CN109306370A - 纳米材料胁迫下桡足类dna损伤的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了纳米材料胁迫下桡足类DNA损伤的检测方法，包括样品提取、细胞存活率测定、体外暴露、DNA损伤的检测，DNA损伤的检测为：将体外暴露得到的沉淀细胞团用PBS或HBSS平衡盐溶液重悬沉淀细胞团，离心，去除上清液得单细胞悬液；将单细胞悬液利用琼脂糖制成胶板；将胶板浸入含有DMF和二甲基甲酰胺的工作液中裂解；将裂解后的胶板置于电泳液中，解旋后电泳；将电泳后的胶板用Tris‑HCl中和；将中和后的胶板染色后在荧光显微镜下观察，拍摄，使用CASP彗星图像分析软件自动分析。本发明检测方法具有简便、快速、低耗、灵敏性和准确性高、重复性好、成本较低等独特优点，所需样本量少。
Description
技术领域
本发明涉及生态基因毒理学技术领域，尤其是涉及纳米材料胁迫下桡足类DNA损伤的检测方法。
技术背景
纳米材料由于具有比表面积大和表面缺陷产生的一系列新的不同于宏观物质的特性，目前已被广泛应用于涂料、染料、电子、医药、国防、服装、化妆品、日用品、生物医药、农业、航天航空等多个领域。随着纳米材料在工业中广泛应用，纳米污染问题日益严重，纳米材料可以通过河水、降雨等过程将转移至海洋环境中，并通过食物链和食物网在生物体内蓄积并持久存在，对生物和生态环境带来严重威胁。纳米尺度颗粒物会严重影响着细胞、亚细胞和蛋白质的生理活性，甚至会造成细胞的死亡。纳米材料通过各种方式进入机体内，并沉积到相应细胞(神经细胞、肝脏细胞等)内，可使蛋白质变性或者降低酶活性，严重的可造成基因毒性、DNA突变、细胞膜和细胞器(主要是线粒体)损伤，最终会影响功能蛋白的表达和机体免疫力等。测定DNA损伤程度，用于评估污染物的行为与毒性，探究其对机体的遗传毒性的影响具有重要的意义。
桡足类是近海的优势浮游生物群体，处于食物链第二营养级，因为其具有生活周期短，分布广泛、滤食性及蓄积性的特点，被广泛应用于毒理学研究。使用桡足类作为模式生物，模拟环境中纳米材料水平测定桡足类体内细胞DNA损伤水平，从而判断纳米材料对于海洋生物的胁迫压力。DNA损伤包括单链损伤、双链损伤、链内交联、链间交联、碱基修饰、腺嘌呤丢失等，检测DNA损伤可根据DNA的基本成分进行，如32P-后标记-薄层层析法、气相色谱-质谱-选择性离子测量分析方法(GC-MS-SIM)等。然而，这些方法往往都存在需要对样品进行预处理，耗时长、所需仪器相对较贵、操作繁琐、灵敏度与特异性较差、易产生交叉反应和环境污染、通量低而且检测对象单一等不足等缺点。现今用于DNA损伤检测较为广泛使用的是单细胞凝胶电泳的方法，又称彗星实验，是一种在单细胞水平进行DNA损伤的检测方法，具有简便、快速、低耗、重复性好等独特优点，不仅能够直接观察单个细胞内的DNA损害和快速并大通量检验真核细胞DNA损伤与修复、DNA双链和单链断裂，还能检测到DNA的碱基的不稳定结构。但目前研究多采用测定桡足类体内细胞DNA损伤水平，从而判断纳米材料对于海洋生物的胁迫压力的报道尚未见到。因此，建立一种快速、方便、高灵敏性并且能检测桡足类DNA损伤的方法就显得尤其重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有简便、快速、低耗、灵敏性和准确性高、重复性好、成本较低等独特优点，所需样本量少的纳米材料胁迫下桡足类DNA损伤的检测方法。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：
纳米材料胁迫下桡足类DNA损伤的检测方法，包括样品提取、细胞存活率测定、体外暴露、DNA损伤的检测，DNA损伤的检测为：
a单细胞悬液制备：将体外暴露得到的沉淀细胞团用PBS或HBSS平衡盐溶液重悬沉淀细胞团，离心，去除上清液得单细胞悬液；
b胶板制备：将单细胞悬液利用琼脂糖制成胶板；
c裂解：将胶板浸入含有DMF和二甲基甲酰胺的工作液中，在0-5℃黑暗条件下裂解15-20min；
d电泳：将裂解后的胶板置于电泳液中，在0-5℃黑暗条件下解旋后电泳；
e中和：将电泳后的胶板用0.4mol/L的Tris-HCl中和；
f观察计数和数据分析：将中和后的胶板用20ug/ml的DNA染色剂染色后在荧光显微镜下观察，拍摄，使用CASP彗星图像分析软件自动分析。
本发明DNA损伤的检测方法是一种在单细胞水平进行DNA损伤的检测方法，具有简便、快速、低耗、灵敏性和准确性高、重复性好、成本较低等独特优点，所需样本量少，结果图较为直观，易分析，同时本发明利用在食物网中起着承上启下的作用的桡足类进行检测纳米材料对于海洋生物的胁迫压力，可有效避免采用其他生物样品可能带来的伦理学问题，有利于动物保护。
作为优选，胶板制备的具体步骤为：第一层为浓度0.5-1.5％的正常熔点琼脂糖，凝固后加浓度为0.5-1.0％、含细胞悬液的低熔点琼脂糖，细胞悬液和低熔点琼脂糖的体积比为1:0.9-1.1，置于0-5℃黑暗条件下固定30-60min，即得胶板。本发明采用不同熔点的琼脂糖配合使用，可保证较短链的DNA片段的断裂也可通过电泳过程呈现，使得所得图像较为完整、清晰、准确，方便后续数据处理，有利于保证数据的准确性，同时所用胶板的上层凝胶不但可以保证有效的与下层凝胶附着，而且所包埋的单细胞能够很好的分散其中，确保可以检测到单细胞水平，同时，琼脂糖凝胶不易破碎、脱落，细胞附着性和分散程度提高，可以减少实验中琼脂糖的使用，减少实验步骤，节省时间，提高检测效果。
作为优选，工作液为含2.5M NaCl、100mM EDTA、10mM Tris base、3-4mM DMF、1.5-2.5mM二甲基甲酰胺、1％曲拉通X-100、10％二甲基亚砜的混合液，其pH值为10.0。该工作液中DMF和二甲基甲酰胺的特殊存在能够配合工作液中的其他有效成分发挥增益作用，尤其和是曲拉通X-100共同作用，破坏细胞脂质双分子层，减少裂解时间且使细胞得到充分裂解，细胞内所含物质能够充分释放到细胞样品溶液中，使得利用少量样本获得较高纯度和得率的核酸成为可能，满足后续检测用量，适于大规模推广应用，且能够使裂解过程更加温和，有效保护了裂解过程中DNA不被破坏，获得完整清晰的图像，提高本发明检测方法的准确性。
作为优选，电泳液为含0.3M NaOH和1mM EDTA的水溶液，其pH≥13.0。
作为优选，解旋时间为20-40min；所述电泳的电压为0.5-0.6V/cm，时间为20-40min。
作为优选，样品提取步骤为：将收集桡足类匀浆，在0-5℃、12000-15000rpm下离心2-5min；离心沉淀物即为细胞样品，备用。桡足类细胞可跟环境污染物直接接触，其提取相对简单、不会造成个体死亡，是用于生物毒性检验的良好材料。
作为优选，细胞存活率测定步骤为：将细胞样品中加入等体积细胞重悬液，混匀后再加入等体积0.4％(v/v)的台盼蓝染料，静置染色3-10min，将染色后的血细胞样品置于血球计数板上，观察计数，计算得出细胞存活率。
作为优选，体外暴露步骤为：将样品提取步骤所得细胞样品置于离心管中，加入等体积的纳米材料溶液，混合均匀后于0-5℃黑暗条件下暴露60min，在0-5℃、12000-15000rpm下离心2-5min，去除上清液，即得沉淀细胞团。
作为优选，纳米材料溶液为含有金属及其氧化物类纳米材料溶液或含聚合物类纳米材料溶液或含复合物类纳米材料溶液或含碳类纳米材料溶液。将单细胞暴露在纳米材料溶液或纳米材料混合溶液中，不仅可以对单一纳米材料胁迫下桡足类DNA损伤进行检测，还可研究纳米材料混合溶液胁迫下桡足类DNA损伤的情况，可有效模拟现实环境中纳米材料复合污染状况，有效提高实验效率及实验准确性。
作为优选，检测方法可用于海洋生物安全风险评估以及海洋生态安全的监测预警过程中。本发明采用的桡足类处于食物链第二营养级，具有生活周期短，分布广泛、滤食性及蓄积性的特点，可以很好地用于海洋生物安全风险评估以及海洋生态安全的监测预警过程中。
与现有技术相比，本发明的优点在于：1)本发明DNA损伤的检测方法具有简便、快速、低耗、灵敏性和准确性高、重复性好、成本较低等独特优点，所需样本量少，结果图较为直观，易分析；2)本发明采用的桡足类处于食物链第二营养级，具有生活周期短，分布广泛、滤食性及蓄积性的特点，可以很好地用于海洋生物安全风险评估以及海洋生态安全的监测预警过程中；3)本发明裂解用工作液能减少裂解时间且使细胞得到充分裂解，使得利用少量样本获得较高纯度和得率的核酸成为可能，满足后续检测用量，适于大规模推广应用，且有效保护了裂解过程中DNA不被破坏，获得完整清晰的图像，提高本发明检测方法的准确性。
附图说明
图1为本发明实施例2检测方法图；
图2为本发明实施例4检测方法图；
图3为本发明对比例1检测方法图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
纳米材料胁迫下桡足类DNA损伤的检测方法，包括样品提取、细胞存活率测定、体外暴露、DNA损伤的检测，DNA损伤的检测为：
a单细胞悬液制备：将体外暴露得到的沉淀细胞团用PBS平衡盐溶液重悬沉淀细胞团，再在0℃、12000rpm下离心2min，去除上清液得单细胞悬液；
b胶板制备：将单细胞悬液利用琼脂糖制成胶板；
c裂解：将胶板浸入含有DMF和二甲基甲酰胺的工作液中，在0℃黑暗条件下裂解15min；
d电泳：将裂解后的胶板置于电泳液中，在0℃黑暗条件下解旋20min后电泳20min；
e中和：将电泳后的胶板用0.4mol/L的Tris-HCl中和；
f观察计数和数据分析：将中和后的胶板用20ug/ml的DNA染色剂染色后在荧光显微镜下观察，拍摄，使用CASP彗星图像分析软件自动分析。
上述DNA损伤的检测方法是一种在单细胞水平进行DNA损伤的检测方法，具有简便、快速、低耗、灵敏性和准确性高、重复性好、成本较低等独特优点，所需样本量少，结果图较为直观，易分析，同时利用在食物网中起着承上启下的作用的桡足类进行检测纳米材料对于海洋生物的胁迫压力，可有效避免采用其他生物样品可能带来的伦理学问题，有利于动物保护。
胶板制备的具体步骤为：第一层为浓度0.5％的正常熔点琼脂糖，凝固后加浓度为0.5％、含细胞悬液的低熔点琼脂糖，细胞悬液和低熔点琼脂糖的体积比为1:0.9，置于0℃黑暗条件下固定30min，即得胶板。采用不同熔点的琼脂糖配合使用，可保证较短链的DNA片段的断裂也可通过电泳过程呈现，使得所得图像较为完整、清晰、准确，方便后续数据处理，有利于保证数据的准确性，同时所用胶板的上层凝胶不但可以保证有效的与下层凝胶附着，而且所包埋的单细胞能够很好的分散其中，确保可以检测到单细胞水平，同时，琼脂糖凝胶不易破碎、脱落，细胞附着性和分散程度提高，可以减少实验中琼脂糖的使用，减少实验步骤，节省时间，提高检测效果。
工作液为含2.5M NaCl、100mM EDTA、10mM Tris base、3mM DMF、1.5mM二甲基甲酰胺、1％曲拉通X-100、10％二甲基亚砜的混合液，其pH值为10.0。该工作液中DMF和二甲基甲酰胺的特殊存在能够配合工作液中的其他有效成分发挥增益作用，尤其和是曲拉通X-100共同作用，破坏细胞脂质双分子层，减少裂解时间且使细胞得到充分裂解，细胞内所含物质能够充分释放到细胞样品溶液中，使得利用少量样本获得较高纯度和得率的核酸成为可能，满足后续检测用量，适于大规模推广应用，且能够使裂解过程更加温和，有效保护了裂解过程中DNA不被破坏，获得完整清晰的图像，提高本发明检测方法的准确性。
电泳液为含0.3M NaOH和1mM EDTA的水溶液，其pH≥13.0。
解旋时间为20min；所述电泳的电压为0.5V/cm，时间为20min。
样品提取步骤为：将收集桡足类匀浆，在0℃、12000rpm下离心2min；离心沉淀物即为细胞样品，备用。桡足类细胞可跟环境污染物直接接触，其提取相对简单、不会造成个体死亡，是用于生物毒性检验的良好材料。
细胞存活率测定步骤为：将细胞样品中加入等体积细胞重悬液，混匀后再加入等体积0.4％(v/v)的台盼蓝染料，静置染色3min，将染色后的血细胞样品置于血球计数板上，观察计数，计算得出细胞存活率。
体外暴露步骤为：将样品提取步骤所得细胞样品置于离心管中，加入等体积的纳米材料溶液，混合均匀后于0℃黑暗条件下暴露60min，在0℃、12000rpm下离心2min，去除上清液，即得沉淀细胞团。
纳米材料溶液为含有金属及其氧化物类纳米材料溶液或含聚合物类纳米材料溶液或含复合物类纳米材料溶液或含碳类纳米材料溶液。将单细胞暴露在纳米材料溶液或纳米材料混合溶液中，不仅可以对单一纳米材料胁迫下桡足类DNA损伤进行检测，还可研究纳米材料混合溶液胁迫下桡足类DNA损伤的情况，可有效模拟现实环境中纳米材料复合污染状况，有效提高实验效率及实验准确性。
检测方法可用于海洋生物安全风险评估以及海洋生态安全的监测预警过程中。采用的桡足类处于食物链第二营养级，具有生活周期短，分布广泛、滤食性及蓄积性的特点，可以很好地用于海洋生物安全风险评估以及海洋生态安全的监测预警过程中。
实施例2：
纳米材料胁迫下桡足类DNA损伤的检测方法，包括样品提取、细胞存活率测定、体外暴露、DNA损伤的检测，具体包括如下步骤：
1)样品提取：将收集桡足类匀浆，在2℃、13000rpm下离心3min；离心沉淀物即为细胞样品，备用；
2)细胞存活率测定：将细胞样品中加入等体积细胞重悬液，混匀后再加入等体积0.4％(v/v)的台盼蓝染料，静置染色7min，将染色后的血细胞样品置于血球计数板上，观察计数，计算得出细胞存活率；
3)体外暴露步骤为：将样品提取步骤所得细胞样品置于离心管中，加入等体积的纳米氧化锌溶液，混合均匀后于2℃黑暗条件下暴露60min，在2℃、13000rpm下离心3min，去除上清液，即得沉淀细胞团；
4)DNA损伤的检测：
a单细胞悬液制备：将体外暴露得到的沉淀细胞团用HBSS平衡盐溶液重悬沉淀细胞团，再在2℃、13000rpm下离心3min，去除上清液得单细胞悬液；
b胶板制备：将单细胞悬液利用琼脂糖制成胶板，第一层为浓度1.0％的正常熔点琼脂糖，凝固后加浓度为0.8％、含细胞悬液的低熔点琼脂糖，细胞悬液和低熔点琼脂糖的体积比为1:1，置于2℃黑暗条件下固定45min，即得胶板；
c裂解：将胶板浸入含2.5M NaCl、100mM EDTA、10mM Tris base、3.5mM DMF、2.0mM二甲基甲酰胺、1％曲拉通X-100、10％二甲基亚砜的工作液中，其pH值为10.0，在2℃黑暗条件下裂解18min；
d电泳：将裂解后的胶板置于电泳液中，电泳液为含0.3M NaOH和1mM EDTA的水溶液，其pH≥13.0，在2℃黑暗条件下解旋30min后电泳30min，电泳的电压为0.55V/cm；
e中和：将电泳后的胶板用0.4mol/L的Tris-HCl中和；
f观察计数和数据分析：将中和后的胶板用20ug/ml的DNA染色剂染色后在荧光显微镜下观察，拍摄，使用CASP彗星图像分析软件自动分析。
实施例3：
纳米材料胁迫下桡足类DNA损伤的检测方法，包括样品提取、细胞存活率测定、体外暴露、DNA损伤的检测，具体包括如下步骤：
1)样品提取：将收集桡足类匀浆，在5℃、15000rpm下离心5min；离心沉淀物即为细胞样品，备用；
2)细胞存活率测定：将细胞样品中加入等体积细胞重悬液，混匀后再加入等体积0.4％(v/v)的台盼蓝染料，静置染色10min，将染色后的血细胞样品置于血球计数板上，观察计数，计算得出细胞存活率；
3)体外暴露步骤为：将样品提取步骤所得细胞样品置于离心管中，加入等体积的纳米羧基磷灰石溶液，混合均匀后于5℃黑暗条件下暴露60min，在5℃、15000rpm下离心5min，去除上清液，即得沉淀细胞团；
4)DNA损伤的检测：
a单细胞悬液制备：将体外暴露得到的沉淀细胞团用PBS或HBSS平衡盐溶液重悬沉淀细胞团，再在5℃、15000rpm下离心5min，去除上清液得单细胞悬液；
b胶板制备：将单细胞悬液利用琼脂糖制成胶板，第一层为浓度1.5％的正常熔点琼脂糖，凝固后加浓度为1.0％、含细胞悬液的低熔点琼脂糖，细胞悬液和低熔点琼脂糖的体积比为1:1.1，置于5℃黑暗条件下固定60min，即得胶板；
c裂解：将胶板浸入含2.5M NaCl、100mM EDTA、10mM Tris base、4mM DMF、2.5mM二甲基甲酰胺、1％曲拉通X-100、10％二甲基亚砜的工作液中，其pH值为10.0，在5℃黑暗条件下裂解20min；
d电泳：将裂解后的胶板置于电泳液中，电泳液为含0.3M NaOH和1mM EDTA的水溶液，其pH≥13.0，在5℃黑暗条件下解旋40min后电泳40min，电泳的电压为0.6V/cm；
e中和：将电泳后的胶板用0.4mol/L的Tris-HCl中和；
f观察计数和数据分析：将中和后的胶板用20ug/ml的DNA染色剂染色后在荧光显微镜下观察，拍摄，图像如图1所示，使用CASP彗星图像分析软件自动分析。
实施例4：
纳米材料胁迫下桡足类DNA损伤的检测方法，包括样品提取、细胞存活率测定、体外暴露、DNA损伤的检测，具体包括如下步骤：
1)样品提取：将收集桡足类匀浆，在2℃、13000rpm下离心3min；离心沉淀物即为细胞样品，备用；
2)细胞存活率测定：将细胞样品中加入等体积细胞重悬液，混匀后再加入等体积0.4％(v/v)的台盼蓝染料，静置染色7min，将染色后的血细胞样品置于血球计数板上，观察计数，计算得出细胞存活率；
3)体外暴露步骤为：将样品提取步骤所得细胞样品置于离心管中，加入等体积的纳米氧化锌溶液，混合均匀后于2℃黑暗条件下暴露60min，在2℃、13000rpm下离心3min，去除上清液，即得沉淀细胞团；
4)DNA损伤的检测：
a单细胞悬液制备：将体外暴露得到的沉淀细胞团用HBSS平衡盐溶液重悬沉淀细胞团，再在2℃、13000rpm下离心3min，去除上清液得单细胞悬液；
b胶板制备：将单细胞悬液利用琼脂糖制成胶板，第一层为浓度1.0％的正常熔点琼脂糖，凝固后加浓度为0.8％、含细胞悬液的低熔点琼脂糖，细胞悬液和低熔点琼脂糖的体积比为1:1，置于2℃黑暗条件下固定45min，即得胶板；
c裂解：将胶板浸入含2.5M NaCl、100mM EDTA、10mM Tris base、3.5mM DMF、2.0mM二甲基甲酰胺、1％曲拉通X-100、10％二甲基亚砜的工作液中，其pH值为10.0，在2℃黑暗条件下裂解18min；
d电泳：将裂解后的胶板置于电泳液中，电泳液为含0.3M NaOH和1mM EDTA的水溶液，其pH≥13.0，在2℃黑暗条件下解旋30min后电泳30min，电泳的电压为0.55V/cm；
e中和：将电泳后的胶板用0.4mol/L的Tris-HCl中和；
f观察计数和数据分析：将中和后的胶板用20ug/ml的DNA染色剂染色后在荧光显微镜下观察，拍摄，图像如图2所示，使用CASP彗星图像分析软件自动分析。
胶板制备步骤用低熔点琼脂糖中含有低熔点琼脂糖重量0.32％的λ-卡拉胶和低熔点琼脂糖重量2.47％的硫氰化铁，λ-卡拉胶在每个二糖单元内有三个硫酸酯基，λ-卡拉胶的分子链在任何温度下皆是随机卷曲构象，普遍被认为不具有凝胶特性，而硫氰化铁的存在可使λ-卡拉胶具有成凝胶的能力，且对细胞无毒性，同时能修饰琼脂糖分子的多糖链，但琼脂糖分子主链的琼二糖骨架结构没有被破坏，降低该低熔点琼脂糖，提高凝胶强度，使形成的平面具有平整的表面以及三维孔洞的内部结构，亲水性好，进而提高细胞的包埋性且使包埋单细胞的分散性更佳，提高检测的准确性。
对比例1：
纳米材料胁迫下桡足类DNA损伤的检测方法，裂解用工作液为含2.5M NaCl、100mMEDTA、10mM Tris base、1％曲拉通X-100、10％二甲基亚砜，其余和实施例2一致，图像如图3所示。
对比图1和图2发现，图2的检测结果要好于图1，这说明低熔点琼脂糖中含有λ-卡拉胶和硫氰化铁能提高细胞的包埋性且使包埋单细胞的分散性更佳，提高检测的准确性；对比图1和图3发现，图3中有许多完整圆形亮点表明无DNA损伤，这表明工作液中DMF和二甲基甲酰胺的特殊存在能使细胞得到充分裂解，有效保护了裂解过程中DNA不被破坏，提高检测方法的准确性。
本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.纳米材料胁迫下桡足类DNA损伤的检测方法，包括样品提取、细胞存活率测定、体外暴露、DNA损伤的检测，其特征在于：所述DNA损伤的检测为：
a单细胞悬液制备：将体外暴露得到的沉淀细胞团用PBS或HBSS平衡盐溶液重悬沉淀细胞团，离心，去除上清液得单细胞悬液；
b胶板制备：将单细胞悬液利用琼脂糖制成胶板；
c裂解：将胶板浸入含有DMF和二甲基甲酰胺的工作液中裂解；
d电泳：将裂解后的胶板置于电泳液中，解旋后电泳；
e中和：将电泳后的胶板用Tris-HCl中和；
f观察计数和数据分析：将中和后的胶板染色后在荧光显微镜下观察，拍摄，使用CASP彗星图像分析软件自动分析。
2.根据权利要求1所述的纳米材料胁迫下桡足类DNA损伤的检测方法，其特征在于：所述胶板制备的具体步骤为：第一层为浓度0.5-1.5％的正常熔点琼脂糖，凝固后加浓度为0.5-1.0％、含细胞悬液的低熔点琼脂糖，细胞悬液和低熔点琼脂糖的体积比为1:0.9-1.1，置于0-5℃黑暗条件下固定30-60min，即得胶板。
3.根据权利要求1所述的纳米材料胁迫下桡足类DNA损伤的检测方法，其特征在于：所述工作液为含2.5M NaCl、100mM EDTA、10mM Tris base、3-4mM DMF、1.5-2.5mM二甲基甲酰胺、1％曲拉通X-100、10％二甲基亚砜的混合液，其pH值为10.0。
4.根据权利要求1所述的纳米材料胁迫下桡足类DNA损伤的检测方法，其特征在于：所述电泳液为含0.3M NaOH和1mM EDTA的水溶液，其pH≥13.0。
5.根据权利要求1所述的纳米材料胁迫下桡足类DNA损伤的检测方法，其特征在于：所述解旋时间为20-40min；所述电泳的电压为0.5-0.6V/cm，时间为20-40min。
6.根据权利要求1所述的纳米材料胁迫下桡足类DNA损伤的检测方法，其特征在于：所述样品提取步骤为：将收集桡足类匀浆，在0-5℃、12000-15000rpm下离心2-5min；离心沉淀物即为细胞样品，备用。
7.根据权利要求1所述的纳米材料胁迫下桡足类DNA损伤的检测方法，其特征在于：所述细胞存活率测定步骤为：将细胞样品中加入等体积细胞重悬液，混匀后再加入等体积0.4％(v/v)的台盼蓝染料，静置染色3-10min，将染色后的血细胞样品置于血球计数板上，观察计数，计算得出细胞存活率。
8.根据权利要求1所述的纳米材料胁迫下桡足类DNA损伤的检测方法，其特征在于：所述体外暴露步骤为：将样品提取步骤所得细胞样品置于离心管中，加入等体积的纳米材料溶液，混合均匀后于0-5℃黑暗条件下暴露60min，在0-5℃、12000-15000rpm下离心2-5min，去除上清液，即得沉淀细胞团。
9.根据权利要求1所述的纳米材料胁迫下桡足类DNA损伤的检测方法，其特征在于：所述纳米材料溶液为含有金属及其氧化物类纳米材料溶液或含聚合物类纳米材料溶液或含复合物类纳米材料溶液或含碳类纳米材料溶液。
10.根据权利要求1所述的纳米材料胁迫下桡足类DNA损伤的检测方法，其特征在于：所述检测方法可用于海洋生物安全风险评估以及海洋生态安全的监测预警过程中。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117761138A (zh) * | 2023-12-20 | 2024-03-26 | 汇智生物技术(苏州)有限公司 | 一种针对大鼠肝脏彗星试验的检测方法 |
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