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ES2543367T3 - Procedimiento para el aislamiento específico del contenido de ADN total de gérmenes bacterianos y un kit para dicho fin - Google Patents

Procedimiento para el aislamiento específico del contenido de ADN total de gérmenes bacterianos y un kit para dicho fin Download PDF

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ES2543367T3
ES2543367T3 ES10735085.2T ES10735085T ES2543367T3 ES 2543367 T3 ES2543367 T3 ES 2543367T3 ES 10735085 T ES10735085 T ES 10735085T ES 2543367 T3 ES2543367 T3 ES 2543367T3
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János KISS
Katalin Sztancsik
Georgina BERNÁTH
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Diagon Kft
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Abstract

Procedimiento para el aislamiento específico de contenido en ADN total de gérmenes bacterianos de muestras, en el curso del cual se lisan las células, el contenido en ADN del lisado se une selectivamente, se lava y después el ácido nucleico de polímeros lineales desalinizados se eluye a partir de la superficie de unión en una solución acuosa, caracterizado porque de forma preliminar las células bacterianas no viables se separan de las células viables en base a sus características fisicoquímicas de superficie celular diferentes como resultado de lo cual exclusivamente el ADN de cadena doble que deriva del lisado de células viables está unido sobre una -SiO2-TiO2-matriz que contiene grupos -OH y dodecilamina químicamente activados.

Description

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La fragmentación promedio de ADN eluido de acuerdo con el punto 6 es 5-12 kilobases (kb), el valor de VC combinado característico es: 15 %. El número de gérmenes bacterianos inicial más bajo para aislamiento de ADN llevado a cabo con nuestro procedimiento de acuerdo con la invención es: 104 U.F.C./ml, el valor de VC combinado característico es: 10,5 %
8) La cantidad de ADN aislado total a partir de títulos de número de gérmenes diferentes con la ayuda de matriz vehículo de unión a ADN puede analizarse apropiadamente por detección semicuantitativa (véase figura 3 y su explicación). En el curso de detección semicuantitativa primero el ADN libre de inhibidores, eluido a partir de la superficie de la matriz se hace entrar en una reacción de POCR, después el polinucleótido multiplicado se detecta en electroforesis de gel de agarosa convencional, con densidad fluorescente emitida por bromuro de etidio de tinción intercalante de ADN sometido a exposición a UV (véase descripción).
9) Una característica especial del procedimiento de los autores de la invención es que el tamaño del ADN bacteriano que se puede preparar es mínimo 500-1500 pares de bases (pb) de ácido nucleico polimérico lineal y el uso del procedimiento de los autores de la presente invención para la reparación de ADN menor que este no es favorable.
Una ventaja adicional del procedimiento de los autores de la invención es que el mantenimiento fisicoquímico del ADN extraído, su pureza y concentración lo hacen adecuado para usar en aplicaciones de PCR aguas abajo.
Una ventaja adicional del procedimiento de la invención de los autores de la invención es que ello puede realizarse rápidamente y puede combinarse con procedimientos de extracción tradicionales y alternativos con la ayuda del tampón de lisis preparado para este propósito.
Una pocas de las posibles realizaciones de acuerdo con la invención se describen a continuación.
Ejemplos de realización
Oportunidades ideales para el aislamiento de contenido en ADN total de gérmenes bacterianos en muestras de agua,comida, muestras clínicas, muestras ambientales sólidas y líquidas, así como muestras de aire atrapadas en líquido, etc.
En el curso de la realización se debe seguir favorablemente más adelante la guía de las tablas de las figuras 4 y 5 anotadas a continuación.
A/ Alteración de muestras con tratamiento mecánico y enzimático
La reacción se optimizó para instrumentos de laboratorio de biología molecular generales y por dispositivos de aislamiento (por ejemplo FastPrep™).
Primera fase del procedimiento/Retirada de células bacterianas no viables de la muestra
1.
La muestra bacteriana cultivada en líquidos se sedimenta a temperatura ambiente (TA), 10 minutos.
2.
La fase líquida de la muestra se transfiere a un tubo de centrífuga limpio, estéril.
3.
La muestra transferida se centrifuga: 3.000 rpm, 1 min., 25 ºC.
4.
El sobrenadante se retira, después el sedimento se resuspende en 5 ml de TAMPÓN QUE RETIRA CÉLULAS NO VIABLES (para su composición y pH véase tabla 1).
5.
La suspensión se mezcla cuidadosamente con un mezclador de vórtice.
6.
La suspensión se centrifuga: 3.000 rpm, 1 min., 25 ºC.
7.
El sobrenadante se retira, después el precipitado se resuspende en 5 ml de TAMPÓN QUE RETIRA CÉLULAS NO VIABLES (para su composición y pH véase tabla 1).
8.
La suspensión se mezcla cuidadosamente con un mezclador de vórtice.
9.
La suspensión se centrifuga: 2.000 rpm, 1 min., 25 ºC.
10.
El sobrenadante se retira, después el sedimento se resuspende en 1 ml de TAMPÓN QUE RETIRA CÉLULAS NO VIABLES (para su composición y pH véase tabla 1).
11.
La suspensión se mezcla cuidadosamente con un mezclador de vórtice.
12.
La suspensión se centrifuga: 1.000 rpm, 3 min., 4 °C.
13.
El sedimento se redisuelve en 0,2-0,5 ml de tampón Tris-HCl 0,1 M (pH = 7,5).
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protocolos de laboratorio estándar (norma EN ISO 20838:2006, GLP).
c) Trabajar en un ambiente estrictamente estéril (normas ISO 209, FS 209, BS5295, ISO 14644-1:1999), a un nivel de seguridad mínimo de BSL2 (Nivel de Bioseguridad 2). Tercera fase del procedimiento/Control de calidad y cantidad La concentración de ADN aislado se determina por la técnica de laboratorio convencional de espectrofotometría, a una
longitud de onda de X = 260 nm. La pureza del ADN aislado se caracteriza por la proporción de valores de densidad óptica medidos a longitudes de onda de X = 260 nm y X = 280 nm.
Las características obligatorias de la tercera fase del procedimiento son las siguientes: a) Durante el procedimiento de espectrofotometría seguir estrictamente los protocolos de laboratorio estándar relativos a procedimientos de PCR (norma EN ISO 20838:2006, GLP).
b) Trabajar en un ambiente estrictamente estéril (normas ISO 209, FS 209, BS5295, ISO 14644-1:1999), a un nivel de seguridad mínimo de BSL2 (Nivel de Bioseguridad 2).
B/ Alteración de muestras con tratamiento mecánico La reacción se optimizó para instrumentos de laboratorio de biología molecular generales y por dispositivos de aislamiento (por ejemplo FastPrep™).
Primera fase del procedimiento/Eliminación de´células bacterianas no viables a partir de la muestra. Las etapas y características obligatorias del procedimiento son las mismas que las descritas en la primera fase de la alteración de muestras A.
Segunda fase del procedimiento/Lisis celular y unión de ADN de doble cadena sobre la superficie de matriz vehículo
1.
Transferir la muestra tratada de acuerdo con las etapas 1-14 de la primera fase del procedimiento en un tubo de destrucción de 2 ml conteniendo 0,1 g de limaduras de vidrio y una bola de acero de CR-Va del tamaño de 4,5'' (4,5 x 25,4 mm).
2.
Situar el tubo de destrucción que contiene la muestra en un disruptor asimétrico homogeneizante (por ejemplo Fast-Prep™) y después comenzar la alteración cíclica. Después de 30 segundos la muestra puede hacerse pasar.
3.
Añadir 1 ml de TAMPÓN DE LISIS (composición y pH de acuerdo con la tabla 2) a la muestra tratada mecánicamente. Mantener a temperatura ambiente durante 1-2 minutos.
4.
Centrifugar la suspensión: 13.000 rpm, 5 min., 4 °C.
5.
Transferir 800 µl del sobrenadante dentro de un tubo de centrífuga de 2,5 ml estéril limpio.
6.
Añadir 800 µl de MATRIZ DE UNIÓN A ADN (composición y pH de acuerdo con la tabla 3). Cerrar el tubo de centrífuga.
7.
Cuidadosamente rotar la suspensión 10-15 veces. En esta etapa no usar un mezclador de vórtice por medio alguno.
8.
Incubarla durante 2 minutos a temperatura ambiente, rotar lentamente el tubo a intervalos amplios.
9.
Centrifugar la suspensión: 12.000 rpm, 1 minuto. Retirar el sobrenadante.
10.
Suspender el precipitado en 700 µl de TAMPÓN DE LAVADO DE ELIMINACIÓN DE SALES (composición y pH de acuerdo con la tabla 4).
11.
Centrifugar la suspensión: 12.000 rpm, 1 minuto. Retirar el sobrenadante.
12.
Suspender el precipitado en 500 µl de TAMPÓN DE LAVADO DE ELIMINACIÓN DE SALES (composición y pH de acuerdo con la tabla 4).
13.
Centrifugar la suspensión: 12.000 rpm, 30 segundos. Retirar el sobrenadante.
14.
Eliminar el sobrenadante residual por encima del precipitado cuidadosamente, sin tocar o agitar la matriz.
15.
Dejar secar la matriz: 2 min., 37 ºC.
16.
Añadir 100-120 ml de ELUYENTE (véase tabla 5) al precipitado de matriz seco. Suspender el precipitado.
17.
Dejarlo permanecer a temperatura ambiente, 1 minuto.
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18.
Centrifugar: 12.000 rpm; 1 minuto.
19.
Transferir el sobrenadante dentro de un tubo de centrífuga libre de ADNasas estéril limpio.
20.
El ADN aislado está listo para aplicaciones corriente abajo. Las características obligatorias de la segunda fase del procedimiento son las siguientes: a) Soluciones y componentes se almacenan a +4...+8 ºC, con la excepción de MATRIZ DE UNIÓN A ADN, que se
mantiene a temperatura ambiente.
b) Cuando se preparan soluciones madre relativas a procedimientos de PCR, deben seguirse estrictamente los protocolos de laboratorio estándar (norma EN ISO 20838:2006, GLP). c) Trabajar en un ambiente estrictamente estéril (normas ISO 209, FS 209, BS5295, ISO 14644-1:1999), a un nivel de
seguridad mínimo de BSL2 (Nivel de Bioseguridad 2). Tercera fase del procedimiento/Control de calidad y cantidad La concentración de ADN aislado se determina por la técnica de laboratorio convencional de espectrofotometría, a una
longitud de onda de ʎ = 260 nm. La pureza del ADN aislado se caracteriza por la proporción de valores de densidad óptica medidos a longitudes de onda de ʎ = 260 nm y ʎ = 280 nm.
Las características obligatorias de la tercera fase del procedimiento son las siguientes: a) Durante el procedimiento de espectrofotometría seguir estrictamente los protocolos de laboratorio estándar relativos a procedimientos de PCR (norma EN ISO 20838:2006, GLP).
b) Trabajar en un ambiente estrictamente estéril (normas ISO 209, FS 209, BS5295, ISO 14644-1:1999), a un nivel de seguridad mínimo de BSL2 (Nivel de Bioseguridad 2).
C/ Alteración de muestras con lisis enzimática Reacción optimizada para instrumentos de laboratorio de biología molecular general. Primera fase del procedimiento/Eliminación de´células bacterianas no viables a partir de la muestra. Las etapas y características obligatorias del procedimiento son las mismas que las descritas en la primera fase de la alteración de muestras A.
Segunda fase del procedimiento/Lisis celular y unión de ADN de doble cadena sobre la superficie de matriz vehículo
1.
Añadir enzima lisozima a la muestra tratada de acuerdo con las etapas 1-14 de la primera fase del procedimiento, a una concentración final de 100 mg/ml e incubarla durante 15 minutos a 37 ºC. Después se hace pasar la muestra.
2.
Añadir 1 ml de TAMPÓN de lisis a la muestra tratada enzimáticamente (composición y pH de acuerdo con la tabla 2). Mantener a temperatura ambiente durante 1-2 minutos.
3.
Centrifugar la suspensión: 13.000 rpm, 5 min., 4 ºC.
4.
Transferir 800 ʎl del sobrenadante dentro de un tubo de centrífuga de 2,5 ml estéril limpio.
5.
Añadir 800 ml de MATRIZ DE UNIÓN A ADN (composición y pH de acuerdo con la tabla 3). Cerrar el tubo de centrífuga.
6.
Cuidadosamente rotar la suspensión 10-15 veces. En esta etapa no usar un mezclador de vórtice por medio alguno.
7.
Incubarla durante 2 minutos a temperatura ambiente, rotar lentamente el tubo a intervalos amplios.
8.
Centrifugar la suspensión: 12.000 rpm, 1 minuto. Retirar el sobrenadante.
9.
Suspender el precipitado en 700 ʎl de TAMPÓN DE LAVADO DE ELIMINACIÓN DE SALES (composición y pH de acuerdo con la tabla 4).
10.
Centrifugar la suspensión: 12.000 rpm, 1 minuto. Retirar el sobrenadante.
11.
Suspender el precipitado en 500 ʎl de TAMPÓN DE LAVADO DE ELIMINACIÓN DE SALES (composición y pH de acuerdo con la tabla 4).
12.
Centrifugar la suspensión: 12.000 rpm, 30 segundos. Retirar el sobrenadante.
13.
Eliminar el sobrenadante residual por encima del precipitado cuidadosamente, sin tocar o agitar la matriz.
14.
Permitir secar la matriz: 2 min., 37 ºC.
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aislamiento de ADN de acuerdo con la invención se puede ver en la figura 5. En la figura se puede ver un sistema de aislamiento integral complejo para aislamientos de ADN microbiano. El KIT contiene las soluciones usadas en las etapas procedimentales que siguen a la retirada de células no viables (tampón de lisis, matriz de unión, tampón de lavado de eliminación de sales, eluyente), así como los tubos de destrucción descritos en el ejemplo de uso.

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ES10735085.2T 2010-07-07 2010-07-07 Procedimiento para el aislamiento específico del contenido de ADN total de gérmenes bacterianos y un kit para dicho fin Active ES2543367T3 (es)

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