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ES2474173T3 - Conjugados de portador pept�dico inmunog�nico beta y métodos de producir los mismos - Google Patents

Conjugados de portador pept�dico inmunog�nico beta y métodos de producir los mismos Download PDF

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Publication number
ES2474173T3
ES2474173T3 ES11151428.7T ES11151428T ES2474173T3 ES 2474173 T3 ES2474173 T3 ES 2474173T3 ES 11151428 T ES11151428 T ES 11151428T ES 2474173 T3 ES2474173 T3 ES 2474173T3
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ES
Spain
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peptide
transporter
conjugate
protein
polypeptide
Prior art date
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Active
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ES11151428.7T
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English (en)
Inventor
Rasappa G. Arumugham
A. Krishna Prasad
Michael Hagen
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Janssen Sciences Ireland UC
Wyeth LLC
Original Assignee
Janssen Alzheimer Immunotherapy
Wyeth LLC
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Publication date
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Abstract

Un conjugado inmunógeno peptídico/transportador de proteína/polipéptido que tiene la fórmula:**Fórmula** donde C es un transportador de proteína CRM197/polipétpido, Xd es un grupo funcional derivatizado de un residuo de aminoácido del transportador de proteína/polipéptido, P es una molécula de inmunógeno peptídico de un fragmento de Aß covalentemente unida al grupo funcional derivatizado del residuo de aminoácido del transportador de proteína/polipéptido, donde el fragmento de Aß se selecciona del grupo consistente en residuos: 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-9, 1-10, 1-11, 1-12, 1-16, 1-28, 3-6, 3-7, 13- 28, 15-24, 16-22, 16-23, 17-23, 17-24, 18-24, 18-25, 17-28, 25-35, 33-42, 35-40 y 35-42 de Aß (SEQ ID NO: 21), R es una molécula de restricción covalentemente unida a su grupo funcional derivatizado de un residuo de aminoácido del transportador de proteína/polipéptido, conservando así la funcionalidad del transportador de tal manera que retiene su habilidad para obtener las respuestas inmunes deseadas contra el inmunógeno peptídico que de otra manera se darían sin un transportador, n es un número entero superior a 0, pero inferior o igual a 85, y p es un número entero superior a 0, pero inferior a 85.

Description

Antecedentes de la invención
La esencia de la inmunidad adaptable es la habilidad de un organismo para reaccionar ante la presencia de sustancias extra�as y producir componentes (anticuerpos o células) capaces de interactuar específicamente y proteger al huésped de su invasión. Un “ant�geno” o “inmun�geno” es una sustancia que es capaz de obtener este tipo de respuesta inmune y también capaz de interactuar con las células y anticuerpos sensibilizados que se fabrican contra él.
Los ant�genos o inmun�genos son normalmente macromoléculas que contienen distintos sitios antig�nicos
o “ep�topes” que se reconocen e interact�an con los varios componentes del sistema inmune. Pueden existir como moléculas individuales compuestas por sustancias químicas orgánicas sintéticas, proteínas, lipoprote�nas, glicoprote�nas, ARN, ADN o polisac�ridos, o pueden ser parte de estructuras celulares (bacterias u hongos) o virus (Harlow y Lane 1988a, b y c; Male et al., 1987).
Mol�culas pequeñas como p�ptidos cortos, aunque normalmente son capaces de interactuar con los productos de una respuesta inmune, a menudo no pueden provocar una respuesta por s� mismas. Estos inmun�genos de p�ptido o “haptenos” como también se llaman, son realmente ant�genos incompletos, y, aunque no son capaces por s� mismos de provocar inmunogenicidad o de obtener producción de anticuerpos, pueden hacerse inmunog�nicos acopl�ndolos a un transportador adecuado. Los transportadores típicamente son ant�genos de proteínas de mayor peso molecular que son capaces de provocar una respuesta inmunog�nica cuando se administran in vivo.
En una respuesta inmune, los anticuerpos se producen y secretan por los linfocitos B en conjunto con células T ayudantes (TA). En la mayoría de los sistemas transportadores de haptenos, las células B producen anticuerpos que son específicos para el hapteno y el transportador. En estos casos, los linfocitos T tendrán dominios específicos de enlace en el transportador pero no reconocerán al hapteno solo. En un tipo de sinergismo, las células B y T cooperan para inducir una respuesta de anticuerpo específica de hapteno. Después de que haya tenido lugar tal respuesta inmune, si el huésped es posteriormente desafiado con el hapteno solamente, normalmente responder� produciendo anticuerpos específicos de hapteno de células con memoria formadas después de la inmunizaci�n inicial.
Los haptenos sintéticos que imitan algunas estructuras epit�picas fundamentales en macromoléculas más grandes a menudo se conjugan con transportadores para crear una respuesta inmune para la molécula “original” más grande. Por ejemplo, los segmentos de p�ptido corto pueden sintetizarse de la secuencia conocida de una proteína y acoplarse a un transportador para inducir inmunogenicidad hacia la proteína nativa. Este tipo de planteamiento sintético para la producción inmunog�nica se ha convertido en la base de muchas de las investigaciones actuales en la creación de vacunas. Sin embargo, en muchos casos, la mera creación de una respuesta de célula B usando conjugados sintéticos de p�ptido-transportador, aunque bien diseñados, no siempre garantizar� una inmunidad protectora hacia un ant�geno intacto. La respuesta inmune generada por un ep�tope de p�ptido corto de una partícula viral más grande o células bacteriana puede ser solamente suficiente para generar memoria en el nivel de célula B. En estos casos, ahora generalmente se acepta que una respuesta citot�xica de célula BT sea un indicador más importante de inmunidad protectora. El diseño de inmun�genos pept�dicos con los sitios apropiados de enlace epit�pico para reconocimiento de célula B y célula T es hoy una de las área de investigación más desafiantes en inmunolog�a.
El planteamiento para aumentar la inmunogenicidad de moléculas pequeñas y pobremente inmunog�nicas al conjugar estas moléculas con moléculas “transportadoras” grandes se ha utilizado con éxito durante décadas (véase, por ejemplo, Goebel et al. (1939) J. exp. Med. 69: 53). Por ejemplo, se han descrito muchas composiciones inmunog�nicas en las que pol�meros capsulares purificados se han conjugado con proteínas transportadoras para crear composiciones inmunog�nicas más efectivas al explotar este “efecto transportador”. Schneerson et al. (1984) Infect. Immun. 45: 582-591). La conjugación también ha demostrado evitar la actividad pobre del anticuerpo normalmente observada en niños cuando se inmunizan con un polisac�rido libre (Anderson et al. (1985) J. Pediatr.
107: 346; Insel et al. (1986) J. Exp. Med 158: 294). WO-A-00/050077 describe inmun�genos pept�dicos unidos a un transportador derivado de Proteína D de Haemophilus influenzae.
Los conjugados hapteno-transportador se han generado con éxito usando varios reactivos de enlace cruzado/acoplamiento tal como enlazadores cruzados homobifuncionales, heterobifuncionales o de longitud cero. Muchos de tales métodos est�n actualmente disponibles para acoplar sac�ridos, proteínas y p�ptidos a transportadores de p�ptido. Un inconveniente de usar reactivos de acoplamiento, que introducen sitios reactivos en las cadenas laterales de moléculas de amino�cido reactivo en el transportador y/o moléculas de hapteno, es que los sitios reactivos si no se neutralizan son libres de reaccionar con cualquier molécula no deseada in vitro (afectando as� negativamente a la funcionalidad o estabilidad del conjugado (o conjugados) o in vivo (planteando as� un riesgo potencial de hechos adversos en personas o animales inmunizados con las preparaciones). Tal exceso de sitios reactivos puede reaccionar o “restringirse”, para inactivar estos sitios, utilizando varias reacciones químicas conocidas, pero estas reacciones pueden ser de otra manera perjudiciales para la funcionalidad de los conjugados. Estos puede ser particularmente problem�tico cuando se intenta crear un conjugado introduciendo los sitios reactivos en la molécula transportadora, ya que su mayor tamaño y su estructura más compleja (en relación con el hapteno) puede hacerla más vulnerable a los efectos perjudiciales del tratamiento químico. De hecho, no se conocen ejemplos de métodos por los cuales se haga un conjugado activando primero el transportador, después haciéndolo reaccionar con el hapteno en una reacción de conjugación y finalmente “restringiendo” el resto de sitios reactivos, mientras se conserva la habilidad del conjugado resultante para funcionar como una composición inmunog�nica que tiene las propiedades deseadas del “efectos transportador”.
Breve resumen de la invención
La presente invención se dirige a un conjugado de inmun�geno pept�dico-transportador de proteína/polip�ptido como se define en la reivindicación 1. Este es un conjugado inmunog�nico de un inmun�geno de p�ptido que comprende un fragmento de Aβ con un transportador CRM197 proteínas/polip�ptido, donde el fragmento de Aβ se conjuga con el transportador por medio de grupos funcionales derivatizados de residuos de amino�cido del transportador tales como residuos de lisina, y donde cualquier grupo funcional derivatizado de los residuos de amino�cido se inactiva por medio de restricción para bloquearlos de la reacción con otras moléculas, incluyendo proteínas/polip�ptidos conservando de este modo la funcionalidad del transportador, de tal modo que retiene su habilidad para obtener las respuestas inmunes deseadas contra el inmun�geno pept�dico que de otra manera no se darían sin un transportador. Además, la invención también se relaciona con composiciones inmunog�nicas que contienen tales conjugados.
La divulgación describe un primer método de conjugación de un inmun�geno pept�dico que comprende p�ptido Aβ o fragmentos de Aβ o análogos del mismo por medio de un grupo reactivo de un residuo de amino�cido del inmun�geno pept�dico con un transportador de proteína/polip�ptido que tiene uno o más grupos funcionales, comprendiendo el método las etapas de: (a) derivatizar uno o más de los grupos funcionales del transportador de proteína/polip�ptido para generar una molécula derivatizadas con sitios reactivos; (b) hacer reaccionar el transportador derivatizado de proteína/polip�ptido del a etapa (a) con un grupo reactivo de un residuo de amino�cido del inmun�geno pept�dico bajo condiciones de reacción de tal manea que el inmun�geno pept�dico se conjugue con el transportador derivatizado de la proteína/polip�ptido por medio de los grupos funcionales; y (c) hacer reaccionar además el conjugado con un reactivo de restricción para inactivar los grupos funcionales reactivos libres en el transportador activado de proteína/polip�ptido, conservando de este modo la funcionalidad del transportador de tal manera que retiene su habilidad para obtener las respuesta inmunes deseadas contra el inmun�geno pept�dico que de otra manera no se daría sin un transportador.
El transportador de proteína/polip�ptido es CRM197.
La invención proporciona un inmun�geno pept�dico que comprende fragmentos de Aβ que obtienen una respuesta inmunog�nica contra ciertos ep�topes en Aβ. Los p�ptidos inmunog�nicos de la invención incluyen p�ptidos heter�logos inmunog�nicos. En algunos p�ptidos inmunog�nicos, una fragmento de Aβ s une a un transportador para formar un p�ptido heter�logo inmunog�nico, y después este p�ptido heter�logo se une a un transportador que usa un método de la presente invención para formar un conjugado.
En otro aspecto de la invención, el inmun�geno pept�dico es un polip�ptido que comprende un segmento de terminal N de al menos 1-5 residuos de Aβ, siendo el primer residuo de Aβ el residuo de terminal N del polip�ptido, donde el polip�ptido est� libre de un segmento de terminal C de Aβ. En otro aspecto más de la invención, el inmun�geno pept�dico es un polip�ptido que comprende un segmento de terminal N de Aβ, empezando el segmento en el residuo 1-3 de Aβ y acabando en los residuos 7-11 de Aβ. En algunos aspectos de la invención, el inmun�geno pept�dico es una gente que induce una respuesta inmunog�nica contra un segmento de terminal N de Aβ, empezando el segmento en el residuo 1-3 de Aβ y acabando en los residuos 7-11 de Aβ sin inducir una respuesta inmunog�nica contra un ep�tope en los residuos de Aβ43. En otro aspecto de la invención, el inmun�geno pept�dico es un polip�ptido heter�logo que comprende un segmento de Aβ unido a una secuencia heter�loga de amino�cido que induce una respuesta de célula T ayudante contra la secuencia heter�loga de amino�cido y de este modo una respuesta de célula B contra el segmento de terminal N.
En algunos inmun�genos pept�dicos, el segmento de terminal N de Aβ est� unido en su terminal C a un polip�ptido heter�logo. En algunos inmun�genos pept�dicos, el segmento de terminal N de Aβ est� unido en su terminal N a un polip�ptido heter�logo. En algunos inmun�genos pept�dicos, el segmento de terminal N est� unido en sus terminales N y C al primer y segundo polip�ptido heter�logo. En algunos inmun�genos pept�dicos, el segmento de terminal N de Aβ est� unido en su terminal N a un polip�ptido heter�logo, y en su terminal C a al menos una copia adicional del segmento de terminal N. En algunos inmun�genos pept�dicos, el polip�ptido comprende de terminal N a terminal C, el segmento de terminal N de Aβ, una pluralidad de copias adicionales del segmento de terminal N y el segmento de amino�cido heter�logo.
En algunos de los inmun�genos pept�dicos anteriores, el polip�ptido comprende además al menos una copia adicional del segmento de terminal N. en algunos de los inmun�genos pept�dicos anteriores, el fragmento est� libre de al menos los 5 amino�cidos de terminal C en Aβ43.
En algunos aspectos de los inmun�genos pept�dicos anteriores, el fragmento comprende hasta 10 amino�cidos contiguos de Aβ.
En otro aspecto, la invención proporciona un inmun�geno pept�dico que comprende p�ptido Aβ de fragmentos de Aβ o análogos de los mismos que obtienen una respuesta inmunog�nica contra ciertos ep�topes en Aβ pueden estar en una configuración referida como configuración de p�ptidos de ant�genos múltiples (PAM).
En algunos de los aspectos anteriores de la invención, el inmun�geno pept�dico de la terminal N es la mitad de Aβ. En algunos aspectos de la invención, el inmun�geno pept�dico es un fragmento Aβ seleccionado del grupo consistente en Aβ1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-10, 1-11, 1-12, 1-16, 3-6 y 3-7. En algunos de los aspectos anteriores de la invención, el inmun�geno pept�dico es de la región interna de Aβ. En algunos de los aspectos de la invención, el inmun�geno pept�dico es un fragmento Aβ seleccionado del grupo consistente en Aβ13-28, 15-24, 17-28 y 25-35. En algunos de los aspectos anteriores de la invención, el inmun�geno pept�dico es del final de la terminal C de Aβ. En algunos de los aspectos de la invención, el inmun�geno pept�dico es un fragmento Aβ seleccionado del grupo consistente en Aβ33-42, 35-40 y 35-42. En algunos aspectos de la invención, el inmun�geno pept�dico es un fragmento Aβ seleccionado del grupo consistente en Aβ1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-10, 1-11, 1-12, 1-16, 1-28, 3-6, 2-7, 13-28, 15-24, 17-28, 25-35, 33-42, 35-40 y 35-42. En algunos aspectos de la invención, el inmun�geno pept�dico es un fragmento Aβ seleccionado del grupo consistente en Aβ1-5, Aβ1-7, Aβ1-9 y Aβ1-12. En algunos aspectos de la invención, el inmun�geno pept�dico es un fragmento Aβ seleccionado del grupo consistente en Aβ1-5-L, Aβ1-7-L, Aβ1-9-L y Aβ1-12-L, donde L es un enlazador. En algunos aspectos de la invención, el inmun�geno pept�dico es un fragmento Aβ seleccionado del grupo consistente en Aβ1-5-L-C, Aβ1-7-L-C, Aβ1-9-L-C y Aβ1-12-L-C, donde C es un residuo de amino�cido ciste�na.
En algunos aspectos de la invención, el inmun�geno pept�dico es un fragmento Aβ seleccionado del grupo consistente en Aβ16-22, Aβ16-23, Aβ17-23, Aβ17-24, Aβ18-24 y Aβ18-25. En algunos aspectos de la invención, el inmun�geno pept�dico es un fragmento Aβ seleccionado del grupo consistente en Aβ16-22-C, Aβ16-23-C, Aβ17-23-C, Aβ17-24-C, Aβ18-24-C y Aβ18-25-C, donde C es un residuo de amino�cido ciste�na. En otros aspectos de la invención, el inmun�geno pept�dico es un fragmento Aβ seleccionado del grupo consistente en C-Aβ16-22, C-Aβ1623, C-Aβ17-23, C-Aβ17-24, C-Aβ18-24 y C-Aβ18-25, donde C es un residuo de amino�cido ciste�na.
En algunos de los inmun�genos pept�dicos anteriores, el polip�ptido heter�logo se selecciona del grupo consistente en p�ptido que tienen un ep�tope de célula T, un ep�tope de célula B y combinaciones de los mismos.
En una realización, el grupo funcional de una o más moléculas de amino�cido del transportador de proteína/polip�ptido o del enlazador de polip�ptido opcionalmente unido se derivatiza usando un reactivo de enlace cruzado. En otra realización, el reactivo de derivatizaci�n es un reactivo de enlace cruzado de longitud cero. En otra realización, el reactivo de derivatizaci�n es un reactivo de enlace cruzado homobifuncional. En otra realización más, el reactivo de derivatizaci�n es un reactivo de enlace cruzado heterobifuncional.
En una realización preferente, el reactivo heterobifuncional es un reactivo que reacciona con un grupo funcional primario o ε-amina de una o más moléculas de amino�cido del transportador de proteína/polip�ptido y un grupo colgante tiol de una o más moléculas de amino�cido del inmun�geno pept�dico. En una realización, el reactivo heterobifuncional es N-succinimidil bromoacetato.
En otra realización, el grupo funcional primario o ε-amina es lisina. En otra realización más, la derivatizaci�n del grupo funcional primario o ε-amina de la lisina del transportador de proteína/polip�ptido con N-succinimidil bromoacetato da como resultado la bromoacetilaci�n de los residuos primarios o ε-amina en molécula de lisina en el transportador de proteína/polip�ptido. En una realización más preferente, el grupo colgante tiol es un residuo de ciste�na del inmun�geno pept�dico, que puede localizarse en la terminal amino del inmun�geno pept�dico, en la terminal carboxi del inmun�geno pept�dico o internamente en el inmun�geno pept�dico.
En otra realización, el grupo colgante tiol se genera por un reactivo de tiolizaci�n tal como N-acetil homociste�na tio lactona, reactivo de Traut (2-iminotilano) SATA (N-Succinimidil S-acetiltioacetato), SMPT (4Succinimidiloxicarbonil-metil2-piridilditio tolueno), Sulfo LC SPDP (Sulfo Succinimidil piridil ditio propionamido hexanoato), SPDP (Succinimidil piridil ditio propionato). En una realización preferente, el reactivo de restricción que se usa para inactivar reactivos libres, grupos funcionales en el transportador activado de proteína/polip�ptido se selecciona del grupo de reactivos consistente en cisteamina, N-acetilcisteamina y etanolamina.
En una realización particularmente preferente, el reactivo de restricción que se usa para inactivar grupos funcionales de reactivo libres en el transportador activado de proteína/polip�ptido se selecciona del grupo de reactivo consistente en hidróxido de sodio, carbonato de sodio, bicarbonato de sodio y amoniaco.
En una realización, el grupo reactivo del residuo de amino�cido del inmun�geno pept�dico es un grupo sulfhidrilo libre.
En otra realización, uno o más de los grupos funcionales son un enlazador, que esta opcionalmente unido al transportador de proteína/polip�ptido. En una realización preferente, el enlazador es un enlazador de p�ptido. En una realización más preferente, el enlazador de p�ptido es polilisina.
La divulgación describe un segundo método para conjugar un inmun�geno pept�dico que comprende p�ptido de Aβ o fragmentos de Aβ o análogos de los mismos Aβ o análogos de los mismos con un transportador de proteína/polip�ptido que tienen la siguiente estructura:
donde:
C es un transportador de proteína/polip�ptido y X es un grupo funcional derivatizado de un residuo de amino�cido en el transportador de proteína/polip�ptido u opcionalmente un residuo de amino�cido de un enlazador de p�ptido covalentemente unido al transportador de proteína/polip�ptido, y donde m es un número entero superior a 0, pero inferior o igual a 85, comprendiendo el método las etapas de:
(a)
derivatizar uno más de los grupos funcionales del transportador de proteína/polip�ptido o de la molécula enlazadora opcionalmente unida para generar una molécula derivatizada con los sitios reactivos;
(b)
hacer reaccionar el transportador de proteína/p�ptido derivatizado de la etapa (a) con un grupo reactivo de un residuo de amino�cido del inmun�geno pept�dico para formar un conjugado covalentemente unido de p�ptido de transportador inmun�geno-proteína/polip�ptido; y
(c)
(c) hacer reaccionar además dicho conjugado con un reactivo de restricción para inactivar los grupos funcionales reactivos libres en el transportador activado de proteína/polip�ptido, de tal manera que los grupos restringidos no sean libres para reaccionar con otras moléculas, incluyendo proteínas/polip�ptidos conservando de este modo la funcionalidad del transportador, de tal manera que retenga su habilidad para obtener las respuestas inmunes deseadas contra el inmun�geno pept�dico que de otra manera se darían sin un transportador para generar un conjugado de transportador de p�ptido restringido inmun�genoprote�na/polip�ptido que tiene la siguiente fórmula:
donde
C es el transportador de proteína/polip�ptido y Xd es un grupo funcional derivatizado de un residuo de amino�cido del transportador de proteína/polip�ptido u opcionalmente de un residuo de amino�cido de un enlazador de p�ptido covalentemente unido al transportador de proteína/polip�ptido, y donde,
P es la molécula de inmun�geno pept�dico covalentemente unida al grupo funcional derivatizado en el residuo de amino�cido en el transportador de proteína u opcionalmente un residuo de amino�cido en un enlazador de p�ptido covalentemente unido al transportador de proteína/polip�ptido, R es una molécula de restricción covalentemente unida al grupo funcional derivatizado o un residuo de amino�cido en el transportador de proteína/polip�ptido u opcionalmente un residuo de amino�cido en un enlazador de p�ptido covalentemente unido a un transportador de proteína/polip�ptido, n es un número entero superior a 0, pero inferior o igual a 85, y p es un número entero superior a 0, pero inferior a 85.
Las realizaciones detalladas para el primer método descrito anteriormente también son aplicables a los conjugados que se acaban de describir preparados mediante el segundo método.
La divulgación proporciona inmun�geno pept�dico que comprende p�ptido de Aβ o fragmentos de Aβ o análogos de los mismos Aβ o análogos de los mismos/conjugados de transportador de polip�ptido donde el transportador de proteína/polip�ptido tiene la fórmula:
donde, C es un transportador de proteína/polip�ptido y X es un grupo funcional derivatizado de un residuo de amino�cido en el transportador de proteína/polip�ptido u opcionalmente un residuo de amino�cido de un enlazador de p�ptido covalentemente unido al transportador de proteína/polip�ptido, y donde m es un número entero superior a 0, pero inferior o igual a 85, y donde el conjugado de inmun�geno pept�dico-proteína/transportador de polip�ptido que tiene la fórmula:
donde
C es el transportador de proteína/polip�ptido y Xd es un grupo funcional derivatizado de un residuo de amino�cido del transportador de proteína/polip�ptido u opcionalmente de un residuo de amino�cido de un enlazador de p�ptido covalentemente unido al transportador de proteína/polip�ptido, y donde, P es la molécula de inmun�geno pept�dico covalentemente unida al grupo funcional derivatizado del residuo de amino�cido del transportador de proteína u opcionalmente de un residuo de amino�cido de un enlazador de p�ptido covalentemente unido a un transportador de proteína/polip�ptido, R es una molécula de restricción covalentemente unida al grupo funcional derivatizado de un residuo de amino�cido del transportador de proteína/polip�ptido u opcionalmente de un residuo de amino�cido de un enlazador de p�ptido covalentemente unido a un transportador de proteína/polip�ptido, conservando de este modo la funcionalidad del transportador, de tal manera que retiene su habilidad para obtener las respuestas inmunes deseadas contra el inmun�geno pept�dico que de otra manera no se darían sin un transportador, n es un número entero superior a 0, pero inferior o igual a 85, y p es un número entero superior a 0, pero inferior a 85.
Las realizaciones detalladas para el primer y segundo método descritos anteriormente también son aplicables a los conjugados que se acaban de describir.
Tambi�n se describen inmun�genos pept�dicos que comprenden p�ptido de Aβ o fragmentos de Aβ o análogos de los mismos Aβ o análogos de los mismos/conjugados de transportador de polip�ptido generados de acuerdo con el segundo método de la invención y que tienen la fórmula:
donde,
C es el transportador de proteína/polip�ptido y Xd es un grupo funcional derivatizado de un residuo de amino�cido del transportador de proteína/polip�ptido u opcionalmente de un residuo de amino�cido de un enlazador de p�ptido covalentemente unido al transportador de proteína/polip�ptido, y donde, P es la molécula de inmun�geno pept�dico covalentemente unida al grupo funcional derivatizado del residuo de amino�cido del transportador de proteína u opcionalmente de un residuo de amino�cido de un enlazador de p�ptido unido covalentemente unido a un transportador de proteína/polip�ptido, R es una molécula de restricción covalentemente unida al grupo funcional derivatizado de un residuo de amino�cido del transportador de proteína/polip�ptido u opcionalmente de un residuo de amino�cido de un enlazador de p�ptido covalentemente unido a un transportador de proteína/polip�ptido, conservando de este modo la funcionalidad del transportador, de tal manera que retiene su habilidad para obtener las respuestas inmunes deseadas contra el inmun�geno pept�dico que de otra manera no se darían sin un transportador, n es un número entero superior a 0, pero inferior o igual a 85, y p es un número entero superior a 0, pero inferior a 85.
Las realizaciones detalladas el segundo método descrito anteriormente también son aplicables a los conjugados generados mediante el segundo método, como se acaba de describir.
En otra realización, la invención se dirige a composiciones inmunog�nicas que comprenden un conjugado de un inmun�geno pept�dico con un transportador de proteína/polip�ptido generado mediante el segundo método, junto con uno o más excipientes, diluyentes o adyuvantes farmac�uticamente aceptables.
Las realizaciones detalladas para el segundo método y los conjugados generados de este modo descritos anteriormente son también aplicables a composiciones inmunog�nicas que contienen esos conjugados como se acaban de describir.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: Diagrama de flujo que representa la química de proceso usada para la conjugación de fragmentos de p�ptido de Aβ para transportador de proteína/polip�ptido CRM197 para formar el conjugado Aβ/CRM197.
Figura 2: Diagrama de flujo que representa química de hidrólisis ácida usada para determinación cuantitativa de Scarboximetilciste�na y S-carboximetilcisteamina como evaluación del grado de conjugación de conjugados inmun�geno pept�dico-proteína/polip�ptido tal como el conjugado Aβ/CRM197. Figura 3: Esta figura representa la dependencia de pH de la reacción de conjugación p�ptido Aβ/CRM.
Figura 4: esta figura representa la dependencia de la conjugación p�ptido Aβ/CRM en la proporción p�ptido:CRM.
Figura 5: Verificación del proceso de restricción para conjugación Aβ1-7/CRM. El pH de la reacción fue 9,15. El tiempo de reacción con p�ptido fue 16 horas, la restricción con N-acetilcisteamina fuer 8 horas.
Figura 6: Conjugación y restricción con varias proporciones p�ptido:CRM con p�ptido. El pH de la reacción fue 9,0. El tiempo de reacción fue 16 horas, la restricción con N-acetilcisteamina fue 8 horas.
Figura 7: Títulos de día 36 de sueros de primates después de inmunizaci�n de primates con conjugados de p�ptido Aβ con varios adyuvantes.
Figura 8: Títulos de día 64 de sueros de primates después de inmunizaci�n de primates con conjugados de p�ptido Aβ con varios adyuvantes.
Figura 9: Títulos de primates por día y grupo de tratamiento. Los primates se inmunizaron con conjugados CRM197 Aβ 1-7 y Aβ 1-5 con alumbre o RC529 como adyuvantes y los títulos de anticuerpos anti-Aβ se midieron el día 29, 36, 57 y 54.
Figura 10: Los conjugados p�ptido-proteína se caracterizaron usando análisis de transferencia Western con un gel prefabricado de tris-tricina. Las calles son: marcador (calle 1); L-28375 24/01 (calle 2); L-28375 24/02 (calle 3); L28375 24/03 (calle 4); L-28375 24/04 (calle 5); L-28375 24/05 (calle 6); L-28375 24/06 (calle 7) L-28375 24/07 (calle 8); L-28375 24/08 (calle 9); L-28375 24/09 (Simulación) (calle 10); y BrAcCRM197 (calle 11).
BREVE DESCRICPI�N DE SECUENCIAS
SEQ ID NO:
Secuencia Descripción
1
DAEFR-C Aβ1-5-C
2
DAEFRHD-C Aβ1-7-C
3
DAEFRHDSG-C Aβ1-9-C
4
DAEFRHDSGYEV-C Aβ1-12-C
5
DAEFR-GAGA-C Aβ1-5-L-C
6
DAEFRHD-GAGA-C Aβ1-7-L-C
7
DAEFRHDSG-GAGA-C Aβ1-9-L-C
8
DAEFRHDSGYEV-GAGA-C Aβ1-12-L-C
9
VEYGSDHRFEAD-C Aβ12-1-C
SEQ ID NO:
Secuencia Descripción
10
GAGA P�ptido enlazador
11
PKYVKQNTLKLAT Hemaglutinina de influenza:HA307-319
12
AKXVAAWTLKAAA P�ptido PAN-PDR (p�ptido PADRE)
13
EKKIAKMEKASSVFNV Malaria CS: ep�tope T3
14
FELLTRTLTI Ant�geno de superficie Hepatitis B: HBsAg19-28
15
DQSIGDLIAEMDKVGNEG Proteína 65 de choque térmico: hsp65153-171
16
QVHFQPLPPAWKL Bacillus Calmette-Guerin (BCG)
17
QYIKANSKFIGITEL Toxoide de tetanos: TT830-844
18
FNNFTVSFWLRPKVSASHLE Toxoide de tetanos: TT947-967
19
KQIINMWQEVGKAMY VIH gp120 T1
20
Aβ1 7/ TT830-844/C/ TT947-967/ Aβ1 7
21
Aβ1 42
22
AN90549: Aβ1 7 TT830-844 (usado en configuración PAM4)
23
AN90550: Aβ1 7 TT947-967 (usado en configuración PAM4)
24
AN90542: Aβ1 7 TT830-844 + TT947-967 (usado en configuración PAM4)
25
AN90576: Aβ3 9 TT830-844 (usado en configuración PAM4)
26
AN90562: Aβ1 7 /PADRE
27
AN90543: Aβ1 7 x 3/PADRE
28
PADRE/ Aβ1 7 x 3
29
Aβ1 7 x 3/PADRE
30
Aβ1 7/fragmento de albúmina
31
Aβ4 10/fragmento de albúmina
32
Aβ3 9/fragmento de albúmina
33
HA307-319/ Aβ1 7 x 3
34
Aβ1 7/ HA307-319/ Aβ1 7
SEQ ID NO:
Secuencia Descripción
35
Aβ1 7 x 3/ HA307-319
36
Aβ17 x 2/ A307-319
37
Aβ1 7/ HA307-319/ Malaria CS/ TT830-844/947-967 /Aβ1 7
38
Aβ1 7 x 3/ TT830-44/CTT947-967
39
Aβ1 7 /TT830-844/CTT947-967
40
CRMβ197
41
ISQAVHAAHAEINEAGR Fragmento de albúmina
42
DAEFGHDSGEVRHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA Murina A(1-42)
43
VFFAEDVG-C A(18-25-C
44
LVFFAEDV-C A(17-24-C
45
KLVFFAED-C A(16-23-C
46
C-VFFAEDVG C-A-(18-25
47
C-CLVFFAEDV C-A-(17-24
48
C-KLVFFAEDV C-A-(16-23
49
VFFAEDV-C A(18-24-C
50
LVFFAED-C - A(17-23-C
51
KLVFFAED-C A(16-22-C
52
C-VFFAEDV C-Aβ18 24
53
C-LVFFAED C-Aβ17 23
54
C-KLVFFAE C-Aβ16 22
Descripci�n detallada de la invención
La presente invención también se dirige a composiciones inmunog�nicas que comprenden dichos conjugados.
El planteamiento para aumentar la inmunogenicidad de moléculas pequeñas o pobremente inmunog�nicas, tales como sac�ridos, por medio de conjugación se ha utilizado con éxito durante décadas (véase, por ejemplo, Goebel et al. (1939) J. Exp. Med. 69:53), y se han descrito muchas composiciones inmunog�nica en las cuales los pol�meros capsulares se han conjugado con proteínas transportadoras para crear composiciones inmunog�nicas más efectivas al explotar este “efecto transportador”. Por ejemplo, Schneerson et al. (J. Exp. Med. 152: 361-376, 1980), describen conjugados de proteína de polisac�rido de Haemophilus influenzae b que confieren inmunidad a enfermedades invasivas causadas por microorganismos. Los conjugados de PRP (polirribosilribitol fosfato, un pol�mero capsular de H. influenzae b) han demostrado ser más efectivos que las composiciones inmunog�nicas basadas en el polisac�rido solo (Chu et al. (1983) Infect. Immun. 40: 245; Schneerson et al. (1984), Infect. Immun.
45: 582-591). La conjugación también ha demostrado evitar la respuesta pobre del anticuerpo observada en niños cuando se inmunizaron con un polisac�rido libre (Anderson et al. (1985) J. Pediatr. 107:346; Insel et al. (1986) J. Exp. Med. 158:294).
Una ventaja más de usar como transportador de proteína una toxina o toxoide bacteriano contra el que la inmunizaci�n rutinaria de humanos (por ejemplo, tétano o difteria) es una práctica estándar es que se induce una inmunidad deseada a la toxina o toxoide junto con la inmunidad contra los pat�genos asociados al pol�mero capsular.
Los conjugados de determinante antig�nico/hapteno-transportador también se est�n usando para producir anticuerpos monoclonales muy específicos que puedan reconocer ep�topes químicos distintos en el hapteno acoplado. Los monoclonales resultantes a menudo se usan para investigar la estructura epit�pica y las interacciones entre proteínas nativas. En muchos casos los determinantes antig�nicos/haptenos usados para generar estos monoclonales son segmentos pequeños de p�ptido que representan sitios antig�nicos cruciales sobre la superficie de proteínas más grandes. Los criterios para un transportador con éxito que se usar� en la generación de un conjugado determinante antig�nico/hapteno-transportador son el potencial para inmunogenicidad, la presencia de grupos funcionales adecuados para conjugación con un determinante antig�nico/hapteno, propiedades de solubilidad razonable incluso después de la derivatizaci�n y falta de toxicidad in vivo.
Estos criterios los cumplen los conjugados generados por los métodos de la presente divulgación. Los conjugados pueden ser cualquier conjugado de transportador de inmun�geno pept�dico generado usando el proceso de conjugación aquí descrito. Los conjugados se generan usando un proceso en el que un transportador de proteína/polip�ptido que tiene la siguiente estructura:
est� covalentemente unido a un transportador de proteína/polip�ptido, donde, C es un transportador de proteína CRM197/polip�ptido y X es un grupo funcional derivatizado en un residuo de amino�cido en el transportador de proteína/polip�ptido u opcionalmente en un residuo de amino�cido en un enlazador de p�ptido covalentemente unido al transportador de proteína/polip�ptido, y donde m es un número entero superior a 0, pero inferior o igual a 85, est� covalentemente unido a un inmun�geno pept�dico y donde el conjugado de inmun�geno pept�dico-transportador de proteína/ polip�ptido tiene la siguiente fórmula, est� representado por la siguiente fórmula:
donde
C es el transportador de proteína CRM197/polip�ptido y Xd es un grupo funcional derivatizado en un residuo de amino�cido en el transportador de proteína/polip�ptido u opcionalmente en un residuo de amino�cido en un enlazador de p�ptido covalentemente unido al transportador de proteína/polip�ptido, P es un inmun�geno pept�dico covalentemente unido al grupo funcional derivatizado en el residuo de amino�cido en el transportador de proteína/polip�ptido u opcionalmente en un residuo de amino�cido en un enlazador de p�ptido covalentemente unido a un transportador de proteína/polip�ptido, R es una molécula de restricción covalentemente unida al grupo funcional derivatizado en un residuo de amino�cido en el transportador de proteína/polip�ptido u opcionalmente en un residuo de amino�cido de un enlazador de p�ptido covalentemente unido a un transportador de proteína/polip�ptido, conservando de este modo la funcionalidad del transportador, de tal manera que retiene su habilidad para obtener las respuestas inmunes deseadas contra el inmun�geno pept�dico que de otra manera no se darían sin un transportador, n es un número entero superior a 0, pero inferior o igual a 85, y p es un número entero superior a 0, pero inferior a 85.
Selecci�n de transportadores
Algunos inmun�genos pept�dicos contienen el ep�tope apropiado para inducir una respuesta inmune, pero son demasiado pequeños para ser inmunog�nicos. En esta situación, los inmun�genos pept�dicos se unen a un transportador adecuado para ayudar a obtener una respuesta inmune. En la representación esquemática anterior del conjugado inmun�genos pept�dicos-transportador generados mediante un proceso de la presente invención, C es un transportador der proteína/polip�ptido con el que los inmun�genos pept�dicos se conjugan directamente mediante grupos funcionales derivatizados en residuos de amino�cido en los propios transportadores o mediante grupos funcionales derivatizados en enlazadores de p�ptido covalentemente unidos a los transportadores. Los transportadores de proteína/polip�ptido adecuados incluyen, aunque no se limitan a, albúmina (incluyendo albúmina de suero humano), hemocianina de lapa californiana, moléculas de inmunoglobulina, tiroglobulina, ovalb�mina, MSCRAMMS, toxoide de tétanos o un toxoide de otras bacterias patog�nicas que tienen toxicidad reducida, incluyendo mutantes, tales como difteria, E. coli, cólera o H. pylori, o un derivado atenuado de toxina. El transportador de la invención es la proteína CRM197 (SEQ ID NO: 40) que es reactiva de cruce con toxina de difteria.
Otros transportadores incluyen ep�topes de célula T que se unen a múltiples alelos MHG, por ejemplo, al menos 75% de todos los alelos humanos MHC. Tales transportadores algunas veces se conocen en la técnica como “ep�topes universales de célula T”. Los transportadores ejemplares con ep�topes universales de célula T incluyen:
Hemaglutinina de Influenza: HA307-319 PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID NO. 11) P�ptido PAN-DR (p�ptido PADRE) AKWVAAWTLKAAA (SEQ ID NO. 12) Malaria CS: ep�tope T3 EKKIAKMEKASSVFNV (SEQ ID NO. 13) Ant�geno de superficie Hepatitis B: HBsAg19-28 FELLTRILTI (SEQ ID NO. 14) Proteína de choque t�rminco: hsp65153-171 QSIGDLIAEAMDKVGNEG (SEQ ID NO. 15) Bacillus Calmette-Guerin (BCG) QVHFQPLPPAVVKL (SEQ ID NO. 16) Toxoide de tétanos: TT830-844 QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO. 17) Toxoide de tétanos: TT947-967 NNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO. 18) VIH GP120 T1: KQIINMWQEVGKAMY (SEQ ID NO. 19) CRM197 Véase la Breve Descripción de las Secuencias (SEQ
ID NO: 40) Fragmento de albúmina ISQAVHAAHAEINEAGR (SEQ ID NO: 41)
Oros transportadores para estimular o mejorar una respuesta inmune y con los que un inmun�geno pept�dico o un hapteno se pueden conjugar incluyen citoquinas tales como IL-1, IL-1α y p�ptidos β, IL-2, γINF, IL-10, GM-CSF, y quimioquinas, tales como MIP 1α y β y RANTES. Los p�ptidos inmunog�nicos también pueden unirse a transportadores de proteínas/p�ptidos que mejorar el transporte a través de tejidos, como se describe en O’Mahony, WO 97/171163 y wO 97/17614.
A�n más transportadores incluyen peptidasa C5a estreptococal recombinante, Streptococcus pyogenes ORFs 1224, 1664 y 2452, Chlamydia pneumoniae ORFs T367 y T858, Streptococcus pneumonia pneumolisina, mutantes de pneumolisina con toxicidad reducida, factores de crecimiento y hormonas.
En la presente invención, la proteína transportadora es CRM197, un mutante no tóxico de toxina de difteria con un cambio de amino�cido en su secuencia primaria. La glicina presente en la posición de amino�cido 52 de la molécula se sustituye por un ácido glut�mico debido a un único cambio de cod�n de ácido nucleico. Debido a este cambio, la proteína carece de actividad ADP-ribosil transferasa y se convierte en no tóxica. Tiene un peso molecular de 58.408 Da. CRM197 se produce en grandes cantidades mediante expresión recombinante de acuerdo con la patente de Estados Unidos 5.614.382. Las conjugaciones de sac�ridos as� como los p�ptidos para CRM197 se realizan mediante unión a través de los grupos amino ε de residuos de lisina. Mediante varios productos comerciales se ha establecido que CRM197 es un transportador excelente y seguro para ep�topes de célula B.
P�ptidos inmunog�nicos
Como aquí se usan, los términos “inmun�geno pept�dico” o “hapteno” es cualquier proteína o estructura/fragmento/análogo de subunidad derivada de los mismos que puede obtener, facilitar o ser inducida para producir una respuesta inmune en la administración a un mamífero. En particular, los términos se usan para referirse a un determinante antig�nico polip�ptido de cualquier fuente (bacteria, virus o eucariota), que puede acoplarse a un transportador usando un método aquí descrito. Tales determinantes de inmun�geno pept�dico/antig�nico pueden ser de origen viral, bacteriano o de célula eucari�tica.
Los inmun�genos pept�dicos pueden conjugarse con un transportador para su uso como un agente inmunoterap�utico en la prevención, tratamiento, profilaxis o mejora de varias enfermedades humanas. Tales inmun�genos pept�dicos incluyen aquellos derivados de Aβ un p�ptido de 39-43 amino�cidos, preferentemente 42 amino�cidos, que es el principal componente de palcas características de enfermedad de Alzheimer (EA) (véase US 4.666.829; Glenner & Wong (1984) Biochem. Biophys. Res. Commun. 120: 1131, Hardy (1984) TINS 20: 1131; Hardy (1977) TINS 20: 154), aquellos derivados de p�ptidos amiloides de amilina, un material polip�ptido producido por células islotes pancreáticas que ha estado implicado en diabetes tipo II, p�ptidos derivados de productos genéticos de lipoprote�na de baja densidad, que han estado implicados en ateroesclerosis y p�ptidos antig�nicos derivados de citoquinas y factores del crecimiento tales como interleuquina 6 (IL-6), factor α de necrosis tumoral (TNF-α) y GDF-8. Tales inmun�genos pept�dicos eucari�ticos pueden incluir ep�tope de célula T (CTL) o de célula B, también conocido como proteína β-amiloide, o p�ptido A4.
Aβ, también conocido como p�ptido β-amiloide, o p�ptido A4 (véase US 4.666.829; Glenner & Wong, Biochem. Biophys. Res. Commun., 120, 1131 (1984)), es un p�ptido de 39-43 amino�cidos, que es el componente principal de palcas características de enfermedad de Alzheimer. Aβ se genera procesando una proteína más grande APP por dos enzimas, denominadas secretasas β y γ (véase Hardy, TINS 20, 154 (1997)). Las mutaciones conocidas en APP asociada con enfermedad de Alzheimer ocurren próximas al sitio de secretasa β y γ, o en Aβ. Por ejemplo, la posición 771 est� próxima al sitio de segmentación de secretasa γ de APP en su procesamiento a Aβ, y las posiciones 670/671 est�n próximas al sito de segmentación de secretasa β. Se cree que las mutaciones causan AD al interactuar con los sitios de segmentación por los que se forma Aβ para aumentar la cantidad de la forma de amino�cido 42/43 de Aβ generado.
Aβ tiene la propiedad inusual de que puede fijar y activar cascadas complementarias clásicas y alternativas. En particular, se une a Clq y por último a C3bi. Esta asociación facilita en enlace con macr�fagos que llevan a la activación de células B. además, C3bi se descompone y después se enlaza con CR2 en células B de una manera dependiente de célula T llevando a un aumento de 10.000 en la activación de estas células. Este mecanismo provoca que Aβ genere una respuesta inmune en exceso de la de otros ant�genos.
Aβ tienen varias formas de darse de manera natural. Las formas humanas de Aβ se refieren como Aβ39, Aβ40, Aβ41, Aβ42 y Aβ43. Las secuencias de estos p�ptidos y su relación con el precursor APP se ilustran en la Figura 1 de Hardy et al., TINS 20, 155-158 (1997). Por ejemplo, Aβ42 tiene la secuencia.
H2N-Asp-Ala-Glu-Fe-Arg-His-Asp-Ser-Gli-Tir-Glu-Val-His-His-Gln-Lis-Leu-Val-Fe-Fe-Ala-Glu-Asp-Val-Gli-Ser-AsnLis-Gli-Ala-Ile-Ile-Gli-Leu-Met-Val-Gli-Gli-Val-Val-Ile-Ala-OH (SEQ ID NO. 21).
Aβ41, Aβ40 Y Aβ39 difieren de Aβ42 en la omisión de Ala, Ala-Ile y Ala-Ile-Val respectivamente del extremo de terminal C. Aβ43 difiere de Aβ42 en la presencia de un residuo de treonina en la terminal C.
Los inmun�genos pept�dicos que son fragmentos de Aβ son ventajosos en relación con la molécula intacta para su uso en el presente método por varias razones. En primer lugar, debido a que solamente ciertos ep�topes en Aβ inducen una repuesta inmunog�nica útil para el tratamiento de Alzheimer, una dosis igual de masa de un fragmento que contiene tales ep�topes proporciona una mayor concentración molar de los ep�topes inmunog�nicos útiles que una dosis de Aβ intacto. En segundo lugar, ciertos inmun�genos pept�dicos de Aβ generan una respuesta inmune contra depósitos de amiloides sin generar una respuesta inmunog�nica significativa contra proteína APP de la que se deriva Aβ. En tercer lugar, los inmun�genos pept�dicos de Aβ son más simples de fabricar que Aβ intacto debido a su tamaño más corto. En cuarto lugar, los inmun�genos pept�dicos de Aβ no se agregan de la misma manera que Aβ intacto, simplificando la generación de conjugados con transportadores.
Algunos inmun�genos pept�dicos de Aβ tienen una secuencia de al menos 2, 3, 5, 6, 10 o 20 amino�cidos contiguos de un p�ptido natural. Algunos inmun�genos pept�dicos no tienen más de 10, 9, 8, 7, 5 o 3 residuos contiguos de Aβ. En una realización preferente, los inmun�genos pept�dicos de la mitad de terminal N de Aβ se usan para preparar conjugados. Los inmun�genos pept�dicos preferentes incluyen Aβ1-5, 1-6, 1-7, 1-10, 1-11, 3-7, 1-3 y 1-4. La designación Aβ1-5 por ejemplo, indica un fragmento de terminal N que incluye residuos 1-5 de Aβ. Los fragmentos de Aβ que comienzan en un fragmento de terminal N y que acaban en un residuo dentro de los residuos 7-11 de Aβ son particularmente preferentes. El fragmento Aβ1-12 también puede usarse pero es menos preferente. En algunos métodos, el fragmento es un fragmento de terminal N diferente a Aβ1-10. Otros fragmentos preferentes incluyen Aβ13-28, 15-24, 1-28, 25-35, 35-40, 35-42 y otros fragmentos internos y fragmentos de terminal C.
Algunos p�ptidos Aβ de la invención son p�ptidos inmunog�nicos que en la administración a un paciente humano o animal generan anticuerpos que específicamente se enlazan con uno o más ep�topes entre los residuos 16 y 25 de Aβ. Los fragmentos preferentes incluyen Aβ16-22, 16-23, 17-23, 17-24, 18-24 y 18-25. Los anticuerpos que específicamente se enlazan con ep�topes entre los residuos 16 y 25 se enlazan específicamente con Aβ soluble sin enlazarse con las placas de Aβ. Estos tipos de anticuerpo pueden enlazarse específicamente con Aβ soluble en la circulación de un paciente o modelo animal sin enlazarse específicamente con placas de depósitos de Aβ en el cerebro del paciente o modelo. El enlace específico de anticuerpos con Aβ soluble inhibe a Aβ de ser incorporado en placas inhibiendo de este modo el desarrollo de placas en un paciente e inhibiendo un mayor aumento en el tamaño
o frecuencia de placas si tales placas ya se han desarrollado antes de administrar el tratamiento.
Preferentemente, el fragmento de Aβ administrado carece de un ep�tope que generaría una repuesta de célula T al fragmento. Generalmente, los ep�topes de célula T tienen más de 10 amino�cidos contiguos. Por lo tanto, los fragmentos preferentes de Aβ tienen un tamaño de 5-10 o preferentemente 7-10 amino�cidos contiguos o más preferentemente 7 amino�cidos contiguos; esto es, una longitud suficiente para generar una respuesta de anticuerpo sin generar una respuesta de célula T. La ausencia de ep�topes de célula T es preferente porque estos ep�topes no son necesarios para la actividad inmunog�nica de fragmentos, y pueden provocar una respuesta inflamatoria no deseada en un subconjunto de pacientes (Anderson et al., (2002) J. Immunol. 168, 3697-3701; Senior (2002) Lancet Neurol., 1,3).
El fragmento Aβ15-25 y los sub-fragmentos de los 7-8 amino�cidos contiguos del mismo son preferentes porque estos p�ptidos generar de manera consistente una alta repuesta inmunog�nica para el p�ptido Aβ. Estos fragmentos incluyen Aβ16-22, Aβ16-23, Aβ16-24, Aβ17-23, Aβ17-24, Aβ18-24 y Aβ18-25. Los fragmentos Aβ15-25 particularmente preferente tienen 7 amino�cidos contiguos de longitud. La designación Aβ15-21 por ejemplo, indica un fragmento que incluye 15-21 residuos de Aβ y que carece de otros residuos de Aβ y preferentemente 7-10 amino�cidos contiguos. Estos fragmentos pueden generar una respuesta de anticuerpo que incluye anticuerpos específicos del extremo.
Los inmun�genos pept�dicos de Aβ requieren una exploración para actividad en la limpieza o prevención de depósitos de amiloide (véase WO 00/72880). La administración de fragmentos de terminal N de Aβ induce la producción de anticuerpos que reconocen depósitos de Aβ in vivo e in vitro. En estos métodos se usan fragmentos que carecen al menos de uno, y a veces al menos 5 o 10 amino�cidos de terminal C presentes en formas que ocurren de manera natural de Aβ. Por ejemplo, un fragmento que carece de 5 amino�cidos de extremo de terminal C de Aβ43 induce los primeros 38 amino�cidos del extremo de terminal N de Aβ.
A menos que se indique lo contrario, la referencia a Aβ incluye las secuencias de amino�cido humano natural indicadas anteriormente as� como análogos que incluyen al�licos, especies y variantes inducidas. Los análogos típicamente difieren de los p�ptidos que ocurren de manera natural en una, dos o unas pocas posiciones, a menudo en virtud de sustituciones conservadoras. Los análogos típicamente muestran al menos 80 o 90% de identidad de secuencia con p�ptidos naturales. Algunos análogos también incluyen amino�cidos no naturales o modificaciones de amino�cidos de terminal N o C en una, dos o unas pocas posiciones. Por ejemplo, el residuo de ácido asp�rtico natural en la posición 1 y/o 7 de Aβ puede sustituirse por ácido iso-asp�rtico.
Ejemplos de amino�cidos no naturales son amino�cidos D, alfa, alfa-disustituidos, amino�cidos de Nalquilo, ácido l�ctico, 4-hidroxiprolina, gamma-carboxiglutamato, �psilon-N,N,N-trimetillisina, �psilon-N-acetillisina, Ofosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 4-hidroxilisina, omega-N-metilarginina, β-alanina, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxprolina, tiroxina, gamma-ácido aminobut�rico, homoserina, citrulina y ácido isoasp�rtico. Los p�ptidos inmunog�nicos también incluyen análogos de Aβ y fragmentos de los mismos. Algunos agentes terapéuticos de la invención son todos los p�ptidos D, por ejemplo, todos los Aβ D, todos los fragmentos de Aβ D, o análogos de todos los Aβ D o fragmentos de Aβ D. los fragmentos y análogos pueden explorarse para eficacia profiláctica o terapéutica en modelos de animales transg�nicos en comparación con controles no tratados o con placebo como se describe en WO 00/72880.
Los inmun�genos pept�dicos también incluyen polip�ptidos más largos que incluyen, por ejemplo, un inmunog�nico de p�ptido Aβ, junto con otros amino�cidos. Por ejemplo, los p�ptidos inmunog�nicos preferentes incluyen proteínas de fusión que comprenden un segmento de Aβ unido a una secuencia heter�loga de amino�cido que induce una respuesta de célula T ayudante contra la secuencia heter�loga de amino�cido y de este modo una respuesta de célula B contra el segmento Aβ. Tales polip�ptidos pueden explorarse para eficacia profiláctica o terapéutica en modelos de animales en comparación con controles no tratados o con placebo como se describe en WO/72880.
El p�ptido Aβ, análogo, fragmento inmunog�nico u otro polip�ptido puede administrase en forma desagregada o agregada. Aβ desagregado o fragmentos del mismo significan unidades monom�ricas de p�ptido. Aβ desagregado o fragmentos del mismo son generalmente solubles, y son capaces de auto-agregarse para formar olig�meros solubles, protofibrillas y ADDLs. Los olig�meros de Aβ o fragmentos de los mismos son normalmente solubles y existen predominantemente como hélices alfa o espirales aleatorias. Aβ agregado o fragmentos del mismo significa olig�meros de Aβ o fragmentos de los mismos que se han asociado en montajes insolubles de lámina beta. Aβ agregado o fragmentos del mismo también significan pol�meros fibrilares. Las fibrillas son normalmente insolubles. Algunos anticuerpos se enlazan con Aβ soluble o fragmentos del mismo o Aβ agregado o fragmentos del mismo. Algunos anticuerpos se enlazan con Aβ soluble o fragmentos del mismo y con Aβ agregado o fragmentos del mismo.
Los p�ptidos inmunog�nicos también incluyen mult�meros de p�ptidos inmunog�nicos monom�ricos. Los p�ptidos inmunog�nicos diferentes a los p�ptidos Aβ deberían inducir una respuesta inmunog�nica contra uno o más de los fragmentos preferentes de Aβ listados anteriormente (por ejemplo, Aβ1-3, 1-7, 1-10 y 3-7).
Los p�ptidos inmunog�nicos de la presente invención est�n unidos a un transportador usando un método de la presente divulgación para formar un conjugado. El p�ptido inmunog�nico puede unirse en su terminal amino, su terminal carboxilo o en ambas a un transportador para formar un conjugado. Opcionalmente, pueden estar presente múltiples repeticiones del p�ptido inmunog�nico en el conjugado.
Un fragmento de terminal N de Aβ puede estar unida en su terminal C a un p�ptido transportador para formar un conjugado. En tales conjugados, el residuo de terminal N del fragmento de Aβ constituye el residuo de terminal N del conjugado. Por consiguiente, tales conjugados son efectivos para inducir anticuerpos que se enlazan con un ep�tope que requiere que el residuo de terminal N de Aβ est� en forma libre. Algunos p�ptidos inmunog�nicos de la invención comprenden una pluralidad de repeticiones de un segmento de terminal N de Aβ unido en la terminal C a uno o más copias del p�ptido transportador para formar in conjugado. El fragmento de terminal N de Aβ incorporado a tale s conjugados a menudo empieza en Aβ1-3 y acaba en Aβ7-11. Aβ1-7, 1-3, 1-4, 1-5 y 3-7 son fragmentos de Aβ de terminal N preferentes. Algunos conjugados comprenden diferentes segmentos de terminal N de Aβ en t�ndem. Por ejemplo, un conjugado puede comprender Aβ1-7 seguido de Aβ1-3 unido al transportador.
En algunos conjugados, un segmento de terminal N de Aβ se une en su extremo de terminal N a un p�ptido transportador. La misma variedad de segmentos de terminal N de Aβ pueden usarse con unión de terminal C. Algunos conjugados comprenden un p�ptido transportador unido a la terminal N de un segmento de terminal N de Aβ, que a su vez est� unido a uno o más segmentos adicionales de terminal N de Aβ en t�ndem. Preferentemente, tales fragmentos inmunog�nicos de Aβ, una vez conjugados con un transportador adecuado, inducen una repuesta inmunog�nica que est� específicamente dirigida al fragmento Aβ sin dirigirse a otros fragmentos de Aβ.
Los p�ptidos inmunog�nicos de la invención incluyen p�ptidos heter�logos inmunog�nicos. En algunos p�ptidos inmunog�nicos, un fragmento Aβ se une a un transportador para formar un p�ptido heter�logo inmunog�nico. Este p�ptido heter�logo est� unido a un transportador usando un método de la presente divulgación para formar un conjugado. Algunos de estos p�ptidos heter�logos inmunog�nicos comprenden fragmentos de Aβ unidos a ep�topes de toxoide del tétanos como se describe en US 5.196.512, EP 378.881 y EP 427.347. Opcionalmente, un p�ptido inmunog�nico puede unirse a una o más copias de un transportador, por ejemplo, en las terminales N y C del transportador para formar un p�ptido heter�logo inmunog�nico. Otros de estos p�ptidos heter�logos inmunog�nicos comprende fragmentos de Aβ unidos a p�ptidos transportadores descritos en US
5.736.142. Por ejemplo, un p�ptido heter�logo inmunog�nico puede comprender Aβ1-7 seguido de Aβ1-3 seguido de un transportador. Ejemplos de tales p�ptidos heter�logos inmunog�nicos incluyen:
Aβ 1-7/toxoide de tétanos 830-844 + 947-967 en una configuración lineal
P�ptidos descritos en US 5.736.142 (todos en configuraciones lineales):
Aβ4-10/fragmento de albúmina:
Aβ4-10/fragmento de albúmina:
Algunos p�ptidos heter�logos inmunog�nicos comprenden un mult�mero de p�ptidos inmunog�nicos representados por la fórmula 2x, donde x es un número entero de 1-5. Preferentemente x es 1, 2 � 3, siendo 2 el más preferente. Cuando x es dos, tal mult�mero tiene cuatro p�ptidos inmunog�nicos unidos en una configuración preferente referida como PAM4 (véase US 5.229.490). Tales p�ptidos inmunog�nicos se unen después a un transportador usando un método de la presente invención para formar un conjugado.
La configuración PAM4 se muestra más abajo, donde las estructuras ramificadas se producen iniciando síntesis de p�ptido en la terminal N y las aminas de cadena lateral de lisina. Dependiendo del número de veces se incorpore la lisina a la secuencia y se deje ramificar, la estructura resultante presentar� múltiples terminales N. En este ejemplo, se han producido cuatro terminales N idénticas en el núcleo que contiene lisina ramificada. Tal multiplicidad mejora en gran medida la sensibilidad de células B similares.
P�ptido KGG P�ptido KA P�ptido KGG P�ptido
Ejemplos de tales p�ptidos heter�logos inmunog�nicos incluyen:
Aβ 1-7/toxoide de tétanos 830-844 en una configuración PAM4: DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 22) Aβ 1-7/toxoide de tétanos 947-967 en una configuración PAM4: DAEFRHD-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 23) Aβ 3-9/toxoide de tétanos 830-844 en una configuración PAM4: EFRHDSG-QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 25)
DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL en una resina con 2 ramas
P�ptido
Lis-Gli-Cis P�ptido
El p�ptido Aβ, análogo, fragmento activo y otros polip�ptido puede administrarse en forma asociadas o multim�rica o en forma disasociada. Los agentes terapéuticos también incluyen mult�meros de agentes inmunog�nicos monom�ricos. Los agentes diferentes a los p�ptidos Aβ deberían inducir una respuesta inmunog�nica contra uno más de los fragmentos preferentes de Aβ listados anteriormente (por ejemplo, 1-10, 1-7, 13 y 3-7), y pueden también conjugarse con un transportador usando un método de la presente invención. Preferentemente, tales agentes, una vez conjugados con un transportador apropiado, inducen una respuesta inmunog�nica que se dirige específicamente a uno de estos fragmentos in dirigirs a otros fragmentos de Aβ. Para facilitar la conjugación de un inmun�geno pept�dico con un transportador, pueden añadirse amino�cidos adicionales a las terminales de los determinantes antig�nicos. Los residuos adicionales también pueden usarse para modificar las propiedades físicas o químicas del inmun�geno pept�dico. Los amino�cidos tales como tirosina, ciste�na, lisina, ácido glut�mico o asp�rtico pueden introducirse en la terminal C o N del inmun�geno pept�dico. Además, los enlazadores pept�dicos que contienen amino�cidos tales como glicina y alanina también pueden introducirse. Además, los determinantes antig�nicos pueden diferir de la secuencia natural al modificarse mediante acetilaci�n de grupo NH2 de terminal, por ejemplo, mediante alcanoil (C1-C20) o acetilaci�n de tioglicolil, amidaci�n de terminalcarboxi, por ejemplo, amoniaco, metilamina, etc. En algunos casos estas modificaciones pueden proporcionar sitios para unir a un soporte u otra molécula.
Los inmun�genos pept�dicos usados para generar conjugados de la presente invención que usan un proceso aquí desvelado pueden combinarse mediante unión para formar pol�meros (mult�meros), o pueden formularse en una composición sin unión, como una mezcla. Donde un p�ptido se une a un p�ptido idéntico, formando de este modo un homopol�mero, se presentan una pluralidad de unidades epit�picas repetidas. Por ejemplo, la tecnología de p�ptidos de ant�genos múltiples (PAM) se usa para construir pol�meros que contienen CTL y/o p�ptidos de anticuerpo y p�ptidos. Un “ep�tope CTL” es uno que se deriva de regiones epit�picas seleccionadas de ant�genos dianas potenciales. Cuando los p�ptidos difieren, por ejemplo, un cocktail que representa diferentes subtipos virales, se proporcionan diferentes ep�topes en un subtipo, diferentes especificidades de restricción HLA o p�ptidos que contienen ep�topes ayudantes T, heteropol�meros con unidades repetidas. Además de las uniones covalentes, también se contemplan uniones no covalentes capaces de formar enlaces intermoleculares e intraestructurales.
Tales inmun�genos pept�dicos y sus análogos se sintetizan mediante síntesis de p�ptido en fase sólida o expresión recombinante, o se obtienen a partir de fuentes naturales. Los sintetizadores automáticos de p�ptidos est�n disponibles en el mercado por parte de numerosos proveedores, tales como Applied Biosystems, Foster City, California.
La expresión recombinante puede ser en bacterias (tales como E. coli), levadura, células de insectos o células de mamífero. Los procedimientos para expresión recombinante los describen Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, NY, 2� ed., 1989). Algunos p�ptidos inmunog�nicos también est�n disponibles en el mercado (por ejemplo, American Peptides Company, Inc., Sunnyvale, CA, y California Peptide Research, Inc., Napa, CA):
Las bibliotecas aleatorias de p�ptidos u otros compuestos también pueden explorarse para su idoneidad como un inmun�geno pept�dico. Las bibliotecas combinatorias pueden producirse para muchos tipos de compuestos que pueden sintetizarse de una manera paso a paso. Tales compuestos incluyen polip�ptidos, imitadores de giro beta, hormonas, glicinas sustituidas por N oligom�rico y oligocarbamatos y similares. Las bibliotecas combinatorias grandes de los compuestos pueden construirse mediante el método de bibliotecas sintéticas codificadas (BSC) descrito en WO 95/12608, WO 93/06121, WO 94/08051, WO 95/35503 y WO 95/30642. Las bibliotecas de p�ptidos también pueden generarse mediante métodos de expresión en fago (véase, por ejemplo, Devlin, WO 91/18980).
Derivatizaci�n y conjugación de un p�ptido inmunog�nico con un transportador de proteína
El sitio de unión de un inmun�geno pept�dico con un transportador de proteína/polip�ptido, y la naturaleza del agente de enlace cruzado que se usa para unir un inmun�geno pept�dico con el transportador son importantes para la especificidad del anticuerpo resultante generado contra él. Para un reconocimiento adecuado, el inmun�geno pept�dico debe acoplarse al transportador con la orientación apropiada. Para que un anticuerpo reconozca posteriormente los inmun�genos pept�dicos libres sin el transportador, el conjugado de inmun�geno pept�dicotransportador de proteína/polip�ptido debe presentar los inmun�genos pept�dicos en una forma expuesta y accesible. La orientación óptima a menudo se consigue dirigiendo la reacción de enlace cruzado a sitios específicos en los inmun�genos pept�dicos. Una manera de conseguir esto con un inmun�geno pept�dico es uniendo un residuo de ciste�na de terminal durante la síntesis de p�ptidos. Esto proporciona un grupo de sulfhidrilo en un extremo del p�ptido para su conjugación con el transportador. El enlace cruzado a través de este grupo proporciona la unión del inmun�geno pept�dico solamente en un extremo, asegurando de este modo una orientación consistente.
En la conjugación inmun�geno pept�dico-transportador, el objetivo no es mantener el estado nativo o la estabilidad nativa del transportador, sino presentar el hapteno de la mejor manera posible para el sistema inmune. Para conseguir este objetivo, la elección de química de conjugación puede controlar el título resultante, afinidad y especificidad de los anticuerpos generados contra el hapteno. Puede ser importante en algunos casos elegir un agente de enlace cruzado que contenga un brazo espaciador lo suficientemente largo para presentar el ant�geno de una manera no restringida. También puede ser importante controlar la densidad del inmun�geno pept�dico sobre la superficie del transportador. Una sustitución de inmun�geno pept�dico demasiado pequeño puede dar como resultado en una respuesta muy pequeña o respuesta nula. Una densidad e inmun�geno pept�dico demasiado alta puede provocar supresión inmunol�gica y disminuir la respuesta. Además, el propio enlazador cruzado puede generar una respuesta inmune no deseada. Estos tejidos necesitan tomarse en consideración en la selección no solamente de los reactivos apropiados de enlace cruzado, sino también las proporciones apropiadas de transportador de proteína/polip�ptido e inmun�geno pept�dico.
Son posibles una variedad de medios para unir los transportadores de proteína/polip�ptido a los inmun�genos pept�dicos. Las interacciones iónicas son posibles a través de terminales o a través del grupo ε amino de lisina. En enlace de hidrógeno entre los grupos laterales de los residuos y el inmun�geno pept�dico también son posibles. Finalmente, las interacciones de conformación entre los transportadores de proteína/p�ptido y el p�ptido inmunog�nico pueden dar lugar a una unión estable.
Se han generado de manera exitosa conjugados de inmun�genos pept�dicos-transportador usando varios reactivos de enlace cruzado tales como enlazadores de cruce de longitud cero, homobifuncionales o heterobifuncionales. Los sistemas reactivos más pequeños disponibles para conjugación son los llamados enlazadores de cruce de longitud cero. Estos compuestos median la conjugación de dos moléculas mediante la formación de un enlace que no contiene átomos adicionales. De este modo, un átomo de una molécula es un espaciador. En muchos diseños de conjugación, el complejo final se une en virtud de componentes químicos que añaden estructuras externas a las sustancias que se est�n sometiendo a enlace cruzado. En algunas aplicaciones, la presencia de estos enlazadores intermedios puede ser perjudicial para el uso planeado. Por ejemplo, en la preparación de conjugados inmun�geno pept�dico-transportador el complejo se forma con la intención de generar una respuesta inmune al hapteno unido. Ocasionalmente, una parte de los anticuerpos producidos mediante esta respuesta tendr� la especificidad para el agente de enlace cruzado usado en el procedimiento de conjugación. Los agentes de enlace cruzado de longitud cero eliminan el potencial para este tipo de reactividad cruzada al mediar una unión directa entre dos sustancias.
Los reactivos homobifuncionales, que primero fueron los reactivos de enlace cruzado para la modificación y conjugación de macromoléculas, consistían en compuestos bireactivos que contienen el mismo grupo funcional en ambos extremos (Hartman y Wold, 1966). Estos reactivos podían atar una proteína a otra mediante reacción covalente con los mismos grupos comunes en ambas moléculas. De este modo, las aminas ε lisina o aminas de terminal N de una proteína podrían someterse a enlace cruzado para los mismos grupos funcionales en una segunda proteína simplemente mezclando lso dos en presencia del reactivo homobifuncional.
Los reactivos de conjugación heterobifuncionales contienen dos grupos reactivos diferentes que pueden acoplarse a dos objetivos funcionales diferentes en proteínas y otras macromoléculas. Por ejemplo, una parte de un enlazador cruzado puede contener un grupo reactivo de amina, mientras otra parte puede consistir en un grupo reactivo sulfhidrilo. El resultado es la habilidad para dirigir la reacción de enlace cruzado a partes seleccionadas de moléculas dianas, consiguiendo de este modo un mejor control sobre el proceso de conjugación.
Los reactivos heterobifuncionales se usaron para proteínas de enlace cruzado y otras moléculas en un proceso de dos o tres etapas que limita el grado de polimerizaci�n a menudo obtenida usando enlazadores cruzados homobifuncionales.
Muchos métodos est�n actualmente disponibles para acoplar inmun�genos pept�dicos a transportadores de proteína/polip�ptido que usan enlazadores cruzados de longitud cero, homobifuncioanles o heterobifuncionales. La mayoría de los métodos cran enlaces de amina, amida, uretano, isotiourea o disulfuro o en algunos casos tio�teres. El método más general acoplar proteínas o p�ptidos a p�ptidos utiliza reactivos de enlace cruzado bifuncionales. Estos son moléculas pequeñas espaciadoras que tienen grupos activos en cada extremo. Las moléculas espaciadoras pueden tener grupos activos idénticos o diferentes en cada extremo. Las funcionalidades activas más comunes, grupos de acoplamiento, y enlaces formados son:
1.
Aldeh�do – amino → amina secundaria
2.
Maleimido – sulfihidrilo (tio�ter
2. Succinimido – amino (amida
4.
�steres de imidato – amino (-amida
5.
Fenil azida – amino (fenil amino
6.
Acil haluro – sulfhidrilo (tio�ter
7.
PIridilsulfido – sulfhidrilo (disulfuro
8.
Isotiocionato – amino (isotiourea
La reactividad de una proteína transportadoras dada, en términos de su habilidad para modificarse mediante un agente de enlace cruzado de tal manera que pueda conjugarse con un inmun�geno pept�dico, se determina mediante su composición de amino�cido y la localización de secuencia de los amino�cidos individuales en la estructura tridimensional de la molécula, as� como por la composición de amino�cido del inmun�geno pept�dico.
En el caso de enlazadores (“L”) en transportadores de proteína/p�ptido y otros p�ptidos (por ejemplo, transportadores de proteína/p�ptido y un inmun�geno pept�dico), los espaciadores se seleccionan típicamente de Ala, Gli u otros espaciadores de amino�cidos no polares o amino�cidos polares neutrales. En ciertas realizaciones el espaciador neutral es Ala. Se entender� que el espaciador opcionalmente presente no necesitar estar comprendido por los mismos residuos y por lo tanto puede ser un hetero-u homo-olig�mero. Espaciadores ejemplares incluyen homo-olig�meros de Ala. Cuando est� presente, el espaciador ser� tendr� normalmente al menos uno o dos residuos, más normalmente de tres a seis residuos. En otras realizaciones el transportador de proteína/polip�ptido se conjuga con un inmun�geno pept�dico, preferentemente con el transportador de proteína/polip�ptido colocado en la terminal amino. El p�ptido puede unirse mediante un enlazador neutral, tal como Ala-Ala-Ala o similar, y preferentemente contiene además un residuo lípido tal como ácido palm�tico o similar que est� unido a gurpos amino alfa o �psilon de un residuo Lis ((PAM)2Lis), que est� unido al terminal amino del conjugado de p�ptido, típicamente por medio de unión Ser-Ser o similares.
En algunos aspectos de la invención, el inmun�geno pept�dico es un fragmento Aβ seleccionado del grupo consistente en Aβ1-5-L, Aβ1-7-L, Aβ1-9-L y Aβ1-12-L. En algunos aspectos de la invención el enlazador es GAGA (SEQ ID NO: 10).
Para facilitar la conjugación de un inmun�geno pept�dico con un transportador, puede añadirse amino�cidos adicionales a los terminales de los determinantes antig�nicos. Los residuos adicionales pueden también usarse para modificar las propiedades físicas o químicas del inmun�geno pept�dico. Los amino�cidos tales como tirosina, ciste�na, lisina, ácido glut�mico o asp�rtico, o similares, pueden introducirse en la terminal C-o N-del inmun�geno pept�dico. Además, los enlazadores de p�ptido que contienen amino�cidos tales como glicina y alanina también pueden introducirse. Además, los determinantes antig�nicos pueden diferir de la secuencia natural modificándose por acilaci�n de grupo NH2 de terminal, por ejemplo, mediante acetilaci�n de alcanoil (C1-C20) o tiocligocol, amidaci�n de terminal carboxi, por ejemplo, amoniaco, metilamina, etc. En algunos caso estas modificaciones pueden proporcionar sitios para unirse a un soporte u otras moléculas.
En algunos aspectos de la invención, el inmun�geno pept�dico es un fragmento Aβ seleccionado del grupo consistente en Aβ1-5-C, Aβ1-7-C, Aβ1-9-C y Aβ1-12-C, donde C es un residuo de amino�cido de ciste�na. En algunos aspectos de la invención, el inmun�geno pept�dico es un fragmento Aβ seleccionado del grupo consistente en Aβ1-5-L-C, Aβ1-7-L-C, Aβ1-9-L-C y Aβ1-12-L-C.
El inmun�geno pept�dico est� unido al transportador de proteína/polip�ptido directamente o por medio de un enlazador en la terminal amino o carboxi del inmun�geno pept�dico. La terminal amino de inmun�geno pept�dico o el transportador de proteína/polip�ptido puede acilarse. Además, el conjugado de inmun�geno pept�dicotransportador de proteína/polip�ptido puede unirse a ciertos lípidos de alcaniol (C1-C20) por medio de uno o más residuos de unión tales como Gli, Gli-Gli, Ser, Ser-Ser como se ha descrito anteriormente. Otras fracciones de lípido útiles incluyen colesterol, ácidos grasos y similares.
Los inmun�genos pept�dicos pueden unirse a un transportador por medio de enlace cruzado químico. Las técnicas para unir un inmun�geno a un transportador incluyen la formación de uniones de disulfuro usando Nsuccinimidil-3-(2-piridil-tio) propionato (SPDP) (Carlsson, J et al. (1978) Biochem J, 173: 723) y succinimidil 4-(Nmaleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) (si el p�ptido carece de un grupo sulfhidrilo, esto puede proporcionarse mediante la adición de un residuos de ciste�na al hapteno). Estos reactivos cran una unión de disulfuro entre ellos y la ciste�na de p�ptido reside en una unión de una proteína y una amida a través de ε-amino en una lisina, u otro grupo amino libre en otras amino�cidos. Una variedad de tales agentes que forman disulfuro/amida se describen en Immuno. Rev. 62: 85 (1982). Otros agentes de acoplamiento bifuncionales forman una unión tio�ter más que una unión disulfuro. Los agentes que forman tio�ter incluyen ésteres reactivos de ácido 6maleimidocaproico, ácido 2-bromoac�tico y ácido 2-iodoac�tico, ácido 4-(N-maleimido-metil)ciclohexano-1carbox�lico. Los grupos carboxilo pueden activarse combin�ndolos con succinimida o ácido 1-hidroxil-2-nitro-4sulf�nico, sal de sodio.
Con más frecuencia, los residuos de lisina son los residuos de amino�cido más abundantes encontrados en las proteínas transportadoras, y estos residuos se modifican usando reactivos de enlace cruzado para generar sitios nucleof�licos que después se acoplan a un hapteno. Este acoplamiento se consigue por medio de cualquiera de las cadenas laterales hidrof�licas en las moléculas de hapteno que est�n químicamente activas. Estas incluyen el grupo guanidil de arginina, los grupos carboxilo de glutamato y ácido asp�rtico, el grupo sulfhidrilo de ciste�na, y el grupo εamina de lisina, por nombrar algunos. Las modificaciones de proteínas tales como que ahora se pueden acoplar a otras fracciones se consiguen usando reactivos de enlace cruzado, que reaccionan con cualquiera de las cadenas laterales en el transportador de proteína o molécula de haptenos.
En un aspecto de la presente invención, la proteínas transportadora con o sin una molécula enlazadora se funcionaliza (derivatiza) con un reactivo que introduce sitios reactivos en la molécula de proteína transportadora que est�n dispuestos a más modificaciones para introducir grupos nucleof�licos. En una realización, el transportador reacciona con un reactivo de haloacetilaci�n, que preferentemente reacciona con un número de grupos funcionales en residuos de amino�cido de proteínas tale como el grupo sulfhidrilo de ciste�na, el grupo primario ε-amina en residuos de lisina, la terminal α de α-aminas, el tio�ter de metionina y ambos nitr�genos de cadena lateral imidazoil de histidina (Gurd, 1967). En una realización preferente, los grupos primarios ε-amina en residuos de lisina de la proteína transportadora se derivatizan con b N-hidroxisuccinimidil bromoacetato para generar un transportador de bromoacetato. La conjugación de inmun�geno pept�dico y el transportador de proteína activada se realizó añadiendo lentamente la proteína activada a la solución que contenía el inmun�geno pept�dico.
Al usar el proceso de esta divulgación, los inmun�genos pept�dicos analizadas en la sección B, anteriormente, pueden conjugarse con cualquiera de los transportadores analizados en la sección A, anteriormente. Los conjugados que resultan del proceso de esta divulgación se usan como inmun�genos para la preparación de anticuerpos contra Aβ para su uso en inmunoterapia pasiva/activa. Además, Aβ o un fragmento de Aβ unido a un transportador puede administrarse a un animal de laboratorio en la producción de anticuerpos monoclonales de Aβ.
En un aspecto de la invención, el conjugado es un conjugado seleccionado del grupo consistente en Aβ1-7-CRM197, (Aβ1-7 x 3)-CRM197 y (Aβ1-7 x 5)-CRM197. En un aspecto de la invención, el conjugado es un conjugado seleccionado del grupo consistente en CRM197-Aβ1-5, CRM197-Aβ1-7, CRM197-Aβ1-9 y CRM197-Aβ1-12. En otro aspecto de la invención, el conjugado es un conjugado seleccionado del grupo consistente en Aβ1-5-C-CRM197, Aβ1-7-C-CRM197, Aβ1-9-C-CRM197 y Aβ1-12-C-CRM197, Aβ16-23-C-CRM197, Aβ17-24-C-CRM197, Aβ18-25-C-CRM197, CRM197-C-Aβ16-23, CRM197-C-Aβ17-24, CRM197-C-Aβ18-25, Aβ16-22-C-CRM197, Aβ17-23-C-CRM197, Aβ18-24-C-CRM197, CRM197-C-Aβ16-22, CRM197-C-Aβ17-23 y CRM197-C-Aβ18-24. Aβ1-9-C-CRM197 y Aβ1-12-C-CRM197. En otro aspecto más de la invención, el conjugado es un conjugado seleccionado del grupo consistente en la selección del grupo consistente en Aβ1-5-L-C-CRM197, Aβ1-7-L-C-CRM197, Aβ1-9-L-C-CRM197 y Aβ1-12-L-C-CRM197.
Restricci�n
Un inconveniente del uso de reactivos de acoplamiento, que introducen sitios reactivos a las cadenas laterales de moléculas reactivas de amino�cido en moléculas de transportador y/o hapteno, es que los sitios reactivos, si no se neutralizan, son libres de reaccionar con cualquier molécula no deseada in vitro o in vivo. En el proceso de la presente invención, la restricción de grupos funcionales no tratados se lleva a cabo mediante reacción de los conjugados con grupos reactivos colgantes con reactivos que inactivan/restringen los grupos reactivos. Reactivos ejemplares de inactivaci�n/restricción para su uso con el proceso de conjugación de la presente invención incluyen cisteamina, N-acetilciesteamina y etanolamina. Alternativamente, la restricción se lleva a cabo mediante reacción con amoniaco o bicarbonato de amoniaco, cualquier de ellos convierte a los grupos de haloacetilo en grupos de aminoacetilo. La restricción también se lleva a cabo en alcalino pH (9.0-9.8) usando hidróxido de sodio o carbonato de sodio, que convierte a los grupos de haloacetilo en grupos de hidroxiacetilo. Una ventaja potencial de convertir a los grupos de haloacetilo en grupos de aminoacetilo o hidroxiacetilo, en oposición a la reacción con derivados de cisteamina, etanolamina, etc., es la introducción e funcionalidades químicas de tamaño relativamente pequeño, mediante la reacción con amoniaco o hidróxido/carbonato. Los grupos funcionales restringidos resultantes, por ejemplo, aminoacetilo o hidroxiacetilo, proporcionan una perturbación relativamente inferior en la parte de proteína transportadora del conjugado. El inmun�geno pept�dico-proteína transportadora restringida se purifica como sea necesario usando métodos conocidos, tales como cromatograf�a (filtración de gel, intercambio de i�n, interacción hidrof�bica o afinidad), di�lisis, ultrafiltraci�n-diafiltraci�n, precipitación selectiva usando sulfato de amoniaco o alcohol, y similares.
Conjugados y composiciones inmunog�nicas
Los conjugados de inmun�geno pept�dico-proteína transportadora restringida se administran en una composición inmunog�nica a mamíferos, particularmente humanos, para fines profilácticos y/o terapéuticos. Los conjugados de la presente invención se usan para obtener y/o mejorar respuestas inmunes contra inmun�genos. Por ejemplo, conjugados CTL-transportador se usan para tratar y/o prevenir infección viral, enfermedades amiloidog�nicas, cáncer, etc. Alternativamente, los conjugados inmun�geno pept�dico-transportador, que inducen respuestas inmunes, también se usan.
En aplicaciones terapéuticas, un conjugado de la presente invención se administra a un individuo que ya sufre una enfermedad amiloidog�nica tal como enfermedad de Alzheimer. Aquellos en la fase de incubaci�n o la fase aguda de la enfermedad pueden tratarse con el conjugado de la presente invención por separado o en conjunto con otros tratamientos, como se apropiado.
En aplicaciones terapéuticas, una composición inmunog�nica de la presente invención se administra a un paciente en una cantidad suficiente para obtener una respuesta CTL efectiva o respuesta humoral a la placa amiloide, y para curar, o al menos para detener parcialmente la progresión, síntomas y/o complicaciones de la enfermedad. Una cantidad adecuada para llevar a cabo esto se define como “dosis terapéuticamente efectiva”. Las cantidades efectivas para este uso dependerán en parte de la composición de p�ptido, la manera de administración, la fase y severidad de la enfermedad que se est� tratando, el peso y estado de salud general del paciente y el juicio del m�dico que prescriba.
Las cantidades terapéuticamente efectivas de las composiciones inmunog�nicas de la presente invención normalmente estarán en el rango para la inmunizaci�n inicial para administración terapéutica o profiláctica, desde aproximadamente 0,1 μg a aproximadamente 10.000 μg de p�ptido para un paciente de 70 kg, normalmente de aproximadamente 0,1 μg a aproximadamente 8.000 μg, preferentemente entre 0,1 y aproximadamente 5.000 μg, y más preferentemente entre 0,1 y aproximadamente 1.000 μg. estas dosis est�n seguidas de dosis de refuerzo de aproximadamente 0,1 μg a aproximadamente 1.000 μg de p�ptido de acuerdo con un régimen de refuerzo durante semanas a meses dependiendo de la respuesta y condición del paciente al medir las respuestas inmunes específicas.
Adem�s, la presente invención se usa profil�cticamente para prevenir y/o mejorar enfermedad amiloidog�nica. Las cantidades efectivas se han descrito anteriormente. Además, un experto en la técnica también sabr� cómo ajustar o modificar tratamientos profilácticos, como sea apropiado, por ejemplo mediante dosis de refuerzo y ajustando dosis y regímenes de dosis.
La administración terapéutica puede empezar al primer signo de la enfermedad. Esta es seguida por dosis de refuerzo hasta que la progresión de la enfermedad se detiene o invierte o los síntomas se reducen sustancialmente y durante un periodo de tiempo después.
Las composiciones inmunog�nicas de la presente invención para tratamiento terapéutico o profiláctico pueden administrarse mediante medios parenterales, t�picos, intravenosos, orales, subcutáneos, intra-arteriales, intra-craneales, intra-peritoneales, intra-nasales o intra-musculares para tratamiento profiláctico y/o terapéutico. Un ruta típica de administración de un agente inmunog�nico es la subcutánea, aunque otras rutas pueden ser igualmente efectivas. Otra ruta común es la inyección intramuscular. Este tipo de inyección se realiza más típicamente en los músculos del brazo o la pierna. En algunos métodos, los agentes se inyectan directamente en un tejido particular donde se han acumulado depósitos, por ejemplo, inyección intracraneal. La inyección intramuscular
o infusión intravenosa es preferente para la administración del anticuerpo. En algunos métodos, se inyectan anticuerpos intravenosos particulares directamente en el cráneo. Debido a la facilidad de administración, las composiciones inmunog�nicas de la invención son particularmente adecuadas para administración oral. La invención proporciona además composiciones inmunog�nicas para administración parenteral, que comprenden una solución de los p�ptidos o conjugados, disueltos o suspendidos en un transportador aceptable, preferentemente un transportador acuoso.
Puede usarse una variedad de diluyentes, excipientes y tampones, por ejemplo, agua, agua amortiguada, tampón fosfato salino, 0,3% glicina, ácido hialur�nico y similares. Estas composiciones puede esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas, o pueden filtrarse estériles. Las soluciones acuosas resultantes pueden empaquetarse para su uso como est�n, o liofilizarse, la preparación liofilizada se combina con una solución estéril antes de su administración. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmac�uticamente aceptables como sea necesario para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes de amortiguación, agentes que ajustan la tonicidad, agentes humectantes y similares, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbit�n, oleato de trietanolamina, etc.
Para composiciones sólidas, pueden usarse transportadores sólidos no tóxicos convencionales. Estos pueden incluir, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, levadura, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio y similares. Para administración oral, se forma una composición no tóxica farmac�uticamente aceptable incorporando cualquiera de los excipientes normalmente empleados, tales como los transportadores previamente listados, y generalmente 10-95% de ingrediente activo, esto es, uno o más conjugados de la invención, y más preferentemente en una concentración de 25-75%.
La concentración de composiciones inmunog�nicas de la presente invención en las formulaciones farmacéuticas puede variar ampliamente, esto es, de menos de aproximadamente 0,1%, normalmente al menos aproximadamente 2% hasta tanto como 20% o 50%, o más por peso, y se seleccionar� principalmente por volúmenes de fluido, viscosidades, etc., de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado.
Los conjugados de la presente invención pueden también administrarse mediante liposomas, que sirven para dirigir los conjugados a un tejido particular, tal como tejido linfoide, o selectividad dirigida a células infectadas, as� como para aumentar la vida media de la composición de p�ptidos. Los liposomas incluyen emulsiones, espumas, micelas, monocapas insolubles, cristales líquidos, dispersiones fosfol�pidas, capas lamelares y similares. En estas preparaciones la composición que se administrar� se incorpora como parte de un liposoma, solo o en conjunto con una molécula, que se enlaza, por ejemplo, con un receptor prevalente entre células linfoides. Estas moléculas incluirán anticuerpos monoclonales, que se enlazan con el ant�geno CD45, o con otras composiciones terapéuticas o inmunog�nicas. De este modo, los liposomas llenos de una composición deseada de la presente invención pueden dirigirse al sitio de células linfoides, donde los liposomas después administran las composiciones de p�ptido terapéuticas/inmunog�nicas seleccionadas. Los liposomas para su uso en la invención est� formados por lípidos estándares que forman la vesícula, que generalmente incluyen fosfol�pidos con carga neutral y negativa y un esterol, tal como colesterol. La selección de lípidos est� generalmente guiada por la consideración del tamaño de liposoma, labilidad ácida y estabilidad de los liposomas en el torrente sanguíneo. Est�n disponibles una variedad de métodos para preparar liposomas, como se describe en, por ejemplo, Szoka, et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980),
U.S. Números de Patente 4.235.871, 4.501.728, 4.837.028 y 5.019.369.
Para administración con aerosol, las composiciones de la presente invención se suministran preferentemente en forma finamente dividida junto con un surfactante o propulsor. Los porcentajes t�picos de las composiciones son 0,01-20% por peso, preferentemente 1-10%. El surfactante, por supuesto, deber se no tóxico, y preferentemente soluble en el propulsor. Los representantes de tales agentes son los ésteres de ésteres parciales de ácidos grasos que contienen de 6 a 22 átomos de carbono, tales como ácidos caproicos, octanoicos, palm�ticos, esteáricos, linoleicos, linol�nicos, olest�ricos y oleicos con un alcohol polih�drico alif�tico o su anh�drido cíclico. Pueden emplearse ésteres mezclados, tales como glic�ricos mezclados o naturales. El surfactante puede constituir 0-1-20% por peso de la composición, preferentemente 0,25-5%. El equilibrio de la composición es generalmente propulsor. También puede incluirse un transportador, si se desea, como con lecitina para administración intranasal.
Los conjugados de la presente invención pueden administrarse opcionalmente en combinación con otros agentes que son al menos parcialmente efectivos en el tratamiento y/o mejora de una enfermedad amiloide y/o sus síntomas. En el caso de enfermedad de Alzheimer o síndrome de Down, en el que se dan depósitos amiloides en el cerebro, los conjugados de la invención pueden administrarse junco con otros agentes para aumentar el paso de los agentes de la invención a través de la barrera sangre-cerebro.
La composición inmunog�nica típicamente contiene un adyuvante. Un adyuvante es una sustancia que mejora la respuesta inmune cuando se administra junto con un inmun�geno o ant�geno. Un número de citoquinas o linfoquinas han demostrado tener actividad moduladora inmune, y de este modo pueden usarse como adyuvantes, incluyendo, pero sin limitar a, las interleuquinas 1-α, 1-β, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12 (véase, por ejemplo, patente de Estados Unidos N1 5.723.127), 13, 14, 15, 16, 17 y 18 (y sus formas mutantes), los interferones – α, β y γ, factor estimulador de colonia granulocito-macr�fago (véase, por ejemplo, patente de Estados Unidos N� 5.078.996), factor estimulador de colonia de macr�fagos, factor estimulador de colonia de granulocitos, GSF y el factor α y β de necrosis tumoral. Otros adyuvantes útiles en esta invención incluyen una quimioquina, incluyendo pero sin limitación, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β y RANTES. Las moléculas de adhesión, tales como una selectina, por ejemplo, L-selectina, P-selectina y E-selectina pueden también ser útiles como adyuvantes. Otros adyuvantes útiles incluyen, sin limitación, una molécula de tipo mucina, por ejemplo, CD34, GliCAM-1 y MadCAM-1, un miembro de la familia de integrinas tales como LFA-1, VLA-1, Mac-1 y p150.95, un miembro de la s�per familia de inmunoglobulinas tales como PECAM, ICAMs, por ejemplo, ICAM-1, ICAM-2 e ICAM-3, CD2 y LFA-3, moléculas co-estimuladoras tales como CD40 y CD40L, factores de crecimiento que incluyen factor de crecimiento vascular, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento de fibroblasto, factor de crecimiento epid�rmico, B7.2, PDGF, BL-1 y factor de crecimiento endotelial vascular, moléculas de receptor que incluyen Fas, receptor TNF, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2 y DR6. Otras molécula adyuvante incluye Caspase (ICE). Veas, también la publicación de patente internacional n� WO98/17799 y n� WO99/43839.
Los adyuvantes adecuados para mejorar una respuesta inmune incluyen, sin limitación, MPLTM (lípido 3-Omonofosforil deacilado A; Corixa, Hamilton, MT), que se describe en la patente de Estados Unidos n� 4.912.094. también adecuados para uso como adyuvantes son los análogos sintéticos de lípido A o compuestos de fosfato de aminoalquil glucosamina (AGP), o derivados o análogos de los mismos, que est�n disponibles en Corixa (Hamilton, MT), y que se describen en la patente de Estados Unidos n� 6.113.918. Un AGP es 2-[(R)-3-Tetradecanoiloxitetradecancilamino] etil 2-Deoxi-4-O-fosfono-3-O-[(S)-3-tetradecanoioxitetradecanoil]-2-[(R)-3tetradecanoiloxi-tetradecanoil-amino]-b-D-glicopiranosida, que es conocido como 529 (también conocido con RC529; Corixa). Este adyuvante 529 se formula como una forma acuosa (529 AF) o como una emulsión estable (529 SE).
Otros adyuvantes incluyen emulsiones de aceite mineral y agua, sales de calcio tales como fosfato de calcio, sales de aluminio (alumbre), tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, etc., Amphigen, Avridine, L212/escualeno, D-l�ctido-polil�ctido/glic�sido, ácidos plur�nicos, polioles, dip�ptido de muramil, Bordetella muerta, saponinas, tales como Stimulon™ QS-21 (Antigenics, Framingham, MA), descrito en patente de Estados Unidos n� 5.057.540, y las partículas generadas de los mismos tales como ISCOMS (Complejos inmunoestimuladores), Mycobacterium tuberculosis, lipopolisac�ridos bacterianos, polinucle�tidos sintéticos tales como oligonucle�tidos que contienen un motivo CpG (Patente de Estados Unidos n� 6.207.646), una toxina pertussis (PT) o una toxina termol�bil de E. coli (LT), particularmente LT-K63, LT-R72, PT-K9/G129; véase, por ejemplo, publicación de patente internacional n� WO 93/13302 y WO 92/19265.
Tambi�n útiles como adyuvantes son toxinas de cólera y mutantes de las mismas, incluyendo aquellas descritas en la solicitud de patente internacional publicada n� WO 00/18434 (donde el ácido glut�mico en la posición 29 de amino�cido se sustituye por otro amino�cido (diferente a ácido asp�rtico, preferentemente una histidina). Toxinas CT o mutantes similares se describen en la solicitud de patente internacional publicada número WO 02/098368 (donde isoleucina en la posición 16 de amino�cido se sustituye por otro amino�cido, bien solo o en combinación con la sustitución de la serina en la posición 68 de amino�cido por otro amino�cido; y/o donde la valina en la posición 72 de amino�cido se sustituye por otro amino�cido). Otras toxinas CT se describen en la solicitud de patente internacional publicada número WO 02/098369 (donde la arginina en la posición 25 de amino�cido se sustituye por otro amino�cido; y7O un amino�cido se inserta en la posición 49 de amino�cido; y/o dos amino�cidos se insertan en la posición 35 y 36 de amino�cido).
Se entender� que la referencia a lo largo de esta especificación a cualquier teoría para explicar los resultados descritos no es para limitar el alcance de la invención. Independientemente del método por medio del cual la invención funciona, los resultados y ventajas aquí descritos pueden conseguirse mediante referencia a los siguientes ejemplos de la invención.
EJEMPLO 1 Conjugación de CRM197 con P�ptido Aβ
La conjugación de haptenos/p�ptidos antig�nicos se realizó haciendo reaccionar transportador activado CRM197, que tiene treinta y nueve residuos de lisina, con un hapteno/p�ptido antig�nico que tiene un grupo tiol colgante usando el método descrito más abajo (Figura 1). Todos los p�ptidos Aβ obtenidos contenían un residuo de ciste�na en la terminal carboxi para facilitar la conjugación de estos p�ptidos a través del grupo cistenil sulfhidrilo con la proteína transportadoras. Estos p�ptidos se produjeron mediante síntesis en fase sólida.
I. Activación
Grupos amino libres de CRM197 se sometieron a bromoacetilaci�n mediante reacción con un exceso de éster N-hidroxisuccinimida de ácido bromoac�tico (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) (Bernatowicz y Matsueda, 1986). Se a�adi� 10% (v/v) 1.0 M NaHCO3 (pH 8,4) a una solución helada de CRM197 (~15 mg). él éster Nhidroxisuccinimida de ácido bromoac�tico, igual en peso que el CRM197 usado, se disolvió en 200 μl dimetilformadida (DMF), se a�adi� lentamente a CRM197, y se mezcl� cuidadosamente a temperatura ambiente en la oscuridad durante 1 horas. La proteína bromoacetilada (activada) resultante se purificó mediante paso a través de una columna de desalaci�n (P6-DG) usando PBS / 1 mM EDTA (pH 7,0) como el eluyente. Después de la purificación, las fracciones correspondientes a CRM197 activado se agruparon y el ensayo de proteína BCA estim� la concentración de proteína. Los grupos amino de proteína, tanto antes como después del tratamiento con éster N-hidroxisuccinimida de ácido bromoac�tico, reaccionaron con ácido 2,4,6-trinitrobencenosulf�nico (TNBSA), que sirvió como un indicador de bromoacetilaci�n (Means et al., 1972).
II. Conjugación
Antes de la conjugación, los p�ptidos reaccionaron con 5,5’-ditio-bis(2-ácido nitrobenzoico) [reactivo de Ellman] para verificar el contenido de grupos SH libres (entre 62-88% de reducción). Para los primeros cuatro p�ptidos Aβ (amino�cidos 1-7 sin enlazador, amino�cidos 1-12 con enlazador GAGA (SEQ ID NO: 10), amino�cidos 1-9 con enlazador GAGA (SEQ ID NO: 10) y amino�cidos 1-7 con enlazador GAGA (SEQ ID NO. 10), aproximadamente 8.0-10,0 mg de p�ptido se disolvió en agua destilada estéril hasta una concentración aproximada de 20 mg/ml. El p�ptido se a�adi� lentamente a CRM197 frío activado en una proporción 1:1 (p/p) y el pH se ajust� a aproximadamente 7,0-7,2 con la adición de 20-36 μl de 1 N NaOH. El material resultante se mezcl� cuidadosamente durante la noche a 4 �C en la oscuridad seguido de di�lisis en la oscuridad contra dos cambios 1L de PBS, pH 7. Para los siguientes cuatro p�ptidos Aβ (amino�cidos 1-5 sin enlazador, amino�cidos 1-9 sin enlazador, amino�cidos 1-12 sin enlazador y amino�cidos 1-5 con enlazador), se us� la reacción con reactivo de Ellman para verificar los grupos SH libres. CRM197 se sometió bromoacetilaci�n, purificó y reaccion� con TNBSA como se ha descrito previamente. El pH de cada p�ptido se ajust� a 7.0 con la adición de 0,1 M NaPO4 (pH 8,5) e 2,2x el volumen del p�ptido disuelto. El p�ptido se a�adi� lentamente a CRM197 frío activado en una proporción 1:1 y se dej� reaccionar durante la noche a 4 �C en la oscuridad. El material resultante se dializ�. Un p�ptido control final (1-12mer en orientación inversa) se conjugó con CRM197 como se ha descrito anteriormente con la siguiente modificación. En lugar de ajustar el pH del p�ptido a 7,0, el pH de CRM197 activado se ajust� aproximadamente a 7,5 con la adición de 20% (v/v) 0,5 M NaPO4 (pH 8,0). Cada conjugado, después de di�lisis, se transfirió a un tubo de propileno de 15 mL, se envolvió en papel de aluminio y se almacen� a 4 �C. La activación de los residuos reactivos de amino en el transportador se verificó posteriormente usando espectrometr�a de masas.
Conjugado P�ptido inmunog�nico
Conjugado P�ptido Inmunog�nico
L = Enlazador (GAGA) (SEQ ID NO: 10)
EJEMPLO 2 Preparación de Conjugado P�ptido Aβ-CRM197 y Purificación mediante Bromoacetilaci�n con Ultrafiltraci�n de CRM197
CRM197 (100 mg) en tampón fosfato salino, 0,9% NaCl, pH 7,0 reaccion� con éster N-hidroxisuccinimida de ácido bromoac�tico (disuelto en 20 mg/ml en DMSO) en una proporción de peso de 1:1 bajo una atmósfera de argón. La reacción se titul� como fue necesario para mantener el pH en 7,0. La mezcla se agit� en la oscuridad durante 1,5 horas a temperatura ambiente. La mezcla de la reacción se filtr� 1,2 μm en un depósito con fracción retenida de un sistema UF/DF (Millipore Labscale TFF, Billerica, MA). La purificación se hizo usando una membrana UF de 10K o 30K mediante diafiltraci�n (30 veces) contra 0,01 m tampón fosfato salino / 0,9% NaCl, pH 7,0. CRM197 bromoacetilado se filtr� pasando a través de un filtro de 0,2 μm. El grado de bromoacetilaci�n se determin� reaccionando CRM197 activado con ciste�na, seguido de análisis de amino�cido y cuantificación de carboximetilciste�na (CMC) resultante.
Conjugaci�n de P�ptido Aβ y CRM197 Bromoacetilado y Restricción con N-Acetilacisteamina
CRM197 bromoacetilado (50 mg) se transfirió a un recipiente de reacción. A la solución agitada, mantenida a 2-8�C, se a�adi� 1 M de carbonato de sodio/bicarbonato. La titulación se realizó para conseguir un pH diana de 9,0, bajo atmósfera de argón. Por separado, se pesaron 50 mg de p�ptido Aβ y se disolvieron en agua por inyección (WFI) a 20 mg/ml. A esta solución se a�adi� 1 M de carbonato de sodio/bicarbonato hasta que se alcanzó pH 9,0. La solución de p�ptido se a�adi� a la solución de CRM197 bromoacetilado, y la mezcla se agit� a 2-8 �C durante 14-18 horas. Los grupos restantes de bromoacetil se restringieron con un exceso molar de 20 veces de N-acetilcisteamina durante 3-6 horas a 2-8 �C.
La mezcla de la reacción se filtr� a través de un filtro de 1,2 μm en el depósito con fracción retenida del sistema UF/DF (Millipore XL) y el conjugado se purificó a temperatura ambiente mediante diafiltraci�n 30 veces en una membrana MWCO de 10K o 30K (Millipore) mediante diafiltraci�n contra 0,01 M tampón fosfato salino / 0,9% NaCl, pH 7,0. La fracción retenida se recogió y 0,2 μm se filtraron y analizaron para contenido de proteína (ensayo colorim�trico Lowry o Micro-BCA) mediante SDS-PAGE, mediante análisis de amino�cido, y para inmunogenicidad en ratones.
EJEMPLO 3 Conversión mediante Restricción de los Grupos de Bromoacetil No Reaccionados con Grupos de Aminocetil
CRM197 bromoacetilado (50 mg), preparado como se ha descrito en el Ejemplo 2, se transfirió a un recipiente de reacción. A la solución agitada, mantenida a 2-8�C, se a�adi� 1 M de carbonato de sodio/bicarbonato. La titulación se realizó para conseguir un pH diana de 9,0, bajo atmósfera de argón. Por separado, se pesaron 50 mg de p�ptido Aβ y se disolvieron en WFI a 20 mg/ml. A esta solución se a�adi� 1 M de carbonato de sodio/bicarbonato hasta que se alcanzó pH 9,0. La solución de p�ptido se a�adi� a la solución de CRM197 bromoacetilado, y la mezcla se agit� a 2-8 �C durante 14-18 horas. Los grupos restantes de bromoacetil se restringieron usando 8% de solución de bicarbonato de amoniaco durante 4 horas a 2-8 �C.
La mezcla de la reacción se filtr� con 1,2 μm en el depósito con fracción retenida del sistema UF/DF (Millipore XL) y el conjugado se purificó a temperatura ambiente mediante diafiltraci�n 30 veces en una membrana MWCO de 10K o 30K (Millipore) mediante diafiltraci�n contra 0,01 M tampón fosfato salino / 0,9% NaCl, pH 7,0. La fracción retenida se recogió y 0,2 μm se filtraron y analizaron para contenido de proteína (ensayo colorim�trico Lowry o Micro-BCA) mediante SDS-PAGE, mediante análisis de amino�cido, y para inmunogenicidad en ratones.
EJEMPLO 4 Determinación Cuantitativa de S-Carboximetilciste�na y S-Carboximetilcisteamina como Evaluación del Grado de Conjugación y Restricción de Conjugados Inmun�geno Pept�dico-Proteína/Polip�ptido
La hidrólisis ácida de conjugados proteína-polip�ptido generada usando química de activación de bromoacetil dio como resultado la formación de S-carboximetilciste�na (CMC) ácida estable de las ciste�nas en los sitios conjugados y la formación de S-carboximetilcisteamina (CMCA) ácida estable de la cisteamina en los sitios restringidos (Figura 2). Todas las lisinas conjugadas y restringidas se convirtieron en lisina y se detectaron como tales. Todos los demás amino�cidos se hidrolizaron a amino�cidos libres excepto para tript�fano y ciste�na, que se destruyeron mediante condiciones de hidrólisis. Asparagina y glutamina se convirtieron en ácido asp�rtico y ácido glut�mico respectivamente.
Las muestras de conjugado se diluyeron con agua desionizada hasta una concentración total de proteínas de menos de 1 mg/mL. Dos alícuotas de 10 microgramos de cada conjugado se secaron y volvieron a suspender en 100 μL de 6N HCl [Pierce], 5 μL de fenol fundido [Sigma-Aldrich], y 1 μL de 2-mercaptoetanol [Sigma-Aldrich]. Las muestras después se incubaron bajo vacío (100 mT) a 110 �C durante 22 horas. Los hidrosilados resultantes se secaron, volvieron a suspender en 250 μL de tampón dilución de muestra de citrato de sido Na-S de Beckman (pH 2,2) [Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA], y filtraron usando filtros con punta de jeringa de nylon de 0,2 μm de Whatman y jeringas de 1 mL.
Cada muestra se cargó después en un circuito cerrado de muestra de amino�cido 6300 Beckman y se colocó en el analizador. Los amino�cidos de cada muestra hidrolizada y el control se separaron usando cromatograf�a de intercambio de i�n seguida de reacción con solución Beckman Ninhydrin NinRX a 135 �C. Los amino�cidos derivatizados se detectaron después en el rango visible a 570 nm y 440 nm (véase Tabla 1). Un conjunto estándar de amino�cidos [Pierce Amino Acid Standard H] que contenía 500 picomoles de cada amino�cido se mantuvo junto con las muestras y controles para cada conjunto de análisis. Se a�adi� S-carboximetilciste�na [Sigma-Aldrich] al estándar.
Tabla 1
Tiempos de Retención para Amino�cidos Uasdno Programas de Gradiente 1 en el Analizador de Amino�cidso Beckman 6300
Tiempo de Retencion (min.) Amino�cido Longitud de Onda usada para Deteccion
8,3 Carboximetilciste�na CMC 570
9,6 ácido asp�rtico y Asparagina Asx 570
11,3 Treonina Tr 570
12,2 Serina Ser 570
15,8 ácido glut�mico y glutamina Glx 570 y 440
18,5 Prolina Pro 440
21,8 Glicina Gli 570
23,3 Alanina Ala 570
29,0 Valina Val 570
32,8 Metionina Met 570
35,5 Isoleucina Ile 570
36,8 Leucina Leu 570
40,5 Tirosina Tir 570
42,3 Fenilalanina Fe 570
45,4 Carboximetilcisteamina CMCA 570
48,8 Histidina His 570
53,6 Lisina Lis 570
70,8 Arginina Arg 570
Tiempos de Retención para Amino�cidos Usando Programa de Gradiente 1 en Analizador de Amino�cido 6300 Beckman
Las áreas de cada pico estándar se usaron como una equivalencia cuantitativa para evaluación proporcional de cada muestra. La prolina se determin� de 400 nm y se convirtió en una equivalencia en 570 nm usando ácido glut�mico, el amino�cido más cercano.
Cada uno estos valores de picomol se convirtió en una proporción molar de residuos de amino�cido usando una comparación de picomoles de lisina con el valor teórico de lisina presente en la proteína. Se eligió lisina para esta evaluación en base a su unión covalente con ciste�na y cisteamina y la esperada hidrólisis similar. Los números resultantes de moles de amino�cido se compararon después con la composición de amino�cido de la proteína y se presentaron junto con los valores para CMC y CMCA. El valor CMC se us� directamente para evaluación del grado de conjugación y el valor CMCA se us� directamente para evaluación del grado de restricción.
EJEMPLO 5 Caracterización y Optimización de Conjugados de P�ptido Aβ-CRM197 B
Para verificar la conjugación, todos los conjugados p�ptido-CRM197 se analizaron mediante análisis de amino�cido y espectrometr�a de masas de desorci�n/ionizaci�n láser asistida por matriz – tiempo de vuelo (MALDI-TOF). Para cada conjugado, los moles de p�ptido conjugado con cada CRM197 mol se determin� mediante análisis de amino�cido (número de residuos de S-carboximetilciste�na) y espectrometr�a de masas MALDI-TOF. Los valores determinados por cada método estuvieron generalmente de acuerdo.
I. Cromatograf�a de exclusión por tamaños
Las muestras del concentrado del lote se sacaron del almacenaje y se dejaron calentar a temperatura ambiente. La muestra de conjugado p�ptido Aβ se mezcl� cuidadosamente para asegurar una preparación homogénea. La muestra de conjugado p�ptido Aβ gir� en una microcentr�fuga Eppendorf para retirar cualquier partícula. El sobrenadante se retir� para cromatograf�a TosoHaas TSK-Gel G3000SW (TosoHaas, Stuttgart, Alemania). Una columna TosoHaas TSK-Gel G3000SW se conect� al sistema HPLC y el límite de presión se fij� en 1,4 MPa. La columna se equilibr� con al menos 30 mL de PBS (10 mM fosfato de sodio, 150 mM NaCl, pH 7,2 � 0,1) a una velocidad de flujo de 0,75 mL/min. La muestra de conjugado de p�ptido Aβ se cargó en la columna TosoHaas TSK-Gel G3000SW usando los siguientes parámetros:
Concentraci�n de muestra de conjugado de p�ptido Aβ: 1,5 � 1,0 mg/mL Velocidad de flujo: 0,75 mL/min Volumen de muestra: 0,1 mL Tiempo de ejecución: 30 minutos
La absorbancia se control� en 280nm y 210nm. Para almacenaje de largo plazo, la columna TosoHaas TSK-Gel G3000SW se equilibr� al menos con 50 mL de 20% etanol a una velocidad de flujo de 0,5 – 1,0 mL/min.
II. PAGE (Electroforesis en Gel de Poliacrilamida)
CRM197 activado (bromoacetilado) y los conjugados p�ptido Aβ-CRM197 se examinaron mediante geles SDS usando electroforesis NuPAGE Bis-Tris (Novex, Frankfurt, Alemania) con un pH neutro, sistema con mini-gel de poliacrilamida prefabricada y Tampón de Ejecución NuPAGE MES SDS. Una alícuota de 8ug de cada CRM activado
o conjugado se mezcl� con la el tampón reductor de muestra y se calentó a 100 �C durante 5 minutos. Los conjugados y los estándares de peso molecular (PM) (Invitrogen, Carlsbad, CA) se cargaron en un gel NuPage (Novex) 10% (p/v, acrilamida) en un sistema amortiguado Bis-Tris-HCl y funcion� en el Tampón de Ejecución PAGE MES SDS (Laemmli). Después de SDS-PAGE, el gel se ti�� con gel Pierce Código Azul (Pierce, Rockford, IL). El conjugado p�ptido Aβ-CRM197 se represent� mediante una banda grande de aproximadamente 66 kDa, por encima de la banda de CRM nativo y una banda más tenue de alrededor de 120 kDa, junto con bandas menores de mult�mero (datos no mostrados)
III. Análisis de Espectrometr�a de Masas MALDI-TOF de Conjugados P�ptido-CRM197:
La espectrometr�a de masas se us� para una aproximación inmediata del grado de conjugación. Alícuotas adecuadas de CRM197 activado y las muestra del conjugado se analizaron mediante espectrometr�a de masas MALDI-TOF usando 3,5-dimetoxi-4-hidroxi-ácido cin�mico (ácido sinap�nico) como la matriz. El peso molecular de CRM197 activado determinado mediante espectrometr�a de masas MALDI-TOF (Espectrómetro de Masas Finningan MAT Lasermat 2000, Ringoes, NY) result� estar centrado alrededor de 60,5 kDa y para conjugados vari� de 65 kDa a 74 kDa dependiendo del grado de conjugación (datos no mostrados). Se descubrió que hasta 22 de las lisinas (~50) en CRM197 se modificaron en una proporción 1:1.
IV. Experimentos de Optimización:
El grado de activación y conjugación son una función de la proporción reactivo:proteína, temperatura de la reacción y pH del tampón de reacción. Más abajo se dan algunos ejemplos para ilustrar las condiciones óptimas de conjugación realizadas para identificar las condiciones óptimas de pH con el fin de tener parámetros reproducibles del control del proceso para las reacciones de conjugación. Los resultados (Figura 3) mostraron que la reacción de conjugación para Aβ 5mer (DAEFRC) (SEQ ID NO: 1) as� como para Aβ 7mer (DAEFRHDC) (SEQ ID NO: 2) es dependiente de pH y produce un mayor grado de modificación/conjugación cuando el pH de la condición de la reacción aumenta. Usando sal TFA de p�ptidos 5mer y 7mer, el grado de conjugación se evalu� en pH 9,0 con cantidades variables de carga de p�ptido (Figura 4). A partir de estos resultados, es evidente que los conjugados de p�ptido con un número definido de copias de p�ptido por molécula CRM pueden generarse variando la proporción p�ptido/CRM activado durante el proceso de conjugación. Se hicieron experimentos similares usando sal de acetato de p�ptido Aβ 7mer.
Para la conjugación Aβ1-7/CRM, el proceso de restricción se evalu� comparando los moles de CMCA por CRM con los moles de CMC por CRM. Ya que el total de CMC y CMCA fue constante para cada proporción p�ptido:CRM testada, se supuso que el proceso de restricción se complet� (Figura 5). La modificación total en el conjugado estuvo entre 19 y 21, comparable con el número de lisinas bromoacetiladas (Figura 5). Estos experimentos se hicieron con TFA como el contra-i�n para el p�ptido. La conjugación Aβ1-7/CRM se repitió usando la sal de acetato del p�ptido en lugar de la sal TFA, y estos datos se muestran en la Figura 5 y 6. El proceso de restricción pareció completarse, con el total de CMC y CMCA para cada p8unto entre 20 y 22. Las condiciones para la reacción de conjugación Aβ/CRM se han optimizado en pH 9,0, con el grado de conjugación controlado por la proporción de p�ptido con CRM en la reacción. Al variar la proporción de 0,1 a 1,5, el grado de conjugación vari� (Figura 6).
El grado de activación y conjugación son una función de la proporción reactivo-proteína, temperatura de la reacción y pH del tampón de reacción. El grado de modificación (conjugación) para cada conjugado se calcul� restando el valor de masa de CRM197 activado del valor de masa de cada conjugado y dividiendo entre la masa del p�ptido usado para preparar el conjugado. El grado de modificación (conjugación) para todos los conjugados se describe en la Tabla 2.
El grado de conjugación también se compar� con los valores determinados por la cantidad estimada de residuos de S-carboximetilciste�na formados por mol de CRM197 (también mostrado en la Tabal 2)
Tabla 2
Grado de Modificación: Comparación de MALDI-TOF y Datos AAA
Muestra
Da (De Espectrometr�a de Masas) Grado de conjugación (De Espectrometr�a de Masas) Grado de conjugación (De Análisis CMC-Amino�cido)
CRM197
58.408 --- ---
BrAc-CRM
60.752 19 ----
Aβ1-7/CRM
74.463 14 15
Aβ1-7/CRM
72.375 12 14
Aβ1-5/CRM
75.425 20 21
Aβ1-5/CRM
71.690 15 18
EJEMPLO 6 Estudios de Inmunogenicidad de Conjugados Aβ P�ptido
Los p�ptidos que abarcan los residuos de terminal N 1-5, 1-7, 1-9 y 1-12 de Aβ (con y sin la secuencia enlazadora GAGAC) y un p�ptido correspondiente al terminal N de Aβ en la secuencia inversa de amino�cido doce a amino�cido uno (1-12mer en secuencia inversa), conjugado cada uno con CRM197, se usaron para inmunizar ratones junto con un p�ptido Aβ 1-12 mer no conjugado en una formulación con STIMULON™ QS-21. Cada grupo de ratones fue inmunizado subcut�neamente con una dosis de 30 μg o 5 μg de una las muestras formuladas con 20 μg del adyuvante STIMULON™ QS-21, al inicio del estudio (semanas 0) y posteriormente las semanas 3 y 6. El protocolo del estudio se ilustra en la Tabla 3.
Como se muestra en la Tabla 3, los p�ptidos que abarcan los residuos de terminal N 1-5, 1-7, 1-9 y 1-12 de Aβ (con y sin la secuencia enlazadora GAGAC) y un p�ptido correspondiente al terminal N de Aβ en la secuencia inversa de amino�cido doce a amino�cido uno (1-12mer en secuencia inversa), conjugado con CRM197, se usaron para inmunizar ratones junto con un p�ptido Aβ 1-12 mer no conjugado en una formulación con QS-21. Cada grupo de ratones fue vacunado subcut�neamente con una dosis de 30 μg o 5 μg de una las muestras formuladas con 20 μg del adyuvante QS-21, al inicio del estudio (semanas 0) y posteriormente las semanas 3 y 6. El protocolo del estudio se ilustra en la Tabla 3. Se usaron ratones Swiss Webster para el estudio completo con 5 ratones en cada grupo. Volumen de inyección = 100 μl; S = Sangrar; V = Vacunar; E = Exanguinar.
Los títulos anti-Aβ se midieron con ELISA contra Aβ y CRM197 como se describe más abajo. En resumen, placas de 96 pozos Costar (#3591) se cubrieron durante la noche a temperatura ambiente con 2 μg/mL Aβ1-42 en tampón estéril carbonato/bicarbonato, pH 9.6. Las placas se vaciaron y bloquearon durante dos horas a temperatura ambiente con 200 μl/pozo de 0,05% BSA en 1X PBS/0,05% Tween 20. Las placas bloqueadas se vaciaron y lavaron con un lavador de placas que contenía TBS, 0,1% tampón de lavado Brij-35 (sin azida). Todos los antisueros primarios se diluyeron en serie y después se transfirieron a los pozos apropiados de placa e incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas. Las placas después se vaciaron/lavaron como se ha descrito anteriormente. Anticuerpo secundario IgG de cabra anti-ratón conjugado con fosfatasa alcalina de Southern Biotech (ciudad, estado) se diluyó 1:1000 con 0,05% BSA en PBS que contenía 0,05% Tween 20/0,02% Azida y se añadieron 100 μL a cada pozo y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas después se vaciaron/lavaron como se ha descrito anteriormente y finalmente se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora con 100 μL/pozo de 1 mg/mL solución de sustrato p-nitrofenil fosfato preparado en dietanolamina/MgCl2, pH 9,8. El desarrollo de color se detuvo con la adición de 50 μL/pozo de 3N NaOH. Las palcas se leyeron en 405 nM con una referencia de 690 nM. Los títulos del punto final se calcularon en O.D de 0,1 AU.
Tabla 3
Protocolo de Estudio de Inmunizaci�n de Ratones
C�digo de Grupo
Descripción Dosis (μg) Sem 0 Sem 3 Sem 6 Sem 8 Sem 13 Sem 16
AE488
CRM/1-7 sin enlazador 30 S, V S, V S, V S S E
AE489
CRM/1-12 con enlazador 30 S, V S, V S, V S S E
AE490
CRM/1-9 con enlazador 30 S, V S, V S, V S S E
AE491
CRM/1-7 con enlazador 30 S, V S, V S, V S S E
AE492
CRM/1-5 sin enlazador 30 S, V S, V S, V S S E
AE493
CRM/1-9 sin enlazador 30 S, V S, V S, V S S E
AE494
CRM/1-12 sin enlazador 30 S, V S, V S, V S S E
AE495
CRM/1-5 con enlazador 30 S, V S, V S, V S S E
AE496
CRM/1-7 sin enlazador 5 S, V S, V S, V S S E
AE497
CRM/1-12 con enlazador 5 S, V S, V S, V S S E
AE498
CRM/1-9 con enlazador 5 S, V S, V S, V S S E
AE499
CRM/1-7 con enlazador 5 S, V S, V S, V S S E
C�digo de Grupo
Descripción Dosis (μg) Sem 0 Sem 3 Sem 6 Sem 8 Sem 13 Sem 16
AE500
CRM/1-5 sin enlazador 5 S, V S, V S, V S S E
AE501
CRM/1-9 sin enlazador 5 S, V S, V S, V S S E
AE502
CRM/1-12 sin enlazador 5 S, V S, V S, V S S E
AE503
CRM/1-5 con enlazador 5 S, V S, V S, V S S E
AE504
CRM197 C16151 30 S, V S, V S, V S S E
AE505
CRM197 C16151 5 S, V S, V S, V S S E
AE506
CRM/12-1mer 30 S, V S, V S, V S S E
AE507
CRM/12-1mer 5 S, V S, V S, V S S E
AE508
1-12mer p�ptido 30 S, V S, V S, V S S E
AE509
1-12mer p�ptido 5 S, V S, V S, V S S E
AE510
Ab 30 S, V S, V S, V S S E
AE511
Ab 5 S, V S, V S, V S S E
ELISA CRM197
Placas Greiner con 96 pozos (#650011) se cubrieron a 37 �C durante 90 minutos con 5,0 μg/mL (100 μg/pozo) de CRM197 en tampón estéril carbonato/bicarbonato, pH 9.6. Las placas se vaciaron y lavaron con un lavador de placas que contenía 1X TBS, 0,1% tampón de lavado Brij-35. Todos los antisueros primarios se diluyeron en serie y después se transfirieron a los pozos apropiados de placa e incubaron a 37 �C durante 1 hora. Las placas después se vaciaron/lavaron como se ha descrito anteriormente. Anticuerpo secundario IgG de cabra anti-ratón conjugado con fosfatasa alcalina de Southern Biotech se diluyó 1:1000 con 1X PBS que contenía 0,05% Tween 20/0,02% Azida y se añadieron 100 μL a cada pozo y se incubaron a 37 �C durante 1 hora. Las placas después se vaciaron/lavaron como se ha descrito anteriormente y finalmente se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora con 100 μL/pozo de 1 mg/mL solución de sustrato p-nitrofenil fosfato preparado en dietanolamina/MgCl2, pH 9,8. El desarrollo de color se detuvo con la adición de 50 μL/pozo de 3N NaOH. Las palcas se leyeron en 405 nM con una referencia de 690 nM. Los títulos del punto final se calcularon en O.D de 0,1 AU.
Las Tablas 4-6 ilustran los títulos del punto final ELISA contra Aβ. Después de la inmunizaci�n primaria, los ocho conjugados (excluyendo el control negativo) indujeron respuesta inmunes medibles anti-Aβ IgG. Sin embargo, la dosis de 30μg, pero o la dosis de 5μg, de Aβ dio una respuesta positiva la semana 3 después de la inmunizaci�n primaria. Entre todos los conjugados, parece que el p�ptido Aβ 1-7 conjugado sin enlazador obtuvo una repuesta tan buena o mejor que los conjugados estudiados. En la dosis de 5μg, Aβ 1-5C hizo mejor en las semanas 8-16. Aβ 17C fuer mejor en la dosis de 30μg. El análisis de títulos de anticuerpo después de la segunda y tercera inmunizaci�n con dosis de 5 o 30μg indico que la respuesta inmune máxima para Aβ para la mayoría de los conjugados se vio después de la segunda inmunizaci�n. Al menos en ratones, la tercera inmunizaci�n no pareció mejorar la respuesta inmune. El p�ptido Aβ sin embargo, necesit� tres inmunizaciones con la dosis de 30μg para alcanzar la máxima respuesta inmune contra el p�ptido (Tabla 5). En términos de descomposición de anticuerpos durante un periodo extenso de tiempo, el nivel de anticuerpo de los grupos inmunizados con conjugados se redujo en 2 o 3 veces en comparación con el nivel más alto dentro del grupo. Las muestras individuales de semanas 6 y 8 se analizaron para calcular GMTs contra Aβ para cada uno del grupo (Tabla 6) para ver si algún grupo conjugado era sustancialmente mejor que los otros. El análisis estadístico de los títulos de semana 6 de conjugados Aβ 1-5C, Aβ 1-7C y Aβ 1-9C indicaron que el conjugado Aβ 1-7 indujo un título significativamente mayor. A partir de este experimento, es también evidente que la secuencia enlazadora GAGAC no contribuyó a mejorar la respuesta inmune al p�ptido.
Tabla 4
Grupo
Semana 3 Semana 6 Semana 8 Semana 13 Semana 16
1-5C
<100 14.960 687.691 882.012 625.208 771.828
1-7C
<100 51.253 1.280.181 860.463 520.060 571.043
1-9C
<100 18.615 1.008.872 622.325 348.967 380.755
1-12C
<100 615 132.009 390.624 166.162 184.170
1-5LC
<100 4.999 458.075 454.631 237.573 220.091
1-7LC
<100 17.693 849.170 842.402 446.089 400.536
1-9LC
<100 18.544 1.465.115 1.180.347 571.127 579.477
1-12LC
<100 12.664 908.360 598.867 368.101 316.075
CRM197
<100 <100 <100 <100 <100 <100
1-42
<100 <100 <100 <100 <100 <100
1-12
<100 <100 <100 <100 <100 <100
12-C
<100 <100 <100 <100 <100 <100
Tabla 4. Semanas 0, 3, 6, 8, 13 y 16 títulos de referencia ELISA contra Aβ usando antisuero de dosis de 5 μg de conjugados de p�ptido que abarcan varias longitudes de la terminal N de Amiloide Aβ p�ptido; Ref: Elan policlonal hiperinmune #592= 3.073.307. Referencia en O. D 0,1 A.U. Ratones Swiss Webster se inmunizaron con SC-N con 5 μg de ant�genos anteriores formulados con 20 μg STIMULON™ QS-21 las semanas 0, 3 y 6.
Tabla 5
Grupo
Semana 3 Semana 6 Semana 8 Semana 13 Semana 16
1-5C
<100 18.150 590.355 332.832 204.645 176.159
1-7C
<100 100.672 1.840.741 647.470 592.638 779.072
1-9C
<100 18.520 1.184.696 713.494 363.459 327.065
1-12C
<100 7.837 1.325.725 1.126.389 681.268 577.604
1-5LC
<100 16.347 469.191 184.077 177.358 164.680
1-7LC
<100 47.866 971.229 462.200 463.466 529.726
1-9LC
<100 59.002 921.544 787.273 405.023 500.468
1-12LC
<100 27.348 697.150 483.320 284.800 397.816
CRM197
<100 <100 <100 <100 <100 <100
1-42
<100 <100 <100 <100 <100 <100
1-12
<100 <100 <100 <100 <100 <100
12-1C
<100 <100 <100 <100 <100 <100
Tabla 5. Semanas 0, 3, 6, 8, 13 y 16 títulos de referencia ELISA contra Aβ usando antisuero de dosis de 30 μg de conjugados de p�ptido que abarcan varias longitudes de la terminal N de Amiloide Aβ p�ptido; Ref: Elan policlonal hiperinmune #592= 3.073.307. Referencia en O. D 0,1 A.U. Ratones Swiss Webster se inmunizaron con SC-N con 30 μg de ant�genos anteriores formulados con 20 μg STIMULON™ QS-21 las semanas 0, 3 y 6.
Tabla 6
Grupo
Semana 6 Semana 8
1-5C
237.668� 161.671b
1-7C
1.866.702� 881.146b
1-9C
963.323� 595.414b
1-12C
940.260 955.470
Grupo
Semana 6 Semana 8
1-5LC
395.553 141.084
1-7LC
516.921 394.521
1-9LC
826.773 562.458
1-12LC
544.768 376.952
1-42
365 4.565
Tabla 6. Semanas 6 y 8 títulos de referencia ELISA GMTs contra Aβ usando antisuero de dosis de 30 μg de conjugados de p�ptido que abarcan varias longitudes de la terminal N de Amiloide-Aβ. Ref: Elan policlonal hiperinmune #592= 3.073.307. Referencia en O. D 0,1 A.U. Ratones Swiss Webster se inmunizaron con SC-N con 30 μg de ant�genos anteriores formulados con 20 μg STIMULON™ QS-21 las semanas 0, 3 y 6. a. Análisis estadístico de títulos de semana 6 de 1-5C, 1-7C y 1-9C usando Tukey-Kramer muestra una diferencia estadística entre 1-5C y 17C solamente, mientras, el análisis que usa Prueba T de Student muestra una diferencia estadística entre 1-5C contra 1-7C y 1-5C contra 1-9C. b. Análisis estad´sitico de títulos de semana 8 de 1-5C, 1-7C y 1-9C no muestr a una diferencia estadística entre los tres grupos. Sin embargo, parece que hay una tende3ncia que puede indicar una diferencia entre 15C y 1-7C.
Tinci�n de Tejido de Cerebro de Ratón PDAPP
El ensayo de tinción de tejido de cerebro PDAPP proporciona una indicación de la funcionalidad de los conjugados de p�ptido Aβ y/o antisuero Aβ 1-42. Las muestras de suero de grupos de ratones individuales se analizaron por separado para su habilidad para reconocer placas de tejido de cerebro de ratón PDAPP que contenían p�ptido amiloide. Los resultados se muestran en la Tabla 7A y 7B. con la excepción del antisuero conjugado Aβ 5mer, hubo una respuesta relacionada con la dosis en el reconocimiento de placas. Independientemente del enlazador, el antisuero inducido por el conjugado de 30μg tuvo mejores patrones de reactividad en comparación con el antisuero conjugado de 5μg. sin embargo, con el antisuero conjugado Aβ 5 mer, se concluyó que los conjugados hechos de Aβ 1-5 mer a Aβ 1-9 mer son suficientes para obtener placa que reconocen respuestas inmune en ratones y la presencia de enlazador no es esencial. A partir de este estudio pueden sacarse las siguientes conclusiones: (a) Todos los conjugados de p�ptido indujeron antisuero de título alto contra la proteína transportadora CRM197 hasta niveles iguales o ligeramente más altos en comparación con el control CRM197 se no conjugdo (no mostrado).(b) Los conjugados con el enlazador GAGAC no obtuvieron inmunogenicidad o funcionalidad en comparación con los conjugados sin el enlazador. (c) Los datos de inmunogenicidad y la tinción de tejido de cerebro PDAPP (una indicación inicial de anticuerpo funcional) muestran que los conjugados Aβ 1-5mer y Aβ 1-7mer parecieron ser los inmun�genos preferentes para posterior desarrollo.
Tabla 7A. Tinción de tejido de ratón PDAPP
Dosis de 5 μg
Sin enlazador
Con enlazador
Vacuna
Animal # Tinción PDAPP Vacuna Animal # Tinción PDAPP
CRM/ Aβ1-5
1 2 3 4 5 + (no difusa) ++/+++ ++/+++ ++ ++ CRM/ Aβ1-5 1 2 3 4 5 --� � �
CRM/ Aβ1-7
1 2 3 4 5 ++ ++ ++ ++ ++ CRM/ Aβ1-7 1 2 3 4 5 + ++ ++ + ++
Dosis de 5 μg
Sin enlazador
Con enlazador
Vacuna
Animal # Tinción PDAPP Vacuna Animal # Tinción PDAPP
CRM/ Aβ1-9
1 2 3 4 5 + +/++ � � � CRM/ Aβ1-9 1 2 3 4 5 ++ ++ + + +
CRM/ Aβ1-12
1 2 3 4 5 -? � -� CRM/ Aβ1-12 1 2 3 4 5 + + ++ -�
CRM/ Aβ12-1mer
1 2 3 4 5 --� -� CRM/ Aβ42 1 2 3 4 5 -----
Todo el antisuero se diluyó 1:1000 para el procedimiento de tinción
Dosis de 30 μg
Sin enlazador
Con enlazador
Vacuna
Animal # Tinción PDAPP Vacuna Animal # Tinción PDAPP
CRM/ Aβ1-5
1 2 3 4 5 -+/++ -� ++ CRM/ Aβ1-5 1 2 3 4 5 + --� -
CRM/ Aβ1-7
1 2 3 4 5 +/++ ++ ++ ++ ++/+++ CRM/ Aβ1-7 1 2 3 4 5 + �/+ +/++ �/+ +/++
CRM/ Aβ1-9
1 2 3 4 5 ++/+++ ++ ++ + + CRM/ Aβ1-9 1 2 3 4 5 +/++ ++ ++ � +/++
Dosis de 30 μg
Sin enlazador
Con enlazador
Vacuna
Animal # Tinción PDAPP Vacuna Animal # Tinción PDAPP
CRM/ Aβ1-12
1 2 3 4 5 -+/++ +/++ � � CRM/ Aβ1-12 1 2 3 4 5 +/++ + -+/++ +
CRM/ Aβ12-1 mer
1 2 3 4 5 ----- Aβ 42 1 2 3 4 5 -----
EJEMPLO 7 Estudios de Inmunogenicidad en Monos
Grupos de 6 monos recibieron 30 ug de conjugado 7mer (conjugado total) adyuvantado con STIMULON™ QS-21, alumbre o formulación RC529 SE los días 0, 29 y 58. Los grupos adicionales incluidos fueron 30 ug conjugado 5mer con alumbre (Al(OH)3) o RC529 SE, 75 y 300μg de Aβ con STIMULON™ QS-21 como controles positivos. Los controles positivos se inmunizaron cada dos semanas. El día 36 y 64 se determinaron los títulos de anticuerpo anti-Aβ (Figuras 7-9). El día 36, los conjugados 7mer/CRM con STIMULON™ QS-21, Alumbre y RC529 obtuvieron títulos GMT de 10110, 13330 y 17090 respectivamente (Figura 7). Sin embargo, Aβ 1-42 más STIMULON™ QS-21 obtuvo GMTs de 223 y 1735 en nivele de dosis de 75 y 300μg, respectivamente. El conjugado Aβ 5mer obtuvo un título de 2134 con alumbre y 15980 con RC529 SE. El día 64, esto es, después de 3 dosis de conjugados con STIMULON™ QS-21 o RC-529 SE se indujeron títulos sustancialmente más altos que después de la segunda dosis (GMTs 69910 para 7 mer/RC-529 SE; 21640 para Aβ 5mer/RC-529 SE y 30310 para Aβ 7mer/ STIMULON™ QS-21) (Figura 8). Los conjugados con alumbre obtuvieron títulos reducidos después de la tercera inmunizaci�n en comparación con después de la segunda inmunizaci�n. Parece que el conjugado Aβ 7mer obtuvo una respuesta mejor en comparación con el conjugado Aβ 5mer. En monos, la adyuvantaci�n del conjugado Aβ 7mer con RC-529 SE o STIMULON™ QS-21 obtuvo la respuesta más alta (Figura 9). La respuesta al conjugado Aβ 7mer con alumbre fue moderada y similar a la de 300 ug Aβ con STIMULON™ QS-21.
A partir del presente ejemplo pueden sacarse las siguientes conclusiones. En primer lugar, ambos conjugados son muy inmunog�nicos en especies de primates. En segundo lugar, la presencia de adyuvantes en la formulación de inmunizaci�n influye de manera significativa en la respuesta inmune. En tercer lugar, excepto el adyuvante de aluminio, RC-529 SE y STIMULON™ QS-21 mejoran la respuesta inmune después de cada dosis de inmunizaci�n al menos hasta tres dosis (Figuras 9). En general, el conjugado Aβ 7mer indujo una respuesta de anticuerpo más alta en presencia de 529, seguido de STIMULON™ QS-21 (véase Figura 9).
EJEMPLO 8 Preparación de Conjugados de P�ptido Antig�nico Múltiple (PAM) y su Estudio Inmunog�nico
Hay disponibles varios métodos para generar sitios antig�nicos múltiples en los transportadores. En los ejemplos previos, cada sitio antig�nico se conjuga por separado con el transportador mediante químicas de conjugación definida y restricción. En este ejemplo, se construyen múltiples sitios antig�nicos mediante síntesis en fase sólida de repeticiones t�ndem de Aβ 7mer. Alternativamente estas repeticiones t�ndem pueden acoplarse con ep�topes de célula T con o sin unión a través de un núcleo de lisina como se describe en otra parte. Estos p�ptidos antig�nicos múltiples se sintetizaron con un residuo cisteinil residual para conjugación con la proteína transportadora. Se sintetizaron p�ptidos que contenían una unidad de repetición (1-7), tres unidades de repetición (1-7)3 y cinco unidades de repetición (1-7)5 con un residuo cisteinil adicional en el extremo carboxil. Estos p�ptidos se unieron covalentemente a CRM bromoacetilado durante la noche a través de sus residuos de ciste�na de terminal
C. la reacción se realiza� a pH 9,0-9,2 con proporciones p�ptido:CRM añadidas como se resume en la Tabla 8. Los grupos de bromoacetilo, que no reaccionaron con p�ptido, se restringieron con N-acetilcisteamina. Estos lotes representan conjugados que contienen una única copia, tres copias t�ndem y cinco copias t�ndem del p�ptido Aβ1-7 conjugado con CRM, respectivamente. La tabla 8 resume brevemente las propiedades de las muestras.
Tabla 8 Muestra de Conjugado de P�ptido Antig�nico Múltiple (PAM)
Conjugado
P�ptido: CRM (p/p)
pH de reacción
Ab(1-7)1/CRM 0,37 8,99 Ab(1-7)3/CRM 1,02 8,95 Ab(1-7)5/CRM 1,67 9,17
La carga de p�ptido (el número medio de p�ptido Aβ 1-7 por transportador) y los números de restricción (Tabla 9) son los números de amino�cidos únicos (CMC o CMCA) por transportador como lo determina el análisis de amino�cido. Los valores CMC y CMCA se citaron para lisina.
Tabla 9 Grado de Conjugación y Restricción de Cada Conjugado
Conjugado
Carga de p�ptido Restricción (CMCA)
(CMC)
Aβ(1-7)1/CRM
12,5 11,7
Aβ(1-7)3/CRM
10,4 15,2
Aβ(1-7)5/CRM
9,8 15,9
Ratones Swiss-Webster (10 por grupo) se inmunizaron subcut�neamente con 1 o 0,1 μg de p�ptido conjugado Aβ/CRM. La mitad de los ratones se inmunizaron con la composición formulada con 100 μg del adyuvante Al(OH)3, y la mitad se inmunizaron sin adyuvante. La inmunizaci�n se program� las semanas 0 y 3. Los sangrados se programaron las semanas 0, 3 y 6. Las muestras de suero se analizaron para respuesta de anticuerpo contra p�ptido Aβ1-42. Los resultados se muestran en la Tabla 10.
Tabla 10 Títulos de Referencia Anti-Aβ para Conjugados de P�ptido Antig�nico Múltiple (PAM)
C�digo de Descripción de Muestra Adyuvante Agrupación GMT Sem 3 GMT Sem 6 Grupo Sem 0
AG332 1 μg Aβ (1-7)1/CRM Al(OH)3 <100 18.096 100.279 AG333 1 μg Aβ (1-7)3/CRM Al(OH)3 <100 44.911 420.235 AG334 1 μg Aβ (1-7)5/CRM Al(OH)3 <100 27.032 394.488 AG335 0,1 μg Aβ (1-7)1/CRM Al(OH)3 <100 19.350 66.834 AG336 0,1 μg Aβ (1-7)3/CRM Al(OH)3 <100 13.307 208.272 AG337 0,1 μg Aβ (1-7)5/CRM Al(OH)3 <100 1.196 22.665 AG338 1 μg Aβ (1-7)1/CRM Ninguno <100 5.273 370.980 AG339 1 μg Aβ (1-7)3/CRM Ninguno <100 9.299 541.093 AG340 1 μg Aβ (1-7)5/CRM Ninguno <100 3.100 185.272 AG341 0,1 μg Aβ (1-7)1/CRM Ninguno <100 340 25.839 AG342 0,1 μg Aβ (1-7)3/CRM Ninguno <100 128 5.553 AG343 0,1 μg Aβ (1-7)5/CRM Ninguno <100 668 2.098
Todos los conjugados indujeron título de anticuerpo anti-Aβ 1-42 después de inmunizaci�n primaria y los niveles aumentaron sustancialmente después de la dosis de refuerzo. En ausencia de adyuvante de aluminio, las diferencias en la repuesta a la dosis fueron evidentes tanto en el sangrado de la semana 3 como el de la semana 6. La dosis más alta obtuvo respuesta de anticuerpo con título más alto. El adyuvante de aluminio obtuvo una respuesta de anticuerpo sustancialmente más alta la semana 3 en ambos niveles de dosis (0,1 y 1 μg) en comparación con los grupos no adyuvantados. Después de inmunizaci�n secundaria, los conjugados que se dieron en una dosis de 1 μg obtuvieron un incremento de 5 y 10 veces en los niveles de anticuerpo. En este nivel de dosis los conjugados de p�ptido con 3 y 5 repeticiones indujeron una mayor respuesta de anticuerpo que un conjugado que contenía una única repetición. También se determinaron los títulos contra el transportador CRM, y estos se enumeran en la Tabla 11.
Tabla 11 Títulos de Referencia Anti-CRM para Conjugados de P�ptido Antig�nico Múltiple (PAM)
C�digo de Descripción de Muestra Adyuvante Agrupación GMT Sem 3 GMT Sem 6
Grupo Sem 0
AG332 1 μg Aβ (1-7)1/CRM Al(OH)3 <50 10.531 114.602
AG333 1 μg Aβ (1-7)3/CRM Al(OH)3 <50 4.274 83.065
AG334 1 μg Aβ (1-7)5/CRM Al(OH)3 <50 1.680 49.320
AG335 0,1 μg Aβ (1-7)1/CRM Al(OH)3 <50 1.114 13.231
AG336 0,1 μg Aβ (1-7)3/CRM Al(OH)3 <50 197 1.484
AG337 0,1 μg Aβ (1-7)5/CRM Al(OH)3 <50 65 222
AG338 1 μg Aβ (1-7)1/CRM Ninguno <50 35 309
AG339 1 μg Aβ (1-7)3/CRM Ninguno <50 29 1.085
AG340 1 μg Aβ (1-7)5/CRM Ninguno <50 29 542
AG341 0,1 μg Aβ (1-7)1/CRM Ninguno <50 25 55
AG342 0,1 μg Aβ (1-7)3/CRM Ninguno <50 25 34
AG343 0,1 μg Aβ (1-7)5/CRM Ninguno <50 29 ND
Los animales se inmunizaron las semanas 0 y 3 y sangraron las semanas 0, 3 y 6. Adyuvante: 100 μg
(Al)OH3 o ninguno: ND=No Determinado
Los datos en la Tabla 11 indican que los grupos no adyuvantados indujeron niveles muy bajos de respuesta de anticuerpo anti-CRM en niveles de dosis de 1 μg as� como de 0,1 μg incluso después de dos inmunizaciones. Sin embargo, conjugados con adyuvante de hidróxido de aluminio indujeron niveles sustanciales de respuesta de anticuerpo anti-CRM en dosis de 1 μg y una respuesta mucho más baja en dosis de 0,1 μg. En presencia del adyuvante, los títulos CRM fueron los más altos para el conjugado con una sola repetición, intermedios para el conjugado con triple repetición y los más bajos para el conjugación con qu�ntuples repeticiones. Esto se espera, ya que la dosis de CRM por p�ptido es la más baja para Aβ(1-7)5/CRM, y la más alta para Aβ(1-7)1/CRM. Las diferencias fueron solamente estadísticamente significativas la semana 6 para la dosis de 0,1 μg.
El objetivo de la presente invención es obtener respuesta inmunog�nica con alto título contra el hapteno antig�nico y no necesariamente contra la proteína transportadora. Bajo ciertas circunstancias es deseable obtener una repuesta inmune óptima contra el determinante antig�nico de hapteno con menos o ninguna respuesta inmune contra la proteína transportadora. Para tales aplicaciones, servirán los conjugados con repeticiones t�ndem de determinantes antig�nicos múltiples con formulación no adyuvantada.
EJEMPLO 9 Preparación de Conjugados Aβ-P�ptido con Varias Proteínas Transportadoras y su Inmunogenicidad
Este ejemplo compara la inmunogenicidad de conjugados usando seis proteínas transportadoras diferentes. La sal de acetato de Aβ1-7 se a�adi� a transportadores bromoacetilados en una proporción 1:1 por peso a pH 9. Todos los conjugados excepto Aβ1-7/rC5ap se restringieron con N-acetilcisteamina. Todos los transportadores alternativos son proteínas bacterianas recombinantes, incluyendo CRM (toxoide de difteria), peptidasa recombinante C5a (rC5ap; clonada de Streptococcus agalactiae, incluye mutaciones D130A y S512A), ORFs 1224, 1664, 2452 (todas clonadas de Streptococcus pyogenes) y T367, T858 (cada una clonada de Chlamydia pneumoniae). En la Tabla 12 se encuentra un resumen de los transportadores usados. El grado de conjugación y restricción de cada conjugado Aβ 1-7 con estos transportadores se presenta en la Tabla 13.
Este estudio mostr� que el conjugado de peptidasa recombinante C5a indujo títulos más altos contra Aβ que la mayoría de los transportadores testados, incluyendo CRM. Esta diferencia fue estadísticamente significativa para los títulos de la semana 6 de grupos que recibieron hidróxido de aluminio. Además, el conjugado Aβ1-7/T858 fuer significativamente más inmunog�nico que la mayoría del resto de conjugados en ausencia de adyuvante. El único conjugado que actu� mal en relación con el conjugado control de CRM fuer Aβ1-7/T367, un conjugado que tampoco reaccion� con un anticuerpo monoclonal específico Aβ mediante análisis de transferencia Western. Este estudio confirma que otros numerosos transportadores pueden usarse de manera exitosa para inmunizar contra el p�ptido Aβ.

Tabla 12 Lista de Transportadores y Propiedades de Conjugado
Prote�na Transportadora
PM de transportador (Da) # de lisinas
CRM
58.408 39
rC5ap
108.560 85
ORF1224
30.950 18
ORF1664
31.270 38
ORF2452
31.790 29
T367
49.700 29
T858
37.190 23
Tabla 13 Grado de Conjugación y Restricción de Cada Conjugado
Conjugado
Carga de P�ptido (CMC)
Restricci�n (CMCA)
Aβ1-7/rC5ap 25,9
Aβ1-7/ORF1224 12,8 5,7
Aβ1-7/ORF1664 13,4 10,8
Aβ1-7/ORF2452 12,03 10,5
Aβ1-7/T367 13,2 8,2
Aβ1-7/T858 5,2 1,7
Resultados de conjugación: Carga de p�ptido (el número medio de p�ptido Aβ 1-7 por transportador) y los números de restricción son los números de amino�cidos únicos (CMC o CMCA) por transportador como lo determina el análisis de amino�cido. Los valores CMC y CMCA se citaron para lisina.
Resultados de inmunizaci�n
El título medio geométrico para cada grupo en este estudio est� enumerado en la Tabla 14. La semana 3, a pesar de la presencia de adyuvante, Aβ1-7/rC5ap indujo títulos anti-Aβ significativamente más altos que los conjugados correspondientes preparados para Streptococcus pyogenes ORFs 1224, 1664, 2542 o Chlamydia pneumoniae ORFs T367 y T858. La semana 3, en ausencia de adyuvante, Aβ1-7/rC5ap fuer también más inmunog�nico que el resto de conjugados excepto Aβ1-7/T868. El conjugado T858 sin Al(OH)3 indujo títulos más altos que los conjugados ORF1224, ORF1664, ORF2452 y CRM sin adyuvante. El único adyuvante que fuer significativamente menos inmunog�nico que Aβ1-7/CRM fue Aβ1-7/T367 (p<0,00002). El transportador de T367 actúo mal con o sin adyuvante la semana 3 y la 6. La semana 6, el conjugado rC5ap con hidróxido de aluminio fuer más inmunog�nico (p<0,04) que el resto de conjugados excepto Aβ 1-7/ORF2452. En ausencia de adyuvante, Aβ17/rC5ap y Aβ1-7/T858 indujeron títulos significativamente más altos que los conjugados de ORF1224, ORF1664 o T367. Aβ1-7/CRM sin hidróxido de aluminio indujo títulos más altos que Aβ1-7/ORF1664 o Aβ1-7-T367.

Tabla 14 Títulos de Referencia Anti-Aβ1-42
C�DIGO
DESCRIPCIÓN DE ADYUVANTE AGRUPACIÓN GMT SEM 3 GMT SEM 6
DE GRUPO
MUESTRA SEM 0
AG344
5 μg Aβ1-7/CRM Al(OH)3 <100 21.404 54.157
AG345
5 μg Aβ1-7/ rC5ap Al(OH)3 <100 61.967 402.972
AG346
5 μg Aβ1-7/ORF1224 Al(OH)3 <100 10.711 30.084
AG347
5 μg Aβ1-7/ORF1664 Al(OH)3 <100 7.188 43.226
AG348
5 μg Aβ1-7/ORF2452 Al(OH)3 <100 11.437 109.091
AG349
5 μg Aβ1-7/T367 Al(OH)3 <100 321 5.139
AG350
5 μg Aβ1-7/T858 Al(OH)3 <100 16.656 33.328
C�DIGO DESCRIPCIÓN DE ADYUVANTE AGRUPACIÓN GMT SEM GMT SEM 6 DE GRUPO MUESTRA SEM 0 3
AG351 5 μg Aβ1-7/CRM Ninguno <100 2.615 119.488
AG352 5 μg Aβ1-7/ rC5ap Ninguno <100 11.858 279.113
AG353 5 μg Aβ1-7/ORF1224 Ninguno <100 1.674 18.719
AG354 5 μg Aβ1-7/ORF1664 Ninguno <100 119 9.832
AG355 5 μg Aβ1-7/ORF2452 Ninguno <100 2.493 76.038
AG356 5 μg Aβ1-7/T367 Ninguno <100 50 620
AG357 5 μg Aβ1-7/T858 Ninguno <100 28.820 275.202
Los animales se inmunizaron la semana 0 y 3 y sangraron las semana 0, 3 y 6. La dosis se basa en la cantidad total de conjugado. Adyuvante: 100 μg Al(OH)3 o ninguno.
EJEMPLO 10 Preparación de Conjugados Adicionales P�ptido Aβ-Proteína
I. Activación
CRM197 descongelado (8 mL, 59,84 mg, a 7,48 mg/mL) se disolvió en 0,1 M tampón de borato (pH 9, 3,968 mL) para conseguir una concentración hasta 5 mg/mL. La solución se enfri� en un baño helado a 0.5 �C. Nhidroxisuccinimida de ácido bromoac�tico (59,9 mg) (Aldrich-Sigma) se disolvió en DMF (100 μL) (Aldrich-Sigma) y se a�adi� en forma de gotas a la solución de CRM197. Después de la adición de N-hidroxisuccinimida de ácido bromoac�tico, se observ� un precipitado. Cuando se comprob� el pH, descendió a pH 6. El pH de la mezcla de reacción se recuper� a pH 9 añadiendo más 0.1 M tampón de borato. La mezcla de la reacción después se agit� a 4 �C durante 1 h, con remolinos. La mezcla se purificó y concentr� usando concentración centrífuga Centriprep YM-10 y se volvió a purificar en Sephadex G-25 usando 10 mM borato como el eluyente. Las fracciones positivas para Reactivo de Bradford se agruparon y concentración usando Centriprep YM-10. El grado de bromoacetilaci�n se determin� mediante ensayo de Bradford (lineal). La concentración result� ser 5,36 mg/mL (Producida 30 mg). La concentración final se ajust� después para ser 5 mg/mL y se almacen� en el congelador en 5% sacarosa hasta posterior uso.
II. Conjugación
Para cada conjugación, se us� CRM197 bromoacetilado descongelado. Los p�ptidos se disolvieron en tampón de borato (2,5 mg en 125 ml de 0,1 M tampón de borato). Se observ� ligera insolubilidad con p�ptidos Aβ KLVFFAEDC (SEQ ID NO: 45), CLVFFAEDV (SEQ ID NO: 47), CKLVFFAED (SEQ ID NO: 48) y LVFFAEDC (SEQ ID NO: 50). CRM197 bromoacetilado (5 mg/mL) se trat� con las suspensiones/soluciones de p�ptido. La proporción del p�ptido y la proteína en la mezcla fue 1:2. Se observ� turbiedad en las mezclas conjugadas con p�ptidos KLVFFAEDC (SEQ ID NO: 45), CLVFFAEDV (SEQ ID NO: 47), CKLVFFAED (SEQ ID NO: 48) y KLVFFAEDC (SEQ ID NO: 45) (creo que es una errata, est� repetida). Las mezclas después se comprobaron para pH (pH 9) e incubaron a 4 �C durante la noche con remolinos lentos. Las concentraciones finales de las mezclas se hicieron a 3 mg/mL antes de la incubaci�n. La turbiedad de las mezclas de conjugado con p�ptidos CLVFFAEDV (SEQ ID NO: 47) y LVFFAEDC (SEQ ID NO: 50) desaparecieron después de la incubaci�n. Sin embargo, KLVFFAEDC (SEQ ID NO: 45) y CKLVFFAED (SEQ ID NO: 48) se mantuvieron ligeramente turbios. También se prepar� un conjugado de proteína soluble simulada con cisteamina en una proporción de 1:1 (p/p). Se obtuvieron p�ptidos sintetizados de BIOSOURCE con aproximadamente 95% de pureza:
Oct�meros: LVFFAEDVC (SEQ ID NO: 44) KLVFFAEDC (SEQ ID NO: 45) VFFAEDVGC (SEQ ID NO: 43) CLVFFAEDV (SEQ ID NO: 47) CKLVFFAED (SEQ ID NO: 48) CVFFAEDVG (SEQ ID NO: 46) Hept�meros: VFFAEDVC (SEQ ID NO: 49) LVFFAEDC (SEQ ID NO: 50)
III. Grupos de Lisina No reaccionada Restringida en Proteína:
Las lisinas no reaccionadas se restringieron con N-acetilcisteamina (CMCA; Aldrich-Sigma) en una proporción de 1/1 (p/p) durante 4 horas a 4 �C mientras se giraba en la oscuridad. Los p�ptidos no reaccionados y los reactivos de restricción se sacaron de los conjugados mediante di�lisis usando casete Lide-A-Lyzer (MW corte 10.000) (Pierce) contra tampón PBS (2 L) durante la noche (13 horas). El intercambio de tampón y di�lisis se realizó dos veces (2 x 14 horas). Se observ� una ligera insolubilidad en los conjugados con p�ptidos KLVFFAEDC (SEQ ID NO: 45) y CKLVFFAED (SEQ ID NO: 48). Todos los conjugados se almacenaron después en el refrigerador a 4 �C en un conservante.
IV. Caracterización del Transportador de Proteína:
Se us� MALDI-TOF MS para determinar la masa de CRM197 y la masa del conjugado N-acetilcisteamina-CRM197 simulado. En base a las masas de CRM197 y CRM197 bromoacetilado, se modificaron 11 residuos de lisina.
(59941,46-58590,29)/122 = 11 Donde; Mw de CRM197 es 58590,29
Mw de CRM197 bromoacetilado es 59941,46
Mw de bromoacetato es 122
El grado de bromoacetilaci�n fue superior a 28%. (El número total de lisinas en CRM197 fue 39). de estos 11 residuos de lisina modificados, 10 se acoplaron con cisteamina. La eficiencia de acoplamiento fuer 90%.
(61143-59941)/119 = 10
Donde; Mw de CRM197 bromoacetilado es 59941,46
Mw de conjugado simulado es 61143
Mw de la N-acetilcisteamina es 119
(10/11) x 100) = 90
V. Caracterización de los Conjugados P�ptido-Proteína mediante análisis de transferencia Western con Gel Tris-Tricina Prefabricado
Los conjugados proteína-p�ptido se analizaron mediante análisis de transferencia Western. Las calles son: marcador (calle 1); L-28375 24/01 (calle 2); L-28375 24/02 (calle 3); L-28375 24/03 (calle 4); L-28375 24/04 (calle 5); L-28375 24/05 (calle 6); L-28375 24/06 (calle 7) L-28375 24/07 (calle 8); L-28375 24/08 (calle 9); L-28375 24/09 (Simulación) (calle 10); y BrAcCRM197 (calle 11). Se us� un anticuerpo monoclonal específico de p�ptido de ratones (248-6H9-806 Aβ 17-28) como el anticuerpo primario (antisuero) (diluciones 1:3000 resultaron ser las mejores). (H+L)-HPR IgG de cabra anti-ratón fue el anticuerpo secundario (dilución 1:1000). Se observ� que todos los conjugados fueron reconocidos por el anticuerpo primario, excepto el conjugado de simulación y el CRM197 activado (véase Figura 10).
Concentraci�n de Proteína
Las concentraciones de proteína de la muestra de conjugado se determinaron mediante ensayo Pierce BCA (véase Tabla 15).
An�lisis de Amino�cido
Se realizó análisis de amino�cido para determinar el grado de conjugación. El grado T de conjugación se calcul� en base a los residuos de CMCA (carboximetilcisteamina) encontrados en los conjugados. Se us� CMCA para restringir los sitios activados no reaccionados después de la conjugación con los p�ptidos. (Véase Tabla 15).
Tabla 15
Grado de Conjugación de P�ptidos con BrAccCRM197
C�digo de Conjugado
Secuencia de P�ptido (SEQ ID NO:) Concentración Final (mg/mL) Grado de Conjugación (En Base a CMCA)
L-28375 24/01
LVFFAEDV-C (SEQ ID NO:44) 1,67 8/10
L-28375 24/02
KLVFFAED-C (SEQ ID NO:45) 0,82 5/10
L-28375 24/03
VFFAEDVG-C (SEQ ID NO:43) 1,43 8/10
L-28375 24/04
C-LVFFAEDV (SEQ ID NO:47 1,04 9/10
L-28375 24/05
C-KLVFFAED (SEQ ID NO:48) 0,78 1/10
C�digo de Conjugado
Secuencia de P�ptido (SEQ ID NO:) Concentración Final (mg/mL) Grado de Conjugación (En Base a CMCA)
L-28375 24/06
C-VFFAEDVG (SEQ ID NO:46) 0,97 9/10
L-28375 24/07
VFFAEDV-C (SEQ ID NO:49) 1,00 7/10
L-28375 24/08
LVFFAED-C (SEQ ID NO:50) 0,99 8/10
L-28375 24/09 (Simulado)
1,89 10/11
Todos los ensayos colorim�tricos se realizaron usando espectrómetro de microplaca y SOFTmax Pro.
EJEMPLO 11 Estudios Inmunog�nicos de Conjugados de P�ptido Aβ en Ratones Swiss Webster
Ratones Swiss Webster exog�micos se inmunizaron con VFFAEDVG-C (SEQ ID NO: 43), LVFFAEDV-C (SEQ ID NO: 44), KLVFFAED-C (SEQ ID NO: 45), C-VFFAEDVG (SEQ ID NO: 46), C-LVFFAEDV (SEQ ID NO: 47), C-KLVFFAED (SEQ ID NO: 48), VFFAEDV-C (SEQ ID NO: 49), LVFFAED-C (SEQ ID NO: 50) cada uno conjugado con CRM197, o con Aβ1-7-CRM197, todos formulados con el adyuvante RC 529 SE. Se inmunizaron nueve grupos de 10 animales por grupo subcut�neamente con uno de los conjugados de p�ptido Aβ al inicio del estudio (semana 0) y posteriormente la semana 4. El suero se recogió antes, pero los mismos días que la inmunizaci�n.
Estudios Inmunog�nicos de Conjugados de P�ptido Aβ en Ratones Balb/c Exog�nicos
Ratones Balb/c exog�nicos se inmunizaron como en el párrafo anterior, pero también se les administr� una dosis de refuerzo con conjugado y adyuvante la semana 12.
Resultados
Se recoge suero de ambos estudios para análisis de título IgG específico de p�ptido Aβ13-28. El suero de ratones Balb/c también se recoge para análisis un día antes del refuerzo de la semana 12, y una semana después. Las células del bazo de animales usados en el Ejemplo 11 se evalúan para su potenial para responder a estimulaci�n in vitro con un grupo superpuesto de p�ptidos que abarca Aβ1-42, Aβ1-42 de longitud completa, CRM197 o activadores policlonales. El análisis comprende una lectura Elispot para interleuquinas 4 y 5, e interfer�n-gamma. Después de su finalización, los conjugados de p�ptido Aβ se evaluarán como se ha descrito anteriormente y como se describe en el Ejemplo 6.
EJEMPLO 12 Estudios Inmunog�nicos de Conjugados de P�ptido Aβ en Ratones PSAPP
Ratones PSAPP se inmunizaron con VFFAEDVG-C (SEQ ID NO: 43), LVFFAEDV-C (SEQ ID NO: 44), KLVFFAED-C (SEQ ID NO: 45), C-VFFAEDVG (SEQ ID NO: 46), C-LVFFAEDV (SEQ ID NO: 47), C-KLVFFAED (SEQ ID NO: 48), VFFAEDV-C (SEQ ID NO: 49), LVFFAED-C (SEQ ID NO: 50). El ratón PSAPP, un ratón doblemente transg�nico (PSAPP) que sobreexpresan los transgenes mutantes APP y PS1, se describen en Holcomb, et al., (1998) Nature Medicine 4:97-11.
Estudios Inmunog�nicos de Conjugados de P�ptido Aβ en Ratones PDAPP
Ratones PDAPP se inmunizaron con VFFAEDVG-C (SEQ ID NO: 43), LVFFAEDV-C (SEQ ID NO: 44), KLVFFAED-C (SEQ ID NO: 45), C-VFFAEDVG (SEQ ID NO: 46), C-LVFFAEDV (SEQ ID NO: 47), C-KLVFFAED (SEQ ID NO: 48), VFFAEDV-C (SEQ ID NO: 49), LVFFAED-C (SEQ ID NO: 50). El ratón PDAPP sobreexpresa una forma mutante de APP humano (AppV71F) y desarrolla enfermedad de Alzheimer a edad temprana (Bard, et al. (2000) Nature Medicine 6:916-919; Maslia E, et al. (1996) J Neurosci. 15; 16 (18):5795-811).
Resultados
Se recogió suero de ambos estudios para análisis de título IgG específico de p�ptido Aβ13-28. Después de su finalización, los conjugados de p�ptido Aβ se evaluar� como se ha descrito anteriormente y como se describe en los Ejemplos 6 y 11, as� como en el ensayo de acondicionamiento de miedo contextual (CFC).
El acondicionamiento de miedo contextual es una forma común que es excepcionalmente fiable y se adquiere rápidamente en la mayoría de animales, por ejemplo, mamíferos. Los animales del test aprenden a temer un estímulo y/o medio neutras previamente debido a su asociación con una experiencia aversiva. (véase, por ejemplo, Fanselow, Anim. Learn. Behav. 18:264-270 (1990); Wehner et al., Nature Genet. 17:331-334. (1997); Caldarone et al., Nature Genet. 17:335-337 (1997)).
El acondicionamiento de miedo contextual es especialmente útil para determinar la función o disfunción cognitiva, por ejemplo, como resultado de enfermedad o trastorno, tal como una enfermedad o trastorno degenerativo, una enfermedad o trastorno relacionado con Aβ, una enfermedad o trastorno amiloide, la presencia de una alteración genética desfavorable que efectúa una función cognitiva (por ejemplo, mutación genética, alteración genética o genotipo no deseado), y/o la eficacia de un agente, por ejemplo, un agente de conjugado Aβ, o habilidad cognitiva. Por consiguiente, el ensayo CFC proporciona un método para testar independientemente y/o validar el efecto terapéutico de agentes para prevenir o tratar una enfermedad o trastorno cognitivo, y en particular, una enfermedad o trastorno que afecta a una o más regiones del cerebro, por ejemplo, el hipocampo, sub�culo, corteza cingulada, corteza prefrontal, corteza perirrinal, corteza sensorial y lóbulo temporal medial.
T�picamente, el ensayo CFC se realiza usando cámaras de animales estándares y la utilización de entrenamiento de acondicionamiento que comprende un choque leve (por ejemplo, un choque de pie de 0,35mA) emparejado con una indicación auditiva (por ejemplo, un periodo de 85 db de ruido blanco), olfativa (por ejemplo, extracto de almendra o limón), táctil (por ejemplo, textura de jaula en el suelo) y/o visual (destello de luz). La respuesta a la experiencia aversiva (choque) es típicamente una de congelación (ausencia de movimiento excepto para la respiración) pero también puede incluir parpadeo de ojos o cambio en el reflejo de la membrana nictitante, dependiendo del animal seleccionado para el test. La respuesta aversiva se caracterizar normalmente el primer día de entrenamiento para determinar el punto de referencia para miedo incondicionado, con resultados de la respuesta aversiva los posteriores días del test, por ejemplo, congelación en presencia del contexto y/o indicación pero en ausencia de la experiencia aversiva, caracterizándose como el miedo condicionado por el contexto o indicación, respectivamente. Para una mejor fiabilidad, los animales del test típicamente se analizan por separado por técnicos independientes y se anotan conforme avanza el tiempo. Los detalles adicionales del diseño experimental pueden encontrarse en la técnica, por ejemplo, en Crawley, JN, What’s Wrong with my Mouse; Behavioural Phenotyping of Transgenic and Knockout Mice, Wiley-Liss, NY (2000).
Los animales ejemplares del test (por ejemplo, animales modelo) incluyen mamíferos (por ejemplo, roedores o primates no humanos) que muestran síntomas prominentes o patología que es característica de un trastorno amiloidog�nico tal como enfermedad de Alzheimer. Los animales modelo pueden crearse mediante endogamia selectiva como se desee o pueden crearse genéticamente usando técnicas transg�nicas que son bien conocidas en la técnica, tales como alteración genética dirigida (por ejemplo, una mutación genética, alteración genética), en un gen asociado con el trastorno de demencia, llevando a una expresión o función aberrante del gen dirigido. Por ejemplo, hay disponibles varias razas de ratón transg�nico que sobreexpresan APP y desarrollan patología de placa amiloide y/o desarrollan d�ficits cognitivos que son característicos de enfermedad de Alzheimer (véase, por ejemplo, Games et al., supra, Johnson-Wood et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:1550 (1997); Masliah E y Rockenstein E. (2000) J Neural Transm Suppl.; 59:175-83).
Alternativamente, el animal modelo pueden crearse usando compuesto químicos (por ejemplo, neurotoxinas, anestésicos) o técnicas quirúrgicas (por ejemplo, ablaci�n estereot�ctica, axotomizaci�n, transecci�n, aspiración) que extirpan o interfieren de otra manera con la función normal de una región anatómica cerebral (por ejemplo, hipocampo, amígdala, corteza pirirrinal, núcleo septal medio, locus cerúleo, cuerpos mamilares) o neuronas específicas (por ejemplo, neuronas seroton�rgicas, colin�rgicas o dopamin�rgicas) que se asocian con síntomas o patología característicos del trastorno amiloidog�nico. En ciertas realizaciones preferentes, el modelo animal muestra un d�ficit cognitivo prominente asociado con el aprendizaje o memoria además de la patología neurodegenerativa que se asocia con un trastorno amiloidog�nico. Más preferentemente, el d�ficit cognitivo empeora progresivamente según avanza la edad, de tal manera que la progresión de la enfermedad en el animal modelo se iguala a la progresión de la enfermedad en un sujeto que sufre el trastorno amiloidog�nico.
El acondicionamiento de miedo contextual y otros ensayos in vivo para analizar la funcionalidad de los conjugados aquí descritos pueden realizarse usando ratones de tipo salvaje o ratones que tienen cierta alteración genética lo que lleva a una memoria dañada o modelos de ratón de enfermedad neurodegenerativa, por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, incluyendo modelos de animales que muestran niveles elevados de Aβ soluble en el fluido cerebroespinal (FCE) o plasma. Por ejemplo, los modelos de animal para enfermedad de Alzheimer incluyen ratones transg�nicos que sobreexpresan la mutación “Suiza” de proteína precursora amiloide humana (hAPPswe; Tg2576) que muestran d�ficits y placas de memoria dependiente de edad (Hsiao et al. (1996) Science 274:99-102). La funcionalidad in vivo de los conjugados aquí descritos también puede analizarse usando ratón mutante PS-1, descrito en Duff, et al. (1996) Nature 383, 710-713. Otros modelos transg�nicos alterados de enfermedad de Alzheimer se describen en Maslia E y Rockenstein E. (2000) J Neural Transm Suppl. 59:175-83.
En varios aspectos, los métodos de la divulgación comprenden la administración de un conjugado Aβ que es capaz de mejorar la cognición en un sujeto donde el conjugado Aβ se ha identificado usando un ensayo que es adecuadamente predictivo de eficacia inmunoterape�tica en el sujeto. En realizaciones ejemplares, el ensayo es un ensayo con animal modelo que se basa, al menos en parte, en comparar cognición, como se determina a partir de un estudio de acondicionamiento de miedo contextual, de un animal después de la administración e un reactivo inmunol�gico del test al animal, en comparación con un control adecuado. El ensayo CFC evalúa cambios en la cognición de un animal (típicamente un ratón o rata) después del tratamiento con un compuesto terapéutico convencional. En ciertas realizaciones, el cambio en la cognición evaluada es una mejora en el estado de deficiencia de memoria o una inversión de d�ficit de memoria. Por consiguiente, el ensayo CFC proporciona un método directo para determinar el efecto terapéutico de agentes para prevenir o tratar enfermedad cognitiva, y en particular, una enfermedad o trastorno que afecta a una o más regiones del cerebro, por ejemplo, el hipocampo, sub�culo, corteza cingulada, corteza prefrontal, corteza perirrinal, corteza sensorial y lóbulo temporal medial. Tales ensayos CFC se analizan en la solicitud de patente de Estados Unidos co-pendiente con número de serie 60/XXX.XXX titulada “Acondicionamiento de Miedo Contextual para Predecir Eficacia Inmunoterap�utica” (Número de Expediente: ELN058-1), presentada el 15 de diciembre, y la solicitud de patente de Estados Unidos con número de serie 60/XXX.XXX titulada “Acondicionamiento de Miedo Contextual para Predecir Eficacia Inmunoterap�utica” (Número de Expediente: ELN-058-2).
BIBLIOGRAF�A
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LISTADO SECUENCIAL
<110> Arumugham, Rasappa Prasad, A. Krishna
<120> Conjugados de Transportador Pept�dico Inmunog�nico A-Beta y Métodos de Producir los Mismo
<130> 15270C-000110EP
<140> Aún no conocido
<141> 2004-12-17
<150> EP 04817081.5
<151> 2004-12-17
<150> WO 2005/58941
<151> 2004-12-17
<150> US 60/530.481
<151> 2003-12-17
<160> 54
<170> Patentln versión 3.3
<221> variación
<222> (3)..(3)
<223> /sustituir=fenilalanina/sustituir=ciclohexilalanina
<220>
<221> variación
<222> (3)..(3)
<223> /sustituir=fenilalanina/sustituir=ciclohexilalanina
<220>
<221> variación
<222> (3)..(3)
<223> /sustituir=fenilalanina/sustituir=ciclohexilalanina
<213> Homo sapiens
<220>
<221> variación
<222> (3)..(3)
<223> /sustituir=fenilalanina/sustituir=ciclohexilalanina
<220>
<221> variación
<222> (3)..(3)
<223> /sustituir=fenilalanina/sustituir=ciclohexilalanina
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)…(8)
<223> CRM 197 añadido por medio de ciste�na terminal
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)…(1)
<223> CRM 197 añadido por medio de ciste�na terminal N
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)…(1)
<223> CRM 197 añadido por medio de ciste�na terminal N

Claims (14)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un conjugado inmun�geno pept�dico/transportador de proteína/polip�ptido que tiene la fórmula:
    donde C es un transportador de proteína CRM197/polip�tpido, Xd es un grupo funcional derivatizado de un residuo de amino�cido del transportador de proteína/polip�ptido, P es una molécula de inmun�geno pept�dico de un fragmento de Aβ covalentemente unida al grupo funcional derivatizado del residuo de amino�cido del transportador de proteína/polip�ptido, donde el fragmento de Aβ se selecciona del grupo consistente en residuos: 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-9, 1-10, 1-11, 1-12, 1-16, 1-28, 3-6, 3-7, 1328, 15-24, 16-22, 16-23, 17-23, 17-24, 18-24, 18-25, 17-28, 25-35, 33-42, 35-40 y 35-42 de Aβ (SEQ ID NO: 21), R es una molécula de restricción covalentemente unida a su grupo funcional derivatizado de un residuo de amino�cido del transportador de proteína/polip�ptido, conservando as� la funcionalidad del transportador de tal manera que retiene su habilidad para obtener las respuestas inmunes deseadas contra el inmun�geno pept�dico que de otra manera se darían sin un transportador, n es un número entero superior a 0, pero inferior o igual a 85, y p es un número entero superior a 0, pero inferior a 85.
  2. 2.
    El conjugado de la reivindicación 1, donde el inmun�geno pept�dico comprende además un residuo de ciste�na terminal y el inmun�geno pept�dico est� covalentemente unido al grupo funcional derivatizado del residuo de amino�cido del transportador de proteína/polip�ptido por medio del residuo de ciste�na terminal.
  3. 3.
    El conjugado de la reivindicación 2, donde el residuo de ciste�na terminal est� situado en la terminal carboxi o la terminal amino del inmun�geno pept�dico.
  4. 4.
    El conjugado de la reivindicación 3, donde el residuo de ciste�na terminal est� situado en el terminal carboxi del inmun�geno pept�dico.
  5. 5.
    El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde el fragmento de Aβ comprende residuos 1-7 de Aβ (SEQ ID NO. 21).
  6. 6.
    El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la molécula de restricción est� formada por la reacción del conjugado con un reactivo de restricción seleccionado del grupo consistente en cisteamina, Cacetilcisteamina, etanolamina, amoniaco, bicarbonato de amonio, hidróxido de sodio y carbonato de sodio.
  7. 7.
    El conjugado de la reivindicación 5, donde el fragmento de Aβ es residuos 1-7 de Aβ (SEQ ID NO. 21).
  8. 8.
    El conjugado de la reivindicación 7, donde el inmun�geno pept�dico es DAEFRHD-C (SEQ ID NO: 2).
  9. 9.
    El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde la molécula de restricción est� formada por la reacción del conjugado con N-acetilcisteamina.
  10. 10.
    El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, donde Xd es un grupo funcional derivatizado de un residuo de lisina.
  11. 11.
    El conjugado de la reivindicación 1 que tiene la fórmula:
  12. 12.
    El conjugado de la reivindicación 11, donde n es 12, 14 � 15.
  13. 13.
    Una composición inmunog�nica, que comprende un conjugado de un inmun�geno pept�dico con un transportador de proteína/polip�ptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, junto con uno o más excipientes, diluyentes y/o adyuvantes farmac�uticamente aceptables.
  14. 14.
    La composición inmunog�nica de la reivindicación 13, donde uno o más adyuvantes se seleccionan del grupo consistente en GM-CSF, 529 SE, IL-12, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, Mycobacterium tuberculis, Bordetella pertussi, lipopolisac�ridos bacterianos, compuestos de fosfato de aminoalquil glucosamina, MPL™ (3-Ol�pido A de monofosforil deacilado), un polip�ptido, Quil A, STIMULON™ QS-21, una toxina de pertussis (TP), y toxina termol�bil de E. coli (LT), IL-1 α, IL-1 β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, interfer�n-α, interfer�n-β, interfer�n-γ, G-CSF, TNF-α y TNF-β.
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