される。更に、表面
プラズモンの電場がｐ−偏光としての特性をもつことか
ら、蛍光の偏光特性の差を利用して背景光を低減するこ
とも可能である。このように、表面プラズモンは、蛍光
免疫分析用の励起源として理想的な長所をもつ。しか
も、電場増強効果及び電場局在化効果を呈する表面プラ
ズモン共鳴と二光子励起又は多光子励起を組み合わせる
とき、一層大きな効果が得られる。すなわち、二光子励
起の吸収断面積は１０-48 〜１０-50 と極端に小さいた
め、超短パルスレーザ等による極めて高強度の励起光を
照射しなければ通常励起できない。他方、たとえば近赤
外光領域における表面プラズモン共鳴により誘導される
電場の強度は入射光の数百倍に達する。このような電場
強度が吸収断面積に重畳されると二桁以上も大きな遷移
確率での励起が可能になり、妨害物質に起因する背景光
の影響が排除される二光子又は多光子励起の長所が発揮
される。抗体の励起には二光子励起が最も好ましいが、
三光子励起以上の多光子励起によっても同様に背景光を
低減し高感度で蛍光を検出することが可能である。三光
子以上の励起においては、二光子励起よりも更に長波長
の光を用いて励起する。通常の直接光照射では、二光子
励起に比較して吸収断面積が更に小さくなるため励起が
極めて困難である。ここに、光源の波長が長波長化する
ほど電場強度が大きくなる表面プラズモン共鳴を加える
と、二光子励起よりも更に大きな遷移確率の増大効果が
得られる。
【００１１】
【実施の形態】本発明に従った蛍光免疫分析装置は、た
とえば図１に示すように三角形ガラスプリズム１０を回
転テーブル１に載置している。三角形ガラスプリズム１
０の一面には抗体を固定化した金属薄膜１１が設けられ
ており、試料溶液が金属薄膜１１に接触しながら流れる
ようにフローパイプ１２及びフローセル１３で流路を構
成する。フローパイプ１２に替えて固定セルを使用する
ことも勿論可能である。金属薄膜１１は、三角形ガラス
プリズム１０の一面に直接形成し、或いは金属薄膜１１
を形成したガラス基板１７（図３）を三角形ガラスプリ
ズム１０に貼り合せることにより設けられる。金属薄膜
１１が設けられる三角形ガラスプリズム１０又はガラス
基板１７としては、近紫外線又は近赤外線の透過率が高
い高屈折率である限り材質に制約を受けるものではな
く、光学用ガラスＢＫ−７，ＬａＳＦ−Ｎ３０，ＳＦ−
１０（ドイツＳｃｈｏｔｔ社製）等が使用される。金属
薄膜１１としては、Ａｕ，Ａｇ，Ｃｕ，Ｐｔ，Ｎｉ，Ａ
ｌ等が使用可能である。
とえば図１に示すように三角形ガラスプリズム１０を回
転テーブル１に載置している。三角形ガラスプリズム１
０の一面には抗体を固定化した金属薄膜１１が設けられ
ており、試料溶液が金属薄膜１１に接触しながら流れる
ようにフローパイプ１２及びフローセル１３で流路を構
成する。フローパイプ１２に替えて固定セルを使用する
ことも勿論可能である。金属薄膜１１は、三角形ガラス
プリズム１０の一面に直接形成し、或いは金属薄膜１１
を形成したガラス基板１７（図３）を三角形ガラスプリ
ズム１０に貼り合せることにより設けられる。金属薄膜
１１が設けられる三角形ガラスプリズム１０又はガラス
基板１７としては、近紫外線又は近赤外線の透過率が高
い高屈折率である限り材質に制約を受けるものではな
く、光学用ガラスＢＫ−７，ＬａＳＦ−Ｎ３０，ＳＦ−
１０（ドイツＳｃｈｏｔｔ社製）等が使用される。金属
薄膜１１としては、Ａｕ，Ａｇ，Ｃｕ，Ｐｔ，Ｎｉ，Ａ
ｌ等が使用可能である。
【００１２】フローパイプ１２及びフローセル１３に
は、試料溶液と反応せず透明度の高いアクリル樹脂が好
適に使用される。フローパイプ１２は、図２に示すよう
にフローセル１３に挿し込まれ、同質の三角形ガラスプ
リズム１０とガラス板１４との間に挟持され、樹脂接着
剤を用いて全体が圧着Ｐされる。フローパイプ１２は一
部が開放されており、試料溶液が金属薄膜１１に接する
接液部１５となる。励起光源２としては、図１では二光
子発生源として半導体レーザ誘起ピコ秒Ｎｄ−ＹＡＧレ
ーザ（波長５３２ｎｍ，パルス幅８００ピコ秒，エネル
ギ１μＪ）を図示しているが、これに拘束されることな
く、対象となる蛍光標識試薬に応じた波長をもつレーザ
が適宜選択される。
は、試料溶液と反応せず透明度の高いアクリル樹脂が好
適に使用される。フローパイプ１２は、図２に示すよう
にフローセル１３に挿し込まれ、同質の三角形ガラスプ
リズム１０とガラス板１４との間に挟持され、樹脂接着
剤を用いて全体が圧着Ｐされる。フローパイプ１２は一
部が開放されており、試料溶液が金属薄膜１１に接する
接液部１５となる。励起光源２としては、図１では二光
子発生源として半導体レーザ誘起ピコ秒Ｎｄ−ＹＡＧレ
ーザ（波長５３２ｎｍ，パルス幅８００ピコ秒，エネル
ギ１μＪ）を図示しているが、これに拘束されることな
く、対象となる蛍光標識試薬に応じた波長をもつレーザ
が適宜選択される。
【００１３】励起光源２から出射されたレーザ光は、ビ
ームスプリッタ３ａで透過光及び反射光に分割される。
透過光は、更にビームスプリッタ３ｂで透過光及び反射
光に分割され、透過光が三角形ガラスプリズム１０のプ
リズム面に導かれる。プリズム側から三角形ガラスプリ
ズム１０に入射した透過光は、屈折して金属薄膜１１に
投影され、金属薄膜１１で反射した後、三角形ガラスプ
リズム１０の他のプリズム面から出射される。三角形ガ
ラスプリズム１０に対する入射角は、回転テーブル1 の
回転角度を調整することにより設定・変更される。
ームスプリッタ３ａで透過光及び反射光に分割される。
透過光は、更にビームスプリッタ３ｂで透過光及び反射
光に分割され、透過光が三角形ガラスプリズム１０のプ
リズム面に導かれる。プリズム側から三角形ガラスプリ
ズム１０に入射した透過光は、屈折して金属薄膜１１に
投影され、金属薄膜１１で反射した後、三角形ガラスプ
リズム１０の他のプリズム面から出射される。三角形ガ
ラスプリズム１０に対する入射角は、回転テーブル1 の
回転角度を調整することにより設定・変更される。
【００１４】三角形ガラスプリズム１０から出射された
光を光検出器４ａで検出し、反射光強度Ｉを測定する。
また、ビームスプリッタ３ｂで分割された反射光を光検
出器４ｂで検出し、入射光強度Ｉ0 を測定する。反射光
強度Ｉ及び入射光強度Ｉ0 は、それぞれ光検出器４ａ及
び光検出器４ｂからＩ／Ｉ0 回路５に出力される。Ｉ／
Ｉ0 回路５で反射率Ｉ／Ｉ0 が求められ、コンピュータ
６に出力され記録される。三角形ガラスプリズム１０を
載せた回転テーブル１を回転させながら反射率Ｉ／Ｉ0
の測定するとき、反射率Ｉ／Ｉ0 が最小になる入射角、
すなわち共鳴角θR が求められる。
光を光検出器４ａで検出し、反射光強度Ｉを測定する。
また、ビームスプリッタ３ｂで分割された反射光を光検
出器４ｂで検出し、入射光強度Ｉ0 を測定する。反射光
強度Ｉ及び入射光強度Ｉ0 は、それぞれ光検出器４ａ及
び光検出器４ｂからＩ／Ｉ0 回路５に出力される。Ｉ／
Ｉ0 回路５で反射率Ｉ／Ｉ0 が求められ、コンピュータ
６に出力され記録される。三角形ガラスプリズム１０を
載せた回転テーブル１を回転させながら反射率Ｉ／Ｉ0
の測定するとき、反射率Ｉ／Ｉ0 が最小になる入射角、
すなわち共鳴角θR が求められる。
【００１５】ビームスプリッタ３ａからの反射光は、光
検出器４ｃに入力され、光検出器４ｄのゲート開閉に利
用される。光検出器４ａ〜４ｃには、たとえばＰＩＮフ
ォトダイオードが使用される。光検出器４ｄには、たと
えばイメージを増強する機能をもつゲート付きＣＣＤ分
光検出器が使用される。金属薄膜１１に固定されている
抗体は、フローパイプ１２から注入された試料溶液中の
抗原と結合する。抗体に結合した抗原に更に蛍光標識抗
体を結合させる。蛍光標識抗体は、三角形ガラスプリズ
ム１０に入射した光で励起され、蛍光ＦＬを発する。
検出器４ｃに入力され、光検出器４ｄのゲート開閉に利
用される。光検出器４ａ〜４ｃには、たとえばＰＩＮフ
ォトダイオードが使用される。光検出器４ｄには、たと
えばイメージを増強する機能をもつゲート付きＣＣＤ分
光検出器が使用される。金属薄膜１１に固定されている
抗体は、フローパイプ１２から注入された試料溶液中の
抗原と結合する。抗体に結合した抗原に更に蛍光標識抗
体を結合させる。蛍光標識抗体は、三角形ガラスプリズ
ム１０に入射した光で励起され、蛍光ＦＬを発する。
【００１６】蛍光標識抗体を含む試薬としては、近紫外
又は近赤外に吸収をもつ限り多数の有機蛍光標識試薬や
希土類蛍光標識試薬が使用される。希土類蛍光標識試薬
には、Ｅｕ，Ｔｂ，Ｙｂ，Ｓｍ，Ｔｍ，Ｎｄ，Ｅｒ，Ｈ
ｏ，Ｐｒ，Ｇｄ等の希土類イオンを含む試薬がある。発
光寿命の短い通常の有機系蛍光標識試薬を使用する場
合、レーザ照射直後に光検出器４ｄのゲートを開けて蛍
光ＦＬを検出するように、光検出器４ｃからゲートパル
サ７に検知信号を送り、ゲートパルサ７から光検出器４
ｄにゲート開閉信号を出力する。これにより、金属薄膜
１１から発せられた蛍光ＦＬが分光器８を透過して光検
出器４ｄで検出される。発生した蛍光ＦＬは、抗体の選
択励起によるものであり、二光子励起により背景光が抑
えられている。発光寿命が極めて長い希土類系標識試薬
を使用する場合、数百ナノ秒が経過した後で光検出器４
ｄのゲートを開き、金属薄膜１１からの蛍光ＦＬを検出
する。ゲート開放のタイミングをこのように調整すると
き、妨害物質に起因する背景光が大幅に低下し、蛍光Ｆ
Ｌが一層高感度で測定される。
又は近赤外に吸収をもつ限り多数の有機蛍光標識試薬や
希土類蛍光標識試薬が使用される。希土類蛍光標識試薬
には、Ｅｕ，Ｔｂ，Ｙｂ，Ｓｍ，Ｔｍ，Ｎｄ，Ｅｒ，Ｈ
ｏ，Ｐｒ，Ｇｄ等の希土類イオンを含む試薬がある。発
光寿命の短い通常の有機系蛍光標識試薬を使用する場
合、レーザ照射直後に光検出器４ｄのゲートを開けて蛍
光ＦＬを検出するように、光検出器４ｃからゲートパル
サ７に検知信号を送り、ゲートパルサ７から光検出器４
ｄにゲート開閉信号を出力する。これにより、金属薄膜
１１から発せられた蛍光ＦＬが分光器８を透過して光検
出器４ｄで検出される。発生した蛍光ＦＬは、抗体の選
択励起によるものであり、二光子励起により背景光が抑
えられている。発光寿命が極めて長い希土類系標識試薬
を使用する場合、数百ナノ秒が経過した後で光検出器４
ｄのゲートを開き、金属薄膜１１からの蛍光ＦＬを検出
する。ゲート開放のタイミングをこのように調整すると
き、妨害物質に起因する背景光が大幅に低下し、蛍光Ｆ
Ｌが一層高感度で測定される。
【００１７】
【実施例】抗体が固定された金属薄膜１１を次の手順で
ガラス基板１７上に設けた。図３に示すように、ガラス
基板１７上にＡｕを蒸着して金属薄膜１１を形成した
後、γ−アミノプロピルトリエトキシシランの２％アセ
トン溶液に浸漬し、メタノール及び蒸留水で洗浄した。
次いで、グルタールアルデヒドの５％水溶液にガラス基
板１７を３時間浸漬し、蒸留水で洗浄することにより、
抗体固定用の有機層２１を金属薄膜１１の上に形成し
た。次いで、血清中の代表的な腫瘍マーカーであるα−
フェトプロテイン（ＡＦＰ）に対する抗体を含む燐酸緩
衝溶液にガラス基板１７を１６時間浸漬し、抗ＡＦＰ抗
体２２を有機層２１に結合させた。更に、抗ＡＦＰ抗体
２２が関与しない非特異的な吸着を防止するため、有機
層２１の活性部位を０．１Ｍエタノールアミン水溶液及
び血清アルブミン溶液でブロッキングした。
ガラス基板１７上に設けた。図３に示すように、ガラス
基板１７上にＡｕを蒸着して金属薄膜１１を形成した
後、γ−アミノプロピルトリエトキシシランの２％アセ
トン溶液に浸漬し、メタノール及び蒸留水で洗浄した。
次いで、グルタールアルデヒドの５％水溶液にガラス基
板１７を３時間浸漬し、蒸留水で洗浄することにより、
抗体固定用の有機層２１を金属薄膜１１の上に形成し
た。次いで、血清中の代表的な腫瘍マーカーであるα−
フェトプロテイン（ＡＦＰ）に対する抗体を含む燐酸緩
衝溶液にガラス基板１７を１６時間浸漬し、抗ＡＦＰ抗
体２２を有機層２１に結合させた。更に、抗ＡＦＰ抗体
２２が関与しない非特異的な吸着を防止するため、有機
層２１の活性部位を０．１Ｍエタノールアミン水溶液及
び血清アルブミン溶液でブロッキングした。
【００１８】ブロッキング層２３の形成後、ガラス基板
１７にアクリル樹脂製のフローセル１３を粘着性パッキ
ングで接着し、回転テーブル１上の三角形ガラスプリズ
ム１０にガラス基板１７のガラス側をマッチングオイル
で接着した。３００μｇ／ｍｌのＡＦＰを含むリン酸緩
衝液をフローセル１３に注入し、抗ＡＦＰ抗体２２と接
触する状態で２時間放置した後、リン酸緩衝溶液で洗浄
し、ガラス基板１７上の抗ＡＦＰ抗体２２にＡＦＰ２４
を結合させた。次いで、蛍光標識抗体として代表的な希
土類蛍光標識試薬であるN1-P-isothiosyanatobenzyl)-d
iethylenetriamine-N1, N2, N3, N3-tetraaceteic acid
europi um（ＤＴＴＡ−Ｅｕ）を１００μｇ／ｍｌ含む
燐酸緩衝溶液をフローセル１３に注入し、ＡＦＰ２４と
接触する状態で２時間放置した後、リン酸緩衝溶液で洗
浄した。これにより、ガラス基板１７上の抗ＡＦＰ抗体
２２で固定されたＡＦＰ２４にＤＴＴＡ−Ｅｕ２５を結
合させた。
１７にアクリル樹脂製のフローセル１３を粘着性パッキ
ングで接着し、回転テーブル１上の三角形ガラスプリズ
ム１０にガラス基板１７のガラス側をマッチングオイル
で接着した。３００μｇ／ｍｌのＡＦＰを含むリン酸緩
衝液をフローセル１３に注入し、抗ＡＦＰ抗体２２と接
触する状態で２時間放置した後、リン酸緩衝溶液で洗浄
し、ガラス基板１７上の抗ＡＦＰ抗体２２にＡＦＰ２４
を結合させた。次いで、蛍光標識抗体として代表的な希
土類蛍光標識試薬であるN1-P-isothiosyanatobenzyl)-d
iethylenetriamine-N1, N2, N3, N3-tetraaceteic acid
europi um（ＤＴＴＡ−Ｅｕ）を１００μｇ／ｍｌ含む
燐酸緩衝溶液をフローセル１３に注入し、ＡＦＰ２４と
接触する状態で２時間放置した後、リン酸緩衝溶液で洗
浄した。これにより、ガラス基板１７上の抗ＡＦＰ抗体
２２で固定されたＡＦＰ２４にＤＴＴＡ−Ｅｕ２５を結
合させた。
【００１９】以上の操作によって、試料溶液に含まれる
ＡＦＰ２４（抗原）の濃度に比例した量のＤＴＴＡ−Ｅ
ｕ２５（蛍光標識抗体）がガラス基板１７に固定され
た。ＡＦＰ２４（抗原）及びＤＴＴＡ−Ｅｕ２５（蛍光
標識抗体）が固定されたガラス基板１７を備えた三角形
ガラスプリズム１０を回転テーブル１上で回転させなが
ら、半導体レーザ励起Ｎｄ−ＹＡＧレーザ（励起光源
２）を用いて波長５３２ｎｍのｐ−偏光をプリズム側か
ら照射し、各入射角ごとに反射率を測定した。その結
果、入射角がほぼ７５度のときに反射率が最少になっ
た。
ＡＦＰ２４（抗原）の濃度に比例した量のＤＴＴＡ−Ｅ
ｕ２５（蛍光標識抗体）がガラス基板１７に固定され
た。ＡＦＰ２４（抗原）及びＤＴＴＡ−Ｅｕ２５（蛍光
標識抗体）が固定されたガラス基板１７を備えた三角形
ガラスプリズム１０を回転テーブル１上で回転させなが
ら、半導体レーザ励起Ｎｄ−ＹＡＧレーザ（励起光源
２）を用いて波長５３２ｎｍのｐ−偏光をプリズム側か
ら照射し、各入射角ごとに反射率を測定した。その結
果、入射角がほぼ７５度のときに反射率が最少になっ
た。
【００２０】反射率が最少になる条件下で発光スペクト
ルを測定したところ、図４に示すように３価ユウロピウ
ムイオンに特徴的な発光スペクトルが観測された。更
に、種々のＡＦＰ濃度を有する試料溶液を用いて検量線
を作成し定量したところ、ＡＦＰ濃度と発光強度との間
に密接な直線関係が成立していることが判った。このこ
とから、本発明によるとき、抗原の濃度を十分に定量で
きることが確認された。
ルを測定したところ、図４に示すように３価ユウロピウ
ムイオンに特徴的な発光スペクトルが観測された。更
に、種々のＡＦＰ濃度を有する試料溶液を用いて検量線
を作成し定量したところ、ＡＦＰ濃度と発光強度との間
に密接な直線関係が成立していることが判った。このこ
とから、本発明によるとき、抗原の濃度を十分に定量で
きることが確認された。
【００２１】
【発明の効果】以上に説明したように、本発明において
は、表面プラズモン共鳴を利用して蛍光標識抗体を二光
子励起又は多光子励起させ、このときに発生する蛍光を
スペクトル分析することにより、金属薄膜に固定した抗
体に結合している抗原を定量している。この方法による
とき、試料溶液に含まれている妨害物質が励起されず、
吸着固定されている蛍光標識抗体のみを選択的に且つ効
率よく励起させることができるため、抗原濃度を高感度
で定量できる。
は、表面プラズモン共鳴を利用して蛍光標識抗体を二光
子励起又は多光子励起させ、このときに発生する蛍光を
スペクトル分析することにより、金属薄膜に固定した抗
体に結合している抗原を定量している。この方法による
とき、試料溶液に含まれている妨害物質が励起されず、
吸着固定されている蛍光標識抗体のみを選択的に且つ効
率よく励起させることができるため、抗原濃度を高感度
で定量できる。
【図１】 表面プラズモン共鳴を利用した蛍光免疫分析
装置の概略図
装置の概略図
【図２】 抗体を固定した金属薄膜が設けられた三角形
ガラスプリズム及びフローセルを示す図
ガラスプリズム及びフローセルを示す図
【図３】 抗体を金属薄膜に固定するプロセス及び抗体
に結合した抗原の濃度を測定するプロセスの説明図
に結合した抗原の濃度を測定するプロセスの説明図
【図４】 実施例で求められた表面プラズモン励起によ
る希土類標識抗体の蛍光スペクトル
る希土類標識抗体の蛍光スペクトル
１：回転テーブル ２：励起光源 ３ａ，３ｂ：ビ
ームスプリッタ ４ａ〜４ｄ：光検出器 ５：Ｉ／
Ｉ0 回路 ６：コンピュータ ７：ゲートパルサ
８：分光器 １０：三角形ガラスプリズム １１：金属薄膜 １
２：フローパイプ １３：フローセル １４：ガラ
ス板 １５：接液部 １７：ガラス基板 ２１：有機層 ２２：抗ＡＦＰ抗体 ２３：ブロッ
キング層 ２４：ＡＦＰ（α−フェトプロテイン：抗
原） ２５：ＤＴＴＡ−Ｅｕ（蛍光標識抗体） Ｉ：反射光強度 Ｉ0 ：入射光強度 ＦＬ：蛍光
ームスプリッタ ４ａ〜４ｄ：光検出器 ５：Ｉ／
Ｉ0 回路 ６：コンピュータ ７：ゲートパルサ
８：分光器 １０：三角形ガラスプリズム １１：金属薄膜 １
２：フローパイプ １３：フローセル １４：ガラ
ス板 １５：接液部 １７：ガラス基板 ２１：有機層 ２２：抗ＡＦＰ抗体 ２３：ブロッ
キング層 ２４：ＡＦＰ（α−フェトプロテイン：抗
原） ２５：ＤＴＴＡ−Ｅｕ（蛍光標識抗体） Ｉ：反射光強度 Ｉ0 ：入射光強度 ＦＬ：蛍光
Claims (2)
- 【請求項１】 抗体が固定された金属薄膜をもつ三角形
ガラスプリズムを回転テーブルに載置し、抗原を含む試
料溶液を三角形ガラスプリズムの金属薄膜側に供給して
抗原を抗体に結合させ、更に蛍光標識抗体を含む蛍光標
識試薬を供給して抗原に結合している抗体に蛍光標識抗
体を結合させた後、蛍光標識抗体が通常吸収する光の整
数倍の波長をもつ光を三角形ガラスプリズムのプリズム
側から入射させて蛍光標識抗体を二光子励起又は多光子
励起させ、反射率が最も小さくなる入射角で三角形ガラ
スプリズムのプリズム側に入射したときに発生する蛍光
をスペクトル分析することを特徴とする蛍光免疫分析方
法。 - 【請求項２】 抗体が固定された金属薄膜を一面にもつ
三角形ガラスプリズムと、該三角形ガラスプリズムが載
置される回転テーブルと、抗原を含む試料溶液及び該抗
原に対する蛍光標識抗体を含む蛍光標識試薬を前記金属
薄膜側に供給するフローセルと、蛍光標識抗体が通常吸
収する光の整数倍の波長をもつ光を三角形ガラスプリズ
ムのプリズム側から入射させる励起光源と、前記抗体に
結合した抗原に更に結合した蛍光標識抗体が二光子励起
又は多光子励起されたときに発する蛍光を分光分析する
光検出器とを備え、反射率が最も小さくなる入射角で三
角形ガラスプリズムのプリズム側に入射したときに発生
する蛍光をスペクトル分析することを特徴とする蛍光免
疫分析装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19353699A JP3249954B2 (ja) | 1999-07-07 | 1999-07-07 | 蛍光免疫分析方法及び装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19353699A JP3249954B2 (ja) | 1999-07-07 | 1999-07-07 | 蛍光免疫分析方法及び装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001021565A JP2001021565A (ja) | 2001-01-26 |
| JP3249954B2 true JP3249954B2 (ja) | 2002-01-28 |
Family
ID=16309718
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19353699A Expired - Fee Related JP3249954B2 (ja) | 1999-07-07 | 1999-07-07 | 蛍光免疫分析方法及び装置 |
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| JP2004156911A (ja) * | 2002-11-01 | 2004-06-03 | Osaka Industrial Promotion Organization | 表面プラズモン蛍光顕微鏡、および表面プラズモンにより励起された蛍光を測定する方法 |
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| WO2006098446A1 (ja) | 2005-03-18 | 2006-09-21 | National University Corporation Hokkaido University | センシングデバイス、センシング装置およびセンシング方法 |
| JP5117679B2 (ja) * | 2005-04-27 | 2013-01-16 | 株式会社リコー | 多光子吸収材料を用いた色素材料、色素材料の製造方法、多光子吸収反応材料、多光子吸収反応材料の反応生成物、多光子吸収反応助剤、および色素溶液 |
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| JP2008102117A (ja) * | 2006-09-21 | 2008-05-01 | Fujifilm Corp | 表面プラズモン増強蛍光センサおよび蛍光検出方法 |
| EP1933130A1 (en) | 2006-12-11 | 2008-06-18 | Fujifilm Corporation | Sensor, sensing apparatus and sensing method |
| JP2008145309A (ja) * | 2006-12-12 | 2008-06-26 | Fujifilm Corp | 表面プラズモン増強蛍光センサ |
| JP4885019B2 (ja) * | 2007-03-15 | 2012-02-29 | 富士フイルム株式会社 | 表面プラズモン増強蛍光センサ |
| JP5424610B2 (ja) * | 2007-11-07 | 2014-02-26 | 株式会社東芝 | 光導波路型センサチップ、光導波路型センサチップの製造方法、物質の測定方法、物質測定用キットおよび光導波路型センサ |
| US20090124024A1 (en) | 2007-11-07 | 2009-05-14 | Shingo Kasai | Optical-waveguide sensor chip, method of manufacturing the same, method of measuring substance, substance-measuring kit and optical-waveguide sensor |
| AU2008352940B2 (en) | 2007-12-19 | 2014-06-05 | Singulex, Inc. | Scanning analyzer for single molecule detection and methods of use |
| JP5216318B2 (ja) * | 2007-12-27 | 2013-06-19 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 蛍光検出装置 |
| JP5344828B2 (ja) | 2008-02-28 | 2013-11-20 | 富士フイルム株式会社 | センシング装置 |
| JP2010190880A (ja) * | 2008-04-18 | 2010-09-02 | Fujifilm Corp | 光信号検出方法、光信号検出装置、光信号検出用試料セルおよび光信号検出用キット |
| JP5301894B2 (ja) * | 2008-06-27 | 2013-09-25 | 富士フイルム株式会社 | 検出方法 |
| JP5160985B2 (ja) * | 2008-07-14 | 2013-03-13 | 富士フイルム株式会社 | 検出方法、検出装置、検出用試料セルおよび検出用キット |
| JP5143668B2 (ja) * | 2008-08-25 | 2013-02-13 | 富士フイルム株式会社 | 検出方法、検出用試料セルおよび検出用キット |
| WO2010096204A2 (en) * | 2009-02-23 | 2010-08-26 | University Of Maryland Biotechnology Institute | Directional surface plasmon coupled fluorescence and chemiluminescence from thin films of nickel, iron or palladium and uses thereof |
| JPWO2010123073A1 (ja) * | 2009-04-24 | 2012-10-25 | コニカミノルタホールディングス株式会社 | 刺激応答性ポリマーを有するプラズモン励起センサを用いたアッセイ法 |
| JP5652393B2 (ja) * | 2009-05-22 | 2015-01-14 | コニカミノルタ株式会社 | Ｓｐｆｓ−ｌｐｆｓ系による測定方法に供するプラズモン励起センサおよびアッセイ法 |
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| US9255883B2 (en) | 2009-10-05 | 2016-02-09 | Konica Minolta, Inc. | Surface plasmon-enhanced fluorescence measuring apparatus |
| JP5776140B2 (ja) * | 2010-06-09 | 2015-09-09 | コニカミノルタ株式会社 | 光学センサおよび光学センサに用いられるチップ構造体 |
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| CN104931472A (zh) * | 2015-06-10 | 2015-09-23 | 东北电力大学 | 连续式多波长激发荧光标记免疫试纸条检测仪 |
| CN106338470B (zh) * | 2016-08-30 | 2019-01-01 | 上海理工大学 | 一种光场行波腔增强表面等离子体共振传感装置 |
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