ES2456960T3 - Fitasa de Hafnia - Google Patents

Abstract

Un polipéptido aislado que tiene actividad de fitasa, seleccionado del grupo que consiste en: un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85% identidad con los aminoácidos 1 a 413 de la SEQ ID NO: 10 sobre la longitud de aminoácidos 1 a 413 de la SEQ ID NO:10, donde la termoestabilidad relativa al polipéptido de aminoácidos 1 a 413 de la SEQ ID NO:10 es, o bien inafectada, o bien mejorada.

Description

Fitasa de Hafnia Listado de secuencias [0001] La presente solicitud contiene una copia en papel y en formato digital de un listado de secuencias. Depósito de material biológico [0002] Una cepa bacteriana que produce fitasa fue aislada a partir de suelo danés. Se demostró que la cepa produce

una fitasa con pH óptimo ácido y alta termoestabilidad. La cepa fue identificada como Hafnia alvei y fue depositada el 21 de Marzo de 2007, según las condiciones del Tratado de Budapest con el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) y se le dio el siguiente número de acceso:

Depósito Número de acceso Fecha del depósito

Hafnia alvei NN020125 DSM 19197 21 de Marzo de 2007

Campo de la invención

[0003] La presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen actividad de fitasa y polinucleótidos aislados que codifican los polipéptidos. Los polipéptidos están relacionados con una fitasa derivada de la Hafnia alvei, la secuencia de aminoácidos que se muestra en el listado de secuencias anexo como SEQ ID NO: 10. La invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos, vectores y células huésped que comprenden los polinucleótidos así como los métodos para producir y usar los polipéptidos, en particular en piensos para animales.

Antecedentes de la invención

[0004] Las fitasas son enzimas bien conocidas, como lo son las ventajas de añadirlas a productos alimenticios para animales, incluyendo humanos. Las fitasas han sido aisladas a partir de muchas fuentes, incluyendo varias cepas fúngicas y bacterianas.

[0005] Específicamente WO 2006/043178 (DANISCO) divulga fitasas de una cepa de Buttiauxiella sp. y variantes de la misma. Estas fitasas son aproximadamente idénticas en un 70% a las fitasas de la presente invención.

[0006] Es un objetivo de la presente invención el proporcionar polipéptidos alternativos que tienen actividad de fitasa y polinucleótidos que codifican los polipéptidos. Los polipéptidos de la invención son preferiblemente de propiedades modificadas, más preferiblemente mejoradas, por ejemplo, de una especificidad de sustrato diferente, de una actividad específica más alta, de una estabilidad incrementada (como por ejemplo estabilidad ácida, estabilidad calorífica y/o estabilidad de proteasa, en particular estabilidad de pepsina), de un pH óptimo alterado (por ejemplo un pH óptimo inferior o más alto) y/o de un rendimiento mejorado en piensos para animales (como por ejemplo una liberación y/o degradación de fitato mejorada).

Resumen de la invención

[0007] La presente invención se refiere a un polipéptido aislado con actividad de fitasa, seleccionado del grupo que consta de:

un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85% de identidad con los aminoácidos 1 a 413 de la SEQ ID NO: 10 sobre la longitud de los aminoácidos 1 a 413 de la SEQ ID NO: 10, donde la termoestabilidad relativa al polipéptido de aminoácidos 1 a 413 de la SEQ ID NO: 10 es, o bien no afectada, o bien mejorada.

[0008] La invención también se refiere a polinucleótidos aislados que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la invención.

[0009] La invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos que comprenden los polinucleótidos de la invención operativamente enlazados a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped de expresión, vectores de expresión recombinantes que comprenden el constructo de ácidos nucleicos de la invención y células huésped recombinantes que comprenden los constructos de ácidos nucleicos.

[0010] La invención se refiere también a métodos para producir tales polipéptidos de la invención que comprenden (a) cultivar una célula, que en su forma de tipo salvaje es capaz de producir el polipéptido o una célula huésped recombinante de la invención, bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.

[0011] La invención se refiere adicionalmente a un método para la producción de un producto de fermentación, que comprende (a) fermentar un material que contiene carbohidratos en presencia de una fitasa de la invención usando un microorganismo fermentativo y (b) producir el producto de fermentación o el coproducto de fermentación del material fermentado que contiene carbohidratos, por el que el producto de fermentación es preferiblemente etanol, cerveza, vino

o granos secos de destilería (GSD).

[0012] La invención también se refiere a una planta transgénica, parte de la planta o célula vegetal, que ha sido transformada con un polinucleótido que codifica el polipéptido de la invención.

[0013] Adicionalmente la invención se refiere a un aditivo para pienso que comprende

(a)

al menos un polipéptido de la invención; y

(b)

al menos una vitamina soluble en grasa, al menos una vitamina hidrosoluble, al menos un oligoelemento o combinaciones de los mismos.

[0014] Según la invención, tal aditivo de pienso puede además comprender al menos una amilasa, al menos una fitasa adicional, al menos una xilanasa, al menos una galactanasa, al menos una alfa-galactosidasa, al menos una proteasa, al menos una fosfolipasa y/o al menos una beta-glucanasa.

[0015] La invención se refiere adicionalmente a una composición de pienso para animales con un contenido bruto de proteína de 50 a 800 g/kg y que comprende al menos un polipéptido de la invención y el uso de al menos un polipéptido de la invención en pienso para animales o en la preparación de una composición para uso en pienso para animales.

Breve descripción de las figuras

[0016]

Fig. 1 muestra el fósforo residual unido al inositol-fosfato después de incubación in vitro, en una comparación entre la fitasa de Hafnia alvei y una fitasa de Citrobacter braakii dosificada desde 125 hasta 500 FYT/kg de pienso.

Fig. 2 muestra una comparación del fósforo residual enlazado al inositol-fosfato después de incubación in vitro entre la fitasa de Hafnia alvei y una fitasa Peniophora lycii dosificada a 250 FYT/kg de pienso y a 500 FYT/kg de pienso.

Fig. 3 muestra el Apéndice de las coordenadas estructurales para la estructura tridimensional cristalina resuelta de la fitasa de Hafnia alvei.

Definiciones

[0017] Actividad de fitasa: en el presente contexto, un polipéptido con actividad de fitasa (una fitasa) es una enzima que cataliza la hidrólisis de fitato (myo-inositol hexakisfosfato) a (1) myo-inositol y/o (2) mono-, di-, tri-, tetra y/o pentafosfatos del mismo y (3) fosfato inorgánico.

[0018] El sitio ENZYMA en Internet (www.expasy.ch/enzyme/) es un repositorio de información relativo a la nomenclatura de enzimas. Está principalmente basado en las recomendaciones del Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (IUB-MB) y describe cada tipo de enzima caracterizada para la cual un número EC (Comisión Enzimática) ha sido proporcionado (Bairoch A. The ENZYME database, 2000, Nucleic Acid Res 28:304-305). Ver también el manual de Nomenclatura Enzimática de NC-IUBMB, 1992.

[0019] Según el sitio ENZYMA, se conocen tres tipos diferentes de fitasas: una 3-fitasa (myo-inositol hexafosfato 3fosfohidrolasa, EC 3.1.3.8), una 6-fitasa (myo-inositol hexafosfato 6-fosfohidrolasa, EC 3.1.3.26) y una 5-fitasa (EC 3.1.3.72). A efectos de la presente invención, todos los tipos se incluyen en la definición de fitasa.

[0020] En una realización particular, las fitasas de la invención pertenecen a la familia de las fosfatasas de histidina ácida, que incluyen la fosfatasa ácida de Escherichia coli con pH 2.5 (gen appA) así como fitasas fúngicas tales como las fitasas de Aspergillus awamorii A y B (EC: 3.1.3.8) (genes PhyA y phyB). Las fosfatasas de ácido de histidina comparten dos regiones de similitud de la secuencia, cada una centrada alrededor de un residuo de histidina conservado. Estas dos histidinas parecen estar implicadas en el mecanismo catalítico de las enzimas. La primera histidina se sitúa en la sección N-terminal y forma un intermedio de fosfo-histidina mientras que la segunda se localiza en la sección C-terminal y posiblemente actúa como donante de protones.

[0021] En una forma de realización particular adicional, las fitasas de la invención tienen un motivo conservado de sitio activo, esto es, R-H-G-X-R-X-P, donde X designa cualquier aminoácido (ver aminoácidos 18 a 24 de la fitasa madura mostrados en la SEQ ID NO: 10).

[0022] A efectos de la presente invención la actividad de fitasa se determina en unidades FYT, siendo una FYT la cantidad de enzima que libera 1 micro-mol de ortofosfato inorgánico por minuto bajo las siguientes condiciones: pH 5.5;

temperatura 37°C; sustrato: fitato de sodio (C6 H6 O24 P6 Na12) en una concentración de 0.0050 mol/L. Ensayos adecuados de fitasa son los ensayos FYT y FTU descritos en ejemplo 1 de WO 00/20569. El FTU sirve para determinar la actividad de fitasa en el pienso y la premezcla. La actividad de fitasa puede también ser determinada usando los ensayos de fitasa de los ejemplos en este documento.

[0023] pH óptimo: el pH óptimo de un polipéptido de la invención se determina incubando la fitasa con varios valores de pH, usando un sustrato en una concentración predeterminada y una temperatura de incubación fija. El pH óptimo se determina luego a partir de una representación gráfica de la actividad de fitasa en función del pH. En una realización particular se usa el ensayo FYT, esto es, el sustrato es fitato de sodio de 5mM, la temperatura de reacción es 37°C y la actividad se determina en unidades FYT con varios valores de pH, como se hace más adelante en los ejemplos. En otra forma de realización particular se usa el ensayo de fitasa de cualquiera de los ejemplos. Un pH óptimo relativamente bajo significa un pH óptimo por debajo de pH 5.0, por ejemplo por debajo de pH 4.5, 4.0, 3.5, 3.0, 2.5 o incluso por debajo de 2.0. Un pH óptimo relativamente alto significa un pH óptimo por encima de pH 5.0, por ejemplo por encima de pH 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5 o incluso por encima de 9.0.

[0024] Polipéptido aislado: el término "polipéptido aislado" tal como se usa en este caso se refiere a un polipéptido que es puro al menos en un 20%, preferiblemente puro al menos en un 40%, más preferiblemente puro al menos en un 60%, incluso más preferiblemente puro al menos en un 80%, de la forma más preferible puro al menos en un 90% e incluso de la forma más preferible puro al menos en un 95%, tal como se determina mediante SDS-PAGE.

[0025] Polipéptido sustancialmente puro: el término "polipéptido sustancialmente puro" denota en este caso un preparado de polipéptido que contiene como mucho un 10%, preferiblemente como mucho un 8%, más preferiblemente como mucho un 6%, más preferiblemente como mucho un 5%, más preferiblemente como mucho un 4%, como mucho un 3%, incluso más preferiblemente como mucho un 2%, de la forma más preferible como mucho 1% e incluso de la forma más preferible como mucho un 0.5% en peso de otro material de polipéptido con el cual esté originalmente asociado. Se prefiere, por lo tanto, que el polipéptido sustancialmente puro sea puro al menos en un 92%, preferiblemente puro al menos en un 94%, más preferiblemente puro al menos en un 95%, más preferiblemente puro al menos en un 96%, más preferiblemente puro al menos en un 96%, más preferiblemente puro al menos en un 97%, más preferiblemente puro al menos en un 98%, incluso más preferiblemente puro al menos en un 99%, de la forma más preferible puro al menos en un 99.5% e incluso de la forma más preferible puro al 100% en peso del material de polipéptido total presente en el preparado.

[0026] Los polipéptidos de la presente invención están preferiblemente en una forma sustancialmente pura. En particular, se prefiere que los polipéptidos estén en "forma esencialmente pura", es decir, que el preparado de polipéptidos esté esencialmente libre de otro material polipeptídico con el cual esté originalmente asociado. Esto se puede lograr, por ejemplo, preparando el polipéptido mediante métodos recombinantes bien conocidos o por métodos de purificación tradicionales.

[0027] En este caso, el término "polipéptido sustancialmente puro" es sinónimo de los términos “polipéptido aislado” y "polipéptido en forma aislada".

[0028] Identidad: el parentesco entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos es descrito por el parámetro "identidad".

[0029] A efectos de la presente invención, el grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos, así como el grado de identidad entre dos secuencias de nucleótidos, se determina mediante el programa "Align" que es un alineamiento Needleman-Wunsch (es decir, alineamiento global), útil para alineamientos tanto de proteínas como de ADN. La matriz de puntuación por defecto BLOSUM50 y la matriz de identidad por defecto se usan para alineamientos de proteínas y ADN respectivamente. La penalización para el primer residuo en un gap es -12 para proteínas y -16 para ADN. Mientras que las penalizaciones para residuos adicionales en un gap son -2 para proteínas y -4 para ADN.

[0030] "Align" es parte del paquete FASTA versión v20u6 (ver W.R. Pearson y D.J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis" PNAS 85:2444-2448, y W.R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology 183:63-98) Los alineamientos de proteínas mediante FASTA usan el algoritmo Smith-Waterman sin limitación en el tamaño de gap (ver "Smith-Waterman algorithm", T. F. Smith y M. S. Waterman (1981) J. Mol. Biol. 147:195-197).

[0031] El algoritmo Needleman-Wunsch es descrito en Needleman, S.B. y Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48: 443-453 y el programa Align por Miers y W. Miller en "Optimal Alignments in Linear Space" CABIOS (aplicaciones de ordenador en las biociencias, por sus siglas en inglés) (1988) 4:11-17.

[0032] El grado de identidad entre la secuencia diana (o muestra, o prueba) y una secuencia especificada (aminoácidos 1 a 413 de la fitasa madura mostrada en la SEQ ID NO: 10) se puede determinar de la siguiente manera: las secuencias son alineadas usando el programa "Align". Se determina el número de correspondencias perfectas ("N-correspondenciaperfecta") en el alineamiento (una correspondencia perfecta significa el mismo residuo de aminoácido en la misma

posición de alineamiento, normalmente designada con una "I" en el alineamiento). Se determina la longitud (el número de residuos de aminoácidos) de la secuencia especificada ("N-especificada", aquí = 413). El grado de identidad se calcula como la razón entre "N-especificada" y "N-correspondencia-perfecta" (para la conversión a porcentaje de identidad multiplicar por 100).

[0033] En una realización alternativa, el grado de identidad entre una secuencia diana (o muestra, o prueba) y la secuencia especificada (aminoácidos 1 a 413 de la SEQ ID NO: 10) se determina de la siguiente manera: las dos secuencias son alineadas usando el programa "align". Se determina el número de correspondencias perfectas ("Ncorrespondencia-perfecta") en el alineamiento (una correspondencia perfecta significa el mismo residuo de aminoácido en la misma posición de alineamiento, normalmente designada con una "I" en el alineamiento). La longitud común de las dos secuencias alineadas se determina también, esto es, el número total de aminoácidos en la parte del alineamiento que se solapa ("N-solapamiento"). El grado de identidad se calcula como la razón entre "N-solapamiento" y "Ncorrespondencia-perfecta" (para la conversión a porcentaje de identidad multiplicar por 100). El N-solapamiento excluye gaps iniciales y finales creados por el alineamiento, si los hay.

[0034] Fragmento de polipéptido: el término "fragmento de polipéptido" se define en este caso como un polipéptido que tiene uno o más aminoácidos delecionados de los terminales amino y/o carboxilo de la parte madura del péptido de la secuencia especificada, por ejemplo la SEQ ID NO: 10 o una secuencia homóloga de la misma, donde el fragmento tiene actividad de fitasa. En realizaciones particulares, el fragmento contiene al menos 350, 360, 370, 380, 390, 400, 405 o al menos 410 residuos de aminoácidos.

[0035] Subsecuencia: el término "subsecuencia" se define en este caso como una secuencia de nucleótidos con uno o más nucleótidos delecionados de los extremos 5' y/o 3' de la parte madura de codificación del péptido de la secuencia especificada, por ejemplo SEQ ID NO: 9, o una secuencia homóloga de la misma, donde la subsecuencia codifica un fragmento de polipéptido con actividad de fitasa. En realizaciones particulares, la subsecuencia contiene al menos 1050, 1080, 1110, 1140, 1170, 1200, 1215, 1230, 1245, 1260, 1275, 1290, 1305, 1320 o al menos 1335 nucleótidos.

[0036] Variante alélica: el término "variante alélica" denota en este caso cualesquiera dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge naturalmente a través de mutaciones y puede suponer polimorfismo dentro de las poblaciones. Las mutaciones de genes pueden ser silenciosas (sin cambios en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.

[0037] Polinucleótido sustancialmente puro: el término "polinucleótido sustancialmente puro" tal como se usa en este caso se refiere a un preparado de polinucleótidos libre de otros nucleótidos superfluos o no deseados y en una forma adecuada para el uso dentro de sistemas de producción de proteínas diseñadas genéticamente. Así, un polinucleótido sustancialmente puro contiene como mucho un 10%, preferiblemente como mucho un 8%, más preferiblemente como mucho un 6%, más preferiblemente como mucho un 5%, más preferiblemente como mucho un 4%, más preferiblemente como mucho un 3%, incluso más preferiblemente como mucho un 2%, de la forma más preferible como mucho un 1% e incluso de la forma más preferible como mucho un 0.5% en peso de otro material polinucleótido con el cual está originalmente asociado. Un polinucleótido sustancialmente puro puede, no obstante, incluir regiones 5' y 3' no traducidas de origen natural, tales como promotores y terminadores. Se prefiere que el polinucleótido sustancialmente puro sea puro al menos en un 90%, preferiblemente puro al menos en un 92%, más preferiblemente puro al menos en un 94%, más preferiblemente puro al menos en un 95%, más preferiblemente puro al menos en un 96%, más preferiblemente puro al menos en un 97%, incluso más preferiblemente puro al menos en un 98%, de la forma más preferible puro al menos en un 99% e incluso de la forma más preferible puro al menos en un 99.5% puro en peso. Los polinucleótidos de la presente invención están preferiblemente en una forma sustancialmente pura. En particular, se prefiere que los polinucleótidos descritos aquí estén en "forma esencialmente pura", es decir, que el preparado de polinucleótidos esté esencialmente libre de otro material de polinucleótidos con el cual esté originalmente asociado. Aquí, el término "nucleótido sustancialmente puro" es sinónimo de los términos “polinucleótido aislado” y " polinucleótido en forma aislada". Los polinucleótidos puede ser de origen genómico, ADNc, ARN, semisintético, sintético o cualquier combinación de los mismos.

[0038] Constructo de ácidos nucleicos: el término "constructo de ácidos nucleicos" tal como se utiliza en este caso se refiere a una molécula de ácido nucleico tanto mono- como bicatenario, que es aislada de un gen de origen natural o que se modifica para contener segmentos de ácidos nucleicos de forma que de otra manera no existirían en naturaleza. El término constructo de ácidos nucleicos es sinónimo del término "casete de expresión" cuando el constructo de ácidos nucleicos contiene las secuencias de control requeridas para la expresión de una secuencia codificante de la presente invención.

[0039] Secuencia de control: el término "secuencia de control" es definido en este caso para incluir todos los componentes, que son necesarios o favorables para la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa o extranjera a la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Tales secuencias de control incluyen, pero de no se limitan a, un líder, una secuencia de poliadenilación, una secuencia de propéptidos, un promotor, una secuencia de péptidos señal y terminador de transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor y señales de terminación traduccionales y

transcripcionales. Las secuencias de control se pueden proporcionar con enlazadores con el propósito de introducir sitios de restricción específicos que faciliten la unión de las secuencias de control con la región de codificación de la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido.

[0040] Operativamente enlazado: el término "operativamente enlazado" denota en este caso una configuración en la que una secuencia de control se sitúa en una posición apropiada en relación a la secuencia codificante de la secuencia de polinucleótidos tal que la secuencia de control dirige la expresión de la secuencia codificante de un polipéptido.

[0041] Secuencia codificante: cuando se usa en este caso el término "secuencia codificante" significa una secuencia de nucleótidos que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de su producto proteínico. Los bordes de la secuencia codificante están generalmente determinados por un marco de lectura abierto, que comienza normalmente con el codón ATG de inicio o con codones de inicio alternativos tales como GTG y TTG. La secuencia codificante puede ser un ADN, ADNc o una secuencia recombinante de nucleótidos.

[0042] Parte madura del polipéptido: cuando se usan en este caso los términos "parte madura del péptido" o "parte madura del polipéptido" se refieren a aquella parte del polipéptido que es segregada por una célula que contiene, como parte de su equipamiento genético, un polinucleótido que codifica el polipéptido. En otras palabras, la parte madura del polipéptido se refiere a aquella parte del polipéptido que permanece después de que la parte de péptido señal se corta una vez ha cumplido su función de dirigir el polipéptido codificado hacia la vía secretora de la célula. La parte de péptido señal predicha de la SEQ ID NO: 10 son los aminoácidos -33 a -1 de la misma, lo que significa que la parte madura de polipéptido predicha de la SEQ ID NO: 10 corresponde a los aminoácidos 1 a 413 del mismo. No obstante, una ligera variación puede ocurrir de célula huésped a célula huésped, y por lo tanto se prefiere la parte madura de expresión del polipéptido.

[0043] Parte de codificación madura del polipéptido: cuando se usa en este caso el término "parte de codificación madura del polipéptido" o "secuencia codificante madura del polipéptido" se refiere a aquella parte del polinucleótido que codifica el polipéptido el cual codifica la parte madura del polipéptido. Por ejemplo, para la SEQ ID NO: 9, la parte madura de codificación del polipéptido predicha corresponde a los nucleótidos 100 a 1338 (codificando los aminoácidos 1 a 413 de la SEQ ID NO: 10).

[0044] Expresión: el término "expresión" incluye cualquier paso implicado en la producción del polipéptido incluyendo, pero no limitado a, transcripción, modificación postranscripcional, traducción, modificación postraduccional y secreción.

[0045] Vector de expresión: el término "vector de expresión" se define en este caso como una molécula de ADN lineal o circular que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de la invención y que se enlaza operativamente a nucleótidos adicionales que garantizan su expresión.

[0046] Célula huésped: el término "célula huésped", como se utiliza en este caso, incluye cualquier tipo de célula que es susceptible a transformación, transfección, transducción y similares con un constructo de ácidos nucleicos que comprende un polinucleótido de la presente invención.

[0047] Modificación: el término "modificación" significa en este caso cualquier modificación química del polipéptido especificado, por ejemplo el polipéptido que consiste en los aminoácidos 1 a 413 de la SEQ ID NO: 10, así como la manipulación genética del ADN que codifica ese polipéptido. La(s) modificación(es) puede(n) ser sustitución(es), deleción(es) y/o inserción(es) del(los) aminoácido(s) así como sustitución(es) de cadena(s) laterales de aminoácidos.

[0048] Variante Artificial: cuando se usa en este caso, el término "variante artificial" significa un polipéptido que tiene actividad de fitasa producida por un organismo que expresa una secuencia de nucleótidos modificada de la parte madura de codificación de fitasa de la SEQ ID NO: 9. La secuencia de nucleótidos modificada se obtiene a través de intervención humana modificando la parte madura de codificación de fitasa de la secuencia de nucleótidos descrita en la SEQ ID NO: 9.

Descripción detallada de la invención

Polipéptidos con actividad de fitasa

[0049] En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido aislado con actividad de fitasa, seleccionado del grupo que consta de:

un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85% identidad con los aminoácidos 1 a 413 de la SEQ ID NO: 10 sobre la longitud de aminoácidos 1 a 413 de la SEQ ID NO:10, donde la termoestabilidad relativa al polipéptido de aminoácidos 1 a 413 de la SEQ ID NO:10 es, o bien no afectada, o bien mejorada.

[0050] En realizaciones particulares, el grado de identidad es al menos un 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 96.5%, 97%, 97. 5%, 98%, 98.5%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99%, 99.0%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%,

99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% o al menos un 99.9%, que tienen actividad de fitasa (en adelante "polipéptidos homólogos").

[0051] En otras realizaciones particulares, los polipéptidos homólogos tienen una secuencia de aminoácidos que difiere en 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1 aminoácido de los aminoácidos 1 a 413 de la SEQ ID NO: 10.

[0052] En realizaciones particulares, el polipéptido de la presente invención comprende la parte madura de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10, que comprende los aminoácidos 1 a 413 de la SEQ ID NO: 10.

[0053] La secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 9, o una subsecuencia de la misma, así como la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10, o un fragmento de la misma, se pueden utilizar para diseñar una sonda de ácido nucleico para identificar y clonar polipéptidos de codificación de ADN con actividad de fitasa de cepas de diferentes géneros o especies según métodos bien conocidos en la técnica. En particular, tales sondas se pueden usar para hibridación con el ADNc o genómico del género o especie de interés, siguiendo procedimientos Southern blot estándar, para identificar y aislar el gen correspondiente en ellos. Tales sondas pueden ser considerablemente más cortas que la secuencia entera, pero deberían ser al menos de 14, preferiblemente al menos de 25, más preferiblemente al menos de 35 y lo más preferible al menos de 70 nucleótidos de longitud. Se prefiere, no obstante, que la sonda de ácido nucleico sea al menos de 100 nucleótidos de longitud. Por ejemplo, la sonda de ácido nucleico puede ser al menos de 200 nucleótidos, preferiblemente al menos de 300 nucleótidos, más preferiblemente al menos de 400 nucleótidos o lo más preferible al menos de 500 nucleótidos de longitud. Incluso sondas más largas pueden ser utilizadas, por ejemplo, sondas de ácido nucleico que son al menos de 600 nucleótidos, preferiblemente al menos de 700 nucleótidos, más preferiblemente al menos de 800 nucleótidos o lo más preferible al menos de 900 nucleótidos de longitud. Se pueden usar sondas tanto de ADN como de ARN. Las sondas son típicamente marcadas para la detección del gen correspondiente (por ejemplo, con 32P, 3H, 35S, biotina o avidina). Tales sondas están incluidas en la presente invención.

[0054] Una biblioteca de ADN genómico preparada a partir de tales otros organismos puede, por lo tanto, ser seleccionada para ADN que se hibride con las sondas anteriormente descritas y que codifica un polipéptido con actividad de fitasa. El ADN genómico o de otro tipo de tales otros organismos puede ser separado mediante electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida u otras técnicas de separación. El ADN de las bibliotecas o el ADN separado se puede transferir e inmovilizar en nitrocelulosa u otro material portador adecuado. Para identificar un clon o ADN que es homólogo a SEQ ID NO: 9 o una subsecuencia del mismo, el material portador se usa en un Southern blot.

[0055] La hibridación indica que la secuencia de nucleótidos se hibrida con una sonda de ácido nucleico marcada que corresponde a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 9, la cadena complementaria de la misma, o una subsecuencia de la misma, bajo condiciones de astringencia de muy bajas a muy altas. Las moléculas con las que la sonda de ácido nucleico se hibrida bajo estas condiciones se pueden detectar usando una película de rayos-x.

[0056] La sonda de ácido nucleico puede ser cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-8. Particularmente, la sonda de ácido nucleico es la cadena complementaria de los nucleótidos 100 a 450, nucleótidos 450 a 90 o nucleótidos 900 a 1338 de la SEQ ID NO: 9. Adicionalmente, la sonda de ácido nucleico puede ser una secuencia de polinucleótidos que codifica la parte madura del polipéptido de la SEQ ID NO: 10 o una subsecuencia de la misma. Además, la sonda de ácido nucleico es SEQ ID NO: 9, en particular las regiones maduras de codificación de polipéptidos de las mismas.

[0057] Para sondas largas de al menos 100 nucleótidos de longitud, las condiciones de astringencia de muy baja a muy alta son definidas como prehibridación e hibridación a 42°C en 5X SSPE, 0.3% de SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y cortado y, o bien 25% de formamida para astringencias muy bajas y bajas, o bien 35% de formamida para astringencias medias y media-altas o bien 50% de formamida para astringencias altas y muy altas, siguiendo procedimientos Southern blot estándar durante 12 a 24 horas óptimamente.

[0058] Para sondas largas de al menos 100 nucleótidos de longitud, el material portador se lava finalmente tres veces, cada una durante 15 minutos, usando 2X SSC, 0.2% de SDS preferiblemente al menos a 45°C (astringencia muy baja), más preferiblemente al menos a 50°C (astringencia baja), más preferiblemente al menos a 55°C (astringencia media), más preferiblemente al menos a 60°C (astringencia media-alta), incluso más preferiblemente al menos a 65°C (astringencia alta) y de la forma más preferible al menos a 70°C (astringencia muy alta).

[0059] Para sondas cortas de nucleótidos que son aproximadamente de 15 hasta alrededor de 70 nucleótidos de longitud, las condiciones de astringencia son definidas como prehibridación, hibridación y lavado post-hibridación desde alrededor de 5°C hasta alrededor de 10°C por debajo de la Tf calculada usando el cálculo según Bolton y McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48:1390) en 0.9 M de NaCl, 0.09 M de Tris-HCl pH 7.6, 6 mM de EDTA, 0.5% de NP-40, 1X solución de Denhardt, 1 mM de pirofosfato de sodio, 1 mM de fosfato monobásico de sodio, 0.1 mM de ATP, y 0.2 mg de ARN de levadura por ml siguiendo procedimientos estándar de Southern blot.

[0060] Para sondas cortas de nucleótidos que son aproximadamente de 15 hasta alrededor de 70 nucleótidos de longitud, el material portador se lava una vez en 6X SCC más 0.1% de SDS durante 15 minutos y dos veces durante 15 minutos cada una usando 6X SSC de 5°C a 10°C por debajo de la Tf calculada.

[0061] Bajo condiciones de hibridación con contenido de sal, la Tf eficaz es la que controla el grado de identidad requerida entre la sonda y el ADN unido al filtro para una hibridación exitosa. La Tf eficaz puede ser determinada usando la fórmula siguiente para determinar el grado de identidad requerida para que dos ADN se hibriden bajo varias condiciones de astringencia.

Tf eficaz = 81,5 +16,6(log M[Na+] + 0,41(%G+C) – 0,72(% formamida)

(Ver www.ndsu.nodak.edu/instruct/mcclean/plsc731/dna/dna6.htm)

[0062] "G+C" designa el contenido de nucleótidos G y T en la sonda. Para astringencia media, por ejemplo, la formamida es el 35% y la concentración de Na+ para 5X SSPE es 0.75 M.

[0063] Los polipéptidos aislados de la invención que tienen actividad de fitasa, puede tener las siguientes propiedades fisicoquímicas (tal y como se analizó en los polipéptidos sustancialmente puros):

(i)

una alta actividad específica, tal como una actividad específica en fitato de al menos el 50% de la actividad específica del appA de E. coli (SPTREMBL:Q8GN88), siendo la actividad específica preferiblemente medida en unidades de FYT por mg de proteína de enzima fitasa;

(ii)

estabilidad ácida; tal como

(a)

al menos un 60%, preferiblemente al menos un 65%, al menos un 70% o al menos un 75% de actividad residual tras la incubación durante la noche a 37°C en tampón de glicina/ácido clorhídrico de pH 2.2, en relación a la actividad residual tras la incubación durante la noche a 37°C en tampón HEPES de pH 7.0

(b)

al menos un 80%, preferiblemente al menos un 85%, al menos un 90% o al menos un 95% de actividad residual tras la incubación durante la noche a 37°C en tampón de glicina/ácido clorhídrico de pH 3.0, en relación a la actividad residual tras la incubación durante la noche a 37°C en tampón HEPES de pH 7.0; y/o

(c)

una actividad de fitasa residual después de 2 horas de incubación a una temperatura de 25, 30, 35 ó 37°C, preferiblemente 37°C y un pH de 2.2, 2.4, 2.5, 2.6, 2.8, 3.0, 3.2, 3.4 ó 3.5, preferiblemente tampones de glicina/ácido clorhídrico de pH 2.2 ó 3.0, de al menos un 50%, en comparación con la actividad residual del appA de E. coli (SPTREMBL:Q8GN88);

(iii) estabilidad calorífica, tal como una actividad de fitasa residual después de 0.5, 1, 1.5 ó 2 horas, preferiblemente 0.5 horas, de incubación con un pH de 5.5 y una temperatura de 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 ó 95°C, preferiblemente de 70°C, de al menos un 50%, en comparación con la actividad residual del appA de E. coli (SPTREMBL:Q8GN88);

[0064] En la alternativa, se pueden utilizar mediciones de Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC, por sus siglas en inglés) para determinar la temperatura de desnaturalización, Td, de la proteína de fitasa purificada. La Td es indicativa de la estabilidad calorífica de la proteína: cuanto más alta es la Td más alta es la estabilidad calorífica. Se pueden realizar mediciones de DSC con varios valores de pH, por ejemplo, usando el VP-DSC de MicroCal. Se realizan barridos a una tasa constante de 1.5°C/min de 20 a 90°C. Los valores de pH preferidos son 4.0 y 5.5, preferiblemente 4.0. Antes de llevar a cabo la DSC, las fitasas son desaladas, por ejemplo usando columnas de NAP-5 (Pharmacia) equilibradas en tampones apropiados (p. ej. 25mM de acetato de sodio de pH 4.0, 0.1M de acetato de sodio de pH 5.5). El tratamiento de los datos se realiza usando el software MicroCal Origin (versión 4.10) y la temperatura de desnaturalización, Td (también llamada temperatura de fusión, Tf) se define como la temperatura en el vértice del pico en el termograma.

(iv) estabilidad de proteasa, tal como una actividad de fitasa residual después de 0.5, 1, 1.5 ó 2 horas, preferiblemente 1 hora, de incubación a una temperatura de 20, 25, 30, 35 o 37°C, preferiblemente 37°C y un pH de 5.5, en presencia de

0.1 mg/ml de pepsina, de al menos un 50%, en comparación con la actividad residual de appA de E. coli (SPTREMBL:Q8GN88); y/o

(v)

un pH óptimo por debajo de pH 5.0, por ejemplo, por debajo de pH 4.5, 4.0, 3.5, 3.0, 2.5 o incluso por debajo de 2.0, determinado usando el ensayo FYT y/o usando el ensayo del ejemplo 4, como se ha descrito previamente.

particularmente para el aspecto (i) anterior, la actividad específica es al menos un 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 o al menos un 150% de la actividad específica de appA de E. coli. En particular para cada uno de los aspectos (ii) a

(iv)

anteriores, la actividad residual es al menos un 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 o al menos un 150% de la actividad residual de appA de E. coli.

[0065] Además, la actividad de la enzima de la invención, a pH 5.0 y 37°C, medida sobre el sustrato pNP-fosfato puede ser menos del 11% de la actividad de la enzima medida en el fitato del sustrato. Preferiblemente, la proporción es menos del 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, o menos del 5%. La proporción de pNP respecto a la hidrólisis de fitato es indicativa de la verdadera naturaleza de fitasa de la enzima. Una alta proporción de actividad en pNP en relación a la actividad en el fitato puede indicar que la enzima en cuestión es una fosfatasa con especificidad de sustrato relativamente baja, mientras que una baja proporción indica que es una enzima que acepta más específicamente fitato como sustrato.

[0066] Además una fitasa de la invención puede tener una liberación más alta de fósforo (P) en un modelo in vitro, en comparación con la fitasa de Peniofora licii, preferiblemente al menos un 110 % de la misma, más preferiblemente al menos un 120%, un 130% o al menos un 140% de la misma. Una fitasa de la invención, dosificada a 0.25 FYT/g de

pienso, puede liberar al menos un 150% de fósforo (P) en relación al fósforo liberado por la fitasa de Peniofora licii, también dosificada a 0.25 FYT/g de pienso en el modelo in vitro. Preferiblemente, la liberación es al menos del 155%, 160%, 165%, 170%, 175% o al menos del 180%. Además una fitasa de la invención, dosificada a 0.75 FYT/g de pienso, puede liberar al menos un 150% de fósforo (P), en relación al fósforo liberado por la fitasa de Peniofora licii, también dosificada a 0.75 FYT/g de pienso, en el modelo in vitro. Preferiblemente, la liberación es al menos del 155%, 160%, 165%, 170%, 175%, 180%, 185% o al menos del 190%.

[0067] Una fitasa de la invención puede tener actividad residual tras una incubación a 37°C y en un tampón de glicina/HCl 0.1 M, pH 2.0, durante 4 horas, de al menos un 20%, en comparación con la actividad a tiempo t = 0, siendo la actividad (y la actividad residual) ensayada a 37°C y pH 5.5 en fitato de sodio al 1% (p/v), usando un tampón de acetato de sodio 0.25 M con pH 5.5, tampón usado como blanco. Preferiblemente, la actividad residual es al menos de un 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% o al menos de un 80%. Además, la fitasa de la invención puede tener actividad residual tras una incubación a 37°C y en un tampón de glicina/HCl 0.1 M, pH 2.5, durante 1 día (24 horas) de al menos un 20%, en comparación con la actividad a tiempo, t = 0, siendo la actividad (y la actividad residual) ensayada a 37°C y pH 5.5 en fitato de sodio al 1% (p/v), usando un tampón de acetato de sodio 0.25 M con pH 5.5, tampón usado como blanco. En realizaciones preferidas, la actividad residual es al menos un 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% o al menos un 80%.

[0068] La presente invención se puede referir a variantes artificiales que comprenden una sustitución conservadora, deleción y/o inserción de uno o más aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 o el polipéptido maduro de los mismos. Una inserción puede ser dentro de la molécula y/o en el N-y/o C-terminal de la molécula en cuyo caso es también llamada extensión. Preferiblemente, los cambios de aminoácidos son de una naturaleza menor, esto es, sustituciones de aminoácidos conservadoras; deleciones pequeñas, típicamente desde 1 hasta alrededor de 30 aminoácidos; extensiones amino- o carboxilo-terminal pequeñas, tales como un residuo de metionina amino-terminal; un péptido de enlace pequeño desde 20 hasta alrededor de 25 residuos; o una pequeña extensión que facilita la purificación cambiando la carga neta u otra función, tal como un tracto de polihistidina, un epítopo antigénico o un dominio de unión

-

en otras palabras: cambios que no afectan significativamente al plegamiento y/o actividad de las proteínas.

[0069] Ejemplos de sustituciones conservadoras se encuentran dentro del grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos acídos (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina) y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina y metionina).

[0070] Otros ejemplos de sustituciones conservadoras son sustituciones de los 20 aminoácidos estándar por aminoácidos no estándar (tales como 4-hidroxiprolina, 6-N-metil lisina, ácido 2-aminoisobutírico, isovalina y alfa-metil serina). Las sustituciones conservadoras pueden también incluir una sustitución en aminoácidos que no son codificados por el código genético y aminoácidos no naturales. Los "aminoácidos no naturales" han sido modificados después de la síntesis de proteínas y/o tienen una estructura química en sus cadena(s) lateral(es) diferente de la de los aminoácidos estándar. Los aminoácidos no naturales pueden ser químicamente sintetizados y, preferiblemente, están disponibles comercialmente e incluyen ácido pipecólico, ácido tiazolidincarboxílico, dehidroxiprolina, 3- y 4-metilprolina y 3,3dimetilprolina.

[0071] Alternativamente, los cambios de aminoácidos son de tal naturaleza que las propiedades fisicoquímicas de los polipéptidos son alteradas. Por ejemplo, los cambios de aminoácidos pueden mejorar la termoestabilidad del polipéptido, alterar la especificidad del sustrato, cambiar el pH óptimo y otras propiedades similares.

[0072] Los aminoácidos esenciales en el polipéptido progenitor se pueden identificar según procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida o mutagénesis de barrido de alanina (Cunningham y Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En esta última técnica, se introducen mutaciones individuales de alanina en cada residuo en la molécula y las moléculas mutantes resultantes son probadas para actividad biológica (es decir, actividad de fitasa) para identificar residuos de aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula. Ver también, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. El sitio activo de la enzima u otra interacción biológica puede también ser determinado por análisis físico de estructura, como se determina mediante técnicas tales como resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción de electrones o marcaje por fotoafinidad, conjuntamente con la mutación de aminoácidos de sitios de contacto putativos. Ver, por ejemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309:59-64. Las identidades de aminoácidos esenciales pueden también ser inferidas de análisis de identidades con polipéptidos que están relacionados con un polipéptido según la invención.

[0073] Sustituciones de aminoácidos individuales o múltiples o pueden ser hechas y probadas usando métodos conocidos de mutagénesis, recombinación y/o barajado, seguidos de un procedimiento de selección relevante, tal como aquellos descritos por Reidhaar-olson y Sauer, 1988 Science 241: 53-57; Bowie y Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; o WO 95/22625. Otros métodos que pueden ser usados incluyen PCR propensa a error, despliegue de fagos (p. ej., Lowman et al., 1991, Biochem. 30:10832-10837; patente estadounidense n°. 5,223,409; WO 92/06204) y mutagénesis dirigida (Derbyshire et al., 1986, Gene 46:145; Ner et al., 1988, DNA 7:127).

[0074] Los métodos de mutagénesis/barajado se pueden combinar con métodos de selección automatizados de alto rendimiento para detectar actividad de polipéptidos clonados mutagenizados expresados por células huésped. Las moléculas de ADN mutagenizadas que codifican polipéptidos activos pueden ser recuperadas de las células huésped y rápidamente secuenciadas usando métodos estándar en la técnica. Estos métodos permiten determinar rápidamente la importancia de los residuos de aminoácidos individuales en un polipéptido de interés y se pueden aplicar a polipéptidos de estructura desconocida.

[0075] El número total de sustituciones de aminoácidos (preferiblemente sustituciones conservadoras), deleciones y/o inserciones en la secuencia de aminoácidos 1 a 413 de la SEQ ID NO: 10 puede ser como mucho 10, preferiblemente como mucho 9, más preferiblemente como mucho 8, más preferiblemente como mucho 7, más preferiblemente como mucho 6, más preferiblemente como mucho 5, más preferiblemente como mucho 4, incluso más preferiblemente como mucho 3, de la forma más preferible como mucho 2 e incluso de la forma más preferible 1.

[0076] El número total de sustituciones de aminoácidos, deleciones y/o inserciones de los aminoácidos 1 a 413 de la SEQ ID NO: 10 puede ser 10, preferiblemente 9, más preferiblemente 8, más preferiblemente 7, más preferiblemente como mucho 6, más preferiblemente como mucho 5, más preferiblemente 4, incluso más preferiblemente 3, de la forma más preferible 2 e incluso de la forma más preferible 1. En la alternativa, el número total de sustituciones de aminoácidos (preferiblemente sustituciones conservadoras), deleciones y/o inserciones en la secuencia de aminoácidos 1 a 413 de la SEQ ID NO: 10 es como mucho 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12 o como mucho 11.

[0077] Específicamente, el polipéptido de la invención puede ser una variante hipoalergénica, diseñada para invocar una respuesta inmunológica reducida cuando se expone a animales, incluido el hombre. El término respuesta inmunológica debe ser entendido como cualquier reacción del sistema inmunológico de un animal expuesto al polipéptido. Un tipo de respuesta inmunológica es una respuesta alérgica que conduce a niveles aumentados de IgE en el animal expuesto. Variantes hipoalergénicas pueden ser preparadas usando técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido se puede conjugar con porciones de polímero protegiendo partes o epítopos del polipéptido implicadas en una respuesta inmunológica. La conjugación con polímeros puede implicar acoplamiento químico in vitro del polímero al polipéptido, por ejemplo como se describe en WO 96/17929, WO98/30682, WO98/35026 y/o WO99/00489. La conjugación puede adicionalmente, o alternativamente a ella, implicar acoplamiento in vivo de polímeros al polipéptido. Tal conjugación se puede conseguir por ingeniería genética de la secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido, insertando secuencias de consenso que codifican sitios de glicosilación adicionales en el polipéptido y expresando el polipéptido en un huésped capaz de glicosilar el polipéptido, ver por ejemplo WO00/26354. Otra vía de proporcionar variantes hipoalergénicas de suministro es la ingeniería genética de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido para causar que el polipéptido se oligomerice a sí mismo, provocando el efecto de que monómeros del polipéptido puedan proteger los epítopos de otros monómeros del polipéptido y así reducir la antigenicidad de los oligómeros. Tales productos y su preparación se describen por ejemplo en WO96/16177. Los epítopos implicados en una respuesta inmunológica se pueden identificar por varios métodos tales como el método de exposición en fago descritos en WO 00/26230 y WO 01/83559 o la estrategia aleatoria descrita en EP 561907. Una vez que un epítopo ha sido identificado, su secuencia de aminoácidos se puede alterar para producir propiedades alteradas inmunológicas del polipéptido mediante técnicas de manipulación génica conocidas tales como mutagénesis dirigida (ver por ejemplo WO 00/26230, WO 00/26354 y/o WO00/22103) y/o conjugación de un polímero puede realizarse con proximidad suficiente al epítopo para que el polímero proteja el epítopo.

Estructura tridimensional de una fitasa de Hafnia alvei

[0078] La estructura tridimensional de una fitasa de Hafnia alvei (aminoácidos 1 a 413 de la SEQ ID NO: 10) se proporciona en el apéndice. La estructura fue resuelta según los principios de los métodos cristalográficos de rayos-x, por ejemplo, como los dados en X-Ray Structure Determinations, Stout, G. K. y Jensen, L. H., John Wiley and Sons, Inc. NY 1989. Las coordenadas estructurales para la estructura cristalina resuelta de la fitasa de Hafnia alvei se dan en formato PDB estándar (Protein Database Bank, Brookhaven National Laboratory, Brookhaven, Conn.) como se expone en el apéndice. Debe entenderse que el apéndice forma parte de la presente solicitud. El apéndice proporciona las coordenadas de los átomos pesados, excluyendo los átomos de hidrógeno. Los primeros tres residuos de la enzima no fueron visibles en la estructura cristalina al igual que los residuos de aminoácidos entre los aminoácidos 180 y 189. No obstante, la estructura entre 180 y 189 fue construida usando un modelado que combina el modelado de homología (ver por ejemplo, Marti-Renom et al., 2000) el programa NEST del paquete JACKAL (wiki.c2b2.columbia.edu/honiglab_public/index.php/Software:Jackal) y el software de simulación llamado CHARMm (//accelrys.com/products/scitegic/component-collections/charmm.html).

Fuentes de polipéptidos con actividad de fitasa

[0079] Un polipéptido de la presente invención se puede obtener de microorganismos de cualquier género. A efectos de la presente invención, el término "obtenido de" como se usa aquí en conexión con una fuente dada significará que el polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos es producido por la fuente o por una cepa en la que la secuencia de nucleótidos de la fuente ha sido insertada. En un aspecto preferido, el polipéptido obtenido de una fuente dada es segregado extracelularmente.

[0080] Un polipéptido de la presente invención puede ser un polipéptido bacteriano. Por ejemplo, el polipéptido puede ser un polipéptido bacteriano gram-positivo tal como un polipéptido de Bacillus o un polipéptido de Streptomyces; o un polipéptido bacteriano gram-negativo, por ejemplo, un polipéptido de Escherichia coli, Yersinia, Klebsiella, Citrobacter o Pseudomonas. En una realización particular, el polipéptido se obtiene de proteobacterias, tales como gammaproteobacterias, por ejemplo enterobacterianos tales como enterobacteriaceae.

[0081] En un aspecto particular, el polipéptido obtenido de enterobacteriaceae es un polipéptido de hafnia, tal como un polipéptido de la especie Hafnia alvei.

[0082] Un polipéptido de la presente invención puede también ser un polipéptido fúngico, tal como un polipéptido de levadura o un polipéptido filamentoso fúngico.

[0083] Cepas de los microorganismos anteriores son fácilmente accesibles para el público en varias colecciones de cultivo, tales como la American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) y la Agricultural Research Service Patent Culture Collection,Northern Regional Research Center(NRRL).

[0084] Además, tales polipéptidos se pueden identificar y obtener de otras fuentes incluyendo microorganismos aislados de la naturaleza (p. ej., tierra, abonos, agua, etc.) usando las sondas anteriormente mencionadas. Las técnicas para aislar microorganismos de hábitats naturales son bien conocidas en la técnica. El polinucleótido puede entonces ser obtenido de forma similar seleccionando una biblioteca genómica o de ADNc de otro microorganismo. Una vez que una secuencia de polinucleótidos un polipéptido ha sido detectada con la(s) sonda(s), el polinucleótido puede ser aislado o clonado utilizando técnicas que son bien conocidas por aquellos familiarizados con la técnica (ver por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

[0085] Los polipéptidos pueden incluir polipéptidos fusionados o polipéptidos divisibles de fusión en los que otro polipéptido se fusiona con N-terminal o el C-terminal del polipéptido o fragmento del mismo. Un polipéptido fusionado se produce fusionando una secuencia de nucleótidos (o una parte de la misma) que codifica a otro polipéptido a una secuencia de nucleótidos (o una parte de la misma) de la presente invención. Técnicas para producir polipéptidos de fusión se conocen en la técnica, e incluyen ligar las secuencias codificantes que codifican los polipéptidos de modo que éstas estén dentro del marco y que la expresión del polipéptido fusionado esté bajo el control del(los) mismo(s) promotor(es) y terminador(es).

Polinucleótidos

[0086] La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la presente invención. En un aspecto preferido, la secuencia de nucleótidos es la región codificante madura del polipéptido de la SEQ ID NO: 9. La presente invención también abarca secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 10, que difiere de la SEQ ID NO: 9, en virtud de la degeneración del código genético.

[0087] La presente invención también se refiere a polinucleótidos mutantes que comprenden al menos una mutación en la secuencia codificante del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 9, en la que la secuencia de nucleótidos mutante codifica un polipéptido que consta de los aminoácidos 1 a 413 de la SEQ ID NO: 10.

[0088] Las técnicas usadas para aislar o clonar un polinucleótido que codifica un polipéptido se conocen en la técnica e incluyen aislamiento de ADN genómico, preparación de ADNc o una combinación de los mismos. La clonación de los polinucleótidos de la presente invención de tal ADN genómico puede ser efectuada, por ejemplo, usando la bien conocida reacción en cadena de polimerasa (PCR) o la selección de anticuerpos de bibliotecas de expresión para detectar fragmentos clonados de ADN con características estructurales compartidas. Ver, por ejemplo, Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York. Otros procedimientos de amplificación de ácido nucleico tales como reacción en cadena de ligasa (LCR), transcripción activada ligada (LAT) y amplificación de nucleótidos basada en secuencias (NASBA) pueden ser utilizados. Los polinucleótidos se pueden clonar de una cepa de Hafnia o de otro organismo u organismo relacionado y así, por ejemplo, puede ser una variante alélica o de especie de la región de codificación del polipéptido de la secuencia de nucleótidos.

[0089] La modificación de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser necesaria para la síntesis de polipéptidos sustancialmente similares al polipéptido. El término "sustancialmente similar" al polipéptido se refiere a formas no naturales en las que se da el polipéptido. Estos polipéptidos pueden diferir del polipéptido aislado de su fuente nativa en alguna forma genéticamente creada, por ejemplo, variantes artificiales que difieren en actividad específica, termoestabilidad, pH óptimo, o similares. La secuencia variante puede ser construida basándose en la secuencia de nucleótidos presentada como la región de codificación de polipéptido de la SEQ ID NO: 9, por ejemplo, una subsecuencia de la misma, y/o mediante introducción de sustituciones de nucleótido que no dan lugar a otra secuencia de aminoácidos del polipéptido codificada por la secuencia de nucleótidos, pero que corresponden al uso del codón del organismo huésped destinado a la producción del polipéptido, o mediante

introducción de sustituciones de nucleótido que pueden dar lugar a una secuencia de aminoácidos diferente. Para una descripción general de sustitución de nucleótido, ver, por ejemplo, Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification

2: 95-107.

[0090] Será aparente a los cualificados en la técnica que tales sustituciones puede ser hechas fuera de las regiones críticas para la función de la molécula y todavía resultar en un polipéptido activo. Residuos de aminoácidos esenciales para la actividad del polipéptido codificado por un polinucleótido aislado de la invención, y por lo tanto preferiblemente no sujeto a sustitución, se pueden identificar según procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida o mutagénesis de barrido de alanina (ver, por ejemplo, Cunningham y Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En esta última técnica, se introducen mutaciones en cada residuo positivamente cargado en la molécula y las moléculas mutantes resultantes se prueban para actividad de fitasa para identificar residuos de aminoácidos que son críticas para la actividad de la molécula. Los sitios de interacción sustrato-polipéptido se pueden también determinar mediante análisis de la estructura tridimensional tal y como se determina mediante técnicas tales como análisis de resonancia magnética nuclear, cristalografía o marcaje por fotoafinidad (ver, por ejemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306312; Smith et al., 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309: 59-64).

Constructos de ácidos nucleicos

[0091] La presente invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos que comprenden un polinucleótido aislado de la presente invención operativamente enlazado a una o más secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula huésped adecuada bajo condiciones compatibles con las secuencias de control.

[0092] Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido de la presente invención se puede manipular en una diversidad de maneras para garantizar la expresión del polipéptido. La manipulación de la secuencia del polinucleótido antes de la inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar las secuencias de polinucleótidos utilizando métodos de ADN recombinante son bien conocidas en la técnica.

[0093] La secuencia de control puede ser una secuencia apropiada de promotor, una secuencia de nucleótidos que es reconocida por una célula huésped para la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención. La secuencia de promotor contiene secuencias de control transcripcionales que median en la expresión del polipéptido. El promotor puede ser cualquier secuencia de nucleótidos que muestra actividad transcripcional en la célula huésped de elección incluyendo promotores mutantes, truncados e híbridos, y se puede obtener de genes que codifican polipéptidos intracelulares o extracelulares tanto homólogos como heterólogos a la célula huésped.

[0094] Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácidos nucleicos de la presente invención, especialmente en una célula huésped bacteriana, son los promotores obtenidos del operón lac de

E. coli, el gen de agarasa de Streptomyces coelicolor (dagA), el gen de levansucrasa de Bacillus subtilis (sacB), el gen de alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL), el gen de amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus (amyM), el gen de alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), el gen de penicilinasa de bacillus licheniformis (penP), los genes xylA y xylB de Bacillus subtilis y el gen de beta-lactamasa procariótica (Villar-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727-3731), así como el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21-25). Otros promotores son descritos en "Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific American, 1980, 242: 74-94; y en Sambrook et al., 1989, supra.

[0095] Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácidos nucleicos de la presente invención en una célula huésped filamentosa fúngica son los promotores obtenidos de los genes para TAKA amilasa de aspergillus oryzae, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger, alfa-amilasa estable en ácido de Aspergillus niger, glucoamilasa (glaA) de Aspergillus niger o Aspergillus awamorii, lipasa de Rhizomucor miehei, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosa fosfato isomerasa de aspergillus oryzae, acetamidasa de Aspergillus nidulans, amiloglucosidasa de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Fusarium venenatum Daria (WO 00/56900), Fusarium venenatum Quinn (WO 00/56900), proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), beta-glucosidasa de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei, endoglucanasa I de Trichoderma reesei, endoglucanasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa III de Trichoderma reesei, endoglucanasa IV de Trichoderma reesei, endoglucanasa V de Trichoderma reesei, xilanasa I de Trichoderma reesei, xilanasa II de Trichoderma reesei, beta-xilosidasa de Trichoderma reesei, así como el promotor NA2-TPI (un híbrido de los promotores de los genes para alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger y de triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae); y promotores mutantes, truncados e híbridos de los mismos.

[0096] En un huésped de levadura, promotores útiles se obtienen de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), galactoquinasa de Saccharomyces cerevisiae (GAL1), alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH1, ADH2/GAP), triosa fosfato isomerasa de Saccharomyces cerevisiae (TPI), metalotionina de Saccharomyces cerevisiae (CUP1), 3-fosfoglicerato quinasa de Saccharomyces

cerevisiae y alcohol-oxidasa de Pichia pastoris (AOX1). Otros promotores útiles para células huésped de levadura son descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.

[0097] La secuencia de control puede también ser una secuencia terminadora de transcripción adecuada, una secuencia reconocida por una célula huésped para terminar la transcripción. La secuencia terminadora se enlaza operativamente al terminal 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Cualquier terminador que es funcional en la célula huésped elegida se puede utilizar en la presente invención.

[0098] Los terminadores preferidos para células huésped filamentosas fúngicas se obtienen de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, glucoamilasa de Aspergillus niger, antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, alfa glucosidasa de Aspergillus niger y proteasa tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

[0099] Los terminadores preferidos para células huésped de levadura se obtienen de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C de Saccharomyces cerevisiae (CYC1) y gliceraldehído-3-fosfatodeshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros terminadores útiles para células huésped de levadura son descritos por Romanos et al., 1992, supra.

[0100] La secuencia de control puede también ser una secuencia líder adecuada, una región no traducida de un ARNm que es importante para la traducción por la célula huésped. La secuencia líder se enlaza operativamente al terminal 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Cualquier secuencia líder que es funcional en la célula huésped elegida se puede utilizar en la presente invención.

[0101] La secuencia de control puede también ser una secuencia líder adecuada, una región no traducida de un ARNm que es importante para traducción por la célula huésped. La secuencia líder se enlaza operativamente al terminal 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Cualquier secuencia líder que es funcional en la célula huésped elegida se puede utilizar en la presente invención.

[0102] Los líderes preferidos para células huésped filamentosas fúngicas se obtienen de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans.

[0103] Los líderes adecuados para células huésped de levadura se obtienen de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), fosfoglicerato-quinasa de Saccharomyces cerevisiae, factor-alfa de Saccharomyces cerevisiae, alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP).

[0104] La secuencia de control puede también ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia enlazada operativamente al terminal 3' de la secuencia de nucleótidos y que, cuando se transcribe, es reconocido por la célula huésped como una señal para añadir residuos de poliadenosina al ARNm transcrito. Cualquier secuencia de poliadenilación que es funcional en la célula huésped elegida se puede utilizar en la presente invención.

[0105] Las secuencias de poliadenilación preferidas para células huésped filamentosas fúngicas se obtienen de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, glucoamilasa de Aspergillus niger, antranilato sintasa de aspergillus nidulans, proteasa tipo tripsina de Fusarium oxysporum y alfa-glucosidasa de Aspergillus niger.

[0106] Secuencias de poliadenilación útiles para células huésped de levadura son descritas por Guo y Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990.

[0107] La secuencia de control puede también ser una región de codificante de péptido señal que codifica para una secuencia de aminoácidos enlazada al terminal amino de un polipéptido y dirige el polipéptido codificado hacia la vía secretora de la célula. El extremo 5'de la secuencia codificante de la secuencia de nucleótidos puede contener intrínsecamente una región codificante de péptido señal enlazado naturalmente en el marco de lectura de traducción con el segmento de la región codificante que codifica el polipéptido segregado. Alternativamente, el extremo 5' de la secuencia codificante puede contener una región codificante de péptido señal que es extranjera a la secuencia codificante. La región codificante de péptido señal extranjera puede ser requerida dónde la secuencia codificante no contiene naturalmente una región de codificación de péptido señal. Alternativamente, la región de codificación de péptido señal extranjera puede simplemente reemplazar la región codificante de péptido señal natural para mejorar la secreción del polipéptido. No obstante, cualquier región codificante de péptido señal que dirige el polipéptido expresado en la vía secretora de una célula huésped elegida se puede utilizar en la presente invención.

[0108] Las regiones codificantes de péptido señal eficaces para células huésped bacterianas son las regiones de codificación de péptido señal obtenidas de los genes para amilasa maltogénica de Bacillus NCIB 11837, alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamasa de Bacillus licheniformis, proteasas neutras de Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM) y Bacillus subtilis (prsA). Péptidos señal adicionales son descritos por Simonen y Palva, 1993, Microbiological Reviews 57:109-137.

[0109] Regiones codificantes de péptido señal eficaz para células huésped filamentosas fúngicas son las regiones de

codificación de péptido señal obtenidas de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, amilasa neutra de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, celulasa de Humicola insolens y lipasa Humicola lanuginosa.

[0110] Péptidos señal útiles para células huésped de levadura se obtienen de los genes para factor-alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertasa de Saccharomyces cerevisiae. Otras regiones codificantes de péptido señal útiles son descritas por Romanos et al., 1992, supra, y por Xiong et al en Journal of Applied Microbiology 2005, 98, 418

428.

[0111] En un aspecto preferido, la región codificante de péptido señal son los nucleótidos 1 a 99 de la SEQ ID NO: 9, que codifica los aminoácidos 1 a 33 de la SEQ ID NO: 10. En otro aspecto preferido, la región codificante de péptido señal son los nucleótidos 1 a 81 de la SEQ ID NO: 11, que codifica los aminoácidos 1 a 27 de la SEQ ID NO: 12.

[0112] La secuencia de control puede también ser una región codificante de propéptido que codifica una secuencia de aminoácidos situada en el amino-terminal de un polipéptido. El polipéptido resultante es conocido como un propolipéptido o propolipéptido (o un zimógeno en algunos casos). Un propolipéptido está generalmente inactivo y se puede convertir en un polipéptido maduro activo por división catalítica o autocatalítica del propéptido del propolipéptido. La región codificante de propéptido se puede obtener de los genes para proteasa alcalina de Bacillus subtilis (aprE), proteasa neutra de bacillus subtilis (nprT), factor-alfa de Saccharomyces cerevisiae, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei y lacasa de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836).

[0113] Dónde regiones tanto de péptido señal como de propéptido están presentes en el amino-terminal de un polipéptido, la región de propéptido está situada junto al amino-terminal de un polipéptido y la región de péptido señal está situada junto al amino terminal de la región de propéptido.

[0114] Puede también ser deseable añadir secuencias reguladores que permiten la regulación de la expresión del polipéptido en relación al crecimiento de la célula huésped. Ejemplos de sistemas reguladores son aquellos que causan que la expresión del gen se active o se desactive en respuesta a un estímulo físico o químico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. Sistemas reguladores en sistemas procarióticos incluyen los sistemas operadores lac, tac y trp. En levadura, se pueden utilizar los sistemas ADH2 o GAL1. En hongos filamentosos, el promotor TAKA alfaamilasa, promotor de glucoamilasa de Aspergillus niger y el promotor de glucoamilasa de Aspergillus oryzae se pueden utilizar como secuencias reguladores. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son los que permiten amplificación génica.

Vectores de expresión

[0115] La presente invención también se refiere a vectores de expresión recombinantes que comprenden un constructo de ácidos nucleicos de la presente invención. Puede comprender adicionalmente un promotor y señales de terminación traduccionales y transcripcionales. Los diversos ácidos nucleicos y secuencias de control anteriormente descritas se pueden juntar para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más sitios de restricción convenientes para permitir inserción o sustitución de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido en tales sitios. Alternativamente, una secuencia de nucleótidos de la presente invención se puede expresar mediante la inserción en un vector apropiado para la expresión de la secuencia de nucleótidos o un constructo de ácidos nucleicos que comprende la secuencia. En la creación el vector de expresión, la secuencia codificante se localiza en el vector de modo que la secuencia codificante está operativamente enlazada con las secuencias de control apropiadas para la expresión.

[0116] El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (p. ej., un plásmido o virus) que puede ser convenientemente sometido a procedimientos de ADN recombinante y puede provocar expresión de la secuencia de nucleótidos. La elección del vector dependerá típicamente de la compatibilidad del vector con la célula huésped en la que el vector debe ser introducido. Los vectores pueden ser plásmidos lineales o circulares cerrados.

[0117] El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula huésped, se integre en el genoma y se replique junto con el(los) cromosoma(s) en el(los) que ha sido integrado. Es más, un único vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos, que juntos contienen el ADN total que se va a introducir en el genoma de la célula huésped, o un transposón pueden ser utilizados.

[0118] Los vectores de la presente invención preferiblemente contienen uno o más marcadores seleccionables que permiten la fácil selección de células transformadas. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia biocida o vírica, resistencia a metales pesados, prototrofía a auxótrofos y propiedades similares.

[0119] Un gen condicionalmente esencial puede funcionar como un marcador seleccionable no antibiótico. Ejemplos no limitantes de marcadores seleccionables bacterianos condicionalmente esenciales no antibióticos son los genes dal de

Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis u otros Bacilos que son sólo esenciales cuando la bacteria se cultiva en ausencia de D-alanina. También los genes que codifican enzimas implicadas en el recambio de UDP-galactosa pueden funcionar como marcadores condicionalmente esenciales en una célula cuando la célula se cultiva en presencia de galactosa o se cultiva en un medio que da lugar a la presencia de galactosa. Ejemplos no limitantes de tales genes son los de B. subtilis o B. licheniformis que codifican fosforilasa dependiente de UTP (EC 2.7.7.10), uridililtransferasa dependiente de UDP-glucosa (EC 2.7.7.12) o UDP-galactosa epimerasa (EC 5.1.3.2). También un gen de xilosa isomerasa, como el xylA, de Bacilos se puede usar como marcador seleccionable en células cultivadas en medio mínimo con xilosa como única fuente de carbono. Los genes necesarios para utilizar gluconato, gntK y gntP, pueden también ser usados como marcadores seleccionables en células cultivadas en medio mínimo con gluconato como única fuente de carbono. Otros ejemplos de genes condicionalmente esenciales se conocen en la técnica. Marcadores seleccionables antibióticos confieren resistencia antibiótica a antibióticos tales como ampicilina, canamicina, cloranfenicol, eritromicina, tetraciclina, neomicina, higromicina o metotrexato.

[0120] Marcadores adecuados para células huésped de levadura son ADE2, HIS3, LEU2, LiS2, MET3, TRP1 y URA3. Marcadores seleccionables para usar en una célula huésped filamentosa fúngica incluyen, pero no se limitan a, amdS (acetamidasa), argB (ornitina-carbamoiltransferasa), bar (fosfonitricina acetiltransferasa), hph (higromicina fosfotransferasa), niaD (nitrato-reductasa), pyrG (orotidina-5'-fosfato-descarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa) y trpC (antranilato sintasa), así como equivalentes de los mismos. Preferidos para el uso en una célula de Aspergillus son los genes amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y el gen bar de Streptomyces hygroscopicus.

[0121] Los vectores de la presente invención contienen preferiblemente un(os) elemento(s) que permite(n) la integración del vector en el genoma de la célula huésped o la replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma.

[0122] Para la integración en el genoma de la célula huésped, el vector puede depender de la secuencia de polinucleótidos que codifica el polipéptido o cualquier otro elemento del vector para la integración en el genoma mediante recombinación homóloga o no homóloga. Alternativamente, el vector puede contener secuencias de nucleótidos adicionales para dirigir la integración mediante recombinación homóloga en el genoma de la célula huésped en una(s) ubicación(es) precisa(s) en el(los) cromosoma(s). Para incrementar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos integracionales deberían contener preferiblemente un número suficiente de ácidos nucleicos, como de 100 a 10000 pares de bases, preferiblemente de 400 a 10000 pares de bases y de la forma más preferible de 800 a 10000 pares de bases, que tienen un alto grado de identidad con la secuencia diana correspondiente para mejorar la probabilidad de recombinación homóloga. Los elementos integracionales pueden ser cualquier secuencia que es homóloga a la secuencia diana en el genoma de la célula huésped. Además, los elementos integracionales pueden ser secuencias de nucleótidos no codificantes o codificantes. Por otro lado, el vector se puede integrar en el genoma de la célula huésped por recombinación no homóloga.

[0123] Para replicación autónoma, el vector puede comprender adicionalmente un origen de replicación habilitando al vector para replicarse de manera autónoma en la célula huésped en cuestión. El origen de replicación puede ser cualquier replicador del plásmido mediando la replicación autónoma que funciona en una célula. El término "replicador del plásmido" u "origen de replicación" se define aquí como una secuencia de nucleótidos que habilita a un plásmido o vector para replicar in vivo.

[0124] Ejemplos de orígenes bacterianos de replicación son los orígenes de replicación de los plásmidos pBR322, pUC19, pACYC177 y pACYC184 permitiendo replicación en E. coli; y pUB110, pE194, pTA1060 y pAMß1 permitiendo replicación en Bacillus.

[0125] Ejemplos de orígenes de replicación para uso en una célula huésped de levadura son el origen de replicación de 2 micras, ARS1, ARS4, la combinación de ARS1 y CEN3 y la combinación de ARS4 y CEN6.

[0126] Ejemplos de orígenes de replicación útiles en una célula fúngica filamentosa son AMA1 y ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98:61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Research 15: 9163-9175; WO 00/24883). El aislamiento del gen AMA1 y la construcción de plásmidos o vectores que comprenden el gen se pueden lograr según los métodos descritos en WO 00/24883.

[0127] Más de una copia de un polinucleótido de la presente invención se puede insertar en la célula huésped para aumentar producción del producto genético. Un incremento en el número de copias del polinucleótido se puede obtener integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula huésped o incluyendo un gen marcador seleccionable amplificable con el polinucleótido donde las células que contienen copias amplificadas del gen de marcador seleccionable y, por lo tanto, copias adicionales del polinucleótido, pueden ser seleccionadas cultivando las células en presencia del agente seleccionable apropiado.

[0128] Los procedimientos usados para ligar los elementos anteriormente descritos para construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención son conocidos por alguien familiarizado con la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

Células huésped

[0129] La presente invención también se refiere a células huésped recombinantes, que comprenden un polinucleótido de la presente invención, las cuales se usan favorablemente en la producción recombinante de los polipéptidos. Un vector que comprende un polinucleótido de la presente invención se introduce en una célula huésped de modo que el vector se mantiene como un integrante cromosómico o como un vector extracromosomal auto-replicante tal y como se ha descrito anteriormente. El término "célula huésped" abarca cualquier descendiente de una célula madre que no es idéntica a la célula madre debido a mutaciones que ocurren durante la replicación. La elección de una célula huésped depende en gran parte del gen que codifica el polipéptido y su fuente.

[0130] La célula huésped puede ser un microorganismo unicelular, por ejemplo, un procariota, o un microorganismo no unicelular, por ejemplo, un eucariota.

[0131] Microorganismos unicelulares útiles son células bacterianas tales como bacterias gram positivas que incluyen, pero no se limitan a, una célula de bacillus, por ejemplo, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, bacillus subtilis y Bacillus thuringiensis; o una célula de Streptomyces, por ejemplo, Streptomyces lividans y Streptomyces murinus; o bacterias gram negativas tales como E. coli y Pseudomonas sp. En un aspecto preferido, la célula huésped bacteriana es un bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus o una célula de Bacillus subtilis. En otro aspecto preferido, la célula de Bacillus es un Bacillus alcalofílico.

[0132] La introducción de un vector en una célula huésped bacteriana puede, por ejemplo, ser efectuada por transformación de protoplasto (ver, por ejemplo, Chang y Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), usando células competentes (ver, por ejemplo, Young y Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829 o Dubnau y Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221), por electroporación (ver, por ejemplo, Shigekawa y Dower, 1988 Biotechniques 6: 742-751) o conjugación (ver, por ejemplo, Koehler y Thome, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278).

[0133] La célula huésped puede también ser un eucariota, tal como una célula de mamífero, de insecto, de planta o fúngica.

[0134] En un aspecto preferido, la célula huésped es una célula fúngica. "Hongos" como se utiliza en este caso incluye los fila Ascomicota, Basidiomicota, Chytridiomycota y Zigomicota (según es definido por Hawkswort et al., In, Ainswort and Bisby´s Dictionary of Fungi, 8ª edición, 1995, CAB international, University Press, Cambridge, Reino Unido) así como los Oomicota (como se cita en Hawkswort et al., 1995, supra, página 171) y todos hongos mitospóricos (Hawkswort et al., 1995, supra).

[0135] En un aspecto más preferido, la célula huésped fúngica es una célula de levadura. "Levadura" como se utiliza en este caso incluye levadura ascoesporógena (Endomicetales), levadura basidiosporógena y levadura perteneciente a los Fungi Imperfecti (Blastomicetos). Ya que la clasificación de levadura puede cambiar en el futuro, a efectos de esta invención, la levadura debe ser definida como se describe en Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore,

S.M. y Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series n°. 9,1980).

[0136] En un aspecto incluso más preferido, la célula huésped de levadura es una célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces o Yarrowia.

[0137] En un aspecto más preferido, la célula huésped de levadura es una célula de Pichia pastoris, Pichia methanolica, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces Kluyveri, Saccharomyces norbensis o Saccharomyces oviformis. En otro aspecto más preferido, la célula huésped de levadura es una Célula de Kluyveromices lactis. En otro aspecto más preferido, la célula huésped de levadura es una Célula de Yarrowia lipolytica.

[0138] En otro aspecto más preferido, la célula huésped fúngica es una célula fúngica filamentosa. "Fúngica filamentosa" incluye todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumicota y Oomicota (como definido por Hawkswort et al., 1995, supra). Los hongos filamentosos se caracterizan generalmente por una pared micelial compuesta por quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo es por alargamiento hifal y el catabolismo de carbono es estrictamente aeróbico. En cambio, el crecimiento vegetativo por levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae es mediante injerto de un tallo unicelular y el catabolismo de carbono puede ser fermentativo.

[0139] En un aspecto incluso más preferido, la célula huésped filamentosa fúngica es una célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filobasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporte, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolipocladium, Trametes o

Trichoderma.

[0140] En un aspecto más preferido, la célula huésped filamentosa fúngica es una célula de Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger o Aspergillus oryzae. En otro aspecto más preferido, la célula huésped filamentosa fúngica es una célula de Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium Sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum. En otro aspecto más preferido, la célula huésped filamentosa fúngica es una célula de cepa de Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa o Ceriporiopsis subvermispora, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride.

[0141] Las células fúngicas se pueden transformar por un proceso que implica la formación de protoplasto, transformación de los protoplastos y regeneración de la pared celular de una manera conocida per se. Procedimientos adecuados para la transformación de células huésped De Aspergillus y Trichoderma se describen en EP 238 023 y Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474. Métodos adecuados para transformar especies de Fusarium son descritos por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156 y WO 96/00787. La levadura puede ser transformada usando los procedimientos descritos por Becker y Guarente, In Abelson, J.N. y Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., Nueva York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; y Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920.

Métodos de producción

[0142] La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención, que comprenden (a) cultivar una célula, que en su forma de tipo salvaje es capaz de producir el polipéptido, bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido. Preferiblemente, la célula es del género Hafnia y más preferiblemente Hafnia alvei.

[0143] La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención, que comprenden (a) cultivar una célula huésped bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.

[0144] La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención, que comprenden (a) cultivar una célula huésped recombinante bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido, donde la célula huésped puede comprender una secuencia de nucleótidos mutante con al menos una mutación en la región de codificación de polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 9, donde la secuencia de nucleótidos mutante codifica un polipéptido que consta de los aminoácidos 1 a 413 de la SEQ ID NO: 10; y (b) recuperar el polipéptido.

[0145] En los métodos de producción de la presente invención, las células se cultivan en un medio nutriente adecuado para la producción del polipéptido usando métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula se puede cultivar mediante cultivo en matraz de agitación y fermentación a escala grande o a escala pequeña (incluyendo fermentaciones continuas, por lote, por lote alimentado o fermentaciones de estado sólido) en laboratorios o fermentadores industriales realizadas en un medio adecuado y bajo condiciones que permitan que el polipéptido se exprese y/o aísle. El cultivo se desarrolla en un medio nutriente adecuado que comprende fuentes de nitrógeno y carbono y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la técnica. Los medios adecuados están disponibles en proveedores comerciales o se pueden preparar según composiciones publicadas (p. ej., en catálogos de la American Type Culture Collection). Si el polipéptido se segrega en el medio nutriente, el polipéptido se puede recuperar directamente del medio. Si el polipéptido no se segrega, puede ser recuperado de lisatos de células.

[0146] Los polipéptidos pueden ser detectado usando métodos conocidos en la técnica que son específicos para los polipéptidos. Estos métodos de detección pueden incluir el uso de anticuerpos específicos, la formación de un producto de polipéptido o la desaparición de un sustrato de polipéptido. Por ejemplo, un ensayo de polipéptido se puede utilizar para determinar la actividad del polipéptido como se describe en este caso.

[0147] El polipéptido resultante puede ser recuperado usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido puede ser recuperado del medio nutriente por procedimientos convencionales incluyendo, pero no limitándose a, centrifugado, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación o precipitación.

[0148] Los polipéptidos de la presente invención se pueden purificar mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica incluyendo, pero no limitándose a, cromatografía (p. ej., intercambio iónico, afinidad,

cromatoenfoque hidrófobo y exclusión de tamaño), procedimientos electroforéticos (p. ej., enfoque isoeléctrico preparativo), solubilidad diferencial (p. ej., precipitación de sulfato de amonio), SDS-PAGE o extracción (ver, por ejemplo, Protein Purification, J.-C. Janson y Lars Riden, editores, VCH Publishers, New York, 1989).

Plantas transgénicas

[0149] La presente invención también se refiere a una planta transgénica, parte de la planta o célula de la planta que ha sido transformada con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la presente invención. Una planta tal puede expresar y producir el polipéptido en cantidades recuperables. El polipéptido se puede recuperar de la planta o parte de la planta. Alternativamente, la planta o parte de la planta que contiene el polipéptido recombinante se puede utilizar como tal para mejorar la calidad de alimentos o pienso, por ejemplo, mejorando el valor nutricional, el sabor y las propiedades reológicas o para destruir un factor antinutricionales.

[0150] En una realización particular, el polipéptido es dirigido a las vacuolas de almacenamiento de endospermo en semillas. Éste se puede obtener sintetizándolo esta como un precursor con un péptido señal adecuado, ver Horvat et al en PNAS, Feb. 15, 2000, vol. 97, n°. 4, p. 1914-1919.

[0151] La planta transgénica puede ser dicotiledónea (una dicot) o monocotiledónea (una monocot) o variantes de las mismas creadas genéticamente. Ejemplos de plantas monocot son hierbas, tales como poa de los prados (poa pratense, poa); hierbas forrajeras tales como Festuca, Lolium; césped templado, como Agrostis; y cereales, por ejemplo, trigo, avena, centeno, cebada, arroz, sorgo, triticale (híbrido estabilizado de trigo (Triticum) y centeno (Secale)) y maíz. Ejemplos de plantas dicot son el tabaco, las leguminosas, tales como el girasol (Helianto), algodón (Gossypium), altramuces, patata, remolacha azucarera, guisante, judías y semilla de soja, y plantas crucíferas (familia Brassicaceae) tales como coliflor, semilla de colza y el organismo modelo estrechamente relacionado de la Arabidopsis thaliana. Plantas de bajo fitato tal y como se describe, por ejemplo, en la patente estadounidense n° 5.689.054 y la patente estadounidense n° 6.111.168 son ejemplos de plantas creadas genéticamente.

[0152] Ejemplos de partes de planta son tallo, callo, hojas, raíz, frutos, semillas y tubérculos, así como los tejidos individuales que comprenden estas partes, por ejemplo: epidermis, mesófilo, parénquima, tejidos vasculares y meristemas. Compartimentos específicos de la planta, tales como cloroplasto, apoplasto, mitocondria, vacuola, peroxisomas y citoplasma se consideran también una parte de planta. Además, cualquier célula vegetal, cualquiera que sea el origen del tejido, se considera que es una parte de planta. Asimismo, partes de planta tales como tejidos específicos y células aisladas para facilitar la utilización de la invención son también consideradas partes de planta, por ejemplo: embriones, endospermos, aleurona y tegumentos.

[0153] También incluida dentro del campo de la presente invención está la descendencia de tales plantas, partes de planta y células vegetales.

[0154] La planta transgénica o la célula vegetal que expresa un polipéptido de la presente invención se puede construir conforme a métodos conocidos en la técnica. Brevemente, la planta o célula vegetal se construye incorporando uno o más constructos de expresión que codifican un polipéptido de la presente invención en el genoma huésped de la planta, y propagando la planta o célula vegetal modificada resultante a una planta o célula vegetal transgénica.

[0155] Convenientemente, el constructo de expresión es un constructo de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido de la presente invención operativamente enlazado a secuencias reguladoras apropiadas requeridas para la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos en la planta o parte de planta elegida. Además, el constructo de expresión puede comprender un marcador seleccionable, útil para identificar células huésped en las que el constructo de expresión ha sido integrado y secuencias de ADN necesarias para introducir el constructo en la planta en cuestión (éste último depende del método usado para introducir el ADN).

[0156] La elección de las secuencias reguladoras, tales como secuencias promotoras y terminadoras y opcionalmente secuencias de señal o tránsito se determinan, por ejemplo, basándose en cuando, dónde y cómo se desea que el polipéptido se exprese. Por ejemplo, la expresión del gen que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser constitutiva o inducible, o puede ser específica de desarrollo, fase o tejido, y el producto genético puede ser dirigido a un compartimiento celular, tejido o parte de planta específicos tales como semillas u hojas. Secuencias reguladoras son, por ejemplo, descritas por Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506.

[0157] Para expresión constitutiva, se pueden utilizar los siguientes promotores: el promotor 35S-CaMV (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294), la ubiquitina 1 de maíz (Christensen AH, Sharrock RA y Quail 1992. Maize Polyubiquitin Genes: structure, termal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation) o el promotor de actina 1 de arroz (Plant Mo. Biol. 18, 675-689.; Zhang W, McElroy D. y Wu R 1991, Analysis of rice Act1 5' region activity in transgenic rice plants.Plant Cell 3, 1155-1165). Promotores específicos de un órgano pueden ser, por ejemplo, un promotor de tejidos sumidero de almacenamiento tales como semillas, tubérculos de patata y frutos (Edwards & Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303), o de tejidos sumidero metabólicos tales como meristemas (Ito et al., 1994, Plant. Mol. Biol. 24: 863-878), un promotor específico de semilla tal como el promotor

de la glutelina, prolamina, globulina, o promotor de albúmina de arroz (Wu et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 885-889), un promotor de Vicia faba de la legúmina B4 y el gen de proteína de semilla desconocido de Vicia faba (Conrad et al., 1998, Journal of Plant Physiology 152: 708-711), un promotor de una proteína de cuerpo aceitoso de semilla (Chen et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 935-941), el promotor napA de proteína de almacenamiento de Brassica napus o cualquier otro promotor específico de semilla conocido en la técnica, por ejemplo; tal y como se describe en WO 91/14772. Además, el promotor puede ser un promotor específico de hoja tal como el promotor de rbcs de arroz o tomate (Kiozuka et al., 1993, Plant Physiology 102: 991-1000), el promotor del gen de adenina metiltransferasa del virus chlorella (Mitra y Higgins, 1994, Plant Molecular Biology 26: 85-93), o el promotor del gen aldP del arroz (Kagaia et al., 1995, Genética General y Molecular 248: 668-674), o un promotor inducible por herida tal como el promotor pin2 de la patata (Xu et al., 1993, Plant Molecular Biology 22: 573-588). Asimismo, el promotor puede ser inducible por tratamientos abióticos tales como temperatura, sequía o alteraciones en salinidad o inducibles por sustancias aplicadas exógenamente que activan el promotor, por ejemplo: etanol, estrógenos, hormonas de planta tipo etileno, ácido abscísico, ácido giberélico y/o metales pesados.

[0158] Un elemento intensificador del promotor se puede usar también para lograr una expresión mayor del polipéptido en la planta. Por ejemplo, el elemento intensificador del puede ser un intrón que se coloca entre el promotor y la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la presente invención. Por ejemplo, Xu et al., 1993, supra, describen el uso del primer intrón del gen de actina del arroz 1 para mejorar la expresión.

[0159] Aún más, el uso del codón se puede optimizar en las especies de planta en cuestión para mejorar la expresión (ver Horvat et al. referido anteriormente).

[0160] El gen marcador seleccionable y cualquier otra parte del constructo de expresión se puede elegir de entre aquellas disponibles en la técnica.

[0161] El constructo de ácidos nucleicos se incorpora en el genoma de la planta según técnicas convencionales conocidas en la técnica, incluyendo transformación mediada por Agrobacterium, transformación mediada por virus, microinyección, bombardeo de partículas, transformación biolística y electroporación (Gassen et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).

[0162] Actualmente, la transferencia de genes mediada por Agrobacterium tumefaciens es el método elegido para generar dicot transgénicas (para revisión ver Hooykas y Schilperoort, 1992, Plant Molecular Biology 19: 15-38) y puede también ser usada para transformar monocot, aunque se usan más frecuentemente otros métodos de transformación para estas plantas. Actualmente, el método elegido para generar monocot transgénicas, complementando la estrategia de Agrobacterium, es el bombardeo de partículas (partículas microscópicas de oro o tungsteno revestidas con el ADN que se ha de transformar) de tejidos embrionarios o embriones en desarrollo (Christou, 1992, Plant Journal 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Current Opinion Biotechnology 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/technology 10: 667-674). Un método alternativo para transformación de monocot se basa en la transformación de protoplastos tal como es descrito por Omirulleh et al., 1993, Plant Molecular Biology 21: 415-428.

[0163] Después de la transformación, los transformantes que han incorporado en ello el constructo de expresión incorporada en estos el constructo de expresión son seleccionados y regenerados en plantas completas según métodos bien conocidos en la técnica. Frecuentemente el procedimiento de transformación se diseña para la eliminación selectiva de genes de selección tanto durante la regeneración como en las siguientes generaciones usando por ejemplo cotransformación con dos constructos de ADN-T separados o escisión específica de sitio del gen de selección mediante una recombinasa específica.

[0164] La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención que comprenden (a) cultivar una planta transgénica o una célula vegetal que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido con actividad de fitasa de la presente invención bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.

Composiciones y usos

[0165] En otros aspectos adicionales, la presente invención se refiere a composiciones que comprenden un polipéptido de la presente invención, así como métodos para el uso de éstos.

[0166] Las composiciones de polipéptidos se pueden preparar conforme a métodos conocidos en la técnica y pueden estar en forma de una composición líquida o una composición seca. Por ejemplo, la composición de polipéptidos puede estar en forma de granulados o microgranulados. El polipéptido se incluye en la composición puede ser estabilizado conforme a métodos conocidos en la técnica.

[0167] La fitasa de la invención se puede usar para degradación, en cualquier contexto industrial de, por ejemplo, fitato, ácido fítico y/o los mono-, di-, tri-, tetra y/o pentafosfatos de myo-inositol. Es bien conocido que las fracciones de fosfato de estos compuestos quelan los cationes divalentes y trivalentes tales como iones metálicos, es decir, los iones nutricionalmente esenciales de calcio, hierro, zinc y magnesio así como los oligoelementos de manganeso, cobre y

molibdeno. Además, el ácido fítico, hasta cierto punto, también enlaza proteínas por interacción electroestática.

[0168] Por consiguiente, los usos preferidos de los polipéptidos de la invención son las preparaciones de pienso o en aditivos para este tipo de preparaciones.

[0169] En particular, el polipéptido de la invención se puede usar para mejorar el valor nutritivo de un pienso. Ejemplos no limitantes de mejoras del valor nutritivo de pienso para animales (incluyendo alimentación humana) son: mejorar la digestibilidad del pienso; promover el crecimiento del animal; mejorar la utilización del pienso; mejorar la biodisponibilidad de proteínas; aumentar el nivel de fosfato digerible; mejorar la liberación y/o degradación de fitato; mejorar la biodisponibilidad de oligoelementos; mejorar la biodisponibilidad de macrominerales; eliminar la necesidad de añadir fosfato adicional suplementario, oligoelementos y/o macrominerales; y/o mejorar la calidad de la cáscara de huevo. El valor nutritivo del pienso es, por lo tanto, incrementado, y el índice de crecimiento y/o aumento de peso y/o conversión de pienso (es decir, el peso del pienso ingerido en relación a la ganancia de peso) del animal puede ser mejorado.

[0170] Adicionalmente, el polipéptido de la invención se puede usar para reducir el nivel de fitato del abono.

Animales, piensos y aditivos de pienso

[0171] El término animal incluye todos animales, incluyendo seres humanos. Ejemplos de animales son no rumiantes y rumiantes. Los animales rumiantes incluyen, por ejemplo, animales tales como ovejas, cabras, caballos y ganado bovino, por ejemplo ganado bovino para carne, vacas y terneras jóvenes. En una realización particular, el animal es un animal no rumiante. Los animales no rumiantes incluyen animales monogástricos, por ejemplo cerdos o puercos (incluyendo, pero no limitándose a, lechones, cerdos en crecimiento y cerdas); aves de corral tales como pavos, patos y pollo (incluyendo, pero no limitándose a, pollos para consumo y gallinas ponedoras); terneras jóvenes; y pescado (incluyendo, pero no limitándose a, salmón, trucha, tilapia, siluro y carpas; y crustáceos (incluyendo, pero no limitándose a, gambas y cigalas).

[0172] El término pienso o composición de pienso quiere decir cualquier compuesto, preparación, mezcla o composición adecuada para, o destinada a, ser ingerida por un animal.

[0173] En el uso según la invención el polipéptido se puede dar al animal antes, después o simultáneamente con la dieta. Esto último es lo que se prefiere.

[0174] En una realización particular, el polipéptido, en la forma en la que se añade al pienso o cuando se incluye en un aditivo de pienso, es sustancialmente puro. En una realización particular está bien definido. El término "bien definido" significa que el preparado de fitasa es puro al menos en un 50% según se determina mediante cromatografía de exclusión por tamaños (véase el ejemplo 12 de WO 01/58275). En otras realizaciones particulares El preparado de fitasa es pura al menos en un 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94 o al menos en un 95% según se determina mediante este método.

[0175] Un preparado sustancialmente puro y/o bien definido de polipéptidos es beneficioso. Por ejemplo, es mucho más fácil administrar correctamente al pienso un polipéptido que está esencialmente libre de interferir o contaminar otros polipéptidos. El término administrar correctamente se refiere en particular al objetivo de obtener resultados constantes y consistentes, y la capacidad de optimizar la dosificación basándose en el efecto deseado.

[0176] Para el uso en pienso, no obstante, el polipéptido de fitasa de la invención no necesita ser tan puro; puede, por ejemplo, incluir otros polipéptidos, en cuyo caso podría ser denominado preparado de fitasa.

[0177] El preparado de fitasa puede ser (a) añadido directamente al pienso (o usado directamente en un proceso de tratamiento de proteínas) o (b) puede ser usado en la producción de una o más composiciones intermedias tales como aditivos de pienso o premezclas que son posteriormente añadidas al pienso (o usadas en un proceso de tratamiento). El grado de pureza anteriormente descrito se refiere a la pureza del preparado de polipéptido original, tanto si se usa según (a) como según (b).

[0178] Preparados de polipéptido con purezas de este orden de magnitud son en particular obtenibles usando métodos recombinantes de producción, mientras que no se obtienen tan fácilmente y están sujetos también a una variación lote a lote mucho más alta cuando el polipéptido se produce por métodos de fermentación tradicionales.

[0179] Tal preparado de polipéptido puede por supuesto ser mezclado con otros polipéptidos.

[0180] El polipéptido se puede añadir al pienso en cualquier forma, ya sea como un polipéptido relativamente puro, o en una mezcla con otros componentes destinados a ser añadidos a pienso, es decir en forma de aditivos de pienso, tales como las llamadas premezclas para pienso.

[0181] En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a composiciones para uso en piensos, tales como

piensos y aditivos de pienso, por ejemplo premezclas.

[0182] Además del polipéptido de la invención, los aditivos de pienso de la invención contienen al menos una vitamina grasa soluble y/o al menos una vitamina soluble en agua y/o al menos un oligoelemento. El aditivo de pienso puede también contener al menos un macromineral.

[0183] Adicionalmente, ingredientes de aditivo de pienso opcionales son agentes colorantes, por ejemplo carotenoides tales como beta-caroteno, astaxantina y luteína; compuestos de aroma; estabilizadores; péptidos antimicrobianos; ácidos grasos poliinsaturados; especies generadoras de oxígeno reactivo; y/o como mínimo otro polipéptido seleccionado de entre fitasa (EC 3.1.3.8 ó 3.1.3.26); xilanasa (EC 3.2.1.8); galactanasa (EC 3.2.1.89); alfagalactosidasa (EC 3.2.1.22); proteasa (EC 3.4.-.-), fosfolipasa A1 (EC 3.1.1.32); fosfolipasa A2 (EC 3.1.1.4); lisofosfolipasa (EC 3.1.1.5); fosfolipasa C (3.1.4.3); fosfolipasa D (EC 3.1.4.4); amilasa como, por ejemplo, alfa-amilasa (EC 3.2.1.1); y/o beta-glucanasa (EC 3.2.1.4 o EC 3.2.1.6).

[0184] En una realización particular estos otros polipéptidos están bien definidos (como se define anteriormente para preparados de fitasa).

[0185] En una realización particularmente preferida, la fitasa de la invención con un pH óptimo relativamente bajo se combina con al menos una fitasa con un pH óptimo más alto. Ejemplos preferidos de fitasas de pH óptimo más alto son fitasas de Bacillus, tales como las fitasas de Bacillus licheniformis y Bacillus subtilis, así como derivados, variantes o fragmentos de las mismas que tienen actividad de fitasa.

[0186] La fitasa de la invención puede también combinarse con otras fitasas, por ejemplo fitasas de ascomicetos tales como fitasas de Aspergillus, por ejemplo derivadas de Aspergillus ficuum, Aspergillus niger o Aspergillus awamori; o fitasas de basidiomiceto, por ejemplo derivado de Peniofora licii, Agrocibe pediades, Trametes pubescens, o Paxillus involutus; o derivados, fragmentos o variantes de las mismas que tienen actividad de fitasa.

[0187] De este modo, en realizaciones preferidas del uso de la invención en piensos, y en realizaciones preferidas del aditivo de pienso y el pienso de la invención, la fitasa de la invención se combina con tales fitasas.

[0188] Las fitasas de ascomiceto y basidiomiceto mencionadas anteriormente, en particular la fitasa de RONOZYME P derivada de Peniofora licii así como derivados, variantes y fragmentos de la misma, pueden también combinarse con fitasas de Bacillus, en particular la fitasa de B.licheniformis así como con un derivado, fragmento o variante de la misma, en particular a efectos de piensos.

[0189] Ejemplos de péptidos antimicrobianos (PAM) son CAP18, Leucocina A, Tritrpticina, Protegrin-1, Tanatina, Defensina, Lactoferrina, Lactoferricina, y Ovispirina tal como Novispirina (Robert Lehrer, 2000), Plectasinas y Estatinas, incluyendo los compuestos y polipéptidos descritos en WO 03/044049 y WO 03/048148, así como variantes o fragmentos de los anteriores que retienen actividad antimicrobiana.

[0190] Ejemplos de polipéptidos antifungicidas (PAF) son los péptidos de Aspergillus giganteus y Aspergillus niger, así como variantes y fragmentos de los mismos que retienen actividad antifúngica, como se describe en WO 94/01459 y WO 02/090384.

[0191] Ejemplos de ácidos grasos poliinsaturados son los ácidos grasos poliinsaturados C18, C20 y C22, tales como ácido araquidónico, ácido docosohexaenoico, ácido eicosapentanoico y ácido gamma-linolénico.

[0192] Ejemplos de especies generadoras de oxígeno reactivo son productos químicos tales como perborato, persulfato

o percarbonato; y polipéptidos tales como una oxidasa, una oxigenasa o una sintetasa.

[0193] Normalmente vitaminas liposolubles e hidrosolubles, así como oligoelementos forman parte de la llamada premezcla destinada a ser agregada al pienso, mientras que los macrominerales son normalmente añadidos al pienso por separado. Cualquiera de estos tipos de composición, cuando se enriquece con un polipéptido de la invención, es un aditivo de pienso de la invención.

[0194] En una realización particular, se pretende que el aditivo de pienso de la invención se incluya (o se prescriba que tiene que incluirse) en dietas para animales o pienso a niveles de 0.01% a 10.0%; más particularmente de 0.05% a 5.0%; o de 0.2% a 1.0% (siendo % los gramos de aditivo por cada 100 g de pienso). Esto es así en particular para premezclas.

[0195] Lo siguiente son listas no exclusivas de ejemplos de estos componentes:

Ejemplos de vitaminas liposolubles son vitamina A, vitamina D3, vitamina E y vitamina K, por ejemplo vitamina K3.

[0196] Ejemplos de vitaminas hidrosolubles son vitamina B12, biotina y colina, vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6, niacina, ácido fólico y pantotenato, por ejemplo Ca-D-pantotenato.

[0197] Ejemplos de oligoelementos son manganeso, zinc, hierro, cobre, yodo, selenio y cobalto.

[0198] Ejemplos de macrominerales son calcio, fósforo y sodio.

5 [0199] Los requisitos nutricionales de estos componentes (ejemplificados con aves de corral y lechones/cerdos) se catalogan en la tabla A de WO 01/58275. Los requisitos nutricionales significan que estos componentes deberían ser proporcionados en la dieta en las concentraciones indicadas.

10 [0200] En la alternativa, el aditivo de pienso de la invención comprende al menos uno de los componentes individuales especificados en la tabla A de WO 01/58275. Al menos uno significa, o bien uno, o bien más de uno o dos, o tres, o cuatro etcétera hasta los trece, o hasta los quince componentes individuales. Más específicamente, este al menos un componente individual se incluye en el aditivo de la invención en tal cantidad como para proporcionar una concentración en el pienso en el rango indicado en las columnas cuatro, cinco o seis de la tabla A.

15 [0201] La presente invención también se refiere a composiciones de piensos. Las composiciones o dietas de pienso tienen un contenido relativamente alto de proteínas. Las dietas de aves de corral y de cerdo se pueden caracterizar como se indica en la tabla B de WO 01/58275, columnas 2-3. Las dietas de pescado se pueden caracterizar como se indica en la columna 4 de esta tabla B. Además tales dietas de pescado normalmente tienen un contenido bruto de

20 grasa de 200-310 g/kg.

[0202] WO 01/58275 corresponde a US 09/779334.

[0203] Una composición de pienso según la invención tiene un contenido bruto de proteína de 50-800 g/kg y comprende 25 además al menos un polipéptido como se reivindica en la presente.

[0204] Además, o en la alternativa (al contenido bruto de proteína indicado antes), la composición del pienso para animales puede tener un contenido de energía metabolizable de 10-30 MJ/kg; y/o un contenido de calcio de 0.1-200 g/kg; y/o un contenido disponible de fósforo de 0.1-200 g/kg; y/o un contenido de metionina de 0.1-100 g/kg; y/o un

30 contenido de metionina más cisteína de 0.1-150 g/kg; y/o un contenido de lisina de 0.5-50 g/kg.

[0205] En particular, el contenido de energía metabolizable, proteína bruta, calcio, fósforo, metionina, metionina más cisteína y/o lisina está dentro de cualquiera de los rangos 2, 3, 4 ó 5 en la tabla B de WO 01 /58275 (R. 2-5).

35 [0206] La proteína bruta se calcula como nitrógeno (N) multiplicado por un factor 6.25, es decir, Proteína bruta (g/kg)= N (g/kg) x 6.25. El contenido de nitrógeno se determina mediante el método Kjeldahl (A.O.A.C., 1984, Official Methods of Analysis 14th ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC).

[0207] La energía metabolizable puede ser calculada basándose en la publicación del NRC: Nutrient requirements in

40 swine, novena edición revisada 1988, Subcommittee on Swine Nutrition, Committee on Animal Nutrition, Board of agriculture, National Research Council. National Academy Press, Washington, D.C., pp. 2-6, y en la European Table of Energy Values for Pultry Feed-stuffs, Speldelholt Centre for Poultry Research and Extension, 7361 DA Beekbergen, Países Bajos. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv, Wageningen. ISBN 90-71463-12-5.

45 [0208] El contenido dietético de calcio, fósforo disponible y aminoácidos en dietas completas para animales se calcula basándose en tablas de piensos tales como la Veevoedertabel 1997, Gegevens over chemische samenstelling, Verteerbaarheid ene voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk Lelystad. ISBN 90-72839-13-7.

50 [0209] En particular, la composición de pienso para animales puede contener al menos una proteína. La proteína puede ser una proteína animal, tal como harina de carne y hueso, y/o harina de pescado; o puede ser una proteína vegetal. El término proteínas vegetales como se utiliza en este caso se refiere en cualquier compuesto, composición, preparado o mezcla que incluye al menos una proteína derivada de u originada en un vegetal, incluyendo proteínas modificadas y derivados de proteínas, en realizaciones particulares, el contenido de proteína de las proteínas vegetales es al menos

55 del 10, 20, 30, 40, 50, o 60% (p/p).

[0210] Las Proteínas vegetales se pueden obtener de fuentes de proteína vegetal, tales como leguminosas y cereales, por ejemplo, materiales de plantas de las familias Fabaceae (Leguminosae), Cruciferaceae, Chenopodiaceae y Poaceae, tales como harina de soja, harina de lupino y harina de semilla de colza.

60 [0211] En particular, la fuente de proteína vegetal es material que viene de una o más plantas de la familia Fabaceae, por ejemplo, soja, altramuz, guisante o judía.

[0212] De otra manera, la fuente de proteína vegetal es material que viene de una o más plantas de la familia 65 Chenopodiaceae, por ejemplo, remolacha, remolacha azucarera, espinaca o quinoa.

[0213] Otros ejemplos de fuentes de proteína vegetal son semilla de colza, semilla de girasol, semilla de algodón y repollo.

[0214] La soja es una fuente de proteína vegetal preferida.

[0215] Otros ejemplos de fuentes de proteína vegetal son cereales tal como cebada, trigo, centeno, avena, maíz, arroz, triticale y sorgo.

[0216] Todavía más particularmente, la composición de pienso para animales puede contener un 0-80% de maíz; y/o un 0-80% de sorgo; y/o un 0-70% de trigo; y/o 0-70% un cebada; y/o un 0-30% de avena; y/o un 0-40% de harina de soja; y/o un 0-25% de harina de pescado; y/o un 0-25% de harina de carne y hueso; y/o 0-20% de lactosuero.

[0217] Las dietas para animales pueden por ejemplo fabricarse como pienso en harina (no granulado) o pienso granulado. Típicamente, los piensos son molidos y se añaden cantidades suficientes de vitaminas y minerales esenciales según las especificaciones para la especie en cuestión. Se pueden añadir polipéptidos como formulaciones de polipéptidos sólidas o líquidas. Por ejemplo, una formulación de polipéptido sólida típicamente se añade antes o durante la fase de mezcla; y una preparación de polipéptido líquida típicamente se añade después de la fase de granulación. El polipéptido puede también ser incorporado en un aditivo de pienso o premezcla.

[0218] La concentración final de polipéptido en la dieta está en el rango de los 0.01-200 mg de proteína de polipéptido por kg de dieta, por ejemplo en el rango de 0.1-10 mg/kg de dieta animal (la dosificación típica está en el rango de 250 a 2000 FYT/kg de dieta para animales).

[0219] La fitasa de la invención debería por supuesto ser aplicada en una cantidad eficaz, es decir, en una cantidad adecuada para mejorar la solubilización y/o mejorar valor nutritivo del pienso. Se contempla actualmente que el polipéptido se administre en una o más de las siguientes cantidades (rangos de dosificación): 0.01-200; 0.01-100; 0.5100; 1-50; 5-100; 10- 100; 0.05-50; o 0.10-10, siendo todos estos rangos en mg de proteína de polipéptido de fitasa por kg (ppm) de pienso.

[0220] Para determinar los mg de proteína de polipéptido de fitasa por kg de pienso, la fitasa es purificada a partir de la composición de pienso y la actividad específica de la fitasa purificada se determina usando un ensayo pertinente. La actividad de fitasa de la composición de pienso como tal se determina también usando el mismo ensayo y, basándose en estas dos determinaciones, se calcula la dosificación en mg de proteína fitasa por kg de pienso.

[0221] Los mismos principios se aplican para determinar los mg de proteína polipeptídica fitasa en aditivos para piensos. Por supuesto, si una muestra de la fitasa usada para preparar el aditivo para pienso o el pienso está disponible, la actividad específica se determina a partir de esta muestra (sin necesidad de purificar la fitasa de la composición de piensos o el aditivo).

Métodos para producir productos de fermentación

[0222] Otro aspecto de la presente invención se refiere a los métodos para producir un producto de fermentación, tal como, por ejemplo, etanol, cerveza, vino, granos secos de destilería (GSD), donde la fermentación se realiza en presencia de una fitasa de la presente invención. Ejemplos de procesos de fermentación incluyen, por ejemplo, los procesos descritos en WO 01/62947. La fermentación se realiza usando un microorganismo fermentativo, tal como levadura.

[0223] En un particular, la presente invención proporciona métodos para producir un producto de fermentación, que comprenden (a) fermentar usando un microorganismo fermentativo, (tal como levadura) un material que contiene carbohidratos (por ejemplo; almidón) en la presencia de una fitasa de la presente invención; y (b) producir el producto de fermentación del material fermentado que contiene carbohidratos.

[0224] Particularmente, la presente invención puede proporcionar métodos para producir etanol, que comprenden fermentar (usando un microorganismo fermentativo, tal como levadura) un material que contiene carbohidratos (por ejemplo; almidón) en presencia de una fitasa de la presente invención y producir o recuperar el etanol del material que contiene carbohidratos fermentado.

[0225] Además, la presente invención puede proporcionar métodos para producir etanol que comprenden: a) hidrolizar almidón, por ejemplo, mediante una licuefacción y/o proceso de sacarificación, un proceso de hidrólisis de almidón crudo; b) fermentar el almidón resultante en presencia de una fitasa de la presente invención; y c) producir etanol.

[0226] La fitasa se puede agregar al proceso de fermentación en cualquier fase adecuada y en cualquier composición adecuada, incluyendo sola o en combinación con otras enzimas, tales como una o más alfa-amilasas, glucoamilasas, proteasas y/o celulasas.

[0227] Adicionalmente, la presente invención puede proporcionar métodos para producir etanol que comprenden

hidrolizar biomasa y fermentar (usando un microorganismo fermentativo, tal como levadura) la biomasa resultante en presencia de una fitasa de la presente invención.

Ejemplos

Ejemplo 1. Clonación de un gen de fitasa de Hafnia alvei

[0228] Un alineamiento múltiple fue hecho a partir de las siguientes fosfatasas ácidas de histidina (HAP): appA Escherichia coli (SPTREMBL:Q8GN88), fitasa de Citrobacter gillenii DSM 13694 (geneseqp:aeh04533), fitasa de Citrobacter amalonaticus ATCC 25407 (geneseqp:aeh04535), fitasa de Citrobacter braakii (geneseqp:aeh04827) e ypo1648 Yersinia pestis CO92 (SPTREMBL:Q8ZFP6). Dos cebadores degenerados de oligonucleótidos fueron diseñados basándose en secuencias de consenso:

2123fw: 5'- CATGGTGTGCGNGCNCCNACNAA -3' (SEQ ID NO:1) 2065rev: 5'- CCCACCAGGNGGNGTRTTRTCNGGiTG -3' (SEQ ID NO:2),

donde Y designa T o C, R designa A o G, y N designa A, C, G o T.

[0229] Los cebadores se usaron para selección PCR de varias especies bacterianas a temperaturas de anillamiento entre 40 y 50°C pero típicamente como programa “touch down” empezando por 50°C y luego reduciendo la temperatura de anillamiento en 1°C por cada ciclo durante los siguientes 10 ciclos antes llevar a cabo PCR estándar.

[0230] Un gen de fitasa parcial en forma de un fragmento PCR de aproximadamente 950 pb fue identificado en Hafnia alvei (DSM 19197).

[0231] El fragmento de PCR fue aislado de gel de agarosa y el fragmento fue secuenciado usando los mismos cebadores PCR con los que el fragmento fue generado. Mediante la traducción de la secuencia de nucleótidos, se confirmó que el fragmento de ADN era parte de un gen de fitasa HAP.

[0232] Para obtener la secuencia completa de nucleótidos del gen se usó el kit DNA WALKING SPEEDUP™ (DWSK- V102 de Seegene, Inc., 2ª planta, Edificio Miungji, 142-21, Samsung-dong, Kangnam-gu, Seoul, 135-090, Corea), el cual está diseñado para capturar sitios diana desconocidos. Con este fin, se diseñaron y usaron 6 oligonucleótidos específicos con el kit.

2328 TSP1dw: 5'- ACTTGCATCGACGTTGGCTG (SEQ ID NO: 3) 2329 TSP2dw: 5'- ACTGAGCAGCAATGGAACTCTCTG (SEQ ID NO: 4) 2330 TSP3dw: 5'- ACTGGGTTCCAATATCACGAGTC (SEQ ID NO: 5) 2331 TSP1up: 5'- ATGGTGGATCGCTAAATCACACTG (SEQ ID NO: 6) 2332 TSP2up: 5'- ACGTCTGCCCAAACATACACG (SEQ ID NO: 7) 2333 TSP3up: 5'- ACCGCCCATCAGGCTAATC (SEQ ID NO: 8)

[0233] La secuencia completa de nucleótidos que codifica la fitasa de Hafnia alvei DSM 19197 se muestra en el listado de secuencias como SEQ ID NO: 9 y la secuencia codificada de aminoácidos correspondiente se muestra en SEQ ID NO: 10. Los primeros 33 aminoácidos de la SEQ ID NO:10 (es decir, los aminoácidos -33 a -1) son un péptido señal, como fue predicho por el software Signal P V3.0 (ver www.cbs.dtu.dk/services/SignaIP/).

Ejemplo 2. Expresión del gen de la fitasa de Hafnia alvei.

[0234] Un péptido señal de 27 aminoácido que codifica un polinucleótido de una proteasa original, Savinase™, de Bacillus licheniformis fue fusionada mediante PCR dentro del marco al gen que codifica la fitasa madura de Hafnia alvei. La secuencia codificante de péptido señal se muestra en la SEQ ID NO: 11, codificando el péptido señal de la SEQ ID NO: 12.

[0235] La codificación de ADN para el polipéptido fusionado se integró mediante recombinación homóloga en un genoma de célula huésped de Bacillus subtilis. El constructo de gen se expresó bajo el control de un sistema de promotor triple (como se describe en WO 99/43835), que consta de los promotores del gen de alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL), del gen de alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ) y el promotor cryIIIA de Bacillus thuringiensis que incluye la secuencia estabilizante de ARNm. El gen que codifica la cloranfenicol acetiltransferasa se usó como marcador, como se describe en, por ejemplo, Diderichsen et al., A useful cloning vector for Bacillus subtilis. Plasmid, 30, p. 312, 1993.

[0236] Transformantes resistentes al cloranfenicol se cultivaron medio PS-1 medio (10% de sacarosa, 4% de harina de soja, 1% de Na3PO4 -12H2O, 0.5% de CaCO3 y 0.01% ácido plurónico) agitado a 250 r.p.m. a 30°C. Después de 2-5 días de incubación se retiró el sobrenadante y la actividad de fitasa fue identificada aplicando 20 microlitros del sobrenadante en agujeros de 4 mm de diámetro perforados en placas de un 1% de LSB-agarosa que contienen 0.1M de acetato de sodio pH 4.5 y 0.1% ácido inositol hexafosfórico. Las placas se dejaron durante la noche a 37°C y se vertió

un tampón que consistía en 0.25M de CaCl2 y 500mM de MES (ajustada a pH 6.5 con 4N NaOH) sobre las placas. Las placas se dejaron a temperatura ambiente durante 1h y la actividad de inositol-fosfato fosfatasa, o fitasa, se identificó luego como una zona limpia.

[0237] Se analizaron diferentes transformantes positivos de fitasa mediante secuenciación de ADN para asegurar la secuencia de ADN correcta de los constructos. Se seleccionó un clon correcto.

Ejemplo 3. Fermentación del huésped de fitasa Hafnia NN020125

[0238] El clon seleccionado de Bacillus subtilis, que albergaba el constructo de fitasa de Hafnia alvei y fue capaz de expresar la fitasa (parte madura) se cultivó a 30°C y con 250 rpm durante 6 días en un medio SK-1M (40g caseinato de sodio (Miprodan 30 de Arla), 200g de maltodextrina 01 (Glucidex 6, catálogo n°. 332203 de Roquette), 50 g de harina de soja, 0.1ml Dowfax 63N10 (un surfactante no iónico de Dow) 0.1ml, agua corriente hasta 1000 ml, pastillas de CaCO3 de 0.5g/100 ml).

Ejemplo 4. Purificación de Fitasa de Hafnia alvei

[0239] El sobrenadante de fermentación con la fitasa se centrifugó primero a 7200 rpm y 5°C durante una hora y filtrado a través de un “sándwich” de cuatro filtros de microfibra de vidrio Whatman (2.7, 1.6, 1.2 y 0.7 micrómetros). Después de esto la solución se filtró estérilmente a través de un filtro de profundidad Seitz-EK usando presión. A continuación, el sobrenadante filtrado fue pretratado de la siguiente manera:

[0240] La solución de muestra fue lavada con agua y concentrada usando una unidad de ultrafiltración (Filtron, de Filtron Technology Corporation) equipada con una membrana de ultrafiltración de 10kDa de corte. Luego el pH fue ajustado a 4,5 con ácido acético al 10%(p/v), lo que causó una precipitación poco importante. No se encontró ninguna actividad en el precipitado y fue retirado mediante filtración a través de un filtro de tapa de botella de PES rápido con un corte de

0.22 micrómetros.

[0241] Después del pretratamiento, la fitasa fue purificada por cromatografía en S sefarosa, aproximadamente 50 ml en una columna XK26, usando como tampón A 50 mM de acetato de sodio pH 4.5 y como tampón B 50 mM de acetato de sodio + 1 M de NaCl pH 4.5. Las fracciones de la columna se analizaron para actividad usando el ensayo de fosfatasa (ver más adelante) y las fracciones con actividad fueron agrupadas.

[0242] A la solución se le añadió sulfato de amonio sólido que da una concentración final de 1.5 M y el pH fue ajustado a

6.0 usando 6 M de HCl. La solución que contenía fitasa fue aplicada a una columna de butil sefarosa, aproximadamente 30 ml en una columna XK26, usando como tampón A 25 mM de bis-tris (Bis-(2-hidroxietil)iminotris(hidroximetiil)metano)) + 1.5 M de sulfato de amonio pH 6.0 y como tampón B 25 mM de bis-tris pH 6.0. Las fracciones de la columna se analizaron para actividad usando el ensayo de fosfatasa (ver más adelante) y las fracciones con actividad fueron agrupadas. Finalmente, la solución que contenía la fitasa purificada se cambió a otro tampón de 50 mM de acetato de sodio + 0.1 M de NaCl, pH 4.5 y fue concentrada usando un dispositivo de filtrado Amicon ultra-15 con una membrana con un corte de 30 kDa.

[0243] El peso molecular, tal y como se estima mediante SDS-PAGE, fue aproximadamente de 40 kDa y la pureza fue > 95%.

Ejemplo 5. Ensayos de actividad

Determinación de actividad de fosfatasa

[0244] Una solución enzimática de 75 microlitros que contiene fitasa se dispensa en un pocillo de una placa de microtitulación, por ejemplo, NUNC 269620 y se añade un sustrato de 75 microlitros (para preparar el sustrato, se disuelven dos pastillas de 5 mg de p-nitrofenil fosfato (Sigma, Cat.Nº.N-9389) en 10 ml de 0.1 M de tampón de acetato de sodio, pH 5.5). La placa se sella y se incuba durante 15 minutos, agitando a 750 r.p.m. a 37°C. Después del periodo de incubación se añaden 75 microlitros de reactivo de parada (el reactivo de parada es 0.1 M de tetraborato de disodio en agua) y la absorbancia a 405 nm se mide en un espectrofotómetro de placa de microtitulación.

Determinación de la actividad de fitasa

[0245] Una solución enzimática de 75 microlitros que contiene fitasa, apropiadamente diluida en 0.25M de acetato de sodio, Tween-20 al 0.005% (p/v) pH 5.5, se dispensa en un pocillo de una placa de microtitulación, por ejemplo, NUNC 269620 y se añade un sustrato de 75 microlitros (preparado disolviendo 100mg de fitato de sodio de arroz (Aldrich Cat.Nº. 274321) en 10 ml de 0.25M de tampón de acetato de sodio, pH 5.5). La placa se sella y se incuba durante 15 minutos, agitando a 750 r.p.m. a 37°C. Tras la incubación, se añaden 75 microlitros de reactivo de parada (siendo el reactivo de parada preparado mezclando 10 ml de solución de molibdato (hepta molibdato de amonio al 10% (p/v) en solución de amonio al 0.25% (p/v)), 10ml vanadato de amonio (0.24% producto comercial de Bie&Berntsen, Cat.No.LAB17650) y 20ml de ácido nítrico al 21.7% (p/v)), y la absorbancia a 405nm se mide en un espectrofotómetro de placa de microtitulación. La actividad de fitasa se expresa en la unidad de FYT, siendo un FYT la cantidad de enzima que libera 1 micromol de ortofosfato inorgánico por minuto bajo las condiciones anteriores. Un valor absoluto para la actividad de fitasa medida se puede obtener haciendo referencia a una curva estándar preparada a partir de diluciones apropiadas de fosfato inorgánico o haciendo referencia a una curva estándar hecha de diluciones de un preparado de

5 enzima fitasa con actividad conocida (tal preparado de enzima fitasa con una actividad conocida está disponible previa instancia a Novozymes A/S, Krogshoejvej 36; DK-2880 Bagsvaerd).

Determinación de actividad de fitasa específica

10 [0246] La actividad específica de la fitasa fue determinada en tampón de acetato sódico, pH 5.5. La fitasa fue altamente purificada como se ha descrito anteriormente, es decir, sólo se identificó un componente en un gel de poliacrilamida SDS.

[0247] La concentración de proteína se determinó mediante análisis de aminoácidos de la siguiente manera: una

15 alícuota de la muestra fue hidrolizada en HCl 6M, 0.1% de fenol durante 16 horas a 110°C en un tubo de vidrio evacuado. Los aminoácidos resultantes fueron cuantificados usando un sistema de análisis de aminoácidos Applied Biosysttems 420A operado según las instrucciones del fabricante. A partir de las cantidades de aminoácidos se calculó la masa total - y así también la concentración - de proteína en la alícuota hidrolizada.

20 [0248] La actividad de fitasa fue determinada en las unidades de FYT tal y como se ha descrito anteriormente y la actividad específica fue calculada como la actividad de fitasa medida en unidades FYT por mg de proteína de enzima fitasa.

[0249] La actividad específica resultante fue 980 FYT/mg de proteína. La actividad específica fue determinada en fitato 25 de sodio a pH 5.5 y 37°C.

Ejemplo 6. Determinación del perfil de pH de la fitasa

[0250] El perfil de pH fue determinado a 37°C en el rango de pH de 2.0 a 7.5 (en pasos de 0.5 unidades de pH) tal y

30 como se ha descrito anteriormente en la sección "Determinación de la actividad de fitasa", excepto que se usó un cóctel de tampones (50mM de glicina, 50mM de ácido acético y 50mM de Bis-tris) en vez del tampón de 0.25M de acetato de sodio pH 5.5. Los resultados se resumen en la tabla 1 más adelante. Los valores dados para cada pH en el rango de 2.0

-

7.5 son la actividad relativa en % normalizada al valor óptimo.

35 Tabla 1: perfil de pH

Fitasa pH

2.0

2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5

Hafnia alvei

46 61 83 95 100 100 88 71 43 18 3 0

Ejemplo 7. Determinación del punto isoeléctrico de la fitasa

[0251] El punto isoeléctrico, pl, para la fitasa fue determinado usando geles de isoelectroenfoque (gel Novex pH 310 IEF

40 de Invitrogen, número de catálogo EC6655A2) utilizados según es descrito por el fabricante. El pl para la fitasa de Hafnia alvei es aproximadamente 7.4.

Ejemplo 8. Perfil de temperatura de la fitasa

45 [0252] Se determinó el perfil de temperatura (actividad de fitasa como función de la temperatura) para la Fitasa de Hafnia alvei en el rango de temperaturas de 20-90°C esencialmente como se ha descrito antes (Determinación). No obstante, las reacciones enzimáticas (100 microlitros de solución enzimática que contiene fitasa + 100 microlitros de sustrato) se desarrollaron en tubos PCR en vez de en placas de microtitulación. Después de un periodo de reacción de 15 minutos a la temperatura deseada los tubos fueron enfriados a 20°C durante 20 segundos y se transfirieron 150

50 microlitros de cada mezcla de reacción a una placa de microtitulación. Se añadieron 75 microlitros de reactivo de parada y se midió la absorbancia a 405 nm en un espectrofotómetro de placa de microtitulación. Los resultados se resumen en la tabla 2 a continuación. Los números dados para cada temperatura son la actividad relativa (en %) normalizada al valor óptimo.

55 Tabla 2: Perfil de temperatura

Temperatura °C

20 30 40 50 55 60 65 70 80 90

Actividad relativa

17 27 45 69 79 85 100 95 7 0

Ejemplo 9.Termostabilidad de fitasa

[0253] Se sometió la fitasa de Hafnia alvei expresada tanto en Aspergillus oryzae como en Bacillus subtilis a mediciones de termoestabilidad mediante Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC) y se comparó con la fitasa de E.coli (disponible comercialmente como PHYZYME XP de Danisco A/S).

[0254] Una alícuota de la muestra proteínica de fitasa de Hafnia alvei (purificada tal y como se describe en el ejemplo 4) fue dializada contra 2 x 500 ml de 20 mM de acetato de sodio, pH 4.0 a 4°C en una fase de 2-3h seguida de una fase durante toda la noche. La muestra fue filtrada a 0.45 µm y diluida con tampón a aprox. 2 A280 unidades. Los valores exactos de absorbancia medidos se dan en la tabla de resultados mostrada más abajo. El tampón de diálisis se usó como referencia en la Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC). Las muestras fueron desgasificadas usando succión de vacío y agitando durante aprox. 10 minutos. Una alícuota de la fitasa de E. coli del producto comercial PHYZYME XP fue purificada de una forma similar a como se describe en el ejemplo 4.

[0255] Se realizó un barrido de DSC a una tasa constante de barrido de 1.5 °C/min de 20 a 80 °C. Periodo de filtración: 16 s. Antes de llevar acabo la DSC, las fitasas fueron dializadas contra los tampones apropiados (p. ej. 0.1 M de glicina-HCl pH 2.5 ó 3.0, 20mM de acetato sódico pH 4.0, 0.1 M de acetato sódico pH 5.5, 0.1 M de Tris-HCl pH 7.0). El tratamiento de datos fue realizado usando el software MicroCal Origin (versión 4.10), y la temperatura de desnaturalización, Td (también llamado temperatura de fusión, Tf) se define como la temperatura en el vértice del pico en el termograma. Para sondear la reversibilidad del proceso de desplegado, se llevó a cabo un segundo barrido inmediatamente después de una corta fase de enfriamiento. Para el segundo barrido el área del pico (el área entre el valor máximo y la referencia = la entalpía de desplegado que se está comparando) se compara con el área del pico del primer barrido. Un valor de pico grande (entre 75-100% del área de pico del primer barrido) se interpreta como un proceso de plegado/desplegado reversible.

[0256] Los resultados de DSC para Fitasa de Hafnia alvei expresada tanto en Aspergillus oryzae como Bacillus subtilis y la fitasa de E.coli se resumen en la tabla 3 a continuación.

Tabla 3. Termoestabilidad comparativa de fitasa de Hafnia alvei y fitasa E. coli

Fitasa

Tampón A280 Td 1º barr. (°C) Td 2º barr. (°C) Tamaño relativo de pico (área real) en 2 barridos

H. alvei expresada en Aspergillus

20 nM NaAc ph 4.0 3.2 70.2 70.3 grande

H. alvei expresada en Bacillus

20 nM NaAc pH 4.0 1.6 70.1 70.3 grande

E. coli

20 nM NaAc pH 4.0 2.4 62.6 62.9 medio

[0257] Como se ilustra en la tabla anterior, la fitasa de Hafnia alvei tenía mayor termoestabilidad que la fitasa de E. coli. Está también claro que la termoestabilidad de la fitasa de Hafnia alvei no fue afectada por el huésped de expresión.

Ejemplo 10. Resistencia Proteolítica Gástrica de la fitasa de Hafnia alvei y fitasa de E. coli

[0258] Muestras de fitasa H. alvei y fitasa de E. coli (PHYZYME XP, disponible en DANISCO) fueron tratadas con pepsina (Pepsina 1:60000 obtenida de Mucosa de Estómago Porcino, Wako 162-18721, 2900 unidades/mg, lote SDK5232) en 250 mM de tampón de glicina pH 3.0 (aprox. 1000 unidades de pepsina/mg de fitasa). Incubación durante 30 minutos a 40°C con agitado (750 r.p.m.). Después de la incubación con pepsina, la actividad de fitasa fue determinada como se describe en el ejemplo 5 y comparada con la actividad de una muestra tratada de la misma manera, pero sin adición de pepsina. Los resultados se resumen en la tabla 4 a continuación.

TABLA 4. Resistencia Proteolítica Gástrica de la fitasa de Hafnia alvei y la fitasa de E. coli

Fitasa

Media (act. res. %)

E. coli

96 Resulta de dos ejecuciones con resultados de actividad residual de un 95% y un 97%.

H. alvei

95.5 Resulta de dos ejecuciones con resultados de actividad residual de un 97% y un 94%.

Por tanto, la fitasa de E. coli y la fitasa H. alvei tienen propiedades de Resistencia Proteolítica Gástrica muy similares.

Ejemplo 11: Rendimiento en piensos para animales en un modelo in vitro para la fitasa de Hafnia alvei y la fitasa de Citrobacter braakii

[0259] El rendimiento en piensos para animales de la fitasa de Hafnia alvei fue comparado, en un modelo in vitro, con el rendimiento de una fitasa de Citrobacter braakii. El modelo in vitro simula condiciones gastro-intestinales en un animal monogástrico y se correlaciona bien con los resultados obtenidos en ensayos in vivo de animales. La actividad de fitasa en la muestra se determina de la manera descrita en el ejemplo 5 bajo "Determinación de actividad de fitasa". La comparación se realizó de la siguiente manera:

[0260] Muestras de pienso compuestas por 30% harina de soja y 70% de harina de maíz con CaCl2 añadido hasta una concentración de 5 g de calcio por kg de pienso, son luego preincubadas y preparadas a 40°C y pH 3.0 durante 30 minutos seguidos de adición de pepsina (pienso de 3000 U/g) y dosificaciones adecuadas de las fitasas (se usan dosificaciones idénticas para todas las fitasas que se deben probar para permitir comparación), por ejemplo en pienso de entre 0.1 y 1.0 unidades de fitasa FYT/g. Un espacio sin actividad de fitasa fue también incluido como referencia. Las muestras se incubaron luego a 40°C y pH 3.0 durante 60 minutos seguidos de pH 4.0 durante 30 minutos.

[0261] Se pararon las reacciones y se extrajeron inositol-fosfatos y ácido fítico mediante adición de HCl a una concentración final de 0.5 M e incubación a 40°C durante 2 horas, seguido de un ciclo de congelación-descongelación e incubación de 1 hora a 40°C.

[0262] El ácido fítico y los inositol-fosfatos fueron separados mediante cromatografía iónica de alto rendimiento tal y como describen Chen et al. en Journal of Chromatography A (2003) vol. 1018, págs. 41-52 y cuantificados como describen Skoglund et al. en J. Agric. Food Chem. (1997), vol. 45, págs. 431-436.

[0263] La figura 1 muestra una dosis-respuesta de la fitasa de Hafnia alvei en comparación con una fitasa Citrobacter braakii para dosis de 125 FYT/kg de pienso, 250 FYT/kg de pienso y 500 FYT/kg de pienso. Los efectos de fitasas in vitro se muestran como el fósforo enlazado a inositol-fosfato (IP-P) residual que queda en una muestra después de incubación in vitro y se comparan con el IP-P residual que queda en una muestra de control sin fitasa. Todos los números que se dan son promedios y desviaciones típicas de 4 ó 5 réplicas (incubaciones in vitro). La administración de 250 FYT/kg de la fitasa de Hafnia redujo la cantidad de IP-P residual en la muestra in vitro hasta más o menos el mismo grado que las 125 FYT/kg de la fitasa de Citrobacter.

[0264] Por consiguiente, la fitasa de Hafnia fue capaz de obtener una reducción óptima en la cantidad de fósforo enlazado a inositol-fosfato residual.

Ejemplo 12: Rendimiento en piensos para animales en un modelo in vitro para la fitasa de Hafnia alvei y la fitasa Peniofora licii

[0265] El rendimiento en piensos para animales de la fitasa de Hafnia alvei en un modelo in vitro fue también comparado con el rendimiento de una fitasa Peniofora licii a dosis de 250 FYT/kg y 500 FYT/kg de pienso. Los resultados fueron obtenidos siguiendo el protocolo experimental tal como se describe en el ejemplo 11. Como se muestra en Figura 2, la fitasa de Hafnia alvei redujo la cantidad de IP-P residual en la muestra in vitro en mayor grado que la fitasa Peniofora licii.

Listado de secuencias

[0266]

<110> Novozymes A/S

<120> Fitasa de Hafnia

<130> 11202.204-WO

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador 2123fw

5

<220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> N designa A, C, G o T.

10

<220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> N designa A, C, G o T.

15

<220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> N designa A, C, G o T.

20

<220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> N designa A, C, G o T.

25 30

<400> 1 catggtgtgc gngcnccnac naa <210> 2 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> cebador 2065rev 23

35

<220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> N designa A, C, G o T.

40

<220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> N designa A, C, G o T.

45

<220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> R designa A o G.

50

<220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> R designa A o G.

55

<220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> N designa A, C, G o T.

60

<220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> Y designa T o C.

65

<400> 2 cccaccaggn ggngtrttrt cnggytg 27

5

<210> 3 <211> 20 <212> ADN <213> secuencia Artificial <220> <223> cebador 2328 TSP1dw

10

<400> 3 acttgcatcg acgttggctg 20

15

<210> 4 <211> 24 <212> ADN <213> secuencia Artificial

<220> <223> cebador 2329 TSP2dw

20

<400> 4 actgagcagc aatggaactc tctg 24

25

<210> 5 <211> 23 <212> ADN <213> secuencia Artificial

30

<220> <223> cebador 2330 TSP3dw <400> 5 actgggttcc aatatcacga gtc 23

35

<210> 6 <211> 24 <212> ADN <213> secuencia Artificial

40

<220> <223> cebador 2331 TSP1up

<400> 6 atggtggatc gctaaatcac actg

24

45

<210> 7 <211> 21 <212> ADN <213> secuencia Artificial

50

<220> <223> cebador 2332 TSP2up

55 60

<400> 7 acgtctgccc aaacatacac g 21 <210> 8 <211> 19 <212> ADN <213> secuencia Artificial <220> <223> cebador 2333 TSP3up

65

<400> 8 accgcccatc aggctaatc 19

<210> 9

<211> 1338

<212> ADN

<213> Hafnia alvei 5

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1338)

10 <220>

<221> sig_peptide

<222> (1)..(99)

<220> 15 <221> mat_peptide

<222> (100)..(1338)

<400> 9

<210> 10 5 <211> 446

<212> PRT

<213> Hafnia alvei

<400> 10 10

<210> 11

<211> 81

<212> ADN

<213> Bacillus licheniformis

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(81)

<223> Péptido señal Savinasa

<211> 27

<212> PRT

<213> Bacillus licheniformis

<400> 12

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un polipéptido aislado que tiene actividad de fitasa, seleccionado del grupo que consiste en:

   5 un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85% identidad con los aminoácidos 1 a 413 de la SEQ ID NO: 10 sobre la longitud de aminoácidos 1 a 413 de la SEQ ID NO:10, donde la termoestabilidad relativa al polipéptido de aminoácidos 1 a 413 de la SEQ ID NO:10 es, o bien inafectada, o bien mejorada.
2. 2. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido según la reivindicación 1.

3. 3.

   Un constructo de ácidos nucleicos que comprende el polinucleótido según la reivindicación 2 operativamente 15 enlazado a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped de expresión.

4. 4. Un vector de expresión recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 3.

5. 5.

   Una célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 3. 20

6. 6. Una planta transgénica, parte de planta o célula vegetal, que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 3.
7. 7. Un aditivo de pienso que comprende 25 (a) al menos un polipéptido según la reivindicación 1; y

   (b) al menos una vitamina liposoluble, al menos una vitamina hidrosoluble, al menos un oligoelemento o combinaciones de los mismos.
8. 8. Aditivo de pienso según la reivindicación 7, que además comprende al menos una amilasa, al menos una fitasa

   30 adicional, al menos una xilanasa, al menos una galactanasa, al menos una alfa-galactosidasa, al menos una proteasa, al menos una fosfolipasa y/o al menos una beta-glucanasa.
9. 9. Una composición de pienso para animales con un contenido bruto de proteína de 50 a 800 g/kg y que comprende al

   menos un polipéptido según la reivindicación 1. 35
10. 10. Un método para la producción del polipéptido según la reivindicación 1, comprendiendo el método (a) cultivar una célula, que en su forma de tipo salvaje es capaz de producir el polipéptido o una célula huésped recombinante según la reivindicación 5, bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.

    40 11. Un método para la producción de un producto de fermentación, que comprende (a) fermentar un carbohidrato que contiene material en presencia de una fitasa según la reivindicación 1 usando un microorganismo fermentativo y (b) producir el producto de fermentación o el coproducto de fermentación del material fermentado que contiene carbohidratos, por el que el producto de fermentación es preferiblemente etanol, cerveza, vino o granos secos de destilería (GSD).
11. 12. Uso de al menos un polipéptido según la reivindicación 1 en pienso para animales o en la preparación de una composición para uso en piensos para animales.