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JP2023549815A - メタニューモウイルスのためのタンパク質ベースのナノ粒子ワクチン - Google Patents

メタニューモウイルスのためのタンパク質ベースのナノ粒子ワクチン Download PDF

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JP2023549815A
JP2023549815A JP2023528432A JP2023528432A JP2023549815A JP 2023549815 A JP2023549815 A JP 2023549815A JP 2023528432 A JP2023528432 A JP 2023528432A JP 2023528432 A JP2023528432 A JP 2023528432A JP 2023549815 A JP2023549815 A JP 2023549815A
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アンドリュー ローレンス フェルドハウス，
ダグラス アンドリュー ホルツマン，
クランシー ブキャナン ウルフ，
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アイコサバックス， インコーポレイテッド
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Abstract

ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）に対するウイルス様粒子ワクチンであって、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質の外部ドメインが、対称性のタンパク質ベースのウイルス様粒子に連結され、それによってその上に提示される、ウイルス様粒子ワクチンが提供される。例えば、ワクチン抗原は、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質の外部ドメインの、１成分又は２成分ウイルス様粒子、例えば２成分正二十面体ウイルス様粒子のための多量体化ドメインを有するタンパク質へのＮ末端融合物であり得る。さらに、ワクチン組成物、製造方法、及び使用方法、例えば、ｈＭＰＶに対する防御免疫応答を生成するために対象を免疫化する方法が提供される。【選択図】図１Ａ

Description

［関連出願の相互参照］
本出願は、２０２０年１１月１３日に出願された米国仮特許出願第６３／１１３，６８６号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
［配列表の参照による組み込み］
本出願は、ＥＦＳ－ＷＥＢを介してＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２１年１１月５日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーの名称はＩＣＶＸ－０１１＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔであり、サイズは４４２，９９５バイトである。
ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）は、全ての年齢の人々において上下呼吸器疾患を引き起こす。症状には、咳、発熱、鼻詰まり、及び息切れが含まれ得る。場合によっては、ｈＭＰＶ感染は、気管支炎又は肺炎などの重度の疾患に進行し得る。
ｈＭＰＶは、パラミクソウイルスファミリーの一本鎖ＲＮＡウイルスであり、これには、麻疹、流行性耳下腺炎、及び呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）などの他の気道感染症も含まれる。ｈＭＰＶは、ウイルスゲノム中のＧ及びＦ遺伝子を遺伝子型決定することによって同定される２つのサブタイプ、Ａ及びＢのものであり得る。Ｆ遺伝子は、ｈＭＰＶ融合糖タンパク質（ｈＭＰＶ Ｆタンパク質）をコードし、ワクチン開発の標的として使用され得る。しかしながら、今日まで、臨床的必要性にもかかわらず、ヒトにおけるｈＭＰＶのための承認されたワクチンはなかった。
したがって、ｈＭＰＶに対するワクチンが必要とされている。
ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインがタンパク質ベースのＶＬＰに連結され、それによって提示される、ヒトメタニューモウイルスのためのタンパク質ベースのウイルス様粒子（ＶＬＰ）ワクチンが提供される。
一態様では、本開示は、第１の成分及び任意に第２の成分を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって、第１の成分が、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）Ｆタンパク質外部ドメイン又はその抗原変異体と、第１の多量体化ドメインとを含む融合タンパク質であり；第２の成分が、存在する場合、第２の多量体化ドメインを含むタンパク質である、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供する。
いくつかの実施形態では、第１の多量体化ドメインは、三量体化ドメインである。いくつかの実施形態では、多量体化ドメインは、配列番号１、４、５、７、９、１８、１９、２１、２４、２５、２６、２９、３０、３１、３４、３６、３７、３９、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、１４４、若しくは１４５、又はそれらの機能的変異体から選択される。いくつかの実施形態では、多量体化ドメインは、Ｉ５３－５０Ａ（配列番号７又は配列番号１４４）又はその機能的変異体若しくは変異体である。いくつかの実施形態では、第１の多量体化ドメインは、配列番号７、配列番号５３、配列番号１４４又は配列番号１４５と、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を共有する。いくつかの実施形態では、第１の多量体化ドメインは、配列番号１４４に対して、アミノ酸置換Ｃ７４Ａ及びＣ９８Ａ；アミノ酸置換Ｃ１６３Ａ及びＣ２０１Ａ；又はアミノ酸置換Ｃ７４Ａ、Ｃ９８Ａ、Ｃ１６３Ａ、及びＣ２０１Ａを含む。いくつかの実施形態では、第１の多量体化ドメインは、配列番号７又は配列番号１４４と同一のポリペプチド配列を有する。いくつかの実施形態では、第１の多量体化ドメインは、配列番号５３又は配列番号１４５と同一のポリペプチド配列を有する。いくつかの実施形態では、第１の多量体化ドメインは、ＶＬＰ形成ドメインである。いくつかの実施形態では、第１の多量体化ドメインは、任意に第２の多量体化ドメインを有する正二十面体粒子又は四面体粒子の集合を駆動するように適合されている。
いくつかの実施形態では、第２の多量体化ドメインは、配列番号２、３、６、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２０、２２、２３、２７、２８、３２、３３、３５、３８、４０、及び４１又はその機能的変異体及び断片から選択される。いくつかの実施形態では、第２の多量体化ドメインは、Ｉ５３－５０Ｂ（配列番号８）、Ｉ５３－５０Ｂ．４ＰｏｓＴ１（配列番号３４）又はその機能的変異体である。
いくつかの実施形態では、第１の成分及び第２の成分は、リンカー配列によって連結される。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、フォルドンを含み、フォルドン配列が、ＥＫＡＡＫＡＥＥＡＡＲＫ（配列番号１２５）である。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、ＧＳＧＧＳＧＳＧＳＧＧＳ（配列番号１２６）を含む。
いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、Ａ１８５Ｐ、Ｑ１００Ｒ、Ｓ１０１Ｒ、Ｔ１２７Ｃ、Ｎ１５３Ｃ、Ｖ８４Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ａ２４９Ｃ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、Ｒ１０２Ｇ、Ａ６３Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｋ４５０Ｃ、Ｓ４７０Ｃ、Ｇ１０６欠失、Ａ１１３Ｃ、Ａ１２０Ｃ、Ａ３３９Ｃ、Ｑ４２６Ｃ、Ｔ１６０Ｆ、Ｑ１００Ｋ、Ｓ１０１Ａ、Ｉ１７７Ｌ、Ｋ４５０Ａ、Ｓ４７０Ａ、Ｇ２９４Ｅ、Ｔ３６５Ｃ、Ｖ４６３Ｃ、Ｌ２１９Ｋ、Ｈ３６８Ｎ、及び／又はＶ２３１Ｉから選択される１つ又は複数の置換又は欠失を含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、Ｖ８４Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、Ｒ１０２Ｇ、Ａ６３Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｋ４５０Ｃ、Ｓ４７０Ｃ、Ｒ９９Ｇ、Ａ１１３Ｃ、Ａ１２０Ｃ、Ａ３３９Ｃ、Ｑ４２６Ｃ、Ｔ１６０Ｆ、Ｑ１００Ｋ、Ｓ１０１Ａ、Ｑ１００Ｒ、Ｓ１０１Ｒ、Ｇ１０６欠失、Ｓ１０１Ｒ、Ａ１８５Ｐ、Ｉ１７７Ｌ、及び／又はＧ２９４Ｅから選択される１つ又は複数の置換又は欠失を含む。
いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、Ｖ８４Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、Ｒ１０２Ｇ、Ａ６３Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｋ４５０Ｃ、Ｓ４７０Ｃ、Ｒ９９Ｇ、Ａ１１３Ｃ、Ａ１２０Ｃ、Ａ３３９Ｃ、Ｑ４２６Ｃ、Ｔ１６０Ｆ、Ｑ１００Ｋ、Ｓ１０１Ａ、Ｑ１００Ｒ、Ｓ１０１Ｒ、Ｇ１０６欠失、Ｓ１０１Ｒ、Ａ１８５Ｐ、Ｉ１７７Ｌ、及び／又はＧ２９４Ｅから選択される２つ以上の置換又は欠失を含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、Ａ１８５Ｐ、Ｑ１００Ｒ、Ｓ１０１Ｒ、Ｔ１２７Ｃ、Ｎ１５３Ｃ、Ｔ３６５Ｃ、Ｖ４６３Ｃ、Ｌ２１９Ｋ、Ｖ２３１Ｉ、Ｇ２９４Ｅ、Ｎ１５３Ｃ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、Ｈ３６８Ｎ、及び／又はＲ１０２Ｇから選択される１つ又は複数の置換を含む。
いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、Ａ１８５Ｐ、Ｑ１００Ｒ、Ｓ１０１Ｒ、Ｔ１２７Ｃ、Ｎ１５３Ｃ、Ｔ３６５Ｃ、Ｖ４６３Ｃ、Ｌ２１９Ｋ、Ｖ２３１Ｉ、Ｇ２９４Ｅ、Ｎ１５３Ｃ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、Ｈ３６８Ｎ、及び／又はＲ１０２Ｇのうちの２つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、以下を含む：置換Ｑ１００Ｒ及びＳ１０１Ｒ；置換Ａ１８５Ｐ、Ｑ１００Ｒ、及びＳ１０１Ｒ；置換Ａ１８５Ｐ、Ｔ１２７Ｃ、Ｎ１５３Ｃ、Ｑ１００Ｒ、及びＳ１０１Ｒ；置換Ｖ８４Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ａ２４９Ｃ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、及びＲ１０２Ｇ；置換Ａ６３Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｋ４５０Ｃ、Ｓ４７０Ｃ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、及びＲ１０２Ｇ；置換及び欠失Ａ６３Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｇ１０６欠失、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、及びＲ１０２Ｇ；置換Ａ１１３Ｃ、Ａ１２０Ｃ、Ａ３３９Ｃ、Ｑ４２６Ｃ、Ｔ１６０Ｆ、Ｉ１７７Ｌ、Ｑ１００Ｋ、及びＳ１０１Ａ；置換Ｖ８４Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ａ２４９Ｃ、Ｑ１００Ｒ、及びＳ１０１Ｒ；置換Ａ６３Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｋ４５０Ｃ、Ｓ４７０Ｃ、Ｑ１００Ｒ、及びＳ１０１Ｒ；置換及び欠失Ａ６３Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｇ１０６欠失、Ｑ１００Ｒ、及びＳ１０１Ｒ；置換Ａ１１３Ｃ、Ａ１２０Ｃ、Ａ３３９Ｃ、Ｑ４２６Ｃ、Ｔ１６０Ｆ、Ｉ１７７Ｌ、Ｑ１００Ｒ、及びＳ１０１Ｒ；置換Ａ１８５Ｐ、Ａ１１３Ｃ、Ａ３３９Ｃ、Ｑ１００Ｒ、及びＳ１０１Ｒ；置換Ａ１８５Ｐ、Ｔ１６０Ｆ、Ｉ１７７Ｌ、Ｑ１００Ｒ、及びＳ１０１Ｒ；置換Ａ１８５Ｐ、Ａ１１３Ｃ、Ａ３３９Ｃ、Ｔ１６０Ｆ、Ｉ１７７Ｌ、Ｑ１００Ｒ、及びＳ１０１Ｒ；置換Ａ６３Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、及びＲ１０２Ｇ；置換Ａ６３Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｋ４５０Ａ、Ｓ４７０Ａ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、及びＲ１０２Ｇ；置換Ａ６３Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｇ２９４Ｅ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、及びＲ１０２Ｇ；置換Ａ６３Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｋ４５０Ｃ、Ｓ４７０Ｃ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、Ｒ１０２Ｇ、及びＧ２９４Ｅ；置換Ａ６３Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、Ｒ１０２Ｇ、及びＧ２９４Ｅ；置換Ｔ１２７Ｃ、Ｎ１５３Ｃ、Ｔ３６５Ｃ、Ｖ４６３Ｃ、Ａ１８５Ｐ、Ｌ２１９Ｋ、Ｖ２３１Ｉ、Ｇ２９４Ｅ、Ｈ３６８Ｎ、Ｑ１００Ｒ、及びＳ１０１Ｒ；置換Ａ６３Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｋ４５０Ｃ、Ｓ４７０Ｃ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、及びＲ１０２Ｇ；置換Ｖ８４Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ａ２４９Ｃ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、及びＲ１０２Ｇ；置換Ｔ１２７Ｃ、Ｎ１５３Ｃ、Ｔ３６５Ｃ、Ｖ４６３Ｃ、Ａ１８５Ｐ、Ｌ２１９Ｋ、Ｖ２３１Ｉ、Ｇ２９４Ｅ、Ｈ３６８Ｎ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、及びＲ１０２Ｇ。
いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、配列番号５８と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、配列番号５９と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、配列番号６０と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、配列番号６１と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、配列番号６２と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、配列番号６３と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、配列番号６４と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、配列番号６５と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、配列番号６６と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、配列番号６７と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、配列番号６８と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、配列番号６９と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、配列番号７０と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、配列番号７１と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、配列番号７２と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、配列番号７３と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、配列番号７４と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、配列番号７５と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、配列番号７６と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、配列番号７７と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、配列番号７８と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、配列番号７９と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、配列番号８０と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、配列番号８１と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、配列番号８２と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、配列番号８３と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、配列番号８４と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、配列番号８５と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、配列番号８６と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、配列番号８７と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、配列番号８８と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、配列番号８９と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、配列番号９０と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、配列番号５８、６０、６１、７７、７８、８６、８７、８８、又は８９と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、配列番号５９、６２、６３、６４、７１、７６、８１、又は８３と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、配列番号７２、７９、又は８０と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、配列番号６５、６６、８２、８４、８５、９０、又は９１と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、配列番号６５、７９、又は８０と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を共有する。いくつかの実施形態では、第１の成分は、配列番号９２～１２４と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を共有する。いくつかの実施形態では、第１の成分は、配列番号９７～１１６、１１９、又は１２２と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を共有する。いくつかの実施形態では、第１の成分は、配列番号９２～９４、９６、１１７、１１８、１２０、１２１、１２３、又は１２４と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を共有する。いくつかの実施形態では、第１の成分は、配列番号９９、１１２、１１７、又は１１８と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を共有する。
いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、ＭＦ１、ＭＦ２、ＭＦ３、ＭＦ９、ＭＦ１２、ＭＦ１４、ＭＦ１５、ＭＦ１１、ＭＦ１６、ＭＦ２０、ＭＦ１７、ＭＦ１８、ＭＦ１９、ＭＦ１０、又はＭＰＥ８から選択される１つ又は複数のｈＭＰＶ Ｆタンパク質抗体に結合する。いくつかの実施形態では、ＶＬＰが、ＭＦ１、ＭＦ２、ＭＦ３、ＭＦ９、ＭＦ１２、ＭＦ１４、ＭＦ１５、ＭＦ１１、ＭＦ１６、ＭＦ２０、ＭＦ１７、ＭＦ１８、ＭＦ１９、ＭＦ１０、ＭＰＥ８から選択される２つ以上の抗体に結合する。いくつかの実施形態では、ＶＬＰが、ＭＦ１、ＭＦ２、ＭＦ３、ＭＦ９、ＭＦ１２、ＭＦ１４、ＭＦ１５、ＭＦ１１、ＭＦ１６、ＭＦ２０、ＭＦ１７、ＭＦ１８、ＭＦ１９、ＭＦ１０、ＭＰＥ８から選択される３つ以上の抗体に結合する。
いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインの融合前形態に優先的に結合する抗体に結合する。いくつかの実施形態では、第１の成分は、配列番号４２、４５、５８、６１、６３、又は６４と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインの融合後形態に優先的に結合する抗体への結合を有しないか、又は結合が低い。いくつかの実施形態では、ＶＬＰ配列は、配列番号９９、１１５、１１７又は１１８と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を共有する。
いくつかの実施形態では、第１の成分は、配列番号９９と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を共有する。
いくつかの実施形態では、第１の成分は一本鎖である。いくつかの実施形態では、一本鎖は、配列番号１２３と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を共有する。
いくつかの実施形態では、第１の成分は、配列番号１１７と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を共有する。
一態様では、本開示は、本明細書に記載のＶＬＰをコードするポリヌクレオチドを提供する。
一態様では、本開示は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。
一態様では、本開示は、ワクチンを製造する方法であって、本明細書に記載の宿主細胞を、宿主細胞が培養培地中に抗原を分泌するように培養培地中で培養することと、任意に、培養培地から抗原を精製することと；抗原を第２の成分と混合することであって第２の成分が抗原と多量体化してウイルス様粒子を形成する、混合することと；任意に、ウイルス様粒子を精製することとを含む、方法を提供する。
一態様では、本開示は、本明細書に記載のＶＬＰを含むワクチンであって、１つ又は複数の薬学的に許容され得る希釈剤、アジュバント、又は賦形剤を任意に含む、ワクチンを提供する。いくつかの実施形態では、ワクチンは安定なエマルジョンである。いくつかの実施形態では、ワクチンは、１つ又は複数のアジュバントを含む。いくつかの実施形態では、１つ又は複数のアジュバントは、スクアレン、ＳＬＡ、ＧＬＡ、Ｒ８４８、ＩＭＱ、３Ｍ－０５２、ＣｐＧ、サポニン（ＱＳ２１）、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、アジュバントはミョウバンである。いくつかの実施形態では、アジュバントはスクアレン系エマルジョンである。いくつかの実施形態では、スクアレン系エマルジョンはＭＦ５９である。
一態様では、本開示は、ヒトメタニューモウイルスによる感染に対して対象を免疫化する方法であって、本明細書に記載のワクチンを投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）による感染に対して同時に免疫化される。いくつかの実施形態では、ワクチンは、皮下注射によって投与される。いくつかの実施形態では、ワクチンは、筋肉内注射によって投与される。いくつかの実施形態では、ワクチンは、皮内注射によって投与される。いくつかの実施形態では、ワクチンは、鼻腔内投与される。一態様では、本開示は、本明細書に記載のワクチンを含むプレフィルドシリンジを提供する。一態様では、本開示は、本明細書に記載のワクチン又は本明細書に記載のプレフィルドシリンジを含むキットを提供する。
本開示によるタンパク質ベースのウイルス様粒子（ＶＬＰ）の例示的な実施形態を示す。
ＶＬＰ及びＶＬＰ成分（Ｇタンパク質は示されていない）のさらなる例示的な実施形態を示す。
融合前配置におけるｈＭＰＶ Ｆタンパク質の二次構造マップを示す（ＰＤＢ ＩＤ：５ＷＢ０；ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇで生成された図）。
図３Ａ～図３Ｃは、本開示の例示的なＶＬＰに対する抗体結合プロファイルを示す一連のプロットである。抗体は、様々な形態のｈＭＰＶ Ｆタンパク質に特異的である。ＭＦ１４は、部位ＩＩエピトープでｈＭＰＶ Ｆタンパク質の融合前及び融合後形態に結合する（図３Ａ）。ＭＦ１６は、部位ＩＶエピトープでｈＭＰＶ Ｆタンパク質の融合前及び融合後形態に結合する（図３Ｂ）。ＭＰＥ８は、部位ＩＩＩエピトープでｈＭＰＶ Ｆタンパク質の融合前形態に結合する（図３Ｃ）。 図３Ａ～図３Ｃは、本開示の例示的なＶＬＰに対する抗体結合プロファイルを示す一連のプロットである。抗体は、様々な形態のｈＭＰＶ Ｆタンパク質に特異的である。ＭＦ１４は、部位ＩＩエピトープでｈＭＰＶ Ｆタンパク質の融合前及び融合後形態に結合する（図３Ａ）。ＭＦ１６は、部位ＩＶエピトープでｈＭＰＶ Ｆタンパク質の融合前及び融合後形態に結合する（図３Ｂ）。ＭＰＥ８は、部位ＩＩＩエピトープでｈＭＰＶ Ｆタンパク質の融合前形態に結合する（図３Ｃ）。 図３Ａ～図３Ｃは、本開示の例示的なＶＬＰに対する抗体結合プロファイルを示す一連のプロットである。抗体は、様々な形態のｈＭＰＶ Ｆタンパク質に特異的である。ＭＦ１４は、部位ＩＩエピトープでｈＭＰＶ Ｆタンパク質の融合前及び融合後形態に結合する（図３Ａ）。ＭＦ１６は、部位ＩＶエピトープでｈＭＰＶ Ｆタンパク質の融合前及び融合後形態に結合する（図３Ｂ）。ＭＰＥ８は、部位ＩＩＩエピトープでｈＭＰＶ Ｆタンパク質の融合前形態に結合する（図３Ｃ）。
アジュバントと共に製剤化されたｈＭＰＶ Ｆタンパク質ＶＬＰの投与に応答したマウスにおける中和抗体価の経時的誘導を示す一連のプロットである。
図５Ａ及び図５Ｂは、２成分ウイルス様粒子（ＶＬＰ）に対するｈＭＰＶ Ｆタンパク質変異体の免疫原性を示す。グラフは、初回免疫化後３５日目に採取した血清試料中のｈＭＰＶ／Ａ（図５Ａ）及びｈＭＰＶ／Ｂ（図５Ｂ）に対する中和抗体価を示す。 図５Ａ及び図５Ｂは、２成分ウイルス様粒子（ＶＬＰ）に対するｈＭＰＶ Ｆタンパク質変異体の免疫原性を示す。グラフは、初回免疫化後３５日目に採取した血清試料中のｈＭＰＶ／Ａ（図５Ａ）及びｈＭＰＶ／Ｂ（図５Ｂ）に対する中和抗体価を示す。
図６Ａ及び図６Ｂは、ｈＭＰＶ００８ ＶＬＰ及び対応する可溶性タンパク質ＣｏｍｐＡ－ｈＭＰＶ００８の免疫原性を示す。グラフは、初回免疫化後３５日目に採取した血清試料中のｈＭＰＶ／Ａ（図６Ａ）及びｈＭＰＶ／Ｂ（図６Ｂ）に対する中和抗体価を示す。 図６Ａ及び図６Ｂは、ｈＭＰＶ００８ ＶＬＰ及び対応する可溶性タンパク質ＣｏｍｐＡ－ｈＭＰＶ００８の免疫原性を示す。グラフは、初回免疫化後３５日目に採取した血清試料中のｈＭＰＶ／Ａ（図６Ａ）及びｈＭＰＶ／Ｂ（図６Ｂ）に対する中和抗体価を示す。
図７Ａ及び図７Ｂは、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質変異体ｈＭＰＶ００８を示すＶＬＰの免疫原性を示す。初回免疫化後３５日目に採取した血清試料中のｈＭＰＶ／Ａ（図７Ａ）及びｈＭＰＶ／Ｂ（図７Ｂ）について中和抗体価を測定した。 図７Ａ及び図７Ｂは、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質変異体ｈＭＰＶ００８を示すＶＬＰの免疫原性を示す。初回免疫化後３５日目に採取した血清試料中のｈＭＰＶ／Ａ（図７Ａ）及びｈＭＰＶ／Ｂ（図７Ｂ）について中和抗体価を測定した。
図８Ａ及び図８Ｂは、ｈＭＰＶ０３３の免疫原性を示す。初回免疫化後３５日目に採取した血清試料中のｈＭＰＶ／Ａ（図８Ａ）及びｈＭＰＶ／Ｂ（図８Ｂ）について中和抗体価を測定した。 図８Ａ及び図８Ｂは、ｈＭＰＶ０３３の免疫原性を示す。初回免疫化後３５日目に採取した血清試料中のｈＭＰＶ／Ａ（図８Ａ）及びｈＭＰＶ／Ｂ（図８Ｂ）について中和抗体価を測定した。
図９Ａ～図９Ｃは、コットンラットにおけるｈＭＰＶ感染に対するｈＭＰＶ０３３の保護効果を示す。ｈＭＰＶ／Ａに対する中和力価を、初回免疫化後３５日目に採取した血清（図９Ｃ）、肺（図９Ｂ）及び鼻（図９Ｃ）試料で決定した。 図９Ａ～図９Ｃは、コットンラットにおけるｈＭＰＶ感染に対するｈＭＰＶ０３３の保護効果を示す。ｈＭＰＶ／Ａに対する中和力価を、初回免疫化後３５日目に採取した血清（図９Ｃ）、肺（図９Ｂ）及び鼻（図９Ｃ）試料で決定した。 図９Ａ～図９Ｃは、コットンラットにおけるｈＭＰＶ感染に対するｈＭＰＶ０３３の保護効果を示す。ｈＭＰＶ／Ａに対する中和力価を、初回免疫化後３５日目に採取した血清（図９Ｃ）、肺（図９Ｂ）及び鼻（図９Ｃ）試料で決定した。
ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）のためのタンパク質ベースのウイルス様粒子（ＶＬＰ）ワクチンであって、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインがタンパク質ベースのＶＬＰ、例えば設計ＶＬＰ、例えば対称ＶＬＰに連結され、それによって提示される、タンパク質ベースのウイルス様粒子（ＶＬＰ）ワクチンが提供される。例えば、ワクチン抗原は、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質の外部ドメインの、１成分又は２成分デノボ設計ＶＬＰ、例えば２成分正二十面体ＶＬＰのための多量体化ドメインを有するタンパク質へのＮ末端融合物であり得る。さらに、ワクチン組成物、製造方法、及び使用方法、例えば、ｈＭＰＶウイルスに対する防御免疫応答を生成するために対象を免疫化する方法が提供される。
定義
すべての刊行物、特許及び特許出願（その中の任意の図面及び付属書を含む）は、あたかも各個々の刊行物、特許又は特許出願、図面又は付属書がすべての目的のためにその全体が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているのと同程度に、すべての目的のためにその全体が参照により組み込まれる。
「ウイルス様粒子」又は「ＶＬＰ」という用語は、ウイルスに似ているが、ウイルスタンパク質又は糖タンパク質の抗原性タンパク質又はその抗原性断片を提示する非感染性の分子集合体を指す。「タンパク質ベースのＶＬＰ」は、タンパク質又は糖タンパク質から形成され、他の成分（例えば、脂質）を実質的に含まないＶＬＰを指す。タンパク質ベースのＶＬＰは、翻訳後修飾及び化学修飾を含み得るが、生きている又は生きている不活化ウイルス調製物からのウイルスタンパク質の抽出によって形成されたミセルＶＬＰ及びＶＬＰとは区別されるべきである。「設計ＶＬＰ」 という用語は、計算タンパク質設計によって生成された１つ又は複数のポリペプチドを含むＶＬＰを指す。例示的な設計ＶＬＰは、図１Ｂに示すナノ構造を含むＶＬＰである。「対称ＶＬＰ」という用語は、図１Ｂに示すような対称コアを有するタンパク質ベースのＶＬＰを指す。これらには、設計ＶＬＰが含まれるが、これに限定されない。例えば、タンパク質フェリチンは、天然に存在するフェリチン配列を使用して対称的なタンパク質ベースのＶＬＰを生成するために使用されてきた。フェリチン系ＶＬＰは、ウイルスタンパク質をフェリチン分子に融合すること以外に、フェリチンから対称ＶＬＰを形成するためにタンパク質工学が必要ないという点で、設計ＶＬＰとは区別される。タンパク質設計法を使用して、鋳型構造（例えば、タンパク質データバンクに寄託された構造）又はデノボ（すなわち、所望の構造を有するが、天然に存在するタンパク質との相同性がほとんど又は全くない新しいタンパク質の計算設計による）に基づいて同様の１成分及び２成分ナノ構造を生成することができる。次いで、そのような１成分及び２成分ナノ構造は、設計ＶＬＰのコアとして使用することができる。
本開示のＶＬＰは、ヒトメタニューモウイルス又は他のメタニューモウイルスに対する免疫応答を誘発することができる抗原を提示する。本開示のワクチンは、ヒトメタニューモウイルスによる感染の重症度を予防及び／又は減少させるのに有用である。
「正二十面体粒子」という用語は、正二十面体対称性を有するコアを有する設計ＶＬＰを指す（例えば、表１のＩ５３及びＩ５２と標識された粒子）。Ｉ５３は、五量体及び三量体から構成される正二十面体粒子を指す。Ｉ５２は、五量体及び二量体から構築された正二十面体粒子を指す。Ｔ３３は、２組の三量体から構成される四面体粒子を指す。Ｔ３２は、三量体及び二量体から構成される四面体粒子を指す。
抗原は、融合タンパク質として、又は本明細書に開示される他の手段によって、非共有結合又は共有結合のいずれかでタンパク質ベースのＶＬＰのコアに結合され得る。多量体抗原は、任意に、ＶＬＰの対称軸に沿って提示され得る。タンパク質及びそのようなタンパク質をコードする核酸分子、製剤、並びに使用方法も提供される。
「抗原」という用語は、免疫応答を誘発するように設計された少なくとも１つの成分を含むポリペプチド又はポリペプチド複合体を指す。本明細書で使用される抗原という用語は、抗原性エピトープを含有するポリペプチド又はポリペプチド複合体の部分に限定されない。
「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合、及び任意に１つ又は複数の翻訳後修飾（例えば、グリコシル化）及び／又は他の修飾（限定されないが、マーカーとして使用されるポリペプチド部分、例えば蛍光タグ又はアジュバントのコンジュゲーションを含む）によって連結された一連のアミノ酸残基を指す。
「感染」という用語は、症候性感染と無症候性感染の両方を指す。
「外部ドメイン」という用語は、タンパク質の天然の状態で、細胞膜又はウイルス膜の外側にある膜貫通タンパク質又は糖タンパク質の部分を指す。
「変異体」という用語は、参照ポリペプチドと比較して１つ又は複数の挿入、欠失、又はアミノ酸置換を有するが、参照タンパク質の１つ又は複数の特性を保持するポリペプチドを指す。
「抗原変異体」という用語は、参照ポリペプチドと共通の１つ又は複数のエピトープを有する、及び／又は対象に投与した場合に参照ポリペプチドと同一若しくは類似の免疫応答を生成する変異体を指す。
「機能的変異体」という用語は、参照ポリペプチドと同一又は類似の機能的効果（複数か）を示す変異体を指す。例えば、多量体化ドメインの機能的変異体は、参照多量体化ドメインと同一の程度又は類似の程度に多量体化を促進することができ、及び／又は参照多量体化ドメインと同一の同族多量体化ドメインと多量体化することができる。
用語「リンカー」は、化学結合（すなわち、共有結合又は間に化学部分を有する一連の共有結合）、又はペプチド結合によってＮ末端及びＣ末端が連結されて融合タンパク質を生成するポリペプチドのいずれかを指す。
「ドメイン」という用語は、三次構造をとるポリペプチドの任意の部分を指す。
「多量体化ドメイン」及び「多量体化する」という用語は、ポリペプチド又はポリペプチドのドメインが、二量体、三量体、四量体、五量体若しくは六量体を形成する能力、及び／又は他の多量体化ドメインとヘテロマーを形成する能力を指す。
「三量体化ドメイン」という用語は、三量体を形成する多量体化ドメインを指す。
「ＶＬＰ形成ドメイン」という用語は、単独で又は他の多量体化ドメインと一緒に、対称性タンパク質複合体を形成する多量体化ドメインを指す。
「断片」という用語は、参照ポリペプチドと比較して１つ又は複数のＮ末端又はＣ末端のトランケーションを有するポリペプチドを指す。
「機能的断片」という用語は、断片の機能的変異体を指す。
「アミノ酸置換」という用語は、配列中の単一のアミノ酸を別のアミノ酸残基で置き換えることを指す。アミノ酸置換のための略語の標準的な形態が使用される。例えば、Ｖ９４Ｒは、参照配列中のバリン（Ｖ）のアルギニン（Ｒ）による置換を指す。略語Ａｒｇ９４は、参照配列に対して９４番目の残基がアルギニン（Ａｒｇ）である任意の配列を指す。
「ヘリックス」又は「らせん状」という用語は、発生することが知られているか、又は発生すると予測されるポリペプチド中のαらせん状二次構造を指す。例えば、計算モデリングが、配列がらせん状立体配座をとる可能性が高いことを示唆する場合、配列はらせん状として記載され得る。
用語「成分」は、適切な条件下でウイルス様粒子に集合することができるタンパク質又はタンパク質複合体を指す（例えば、多量体化ドメインを含む抗原又はポリペプチド）。
「ワクチン」という用語は、対象において免疫応答を生成するのに使用することができる医薬組成物を指す。
「薬学的に許容され得る賦形剤」という用語は、動物又はヒトにおけるインビボ使用に生物学的又は薬理学的に適合する賦形剤を意味し、連邦又は州政府の規制当局によって承認された賦形剤、又は動物、より具体的にはヒトにおける使用のために米国薬局方又は他の一般に認識されている薬局方に記載されている賦形剤を意味することができる。
「アジュバント」という用語は、抗原と同時投与された場合、又は対象への抗原の投与前、投与中、若しくは投与後に投与された場合、抗原に対する免疫応答を増強する薬学的に許容され得る物質を指す。
「ＴＬＲ４免疫賦活化剤」という用語は、対象の免疫細胞中のＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）を刺激して免疫応答を調節するアジュバント、例えばモノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬ）、グルコピラノシルリピッドＡ（ＧＬＡ）及び／又は可溶性リーシュマニア抗原（ＳＬＡ）を指す。
「有効量」という用語は、状態、障害又は症状を処置するために患者に投与された場合、そのような処置を行うのに十分であるか、又は免疫応答を生成するために患者に投与された場合、そのような免疫応答を生成するのに十分である本発明による製剤の量を指す。「有効量」は、有効成分、処置される状態、障害、又は症状及びその重症度、並びに処置される対象の年齢、体重、身体状態及び反応性に応じて変化する。
「免疫応答」という用語は、対象における１つ又は複数の免疫細胞型の活性の誘発を指す。免疫応答には、例えば、Ｔ細胞応答及びＢ細胞応答が含まれる。
「体液性免疫応答」という用語は、血漿又は血清抗体（例えば、ＩｇＧ）を生成する免疫応答を指す。
「防御免疫応答」という用語は、対象が後に病原体を負荷された場合に、病原体による感染の重症度を予防及び／又は軽減する免疫応答、又は防御と相関するレベルの免疫応答を生成する免疫応答を指す。例えば、ワクチン接種は、対象（例えば、ヒト、ペット、又は農業動物）の血漿又は血清中で、対象をその後の感染から保護する中和抗体の産生をもたらす場合、及び／又は、試験対象（例えば、ニュージーランドホワイト（ＮＺＷ）ウサギ）に対して保護を付与することが観察される量で存在する場合、防御免疫応答を生成し得る。
「ポリクローナル抗体応答」という用語は、抗体配列に１つよりも多くの特異性及び／又は変異を有する抗体を含む抗体応答を指す。
「中和する」（例えば、「抗体応答を中和する」）という用語は、病原体による感染を予防する及び／又は感染レベルを低下させる抗体を指す。抗体応答の中和は、インビトロアッセイ（例えば、抗体の存在下での病原体による培養中の細胞の感染）又はインビボアッセイ（例えば、病原体の感染用量による負荷の前に抗体を対象に投与することによって抗体の保護用量を決定することによる）のいずれかで測定することができる。
標的（例えば、ヒトメタニューモウイルス又はｈＭＰＶタンパク質）に「結合する」又は「特異的である」又は「特異的に結合する」抗体（本明細書において相互交換可能に用いられる）は、当技術分野でよく理解されている用語であり、そのような特異的又は優先的な結合を決定する方法も当技術分野でよく知られている。分子は、特定の細胞又は物質と、それが代替の細胞又は物質と反応又は会合するよりも、より頻繁に、より迅速に、より長い持続時間で、及び／又はより高い親和性で反応又は会合する場合、「特異的結合」又は「優先的結合」を示すと言われる。例えば、胸腺細胞に特異的又は優先的に結合する免疫グロブリンは、他の細胞に結合するよりも高い親和性、結合活性で、より容易に、及び／又はより長い期間で胸腺細胞に結合する免疫グロブリンである。第１の細胞又は物質に特異的に結合する免疫グロブリンは、第２の細胞又は物質に特異的又は優先的に結合してもしなくてもよい。したがって、「特異的結合」は、排他的結合を必ずしも必要としない（しかし、排他的結合を含むことができる）。一般に、必ずしもそうとは限らないが、結合への言及は特異的結合を意味する。
「所定の時間」という用語は、特定の効果を観察するために適切に選択された時間の間隔を指す。所定の時間は、実験又は手順の前又は間に選択されてもよい。
「曝露後予防」という用語は、免疫応答を誘発して病原体による感染から保護するため、及び／又は病原体による感染の１つ又は複数の症候の重症度を低下させるために、以前に病原体に曝露された及び／又は感染した対象に抗原組成物（例えば、ワクチン）を投与することを指す。
「投与する」という用語は、組成物が意図した効果を有することを可能にする様式で組成物を対象に提供することを指す。ワクチン接種又は曝露後予防のための投与は、筋肉内注射、静脈内注射、腹腔内注射、又は任意の他の適切な経路によって行われ得る。
「免疫化」及び「免疫化する」という用語は、１回又は複数回の投与工程の後に、所望の免疫応答（例えば、ＶＬＰに対する体液性免疫応答）を誘発するのに十分な量で組成物（例えば、ウイルス様粒子）を対象に投与することを指す。免疫化は、組成物の１回～１０回又はそれを超える投与（例えば、注射）、例えば１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回又はそれを超える投与を含んでよい。初回投与は、検出可能な免疫応答を誘発し得ないが、これは、一般に、その後の各投与は、以前の投与によって生成された免疫応答をブーストするからである。本明細書で使用される「免疫化する」という用語は、曝露後予防を含む。
「対象」という用語は、ワクチン接種、処置、又は他の目的のために組成物が投与され得るヒト又は非ヒト動物を指す。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、非ヒト霊長類、ウサギ、ハムスター、スナネズミ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、モルモット、ラット、マウス、リス、オオカミ、キツネ、ウマ、シマウマ、キリン、ゾウ、ネコ、イヌ、ラマ、又はフェレットである。
「製造」という用語は、少なくとも２５ｍＬ、５０ｍＬ、１Ｌ、１，０００Ｌ、５０，０００Ｌ又はそれを超える規模を含む任意の規模での組換えポリペプチド又はウイルス様粒子の産生を指す。
「培養する」及び「培養培地」という用語は、標準的な細胞培養及び組換えタンパク質発現技術を指す。
「宿主細胞」という用語は、組換えポリペプチドの発現に使用することができる任意の細胞を指す。
「分泌する」という用語は、宿主細胞が培養される培地中にポリペプチドを分泌する能力を指す。
「シグナル配列」という用語は、ポリペプチドを特定の細胞区画に指向させる、典型的には宿主細胞で発現されるポリペプチドのＮ末端のポリペプチド配列を指す。シグナル配列は、宿主細胞が、宿主細胞と共に培養される培地中にポリペプチドを分泌させる分泌シグナルであり得る。様々なシグナル配列が知られており、適切なシグナル配列を選択することは当業者の技術の範囲内である。
「混合」という用語は、２つの溶液を接触させて溶液を混合させることを指す。
「精製する」という用語は、組成物中に存在する他の物質から分子を分離することを指す。ポリペプチドは、親和性（例えば、抗体又はタグに対する親和性であり、例えばＨｉｓタグ捕捉樹脂を使用する）、電荷（例えば、イオン交換クロマトグラフィ）、サイズ（例えば、分取超遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィ）などによって精製され得る。
本明細書で互換的に使用される「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかである、約１００ヌクレオチドを超えるヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、この用語には、一本鎖、二本鎖若しくは多本鎖のＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、又はプリン及びピリミジン塩基、又は他の天然、化学的若しくは生化学的に修飾された、非天然若しくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれるが、これらに限定されない。「オリゴヌクレオチド」は、一般に、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡの約５～約１００ヌクレオチドのポリヌクレオチドを指す。しかしながら、本開示の目的のために、オリゴヌクレオチドの長さに上限はない。オリゴヌクレオチドは、「オリゴマー」又は「オリゴ」としても知られており、遺伝子から単離され得るか、又は当技術分野で公知の方法によって化学的に合成され得る。「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、記載されている実施形態に適用可能なように、一本鎖（センス又はアンチセンスなど）及び二本鎖ポリヌクレオチドを含むと理解されるべきである。
「同一性」、「同一」、及び「配列同一性」 という用語は、同じであり、同じ相対位置にある２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列間の塩基又はアミノ酸の割合を指す。したがって、１つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列は、別のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列と比較して特定の割合の配列同一性を有する。配列比較のために、典型的には、１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として作用する。「参照配列」という用語は、試験配列が比較される分子を指す。
比較及び配列同一性パーセントの決定のための配列アラインメントの方法は、当技術分野で周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えばＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装によって（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、手動アライメント及び目視検査によって（例えば、Ｂｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙを参照）、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズム（それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９７７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２；及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０に記載されている）を含む当技術分野で公知のアルゴリズムを用いることによって、行うことができる。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通して公的に入手可能である。
「処置する」という用語は、対象における症状の少なくとも１つの症候の緩和、軽減、遅延、低減、逆転、改善、又は管理の１つ又は複数を意味する。用語「処置する」はまた、発症の停止、遅延（すなわち、症状の臨床的発現前の期間）、又は症状の発症若しくは悪化のリスクの低減のうちの１つ又は複数を意味し得る。
「約（ａｂｏｕｔ）」又は「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、当業者によって決定される特定の値の許容され得る誤差範囲内を意味し、これは、値がどのように測定又は決定されるか、例えば、測定システムの制限に部分的に依存する。例えば、「約」は、１標準偏差以内又は１標準偏差を超えることを意味することができる。あるいは、「約」は、最大２０％、最大１０％、又は最大５％のプラス又はマイナスの範囲を意味することができる。
本明細書で言及される全ての重量百分率（すなわち、「重量％」及び「ｗｔ．％」及びｗ／ｗ）は、特に明記しない限り、医薬組成物の総重量に対して測定される。
本明細書で使用される場合、「実質的に」又は「実質的な」は、動作、特徴、特性、状態、構造、項目、又は結果の完全又はほぼ完全な程度又は度合いを指す。例えば、「実質的に」囲まれている物体は、物体が完全に囲まれているか、又はほぼ完全に囲まれていることを意味する。絶対的完全性からの正確な許容可能な逸脱度は、場合によっては、特定の状況に依存し得る。しかしながら、一般的に言えば、完了の近さは、あたかも絶対的かつ完全な完了が得られたかのように全体的に同じ結果を有するようになる。「実質的に」の使用は、動作、特徴、特性、状態、構造、項目、又は結果の完全な又はほぼ完全な欠如を指す否定的な意味合いで使用される場合にも等しく適用可能である。例えば、他の活性剤を「実質的に含まない」組成物は、他の活性剤を完全に欠くか、又は他の活性剤をほぼ完全に欠くため効果は他の活性剤を完全に欠く場合と同じである。換言すれば、成分若しくは要素又は別の活性剤を「実質的に含まない」組成物は、その測定可能な効果がない限り、そのような項目を依然として含有し得る。
以下の説明は、本発明を理解するのに有用であり得る情報を含む。本明細書で提供される情報のいずれかが先行技術であること、又は現在特許請求されている発明に関連すること、又は具体的又は暗黙的に参照される任意の刊行物が先行技術であることを認めるものではない。
概要
ワクチン接種は、細菌、ウイルス、及び寄生虫を含む様々な感染因子による感染の重症度を予防又は減少させるために使用される処置モダリティである。新しいワクチンの開発は、重要な商業的及び公衆衛生的意味を有する。特に、ライム病、百日咳、ヘルペスウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、ニューモウイルス、フィロウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、レトロウイルス、コロナウイルス、及びマラリアは、ワクチンが既に存在する、開発中である、又は望ましい感染因子である。
サブユニットワクチンは、単離された抗原、通常は細菌、昆虫又は哺乳動物細胞宿主において組換え発現されるタンパク質から作製されたワクチンである。典型的には、サブユニットワクチンの抗原性成分は、感染時に自然免疫応答を誘発することが観察される感染因子のタンパク質の中から選択されるが、場合によっては、感染因子の他の成分を使用することができる。サブユニットワクチンに使用するための典型的な抗原としては、標的感染因子の表面上に発現されるタンパク質、例えばウイルスの表面発現エンベロープ糖タンパク質が挙げられる。好ましくは、抗原は、抗体を中和するための標的である。より好ましくは、抗原は、抗原に対する免疫応答が感染因子の複数の株に対する免疫をカバーするように、抗体を広く中和するための標的である。場合によっては、サブユニットワクチンにＮ結合又はＯ結合したグリカンは、抗原のエピトープに寄与することによって、又は立体障害によって抗原上の特定のエピトープに対する免疫応答を誘導することによって、ワクチン接種においても重要であり得る。ワクチン接種に応答して起こる免疫応答は、タンパク質自体、グリカン、又はタンパク質と結合グリカンの両方に対して向けられ得る。サブユニットワクチンは、生きた病原体を含まないことを含む様々な利点を有し、ワクチンによる患者の感染に関する懸念を排除し；標準的な遺伝子工学技術を使用して設計することができ；他の形態のワクチンよりも均質であり；そして、十分に特徴付けられた発現系を使用して、標準化された組換えタンパク質発現産生系で製造することができる。場合によっては、抗原は、中和抗体又は広域中和抗体などの望ましい抗体の生成を促進するように遺伝子操作され得る。特に、Ｘ線結晶学、電子顕微鏡法又は核磁気共鳴実験によって得られた目的の抗原に関する構造情報を使用して、サブユニットワクチンの合理的な設計を導くことができる。
サブユニットワクチンの既知の制限は、誘発される免疫応答が、全ウイルス、生ワクチン又は弱毒生ワクチンなどの他の種類のワクチンに対する免疫応答よりも弱い場合があることである。本発明者らは、設計及び／又はタンパク質ベースのＶＬＰワクチンが、対称的に配列されたアレイにおける抗原の多価ディスプレイを介してワクチン誘導性免疫応答の効力及び幅を増加させながら、サブユニットワクチンの利点を利用する可能性を有することを認識し、本明細書で開示している。本開示では、タンパク質ベースのＶＬＰは、ナノ粒子ワクチンと区別される。なぜならば、ナノ粒子ワクチンという用語は、タンパク質ベース又は糖タンパク質ベースのワクチン（例えば、米国特許第９，４４１，０１９号を参照）、重合リポソーム（例えば、米国特許第７，２８５，２８９号を参照）、界面活性剤ミセル（例えば、米国特許出願公開第２００４／００３８４０６号明細書を参照）、及び合成生分解性粒子（例えば、米国特許第８，３２３，６９６号明細書を参照）を指すために当技術分野で使用されているからである。
本開示のタンパク質ベースのＶＬＰは、界面活性剤（例えば、ＮＰ－９）を含有するミセル粒子の表面に抗原を提示するＶＬＰ；あるいは、ウイルスエンベロープの脂質成分を保持しながら生ウイルスから抗原性タンパク質を抽出することによって作製されるものから区別可能である。対照的に、本明細書に記載のタンパク質ベースのＶＬＰは、脂質及び界面活性剤を含まないか、又は実質的に含まない。さらに、本開示のタンパク質ベースのＶＬＰのいくつかの実施形態でのｈＭＰＶ Ｆタンパク質の対称的な提示は、他のＶＬＰと比較してＦタンパク質に対する優れた免疫応答を生成し得る。
実施形態
本開示は、タンパク質ベースのＶＬＰ及びタンパク質ベースのＶＬＰワクチンに関する。本開示のＶＬＰは、ｈＭＰＶに対する免疫応答を誘発することができる抗原を提示する。本開示のいくつかのワクチンは、ｈＭＰＶによる感染の重症度を予防又は減少させるのに有用である。特に、本開示の抗原は、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質の外部ドメインを提示する。外部ドメインは、融合タンパク質として、又は本明細書に開示される他の手段によって、非共有結合又は共有結合のいずれかでＶＬＰのコアに結合され得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、外部ドメインを、多量体化ドメインを含む第１のポリペプチドに連結する。リンカーは、第１のポリペプチドに対する外部ドメインのＮ末端又はＣ末端融合を形成するために使用されるポリペプチドを含むがこれらに限定されない任意の化学結合であり得る。ｈＭＰＶ Ｆタンパク質は、任意に、ＶＬＰの対称軸に沿って提示され得る。いくつかの実施形態では、Ｆタンパク質は、三量体化ドメイン及び任意にさらなる三量体化タグ（例えば、フォルドンタグ）を含む第１のポリペプチドにＣ末端が連結されている。タンパク質及びそのようなタンパク質をコードする核酸分子、製剤、並びに使用方法も提供される。
タンパク質ベースのウイルス様粒子
本発明のＶＬＰは、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質の外部ドメイン又はその抗原性断片を提示するように適合された多量体タンパク質集合体を含んでもよい。本発明のＶＬＰは、少なくとも第１の複数のポリペプチドを含む。第１の複数のポリペプチド（「第１の成分」とも呼ばれる）は、少なくとも１つのアミノ酸残基の置換によって、又は１つ若しくは複数の残基のＮ末端若しくはＣ末端でのさらなる置換によって、天然に存在するタンパク質配列から誘導され得る。場合によっては、第１の成分は、計算方法によって決定されたタンパク質配列を含む。この第１の成分は、ＶＬＰのコア全体を形成してもよい。又は、ＶＬＰが２、３、４、５、６、７又はそれを超える複数のポリペプチドを含むように、ＶＬＰのコアが１つ又は複数のさらなるポリペプチド（「第２の成分」又は第３、第４、第５の成分などとも呼ばれる）を含み得る。場合によっては、第１の複数は、３回対称の回転に関連する三量体を形成し、第２の複数は、５回対称の回転に関連する五量体を形成する。そのような場合、ＶＬＰは、Ｉ５３対称性を有する「正二十面体粒子」を形成する。合わせて、これらの１つ又は複数のポリペプチドは、各複数のポリペプチドのメンバーが対称性演算子によって互いに関連するように配置され得る。標的対称構造におけるタンパク質構成要素の対称ドッキングを含む、自己集合性タンパク質材料を設計するための一般的な計算方法が、米国特許出願公開第２０１５／０３５６２４０号に開示されている。
ＶＬＰの「コア」は、本明細書では、ＶＬＰによって提示されるｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメイン又はその抗原性断片のいくつかのコピーを一緒に連結するＶＬＰの中心部分を説明するために使用される。一実施形態では、第１の成分は、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメイン又はその抗原変異体を含む第１のポリペプチドと、リンカーと、多量体化ドメインを含む第１のポリペプチドとを含む。それにより、「抗原」は、単独で、又はこれが第２の成分（第３、第４、又は第５などの成分）のいずれかで、ＶＬＰに自己集合することができる単一のポリペプチドである。抗原自体が自己集合するように設計する利点は、ＶＬＰ全体がワクチンの抗原性成分として作用することである。他の実施形態では、外部ドメイン又はその抗原性断片は、多量体化ドメインを含む第１のポリペプチドに非共有結合的又は共有結合的に連結される。例えば、抗体又はその抗原性断片は、第１のポリペプチドに融合され、第１のポリペプチドの一部又は第１のポリペプチド上の化学タグに結合するように構成され得る。ストレプトアビジン－ビオチン（又はニューラビジン（ｎｅｕｒａｖｉｄｉｎ）－ビオチン）リンカーを使用することができる。又は、様々な化学リンカーが使用され得る。汎用プラットフォームであるようにコアを設計することの利点は、コアを含む１つ又は複数のポリペプチドを事前に設計及び最適化し、次いで外部ドメインに連続的に適用して、ワクチンとして優れた有効性を有するＶＬＰ（複数可）を同定することができることである。場合によっては、同じポリペプチドが「コア」の一部を形成し、次いで、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインの結合のためのアダプターとして外側に伸長し、外部ドメインを含み得ることが理解されるであろう（すなわち、融合タンパク質）。本開示の実施形態では、抗原は、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインに加えて、さらなるポリペプチド配列を含む。特定の実施形態では、外部ドメインは、天然に又は代替オリゴ糖（例えば、抗原を発現するために使用される宿主細胞に特異的なオリゴ糖）を使用してグリコシル化される。
場合によっては、コアが外部ドメインの非存在下で独立して自己集合することができるにもかかわらず、自己集合は外部ドメインの多量体化によってさらに促進され得る。ｈＭＰＶ Ｆタンパク質は、その天然状態で三量体として検出される（Ｃｓｅｋｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２１（２）：６９８－７０７（２００７））。少なくともいくつかの実施形態では、ＶＬＰ上の外部ドメインの提示は、集合のための熱力学的障壁及び／又は集合したＶＬＰ成分と集合していないＶＬＰ成分との平衡比が低下する。場合によっては、ＶＬＰの３倍軸に沿って配置された三量体外部ドメインは、外部ドメインの適切な折り畳み及び立体配座安定性を促進し、ＶＬＰの自己集合を協調プロセスにし、外部ドメインは、部分的にはＶＬＰのコアの３倍軸上に提示されるために適切に三量体化され、ＶＬＰは、少なくとも部分的には、三量体単位間の非共有結合又は共有結合相互作用によってその集合形態で安定化される。場合によっては、抗原又はＶＬＰ成分への突然変異の導入は、特にシステイン残基が分子内ジスルフィド結合を生成するように配置されている場合、任意に、集合をさらに安定化し得る。いくつかの例において、二量体抗原、三量体抗原、四量体抗原、五量体抗原又は六量体抗原は、適合する２倍、３倍、４倍、５倍又は６倍の対称軸を有するように設計されたコア上に提示され、その結果、コアは、抗原の生来的な対称性を有する多量体抗原の配置に適応する。
ＶＬＰの様々な非限定的な例
一実施形態の非限定的な例が図１Ａに示されており、これは、宿主細胞（例えば、２９３Ｆ細胞）において任意に組換え発現されるＶＬＰの成分（第１の複数のポリペプチド）に遺伝子融合された外部ドメイン抗原を示す。同じ又は異なる宿主細胞（例えば、大腸菌細胞）において任意に組換え発現される五量体タンパク質集合体（第２の複数のポリペプチド）と共に、これらの２つの複数のポリペプチドは、正二十面体コアの周りに２０個の抗原三量体を示すＶＬＰに自己集合する。この実施形態では、コアは一般的な設計を有する。以下に説明するように、他の実施形態では、本開示の抗原は、同じＶＬＰ中の別の抗原タンパク質、例えば第２のウイルス由来のタンパク質の外部ドメイン、又は例えば別のウイルス由来の三量体糖タンパク質と混合される。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインに加えて、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＲＳＶ、インフルエンザ、エボラ、マールブルク、デング熱、ＳＡＲＳ、ＭＥＲＳ、ハンタ又はジカウイルスの三量体糖タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、ヘルペスウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、ニューモウイルス、フィロウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、又はレトロウイルスを含むがこれらに限定されない、これらの例示的なウイルスのいずれかに進化的に又は配列同一性で関連するウイルスの三量体糖タンパク質を含む。一実施形態では、ＶＬＰは、膜貫通タンパク質若しくは糖タンパク質の細胞外ドメイン（単数又は複数）、又はその抗原性断片を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、アジュバントとして作用することができるポリペプチド又は他の薬剤にさらに連結される。いくつかの実施形態では、抗原（第１の成分）及び／又は第２の成分は、１つ又は複数のＴ細胞エピトープ、任意に、異種起源のＴ細胞エピトープを含む。
混合ＶＬＰを形成するために開示のＶＬＰと共に使用され得る三量体抗原は、場合によっては、限定されないが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、呼吸器合胞体ウイルス、ＨＩＶ ｇｐ １４０、インフルエンザＨＡ、デング熱Ｅタンパク質、又はエボラｓＧＰである。本開示の混合ＶＬＰには、水疱性口内炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、トゴトウイルス及びボルナウイルス科の１つ又は複数に由来するｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメイン及び抗原性タンパク質（複数可）の両方を含むものが含まれる。他の三量体抗原が使用される場合、それらはＶＬＰの３回対称軸上に任意に配置され得る。場合によっては、選択される抗原は単量体であるが、それでもなお３倍軸上に配置される。したがって、図１Ａに示すＶＬＰは、２０個の三量体抗原又は６０個の単量体抗原を提示することができる。追加的又は代替的に、ＶＬＰの五量体複合体は、１２個の五量体抗原又は７０個の単量体抗原を提示するために使用される。一実施形態では、ＶＬＰは、２０コピーの三量体抗原及び１２コピーの五量体抗原を含む。
ＶＬＰコア
本開示のポリペプチドの他の可能な配置を図１Ｂに示す。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、最大８個の三量体；８個の三量体及び１２個の二量体；６個の四量体及び１２個の二量体；６個の四量体及び８個の三量体；２０個の三量体及び３０個の二量体；４個の３量体、６個の２量体；４個の第１の三量体及び４個の第２の三量体、又は８個の三量体；１２個の五量体及び２０個の三量体；又は１２個の五量体及び３０個の二量体；又は４個の三量体の提示に適合される。場合によっては、対称軸の１つは抗原提示に使用されず、したがって、いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、最大８個の三量体；１２個の二量体；６個の四量体；２０個の三量体；３０個の二量体；４個の３量体；６個の二量体；８個の３量体；又は１２個の五量体の提示に適合される。場合によっては、単量体抗原が提示され、したがって、ＶＬＰは、最大１２、２４、６０、又は７０個の単量体抗原の提示に適合される。場合によっては、ＶＬＰは、ＶＬＰのコアのそれ以外は同一のポリペプチドが異なる抗原を示すか又は抗原を示さないように、混合された複数のポリペプチドを含む。したがって、ポリペプチドの比に応じて、ＶＬＰは、場合によっては、１～１３０個の抗原の提示に適合し（例えば、Ｉ５２粒子上）、表示される各抗原は、同じであってもよく、又は、選択された任意の比に比例して混合集団の異なるメンバーであってもよい。抗原を組換え発現系で共発現させ、精製前に自己集合させることができる。あるいは、抗原は別々に発現され、次いで、発現宿主及び関連する汚染物質からの精製の前又は後のいずれかに一緒に混合され得る。様々な実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、又はそれを超える抗原が表示される。非限定的な例示的ＶＬＰは、Ｂａｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５３：３８９－９４（２０１６）；Ｈｅｉｎｚｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ Ｂ．１２０：５９４５－５９５２（２０１６）；Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５１０：１０３－１０８（２０１４）；及びＫｉｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３６：１１７１－７１（２０１２）に提供されている。
混合ＶＬＰ
場合によっては、ＶＬＰは、ｈＭＰＶの２つ以上の多様な株からの同じ抗原を提示するように適合される。非限定的な例では、同じＶＬＰは、ホモ三量体タンパク質抗原の混合集団又はｈＭＰＶの異なる株由来のタンパク質抗原の混合ヘテロ三量体を示す。一実施形態では、ＶＬＰは、「ヒトメタニューモウイルスＦ」というキーワードでタンパク質データベースを検索することによって見出されたＧｅｎＢａｎｋの任意の配列に開示されたＦタンパク質又はその抗原性断片を、個別に又は混合ＶＬＰで提示する。
混合ＶＬＰを作製する場合、例えば、すべての株１ Ｆタンパク質がＴ３３粒子の一方の３倍軸上に提示され、すべての株２ Ｆタンパク質がＴ３３粒子の他方の３倍軸上に提示されるように、ヘテロ多量体化を可能にするのではなく、株特異的な様式でホモ多量体の形成を確実にすることが有利であり得る。これは、２つ以上の複数のポリペプチドを含むＶＬＰをＶＬＰのコアとして使用することによって達成され得、各複数のポリペプチドは異なる抗原に結合している。あるいは、ＶＬＰは、異なる抗原間の三量体形成を防止する効果を有する、ノブインホール突然変異又は分子内ジスルフィド突然変異などの１つ又は複数の対称性破壊突然変異を用いて操作され得る。その場合、ＶＬＰは、異なる株由来の多量体抗原をＶＬＰ上の対称的に等価な位置に提示するが、ＶＬＰ上の各位置は、同じ株由来のホモ多量体によって占められており、株間ヘテロマー抗原の割合はわずかである。場合によっては、抗原自体を、株間ヘテロ多量体化を防止するように遺伝子操作することができる。一実施形態では、ＶＬＰは、保存された構造を有するが異なる抗原性を有する２つの抗原性タンパク質、例えば株１ Ｆタンパク質及び株２ Ｆタンパク質、又はｈＭＰＶ Ｆタンパク質及び非ｈＭＰＶ抗原性タンパク質のヘテロ多量体化を防止するように操作される。さらに、混合ＶＬＰが作製され、抗原が融合タンパク質として提示される場合、融合タンパク質は、異なる抗原性ドメインを有するＶＬＰのコアを形成するために使用される同一の（又は同等の）ドメインを共有するので、ＶＬＰは３つ以上の異なるタンパク質を含み、各抗原に対して１つがＶＬＰ上に提示される。
結合モダリティ（リンカー）
本開示のＶＬＰは、遺伝子融合として、又は本明細書に開示される他の手段を含む様々な方法で抗原性タンパク質を提示する。本明細書で使用される場合、「に連結された」又は「に結合された」は、２つのポリペプチドを会合させるための当技術分野で公知の任意の手段を意味する。会合は、直接的又は間接的、可逆的又は不可逆的、弱い又は強い、共有結合性又は非共有結合性、及び選択的又は非選択的であり得る。
いくつかの実施形態では、結合は、ＶＬＰを構成する複数のポリペプチドのうちの１つに対する抗原のＮ末端又はＣ末端融合物を作製するための遺伝子操作によって達成される。したがって、ＶＬＰは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の複数の抗原を提示する１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の複数のポリペプチドからなる、又は本質的になることができ、複数の抗原の少なくとも１つは、複数のポリペプチドの少なくとも１つに遺伝子的に融合している。場合によっては、ＶＬＰは、自己集合することができ、それに遺伝的に融合された複数の抗原性タンパク質を含む１つの複数のポリペプチドから本質的になる。場合によっては、ＶＬＰは、複数の抗原を含む第１の複数のポリペプチド；及び２成分ＶＬＰに共集合することができる第２の複数のポリペプチドから本質的になり、一方の複数のポリペプチドは抗原性タンパク質をＶＬＰに結合し、他方の複数のポリペプチドはＶＬＰの自己集合を促進する。
いくつかの実施形態では、結合は、１つ又は複数のポリペプチドと１つ又は複数の抗原性タンパク質との間の翻訳後共有結合によって達成される。場合によっては、化学的架橋を使用して、抗原をＶＬＰポリペプチドに非特異的に結合させる。場合によっては、化学的架橋を使用して、抗原性タンパク質をＶＬＰポリペプチド（例えば、第１のポリペプチド又は第２のポリペプチド）に特異的に結合させる。クリックケミストリー及び他の方法などの様々な特異的及び非特異的架橋化学が当技術分野で公知である。一般に、２つのタンパク質を連結するために使用される任意の架橋化学を、本開示のＶＬＰでの使用に適合させることができる。特に、免疫コンジュゲート又は抗体薬物コンジュゲートの作製に使用される化学物質を使用してもよい。場合によっては、切断可能又は切断不可能なリンカーを使用してＶＬＰを作製する。抗原を担体にコンジュゲートするためのプロセス及び方法は、例えば、米国特許出願公開第２００８／０１４５３７３号によって提供される。
一実施形態では、結合は、１つ又は複数のポリペプチドと１つ又は複数の抗原との間の非共有結合によって達成される。場合によっては、抗原性タンパク質は、少なくとも１つの表面上で負に帯電するように操作され、コアポリペプチドは、少なくとも１つの表面上で正に帯電するように、又はそれぞれ正及び負に帯電するように操作される。これにより、静電気力による抗原性タンパク質とコアポリペプチドとの分子間会合が促進される。場合によっては、抗原タンパク質のコアへの結合を引き起こすために、形状相補性が用いられる。形状相補性は、既存のものであっても、合理的に設計されていてもよい。場合によっては、結合を達成するために、タンパク質－タンパク質界面の計算設計が使用される。一実施形態では、抗原はビオチン標識されており、ポリペプチドはストレプトアビジンを含むか、又はその逆である。一実施形態では、ストレプトアビジンは、遺伝子融合によって、又はさもなければコアの４倍軸上の四量体として提示され、ビオチン標識抗原は単量体、二量体又は四量体であり、抗原の天然の多量体化に適した構成でコアとの会合を可能にする。場合によっては、抗原性タンパク質を捕捉するためにタンパク質ベースのアダプターが使用される。場合によっては、ポリペプチドは、抗原性タンパク質に融合された相補的タンパク質に結合することができるタンパク質に融合される。
ｈＭＰＶ Ｆに対する免疫反応は、コアに対する外部ドメインの配向を変化させることによって制御され得る。抗原性タンパク質がＶＬＰのコアにどのように結合するかに応じて、抗原性タンパク質は様々な向きで提示され得る。いくつかの実施形態では、抗原性タンパク質は、１つ又は複数の既知のエピトープが抗原性タンパク質の遠位端に配向されるか、又は遠位端に向かって配向されるように、これらのエピトープが免疫系に優先的にアクセス可能であるように提示される。場合によっては、配向は、ウイルスに対するウイルスタンパク質の配向を再現する。配向の選択は、免疫系を一方又は他方のエピトープに向けることができる。
いくつかの実施形態では、エピトープ優先性は、抗原性タンパク質のアミノ酸配列に含まれるＶＬＰのポリペプチドのいずれかのアミノ酸配列の所定の位置でのＮ結合グリカン配列モチーフＮ－Ｘ－［Ｔ／Ｓ］の付加又は減算によるＶＬＰ上のグリカンの配置などの他の手段による制御である。
場合によっては、近位端から遠位端までの中間距離に見られるエピトープは、ＶＬＰの全体的な幾何学的形状、表面疎水性、表面電荷、及び対象に内因的に存在するタンパク質又はワクチン組成物に外因的に提供されるタンパク質の競合的結合を含むがこれらに限定されない様々な考慮事項に応じて、より遠位に位置するエピトープよりも好ましい。本開示は、タンパク質構造の合理的な設計の全ての既知の方法を包含し、上記は限定することを意図しない。
ＶＬＰポリペプチド配列
本開示のポリペプチドは、様々なアミノ酸配列のいずれかを有し得る。米国特許出願公開第２０１５／０３５６２４０号は、タンパク質集合体を設計するための様々な方法を記載している。米国特許出願公開第２０１６／０１２２３９２号に記載されているように、国際特許出願公開第２０１４／１２４３０１号には、配列番号１～５１の単離ポリペプチドが、正二十面体粒子などのＶＬＰを形成するために対で自己集合する能力について設計された。この設計は、ＶＬＰを形成するために集合することができるポリペプチド対の各メンバーに適した界面残基の設計を含んでいた。そのように形成されたＶＬＰは、第１の集合体及び第２の集合体を正二十面体対称性を有するものなどのＶＬＰに配向させる対称的に繰り返される非天然の非共有結合性ポリペプチド－ポリペプチド界面を含む。したがって、一実施形態では、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチド（すなわち、ＶＬＰのコアの２つのポリペプチド）は、配列番号１～５１からなる群から選択される。いずれの場合も、全長タンパク質中に存在するが、融合を行うために除去され得るＮ末端メチオニン残基は、配列に含まれない。表１中の同定された残基は、Ｎ末端メチオニン（図示せず）で始まって番号付けされている。様々な実施形態において、１つ又は複数のさらなる残基がＮ末端から欠失され、及び／又はさらなる残基がＮ末端に付加される（例えば、らせん状の延長部を形成する）。
表１は、本開示の実施形態の第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドのアミノ酸配列を提供する。いずれの場合も、配列の対は共に、正二十面体対称性を有するＩ５３多量体を形成する。表１の右側の列は、得られた集合ウイルス様粒子の界面に存在すると同定された各例示的ポリペプチド中の残基番号を同定する（すなわち、「識別された界面残基」）。図から分かるように、配列番号１～３４の例示的なポリペプチドの界面残基の数は４～１３の範囲である。様々な実施形態では、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは、配列番号１～３４からなる群から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列と、その長さにわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であり、（所与のポリペプチドの界面残基の数に応じて）少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又は１３個の同定された界面位置が同一であるアミノ酸配列を含む。配列番号３５～５１は、本開示の実施形態からの第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドの他のアミノ酸配列を表す。他の実施形態では、第１のポリペプチド及び／又は第２のポリペプチドは、配列番号１～５１からなる群から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列と、その長さにわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であり、同定された界面位置の少なくとも２０％、２５％、３３％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
一般にタンパク質の場合のように、ポリペプチドは、ウイルス様粒子へのその後の集合を破壊することなく、設計された配列におけるいくらかの変異に耐えると予想される（特にそのような変異が保存的アミノ酸置換を含む場合）。本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」とは：疎水性アミノ酸（Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ）は、他の疎水性アミノ酸でのみ置換され得ること；かさ高い側鎖を有する疎水性アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）は、かさ高い側鎖を有する他の疎水性アミノ酸でのみ置換され得ること；正に荷電した側鎖を有するアミノ酸（Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ）は、正に荷電した側鎖を有する他のアミノ酸でのみ置換され得ること；負に荷電した側鎖を有するアミノ酸（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）は、負に荷電した側鎖を有する他のアミノ酸でのみ置換され得ること；及び、極性非荷電側鎖を有するアミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ）は、極性非荷電側鎖を有する他のアミノ酸でのみ置換され得ることを意味する。
本発明のＶＬＰの様々な実施形態では、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチド、又はその逆は、以下の対又はその改変バージョンから選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む（すなわち、本発明のポリペプチドについて開示されるような許容される改変：以下の配列番号によって示されるアミノ酸配列に対して、その長さにわたって少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも１００％、及び／又は少なくとも１つの同定された界面位置において同一であるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド）：
配列番号１及び配列番号２（Ｉ５３－３４Ａ及びＩ５３－３４Ｂ）；
配列番号３及び配列番号４（Ｉ５３－４０Ａ及びＩ５３－４０Ｂ）；
配列番号３及び配列番号２４（Ｉ５３－４０Ａ及びＩ５３－４０Ｂ．１）；
配列番号２３及び配列番号４（Ｉ５３－４０Ａ．１及びＩ５３－４０Ｂ）；
配列番号３５及び配列番号３６（Ｉ５３－４０Ａ属及びＩ５３－４０Ｂ属）；
配列番号５及び配列番号６（Ｉ５３－４７Ａ及びＩ５３－４７Ｂ）；
配列番号５及び配列番号２７（Ｉ５３－４７Ａ及びＩ５３－４７Ｂ．１）；
配列番号５及び配列番号２８（Ｉ５３－４７Ａ及びＩ５３－４７Ｂ．１ＮｅｇＴ２）；
配列番号２５及び配列番号６（Ｉ５３－４７Ａ．１及びＩ５３－４７Ｂ）；
配列番号２５及び配列番号２７（Ｉ５３－４７Ａ．１及びＩ５３－４７Ｂ．１）；
配列番号２５及び配列番号２８（Ｉ５３－４７Ａ．１及びＩ５３－４７Ｂ．１ＮｅｇＴ２）；
配列番号２６及び配列番号６（Ｉ５３－４７Ａ．１ＮｅｇＴ２及びＩ５３－４７Ｂ）；
配列番号２６及び配列番号２７（Ｉ５３－４７Ａ．１ＮｅｇＴ２及びＩ５３－４７Ｂ．１）；
配列番号２６及び配列番号２８（Ｉ５３－４７Ａ．１ＮｅｇＴ２及びＩ５３－４７Ｂ．１ＮｅｇＴ２）；
配列番号３７及び配列番号３８（Ｉ５３－４７Ａ属及びＩ５３－４７Ｂ属）；
配列番号７及び配列番号８（Ｉ５３－５０Ａ及びＩ５３－５０Ｂ）；
配列番号７及び配列番号３２（Ｉ５３－５０Ａ及びＩ５３－５０Ｂ．１）；
配列番号７及び配列番号３３（Ｉ５３－５０Ａ及びＩ５３－５０Ｂ．１ＮｅｇＴ２）；
配列番号７及び配列番号３４（Ｉ５３－５０Ａ及びＩ５３－５０Ｂ．４ＰｏｓＴ１）；
配列番号２９及び配列番号８（Ｉ５３－５０Ａ．１及びＩ５３－５０Ｂ）；
配列番号２９及び配列番号３２（Ｉ５３－５０Ａ．１及びＩ５３－５０Ｂ．１）；
配列番号２９及び配列番号３３（Ｉ５３－５０Ａ．１及びＩ５３－５０Ｂ．１ＮｅｇＴ２）；
配列番号２９及び配列番号３４（Ｉ５３－５０Ａ．１及びＩ５３－５０Ｂ．４ＰｏｓＴ１）；
配列番号３０及び配列番号８（Ｉ５３－５０Ａ．１ＮｅｇＴ２及びＩ５３－５０Ｂ）；
配列番号３０及び配列番号３２（Ｉ５３－５０Ａ．１ＮｅｇＴ２及びＩ５３－５０Ｂ．１）；
配列番号３０及び配列番号３３（Ｉ５３－５０Ａ．１ＮｅｇＴ２及びＩ５３－５０Ｂ．１ＮｅｇＴ２）；
配列番号３０及び配列番号３４（Ｉ５３－５０Ａ．１ＮｅｇＴ２及びＩ５３－５０Ｂ．４ＰｏｓＴ１）；
配列番号３１及び配列番号８（Ｉ５３－５０Ａ．１ＰｏｓＴ１及びＩ５３－５０Ｂ）；
配列番号３１及び配列番号３２（Ｉ５３－５０Ａ．１ＰｏｓＴ１及びＩ５３－５０Ｂ．１）；
配列番号３１及び配列番号３３（Ｉ５３－５０Ａ．１ＰｏｓＴ１及びＩ５３－５０Ｂ．１ＮｅｇＴ２）；
配列番号３１及び配列番号３４（Ｉ５３－５０Ａ．１ＰｏｓＴ１及びＩ５３－５０Ｂ．４ＰｏｓＴ１）；
配列番号３９及び配列番号４０（Ｉ５３－５０Ａ属及びＩ５３－５０Ｂ属）；
配列番号９及び配列番号１０（Ｉ５３－５１Ａ及びＩ５３－５１Ｂ）；
配列番号１１及び配列番号１２（Ｉ５２－０３Ａ及びＩ５２－０３Ｂ）；
配列番号１３及び配列番号１４（Ｉ５２－３２Ａ及びＩ５２－３２Ｂ）；
配列番号１５及び配列番号１６（Ｉ５２－３３Ａ及びＩ５２－３３Ｂ）
配列番号１７及び配列番号１８（Ｉ３２－０６Ａ及びＩ３２－０６Ｂ）；
配列番号１９及び配列番号２０（Ｉ３２－１９Ａ及びＩ３２－１９Ｂ）；
配列番号２１及び配列番号２２（Ｉ３２－２８Ａ及びＩ３２－２８Ｂ）；
配列番号２３及び配列番号２４（Ｉ５３－４０Ａ．１及びＩ５３－４０Ｂ．１）；
配列番号４１及び配列番号４２（Ｔ３２－２８Ａ及びＴ３２－２８Ｂ）；
配列番号４３及び配列番号４４（Ｔ３３－０９Ａ及びＴ３３－０９Ｂ）；
配列番号４５及び配列番号４６（Ｔ３３－１５Ａ及びＴ３３－１５Ｂ）；
配列番号４７及び配列番号４８（Ｔ３３－２１Ａ及びＴ３３－２１Ｂ）；
配列番号４９及び配列番号５０（Ｔ３３－２８Ａ及びＴ３２－２８Ｂ）；並びに
配列番号５１及び配列番号４４（Ｔ３３－３１Ａ及びＴ３３－０９Ｂ（Ｔ３３－３１Ｂとも呼ばれる））
いくつかの実施形態では、１つ又は複数のｈＭＰＶ Ｆタンパク質又はその抗原性断片は、第１の多量体化ドメインとの融合タンパク質として発現される。いくつかの実施形態では、第１の多量体化ドメイン及びｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、リンカー配列によって連結される。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、フォルドンを含み、フォルドン配列が、ＥＫＡＡＫＡＥＥＡＡＲＫ（配列番号１２５）である。
本開示のタンパク質ベースのＶＬＰに有用な設計されたタンパク質複合体の非限定的な例には、米国特許第９，６３０，９９４号；ＷＯ２０１８１８７３２５；米国特許出願公開番号２０１８／０１３７２３４；米国特許出願公開番号２０１９／０１５５９８８に開示されているものが含まれる（その各々はその全体が本明細書に組み込まれる）。
本開示のＶＬＰの様々な実施形態では、多量体化ドメインは、以下の対又はその改変バージョンから選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである（すなわち、本発明のポリペプチドについて開示されるような許容される改変：以下の配列番号によって示されるアミノ酸配列に対して、その長さにわたって少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも１００％、及び／又は少なくとも１つの同定された界面位置において同一であるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド）：
配列番号１３５及び配列番号１３６（Ｔ３３＿ｄｎ２Ａ及びＴ３３＿ｄｎ２Ｂ）；
配列番号１３７及び配列番号１３８（Ｔ３３＿ｄｎ５Ａ及びＴ３３＿ｄｎ５Ｂ）；
配列番号１３９及び配列番号１４０（Ｔ３３＿ｄｎ１０Ａ及びＴ３３＿ｄｎ１０Ｂ）；又は
配列番号１４１及び配列番号１４２（Ｉ５３＿ｄｎ５Ａ及びＩ５３＿ｄｎ５Ｂ）。
抗原性タンパク質
本開示は、ヒト又は動物（特にペット、農業動物、及び疾患の伝播に関連する任意の動物）におけるｈＭＰＶのためのタンパク質ベースのＶＬＰワクチンを提供する。本開示は、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質の任意の抗原性フラグメント（例えば、外部ドメイン又はその抗原性断片）のＶＬＰワクチンへの組込みに関する。ガイダンスは、感染又はワクチン接種に対する免疫応答の研究、例えば、結合又は中和抗体の単離、Ｆタンパク質配列の遺伝子分析、抗原性タンパク質及び抗体の構造研究、最も具体的にはサブユニットワクチンによる臨床的及び獣医学的経験から特に利用可能である。ｈＭＰＶのためのサブユニットワクチンは、上記で提供された提示モダリティを使用することによって、本開示のＶＬＰと共に使用するために適合させることができる。本開示はｈＭＰＶ Ｆの外部ドメインに言及するが、膜貫通ドメインの一部が含まれ得ることが理解されるであろう。
「抗原性断片」という用語は、インビボでタンパク質に対する免疫応答（体液性又はＴ細胞応答）を生成するタンパク質の任意の断片を指す。抗原性断片は、線状エピトープ、不連続エピトープ、又は立体配座エピトープ（例えば、折り畳まれたドメイン）であり得る。抗原性断片は、全長タンパク質の二次、三次及び／又は四次構造を保存し得る。いくつかの実施形態では、抗原性断片は中和エピトープを含む。そのような場合、ＶＬＰは中和抗体応答を生じ得る。抗原性断片は、二次構造を予測し、Ｎ末端若しくはＣ末端の非構造化領域若しくは内部ループ、又は構造要素全体（アルファらせん状及び／又はベータシート）を合理的に除去することなどによって、計算的に設計され得る。図２は、例示的な二次構造マップを提供する。いくつかの実施形態では、外部ドメインは、Ｎ末端シグナルペプチド（例えば、ＭＳＷＫＶＶＩＩＦＳＬＬＩＴＰＱＨＧＬ（配列番号１３３）又はＭＳＷＫＶＭＩＩＩＳＬＬＩＴＰＱＨＧＬ（配列番号１３４）の一部又は全部の切断又は欠失を含む。
いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、Ｃ末端切断型である。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメイン配列は、天然配列の残基４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、又は４９０で終結する。
Ａ株ｈＭＰＶ Ｆタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＹ１４５２９７）の天然配列を以下に示し、シグナル配列に下線及び斜線を付し、膜貫通部分及び細胞内部分に下線を付している（配列番号５６）：
１ ＭＳＷＫＶＶＩＩＦＳ ＬＬＩＴＰＱＨＧＬＫ ＥＳＹＬＥＥＳＣＳＴ ＩＴＥＧＹＬＳＶＬＲ
４１ ＴＧＷＹＴＮＶＦＴＬ ＥＶＧＤＶＥＮＬＴＣ ＳＤＧＰＳＬＩＫＴＥ ＬＤＬＴＫＳＡＬＲＥ
８１ ＬＫＴＶＳＡＤＱＬＡ ＲＥＥＱＩＥＮＰＲＱ ＳＲＦＶＬＧＡＩＡＬ ＧＶＡＴＡＡＡＶＴＡ
１２１ ＧＶＡＩＡＫＴＩＲＬ ＥＳＥＶＴＡＩＫＮＡ ＬＫＴＴＮＥＡＶＳＴ ＬＧＮＧＶＲＶＬＡＴ
１６１ ＡＶＲＥＬＫＤＦＶＳ ＫＮＬＴＲＡＩＮＫＮ ＫＣＤＩＤＤＬＫＭＡ ＶＳＦＳＱＦＮＲＲＦ
２０１ ＬＮＶＶＲＱＦＳＤＮ ＡＧＩＴＰＡＩＳＬＤ ＬＭＴＤＡＥＬＡＲＡ ＶＳＮＭＰＴＳＡＧＱ
２４１ ＩＫＬＭＬＥＮＲＡＭ ＶＲＲＫＧＦＧＩＬＩ ＧＶＹＧＳＳＶＩＹＭ ＶＱＬＰＩＦＧＶＩＤ
２８１ ＴＰＣＷＩＶＫＡＡＰ ＳＣＳＧＫＫＧＮＹＡ ＣＬＬＲＥＤＱＧＷＹ ＣＱＮＡＧＳＴＶＹＹ
３２１ ＰＮＥＫＤＣＥＴＲＧ ＤＨＶＦＣＤＴＡＡＧ ＩＮＶＡＥＱＳＫＥＣ ＮＩＮＩＳＴＴＮＹＰ
３６１ ＣＫＶＳＴＧＲＨＰＩ ＳＭＶＡＬＳＰＬＧＡ ＬＶＡＣＹＫＧＶＳＣ ＳＩＧＳＮＲＶＧＩＩ
４０１ ＫＱＬＮＫＧＣＳＹＩ ＴＮＱＤＡＤＴＶＴＩ ＤＮＴＶＹＱＬＳＫＶ ＥＧＥＱＨＶＩＫＧＲ
４４１ ＰＶＳＳＳＦＤＰＩＫ ＦＰＥＤＱＦＮＶＡＬ ＤＱＶＦＥＮＩＥＮＳ ＱＡＬＶＤＱＳＮＲＩ
４８１ ＬＳＳＡＥＫＧＮＴＧ ＦＩＩＶＩＩＬＩＡＶ ＬＧＳＳＭＩＬＶＳＩ ＦＩＩＩＫＫＴＫＫＰ
５２１ ＴＧＡＰＰＥＬＳＧＶ ＴＮＮＧＦＩＰＨＳ（配列番号５６）
天然シグナル配列は、タンパク質が発現されると翻訳後に切断される。天然シグナル配列は、外部ドメインの発現のための別のシグナル配列で置き換えられ得るか、又はいくつかの実施形態では、シグナル配列は使用されない。したがって、いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、配列番号５７、又はその変異体である。
１ Ｋ ＥＳＹＬＥＥＳＣＳＴ ＩＴＥＧＹＬＳＶＬＲ
４１ ＴＧＷＹＴＮＶＦＴＬ ＥＶＧＤＶＥＮＬＴＣ ＳＤＧＰＳＬＩＫＴＥ ＬＤＬＴＫＳＡＬＲＥ
８１ ＬＫＴＶＳＡＤＱＬＡ ＲＥＥＱＩＥＮＰＲＱ ＳＲＦＶＬＧＡＩＡＬ ＧＶＡＴＡＡＡＶＴＡ
１２１ ＧＶＡＩＡＫＴＩＲＬ ＥＳＥＶＴＡＩＫＮＡ ＬＫＴＴＮＥＡＶＳＴ ＬＧＮＧＶＲＶＬＡＴ
１６１ ＡＶＲＥＬＫＤＦＶＳ ＫＮＬＴＲＡＩＮＫＮ ＫＣＤＩＤＤＬＫＭＡ ＶＳＦＳＱＦＮＲＲＦ
２０１ ＬＮＶＶＲＱＦＳＤＮ ＡＧＩＴＰＡＩＳＬＤ ＬＭＴＤＡＥＬＡＲＡ ＶＳＮＭＰＴＳＡＧＱ
２４１ ＩＫＬＭＬＥＮＲＡＭ ＶＲＲＫＧＦＧＩＬＩ ＧＶＹＧＳＳＶＩＹＭ ＶＱＬＰＩＦＧＶＩＤ
２８１ ＴＰＣＷＩＶＫＡＡＰ ＳＣＳＧＫＫＧＮＹＡ ＣＬＬＲＥＤＱＧＷＹ ＣＱＮＡＧＳＴＶＹＹ
３２１ ＰＮＥＫＤＣＥＴＲＧ ＤＨＶＦＣＤＴＡＡＧ ＩＮＶＡＥＱＳＫＥＣ ＮＩＮＩＳＴＴＮＹＰ
３６１ ＣＫＶＳＴＧＲＨＰＩ ＳＭＶＡＬＳＰＬＧＡ ＬＶＡＣＹＫＧＶＳＣ ＳＩＧＳＮＲＶＧＩＩ
４０１ ＫＱＬＮＫＧＣＳＹＩ ＴＮＱＤＡＤＴＶＴＩ ＤＮＴＶＹＱＬＳＫＶ ＥＧＥＱＨＶＩＫＧＲ
４４１ ＰＶＳＳＳＦＤＰＩＫ ＦＰＥＤＱＦＮＶＡＬ ＤＱＶＦＥＮＩＥＮＳ ＱＡＬＶＤＱＳＮＲＩ
４８１ ＬＳＳＡＥＫＧＮＴＧ Ｆ
５２１ （配列番号５７）
いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、配列番号５７又はその抗原性断片と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を共有する。
さらなるｈＭＰＶ Ｆタンパク質配列を表２に提供する。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、表２の外部ドメイン又はその抗原性断片と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を共有する。
様々なシグナル配列を使用することができ、天然外部ドメイン配列と対にすることができ、又は異なるｈＭＰＶ配列間で交換することができる。したがって、いくつかの実施形態では、抗原は、表２のシグナル配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を共有する配列を含む。
ｈＭＰＶ Ｆタンパク質は、１つ又は複数の置換を含んでもよい。
例示的な置換としては、配列番号５７に対するＡ１８５Ｐ、Ｑ１００Ｒ、Ｓ１０１Ｒ、Ｔ１２７Ｃ、Ｎ１５３Ｃ、Ｖ８４Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ａ２４９Ｃ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、Ｒ１０２Ｇ、Ａ６３Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｋ４５０Ｃ、Ｓ４７０Ｃ、Ｇ１０６欠失、Ａ１１３Ｃ、Ａ１２０Ｃ、Ａ３３９Ｃ、Ｑ４２６Ｃ、Ｔ１６０Ｆ、Ｑ１００Ｋ、Ｓ１０１Ａ、Ｉ１７７Ｌ、Ｋ４５０Ａ、Ｓ４７０Ａ、Ｇ２９４Ｅ、Ｔ３６５Ｃ、Ｖ４６３Ｃ、Ｌ２１９Ｋ、Ｈ３６８Ｎ、及び／又はＶ２３１Ｉが挙げられる。したがって、様々な実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、このリストから選択される１つ又は複数の置換を含む。
例示的な置換としては、配列番号５７に対するＶ８４Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、Ｒ１０２Ｇ、Ａ６３Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｋ４５０Ｃ、Ｓ４７０Ｃ、Ｒ９９Ｇ、Ａ１１３Ｃ、Ａ１２０Ｃ、Ａ３３９Ｃ、Ｑ４２６Ｃ、Ｔ１６０Ｆ、Ｑ１００Ｋ、Ｓ１０１Ａ、Ｑ１００Ｒ、Ｓ１０１Ｒ、Ｇ１０６欠失、Ｓ１０１Ｒ、Ａ１８５Ｐ、Ｉ１７７Ｌ、及びＧ２９４Ｅが挙げられる。したがって、様々な実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、このリストから選択される１つ又は複数の置換を含む。
例示的な置換としては、Ｖ８４Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、Ｒ１０２Ｇ、Ａ６３Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｋ４５０Ｃ、Ｓ４７０Ｃ、Ｒ９９Ｇ、Ａ１１３Ｃ、Ａ１２０Ｃ、Ａ３３９Ｃ、Ｑ４２６Ｃ、Ｔ１６０Ｆ、Ｑ１００Ｋ、Ｓ１０１Ａ、Ｑ１００Ｒ、Ｓ１０１Ｒ、Ｇ１０６欠失、Ｓ１０１Ｒ、Ａ１８５Ｐ、Ｉ１７７Ｌ、及びＧ２９４Ｅが挙げられる。したがって、様々な実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、このリストから選択される２つ以上の置換を含む。
例示的な置換としては、Ａ１８５Ｐ、Ｑ１００Ｒ、Ｓ１０１Ｒ、Ｔ１２７Ｃ、Ｎ１５３Ｃ、Ｔ３６５Ｃ、Ｖ４６３Ｃ、Ｌ２１９Ｋ、Ｖ２３１Ｉ、Ｇ２９４Ｅ、Ｎ１５３Ｃ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、及びＲ１０２Ｇが挙げられる。したがって、様々な実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、このリストから選択される１つ又は複数の置換を含む。
例示的な置換としては、Ａ１８５Ｐ、Ｑ１００Ｒ、Ｓ１０１Ｒ、Ｔ１２７Ｃ、Ｎ１５３Ｃ、Ｔ３６５Ｃ、Ｖ４６３Ｃ、Ｌ２１９Ｋ、Ｖ２３１Ｉ、Ｇ２９４Ｅ、Ｎ１５３Ｃ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、及びＲ１０２Ｇが挙げられる。したがって、様々な実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、このリストから選択される２つ以上の置換を含む。
いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、置換Ｑ１００Ｒ及びＳ１０１Ｒを含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、置換Ａ１８５Ｐ、Ｑ１００Ｒ、及びＳ１０１Ｒを含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、置換Ａ１８５Ｐ、Ｔ１２７Ｃ、Ｎ１５３Ｃ、Ｑ１００Ｒ、及びＳ１０１Ｒを含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、置換Ｖ８４Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ａ２４９Ｃ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、及びＲ１０２Ｇを含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、置換Ａ６３Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｋ４５０Ｃ、Ｓ４７０Ｃ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、及びＲ１０２Ｇを含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、置換及び欠失Ａ６３Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｇ１０６欠失、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、及びＲ１０２Ｇを含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、置換Ａ１１３Ｃ、Ａ１２０Ｃ、Ａ３３９Ｃ、Ｑ４２６Ｃ、Ｔ１６０Ｆ、Ｉ１７７Ｌ、Ｑ１００Ｋ、及びＳ１０１Ａを含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、置換Ｖ８４Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ａ２４９Ｃ、Ｑ１００Ｒ、及びＳ１０１Ｒを含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、置換Ａ６３Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｋ４５０Ｃ、Ｓ４７０Ｃ、Ｑ１００Ｒ、及びＳ１０１Ｒを含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、置換及び欠失Ａ６３Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｇ１０６欠失、Ｑ１００Ｒ、及びＳ１０１Ｒを含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、置換Ａ１１３Ｃ、Ａ１２０Ｃ、Ａ３３９Ｃ、Ｑ４２６Ｃ、Ｔ１６０Ｆ、Ｉ１７７Ｌ、Ｑ１００Ｒ、及びＳ１０１Ｒを含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、置換Ａ１８５Ｐ、Ａ１１３Ｃ、Ａ３３９Ｃ、Ｑ１００Ｒ、及びＳ１０１Ｒを含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、置換Ａ１８５Ｐ、Ｔ１６０Ｆ、Ｉ１７７Ｌ、Ｑ１００Ｒ、及びＳ１０１Ｒを含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、置換Ａ１８５Ｐ、Ａ１１３Ｃ、Ａ３３９Ｃ、Ｔ１６０Ｆ、Ｉ１７７Ｌ、Ｑ１００Ｒ、及びＳ１０１Ｒを含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、置換Ａ６３Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、及びＲ１０２Ｇを含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、置換Ａ６３Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｋ４５０Ａ、Ｓ４７０Ａ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、及びＲ１０２Ｇを含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、置換Ａ６３Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｇ２９４Ｅ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、及びＲ１０２Ｇを含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、置換Ａ６３Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｋ４５０Ｃ、Ｓ４７０Ｃ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、Ｒ１０２Ｇ、及びＧ２９４Ｅを含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、置換Ａ６３Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、Ｒ１０２Ｇ、及びＧ２９４Ｅを含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、置換Ｔ１２７Ｃ、Ｎ１５３Ｃ、Ｔ３６５Ｃ、Ｖ４６３Ｃ、Ａ１８５Ｐ、Ｌ２１９Ｋ、Ｖ２３１Ｉ、Ｇ２９４Ｅ、Ｈ３６８Ｎ、Ｑ１００Ｒ、及びＳ１０１Ｒを含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、置換Ａ６３Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｋ４５０Ｃ、Ｓ４７０Ｃ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、及びＲ１０２Ｇを含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、置換Ｖ８４Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ａ２４９Ｃ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、及びＲ１０２Ｇを含む。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、置換Ｔ１２７Ｃ、Ｎ１５３Ｃ、Ｔ３６５Ｃ、Ｖ４６３Ｃ、Ａ１８５Ｐ、Ｌ２１９Ｋ、Ｖ２３１Ｉ、Ｇ２９４Ｅ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、Ｈ３６８Ｎ、及びＲ１０２Ｇを含む。
さらなる例示的なアミノ酸置換を表２に提供する。様々な実施形態において、外部ドメインは、表２に列挙される置換及び代替の置換から選択される１つ又は複数の置換を含む。いくつかの実施形態では、置換はＶＬＰに対して意図された効果を有し、意図された効果は、その置換を有するＶＬＰのすべての実施形態において達成されるわけではないことが理解される。いくつかの実施形態では、意図される効果は、産生細胞株における発現の増加である（Ｍａｓ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．１２：ｅ１００５８５９（２０１６））。いくつかの実施形態では、意図される効果は、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインの融合後形態又は融合前形態を安定化することである（Ｂａｔｔｌｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．８：１５２８（２０１７））。いくつかの実施形態では、意図される効果は、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質に対する中和抗体の結合である。抗原は、配列番号１４６～１７８に示されるように、Ｎ末端にロイシンをさらに含み得る。
したがって、いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインは、配列番号５８～９０又はその抗原性断片と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を共有する。
いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質は、１つ又は複数のフューリン切断部位、任意に１つ又は複数のコピーのＡｒｇ－Ｘ－Ｘ－Ａｒｇモチーフ（配列番号５２）、例えば天然配列ＲＱＳＲ（配列番号５４）を含む。フューリン切断部位がｈＭＰＶ外部ドメイン中に存在する場合、発現収率は、場合によっては、トランスフェクトされたプラスミドからの、又は宿主細胞中に安定に組み込まれたポリヌクレオチド配列からの、フューリン又はその機能的変異体の共発現によって増加し得る。いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質のフューリン切断部位は、ＲＱＳＲ（配列番号５４）モチーフをＲＲＲＲ（配列番号５５）に変異させることによって改変されるか、又はＧｌｙリンカーを置換することによって、又は他のアミノ酸置換を行うことによって除去される。
ｈＭＰＶ中和活性は、融合前及び融合後のＦタンパク質立体配座の両方を認識する抗体によって媒介され、インビボ免疫学的応答において生成された抗体は、融合前特異的部位又は融合後特異的部位のいずれかを選択的に認識することができるか、又はＦタンパク質の融合前形態及び融合後形態の両方を認識することができる。Ｂａｔｔｌｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．８：１５２８（２０１７）。ＤＳ７、ＭＰＶ１９６、ＭＰＶ２０１及びＭＰＶ３１４中和抗体は、Ｆタンパク質の融合前形態及び融合後形態の両方でアクセス可能な抗原部位に結合し、Ｆタンパク質のＤＩ及びＤＩＩヘッドドメイン上に位置する。Ｗｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９（４）：４６１－４６３（２０１２）；Ｂａｒ－Ｐｅｌｅｄ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．９３：ｅ００３４２－１９（２０１９））。ＭＰＥ８中和抗体は、ＤＩ、ＤＩＩ、及びＤＩＩＩサブユニットにわたるＦタンパク質上のエピトープに結合し、融合前Ｆ立体配座に依存して接触を形成する。Ｗｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２：１６２７２（２０１７）。例えば部位ＩＩＩ及び部位ＩＶエピトープなどのいくつかの抗原性エピトープが呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆタンパク質と共有されている（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：２７７８（２０１９））。これらは例であり、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質に対する中和抗体について記載されたエピトープの網羅的なリストではない。
中和エピトープは一般に立体配座エピトープであるので、エピトープに対応するペプチドは抗体に結合せず、したがって中和力価を誘導しない。中和抗体は、ｈＭＰＶに対して血清陽性である健康なドナーから単離することができ（Ｂａｔｔｌｅｓら）、又は動物モデルにおける免疫化によって作製することができる（Ｇａｂｒｉｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．８１（２）：６９８－７０７（２００７））。
いくつかの実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインを含む本開示のＶＬＰは、抗ｈＭＰＶ Ｆタンパク質抗体とも呼ばれるｈＭＰＶ Ｆタンパク質に対する中和抗体に結合することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＶＬＰは、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質の融合前形態に選択的に結合することが知られている抗ｈＭＰＶ Ｆタンパク質抗体に結合することができる。ｈＭＰＶ Ｆタンパク質の融合前形態に選択的に結合する抗体の例には、ＭＦ１０及びＭＰＥ８抗体が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＶＬＰは、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質の融合後形態に選択的に結合することが知られている抗ｈＭＰＶ Ｆタンパク質抗体に結合する。ｈＭＰＶ Ｆタンパク質の融合後形態に選択的に結合する抗体の例には、ＭＦ１、ＭＦ２、ＭＦ３、ＭＦ１１、ＭＦ１７、ＭＦ１８、及びＭＦ１９抗体が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＶＬＰは、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質の融合前形態と融合後形態の両方に結合する抗体に結合することができる。ｈＭＰＶ Ｆタンパク質の融合前形態及び融合後形態に結合する抗体の例としては、ＭＦ９、ＭＦ１２、ＭＦ１４、ＭＦ１５、ＭＦ１６及びＭＦ２０抗体が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＶＬＰは、１つ又は複数の抗ｈＭＰＶ Ｆタンパク質抗体に結合する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＶＬＰは、２つ以上の抗ｈＭＰＶ Ｆタンパク質抗体に結合する。
多量体化ドメイン及びリンカー
いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、第１の多量体化ドメインを含む第１のポリペプチド及び第２の多量体化ドメインを含む第１のポリペプチドを含む抗原の三量体集合体を含む。第１の多量体化ドメインは、３コピーの第１のポリペプチドを自己会合させて三量体構成要素を形成させるタンパク質－タンパク質界面を含む。２つ以上の成分を有するＶＬＰにおいて、第１の多量体化ドメインの各コピーは、第２の多量体化ドメイン上の相補的な表面露出界面と相互作用する表面露出界面をさらに含む。同様に述べると、第２の多量体化ドメインは、（第１の成分の第１のポリペプチドの）第１の多量体化ドメインと多量体化するように適合される。Ｋｉｎｇら（Ｎａｔｕｒｅ ５１０，１０３－１０８，２０１４）、Ｂａｌｅら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５３，３８９－３９４，２０１６）、並びに国際公開第２０１４１２４３０１号及び米国特許出願公開第２０１６０１２２３９２号に記載されているように、第１の多量体化ドメインと第２の多量体化ドメインとの間の相補的タンパク質－タンパク質界面は、複数のコピーの三量体集合体ドメイン及び第２の集合体ドメインの、標的ＶＬＰへの集合を駆動する。いくつかの実施形態では、ＶＬＰの三量体集合体ドメインの各コピーは、それに連結された抗原性タンパク質又はその抗原性断片（例えば、遺伝子融合として）を有する。これらのＶＬＰは、タンパク質を完全な結合価で提示する。他の実施形態では、本開示のＶＬＰは、抗原タンパク質又はその抗原性断片（例えば、遺伝子融合として）を担持する１つ又は複数のコピーの第１の多量体化ドメイン、並びに抗原性タンパク質を担持しない１つ又は複数の第１の多量体化ドメインを含む。これらのＶＬＰは、Ｇタンパク質を部分結合価で提示する。第１の多量体化ドメインは、三量体を形成し、第２の多量体化ドメインと相互作用して、標的ＶＬＰへの集合を駆動する任意のポリペプチド配列であり得る。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、米国特許第２０１３０２７４４４１号、米国特許出願公開第２０１５／０３５６２４０号、米国特許出願公開第２０１６／０１２２３９２号、国際公開第２０１８／１８７３２５号に開示されているものから選択される第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含み、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示のＶＬＰのいくつかの実施形態では、抗原性タンパク質及びＶＬＰのコアは、それらが両方とも一本鎖ポリペプチドとも呼ばれる単一ポリペプチド中に存在するように遺伝的に融合され得る。タンパク質とコアとの間の結合は、抗原性タンパク質又はその抗原性断片がＶＬＰの外側に提示されることを可能にする。したがって、コアとの接続点は、形成されたウイルス様粒子のコアの外側にあるべきである。多種多様なポリペプチド配列を使用して、タンパク質又はその抗原性断片とウイルス様粒子のコアとを連結することができる。場合によっては、リンカーはそのポリペプチド配列を含む。任意の適切なリンカーポリペプチドを使用することができる。いくつかの実施形態では、リンカーは、抗原性タンパク質（例えば外部ドメイン）又はその抗原性断片のコアに対する堅固な相対配向を課す。いくつかの実施形態では、リンカーは、抗原性タンパク質（例えば外部ドメイン）又はその抗原性断片をコアに柔軟に連結する。いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｆタンパク質の三量体型、例えばＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ（配列番号９１）又はその機能的変異体の安定化を助けるための追加の三量体化ドメイン（例えば、Ｔ４フィブリチンのフォルドンドメイン）を含む。
いくつかの実施形態では、リンカーは、任意の適切な長さのＧｌｙ－Ｓｅｒリンカー（すなわち、グリシン残基及びセリン残基からなるリンカー）を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれを超えるアミノ酸長であり得る。いくつかの実施形態では、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーは、ＧＳＧＧＳＧＳＧＳＧＧＳＧＳＧ（配列番号１２７）、ＧＧＳＧＧＳＧＳ（配列番号１２８）又はＧＳＧＧＳＧＳＧ（配列番号１２９）のアミノ酸配列を含み得るか、又はそれからなり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列ＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号１３０）を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号１３１）を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列ＧＳＧＧＳＧＳＧＳＧＧＳ（配列番号１２６）を含む。
本開示のＶＬＰのいくつかの実施形態では、第１の成分は、ポリ－Ｈｉｓタグ、ＨＨＨＨＨＨ（配列番号１４３）を任意に含み得る。
表３は、本明細書に記載のＶＬＰ配列の例示的な例を示す。配列は、多量体化ドメイン、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメイン、リンカー、ポリ－Ｈｉｓタグ及びシグナル配列を含む。シグナル及びポリ－Ｈｉｓタグ配列には下線が引かれており、任意に配列に含まれる。
ＶＬＰの集合体
いくつかの実施形態では、単一の成分がＶＬＰに自己集合する。いくつかの実施形態では、ＶＬＰの形成に使用するための第１及び第２の成分の１つ又は複数の精製試料を、水性条件でほぼ等モル比で混合する（例えば、Ｉ５３－５０Ａ／Ｂ等面体ＶＬＰ）。第１及び第２の成分は、（多量体化ドメインを介して、及び任意に外部ドメインを介して）互いに相互作用して、標的ＶＬＰの集合を駆動する。標的ＶＬＰの集合の成功は、サイズ排除クロマトグラフィ、天然（非変性）ゲル電気泳動、動的光散乱、多角度光散乱、分析超遠心分離、ネガティブ染色電子顕微鏡法、低温電子顕微鏡法、又はＸ線結晶学を含むがこれらに限定されない、タンパク質又はタンパク質集合体の物理的サイズを評価するために使用される一般的な生化学的又は生物物理学的方法によってインビトロ集合反応を分析することによって確認することができる。必要に応じて、サイズ排除クロマトグラフィ、分取超遠心分離、接線流濾過、又は分取ゲル電気泳動を含むがこれらに限定されない、それらの物理的サイズによってタンパク質を単離するために一般的に使用される分取技術を使用して、インビトロ集合反応に存在する他の種又は分子から集合したＶＬＰを精製することができる。ＶＬＰ中の抗原性タンパク質の存在は、限定するものではないが、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、質量分析、タンパク質配列決定、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法、又はアミノ酸分析を含む、水溶液中のタンパク質分子の同一性を決定するために一般的に使用される技術によって評価することができる。粒子の外部でのタンパク質の接近可能性、並びにその立体配座又は抗原性は、限定されないが、モノクローナル抗体、立体配座特異的モノクローナル抗体、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法、又は抗原に特異的な抗血清による結合を含む、抗原の存在及び立体配座を検出するために一般的に使用される技術によって評価することができる。
様々な実施形態では、本開示のＶＬＰは、遺伝子融合物として異なる抗原性タンパク質を有する２つ以上の異なる第１のポリペプチドを含む。これらのＶＬＰは、同じＶＬＰ上に複数の異なるタンパク質を共提示する。これらの多抗原ＶＬＰは、それぞれが多量体化ドメインを含む２つ以上の抗原の混合物を用いてインビトロ集合を行うことによって産生される。混合物中の各抗原の割合は、得られたＶＬＰ中の各抗原性タンパク質の平均価数を決定する。所与の試料中の各抗原の存在及び平均価は、全価ＶＬＰ中の抗原性タンパク質の存在を評価するための上記の技術を用いた定量分析によって評価することができる。
様々な実施形態では、ＶＬＰは、直径が約２０ナノメートル（ｎｍ）～約４０ｎｍであり、内部ルーメンが横約１５ｎｍ～約３２ｎｍであり、タンパク質シェルの孔径が最長寸法約１ｎｍ～約１４ｎｍである。
いくつかの実施形態では、ＶＬＰは正二十面体対称性を有する。そのような実施形態では、ＶＬＰは、６０コピーの第１の成分及び６０コピーの第２の成分を含み得る。１つのそのような実施形態において、各第１の集合体における同一の第１のポリペプチドの数は、各第２の集合体における同一の第１のポリペプチドの数とは異なる。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、１２個の第１の集合体及び２０個の第２の集合体を含む。そのような実施形態では、各第１の集合体は、例えば、５つのコピーの同一の第１の成分を含むことができ、各第２の集合体は、例えば、３つのコピーの同一の第２の成分を含むことができる。他の実施形態では、ＶＬＰは、１２個の第１の集合体及び３０個の第２の集合体を含む。そのような実施形態では、各第１の集合体は、例えば、５つのコピーの同一の第１の成分を含むことができ、各第２の集合体は、例えば、２つのコピーの同一の第２の成分を含むことができる。さらなる実施形態では、ＶＬＰは、２０個の第１の集合体及び３０個の第２の集合体を含む。この実施形態では、各第１の集合体は、例えば、３つのコピーの同一の第１の成分を含むことができ、各第２の集合体は、例えば、２つのコピーの同一の第２の成分を含むことができる。これらの実施形態のすべては、正二十面体対称性を有するタンパク質ベースのＶＬＰを形成することができる。
様々なさらなる実施形態では、第１及び第２の多量体化ドメインのオリゴマー状態は、以下の通りである。
Ｉ５３－３４Ａ：三量体＋Ｉ５３－３４Ｂ：五量体；
Ｉ５３－４０Ａ：五量体＋Ｉ５３－４０Ｂ：三量体；
Ｉ５３－４７Ａ：三量体＋Ｉ５３－４７Ｂ：五量体；
Ｉ５３－５０Ａ：三量体＋Ｉ５３－５０Ｂ：五量体；
Ｉ５３－５１Ａ：三量体＋Ｉ５３－５１Ｂ：五量体；
Ｉ３２－０６Ａ：二量体＋Ｉ３２－０６Ｂ：三量体；
Ｉ３２－１９Ａ：三量体＋Ｉ３２－１９Ｂ：二量体；
Ｉ３２－２８Ａ：三量体＋Ｉ３２－２８Ｂ：二量体；
Ｉ５２－０３Ａ：五量体＋Ｉ５２－０３Ｂ：二量体；
Ｉ５２－３２Ａ：二量体＋Ｉ５２－３２Ｂ：五量体；及び
Ｉ５２－３３Ａ：五量体＋Ｉ５２－３３Ｂ：二量体
いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドの第２の多量体化ドメインは、Ｉ５３－５０Ａ又はその変異体と少なくとも９５％の同一性を共有する配列を含む：
Ｉ５３－５０Ａ
１ ＭＥＥＬＦＫＫＨＫＩ ＶＡＶＬＲＡＮＳＶＥ ＥＡＩＥＫＡＶＡＶＦ ＡＧＧＶＨＬＩＥＩＴ
４１ ＦＴＶＰＤＡＤＴＶＩ ＫＡＬＳＶＬＫＥＫＧ ＡＩＩＧＡＧＴＶＴＳ ＶＥＱＣＲＫＡＶＥＳ
８１ ＧＡＥＦＩＶＳＰＨＬ ＤＥＥＩＳＱＦＣＫＥ ＫＧＶＦＹＭＰＧＶＭ ＴＰＴＥＬＶＫＡＭＫ
１２１ ＬＧＨＴＩＬＫＬＦＰ ＧＥＶＶＧＰＱＦＶＫ ＡＭＫＧＰＦＰＮＶＫ ＦＶＰＴＧＧＶＮＬＤ
１６１ ＮＶＣＥＷＦＫＡＧＶ ＬＡＶＧＶＧＳＡＬＶ ＫＧＴＰＤＥＶＲＥＫ ＡＫＡＦＶＥＫＩＲＧ
２０１ ＣＴＥ（配列番号１４４）
いくつかの実施形態では、第２の多量体化ドメインは、配列番号７若しくは配列番号１４４又はその抗原性断片と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を共有する。
Ｉ５３－５０Ａタンパク質配列は、２つのモノマー内ジスルフィド結合を有する。いくつかの実施形態では、システイン残基は、チオール基を含有しない残基（例えば、アラニン又はセリン）に変異している。チオール基の除去は、多量体化を損なわずに正しいタンパク質折り畳みを促進することができる。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドの多量体化ドメインは、本明細書中に示されるように、配列番号１４４に対して位置７４、９８、１６３及び２０１のうちの１つ又は複数にアミノ酸置換を含む：
Ｉ５３－５０Ａ
１ ＭＥＥＬＦＫＫＨＫＩ ＶＡＶＬＲＡＮＳＶＥ ＥＡＩＥＫＡＶＡＶＦ ＡＧＧＶＨＬＩＥＩＴ
４１ ＦＴＶＰＤＡＤＴＶＩ ＫＡＬＳＶＬＫＥＫＧ ＡＩＩＧＡＧＴＶＴＳ ＶＥＱＣＲＫＡＶＥＳ
８１ ＧＡＥＦＩＶＳＰＨＬ ＤＥＥＩＳＱＦＣＫＥ ＫＧＶＦＹＭＰＧＶＭ ＴＰＴＥＬＶＫＡＭＫ
１２１ ＬＧＨＴＩＬＫＬＦＰ ＧＥＶＶＧＰＱＦＶＫ ＡＭＫＧＰＦＰＮＶＫ ＦＶＰＴＧＧＶＮＬＤ
１６１ ＮＶＣＥＷＦＫＡＧＶ ＬＡＶＧＶＧＳＡＬＶ ＫＧＴＰＤＥＶＲＥＫ ＡＫＡＦＶＥＫＩＲＧ
２０１ ＣＴＥ（配列番号１４４）
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドの多量体化ドメインは、配列番号１３２に対するＣ７４Ａ、Ｃ９８Ａ、Ｃ１６３Ａ及びＣ２０１Ａのうちの１つ又は複数のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドの多量体化ドメインは、配列番号１３２又はその変異体を含む。
Ｉ５３－５０Ａ－Δｃｙｓ（ジスルフィド非含有形態）
１ ＭＥＥＬＦＫＫＨＫＩ ＶＡＶＬＲＡＮＳＶＥ ＥＡＩＥＫＡＶＡＶＦ ＡＧＧＶＨＬＩＥＩＴ
４１ ＦＴＶＰＤＡＤＴＶＩ ＫＡＬＳＶＬＫＥＫＧ ＡＩＩＧＡＧＴＶＴＳ ＶＥＱＡＲＫＡＶＥＳ
８１ ＧＡＥＦＩＶＳＰＨＬ ＤＥＥＩＳＱＦＡＫＥ ＫＧＶＦＹＭＰＧＶＭ ＴＰＴＥＬＶＫＡＭＫ
１２１ ＬＧＨＴＩＬＫＬＦＰ ＧＥＶＶＧＰＱＦＶＫ ＡＭＫＧＰＦＰＮＶＫ ＦＶＰＴＧＧＶＮＬＤ
１６１ ＮＶＡＥＷＦＫＡＧＶ ＬＡＶＧＶＧＳＡＬＶ ＫＧＴＰＤＥＶＲＥＫ ＡＫＡＦＶＥＫＩＲＧ
２０１ ＡＴＥ（配列番号１３２）
いくつかの実施形態では、多量体化ドメインは、配列番号１４４若しくは配列番号１３２又はその抗原性断片と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を共有し、Ｃ７４Ａ、Ｃ９８Ａ、Ｃ１６３Ａ及びＣ２０１Ａから選択される１個、２個、３個又は４個のアミノ酸置換を含む。あるいは、置換は、ＣからＡ、Ｔ、Ｓ、Ｌ、Ｉ、又はＣ以外の任意のアミノ酸への置換であり得る。
核酸
別の態様では、本開示は、本開示の抗原、第１の成分及び／又は第２の成分をコードする単離された核酸を提供する。単離された核酸配列は、ＲＮＡ又はＤＮＡを含み得る。本明細書で使用される場合、「単離された核酸」は、ゲノム又はｃＤＮＡ配列中のそれらの通常の周囲核酸配列から除去されたものである。そのような単離された核酸配列は、限定するものではないが、ポリＡ配列、修飾コザック配列、並びにエピトープタグ、エクスポートシグナル及び分泌シグナル、核局在化シグナル及び原形質膜局在化シグナルをコードする配列を含む、コードされたタンパク質の発現及び／又は精製を促進するのに有用なさらなる配列を含んでもよい。本明細書の教示に基づいて、どの核酸配列が本開示のタンパク質をコードするかは、当業者には明らかであろう。
さらなる態様では、本開示は、適切な制御配列に作動可能に連結された本開示の任意の実施形態又は実施形態の組み合わせの単離された核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。「組換え発現ベクター」は、核酸コード領域又は遺伝子を、遺伝子産物の発現をもたらすことができる任意の制御配列に作動可能に連結するベクターを含む。本開示の核酸配列に作動可能に連結された「制御配列」は、核酸分子の発現をもたらすことができる核酸配列である。制御配列は、その発現を指示するように機能する限り、核酸配列と連続している必要はない。したがって、例えば、介在する翻訳されないが転写される配列がプロモーター配列と核酸配列との間に存在することができ、プロモーター配列は依然としてコード配列に「作動可能に連結されている」と考えることができる。他のかかる制御配列には、ポリアデニル化シグナル、終結シグナル及びリボソーム結合部位が含まれるが、これらに限定されない。そのような発現ベクターは、プラスミド及びウイルスベースの発現ベクターを含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の任意のタイプのものであり得る。哺乳動物系において開示される核酸配列の発現を駆動するために使用される制御配列は、構成的（ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、アクチン、ＥＦを含むがこれらに限定されない様々なプロモーターのいずれかによって駆動される）又は誘導性（テトラサイクリン、エクジソン、ステロイド応答性を含むがこれらに限定されない多数の誘導性プロモーターのいずれかによって駆動される）であり得る。原核細胞のトランスフェクションに使用するための発現ベクターの構築も当技術分野で周知であり、したがって標準的な技術によって達成することができる。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｉｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｐｐ．１０９－１２８，ｅｄ．Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、及びＡｍｂｉｏｎ １９９８ Ｃａｔａｌｏｇ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を参照のこと。発現ベクターは、エピソームとして、又は宿主染色体ＤＮＡへの組込みによって、宿主生物において複製可能でなければならない。好ましい実施形態では、発現ベクターはプラスミドを含む。しかしながら、本開示は、ウイルスベクターなどの同等の機能を果たす他の発現ベクターを含むことを意図している。
別の態様では、本開示は、本明細書に開示される組換え発現ベクターでトランスフェクト又は形質導入された宿主細胞を提供し、宿主細胞は原核生物又は真核生物のいずれかであり得る。細胞は、一過性又は安定にトランスフェクト又は形質導入することができる。原核細胞及び真核細胞への発現ベクターのそのようなトランスフェクション又は形質導入は、標準的な細菌形質転換、リン酸カルシウム共沈殿、エレクトロポレーション、又はリポソーム媒介性、ＤＥＡＥデキストラン媒介性、ポリカチオン媒介性、若しくはウイルス媒介性トランスフェクションを含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の任意の技術によって達成することができる。（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，２ｎｄ Ｅｄ．（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ．１９８７．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照のこと）。
別の態様では、本開示は、本開示による抗原、成分又はＶＬＰを産生する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、（ａ）本開示のこの態様による宿主をポリペプチドの発現を助長する条件下で培養する工程、及び（ｂ）任意に、発現されたポリペプチドを回収する工程を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、宿主細胞が培養培地中に抗原を分泌するように、本開示の抗原をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養培地中で培養することと；任意に、培養培地から抗原を精製することと；抗原を第２の成分と混合することであって第２の成分が抗原と多量体化してＶＬＰを形成する、混合することと；任意に、ＶＬＰを精製することとを含む、ワクチンを製造する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、宿主細胞が第１の成分及び第２の成分を培養培地に分泌するように、本開示のいずれか１つのＶＬＰの両方の成分をコードする配列を含む１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養することと；任意に培養培地からＶＬＰを精製することとを含む、ワクチンを製造する方法を提供する。
例示的な宿主細胞には、大腸菌細胞、２９３及び２９３Ｆ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｓｆ９細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、及び組換えタンパク質の産生に使用される任意の他の細胞株が含まれる。
様々な実施形態において、第１の成分は、本開示による製造方法（例えば懸濁液中で成長させた２９３Ｆ細胞）において、約０．５ｍｇ／ｍＬ、約１．０ｍｇ／ｍＬ、約１．５ｍｇ／ｍＬ、約２．５ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ、約７５ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ又はそれを超える量で発現する。様々な実施形態において、第１の成分は、同じ又は類似の発現系におけるｈＭＰＶ Ｆタンパク質（任意に、ＶＬＰの場合と同じ外部ドメイン）の発現レベルの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％を発現する。様々な実施形態において、第１の成分は、同じ又は類似の発現系におけるｈＭＰＶ Ｆタンパク質（任意に、ＶＬＰの場合と同じ外部ドメイン）の発現レベルの少なくとも１０５％、少なくとも１１０％、少なくとも１１５％、少なくとも１２０％、少なくとも１２５％、少なくとも１５０％、少なくとも１７５％、又は少なくとも２００％を発現する。
いくつかの実施形態では、第１の成分のｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが融合前の立体配座であるか、又はｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインの実質的な画分が融合前の立体配座である。様々な実施形態では、第１の成分のｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％が、融合前の立体配座である。いくつかの実施形態では、ＶＬＰのｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが融合前の立体配座であるか、又はｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインの実質的な画分が融合前の立体配座である。様々な実施形態では、ＶＬＰのｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％が、融合前の立体配座である。
いくつかの実施形態では、融合前状態のｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインの画分は、立体配座特異的抗体（例えば、Ｄ１－２５及び１１１２－１）への結合によって決定される。いくつかの実施形態では、融合前の立体配座における第１の成分中のｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインの画分は、参照成分中の画分よりも、又は多量体化ドメインに連結されていない参照タンパク質中の画分よりも、少なくとも１０５％、少なくとも１１０％、少なくとも１１５％、少なくとも１２０％、少なくとも１２５％、少なくとも１５０％、少なくとも１７５％、又は少なくとも２００％大きい。いくつかの実施形態では、融合前の立体配座における第１の成分中のｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインの画分は、ＶＬＰ（例えばミセルＶＬＰ）中の画分よりも、少なくとも１０５％、少なくとも１１０％、少なくとも１１５％、少なくとも１２０％、少なくとも１２５％、少なくとも１５０％、少なくとも１７５％、又は少なくとも２００％大きい。
ワクチン及び投与
本開示はまた、本明細書に記載のＶＬＰを含むワクチンを提供する。そのような組成物は、哺乳動物（例えば、ヒト）において抗体を産生するために使用することができる。本開示のワクチン組成物は、典型的には、薬学的に許容され得る担体を含み、そのような担体の十分な議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙで利用可能である。
組成物のｐＨは、通常、約４．５～約１１、例えば約５～約１１、約５．５～約１１、約６～約１１、約５～約１０．５、約５．５～約１０．５、約６～約１０．５、約５～約１０、約５．５～約１０、約６～約１０、約５～約９．５、約５．５～約９．５、約６～約９．５、約５～約９、約５．５～約９、約６～約９、約５～約８．５、約５．５～約８．５、約６～約８．５、約５～約８、約５．５～約８、約６～約８、約４．５、約５、約６．５、約６、約６．５、約７、約７．５、約８、約８．５、約９、約９．５、約１０、約１０．５、約１１などである。安定なｐＨは、緩衝液、例えばＴｒｉｓ緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液又はヒスチジン緩衝液の使用によって維持され得る。したがって、組成物は一般に緩衝液を含む。
組成物は、無菌及び／又は発熱物質を含まなくてもよい。組成物は、ヒトに対して等張性であり得る。
ワクチン組成物は、免疫学的有効量のその抗原（複数可）を含む。「免疫学的有効量」又は「有効量」は、対象に投与した場合、抗原に対する抗体応答を誘発するのに有効な量である。この量は、処置される個体の健康及び身体状態、それらの年齢、個体の免疫系が抗体を合成する能力、所望の保護の程度、ワクチンの製剤、処置中の医師による医学的状況の評価、及び他の関連因子に応じて変動し得る。この量は、日常的な試験によって決定することができる比較的広い範囲に入ると予想される。本開示の組成物の抗原含有量は、一般に、用量あたりのタンパク質の質量に関して表される。抗原あたり１０～５００μｇ（例えば５０μｇ）の用量が有用であり得る。
ワクチン組成物は免疫アジュバントを含み得る。例示的なアジュバントとしては、以下が挙げられる：１．鉱物含有組成物；２．油エマルジョン；３．サポニン製剤；４．ビロソーム及びウイルス様粒子；５．細菌又は微生物の誘導体；６．生体接着剤及び粘膜接着剤；７．リポソーム；８．ポリオキシエチレンエーテル及びポリオキシエチレンエステルの配合；９．ポリホスファゼン（ｐｃｐｐ）；１０．ムラミルペプチド；１１．イミダゾキノロン化合物；１２．チオセミカルバゾン化合物；１３．トリプタントリン化合物；１４．ヒト免疫調節剤；１５．リポペプチド；１６．ベンゾナフチリジン；１７．微粒子；１８．免疫賦活性ポリヌクレオチド（例えば、ｒｎａ又はｄｎａ；例えば、ｃｐｇ含有オリゴヌクレオチド）。
例えば、組成物は、アルミニウム塩アジュバント、水中油型エマルジョン（例えば、スクアレンを含む水中油型エマルジョン、例えばＭＦ５９又はＡＳ０３）、ＴＬＲ７アゴニスト（イミダゾキノリン又はイミキモドなど）、又はそれらの組み合わせを含み得る。適切なアルミニウム塩には、水酸化物（例えば、オキシ水酸化物）、リン酸塩（例えば、ヒドロキシホスフェート、オルトリホスフェート）、（例えば、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ．（１９９５）ｅｄｓ．Ｐｏｗｅｌｌ＆Ｎｅｗｍａｎ．ＩＳＢＮ：０３０６４４８６７Ｘ．Ｐｌｅｎｕｍの第８章及び第９章を参照）、又はそれらの混合物が含まれる。塩は、任意の適切な形態（例えば、ゲル、結晶性、非晶質など）をとることができ、塩への抗原の吸着が一例である。患者への投与のための組成物中のＡｌ＋＋＋の濃度は、５ｍｇ／ｍｌ未満、例えば４ｍｇ／ｍｌ未満、３ｍｇ／ｍｌ未満、２ｍｇ／ｍｌ未満、１ｍｇ／ｍｌ未満などであり得る。好ましい範囲は、０．３～１ｍｇ／ｍｌである。最大０．８５ｍｇ／用量が好ましい。水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウムアジュバントは、本開示での使用に適している。
本明細書中に提供される医薬組成物において使用され得る例示的なアジュバントとしては、限定されないが以下が挙げられる：３Ｍ－０５２、Ａｄｊｕ－Ｐｈｏｓ（商標）、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（商標）、Ａｄｊｕｍｅｒ（商標）、アルブミン－ヘパリン微粒子、藻類グルカン、Ａｌｇａｍｍｕｌｉｎ、ミョウバン、抗原製剤、ＡＳ－２アジュバント、ＡＳＯ１、ＡＳＯ３、自己樹状細胞、自己ＰＢＭＣ、Ａｖｒｉｄｉｎｅ（商標）、Ｂ７－２、ＢＡＫ、ＢＡＹ Ｒ１００５、ＢＥＣＣ ＴＬＲ－４アゴニスト、ブピバカイン、ブピバカイン－ＨＣｌ、ＢＷＺＬ、カルシトリオール、リン酸カルシウムゲル、ＣＣＲ５ペプチド、ＣＦＡ、コレラホロトキシン（ＣＴ）及びコレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）、コレラ毒素Ａ１－サブユニット－Ａ Ｄ－断片融合タンパク質、ＣｐＧ、ＣＰＧ－１０１８、ＣＲＬ１００５、サイトカイン含有リポソーム、Ｄ－ムラパルミチン、ＤＤＡ、ＤＨＥＡ、ジフテリアトキソイド、ＤＬ－ＰＧＬ、ＤＭＰＣ、ＤＭＰＧ、ＤＯＣ／ミョウバン複合体、鶏痘、フロイント完全アジュバント、ガンマイヌリン、Ｇｅｒｂｕアジュバント、ＧＭ－ＣＳＦ、ＧＭＤＰ、ｈＧＭ－ＣＳＦ、ｈＩＬ－１２（Ｎ２２２Ｌ）、ｈＴＮＦ－α、ＩＦＡ、ｐｃＤＮＡ３中のＩＦＮ－γ、ＩＬ－１２ ＤＮＡ、ＩＬ－１２プラスミド、ＩＬ－１２／ＧＭＣＳＦプラスミド（Ｓｙｋｅｓ）、ｐｃＤＮＡ３中のＩＬ－２、ＩＬ－２／Ｉｇプラスミド、ＩＬ－２／Ｉｇタンパク質、ＩＬ－４、ｐｃＤＮＡ３中のＩＬ－４、イミキモド（商標）、ＩｍｍＴｈｅｒ（商標）、共刺激分子に対する抗体を含有する免疫リポソーム、インターフェロン－ガンマ、インターロイキン－１ベータ、インターロイキン－１２、インターロイキン－２、インターロイキン－７、ＩＳＣＯＭ（ｓ）（商標）、Ｉｓｃｏｐｒｅｐ ７．０．３（商標）、キーホールリンペットヘモシアニン、脂質ベースのアジュバント、リポソーム、ロキソリビン、ＬＴ（Ｒ１９２Ｇ）、ＬＴ－ＯＡ又はＬＴ口腔アジュバント、ＬＴ－Ｒ１９２Ｇ、ＬＴＫ６３、ＬＴＫ７２、Ｍａｔｒｉｘ－Ｍ（商標）アジュバント、ＭＦ５９、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ ＩＳＡ ５１、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ ＩＳＡ ７２０、ＭＰＬ．（商標）、ＭＰＬ－ＳＥ、ＭＴＰ－ＰＥ、ＭＴＰ－ＰＥリポソーム、Ｍｕｒａｍｅｔｉｄｅ、Ｍｕｒａｐａｌｍｉｔｉｎｅ、ＮＡＧＯ、ｎＣＴ天然コレラ毒素、非イオン性界面活性剤ベシクル、コレラ毒素ｍＣＴ－Ｅ１１２Ｋの非毒性変異体Ｅ１１２Ｋ、ｐ－ヒドロキシ安息香酸メチルエステル、ｐＣＩＬ－１０、ｐＣＩＬ１２、ｐＣＭＶｍＣＡＴ１、ｐＣＭＶＮ、Ｐｅｐｔｏｍｅｒ－ＮＰ、プルーラン（Ｐｌｅｕｒａｎ）、ＰＬＧ、ＰＬＧＡ、ＰＧＡ及びＰＬＡ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１、ＰＭＭＡ、ＰＯＤＤＳ（商標）、ポリｒＡ：ポリｒＵ、ポリソルベート８０、タンパク質コクリエート、ＱＳ－２１、Ｑｕａｄｒｉ Ａサポニン、Ｑｕｉｌ－Ａ、Ｒｅｈｙｄｒａｇｅｌ ＨＰＡ、Ｒｅｈｙｄｒａｇｅｌ ＬＶ、ＲＩＢＩ、Ｒｉｂｉ様アジュバント系（ＭＰＬ、ＴＭＤ、ＣＷＳ）、Ｓ－２８４６３、ＳＡＦ－１、Ｓｃｌａｖｏペプチド、Ｓｅｎｄａｉプロテオリポソーム、Ｓｅｎｄａｉ含有脂質マトリックス、Ｓｐａｎ ８５、Ｓｐｅｃｏｌ、スクアラン１、スクアラン２、ステアリルチロシン、ＳＷＥ、破傷風トキソイド（ＴＴ）、Ｔｈｅｒａｍｉｄｅ（商標）、スレオニルムラミルジペプチド（ＴＭＤＰ）、Ｔｙ粒子並びにＷａｌｔｅｒ Ｒｅｅｄリポソーム。
好ましい実施形態では、アジュバントは水酸化アルミニウムゲル（例えば、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（商標））である。好ましい実施形態では、アジュバントはＳＷＥである。好ましい実施形態では、アジュバントはＭＦ５９である。
ＭＦ５９は、クエン酸緩衝液中にスクアレン（４．３％）を含み、安定化非イオン性界面活性剤Ｔｗｅｅｎ ８０（０．５％）及びＳｐａｎ ８５（０．５％）を含む水中油型エマルジョンである。ＭＦ５９は、ヒトにおいて忍容性が高いことが示されており、季節性インフルエンザに対するワクチンに使用されている（Ｋｏ ａｎｄ Ｋａｎｇ，Ｈｕｍ Ｖａｃｃｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１８；１４（１２）：３０４１－３０４５；米国特許第６，２９９，８８４号を参照）。
例えば、組成物は、アルミニウム塩アジュバント、水中油型エマルジョン（例えば、スクアレンを含む水中油型エマルジョン、例えばＭＦ５９、ＳＷＥ又はＡＳ０３）、ＴＬＲ９アゴニスト（例えばＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドなど）、ＴＬＲ７アゴニスト（イミダゾキノリン又はイミキモドなど）、又はそれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、アジュバントは、アルミニウム塩とＣＰＧ１０１８との組み合わせである。適切なアルミニウム塩には、水酸化物（例えば、オキシ水酸化物）、リン酸塩（例えば、ヒドロキシホスフェート、オルトリホスフェート）、（例えば、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ．（１９９５）ｅｄｓ．Ｐｏｗｅｌｌ＆Ｎｅｗｍａｎ．ＩＳＢＮ：０３０６４４８６７Ｘ．Ｐｌｅｎｕｍの第８章及び第９章を参照）、又はそれらの混合物が含まれる。塩は、任意の適切な形態（例えば、ゲル、結晶性、非晶質など）をとることができ、塩への抗原の吸着が一例である。患者への投与のための組成物中のＡｌ＋＋＋の濃度は、５ｍｇ／ｍｌ未満、例えば４ｍｇ／ｍｌ未満、３ｍｇ／ｍｌ未満、２ｍｇ／ｍｌ未満、１ｍｇ／ｍｌ未満などであり得る。好ましい範囲は、０．３～１ｍｇ／ｍｌである。最大０．８５ｍｇ／用量が好ましい。水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウムアジュバントは、本開示での使用に適している。好ましい実施形態では、本明細書で提供される医薬組成物は、アジュバントとして水酸化アルミニウムを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される医薬組成物は、５００μｇの水酸化アルミニウムを含む。
アジュバントの選択は、処置される対象に依存する。好ましくは、薬学的に許容され得るアジュバントが使用される。
いくつかの実施形態では、アジュバントはスクアレンエマルジョンである。
いくつかの実施形態では、アジュバントは、例えば、Ｖａｎ Ｈｏｅｖｅｎ ａｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．１１（２）：ｅ０１４９６１０（２０１６）に記載されているように、ＴＬＲ４免疫刺激薬（例えば、ＳＬＡ、ＧＬＡ）である。
いくつかの実施形態では、アジュバントは、例えば、Ｄｏｗｌｉｎｇ Ｄ．ＩｍｍｕｎｏＨｏｒｉｚｏｎｓ（６）：１８５－１９７（２０１８）に記載されるようなＴＬＲ７／８免疫賦活化剤（例えば、Ｒ８４８、ＩＭＱ、３Ｍ－０５２）である。
いくつかの実施形態では、アジュバントは、例えばＢｏｄｅ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ．１０（４）：４９９－５１１（２０１１）に記載されているように、ＴＬＲ９免疫賦活化剤（ＣｐＧ）である。
いくつかの実施形態では、アジュバントは、例えば、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｐｒｏｄ Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ．３（４）：ｅ１１３（２０１６）に記載されているサポニン（ＱＳ２１）である。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、２つ以上のアジュバント（例えば、スクアレンエマルジョン及びミョウバン又はＴＬＲ４免疫賦活剤）の組み合わせを含む。
１つの適切な免疫アジュバントは、アルミニウム塩に吸着された、国際公開第２０１１／０２７２２２号に定義されている式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容され得る塩を含む。Ｐｏｗｅｌｌ＆Ｎｅｗｍａｎ（１９９５）に開示されているもののいずれかを含む、多くのさらなるアジュバントを使用することができる。
組成物は、特に複数回投与形式で包装される場合、抗菌剤を含み得る。チオメルサール及び２－フェノキシエタノールなどの抗菌剤は、ワクチンに一般的に見られるが、水銀を含まない防腐剤又は防腐剤を全く使用しないことが望ましい場合がある。
組成物は、洗剤、例えばポリソルベート８０などのポリソルベートを含み得る。洗剤は一般に低レベル、例えば０．０１％未満で存在する。
組成物は、等張性を与えるためにナトリウム塩（例えば塩化ナトリウム）を含んでもよい。１０±２ｍｇ／ｍｌ、例えば約９ｍｇ／ｍｌのＮａＣｌの濃度が典型的である。
いくつかの実施形態では、ワクチン組成物中の緩衝液は、トリス緩衝液、ヒスチジン緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液又は酢酸緩衝液である。組成物はまた、凍結保護剤、例えばスクロース、ソルビトール又はトレハロースを含み得る。特定の実施形態では、組成物は、防腐剤、例えば塩化ベンザルコニウム、ベンゼトニウム、クロロヘキシジン、フェノール、ｍ－クレゾール、ベンジルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロロブタノール、ｏ－クレゾール、ｐ－クレゾール、クロロクレゾール、硝酸フェニル水銀、チメロサール、安息香酸、及びそれらの様々な混合物を含む。他の実施形態では、組成物は、グリシンのような増量剤を含む。さらに他の実施形態では、組成物は、界面活性剤、例えば、ポリソルベート－２０、ポリソルベート－４０、ポリソルベート－６０、ポリソルベート－６５、ポリソルベート－８０ポリソルベート－８５、ポロキサマー－１８８、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタントリラウレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタントリオレアステ（ｓｏｒｂｉｔａｎ ｔｒｉｏｌｅａｓｔｅ）、又はそれらの組み合わせを含む。組成物はまた、等張性調整剤、例えば、製剤をヒト血液と実質的に等張性又は等浸透性にする化合物を含んでもよい。例示的な等張性調整剤としては、スクロース、ソルビトール、グリシン、メチオニン、マンニトール、デキストロース、イノシトール、塩化ナトリウム、アルギニン及びアルギニン塩酸塩が挙げられる。他の実施形態では、組成物は、安定剤、例えば、凍結乾燥又は液体形態のＶＬＰの化学的及び／又は物理的不安定性を実質的に防止又は低減する分子をさらに含む。例示的な安定剤としては、スクロース、ソルビトール、グリシン、イノシトール、塩化ナトリウム、メチオニン、アルギニン及びアルギニン塩酸塩が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本開示は、１つ又は複数の薬学的に許容され得る賦形剤を含むワクチン（免疫原性組成物）を提供する。
いくつかの実施形態では、ワクチン（免疫原性組成物）は安定なエマルジョンである。
いくつかの実施形態では、本開示は、１つ又は複数のアジュバントを含むワクチン（免疫原性組成物）を提供する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数のアジュバントは、ＴＬＲ４免疫賦活化剤、例えば、モノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬ）、グルコピラノシルリピッドＡ（ＧＬＡ）及び／又は可溶性リーシュマニア抗原（ＳＬＡ）を含む。
別の態様では、本開示は、ｈＭＰＶに対する免疫応答を誘導する方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載のＶＬＰを含む免疫学的有効量の本明細書に記載の免疫原性組成物を投与することを含む方法を提供する。
特定の実施形態では、免疫応答は、感染因子に対する中和抗体の産生を含む。特定の実施形態では、中和抗体は補体非依存性である。
免疫応答は、体液性免疫応答、細胞媒介性免疫応答、又はその両方を含み得る。いくつかの実施形態では、免疫応答は、送達された各抗原性タンパク質に対して誘導される。細胞媒介性免疫応答は、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）応答、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答、又はその両方を含み得る。いくつかの実施形態では、免疫応答は体液性免疫応答を含み、抗体は中和抗体である。中和抗体は、細胞のウイルス感染を阻止する。ウイルスは上皮細胞及び線維芽細胞にも感染する。いくつかの実施形態では、免疫応答は、両方の細胞型の感染を低減又は防止する。中和抗体応答は、補体依存性又は補体非依存性であり得る。いくつかの実施形態では、中和抗体応答は補体非依存性である。いくつかの実施形態では、中和抗体応答は交差中和である。すなわち、投与された組成物に対して生成された抗体は、組成物に使用される株以外の株のウイルスを中和する。
当技術分野における抗体効力の有用な尺度は、「５０％中和力価」である。５０％中和力価を決定するために、免疫化動物由来の血清を希釈して、どのように希釈血清が依然として細胞への５０％のウイルスの侵入を阻止する能力を保持できるかを評価する。例えば、力価７００は、血清が７００倍に希釈された後に５０％のウイルスを中和する能力を保持したことを意味する。したがって、より高い力価は、より強力な中和抗体応答を示す。いくつかの実施形態では、この力価は、約２００、約４００、約６００、約８００、約１０００、約１５００、約２０００、約２５００、約３０００、約３５００、約４０００、約４５００、約５０００、約５５００、約６０００、約６５００又は約７０００の下限を有する範囲にある。５０％中和力価範囲は、約４００、約６００、約８００、約１０００、約１５００、約２０００、約２５００、約３０００、約３５００、約４０００、約４５００、約５０００、約５５００、約６０００、約６５００、約７０００、約８０００、約９０００、約１００００、約１１０００、約１２０００、約１３０００、約１４０００、約１５０００、約１６０００、約１７０００、約１８０００、約１９０００、約２００００、約２１０００、約２２０００、約２３０００、約２４０００、約２５０００、約２６０００、約２７０００、約２８０００、約２９０００、又は約３００００の上限を有することができる。例えば、５０％中和力価は約３０００～約２５０００であり得る。「約」は、列挙された値の±１０％を意味する。
いくつかの実施形態では、本開示のウイルス様粒子は、０．５ＩＵ／ｍＬ、１．０ＩＵ／ｍＬ、１．５ＩＵ／ｍＬ、２．０ＩＵ／ｍＬ、１０ＩＵ／ｍＬ、２５ＩＵ／ｍＬ、５０ＩＵ／ｍＬ、１００ＩＵ／ｍＬ又はそれを超える免疫応答を生じる。いくつかの実施形態では、本開示のウイルス様粒子は、０．５ＩＵ／ｍＬ又はそれを超える免疫応答を生じる。
本開示の組成物は、一般に、対象に直接投与される。直接送達は、非経口注射（例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、又は組織の間質腔に）、経口、鼻腔内、又は任意の他の適切な経路によって達成され得る。例えば、筋肉内投与を、例えば大腿部又は上腕に使用することができる。注射は針（例えば皮下注射針）を介してもよいが、代わりに無針注射を使用してもよい。典型的な筋肉内投与量は０．５ｍｌである。
投与量は、単回投与スケジュール又は複数回投与スケジュールによるものであり得る。複数回の用量は、一次免疫化スケジュール及び／又はブースター免疫化スケジュールで使用され得る。複数回用量スケジュールでは、様々な用量は、同じ又は異なる経路、例えば、非経口プライム及び粘膜ブースト、粘膜プライム及び非経口ブーストなどによって与えられ得る。複数回の用量は、典型的には、少なくとも１週間間隔（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）で投与される。複数回の用量は、少なくとも１ヶ月間隔（例えば、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約６ヶ月、約８ヶ月、約１０ヶ月、約１２ヶ月、約１６ヶ月）で投与され得る。２回目以降の投与は、より長い間隔、例えば、前回の投与の約１年後又は約２年後に行うことができる。
ワクチンが予防的使用のためのものである場合、ヒトは好ましくは小児（例えば、幼児又は乳児）、十代又は成人である。ワクチンが治療的使用のためのものである場合、ヒトは好ましくは十代又は成人である。小児用のワクチンはまた、例えば、安全性、投与量、免疫原性などを評価するために成人にも投与され得る。
本開示のワクチンは、予防的（すなわち、疾患を予防するため）又は治療的（すなわち、疾患の症候を軽減又は排除するため）であり得る。予防という用語は、特定の症状の重症度を低下させるか、又はその発症を予防すると考えられ得る。誤解を避けるために、予防ワクチンという用語はまた、例えばそのような感染の重症度又は持続期間を減少させることによって、将来の感染の影響を改善するワクチンも指し得る。
本明細書に記載の単離及び／又は精製ＶＬＰは、単独で、又はＲＮＡプライム又はＤＮＡプライマーに続いてタンパク質ブーストを行うような混合モダリティレジームにおけるプライム又はブーストのいずれかとして投与することができる。タンパク質プライム／タンパク質ブースト戦略と比較したＲＮＡプライム／タンパク質ブースト戦略の利点は、例えば、抗体力価の増加、よりバランスのとれたＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａサブタイププロファイル、ウイルス粒子のものと類似したＴＨ１型ＣＤ４＋Ｔ細胞媒介性免疫応答の誘導、及び非中和抗体の産生の減少を含む。ＲＮＡプライムは、アジュバントを含有するか含有しないかにかかわらず、組成物の免疫原性を増加させることができる。
ＲＮＡプライム／タンパク質ブースト戦略では、ＲＮＡ及びタンパク質は同じ標的抗原に向けられる。ＲＮＡを送達する適切なモードの例としては、ウイルス様レプリコン粒子（ＶＲＰ）、アルファウイルスＲＮＡ、脂質ナノ粒子に封入されたレプリコン（ＬＮＰ）、又はカチオン性ナノエマルジョン（ＣＮＥ）と共に製剤化されたレプリコンなどの製剤化ＲＮＡが挙げられる。適切なカチオン性水中油型ナノエマルジョンは、国際公開第２０１２／００６３８０号に開示されており、例えば油コア（例えば、スクアレンを含む）及びカチオン性脂質（例えば、ＤＯＴＡＰ、ＤＭＴＡＰ、ＤＳＴＡＰ、ＤＣ－コレステロールなど）を含む。
あるいは、プライムブースト効果を達成するために、ＶＬＰの２回の投与を所定の間隔で行ってもよい。所定の間隔は、１、２、３、４、６、７、１０、若しくは１４日間；又は３～５日、７～１０日、又は１０～１４日などであってもよい。所定の間隔は、１、２、３、４、若しくは６週間；又は２～３週間、３～４週間、又は５～６週間などであってもよい。所定の間隔は、１、２、３、又は４ヶ月であってもよい。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、カチオン性脂質、リポソーム、コクリエート、ビロソーム、免疫刺激複合体、微粒子、ミクロスフェア、ナノスフェア、単層ベシクル、多層ベシクル、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、エマルソーム、ポリカチオン性ペプチド、カチオン性ナノエマルジョン、又はそれらの組み合わせに封入、結合又は吸着される。
本開示は、混合ワクチンをさらに提供する。本開示のワクチンには、ｈＭＰＶ ＶＬＰと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、呼吸器合胞体ウイルス、狂犬病、腸チフス、Ａ型肝炎、ポリオ、インフルエンザ、Ｂ型肝炎、黄熱病、日本脳炎、パルボウイルス、ディステンパー、アデノウイルス、パラインフルエンザ、インフルエンザ、麻疹、ライム病、コロナウイルス、水疱性口内炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、トゴトウイルス及びボルナウイルス科の１つ又は複数のためのワクチンとの両方を含むワクチンが含まれる。
本明細書に記載の核酸（例えば、ＲＮＡ）、精製タンパク質、及び精製ＶＬＰの投与用キット、並びに使用説明書も本明細書で提供される。本開示はまた、本明細書に開示される組成物又はワクチンで予め充填された送達装置を提供する。
本明細書に記載の医薬組成物は、１つ又は複数の追加の治療剤と組み合わせて投与することができる。さらなる治療剤には、抗生物質又は抗菌剤、制吐剤、抗真菌剤、抗炎症剤、抗ウイルス剤、免疫調節剤、サイトカイン、抗うつ剤、ホルモン、アルキル化剤、代謝拮抗物質、抗腫瘍抗生物質、有糸分裂阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、細胞増殖抑制剤、抗浸潤剤、抗血管新生剤、ウイルス複製の増殖因子機能阻害剤の阻害剤（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、ウイルス酵素阻害剤、抗癌剤、α－インターフェロン、β－インターフェロン、リバビリン、ホルモン、及び他のトール様受容体調節剤、免疫グロブリン（Ｉｇ）、及びＩｇ機能を調節する抗体（抗ＩｇＥ（オマリズマブ）など）が含まれ得るが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、医薬として、例えば、哺乳類などのそれを必要とする対象における免疫応答の誘導又は増強における使用のために使用され得る。
特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、それを必要とする対象、例えば哺乳動物において免疫応答を誘導又は増強するための医薬の製造に使用され得る。
治療的処置の有効性を確認する１つの方法は、本明細書に開示される組成物又はワクチンの投与後に感染因子による感染を監視することを含む。予防的処置の有効性を確認する１つの方法は、抗原に対する免疫応答を、全身的に監視すること（例えばＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ産生のレベルを監視すること）及び／又は粘膜的に監視すること（例えばＩｇＡ産生のレベルを監視すること）を含む。典型的には、抗原特異的血清抗体応答は免疫化後であるが負荷前に決定され、抗原特異的粘膜抗体応答は免疫化後かつ負荷後に決定される。
実施例１
この実施例は、ｈＭＰＶウイルスのワクチンとしての使用を意図した２成分正二十面体ＶＬＰの産生を例示する。第１の成分Ａとして、ワクチンは、Ｉ５３－５０Ａタンパク質（配列番号１４４）にＣ末端融合したｈＭＰＶ Ｆタンパク質の外部ドメインで構成されるポリペプチド抗原を使用する。成分Ｂとして、ＶＬＰはＩ５３－５０Ｂタンパク質を使用する。Ｉ５３－５０Ａ及びＩ５３－５０Ｂは、図１Ａ及び図１Ｂに示すように、３：５の比率で自発的に集合し、正二十面体（Ｉ５３）対称性を有するＶＬＰを形成することが知られている。
ＣｏｍｐＡに融合したｈＭＰＶ Ｆタンパク質の発現レベルを決定した。ヒトコドン最適化ポリヌクレオチド配列を遺伝子合成によって作製し、発現ベクターにクローニングした。各発現ベクターを、Ｅｘｐｉ２９３細胞における一過性トランスフェクションによって個別に発現させた。トランスフェクションの４日後に上清を回収した。
組換え発現融合タンパク質が上清に分泌されたかどうかを決定するために、抗Ｈｉｓ６モノクローナル抗体を使用するウエスタンブロットを行った。馴化培地を、５％（ｖ／ｖ）β－メルカプトエタノールを含む２×Ｌａｅｍｍｌｉローディング緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で最小１０倍希釈し、９５℃に１０分間加熱し、１０μｌをゲル上で流した。組換えＨｉｓタグ付きヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の参照試料を、０．０１ｍｇ／ｍＬへの初期希釈、続いて２倍希釈系列によって調製して、２×Ｌａｅｍｍｌｉローディング緩衝液中の１０μＬのローディング体積中６．２５から１００ｎｇの標準曲線を得た。試料をＮｕＰＡＧＥ ４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓタンパク質ゲルにローディングし、１５０Ｖで４５分間泳動した。タンパク質をＩｍｍｕｎｏ－Ｂｌｏｔ ＰＤＶＦ膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に移した。転写後、ブロットをＴＢＳＴ中３％ ＢＳＡ（ｗ／ｖ）で、振盪しながら室温で１時間ブロッキングした。抗Ｈｉｓ ＨＲＰコンジュゲート抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＭＡＢ０５０Ｈ）をＴＢＳＴ中３％ ＢＳＡ（ｗ／ｖ）で１：８，０００に希釈し、膜と室温で１時間インキュベーションした。次いで、ＴＢＳＴを用いて膜を５分間で３回洗浄し、次いで、ルミノール化学発光基質（ＶｉｓｉＧｌｏ、ＶＷＲ）を用いてＨｉｓタグ化タンパク質を検出し、ＵＶＰ Ｃｈｅｍｓｔｕｄｉｏ（Ａｎａｌｙｔｉｋ Ｊｅｎａ）で１０～２０秒の曝露時間を用いて捕捉した。
ＣｏｍｐＡに融合したｈＭＰＶ Ｆタンパク質の発現レベルを表４に示す。発現レベルをウエスタンブロットの目視検査によって評価し、発現なし（Ｘ）又は低発現（＊）～高発現（＊＊＊＊）と命名した。ｈＭＰＶ００８、ｈＭＰＶ００９、ｈＭＰＶ０２４、ｈＭＰＶ０２６、ｈＭＰＶ０２７、ｈＭＰＶ０３３、及びｈＭＰＶ０３４ ＣｏｍｐＡ融合タンパク質は、この系において最も高い発現レベルを示した。
実施例２
この実施例では、ｈＭＰＶ Ｆ－ＣｏｍｐＡ融合タンパク質を含有する馴化培地を、抗体結合活性を使用して特徴付けて、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質の立体配座を決定した。融合タンパク質ｈＭＰＶ００５、ｈＭＰＶ００８、ｈＭＰＶ０２１、ｈＭＰＶ０２４、ｈＭＰＶ０２６、ｈＭＰＶ０２７、ｈＭＰＶ０２７Ｃ、及びｈＭＰＶ０３３を評価した（表５）。構築物ｈＭＰＶ０２６及びｈＭＰＶ０２７は、Ｅｘｐｉ２９３一過性トランスフェクションにおいて切断されなかったフューリン切断部位を含有する。ヒトフューリンの同時トランスフェクションの際に、発現されたタンパク質を適切に切断し、ｈＭＰＶ０２６Ｃ又はｈＭＰＶ０２７Ｃと命名して、切断型を表した。
ＣｏｍｐＡに融合した組換え発現ｈＭＰＶ Ｆタンパク質の立体配座を特徴付けるために、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインの特定の形態に結合する１５種のモノクローナル抗体を使用してＥＬＩＳＡを行った。
９６ウェルプレートのウェルを、１００μＬの５０ｍＭ炭酸ナトリウム－炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）中の２００ｎｇの各抗体、又はＭＰＥ８については５０ｎｇで、４℃で一晩コーティングした。プレートを、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含む３００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。１％ ＢＳＡを含む１５０μｌのＰＢＳで室温で１時間ブロッキングした後、吸収パッドをタップすることによってプレートを空にした。各構築物のＥｘｐｉ２９３トランスフェクションからの馴化培地上清を、抗原濃度が（Ｍａｓデータからの）抗原の予想されるＥＣ５０を満たすように半定量的ウエスタンブロットに基づいて希釈した。各構築物の３つの希釈物を各抗体についてウェルあたり１００μＬでプレートし、プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートを、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含む３００μｌのＰＢＳで６回洗浄した。抗Ｈｉｓモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＭＡＢ０５０Ｈ）を１：１５，０００に希釈し、１００μＬを各ウェルに添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートを０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含む３００μｌのＰＢＳで６回洗浄した後、１００μｌのＴＭＢ基質を加え、プレートを暗所で１０分間現像した。１００μｌの０．６Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加することによって反応を停止させ、プレートリーダーで４５０ｎｍで吸光度を測定した。
融合後特異的抗体はｈＭＰＶ０２１に結合し、この構築物が融合後の立体配座を有することを示唆した。他の構築物は、融合後特異的Ａｂに結合せず、ＭＰＥ８に、融合前及び融合後の両方の立体配座を認識する複数のＡｂと共に結合した。このデータは、融合タンパク質が融合前の立体配座特性を有することを示唆している。
実施例３
精製ｈＭＰＶ Ｆ－ＣｏｍｐＡ融合タンパク質で見られる結合活性。図３Ａ～３Ｃは、既知濃度の精製成分Ａ（ＣｏｍｐＡ）融合物との結合、すなわち、Ｉ５３－５０Ａ（配列番号１４４）又はＩ５３－５０ＡΔＣｙｓ（配列番号１４５）にＮ末端融合したｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインとの結合を示す。ＭＦ１４、ＭＰＥ８及びＭＦ１６はそれぞれ抗原部位ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶを認識し、これらの抗原部位は中和抗体によって認識される主要部位である。さらに、ＭＰＥ８は、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質の融合前形態を優先的に認識する。９６ウェルプレートのウェルを、１００μＬの５０ｍＭ炭酸ナトリウム－炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）中の５０ｎｇのＭＰＥ８並びに１００ｎｇのＭＦ１４及びＭＦ１６で４℃にて一晩コーティングした。プレートを、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含む３００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。１％ ＢＳＡを含む１５０μｌのＰＢＳで室温で１時間ブロッキングした後、吸収パッドをタップすることによってプレートを空にした。各構築物の精製試料を４０μｇ／ｍＬ（ｈＭＰＶ００８、０２１、０２６、０２７）又は４μｇ／ｍＬ（ｈＭＰＶ０２６Ｃ及び０３３）に希釈し、続いて１％ ＢＳＡを含むＰＢＳ中でそれぞれ３倍又は４倍希釈系列に希釈し、ウェルあたり１００μＬでプレートし、プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートを、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含む３００μｌのＰＢＳで６回洗浄した。抗Ｈｉｓモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＭＡＢ０５０Ｈ）を１：１５，０００に希釈し、１００μＬを各ウェルに添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートを０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含む３００μｌのＰＢＳで６回洗浄した後、１００μｌのＴＭＢ基質を加え、プレートを暗所で１０分間現像した。１００μｌの０．６Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加することによって反応を停止させ、プレートリーダーで４５０ｎｍで吸光度を測定した。ＭＦ１４（部位ＩＩ、図３Ａ）及びＭＦ１６（部位ＩＶ、図３Ｂ）への結合は類似しているが、ＭＰＥ８（部位ＩＩＩ、図３Ｃ）との結合は、ｈＭＰＶ００８及びｈＭＰＶ０２１との結合よりも高いＥＣ５０を有する（表６）。これは、中和抗体認識部位である部位ＩＩＩがｈＭＰＶ０２６、ｈＭＰＶ０２７及びｈＭＰＶ０３３においてより保存されており、これらの構築物は、ｈＭＰＶ００８及びｈＭＰＶ０２１よりも融合前の立体配座をより優先的に採用していることを示唆している。
実施例４
この実施例では、０日目及び２１日目に、雌Ｂａｌｂ／ｃマウスの両後肢に、集合したｈＭＰＶ００８ ＶＬＰ又はｈＭＰＶ００８ ＣｏｍｐＡ単独を筋肉内注射した。各群の量及び製剤を表７に列挙する。採血を０日目、２４日目及び３５日目に収集し、血清に処理した。０日目の血清試料を群ごとにプールした。全ての血清試料をｈＭＰＶ中和抗体力価アッセイで評価した（図４）。アジュバントであるＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（ミョウバン）又はＡｄｄａｖａｘ（スクアレン水中油型エマルジョン）を含むｈＭＰＶ００８製剤は、２４日目及び３５日目にすべての用量で測定可能な中和力価を誘導し、健康な成人血清の力価に匹敵した（図４）。これらの結果は、ｈＭＰＶ００８ ＶＬＰが健康なヒト対照血清に匹敵する堅牢な中和力価を誘導することを示している。
実施例５
ナイーブマウスにおいて、２成分ウイルス様粒子（ＶＬＰ）上に提示される免疫原性ｈＭＰＶ Ｆタンパク質変異体を探索する試験を行った。４つの異なるｈＭＰＶ Ｆタンパク質変異体、ｈＭＰＶ００８、ｈＭＰＶ０２４、ｈＭＰＶ０２６Ｃ及びｈＭＰＶ０３３のうちの１つ、又はｈＭＰＶ０２６Ｃに対応する可溶性タンパク質を含有するＶＬＰを試験した。各群は、８匹の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスからなった。０日目及び２１日目にマウスを免疫化した。すべての試験品は、水中油アジュバントであるＡｄｄａｖａｘを用いて製剤化された。２つの用量レベル（１μｇ及び０．２５μｇ）又は同等の抗原含有量の可溶性タンパク質を投与した（表８）。ｈＭＰＶ／Ａ及びｈＭＰＶ／Ｂに対する中和抗体価を３５日目の血清から決定した（それぞれ図５Ａ及び図５Ｂ）。結果は、両方のｈＭＰＶ株に対して、すべてのＶＬＰによって強い中和力価が誘導されたことを示した。可溶性タンパク質はまた、両方のｈＭＰＶ株に対してＶＬＰよりも低いレベルで力価を誘導した。
実施例６
ｈＭＰＶ００８ ＶＬＰ及び対応する可溶性タンパク質ＣｏｍｐＡ－ｈＭＰＶ００８の免疫原性を調査するために、ナイーブマウスで研究を行った。ｈＭＰＶ００８ ＶＬＰ及びＣｏｍｐＡ－ｈＭＰＶ００８を、２つの用量レベル（１μｇ及び０．１μｇのＶＬＰ並びにＣｏｍｐＡ－ｈＭＰＶ００８について同等の抗原用量）で水性緩衝液、スクアレン系アジュバント（ＳＥ）、又はＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌに製剤化した。さらに、ＳＥと共に製剤化されたｈＭＰＶ０３３ ＶＬＰ（０．１μｇ）を有する１つの群を含めた（表９）。各群は、８匹の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスからなった。０日目及び２１日目にマウスを免疫化した。ｈＭＰＶ／Ａ及びｈＭＰＶ／Ｂに対する中和抗体価を３５日目の血清から決定した。結果は、ＳＥと共に製剤化されたｈＭＰＶ００８ ＶＬＰが、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ又は水性製剤よりも高い力価をもたらしたことを実証した（図６Ａ及び６Ｂ）。ＶＬＰは、すべての製剤で可溶性タンパク質ＣｏｍｐＡ－ｈＭＰＶ００８よりも高い中和力価を誘導した（図６Ａ及び６Ｂ）。
実施例７
ｈＭＰＶ Ｆタンパク質変異体ｈＭＰＶ００８を示す免疫原性ＶＬＰを調査するために、ナイーブマウスで研究を行った。各群は、８匹の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスからなった。０日目及び２１日目に、水中油アジュバントであるＡｄｄａｖａｘを配合したｈＭＰＶ００８でマウスを免疫化した。表１０に示すように、２つの用量レベル（１ｕｇ及び０．２ｕｇ）のＶＬＰを投与した。３５日目に採取した血清試料からｈＭＰＶ／Ａ及びｈＭＰＶ／Ｂについて中和抗体価を測定した。結果は、強いｈＭＰＶ／Ａ及びｈＭＰＶ／Ｂ中和力価が両方の用量レベルでｈＭＰＶ００８によって誘導されることを実証した（図７Ａ及び７Ｂ）。
実施例８
ｈＭＰＶ０３３の免疫原性を調べるために、ナイーブマウスにおいて研究を行った。各群は、８匹の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスからなった。０日目及び２１日目に、４つの用量レベル（４、２、１、０．５μｇ）で、水中油型アジュバントであるＡｄｄａｖａｘを配合したｈＭＰＶ０３３でマウスを免疫化した（表１１）。３５日目に採取した血清試料からｈＭＰＶ／Ａ及びｈＭＰＶ／Ｂについて中和抗体価を測定した。結果は、強いｈＭＰＶ／Ａ及びｈＭＰＶ／Ｂ中和力価がすべての用量レベルでｈＭＰＶ０３３によって誘導されることを実証した（それぞれ、図８Ａ及び８Ｂ）。
実施例９
コットンラットにおけるｈＭＰＶ感染から保護するｈＭＰＶ０３３の能力を査定及び評価するために、ナイーブコットンラットにおいて研究を行った。ｈＭＰＶ０３３を、Ａｄｄａｖａｘと配合された１μｇの用量レベルで０日目及び２１日目に投与した（表１２）。各群は、８匹の雌コットンラットからなった。ｈＭＰＶ／Ａに対する中和力価を３５日目の血清試料から決定した（図９Ａ）。群を３５日目に１０５ｐｆｕのｈＭＰＶで負荷し（表１２）、４０日目に屠殺した。ウイルス力価を、プラークアッセイにおいて肺又は鼻甲介から決定した。結果は、ｈＭＰＶ０３３が堅牢な中和力価を誘導したことを実証した（図９Ａ）。肺及び鼻甲介組織ホモジネートに対するプラークアッセイは、対照動物の負荷後に肺及び鼻甲介において高いウイルス力価が検出されたことを実証した。対照的に、ワクチン接種したコットンラットのウイルス力価は、肺及び鼻甲介試料の検出下限未満であった。（図９Ｂ及び９Ｃ）。ホルマリン不活性化ｈＭＰＶワクチン接種は、その後の負荷に対して防御しなかった（図９Ｂ～９Ｃ）。
本発明をその提案された特定の実施形態に関連して説明してきたが、本発明はさらなる修正が可能であり、本出願は、一般に、本発明の原理に従って、及び本発明が関係する技術分野内の既知の又は慣習的な実施に含まれるような、及び添付の特許請求の範囲において上述及び以下の本質的な特徴に適用され得るような、本開示からの逸脱を含む、本発明の任意の変形、使用、又は適合を網羅することを意図していることが理解されよう。
一態様では、本開示は、ヒトメタニューモウイルスによる感染に対して対象を免疫化する方法であって、本明細書に記載のワクチンを投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）による感染に対して同時に免疫化される。いくつかの実施形態では、ワクチンは、皮下注射によって投与される。いくつかの実施形態では、ワクチンは、筋肉内注射によって投与される。いくつかの実施形態では、ワクチンは、皮内注射によって投与される。いくつかの実施形態では、ワクチンは、鼻腔内投与される。一態様では、本開示は、本明細書に記載のワクチンを含むプレフィルドシリンジを提供する。一態様では、本開示は、本明細書に記載のワクチン又は本明細書に記載のプレフィルドシリンジを含むキットを提供する。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
第１の成分及び任意に第２の成分を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって、
前記第１の成分が、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）Ｆタンパク質外部ドメイン又はその抗原変異体と、第１の多量体化ドメインとを含む融合タンパク質であり；
前記第２の成分が、存在する場合、第２の多量体化ドメインを含むタンパク質である、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
（項目２）
前記第１の多量体化ドメインが三量体化ドメインである、項目１に記載のＶＬＰ。
（項目３）
前記第１の多量体化ドメインが、配列番号１、４、５、７、９、１８、１９、２１、２４、２５、２６、２９、３０、３１、３４、３６、３７、３９、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、１４４、１４５、又はそれらの機能的変異体から選択される、項目１又は項目２に記載のＶＬＰ。
（項目４）
前記第１の多量体化ドメインが、Ｉ５３－５０Ａ（配列番号１４４）又はその機能的変異体若しくは変異体である、項目１～３のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目５）
前記第１の多量体化ドメインが、下記に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を共有する、項目１～３のいずれか一項に記載のＶＬＰ：
１ ＭＥＥＬＦＫＫＨＫＩ ＶＡＶＬＲＡＮＳＶＥ ＥＡＩＥＫＡＶＡＶＦ ＡＧＧＶＨＬＩＥＩＴ
４１ ＦＴＶＰＤＡＤＴＶＩ ＫＡＬＳＶＬＫＥＫＧ ＡＩＩＧＡＧＴＶＴＳ ＶＥＱＣＲＫＡＶＥＳ
８１ ＧＡＥＦＩＶＳＰＨＬ ＤＥＥＩＳＱＦＣＫＥ ＫＧＶＦＹＭＰＧＶＭ ＴＰＴＥＬＶＫＡＭＫ
１２１ ＬＧＨＴＩＬＫＬＦＰ ＧＥＶＶＧＰＱＦＶＫ ＡＭＫＧＰＦＰＮＶＫ ＦＶＰＴＧＧＶＮＬＤ
１６１ ＮＶＣＥＷＦＫＡＧＶ ＬＡＶＧＶＧＳＡＬＶ ＫＧＴＰＤＥＶＲＥＫ ＡＫＡＦＶＥＫＩＲＧ
２０１ ＣＴＥ（配列番号１４４）
又は
１ ＭＥＥＬＦＫＫＨＫＩ ＶＡＶＬＲＡＮＳＶＥ ＥＡＩＥＫＡＶＡＶＦ ＡＧＧＶＨＬＩＥＩＴ
４１ ＦＴＶＰＤＡＤＴＶＩ ＫＡＬＳＶＬＫＥＫＧ ＡＩＩＧＡＧＴＶＴＳ ＶＥＱＡＲＫＡＶＥＳ
８１ ＧＡＥＦＩＶＳＰＨＬ ＤＥＥＩＳＱＦＡＫＥ ＫＧＶＦＹＭＰＧＶＭ ＴＰＴＥＬＶＫＡＭＫ
１２１ ＬＧＨＴＩＬＫＬＦＰ ＧＥＶＶＧＰＱＦＶＫ ＡＭＫＧＰＦＰＮＶＫ ＦＶＰＴＧＧＶＮＬＤ
１６１ ＮＶＡＥＷＦＫＡＧＶ ＬＡＶＧＶＧＳＡＬＶ ＫＧＴＰＤＥＶＲＥＫ ＡＫＡＦＶＥＫＩＲＧ
２０１ ＡＴＥＬＥ（配列番号１４５）。
（項目６）
前記第１の多量体化ドメインが、配列番号１４４に対して、
アミノ酸置換Ｃ７４Ａ及びＣ９８Ａ；
アミノ酸置換Ｃ１６３Ａ及びＣ２０１Ａ；又は
アミノ酸置換Ｃ７４Ａ、Ｃ９８Ａ、Ｃ１６３Ａ、及びＣ２０１Ａを含む、項目５に記載のＶＬＰ。
（項目７）
前記第１の多量体化ドメインが、配列番号１４４と同一のポリペプチド配列を有する、項目１～３のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目８）
前記第１の多量体化ドメインが、配列番号１４５と同一のポリペプチド配列を有する、項目１～３のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目９）
前記第１の多量体化ドメインがＶＬＰ形成ドメインである、項目１～９のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目１０）
前記第１の多量体化ドメインが、任意に第２の多量体化ドメインを有する正二十面体粒子又は四面体粒子の集合を駆動するように適合されている、項目１～９のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目１１）
第２の多量体化ドメインが、配列番号２、３、６、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２０、２２、２３、２７、２８、３２、３３、３５、３８、４０、並びに４１又はその機能的変異体及び断片から選択される、項目１～１０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目１２）
前記第２の多量体化ドメインが、Ｉ５３－５０Ｂ（配列番号８）、Ｉ５３－５０Ｂ．４ＰｏｓＴ１（配列番号３４）又はその機能的変異体である、項目１～１１のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目１３）
前記（ｈＭＰＶ）Ｆタンパク質外部ドメイン又はその抗原変異体及び前記第１の多量体化ドメインが、リンカー配列によって連結されている、項目１～１２のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目１４）
前記リンカー配列が、フォルドンを含み、前記フォルドン配列が、ＥＫＡＡＫＡＥＥＡＡＲＫ（配列番号１２５）である、項目１３に記載のＶＬＰ。
（項目１５）
前記リンカー配列が、ＧＳＧＧＳＧＳＧＳＧＧＳ（配列番号１２６）を含む、項目１３又は１４に記載のＶＬＰ。
（項目１６）
前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、Ａ１８５Ｐ、Ｑ１００Ｒ、Ｓ１０１Ｒ、Ｔ１２７Ｃ、Ｎ１５３Ｃ、Ｖ８４Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ａ２４９Ｃ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、Ｒ１０２Ｇ、Ａ６３Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｋ４５０Ｃ、Ｓ４７０Ｃ、Ｇ１０６欠失、Ａ１１３Ｃ、Ａ１２０Ｃ、Ａ３３９Ｃ、Ｑ４２６Ｃ、Ｔ１６０Ｆ、Ｑ１００Ｋ、Ｓ１０１Ａ、Ｉ１７７Ｌ、Ｋ４５０Ａ、Ｓ４７０Ａ、Ｇ２９４Ｅ、Ｔ３６５Ｃ、Ｖ４６３Ｃ、Ｌ２１９Ｋ、Ｈ３６８Ｎ、及び／又はＶ２３１Ｉから選択される１つ又は複数の置換又は欠失を含む、項目１～１５のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目１７）
前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、Ｖ８４Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、Ｒ１０２Ｇ、Ａ６３Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｋ４５０Ｃ、Ｓ４７０Ｃ、Ｒ９９Ｇ、Ａ１１３Ｃ、Ａ１２０Ｃ、Ａ３３９Ｃ、Ｑ４２６Ｃ、Ｔ１６０Ｆ、Ｑ１００Ｋ、Ｓ１０１Ａ、Ｑ１００Ｒ、Ｓ１０１Ｒ、Ｇ１０６欠失、Ｓ１０１Ｒ、Ａ１８５Ｐ、Ｉ１７７Ｌ、及び／又はＧ２９４Ｅから選択される１つ又は複数の置換又は欠失を含む、項目１～１５のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目１８）
前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、Ｖ８４Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、Ｒ１０２Ｇ、Ａ６３Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｋ４５０Ｃ、Ｓ４７０Ｃ、Ｒ９９Ｇ、Ａ１１３Ｃ、Ａ１２０Ｃ、Ａ３３９Ｃ、Ｑ４２６Ｃ、Ｔ１６０Ｆ、Ｑ１００Ｋ、Ｓ１０１Ａ、Ｑ１００Ｒ、Ｓ１０１Ｒ、Ｇ１０６欠失、Ｓ１０１Ｒ、Ａ１８５Ｐ、Ｉ１７７Ｌ、及び／又はＧ２９４Ｅから選択される２つ以上の置換又は欠失を含む、項目１～１５のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目１９）
前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、Ａ１８５Ｐ、Ｑ１００Ｒ、Ｓ１０１Ｒ、Ｔ１２７Ｃ、Ｎ１５３Ｃ、Ｔ３６５Ｃ、Ｖ４６３Ｃ、Ｌ２１９Ｋ、Ｖ２３１Ｉ、Ｇ２９４Ｅ、Ｎ１５３Ｃ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、Ｈ３６８Ｎ、及び／又はＲ１０２Ｇから選択される１つ又は複数の置換を含む、項目１～１５のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目２０）
前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、Ａ１８５Ｐ、Ｑ１００Ｒ、Ｓ１０１Ｒ、Ｔ１２７Ｃ、Ｎ１５３Ｃ、Ｔ３６５Ｃ、Ｖ４６３Ｃ、Ｌ２１９Ｋ、Ｖ２３１Ｉ、Ｇ２９４Ｅ、Ｎ１５３Ｃ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、Ｈ３６８Ｎ、及び／又はＲ１０２Ｇのうちの２つ以上を含む、項目１～１５のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目２１）
前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが以下を含む、項目１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ：
ａ．置換Ｑ１００Ｒ及びＳ１０１Ｒ；
ｂ．置換Ａ１８５Ｐ、Ｑ１００Ｒ、及びＳ１０１Ｒ；
ｃ．置換Ａ１８５Ｐ、Ｔ１２７Ｃ、Ｎ１５３Ｃ、Ｑ１００Ｒ、及びＳ１０１Ｒ；
ｄ．置換Ｖ８４Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ａ２４９Ｃ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、及びＲ１０２Ｇ；
ｅ．置換Ａ６３Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｋ４５０Ｃ、Ｓ４７０Ｃ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、及びＲ１０２Ｇ；
ｆ．置換及び欠失Ａ６３Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｇ１０６欠失、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、及びＲ１０２Ｇ；
ｇ．置換Ａ１１３Ｃ、Ａ１２０Ｃ、Ａ３３９Ｃ、Ｑ４２６Ｃ、Ｔ１６０Ｆ、Ｉ１７７Ｌ、Ｑ１００Ｋ、及びＳ１０１Ａ；
ｈ．置換Ｖ８４Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ａ２４９Ｃ、Ｑ１００Ｒ、及びＳ１０１Ｒ；
ｉ．置換Ａ６３Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｋ４５０Ｃ、Ｓ４７０Ｃ、Ｑ１００Ｒ、及びＳ１０１Ｒ；
ｊ．置換及び欠失Ａ６３Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｇ１０６欠失、Ｑ１００Ｒ、及びＳ１０１Ｒ；
ｋ．置換Ａ１１３Ｃ、Ａ１２０Ｃ、Ａ３３９Ｃ、Ｑ４２６Ｃ、Ｔ１６０Ｆ、Ｉ１７７Ｌ、Ｑ１００Ｒ、及びＳ１０１Ｒ；
ｌ．置換Ａ１８５Ｐ、Ａ１１３Ｃ、Ａ３３９Ｃ、Ｑ１００Ｒ、及びＳ１０１Ｒ；
ｍ．置換Ａ１８５Ｐ、Ｔ１６０Ｆ、Ｉ１７７Ｌ、Ｑ１００Ｒ、及びＳ１０１Ｒ；
ｎ．置換Ａ１８５Ｐ、Ａ１１３Ｃ、Ａ３３９Ｃ、Ｔ１６０Ｆ、Ｉ１７７Ｌ、Ｑ１００Ｒ、及びＳ１０１Ｒ；
ｏ．置換Ａ６３Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、及びＲ１０２Ｇ；
ｐ．置換Ａ６３Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｋ４５０Ａ、Ｓ４７０Ａ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、及びＲ１０２Ｇ；
ｑ．置換Ａ６３Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｇ２９４Ｅ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、及びＲ１０２Ｇ；
ｒ．置換Ａ６３Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｋ４５０Ｃ、Ｓ４７０Ｃ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、Ｒ１０２Ｇ、及びＧ２９４Ｅ；
ｓ．置換Ａ６３Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、Ｒ１０２Ｇ、及びＧ２９４Ｅ；
ｔ．置換Ｔ１２７Ｃ、Ｎ１５３Ｃ、Ｔ３６５Ｃ、Ｖ４６３Ｃ、Ａ１８５Ｐ、Ｌ２１９Ｋ、Ｖ２３１Ｉ、Ｇ２９４Ｅ、Ｈ３６８Ｎ、Ｑ１００Ｒ、及びＳ１０１Ｒ；
ｕ．置換Ｖ８４Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ａ２４９Ｃ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、及びＲ１０２Ｇ；又は
ｖ．置換Ｔ１２７Ｃ、Ｎ１５３Ｃ、Ｔ３６５Ｃ、Ｖ４６３Ｃ、Ａ１８５Ｐ、Ｌ２１９Ｋ、Ｖ２３１Ｉ、Ｇ２９４Ｅ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、Ｈ３６８Ｎ、及びＲ１０２Ｇ。
（項目２２）
前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号５８と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、項目１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目２３）
前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号５９と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、項目１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目２４）
前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号６０と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、項目１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目２５）
前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号６１と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、項目１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目２６）
前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号６２と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、項目１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目２７）
前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号６３と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、項目１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目２８）
前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号６４と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、項目１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目２９）
前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号６５と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、項目１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目３０）
前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号６６と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、項目１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目３１）
前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号６７と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、項目１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目３２）
前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号６８と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、項目１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目３３）
前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号６９と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、項目１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目３４）
前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号７０と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、項目１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目３５）
前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号７１と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、項目１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目３６）
前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号７２と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、項目１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目３７）
前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号７３と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、項目１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目３８）
前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号７４と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、項目１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目３９）
前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号７５と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、項目１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目４０）
前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号７６と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、項目１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目４１）
前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号７７と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、項目１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目４２）
前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号７８と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、項目１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目４３）
前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号７９と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、項目１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目４４）
前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号８０と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、項目１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目４５）
前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号８１と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、項目１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目４６）
前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号８２と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、項目１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目４７）
前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号８３と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、項目１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目４８）
前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号８４と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、項目１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目４９）
前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号８５と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、項目１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目５０）
前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号８６と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、項目１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目５１）
前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号８７と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、項目１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目５２）
前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号８８と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、項目１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目５３）
前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号８９と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、項目１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目５４）
前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号９０と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、項目１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目５５）
前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号５８、６０、６１、７７、７８、８６、８７、８８又は８９と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を共有する、項目１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目５６）
前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号５９、６２、６３、６４、７１、７６、８１、又は８３と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を共有する、項目１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目５７）
前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号７２、７９、又は８０と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を共有する、項目１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目５８）
前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号６５、６６、８２、８４、８５、９０、又は９１と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を共有する、項目１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目５９）
前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号６５、７９、又は８０と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を共有する、項目１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目６０）
前記第１の成分が、配列番号９２～１２４と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を共有する、項目１～５９のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目６１）
前記第１の成分が、配列番号９７～１１６、１１９、又は１２２と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を共有する、項目１～５９のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目６２）
前記第１の成分が、配列番号９２～９４、９６、１１７、１１８、１２０、１２１、１２３、又は１２４と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を共有する、項目１～５９のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目６３）
前記第１の成分が、配列番号９９、１１２、１１７、又は１１８と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を共有する、項目１～５９のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目６４）
前記ＶＬＰが、ＭＦ１、ＭＦ２、ＭＦ３、ＭＦ９、ＭＦ１２、ＭＦ１４、ＭＦ１５、ＭＦ１１、ＭＦ１６、ＭＦ２０、ＭＦ１７、ＭＦ１８、ＭＦ１９、ＭＦ１０、又はＭＰＥ８から選択される１つ又は複数のｈＭＰＶ Ｆタンパク質抗体に結合する、項目１～６３のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目６５）
前記ＶＬＰが、ＭＦ１、ＭＦ２、ＭＦ３、ＭＦ９、ＭＦ１２、ＭＦ１４、ＭＦ１５、ＭＦ１１、ＭＦ１６、ＭＦ２０、ＭＦ１７、ＭＦ１８、ＭＦ１９、ＭＦ１０、ＭＰＥ８から選択される２つ以上の抗体に結合する、項目１～６３のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目６６）
前記ＶＬＰが、ＭＦ１、ＭＦ２、ＭＦ３、ＭＦ９、ＭＦ１２、ＭＦ１４、ＭＦ１５、ＭＦ１１、ＭＦ１６、ＭＦ２０、ＭＦ１７、ＭＦ１８、ＭＦ１９、ＭＦ１０、ＭＰＥ８から選択される３つ以上の抗体に結合する、項目１～６３のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目６７）
前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインの融合前形態に優先的に結合する抗体に結合する、項目１～６３のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目６８）
前記第１の成分が、配列番号４２、４５、５８、６１、６３、又は６４と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を共有する、項目６４～６７のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目６９）
前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインの融合後形態に優先的に結合する抗体への結合を有しないか、又は結合が低い、項目１～６３のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
（項目７０）
前記ＶＬＰ配列が、配列番号９９、１１５、１１７、又は１１８と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を共有する、項目６９に記載のＶＬＰ。
（項目７１）
前記第１の成分が、配列番号９９と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を共有する、項目１に記載のＶＬＰ。
（項目７２）
前記第１の成分が一本鎖である、項目１に記載のＶＬＰ。
（項目７３）
前記一本鎖が、配列番号１２３と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を共有する、項目３７に記載のＶＬＰ。
（項目７４）
前記第１の成分が、配列番号１１７と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を共有する、項目１に記載のＶＬＰ。
（項目７５）
項目１～７４のいずれか一項に記載のＶＬＰをコードするポリヌクレオチド。
（項目７６）
項目７５に記載されるポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
（項目７７）
ワクチンを製造する方法であって、項目７６に記載の宿主細胞を、前記宿主細胞が培養培地中に抗原を分泌するように前期培養培地中で培養することと、任意に、前記培養培地から前記抗原を精製することと；前記抗原を第２の成分と混合することであって前記第２の成分が前記抗原と多量体化してウイルス様粒子を形成する、混合することと；任意に、前記ウイルス様粒子を精製することとを含む、方法。
（項目７８）
項目１～７４のいずれか一項に記載のＶＬＰを含むワクチンであって、１つ又は複数の薬学的に許容され得る希釈剤、アジュバント、又は賦形剤を任意に含む、ワクチン。
（項目７９）
安定なエマルジョンである、項目７８に記載のワクチン。
（項目８０）
前記ワクチンが、１つ又は複数のアジュバントを含む、項目７８又は項目７９に記載のワクチン。
（項目８１）
前記１つ又は複数のアジュバントが、スクアレン、ミョウバン、ＳＬＡ、ＧＬＡ、Ｒ８４８、ＩＭＱ、３Ｍ－０５２、ＣｐＧ、サポニン（ＱＳ２１）、又はそれらの組み合わせである、項目８０に記載のワクチン。
（項目８２）
前記アジュバントがミョウバンである、項目８０に記載のワクチン。
（項目８３）
前記アジュバントがスクアレン系エマルジョンである、項目８０に記載のワクチン。
（項目８４）
前記スクアレン系エマルジョンがＭＦ５９である、項目８３に記載のワクチン。
（項目８５）
ヒトメタニューモウイルスによる感染に対して対象を免疫化する方法であって、項目７８～８４のいずれか一項に記載のワクチンを投与することを含む、方法。
（項目８６）
前記対象が呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）による感染に対して同時に免疫化される、項目８５に記載の方法。
（項目８７）
前記ワクチンが皮下注射によって投与される、項目８５に記載の方法。
（項目８８）
前記ワクチンが筋肉内注射によって投与される、項目８５に記載の方法。
（項目８９）
前記ワクチンが皮内注射によって投与される、項目８５に記載の方法。
（項目９０）
前記ワクチンが鼻腔内投与される、項目８５に記載の方法。
（項目９１）
項目７８～８４のいずれか一項に記載のワクチンを含む、プレフィルドシリンジ。
（項目９２）
項目７８～８４のいずれか一項に記載のワクチン又は項目９１に記載のプレフィルドシリンジを含む、キット。
（項目９３）
前記宿主細胞が、フューリン又はその機能的変異体をコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトされる、項目７７に記載の方法。



さらなる例示的なアミノ酸置換を表２に提供する。様々な実施形態において、外部ドメインは、表２に列挙される置換及び代替の置換から選択される１つ又は複数の置換を含む。いくつかの実施形態では、置換はＶＬＰに対して意図された効果を有し、意図された効果は、その置換を有するＶＬＰのすべての実施形態において達成されるわけではないことが理解される。いくつかの実施形態では、意図される効果は、産生細胞株における発現の増加である（Ｍａｓ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．１２：ｅ１００５８５９（２０１６））。いくつかの実施形態では、意図される効果は、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインの融合後形態又は融合前形態を安定化することである（Ｂａｔｔｌｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．８：１５２８（２０１７））。いくつかの実施形態では、意図される効果は、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質に対する中和抗体の結合である。抗原は、Ｎ末端にロイシンをさらに含み得る。

Claims (93)

  1. 第１の成分及び任意に第２の成分を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって、
    前記第１の成分が、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）Ｆタンパク質外部ドメイン又はその抗原変異体と、第１の多量体化ドメインとを含む融合タンパク質であり；
    前記第２の成分が、存在する場合、第２の多量体化ドメインを含むタンパク質である、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
  2. 前記第１の多量体化ドメインが三量体化ドメインである、請求項１に記載のＶＬＰ。
  3. 前記第１の多量体化ドメインが、配列番号１、４、５、７、９、１８、１９、２１、２４、２５、２６、２９、３０、３１、３４、３６、３７、３９、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、１４４、１４５、又はそれらの機能的変異体から選択される、請求項１又は請求項２に記載のＶＬＰ。
  4. 前記第１の多量体化ドメインが、Ｉ５３－５０Ａ（配列番号１４４）又はその機能的変異体若しくは変異体である、請求項１～３のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  5. 前記第１の多量体化ドメインが、下記に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を共有する、請求項１～３のいずれか一項に記載のＶＬＰ：
    １ ＭＥＥＬＦＫＫＨＫＩ ＶＡＶＬＲＡＮＳＶＥ ＥＡＩＥＫＡＶＡＶＦ ＡＧＧＶＨＬＩＥＩＴ
    ４１ ＦＴＶＰＤＡＤＴＶＩ ＫＡＬＳＶＬＫＥＫＧ ＡＩＩＧＡＧＴＶＴＳ ＶＥＱＣＲＫＡＶＥＳ
    ８１ ＧＡＥＦＩＶＳＰＨＬ ＤＥＥＩＳＱＦＣＫＥ ＫＧＶＦＹＭＰＧＶＭ ＴＰＴＥＬＶＫＡＭＫ
    １２１ ＬＧＨＴＩＬＫＬＦＰ ＧＥＶＶＧＰＱＦＶＫ ＡＭＫＧＰＦＰＮＶＫ ＦＶＰＴＧＧＶＮＬＤ
    １６１ ＮＶＣＥＷＦＫＡＧＶ ＬＡＶＧＶＧＳＡＬＶ ＫＧＴＰＤＥＶＲＥＫ ＡＫＡＦＶＥＫＩＲＧ
    ２０１ ＣＴＥ（配列番号１４４）
    又は
    １ ＭＥＥＬＦＫＫＨＫＩ ＶＡＶＬＲＡＮＳＶＥ ＥＡＩＥＫＡＶＡＶＦ ＡＧＧＶＨＬＩＥＩＴ
    ４１ ＦＴＶＰＤＡＤＴＶＩ ＫＡＬＳＶＬＫＥＫＧ ＡＩＩＧＡＧＴＶＴＳ ＶＥＱＡＲＫＡＶＥＳ
    ８１ ＧＡＥＦＩＶＳＰＨＬ ＤＥＥＩＳＱＦＡＫＥ ＫＧＶＦＹＭＰＧＶＭ ＴＰＴＥＬＶＫＡＭＫ
    １２１ ＬＧＨＴＩＬＫＬＦＰ ＧＥＶＶＧＰＱＦＶＫ ＡＭＫＧＰＦＰＮＶＫ ＦＶＰＴＧＧＶＮＬＤ
    １６１ ＮＶＡＥＷＦＫＡＧＶ ＬＡＶＧＶＧＳＡＬＶ ＫＧＴＰＤＥＶＲＥＫ ＡＫＡＦＶＥＫＩＲＧ
    ２０１ ＡＴＥＬＥ（配列番号１４５）。
  6. 前記第１の多量体化ドメインが、配列番号１４４に対して、
    アミノ酸置換Ｃ７４Ａ及びＣ９８Ａ；
    アミノ酸置換Ｃ１６３Ａ及びＣ２０１Ａ；又は
    アミノ酸置換Ｃ７４Ａ、Ｃ９８Ａ、Ｃ１６３Ａ、及びＣ２０１Ａを含む、請求項５に記載のＶＬＰ。
  7. 前記第１の多量体化ドメインが、配列番号１４４と同一のポリペプチド配列を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  8. 前記第１の多量体化ドメインが、配列番号１４５と同一のポリペプチド配列を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  9. 前記第１の多量体化ドメインがＶＬＰ形成ドメインである、請求項１～９のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  10. 前記第１の多量体化ドメインが、任意に第２の多量体化ドメインを有する正二十面体粒子又は四面体粒子の集合を駆動するように適合されている、請求項１～９のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  11. 第２の多量体化ドメインが、配列番号２、３、６、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２０、２２、２３、２７、２８、３２、３３、３５、３８、４０、並びに４１又はその機能的変異体及び断片から選択される、請求項１～１０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  12. 前記第２の多量体化ドメインが、Ｉ５３－５０Ｂ（配列番号８）、Ｉ５３－５０Ｂ．４ＰｏｓＴ１（配列番号３４）又はその機能的変異体である、請求項１～１１のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  13. 前記（ｈＭＰＶ）Ｆタンパク質外部ドメイン又はその抗原変異体及び前記第１の多量体化ドメインが、リンカー配列によって連結されている、請求項１～１２のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  14. 前記リンカー配列が、フォルドンを含み、前記フォルドン配列が、ＥＫＡＡＫＡＥＥＡＡＲＫ（配列番号１２５）である、請求項１３に記載のＶＬＰ。
  15. 前記リンカー配列が、ＧＳＧＧＳＧＳＧＳＧＧＳ（配列番号１２６）を含む、請求項１３又は１４に記載のＶＬＰ。
  16. 前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、Ａ１８５Ｐ、Ｑ１００Ｒ、Ｓ１０１Ｒ、Ｔ１２７Ｃ、Ｎ１５３Ｃ、Ｖ８４Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ａ２４９Ｃ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、Ｒ１０２Ｇ、Ａ６３Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｋ４５０Ｃ、Ｓ４７０Ｃ、Ｇ１０６欠失、Ａ１１３Ｃ、Ａ１２０Ｃ、Ａ３３９Ｃ、Ｑ４２６Ｃ、Ｔ１６０Ｆ、Ｑ１００Ｋ、Ｓ１０１Ａ、Ｉ１７７Ｌ、Ｋ４５０Ａ、Ｓ４７０Ａ、Ｇ２９４Ｅ、Ｔ３６５Ｃ、Ｖ４６３Ｃ、Ｌ２１９Ｋ、Ｈ３６８Ｎ、及び／又はＶ２３１Ｉから選択される１つ又は複数の置換又は欠失を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  17. 前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、Ｖ８４Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、Ｒ１０２Ｇ、Ａ６３Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｋ４５０Ｃ、Ｓ４７０Ｃ、Ｒ９９Ｇ、Ａ１１３Ｃ、Ａ１２０Ｃ、Ａ３３９Ｃ、Ｑ４２６Ｃ、Ｔ１６０Ｆ、Ｑ１００Ｋ、Ｓ１０１Ａ、Ｑ１００Ｒ、Ｓ１０１Ｒ、Ｇ１０６欠失、Ｓ１０１Ｒ、Ａ１８５Ｐ、Ｉ１７７Ｌ、及び／又はＧ２９４Ｅから選択される１つ又は複数の置換又は欠失を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  18. 前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、Ｖ８４Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、Ｒ１０２Ｇ、Ａ６３Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｋ４５０Ｃ、Ｓ４７０Ｃ、Ｒ９９Ｇ、Ａ１１３Ｃ、Ａ１２０Ｃ、Ａ３３９Ｃ、Ｑ４２６Ｃ、Ｔ１６０Ｆ、Ｑ１００Ｋ、Ｓ１０１Ａ、Ｑ１００Ｒ、Ｓ１０１Ｒ、Ｇ１０６欠失、Ｓ１０１Ｒ、Ａ１８５Ｐ、Ｉ１７７Ｌ、及び／又はＧ２９４Ｅから選択される２つ以上の置換又は欠失を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  19. 前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、Ａ１８５Ｐ、Ｑ１００Ｒ、Ｓ１０１Ｒ、Ｔ１２７Ｃ、Ｎ１５３Ｃ、Ｔ３６５Ｃ、Ｖ４６３Ｃ、Ｌ２１９Ｋ、Ｖ２３１Ｉ、Ｇ２９４Ｅ、Ｎ１５３Ｃ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、Ｈ３６８Ｎ、及び／又はＲ１０２Ｇから選択される１つ又は複数の置換を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  20. 前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、Ａ１８５Ｐ、Ｑ１００Ｒ、Ｓ１０１Ｒ、Ｔ１２７Ｃ、Ｎ１５３Ｃ、Ｔ３６５Ｃ、Ｖ４６３Ｃ、Ｌ２１９Ｋ、Ｖ２３１Ｉ、Ｇ２９４Ｅ、Ｎ１５３Ｃ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、Ｈ３６８Ｎ、及び／又はＲ１０２Ｇのうちの２つ以上を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  21. 前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが以下を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ：
    ａ．置換Ｑ１００Ｒ及びＳ１０１Ｒ；
    ｂ．置換Ａ１８５Ｐ、Ｑ１００Ｒ、及びＳ１０１Ｒ；
    ｃ．置換Ａ１８５Ｐ、Ｔ１２７Ｃ、Ｎ１５３Ｃ、Ｑ１００Ｒ、及びＳ１０１Ｒ；
    ｄ．置換Ｖ８４Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ａ２４９Ｃ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、及びＲ１０２Ｇ；
    ｅ．置換Ａ６３Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｋ４５０Ｃ、Ｓ４７０Ｃ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、及びＲ１０２Ｇ；
    ｆ．置換及び欠失Ａ６３Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｇ１０６欠失、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、及びＲ１０２Ｇ；
    ｇ．置換Ａ１１３Ｃ、Ａ１２０Ｃ、Ａ３３９Ｃ、Ｑ４２６Ｃ、Ｔ１６０Ｆ、Ｉ１７７Ｌ、Ｑ１００Ｋ、及びＳ１０１Ａ；
    ｈ．置換Ｖ８４Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ａ２４９Ｃ、Ｑ１００Ｒ、及びＳ１０１Ｒ；
    ｉ．置換Ａ６３Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｋ４５０Ｃ、Ｓ４７０Ｃ、Ｑ１００Ｒ、及びＳ１０１Ｒ；
    ｊ．置換及び欠失Ａ６３Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｇ１０６欠失、Ｑ１００Ｒ、及びＳ１０１Ｒ；
    ｋ．置換Ａ１１３Ｃ、Ａ１２０Ｃ、Ａ３３９Ｃ、Ｑ４２６Ｃ、Ｔ１６０Ｆ、Ｉ１７７Ｌ、Ｑ１００Ｒ、及びＳ１０１Ｒ；
    ｌ．置換Ａ１８５Ｐ、Ａ１１３Ｃ、Ａ３３９Ｃ、Ｑ１００Ｒ、及びＳ１０１Ｒ；
    ｍ．置換Ａ１８５Ｐ、Ｔ１６０Ｆ、Ｉ１７７Ｌ、Ｑ１００Ｒ、及びＳ１０１Ｒ；
    ｎ．置換Ａ１８５Ｐ、Ａ１１３Ｃ、Ａ３３９Ｃ、Ｔ１６０Ｆ、Ｉ１７７Ｌ、Ｑ１００Ｒ、及びＳ１０１Ｒ；
    ｏ．置換Ａ６３Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、及びＲ１０２Ｇ；
    ｐ．置換Ａ６３Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｋ４５０Ａ、Ｓ４７０Ａ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、及びＲ１０２Ｇ；
    ｑ．置換Ａ６３Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｇ２９４Ｅ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、及びＲ１０２Ｇ；
    ｒ．置換Ａ６３Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｋ４５０Ｃ、Ｓ４７０Ｃ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、Ｒ１０２Ｇ、及びＧ２９４Ｅ；
    ｓ．置換Ａ６３Ｃ、Ｋ１８８Ｃ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、Ｒ１０２Ｇ、及びＧ２９４Ｅ；
    ｔ．置換Ｔ１２７Ｃ、Ｎ１５３Ｃ、Ｔ３６５Ｃ、Ｖ４６３Ｃ、Ａ１８５Ｐ、Ｌ２１９Ｋ、Ｖ２３１Ｉ、Ｇ２９４Ｅ、Ｈ３６８Ｎ、Ｑ１００Ｒ、及びＳ１０１Ｒ；
    ｕ．置換Ｖ８４Ｃ、Ａ１４０Ｃ、Ａ１４７Ｃ、Ａ２４９Ｃ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、及びＲ１０２Ｇ；又は
    ｖ．置換Ｔ１２７Ｃ、Ｎ１５３Ｃ、Ｔ３６５Ｃ、Ｖ４６３Ｃ、Ａ１８５Ｐ、Ｌ２１９Ｋ、Ｖ２３１Ｉ、Ｇ２９４Ｅ、Ｎ９７Ｇ、Ｐ９８Ｇ、Ｒ９９Ｇ、Ｑ１００Ｇ、Ｓ１０１Ｇ、Ｈ３６８Ｎ、及びＲ１０２Ｇ。
  22. 前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号５８と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  23. 前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号５９と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  24. 前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号６０と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  25. 前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号６１と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  26. 前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号６２と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  27. 前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号６３と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  28. 前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号６４と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  29. 前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号６５と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  30. 前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号６６と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  31. 前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号６７と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  32. 前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号６８と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  33. 前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号６９と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  34. 前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号７０と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  35. 前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号７１と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  36. 前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号７２と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  37. 前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号７３と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  38. 前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号７４と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  39. 前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号７５と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  40. 前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号７６と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  41. 前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号７７と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  42. 前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号７８と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  43. 前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号７９と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  44. 前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号８０と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  45. 前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号８１と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  46. 前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号８２と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  47. 前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号８３と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  48. 前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号８４と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  49. 前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号８５と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  50. 前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号８６と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  51. 前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号８７と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  52. 前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号８８と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  53. 前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号８９と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  54. 前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号９０と少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を共有する配列を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  55. 前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号５８、６０、６１、７７、７８、８６、８７、８８又は８９と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を共有する、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  56. 前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号５９、６２、６３、６４、７１、７６、８１、又は８３と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を共有する、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  57. 前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号７２、７９、又は８０と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を共有する、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  58. 前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号６５、６６、８２、８４、８５、９０、又は９１と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を共有する、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  59. 前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、配列番号６５、７９、又は８０と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を共有する、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  60. 前記第１の成分が、配列番号９２～１２４と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を共有する、請求項１～５９のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  61. 前記第１の成分が、配列番号９７～１１６、１１９、又は１２２と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を共有する、請求項１～５９のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  62. 前記第１の成分が、配列番号９２～９４、９６、１１７、１１８、１２０、１２１、１２３、又は１２４と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を共有する、請求項１～５９のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  63. 前記第１の成分が、配列番号９９、１１２、１１７、又は１１８と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を共有する、請求項１～５９のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  64. 前記ＶＬＰが、ＭＦ１、ＭＦ２、ＭＦ３、ＭＦ９、ＭＦ１２、ＭＦ１４、ＭＦ１５、ＭＦ１１、ＭＦ１６、ＭＦ２０、ＭＦ１７、ＭＦ１８、ＭＦ１９、ＭＦ１０、又はＭＰＥ８から選択される１つ又は複数のｈＭＰＶ Ｆタンパク質抗体に結合する、請求項１～６３のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  65. 前記ＶＬＰが、ＭＦ１、ＭＦ２、ＭＦ３、ＭＦ９、ＭＦ１２、ＭＦ１４、ＭＦ１５、ＭＦ１１、ＭＦ１６、ＭＦ２０、ＭＦ１７、ＭＦ１８、ＭＦ１９、ＭＦ１０、ＭＰＥ８から選択される２つ以上の抗体に結合する、請求項１～６３のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  66. 前記ＶＬＰが、ＭＦ１、ＭＦ２、ＭＦ３、ＭＦ９、ＭＦ１２、ＭＦ１４、ＭＦ１５、ＭＦ１１、ＭＦ１６、ＭＦ２０、ＭＦ１７、ＭＦ１８、ＭＦ１９、ＭＦ１０、ＭＰＥ８から選択される３つ以上の抗体に結合する、請求項１～６３のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  67. 前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインの融合前形態に優先的に結合する抗体に結合する、請求項１～６３のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  68. 前記第１の成分が、配列番号４２、４５、５８、６１、６３、又は６４と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を共有する、請求項６４～６７のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  69. 前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインが、前記ｈＭＰＶ Ｆタンパク質外部ドメインの融合後形態に優先的に結合する抗体への結合を有しないか、又は結合が低い、請求項１～６３のいずれか一項に記載のＶＬＰ。
  70. 前記ＶＬＰ配列が、配列番号９９、１１５、１１７、又は１１８と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を共有する、請求項６９に記載のＶＬＰ。
  71. 前記第１の成分が、配列番号９９と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を共有する、請求項１に記載のＶＬＰ。
  72. 前記第１の成分が一本鎖である、請求項１に記載のＶＬＰ。
  73. 前記一本鎖が、配列番号１２３と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を共有する、請求項３７に記載のＶＬＰ。
  74. 前記第１の成分が、配列番号１１７と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を共有する、請求項１に記載のＶＬＰ。
  75. 請求項１～７４のいずれか一項に記載のＶＬＰをコードするポリヌクレオチド。
  76. 請求項７５に記載されるポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
  77. ワクチンを製造する方法であって、請求項７６に記載の宿主細胞を、前記宿主細胞が培養培地中に抗原を分泌するように前期培養培地中で培養することと、任意に、前記培養培地から前記抗原を精製することと；前記抗原を第２の成分と混合することであって前記第２の成分が前記抗原と多量体化してウイルス様粒子を形成する、混合することと；任意に、前記ウイルス様粒子を精製することとを含む、方法。
  78. 請求項１～７４のいずれか一項に記載のＶＬＰを含むワクチンであって、１つ又は複数の薬学的に許容され得る希釈剤、アジュバント、又は賦形剤を任意に含む、ワクチン。
  79. 安定なエマルジョンである、請求項７８に記載のワクチン。
  80. 前記ワクチンが、１つ又は複数のアジュバントを含む、請求項７８又は請求項７９に記載のワクチン。
  81. 前記１つ又は複数のアジュバントが、スクアレン、ミョウバン、ＳＬＡ、ＧＬＡ、Ｒ８４８、ＩＭＱ、３Ｍ－０５２、ＣｐＧ、サポニン（ＱＳ２１）、又はそれらの組み合わせである、請求項８０に記載のワクチン。
  82. 前記アジュバントがミョウバンである、請求項８０に記載のワクチン。
  83. 前記アジュバントがスクアレン系エマルジョンである、請求項８０に記載のワクチン。
  84. 前記スクアレン系エマルジョンがＭＦ５９である、請求項８３に記載のワクチン。
  85. ヒトメタニューモウイルスによる感染に対して対象を免疫化する方法であって、請求項７８～８４のいずれか一項に記載のワクチンを投与することを含む、方法。
  86. 前記対象が呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）による感染に対して同時に免疫化される、請求項８５に記載の方法。
  87. 前記ワクチンが皮下注射によって投与される、請求項８５に記載の方法。
  88. 前記ワクチンが筋肉内注射によって投与される、請求項８５に記載の方法。
  89. 前記ワクチンが皮内注射によって投与される、請求項８５に記載の方法。
  90. 前記ワクチンが鼻腔内投与される、請求項８５に記載の方法。
  91. 請求項７８～８４のいずれか一項に記載のワクチンを含む、プレフィルドシリンジ。
  92. 請求項７８～８４のいずれか一項に記載のワクチン又は請求項９１に記載のプレフィルドシリンジを含む、キット。
  93. 前記宿主細胞が、フューリン又はその機能的変異体をコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトされる、請求項７７に記載の方法。
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