ES2402795T3

ES2402795T3 - Muestreador automatizado de semillas y procedimientos de muestreo y ensayo de semillas

Info

Publication number: ES2402795T3
Application number: ES10184375T
Authority: ES
Inventors: Kevin Deppermann; Michael W. Petersen
Original assignee: Monsanto Technology LLC
Current assignee: Monsanto Technology LLC
Priority date: 2004-08-26
Filing date: 2005-08-26
Publication date: 2013-05-09
Anticipated expiration: 2025-08-26
Also published as: ZA200701589B; US11530963B2; US7849632B2; US20060048248A1; US20130244321A1; BRPI0514685B1; BRPI0514685A; US20110081716A1; EP1869961A3; EP1869961A2; MX2007002306A; US20060046264A1; EP1862051A2; US20060048247A1; ES2485892T3; EP2798947A3; WO2006026466A2; US7877926B2; CN102742394A; EP2279658B1

Abstract

Un sistema automatizado (20) para muestrear semillUn sistema automatizado (20) para muestrear semillas, comprendiendo el sistema: una estación de muesas, comprendiendo el sistema: una estación de muestreo (72) automatizada que tiene un muestreador (2treo (72) automatizada que tiene un muestreador (26) configurado para retirarmaterial de una semilla6) configurado para retirarmaterial de una semilla, caracterizado porque el material es retirado mie, caracterizado porque el material es retirado mientras se mantiene la viabilidad degerminación de lntras se mantiene la viabilidad degerminación de la semilla, y comprendiendo además un transportadora semilla, y comprendiendo además un transportador de semillas (32) configurado pararecibir la semil de semillas (32) configurado pararecibir la semilla desde fuera de la estación de muestreo, despuésla desde fuera de la estación de muestreo, después de que el material es retirado de lasemilla; y un de que el material es retirado de lasemilla; y un transportador de muestras (34) configurado para r transportador de muestras (34) configurado para recibir el material retirado de la semilla. ecibir el material retirado de la semilla.

Description

Muestreador automatizado de semillas y procedimientos de muestreo y ensayo de semillas

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a sistemas y procedimientos, para tomar muestras de materiales biológicos tales como semillas.

En el desarrollo y mejora de plantas, se realizan mejoras genéticas en la planta, bien mediante reproducción selectiva o manipulación genética, y cuando se consigue una mejora deseable, se desarrolla una cantidad comercial plantando y recolectando semillas a lo largo de varias generaciones. No todas las semillas expresan los rasgos deseados y, por tanto, es necesario desechar estas semillas de la población. Para acelerar el procedimiento de aumentar el volumen de la población, se toman muestras estadísticas y se ensayan para desechar semillas de la población que no expresan adecuadamente el rasgo deseado. Sin embargo, este muestreo estadístico permite necesariamente que algunas semillas sin el rasgo deseable permanezcan en la población y asimismo puede excluir accidentalmente algunas semillas con el rasgo deseable de la población deseada.

El documento WO 03/100381 A1 divulga el preámbulo de la reivindicación 1.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a sistemas y procedimientos para muestrear de manera no destructiva material de semillas. Los procedimientos están particularmente adaptados para la automatización, lo cual permite un mayor muestreo respecto de la práctica anterior. Con el muestreo no destructivo automatizado permitido por al menos algunas de las realizaciones de la presente invención, es posible ensayar cada semilla de la población y desechar aquellas semillas que no expresan el rasgo deseado. Esto acelera en gran medida el procedimiento de aumento de volumen de una población de semillas dada y puede dar como resultado una población final mejorada.

Las realizaciones de la presente invención facilitan el ensayo de la mayoría o de todas las semillas de una población antes de plantar, de manera que no se desperdician tiempo y recursos en el cultivo de plantas sin los rasgos deseados.

Generalmente, el sistema de la presente invención comprende: una estación de muestreo; un muestreador para retirar material de una semilla en la estación de muestreo; un transportador de semillas para transportar la semilla desde la estación de muestreo a un compartimento en una bandeja de semillas; y un transportador para transportar el material retirado de la semilla a un compartimento correspondiente en una bandeja de muestras.

Según el procedimiento de la presente invención, se suministran las semillas individualmente a una estación de muestreo; y se mantienen en la estación de muestreo mientras se toma una muestra de la semilla. Se transporta cada muestra a al menos un compartimento individual en una bandeja de muestras y cada semilla se transporta a un compartimento en una bandeja de muestras con una relación conocida con el/los compartimento(s) de la bandeja de muestras al/a los que se transportó la muestra correspondiente. Se pueden ensayar las muestras y se pueden clasificar las semillas basándose en los resultados del ensayo.

Este sistema y procedimiento de la presente invención facilitan el muestreo no destructivo automatizado de semillas. Permiten el ensayo y la clasificación de grandes volúmenes de semillas, facilitando de este modo el aumento de volumen de poblaciones de semillas con rasgos deseables. Esta y otras características y ventajas serán en parte evidentes, y en parte señaladas en lo sucesivo.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es una vista en perspectiva de una primera realización de un sistema muestreador de semillas construido según los principios de la presente invención;

la figura 2 es una vista en perspectiva ampliada del conjunto muestreador de semillas del sistema muestreador de semillas;

la figura 3 es una vista en perspectiva ampliada de la tolva y el mecanismo de alimentación de semillas del conjunto muestreador de semillas;

la figura 4 es una vista en perspectiva del husillo para raspar muestras de las semillas;

la figura 5 es una vista en perspectiva de la corredera para conducir el husillo;

la figura 6 es una vista en perspectiva del pistón en el mecanismo de alimentación de la tolva;

la figura 7 es una vista en perspectiva de un piso con una pluralidad de bandejas de semillas y bandejas de muestras montadas en el mismo;

la figura 8 es una vista en perspectiva del mecanismo de traslación bidimensional; la figura 9 es una vista en perspectiva de la entrada del transportador de semillas; la figura 10 es una vista en perspectiva de la salida del transportador de semillas; la figura 11 es una vista en perspectiva de la salida del transportador de muestras; la figura 12 es una vista en perspectiva del multiplicador de aire usado en los transportadores de semillas y

muestras;

la figura 13 es una vista superior en planta de un sistema muestreador de semillas de alto rendimiento según los

principios de la presente invención;

la figura 14 es una vista en alzado lateral del sistema muestreador de semillas de alto rendimiento;

la figura 15 es una vista en perspectiva frontal del sistema muestreador de semillas de alto rendimiento;

la figura 16 es una vista en perspectiva posterior del sistema muestreador de semillas de alto rendimiento;

la figura 17 es una vista en perspectiva de la estación de muestreo del sistema muestreador de semillas de alto

rendimiento;

la figura 18A es una vista en perspectiva parcial de una porción de la estación de muestreo de semillas, según los principios de la presente invención, con el husillo retraído; la figura 18B es una vista en perspectiva parcial de una porción de la estación de muestreo de semillas, según los

principios de la presente invención, con el husillo extendido;

la figura 19A es una vista en alzado lateral de la estación de muestreo de semillas, con el husillo en su posición retraída; la figura 19B es una vista en alzado lateral de la estación de muestreo de semillas, con el husillo en su posición

extendida; la figura 20 es una vista en sección transversal longitudinal de la estación de muestreo de semillas; la figura 21 es una vista en alzado de extremo frontal de la estación de muestreo de semillas; la figura 22 es una vista en sección transversal de la estación de muestreo de semillas; la figura 23A es una vista en alzado lateral de la rueda de selección de semillas; la figura 23B es una vista de despiece de la rueda de selección de semillas; la figura 23C es una vista en sección transversal vertical de la rueda de selección de semillas; la figura 24 es una vista en alzado frontal del mecanismo de alimentación; la figura 25 es una vista en alzado lateral del mecanismo de alimentación; la figura 26A es una vista en perspectiva del mecanismo de alimentación; la figura 26B es una vista en alzado lateral del mecanismo de alimentación; la figura 26C es una vista en sección transversal longitudinal del mecanismo de alimentación, tomada a lo largo del

plano de la línea 26C-26C de la figura 26B; la figura 26D es una vista en planta inferior del mecanismo de alimentación; la figura 27A es una vista en sección transversal longitudinal vertical del mecanismo de muestreo; la figura 27B es una vista en sección transversal vertical parcial ampliada del mecanismo de muestreo mostrado en

la figura 27A; la figura 28A es una vista en sección transversal vertical del mecanismo de muestreo; la figura 28B es una vista en sección transversal parcial ampliada del mecanismo de muestreo mostrado en la figura

28A; y la figura 29 es un alelograma que representa muestras de tejido de endospermo de maíz que se han sometido a

PCR para la detección de un polimorfismo PNS en particular.

Los números de referencia correspondientes indican las partes correspondientes en todas las diversas vistas de los dibujos.

Descripción detallada de las realizaciones preferentes

Una primera realización de un sistema muestreador automatizado de semillas construido según los principios de la presente invención se indica generalmente como 20 en la figura 1. El sistema muestreador de semillas 20 está adaptado para aislar una semilla de una tolva, suministrarla a una estación de muestreo, rascar una muestra de la semilla, transportar la muestra a un recipiente de semillas y transportar la semilla a un recipiente de semillas correspondiente. Como se muestra en la figura 1, el sistema muestreador de semillas comprende un soporte 22, un bastidor 24 sobre el soporte; un conjunto muestreador 26, un piso 28 montado sobre un mecanismo de traslación bidimensional 30, un transportador de semillas 32 para transportar semillas desde el conjunto muestreador de semillas y un transportador de muestras 34 para transportar una muestra retirada de una semilla al conjunto muestreador de semillas.

Como se muestra en la figura 1, en la primera realización preferente, el soporte 22 comprende un carro con ruedas 40, que tiene cuatro montantes verticales 42 conectados por miembros longitudinales superiores e inferiores 44 y 46, en la parte frontal y trasera, y por miembros transversales superiores e inferiores 48 y 50 en los lados izquierdo y derecho, y una tabla superior 52 montada sobre el mismo. Se puede montar una rueda 54 en la parte inferior de cada montante 42 para facilitar el desplazamiento del soporte 22. Los detalles de la construcción del soporte 22 no son críticos para la invención y, por lo tanto, el soporte 22 podría tener alguna otra configuración sin desviarse de los principios de la presente invención.

Como se muestra también en la figura 1, el bastidor 24 comprende cuatro vástagos 60 que se extienden verticalmente montados sobre la tabla superior 52, que soportan una placa 62 generalmente horizontal. El conjunto muestreador 26 se monta sobre la placa 62, como se describe más en detalle en lo sucesivo. Un eje 64 se monta también sobre la placa, y se extiende generalmente en horizontal desde la misma. El extremo libre del árbol 64 tiene un primer y un segundo montantes verticales 66 y 68 para montar un transportador de semillas 32 y partes del transportador de muestras 34, respectivamente. Los detalles de la construcción del bastidor 24 no son críticos para la invención y, por tanto, el bastidor podría tener alguna otra configuración sin desviarse de los principios de la presente invención.

Como se muestra en las figuras 1 y 2, el conjunto muestreador 26 se monta sobre la placa 62 del bastidor 24. El conjunto de muestras comprende un silo o tolva 70, una estación de muestreo 72 y un mecanismo de alimentación 74 para proporcionar una única semilla desde la tolva 70 a la estación de muestreo.

Como se muestra en las figuras 1 y 3, el piso 28 está adaptado para montar de manera segura una pluralidad de bandejas de semillas 80 y bandejas de muestras 82 en posiciones y orientaciones fijas. Preferentemente, cada una de las bandejas de semillas 80 y bandejas de muestras 82 se divide en una pluralidad de compartimentos. Preferentemente, el número y la disposición de los compartimentos de las bandejas de semillas 80 se corresponden con el número y la disposición de los compartimentos de las bandejas de muestras 82. Esto facilita la correspondencia unívoca entre una semilla y su muestra. Sin embargo, en algunas realizaciones puede ser deseable proporcionar múltiples compartimentos en la bandeja de muestras para cada compartimento de la bandeja de semillas, por ejemplo donde se pueden efectuar múltiples ensayos en las muestras, o donde se pueden tomar diferentes muestras de la misma semilla (por ejemplo, muestras de diferentes profundidades).

El piso 28 se monta sobre un mecanismo de traslación bidimensional 30, que en esta realización preferente comprende una base 90 con un primer accionador lineal 92 que tiene un carro desplazable 94 montado sobre una base 90, y un segundo accionador lineal 96, que tiene un carro 98 montado sobre el carro 94 del primer accionador lineal 92. El piso 28 se monta sobre el carro 98 del segundo accionador lineal 96 y, por tanto, se puede desplazar con precisión en dos dimensiones a través de la operación del primer y del segundo accionadores lineales 92 y 96.

El transportador de semillas 32 comprende un tubo 100 con un extremo de entrada 102 adyacente a la estación de muestreo 72 y un extremo de salida 104 montado sobre el montante 66 del bastidor 24. Hay un primer dispositivo Venturi 106 en el extremo de entrada 102 del tubo 100 para inducir un flujo de aire en el tubo hacia el extremo de salida 104 del tubo, y un segundo dispositivo Venturi 108 en el extremo de salida 104 del tubo 100 para inducir un flujo de aire hacia el extremo de entrada 102 del tubo. El primer dispositivo Venturi 106 se usa para crear un flujo de aire en el tubo y arrastrar una semilla de la estación de muestreo hacia dentro del tubo a lo largo del primer extremo. El segundo dispositivo Venturi 108 se usa después para crear un flujo de aire en la dirección opuesta, ralentizando de este modo la semilla para reducir la probabilidad de dañar la semilla cuando sale por el extremo de salida 104 del tubo y se suministra a un compartimento en la bandeja. En esta realización preferente, el segundo Venturi 108 detiene efectivamente el movimiento de la semilla, permitiendo que caiga por gravedad en su compartimento en una bandeja 80. Se pueden disponer diversos sensores de posición pueden disponerse sobre el tubo 100 para detectar la presencia de la semilla y confirmar la operación correcta del transportador de semillas 32.

El transportador de muestras 34 comprende un tubo 120 con un extremo de entrada 122 adyacente a la estación de muestreo 72 y un extremo de salida 124 montado en el montante 68 del bastidor 24. Hay un primer dispositivo Venturi 126 en el extremo de entrada 122 del tubo 120 para inducir un flujo de aire en el tubo hacia el extremo de salida 124 del tubo. Hay un separador 128 dispuesto en el extremo de salida para separar el material de muestra de la corriente de aire que lo lleva, de manera que la corriente de aire no saque la muestra del compartimento de la bandeja 82. Preferentemente, el separador contiene asimismo un filtro para evitar la contaminación cruzada de las muestras.

Como se muestra en la figura 2, el conjunto de muestreo de semillas 26 está adaptado para montarlo en la placa 62 sobre un montante 140. El conjunto de muestreo de semillas 26 comprende una placa de montaje de tolva 142, una placa de montaje de corredera 144 y cuatro soportes separados de corredera 146 entre las mismas. La tolva 70 (mostrada en la figura 3), que suministra semillas individuales a una estación de muestreo 72, se monta sobre la placa de tolva 142. La estación de muestreo 72 comprende un nido de semillas 148 montado en una montura de nido 150, que está soportada desde la placa de montaje de corredera 144 por un par de soportes separados 152. El nido 148 tiene un rebaje que se abre a su superficie inferior, dentro del cual la tolva 70 suministra una única semilla. Hay una ranura en la parte superior del nido de semillas 148 a través de la cual se expone una porción de una semilla en el rebaje. Un husillo 154 (figura 4) se monta en un portahusillos 156 que se monta sobre una placa de transición de corredera 158 sobre una corredera programable 160, con un bloque de sujeción de husillo 162. La corredera programable 160 (figura 5) se monta sobre la cara inferior de la placa de montaje de corredera 144 y desplaza el husillo 154 a través de la ranura del nido de semillas 148 para retirar una muestra de una semilla en el rebaje del nido de semillas.

Como se observa mejor en la figura 4, el husillo 154 tiene una pluralidad de dientes 164 que aumentan en altura hacia el extremo proximal, de manera que a medida que el husillo 154 avanza en la ranura, corta cada vez más profundamente en la semilla en el rebaje del nido 148. El raspado gradual resultante reduce el daño a la semilla, protegiendo su viabilidad. Además, como se describe más en detalle en lo sucesivo, cortando a diferentes profundidades en momentos diferentes, se pueden separar muestras de diferentes profundidades de la misma semilla para su análisis por separado.

Un tubo de transferencia de muestras 166 se extiende desde el rebaje del nido de muestras 148 y tiene un conector 168 sobre su extremo para su conexión al transportador de muestras 34.

La estación de muestreo 26 incluye asimismo una tolva 70, que se observa mejor en la figura 3. La tolva 70 comprende placas de montaje de tolva izquierda y derecha 170 y 172, y una placa de montaje de cilindro 174 y un soporte de cilindro superior 176. La tolva 70 tiene asimismo un panel frontal 178, un panel trasero 180, paneles en el primer y el segundo extremo 182 y 184 y un fondo 186. Un divisor 188 divide la tolva en un primer y un segundo compartimentos 190 y 192. El primer compartimento 190 contiene un suministro de semillas que se transfieren individualmente al segundo compartimento 192.

Un accionador de pistón 194 acciona un pistón 196 para extraer una semilla del primer compartimento. Un conjunto de chorro de aire 198 transfiere una semilla desde el extremo del pistón 196 al segundo compartimento 192. El segundo compartimento tiene un fondo conformado 200 con un pocillo 202 para recibir la semilla y colocarla. Un accionador de pistón 210 acciona un pistón 214 para extraer una semilla del segundo compartimento 192. Se usa un conjunto de chorro de aire 216 para agitar las semillas durante el procedimiento de recogida de semillas.

Como se muestra en la figura 7, el piso 28 tiene soportes 220 para montar bandejas de semillas 80 y bandejas de muestras 82 que se están registrando de manera que el transportador de semillas y el transportador de muestras suministran semillas y muestras a los compartimentos correspondientes, en las bandejas respectivas. Las bandejas de muestras 82 pueden (como se muestra) adaptarse para contener viales individuales. Evidentemente, se pueden usar bandejas de diferentes configuraciones, por ejemplo donde se disponen múltiples compartimentos para múltiples muestras de la misma semilla. Por ejemplo, donde una muestra se divide en varias muestras, o donde las muestras se separan del emplazamiento donde se han tomado, por ejemplo por profundidad.

Como se muestra en la figura 8, el mecanismo de traslación bidimensional 30 incluye asimismo una corredera 230 que tiene un carril 232 y un carro 234, que se posiciona en paralelo al primer accionador lineal 92. El segundo accionador 96 se monta sobre el carro 94 que tiene el carro 98 montado sobre el carro 94 del primer accionador lineal 92. El piso 28 se monta sobre el carro 98 del segundo accionador lineal 96 y, por tanto, se puede desplazar con precisión en dos dimensiones a través de la operación del primer y el segundo accionadores lineales 92 y 96. Bajo el control apropiado, el mecanismo de traslación puede alinear compartimentos individuales de las bandejas de semillas 80 y las bandejas de muestras 82 con las salidas del transportador de semillas y el transportador de muestras.

Como se muestra en la figura 9 en el extremo de entrada 102 del tubo 100 del transportador de semillas 32, un soporte 240 lleva montados un amplificador de aire 242 y un tubo sensor de semillas 244. El soporte 240 comprende las secciones 246, 248, 250, 252 y 254. Como se muestra en la figura 2, el soporte 240 se monta en la placa de montaje de tolva 142. El amplificador de aire 242 (mostrado en la figura 12) está adaptado para conectarse a una fuente de aire comprimido. Cuando se aplica aire al amplificador de aire, éste induce un flujo de aire a través del tubo 100, empleando el efecto Venturi. El tubo sensor 244 lleva sensores de semillas 256 para detectar el paso de una semilla a través del mismo. Preferentemente, los sensores 256 son sensores ópticos alineados con aberturas en el tubo sensor 244 que detectan ópticamente el paso de una semilla.

Como se muestra en la figura 10, un conjunto de descarga de semillas 260 se dispone en el extremo de salida 104 del tubo 100 del transportador de semillas 32. El conjunto de descarga se monta sobre el montante 66, con un soporte 262 y un soporte de descarga 264. Un tubo sensor de semillas 266 se monta en el soporte 262, y lleva sensores de semillas 268 para detectar el paso de una semilla a través del mismo. Preferentemente, los sensores 268 son sensores ópticos alineados con aberturas en el tubo sensor 266 que detectan ópticamente el paso de una semilla. Un amplificador de aire 270 se conecta al tubo sensor de semillas 266. El amplificador de aire 270 (Figura 12) está adaptado para conectarse a una fuente de aire comprimido. Cuando se aplica aire comprimido al amplificador de aire, éste induce un flujo de aire a través del tubo 100, empleando el efecto Venturi. Por debajo del amplificador de aire 270 se encuentra un tubo conector 272, y por debajo de él hay un tubo de descarga de semillas ventilado 274, que está asimismo soportado por un portatubo de descarga de semillas 276, llevado sobre un accionador de tubo de descarga de semillas 278.

El extremo de entrada 122 del tubo 120 del transportador de muestras 34 se conecta mediante el conector 168 al tubo de descarga de muestras 166. Como se muestra en la figura 11, el extremo de salida 124 del tubo 120 se conecta a un conector de muestra 280, que a su vez se conecta al amplificador de aire 282, que se conecta al conjunto de boquilla de fragmentos 284. El conjunto de boquilla de fragmentos 284 se monta sobre el portatubo de descarga de semillas 286, llevado sobre un accionador de descarga 288. El accionador de descarga se monta sobre el montante 68. En las salidas del conjunto de boquilla de chip 284 se montan filtros 290, para evitar que las muestras que se están descargando contaminen los otros compartimentos.

Operación del sistema muestreador

En operación, una pluralidad de semillas, por ejemplo semillas de soja, se depositan en la tolva 70. El mecanismo de alimentación de semillas 74 transporta una semilla individual a la estación de muestreo 72. En la estación de muestreo, se retira una muestra de material de la semilla de una manera que reduce al mínimo el impacto sobre la viabilidad de la semilla.

La muestra se retira de la estación de muestreo 72 por el transportador de muestras 34. El dispositivo Venturi 126 crea un flujo de aire en el tubo 120 hacia el extremo de salida 124. Se arrastra el material de muestra dentro del tubo y hacia el compartimento de la bandeja de muestras alineado con el extremo de salida 124 del tubo 120. El separador 128 separa la muestra de la corriente de aire que la lleva y permite que la muestra caiga dentro del compartimento. En algunas realizaciones, la muestra se puede distribuir en dos o más compartimentos en la misma bandeja, en cuyo caso el mecanismo de traslación bidimensional 30 se usa para poner uno o más compartimentos adicionales en alineación con la salida 124. Es posible coordinar con precisión el movimiento de las bandejas de muestras con la operación de la estación de muestreo 72 de manera que se puedan proporcionar muestras de diferentes porciones de la semilla, y en particular diferentes profundidades de la semilla, a compartimentos separados en la bandeja de muestras.

Después de terminar el muestreo de la semilla, se acciona el transportador de semillas 32 para retirar la semilla de la estación de muestreo. El primer dispositivo Venturi 106 se acciona para crear un flujo de aire en el tubo y arrastrar una semilla de la estación de muestreo 72 dentro del tubo 100. El segundo dispositivo Venturi 108 se acciona después para crear un flujo de aire en la dirección opuesta, permitiendo de este modo ralentizar la semilla para reducir el daño a la semilla al salir por el extremo de salida 104 del tubo 100 y se suministra a un compartimento de la bandeja de semillas 82. Preferentemente, el segundo Venturi 108 detiene el movimiento de la semilla, permitiendo que caiga por gravedad en su compartimento en una bandeja 80. La operación del primer y el segundo Venturi 106 y 108 se puede programar, o se pueden poner en marcha por sensores de posición que vigilan el tubo 100.

Una realización de un sistema muestreador de semillas de alto rendimiento se indica generalmente como 500 en las figuras 13-26. Como se muestra en las figuras 13 y 14, el sistema muestreador de semillas 500 comprende una estación de muestreo 502, una estación de manipulación de muestras 504 y una estación de manipulación de semillas 506. Es deseable, pero no esencial, que el sistema muestreador de semillas 500 esté ajustado en uno o más carros con ruedas que pueden pasar a través de puertas convencionales, de manera que se pueda transportar el sistema de manera cómoda. En esta realización preferente, la estación de muestreo de semillas 502 se monta sobre un carro 508, la estación de manipulación de muestras se monta sobre un carro 510 y la estación de manipulación de semillas se monta sobre un carro 512.

La estación de muestreo de semillas 502 comprende un alimentador de semillas 514 y una trituradora de semillas

516. Una pluralidad de columnas 518 se extienden verticalmente hacia arriba desde la superficie 520 del carro 508 Una plataforma 522 se monta sobre la parte superior de las columnas 518 y soporta la trituradora de semillas 514. Dos soportes en forma de L 524 se extienden horizontalmente desde las columnas 518 y soportan una plataforma

526. Un piso 528 se monta sobre la plataforma 526 mediante una pluralidad de montantes 530 y soporta el alimentador de semillas 514.

Una pluralidad de pilares 532 se extienden hacia arriba desde la placa 522. Una placa 534 se monta sobre los pilares 532. Una pluralidad de montantes 536 penden de la placa 534 y soportan un estante 538.

Como se muestra en las figuras 13, 14, 15 y 16, el alimentador de semillas 514 comprende una tolva 550, con una superficie conformada adaptada para alimentar semillas depositadas en la tolva hacia una rueda de separación 552 (véanse también las figuras 23A a 23C). La rueda de separación 552 se monta para girar en un plano vertical adyacente a la tolva 550 y tiene una pluralidad de rebajes espaciados 554 que tienen cada uno una abertura 556 en su interior que comunica con un sistema de vacío (no mostrado). La rueda 552 avanza con un motor de indexación

560. Las semillas individuales son recogidas por los rebajes 554 en la rueda 552 y se mantienen en los rebajes por succión del sistema de vacío por las aberturas 556. Una escobilla 562 barre las semillas individuales de los rebajes 554, permitiendo que caigan a través de una guía 564 dentro de una abertura en un distribuidor 566.

Como se muestra en las figuras 24-26, el distribuidor 566 comprende un árbol 568 que tiene una pluralidad (seis en la realización preferente) de pasos 570 que se extienden transversalmente a través del mismo. Las camisas 572 y 574 se montan de forma deslizante sobre cada extremo del árbol 568 para trasladarse entre la primera posición (interior) y la segunda posición (exterior). Las camisas 572 y 574 tienen una pluralidad de pares de aberturas alineadas 576 y 578 sobre lados opuestos de las mismas. Las aberturas 576 son alargadas y las aberturas 576 y 578 están dimensionadas y dispuestas de manera que cuando las camisas 572 y 574 están en su primera posición (interior) (en el lado izquierdo en la figura 24), una parte de las aberturas alargadas 576 se alinea con un paso 570 del árbol 568 y cuando las camisas se encuentran en su segundas posiciones (exteriores) una porción de las aberturas alargadas 576 y las segundas aberturas 578 se alinean con el paso (en el lado derecho en la figura 24). Un accionador 580 desliza selectivamente las camisas 572 y 574 entre sus posiciones primera y segunda.

El distribuidor 566 se monta mediante un soporte 582 sobre el carro 584 de un accionador lineal 586, para trasladar respecto de la guía 564, poniendo sucesivamente cada uno de los pasos 570 del árbol 568 en alineación con la guía 564 para que una semilla se pueda depositar en su interior. Un sensor de semillas (no mostrado) se puede montar adyacente a la guía 564 para confirmar que una semilla se deposita en cada paso 570. Una pluralidad de boquillas de aire 590 se montan en el piso 528 y se alinean con los pasos 570 cuando el distribuidor 566 se desplaza dentro a su posición de dispensación por el accionador 586. Un tubo 592 se alinea con cada paso 570 y cada tubo se conecta a una de una pluralidad de estaciones de muestreo de semillas 600 en la trituradora de semillas 516. Las camisas 572 y 574 se trasladan permitiendo a las semillas en los pasos 570 caer dentro de los tubos 592 Una de las boquillas 590 se alinea con cada uno de los pasos 570, y se acciona para facilitar el movimiento de las semillas desde los pasos 570 a través de los tubos 592 a sus estaciones de muestreo de semillas 600 respectivas.

Preferentemente, hay un orificio 596 a través de la tolva 550 que se alinea con la abertura 556 en cada rebaje 554 a medida que la rueda 552 gira. El orificio 596 se puede conectar a un aspirador para extraer cualquier suciedad o fragmentos de cáscaras de semillas o semillas que pueda atascar las aberturas 556 en el rebaje 554 y dificultar la capacidad de la rueda 552 de seleccionar semillas individuales de la tolva 550.

La trituradora de semillas 516 comprende al menos una, y en esta realización preferente seis, estaciones de muestreo 600. Cada estación de muestreo de semillas 600 retira una muestra de material de una semilla suministrada a la misma. En esta realización preferente, las estaciones de muestreo 600 se disponen o agrupan en dos grupos de tres, pero el número y disposición de las estaciones de muestreo podría variar. La estación de manipulación de muestras 504 recibe muestras de tejido retiradas de una semilla y transportadas desde cada estación de muestreo 600. Asimismo, la estación de manipulación de semillas 506 recibe una semilla después de haberse retirado una muestra de la semilla y la semilla se transporta desde la estación de muestreo 600.

Cada estación de muestreo 600 tiene un anillo de entrada 602 conectado al tubo 592, que se abre a una cámara

604. La superficie de fondo de la cámara 604 está formada por el extremo de una varilla 606 de accionador 608. La superficie del fondo está por debajo del anillo de entrada 602 para garantizar que toda la semilla cae dentro de la cámara 604 y no queda atrapada en una posición solo parcialmente en la cámara. Un respiradero 610 se puede situar opuesto al anillo de entrada 602 para permitir que el aire de las boquillas de aire 590 se escape. El respiradero 610 se puede cubrir con una rejilla de malla 612 para evitar que la semilla se escape de la cámara 604 y para amortiguar la semilla cuando se suministra al interior de la cámara.

Esta varilla 606 extrae una semilla de la cámara 604 y la introduce dentro de un rebaje de recepción de semillas 614 en la parte inferior de una placa de muestreo de semillas 616. La placa de muestreo 616 tiene una abertura de muestreo 618 a través de la cual sobresale una semilla en el rebaje de recepción de semillas 614. Un surco de muestreo 620 se forma en la superficie superior de la placa de muestreo 616 de manera que una porción de una semilla en el rebaje 614 sobresale dentro del surco. La placa de muestreo 616 tiene también aberturas lateralmente orientadas 622 y 624 en su interior alineadas con el rebaje de recepción de semillas 614. Cuando la varilla 606 extrae una semilla proporcionada a la estación de muestras 600 y la introduce en el rebaje 614 de la placa 616, los dedos 626 y 628 se extienden transversalmente a través de las aberturas 622 y 624 y son accionados por el accionador 630 para enganchar y comprimir la semilla. Se ha descubierto que la compresión de al menos algunos tipos de semillas durante el procedimiento de muestreo puede mejorar la viabilidad de las semillas después del muestreo. Para semillas tales como las semillas de soja, se ha descubierto que una presión compresiva mejora la viabilidad de las semillas, y que la presión compresiva de entre aproximadamente 17,24 kPa (2,5 libras) y aproximadamente 34,47 kPa (5 libras) es suficiente para potenciar la viabilidad.

Un husillo de muestreo 650 que tiene una pluralidad de bordes de corte 652 oscila en el surco 620 de manera que los bordes de corte 652 pueden raspar una muestra de una semilla retenida en el rebaje 614 por la varilla 606 y los dedos 626 y 628. Los bordes de corte 652 son preferentemente paralelos y están orientados formando un ángulo oblicuo inferior a 90º respecto de la dirección de avance del husillo. Es deseable, pero no esencial, que los bordes de corte 652 formen un ángulo suficiente para que un borde permanezca en contacto con la semilla en todo momento. El ajuste en ángulo de los bordes de corte permite que la siguiente cuchilla entre en contacto con la semilla antes de que la cuchilla actual pierda el contacto con la semilla. En la realización preferente, los bordes de corte se orientan formando un ángulo de aproximadamente 60º, aunque este ángulo dependerá en alguna medida de la anchura del husillo. La anchura del husillo puede también ser importante para preservar la viabilidad de las semillas después del muestreo y puede variar dependiendo del tipo de semilla y su contenido en humedad.

Los bordes de corte 652 están escalonados, siendo cada corte progresivamente más profundo que el anterior. La cantidad de material de muestra y la profundidad del corte se pueden controlar controlando el avance del husillo 650. Para muestras más pequeñas y profundidades más superficiales de corte, la carrera del husillo 650 es menor, y para muestras mayores o profundidades más profundas de corte, la carrera del husillo es más larga. Para carreras parciales, los tejidos de la semilla pueden quedar atrapados entre los bordes 652. El husillo 650 puede avanzar y retraerse para ayudar a la liberación de toda la muestra. Por ejemplo, después de la liberación de la semilla, el husillo puede avanzar y retraerse para ayudar a retirar el tejido de semilla atrapado entre los bordes de corte. Todo el intervalo de desplazamiento del husillo 650 se muestra en las figuras 19A y 18B.

El husillo de muestreo 650 es dirigido preferentemente por un accionador lineal 654. En la realización preferente, tres husillos 650 son dirigidos por un solo accionador 654. Usar un único accionador para accionar múltiples husillos ahorra espacio y es más económico.

Un sistema de transporte de muestras 656 que comprende un conducto 658 que tiene una entrada 660 que comunica con un paso 662 que se abre a la abertura de muestreo 618 y el surco 620 en la placa de muestreo 616 retira muestras de tejido realizadas por la acción de los bordes de corte 652 del husillo de muestreo 650. El conducto 658 trasporta la muestra a la salida 664 donde se deposita en un único portamuestras en la estación de manipulación de muestras 504. Este portamuestras puede ser, por ejemplo, un pocillo 666 en una bandeja 668 montada en una tabla de indexación x-y 670 sobre el carro 510, de manera que se pueda determinar la relación entre las muestras y sus semillas respectivas. El sistema de transporte de muestras 656 incluye un chorro de aire 672 que induce un flujo de aire a través del conducto 658 para desplazar la muestra a través del conducto.

Se puede montar un segundo mecanismo de muestreo sobre el accionador lineal 654 y se mueve con el husillo 650. El segundo mecanismo de muestreo puede comprender un dispositivo de toma de muestras de núcleo 674, que tiene una herramienta de toma de muestras del núcleo 676 para tomar una muestra cilíndrica de la semilla del corte hecho por el husillo 650. El tejido de esta muestra procede de una zona más profunda que el tejido raspado por el husillo 650 y proporciona una información diferente. En algunas realizaciones, el material retirado por el husillo 650 simplemente se puede desechar y solo se conserva el material tomado por el dispositivo de toma de muestras del núcleo 674. En algunas realizaciones pueden conservarse ambas muestras y almacenarlas por separado para ensayarlas por separado. En otras realizaciones más, la única muestra es la muestra retirada por el husillo 650. En las realizaciones sin el segundo mecanismo de muestreo, se pueden sustituir el dispositivo de toma de muestras del núcleo 674 y la herramienta de toma de muestras del núcleo 676 por un accionador con una varilla de empuje simple que se extiende a través de la abertura de muestreo 618 para ayudar a empujar a una semilla hasta el rebaje 614.

Después de la operación de muestreo, un mecanismo de transporte de semillas 680, que tiene un rebaje 614 adyacente a una entrada 682 para introducir semillas después de que hayan sido liberadas por los dedos 626 y 628 y la varilla 606, hace descender la semilla. El sistema de transporte de semillas 680 transporta las semillas a un receptáculo para semillas único de la estación de manipulación de semillas 506 del carro 512. Este receptáculo para semillas puede ser, por ejemplo, un pocillo 684 de una bandeja 686 montada en una tabla de indexación x-y 688 en el carro 612, de tal manera que se puede determinar la relación entre muestras y sus respectivas semillas. El mecanismo de transporte de semillas 680 incluye un chorro de aire 690 que induce un flujo de aire a través del conducto 680 para desplazar la muestra a través del conducto.

Operación

En operación, una pluralidad de semillas, por ejemplo semillas de soja, se descargan en la tolva 550 del sistema de muestreo 500. Estas semillas fluyen por gravedad hacia el disco 552, la succión a través de los orificios 556 retiene una semilla en cada cavidad 554. A medida que el disco 552 gira mediante el motor de indexación 560, las semillas individuales se barren del disco mediante la escobilla 562, y caen por gravedad a través de la guía 564 hacia la salida. El accionador lineal 586 desplaza el distribuidor 566 para que cada paso 570 del distribuidor se alinee con la guía 564 para cargar una semilla a través de la abertura 576 y dentro del paso 570. Cuando todos los pasos 570 en el distribuidor 566 están llenos, el accionador lineal 568 desplaza el distribuidor a la posición de carga de sus semillas dentro de las estaciones de muestreo 600 en la trituradora de semillas 516. Las camisas 572 y 574 se desplazan mediante el accionador 580, que alinea las aberturas 578 con los pasos 570, permitiendo que las semillas en los pasos 570 caigan dentro de los tubos 592 que conducen a las unidades de muestreo 600. Las boquillas 590 proporcionan una ráfaga de aire que ayuda a empujar las semillas desde los pasos 570 a través de los tubos 592 a las cámaras 604 de las unidades de muestreo 600.

Preferentemente todos los pasos 570 se cargan en serie y descargan sus semillas simultáneamente a las unidades de muestreo 600, pero el distribuidor se podría programar para que funciones de alguna otra manera. Una vez que las semillas llegan a las estaciones de muestreo 600, las varillas 606 extraen las semillas y las introducen en los rebajes 614 en la parte inferior de las placas 616. Los rebajes 614 se pueden dimensionar y conformar para ayudar a orientar de manera óptima la semilla. En los rebajes 614, una porción de las semillas sobresale a través de los orificios de muestreo 618 y dentro de los surcos 620. Los husillos 650 se trasladan a los surcos 620 permitiendo que sus bordes de corte 652 retiren material de las porciones de las semillas que sobresalen dentro de los surcos 620 y formando pequeños cortes en las semillas. A medida que cada husillo 650 retira material, el sistema de transporte de muestras 656 arrastra el material de muestra a través del paso 662 y dentro de la entrada 660. Las muestras se desplazan en los conductos 658 alejándose de las estaciones de muestreo 600 a una localización de almacenamiento de muestras, tal como pocillos 666 en una bandeja de muestras 668. Una segunda muestra puede ser tomada por la herramienta de toma de muestras del núcleo 676 del dispositivo de muestreo 674 a través de la abertura 618 en la placa de muestreo 616. Después de terminar el muestreo, la varilla 606 se retrae, y a medida que la semilla cae el sistema de transporte de semillas muestreadas 680 transporta la semilla muestreada a una localización de almacenamiento de semillas, tal como un pocillo 684 en una bandeja de semillas 686.

Las tablas de indexación 670 y 688 se desplazan para alinear diferentes pocillos con las salidas del sistema de transporte de muestras 656 y el sistema de transporte de semillas 680 y se repite el proceso de muestreo. Cuando todos los pocillos 666 de una bandeja de muestras 668 están llenos, las muestras de la bandeja de muestras se pueden ensayar y las semillas en la bandeja de semillas 686 correspondiente se pueden seleccionar basándose en los resultados del ensayo de muestras. Preferentemente, el muestreo no afecta de manera sustancialmente adversa a la viabilidad de las semillas.

Aplicaciones

La presente invención proporciona procedimientos para analizar semillas que tienen un rasgo, marcador o genotipo deseado. En un aspecto de la invención, los procedimientos analíticos permiten analizar semillas individuales que están presentes en una partida o una población a granel de semillas, de forma que se pueden determinar las características químicas y/o genéticas de las semillas individuales.

Se pueden usar muestras preparadas por la presente invención para determinar una gran variedad de rasgos físicos, químicos y/o genéticos. Los ejemplos de análisis químicos para su uso en los procedimientos de la presente invención incluyen el contenido en almidón, contenido en proteínas, contenido en aceites, la determinación de perfiles de ácidos grasos, etc.

En una realización, los procedimientos y dispositivos de la presente invención se pueden usar en un programa de reproducción para seleccionar plantas o semillas que tienen un rasgo o genotipo marcador deseados. Los procedimientos de la presente invención se pueden usar en combinación con cualquier metodología de reproducción y se pueden usar para seleccionar una única generación o para seleccionar múltiples generaciones. La elección de los procedimientos de reproducción depende del modo de reproducción de las plantas, siendo la heredabilidad del/de los rasgo(s) mejorada, y del tipo de variedad de cultivo usado comercialmente (por ejemplo, variedad de cultivo híbrido F1, variedad de cultivo de línea pura, etc.). En lo sucesivo se establecen enfoques no limitativos seleccionados para cultivar las plantas de la presente invención. Cabe entender además, que se puede utilizar cualquier variedad de cultivo comercial y no comercial en un programa de reproducción. Los factores tales como, por ejemplo, vigor de emergencia, vigor vegetativo, tolerancia al estrés, resistencia a enfermedades, ramificación, floración, desarrollo de semillas, dimensión de semillas, densidad de semillas, resistencia y desgranabilidad, etc. dictarán generalmente la elección.

En una realización particular, los procedimientos de la presente invención se usan para determinar las características genéticas de semillas en un programa de reproducción asistido por marcadores. Tales procedimientos permiten programas de reproducción asistidos por marcadores mejorados en los cuales se puede llevar a cabo el muestreo directo de semillas de manera no destructiva mientras se mantiene la identidad de los individuos del muestreador de semillas al campo. En consecuencia, el programa de reproducción asistido por marcadores da como resultado una plataforma de “alto rendimiento” en la cual una población de semillas que tiene un rasgo, marcador o genotipo deseado se pueden agrupar más eficazmente en un periodo de tiempo más corto, con menos recursos requeridos de campo y de mano de obra. Tales ventajas se describirán de manera más completa en lo sucesivo.

En una realización, la presente invención proporciona un procedimiento para analizar semillas individuales dentro de una población de semillas que tienen diferencias genéticas. El procedimiento comprende retirar una muestra que comprende células con ADN de semillas de la población sin afectar a la viabilidad de germinación de las semillas; cribar el ADN extraído de la muestra para detectar la presencia o ausencia de al menos un marcador genético; seleccionar semillas de la población basándose en los resultados del cribado de ADN; y cultivar plantas a partir de la semilla seleccionada.

Como se ha descrito anteriormente, los sistemas y procedimientos de muestreo de la presente invención protegen la viabilidad de germinación de las semillas, de forma que no son destructivos. La viabilidad de germinación significa que un número predominante de semillas muestreadas (es decir, más del 50 % de todas las semillas muestreadas), siguen siendo viables después del muestreo. En una realización particular, al menos aproximadamente el 75 % de las semillas muestreadas, y en algunas realizaciones al menos aproximadamente el 85 % de las semillas muestreadas siguen siendo viables. Cabe resaltar que pueden ser tolerables tasas de viabilidad de germinación inferiores en determinadas circunstancias o para determinadas aplicaciones, por ejemplo, como la reducción de los costes de genotipado con el tiempo porque un mayor número de semillas se podría muestrear con el mismo coste de genotipo.

En otra realización, la viabilidad de germinación se mantiene durante al menos seis meses después del muestreo para garantizar que la semilla muestreada será viable hasta que llegue al campo para plantarla. En una realización particular, los procedimientos de la presente invención comprenden, además, tratar las semillas muestreadas para mantener la viabilidad de germinación. Tal tratamiento puede incluir generalmente cualquier medio conocido en la técnica para proteger una semilla de las condiciones ambientales durante el almacenamiento o el transporte. Por ejemplo, en una realización, las semillas muestreadas se pueden tratar con un polímero y/o un fungicida para proteger la semilla muestreada durante el almacenamiento o el transporte al campo antes de plantarla.

El ADN se puede extraer de la muestra usando cualquier procedimiento de extracción de ADN conocido por el experto en la técnica que proporcione rendimiento de ADN, calidad de ADN y respuesta de PCR suficientes. Un ejemplo no limitativo de procedimientos de extracción de ADN apropiados es la extracción basada en SDS con centrifugación. Además, el ADN extraído se puede amplificar después de la extracción usando cualquier procedimiento de amplificación conocido por el experto en la técnica. Por ejemplo, un procedimiento de amplificación apropiado es la preparación de amplificación de ADN GenomiPhi® de AmershamBiosciences.

El ADN extraído se criba para detectar la presencia o ausencia de un marcador genético apropiado. Una gran variedad de marcadores genéticos están disponibles y son conocidos por el experto en la técnica. El cribado de ADN para detectar la presencia o ausencia del marcador genético se puede usar para la selección de semillas en una población de reproducción. Los alelos, QTL, o haplotipos por los que se van a seleccionar se pueden identificar usando técnicas de biología molecular más nuevas con modificaciones de las estrategias de reproducción clásicas.

En una realización, la semilla se selecciona basándose en la presencia o ausencia de un marcador genético que está genéticamente relacionado con un QTL. Los ejemplos de QTL que son a menudo de interés incluyen pero no se limitan a rendimiento, resistencia al encamado, altura, madurez, resistencia a enfermedades, resistencia a plagas, resistencia a deficiencia de nutrientes y composición del grano. Alternativamente, la semilla se puede seleccionar basándose en la presencia o ausencia de un marcador que está relacionado genéticamente con un haplotipo asociado a un QTL. Los ejemplos de tales QTL pueden de nuevo incluir sin limitación rendimiento, resistencia al encamado, altura, madurez, resistencia a enfermedades, resistencia a plagas, resistencia a deficiencia de nutrientes y composición del grano.

La selección de una población de reproducción se puede iniciar ya en el nivel de reproducción F2, si se usan progenitores endógamos homocigóticos en el cruce de reproducción inicial. Una generación F1 también se podría muestrear y avanzar si uno o más de los progenitores del cruce son heterocigóticos para los alelos o marcadores de interés. El reproductor puede cribar cualquier población F2 para recuperar el genotipo marcador de cada individuo en la población. Las dimensiones de población iniciales, limitadas solo por el número de semillas disponibles para cribar, se pueden ajustar para cumplir con la probabilidad deseada de identificar con éxito el número deseado de individuos. Véase Sedcole, J.R. “Number of plants necessary to recover a trait”. Crop Sci. 17:667-68 (1977). En consecuencia, la probabilidad de encontrar el genotipo deseado, la dimensión de población inicial y la dimensión de población resultante objetivo se pueden modificar para diversas metodologías de reproducción y el nivel de endogamia de la población muestreada.

Las semillas seleccionadas se pueden agrupar o mantener separadas dependiendo de la metodología de reproducción y el objetivo. Por ejemplo, cuando un reproductor está cribando una población F2 para resistencia a enfermedades, todos los individuos con el genotipo deseado se pueden agrupar y plantar en el vivero de cría. Por el contrario, si se seleccionan múltiples QTL con efectos variables para un rasgo tal como el rendimiento de granos a partir de una población dada, el reproductor puede mantener la identidad individual preservada, yendo al campo para diferenciar individuos con varias combinaciones del QTL objetivo.

Se pueden usar varios procedimientos para preservar la identidad de semilla individual mientras se transfiere la semilla del laboratorio de triturado al campo. Los procedimientos incluyen, pero no se limitan a, transferir individuos seleccionados a una banda de semillas, una bandeja de casete o la bandeja de indexación, trasplantar con macetas con turba y plantar a mano a partir de paquetes de semillas individuales.

Se pueden usar múltiples ciclos dependiendo de los objetivos de reproducción y la complejidad genética.

Las ventajas de usar los procedimientos de cribado de la invención incluyen, sin limitación, la reducción de mano de obra y recursos de campo requeridos por población o línea de reproducción, aumento de la capacidad para evaluar un mayor número de poblaciones de reproducción por unidad de campo y aumento de la capacidad para cribar poblaciones de reproducción para detectar rasgos deseados antes de plantar. Los recursos de campo por población se reducen limitando el espacio de campo requerido para avanzar los genotipos deseados. Por ejemplo, una población de 1.000 individuos se puede plantar en 25 semillas por fila consumiendo un total de 40 filas en el campo. Usando el muestreo de tejido convencional, las 1.000 plantas se catalogarían y muestrearían manualmente evaluando el tejido foliar. Los resultados del marcador molecular serían necesarios antes de la polinización y solo se polinizarían las plantas que contienen la composición genética deseada. De este modo, si se determinase que 50 semillas contenían la composición genética deseada, la metodología de reproducción convencional requeriría la plantación de 1.000 plantas para obtener 50 semillas. Por el contrario, los procedimientos de cribado de la presente invención permiten al reproductor cribar las 1.000 semillas en el laboratorio y seleccionar las 50 semillas deseadas antes de la plantación. Los 50 individuos se pueden plantar después en el campo, consumiendo solo dos filas de 25 semillas. Además, los procedimientos de cribado de la presente invención no requieren catalogación o muestreo en el campo, reduciendo de este modo de manera significativa los recursos de mano de obra necesarios.

Además de reducir el número de filas de campo por población, los procedimientos de cribado de la invención pueden aumentar adicionalmente el número de poblaciones que el reproductor puede evaluar en un vivero de cría dado. Usando el ejemplo anterior en el cual 50 semillas de cada población de 1.000 semillas contenían la composición genética deseada, un reproductor que aplica los procedimientos de la invención podrían evaluar 20 poblaciones de 50 semillas cada una usando la misma área de campo consumida por una única población usando técnicas de muestreo de tejido de campo convencionales. Incluso si se seleccionan las poblaciones para un único alelo, usando una relación de segregación esperada de 1:2:1 para una población F2, el reproductor podría evaluar 4 poblaciones en la misma área de campo que una población muestreada de tejido en un solo campo.

Una ventaja potencial adicional de la división de semillas es que se podría usar para mitigar los riesgos asociados con el cultivo de plantas en algunas zonas geográficas en las que las plantas pueden crecer con dificultad o experimentar condiciones ambientales pobres, o incluso destruirse durante las tormentas. Por ejemplo, las semillas con el “mejor” genotipo o composición de marcadores se podrían plantar en la zona geográfica 1 y las semillas con el “siguiente mejor” genotipo se podrían plantar en la zona geográfica 2. En este caso, la zona geográfica 2 sería una copia de seguridad en caso de que se produzca cualquier problema en las plantas cultivadas en la zona geográfica 1. Esto es muy difícil de llevar a cabo con el procedimiento tradicional de toma de muestras de tejido de plantas germinadas para genotipado, porque entonces sería necesario arrancar estas plantas y trasplantarlas en la segunda zona geográfica. El uso de los procedimientos de la presente invención evita el problema del trasplante.

Los procedimientos de cribado de la invención se pueden usar, además, en un programa de reproducción para la introgresión de un rasgo en una planta. Tales procedimientos comprenden retirar una muestra que comprende células con ADN de semillas de una población, cribar el ADN extraído de cada semilla para detectar la presencia o ausencia de al menos un marcador genético, seleccionar semillas de la población basándose en los resultados del cribado de ADN; cultivar una planta fértil a partir de la semilla; y usar la planta fértil bien como un progenitor hembra

o un progenitor macho en un cruce con otra planta.

Los ejemplos de cribado genético para seleccionar semillas para la integración de rasgos incluyen, sin limitación, la identificación de frecuencias altas de alelos parentales recurrentes, seguimiento de transgenes de interés o cribado para detectar la ausencia de transgenes no deseados, selección de semillas híbridas de ensayo y ensayo de cigosidad.

La identificación de frecuencias altas de pares de alelos recurrentes por los procedimientos de cribado de la presente invención permite de nuevo un número reducido de filas por población y un aumento del número de poblaciones, o líneas endógamas, que se van a plantar en una unidad de campo dada. De este modo, los procedimientos de cribado de la presente invención pueden también reducir eficazmente los recursos requeridos para terminar la conversión de líneas endógamas.

Los procedimientos de la presente invención proporcionan además una garantía de calidad (GC) y un control de calidad, garantizando que los transgenes regulados o no deseados se identifican y se descartan antes de plantar. Esta aplicación en una capacidad de GC podría eliminar eficazmente infracciones de liberación cometidas involuntariamente.

Los procedimientos de la presente invención se pueden aplicar, además, para identificar una semilla híbrida para ensayo de transgenes. Por ejemplo, en una conversión en una línea endógama en la etapa BCnF1, un reproductor podría crear eficazmente un lote de semillas híbridas (salvo la selección de gametos) que fuera hemicigótico al 50% para el rasgo de interés y homocigótico al 50% para la falta del rasgo con el fin de generar una semilla híbrida para ensayo. El reproductor podría cribar después todas las semillas F1 producidas en el cruce de ensayo e identificar y seleccionar las semillas que fueran homocigóticas. Tal procedimiento es ventajoso porque las interferencias de los ensayos híbridos representarían productos genéticos híbridos comerciales respecto de la cigosidad del rasgo.

Otras aplicaciones de los procedimientos de cribado de la presente invención para identificar y seguir los rasgos de interés tienen las mismas ventajas identificadas anteriormente respecto de los recursos de campo y de mano de obra requeridos. Generalmente, los programas de conversión transgénica se ejecutan en localizaciones multitemporada que conllevan una estructura de coste de tierra y gestión mucho mayor. De este modo, el impacto bien de la reducción de las necesidades de filas por población o bien del aumento del número de poblaciones dentro de una unidad de campo dada es significativamente más espectacular en el coste frente a aplicaciones templadas.

Asimismo, los procedimientos de cribado de la presente invención se pueden usar para mejorar la eficacia del programa de doble haploide a través de la selección de genotipos deseados en la etapa haploide y la identificación del nivel de ploidía para eliminar el procesamiento de las semillas no haploides y su avance al campo. Ambas aplicaciones dan de nuevo como resultado la reducción de los recursos de campo por población y la capacidad de evaluar un mayor número de poblaciones dentro de una unidad de campo dada.

En otra realización, la invención proporciona, además, un ensayo para predecir la cigosidad embrionaria para un gen de interés particular (GDI). El ensayo predice cigosidad embrionaria basándose en la relación del número relativo de copias de un GDI y de un gen de control interno (CI) por célula o por genoma. Generalmente, este ensayo usa un gen de CI que es de cigosidad conocida, por ejemplo, homocigótico en el locus (dos copias de CI por célula diploide), para normalizar la medición del GDI. La relación de los números relativos de copias del CI respecto del GDI predice el número de copias del GDI en la célula. En una célula homocigótica para cualquier gen dado (o secuencia genética única), el número de copias del gen es igual al nivel de ploidía de la célula ya que la secuencia está presente en el mismo locus en todos los cromosomas homólogos. Cuando una célula es heterocigótica para un gen particular, el número de copias del gen será inferior al nivel de ploidía de la célula. La cigosidad de una célula en cualquier locus se puede determinar de este modo por el número de copias del gen en la célula.

En una realización particular, la invención proporciona un ensayo para predecir la cigosidad embrionaria del maíz. En la semilla de maíz, el tejido del endospermo es triploide, mientras que el tejido embrionario es diploide. El endospermo que es homocigótico para el CI contendrá tres copias del CI. El número de copias del GDI del endospermo puede variar entre 0 (homocigótico negativo) y 3 (homocigótico positivo); y un número de copias del GDI del endospermo de 1 o 2 se encuentra en semillas heterocigóticas para el GDI (o hemicigóticas para el GDI si el GDI es un transgén). El número de copias del endospermo es un reflejo de la cigosidad del embrión: un endospermo homocigótico (positivo o negativo) acompaña a un embrión homocigótico, el endospermo heterocigótico (con un número de copias del GDI de 1 o 2) refleja un embrión heterocigótico (número de copias del GDI de 1). El número de copias del GDI del endospermo (que puede variar entre 0 y 3 copias) se puede determinar a partir de la relación del número de copias del CI del endospermo respecto del número de copias del GDI del endospermo (que puede variar de 0/3 a 3/3, es decir, de 0 a 1), que se puede usar después para predecir la cigosidad del embrión.

Los números de copias del GDI o el CI se pueden determinar por cualquier técnica de ensayo apropiada para la cuantificación de números de copias, como es conocido en la técnica. Los ejemplos de ensayos apropiados incluyen, pero no se limitan a, ensayos de PCR en tiempo real (TaqMan®) (Applied Biosystems, Foster City, CA) e Invader® (Third Wave Technologies, Madison, WI). Preferentemente, tales ensayos se desarrollan de manera que la eficacia de amplificación tanto de las secuencias del CI como del GDI sean iguales o muy similares. Por ejemplo en un ensayo de PCR en tiempo real TaqMAn®, la señal de un GDI de copia única (se determina que la célula original sea heterocigótica para el GDI) será detectada un ciclo de amplificación más tarde que la señal de un CI de dos copias, porque la cantidad del GDI es la mitad de la del CI. Para la misma muestra heterocigótica, un ensayo Invader® mediría una relación GDI/CI de aproximadamente 1:2 o 0,5. Para una muestra que es homocigótica tanto para el GDI como para el CI, la señal del GDI sería detectada al mismo tiempo que la señal del CI (TaqMan®), y el ensayo Invader® mediría una relación GDI/CI de aproximadamente 2:2 o 1.

Estas directrices se aplican a cualquier célula poliploide o a células haploides (tales como células de polen), ya que el número de copias del GDI o del CI siguen siendo proporcionales al número de copias del genoma (o nivel de ploidía) de la célula. De este modo, estos ensayos de cigosidad se pueden llevar a cabo en tejidos triploides tales como el endospermo de maíz.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos son meramente ilustrativos y no limitan en modo alguno esta divulgación.

Ejemplo 1

Este ejemplo describe un ensayo para predecir la cigosidad de embriones de maíz usando un gen de control interno

(CI) homocigótico en el locus (es decir, dos copias del CI en el embrión diploide y tres copias del CI en el endospermo triploide). En una línea endógama de un organismo diploide (o de ploidía superior) tal como el maíz, el control interno endógamo es típicamente homocigótico; los eventos transgénicos en tales organismos en la primera generación (denominada “R0” en el maíz) son típicamente hemicigóticos (es decir, el transgén está típicamente presente en solo uno de los dos o más cromosomas homólogos). El maíz (Zea mays) es un organismo diploide, de este modo, un evento R0 de “copia única” tiene una copia del GDI por célula, pero 0,5 copias por genoma haploide, un evento R0 de “dos copias” tiene dos copias del GDI por célula, pero 1 copia por genoma haploide, y así sucesivamente.

En este ejemplo, se usó tubulina como el gen de CI y el GDI fue un transgén que codifica fosfotransferasa de neomincina II (NPT II), que se usa para selección de resistencia a la kanamicina. Se tomó tejido del endospermo (triploide) de la semilla (bien por muestreo manual o raspando una semilla con un muestreador automatizado de la presente invención). La semilla de endospermo muestreado se germinó y el tejido foliar (diploide) de plantas germinadas con éxito se muestreó también para su análisis genético. El tejido foliar se correlaciona directamente con la cigosidad embrionaria y, por tanto, se uso para demostrar que la cigosidad del endospermo predice

5 generalmente la cigosidad del embrión y para confirmar los casos de homocigosidad del endospermo. El ADN genómico total se extrajo del tejido del endospermo y del tejido foliar y se analizó cuantitativamente usando un ensayo Invader® con sondas oligonucleotídicas específicas para el gen de interés, NPT II, o para el gen de control interno, tubulina. La relación del GDI respecto del CI se midió usando técnicas convencionales de biología molecular. Véase la tabla 1. Se muestra un sumario de resultados de múltiples experimentos en la tabla 2.

10 Los resultados indicaron que la cigosidad del endospermo predecía generalmente la cigosidad del embrión (indicada por la cigosidad de la hoja) y que era fiable para predecir la homocigosidad para todas las semillas que germinaron. Asimismo, el análisis de la cigosidad del endospermo dio unas pocas predicciones homocigóticas de falso negativo (especialmente cuando el tejido de endospermo se obtuvo con el muestreador automatizado). Estos resultados demuestran que para una célula de un nivel de ploidía conocido, la relación del número de copias de un GDI

15 respecto del de un CI indica la cigosidad de esa célula. Asimismo, el ensayo de cigosidad de la presente invención puede predecir la cigosidad de un tejido basándose en la cigosidad de otro, es decir, el ensayo puede predecir la cigosidad embrionaria basándose en la cigosidad del endospermo.

Tabla 1

Relación Automatizada: Cigosidad automatizada Relación manual Cigosidad manual

1,39: Heterocigótico 1,42 Heterocigótico

0,14: Homocigótico negativo 0,12 Homocigótico negativo

0,08: Homocigótico negativo 0,08 Homocigótico negativo

0,13: Homocigótico negativo 0,10 Homocigótico negativo

0,10: Homocigótico negativo 0,08 Homocigótico negativo

1,55: Heterocigótico 1,38 Heterocigótico

0,84: Heterocigótico 1,45 Heterocigótico

0,14: Homocigótico negativo 1,48 Heterocigótico

1,48: Heterocigótico 1,37 Heterocigótico

1,39: Heterocigótico 1,47 Heterocigótico

2,03: Homocigótico POS 1,93 Homocigótico POS

0,13: Homocigótico negativo 0,05 Homocigótico negativo

1,71: No concluyente 1,81 Homocigótico POS

0,81: Heterocigótico 1,41 Heterocigótico

1,84: Homocigótico POS 1,77 Homocigótico POS

1,54: Heterocigótico 1,43 Heterocigótico

1,48: Heterocigótico 1,50 Heterocigótico

0,92: Heterocigótico 1,40 Heterocigótico

1,51: Heterocigótico 1,42 Heterocigótico

1,60: Heterocigótico 1,37 Heterocigótico

0,86: Heterocigótico 1,47 Heterocigótico

1,81: Homocigótico POS 2,02 Homocigótico POS

(continuación)

0,15: Homocigótico negativo ADN bajo

1,89: Homocigótico POS 1,85 Homocigótico POS

0,21: Homocigótico negativo 0,10 Homocigótico negativo

0,09: Homocigótico negativo 0,11 Homocigótico negativo

0,89: Heterocigótico 1,50 Heterocigótico

1,50: Heterocigótico 1,37 Heterocigótico

1,82: No concluyente 2,02 Homocigótico POS

2,14: Homocigótico POS 0,99 No concluyente

1,22: Heterocigótico 1,44 Heterocigótico

2,22: Homocigótico POS 2,24 Homocigótico POS

0,79: Heterocigótico 1,40 Heterocigótico

1,23: Heterocigótico 1,47 Heterocigótico

1,49: Heterocigótico 1,38 Heterocigótico

1,33: Heterocigótico 1,37 Heterocigótico

Tabla 2

Procedimiento de muestreo del endospermo: Número de semillas homocigóticas identificadas por análisis del endospermo Número de semillas predichas homocigóticas que no germinaron Número de casos de homocigosis confirmados basados en el análisis foliar Número de casos de homocigosis falsos negativos basados en el análisis del endospermo

Manual: 8 de 36 0 8 (todas) 5 (13,9 %)

Automatizado: 6 de 24 1 5 0

Manual: 6 de 36 0 6 (todas) 2 (5,6 %)

Automatizado: 6 de 24 1 5 0

Manual: 5 de 36 0 5 (todas) 7 (19,4 %)

Automatizado: 7 de 24 2 5 0

Manual: 7 de 36 1 6 0

Automatizado: 5 de 24 2 3 0

Ejemplo 2

5 Este ejemplo demuestra el uso de los procedimientos de cribado de la presente invención en un programa para selección asistida por marcador de sojas con bajo contenido en ácido linoleico.

La soja es el cultivo leguminoso más valioso, con muchos usos nutricionales e industriales debido a su composición

química única. Las semillas de soja son una fuente importante de aceite vegetal, que se usa en productos

alimentarios por todo el mundo. El nivel relativamente alto (habitualmente aproximadamente del 8 %) de ácido 10 linolénico (18:3) en el aceite de soja reduce su estabilidad y sabor. La hidrogenación del aceite de soja se usa para

reducir el nivel de ácido linolénico (18:3) y mejorar tanto la estabilidad como el sabor de los aceites de soja. Sin embargo, la hidrogenación da como resultado la producción de ácidos grasos trans, que aumentan el riesgo de cardiopatías coronarias cuando se consumen. El desarrollo de soja con bajo contenido de ácido linolénico se ha complicado por la naturaleza cuantitativa del rasgo. Se ha descubierto que las variedades de soja con bajo contenido en ácido linolénico que se han desarrollado tienen un bajo rendimiento, limitando su utilidad en la mayoría de los ámbitos comerciales. Desarrollar un producto con un rendimiento de semillas comercialmente significativo es de alta prioridad en la mayoría de los programas de desarrollo de variedades de cultivo de soja.

Un ejemplo de la aplicación de los procedimientos de cribado de la presente invención es la selección de plantas de soja tanto con gran rendimiento como con un contenido reducido en ácido linolénico. El comportamiento de la progenie de la soja en cuanto al bajo contenido en ácido linoleico se basa principalmente en dos locus principales de rasgos cuantitativos (QTL) en Fad3-1b y Fad3-1c. El análisis de plantas secretoras demostró que Fad3-1b y Fad3-1c controlan de forma aditiva el contenido en linolénico de la soja. Por lo tanto, usando una combinación de marcadores para Fad3-1b y Fad3-1c, un reproductor que usa la invención puede predecir con precisión el contenido en ácido linolénico de las plantas de soja. Los marcadores se pueden usar para inferir el estado genotípico de una semilla en cualquier etapa del proceso de reproducción, por ejemplo, en la etapa de línea endógama acabada, o la F1, F2, F3, etc.

Un híbrido F1 seminal se puede producir cruzando dos líneas de soja endógamas (por ejemplo, cruzando una planta que contiene los alelos Fad3-1b y/o Fad3-1c asociados con un contenido reducido en ácido linoleico con una planta que carece de estos alelos) seguido de autopolinización natural. Puesto que los marcadores se pueden usar para inferir el estado genotípico de una semilla individual obtenida a partir de un interacoplamiento de tales líneas endógamas, se puede llevar a cabo el cultivo asistido por marcador de generación temprana (es decir, F2).

La semilla de soja a humedad y temperatura ambiente se equilibra típicamente a una humedad del 8 % basado en peso en seco. La semilla de soja a este nivel de humedad tiende a dividirse cuando se tritura. Para reducir la división, la semilla debería humedecerse hasta un nivel de humedad del 12 %. Cuando se pretrata de esta manera, la división se reduce significativamente hasta < 5 %.

Las semillas F2 seleccionadas que tienen el genotipo deseado se pueden agrupar o mantener separadas dependiendo de los objetivos de reproducción. Si se seleccionaran múltiples QTL con efectos variables a partir de una población dada, el reproductor podría preservar la identidad de semilla individual para diferenciar individuos con diversas combinaciones del QTL de resistencia objetivo. Estas semillas se podrían plantar en el campo con identificación de campo apropiada. Varios procedimientos de preservación de identidad de semillas individuales se pueden usar mientras se transfiere la semilla desde el laboratorio de triturado al campo. Los procedimientos incluyen transferir individuos seleccionados a cinta de semillas hortícola que también podría incluir identificación por radiofrecuencia para ayudar a la identificación de la semilla individual genotipada. Otros procedimientos serían usar una bandeja de indexación, plantar semillas en macetas con turba y a continuación trasplantarlas, o plantar a mano a partir de paquetes individuales de semillas.

Ejemplo 3

Este ejemplo demuestra el uso de los procedimientos de cribado de la presente invención en un programa para alelos parentales recurrentes en un programa de reproducción por retrocruzamiento.

Los procedimientos de cribado de la presente invención se pueden usar para la selección de transgenes así como la identificación de alelos parentales recurrentes. La identificación de genotipos con frecuencias de alelos parentales recurrentes deseadas antes de la plantación permite que el número de filas por población se reduzca a lo largo de todo el programa de reproducción junto con un aumento en el número de poblaciones incluidas en el programa de conversión dentro de una unidad de campo dada. Esto da como resultado un uso mejorado de la tierra, costes de mano de obra y de tierra reducidos, etc.

Un ejemplo de cribado de tejido de endospermo de maíz para detectar alelos parentales recurrentes en un programa de reproducción por retrocruzamiento se muestra en la figura 29.

Ejemplo 4

Este ejemplo demuestra el uso de procedimientos de cribado de la presente invención para su uso en la determinación de la fase de enlace y la huella genética de la línea de ADN.

Combinado con la agrupación del ADN de una semilla individual, se podría llevar a cabo la huella genética de la línea sin la necesidad de muestrear la línea en el campo.

Usando tejido de endospermo de semillas (revestimiento de semilla en la soja) derivado de una planta diploide, los haplotipos de marcador progenitor se puede determinar usando un sistema de genotipado que permite la detección de diferentes frecuencias de alelos en muestras de ADN. Puesto que el tejido del endospermo es triploide, con dos copias derivadas del gameto femenino, la fase de enlace de la línea progenitora se puede derivar diseccionando genotipos de progenie heterocigótica. La muestra de ADN de tejido de endospermo permite una determinación del nivel de ploidía del marcador genético. Un nivel de ploidía diploide en el marcador genético indica herencia materna

y un nivel de ploidía haploide en el marcador genético indica herencia paterna.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un sistema automatizado (20) para muestrear semillas, comprendiendo el sistema:

una estación de muestreo (72) automatizada que tiene un muestreador (26) configurado para retirar material de una semilla, caracterizado porque el material es retirado mientras se mantiene la viabilidad de germinación de la semilla, y comprendiendo además un transportador de semillas (32) configurado para recibir la semilla desde fuera de la estación de muestreo, después de que el material es retirado de la semilla; y

un transportador de muestras (34) configurado para recibir el material retirado de la semilla.
2. El sistema de la reivindicación 1, que comprende además:

una bandeja de semillas (80, 686) y una bandeja de muestras (82, 668);

una mesa (670, 688) que soporta la bandeja de semillas (80, 686) y la bandeja de muestras (82, 668); y

un mecanismo de indexación (560) que es operable para mover la tabla (670, 688) para poner la bandeja de semillas (80, 686) en posición para recibir desde la estación de muestreo (72) la semilla de la cuál es retirado el material, y poner la bandeja de muestras (82, 668) en posición para recibir el material retirado de la semilla.
3. El sistema de la reivindicación 2, en el que:

el transportador de muestras (34) está configurado para transportar el material retirado de la semilla a la bandeja de muestras (82, 668);

el transportador de semillas está configurado para transportar la semilla, de la cuál es retirado el material, a la bandeja de semillas (80, 686);

el mecanismo de indexación (560) es operable para mover la mesa (670, 688), para poner un compartimento de la bandeja de muestras (82, 668) alineado con el transportador de muestras (34) para recibir el material retirado de la semilla; y el mecanismo de indexación (560) es operable para mover la mesa (670, 688), para poner un compartimento de la bandeja de semillas (80, 686) alineado con el transportador de semillas (32) para recibir del transportador de semillas (32) la semilla de la cuál es retirado el material.
4.

El sistema de la reivindicación 1, en el que el transportador de muestras (34) está configurado para suministrar el material retirado de la semilla a una bandeja de muestras (82, 668), y/o en el que el transportador de semillas (32) está configurado para suministrar a una bandeja de semillas (80, 686) la semilla de la cuál es retirado el material.
5.

El sistema de la reivindicación 1, en el que el transportador de muestras (34) está configurado para situar el material retirado de la semilla en un recipiente para muestras y en el que el transportador de semillas (32) está configurado para situar la semilla, de la cuál es retirado el material, en un recipiente para semillas para facilitar una correspondencia unívoca entre la semilla y el material retirado de la semilla.
6.

El sistema de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la estación de muestreo (72) incluye un soporte configurado para orientar la semilla mientras está en la estación de muestreo (72) y mantener la semilla en la orientación deseada, de tal manera que el muestreador (26) pueda retirar el material de la semilla mientras mantiene la viabilidad de germinación de la semilla.
7.

El sistema de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende además un alimentador de semillas

(514) que es operable para alimentar las semillas individualmente desde un silo (70) de semillas a la estación de muestreo (72).
8. El sistema de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el muestreador de la estación de muestreo

(72) comprende un husillo (650) que tiene múltiples dientes para retirar el material de la semilla.
9. Un procedimiento automatizado para tomar una muestra de tejido de una semilla, comprendiendo el procedimiento:

orientar una semilla en una estación de muestreo (72) automatizada;

retirar una muestra de tejido de la semilla orientada, donde la semilla está orientada en la estación de muestreo, de tal manera que la muestra de tejido pueda ser retirada de la semilla mientras se mantiene la viabilidad de germinación de la semilla;

recibir la semilla, de la cuál es retirada la muestra de tejido, en una bandeja de semillas (80, 686) y recibir la muestra de tejido en una bandeja de muestras (82, 668).
10. El procedimiento de la reivindicación 9, que comprende además:

ensayar la muestra de tejido por una característica; y

separar las semillas en base a si la muestra de tejido se ensayó positivamente para la característica o no se 5 ensayó positivamente para la característica.
11.

El procedimiento de las reivindicaciones 9 o 10, en el que orientar la semilla incluye posicionar la semilla contra una superficie configurada para orientar la semilla.
12.

El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 9-11, en el que orientar la semilla comprende posicionar la semilla en un rebaje (614), de tal manera que una parte de la semilla sobresale a través del rebaje

10 (614), y en el que retirar una muestra de tejido de la semilla orientada comprende retirar una muestra de tejido de la parte de la semilla que sobresale a través del rebaje (614).
13. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 9-12, en el que retirar una muestra de tejido de la semilla orientada en la estación de muestreo comprende arrastrar una herramienta multidentada (650) por una superficie de la semilla.

15 14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 9-13, que comprende además alimentar la semilla a la estación de muestreo (72) antes de orientar la semilla.
15. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 9-14, en el que recibir la semilla de la cuál es retirado la muestra de tejido comprende recibir la semilla en una posición en la bandeja de semillas (80, 686) correspondiente a la posición en la bandeja de muestras (82, 668) de la muestra de tejido retirada de la semilla.

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