ES2323407T3 - Nuevo antigeno tumoral util en el diagnostico y terapia del cancer de vejiga, ovario, pulmon y riñon. - Google Patents
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Abstract
Un método para detectar el cáncer de vejiga en un individuo que comprende: evaluar el nivel de expresión de un producto génico 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra biológica; evaluar el nivel de expresión de un producto génico 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra normal correspondiente; comparar el nivel de expresión del producto génico en la muestra biológica respecto del de la muestra normal correspondiente, en donde el producto génico es una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:2 o un ARNm que codifica la secuencia de aminoácidos, y en donde un incremento en los niveles de expresión del producto génico en la muestra biológica en comparación con la correspondiente muestra normal es indicativo de cáncer de vejiga.
Description
Nuevo antígeno tumoral útil en el diagnóstico y
terapia del cáncer de vejiga, ovario, pulmón y riñón.
El cáncer de próstata es el cáncer diagnosticado
más frecuentemente y la segunda principal causa de muerte por
cáncer en hombres. Unos 45.000 hombres mueren anualmente a causa de
esta enfermedad. Solamente el cáncer de pulmón tiene una mayor
mortalidad. La probabilidad de que un hombre desarrolle cáncer de
próstata invasivo durante su vida es 1 en 6. A la edad de 50, un
hombre posee una probabilidad mayor del 40% de desarrollar cáncer
de próstata y una probabilidad de casi el 3% de morir a causa de
esta enfermedad. A pesar de que se han logrado algunos avances en
el tratamiento de tumores confinados localmente, el cáncer de
próstata es incurable una vez que el mismo produjo metástasis. Los
pacientes con cáncer de próstata metastásico son tratados mediante
terapia de ablación hormonal, pero solamente con éxito a corto
plazo. A la larga, estos pacientes desarrollan un estado
refractario a los andrógenos que conduce a un avance de la
enfermedad y a la muerte.
Un problema persistente y fundamental en el
control del cáncer de próstata es la ausencia de marcadores
diagnósticos y pronósticos confiables capaces de detectar
exactamente los tumores localizados en la etapa temprana y/o
predecir la sensibilidad y avance de la enfermedad. La detección y
diagnóstico precoces del cáncer de próstata actualmente se basa en
el examen digital rectal (DRE), mediciones del antígeno específico
de próstata (PSA), la ultrasonografía transrectal (TRUS) y la
biopsia transrectal por aguja (TRNB). Las mediciones del PSA sérico
en combinación con DRE representan el principal abordaje de
diagnóstico en la actualidad. Sin embargo, este abordaje tiene
importantes limitaciones que han estimulado la investigación
intensiva para descubrir mejores marcadores de diagnóstico de esta
enfermedad. Se han identificado una serie de marcadores y al menos
uno, el PSA, tiene uso clínico generalizado. Sin embargo, los
marcadores ideales del tumor de próstata han sido extremadamente
fugaces y aún ningún marcador ha probado ser confiable para predecir
el avance de la enfermedad. De este modo, existe la necesidad de
métodos diagnósticos y pronósticos más confiables e informativos en
el manejo del cáncer de próstata.
Además, también existe gran interés en
identificar las proteínas específicas de la próstata que pudieran
ser apropiadas como blancos terapéuticos, ya que no existe
tratamiento eficaz para los pacientes que desarrollan la enfermedad
recurrente o a quienes se les ha diagnosticado enfermedad
metastásica. Aunque la terapia de ablación de hormonas puede
aliviar a estos pacientes, la mayoría inevitablemente avanza hasta
desarrollar una enfermedad andrógeno-independiente
incurable (Lalani et al., 1997, Cancer Metastasis Rev. 16:
29-66).
El PSA es actualmente el marcador tumoral más
ampliamente utilizado para detectar, diagnosticar, y monitorear el
cáncer de próstata. En particular, varios inmunoensayos para la
detección del PSA sérico tienen uso clínico generalizado.
Recientemente, se ha desarrollado un ensayo de reacción en cadena de
la polimerasa de transcriptasa inversa (RT-PCR)
para ARNm de PSA en suero. Sin embargo, el PSA no es un marcador
específico de la enfermedad, ya que niveles elevados de PSA son
detectables en un gran porcentaje de pacientes con BPH y prostatitis
(25-86%)(Gao et al., 1997, Prostate 31:
264-281), así como en otros trastornos no malignos y
en algunos hombres normales, un factor que limita
significativamente la especificidad diagnóstica de este marcador.
Por ejemplo, se observan elevaciones en el PSA sérico de entre 4 a
10 ng/ml en BPH, y aún se observan valores más altos en prostatitis,
particularmente prostatitis aguda. BPH es una enfermedad
extremadamente común en hombres. El hecho de que las elevaciones
del PSA sérico pueden observarse sin ninguna indicación de la
enfermedad a partir del DRE, y viceversa, confunde más la
situación. Es más, ahora se reconoce que el PSA no es específico de
la próstata y que posee una variedad de actividades biológicas
complejas (Véase, p. ej., Fortier et al., J. Natl. Cancer
Inst. 1999, 91(19):1635-40).
Se han descrito varios métodos diseñados para
mejorar la especificidad de detección en función del PSA, tal como
medir la densidad del PSA y la relación PSA libre vs. complejado.
Sin embargo, ninguna de estas metodologías ha sido capaz de
distinguir reproduciblemente la enfermedad prostática maligna de la
benigna. Además, los diagnósticos de PSA poseen sensibilidades de
entre 57-79% (Cupp & Osterling, 1993, Mayo Clin
Proc 68:297-306), y de este modo no identifican el
cáncer de próstata en una significativa población de hombres con la
enfermedad.
El antígeno de membrana específico de la
próstata (PSMA) es un marcador de superficie celular de cáncer de
próstata recientemente descrito que ha sido el objeto de varios
estudios que evalúan su uso como marcador terapéutico y
diagnóstico. La expresión del PSMA se limita mayormente a tejidos
prostáticos, pero se han observado niveles detectables de ARNm de
PSMA ARNmen carcinoma de cerebro, glándula salival, intestino
delgado y células renales (Israeli et al., 1993, Cancer Res
53: 227-230). La proteína PSMA se expresa mayormente
en la mayoría de los cánceres de próstata primarios y
metastásicos, pero también se expresa en la mayoría de los
especímenes neoplásicos intraepiteliales (Gao et al.,
supra). Los resultados preliminares que usan un anticuerpo
monoclonal anti-PSMA marcado con
Indio-111 para detectar por imágenes el cáncer de
próstata recurrente muestran alguna promesa (Sodee et al.,
1996, Clin Nuc Med 21: 759-766). El PSMA es un
antígeno dependiente de hormonas que requiere la presencia de un
receptor funcional de andrógenos. Debido a que no todas las células
de cáncer de próstata expresan el receptor de andrógenos, la
utilidad clínica del PSMA como blanco terapéutico puede estar
intrínsecamente limitada. También se están llevando a cabo ensayos
clínicos diseñados para examinar la efectividad de la
Inmunoterapia
con PSMA.
con PSMA.
\newpage
El Antígeno de Células Madre Prostáticas (PSCA)
es otro marcador de superficie celular de cáncer de próstata
recientemente descrito (Reiter et al., 1998, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 95: 1735-1740). Se ha demostrado que
la expresión del PSCA es predominantemente específica de la próstata
y que se sobreexpresa ampliamente a lo largo de todas las etapas
del cáncer de próstata, incluyendo la neoplasia intraepitelial
prostática de alto grado (PIN), tumores de próstata dependientes de
andrógenos e independientes de andrógenos. El gen del PSCA se ha
mapeado en el cromosoma 8q24.2, una región de ganancia alélica en
más del 80% de los cánceres de próstata. El PSCA parece ser
prometedor como blanco diagnóstico y terapéutico en vista de su
localización de la superficie celular, especificidad prostática y
expresión sumamente regulada por aumento en las células del cáncer
de próstata.
El avance en la identificación de marcadores
específicos ha sido lento debido a la falta de sistemas de modelos
de animales experimentales que recapitulan la enfermedad clínica.
Las soluciones tentativas de este problema han incluido la
generación de líneas celulares de cáncer de próstata (Horoszewicz
et al., 1983, Cancer Res. 43, 1809) y xenoinjertos de cáncer
de próstata (Pretlow et al., 1991, Cáncer Res. 51, 3814; van
Weerden et al., 1996, Am. J. Pathol. 149, 1055; Klein et
al., 1997, Nature Med. 3, 402). Sin embargo, estos abordajes
han tenido éxito limitado. Por ejemplo, los xenoinjertos en general
han producido bajas tasas de supervivencia a largo plazo. Además,
se ha demostrado que ninguna de las líneas celulares de cáncer de
próstata humano más ampliamente usadas - PC-3,
DU-145, y LNCaP - ha dado lugar en forma
reproducible a lesiones osteoblásticas típicas del cáncer de
próstata. Otra limitación de las líneas celulares
DU-145 y PC-3 es que estas células
no expresan el antígeno específico de la próstata (PSA) o el
receptor de andrógenos (AR) (Kaighn et al., 1979, Invest.
Ural. 17: 16-23; Gleave et al., 1992, Cancer
Res. 52: 1598-1605), cuestionando su relevancia
respecto del cáncer de próstata clínico. La línea celular LNCaP es
sensible a los andrógenos y expresa el PSA, pero contiene una
mutación en el receptor de andrógenos que altera la especificidad
del ligando.
Recientemente, sin embargo, se ha descrito una
serie de xenoinjertos de cáncer de próstata (obtenidos a partir de
tumores de pacientes) que demuestran características genéticas y
fenotípicas que son estrechamente análogas a la situación clínica
humana (Klein et al., 1997, Nature Med. 3:402). Estos
xenoinjertos de LAPC (Los Angeles Prostate Cancer) has sobrevivido
el pasaje a ratones con síndrome de inmunodeficiencia severa
combinada (SCID) por un período mayor que un año. Los sistemas
modelo de xenoinjertos LAPC-4 tienen la capacidad de
imitar la transición de la dependencia de andrógenos a la
independencia de andrógenos y el desarrollo de lesiones metatásicas
(Klein et al., 1997, supra). Los tumores
LAPC-4 experimentan una regresión en ratones macho
después de la castración, pero recrecen dentro de los
2-3 meses como tumores independientes de andrógenos.
Ambos tumores de xenoinjertos de LAPC-4
dependientes de andrógenos (AD) e independientes de andrógenos (AI)
expresan iguales niveles de los marcadores específicos de la
próstata PSA, PSMA y PSCA (antígeno de células madre prostáticas),
lo que se identificó utilizando análi-
sis de diferencias representativas de los ADNc obtenidos a partir de las variantes AD y Al del xenoinjerto LAPC-4.
sis de diferencias representativas de los ADNc obtenidos a partir de las variantes AD y Al del xenoinjerto LAPC-4.
La patente WO 00/23111 describe métodos para
detectar, diagnosticar, monitorear, clasificar en estadios,
pronosticar, detectar por imágenes y tratar el cáncer de próstata.
La patente de EEUU 6.043.033 describe una proteasa asociada a la
próstata humana (HUPAP) y polinucleótidos que identifican y
codifican la HUPAP. Se descubrió que la HUPAP se expresa en el
tejido de la próstata de pacientes con cáncer, indicando una
utilidad de esta proteína en la detección y tratamiento del cáncer
de próstata. La patente WO 00/18961 describe el descubrimiento de
una serie de genes que son inducibles por andrógenos en células de
cáncer de próstata dependientes de andrógenos y constitutivamente
expresados en células de cáncer de próstata independientes de
andrógenos y por ello son útiles en el diagnóstico y tratamiento del
cáncer de próstata.
La presente invención se refiere a métodos y
composiciones para el diagnóstico y terapia del cáncer de vejiga,
obtenidos a partir de o basados en una
serina-proteasa normalmente específica de la
próstata, regulada por andrógenos, denominada 20P1F12/TMPRSS2
descrita en la presente memoria. Se describe un ADNc de longitud
completa que comprende la secuencia codificadora entera del gen
20P1F12/TMPRSS2 (también denominado en la presente memoria
20P1F12-GTC1) (Figura 1). Este ADNc codifica una
proteína que está sumamente relacionada con, pero estructuralmente
se distingue de, el TMPRSS2 recientemente publicado
(Paoloni-Giacobino et al., 1997, Genomics
44: 309-320). El gen 20P1F12/TMPRSS2 también muestra
un patrón de expresión muy diferente respecto del perfil de
expresión del TMPRSS2.
La invención proporciona un método para detectar
cáncer de vejiga en un individuo, que comprende:
evaluar el nivel de expresión de un producto
génico 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra biológica;
evaluar el nivel de expresión de un producto
génico 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra normal correspondiente; y
comparar el nivel de expresión del producto
génico en la muestra biológica respecto del de la correspondiente
muestra normal, en donde el producto génico es una proteína que
comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO.:2 o un ARNm que
codifica la secuencia de aminoácidos, y en donde un incremento en
los niveles de expresión del producto génico en la muestra biológica
en comparación con la correspondiente muestra normal es indicativo
de cáncer de vejiga.
La invención además proporciona:
- una composición inmunogén para utilizar en la
inhibición del crecimiento de un cáncer de vejiga, comprendiendo la
composición inmunogén la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO.: 2
o una porción inmunogén de la misma, o un vector que comprende una
secuencia nucleotídica que codifica la SEC ID NO.: 2;
y un vehículo fisiológicamente aceptable, en
donde la composición inmunogén es capaz de provocar una respuesta
inmune de un mamífero;
- un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno
del mismo que específicamente se une a la proteína que comprende la
secuencia de aminoácidos de SEC ID NO.: 2 acoplado a un agente
citotóxico para su uso en el tratamiento del cáncer de vejiga.
- un método para inhibir el crecimiento de una
célula neoplásica de vejiga in vitro que comprende poner en
contacto la célula neoplásica de vejiga con un anticuerpo o
fragmento de unión al antígeno del mismo que específicamente se une
a la proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID
NO.: 2 acoplado a un agente citotóxico.
Más específicamente, la invención se refiere a
polinucleótidos correspondientes a o complementarios de todo o
parte del gen 20P1F12/TMPRSS2, ARNm, y/o secuencia codificadora,
preferiblemente en forma aislada, incluyendo los polinucleótidos
que codifican las proteínas 20P1F12/TMPRSS2 y fragmentos de los
mismos, ADN, ARN, híbrido de ADN/ARN y moléculas relacionadas,
polinucleótidos u oligonucleótidos complementarios de los genes
20P1F12/TMPRSS2 o secuencias del ARNm o partes del mismo, y
polinucleótidos u oligonucleótidos que hibridizan a los genes
20P1F12/TMPRSS2, a ARNm, o a polinucleótidos que codifican
20P1F12/TMPRSS2. La invención también se refiere a medios para
aislar los ADNc y los genes que codifican 20P1F12/TMPRSS2. También
se describen moléculas de ADN recombinante que contienen
polinucleótidos de 20P1F12/TMPRSS2, células transformadas o
transducidas con tales moléculas, y sistemas
hospedante-vector para la expresión de los productos
génicos 20P1F12/TMPRSS2. La invención además se refiere a proteínas
20P1F12/TMPRSS2 y a fragmentos polipeptídicos de las mismas.
Se describen métodos para detectar la presencia
de polinucleótidos y proteínas 20P1F12/TMPRSS2 en diversas muestras
biológicas, así como métodos para identificar células que expresan
20P1F12/TMPRSS2. También se describen métodos diagnósticos por
imágenes para el manejo de cánceres de próstata, colon, vejiga,
pulmón, de ovario y riñón, y cáncer metatásico.
La invención además proporciona diversas
composiciones terapéuticas y estrategias para tratar el cáncer de
vejiga, incluyendo particularmente el polipéptido 20P1F12/TMPRSS2 y
métodos de terapia con anticuerpos
anti-20P1F12/
TMPRSS2 y composiciones, vacunas para el cáncer y terapia con moléculas pequeñas.
TMPRSS2 y composiciones, vacunas para el cáncer y terapia con moléculas pequeñas.
La invención proporciona anticuerpos que se unen
a las proteínas 20P1F12/TMPRSS2 y a fragmentos polipeptídicos de
las mismas, incluyendo anticuerpos policlonales y monoclonales,
anticuerpos murinos y de otros mamíferos, anticuerpos quiméricos,
anticuerpos humanizados y completamente humanos, acoplados a un
agente citotóxico. En la presente memoria también se describen
varios anticuerpos monoclonales específicamente reactivos con
20P1F12/TMPRSS2.
La presentación de esta patente contiene al
menos una figura realizada en color. Las copias de esta patente con
figura(s) en color serán proporcionadas por la Oficina de
Patentes y Marcas a pedido y con el pago de la tasa necesaria.
Figura 1. Nucleótido (SEC ID NO.: 1) y
secuencias deducidas de aminoácidos (SEC ID NO.: 2) del ADNc clon
20P1F12-GTC1 (Ejemplo 3) (según lo presentado ante
ATCC; Acceso Núm. 207097.)
Figura 2. Nucleótido (SEC ID NO.: 3) y
secuencias deducidas de aminoácidos (SEC ID NO.: 4) de la secuencia
del gen TMPRSS2 según lo publicado en
Paoloni-Giacobino et al., 1997, Genomics 44:
309-320.
Figura 3A-B. La Figura 3A
muestra una alineamiento de secuencias de aminoácidos que compara el
ADNc 20P1P12-GTC1 (Ejemplo 3) con la secuencia
anteriormente publicada de TMPRSS2
(Paoloni-Giacobino et al., 1997, Genomics 44:
309-320). Las diferencias de aminoácidos se muestran
en tipo negrita. La Figura 3B muestra una representación esquemática
de la estructura de dominio de 20P1F12/TMPRSS2.
Figura 4. Secuencia nucleotídica del clon
20P1F12 de SSH inicialmente aislado (SEC ID NO.: 5).
Figura 5A-D. Análisis
RT-PCR de la expresión del gen 20P1F12/TMPRSS2 en
xenoinjertos de cáncer de próstata, próstata normal y otros tejidos
y líneas celulares, que muestra niveles de expresión aproximadamente
iguales en próstata normal y tres xenoinjertos de cáncer de próstata
(Figura 5A); y que muestran en gran parte expresión específica de la
próstata en tejidos humanos normales, con niveles de expresión
significativamente más bajos detectables en colon, páncreas, riñón y
pulmón (Fig. 5B y C). También se demuestra que 20P1F12/TMPRSS2 se
expresa en tejidos de cáncer de vejiga (Figura 5D).
Figura 6. Análisis de transferencia Northern de
la expresión del gen 20P1F12/TMPRSS2 en tejidos humanos normales y
xenoinjertos de cáncer de próstata utilizando sonda de ADNc marcada
del clon 20P1F12. La expresión en 16 tejidos normales se limitó en
su mayor parte a la próstata, mostrando el riñón, páncreas y pulmón
niveles de expresión 10 a 20 veces más bajos.
Figura 7A y 7B. Expresión de 20P1F12/TMPRSS2 en
líneas celulares de cáncer de próstata y colon (Figura 7A). Se
prepararon filtros de xenoinjertos y líneas celulares con 10 \mug
de ARN total por calle. Se analizaron las transferenciasas
utilizando una sonda de fragmento de gen derivada de
20P1F12/TMPRSS2. Todas las Muestras de ARN se normalizaron mediante
tinción con bromuro de etidio. Kilobases= kb. Excepto por
LAPC-9 AI, la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 en los
xenoinjertos fue comparable a los niveles observados en las muestras
de próstata normal. Además, se observó expresión de menor nivel en
la línea A431 de carcinoma epidermoide. 20P1F12/TMPRSS2 también se
expresa en los tejidos de cáncer de vejiga, pulmón y ovario, así
como en un conjunto de cánceres metatásicos (colon a pulmón, colon a
hígado, ovario a trompas de Falopio) (Figura 7B). Sin embargo, el
patrón de expresión se invierte para riñón normal/cáncer de riñón:
20P1F12 se expresa en riñón normal, pero se expresa a niveles mucho
menores en cáncer de riñón (Figura 7B) (el conjunto de cáncer de
riñón se obtuvo a partir de dos cánceres de riñón de grado 2 y un
cáncer de riñón de grado 3).
Figura 8. Caracterización de anticuerpos
monoclonales dirigidos contra 20P1F12/TMPRSS2. Se generaron
anticuerpos monoclonales hacia 20P1F12/TMPRSS2 utilizando una
proteína de fusión purificada
GST-20P1F12/
TMPRSS2 según se describe en el Ejemplo 5. Se examinaron los anticuerpos monoclonales mediante transferencia western contra lisados obtenidos a partir de células 293T transfectadas con un vector PADNc 3.1 que codifica myc His-20P1F12/TMPRSS2. (A) Se utilizaron seis mAbs: 1F9 (IgG1, K), 2D10 (IgG1, K), 2F8, (IgG1, K) 6B11 (IgG1, K), 8C6 (IgG1, K) y 9G8 (IgG2a, K) que específicamente reconocen 20P1F12/TMPRSS2 para sondear las transferencias western de lisados celulares obtenidos a partir de células 293T transfectadas con 20P1F12/TMPRSS2 (calle 1) o neo (como control, calle 2). (B) Lisados celulares provenientes de células 293T transfectadas con 20P1F12/TMPRSS2 (calle 1) o neo (como control, calle 2), LAPC-9 AD y LNCaP se sondearon con 1F9 anti-TMPRSS2 mAb. Los estándares de peso molecular se indican en un lateral en kilodaltons (KD).
TMPRSS2 según se describe en el Ejemplo 5. Se examinaron los anticuerpos monoclonales mediante transferencia western contra lisados obtenidos a partir de células 293T transfectadas con un vector PADNc 3.1 que codifica myc His-20P1F12/TMPRSS2. (A) Se utilizaron seis mAbs: 1F9 (IgG1, K), 2D10 (IgG1, K), 2F8, (IgG1, K) 6B11 (IgG1, K), 8C6 (IgG1, K) y 9G8 (IgG2a, K) que específicamente reconocen 20P1F12/TMPRSS2 para sondear las transferencias western de lisados celulares obtenidos a partir de células 293T transfectadas con 20P1F12/TMPRSS2 (calle 1) o neo (como control, calle 2). (B) Lisados celulares provenientes de células 293T transfectadas con 20P1F12/TMPRSS2 (calle 1) o neo (como control, calle 2), LAPC-9 AD y LNCaP se sondearon con 1F9 anti-TMPRSS2 mAb. Los estándares de peso molecular se indican en un lateral en kilodaltons (KD).
Figura 9. Biotinilación de 20P1F12/TMPRSS2. (A)
Se transfectaron 20P1F12/TMPRSS2 marcada con His o neo (como
control) a células 293T. Se incubaron células intactas con biotina
para biotinilar las proteínas celulares. Los lisados celulares se
analizaron mediante transferencia western directamente (calles 1 y
2, o se incubaron con estreptoavidina para purificar por afinidad
todas las proteínas celulares marcadas). Se analizaron las proteínas
celulares purificadas con estreptoavidina mediante transferencia
western utilizando anticuerpos anti-His (calles 3 y
4). Sólo se detectó proteína biotinilada en las células
transfectadas con 20P1F12/TMPRSS2. (B) Se incubaron
PC-3 biotinilada (calle 2) y LNCaP (calle 4) y
PC-3 no marcada (calle 1) y LNCaP (calle 3) con gel
de estreptoavidina y después se analizaron mediante transferencia
western utilizando 1F9 mAb. Sólo se detectó 20P1F12/TMPRSS2 en las
muestras biotiniladas. Los estándares de peso molecular se indican
en un lateral en kilodaltons (KD).
Figura 10. Desglicosilación de 20P1F12/TMPRSS2
en células 293T transfectadas. 20P1F12/TMPRSS2 marcada con His
transfectada a células 293T se purificó utilizando
Níquel-agarosa. Después se desglicosiló la proteína
20P1F12/TMPRSS2 utilizando N-glicosidasa F. Se
analizaron 20P1F12/TMPRSS2 no tratada (calle 1) y la proteína
desglicosilada (calle 2) mediante transferencia western utilizando
anticuerpos anti-His. Se detecta un cambio en el
peso molecular con la desglicosilación. Los estándares de peso
molecular se indican en el lateral en kilodaltons (KD).
Figura 11. Regulación por andrógenos de la
proteasa de la superficie celular 20P1F12/TMPRSS2. Células LNCaP
fueron privadas de andrógenos haciendo crecer células en suero fetal
bovino al 2% tratado con carbón vegetal durante 1 semana (calle 1),
o 24 horas (calle 3). Se determinó la regulación por andrógenos
estimulando células privadas de nutrientes durante 24 horas con
mibolerona 10 nM (análogo de andrógenos) durante 9 horas (calle 4).
Se comparó la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 con los niveles de
20P1F12/TMPRSS2 en células LNCaP que crecieron en un medio completo
(calle 2) mediante transferencia northern de 10 \mug de ARN/calle
sondeado con una sonda de 20P1F12/TMPRSS2. Se determinó la carga
igual de ARN mediante tinción con bromuro de etidio y posterior
sondeo con una sonda de \beta-actina. Se
determinaron los niveles de PSA como control para la regulación por
andrógenos. Los estándares de peso molecular se indican en el
lateral en kilobases (kb).
Figura 12. Regulación por andrógenos de
20P1F12/TMPRSS2 en LNCaP. Células LNCaP fueron privadas de
andrógenos haciendo crecer células en suero fetal bovino 2% tratado
con carbón vegetal durante 1 semana. Se determinó la regulación por
andrógenos estimulando células con mibolerona (Mib) para varios
puntos de tiempo. Se determinó la expresión de 20P1F12/TMPRSS2
mediante transferencia western de los lisados celulares utilizando
mAb anti-1F9. Como controles adicionales se
utilizaron lisados celulares de células PC-3
infectadas con neo (como control) o 20P1F12/TMPRSS2. Se determinó la
carga igual de proteínas mediante el sondeo de la transferencia
western con anticuerpos anti-Grb-2
(Transduction Laboratories). La expresión proteica de
20P1F12/TMPRSS2 se comparó con los niveles de ARN mediante
transferencia northern de 10 \mug ARN/calle sondeado con una sonda
de 20P1F12/TMPRSS2. Se determinó la carga igual de ARN sondeando la
transferencia northern con una sonda de
\beta-actina.
Figura 13. Efecto de la expresión de
20P1F12/TMPRSS2 en células NIH 3T3. Se infectaron células NIH 3T3
con retrovirus que codifica neo (como control) o 20P1F12/TMPRSS2. Se
analizaron las células cuarenta y ocho horas después de la infección
mediante microscopía luminosa. Las células que parecieron acumular
un gran número de vacuolas se indican con flechas.
Figura 14. Altos niveles de expresión de
20P1F12/TMPRSS2 en células de próstata, cáncer de próstata y cáncer
de colon. Se sondearon transferencias northern que contenían ARN
obtenido a partir de tejidos normales, xenoinjertos de cáncer de
próstata y líneas celulares, y líneas celulares de cáncer de colon
utilizando un fragmento de ADNc de 20P1F12/TMPRSS2. Las muestras
son: 1. próstata, 2. LAPC-4 AD, 3.
LAPC-4 Ax, 4. LAPC-9 AD, 5.
LAPC-9 Al, 6. LNCaP, 7. PC-3, 8.
DU145, 9. CaCo-2, 10. LoVo, 11. T84, 12.
Colo-205. Todas las muestras de ARN se normalizaron
con una sonda de \beta-actina. Los estándares de
tamaño en kilobases (kb) se indican en el lateral.
Figura 15. La proteína 20P1F12/TMPRSS2 se
expresa como una forma de longitud completa y escindida por acción
proteolítica en tejidos y líneas celulares. Se prepararon lisados
celulares y tisulares (20 \mug de proteína) en tampón de muestra y
se sondearon en transferencias western utilizando el MAb 1F9
anti-20P1F12/TMPRSS2. Se obtuvieron tejidos
tumorales de próstata (T) con tejidos adyacentes
correspondientes(N) a partir de pacientes con puntaje de
Gleason de 7, 9 y 7, respectivamente. Se utilizaron como controles
negativo y positivo, respectivamente, Lisados de células 293T
transfectadas con vector de control o con vector que expresa
20P1F12/TMPRSS2.
Figura 16. La proteasa de20P1F12/TMPRSS2 es
regulada por andrógenos y secretada al medio de células de cáncer de
próstata. (A) Se hicieron crecer células LNCaP en un medio que
contenía suero fetal bovino al 10% (NT) o en suero tratado con
carbón vegetal al 2% (CSS) durante 1 semana. Las células que
crecieron en CSS se dejaron posteriormente sin tratamiento (-) o se
estimularon (+) con mibolerona (10 nM) durante 9 o 24 horas. Las
células PC-3 y Células PC-3 que
expresaban el receptor de andrógenos (AR) se estimularon con
mibolerona durante 9 horas. Se sondearon los lisados con MAb 1F9.
(B) Células LNCaP fueron privadas de andrógenos (-) y después se
trataron con mibolerona 1 nM o 10 nM durante 36 horas. Se
recolectaron los extractos celulares y el medio de las células para
transferencia western con anti-1F9. Se analizó el
medio después de la inmunoprecipitación (i.p.) con MAb 1F9 o tal
cual (20 \mul). Los estándares de peso molecular se indican en el
lateral en kilodaltons (KD).
Figura 17. Análisis inmunohistoquímico de
muestras de pacientes con cáncer de próstata y colon con MAb
anti-20P1F12/TMPRSS2. Las muestras incluyen: (a)
células LNCaP desarrolladas en un medio que contenía CSS al 2%
durante 1 semana, (b) células LNCaP desarrolladas en un medio que
contenía CSS al 2% durante 1 semana y estimuladas con mibolerona (10
nM) durante 9 horas, (c) tejido de próstata normal, (d) carcinoma de
próstata grado 3, (e) tejido normal de próstata teñido con 1F9
(aumento x 1000), (f) tejido normal de próstata teñido con
anticuerpos anti-PSA (aumento x 1000), (g) colon
normal, (h) cáncer de colon. La tinción de proteínas secretadas
dentro del lumen glandular de la próstata se indica mediante las
flechas. Todas las fotos tienen un aumento de 400x, excepto donde se
indica de manera diferente. Las observaciones comparativas de, por
ejemplo, la localización de tinción de 20P1F12/TMPRSS2 en colon
normal y cáncer de colon, muestran distintas diferencias en la
acumulación de 20P1F12/TMPRSS2, un descubrimiento que proporciona
evidencia confirmatoria del uso de 20P1F12/TMPRSS2 como blanco
diagnóstico y terapéutico.
Figura 18. El análisis mutagénico de
20P1F12/TMPRSS2 revela la actividad auto-catalítica
y el sitio de ruptura proteolítica. Se transfectaron células 293T
con las diferentes mutantes puntuales de 20P1P12/TMPRSS2 según se
describe en el Ejemplo 10. Se sondearon los lisados celulares (20
\mug de proteína) con MAb 1F9. Los estándares de peso molecular
se indican en el lateral en kilodaltons (KD).
Figura 19. Expresión aumentada de
20P1F12/TMPRSS2 y del producto de ruptura
auto-proteolítica de 32 kD en células LAPC4 con
estimulación de andrógenos. Células LAPC4 confluentes al 70% en
placas de 10 cm fueron privadas de andrógenos mediante incubación en
medio RPMI que contenía 2% de FBS tratado con carbón
vegetal-dextrano (CD-FBS) durante 4
días. El medio después se aspiró y se reemplazó con RPMI
CD-FBS 2% fresco en presencia o ausencia del análogo
de andrógenos milberona de concentración 5 nM. En el momento
indicado, las células se cosecharon y se lisaron en tampón RIPA que
contenía inhibidores de proteasas. A modo de comparación, en el
análisis se incluyeron lisados de LNCaP y células LAPC4
desarrolladas en RPMI + FBS al 5% y de un lisado de tejido completo
de un xenoinjerto de ratón LAPC4 SCID. Se separaron 25 \mug/calle
del lisado celular indicado mediante SDS-PAGE en
gradiente al 10-20%, se transfirieron a
nitrocelulosa y se sometieron a análisis Western utilizando el mAb
1F9 anti-TMPRSS2 de la siguiente manera. Primero se
bloqueó la transferencia durante 2 horas en TRIS 25 mM pH 7,5 y NaCl
150 mM (TBS) que contenía 3% de leche descremada. Después se incubó
la transferencia durante toda la noche a 4ºC con 2 \mug/ml de mAb
1F9 en TBS de elevada salinidad (NaCl 500 mM + 0,15% de
Tween-20 (hTBS-T) que contenía 1% de
Leche. Se lavó la transferencia con hTBS-T y después
se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente con una dilución
1:4.000 del anticuerpo secundario conjugado IgGI-HRP
anti-ratón de cabra (Southern Biotechnology) I
hTBS-T + 1% de leche. Tras el lavado, se
visualizaron bandas inmunorreactivas anti-TMPRSS2
mediante quimioluminiscencia aumentada y exposición a película
autorradiográfica. Las flechas indican la proteína de longitud
completa 20P1F12/TMPRSS2 de 70 kD y el producto de ruptura
auto-proteolítica de 32 kD.
Figura 20. 20P1F12/TMPRSS2 se expresa en
xenoinjertos de cáncer de próstata, en líneas celulares de cáncer de
próstata, en fluido seminal normal y en tejidos clínicos. Se realizó
el análisis de la expresión de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 mediante
transferencia western utilizando el mAb 1F9
anti-TMPRSS2 según se indica en la Figura 19. Las
muestras de 293T provenían de células transfectadas transitoriamente
con un vector vacío o con un plásmido de expresión retroviral que
codifica 20P1F12/TMPRSS2 de tipo salvaje o con una mutante puntual
de 20P1F12/TMPRSS2 deficiente en proteasa. Los lisados de proteínas
de la línea celular LAPC4 (LAPC4CL), células LNCaP, xenoinjertos
LAPC4 y LAPC9 9, y tejidos clínicos combinados se obtuvieron
mediante la solubilización de pellets celulares, xenoinjertos y
tejidos en tampón de muestra 2X SDS-PAGE y
calentamiento. La normalización de la carga de lisados se verificó
mediante tinción con Ponceau S de membranas de nitrocelulosa después
de la transferencia. El fluido seminal de un donante masculino
normal se centrifugó durante 5 minutos a 14.000 G para paletizar las
células y el material coagulado y el sobrenadante se diluyeron 4
veces en tampón RIPA. Se mezclaron 2 \mul de este fluido en tampón
de muestra de SDS-PAGE y se corrieron en la calle
indicada. Las flechas indican la proteína 20P1F12/TMPRSS2 de
longitud completa de 70 kD, el producto de ruptura de 32 kD, y una
banda inmunorreactiva nueva anti-TMPRSS2 de 90 kD en
plasma seminal normal.
Figura 21. Inducción por andrógenos y liberación
del fragmento auto-proteolítico de 32 kD en los
sobrenadantes de células LAPC4 y LNCaP y la aparición de un complejo
nuevo de proteínas inmunorreactivas anti-TMPRSS2 de
103 kD. Células LAPC4 y LNCaP (placas de 10 cm confluentes al 70%)
fueron privadas de andrógenos por incubación en medio RPMI que
contenía CD-FBS al 2% durante 5 días. El medio se
aspiró y se reemplazó con 4 ml de medio fresco RPMI +
CD-FBS al 2% con o sin mibolerona 1 o 10 nM y se
incubó durante otras 48 horas. Los lisados celulares enteros
("WCL", 25 \mug/calle) o sobrenadantes de cultivo de tejido
acondicionado (25 \mul, esterilizado con filtro de 0,22 \muM)
después se sometieron a SDS-PAGE y análisis Western
anti-TMPRSS2 con mAb 1F9 según se describe en la
Figura 19. Las flechas indican el fragmento
auto-proteolítico de 32 kD y el complejo
inmunorreactivo anti-TMPRSS2 de 103 kD en medio
acondicionado. Las concentraciones de PSA de los sobrenadantes,
determinadas por un ELISA (Anogen) comercial, se indican a modo de
comparación con una conocida proteína secretada inducida por
andrógenos.
Figura 22. Liberación del fragmento proteolítico
de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 en el sobrenadante de los cultivos de
células LNCaP y en el suero de ratones SCID portadores de
xenoinjertos de LNCaP. Los lisados celulares enteros del tampón RIPA
y los sobrenadantes de cultivo de tejido acondicionado de células
LNCaP tratadas según se describe en la Figura 21 o desarrolladas en
RPMI + FBS al 5% o suero de ratones SCID portadores de xenoinjertos
de LNCaP se inmunoprecipitaron con mAb anti-TMPRSS2
acoplado covalentemente a cuentas de proteína G de la siguiente
manera. 1 ml de lisados celulares enteros de RIPA (600 \mug de
proteína total), 2,5 ml de acondicionado diluido con un volumen
igual de tampón RIPA, y 340 \mul (15 mg de proteína total) de
suero SCID diluido hasta 1 ml con tampón RIPA primero se
preclarificaron durante 3 horas a 4ºC mediante incubación con 50
\mul de una suspensión de cuentas de proteína G al 50% en tampón
RIPA. Se acopló covalentemente mAb 1F9 anti-TMPRSS2
a cuentas de proteína G utilizando el reactivo de entrecruzamiento
homobifuncional pimelimidato de dimetilo (DMP) según se describe en
"Using Antibodies, a Laboratory Manual", Harlow y Lane, 1999,
pág. 323. Después se añadieron 50 \mul de una suspensión al 50% de
IF9/cuentas de proteína G (\sim50 \mug de mAb) a cada muestra y
se incubaron durante toda la noche a 4ºC. Los inmunoprecipitados se
lavaron 4 veces en tampón RIPA y los complejos inmunes se disociaron
mediante la adición de 35 \mul de tampón de muestra 3X
SDS-PAGE y calentamiento. Después se sometieron 25
\mul de cada muestra a SDS-PAGE y transferencia
Western con mAb 1F9 según se describe en la Figura 19. Se
sometieron los lisados de tampón RIPA de células 293T (293T wcl) y
CD-FBS RPMI al 2% (medio) al protocolo IP/Western
como controles negativos. Las flechas indican la proteína
20P1F12/TMPRSS2 de longitud completa de 70 kD, el fragmento de
ruptura de 32 kD, y el complejo inmunorreactivo novedoso
anti-TMPRSS2 de 103 kD en sobrenadantes estimulados
por andrógenos y suero SCID.
Figura 23. Expresión del fragmento de ruptura de
20P1F12/TMPRSS2 de 32 kD y un complejo inmunorreactivo novedoso de
20P1F12/TMPRSS2 de 103 kD en pacientes con cáncer de próstata y
colon y muestras de suero de ratones SCID portadores del tumor
LNCaP. 100 \mul de suero de ratón SCID portador del tumor LNCaP o
sin tratamiento previo (A) o 1 ml de las muestras séricas clínicas
humanas indicadas (B) se inmunoprecipitaron con anticuerpos
monoclonales 1F9 anti-TMPRSS2 covalentemente
acoplados/cuentas de agarosa de proteína G de la siguiente manera.
Sueros de ratón SCID y sueros humanos se ajustaron a 1 ml y 2 ml,
respectivamente, con tampón RIPA (TRIS 25 mM, pH7,5, NaCl 150 mM,
Triton-X-100 al 1%, desoxicolato de
sodio al 0,5%, SDS al 0,1%, EDTA 0,5 mM) y se preclarificaron con
cuentas de agarosa de proteína G durante 3 horas a 4ºC. Se acopló
mAb lF9 anti-TMPRSS2 covalentemente a cuentas de
proteína G utilizando el reactivo de entrecruzamiento
homobifuncional pimelimidato de dimetilo (DMP) según se descrito en
"Using Antibodies, a Laboratory Manual", Harlow y Lane, 1999,
pág. 323. Después se añadieron 50 \mul de una suspensión al 50% de
1F9/cuentas de proteína G (\sim50 \mug de mAb) a cada muestra y
se incubaron durante toda la noche a 4ºC. Los inmunoprecipitados se
lavaron 4 veces en tampón RIPA y los complejos inmunes se disociaron
mediante la adición de 40 \mul del tampón de muestra 3X
SDS-PAGE y calentamiento. Se separaron 25
\mul/calle del inmunoprecipitado indicado o del medio de cultivo
de tejido acondicionado de LNCaP o (C) se separaron mediante
SDS-PAGE los volúmenes indicados del lisado tisular
entero de la próstata de una víctima de accidente masculina normal
de 28 años, se transfirieron a nitrocelulosa y se sometieron a
análisis Western anti-TMPRSS2 con mAb IF9 según se
describe en la Figura 19. Las flechas indican el fragmento de
ruptura de 20P1F12/TMPRSS2 de 32 kD y la banda inmunorreactiva
novedosa anti-TMPRSS2 de 103 kD. Se presenta una
exposición más oscura de la porción inferior del panel A para
visualizar mejor el fragmento de 32 kD en suero de ratón portador de
tumor LNCaP.
Figura 24. Expresión del fragmento de clivaje de
20P1F12/TMPRSS2 de 32 kD y un complejo inmunorreactivo novedoso de
20P1F12/TMPRSS2 de 90 kD en plasma seminal normal. Panel A. Se
sometieron lisados tisulares de xenoinjertos de LAPC4 y LAPC9 de
ratón SCID y cultivos de líneas celulares de LNCaP y LAPC4 o plasma
seminal normal a análisis Western con mAb 1F9
anti-TMPRSS2. Panel B. Se sometieron plasma seminal
normal o lisados celulares y sobrenadantes acondicionados de células
LNCaP incubadas durante 4 días en FBS al 2% tratado con carbón
vegetal/dextrano y después incubados en presencia (+) o ausencia
(-) de mibolerona 10 nM durante 8 horas, se sometieron a
inmunoprecipitación y análisis Western con mAb 1F9. Las flechas
indican el fragmento de clivaje de 32 kD, la proteína
20P1F12/TMPRSS2 de longitud completa de 70 kD, y los complejos
inmunorreactivos novedosos de 20P1F12/TMPRSS2 de 103 kD y 90 kD
presentes en sobrenadante de LNCaP acondicionado y plasma seminal,
respectivamente.
Figura 25. Detección de expresión de la proteína
20P1F12/TMPRSS2 en xenoinjerto de cáncer de próstata de LAPC9, línea
celular de cáncer de próstata LNCaP y fluido seminal normal mediante
7 anticuerpos monoclonales anti-TMPRSS2. Se
separaron lisados tisulares del xenoinjerto de ratón SCID de LAPC9,
de células LNCaP estimuladas con mibolerona (10 nM durante 48 horas)
y de plasma seminal humano normal mediante SDS-PAGE
en gel con gradiente al 10-20%, se transfirieron a
nitrocelulosa y se sometieron a análisis Western con sobrenadantes
de cultivo de tejido libre de suero condicionado de 7 hibridomas de
anticuerpos monoclonales anti-TMPRSS2 de la
siguiente manera. Primero se bloquearon las transferencias durante 2
horas a temperatura ambiente con TBS (Tris 25 mM, pH 7,5, NaCl 150
mM) + 3% de leche descremada. Después se incubaron las
transferencias durante toda la noche a 4ºC con una dilución 1 a 6 de
sobrenadantes de hibridomas acondicionados libres de suero en TBS
de elevada salinidad (hTBS; Tris 25 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM) que
contenía Tween 20 al 0,15% (hTBS-T) y 1% de leche
descremada. Se lavaron las transferencias 3X con
hTBS-T y después se incubaron con una dilución
1:4.000 de conjugado IgG-HRP
anti-ratón de cabra en hTBS-T + 1%
de leche durante 1 hora a TA. Después se lavaron las transferencias
3X con hTBS-T. Después se visualizaron las bandas
inmunorreactivas anti-TMPRSS2 mediante
quimioluminiscencia aumentada y exposición a película
auto-radiográfica. Las flechas indican la proteína
20P1F12/TMPRSS2 de longitud completa de 70 kD, el fragmento
auto-catalítico de 32 kD y la banda de plasma
seminal de 90 kD.
Figura 26. Elevada expresión del fragmento de
ruptura de 20P1F12/TMPRSS2 de 32 kD en líneas celulares de cáncer de
colon y muestras de tejido de cáncer de colon en comparación con
tejido de colon normal. Los lisados de especímenes clínicos que
representaban tejido combinado de cáncer de colon o tejido adyacente
normal (lado izquierdo de la transferencia) y de líneas celulares de
cáncer de colon (lado derecho de la transferencia) y de xenoinjertos
de cáncer de próstata de LAPC4 y LAPC9, se sometieron a análisis de
transferencia Western anti-TMPRSS2 utilizando mAb
1F9. Las flechas indican la posición del fragmento
auto-catalítico de 32 kD y de la proteína
20P1F12/TMPRSS2 de longitud completa de 70 kD. Se observa mayor
expresión del fragmento de 32 kD en el tejido de cáncer de colon que
en el tejido adyacente normal correspondiente. También, la especie
inmunorreactiva predominante presente en las líneas celulares de
cáncer de colon también es el fragmento de 32 kD. Resulta
interesante destacar que existe muy poca expresión de la proteína
20P1F12/TMPRSS2 de longitud completa en las muestras de colon pero
existe una fuerte expresión de una banda inmunorreactiva
anti-TMPRSS2 de \sim90 kD en los tejidos de colon
que puede representar un complejo del fragmento de 32 kD.
Figs. 27A-C. Se anlizaron
células PC3 progenitoras y células PC3 que expresan de manera
estable 20P1F12/
TMPRSS2 para determinar su potencial invasivo utilizando un sistema Transwell Insert System (Becton Dickinson). Las células se cargaron con un colorante fluorescente, en particular calceína, y se implantaron en el pocillo superior de la inserción Transwell. Se determinó la invasión midiendo la fluorescencia de células en la cámara inferior en relación con la fluorescencia de la población entera de células. El ensayo se realizó por triplicado.
TMPRSS2 para determinar su potencial invasivo utilizando un sistema Transwell Insert System (Becton Dickinson). Las células se cargaron con un colorante fluorescente, en particular calceína, y se implantaron en el pocillo superior de la inserción Transwell. Se determinó la invasión midiendo la fluorescencia de células en la cámara inferior en relación con la fluorescencia de la población entera de células. El ensayo se realizó por triplicado.
Figura 28. Actividad de proteasa de
20P1F12/TMPRSS2. Se analizó GST-20P1F12/TMPRSS2
recombinante purificada (aa255-492) para determinar
la actividad de proteasa utilizando caseína (FTC) marcada con
tiocarbamoílo fluorescente como sustrato (Molecular Probes). Se
incubaron diferentes dosis de GST-20P1F12/TMPRSS2 a
37ºC con FTC-caseína durante un período de 6 horas.
Se leyó la fluorescencia a intervalos de 10 minutos utilizando un
fluorómetro. Se detecta la ruptura de la caseína por parte de la
20P1F12/TMPRSS2 a través del aumento de la fluorescencia. El ensayo
se realizó por triplicado.
Figura 29. Efectos de la proteína de fusión
20P1F12/TMPRSS2 recombinante purificada sobre la invasión. Células
PC3 cargadas con calceína se implantaron en la cámara de invasión
solas en medio solo o en presencia de proteína de fusión
recombinante purificada que contenía el dominio de proteasa de
20P1F12/TMPRSS2, es decir GST-TMPRSS2 (aa
255-492). Se utilizó GST purificada como control. Se
determinó la invasión midiendo la fluorescencia de células en la
cámara inferior en relación con la fluorescencia de la población
entera de células. El ensayo se realizó por triplicado.
Figura 30. Se implantaron células PC3 cargadas
con calceína en la cámara de invasión en medio solo o en presencia
de 1 ng/ml de proteína de fusión 20P1F12/TMPRSS2 purificada
recombinante, es decir GST-TMPRSS2 (aa
255-492). Se añadieron control o mAb (1F9)
anti-TMPRSS2 a las muestras indicadas. Se determinó
la invasión midiendo la fluorescencia de células en la cámara
inferior en relación con la fluorescencia de la población entera de
células. El ensayo se realizó por triplicado.
Figura 31. Oligonucleótidos antisentido de
20P1F12/TMPRSS2. Se cargaron por raspado células LNCaP con
morfolino-oligonucleótidos de concentración 10 o 30
\muM marcados con FITC. Se hicieron crecer las células durante 24
horas y se evaluó la fluorescencia utilizando citometría de flujo.
Este histograma muestra que el 100% de las células expuestas a
morfolino-oligonucleótidos retienen estos
oligonucleótidos 24 horas después de la carga.
Figura 32. Los oligonucleótidos antisentido de
20P1F12/TMPRSS2 reducen los niveles de proteína
20P1F12/
TMPRSS2. Se cargaron por raspado células LNCaP con morfolino-oligonucleótidos de concentración 10 o 30 \muM. Se hicieron crecer las células durante 48 horas y se evaluó la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 mediante transferencia western utilizando el anticuerpo 1F9 anti-TMPRSS2. Los oligonucleótidos antisentido de 20P1F12/TMPRSS2 reducen específicamente la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 de longitud completa en células LNCaP (calles 3 y 4).
TMPRSS2. Se cargaron por raspado células LNCaP con morfolino-oligonucleótidos de concentración 10 o 30 \muM. Se hicieron crecer las células durante 48 horas y se evaluó la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 mediante transferencia western utilizando el anticuerpo 1F9 anti-TMPRSS2. Los oligonucleótidos antisentido de 20P1F12/TMPRSS2 reducen específicamente la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 de longitud completa en células LNCaP (calles 3 y 4).
Figura 33. Expresión de TMPRSS2 en Especímenes
de Cáncer en Pacientes. Se realizó un ensayo de la expresión de
TMPRSS2 en un panel de cánceres de riñón humano (T) y sus
respectivos tejidos normales correspondientes (N) (el tejido normal
se tomó de regiones normales adyacentes al tumor) en las
transferencias de puntos de ARN. En los tejidos de riñón, la
expresión de TMPRSS2 mayormente se detecta en tejidos normales en
comparación con tejidos tumorales. En un caso, TMPRSS2 aparece
regulada por aumento en el tejido tumoral en comparación con el
tejido normal.
Fig. 34. Reconocimiento del fragmento del
dominio de TMPRSS2 LDLRA/SRCR tras la ruptura del dominio de
proteasa. Se generó un anticuerpo policlonal de ratón (pAb) dirigido
a la región extracelular de TMPRSS2 que carece del dominio de
proteasa mediante inmunización con proteína Tag5 purificada por
afinidad con quelato metálico, que codifica los dominios LDLRA y
SRCR (aminoácidos 111-255). Se utilizó este suero en
análisis de transferencia Western de células LNCaP de cáncer de
próstata que fueron privadas de andrógeno durante 3 días (-A)
mediante la incubación en medio RPMI que contenía FBS tratado con
carbón vegetal/dextrano al 2%, o fueron privadas y se
re-estimularon con andrógeno durante 48 horas (+A)
mediante incubación con mibolerona 20 nM. Se prepararon lisados
celulares y se sometieron a transferencia Western con una dilución
1:500 de suero de ratón anti-LDLRA/SRCR o con 2
\mug/ml de MAb IF9 que reconoce el dominio de proteasa de TMPRSS2
(Figura 34B). Se indican con flechas TMPRSS2 de longitud completa de
70 kD y el dominio de proteasa de 32 kD reconocido mediante mAb 1F9
y el fragmento de longitud completa posterior a la ruptura de 40 kD
que contenía los dominios LDLRA/SRCR reconocidos mediante el pAb de
ratón. Estos dominios también se ilustran en forma esquemática en la
Figura 34A.
La Figura 35 ilustra la inhibición de la
formación de tubos por TMPRSS2 en células HUVEC en diversas
condiciones.
La Figura 36 ilustra la inhibición de la
proliferación de HUVEC mediante TMPRSS2.
Figura 37. La Expresión Constitutiva de TMPRSS2
en Células PC3 Produce un Aumento en la Formación de Tumores
Subcutáneos. Se manipularon genéticamente células PC3 para expresar
el ADNc de TMPRSS2 mediante infección utilizando transferencia
estándar de genes retrovirales. Ratones SCID machos fueron
inyectados con células tumorales o de control. Las mediciones de
tumores comenzaron el día 21 y se realizaron dos veces por semana
durante las siguientes 3 1/2 semanas.
Figura 38. Aumento en la Formación del Tumor
LAPC-9 por el MAb 1F9 Anti-TMPRSS2.
A., efecto del anticuerpo sobre el crecimiento tumoral. B., efecto
del anticuerpo sobre el PSA sérico.
Fig. 39. Reconocimiento del dominio TMPRSS2
LDLRA/SRCR en células LNCaP mediante anticuerpos policlonales de
ratón.
Fig. 40. Títulos relativos de anticuerpos
LDLRA/SRCR anti-TMPRSS2 en suero humano.
A menos que se defina lo contrario, todos los
términos de la técnica, notaciones y otra terminología científica
utilizada en la presente memoria tienen por objeto tener los
significados comúnmente comprendidos por aquellos expertos en la
técnica a quienes pertenece esta invención. En algunos casos, los
términos con significados comúnmente comprendidos se definen en la
presente memoria por razones de claridad y/o para una rápida
referencia, y no debe necesariamente interpretarse que la inclusión
de tales definiciones en la presente memoria representa una
diferencia sustancial sobre lo que en general se entiende en la
técnica. Las técnicas y procedimientos descritos o a los que se
hace referencia en la presente memoria en general son bien
comprendidos y comúnmente se emplean utilizando la metodología
convencional por parte de aquellos expertos en la técnica, tales
como, por ejemplo, las metodologías de clonación molecular muy
utilizadas descritas en Sambrook et al., 1989, Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, 2º edición, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Si corresponde, los
procedimientos que involucran el uso de kits y reactivos disponibles
en el comercio en general se llevan a cabo de conformidad con
protocolos y/o parámetros definidos por el fabricante a menos que se
indique lo contrario.
Según se utiliza en la presente memoria, el
término "polinucleótido" significa una forma polimérica de
nucleótidos de al menos 10 bases o pares de base de longitud, ya
sean ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de
cualquier tipo de nucleótido, y tiene como objeto incluir formas de
ADN mono- y bicatenarias.
Según se utiliza en la presente memoria, el
término "polipéptido" significa un polímero de al menos 6
aminoácidos. A lo largo de la especificación, se utilizan
designaciones estándar de tres letras o una única letra para los
aminoácidos. En este contexto un "polipéptido 20P1F12/TMPRSS2"
incluye, por ejemplo, una proteína que posee la proteína de
secuencia de 492 aminoácidos que se muestra en la Figura 1 así como
el dominio de proteasa de 32 kD que contiene el fragmento que se
muestra, por ejemplo, en la Figura 8.
Según se utiliza en la presente memoria, los
términos "hibridizar", "hibridizante", "hibridiza" y
similares, utilizados en el contexto de los polinucleótidos, tienen
por objeto referirse a las condiciones convencionales de
hibridización, preferiblemente tales como hibridización en formamida
al 50%/6XSSC/SDS al 0,1%/100 \mug/ml ssADN, en los que las
temperaturas para la hibridización están por encima de los 37 grados
C y las temperaturas para el lavado en 0,1X SSC/SDS al 0,1% están
por encima de los 55 grados C y, más preferiblemente, a las
condiciones rigurosas de hibridización.
La "rigurosidad" de las reacciones de
hibridización es fácilmente determinable por un experto en la
técnica, y en general es un cálculo empírico que depende de la
longitud de la sonda, la temperatura de lavado y la concentración
salina. En general, las sondas más largas requieren mayores
temperaturas para una alineación apropiada, mientras que las sondas
más pequeñas necesitan temperaturas más bajas. La hibridización en
general depende de la capacidad del ADN desnaturalizado para
realinearse cuando están presentes hebras complementarias en el
entorno por debajo de su temperatura de fusión. Cuanto mayor es el
grado de homología deseada entre la sonda y la secuencia
hibridizable, mayor es la temperatura relativa que puede utilizarse.
Como resultado, se obtiene que las temperaturas relativas mayores
tenderían a hacer que las condiciones de reacción sean más
rigurosas, mientras que las temperaturas más bajas reducen esta
tendencia. Para detalles adicionales y una explicación de la
rigurosidad de las reacciones de hibridización; véase Ausubel et
al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience
Publishers, (1995).
Las "condiciones rigurosas" o
"condiciones de elevada rigurosidad", según se define en la
presente memoria, pueden identificarse por aquellas que: (1)
emplean baja fuerza iónica y alta temperatura para el lavado, por
ejemplo cloruro de sodio 0,015 M/citrato de sodio 0,0015 M/dodecil
sulfato de sodio al 0,1% a 50ºC; (2) emplean durante la
hibridización un agente desnaturalizante, tal como formamida, por
ejemplo formamida al 50% (v/v) con albúmina sérica bovina al
0,1%/Ficoll al 0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/tampón fosfato de
sodio 50mM a pH 6,5 con cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio
75 mM a 42ºC; o (3) emplean formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl 0,75 M,
citrato de sodio 0,075 M), fosfato de sodio 50 mM (pH 6,8),
pirofosfato de sodio al 0,1%, 5 x solución de Denhardt, ADN de
esperma de salmón sonicado (50 \mug/ml), SDS al 0,1%, y sulfato de
dextrano al 10% a 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2 x SSC (cloruro de
sodio/citrato de sodio) y formamida al 50% a 55ºC, seguido por un
lavado de alta rigurosidad que consiste en 0,1 x SSC que contiene
EDTA a 55ºC.
Las "condiciones moderadamente rigurosas"
pueden identificarse según lo descrito por Sambrook et al.,
1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold
Spring Harbor Press, e incluyen el uso de solución de lavado y
condiciones de hibridización (p. ej., temperatura, fuerza iónica y %
de SDS) menos rigurosas que las descritas más arriba. Un ejemplo de
condiciones moderadamente rigurosas es la incubación durante toda
la noche a 37ºC en una solución que comprende: formamida al 20%, 5 x
SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato de sodio 50 mM
(pH 7,6), 5 x Solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10%, y 20
mg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado por
cizallamiento, seguido por lavado de los filtros en 1 x SSC a
aproximadamente 37-50ºC. El técnico experto
reconocerá cómo ajustar la temperatura, fuerza iónica, etc., según
sea necesario para acomodar factores tales como longitud de sondas y
similares.
En el contexto de las comparaciones de
secuencias de aminoácidos, el término "identidad" se utiliza
para expresar el porcentaje de restos de aminoácidos en las mismas
posiciones relativas que son iguales. También en este contexto, el
término "homología" se utiliza para expresar el porcentaje de
restos de aminoácidos en las mismas posiciones relativas que son o
bien idénticos o similares, utilizando los criterios de aminoácidos
conservados del análisis de BLAST, según lo que en general se
entiende en la técnica. Por ejemplo, los valores de % de identidad
pueden generarse mediante WU-BLAST-2
(Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology
266:460-480;
http://blast.wustl/edu/blast/README.html). Más abajo se proporcionan
más detalles con respecto a las sustituciones de aminoácidos, que se
consideran conservadoras conforme a dichos criterios.
A lo largo de las subsecciones que siguen se
proporcionan definiciones adicionales.
La presente invención se refiere a métodos y
composiciones para el diagnóstico y terapia de ciertos cánceres
utilizando polinucleótidos aislados correspondientes al gen
20P1F12/TMPRSS2, proteínas codificadas por el gen 20P1F12/TMPRSS2 y
fragmentos del mismo, y anticuerpos capaces de reconocer y unirse
específicamente a las proteínas 20P1F12/TMPRSS2. A lo largo de
esta Solicitud, los métodos y composiciones típicamente se describen
para el uso en el contexto de los cánceres de próstata y colon. Sin
embargo, como los datos presentados en la presente memoria muestran
que 20P1F12/TMPRSS2 se expresa en tumores que surgen de otros
linajes celulares (véase, p. ej., la Figura 5D que muestra la
expresión de 20F1F12/TMPRSS2 en cánceres de vejiga, y la Figura 7B
que muestra la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 en cáncer de riñón,
pulmón y ovario, así como ciertos cánceres metatásicos), el técnico
experto entenderá que las descripciones diagnósticas y terapéuticas
también son aplicables a cánceres de estos linajes. Los datos de la
Figura 7B y la Figura 33 indican que 20P1F12/TMPRSS2 se expresa en
cánceres de vejiga, pulmón y ovario y ciertos cánceres metatásicos,
pero no se expresa en los tejidos normales de este tipo, y de este
modo puede servir como marcador de cáncer. Los datos presentados en
la Figura 7B y la Figura 33 indican que 20P1F12/TMRPSS2 se expresa
en tejido de riñón normal, pero no se expresa en cáncer de riñón,
un patrón opuesto al observado en los otros tejidos. (En una de las
muestras ilustradas en la Figura 7B, 20P1F12/TMPRSS2 está regulada
por aumento en el tejido tumoral en comparación con el tejido
normal.)
La administración de TMPRSS2, por lo tanto,
puede ser terapéuticamente beneficiosa en el contexto del cáncer de
riñón. Como diagnóstico para el cáncer de riñón se utiliza el
análisis del gen que codifica TMPRSS2, por lo cual una mutación del
gen se correlaciona con la existencia de, o la probabilidad de estar
sometido a, cáncer de riñón. La administración del dominio
serina-proteasa de TMPRSS2 también puede ser
terapéuticamente beneficiosa en el tratamiento de ciertos cánceres,
tales como el cáncer de riñón, donde el dominio
serina-proteasa de TMPRSS2 inhibe el crecimiento o
formación del tumor.
El gen 20P1F12/TMPRSS2 codifica una proteína
prevista de 492 aminoácidos que contiene múltiples dominios,
incluyendo un dominio serina-proteasa, un dominio
receptor de barredores rico en cisteína, un dominio clase A
receptor de LDL, y un dominio transmembrana previsto según se ha
descrito para TMPRSS2 (Paoloni-Giacobino et
al., 1997, Genomics 44: 309-320).
Paoloni-Giacobino et al. descubrieron que el
gen TMPRSS2 se expresa fuertemente en intestino delgado y sólo
débilmente en varios otros tejidos y también han mapeado el gen
TMPRSS2 en el cromosoma 21. Se desconoce el papel fisiológico de
TMPRSS2. Los solicitantes han clonado un ADNc de longitud completa
que comprende la región codificadora entera del gen 20P1F12/TMPRSS2,
pero contiene varias diferencias de secuencias nucleotídicas en
relación con la secuencia publicada de TMPRSS2. Seis de estas
diferencias de secuencia dan como resultado diferencias de
aminoácidos. No se conocen actualmente la naturaleza y significación
específicas de estos cambios. Sin embargo, una cantidad de
diferencias de aminoácidos entre la proteína descrita por
Paoloni-Giacobino et al. y la proteína
20P1F12/TMPRSS2 descrita en la presente memoria son cambios no
conservadores que caen dentro del dominio de proteasa de la proteína
(véase, p. ej., la Figura 3). En consecuencia, una proteína que
posee la secuencia descrita en Paoloni-Giacobino
et al. puede tener una actividad funcional
significativamente diferente de la proteína descrita en la presente
memoria. Por otra parte, se sabe en la técnica que los genes poseen
una cierta proporción de variabilidad y que esta variabilidad puede
afectar a varios aspectos de la fisiología celular, incluyendo
aquellos asociados con la oncogénesis (véase, p. ej., Rebbeck et
al., J. Natl. Cancer Inst. 90(16):
1225-1229 (1998) y Tonin et al., Semin. Surg.
Oncol. 18(4): 281-286 (2000)). Además, el
nuevo 20P1F12/TMPRSS2 de los solicitantes posee un patrón de
expresión completamente diferente en comparación con lo que se ha
conocido para el TMPRSS2 informado previamente.
Debido a que 20P1F12/TMPRSS2 se expresa en las
células cancerosas descritas y contiene un dominio de proteasa, es
posible que funcione en el desarrollo, invasión y/o avance de estos
cánceres, particularmente en el desarrollo de la enfermedad
metastásica. Al respecto, se sabe que las proteasas están
involucradas en la invasión y metástasis de las células cancerosas
(Henriet et al., 1999, APMIS
107(1):111-9; Rochefort et al., 1999,
APMIS 107(1):86-95; Webber et al.,
1995, Clin Cancer Res 1(10):1089-94; Duffy,
1996, Clin Cancer Res 2(4):613-8; Webber y
Waghray, 1995 Clin Cancer Res 1(7):755-61).
Por ejemplo, se cree que el activador de plasminógenos tipo
uroquinasa (u-PA), la catepsina D y PSA modulan la
capacidad de las células del cáncer de próstata para formar
metástasis (véase, p. ej., Fortier et al., J. Nat. Cancer
Inst. 91(19): 1635-1640(1999)). La
participación potencial de la función de 20P1F12/TMPRSS2 en el
cáncer de próstata y colon, y particularmente en metástasis, puede
evaluarse según se describe en los Ejemplos de más abajo.
Es interesante destacar que la estructura
primaria de 20P1F12/TMPRSS2 y TMPRSS2 contiene dominios de
interacción proteína-proteína y un dominio de
proteasa y se encuentra que forma un complejo proteico (véase, p.
ej., la Figura 21). No está clara la función de 20P1F12/TMPRSS2 y
TMPRSS2. La función de 20P1F12/TMPRSS2 y TMPRSS2 puede involucrar
la unión con proteínas sustrato en el medio extracelular a través
de sus dominios SRCR y/o LDLA. Ejemplos de proteínas que exhiben
dominios SRCR incluyen: CD6, una molécula de adhesión que se une a
ALCAM (molécula de adhesión celular a leucocitos activados) y media
la unión celular timocito-epitelio tímico (Whitney
et al., 1995, J Biol Chem 270:18187); CD5
(Ly-1), una proteína de células T que se une a CD72
en las células B y puede estar involucrada en la comunicación de
células T-B (Luo et al., 1992, J Immunol.
148:1630); BSSP-3, una
serina-proteasa específica del cerebro con una
estructura similar a una rosquilla y tres motivos receptores
barredores ricos en cisteína (Yamamura et al., 1997, Biochem
Biophys Res Commun 239:386). Los dominios LDLR se han vinculado
con la unión y reciclado de complejos inhibidores de proteasa tales
como los complejos uPA-activador 1 del plasminógeno
(PAI-1) (véase, p. ej., Strickl et al., FASEB
J. 9: 890-898 (1995); Moestrup Biochim. Biophys.
Acta 1197: 337-360 (1994)).
El tejido de la próstata expresa una serie de
proteasas reguladas por andrógenos, incluyendo el PSA, la calicreína
glandular humana (hK2) y la prostasa/KLK-L1 (Wolf
et al., 1992, Mol Endocrinol 6:753-762;
Nelson et al., 1999 PNAS 96:3114-3119;
Yousef et al., 1999, Cancer Res
59:4252-4256). 20P1F12/TMPRSS2 es único entre estas
proteasas debido a sus características estructurales. Esta es una
proteasa transmembrana tipo II putativa con un dominio receptor
barredor rico en cisteína (SRCR) y un dominio receptor A (LDLA) de
lipoproteínas de baja densidad (Paoloni-Giacobino
et al., 1997). El dominio proteasa se localiza en el extremo
carboxilo terminal, que es secretado según se describe en la
presente memoria. Estas características proporcionaron evidencia de
que la proteína 20P1F12/TMPRSS2 puede expresarse en la membrana
celular y podría funcionar como receptor para otras proteínas o
moléculas pequeñas. El dominio proteasa de 20P1F12/TMPRSS2 es
sumamente homólogo respecto de la hepsina, también una proteasa
transmembrana tipo II (Leytus et al., 1988, Biochemistry
27:1067), que es regulada por aumento en el cáncer ovárico (Yan
et al., 1997, Cancer Res 57:2884). Los estudios de
fraccionamiento sub-celular localizaron la Hepsina
en la fracción membranosa de las células HepG2 cultivadas (Tsuji
et al., 1991, J. Biol. Chem.
266:16948-16953). Los estudios provistos en la
presente memoria muestran que en los cánceres de próstata y colon,
la mayor parte de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 se escinde
proteolíticamente y es secretada. Las regiones restantes,
incluyendo los dominios LDLA y SRCR, aún es posible que estén
asociadas a la membrana y podrían funcionar como receptores para
los componentes intracelulares independientes del dominio proteasa
que podría estar involucrado, por ejemplo, en la unión de barrido y
reciclado de complejos proteasa-inhibidor (véase, p.
ej., Takeuchi et al., PNAS: 96: 11054-11061
(1999)).
La inactivación mutacional de la proteasa
20P1F12/TMPRSS2 demuestra que la ruptura y liberación del dominio
de proteasa es una consecuencia de su propia actividad catalítica,
demostrando que 20P1F12/TMPRSS2 es su propio sustrato (véase, p.
ej., el Ejemplo 10). También se ha observado una similar ruptura
auto-catalítica para la pepsina
(Thien-Khai et al.,1997, J. Biol. Chem.
272(50):31315-31320). La
auto-escisión de 20P1F12/TMPRSS2 se produce en Arg
255 y resulta en la liberación del dominio de proteasa. Los estudios
de tinción de tejidos que utilizan Mab
anti-20P1P12/TMPRSS2 proporcionan evidencia de que
la proteína se concentra en estructuras vesiculares y es secretada
en el lumen glandular de tejido de próstata normal y canceroso. El
análisis del medio de cultivo celular y sueros de ratones
portadores de tumores confirmó que la proteasa de 20P1F12/TMPRSS2
es secretada por células de cáncer de próstata. Estos datos
proporcionan evidencia de que la proteasa de 20P1F12/TMPRSS2
liberada puede ser útil como marcador sérico potencial de
diagnóstico o pronóstico para el cáncer de próstata y posiblemente
cáncer de colon y que la ruptura del dominio de proteasa está
involucrada en el crecimiento e invasión tumorales. La
proliferación y metástasis de células cancerosas, así como la
destrucción de la arquitectura del tejido normal puede, como el
PSA, causar un incremento en los niveles séricos de 20P1F12/TMPRSS2
que significaría la presencia de células cancerígenas. Datos
adicionales indican que 20P1F12/TMPRSS2 también puede ser útil como
marcador sérico de diagnóstico o pronóstico para el cáncer de
vejiga, pulmón y ovario, y cánceres metatásicos.
Describimos anticuerpos que específicamente
reconocen 20P1F12/TMPRSS2 funcional expresada en tejidos
cancerosos, junto con métodos de detección en tejidos cancerosos.
La proteína 20P1F12/TMPRSS2 expresada en cánceres de próstata,
colon, vejiga, pulmón y ovario presenta ruptura autocatalítica. En
consecuencia la actividad de serina-proteasa y el
sitio de ruptura parecen mostrar actividad normal (véase la Figura
34); aquellas áreas de la proteína aparentemente no tienen
mutaciones que alteren la actividad normal. De este modo, en estos
cánceres la proteína TMPRSS2 parece no estar mutada, sino que tiene
su configuración nativa.
La proteasa de 20P1F12/TMPRSS2S secretada puede
estar involucrada en el procesamiento y posiblemente en la
activación de los factores de modulación del crecimiento presentes
en el espacio extracelular. Trabajos recientes con PSA y hK2 han
demostrado que pueden desempeñar un papel en la activación de los
factores de modulación de crecimiento importantes en la respuesta
osteoblástica del cáncer de próstata con metástasis en hueso
(Koeneman et al., 1999, Prostate
39:246-261). Uno de estos factores, la proteína
relacionada con la hormona paratiroidea (PTHrP), ha demostrado
incrementar el porcentaje de crecimiento de tumores en próstata
in vivo y proteger las células LNCaP de la apoptosis
(Dougherty et al., 1999, Cancer Res.
59:6015-6022). Queda por ver si 20P1F12/TMPRSS2 es
capaz de activar PTHrP y/u otros factores que pudieran influir en el
crecimiento del cáncer de próstata y/o cáncer de colon. El patrón
de expresión y la localización de 20P1F12/TNTPRSS2 la convierten en
un blanco previamente no apreciado para la terapia en cánceres de
próstata y colon.
La invención se basa, en parte, en el
aislamiento de un fragmento de ADNc correspondiente al gen
20P1F12/
TMPRSS2 mediante la clonación por Hibridación Sustractiva por Supresión y en los estudios detallados de caracterización molecular y bioquímica descritos en los Ejemplos. El fragmento de ADNc inicialmente aislado, el clon 20P1F12, mostró identidad en una parte superpuesta de la secuencia no traducida 3' del ADNc de longitud completa recientemente descrito que codifica TMPRSS2. Los cebadores diseñados para amplificar específicamente el gen correspondiente a 20P1F12 después se utilizaron para caracterizar la expresión 20P1F12/TMPRSS2 en xenoinjertos de cáncer de próstata, en próstata normal y en una variedad de tejidos normales y cancerosos adicionales. Los ADNc de longitud completa que comprenden el gen 20P1F12/TMPRSS2 completo se asilaron independientemente de bibliotecas separadas y en la presente memoria se proporciona la secuencia codificadora entera identificada a partir de estos clones (véase, p. ej., la Figura 1).
TMPRSS2 mediante la clonación por Hibridación Sustractiva por Supresión y en los estudios detallados de caracterización molecular y bioquímica descritos en los Ejemplos. El fragmento de ADNc inicialmente aislado, el clon 20P1F12, mostró identidad en una parte superpuesta de la secuencia no traducida 3' del ADNc de longitud completa recientemente descrito que codifica TMPRSS2. Los cebadores diseñados para amplificar específicamente el gen correspondiente a 20P1F12 después se utilizaron para caracterizar la expresión 20P1F12/TMPRSS2 en xenoinjertos de cáncer de próstata, en próstata normal y en una variedad de tejidos normales y cancerosos adicionales. Los ADNc de longitud completa que comprenden el gen 20P1F12/TMPRSS2 completo se asilaron independientemente de bibliotecas separadas y en la presente memoria se proporciona la secuencia codificadora entera identificada a partir de estos clones (véase, p. ej., la Figura 1).
El nucleótido y las secuencias deducidas de
aminoácidos del nuevo gen 20P1F12/TMPRSS2 (también denominado
20P1F12-GTC1 en la presente memoria) se muestran en
la Figura 1. Existen diferencias significativas en las secuencia
de aminoácidos codificadas por el gen
20P1F12-GTC1/TMPRSS2 en comparación con la secuencia
previamente informada de TMPRSS2 (véase la alineación de
aminoácidos de la Figura 3). Por ejemplo, cuatro de las diferencias
de aminoácidos están en el dominio de proteasa, tres de las cuales
son diferencias de aminoácidos no conservativas y que podrían
afectar la función y/o especificidad de la proteasa. La nueva
proteína 20P1F12/TMPRSS2 de los solicitantes ha sido caracterizada
extensivamente, según se describe además en los Ejemplos de la
presente memoria. La proteína 20P1F12/TMPRSS2 es una proteína
transmembrana tipo II glicosilada con un dominio de proteasa
C-terminal secretado.
El gen 20P1F12/TMPRSS2 es regulado por
andrógenos. Resulta interesante destacar que, en el cáncer de
próstata, la regulación de andrógenos y el desarrollo de un estado
refractario a los andrógenos es un aspecto significativo del avance
neoplásico y el crecimiento independiente de andrógenos está
asociado a la enfermedad metastásica. Además, se sabe que la
amplificación del gen receptor de andrógenos incrementa la
expresión de la proteína PSA tisular en carcinomas de próstata
refractarios a hormonas (véase, p. ej., Koivisto et al., J.
Patholo. 189(2): 219-223 (1999); Koivisto
et al., Am. J. Pathol. 152(1): 1-9
(1998)). La proteína 20P1F12/TMPRSS2 es detectable en la
superficie celular. También se observa la expresión de
20P1F12/TMPRSS2 en el cáncer de próstata, incluyendo expresión de
alto nivel en la enfermedad avanzada y metastásica. Además, 20P1F12
parece estar sobreexpresada en el cáncer de colon y también puede
estar expresado en otros cánceres (véase, p. ej., la Figura 5D).
Además de las diferencias en la estructura entre
el gen 20P1F12-GTC1/TMPRSS2 de los solicitantes
(Figura 1) y la secuencia previamente informada (Figura 2), los
resultados del análisis de expresión de los solicitantes son
contrarios a los informados por Paoloni-Giacobino
et al. Más aún, para los cánceres de próstata, colon,
vejiga, ovario y pulmón, así como los cánceres metatásicos, los
datos descritos en la presente memoria son contrarios a las
afirmaciones de Wong et al. (Patente Estadounidense Núm.
6.166.194, otorgada el 26 de Diciembre de 2000) en e sentido de que
la proteína TMPRSS2 sigue expresándose en tejidos malignos. Además,
sobre la base de su función continua como proteasa, TMPRSS2 parece
haber mantenido su configuración nativa. En particular, el análisis
de los solicitantes de la expresión del gen 20P1F12/TMPRSS2 mediante
RT-PCR en 16 tejidos normales muestra el nivel más
alto de expresión en próstata, con niveles sustancialmente menores
detectados en colon, páncreas, riñón, hígado y pulmón y expresión
no detectable en intestino delgado (Figura 5, Paneles B y C). Se
obtuvieron resultados similares en el análisis de transferencia
Northern, aunque el nivel de expresión detectado en próstata
mediante transferencia Northern es extremadamente alto en relación
con estos otros tejidos en los que solamente se detecta expresión
de muy bajo nivel (Figura 6). Más aún, según se muestra en la Tabla
1, el análisis inmunohistoquímico muestra expresión de la proteína
20P1F12/TMPRSS2 en próstata y páncreas. Además, el patrón de
expresión de 20P1F12/TMPRSS2 (tal como los datos presentados en la
Figura 6) ha sido corroborado por otros investigadores (véase, p.
ej., Lin et al., Cancer Res. 1999, 59(17):
4180-4184).
El análisis de expresión también muestra alto
nivel de expresión de 20P1F12/TMPRSS2 en todos los xenoinjertos de
cáncer de próstata probados, en aproximadamente los mismos niveles
observados en próstata normal (Figura 5, Panel A). El análisis de
transferencia Northern muestra resultados similares, con un nivel
de expresión algo más bajo detectado en el xenoinjerto
LAPC-9 en relación con los xenoinjertos
LAPC-4 y próstata normal; también se detecta
expresión en algunos de las líneas celulares de cáncer de próstata
analizadas (Figura 7). El gen 20P1F12/TMPRSS2 también se expresa en
una serie de líneas celulares de cáncer de próstata (Figura 7).
Estos resultados indican que el gen 20P1F12/TMPRSS2 es un gen
predominantemente específico de la próstata que puede estar
involucrado en el desarrollo y/o avance del cáncer de próstata. Más
aún, se detectó un alto nivel de expresión de 20P1F12/TMPRSS2
mediante transferencia Northern en una serie de líneas celulares de
carcinoma de colon (Figura 7). Además, se detectó un alto nivel de
expresión de 20P1F12/TMPRSS2 mediante análisis inmunohistoquímico
en una serie de muestras de cáncer de próstata y colon (véase, p.
ej., la Figura 17 y la Tabla 1). La Tabla 1 además muestra que
puede utilizarse un anti-20P1P12/TMPRSS2 para
identificar las diferencias en la localización por tinción
predominante de 20P1F12/TMPRSS2 en tejidos cancerosos y no
cancerosos. Estos datos de la Tabla 1 son consistentes con otros
datos presentados en la presente memoria que indican que
20P1F12/TMPRSS2 es una molécula secretada que posee un papel
fisiológico en la invasión y metástasis. En consecuencia, estos
datos proporcionan evidencia de que la expresión de 20P1F12/TMPRSS2
en cánceres de próstata, vejiga, ovario, pulmón y colon, y en
cánceres metatásicos, puede proporcionar una base molecular para
detectar, diagnosticar, pronosticar y/o tratar estos cánceres.
De este modo, describimos un gen (y una
proteína) 20P1F12/TMPRSS2 únicos y útiles, que poseen las secuencias
nucleotídica y codificada de aminoácidos que se muestran en la
Figura 1. Las sondas nucleotídicas correspondientes a todas o parte
de las secuencias de ADNc de 20P1F12/TMPRSS2 descritas en la
presente memoria pueden utilizarse para aislar o identificar otros
ADNc que codifican toda o parte de la secuencia del gen
20P1F12/TMPRSS2. Existen cebadores relacionados con la invención,
capaces de amplificar específicamente el gen 20P1F12/TMPRSS2 o sus
ARN transcriptos. También se describen polinucleótidos aislados que
contienen secuencias codificadoras del/de los producto(s)
del gen 20P1F12/TMPRSS2. Tales polinucleótidos pueden utilizarse
para expresar proteínas y péptidos codificados por 20P1F12/TMPRSS2
que poseen una cantidad de usos adicionales. También pueden
utilizarse sondas y cebadores del gen 20P1F12/TMRSS2 para detectar
la presencia o ausencia del ARNm de 20P1F12/TMPRSS2 en diversas
muestras biológicas, para detectar células cancerosas y otras
células que expresan 20P1F12/TMPRSS2, para generar vacunas para
tumores y en ensayos moleculares de diagnóstico y pronóstico para
cáncer de próstata, vejiga, ovario, pulmón y colon, y cánceres
metatásicos. Los polinucleótidos correspondientes a o
complementarios del gen 20P1F12/TMPRSS2 pueden ser útiles en
métodos para tratar el cáncer de próstata, vejiga, ovario, pulmón,
riñón y colon, y cánceres metatásicos, tales como, por ejemplo, en
la modulación de la actividad biológica de 20P1F12/TMPRSS2.
Más específicamente, un polinucleótido
20P1F12/TMPRSS2 útil en la práctica de la invención puede comprender
un polinucleótido que posee la secuencia nucleotídica de 20P1
F12/TMPRSS2 humano según se muestra en la Figura 1 (SEC ID NO.: 1)
o la secuencia nucleotídica del TMPRSS2 previamente informado según
se muestra en la Figura 2 (SEC ID NO.: 3), una secuencia
complementaria de cualquiera de los anteriores, o un fragmento de
polinucleótido de cualquiera de los anteriores. Otro ejemplo
comprende un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos
de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 según se muestra en la Figura 1 (SEC
ID NO.: 2), una secuencia complementaria de la misma, o un
fragmento de polinucleótido del mismo. Otro ejemplo comprende un
polinucleótido que es capaz de hibridizarse en condiciones
rigurosas de hibridización al ADNc 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en
la Figura 1 (SEC ID NO.: 1) o un fragmento de polinucleótido del
mismo.
Un típico ejemplo de un polinucleótido
20P1F12/TMPRSS2 es un polinucleótido 20P1F12/TMPRSS2 que posee la
secuencia que se muestra en la Figura 1. Un polinucleótido
20P1F12/TMPRSS2 puede comprender un polinucleótido que posee la
secuencia nucleotídica de 20P1F12/TMPRSS2 humano según se muestra en
la Figura 1, en donde T también puede ser U; un polinucleótido que
codifica todo o parte de la proteína 20P1F12/TMPRSS2; una secuencia
complementaria a la anterior; o un fragmento de polinucleótido de
cualquiera de los anteriores. Otro ejemplo comprende un
polinucleótido que posee la secuencia que se muestra en la Figura 1,
desde el residuo del nucleótido número 114 hasta el residuo del
nucleótido número 1589, en donde T también puede ser U. Otro ejemplo
comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido
20P1F12/TMPRSS2 cuya secuencia está codificada por el ADNc contenido
en el plásmido según depositado ante la American Type Culture
Collection con el Número de Designación ATCC otorgado 207097.
Los ejemplos típicos relacionados con la
invención descrita en la presente memoria incluyen polinucleótidos
de 20P1F12/TMPRSS2 que contienen porciones específicas de la
secuencia de ARNm de 20P1F12/TMPRSS2 (y aquellas que son
complementarias con dichas secuencias) tales como las que codifican
la proteína y fragmentos de la misma. Por ejemplo, los ejemplos
representativos descritos en la presente memoria incluyen:
polinucleótidos que codifican desde alrededor del aminoácido 1
hasta alrededor del aminoácido 10 de la proteína 20P1F12/TMPRSS2
que se muestra en la Figura 1, polinucleótidos que codifican desde
alrededor del aminoácido 20 hasta alrededor del aminoácido 30 de la
proteína 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1,
polinucleótidos que codifican desde alrededor del aminoácido 30
hasta alrededor del aminoácido 40 de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 que
se muestra en la Figura 1, polinucleótidos que codifican desde
alrededor del aminoácido 40 hasta alrededor del aminoácido 50 de la
proteína 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1,
polinucleótidos que codifican desde alrededor del aminoácido 50
hasta alrededor del aminoácido 60 de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 que
se muestra en la Figura 1, polinucleótidos que codifican desde
alrededor del aminoácido 60 hasta alrededor del aminoácido 70 de
la proteína 20P1F12/TMPRSS2 mostrada en la Figura 1, polinucleótidos
que codifican desde alrededor del aminoácido 70 hasta alrededor
del aminoácido 80 de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en
la Figura 1, polinucleótidos que codifican desde alrededor del
aminoácido 80 hasta alrededor del aminoácido 90 de la proteína
20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1 y polinucleótidos que
codifican desde alrededor del aminoácido 90 hasta alrededor del
aminoácido 100 de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la
Figura 1, etc. Siguiendo este esquema, los polinucleótidos que
codifican porciones de la secuencia de aminoácidos de los
aminoácidos 100-492 de la proteína 20P1F12/TMPRSS2
también son ejemplos típicos descritos en la presente memoria.
También se contemplan polinucleótidos que codifican porciones
mayores de la proteína 20P1F12/TMPRSS2. Por ejemplo,
polinucleótidos que codifican desde alrededor del aminoácido 1 (o
20 o 30 o 40, etc.) hasta alrededor del aminoácido 20 (o 30 o 40 o
50, etc.) de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura
1 pueden generarse mediante una variedad de técnicas bien conocidas
en la técnica.
Ejemplos ilustrativos adicionales de
polinucleótidos de 20P1F12/TMPRSS2 incluyen aquellos que consisten
en un polinucleótido que posee la secuencia que se muestra en la
Figura 1 desde alrededor del residuo del nucleótido número 1 hasta
alrededor del residuo del nucleótido número 500, desde alrededor del
residuo del nucleótido número 500 hasta alrededor del residuo del
nucleótido número 1000, desde alrededor del residuo del nucleótido
número 1000 hasta alrededor del residuo del nucleótido número 1500,
desde alrededor del residuo del nucleótido número 1500 hasta
alrededor del resto del nucleótido número 1740. Ejemplos
ilustrativos adicionales descritos en la presente memoria incluyen
los fragmentos del polinucleótido 20P1F12/TMPRSS2 que codifica uno o
más de los motivos biológicos contenidos dentro de la secuencia de
la proteína 20P1F12/TMPRSS2 y tratados más abajo.
Además de la detección del crecimiento celular
desregulado, los polinucleótidos de los párrafos anteriores poseen
una serie de usos específicos diferentes. Por ejemplo, debido a que
el gen 20P1F12/TMPRSS2 humano mapea el cromosoma 21q22, los
polinucleótidos que codifican diferentes regiones de la proteína
20P1F12/TMPRSS2 pueden utilizarse para caracterizar anormalidades
citogenéticas en el cromosoma 21, banda q22 que se ha identificado
por estar asociado a diversos cánceres. En particular, han sido
identificadas una variedad de anormalidades cromosómicas en 21q22,
incluyendo reordenamientos, como anormalidades citogenéticas
frecuentes en una serie de diferentes cánceres (véase, p. ej.,
Simpson et al., 1997, Oncogene, 14(18):
2149-2157; Desmaze et al., 1997, Cancer
Genet. Cytogenet. 97(1): 1249). En consecuencia, los
polinucleótidos que codifican regiones específicas de la proteína
20P1F12/TMPRSS2 proporcionan nuevas herramientas que pueden
utilizarse para delinear con una mayor precisión que la previamente
posible, la naturaleza específica de las anormalidades citogenéticas
en esta región del cromosoma 21 que pueden contribuir al fenotipo
maligno. En este contexto, estos polinucleótidos satisfacen una
necesidad en la técnica de expandir la sensibilidad del examen
cromosómico a fin de identificar anormalidades cromosómicas más
sutiles y menos comunes (véase, p. ej., Evans et al., 1994,
Am. J. Obstet. Gynecol.
171(4):1055-1057).
Por ello, los polinucleótidos útiles son ADN
genómico, ADNc, ribozimas, y moléculas antisentido, así como
moléculas de ácido nucleico basadas en un esqueleto alternativo o
incluyendo bases alternativas, ya sea obtenidas a partir de fuentes
naturales o sintetizadas. Por ejemplo, las moléculas antisentido
pueden ser ARN u otras moléculas, incluyendo ácidos nucleicos de
péptidos (PNAs) o moléculas distintas de ácidos nucleicos tales
como derivados de foforotioato, que específicamente se unen al ADN o
ARN de una manera dependiente de los pares de bases. Un técnico
experto puede obtener fácilmente estas clases de moléculas de ácido
nucleico utilizando los polinucleótidos y secuencias de
polinucleótidos de 20P1F12/TMPRSS2 descritas en la presente memoria.
Por ejemplo, la tecnología antisentido supone la administración de
oligonucleótidos exógenos que se unen a un polinucleótido blanco
localizado dentro de las células. El término "antisentido" se
refiere al hecho de que tales oligonucleótidos son complementarios
de sus blancos intracelulares, p. ej., 20P1F12/TMPRSS2. Véase, por
ejemplo, Jack Cohen, 1988, OLIGODEOXYNUCLEOTIDES, Antisense
Inhibitors of Gene Expression, CRC Press; and Synthesis
I:1-5 (1988). Los oligonucleótidos antisentido de
20P1F12/TMPRSS2 descritos en la presente memoria incluyen derivados
tales como S-oilgonucleótidos (derivados de
fosforotioato o S-oligos, véase, Jack Cohen,
supra), que exhiben acción inhibidora aumentada del
crecimiento celular del cáncer. Los S-oligos
(nucleósido fosforotioatos) son análogos isoelectrónicos de un
oligonucleótido (O-oligo) en los que un átomo de
oxígeno no formador de puente del grupo fosfato se reemplaza por un
átomo de azufre. Los S-oligos pueden prepararse por
tratamiento de los O-oligos correspondientes con
3H-1,2-benzoditiol-3-ona-1,1-dioxido,
que es un reactivo de transferencia de azufre. Véase Iyer, R. P.
et al, 1990, J. Org. Chem. 55:4693-4698; e
Iyer, R. P. et al., 1990, J. Am. Chem. Soc.
112:1253-1254. Según se describe en el Ejemplo 14 y
se muestra en las Figuras 30 y 31, los oligonucleótidos antisentido
adicionales de 20P1F12/TMPRSS2 pueden incluir
morfolino-oligonucleótidos antisentido conocidos en
la técnica (véase, p. ej., Partridge et al., 1996, Antisense
& Nucleic Acid Drug Development 6: 169-175).
Además existen cebadores y pares de cebadores
relacionados con la invención que permiten la amplificación
específica de los polinucleótidos descritos o de cualesquier partes
específicas del mismo, y sondas que selectivamente o
específicamente se hibridizan a las moléculas de ácido nucleico
descritas o cualquier parte de las mismas. Las sondas pueden
marcarse con un marcador detectable, tal como, por ejemplo, un
radioisótopo, un compuesto fluorescente, un compuesto
bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un agente quelante
metálico o enzima. Dichas sondas y cebadores pueden utilizarse para
detectar la presencia de un polinucleótido 20P1F12/TMPRSS2 en una
muestra y como un medio para detectar una célula que expresa una
proteína 20P1F12/TMPRSS2. Un ejemplo de dicha sonda es un
polinucleótido que comprende toda o parte de la secuencia de ADNc de
20P1F12/TMPRSS2 humano de que se muestra en la Figura 1 (SEC ID
NO.: 1). Ejemplos de pares de cebadores capaces de amplificar
específicamente los ARNm de 20P1F12/TMPRSS2 también se describen en
los Ejemplos que siguen. Tal como será comprendido por el técnico
experto, pueden prepararse muchos cebadores y sondas diferentes
basados en las secuencias provistas en la presente memoria y
utilizados eficazmente para amplificar, clonar y/o detectar un ARNm
de 20P1F12/TMPRSS2.
Los polinucleótidos de 20P1F12/TMPRSS2 son
útiles para una variedad de fines, incluyendo, sin limitación, su
uso como sondas y cebadores para la amplificación y/o detección del
gen 20P1F12/TMPRSS2, ARNm, o fragmentos del mismo; como reactivos
para el diagnóstico y/o pronóstico de cáncer de próstata, vejiga,
ovario, pulmón, riñón y colon, y cánceres metastásicos; como
secuencias codificadoras capaces de dirigir la expresión de los
polipéptidos de 20P1F12/TMPRSS2; como herramientas para modular o
inhibir la expresión del gen 20P1F12/TMPRSS2 y/o la traducción del
transcripto de 20P1F121/TMPRSS2; y como agentes terapéuticos.
Existen proteínas y polipéptidos de
20P1F12/TMPRSS2 relacionados con la invención que pueden utilizarse,
por ejemplo, para generar anticuerpos contra varias porciones de
20P1F12/TMPRSS2 tales como fragmentos asociados a membrana y
secretados. Pueden utilizarse pruebas de selección de anticuerpos y
otras pruebas de selección para estos fragmentos asociados a
membrana o secretados para el diagnóstico y clasificación por
estadios de cánceres, o para evaluar la eficacia del tratamiento.
Existen proteínas y polipéptidos de 20P1F12/TMPRSS2 relacionados
con la invención que pueden utilizarse, por ejemplo, como vacunas
para el cáncer. Aquellos expertos en la técnica comprenden que los
anticuerpos que reconocen proteínas se unen a los epitopos de tamaño
variable, y una agrupación del orden de alrededor de seis
aminoácidos, contiguos o no, se considera un número típico de
aminoácidos en un epitopo mínimo. Véase, p. ej. Hebbes et
al., Mol Inmunol septiembre de 1989;
26(9):865-73; Schwartz et al., J
Immunol octubre de 1985,135(4):2598-648.
Efectuando un barrido a lo largo de la secuencia del polipéptido
que se muestra en la Figura 1, los polipéptidos ilustrativos que
pueden utilizarse para generar anticuerpos contra cualquier porción
de las proteínas 20P1F12/TMPRSS2 incluyendo, por ejemplo: un
polipéptido que contiene al menos alrededor de 6 aminoácidos de la
secuencia de 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1.
Los polipéptidos que pueden utilizarse (p. ej.
como inmunógenos o como moduladores de invasión) típicamente
consisten en un polipéptido que contiene al menos alrededor de 6
aminoácidos de la secuencia de 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la
Figura 1, incluyendo la valina en la posición 165; un polipéptido
que contiene al menos alrededor de 6 aminoácidos de la secuencia de
20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1 incluyendo la
isoleucina en la posición 242; un polipéptido que contiene al menos
alrededor de 6 aminoácidos de la secuencia de 20P1F12/TMPRSS2 que
se muestra en la Figura 1 incluyendo el ácido glutámico en la
posición 329; un polipéptido que contiene al menos alrededor de 6
aminoácidos de la secuencia de 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la
Figura 1 incluyendo la lisina en la posición 449; un polipéptido
que contiene al menos alrededor de 6 aminoácidos de la secuencia de
20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1 incluyendo la arginina
en la posición 489; y/o un polipéptido que contiene al menos
alrededor de 6 aminoácidos de la secuencia de 20P1F12/TMPRSS2 que
se muestra en la Figura 1 incluyendo el ácido aspártico en la
posición 491. Opcionalmente, dichos polipéptidos ilustrativos
incluyen cualquiera de los otros aminoácidos que se muestran en la
Figura 1, por ejemplo la metionina en la posición 1.
Ejemplos adicionales estrechamente relacionados
incluyen: un polinucleótido aislado que codifica al menos alrededor
de 6 aminoácidos de la secuencia de 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra
en la Figura 1 incluyendo la valina en la posición 165; un
polinucleótido que codifica al menos alrededor de 6 aminoácidos de
la secuencia de 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1
incluyendo la isoleucina en la posición 242; un polinucleótido que
codifica al menos alrededor de 6 aminoácidos de la secuencia de
20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1 incluyendo el ácido
glutámico en la posición 329; un polinucleótido que codifica al
menos alrededor de 6 aminoácidos de la secuencia de 20P1F12/TMPRSS2
que se muestra en la Figura 1 incluyendo la lisina en la posición
449; un polinucleótido que codifica al menos alrededor de 6
aminoácidos de la secuencia 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la
Figura 1 incluyendo la arginina en la posición 489 y/o un
polinucleótido que codifica al menos alrededor de 6 aminoácidos de
la secuencia de 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1
incluyendo el ácido aspártico en la posición 491. Opcionalmente,
dichos polinucleótidos ilustrativos codifican cualquiera de los
otros aminoácidos que se muestran en la Figura 1, por ejemplo la
metionina en la posición 1.
Los ejemplos descritos en la presente memoria
incluyen una amplia variedad de variantes de proteínas
20P1F12/
TMPRSS2 aceptadas en la técnica tales como polipéptidos que poseen inserciones, supresiones y sustituciones de aminoácidos. Las variantes de 20P1F12/TMPRSS2 pueden realizarse utilizando métodos conocidos en la técnica tales como mutagénesis dirigida al sitio, barrido con alanina, y mutagénesis por FCR. La mutagénesis dirigida al sitio (Carter et al., 1986, Nucl. Acids Res. 13:4331; Zoller et al., 1987, Nucl. Acids Res. I0:6487), la mutagénesis por casete (Wells et al., 1985, gen 34:315), la mutagénesis de selección por restricción (Wells et al., 1986, Philos. Trans. R. Soc. London Ser. A, 317:415) o pueden realizarse otras técnicas conocidas sobre el ADN clonado para producir la variante de ADN de 20P1F12/TMPRSS2. El análisis de aminoácidos por barrido también puede emplearse para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos preferidos del barrido están los aminoácidos neutros relativamente pequeños. Dichos aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. La alanina es típicamente un aminoácido de barrido preferido entre este grupo porque elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos factible que altere la conformación de la cadena principal de la variante. La alanina también es típicamente preferida porque es el aminoácido más común. Además, frecuentemente se encuentra en posiciones tanto ocultas como expuestas (Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, 1976, J. Mol. Biol.,150:1). Si la sustitución con alanina no rinde las cantidades adecuadas de la variante, puede utilizarse un aminoácido isostérico.
TMPRSS2 aceptadas en la técnica tales como polipéptidos que poseen inserciones, supresiones y sustituciones de aminoácidos. Las variantes de 20P1F12/TMPRSS2 pueden realizarse utilizando métodos conocidos en la técnica tales como mutagénesis dirigida al sitio, barrido con alanina, y mutagénesis por FCR. La mutagénesis dirigida al sitio (Carter et al., 1986, Nucl. Acids Res. 13:4331; Zoller et al., 1987, Nucl. Acids Res. I0:6487), la mutagénesis por casete (Wells et al., 1985, gen 34:315), la mutagénesis de selección por restricción (Wells et al., 1986, Philos. Trans. R. Soc. London Ser. A, 317:415) o pueden realizarse otras técnicas conocidas sobre el ADN clonado para producir la variante de ADN de 20P1F12/TMPRSS2. El análisis de aminoácidos por barrido también puede emplearse para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos preferidos del barrido están los aminoácidos neutros relativamente pequeños. Dichos aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. La alanina es típicamente un aminoácido de barrido preferido entre este grupo porque elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos factible que altere la conformación de la cadena principal de la variante. La alanina también es típicamente preferida porque es el aminoácido más común. Además, frecuentemente se encuentra en posiciones tanto ocultas como expuestas (Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, 1976, J. Mol. Biol.,150:1). Si la sustitución con alanina no rinde las cantidades adecuadas de la variante, puede utilizarse un aminoácido isostérico.
También se describen polipéptidos que contienen
una secuencia menor de 492 aminoácidos de la proteína
20P1F12/
TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1 (y los polinucleótidos que codifican tales polipéptidos). Por ejemplo, los ejemplos representativos descritos en la presente memoria incluyen polipéptidos que consisten en desde alrededor del aminoácido 1 hasta alrededor del aminoácido 10 de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1, polipéptidos que consisten en desde alrededor del aminoácido 20 hasta alrededor del aminoácido 30 de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1, polipéptidos que consisten en desde alrededor del aminoácido 30 hasta alrededor del aminoácido 40 de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1, polipéptidos que consisten en desde alrededor del aminoácido 40 hasta alrededor del aminoácido 50 de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1, polipéptidos que consisten en desde alrededor del aminoácido 50 hasta alrededor del aminoácido 60 de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1, polipéptidos que consisten en desde alrededor del aminoácido 60 hasta alrededor del aminoácido 70 de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1, polipéptidos que consisten en desde alrededor del aminoácido 70 hasta alrededor del aminoácido 80 de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1, polipéptidos que consisten en desde alrededor del aminoácido 80 hasta alrededor del aminoácido 90 de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1 y polipéptidos que consisten en desde alrededor del aminoácido 90 hasta alrededor del aminoácido 100 de la proteína de 220P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1, etc. Siguiendo este esquema, los polipéptidos que consisten en porciones de la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 100-492 de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 son ejemplos típicos. También se contemplan los polipéptidos que consisten en porciones mayores de la proteína 20P1F12/TMPRSS2. Por ejemplo los polipéptidos que consisten en desde alrededor del aminoácido 1 (o 20 o 30 o 40, etc.) hasta alrededor del aminoácido 20 (o 30, o 40 o 50, etc.) de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1 pueden generarse mediante una variedad de técnicas bien conocidas en la técnica.
TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1 (y los polinucleótidos que codifican tales polipéptidos). Por ejemplo, los ejemplos representativos descritos en la presente memoria incluyen polipéptidos que consisten en desde alrededor del aminoácido 1 hasta alrededor del aminoácido 10 de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1, polipéptidos que consisten en desde alrededor del aminoácido 20 hasta alrededor del aminoácido 30 de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1, polipéptidos que consisten en desde alrededor del aminoácido 30 hasta alrededor del aminoácido 40 de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1, polipéptidos que consisten en desde alrededor del aminoácido 40 hasta alrededor del aminoácido 50 de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1, polipéptidos que consisten en desde alrededor del aminoácido 50 hasta alrededor del aminoácido 60 de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1, polipéptidos que consisten en desde alrededor del aminoácido 60 hasta alrededor del aminoácido 70 de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1, polipéptidos que consisten en desde alrededor del aminoácido 70 hasta alrededor del aminoácido 80 de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1, polipéptidos que consisten en desde alrededor del aminoácido 80 hasta alrededor del aminoácido 90 de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1 y polipéptidos que consisten en desde alrededor del aminoácido 90 hasta alrededor del aminoácido 100 de la proteína de 220P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1, etc. Siguiendo este esquema, los polipéptidos que consisten en porciones de la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 100-492 de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 son ejemplos típicos. También se contemplan los polipéptidos que consisten en porciones mayores de la proteína 20P1F12/TMPRSS2. Por ejemplo los polipéptidos que consisten en desde alrededor del aminoácido 1 (o 20 o 30 o 40, etc.) hasta alrededor del aminoácido 20 (o 30, o 40 o 50, etc.) de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1 pueden generarse mediante una variedad de técnicas bien conocidas en la técnica.
Ejemplos ilustrativos adicionales descritos en
la presente memoria incluyen polipéptidos de 20P1F12/TMPRSS2 que
contienen los residuos de aminoácidos de uno o más de los dominios
contenidos dentro de la secuencia del polipéptido de
20P1F12/TMPRSS2 que se muestra, por ejemplo, en la Figura 3B (y los
polinucleótidos que codifican estos polipéptidos). En un ejemplo,
los polipéptidos típicos pueden contener el dominio citoplasmático,
desde alrededor del aminoácido 1 hasta alrededor del aminoácido 84.
En otro ejemplo, los polipéptidos típicos pueden contener el
dominio transmembrana, desde alrededor del aminoácido 84 hasta
alrededor del aminoácido 106. En otro ejemplo, los polipéptidos
típicos pueden contener el dominio LDLRA, desde alrededor del
aminoácido 113 hasta alrededor del aminoácido 148. En otro ejemplo,
los polipéptidos típicos pueden contener el dominio SRCR, desde
alrededor del aminoácido 149 hasta alrededor del aminoácido 242. En
otro ejemplo, los polipéptidos típicos relacionados con la
invención pueden contener el dominio de proteasa, desde alrededor
del aminoácido 255 hasta alrededor del aminoácido 492.
Los ejemplos ilustrativos adicionales descritos
en la presente memoria incluyen polipéptidos de
20P1F12/
TMPRSS2 que contienen los residuos de aminoácidos de uno o más de los motivos biológicos contenidos dentro de la secuencia del polipéptido de 20P1F12/TMPRSS2 según se muestra en la Figura 1 (y los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos). En un ejemplo, los polipéptidos típicos pueden contener uno o más de los sitios de glicosilación de 20P1F12/TMPRSS2 tales como NTSA en los residuos 213-216 y/o NSSR en los residuos 249-252. En otro ejemplo, los polipéptidos típicos pueden contener uno o más de los sitios de fosforilación de la proteína Quinasa C de 20P1F12/TMPRSS2 tales como TSK en los residuos 78-80, TSK en los residuos 447-449, TKK en los residuos 81-83, SQR en los residuos 163-165, SSK en los residuos 232-234, SLR en los residuos 238-240, SSR en los residuos 250-252 y/o TQR en los residuos 407-409. En otro ejemplo, los polipéptidos típicos pueden contener uno o más de los sitios de fosforilación de la caseína quinasa II de 20P1F12/TMPRSS2 tales como TVYE en los residuos 35-38, SGlE en los residuos 116-119 y/o TFND en los residuos 356-359. En otro ejemplo, los polipéptidos típicos pueden contener uno o más de los sitios de N-miristoilación N tales como GSPPAI en los residuos 6-11, GTVCTS en los residuos 74-79, GAALAA en los residuos 97-102, GSKCSN en los residuos 110-115, GVNLNS en los residuos 245-250, GGESAL en los residuos 258-263, GNVDSC en los residuos 432-437, GSGCAK en los residuos 462-467, GCAKAY en los residuos 464-469 y/o GVYGN en los residuos 472-477. En otro ejemplo, los polipéptidos típicos pueden contener el motivo A del sitio de unión al ATP/GTP (bucle P), ATEEKGKT en los residuos 386-393. En otro ejemplo, los polipéptidos típicos pueden contener la firma del dominio clase A del receptor de LDL (LDLRA), CINPSNWCDGVSHCPGGEDENRC, en los residuos 126-148. En otro ejemplo, los polipéptidos típicos pueden contener las serina-proteasas, familia de la tripsina, sitio activo de histidina VTAAHC en los residuos 292-297. En otro ejemplo, los polipéptidos típicos pueden contener las serina-proteasas, familia de la tripsina, sitio activo de la serina DSCQGDSGGPLV en los residuos 435-446. Los ejemplos relacionados incluyen polipéptidos que contienen combinaciones de los diferentes motivos tratados más arriba, siendo los ejemplos preferidos aquellos que no contienen ninguna inserción, supresión o sustitución ya sea dentro de los motivos o las secuencias intervinientes de estos polipéptidos.
TMPRSS2 que contienen los residuos de aminoácidos de uno o más de los motivos biológicos contenidos dentro de la secuencia del polipéptido de 20P1F12/TMPRSS2 según se muestra en la Figura 1 (y los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos). En un ejemplo, los polipéptidos típicos pueden contener uno o más de los sitios de glicosilación de 20P1F12/TMPRSS2 tales como NTSA en los residuos 213-216 y/o NSSR en los residuos 249-252. En otro ejemplo, los polipéptidos típicos pueden contener uno o más de los sitios de fosforilación de la proteína Quinasa C de 20P1F12/TMPRSS2 tales como TSK en los residuos 78-80, TSK en los residuos 447-449, TKK en los residuos 81-83, SQR en los residuos 163-165, SSK en los residuos 232-234, SLR en los residuos 238-240, SSR en los residuos 250-252 y/o TQR en los residuos 407-409. En otro ejemplo, los polipéptidos típicos pueden contener uno o más de los sitios de fosforilación de la caseína quinasa II de 20P1F12/TMPRSS2 tales como TVYE en los residuos 35-38, SGlE en los residuos 116-119 y/o TFND en los residuos 356-359. En otro ejemplo, los polipéptidos típicos pueden contener uno o más de los sitios de N-miristoilación N tales como GSPPAI en los residuos 6-11, GTVCTS en los residuos 74-79, GAALAA en los residuos 97-102, GSKCSN en los residuos 110-115, GVNLNS en los residuos 245-250, GGESAL en los residuos 258-263, GNVDSC en los residuos 432-437, GSGCAK en los residuos 462-467, GCAKAY en los residuos 464-469 y/o GVYGN en los residuos 472-477. En otro ejemplo, los polipéptidos típicos pueden contener el motivo A del sitio de unión al ATP/GTP (bucle P), ATEEKGKT en los residuos 386-393. En otro ejemplo, los polipéptidos típicos pueden contener la firma del dominio clase A del receptor de LDL (LDLRA), CINPSNWCDGVSHCPGGEDENRC, en los residuos 126-148. En otro ejemplo, los polipéptidos típicos pueden contener las serina-proteasas, familia de la tripsina, sitio activo de histidina VTAAHC en los residuos 292-297. En otro ejemplo, los polipéptidos típicos pueden contener las serina-proteasas, familia de la tripsina, sitio activo de la serina DSCQGDSGGPLV en los residuos 435-446. Los ejemplos relacionados incluyen polipéptidos que contienen combinaciones de los diferentes motivos tratados más arriba, siendo los ejemplos preferidos aquellos que no contienen ninguna inserción, supresión o sustitución ya sea dentro de los motivos o las secuencias intervinientes de estos polipéptidos.
Los anticuerpos capaces de unirse
específicamente a e identificar las proteínas o polipéptidos de
20P1F12/
TMPRSS2 pueden utilizarse para detectar la presencia de 20P1F12/TMPRSS2 secretado y/o células que expresan 20P1F12/TMPRSS2 en cualquier muestra biológica, para determinar su localización subcelular, detectar y registrar por imágenes células de cáncer de próstata, vejiga, ovario, pulmón y colon y células de cáncer metastásico y tumores de próstata, vejiga, ovario, pulmón y colon y tumores metastásicos, y modular o inhibir la actividad biológica de 20P1F12/TMPRSS2. Los anticuerpos también pueden utilizarse terapéuticamente según se describe más abajo. Los métodos para la generación de anticuerpos policlonales y monoclonales son bien conocidos en la técnica.
TMPRSS2 pueden utilizarse para detectar la presencia de 20P1F12/TMPRSS2 secretado y/o células que expresan 20P1F12/TMPRSS2 en cualquier muestra biológica, para determinar su localización subcelular, detectar y registrar por imágenes células de cáncer de próstata, vejiga, ovario, pulmón y colon y células de cáncer metastásico y tumores de próstata, vejiga, ovario, pulmón y colon y tumores metastásicos, y modular o inhibir la actividad biológica de 20P1F12/TMPRSS2. Los anticuerpos también pueden utilizarse terapéuticamente según se describe más abajo. Los métodos para la generación de anticuerpos policlonales y monoclonales son bien conocidos en la técnica.
La invención también se refiere a moléculas
recombinantes de ADN o ARN que contienen un polinucleótido
20P1F12/TMPRSS2, incluyendo sin limitación, fagos, plásmidos,
fagémidos, cósmidos, YACs, BACs, así como diversos vectores virales
y no virales bien conocidos en la técnica, y células transformadas o
transfectadas con tales moléculas recombinantes de ADN o ARN. Según
se utiliza en la presente memoria, una molécula recombinante de ADN
o ARN es una molécula de ADN o ARN que se ha sometido a una
manipulación molecular in vitro. Los métodos para generar
tales moléculas son bien conocidos (véase, por ejemplo, Sambrook
et al., 1989, supra).
También se describe un sistema
-hospedante-vector que comprende una molécula
recombinante de ADN que contiene un polinucleótido 20P1F12/TMPRSS2
dentro de una célula hospedante procariota o eucariota apropiada.
Los ejemplos de células hospedantes eucariotas incluyen una célula
de levadura, una célula vegetal o una célula animal, tal como una
célula de mamífero o una célula de insecto (p. ej., una célula
infectable con baculovirus tal como una célula Sf9). Los ejemplos
de células de mamíferos apropiadas incluyen diversas líneas
celulares de cáncer de próstata tales como LnCaP,
PC-3, DU145, LAPC-4, TsuPr 1, otras
líneas celulares transfectables o transducibles de cáncer de
próstata, así como una serie de células de mamíferos utilizadas
rutinariamente para la expresión de proteínas recombinantes (p.
ej., células COS, CHO, 293, 293T). Más particularmente, un
polinucleótido que comprende la secuencia codificadora de una
20P1F12/TMPRSS2 puede utilizarse para generar proteínas
20PLF12/TMPRSS2 o fragmentos de las mismas utilizando cualquier
cantidad de sistemas
hospedante-vector-rutinariamente
utilizados y ampliamente conocidos en la técnica.
Está disponible una amplia variedad de sistemas
hospedante-vector apropiados para la expresión de
las proteínas 20P1F12/TMPRSS2 o fragmentos de las mismas; véase,
por ejemplo, Sambrook et al., 1989, Current Protocols in
Molecular Biology, 1995, supra. Los vectores preferidos para
la expresión en mamíferos incluyen, sin limitación, pcDNA 3.1
myc-His-tag (Invitrogen), el vector
retroviral pSR\alphatkneo (Muller et al., 1991, MCB
11:1785) y/o el vector Tag5 (GenHunter Corporation, Nashville TN).
El vector Tag5 es un vector preferido y proporciona una señal de
secreción de IgGK que puede utilizarse para facilitar la producción
de una proteína 20P1F12/TMPRSS2 secretada en células transfectadas.
Utilizando estos vectores de expresión, 20P1F12/T MPRSS2 puede
expresarse preferiblemente en diversas líneas celulares de cáncer
de próstata y de no próstata, incluyendo, por ejemplo 3T3, 293,
293TPC-3, LNCaP y TsuPr1. Los sistemas
hospedante-vector son útiles para la producción de
una proteína 20P1F12/TMPRSS2 o fragmento de la misma. Tales
sistemas hospedante-vector pueden emplearse para
estudiar las propiedades funcionales de 20P1F12/TMPRSS2 y mutaciones
de 20P1F12/TMPRSS2.
La redundancia en el código genético permite
variación en las secuencias del gen 20P1F12/TMPRSS2. En particular,
un experto en la técnica reconocerá las preferencias específicas de
codones por una especie hospedante específica y puede adaptar la
secuencia descrita como sea preferible para un hospedante deseado.
Por ejemplo, a las secuencias de codones preferidas típicamente se
les reemplazan los codones poco comunes (es decir, codones que
poseen una frecuencia de uso menor que alrededor del 20% en
secuencias conocidas del hospedante deseado) por codones de mayor
frecuencia. Las preferencias de codones para un organismo específico
pueden calcularse, por ejemplo, utilizando las tablas de uso de
codones disponibles en Internet en la siguiente dirección:
http://www.dna.affrc.go.jp/-nakamura/codon.html. En la presente
memoria, las secuencias nucleotídicas que han sido optimizadas para
una especie hospedante particular reemplazando cualquier codón que
posea una frecuencia de uso menor que alrededor del 20%, se
denominan "secuencias de codones optimizadas".
Además de la detección de crecimiento celular
desregulado, las proteínas codificadas por los genes
20P1F12/
TMPRSS2, o por fragmentos de los mismos, tendrán una variedad de usos, incluyendo, sin limitación, generar anticuerpos y en métodos para identificar ligandos y otros agentes y constituyentes celulares que se unen a un producto génico 20P1F12/TMPRSS2. Dichas proteínas también pueden utilizarse como vacunas para el cáncer. Los anticuerpos producidos contra una proteína 20P1F121/TMPRSS2 o fragmento de la misma pueden ser útiles en ensayos diagnósticos y pronósticos, en metodologías de detección por imágenes (incluyendo, particularmente, detección por imágenes del cáncer) y en métodos terapéuticos en el manejo de cánceres humanos caracterizados por la expresión de una proteína 20P1F12/TMPRSS2, tales como cánceres de próstata, vejiga, ovario, pulmón y colon y cánceres metastásicos. Se contemplan diversos ensayos inmunológicos útiles para la detección de las proteínas 20P1F12/TMPRSS2, incluyendo, sin limitación, varios tipos de radioinmunoensayos, ensayos de inmunosorción ligados a enzimas (ELISA), ensayos inmunofluorescentes ligados a enzimas (ELIFA), métodos inmunocitoquímicos y similares. Dichos anticuerpos pueden marcarse y utilizarse como reactivos inmunológicos de detección por imágenes capaces de detectar células de cáncer de próstata, vejiga, ovario, pulmón y/o colon, y/o células de cáncer metastásico (p. ej., en métodos radiocentellográficos de representación por imágenes).
TMPRSS2, o por fragmentos de los mismos, tendrán una variedad de usos, incluyendo, sin limitación, generar anticuerpos y en métodos para identificar ligandos y otros agentes y constituyentes celulares que se unen a un producto génico 20P1F12/TMPRSS2. Dichas proteínas también pueden utilizarse como vacunas para el cáncer. Los anticuerpos producidos contra una proteína 20P1F121/TMPRSS2 o fragmento de la misma pueden ser útiles en ensayos diagnósticos y pronósticos, en metodologías de detección por imágenes (incluyendo, particularmente, detección por imágenes del cáncer) y en métodos terapéuticos en el manejo de cánceres humanos caracterizados por la expresión de una proteína 20P1F12/TMPRSS2, tales como cánceres de próstata, vejiga, ovario, pulmón y colon y cánceres metastásicos. Se contemplan diversos ensayos inmunológicos útiles para la detección de las proteínas 20P1F12/TMPRSS2, incluyendo, sin limitación, varios tipos de radioinmunoensayos, ensayos de inmunosorción ligados a enzimas (ELISA), ensayos inmunofluorescentes ligados a enzimas (ELIFA), métodos inmunocitoquímicos y similares. Dichos anticuerpos pueden marcarse y utilizarse como reactivos inmunológicos de detección por imágenes capaces de detectar células de cáncer de próstata, vejiga, ovario, pulmón y/o colon, y/o células de cáncer metastásico (p. ej., en métodos radiocentellográficos de representación por imágenes).
En un ejemplo específico, una nueva proteína
20P1F12/TMPRSS2 que posee la secuencia de aminoácidos de la
20P1F12/TMPRSS2 humana se da en la Figura 1 (SEC ID NO.: 2).
También se contemplan proteínas de fusión que combinan todo o parte
de 20P1F12/TMPRSS2 con un polipéptido heterólogo y una realización
representativa donde el polipéptido heterólogo es
glutatión-s-sintetasa tranferasa se
muestra en el Ejemplo 5. En otro ejemplo típico la molécula
quimérica puede comprender una fusión de 20P1F12/TMPRSS2 con una
inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina.
Para una forma bivalente de la molécula quimérica (también
denominada "inmunoadhesina"), dicha fusión podría ser a la
región Fe región de una molécula de IgG. Las fusiones con Ig
preferiblemente incluyen la sustitución de una forma soluble
(dominio transmembrana suprimido o inactivado) de un polipéptido de
20P1F12/TMPRSS2 en lugar de al menos una región variable dentro de
una molécula de Ig. En un ejemplo particularmente preferido la
función con la inmunoglubilina incluye las regiones bisagra, CH2 y
CH3, o bisagra, CH1, CH2 y CH3 de una molécula de IgGI. Para la
producción de fusiones de inmunoglobulinas véase también la Patente
Estadounidense No. 5.428.130 emitida el 27 de junio de 1995. Se
conoce bien en la técnica una variedad de polipéptidos de fusión y
las realizaciones típicas se describen en Current Protocols In
Molecular Biology, Unidades 9 y 16, Frederick M. Ausubul et
al. eds., 1995.
La proteína 20P1F12/TMPRSS2 relacionada con la
invención puede utilizarse en muchas formas, preferiblemente en
forma aislada. Según se utiliza en la presente memoria, se dice que
la proteína es "aislada" cuando se emplean métodos físicos,
mecánicos o químicos para retirar la proteína 20P1F12/TMPRSS2 de los
constituyentes celulares que normalmente están asociados a la
proteína. Un técnico experto puede emplear fácilmente métodos
estándar de purificación para obtener una proteína 20P1F12/TMPRSS2
aislada. Una molécula de proteína 20P1F12/TMPRSS2 purificada estará
sustancialmente libre de otras proteínas o moléculas que perjudican
la unión de 20P1F12/TMPRSS2 al anticuerpo u otro ligando. La
naturaleza y grado de aislamiento y purificación dependerá del uso
previsto. Los ejemplos de una proteína 20P1F12/TMPRSS2 incluyen una
proteína 20P1F12/TMPRSS2 purificada y una proteína 20P1F12/TMPRSS2
funcional y soluble. En una forma, dichas proteínas 20P1F12/TMPRSS2
funcionales y solubles o fragmentos de las mismas retienen la
capacidad de unirse a un anticuerpo, a una sustancia asociada de
unión a un ligando y/o a un sustrato (p. ej., un blanco
proteolítico).
Los ácidos nucleicos que codifican
20P1F12/TMPRSS2 o sus formas modificadas también pueden utilizarse
para generar animales transgénicos o animales "knock out" (o
líneas celulares) que, a su vez, son útiles en el desarrollo y
selección de reactivos terapéuticamente útiles. Un animal
transgénico (p. ej., un ratón o rata) es un animal que posee
células que contienen un transgén, transgén que se introdujo en el
animal o un ancestro del animal en un estadío prenatal, p. ej. una
etapa embrionaria. Un transgén es un ADN que está integrado en el
genoma de una célula a partir de la cual se desarrolla un animal
transgénico. En un ejemplo puede utilizarse un ADNc que codifica
20P1F12/TMPRSS2 para clonar un ADN genómico que codifica
20P1F12/TMPRSS2 de conformidad con técnicas establecidas y las
secuencias genómicas utilizadas para generar animales transgénicos
que contienen células que expresan ADN que codifica
20P1F12/TMPRSS2. Los métodos para generar animales transgénicos,
particularmente animales tales como ratones o ratas, se han vuelto
convencionales en la técnica y se describen, por ejemplo, en la
Patente Estadounidense No. 4.736.866 y 4.870.009. Típicamente,
células particulares serían localizadas para la incorporación del
transgén de 20P1F12/TMPRSS2 con mejoradores específicos del tejido.
Pueden utilizarse animales transgénicos que incluyen una copia de
un transgén que codifica 20P1F12/TVIPRSS2 introducido en la línea
germinal del animal en una etapa embrionaria para examinar el efecto
de la expresión aumentada del ADN que codifica 20P1F12/TMPRSS2.
Dichos animales pueden utilizarse como animales de prueba para
reactivos que se considera confieren protección, por ejemplo,
contra afecciones s patológicas asociadas con su sobreexpresión. De
conformidad con esta faceta de la descripción, se trata un animal
con el reactivo y una reducida incidencia de la afección
patológica, en comparación con animales no tratados portadores del
transgén, indicaría una potencial intervención terapéutica para la
afección patológica.
Alternativamente, pueden utilizarse homólogos no
humanos de 20P1F12/TMPRSS2 para construir un animal "knock
out" de 20P1F12/TMPRSS2 que posee un gen defectuoso o alterado
que codifica 20P1F12/TMPRSS2 como resultado de recombinación
homóloga entre el gen endógeno que codifica 20P1P12/TMPRSS2 y ADN
genómico alterado que codifica 20P1F12/TMPRSS2 introducido en una
célula embrionaria del animal. Por ejemplo, puede utilizarse ADNc
que codifica 20P1F12/TMPRSS2 para clonar ADN genómico que codifica
20P1F12/TMPRSS2 de conformidad con técnicas establecidas. Una
porción del ADN genómico que codifica 20P1F12/TMPRSS2 puede
suprimirse o reemplazarse con otro gen, tal como un gen que
codifica un marcador seleccionable que puede utilizarse para
monitorear la integración. Típicamente, varias kilobases de ADN
flanqueante inalterado (en ambos extremos 5' y 3') se incluyen en el
vector (véase, p. ej., Thomas y Capecchi, 1987, Cell 51:503, para
una descripción de los vectores de recombinación homóloga). El
vector se introduce en una línea de células madre embrionarias (p.
ej., por electroporación) y se seleccionan las células en las que
el ADN introducido se ha recombinado homólogamente con el ADN
endógeno (véase, p. ej., Li et al., 1992. Cell 69:915).
Después, las células seleccionadas se inyectan en un blastocito de
un animal (p. ej., un ratón o rata) para formar quimeras de
agregación (véase, p. ej., Bradley, en Robertson, ed., 1987,
Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach,
(IRL, Oxford), pp. 113-152). Después puede
implantarse un embrión quimérico en un animal hembra adoptivo
seudo-preñado apropiado y el embrión se lleva a
término para crear un animal "knock out". La progenie que
alberga el ADN homólogamente recombinado en sus células germinales
puede identificarse mediante técnicas estándar y se utiliza para
reproducir animales en los que todas las células del animal
contienen el ADN homólogamente recombinado. Los animales knock out
pueden caracterizarse, por ejemplo, por su capacidad para
defenderse de ciertas afecciones patológicas y por su desarrollo de
afecciones patológicas debido a la ausencia del polipéptido
20P1F12/TMPRSS2.
Pueden utilizarse métodos recombinantes para
generar moléculas de ácido nucleico que codifican la proteína
20P1F12/TMPRSS2. Al respecto, las moléculas de ácido nucleico que
codifican 20P1F12/TMPRSS2 descritas en la presente memoria
proporcionan los medios para generar fragmentos definidos de la
proteína 20P1F12/TMPRSS2. Dichos polipéptidos 20P1F12/TMFRSS2 son
particularmente útiles en generar anticuerpos específicos del
dominio (p. ej., anticuerpos que reconocen un epitopo
predominantemente secretado o predominantemente asociado a la
membrana de la proteína 20P1F12/TMPRSS2), que identifican agentes o
factores celulares que se unen a un dominio particular de
20P1F12/TMPRSS2, y en varios contextos terapéuticos, incluyendo, sin
limitación, vacunas para el cáncer. Los polipéptidos de
20P1F12/TMPRSS2 que contienen estructuras particularmente
interesantes pueden predecirse y/o identificarse utilizando
diversas técnicas analíticas bien conocidas en la técnica,
incluyendo, por ejemplo, los métodos de
Chou-Fasman, Gamier-Robson,
Kyte-Doolittle, Eisenberg,
Karplus-Schultz o el análisis de
Jameson-Wolf, o sobre la base de la
inmunogenicidad.
Otro aspecto de la invención se refiere a
anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a la proteína
20P1F12/
TMPRSS2 y a fragmentos polipeptídicos de la misma. Los anticuerpos más preferidos se unirán selectivamente a una proteína 20P1F12/TMPRSS2 y no se unirán (o se unirán débilmente) a proteínas y polipéptidos que no sean 20P1F12/TMPRSS2. Los anticuerpos anti-20P1F12/TMPRSS2 que están particularmente contemplados incluyen anticuerpos monoclonales y policlonales así como fragmentos que contienen el dominio de unión al antígeno y/o una o más regiones determinantes de complementariedad de estos anticuerpos. Según se utiliza en la presente memoria, un fragmento de anticuerpo se define como al menos una porción de la región variable de la molécula de inmunoglobulina que se une a su blanco, es decir la región de unión al antígeno.
TMPRSS2 y a fragmentos polipeptídicos de la misma. Los anticuerpos más preferidos se unirán selectivamente a una proteína 20P1F12/TMPRSS2 y no se unirán (o se unirán débilmente) a proteínas y polipéptidos que no sean 20P1F12/TMPRSS2. Los anticuerpos anti-20P1F12/TMPRSS2 que están particularmente contemplados incluyen anticuerpos monoclonales y policlonales así como fragmentos que contienen el dominio de unión al antígeno y/o una o más regiones determinantes de complementariedad de estos anticuerpos. Según se utiliza en la presente memoria, un fragmento de anticuerpo se define como al menos una porción de la región variable de la molécula de inmunoglobulina que se une a su blanco, es decir la región de unión al antígeno.
Para algunas aplicaciones, puede ser deseable
generar anticuerpos que reaccionen específicamente con una proteína
20P1P12/TMPRSS2 particular y/o un epitopo dentro de un dominio
estructural particular. Por ejemplo, los anticuerpos preferidos
útiles para fines de detección por imágenes en el diagnóstico del
cáncer son aquellos que reaccionan con un epitopo en una región
asociada a membrana de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 expresada en
células cancerosas. Dichos anticuerpos pueden generarse utilizando
la proteína 20P1F12/TMPRSS2 o utilizando péptidos obtenidos a partir
de dominios secretados u otros dominios de 20P1F12/TMPRSS2, y
utilizarse como un inmunógeno.
Los anticuerpos de 20P1F12/TMPRSS2 pueden ser
particularmente útiles en los ensayos diagnósticos y pronósticos,
metodologías de obtención de imágenes y estrategias terapéuticas
para el cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón,
cáncer de colon, cáncer ovárico, cáncer de riñón y cánceres
metastásicos. La invención proporciona diversos ensayos
inmunológicos útiles para la detección y cuantificación de
20P1F12/TMPRSS2. Tales ensayos en general comprenden uno o más
anticuerpos de 20P1F12/TMPRSS2 capaces de reconocer y unirse a
20P1F12/TMPRSS2, y pueden realizarse dentro de diversos formatos de
ensayos inmunológicos bien conocidos en la técnica, incluyendo, sin
limitación, a varios tipos de radioinmunoensayos, ensayos de
inmunosorción ligados a enzimas (ELISA), ensayos
inmunofluorescentes ligados a enzimas (ELIFA) y similares. Además,
también se proporcionan métodos inmunológicos de obtención de
imágenes capaces de detectar cáncer de próstata, vejiga, ovario,
pulmón y colon y cáncer metastásico, incluyendo, y limitándose, a
métodos de obtención de imágenes radiocentellográficas utilizando
anticuerpos de 20P1F12/TMPRSS2 marcados. Tales ensayos pueden ser
clínicamente útiles en la detección, monitoreo y pronóstico del
cáncer de próstata, vejiga, ovario, pulmón y colon, y cáncer
metastásico, particularmente el cáncer avanzado. Debido a que la
expresión de TMPRSS2 es reducida en cáncer de riñón, la detección,
monitoreo y pronóstico de este cáncer se lleva a cabo evaluando la
regulación por disminución o el cese de la expresión.
Los anticuerpos de 20P1F12/TMPRSS2 también
pueden utilizarse en métodos para purificar las proteínas y
polipéptidos de 20P1F12/TMPRSS2 y para aislar moléculas homólogas y
relacionadas con 20P1F12/TMPRSS2. Por ejemplo, el método para
purificar una proteína 20P1F12/TMPRSS2 comprende incubar un
anticuerpo de 20P1F12/
TMPRSS2, que se ha acoplado a una matriz sólida, con un lisado u otra solución que contiene 20P1F12/TMPRSS2 en condiciones que permitan que el anticuerpo de 20P1F12/TMPRSS2 se una a 20P1F12/TMPRSS2, lavar la matriz sólida para eliminar impureza y eluir el 20P1F12/TMPRSS2 del anticuerpo acoplado. Otros usos de los anticuerpos de 20P1F12/TMPRSS2 incluyen generar anticuerpos anti-idiotípicos que imitan a la proteína 20P1F12/TMPRSS2.
TMPRSS2, que se ha acoplado a una matriz sólida, con un lisado u otra solución que contiene 20P1F12/TMPRSS2 en condiciones que permitan que el anticuerpo de 20P1F12/TMPRSS2 se una a 20P1F12/TMPRSS2, lavar la matriz sólida para eliminar impureza y eluir el 20P1F12/TMPRSS2 del anticuerpo acoplado. Otros usos de los anticuerpos de 20P1F12/TMPRSS2 incluyen generar anticuerpos anti-idiotípicos que imitan a la proteína 20P1F12/TMPRSS2.
Los anticuerpos de 20P1F12/TMPRSS2 también
pueden utilizarse para, por ejemplo, modular o inhibir la actividad
biológica de una proteína 20P1F12/TMPRSS2 o para localizar y
destruir células (tales como células de cáncer de próstata, vejiga,
ovario, pulmón y colon, o células de cáncer metatásico) que expresan
una proteína 20P1F12/TMPRSS2. La terapia con anticuerpos del cáncer
de próstata, vejiga, ovario, pulmón y colon, y del cáncer
metastásico, se describe en mayor detalle más abajo. Un ejemplo
típico en este contexto consiste en un método para inhibir el
crecimiento de una célula precancerosa o cancerosa que expresa
20P1F12/TMPRSS2, que comprende poner en contacto la 20P1F12/TMPRSS2
expresada por la célula neoplásica con una cantidad efectiva de un
anticuerpo anti-20P1F12/TMPRSS2 de modo que el
crecimiento de la célula neoplásica sea inhibido. Preferiblemente un
anticuerpo utilizado en este método reconoce un epitopo de
20P1F12/TMPRSS2 que está predominantemente asociado a la superficie
celular. Los métodos para la inhibición mediada por anticuerpos y
lisis celular son bien conocidos en la técnica e incluyen, por
ejemplo, citotoxicidad celular mediada por complementos o
dependiente de anticuerpos (ADCC). Un ejemplo alternativo en este
contexto consiste en un método para modular la actividad biológica
de 20P1F12/TMPRSS2 secretada que comprende poner en contacto la
20P1F12/TMPRSS2 secretada con una cantidad efectiva de un anticuerpo
anti-20PJF12/TMPRSS2 de modo que se module la
actividad de la 20P1F12/TMPRSS2 secretada. Preferiblemente un
anticuerpo utilizado en este método reconoce a un epitopo de
20P1F12/TMPRSS2 que es secretado predominantemente.
Son bien conocidos en la técnica diversos
métodos para la preparación de anticuerpos. Por ejemplo, pueden
prepararse anticuerpos inmunizando un huésped mamífero apropiado
utilizando una proteína péptido o fragmento de 20P1F12/TMPRSS2,, en
forma aislada o inmunoconjugada. (Antibodies: A Laboratory Manual,
CSH Press, Eds., Harlow, y Lane (1988); Harlow, Antibodies, Cold
Spring Harbor Press, NY (1989)). Además, también pueden utilizarse
proteínas de fusión de 20P1F12/TMRRSS2, tal como una proteína de
fusión con GST de 20P1F12/TMPRSS2. En un ejemplo particular, una
proteína de fusión con GST que comprende toda o la mayor parte de la
secuencia de aminoácidos del marco de lectura abierto de la Figura
1 puede producirse y utilizarse como inmunógeno para generar
anticuerpos adecuados. Según se describe en el Ejemplo 5, dicha
fusión con GST se utilizó para generar diversos anticuerpos
monoclonales que reaccionan inmunoespecíficamente con
20P1F12/TMPRSS2. También pueden utilizarse células que expresan o
sobreexpresan 20P1F12/TMPRSS2 para inmunizaciones. De manera
similar, puede utilizarse cualquier célula manipulada genéticamente
para expresar 20P1F12/TMPRSS2. Esta estrategia puede resultar en la
producción de anticuerpos monoclonales con capacidades aumentadas
para reconocer 20P1F12/TMPRSS2 endógena. Se describen estrategias
adicionales para generar anticuerpos de 20P1F12/TMPRSS2 en el
Ejemplo 5 en la presente memoria.
La secuencia de aminoácidos de 20P1F12/TMPRSS2
que se muestra en la Figura 1 (SEC ID NO.: 2) puede utilizarse para
seleccionar regiones específicas de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 para
generar inmunógenos. Por ejemplo, pueden utilizarse análisis de
hidrofobicidad e hidrofilicidad de la secuencia de aminoácidos de
20P1F12/TMPRSS2 para identificar regiones hidrofílicas en la
estructura de 20P1F12/TMPRSS2. Las regiones de la proteína
20P1F12/
TMPRSS2 que muestran estructura inmunogén, así como otras regiones y dominios, pueden identificarse fácilmente utilizando otros diversos métodos conocidos en la técnica, tales como análisis de Chou-Fasman, Gamier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz o Jameson Wolf. Por ejemplo, pueden generarse anticuerpos que preferencialmente se dirigen a una especie de 20P1F12/TMPRSS2 especifica (tal como la especies secretada de 32 kD que contiene el dominio de proteasa o una especie asociada a membrana; véase, p. ej., las Figs. 17 y 22) por métodos tratados más abajo.
TMPRSS2 que muestran estructura inmunogén, así como otras regiones y dominios, pueden identificarse fácilmente utilizando otros diversos métodos conocidos en la técnica, tales como análisis de Chou-Fasman, Gamier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz o Jameson Wolf. Por ejemplo, pueden generarse anticuerpos que preferencialmente se dirigen a una especie de 20P1F12/TMPRSS2 especifica (tal como la especies secretada de 32 kD que contiene el dominio de proteasa o una especie asociada a membrana; véase, p. ej., las Figs. 17 y 22) por métodos tratados más abajo.
Se conocen bien en la técnica métodos para
preparar una proteína o polipéptido para su uso como inmunógeno y
para preparar conjugados inmunogenes de una proteína con un vehículo
tal como BSA, KLH u otras proteínas de transporte. En algunas
circunstancias, puede utilizarse la conjugación directa que utiliza,
por ejemplo, reactivos de carbodiimida; en otros casos pueden ser
efectivos reactivos conectores tales como los proporcionados por
Pierce Chemical Co., Rockford, IL. La administración de un inmunogen
de 20P1F12/TMPRSS2 en general se realiza mediante inyección en un
período de tiempo apropiado y con el uso de un adyuvante apropiado,
como en general se entiende en la técnica. Durante el programa de
inmunización, pueden medirse títulos de anticuerpos para determinar
la adecuación de la formación del anticuerpo.
Se prefieren los anticuerpos monoclonales
anti-20P1F12/TMPRSS2 y pueden producirse mediante
varios medios bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden
prepararse líneas celulares inmortalizadas que segregan un
anticuerpo monoclonal deseado utilizando el método estándar de
Kohler y Milstein o modificaciones que producen la inmortalización
de linfocitos o células esplénicas, como se conoce en general. Las
líneas celulares inmortalizadas que secretan los anticuerpos
deseados se examinan mediante un inmunoensayo en el que el antígeno
es la proteína 20P1F12/TMPRSS2 o fragmento de 20P1F12/TMPRSS2.
Cuando se identifica el cultivo apropiado de células inmortalizadas
que secretan el anticuerpo deseado, las células pueden expandirse y
los anticuerpos pueden producirse ya sea a partir de cultivos in
vitro o a partir de líquido de ascitis.
Los anticuerpos o fragmentos también pueden
producirse utilizando tecnología actual, por medios recombinantes.
Las regiones que se unen específicamente a las regiones deseadas de
la proteína 20P1F12/TMPRSS2 también pueden producirse en el
contexto de anticuerpos quiméricos o de CDR injertadas originados en
múltiples especies. También pueden producirse anticuerpos
humanizados o humanos de 20P1F12/TMPRSS2 y se prefieren. Se conocen
diversos abordajes para producir tales anticuerpos humanizados, e
incluyen métodos quiméricos y de injerto de CDR; los métodos para
producir anticuerpos monoclonales completamente humanos incluyen
métodos de despliegue de fagos y transgénicos (a modo de revisión,
véase Vaughan et al., 1998, Nature Biotechnology 16:
535-539).
Pueden generarse anticuerpos monoclonales
completamente humanos de 20P1F12/TMPRSS2 utilizando tecnologías de
clonación empleando grandes bibliotecas combinatorias de genes de Ig
humanos (p. ej., despliegue de fagos)(Griffiths y Hoogenboom,
Building an in vitro immune system: human antibodies from
phage display libraries. En: Protein Engineering of Antibody
Molecules for Prophylactic and Therapeutic Applications in Man.
Clark, M. (Ed.), Nottingham Academic, pp 45-64
(1993); Burton y Barbas, Human Antibodies from combinatorial
libraries. Id., pp 65-82). También pueden
producirse anticuerpos monoclonales completamente humanos de
20P1F12/TMPRSS2 utilizando ratones transgénicos manipulados
genéticamente para que contengan loci genéticos de inmunoblogina
humana según se describe en la Solicitud de Patente PCT WO98/24893
concedida a Kucherlapati et al., publicada el 3 de diciembre
de 1997 (véase también Jakobovits, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs
7(4): 607414). Este método evita la manipulación in
vitro requerida con tecnología de despliegue de fagos y produce
de manera eficaz anticuerpos humanos auténticos de alta
afinidad.
La reactividad de los anticuerpos de
20P1F12/TMPRSS2 con una proteína 20P1F12/TMPRSS2 puede establecerse
por una serie de medios bien conocidos, incluyendo transferencia
Western, inmunoprecipitación, ELISA y análisis FACS utilizando,
según corresponda, proteínas 20P1F12/TMPRSS2, péptidos, células que
expresan 20P1F12/
TMPRSS2 o extractos de las mismas.
TMPRSS2 o extractos de las mismas.
Un anticuerpo de 20P1F12/TMPRSS2 o fragmento del
mismo puede marcarse con un marcador detectable o conjugado a una
segunda molécula, tal como un agente citotóxico o terapéutico, y
utilizarse para localizar una célula positiva para 20P1F12/TMPRSS2
(Vitetta, E.S. et al., 1993, Immunotoxin therapy, en DeVita,
Ir., V.T. et al., eds., Cancer Principles and Practice of
Oncology, 4ta. edición, J.B. Lippincott Co., Philadelphia,
2624-2636). Se conocen bien en la técnica una
variedad de conjugados terapéuticos y diagnósticos apropiados e
incluyen, sin limitación, un radioisótopo tal como un emisor de
partículas \alpha, un compuesto fluorescente, un compuesto
bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un agente quelante
metálico o un polipéptido tal como una enzima. Se describen
conjugados típicos, por ejemplo, en Current Protocols In Molecular
Biology, Unidades 11 y 17, Frederick M. Ausubul et al. eds.,
1995. En realizaciones preferidas de la invención, se acoplan
conjugados terapéuticos a un anticuerpo que reconoce un epitopo de
20P1F12/TMPRSS2 que está predominantemente asociado a la superficie
celular.
Se describen ejemplos específicos típicos de los
anticuerpos relacionados con la invención en el Ejemplo 5 más
abajo. Tal como se describe en el Ejemplo 5, utilizando los métodos
descritos en la presente memoria se generaron hibridomas que
producen los anticuerpos monoclonales denominados 1F9 (IgGl, K),
2D10 (IgG1, K), 2F8 (IgGl, K), 6B11 (IgGl, K), 3G3 (IgG1, K), 8C6
(IgGI, K) y 9G8 (IgG2a, K). Por ello los ejemplos específicos de
anticuerpos incluyen un anticuerpo monoclonal, cuyo sitio de
combinación con el epitopo inhibe competitivamente esencialmente
toda la unión al epitopo del anticuerpo monoclonal 1F9, 2D10, 2F8,
6B11, 3G3, 8C6 y/o 9G8. Los ejemplos específicos relacionados
incluyen un inmunoconjugado que comprende una molécula que contiene
la región de unión al antígeno del anticuerpo monoclonal 1F9, 2D10,
2F8, 6B11, 3G3, 8C6 y/o 9G8 unido a un agente diagnóstico o
terapéutico.
Ejemplos específicos adicionales relacionados
con la invención que utilizan los anticuerpos monoclonales
denominados 1F9, 2D10, 2F8, 6B11, 3G3, 8C6 y 9G8 incluyen métodos
para detectar el crecimiento celular desregulado tal como el cáncer
determinando la presencia del epitopo de 20P1F12/TMPRSS2 presente en
una muestra de un mamífero, que comprende la utilización de un
anticuerpo monoclonal para reaccionar con el epitopo de
20P1F12/TMPRSS2 presente en la muestra, el anticuerpo caracterizado
por la unión inmunológica a un epitopo de 20P1F12/TEMPRSS2,
teniendo dicho anticuerpo un sitio de combinación con el antígeno
que inhibe competitivamente la unión inmunoespecífica de un
anticuerpo denominado 1F9, 2D10, 2F8, 6B11, 3G3, 8C6 y 9G8,
respectivamente a su antígeno blanco. Otros ejemplos específicos
relacionados con la invención que utilizan los anticuerpos
monoclonales denominados 1F9, 2D10, 2F8, 6B11, 3G3, 8C6 y 9G8
incluyen métodos para inhibir el avance del crecimiento celular
desregulado tal como cáncer, que comprenden poner en contacto un
epitopo de 20P1F12/TMPRSS2 con un anticuerpo monoclonal o fragmento
de unión al antígeno de modo que el avance del cáncer sea inhibido,
en donde dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de unión al
antígeno posee una región de unión al antígeno del anticuerpo
monoclonal murino 1F9, 2D10, 2F8, 6B11, 3G3, 8C6 y/o 9G8.
Ejemplos específicos adicionales relacionados
con la invención que utilizan los anticuerpos monoclonales
denominados 1F9, 2D10, 2F8, 6B11, 3G3, 8C6 y 9G8 incluyen métodos
para determinar la presencia de crecimiento celular desregulado tal
como cáncer en una muestra biológica, que comprenden poner en
contacto un espécimen de dicha muestra con un anticuerpo monoclonal
o fragmento de unión al antígeno del mismo que específicamente se
enlaza a un epitopo de 20P1F12/TMPRSS2, en donde dicho anticuerpo
monoclonal o fragmento de unión al antígeno posee una región de
unión al antígeno del anticuerpo monoclonal murino 1F9, 2D10, 2F8,
6B11, 3G3, 8C6 y/o 9G8, y detectar la unión de dicho anticuerpo o
fragmento a dicha muestra biológica.
Tal como se describe en detalle más abajo,
ejemplos específicos adicionales relacionados con la invención que
utilizan los anticuerpos monoclonales denominados 1F9, 2D10, 2F8,
6B11, 3G3, 8C6 y 9G8 incluyen métodos para inhibir el crecimiento
celular desregulado tal como cáncer en una muestra biológica, que
comprenden poner en contacto un espécimen de dicha muestra con un
anticuerpo monoclonal o fragmento de unión al antígeno del mismo
que específicamente se une a un epitopo de 20P1F12/TMPRSS2, en donde
dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de unión al antígeno posee
una región de unión al antígeno del anticuerpo monoclonal murino
1F9, 2D10, 2F8, 6B11, 3G3, 8C6 y/o 9G8, respectivamente, de modo que
el crecimiento celular desregulado sea inhibido.
Los datos ilustrados en la Figura 7B y la Figura
33 indican que 20TP1F12/TMPRSS2 se expresa en tejido de riñón
normal, pero está regulado por disminución o se expresa a niveles
menores en la mayoría de los tejidos de cáncer de riñón. En un caso
en los experimentos ilustrados en la Figura 33, la expresión en
cáncer de riñón está aumentada en comparación con el tejido normal.
La regulación por disminución de 20P1F12/TMPRSS2 puede de este modo
predisponer a un paciente a desarrollar cáncer de riñón. Por
consiguiente, los métodos terapéuticos para el tratamiento del
cáncer de riñón pueden comprender administrar 20P1F12/TMPRSS2 o
fragmentos funcionales de la misma a pacientes con cáncer de riñón,
o transfectar las células cancerosas con una construcción genética
que expresa 20P1F12/TMPRSS2 (p. ej., terapia génica, mediante
métodos de administración virales o liposomales u otros métodos de
administración conocidos por los expertos en la técnica).
Se proporcionan más abajo métodos terapéuticos y
diagnósticos ilustrativos adicionales relacionados con la invención.
Estos métodos simplemente representan ejemplos típicos descritos en
la presente memoria y de ninguna manera limitan la invención.
La proteína 20P1F12/TMPRSS2 es una
serina-proteasa que puede encontrarse tanto en las
formas secretadas como en las formas asociadas a la superficie
celular y puede estar involucrada en la invasión y metástasis de
cánceres de próstata, vejiga, ovario, pulmón, colon y otros
cánceres. Por consiguiente, 20P1F12/TMFRSS2 puede ser un blanco
ideal para la intervención terapéutica. Según se destaca en la
presente memoria, se descubre que 20P1F12/TMFRSS2 aparece en una
variedad de formas o especies que incluyen especies secretadas y
asociadas a células. Sus especies de proteasa secretada son, por
ejemplo, blancos potenciales de fármacos y anticuerpos, mientras que
las especies asociadas a membrana son, por ejemplo, blancos de
anticuerpos terapéuticos. Por lo tanto, describimos varias
composiciones inmunoterapéuticas y métodos para tratar el cáncer de
próstata, colon, vejiga, pulmón y ovárico y cánceres metastásicos
incluyendo terapia de anticuerpos, vacunas in vivo, y
abordajes de inmunoterapias ex vivo, que utilizan
polinucleótidos y polipéptidos correspondientes a 20P1F12/TMPRSS2 y
anticuerpos anti-20P1F12/TMPRSS2. Un ejemplo típico
en este contexto consiste en un método para inhibir el crecimiento
de una célula neoplásica que expresa 20P1F12/TMPRSS2, que comprende
poner en contacto 20P1F12/TMPRSS2 expresada por la célula
neoplásica con una cantidad efectiva de un anticuerpo
anti-20P1F12/TMRSS2 de modo que el crecimiento de la
célula neoplásica sea inhibido.
En un abordaje, pueden utilizarse anticuerpos
anti-20P1F12/TMPRSS2 para tratar cánceres tales como
cáncer de próstata, vejiga, ovario, pulmón y colon y cánceres
metastásicos. Por ejemplo, el anticuerpo
anti-20P1F12/TMPRSS2 puede introducirse en un
paciente de modo tal que el anticuerpo se una a20P1F12/TMPRSS2 libre
y module su actividad biológica, conduciendo de ese modo a la
inhibición de la invasión del tumor. Alternativamente, el
anticuerpo anti-20P1F12/TMPRSS2 puede introducirse
en un paciente de modo tal que el anticuerpo se una a
20P1F12/TMPRSS2 en las células de cáncer de próstata, vejiga,
ovario, pulmón o colon o células de cáncer metastásico y medie la
destrucción de las células y el tumor. El mecanismo terapéutico de
acción puede incluir citólisis mediada por el complemento,
citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo, alteración de la
función fisiológica de 20P1F12/TMPRSS2 y/o la inhibición de unión
al ligando o vías de transducción de señales. Anticuerpos
anti-20P1F12/TMPRSS2 conjugados a agentes tóxicos
tales como ricina, o a agentes terapéuticos, también pueden
utilizarse terapéuticamente para administrar el agente tóxico o
agente terapéutico directamente a las células tumorales portadoras
de 20P1F12/TMPRSS2 y de ese modo destruir el tumor.
La inmunoterapia para el cáncer que utiliza
anticuerpos anti-20P1F12/TMPRSS2 puede seguir las
enseñanzas generadas a partir de diversos abordajes que se han
empleado exitosamente con respecto a otros tipos de cáncer,
incluyendo, sin limitación, el cáncer de colon (Arlen et
al., 1998, Crit Rev Immunol 18: 133-138),
mieloma múltiple (Ozaki et al., 1997, Blood 90:
3179-3186; Tsunenari et al., 1997, Blood 90:
2437-2444), cáncer gastrico (Kaspizyk et
al., 1992, Cancer Res 52: 2771-2776), linfoma de
células B (Funakoshi et al., 1996, J Immunther Emphasis
Tumor Immunol 19: 93-101), leucemia (Thong et
al., 1996, Leuk Res 20: 581-589), cáncer
colorrectal (Moun et al., 1994, Cancer Res 54:
6160-6166); Velders et al., 1995, Cancer Res
55: 4398-4403) y cáncer de mama (Shepard et
al., 1991, J Clin Immunol 11: 117-127).
Los anticuerpos de 20P1F12/TMPRSS2 pueden
introducirse en un paciente de modo tal que el anticuerpo se una a
20P1F12/TM'RSS2 en las células cancerosas y medie la destrucción de
las células y el tumor y/o inhiba el crecimiento de las células o
el tumor. Los mecanismos por medio de los cuales los anticuerpos
ejercen un efecto terapéutico pueden incluir citólisis mediada por
el complemento, citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo,
modulación de la función fisiológica de 20P1F12/TMPRSS2, inhibición
de la unión del ligando o vías de transducción de señales,
modulación de la diferenciación de células tumorales, alteración de
los perfiles de factores angiogénicos tumorales y/o inducción de la
apoptosis. Los anticuerpos de 20P1F12/TMPRSS2 conjugados a agentes
tóxicos o terapéuticos también pueden utilizarse terapéuticamente
para administrar el agente tóxico o terapéutico directamente a las
células tumorales portadoras de 20P1F12/TMPRSS2.
Aunque la terapia con anticuerpos de
20P1F12TTMPRSS2 puede ser útil para todos los estadios de los
cánceres anteriores, la terapia con anticuerpos puede ser
particularmente apropiada en cánceres de próstata, vejiga, ovario,
pulmón y colon avanzados o metastásicos y/u otros cánceres
metastásicos. La combinación del método de la terapia con
anticuerpos con un régimen de terapia hormonal o quimioterapéutica
puede ser preferible en los pacientes que no han recibido
tratamiento quimioterapéutico, mientras que el tratamiento con la
terapia de anticuerpos puede indicarse a pacientes que hayan
recibido uno o más tratamientos quimioterapéuticos. Además, la
terapia con anticuerpos también puede permitir el uso de
dosificaciones reducidas de hormona concomitante o quimioterapia,
particularmente en pacientes que no toleran muy bien la toxicidad
del agente quimioterapéutico.
Puede desearse que los pacientes sean evaluados
en cuanto a la presencia y nivel de 20P1F12/TMPRSS2, preferiblemente
utilizando evaluaciones inmunohistoquímicas de tejido tumoral, la
detección cuantitativa por imágenes de 20P1F12TMPRSS2 u otras
técnicas capaces de indicar de manera segura la presencia y grado de
expresión. El análisis inmunohistoquímico de biopsias tumorales o
especímenes quirúrgicos puede preferirse para este fin. Se conocen
bien en la técnica métodos para el análisis inmunohistoquímico de
tejidos tumorales.
Los anticuerpos
anti-20P1F12/TMPRSS2 útiles en el tratamiento de
cáncer de próstata, vejiga, ovario, pulmón y colon y otros cánceres
incluyen aquellos que son capaces de iniciar una respuesta inmune
potente contra el tumor y aquellos que son capaces de dirigir la
citotoxicidad. Al respecto, los mAb
anti-20P1F12/TMPRSS2 tales como los descritos en el
Ejemplo 5 pueden provocar lisis de las células tumorales ya sea por
mecanismos de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos o
mediada por complementos (ADCC), en donde ambas requieren una
porción intacta de Fc de la molécula de la inmunoglobulina para la
interacción con los sitios del receptor Fc de las células efectoras
o proteínas del complemento. Además, los mAb
anti-20P1F12/TMPRSS2 que ejercen un efecto
biológico directo sobre el crecimiento tumoral son útiles en la
práctica de la invención. Los mecanismos potenciales por medio de
los cuales dichos mAb citotóxicos directamente pueden actuar
incluyen la inhibición del crecimiento celular, modulación de la
diferenciación celular, modulación de perfiles de factores
angiogénicos tumorales y la inducción de la apoptosis. El mecanismo
por el cual un mAb particular anti-20P1F12/TMPRSS2
ejerce un efecto anti-tumoral puede evaluarse
utilizando cualquier cantidad de ensayos in vitro diseñados
para determinar ADCC y lisis celular mediada por el complemento, así
como inhibición del crecimiento, modulación de la apoptosis e
inhibición de la diferenciación, y/o inhibición de la angiogénesis,
tal como se conoce en general en la técnica.
\newpage
Un mecanismo potencial adicional por el cual los
anticuerpos tales como 1F9, 2D10, 2F8, 6B11, 3G3, 8C6 y 9G8 pueden
inhibir el avance de los cánceres tales como cánceres de próstata,
vejiga, ovario, pulmón y colon y cánceres metastásicos es por
modulación de la actividad de proteasa de, por ejemplo, la especie
20P1F12/TMPRSS2 de 32 kD hallada en el suero de individuos que
sufren de cáncer de próstata y colon (véase, p. ej., las Figs. 23 y
25). Este descubrimiento de que una forma secretada de
20P1F12/TMPRSS2 se encuentra en los sueros de individuos que sufren
de cáncer de próstata y colon proporciona evidencia de que esta
molécula puede localizarse mediante métodos terapéuticos
extracelulares. En este contexto, se ha demostrado que el uso de
anticuerpos para inhibir la función de la proteasa asociada a
procesos oncogénicos inhibe procesos oncogénicos tales como
metástasis (véase, p. ej., Mueller et al., P.N.A.S.
89(24): 11832-11836 (1992); Waghray et
al., Clin. Cancer Res. 1(7): 747-753
(1995)). Además de los anticuerpos, las moléculas pequeñas que
modulan la actividad de proteasa también pueden inhibir el avance
de los procesos oncogénicos y pueden ser útiles para, por ejemplo,
la terapia anti-metastásica en pacientes con
diversos cánceres (véase, p. ej., McMillan et al., Int. J.
Cancer 67(4): 523-531 (1996); Morikawa et
al., Nippon Ika Daigaku Zasshi 62(4):
320-328 (1995)). El diseño racional de los
inhibidores de proteasa es conocido en la técnica (véase, p. ej.,
Wagner et al., J. Med. Chem. 41(19):
3664-3674 (1998); LaLonde et al, J. Med.
Chem. 41(23): 4567-4576 (1998)). Además, la
ruptura auto-catalítica observada (véase el Ejemplo
10 más abajo) puede explotarse para identificar moléculas pequeñas
que inhiben la actividad de 20P1F12/TMPRSS2. Específicamente, las
células pueden hacerse crecer en presencia o ausencia de
inhibidores de moléculas pequeñas para buscar específicamente la
inhibición de la ruptura. Es más, la identificación de moléculas
que pueden interactuar con 20P1F12/TMFRSS2 se trata en detalle más
abajo.
La actividad anti-tumoral de un
anticuerpo anti-20P1F12/TMPRSS2 particular, molécula
pequeña, o combinación de tales moléculas, puede evaluarse in
vivo utilizando un modelo animal apropiado. Por ejemplo, los
modelos xenogénicos de cáncer de próstata en donde los explantes
humanos de cáncer de próstata o los tejidos de xenoinjertos pasados
se introducen en animales inmunocomprometidos, tales como ratones
lampiños o SCID, son apropiados en relación con el cáncer de
próstata y han sido descritos (Klein et al., 1997, Nature
Medicine 3: 402408). Por ejemplo, la Solicitud de Patente PCT
WO98/16628, Sawyers et al, publicada el 23 de abril de 1998,
describe varios modelos de xenoinjertos de cáncer de próstata
humana capaces de recapitular el desarrollo de tumores primarios,
micrometástasis y la formación de metástasis osteoblástica
característica de la enfermedad en estadío tardío. La eficacia
puede predecirse utilizando la inhibición de la formación tumoral,
regresión tumoral, metástasis y similares.
Se debe observar que el uso de anticuerpos
monoclonales murinos u otros anticuerpos monoclonales no humanos,
los mAb quiméricos de humano/ratón, puede inducir respuestas inmunes
moderadas a fuertes en algunos pacientes. En los casos más graves,
dicha respuesta inmune puede llevar a la formación extensiva de
complejos inmunes que, potencialmente, pueden causar insuficiencia
renal. Por consiguiente, los anticuerpos monoclonales preferidos
utilizados en la práctica de los métodos terapéuticos son aquellos
que son completamente humanos o humanizados y que se unen
específicamente al antígeno 20P1F12/TMPRSS2 blanco con alta
afinidad pero exhiben baja o ninguna antigenicidad en el
paciente.
Los métodos descritos contemplan la
administración de mAb anti-20P1F12/TMPRSS2 únicos
así como combinaciones, o "cóteles", de diferentes mAb. Tales
cócteles de mAb pueden tener ciertas ventajas en la medida que los
mismos contengan mAbs que exploten especificidad de diferentes
epitopos, diferentes mecanismos efectores o combinen directamente
los mAb citotóxicos con mAb que dependen de la funcionalidad
efectora inmune . Dichos mAb en combinación pueden exhibir efectos
terapéuticos sinérgicos. Además, la administración de mAb
anti-20P1F12/TMPRSS2 puede combinarse con otros
agentes terapéuticos o terapia radiante, incluyendo, sin limitación,
varios agentes quimioterapéuticos, bloqueadores de andrógenos y
moduladores inmunes (p. ej., IL-2,
GM-CSF). Los mAb
anti-20P1F12/TMPRSS2 pueden administrarse en su
forma "desnuda" o no conjugada o pueden tener agentes
terapéuticos o tóxicos conjugados a ellos.
Los anticuerpos monoclonales
anti-20P1F12/TMPRSS2 utilizados en la práctica de
los métodos descritos pueden formularse en composiciones
farmacéuticas que comprenden un vehículo apropiado para el método de
administración deseado. Los vehículos apropiados incluyen cualquier
material que cuando se combina con los mAb
anti-20P1F12/TMPRSS2 retiene la especificidad y la
función anti-tumoral del anticuerpo y no es reactivo
con los sistemas inmunes del sujeto. Los ejemplos incluyen, sin
limitación, uno cualquiera de un número de vehículos farmacéuticos
estándar tales como soluciones salinas estériles tamponadas con
fosfato, agua bacteriostática y similares.
Las formulaciones de anticuerpos
anti-20P1F12/TMPRSS2 pueden administrarse a través
de cualquier vía capaz de aplicar los anticuerpos al sitio tumoral.
Las vías de administración potencialmente efectivas incluyen, sin
limitación, la intravenosa, intraperitoneal, intramuscular,
intratumoral, intradérmica y similares. La vía de administración
preferida es mediante inyección intravenosa. Una formulación
preferida para la inyección intravenosa comprende los mAb
anti-20P1F12/TMPRSS2 en una solución de agua
bacteriostática con preservadores, agua estéril sin preservadores
y/o diluida en bolsas de cloruro de polivinilo o de polietileno que
contienen Cloruro de Sodio estéril al 0,9% para inyección, USP. La
preparación de mAb anti-20P1F12/TMPRSS2 puede
liofilizarse y conservarse como un polvo estéril, preferiblemente
al vacío, y después puede reconstituirse en agua bacteriostática que
contiene, por ejemplo, alcohol bencílico como preservador, o en agua
estéril previo a la inyección.
El tratamiento en general involucrará la
administración repetida de la preparación de anticuerpos
anti-20P1F12/
TMPRSS2 a través de una vía de administración aceptable tal como inyección intravenosa (IV), típicamente en una dosis en el intervalo de alrededor de 0,1 a alrededor de 10 mg/kg de peso corporal. Las dosis en el intervalo de 10-500 mg de mAb por semana pueden ser efectivas y bien toleradas. Sobre la base de la experiencia clínica con el mAb de herceptina en el tratamiento del cáncer de mama metastásico, una dosis de carga inicial IV de aproximadamente 4 mg/kg de peso corporal del paciente seguida de dosis semanales IV de alrededor de 2 mg/kg de la preparación del mAb anti-20P1F12/TMPRSS2 puede representar un régimen de dosificación aceptable. Preferiblemente, la dosis de carga inicial se administra como una infusión de 90 minutos o más. La dosis de mantenimiento periódica puede administrarse como una infusión de 30 minutos o más, siempre que la dosis inicial haya sido bien tolerada. Sin embargo, tal como el experto en la técnica entenderá, diversos factores influirán sobre el régimen de dosis ideal en un caso particular. Tales factores pueden incluir, por ejemplo, la afinidad de unión y vida útil del mAb o mAbs utilizados, el grado de sobreexpresión de 20P1F12/TMPRSS2 en el paciente, el grado de circulación del antígeno 20P1F12/TMPRSS2 liberado, el nivel deseado de concentración del anticuerpo en estado estacionario, la frecuencia del tratamiento y la influencia de agentes quimioterapéuticos utilizados en combinación con los métodos de tratamiento descritos.
TMPRSS2 a través de una vía de administración aceptable tal como inyección intravenosa (IV), típicamente en una dosis en el intervalo de alrededor de 0,1 a alrededor de 10 mg/kg de peso corporal. Las dosis en el intervalo de 10-500 mg de mAb por semana pueden ser efectivas y bien toleradas. Sobre la base de la experiencia clínica con el mAb de herceptina en el tratamiento del cáncer de mama metastásico, una dosis de carga inicial IV de aproximadamente 4 mg/kg de peso corporal del paciente seguida de dosis semanales IV de alrededor de 2 mg/kg de la preparación del mAb anti-20P1F12/TMPRSS2 puede representar un régimen de dosificación aceptable. Preferiblemente, la dosis de carga inicial se administra como una infusión de 90 minutos o más. La dosis de mantenimiento periódica puede administrarse como una infusión de 30 minutos o más, siempre que la dosis inicial haya sido bien tolerada. Sin embargo, tal como el experto en la técnica entenderá, diversos factores influirán sobre el régimen de dosis ideal en un caso particular. Tales factores pueden incluir, por ejemplo, la afinidad de unión y vida útil del mAb o mAbs utilizados, el grado de sobreexpresión de 20P1F12/TMPRSS2 en el paciente, el grado de circulación del antígeno 20P1F12/TMPRSS2 liberado, el nivel deseado de concentración del anticuerpo en estado estacionario, la frecuencia del tratamiento y la influencia de agentes quimioterapéuticos utilizados en combinación con los métodos de tratamiento descritos.
De manera óptima, los pacientes deben ser
evaluados con respecto al nivel de antígeno 20P1F12TTMPRSS2 liberado
circulante en suero con el fin de contribuir a la determinación del
régimen de dosificación más efectivo y factores relacionados. Tales
evaluaciones también pueden utilizarse con fines de monitoreo a lo
largo de la terapia, y pueden ser útiles para medir el éxito
terapéutico en combinación con la evaluación de otros parámetros
(tales como niveles séricos de PSA en la terapia del cáncer de
próstata).
La invención además se refiere a vacunas para
el cáncer que comprenden una proteína 20P1F12/TMPRSS2 o fragmento
de la misma. El uso de un antígeno tumoral en una vacuna para
generar inmunidad humoral y mediada por células para el uso en
terapia anti-cáncer es bien conocido en la técnica y
se ha empleado en el cáncer de próstata utilizando PSMA humano e
inmunógenos PAP de roedores (Hodge et al., 1995, Int. J.
Cancer 63: 231-237; Fong et al., 1997; J.
Immunol. 159: 3113-3117). Tales métodos pueden
llevarse a la práctica fácilmente empleando una proteína
20P1F12/TMPRSS2 o fragmento de la misma, o una molécula de ácido
nucleico que codifica 20P1F12/TMPRSS2 y vectores recombinantes
capaces de expresar y presentar adecuadamente el inmunógeno
20P1F12/TMPRSS2. En este contexto, puede utilizarse una variedad de
polipéptidos de 20P1F12/TMPRSS2 como inmunógenos incluyendo aquellos
que se dirigen a un dominio específico (tales como el dominio
proteasa en la especie 20P1F12/TMPRSS2 secretada de 32 kD) o uno de
los motivos biológicos tratados más arriba. Según se muestra en el
Ejemplo 5 y la Tabla 2, los inmunógenos de 20P1F12/TMPRSS2 pueden
generar una respuesta inmune a una variedad de epitopos de
20P1F12/TMPRSS2.
Pueden utilizarse sistemas de administración de
genes virales para administrar una molécula de ácido nucleico que
codifica 20P1F12/TMPRSS2. Diversos sistemas de administración de
genes virales que pueden utilizarse en la práctica de este aspecto
de la invención incluyen, sin limitación, virus vacuna, virus de la
viruela aviar, viruela de los canarios, adenovirus, virus de la
gripe, poliovirus, virus adeno-asociados, lentivirus
y virus sindbus (Restifo, 1996, Curr. Opin. immunol. 8:
658-663). También pueden emplearse sistemas de
administración no virales utilizando ADN desnudo que codifica una
proteína 20P1F12/TMPRSS2 o fragmento de la misma introducido en el
paciente (p. ej., por vía intramuscular) para inducir una respuesta
anti-tumoral. En un ejemplo puede emplearse el ADNc
humano de 20P1F12/TMPRSS2 de longitud completa. En otro ejemplo
pueden emplearse moléculas de ácido nucleico de 20P1F12/TMPRSS2 que
codifican epitopos de linfocitos T citotóxicos específicos (CTL).
Los epitopos de CTL pueden determinarse utilizando algoritmos
específicos (p. ej., Epimer, Brown University) para identificar
péptidos dentro de una proteína 20P1F12/TMPRSS2 que es capaz de
unirse de manera óptima a alelos HLA especificados.
También pueden emplearse diversas estrategias
ex vivo. Un abordaje incluye el uso de células dendríticas
para presentar el antígeno de 20P1F12/TMPRSS2 al sistema inmune de
un paciente. Las células dendríticas expresan MHC clase I y II,
coestimulador B7 e 1L-12, y de este modo son células
presentadoras del antígeno altamente especializadas. En el cáncer
de próstata, se están utilizando células dendríticas autólogas
pulsadas con péptidos del antígeno de membrana específico de la
próstata (PSMA) en un ensayo clínico de Fase I para estimular los
sistemas inmunes de los pacientes con cáncer de próstata (Tjoa et
al., 1996, Prostate 28: 65-69; Murphy et
al., 1996, Prostate 29: 371-380). Pueden
utilizarse células dendríticas para presentar los péptidos
20P1F12/TMPRSS2 a células T en el contexto de moléculas MHC clase I
y II. En un ejemplo, las células dendríticas autólogas son pulsadas
con péptidos de 20P1F12/TMPRSS2 capaces de unirse a las moléculas
MHC. En otro ejemplo, las células dendríticas son pulsadas con la
proteína completa 20P1F12/TMPRSS2. Inclusive otro ejemplo incluye
manipular genéticamente la sobreexpresión del gen 20P1F12/TMPRSS2
en células dendríticas utilizando diversos vectores de
implementación conocidos en la técnica, tales como adenovirus
(Arthur et al., 1997, Cancer Gene Ther. 4:
17-25), retrovirus (Henderson et al., 1996,
Cancer Res. 56: 3763-3770), lentivirus, virus
adeno-asociados, transfección de ADN (Ribas et
al., 1997, Cancer Res. 57: 2865-2869) y
transfección de ARN obtenido de tumores (Ashley et al., 1997,
J. Exp. Med. 186: 1177-1182).
También pueden utilizarse anticuerpos
anti-idiotípicos
anti-20P1F12/TMPRSS2 en la terapia
anti-cáncer como vacuna para inducir una respuesta
inmune a células que expresan una proteína 20P1F12/TMPRSS2.
Específicamente, la generación de anticuerpos
anti-idiotípicos es bien conocida en la técnica y
puede adaptarse fácilmente para generar anticuerpos
anti-idiotípicos
anti-20P1F12/TMPRSS2 que imitan un epitopo en una
proteína 20P1F12/TMPRSS2 (véase, por ejemplo, Wagner et al.,
1997, Hybridoma 16: 33-40; Foon et al., 1995,
J Clin Invest 96: 334-342; Herlyn et al.,
1996, Cancer Immunol Immunother 43: 65-76). Tal
anticuerpo anti-idiotípico puede utilizarse en
terapia anti-idiotípica tal como se practica
actualmente con otros anticuerpos anti-idiotípicos
dirigidos contra antígenos tumorales.
Pueden emplearse métodos de inmunización
genética para generar respuestas inmunes celulares y humorales
profilácticas o terapéuticas dirigidas contra células cancerosas
que expresan 20P1F12/TMPRSS2, particularmente células de cáncer de
próstata, vejiga, ovario, pulmón y colon y células de cáncer
metastásico. Construcciones que comprenden ADN que codifica una
proteína/inmunógeno de 20P1F12/TMPRSS2 y secuencias reguladoras
apropiadas pueden inyectarse directamente en el músculo o piel de
un individuo, de manera tal que las células del músculo o piel
capten la construcción y expresen la proteína/inmunogén de
20P1F12/TMPRSS2 codificado. La proteína/inmunógeno de
20P1F12/TMPRSS2 puede expresarse como una proteína de superficie
celular o puede secretarse. La expresión de la proteína/inmunogén
de 20P1F12/TMPRSS2 da lugar a la generación de inmunidad celular y
humoral profiláctica o terapéutica contra el cáncer de próstata,
vejiga, ovario, pulmón y colon y cáncer metastásico. Pueden
utilizarse diversas técnicas de inmunización genética profilácticas
o terapéuticas conocidas en la técnica (a modo de revisión, véase la
información y referencias publicadas en la dirección de Internet
www.genweb.com).
Los ejemplos típicos relacionados con la
invención consisten en una composición para vacuna para el
tratamiento de un cáncer que expresa 20P1F12/TMPRSS2, que comprende
una porción inmunogén de un polipéptido de 20P1F12/TMPRSS2 y un
vehículo fisiológicamente aceptable. Un aspecto relacionado consiste
en el método para modular el crecimiento de una célula que expresa
20P1F12/TMPRSS2 en un paciente, que comprende administrar al
paciente una cantidad efectiva de la vacuna.
La descripción además incluye diversos métodos y
composiciones para inhibir la unión de 20P1F12/TMPRSS2 a su pareja
de unión o ligando, o su asociación con otra(s)
proteína(s) así como métodos para inhibir la función de
20P1F12/TMPRSS2. En un abordaje, los vectores recombinantes que
codifican anticuerpos de cadena única que específicamente se unen a
20P1F12/TMPRSS2 pueden introducirse en células que expresan
20P1F12/TMPRSS2 a través de tecnologías de transferencia génica, en
donde el anticuerpo anti-20P1F12/TMPRSS2 codificado
de cadena única se expresa intracelularmente, se une a la proteína
20P1F12/TMPRSS2, y de ese modo inhibe su función. Se conocen bien
métodos para manipular genéticamente dichos anticuerpos
intracelulares de cadena única. Dichos anticuerpos intracelulares,
también conocidos como "intracuerpos", pueden dirigirse
específicamente a un compartimiento particular dentro de la célula,
proporcionado control sobre dónde se focalizará la actividad
inhibidora del tratamiento. Esta tecnología se ha aplicado
exitosamente en la técnica (a modo de revisión, véase Richardson y
Marasco, 1995, TIBTECH vol. 13). Se ha demostrado que los
intracuerpos eliminan virtualmente la expresión de receptores de la
superficie celular de otro modo abundantes. Véase, por ejemplo,
Richardson et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:
3137-3141; Beerli et al., 1994, J. Biol.
Chem. 289: 23931-23936; Deshane et al., 1994,
Gene Ther. 1: 332-337.
Los anticuerpos de cadena única comprenden los
dominios variables de la cadena pesada y liviana unidos por un
polipéptido conectorflexible, y se expresan como un único
polipéptido. Opcionalmente, los anticuerpos de cadena única pueden
expresarse como un fragmento de región variable de cadena única
unido a la región constante de cadena liviana. Pueden manipularse
señales de tráfico intracelular bien conocidas en vectores de
polinucleótidos recombinantes que codifican dichos anticuerpos de
cadena única a fin de localizar con precisión el intracuerpo
expresado en el compartimiento intracelular deseado. Por ejemplo,
los intracuerpos dirigidos al retículo endoplasmático (RE) pueden
manipularse genéticamente para incorporar un péptido líder y,
opcionalmente, una señal de retención del RE
C-terminal, tal como el motivo de los aminoácidos
KDEL. Los intracuerpos que tienen el objeto de ejercer una
actividad en el núcleo pueden manipularse genéticamente para incluir
una señal de localización nuclear. Restos de lípidos pueden unirse
a los intracuerpos con el fin de sondear el intracuerpo al lado
citosólico de la membrana plasmática. Los intracuerpos también
pueden dirigirse para ejercer su función en el citosol. Por
ejemplo, los intracuerpos citosólicos pueden utilizarse secuestrar
factores dentro del citosol, evitando de ese modo que sean
transportados a su destino celular natural.
En un ejemplo, los intracuerpos pueden
utilizarse para capturar 20P1F12/TMPRSS2 en el núcleo, evitando de
ese modo su actividad dentro del núcleo. Pueden manipularse
genéticamente señales de localización nuclear en dichos
intracuerpos de 20P1F12/TMPRSS2 con el fin de lograr la localización
deseada. Dichos intracuerpos de 20P1F12/TMPRSS2 pueden diseñase
para unirse específicamente a un dominio particular de
20P1F12/TMPRSS2. En otro ejemplo, los intracuerpos citosólicos que
se unen específicamente a la proteína 20P1F12/TMPRSS2 pueden
utilizarse para evitar que 20P1F12/TMPRSS2 gane acceso al núcleo,
evitando de ese modo que el mismo ejerza cualquier actividad
biológica dentro del núcleo (p. ej., evitando que 20P1F12/TMPRSS2
forme complejos de transcripción con otros factores).
Con el fin de dirigir específicamente la
expresión de dichos intracuerpos a células tumorales particulares,
la transcripción del intracuerpo puede ubicarse bajo el control
regulador de un promotor y/o mejorador apropiado específico del
tumor. Con el fin de dirigir la expresión del intracuerpo
específicamente a la próstata, por ejemplo, puede utilizarse el
promotor y/o el promotor/mejorador del PSA (Véase, por ejemplo, la
Patente Estadounidense No. 5.919.652).
En otro abordaje, se utilizan moléculas
recombinantes que son capaces de unirse a 20P1F12/TMPRSS2, evitando
de ese modo que 20P1F12/TMPRSS2 acceda/se una a su(s)
pareja(s) de unión o se asocie a otra(s)
proteína(s), para inhibir la función de 20P1F12/TMPRSS2.
Dichas moléculas recombinantes pueden, por ejemplo, contener
la(s) parte(s)
reactiva(s) de una molécula específica del anticuerpo de 20P1F12/TMPRSS2. En un ejemplo particular, el dominio de unión de 20P1F12/TMPRSS2 de una pareja de unión de 20P1F12/TMPRSS2 puede manipularse genéticamente en una proteína de fusión dimérica que comprende dos dominios de unión al ligando de 20P1F12/TMPRSS2 unidos a la porción Fc de una IgG humana, tal como la lgG1 humana. Dicha porción de IgG puede contener, por ejemplo, los dominios C_{H}2 y C_{H}3 y la región bisagra, pero no el dominio C_{H}1. Dichas proteínas de fusión diméricas pueden administrarse en forma soluble a pacientes que sufren de un cáncer asociado a la expresión de 20P1F12/TMPRSS2, incluyendo, sin limitación, cánceres de próstata, vejiga, ovario, pulmón y colon, y cánceres metastásicos, donde la proteína de fusión dimérica específicamente se une a 20P1F12/TMPRSS2, bloqueando de ese modo la interacción de 20P1F12/TMPRSS2 con una pareja de unión. Dichas proteínas de fusión diméricas además pueden combinarse para dar proteínas multiméricas utilizando conocidas tecnologías de enlace de anticuerpos.
reactiva(s) de una molécula específica del anticuerpo de 20P1F12/TMPRSS2. En un ejemplo particular, el dominio de unión de 20P1F12/TMPRSS2 de una pareja de unión de 20P1F12/TMPRSS2 puede manipularse genéticamente en una proteína de fusión dimérica que comprende dos dominios de unión al ligando de 20P1F12/TMPRSS2 unidos a la porción Fc de una IgG humana, tal como la lgG1 humana. Dicha porción de IgG puede contener, por ejemplo, los dominios C_{H}2 y C_{H}3 y la región bisagra, pero no el dominio C_{H}1. Dichas proteínas de fusión diméricas pueden administrarse en forma soluble a pacientes que sufren de un cáncer asociado a la expresión de 20P1F12/TMPRSS2, incluyendo, sin limitación, cánceres de próstata, vejiga, ovario, pulmón y colon, y cánceres metastásicos, donde la proteína de fusión dimérica específicamente se une a 20P1F12/TMPRSS2, bloqueando de ese modo la interacción de 20P1F12/TMPRSS2 con una pareja de unión. Dichas proteínas de fusión diméricas además pueden combinarse para dar proteínas multiméricas utilizando conocidas tecnologías de enlace de anticuerpos.
Dentro de otra clase de abordajes terapéuticos,
describimos diversos métodos y composiciones para inhibir la
transcripción del gen 20P1F12/TMPRSS2. De manera similar, la
descripción también proporciona métodos y composiciones para inhibir
la traducción del ARNm de 20P1F12/TMPRSS2 a proteína.
En un abordaje, un método para inhibir la
transcripción del gen 20P1F12/TMPRSS2 comprende poner en contacto
el gen 20P1F12/TMPRSS2 con un polinucleótido antisentido de
20P1F12/TMPRSS2 según se ilustra en el Ejemplo 14. En otro
abordaje, un método para inhibir la traducción del ARNm de
20P1F12/TMPRSS2 comprende poner en contacto el ARNm de
20P1F12/TMPRSS2 con un polinucleótido antisentido. En otro abordaje,
puede utilizarse una ribozima específica de 20P1F12/TMPRSS2 para
escindir el mensaje de 20P1F12/TMPRSS2, inhibiendo de ese modo la
traducción. Dichos métodos antisentido y basados en ribozimas
también pueden dirigirse a regiones reguladoras del gen
20P1F12/TMPRSS2, tales como el promotor y/o elementos mejoradores de
20P1F12/TMPRSS2. De manera similar, pueden utilizarse proteínas
capaces de inhibir un factor de transcripción del gen
20P1F12/TMPRSS2 para inhibir la transcripción del ARNm de
20P1F12/TMPRSS2. Los diversos polinucleótidos y composiciones útiles
en los métodos antes mencionados se han descrito más arriba. El uso
de moléculas antisentido y ribozimas para inhibir transcripción y
traducción es bien conocido en la técnica.
Otros factores que inhiben la transcripción de
20P1F12/TMPRSS2 a través de la interferencia con la activación
transcripcional de 20P1F12/TMPRSS2 también pueden ser útiles para
el tratamiento de cánceres que expresan 20P1F12/TMPRSS2. De manera
similar, los factores que son capaces de interferir con el
procesamiento de 20P1F12/TMPRSS2 pueden ser útiles para el
tratamiento de cánceres que expresan 20P1F12/TMPRSS2. Se prevén
métodos de tratamiento del cáncer que utilizan dichos factores.
Pueden utilizarse tecnologías de transferencia
génica y terapia génica para administrar moléculas terapéuticas del
polinucléotido a células tumorales que sintetizan 20P1F12/'TMPRSS2
(es decir, moléculas antisentido, ribozimas, polinucleótidos que
codifican intracuerpos y otras moléculas inhibidoras de
20P1F12/TMPRSS2). En la técnica se conoce una serie de abordajes de
terapia génica. Los vectores recombinantes que codifican
polinucleótidos antisentido de 20P1F12/TMPRSS2, ribozimas, factores
capaces de interferir con la transcripción de 20P1F12/TMPRSS2,
etcétera, pueden administrarse a células tumorales blanco utilizando
dichos abordajes de terapia génica.
Los abordajes terapéuticos anteriores pueden
combinarse con uno cualquiera de una amplia variedad de regímenes
de quimioterapia o terapia radiante. Estos abordajes terapéuticos
también pueden permitir el uso de dosificaciones reducidas de
quimioterapia y/o administración menos frecuente, particularmente en
pacientes que no toleran bien la toxicidad del agente
quimioterapéutico.
La actividad anti-tumoral de una
composición particular (p. ej., antisentido, ribozima, intracuerpo),
o una combinación de tales composiciones, puede evaluarse
utilizando diversos sistemas de ensayo in vitro e in
vivo. Los ensayos in vitro para evaluar el potencial
terapéutico incluyen ensayos de crecimiento celular, ensayos de
agar blando, ensayos de invasión y angiogénicos y otros ensayos
indicativos de actividad promotora de tumores, ensayos de unión
capaces de determinar en qué medida una composición terapéutica
inhibirá la unión de 20P1F12/TMPRSS2 a una pareja de unión, etc.
In vivo, el efecto de una composición
terapéutica de 20P1F12/TMPRSS2 puede evaluarse en un modelo animal
apropiado, Por ejemplo, los modelos de cáncer de próstata
xenogénico en donde los explantes humanos de cáncer de próstata o
tejidos de xenoinjertos pasados se introducen en animales
inmunocomprometidos, tales como ratones lampiños o SCID, son
apropiados con relación al cáncer de próstata y han sido descritos
(Klein et al., 1997, Nature Medicine 3:4021408). Por
ejemplo, la Solicitud de Patente PCT W098116628, Sawyers et
al., publicada el 23 de abril de 1998, describe varios modelos
de xenoinjertos de cáncer de próstata humano capaces de recapitular
el desarrollo de tumores primarios, micrometástasis y la formación
de metástasis osteoblástica característica de la enfermedad en
estadío tardío. La eficacia puede predecirse utilizando ensayos que
miden la inhibición de formación tumoral, regresión del tumor o
metástasis, y similares. Véase, también, los Ejemplos de más
abajo.
Los ensayos in vivo que califican la
promoción de apoptosis también pueden ser útiles en la evaluación de
potenciales composiciones terapéuticas. En un ejemplo, xenoinjertos
de ratones portadores tratados con la composición terapéutica
pueden examinarse para determinar la presencia de focos apoptóticos
y compararse con ratones control portadores de xenoinjertos no
tratados. El grado en el que se encuentran los focos apoptóticos en
los tumores de los ratones no tratados proporciona una indicación de
la eficacia terapéutica de la composición.
Las composiciones terapéuticas utilizadas en la
práctica de los métodos precedentes pueden formularse para dar
composiciones farmacéuticas que comprenden un vehículo apropiado
para el método de administración deseado. Los vehículos apropiados
incluyen cualquier material que al combinarse con la composición
terapéutica retiene la función anti-tumoral de la
composición terapéutica y es no reactivo con el sistema inmune del
paciente. Los ejemplos incluyen, sin limitación, cualquiera de una
serie de vehículos farmacéuticos estándar tales como soluciones
salinas estériles tamponadas con fosfato, agua bacteriostática y
similares (véase, en general, Remington's Pharmaceutical Sciences
16ta. edición., A. Osal., Ed., 1980).
Las formulaciones terapéuticas pueden
solubilizarse y administrarse a través de cualquier vía capaz de
administrar la composición terapéutica al sitio tumoral. Las vías
potencialmente efectivas de administración incluyen, sin
limitación, intravenosa, parenteral, intraperitoneal, intramuscular,
intratumoral, intradérmica, intraorgánica, ortotópica y similares.
Una formulación preferida para la inyección intravenosa comprende la
composición terapéutica en una solución en agua bacteriostática con
preservador, agua estéril sin preservador y/o diluida en bolsas de
cloruro de polivinilo o polietileno que contienen cloruro de sodio
estéril al 0,9% para inyección, USP. Las preparaciones de proteínas
terapéuticas pueden liofilizarse y conservarse como polvos
estériles, preferiblemente al vacío, y después pueden
reconstituirse en agua bacteriostática que contiene, por ejemplo,
alcohol bencílico como preservador, o en agua estéril antes de la
inyección.
Los protocolos de dosificación y administración
para el tratamiento de cánceres utilizando los métodos precedentes
variará con el método y el cáncer a tratar y en general dependerá de
una serie de otros factores apreciados en la técnica.
Un "motivo", como en el motivo biológico de
una proteína relacionada con 20P1F12/TMPRSS2, se refiere a cualquier
patrón de aminoácidos que forma parte de la secuencia primaria de
una proteína, que está asociada a una función particular (p. ej.,
interacción proteína-proteína, interacción
proteína-ADN, etc) o modificación (p. ej., que es
fosforilada, glicosilada o amidada), o localización (p. ej.,
secuencia secretora, secuencia de localización nuclear, etc.) o una
secuencia que se correlaciona con ser inmunogén, ya sea a nivel
humoral o celular. Un motivo puede ser o contiguo o capaz de
alinearse a ciertas posiciones que en general se correlacionan con
una cierta función o propiedad. En el contexto de los motivos HLA,
"motivo" se refiere al patrón de residuos en un péptido de
longitud definida, usualmente un péptido de aproximadamente 8 a
aproximadamente 13 aminoácidos para un motivo HLA de clase I y de
aproximadamente 6 a aproximadamente 25 aminoácidos para un motivo
HLA de clase II, que es reconocido por una molécula HLA particular.
Los motivos peptídicos para la unión de HLA son típicamente
diferentes para cada proteína codificada por cada alelo HLA humano y
difieren en el patrón de los residuos de anclaje primario y
secundario.
Un "residuo de anclaje primario" a HLA es
un aminoácido en una posición específica a lo largo de una secuencia
de péptido que se entiende que proporciona un punto de contacto
entre el péptido inmunogén y la molécula HLA. Uno a tres,
usualmente dos, residuos de anclaje primario dentro de un péptido de
longitud definida en general definen un "motivo" para un
péptido inmunogén. Estos residuos se entiende que encajan en
estrecho contacto con el surco de unión al péptido de una molécula
HLA, con sus cadenas laterales ocultas en bolsillos específicos del
surco de unión. En un ejemplo, los residuos de anclaje primario para
una molécula HLA clase I se ubican en la posición 2 (desde la
posición amino terminal) y en la posición carboxilo terminal de un
epitopo de un péptido de 8, 9, 10, 11, o 12 residuos. En otro
ejemplo, los residuos de anclaje primario de un péptido que se une
a una molécula HLA clase II están espaciados uno con respecto al
otro, en lugar de a los extremos de un péptido, donde el péptido en
general tiene al menos 9 aminoácidos de longitud. Las posiciones de
anclaje primario para cada motivo y supermotivo se exponen en la
Tabla IV. Por ejemplo, pueden crearse péptidos análogos alterando
la presencia o ausencia de restos particulares en las posiciones de
anclaje primario y/o secundario que se muestran en la Tabla IV.
Dichos análogos se utilizan para modular la afinidad
de unión y/o la cobertura de población de un péptido que comprende un motivo o supermotivo HLA particular.
de unión y/o la cobertura de población de un péptido que comprende un motivo o supermotivo HLA particular.
Un "supermotivo" HLA es una especificidad
de unión a péptidos compartida por moléculas HLA codificadas por dos
o más alelos HLA.
Según se utiliza en la presente memoria, una
"vacuna" de respuesta inmune HLA o celular es una composición
que contiene o codifica uno o más péptidos relacionados con la
invención. Existen numerosos ejemplos de tales vacunas, tales como
un cóctel de uno o más péptidos individuales; uno o más péptidos
relacionados con la invención compuestos por un péptido
poliepitópico; o ácidos nucleicos que codifican dichos péptidos
individuales o polipéptidos, p. ej. un minigen que codifica un
péptido poliepitópico. El término "uno o más péptidos" puede
incluir cualquier número de unidades enteras de
1-150 o más, p. ej. al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,
10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,
27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43,
44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100,
105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145 o 150 o más péptidos
relacionados con la invención. Los péptidos o polipéptidos
opcionalmente pueden modificarse, tal como por lipidación, adición
de secuencias de localización u otras. Los péptidos HLA clase I de
la invención pueden mezclarse con, o conectarse a, péptidos HLA
clase II, para facilitar la activación tanto de los linfocitos T
citotóxicos como de los linfocitos T ayudantes. Las vacunas HLA
también pueden comprender células presentadoras de antígenos
pulsadas por péptidos, p. ej. células dendríticas.
Según se define en la presente memoria, las
variantes, análogos u homólogos de 20P1F12/TMPRSS2 poseen el
atributo distintivo de poseer al menos un epitopo que tiene
"reacción cruzada" con una proteína 20P1F12/TMPRSS2. Según se
utiliza en esta oración, "reacción cruzada" significa que un
anticuerpo o célula T que se une específicamente a una variante de
20P1F12/TMPRSS2 también se une específicamente a la proteína
20P1F12/TMPRSS2. Un polipéptido deja de ser una variante de la
proteína 20P1F12/TMPRSS2 cuando ya no contiene ningún epitopo capaz
de ser reconocido por un anticuerpo o célula T que se une
específicamente a la proteína 20P1F12/TMPRSS2. Aquellos expertos en
la técnica comprenden que los anticuerpos que reconocen proteínas se
unen a epitopos de tamaño variable, y una agrupación del orden de
aproximadamente cuatro o cinco aminoácidos, contiguos o no, se
considera un número típico de aminoácidos en un epitopo mínimo.
Véase, p. ej., Nair et al., J. Immunol 2000165(12):
6949-6955; Hebbes et al., Mol Immunol. (1989)
26(9):865-73; Schwartz et al., 7
Immunol (1985) 135(4)2598-608.
Los ejemplos ilustrativos adicionales descritos
en la presente memoria incluyen polipéptidos de
20P1F12/
TMPRSS2 que comprenden los restos de aminoácidos de uno o más de los motivos biológicos contenidos dentro de la secuencia polipeptídica de 20P1F12/TMPRSS2. En la técnica se conocen diversos motivos, y una proteína puede evaluarse para determinarla presencia de dichos motivos mediante una serie de sitios de Internet públicamente disponibles (véase, p. ej., direcciones URL: pfam.wustl.edu/; searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq-search/struc-predict.htmlpsort.ims.u-tokyo.ac.ip/; www.cbs.dtu.dk/; www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html; www.expasy.ch/tools/
scnpsit1.html; Epimatrix^{TM} y Epimer^{TM}, Brown University, www.brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/
epimatrix.html; y BIMAS, bimas.dert.nih.gov/.).
TMPRSS2 que comprenden los restos de aminoácidos de uno o más de los motivos biológicos contenidos dentro de la secuencia polipeptídica de 20P1F12/TMPRSS2. En la técnica se conocen diversos motivos, y una proteína puede evaluarse para determinarla presencia de dichos motivos mediante una serie de sitios de Internet públicamente disponibles (véase, p. ej., direcciones URL: pfam.wustl.edu/; searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq-search/struc-predict.htmlpsort.ims.u-tokyo.ac.ip/; www.cbs.dtu.dk/; www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html; www.expasy.ch/tools/
scnpsit1.html; Epimatrix^{TM} y Epimer^{TM}, Brown University, www.brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/
epimatrix.html; y BIMAS, bimas.dert.nih.gov/.).
Los polipéptidos que comprenden uno o más de los
motivos de 20P1F12/TMPRSS2 tratados más arriba son útiles para
dilucidar las características específicas de un fenotipo maligno en
vista de la observación de que la regulación de 20P1F12/TMPRSS2
está alterada en ciertos cánceres. La caseína quinasa II, el AMPc y
la proteína quinasa dependiente del AMPc, y la Proteína Quinasa C,
por ejemplo, son enzimas que se sabe están asociadas al desarrollo
del fenotipo maligno (véase, p. ej., Chen et at, Lab Invest.,
78(2): 165-174 (1998); Gaiddon et
al., Endocrinology 136(10): 4331-4338
(1995); Hall et at, Ácidos nucleicos Research 24(6):
1119-1126 (1996); Peterziel et al., Oncogene
18(46): 6322-6319 (1999) y O'Brian, Oncol.
Rep. 5(2): 305-309 (1998)). Es más, tanto la
glicosilación como la miristoilación son modificaciones de proteínas
también asociadas al cáncer y al avance del cáncer (véase, p. ej.,
Dennis et at, Biochem. Biophys. Acta
1473(1):21-34 (1999); Raju et al.,
Exp. Cell Res. 235(1): 145-154 (1997)). La
amidación es otra modificación de la proteína también asociada al
cáncer y al avance del cáncer (véase, p. ej., Treston et al.,
J. Natl. Cancer Inst. Monogr. 13): 169-175
(1992)).
En otro ejemplo, las proteínas comprenden uno o
más de los epitopos inmunorreactivos identificados de conformidad
con métodos aceptados por la técnica. Los epitopos CTL pueden
determinarse utilizando algoritmos específicos para identificar
péptidos dentro de una proteína 20P1F12/TMPRSS2 que es capaz de
unirse a alelos HLA especificados de manera óptima
(Epimatrix^{TM} y Epimer^{TM}, Brown University, URL
www.brown.edri/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html;
y BIMAS, URL bimas.dert.nib.gov/.) Más aún, los procesos para
identificar péptidos que poseen suficiente afinidad de unión para
las moléculas HLA y que se correlacionan con ser epitopos
inmunogenes, son bien conocidos en la técnica, y se llevan a cabo
sin experimentación indebida. Además, los procesos para identificar
péptidos que son epitopos inmunogenes, son bien conocidos en la
técnica, y se llevan a cabo sin experimentación indebida ya sea
in vitro o in vivo.
También se conocen en la técnica los principios
para crear análogos de dichos epitopos con el fin de modular la
inmunogenicidad. Por ejemplo, se comienza con un epitopo que posee
un motivo CTL o HTL (véase, p. ej., los motivos/supermotivos HLA
clase I y HLA clase II de la Tabla IV). El epitopo se convierte en
análogo sustituyendo un aminoácido en una de las posiciones
especificadas, y reemplazándolo con otro aminoácido especificado
para esa posición.
Una variedad de referencias reflejan la técnica
con respecto a la identificación y generación de epitopos en una
proteína de interés así como análogos de los mismos. Véase, por
ejemplo, WO 9733602 para Chesnut et al.; Sette,
Immunogenetics 1999 50(3-4):
201-212; Sette et al., J. Immunol. 2001
166(2): 1389-1397; Sidney et al.,
Hum.. Immunol. 1997 58(1): 12-20; Kondo et
al., Immunogenetics 1997 45(4): 249-258;
Sidney et al., J. Immunol. 1996 157(8):
3480-90; y Falk et al., Nature 351:
290-6 (1991); Hunt et al., Science
255:1261-3 (1992); Parker et al., J.
Immunol. 149:3580-7 (1992); Parker et al., J.
Immunol. 152:163-75 (1994)); Kast et al.,
1994 152(8): 3904-12;
Borras-Cuesta et al., Hum. Immunol. 2000
61(3):266-278; Alexander et al., J.
Immunol. 2000 164(3);164(3):
1625-1633; Alexander et al., PMID: 7895164,
UI: 95202582; O'Sullivan et al., J. Immunol. 1991
147(8): 2663-2669; Alexander et al.,
Immunity 1994 1(9): 751-761 y Alexander et
al., Immunol. Res. 1998 18(2):
79-92.
Los ejemplos relacionados incluyen polipéptidos
que comprenden combinaciones de los diferentes motivos conforme a
lo determinado por los procedimientos arriba referenciados, y/o uno
o más de los epitopos CTL previstos conforme a lo determinado por
los procedimientos arriba referenciados, y/o uno o más de los
motivos de unión a células T conocidos en la técnica. Los ejemplos
preferidos no contienen ninguna inserción, supresión o sustitución
ya sea dentro de los motivos o las secuencias intervinientes de los
polipéptidos. Además, pueden ser deseables ejemplos que incluyen
una serie de residuos de aminoácidos ya sea N- terminales y/o
C-terminales en cualquier lado de estos motivos
(para, por ejemplo, incluir una mayor porción de la arquitectura
polipeptídica en la que se ubica el motivo). Típicamente, el número
de residuos de aminoácido N-terminales N y/o
C-terminales en cualquier lado de un motivo está
entre aproximadamente 1 a aproximadamente 100 residuos de
aminoácidos, preferiblemente 5 a aproximadamente 50 residuos de
aminoácidos.
Las proteínas relacionadas con 20P1F12/TMPRSS2
se ejemplifican en muchas formas, preferiblemente en forma aislada.
Una molécula de proteína 20P1F12/TMPRSS2 purificada sustancialmente
estará libre de otras proteínas o moléculas que perjudiquen la
unión de 200P1F12/TMPRSS2 con un anticuerpo, célula T u otro
ligando. La naturaleza y grado de aislamiento y purificación
dependerá del uso previsto. Los ejemplos de proteínas relacionadas
con 20P1F12/TMPRSS2 incluyen proteínas purificadas relacionadas con
20P1F12/TMPRSS2 y proteínas funcionales y solubles relacionadas con
20P1F12/TMPRSS2. En un ejemplo, una proteína 20P1F12/TMPRSS2
funcional y soluble o fragmento de la misma retiene la capacidad de
unirse a un anticuerpo, célula T u otro ligando.
La descripción también proporciona proteínas
20P1F12/TMPRSS2 que comprenden fragmentos biológicamente activos de
la secuencia de aminoácidos de 20P1F12/TMPRSS2. Dichas proteínas
exhiben propiedades de la proteína 20P1F12/TMPRSS2, tales como la
capacidad para provocar la generación de anticuerpos que
específicamente se unen a un epitopo asociado a la proteína
20P1F12/TMPRSS2; para unirse con dichos anticuerpos; para provocar
la activación de HTL o CTL; y/o para ser reconocida por HTL o
CTL.
Los polipéptidos relacionados con
20P1F12/TMPRSS2 que contienen estructuras particularmente
interesantes pueden predecirse y/o identificarse utilizando
diversas técnicas analíticas bien conocidas en la técnica,
incluyendo, por ejemplo, los métodos de análisis de
Chou-Fasman, Garnier-Robson,
Kyte-Doolittle, Eisenberg,
Karplus-Schultz o Jameson-Wolf, o
sobre la base de la inmunogenicidad. Los fragmentos que contienen
dichas estructuras son particularmente útiles en generar
anticuerpos anti-20P1F12/TMPRSS2 específicos de la
sub-unidad o células T, o en identificar factores
celulares que se unen a 20P1F12/TMPRSS2.
Los epitopos CTL pueden determinarse utilizando
algoritmos específicos para identificar péptidos dentro de una
proteína 20P1F12/TMPRSS2 que son capaces de unirse de manera óptima
a alelos HLA especificados (p. ej., utilizando el sitio SYFPEITHI
en la Red Global Mundial URL
syfpeithi.bmi-heidelberg.com/; Epimatrix^{TM} y
Epimer^{TM}, Brown University, URL
(www.brown.edu/Research/TB-HIV_
Lab/epimatrix/epimatrix.html); y BIMAS, URL bimas.dcrt.nih.gov/). A
modo de ilustración, pueden predecirse los epitopos de péptidos de
20P1F12/TMPRSS2 que se presentan en el contexto de moléculas MHC
humanas clase I HLA-A1, A2, A3, A11, A24, B7 y B35.
Específicamente, la secuencia completa de aminoácidos de la
proteína 20P1F12/TMPRSS2 se ingresa en el algoritmo de Búsqueda de
Motivos de Péptidos HLA que se encuentra en el sitio web de
Bioinformatics and Molecular Analysis Section (BIMAS) detallado más
arriba. El algoritmo de búsqueda de motivo a de Péptidos HLA fue
desarrollado por el Dr. Ken Parker sobre la base de la unión de
secuencias peptídicas específicas en el surco de las moléculas HLA
Clase I, en particular HLA-A2, (véase, p. ej., Falk
et al., Nature 351: 290-6 (1991); Hunt et
al., Science 255:1261-3 (1992); Parker et
al., J. Immunol. 149:3580-7 (1992); Parker et
al:, J. Inmunol. 152:163-75 (1994)). Este
algoritmo permite la ubicación y clasificación de péptidos
octaméricos, nonaméricos y decaméricos a partir de una secuencia
proteica completa para la unión prevista a HLA-A2
así como numerosas otras moléculas HLA Clase I. Muchos péptidos de
unión a HLA clase I son octa-, nona-, deca- o undecámeros. Por
ejemplo, para HLA-A2 clase I, los epitopos
preferiblemente contienen una leucina (L) o metionina (M) en la
posición 2 y una valina (V) o leucina (L) en el extremo
C-terminal (véase, p. ej., Parker et al., J.
Inmunol. 149:3580-7 (1992)). Los resultados de
péptidos de unión predichos de 20P1F12/TMPRSS2 pueden clasificarse
por puntaje de unión estimado. El puntaje de unión corresponde a la
vida media estimada de disociación de complejos que contienen el
péptido a 37ºC, a pH 6,5. Se prevé que los péptidos con puntaje de
unión más alto son los que se unen más estrechamente a HLA Clase I
en la superficie celular durante el mayor período de tiempo y de
este modo representan los mejores blancos inmunogenes para el
reconocimiento de células T.
La unión real de los péptidos a un alelo HLA
puede evaluarse mediante estabilización de la expresión de HLA en
la línea celular T2 defectuosa en el procesamiento de antígenos
(véase, p. ej., Xue et al., Prostate 30:73-8
(1997) y Peshwa et al., Prostate 36:129-38
(1998)). La inmunogenicidad de péptidos específicos puede evaluarse
in vitro por estimulación de linfocitos T citotóxicos CD8+
(CTL) en presencia de células presentadoras de antígenos tales como
células dendríticas.
Se debe apreciar que epitopo predicho por el
sitio BIMAS, sitios de Epimer^{TM} y Epimatrix^{TM}, o
especificado por los motivos HLA clase I o clase II disponibles en
la técnica o que se vuelvan parte de la técnica, tal como se
determina utilizando el sitio de Red Global Mundial URL
syfpeithi.brniheidelberg.com/, debe ser "aplicado" a la
proteína 20P1F12/TMPRSS2. Según se utiliza en este contexto,
"aplicado" significa que la proteína 20P1F12/TMPRSS2 se
evalúa, p. ej., visualmente o por métodos de descubrimiento de
patrones sobre basados en la computadora, tal como es apreciado por
los expertos en la técnica relevante. Se contempla cada subsecuencia
de 20P1F12/TMPRSS2 de 8, 9, 10 u 11 residuos de aminoácidos que
posee un motivo HLA Clase I, o una subsecuencia de 9 o más residuos
de aminoácidos que posee un motivo HLA Clase II.
El mecanismo mediante el cual las células T
reconocen antígenos ha sido delineado. Composiciones eficaces de
vacuna de epitopo de péptido de la invención inducen respuestas
inmunes terapéuticas o profilácticas en segmentos muy amplios de la
población global mundial. Para una comprensión del valor y eficacia
de las composiciones de la invención que inducen respuestas inmunes
celulares, se proporciona una breve revisión de tecnología
relacionada con la inmunología.
Un complejo de una molécula HLA y un antígeno
peptídico actúa como ligando reconocido por células T restringidas
a HLA (Buns, S. et al., Cell 47:1071, 1986; Babbitt, B. P.
et al., Nature 317:359, 1985; Townsend, A. y Bodmer, H.,
Annu. Rev. Immunol. 7:601, 1989; Germain, R. N., Annu. Rev.
Immunol. 11:403, 1993). A través del estudio de análogos de
antígenos sustituidos por un único aminoácido y la secuenciación de
péptidos procesados naturalmente, unidos endógenamente, se han
identificado los residuos críticos que corresponden a los motivos
requeridos para la unión específica a las moléculas de antígenos
HLA y se exponen en la Tabla IV (véase también, p. ej., Southwood,
et al., J. Immunol. 160:3363, 1998; Rammensee, et al,
Immumogenetics 41:178, 1995; Rammensee et al., SYFPEXTHI,
acceso a través de la Red Global Mundial en URL
syfpeithi.bmi-heidelberg.com/; Sette, A. y Sidney,
J. Curr. Opus. immunol. 10:478, 1998; Engelhard, V. H., Curr. Opin.
Immunol. 6:13. 1994; Sette, A. y Grey, H. M., Curr Opin. Immunol.
4:79, 1992; Sinigaglia, F. y Hammer, J. Curr. Biol. 6:52, 1994;
Ruppert et al., Cell 74:929-937, 1993; Kondo
et al., Immunol. 155:4307-4312, 1995; Sidney
et al., J. Zemmol. 157:3480-3490, 1996;
Sidney et al., Human Immunol. 45:79-93, 1996;
Sette, A. y Sidney, J. Immunogenetics noviembre de 1999;
50(34):201-12, Review).
Además, los análisis cristalográficos de rayos x
de los complejos HLA-péptido han revelado bolsillos
dentro del hueco/hendidura de unión al péptido de las moléculas HLA
que acomodan, de un modo específico del alelo, los residuos
transportados por los ligandos del péptido; estos residuos a su vez
determinan la capacidad de unión a HLA de los péptidos en los que
están presentes. (Véase, p. ej., Madden, D.R. Anne. Rev. Immunol.
13:587. 1995; Smith, et al, Immunity 4:203, 1996; Fremont
et al., Immunity 8:305, 1998; Stern et al., Structure
2:245, 1994; Jones, E.Y. Curr. Opin, Immunol. 9:75, 1997; Brown, J.
H. et al., Nature 364:33, 1993; Guo, H. C. et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8053, 1993; Guo, H. C. et al.,
Nature 360:364, 1992; Silver, M. L. et al., Nature
360:367.1992; Matsumura, M. et al., Science 257:927, 1992;
Madden et al., Cell 70:1035, 1992; Fremont, D. H. et
al., Science 257:919, 1992; Saper, M. A., Bjorkman, P. J. y
Wiley, D. C., J. Mol. Biol. 219:277,1991.)
Por consiguiente, la definición de motivos de
unión a HLA específicos del alelo clase I y clase II, o supermotivos
clase I o clase II permite la identificación de regiones dentro de
una proteína que se correlacionan con la unión a (un)
antígeno(s) HLA particular(es).
De este modo, mediante un proceso de
identificación de motivos HLA, se han identificado candidatos para
vacunas basadas en epitopos; dichos candidatos además pueden
evaluarse mediante ensayos de unión al péptido HLA para determinar
la afinidad de unión y/o el período de tiempo de asociación del
epitopo y su molécula HLA correspondiente. Puede realizarse trabajo
adicional confirmatorio para seleccionar, entre estos candidatos a
vacuna, epitopos con características preferidas en términos de
cobertura de población y/o inmunogenicidad.
Se pueden utilizar diversas estrategias para
evaluar la inmunogenicidad celular, incluyendo:
1) Evaluación de cultivos de células T primarias
de individuos normales (véase, p. ej., Wentworth, P. A et
al., Mol. Immunol. 32:603, 1995; Celis, E. et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 91:2105,1994; Tsai, V. et al., J.
Immunol. 155:1796,1997; Kawashima, I. et al., Human Immunol.
59:1,1998). Este procedimiento implica la estimulación de
linfocitos sanguíneos periféricos (PBL) de sujetos normales con un
péptido de prueba en presencia de células presentadoras de
antígenos in vitro por un período de varias semanas. Las
células T específicas para el péptido se activan durante este
período y se detectan utilizando, p. ej., ensayo de liberación de
linfoquina o de ^{51}Cr que involucra a células blanco
sensibilizadas con el péptido.
2) Inmunización de ratones transgénicos HLA
(véase, p. ej., Wentworth, P. A. et al., J. Immunol. 26:97,
1996; Wentworth, P. A. et al., Int. Immunol. 8:651, 1996;
Alexander, J. et al., J. Immunol. 159:4753, 1997). Por
ejemplo, en dichos métodos se administran en forma subcutánea
péptidos en adyuvante incompleto de Freund a ratones transgénicos
HLA. Varias semanas después de la inmunización, se extraen
esplenocitos y se cultivan in vitro en presencia del péptido
de prueba durante aproximadamente una semana. Las células T
específicas del péptido se detectan utilizando, p. ej., un ensayo
de liberación de ^{51}Cr que involucra células blanco
sensibilizadas con el péptido y células blanco que expresan el
antígeno generado en forma endógena.
3) Demostración de las respuestas de células T
de memoria de individuos inmunes que hayan sido efectivamente
vacunados y/o de pacientes enfermos crónicos (véase, p. ej.,
Rehermann, B. et al., J. Exp. Med. 181:1047, 1995; Nolan, D.
L. et al., Immunity 7:97,1997; Bertoni, R. et al., J.
Clin. Invest 100:503, 1997; Threlkeld, S. C. et al., J.
Immunol. 159:1648, 1997; Diepolder, H. M. et al., J.
Virol.71:6011, 1997). Por consiguiente, las respuestas de memoria
se detectan cultivando PBL de sujetos que se han expuesto al
antígeno debido a enfermedad y de este modo han generado una
respuesta inmune "naturalmente", o de pacientes que fueron
vacunados contra el antígeno. Los PBL de sujetos se cultivan in
vitro durante 1-2 semanas en presencia del
péptido de prueba más células presentadoras del antígeno (APC)
para permitir activación de las células T de "memoria", en
comparación con las células T no tratadas previamente
("naive"). Al final del período de cultivo, la actividad de las
células T se detecta utilizando ensayos que incluyen la liberación
de ^{51}Cr que involucran los blancos sensibilizados por el
péptido, proliferación de células T, o liberación de la
linfoquina.
La invención además se refiera a vacunas para el
cáncer que comprenden una proteína relacionada con
20P1F12/
TMPRSS2 o un ácido nucleico relacionado con 20P1F12/TMPRSS2. En vista de la expresión de 20P1F12/TMPRSS2, las vacunas para el cáncer previenen y/o tratan los cánceres que expresan 20P1F12/TMPRSS2 con efectos mínimos o nulos sobre los tejidos a los que no van dirigidas. El uso de un antígeno tumoral en una vacuna que genera respuestas inmunes humorales y/o mediadas por células como terapia anti-cáncer es bien conocido en la técnica y se ha empleado en cáncer de próstata utilizando inmunógenos de PSMA humano y PAP de roedor (Hodge et al., 1995, Int. J. Cancer 63:231-237; Fong et al., 1997, J. Immune). 159:3113-3117).
TMPRSS2 o un ácido nucleico relacionado con 20P1F12/TMPRSS2. En vista de la expresión de 20P1F12/TMPRSS2, las vacunas para el cáncer previenen y/o tratan los cánceres que expresan 20P1F12/TMPRSS2 con efectos mínimos o nulos sobre los tejidos a los que no van dirigidas. El uso de un antígeno tumoral en una vacuna que genera respuestas inmunes humorales y/o mediadas por células como terapia anti-cáncer es bien conocido en la técnica y se ha empleado en cáncer de próstata utilizando inmunógenos de PSMA humano y PAP de roedor (Hodge et al., 1995, Int. J. Cancer 63:231-237; Fong et al., 1997, J. Immune). 159:3113-3117).
Tales métodos pueden llevarse fácilmente a la
práctica empleando una proteína relacionada con
20P1F12/
TMPRSS2, o una molécula de ácido nucleico que codifica 20P1F12TTMPRSS2 y vectores recombinantes capaces de expresar y presentar el inmunógeno de 20P1F12/TMPRSS2 (que típicamente comprende una serie de anticuerpos o epitopos de células T). Los técnicos expertos comprenden que se conoce en la técnica una amplia variedad de sistemas de vacunas para la administración de epitopos inmunorreactivos (véase, p. ej., Heryln et al., Ann Med febrero de 1999 31(1):66-78; Maruyama et al., Cancer Immunol Immunother junio de 2000 49(3):123-32) En resumen, dichos métodos para generar una respuesta inmune (p. ej. humoral y/o mediada por células) en un mamífero, comprenden las etapas de: exponer al sistema inmune del mamífero a un epitopo inmunorreactivo (p. ej. un epitopo presente en la proteína 20P1F12/TMPRSS2 o análogo u homólogo de la misma) de modo que el mamífero genere una respuesta inmune que sea específica para ese epitopo (p. ej. genere anticuerpos que específicamente reconocen ese epitopo). En un método preferido, el inmunógeno de 20P1F12/TMPRSS2 contiene un motivo biológico, véase p. ej., Tablas V-XVIlI, o un péptido dentro de un intervalo de tamaño de 20P1F12/TMPRSS2 indicado en la Figura 14, Figura 15, Figura 16, Figura 17 y Figura 18.
TMPRSS2, o una molécula de ácido nucleico que codifica 20P1F12TTMPRSS2 y vectores recombinantes capaces de expresar y presentar el inmunógeno de 20P1F12/TMPRSS2 (que típicamente comprende una serie de anticuerpos o epitopos de células T). Los técnicos expertos comprenden que se conoce en la técnica una amplia variedad de sistemas de vacunas para la administración de epitopos inmunorreactivos (véase, p. ej., Heryln et al., Ann Med febrero de 1999 31(1):66-78; Maruyama et al., Cancer Immunol Immunother junio de 2000 49(3):123-32) En resumen, dichos métodos para generar una respuesta inmune (p. ej. humoral y/o mediada por células) en un mamífero, comprenden las etapas de: exponer al sistema inmune del mamífero a un epitopo inmunorreactivo (p. ej. un epitopo presente en la proteína 20P1F12/TMPRSS2 o análogo u homólogo de la misma) de modo que el mamífero genere una respuesta inmune que sea específica para ese epitopo (p. ej. genere anticuerpos que específicamente reconocen ese epitopo). En un método preferido, el inmunógeno de 20P1F12/TMPRSS2 contiene un motivo biológico, véase p. ej., Tablas V-XVIlI, o un péptido dentro de un intervalo de tamaño de 20P1F12/TMPRSS2 indicado en la Figura 14, Figura 15, Figura 16, Figura 17 y Figura 18.
La proteína 20P1F12/TMPRSS2 entera, regiones
inmunogenes o epitopos de la misma pueden combinarse y administrarse
por diversos medios. Dichas composiciones de vacuna pueden incluir,
por ejemplo, lipopéptidos (p. ej., Vitiello, A. et al., J.
CIin. Invest. 95:341, 1995), composiciones de péptido encapsuladas
en microesferas de
poli(DL-lactida-co-glicolida)
("PLG") (véase, p. ej., Eldridge, et al., Malec.
Immunol. 28:287-294, 1991: Alamo et al.,
Vaccine 12:299-306, 1994; Jones et al.,
Vaccine 13:675-681, 1995), composiciones de péptido
contenidas en complejos de estimulación inmune (ISCOMS) (véase, p.
ej., Takahashi et al., Nature 344:873-875,
1990; Hu et al., Clin Exp Immunol.
113:235-243, 1998), sistemas múltiples de péptido
antigénico (MAPs) (véase p. ej., Tam, J. P., Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 85:5409-5413, 1988; Tam, J.P., J. Immunol
Methods 196:17-32, 1996), péptidos formulados como
péptidos multivalentes; péptidos para el uso en sistemas balísticos
de administración, péptidos típicamente cristalizados, vectores de
administración viral (Perkus, M. E. et al., En: Concepts in
vaccine development, Kaufmann, S. H. E., ed., p. 379, 1996;
Chakrabarti, S. et al., Nature 320:535, 1986; Hu, S. L. et
al., Nature 320:537, 1986; Kieny, M.-P. et al., AIDS
Bits/Technology 4:790, 1986; Top, F. H. et al., J. Infect.
Die. 124:148, 1971; Chanda, P. K.. et al., Virology 175:535,
1990), partículas de origen viral o sintético (p. ej., Kofler, N.
et al., J. Immunol. Methods. 192:25, 1996; Eldridge, J. H.
et al., Sent. Hematol. 30:16, 1993; Falo, L. D., Jr. et
al., Nature Med 7:649, 1995), adyuvantes (Warren, H. S., Vogel,
F. R., y Chedid, L. A. Anna. Rev. Immunol.. 4:369, 1986; Gupta, R.
K. et al., Vaccine 11:293, 1993), liposomas (Reddy, R. et
al., J. Immunol. 148:1585, 1992; Rock, K. L., Immunol. Today
17:131, 1996), o ADNc desnudo o absorbido en partículas (Ulmer, J.
B. et al., Science 259:1745, 1993; Robinson, H. L., Hunt, L.
A., y Webster, R. G., Vaccine 11:957, 1993; Shiver, J. W. et
al., In: Concepts in vaccine development, Kaufmann, S. H. E.,
ed., p. 423, 1996; Cease, K. B., y Berzofsky, J. A., Anne. Rev.
Immunol. 12:923, 1994 y Eldridge, J. H. et al., San. Immunol
30:16, 1993). También pueden utilizarse tecnologías de
administración dirigidas a toxinas, también conocidas como
localización mediada por receptores, tales como las de Avant
Immunotherapeutics, Inc. (Needham, Massachusetts).
En pacientes con cáncer asociado a
20P1F12/TMPRSS2, las composiciones de vacunas de la descripción
también pueden utilizarse en conjunción con otros tratamientos
utilizados para el cáncer, p. ej. cirugía, quimioterapia, terapias
de fármacos, terapias radiantes, etc., incluyendo su uso en
combinación con adyuvantes inmunes tales como IL-2,
IL-12, GM-CSF y similares.
Vacunas celulares: los epitopos CTL pueden
determinarse utilizando algoritmos específicos para identificar
péptidos dentro de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 que se unen a los
alelos HLA correspondientes (véase, p. ej., Tabla IV; Epimer^{TM}
y Epimatrix^{TM}, Brown University (UAL
www.brown.edulResearch/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html);
y BIMAS, (URL bimas.dcrt.nih.gov/; SYFPEITHI en URL
syfpeithi.bmi-heidelberg.com/). En un ejemplo
preferido el inmunógeno de 20P1F12/TMPRSS2 contiene una o más
secuencias de aminoácidos identificadas utilizando técnicas bien
conocidas en la técnica, por ejemplo un péptido de 8, 9, 10 o 11
aminoácidos especificados por un motivo/supermotivo HLA Clase I (p.
ej., Tabla IV (A), Tabla IV (D) o Tabla IV (E)) y/o un péptido de al
menos 9 aminoácidos que comprende un motivo/supermotivo HLA Clase
II (p. ej., Tabla IV (B) o Tabla IV (C)). Tal como se aprecia en la
técnica, el surco de unión HLA Clase I está esencialmente cerrado en
el extremo de manera que los péptidos sólo de un intervalo de
tamaño particular pueden encajar en el hueco y unirse, en general
los epitopos HLA Clase I son de 8, 9, 10 u 11 aminoácidos de largo.
En oposición, el surco de unión HLA Clase II está esencialmente
abierto en el extremo; por ello un péptido de alrededor de 9 o más
aminoácidos puede unirse mediante una molécula HLA Clase II. Debido
a las diferencias entre el surco de unión HLA Clase I y II, los
motivos HLA Clase I son específicos en longitud, es decir, la
posición dos de un motivo Clase I es el segundo aminoácido en una
dirección amino a carboxilo del péptido. Las posiciones de
aminoácidos en un motivo Clase II son relativas solamente entre sí,
no respecto del péptido global, es decir, aminoácidos adicionales
pueden adherirse a los extremos amino y/o carboxilo terminales de
una secuencia portadora de un motivo. Los epitopos HLA Clase II a
menudo tienen 9, 10, 11,12, 15, 16. 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o
25 aminoácidos de largo, o más de 25 aminoácidos.
Vacunas basadas en Anticuerpos: Se conoce en la
técnica una amplia variedad de métodos para generar una respuesta
inmune en un mamífero (por ejemplo como la primer etapa en la
generación de hibridomas). Los métodos para generar una respuesta
inmune en un mamífero comprenden exponer el sistema inmune del
mamífero a un epitopo inmunogén en una proteína (p. ej., la
proteína 20P1F12/TMPRSS2) de manera que se genere una respuesta
inmune. Un ejemplo típico consiste en un método para generar una
respuesta inmune con respecto a 20P1F12/TMPRSS2 en un hospedante,
poniendo en contacto el hospedante con una cantidad suficiente de al
menos una célula B de 20P1F12/TMPRSS2 o epitopo de células T
citotóxicas o análogo del mismo; y al menos un intervalo periódico
a partir de entonces ponga en contacto nuevamente el hospedante con
la célula B de 20P1F12/TMPRSS2 o el epitopo de células T
citotóxicas o análogo del mismo. Un ejemplo específico consiste en
un método para generar una respuesta inmune contra una proteína
relacionada con 20P1F12/TMPRSS2 o un péptido multiepitópico hecho
por el hombre que comprende: administrar el inmunógeno de
20P1F12/TMPRSS2 (p. ej. la proteína 20P1F12/TMPRSS2 o un fragmento
peptídico del mismo, una proteína de fusión 20P1F12/TMPRSS2 o
análogo etc.) en una preparación de vacuna para un humano u otro
mamífero. Típicamente, dichas preparaciones de vacuna además
contienen un adyuvante apropiado (véase, p. ej., Patente
Estadounidense No. 6.146.635) o un epitopo auxiliar universal tal
como un péptido PADRE^{TM} (Epimmune Inc., San Diego, CA; véase,
p. ej., Alexander et al., J. Immunol. 2000 164(3);
164(3): 1625-1633; Alexander et al.,
Immunity 1994 1(9): 751-761 y Alexander et
al., Inmunol. Res. 1998 18(2):79-92). Un
método alternativo comprende generar una respuesta inmune en un
individuo contra un inmunógeno de 20P1F12/TMPRSS2: administrar
in vivo al músculo o piel del cuerpo de un individuo una
molécula de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica un
inmunógeno de 20P1F12/TMPRSS2, la secuencia de ADN operativamente
acoplada a secuencias reguladoras que controlan la expresión de la
secuencia de ADN; en donde la molécula de ADN es captada por las
células, la secuencia de ADN se expresa en las células y se genera
una respuesta inmune contra el inmunógeno (véase, p. ej., la
Patente Estadounidense No. 5.962.428). Opcionalmente también se
administra un facilitador genético de vacuna tal como lípidos
aniónicos, saponinas, lectinas, compuestos estrogénicos, alquilos
inferiores hidroxilados, sufóxido de dimetilo y urea.
Vacunas de ácido nucleico: las composiciones de
vacunas incluyen modalidades mediadas por ácido nucleico. Pueden
administrarse ADN o ARN que codifican las(s)
proteína(s) relacionada(s) con la invención a un
paciente. Pueden emplearse métodos de inmunización genética para
generar respuestas inmunes celulares y humorales profilácticas o
terapéuticas dirigidas contra células cancerosas que expresan
20P1F12/TMPRSS2. Pueden inyectarse construcciones que comprenden
ADN que codifica una proteína/inmunógeno relacionado con
20P1F12/TMPRSS2 y secuencias reguladoras apropiadas directamente en
el músculo o piel de un individuo, de manera tal que las células del
músculo o piel capten la construcción y expresen la
proteína/inmunógeno de 20P1F12/TMPRSS2 codificado. Alternativamente,
una vacuna comprende una proteína relacionada con 201F12/TMPRSS2.
La expresión de la proteína inmunógeno relacionada con
20P1F12/TMPRSS2 resulta en la generación de inmunidad celular y
humoral profiláctica o terapéutica contra las células portadoras de
la proteína 20P1F12/TMPRSS2. Pueden utilizarse diversas técnicas de
inmunización genética profilácticas o terapéuticas conocidas en la
técnica (a modo de revisión, véase la información y referencias
publicadas en la dirección de Internet www.genweb.com). La
administración basada en ácidos nucleicos se describe, por ejemplo,
en Wolff et. al., Science 247:1465 (1990) así como las
Patentes Estadounidenses Nos. 5.580.859, 5.589.466, 5.804.566,
5.739.118, 5.736.524, 5.679.647, WO 98/04720. Los ejemplos de
tecnologías de administración basadas en ADN incluyen "ADN
desnudo", administración facilitada (mediada por bupivicaína,
polímeros, péptidos), complejos de lípidos catiónicos y
administración mediada por partículas ("pistola de genes") o
mediada por presión (véase, p. ej., Patente Estadounidense
No. 5.922.687).
Con fines de inmunización terapéutica o
profiláctica, las proteínas relacionadas con la invención pueden ser
expresadas por vectores virales o bacterianos. Diversos sistemas
de administración de genes virales que pueden utilizarse en la
práctica de la invención incluyen, sin limitación, virus vacuna,
virus de la viruela aviar, viruela de los canarios, adenovirus,
virus de la gripe, poliovirus, virus
adeno-asociados, lentivirus y virus sindbis (véase,
p. ej., Restifo, 1996, Curr. Opin. Immunol.
8:658-663; Tsang et al., I. Natl. Cancer
Inst. 87982990 (1995)). También pueden emplearse sistemas de
administración no virales introduciendo ADN desnudo que codifica
una proteína relacionada con 20P1F12/TMPRSS2 en el paciente (p. ej.,
por vía intramuscular o intradérmica) para inducir una respuesta
anti-tumoral.
El virus vacuna, se utiliza, por ejemplo, como
vector para expresar secuencias nucleotídicas que codifican los
péptidos relacionados con la invención. Tras la introducción en un
hospedante, el virus vacuna recombinante expresa el péptido
inmunogén de la proteína, y de ese modo provoca una respuesta inmune
del huésped. Se describen vectores de vacuna y métodos útiles en
los protocolos de inmunización en, p. ej., Patente Estadounidense
No. 4.722.848. Otro vector es el BCG (Bacille Calmette Guerin). Los
vectores BCG se describen en Stover et al., Nature
351:456-460 (1991). Una amplia variedad de otros
vectores útiles para administración o inmunización terapéutica de
los péptidos de la invención, p. ej. vectores de adenovirus y
adeno-asociados, vectores retrovirales, vectores de
Salmonella typhi, vectores de toxina de ántrax detoxificada y
similares, serán evidentes para los expertos en la técnica a partir
de la descripción de la presente memoria.
De este modo, se utilizan sistemas de
administración de genes para administrar una molécula de ácido
nucleico relacionada con 20P1F12/TMPRSS2. En un ejemplo, se emplea
el ADNc humano de longitud completa de 20P1F12/
TMPRSS2. En otro ejemplo, se emplean las moléculas de ácido nucleico de 20P1F12/TMPRSS2 que codifican linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos y/o epitopos de anticuerpos.
TMPRSS2. En otro ejemplo, se emplean las moléculas de ácido nucleico de 20P1F12/TMPRSS2 que codifican linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos y/o epitopos de anticuerpos.
Vacunas Ex Vivo: También pueden emplearse
diversas estrategias ex vivo para generar una respuesta
inmune. Un abordaje incluye el uso de células presentadoras del
antígeno (APC) tales como células dendríticas (DC) para presentar
el antígeno de 20P1P12/TMPRSS2 al sistema inmune de un paciente. Las
células dendríticas expresan moléculas MHC Clase I y II,
co-estimulador B7 e IL-12, y de este
modo son células presentadoras de antígenos altamente
especializadas. En el cáncer de próstata, se están utilizando
células dendríticas autólogas pulsadas con péptidos del antígeno de
membrana específico de la próstata (PSMA) en un ensayo clínico de
Fase I para estimular sistemas inmunes de pacientes con cáncer de
próstata (Tjoa et al., 1996, Prostate
28:65-69; Murphy et al., 1996, Prostate
29:371-380). De este modo, las células dendríticas
pueden utilizarse para presentar péptidos de 20P1F12/TMPRSS2 a
células T en el contexto de moléculas MHC Clase I o II. En un
ejemplo, las células dendríticas autólogas son pulsadas con
péptidos de 20P1F12/TMPRSS2 capaces de unirse a moléculas MHC Clase
I y/o Clase II. En otro ejemplo, las células dendríticas son
pulsadas con la proteína completa 20P1F12/TMPRSS2. Inclusive otro
ejemplo incluye manipular genéticamente la sobreexpresión del gen
20P1F12/TMPRSS2 en células dendríticas utilizando diversos vectores
de implementación conocidos en la técnica, tales como adenovirus
(Arthur et al., 1997, Cancer Gene Ther.
4:17-25), retrovirus (Henderson et al., 1996,
Cancer Res. 56:3763-3770), lentivirus, virus
adeno-asociados, transfección de ADN (Ribas et
al., 1997, Cancer Res. 57:2865-2869) o
transfección de ARN obtenido de tumores (Ashley et al.,1997,
J. Exp. Med. 186:11774182). Las células que expresan 20P1F12/TMPRSS2
también pueden manipularse genéticamente para expresar
inmunomoduladores, tales como GM-CSF, y pueden
utilizarse como agentes
inmunizantes.
inmunizantes.
Los perfiles de antigenicidad pueden
determinarse utilizando el sitio web ProtScale (URL
www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) en el servidor
de biología molecular ExPasy, Hidrofilicidad, (Hopp T.P., Woods KR.,
1981. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 78:3824-3828),
Hidropaticidad, (Kyte J., Doolittle R.F., 1982. J. Mel. Biol.
157:105-132); Porcentaje de Residuos Accesibles
(Janie J., 1979 Nature 277:491-492), Flexibilidad
Media, (Bhaskaran R, y Ponnuswamy P.K., 1988. Int. J. Pept. Protein
Res. 32:242-255); Giro beta (Deleage, G., Roux B.
1987 Protein Engineering 1:289-294); y
opcionalmente otros métodos disponibles en la técnica, tales como en
el sitio web ProtScale, pueden utilizarse para identificar regiones
antigénicas de la proteína 20P1F12/TMPRSS2. Ejemplos no limitantes
de los parámetros ProtScale para el análisis son: 1) Un tamaño de
ventana de 9; 2) 100% del peso de los extremos de ventana en
comparación con el centro de ventana; y 3) valores del perfil del
aminoácido normalizados para estar entre 0 y 1.
Las regiones determinadas por estos métodos
tienen mayor probabilidad de estar expuestas a la proteína y, de
este modo, accesibles al reconocimiento inmune, tal como por
anticuerpos. Las secuencias antigénicas de la proteína
20P1F12/TMPRSS2 así indicadas se utilizan para preparar inmunógenos,
ya sea péptidos o ácidos nucleicos que los codifican, para generar
anticuerpos anti-20P1F12/TMPRSS2 terapéuticos y
diagnósticos. El inmunógeno puede ser cualquiera de 5, 6, 7, 8, 9,
10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 13, 19, 20, 21, 22, 23, 25, 25, 30,
35, 40, 45, 50 o más de 50 aminoácidos contiguos, o los ácidos
nucleicos correspondientes que los codifican, de la proteína
20P1F12/TMPRSS2.
Tal como se observó más arriba, PSA y
20P1F12/TMPRSS2 comparten una serie de características relacionadas,
un descubrimiento que proporciona evidencia de que estas dos
moléculas pueden tener papeles fisiológicos similares in
vivo. En este contexto, las observaciones en la biología de PSA
pueden proporcionar una perspectiva en la biología de
20P1F12/TMPRSS2. Resulta interesante que mientras que la medición de
niveles séricos de PSA se utiliza ampliamente como herramienta de
diagnóstico para el cáncer de próstata, con la excepción de los
datos que indican un papel potencial como proteasa
IGFBP-3 (Cohen et al., J. Endocrinol. 142:
407-415 (1994)), sorprendentemente se conoce poco
acerca del papel de PSA en el cáncer.
Recientemente, un estudio que evalúa
sistemáticamente los efectos de PSA sobre la proliferación,
migración e invasión de células endoteliales, descubrió que PSA
posee propiedades
anti-invasivas/anti-angiogénicas
in vivo (Fortier et al., J. Nat. Cancer Inst.
91(19): 16354640(1999)). Estos descubrimientos son
consistentes con estudios anteriores que mostraron que los fármacos
anti-angiogénicos talidomida y TNP470 inducen
incrementos estadísticamente significativos en la producción de PSA
por líneas celulares de próstata in vitro (Horti et
al., Br. J. Cancer 79: 1588-1593 (1999) y que
los pacientes con tumores de mama y altos niveles de PSA tenían un
mejor pronóstico que aquellos pacientes cuyos tumores tenían niveles
más bajos de PSA (Yu et al., Clin. Cancer Research, 4:
1489-1497 (1998)). Los efectos
anti-tumorales de PSA descritos en Fortier et
al. pueden provenir de sus acciones como
serina-proteasa, ya que ACT bloqueó tanto su
actividad enzimática como su actividad
anti-angiogénica in vitro. Por otra parte,
estos descubrimientos están respaldados por observaciones de que
PSA es capaz de convertir Lys-plasminógeno en
angiostatina biológicamente activa como fragmentos, y que estos
fragmentos inhibieron la proliferación y formación tubular de
células endoteliales de vena umbilical humana con la misma eficacia
que la angiostatina (Heidtmann et al., Br. J. Cáncer
81(8): 1269-1273 (1999)). En términos
globales, estos datos proporcionan evidencia de que las elevaciones
de PSA en una variedad de tumores malignos son parte de un proceso
normal homeostático para combatir el avance del cáncer y que la
administración de PSA como fármaco para aumentar las
concentraciones endógenas podría proporcionar un abordaje
terapéutico racional en el tratamiento del cáncer. Además, los
datos de 20P1F12/TMPRSS2 que se muestran en la Figura 35 y Figura
36 y presentados en los Ejemplos más abajo así como estos estudios
sobre PSA demuestran que 20P1F12/TMPRSS2 también exhibe dicha
actividad anti-invasiva. La Figura 35 muestra la
inhibición de formación de tubos por parte de TMPRSS2. Se sembraron
en placa células HUVEC en matrigel y se incubaron en presencia de
FBS al 10%, 1 \mug/ml de GST-20P1F12/TMPRSS2
purificada recombinante (aa255-492), 0,3 \mug/ml
de PSA purificado o 1 \mug/ml de proteína GST purificada. El
tratamiento con VEGF recombinante se utilizó como control para la
formación de tubos. El tratamiento con
GST-20P1F12/TMPRSS2 purificada inhibió la formación
de tubos inducida por FBS. Se observó una similar inhibición con
PSA, un conocido inhibidor de la angiogénesis (J. Natl. Cancer
Inst, 1999, 91:1635). La Figura 36 ilustra la inhibición de la
proliferación de HUVEC por TMPRSS2. Se sembraron células HUVEC en
placas de 96 pocillos en presencia o ausencia de FBS al 10%, 10
\mug/ml de GST-20P1F12/TMPRSS2 recombinante (aa
255-492) o PSA purificado. Las células se hicieron
crecer durante 72 horas y se analizaron para determinar la
proliferación utilizando reducción de Alamar Blue como lectura. El
experimento se realizó por triplicado. El tratamiento con
GST-20P1F12/TMPRSS2 purificada inhibió la
proliferación de HUVEC mediante dosis bajas y altas de FBS. Se
observó inhibición similar con PSA.
En el cáncer, el crecimiento del tumor depende
del crecimiento angiogénico de nuevos vasos sanguíneos. La
angiogénesis es un proceso estrechamente regulado, modulado por la
interacción dinámica entre estimuladores e inhibidores agiogénicos
que controlan la proliferación, migración e invasión de células
endoteliales. Este concepto se refuerza por el descubrimiento
anterior de estimuladores endógenos de la angiogénesis, tales como
factores de crecimiento de fibroblastos (FGF) y factores de
crecimiento endotelial vascular (VEGF) y, más recientemente,
mediante el descubrimiento de inhibidores endógenos de la
angiogénesis, incluyendo las proteínas Angostatin® y
Endostatin^{TM} (O'Reilly et al., Cell, 79:
315-328 (1994); O'Reilly et al., Cell, 88:
277-285 (1997); Sim, Angiogenesis, 2:
37-48 (1998)). Los resultados preliminares indican
que pueden aparecer concentraciones incrementadas de la proteína
anti-angiogénica Endostatin^{TM} en animales y
pacientes con tumores en crecimiento, lo que puede indicar que la
angiogénesis está teniendo lugar (Paciotti et al., Proe. Am.
Assoc. Cancer Res. 40: 66 (1999)). Estos descubrimientos, así como
las observaciones con PSA, apuraron los estudios descritos en el
Ejemplo 13, que proporcionan evidencia de que concentraciones
crecientes de 20P1F12/TMPRSS2 pueden no ser un presagio de malas
noticias y avance de cáncer sino, más precisamente, pueden indicar
que el organismo está intentando luchar contra el cáncer
produciendo sus propias proteínas
anti-angiogénicas.
Según se muestra en las Figuras
27-30, al igual que PSA, 20P1F12/TMPRSS2 es una
proteasa que es capaz de modular el crecimiento y la invasión
tumoral. Las Figuras 27A-27C muestran las
diferencias en el potencial invasivo de células PC3 en comparación
con células PC3 transfectadas de manera estable con 20P1F12/TMPRSS2.
Los datos de las Figuras 27A-27C muestran que las
células que expresan 20P1F12/TMPRSS2 han reducido sus capacidades
invasivas y proporcionan evidencias de que la expresión de
20P1F12/TMPRSS2 inhibe la invasión de tumores in vivo.
Además, estas figuras proporcionan datos comparativos con el
activador uroquinasa-plasminógeno (véase p. ej.
Rabbani et al., In Vivo., enero - febrero de 1998;
12(1):135-42 Evans et al., Cancer Res.
agosto de 1997 15;57(16):3594-9 y Wilson
et al., Anat Rec. 1997
Sep;249(1):63-73). La Figura 28 muestra la
actividad proteolítica de 20P1F12/TMPRSS2. Específicamente, la
Figura 28 ilustra la capacidad de un fragmento de 20P1F12/TMPRSS2
(GST-20P1F12/TMPRSS2 (aa255-492))
para escindir la caseína. La Figura 29 muestra los efectos de un
fragmento purificado de proteasa de 20P1F12/TMPRSS2 sobre la
invasión de PC3. Los datos en la Figura 29 demuestran cómo el
fragmento de proteasa de 20P1F12/TMPRSS2 reduce la invasión de
células PC3 a través de la matriz de membrana basal Matrigel^{TM}
y proporciona evidencia de que el dominio de proteasa de
20P1P12/TMPRSS2 puede inhibir la invasión de tumores in
vivo. La Figura 30 muestra cómo los efectos de un fragmento
purificado de proteasa de 20P1F12/TMPRSS2 sobre la invasión de PC3
son modulados por el MAb 1F9 anti-20P1F12/TMPRSS2.
Los datos de la Figura 30 demuestran cómo un anticuerpo
anti-20P1F12/TMPRSS2 puede suprimir la actividad
inhibidora de invasión de 20P1F12/TMPRSS2 y proporciona evidencia
confirmatoria de que esta molécula puede inhibir la invasión de
tumores en un modelo in vitro conocido por correlacionarse
con procesos in vivo.
Los datos provistos en las Figuras
27-30 muestran que 20P1F12/TMPRSS2 es una proteasa y
que esta proteasa reduce la invasión de células PC3 a través de la
matriz extracelular y que los anticuerpos contra el dominio de
proteasa aumenten la invasión tumoral. De este modo, estos datos
proporcionan evidencia de que 20P1F12/TMPRSS2 es una proteasa que
está involucrada en la modulación del crecimiento de tumores
primarios así como en la formación de metástasis. Sin atarnos a una
teoría científica específica, los datos presentados en la presente
memoria proporcionan evidencia de que 20P1F12/TMPRSS2 puede inducir
la proteólisis de un factor involucrado en el crecimiento, invasión
o angiogénesis tumoral o puede actuar directamente sobre el tumor o
sobre su entorno (p. ej., células endoteliales).
Los datos presentados en la presente memoria
proporcionan evidencia de que, como el PSA, 20P1F12/TMPRSS2 puede
servir tanto como indicador de cánceres tales como el cáncer de
próstata, así como modulador del crecimiento y la invasión tumoral.
Más aún, como la invasión es una de las etapas iniciales en la
formación de metástasis, estos datos además proporcionan evidencia
de que 20P1F12/TMPRSS2 puede afectar la angiogénesis. En
consecuencia, los métodos que utilizan 20P1F12/TMPRSS2 pueden
utilizarse para inhibir el crecimiento y la invasión tumoral. En
este contexto, el efecto psicológico de 20P1F12/TMPRSS2 puede
depender de su estado, p. ej. si está libre o complejada con uno o
más de sus parejas de unión, tales como los observados en los
complejos inmunorreactivos que se muestran, por ejemplo, en la
Figura 24.
Son bien conocidas en la técnica una variedad de
metodologías para utilizar y evaluar la actividad de moléculas que
modulan la actividad invasiva y/o angiogénica de células. Por
ejemplo, la Patente Estadounidense No. 6.060.449 describe un
inhibidor de la angiogénesis inducida por el crecimiento de las
células endoteliales vasculares que comprende el Inhibidor de la
Vía del Factor Tisular (TFPI) como principio activo. La Patente
Estadounidense No. 6.057.122 describe los fragmentos kringle 5 de
mamíferos y se describen proteínas de fusión kringle 5 como
compuestos para tratar enfermedades angiogénicas. La Patente
Estadounidense No. 6.025.331 describe composiciones farmacéuticas
que contienen cantidades terapéuticamente efectivas de troponina C,
I, o T, sub-unidades, fragmentos, o análogos para
el tratamiento de enfermedades o trastornos que involucran
angiogénesis anormal. La Patente Estadounidense No. 6.024.688
describe métodos para utilizar fragmentos de un inhibidor de
proliferación celular endotelial obtenido a partir de plasminógeno,
específicamente un fragmento de angiostatina. Además, la Patente
Estadounidense No. 5.981.484 describe varios péptidos que inhiben la
angiogénesis y son útiles en el tratamiento de estados de
enfermedad tales como cáncer, artritis, degeneración macular y
retinopatía diabética en las que la angiogénesis desempeña un
papel.
Los polipéptidos de 20P1F12/TMPRSS2 relacionados
con la invención además pueden caracterizarse por producir un
efecto inhibidor sobre la invasión, angiogénesis, sobren la
metástasis tumoral o sobre reacciones inflamatorias. Los
polipéptidos de 20P1F12/TMPRSS2 son especialmente útiles para
inhibir la invasión en un hospedante mamífero, preferiblemente
humano, que alberga un tumor. El término "invasión" se utiliza
conforme a su significado aceptado en la técnica como el proceso
fisiológico por el cual una célula tal como una célula tumoral se
mueve a través de una matriz extracelular o membrana basal. Se
observa la invasión en una variedad de contextos específicos tales
como ensayos de invasión del diafragma in vivo utilizando
ratones SCID así como ensayos in vitro utilizando membranas
basales reconstituidas específicamente diseñadas para imitar la
matriz extracelular que las células tumorales diseminan durante la
metástasis (véase, p. ej., Stearns et al., Cancer Res. 1992,
52(13): 3776-3781 y Knox et al.,
Prostate 1998, 35(4): 248-254). Además, la
invasión puede cuantificarse mediante una variedad de métodos
conocidos en la técnica tales como los que utilizan el sistema
Transwell Insert (Becton Dickinson) descrito en el Ejemplo 13.
Las composiciones y métodos de tratamiento
anti-invasivos y/o anti-angiogénicos
precedentes son útiles para inhibir la migración celular e invasión
o la proliferación celular inducida por la migración en un sujeto
que posee una enfermedad o afección asociada con una invasión
celular no deseada, la proliferación inducida por la migración,
angiogénesis o metástasis. Dichas enfermedades o afecciones pueden
incluir tumores de crecimiento primario o sólidos o leucemia y
linfomas, metástasis, invasión y/o crecimiento de metástasis
tumoral, arteriosclerosis, angiogénesis del miocardio, restenosis
vascular pos-angioplastía con balón, formación de
neoíntima tras un trauma vascular, restenosis de injerto vascular,
formación de colaterales coronarias, trombosis venosa profunda,
angiogénesis de miembro isquémico, telangiectasia, granuloma
piogénico, enfermedades de la córnea, rubeosis, glaucoma
neovascular, retinopatía diabética y otras retinopatías, fibroplasia
retrolental, neovascularización diabética, degeneración macular,
endometriosis, artritis, fibrosis asociada con afecciones
inflamatorias crónicas incluyendo psoriasis escleroderma, fibrosis
de pulmón, fibrosis inducida por quimioterapia, curación de herida
con cicatriz y fibrosis; úlceras pépticas, fracturas, queloides y
trastornos de vasculogénesis, hematopoyesis, ovulación,
menstruación, embarazo y placentación, o cualquier otra enfermedad o
afección en la que la invasión o angiogénesis sea patogénica.
Por consiguiente, este aspecto específico de la
descripción incluye métodos para inhibir la invasión celular,
principalmente por células tumorales, o angiogénesis,
fundamentalmente inducida por células tumorales, en un sujeto. Al
inhibir la invasión por parte de células o angiogénesis, el método
produce inhibición de la metástasis tumoral. En este método, se
administra a un sujeto vertebrado, preferiblemente un mamífero, más
preferiblemente un humano, una cantidad de una molécula
20P1F12/TMPRSS2 que comprende típicamente un polipéptido que posee
la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO.: 2 o es un
fragmento biológicamente activo de la misma. El polipéptido
20P1F12/TMPRSS2 preferiblemente se administra en forma de
composición farmacéutica según se describe más arriba.
Las dosis de las moléculas 20P1F12/TMPRSS2
preferiblemente incluyen unidades de dosificación farmacéutica que
comprenden una cantidad efectiva de un polipéptido 20P1F12/TMPRSS2.
Por cantidad efectiva se entiende una cantidad suficiente para
lograr una concentración de estado estacionario in vivo que
produce una reducción mensurable en cualquier parámetro relevante
de la enfermedad y puede incluir invasión y/o crecimiento de tumores
primarios o metastásicos, cualquier índice aceptado de reactividad
inflamatoria, o una prolongación mensurable de intervalo libre de
enfermedad o de supervivencia. Por ejemplo, una reducción en el
crecimiento tumoral en el 20% de los pacientes se considera eficaz
(Frei III, E., Cancer Journal 3:127-136 (1997)). Sin
embargo, un efecto de esta magnitud no se considera que sea un
requerimiento mínimo para que la dosis sea efectiva de conformidad
con esta invención. Los rangos de dosis efectivas y dosis óptimas
pueden determinarse utilizando los métodos conocidos en la técnica
incluyendo aquellos descritos en la presente memoria.
Alternativamente, la amplia variedad de
tecnologías de transferencia génica y terapia génica conocidas en
la técnica pueden utilizarse para administrar moléculas terapéuticas
de polinucléotidos a células (p. ej., un polinucleótido
20P1F12/TMPRSS2 que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en
la SEC ID NO.: 2 o fragmentos anti-proliferativos
de la misma). Se conocen en la técnica una cantidad de abordajes de
terapia génica y se describen, por ejemplo, en las Patentes
Estadounidenses Nos.: 5.830.880, 6.071.890 y 5.792.453. Utilizando
tales métodos bien conocidos, vectores recombinantes que codifican
dichas moléculas de 20P1F12/TMPRSS2 pueden administrarse a células
blanco (p. ej., células tumorales y endoteliales) que posteriormente
expresarán 20P1F12/TMPRSS2 como un medio de modulación del
crecimiento, invasión y/o metástasis celular.
Se proporcionan en la presente memoria una serie
de métodos representativos de uso de 20P1F12/TMPRSS2 para modular
el crecimiento, invasión y/o` metástasis celular. En estos métodos
la molécula de 20P1F12/TMPRSS2 típicamente comprende un polipéptido
que posee la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2 o
es un fragmento biológicamente activo del mismo. Los ejemplos
típicos incluyen un método para inhibir la invasión celular en un
mamífero que comprende administrar al mamífero una cantidad
inhibidora de la invasión celular de una molécula de
20P1F12/TMPRSS2 que posee una actividad
anti-invasiva in vivo. Otro ejemplo
relacionado consiste en un método para inhibir la invasión celular
y/o angiogénesis en un mamífero que comprende administrar al
mamífero una cantidad inhibidora de la invasión de una molécula de
20P1F12/TMPRSS2 que posee actividad anti-invasiva,
en donde dicho fragmento contiene sustituciones y/o supresiones y/o
adiciones de aminoácidos de la secuencia expuesta en la SEC ID NO.:
2, pero retiene la actividad anti-invasiva (p. ej.,
un fragmento de GST que comprende los aminoácidos
255-492 de la secuencia expuesta en la SEC ID NO.:
2).
Un ejemplo típico relacionado con la invención
consiste en un método para inhibir la invasión por una célula
tumoral que comprende introducir en el entorno de la célula un
polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en
SEC ID NO.: 2 o fragmentos anti-invasivos del mismo,
por lo cual se inhibe la invasión. Por introducción en el entorno
de la célula se entiende que se coloca el polipéptido en el medio de
la célula de manera que el mismo pueda efectuar un proceso
fisiológico de esa célula ya sea directa o indirectamente. Son bien
conocidos en la técnica una variedad de métodos para introducir
agentes terapéuticos tales como polipéptidos en el entorno de una
célula, incluyendo los métodos típicos la inyección intravenosa o
sitio-específica
Típicamente el fragmento
anti-invasivo del polipéptido 20P1F12/TMPRSS2
comprende el dominio de proteasa del fragmento de proteasa de 32 KD
que se muestra, por ejemplo, en la Figura 23. Otro ejemplo
ilustrativo de semejante fragmento es el polipéptido que comprende
los aminoácidos 255-492 de la secuencia expuesta en
la SEC ID NO.: 2 que se utiliza en los ensayos
anti-invasivos descritos en el Ejemplo 13. En
ejemplos preferidos de este método, el polipéptido se introduce en
el entorno de la célula por vía parenteral. En ejemplos típicos, el
polipéptido se introduce en el entorno de la célula por inyección
intravenosa.
Un ejemplo específico descrito consiste en un
método para inhibir la invasión de la membrana basal por parte de
una célula tumoral que comprende introducir en el entorno de la
célula un polipéptido de SEC ID NO.: 2, mediante el que se inhibe
la invasión de la membrana basal. Preferiblemente las células
tumorales en estos métodos exhiben expresión o secreción aumentada
de 20P1F12/TMPRSS2. Un ejemplo específico relacionado consiste en
un método para inhibir la invasión de células tumorales en donde
dichas células tumorales exhiben una síntesis o secreción aumentada
de 20P1F12/TMPRSS2, que comprende administrar un polipéptido de SEC
ID NO.: 2, mediante el que se inhibe la invasión de células
tumorales. En ejemplos preferidos de estos métodos, el polipéptido
de SEC ID NO.: 2 consiste en el fragmento de 32 kD que contiene el
dominio de proteasa de 20P1F12/TMPRSS2.
Los ejemplos relacionados consisten en métodos
para inhibir la expansión de células tumorales en un mamífero que
comprenden administrar al mamífero una cantidad suficiente de una
molécula de 20P1F12/TMPRSS2 para inhibir la expansión de células
tumorales, tales como la expansión de tumores de próstata, vejiga,
ovario, pulmón, riñón o colon, o tumores metastásicos, en donde la
molécula de 20P1F12/TMPRSS2 posee una secuencia de aminoácidos que
comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO.: 2 o
fragmentos anti-proliferativos de la misma. En un
ejemplo específico la molécula de 20P1F12/TMPRSS2 contiene el
dominio de proteasa o un fragmento
anti-proliferativo del mismo.
El técnico experto entiende que la modificación
de polipéptidos puede facilitar su uso en diversos contextos. En
consecuencia, además de las modificaciones con polipéptidos
heterólogos (véanse, p. ej., los polipéptidos de fusión de
inmunoglobulinas tratados más arriba), la presente descripción
además proporciona variantes de 20P1F12/TMPRSS2 unidas en forma
covalente (de aquí en adelante "conjugadas") a uno o más grupos
químicos. Tales variantes pueden ser particularmente útiles para
usos in vivo. Los grupos químicos apropiados para el uso en
un conjugado de la variante 20P1F12/TMPRSS2 de la presente
descripción son preferiblemente significativamente no tóxicos o
inmunogenes, es decir, cualquier toxicidad o inmunogenicidad
observada con un conjugado de variante de 20P1F12/TMPRSS2 no es
significativamente (p. ej., menor que el 50%) mayor que cualquier
toxicidad o inmunogenicidad observada con la correspondiente
variante no modificada de 20P1F12/TMPRSS2. Típicamente, se
selecciona un grupo químico que reduce la toxicidad y/o
inmunogenicidad asociada a la variante no modificada de
20P1F12/TMPRSS2. Además, el grupo químico se selecciona
convenientemente para producir un conjugado de variante de
20P1F12/TMPRSS2 que puede conservarse y utilizarse en condiciones
apropiadas para la conservación y uso de la variante no modificada
de 20P1F12/TMPRSS2. Los grupos químicos que sirven de ejemplo
incluyen carbohidratos, tales como, por ejemplo, los carbohidratos
que aparecen naturalmente en las glicoproteínas, y polímeros no
proteicos, tales como polioles.
Un poliol, por ejemplo, puede conjugarse con una
molécula variante de 20P1F12/TMPRSS2 en uno o más residuos de
aminoácidos, incluyendo residuos de lisina, según se describe en WO
93/00109. El poliol empleado puede ser cualquier polímero de
poli(óxido de alquileno) soluble en agua y puede tener una cadena
lineal o ramificada. Los polioles apropiados incluyen los
sustituidos en una o más posiciones de hidroxilos con un grupo
químico, tal como un grupo alquilo que posee entre uno y cuatro
carbonos, Típicamente, el poliol es un poli(alquilenglicol),
tal como polietilenglicol) (PEG) y, de este modo, para facilitar la
descripción, el resto de la descripción se refiere a una
realización a modo de ejemplo en donde el poliol empleado es PEG y
el proceso de conjugar el poliol con una variante de
20P1F12/TMPRSS2 se denomina "pegilación". Sin embargo, los
expertos en la técnica reconocen que pueden emplearse otros
polioles, tales como, por ejemplo, polipropilenglicol y copolímeros
polietileno-polipropilenglicol, utilizando las
técnicas para conjugación descritas en la presente memoria para PEG.
El grado de pegilación de una variante de 20P1F12/TMPRSS2 de la
presente invención puede ajustarse para proporcionar una semivida
in vivo deseablemente aumentada (de aquí en adelante
"semivida"), en comparación con la proteína no pegilada
correspondiente.
Se ha descrito una variedad de métodos para
pegilar proteínas. Véase, p. ej., la Patente Estadounidense No.
4.179.337 (concedida a Davis et al.), que describe la
conjugación de una serie de hormonas y enzimas con PEG y
polipropilenglicol para producir composiciones no inmunogenes
fisiológicamente activas. En general, un PEG que posee al menos un
grupo hidroxi terminal se hace reaccionar con un agente de
acoplamiento para formar un PEG activado que posee un grupo
reactivo terminal. Este grupo reactivo después puede hacerse
reaccionar con \alpha- y \varepsilon-aminas de
proteínas para formar un enlace covalente. De manera conveniente,
el otro extremo de la molécula de PEG puede "bloquearse" con un
grupo químico no reactivo, tal como un grupo metoxi, para reducir
la formación de complejos de moléculas de proteínas entrecruzados
con PEG.
Tal como se observó más arriba, los ensayos que
evalúan el estatus de 20P1F12/TMPRSS2 (p. ej. el estatus del gen
20P1F12/TMPRSS2 y productos génicos tales como ARNm y proteínas) en
un individuo pueden utilizarse para proporcionar información acerca
del crecimiento o potencial oncogénico de células del individuo. En
particular, el descubrimiento de que el ARNm de 20P1F12/TMPRSS2 se
expresa en forma tan elevada en líneas de cáncer de próstata y
colon identifica este gen y sus productos como blancos que el
técnico experto puede utilizar para evaluar muestras biológicas de
individuos de los que se sospecha poseen una enfermedad asociada con
alteraciones en el estatus de 20P1F12/TMPRSS2.
Debido a que 20P1F12/TMPRSS2 se expresa en
diversos tejidos y líneas celulares de xenoinjertos de cáncer de
próstata, y también se expresa en algunas líneas celulares de cáncer
de colon, el estatus de expresión de 20P1F12/
TMPRSS2 puede proporcionar información útil para determinar información, incluyendo la presencia, estadio y ubicación de las células displásicas, precancerosas y cancerosas, previendo la susceptibilidad a diversos estadios de la enfermedad, y/o para medir la agresividad del tumor. Más aún, el perfil de expresión y la localización en la superficie celular de 20P1F12/TN PRSS2 la convierte en un potencial reactivo para obtención de imágenes para la enfermedad metastásica. En consecuencia, un importante aspecto de la invención está relacionado con los diferentes métodos pronósticos y diagnósticos moleculares para examinar el estatus de 20P1F12/TMPRSS2 en muestras biológicas tales como las de individuos que sufren, o se sospecha que sufren, una patología caracterizada por el crecimiento celular desregulado, tal como el cáncer.
TMPRSS2 puede proporcionar información útil para determinar información, incluyendo la presencia, estadio y ubicación de las células displásicas, precancerosas y cancerosas, previendo la susceptibilidad a diversos estadios de la enfermedad, y/o para medir la agresividad del tumor. Más aún, el perfil de expresión y la localización en la superficie celular de 20P1F12/TN PRSS2 la convierte en un potencial reactivo para obtención de imágenes para la enfermedad metastásica. En consecuencia, un importante aspecto de la invención está relacionado con los diferentes métodos pronósticos y diagnósticos moleculares para examinar el estatus de 20P1F12/TMPRSS2 en muestras biológicas tales como las de individuos que sufren, o se sospecha que sufren, una patología caracterizada por el crecimiento celular desregulado, tal como el cáncer.
Se sabe que la oncogénesis es un proceso de
crecimiento de múltiples etapas donde el crecimiento celular se
vuelve progresivamente desregulado y las células avanzan desde un
estado fisiológico normal a estados precancerosos y después
cancerosos (véase, p. ej., Alers et al., Lab Invest
77(5): 437-438 (1997) e Isaacs et al.,
Cancer Surv. 23: 19-32 (1995)). En este contexto,
examinar una muestra biológica en busca de evidencia de crecimiento
celular desregulado (tal como expresión anómala de 20P1F12/TMPRSS2
en cánceres de próstata, vejiga, ovario, pulmón, riñón o colon, o
cánceres metastásicos) puede permitir la detección temprana de dicha
fisiología celular aberrante antes de que una patología tal como el
cáncer haya avanzado a un estadío en el que las opciones
terapéuticas son más limitadas. En dichos exámenes, el estatus de
20P1F12/TMPRSS2 en una muestra biológica de interés (tal como una
que se sospecha que posee crecimiento celular desregulado) puede
compararse, por ejemplo, con el estatus de 20P1F12/TMPRSS2 en una
muestra normal correspondiente (p. ej. una muestra de ese individuo
(o alternativamente otro individuo) que no esté afectada por una
patología, por ejemplo una que se sospeche que no posee crecimiento
celular desregulado) con alteraciones en el estatus de
20P1F12/TMPRSS2 en la muestra biológica de interés (en comparación
con la muestra normal), proporcionando evidencia del crecimiento
celular desregulado. Además de utilizar una muestra biológica que
no esté afectada por una patología como muestra normal, también se
puede utilizar un valor normativo predeterminado tal como un nivel
normal predeterminado de la expresión del ARNm (véase, p. ej.,
Grever et al., J. Comp. Neurol. diciembre de 1996
9;376(2):306-14 y Patente Estadounidense No.
5.837.501) para comparar 20P1F12/TMPRSS2 en muestras normales versus
sospechosas.
El término "estatus" en este contexto se
utiliza conforme a su significado aceptado en la técnica y se
refiere a la condición o estado de un gen y sus productos. Tal como
se describe específicamente en la presente memoria, el estatus de
20P1F12/TMPRSS2 puede evaluarse mediante una serie de parámetros
conocidos en la técnica. Por ejemplo, según se muestra en la Figura
3 y se describe en el Ejemplo 1, el estatus de 20P1F12/TMPRSS2 en
una muestra biológica puede evaluarse examinando las secuencias de
los polinucleótidos y/o polipéptidos de 20P1F12/TMPRSS2 en esa
muestra biológica. Alternativamente, según se muestra en las Figuras
5-7 y se describe en los Ejemplos 3 y 4, el estatus
de 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra biológica puede evaluarse
examinando los niveles de los productos génicos de 20P1F12/TMPRSS2
(p. ej. ARNm y/o proteínas) en esa muestra biológica.
Alternativamente, según se muestra en las Figuras 17 y la Tabla 1,
el estatus de 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra biológica puede
evaluarse observando la localización de 20P1F12/TMPRSS2 en muestras
biológicas normales y comparándola con la localización de
20P1F12/TMPRSS2 en muestras biológicas sospechadas de contener
evidencia de crecimiento celular desregulado. Alternativamente,
según se muestra en las Figuras 18 y se describe en el Ejemplo 10,
el estatus de 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra biológica puede
evaluarse examinando la presencia o ausencia de una especie de
20P1F12/TMPRSS2 específica tal como el fragmento de proteasa de 32
kD que resulta de la ruptura autocatalítica
post-traduccional. Alternativamente, según se
muestra en las Figuras 20-23 y se describe en el
Ejemplo 11, el estatus de 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra biológica
puede evaluarse buscando la presencia o ausencia de un complejo
inmunorreactivo específico de 20P1F12/TMPRSS2 en la muestra
biológica.
Típicamente, los técnicos expertos utilizan una
serie de parámetros para evaluar la condición o estado de un gen y
sus productos. Estos incluyen, sin limitación, la integridad y/o
patrón de metilación de un gen, incluyendo sus secuencias
reguladoras, la localización de los productos génicos expresados
(incluyendo la ubicación de las células que expresan
20P1F12/TMPRSS2), la presencia, nivel y actividad biológica de los
productos génicos expresados (tales como polinucleótidos y
polipéptidos del ARNm de 20P1F12/TMPRSS2), la presencia o ausencia
de modificaciones transcripcionales y traduccionales a los productos
génicos expresados así como asociaciones de productos génicos
expresados con otras moléculas biológicas tales como parejas de
unión a proteínas (p. ej., un complejo
proteína-proteína como se muestra, por ejemplo, en
la Figura 21).
Las alteraciones en el estatus de
20P1F12/TMPRSS2 pueden evaluarse mediante una amplia variedad de
metodologías bien conocidas en la técnica, típicamente aquellas
tratadas más abajo. Típicamente una alteración en el estatus de
20P1F12/TMPRSS2 comprende un cambio en la localización de
20P1F12/TMPRSS2 y/o las células que expresan 20P1F12/TMPRSS2, un
incremento en el ARNm de 20P1F12/TMPRSS2 y/o la expresión de la
proteína y/o la asociación o disociación de 20P1F12/TMPRSS2 con
una pareja de unión. Como los datos presentados en la presente
memoria proporcionan evidencia de que las proteínas 20P1F12/TMPRSS2
son secretadas en los sueros tras la alteración de la arquitectura
glandular (véase, p. ej., la Figura 17 y la Tabla 1), una alteración
representativa específica en el estatus de 20P1F12/TMPRSS2 incluye
un cambio en los niveles de las proteínas 20P1F12/TMPRSS2 secretadas
en el suero.
Tal como se trata en detalle en la presente
memoria, a fin de identificar una afección o fenómeno asociado al
crecimiento celular desregulado, el estatus de 20P1F12/TMPRSS2 en
una muestra biológica puede evaluarse mediante una serie de métodos
utilizados por los técnicos expertos incluyendo, pero sin
limitación, análisis genómico Southern (para examinar, por ejemplo,
perturbaciones en el gen 20P1F12/TMPRSS2), análisis Northern y/o
PCR del ARNm de 20P1F12/TMPRSS2 (para examinar, por ejemplo,
alteraciones en las secuencias de polinucleótidos o niveles de
expresión de los ARNm de 20P1F12/TMPRSS2), y análisis Western y/o
inmunohistoquímico (para examinar, por ejemplo, las alteraciones en
las secuencias de polipéptidos, las alteraciones en la localización
de polipéptidos dentro de una muestra, alteraciones en los niveles
de expresión de las proteínas 20P1F12/TMPRSS2 y/o asociaciones de
proteínas 20P1F12/TMPRSS2 con parejas de unión a polipéptidos). Los
polinucleótidos detectables de 20P1F12/TMPRSS2 incluyen, por
ejemplo, un gen 20P1F12/TMPRSS2 o fragmentos del mismo, ARNm de
20P1F12/TMPRSS2, ARNms de 20P1F12/TMPRSS2 de variantes alternativas
de empalme, y moléculas de ADN o ARN recombinantes que contienen un
polinucleótido de 20P1F12/TMPRSS2.
Tal como se trata en los Ejemplos 6, 8, 9 y 11 y
se muestra, por ejemplo, en las Figuras 20, 22, 23, 24 y 26, se
observa una serie de diferentes especies de 20P1F12/TMPRSS2 en
diversas muestras biológicas. En este contexto, la presencia,
ausencia y/o niveles de polipéptidos detectables de 20P1F12/TMPRSS2
puede examinarse para obtener información acerca del estatus de una
muestra. Los polipéptidos detectables de 20P1F12/TMPRSS2 incluyen,
por ejemplo, el polipéptido de dominio de proteasa de 32 kD, la
proteína 20P1F12/TMPRSS2 de longitud completa de 70 kD así como las
especies de 90 kD y 103 kD que posiblemente representan complejos de
un polipéptido 20P1F12/TMPRSS2 y una segunda molécula biológica
(tal como se observa, por ejemplo con PSA). Es más, los técnicos
expertos son conscientes de que las observaciones de polipéptidos
y/o complejo(s) de proteínas similares y su relación pueden
entonces aplicarse en el diagnóstico de pacientes con, por ejemplo,
cáncer de próstata, vejiga, ovario, pulmón o colon (véase, p. ej.,
5.672.480, 5.939.533, 5.840.501 tratadas más abajo). Esto es
particularmente relevante en el contexto de 20P1F12/TMPRSS2 porque,
según se muestra, por ejemplo, en la Figura 23, en lisado tisular
entero de la próstata de un individuo masculino normal de 28 años
víctima de un accidente (panel C), la relación entre las especies
de 70 kD y 32 kD de 20P1F12/TMPRSS2 parece ser diferente de la
observada en el lisado tisular entero de las próstatas de
individuos que sufren de cáncer (panel B).
Se contempla una variedad de observaciones que
examinan diversas especies de 20P1F12/TMPRSS2 y sus relaciones en
el contexto de métodos diagnósticos. Se puede examinar, por ejemplo:
la relación de la especie de 32 kD respecto de la especie de 70 kD,
la especie de 90 kD y/o la especie de 103 kD; la relación de la
especie de 70 kD respecto de la especie de 32 kD, la especie de 90
kD y/o la especie de 103 kD; la relación de la especie de 90 kD
respecto de la especie de 32 kD, la especie de 70 kD y/o la especie
de 103 kD; y la relación de la especie de 103 kD respecto de la
especie de 32 kD, la especie de 70 kD y/o la especie de 90 kD, etc.
Alternativamente, se puede examinar una relación de un subconjunto
de especies de 20P1F12/TMPRSS2 y, además, la presencia de otra
especie específica de 20P1F12/TMPRSS2. Se puede examinar, por
ejemplo: la relación de la especie de 32 kD respecto de la especie
de 70 kD y la presencia de la especie de 90 kD y/o la especie de 103
kD; la relación de la especie de 70 kD respecto de la especie de 90
kD y la presencia de la especie de 32 kD y/o la especie de 103 kD;
la relación de la especie de 103 kD respecto de la especie de 32 kD
y la presencia de la especie de 70 kD y/o la especie de 90 kD, etc.
Alternativamente, se puede examinar una relación de un subconjunto
de especies de 20P1F12/TMPRSS2 y, además, una relación de otro
subconjunto de especies de 20P1F12/TMPRSS2. Se puede examinar, por
ejemplo: la relación de la especie de 32 kD respecto de la especie
de 70 kD y la relación de la especie de 32 kD respecto de la
especie de 90 kD; la relación de la especie de 70 kD respecto de la
especie de 103 kD y la relación de la especie de 90 kD respecto de
la especie de 32 kD; la relación de la especie de 70 kD respecto de
la especie de 90 kD y la relación de la especie de 103 kD respecto
de la especie de 32 kD, etc.
Al examinar las diferentes especies de
20P1F12/TMPRSS2 y sus relaciones en el contexto de métodos
diagnósticos, también se pueden tener en cuenta factores
adicionales tales como su estatus normal en el tejido biológico
específico que se está examinando (véase, p. ej., el tejido según se
muestra en la Figura 17, líquido seminal según se muestra en la
Figura 20 y suero según se muestra en la Figura 23). Por ejemplo,
diversas parejas de unión que pueden complejarse con proteínas
20P1F12/TMPRSS2 pueden estar presentes en cantidades variables en
diferentes linajes tisulares. En consecuencia, pueden analizarse los
niveles relativos de las parejas de unión que pueden complejarse
con las proteínas 20P1F12/TMPRSS2. Las calles 5-7 de
la Figura 26 ilustran los diferentes niveles aparentes de tales
parejas de unión en diferentes muestras proporcionando evidencia de
que ciertas especies de 20P1F12/TMPRSS2 parecen darse
predominantemente en muestras obtenidas de colon y no en próstata
(véase, p. ej., la banda a aproximadamente 45-50
kD). Además, esta banda de 45-50 kD parece
expresarse predominantemente en muestras de colon normal (véanse,
p. ej., las calles 1 y 2), proporcionando respaldo adicional a las
metodologías que utilizan la presencia, ausencia o niveles relativos
de una o más especies de 20P1F12/TMPRSS2 y/o parejas de unión de
20P1F12/TMPRSS2 para proporcionar información diagnóstica acerca del
estatus de una muestra.
Al examinar las diferentes especies de
20P1F12/TMPRSS2 y sus relaciones en el contexto de métodos
diagnósticos, también pueden tenerse en cuenta factores tales como
la localización de las especies de 20P1F12/TMPRSS2 ya sea dentro de
una célula (véanse, p. ej., las especies de 20P1F12/TMPRSS2
asociadas a células que se muestran en la Figura 17) o fuera de una
célula (véanse, p. ej., Las especies de 20P1F12/TMPRSS2 secretadas
que se muestran en las Figuras 22 y 23). Tales observaciones son
bien conocidas en la técnica y pueden tomarse por ejemplo
utilizando anticuerpos específicamente dirigidos a un dominio dentro
de una especie secretada (es decir, el dominio de proteasa) o
anticuerpos específicamente dirigidos a un dominio asociado a la
superficie celular.
Tal como se trata en detalle más abajo,
20P1F12/TMPRSS2 puede analizarse mediante cualquier técnica dentro
de la amplia variedad de técnicas empleadas para tales fines,
incluyendo: (i) análisis inmunohistoquímico, (ii) hibridización
in situ, (iii) análisis RT-PCR, (iv) análisis
de transferencia Western de muestras clínicas y líneas celulares,
(v) análisis de matrices tisulares y (vi) obtención de imágenes
in vivo. Los protocolos típicos ilustrativos para evaluar el
estatus de un gen y sus productos puede encontrarse, por ejemplo, en
Current Protocols In Molecular Biology, Unidades 2 [Northern
Blotting], 4 [Southern Blotting], 15 [Immunoblotting] y 18 [PCR
Analysis], Frederick M. Ausubul et al. eds., 1995. Diversos
ensayos inmunológicos específicos útiles para la detección de
proteínas 20P1F12/TMPRSS2 incluyen, sin limitación, varios tipos de
radioinmunoensayos, ensayos de inmunosorción ligados a enzimas
(ELISA), ensayos inmunofluorescentes acoplados a enzimas (ELIFA),
métodos inmunocitoquímicos y similares. Como ejemplo, los
anticuerpos contra 20P1F12/TMPRSS2 pueden marcarse y utilizarse
como reactivos inmunológicos para obtención de imágenes capaces de
detectar células de cáncer de próstata, vejiga, ovario, pulmón,
riñón o colon, o células de cáncer metastásico (p. ej., en métodos
radiocentellográficos de obtención de imágenes). Para la obtención
de imágenes radiocentellográficas in vivo, se prefieren los
anticuerpos radiomarcados de 20P1F12/TMPRSS2 específicamente
reactivos con epitopos secretados de 20P1F12/TMPRSS2.
Los ensayos para identificar trastornos
asociados a la desregulación del crecimiento celular, tal como
sucede en los cánceres de próstata, vejiga, ovario, pulmón, riñón o
colon, o cánceres metastásicos, pueden comprender detectar los
niveles de polipéptidos o polinucleótidos de 20P1F12/TMPRSS2 en
cualquier muestra dentro de una amplia variedad de muestras
biológicas utilizadas para evaluar estados patológicos, tales como
orina, materia fecal o semen así como preparaciones celulares de
tejidos que pueden estar afectados cuando el cáncer produce
metástasis. Las muestras típicas incluyen sangre periférica y/o
suero que pueden analizarse convenientemente para determinar la
presencia de proteínas 20P1F12/TMPRSS2 o células cancerosas,
incluyendo, sin limitación, cánceres de próstata, vejiga, ovario,
pulmón, riñón o colon, o cánceres metastásicos. En este contexto, en
la presente memoria se describen varias especies de 20P1F12/TMPRSS2
en una variedad de muestras biológicas que incluyen tejido (véase,
p. ej., la Figura 17), suero (véase, p. ej., la Figura 23) y plasma
seminal (véase, p. ej., la Figura 24).
La sangre periférica y suero pueden analizarse
convenientemente para determinar la presencia de proteína
20P1F12/TMPRSS2 y/o de células de cáncer de próstata, vejiga, ovario, pulmón, riñón o colon, o células de cáncer metastásico, utilizando, por ejemplo, análisis inmunológico o Northern o RT-PCR para detectar 20P1F12/TMPRSS2. Los ensayos de detección por RT-PCR para células tumorales en sangre periférica actualmente están siendo evaluados para el uso en el diagnóstico y manejo de una serie de tumores sólidos humanos. En el campo del cáncer de próstata, estos incluyen ensayos RT- PCR para la detección de células que expresan PSA y PSM (Verkaik et al., 1997, Urol. Res. 25: 373-384; Ghossein et al., 1995, J. Clin. Oncol. 13: 1195-2000; Heston et al., 1995, Clin. Chem. 41: 1687-1688). En otro abordaje, puede utilizarse un ensayo sensible descrito recientemente para detectar y caracterizar células de carcinomas en sangre (Racila et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 4589-4594). Este ensayo combina enriquecimiento inmunogenético con análisis inmunohistoquímico y citométrico de flujo de múltiples parámetros, y es sumamente sensible para la detección de células cancerosas en sangre, según se informa capaz de detectar una célula epitelial en 1 ml de sangre periférica.
20P1F12/TMPRSS2 y/o de células de cáncer de próstata, vejiga, ovario, pulmón, riñón o colon, o células de cáncer metastásico, utilizando, por ejemplo, análisis inmunológico o Northern o RT-PCR para detectar 20P1F12/TMPRSS2. Los ensayos de detección por RT-PCR para células tumorales en sangre periférica actualmente están siendo evaluados para el uso en el diagnóstico y manejo de una serie de tumores sólidos humanos. En el campo del cáncer de próstata, estos incluyen ensayos RT- PCR para la detección de células que expresan PSA y PSM (Verkaik et al., 1997, Urol. Res. 25: 373-384; Ghossein et al., 1995, J. Clin. Oncol. 13: 1195-2000; Heston et al., 1995, Clin. Chem. 41: 1687-1688). En otro abordaje, puede utilizarse un ensayo sensible descrito recientemente para detectar y caracterizar células de carcinomas en sangre (Racila et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 4589-4594). Este ensayo combina enriquecimiento inmunogenético con análisis inmunohistoquímico y citométrico de flujo de múltiples parámetros, y es sumamente sensible para la detección de células cancerosas en sangre, según se informa capaz de detectar una célula epitelial en 1 ml de sangre periférica.
20P1F12/TMPRSS2 comparte una serie de
características con el antígeno específico de la próstata,
incluyendo regulación de andrógenos, dominios funcionales
similares, una presencia en suero, la capacidad para formar un
complejo con una o más proteínas y niveles de expresión aumentados
que están asociados al cáncer. En consecuencia, los diferentes
ensayos conocidos en la técnica para evaluar PSA proporcionan
ilustraciones de métodos típicos que también pueden utilizarse para
evaluar 200P1F12/TIVPRSS2. Más abajo se proporciona una cantidad de
ensayos representativos que incluyen el examen de PSA que contienen
métodos que pueden adaptarse para el uso con 20P1F12/TMPRSS2. Tales
ensayos también pueden utilizarse en combinación con ensayos para
evaluar el estatus de 20P1F12/TMPRSS2.
La Patente Estadounidense No. 5.840.501
proporciona métodos típicos para examinar inmunológicamente PSA
determinable en una muestra de sangre. En esta variación de dichos
ensayos bien conocidos, el PSA se examina mediante un ensayo
inmunométrico de dos sitios en el que la muestra de sangre se trata
par liberar el PSA (PSAf) inmunológicamente no detectable. Se ha
descubierto que la medición de los niveles sanguíneos de PSAc en
este contexto proporciona un método para contribuir al diagnóstico
y monitoreo del cáncer de próstata que es sumamente sensible y
específico, y elimina la necesidad de que un número importante de
pacientes se someta a una innecesaria biopsia de próstata. Un
método de ensayo inmunométrico particularmente preferido descrito en
la Patente Estadounidense No. 5.840.501 emplea tres anticuerpos
anti-PSA: un anticuerpo que se une a ambos PSAc y
PSAf (anti-tPSA), un segundo anticuerpo
anti-PSAt que se caracteriza por su propiedad única
de que la unión a PSAf se bloquea mediante la unión de anticuerpos
específicos de PSAf, y un tercer anticuerpo que es un anticuerpo
específico de PSAf. De este modo, la unión del anticuerpo
específico de PSAf a PSA en la muestra sólo permite que se mida PSAc
en el ensayo inmunométrico. Después de los métodos descritos en la
Patente Estadounidense No. 5.840.501 el experto en la técnica
podría emplear métodos análogos con, por ejemplo, tres anticuerpos
anti-20P1F12/TMPRSS2: un anticuerpo que se une a
ambas 20P1F12/TMPRSS2c y 20P1F12/TMPRSS2f
(anti-20P1F12/TMPRSS2t), un segundo anticuerpo
anti-20P1F12/TMPRSS2t que se caracteriza por su
propiedad única de que la unión a 20P1F12/TMPRSS2f se bloquea
mediante la unión a anticuerpos específicos de 20P1F12/TMPRSS2f, y
un tercer anticuerpo que es un anticuerpo específico de
20P1F12/TMPRSS2f. De este modo, la unión del anticuerpo específico
de 20P1F12/TMPRSS2f a 20P1F12/TMPRSS2 en la muestra permitiría que
sólo 20P1F12/TMPRSS2c se mida en un ensayo inmunométrico.
La Patente Estadounidense No. 5.939.5331
proporciona inmunoensayos típicos adicionales para medir PSA libre
así como un complejo inhibidor de proteinasa. En los métodos
descritos en la Patente Estadounidense No. 5.939.533, el PSA libre
y el complejo de PSA se miden mediante un inmunoensayo no
competitivo que emplea al menos dos anticuerpos monoclonales
diferentes. El método además se caracteriza porque el complejo
PSA-inhibidor de la proteinasa de interés se forma
ya sea con \alpha_{1-}antiquimotripsina, con el inhibidor de la
\alpha_{1-}proteasa (API) o con
\alpha_{2}-macroglobulina. Más aún, el método
descrito en la Patente 5.939.533 se caracteriza por la observación
de que el PSA libre, el complejo PSA-inhibidor de la
proteinasa y su relación pueden aplicarse en el diagnóstico de
pacientes con cáncer de próstata. Siguiendo los métodos descritos en
la Patente Estadounidense No. 5.939.533, un experto en la técnica
podría emplear métodos análogos para observar, por ejemplo, las
especies de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 que se muestran en las
Figuras 23, 24 y 26. En este contexto, pueden aplicarse entonces
las observaciones de 20P1F12/TMPRSS2 libre y/o el/los
complejo(s) 20P1F12/TMPRSS2-proteína y su
relación en el diagnóstico de pacientes con, por ejemplo, cáncer de
próstata, vejiga, ovario, pulmón, riñón o colon, o cáncer
metastásico.
La Patente Estadounidense No. 5.672.480
proporciona métodos de inmunoensayos típicos adicionales para el
antígeno específico de la próstata (PSA). En los métodos descritos
en 5.672.480 también se presenta un complejo que se asemeja a un
complejo de PSA y \alpha_{1}-antiquimotripsina
(ACT) que puede utilizarse como calibrador o control en un
inmunoensayo para PSA. Además en la Patente 5.672.480 se presentan
métodos para fraccionar anticuerpos policlonales contra PSA, en
aquellos que se unen a epitopos que están enmascarados por la unión
de PSA a ACT y aquellos que no se unen a dichos epitopos. Siguiendo
los métodos descritos en los métodos expuestos en la patente
5.672.480 el experto en la técnica podría emplear métodos análogos
para generar un complejo que se asemeje a un complejo de
20P1F12/TMPRSS2 y su pareja de unión que pueda utilizarse como
calibrador o control en un inmunoensayo para 20P1F12/TMPRSS2.
Además, el experto en la técnica podría emplear los métodos
presentados en la patente 5.672.480 para fraccionar anticuerpos
policlonales contra 20P1F12/TMPRSS2, en aquellos que se unen a
epitopos que están enmascarados por la unión de 20P1F12/TMPRSS2 a su
pareja de unión y aquellos que no se unen a dichos epitopos.
La Patente Estadounidense No. 5.614.372 describe
otro ensayo de bioafinidad típico del antígeno específico de la
próstata (PSA) que comprende o bien la medición de la concentración
de PSA total (PSA-T), la concentración de la forma
libre de PSA (PSA-F) o la concentración de PSA
complejado con
alfa-1-antiquimotripsina (PSA-.ACT),
siendo PSA-T la suma de PSA-F y
PSA-ACT. Conforme a la descripción de la Patente
Estadounidense No. 5.614.372, se mide además la concentración de
otra molécula, la calicreína glandular humana
(hGK-1). Las concentraciones de
PSA-T y hGK-1 pueden medirse en un
único ensayo o en ensayos separados, utilizándose la suma de las
concentraciones de PSA-T y hGK-1
para determinar la relación a) PSA
F/(PSA-T+hGK-1:) y/o b)
PSA-ACT/(PSA-T+hGK-1).
En la descripción de la Patente Estadounidense No. 5.614.372 se
demuestra que ambas relaciones poseen utilidad clínica para la
discriminación del cáncer de próstata y la hiperplasia prostática
benigna. Siguiendo los métodos descritos en la patente 5.614.372,
el experto en la técnica podría emplear métodos análogos para
analizar 20P1F12/TMPRSS2, que comprende la medición de ya sea la
concentración de 20P1F12/TMPRSS2 total
(20P1F12/TMPRSS2-T), la concentración de la forma
libre de 20P1F12/TMPRSS2 (20P1F12/TMPRSS2-F) o la
concentración de 20P1F12/TMPRSS2 complejada con su pareja de unión
(20P1F12/TMPRSS2-BP), siendo
20P1F12/TMPRSS2-T la suma de
20P1F12/TMPRSS2-F y
20P1F12/TMPRSS2-BP. Además, la concentración de
calicreína glandular humana (hGK-1) puede medirse y
utilizarse para determinar la relación a)
20P1F12/TMPRSS2-F/(20P1F12/TMPRSS2-T+hGK-1)
y/o b)
20PlF12/TMPRSS2-ACT/(20P1Fl2/TMPRSS2-T+hGK-1).
Tal como en la descripción de la Patente Estadounidense No.
5.614.372, estas relaciones pueden emplearse para utilidad
clínica.
La Patente Estadounidense No. 5.939.258
proporciona otros métodos típicos para diagnosticar micrometástasis
de próstata mediante los que se aíslan ácidos nucleicos de una
muestra tisular de un paciente, se amplifican los ácidos nucleicos
de la muestra tisular específica para el cáncer de próstata, o se
amplifica una señal generada por hibridización de una sonda
específica de un ácido nucleico específico del cáncer de próstata;
y la detección de ácidos nucleicos amplificados es indicativa de
micrometástasis del cáncer de próstata. Según se ilustra en detalle
más abajo, las sondas específicas para un ácido nucleico de
20P1F12/TMPRSS2 pueden amplificarse de manera similar; con la
detección de ácidos nucleicos amplificados proporcionando evidencia
de micrometástasis del cáncer de próstata o colon.
La Patente Estadounidense Núm. 5.972.615
proporciona otrastécnicas diagnósticas típicas para la detección de
enfermedad prostáica humana. La invención se refiere particularmente
a sondas y métodos para evaluar la presencia de especies de ARN que
se expresan en forma diferencial en cáncer de próstata metastásico
en comparación con próstata humana normal, hiperplasia prostática
benigna, y cáncer de próstata no metastásico. La invención también
se refiere a sondas y métodos para evaluar la presencia de especies
de ARN que se expresan en forma diferencial en la sangre periférica
de individuos con el estado de enfermedad en comparación con
individuos saludables normales. Se describen métodos de uso
terapéutico para los genes identificados como diferencialmente
expresados en cáncer de próstata metastásico y medios para
seleccionar productos farmacéuticos eficaces en el tratamiento del
cáncer de próstata. De manera similar, la Patente Estadounidense
Núm. 5.972.615 proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas de
mamíferos que codifican antígeno de membrana específico de próstata
(PSM) alternativamente empalmado , moléculas de ácido nucleico
aisladas que codifican secuencias promotoras del antígeno de
membrana específico de próstata y métodos para detectar células
tumorales micrometastásicas hematógenas de un individuo en el
contexto de la determinación del avance del cáncer de próstata en un
individuo. Según se ilustra en detalle más abajo, pueden utilizarse
moléculas específicas para 20P1F12/TMPRSS2 para detectar células
tumorales micrometastásicas hematógenas de un individuo en el
contexto de la determinación del avance en un individuo del cáncer
de próstata, vejiga, ovario, pulmón y/o colon, y/u otros cánceres,
incluyendo cánceres metastásicos.
Según se ilustra en los diferentes ejemplos
típicos proporcionados más abajo, puede utilizarse una amplia
variedad de métodos para determinar el estatus de 20P1F12/TMPRSS2 en
un individuo para proporcionar información pronóstica y/o
diagnóstica. Tales métodos para determinar el estatus de
20P1F12/TMPRSS2 pueden proporcionar información útil para predecir
la susceptibilidad a una enfermedad particular, los estadíos y
avance de la enfermedad y/o la agresividad tumoral. En este
contexto se proporciona más abajo una variedad de aspectos
ilustrativos relacionados con la invención como métodos y ensayos
típicos para determinar el estatus de 20P1F12/TMPRSS2 y evaluar
síndromes que incluyen la desregulación del crecimiento celular.
Un ejemplo particularmente preferido relacionado
con la invención consiste en un método para examinar o ensayar una
muestra biológica de interés para hallar evidencia de crecimiento
celular desregulado, que comprende comparar el estatus de
20P1F12/TMPRSS2 en la muestra biológica de prueba con el estado de
20P1F12/TMPRSS2 en una muestra normal correspondiente, en donde las
alteraciones en el estado de 20P1F12/TMPRSS2 en la muestra biológica
están asociadas al crecimiento celular desregulado. Como la
desregulación del crecimiento celular (es decir, la alteración de
la proliferación celular normal que aparece en las células
hiperplásicas, precancerosas y cancerosas, etc.) es un factor
significativo en el proceso complejo de múltiples etapas de
carcinogénesis y avance tumoral, los métodos para identificar una
afección o fenómeno que es indicativo del crecimiento celular
desregulado (es decir, una alteración en la biología normal de
20P1F12/TMPRSS2) son de particular interés para los médicos porque
la detección temprana de patologías tales como cánceres tiene una
profunda influencia sobre la morbilidad y la mortalidad.
Según se muestra, por ejemplo, en la Figura 5 y
la Figura 7, se descubre que 20P1F12/TMPRSS2 está sobreexpresada en
los tejidos o líneas celulares de cáncer de próstata, cáncer de
colon, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón y cáncer ovárico, así
como en un conjunto de tejidos de cáncer metastásico, mientras que
está subexpresada en tejidos de cáncer de riñón (véase también la
Figura 33, donde TMPRSS2 está subexpresada en tejidos tumorales en
la mayoría de las muestras y sobreexpresada en una muestra). Más
aún, tal como se trata en detalle más abajo, 20P1F12/TMPRSS2 exhibe
una constelación de características que proporcionan fuerte
evidencia de que está involucrada en procesos oncogénicos. En
consecuencia, la identificación de alteraciones en el estatus de
20P1F12/TMPRSS2 en una muestra de prueba (p. ej. un incremento en la
expresión del ARNm) en comparación con una muestra normal
correspondiente de, por ejemplo, una localización proximal no
afectada (p. ej. tejido de colon o próstata normal) o un individuo
no afectado proporciona evidencia de crecimiento celular
desregulado.
Según se describe en detalle más arriba, el
estatus de 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra biológica puede examinarse
mediante una serie de procedimientos bien conocidos en la técnica.
Por ejemplo, el estatus de 20P1F12/
TMPRSS2 en una muestra biológica puede examinarse comparando, por ejemplo, el nivel de expresión del polinucleótido o polipéptido de 20P1F12/TMPRSS2 que se sabe que aparece en muestras no cancerosas versus muestras precancerosas o cancerosas (con una sobreexpresión de polinucleótidos o polipéptidos de 20P1F12/TMPRSS2 proporcionando evidencia de crecimiento celular desregulado). En este contexto, la 20P1F12/TMPRSS2 que puede evaluarse incluye tanto la secuencia polinucleotídica 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la SEC ID NO.: 1 como la secuencia del polipéptido 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la SEC ID NO.: 2.
TMPRSS2 en una muestra biológica puede examinarse comparando, por ejemplo, el nivel de expresión del polinucleótido o polipéptido de 20P1F12/TMPRSS2 que se sabe que aparece en muestras no cancerosas versus muestras precancerosas o cancerosas (con una sobreexpresión de polinucleótidos o polipéptidos de 20P1F12/TMPRSS2 proporcionando evidencia de crecimiento celular desregulado). En este contexto, la 20P1F12/TMPRSS2 que puede evaluarse incluye tanto la secuencia polinucleotídica 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la SEC ID NO.: 1 como la secuencia del polipéptido 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la SEC ID NO.: 2.
Una muestra biológica tomada de una localización
específica en el organismo también puede examinarse evaluando la
muestra para determinar la presencia o ausencia de células que
expresan 20P1F12/TMPRSS2 (p. ej. las que expresan ARNm o proteínas
20P1F12/TMPRSS2). Este examen puede proporcionar evidencia del
crecimiento celular desregulado, por ejemplo, cuando las células
que expresan 20P1F12/TMPRSS2 se encuentran en una muestra biológica
de una región del organismo que normalmente no contiene tales
células (tal como un ganglio linfático, hueso o hígado, etc.).
Tales alteraciones en el estatus de 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra
biológica a menudo están asociadas al crecimiento celular
desregulado. Específicamente, un indicador del crecimiento celular
desregulado es la metástasis de células cancerosas desde un órgano
de origen (tal como la glándula prostática o el colon) a un área
diferente del organismo (tal como un ganglio linfático). Tal
evidencia de crecimiento celular desregulado es importante en el
contexto del cáncer de colon, por ejemplo, pues un entendimiento de
la distribución de la metástasis nodal en los cánceres de colon
hará posible reconocer la enfermedad nodal recurrente temprana
(véase, p. ej., AJR Am J Roentgenol octubre de
1992;159(4):757-61). Tal evidencia de
crecimiento celular desregulado es importante en el contexto del
cáncer de próstata, por ejemplo, porque la metástasis oculta de los
ganglios linfáticos puede detectarse en una proporción sustancial
de pacientes con cáncer de próstata y semejantes metástasis están
asociadas a predictores conocidos del avance de la enfermedad
(véase, p. ej., J Urol agosto de 1995;154(2 Pt
1);474-8).
En un ejemplo específico relacionado con la
invención, un método para detectar una alteración en el estatus del
ARNm de 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra biológica de interés
(típicamente de un paciente que se sospecha que posee un síndrome
patológico que exhibe una constelación de indicadores, uno de los
cuales es elevada expresión de 20P1F12/TMPRSS2) comprende producir
ADNc de la muestra mediante transcripción inversa utilizando al
menos un cebador; amplificar el ADNc así producido utilizando
polinucleótidos 20P1F12/TMPRSS2 como cebadores homosentido y
antisentido para amplificar los ADNc de 20P1F12/TMPRSS2 en los
mismos; y detectar la presencia del ADNc amplificado de
20P1F12/TMPRSS2. En un ejemplo típico, un método para detectar un
gen 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra biológica comprende primero
asilar el ADN genómico de la muestra; amplificar el ADN genómico
aislado utilizando polinucleótidos 20P1F12/TMPRSS2 como cebadores
homosentido y antisentido para amplificar el gen 20P1F12/TMPRSS2 en
los mismos; y detectar la presencia del gen 20P1F12/TMPRSS2
amplificado. Puede diseñase cualquier cantidad de combinaciones
apropiadas de sondas homosentido y antisentido a partir de la
secuencia nucleotídica provista para 20P1F12/TMPRSS2 (Figura 1; SEC
ID NO.: 1) y utilizarse para este fin. En otro ejemplo, un método
para detectar la presencia de una proteína 20P1F12/TMPRSS2 en una
muestra biológica comprende primero poner en contacto la muestra
con un anticuerpo de 20P1F12/TMPRSS2, un fragmento reactivo de
20P1F12/TMPRSS2 del mismo, o una proteína recombinante que contiene
una región de unión al antígeno de un anticuerpo de 20P1F12/TMPRSS2;
y detectar después la unión de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 de la
muestra a los mismos.
También se proporcionan métodos para identificar
una célula que expresa y/o exhibe una expresión aberrante de
20P1F12/TMPRSS2. En un ejemplo, un ensayo para identificar una
célula que expresa un gen 20P1F12/TMPRSS2 comprende detectar la
presencia del ARNm de 20P1F12/TMPRSS2 en la célula. Los métodos para
la detección de ARNm particulares en células son bien conocidos e
incluyen, por ejemplo, ensayos de hibridización utilizando sondas
de ADN complementario (tales como hibridización in situ
utilizando ribosondas de 20P1F12/TMPRSS2 marcadas, transferencia
Northern y técnicas relacionadas) y diversos ensayos de
amplificación de ácidos nucleicos (tales como
RT-PCR utilizando cebadores complementarios
específicos para 20P1F12/TMPRSS2, y otros métodos de detección del
tipo amplificación, tales como, por ejemplo, ADN ramificado, SISBA,
TMA y similares). Alternativamente, un ensayo para identificar una
célula que expresa un gen 20P1F12/TMPRSS2 comprende detectar la
presencia de proteína 20P1F12/TMPRSS2 en la célula o secretada por
la célula. Se conocen bien en la técnica diversos métodos para la
detección de proteínas y pueden emplearse para la detección de
proteínas de 20P1F12/TMPRSS2 y células que expresan
20P1F12/TMPRSS2.
Un ejemplo típico relacionado con la invención
proporciona métodos para monitorear o evaluar productos génicos de
20P1F12/TMPRSS2 determinando el estatus de los productos génicos de
20P1F12/TMPRSS2 en una muestra biológica de un individuo que se
sospecha tiene una enfermedad asociada al crecimiento celular
desregulado (tal como displasia, hiperplasia o cáncer) y después
comparando el estatus así determinado con el estatus de los
productos génicos de 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra biológica
normal correspondiente, suministrando la presencia de productos
génicos aberrantes de 20P1F12/TMPRSS2 en la muestra biológica de
prueba en relación con la muestra biológica normal una indicación de
la presencia de crecimiento celular desregulado dentro del
individuo.
Un ejemplo típico relacionado con la invención
proporciona ensayos útiles para determinar la presencia de cáncer
en un individuo, que comprende detectar un aumento o reducción
importante en la expresión del ARNm o proteína 20P1F12/TMPRSS2 en
una muestra biológica en relación con los niveles de expresión de la
muestra normal correspondiente. La presencia de ARNm de
20P1F12/TMPRSS2 puede, por ejemplo, evaluarse en muestras
biológicas incluyendo, sin limitación, sangre y suero así como
muestras de tejido de próstata, colon, vejiga, riñón, ovario y
pulmón, etc, y sitios metastásicos. Por otra parte, también pueden
evaluarse muestras biológicas de tejidos y sitos asociados a la
metástasis del cáncer. La presencia de niveles significativos de
expresión de 20P1F12/TMPRSS2 y/o alteraciones en 20P1F12/TMPRSS2 en
cualquiera de estos tejidos puede ser útil para indicar la
emergencia, presencia; metástasis y/o gravedad de estos cánceres,
debido a que los tejidos normales correspondientes no expresan el
ARNm o proteína 20P1F12/TMPRSS2 o lo expresan a niveles más
bajos.
Un ejemplo típico relacionado con la invención
proporciona un ensayo útil para determinar la presencia de
crecimiento celular desregulado (tal como ocurre en el cáncer) en un
individuo, que comprende detectar un incremento significativo en la
expresión del ARNm o proteína 20P1F12/TMPRSS2 en una célula de
prueba o muestra tisular respecto de los niveles de expresión en
la célula o tejido normal correspondiente. La presencia del ARNm de
20P1F12/TMPRSS2 en una muestra de colon, por ejemplo, puede indicar
la emergencia, presencia y/o gravedad del cáncer de colon. En un
ejemplo relacionado, puede determinarse el estatus de los productos
génicos de 20P1F12/TMPRSS2 a nivel de proteínas en lugar de a nivel
de ácidos nucleicos. Por ejemplo, semejante método o ensayo
comprendería determinar el nivel de proteína 20P1F12/TMPRSS2
expresada por las células en una muestra tisular de prueba y
comparar el nivel así determinado respecto del nivel de
20P1F12/TMPRSS2 expresado en una muestra normal correspondiente.
Puede evaluarse la presencia de la proteína 20P1F12/TMPRSS2, por
ejemplo, utilizando métodos inmunohistoquímicos. Pueden utilizarse
anticuerpos de 20P1F12/TMPRSS2 o parejas de unión capaces de
detectar la expresión de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 en una variedad
de formatos de ensayo bien conocidos en la técnica para este
fin.
Tal como se observó más arriba, los métodos para
detectar y cuantificar la expresión del ARNm o proteína
20P1P12/TMPRSS2 descritos en la presente memoria pueden utilizar
cualquiera de una variedad de tecnologías estándar de cuantificación
y detección de ácidos nucleicos y proteínas bien conocidas en la
técnica. Los métodos estándar para la detección y cuantificación
del ARNm de 20P1F12/TMPRSS2 incluyen hibridización in situ
que utiliza ribosondas de 20P1F12/TMPRSS2 marcadas, transferencia
Northern y técnicas relacionadas que utilizan sondas
polinucleotídicas de 20P1F12/TMPRSS2, análisis
RT-PCR que utiliza cebadores específicos para
20P1F12/TMPRSS2, y otros métodos de detección del tipo
amplificación, tales como, por ejemplo, ADN ramificado, SISBA, TMA y
similares. En un ejemplo específico puede utilizarse
RT-PCR semi-cuantitativa para
detectar y cuantificar la expresión del ARNm de 20P1F12/TMPRSS2
según se describe en los Ejemplos que siguen. Puede utilizarse
cualquier cantidad de cebadores capaces de amplificar
20P1F12/TMPRSS2 para este fin, incluyendo, sin limitación, los
diferentes conjuntos de cebadores específicamente descritos en la
presente memoria. Pueden utilizarse métodos estándar para la
detección y cuantificación de proteínas para este fin. En un
ejemplo específico, pueden utilizarse anticuerpos monoclonales o
policlonales específicamente reactivos con la proteína
20P1F12/TMPRSS2 en un ensayo inmunohistoquímico de tejido
proveniente de biopsia.
En ejemplos relacionados de los métodos
descritos más arriba, se puede evaluar la integridad de secuencias
de nucleótidos y aminoácidos de 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra
biológica con el fin de identificar perturbaciones en la estructura
de estas moléculas tales como inserciones, supresiones,
sustituciones y similares. Tales ejemplos son útiles porque las
perturbaciones en las secuencias de nucleótidos y aminoácidos se
observan en un gran número de proteínas asociadas a un fenotipo
desregulado de crecimiento (véase, p. ej., Marrogi et al.,
J. Cutan. Pathol. 26(8): 369-378 (1999)). En
este contexto, se conocen bien en la técnica una amplia variedad de
ensayos para observar perturbaciones en secuencias de nucleótidos y
aminoácidos. Por ejemplo, puede observarse el tamaño y estructura
de secuencias de ácido nucleicos o aminoácidos de productos génicos
de 20P1F12/TMPRSS2 mediante protocolos de Northern, Southern,
Western, PCR y secuenciación de ADN tratados en la presente
memoria. Además, se conocen bien en la técnica otros métodos para
observar las perturbaciones en secuencias de nucleótidos y
aminoácidos tales como análisis de polimorfismo de conformación de
cadena única (véanse, p. ej., las Patentes Estadounidenses Nos.
5.382.510 y 5.952.170).
En otro ejemplo, se puede examinar el estatus de
metilación del gen 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra biológica. La
desmetilación y/o hipermetilación aberrantes de islas CpG en las
regiones 5' reguladoras del gen frecuentemente sucede en células
inmortalizadas y transformadas y puede dar lugar a expresión
alterada de varios genes. Por ejemplo, la hipermetilación del
promotor de la glutatión S-transferasa clase pi (una
proteína expresada en próstata normal pero no expresada en >90%
de los carcinomas de próstata) parece silenciar permanentemente la
transcripción de este gen y es la alteración genómica más
frecuentemente detectada en carcinomas de próstata (De Mario et
al., Am. J. Pathol. 155(6): 1985-1992
(1999)). Además, esta alteración está presente en al menos 70% de
los casos de neoplasia intraepitelial prostática (PIN) de alto grado
(Brooks et al, Cáncer Epidemiol. Biomarkers Prev., 1998,
7:531-536). En otro ejemplo, la expresión del gen
especifico de tumor LAGE-I (que no se expresa en
próstata normal pero se expresa en el 25-50% de los
cánceres de próstata) es inducida por la
desoxi-azacitidina en células linfoblastoides,
sugiriendo que la expresión tumoral se debe a la desmetilación
(Lethe et al., Int. J. Cáncer 76(6):
903-908 (1998)). En este contexto, se conocen bien
en la técnica una variedad de ensayos para examinar el estatus de
metilación de un gen. Por ejemplo, se puede utilizar en abordajes
de hibridización Southern enzimas de restricción sensibles a la
metilación que no pueden escindir secuencias que contienen sitios
CpG metilados con el fin de evaluar el estatus de metilación global
de las islas CpG. Además, la MSP (PCR específica de la metilación)
puede rápidamente determinar el perfil del estatus de metilación de
todos los sitios CpG presentes en una isla CpG de un gen dado. Este
procedimiento implica la modificación inicial del ADN mediante
bisulfito de sodio (que convertirá todas las citosinas no metiladas
en uracilos) seguido de amplificación utilizando cebadores
específicos para el ADN no metilado versus metilado. También pueden
encontrarse protocolos que implican interferencia de metilación, por
ejemplo, en Current Protocols in Molecular Biology, Unidades 12,
Frederick M. Ausubul et al. eds., 1995.
Un examen de amplificación de genes proporciona
un método adicional para evaluar el estatus de
20P1F12/
TMPRSS2. La amplificación de genes puede medirse en una muestra directamente, por ejemplo, mediante transferencia convencional Southern, transferencia Northern, para cuantificar la transcripción de ARNm (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)), transferencia de puntos (análisis de ADN) o hibridización in situ, utilizando una sonda adecuadamente marcada, sobre la base de las secuencias provistas en la presente memoria. Alternativamente, pueden emplearse anticuerpos que pueden reconocer moléculas dobles específicas, incluyendo ADN dobles, ARN dobles e híbridos dobles de ADN-ARN o moléculas dobles ADN-proteína. Los anticuerpos a su vez pueden marcarse y el ensayo puede realizarse donde la molécula doble se une a la superficie, de manera que tras la formación de la molécula doble en la superficie, se puede detectar la presencia de anticuerpo unido a la molécula doble.
TMPRSS2. La amplificación de genes puede medirse en una muestra directamente, por ejemplo, mediante transferencia convencional Southern, transferencia Northern, para cuantificar la transcripción de ARNm (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)), transferencia de puntos (análisis de ADN) o hibridización in situ, utilizando una sonda adecuadamente marcada, sobre la base de las secuencias provistas en la presente memoria. Alternativamente, pueden emplearse anticuerpos que pueden reconocer moléculas dobles específicas, incluyendo ADN dobles, ARN dobles e híbridos dobles de ADN-ARN o moléculas dobles ADN-proteína. Los anticuerpos a su vez pueden marcarse y el ensayo puede realizarse donde la molécula doble se une a la superficie, de manera que tras la formación de la molécula doble en la superficie, se puede detectar la presencia de anticuerpo unido a la molécula doble.
Un aspecto relacionado de la descripción se
dirige a predecir la susceptibilidad para desarrollar un síndrome
asociado a la expresión desregulada de 20P1F12/TMPRSS2 (tal como
cáncer) en un individuo. En un ejemplo, un método para predecir la
susceptibilidad al cáncer comprende detectar el ARNm de
20P1F12/TMPRSS2 o proteína 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra
biológica, indicando su presencia susceptibilidad al cáncer, en
donde el grado de expresión del ARNm de 20P1F12/TMPRSS2 presente es
proporcional al grado de susceptibilidad. En un ejemplo específico,
se examina la presencia o cantidad de 20P1F12/TMPRSS2 en suero o
tejido de próstata, vejiga, ovario, pulmón o colon, proporcionando
la presencia de 20P1F12/TMPRSS2 en la muestra una indicación de
susceptibilidad al cáncer (o la emergencia o existencia de un
tumor). En otro ejemplo, se examina la presencia o cantidad de
20P1F12/TMPRSS2 en suero o lidney, suministrando una reducción en
la cantidad en relación con un valor normal de 20P1F12/TMPRSS2 en
la muestra una indicación de susceptibilidad al cáncer (o la
emergencia o existencia de un tumor). En un ejemplo estrechamente
relacionado, se puede evaluar la integridad de secuencias de
nucleótidos y aminoácidos de 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra
biológica con el fin de identificar perturbaciones en la estructura
de estas moléculas, tales como inserciones, supresiones,
sustituciones y similares, proporcionando la presencia de una o más
perturbaciones en los productos génicos de 20P1F12/TMPRSS2 en la
muestra una indicación de susceptibilidad al cáncer (o la
emergencia, existencia o metástasis de un tumor).
Aun otro aspecto relacionado de la descripción
está dirigido a métodos para medir la agresividad tumoral. En un
ejemplo, un método para medir la agresividad de un tumor comprende
determinar el nivel del ARNm de 20P1F12/
TMPRSS2 o proteína 20P1F12/TMPRSS2 expresada en suero, semen, orina, materia fecal, etc., o por células en una muestra del tumor, comparar el nivel así determinado respecto del nivel del ARNm de 20P1F12/TMPRSS2 o proteína 20P1F12/TMPRSS2 expresada en una muestra normal correspondiente tomada del mismo individuo o una muestra de referencia de tejido normal, en donde el grado de expresión del ARNm de 20P1F12/TMPRSS2 o proteína 20P1F12/TMPRSS2 en la muestra sospechosa en relación con la muestra normal indica el grado de agresividad. En un ejemplo específico, la agresividad de los tumores de próstata, vejiga, ovario, pulmón o colon, o tumores metastásicos, se evalúa determinando el grado en el que 20P1F12/TMPRSS2 se expresa en una muestra de un individuo, indicando los niveles de expresión más elevados tumores más agresivos. En un ejemplo estrechamente relacionado se puede evaluar la integridad de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra biológica con el fin de identificar perturbaciones en la estructura de estas moléculas, tales como inserciones, supresiones, sustituciones y similares, indicando la presencia de una o más perturbaciones tumores más agresivos.
TMPRSS2 o proteína 20P1F12/TMPRSS2 expresada en suero, semen, orina, materia fecal, etc., o por células en una muestra del tumor, comparar el nivel así determinado respecto del nivel del ARNm de 20P1F12/TMPRSS2 o proteína 20P1F12/TMPRSS2 expresada en una muestra normal correspondiente tomada del mismo individuo o una muestra de referencia de tejido normal, en donde el grado de expresión del ARNm de 20P1F12/TMPRSS2 o proteína 20P1F12/TMPRSS2 en la muestra sospechosa en relación con la muestra normal indica el grado de agresividad. En un ejemplo específico, la agresividad de los tumores de próstata, vejiga, ovario, pulmón o colon, o tumores metastásicos, se evalúa determinando el grado en el que 20P1F12/TMPRSS2 se expresa en una muestra de un individuo, indicando los niveles de expresión más elevados tumores más agresivos. En un ejemplo estrechamente relacionado se puede evaluar la integridad de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra biológica con el fin de identificar perturbaciones en la estructura de estas moléculas, tales como inserciones, supresiones, sustituciones y similares, indicando la presencia de una o más perturbaciones tumores más agresivos.
Aun otro aspecto relacionado de la descripción
está dirigido a métodos para observar el avance de una enfermedad
maligna en un individuo con el paso del tiempo. En un ejemplo, los
métodos para observar el avance de la enfermedad maligna en un
individuo con el paso del tiempo comprenden determinar el nivel del
ARNm de 20P1F12/TMPRSS2 o proteína 20P1F12/TMPRSS2 expresada en una
muestra biológica, comparar el nivel así determinado respecto del
nivel del ARNm de 20P1F12/TMPRSS2 o proteína 20P1F12/TMPRSS2
expresada en una muestra biológica equivalente tomada del mismo
individuo en un momento diferente, en donde el grado de expresión
del ARNm de 20P1F12/TMPRSS2 o proteína 20P1F12/TMPRSS2 en la
muestra con el paso del tiempo proporciona información acerca del
avance del cáncer. En un ejemplo específico el avance del cáncer se
evalúa determinando el grado en el que la expresión de
20P1F12/TMPRSS2 en las células tumorales se altera con el paso del
tiempo, indicando los niveles de expresión más elevados un avance
del cáncer. En un ejemplo alternativo, el avance del cáncer se
evalúa determinando el grado en el que la expresión de
20P1F12/TMPRSS2 en suero se altera con el paso del tiempo, indicando
concentraciones más elevadas un avance del cáncer. En un ejemplo
estrechamente relacionado, se puede evaluar la integridad de las
secuencias de nucleótidos y aminoácidos de 20P1F12/TMPRSS2 en una
muestra biológica con el fin de identificar perturbaciones en la
estructura de estas moléculas tales como inserciones, supresiones,
sustituciones y similares, indicando la presencia de una o más
perturbaciones que avance del cáncer.
Los abordajes diagnósticos anteriores pueden
combinarse con uno cualquiera de una amplia variedad de protocolos
pronósticos y diagnósticos conocidos en la técnica. Por ejemplo,
otro aspecto descrito en la presente memoria está dirigido a
métodos para observar una coincidencia entre la expresión del gen
20P1F12/TMPRSS2 y productos génicos de 20P1F12/TMPRSS2 (o
perturbaciones en el gen 20P1F12/TMPRSS2 y en los productos génicos
de 20P1F12/TMPRSS2) y un factor que está asociado a malignidad como
medio para diagnosticar y pronosticar el estado de una muestra
tisular. En este contexto, puede utilizarse una amplia variedad de
factores asociados a la malignidad, tales como la expresión de
genes asociados de otra manera a la malignidad (incluyendo PSA,
PSCA, PSM y expresión de calicreína glandular humana) así como
observaciones citológicas groseras (véase, p. ej., Bocking et
al., Anal Quant Cytol. 5(2):7488 (1984); Eptsein, Hum
Patliol. 1995 Feb;26(2):223-9 (1995); Thorson
et al., Mod Pathol. junio
1998;11(6):543-51; Baisclen et al., Am
J Surg Pathol. 23(8)918-24 91999)).
Los métodos para observar una coincidencia entre la expresión del
gen 20P1F12/TMPRSS2 y productos génicos de 20P1F12/TMPRSS2 (o
perturbaciones en el gen 20P1F12/TMPRSS2 y productos génicos de
20P1F12/TMPRSS2) y un factor adicional que está asociado a la
malignidad, son útiles, por ejemplo, porque la presencia de un
conjunto o constelación de factores específicos que coinciden
proporciona información crucial para diagnosticar y pronosticar el
estatus de una muestra tisular.
En un ejemplo típico, los métodos para observar
una coincidencia entre la expresión del gen 20P1F12/TMPRSS2 y
productos génicos de 20P1F12/TMPRSS2 (o perturbaciones en el gen
20P1F12/TMPRSS2 y productos génicos de 20P1F12/TMPRSS2) y un factor
que está asociado a la malignidad permiten detectar la
sobreexpresión del ARNm o proteína 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra
biológica, detectar la sobreexpresión del ARNm de PSA o proteína
en una muestra biológica, y observar una coincidencia de la
sobreexpresión del ARNm o proteína 20P1F12/TMPRSS2 y ARNm o
proteína de PSA. En un ejemplo específico, se examina la expresión
de 20P1F12/TMPRSS2 y ARNm de PSA en suero o tejido de próstata,
vejiga, ovario, pulmón, riñón o colon. En un ejemplo preferido la
coincidencia de la sobreexpresión del ARNm de 20P1F12/TMPRSS2 y PSA
en la muestra proporciona una indicación de cáncer de próstata,
vejiga, ovario, pulmón o colon, susceptibilidad al cáncer de
próstata, vejiga, ovario, pulmón o colon; o la emergencia,
existencia o metástasis de dichos tumores, y lo contrario es válido
para el cáncer de riñón.
En estos métodos, el estatus de 20P1F12/TMPRSS2
puede examinarse en una amplia variedad de muestras biológicas,
tales como orina, materia fecal, semen, así como preparaciones
celulares de tejidos de próstata, vejiga, ovario, riñón, pulmón,
colon y otros tejidos que pueden estar afectados, por ejemplo,
cuando un cáncer produce metástasis. Además de estas muestras,
puede analizarse convenientemente sangre periférica y/o suero para
determinar la presencia de proteínas 20P1F12/TMPRSS2 o células
cancerosas, incluyendo, sin límites, cánceres de próstata, vejiga,
ovario, pulmón, riñón y colon, y cánceres metastásicos. El estatus
de 20P1F12/TMPRSS2 en la muestra biológica se evalúa mediante
cualquier método dentro de una gran variedad de métodos aceptados en
la técnica tales como análisis Southern, análisis Northern,
análisis de reacción en cadena de la polimerasa e inmunoensayo.
Preferiblemente, la muestra biológica se evalúa examinando el nivel
de la expresión del ARNm de 20P1F12/TMPRSS2 o la expresión de la
proteína 20P1F12/TMPRSS2. En métodos especialmente preferidos, el
crecimiento celular desregulado es indicativo de cáncer. En métodos
alternativos preferidos, el crecimiento celular desregulado es
indicativo de un cáncer de colon. Preferiblemente, el
20P1F12/TMPRSS2 evaluado en la muestra biológica es secretado a
partir de células que exhiben crecimiento desregulado.
Un ejemplo alternativo de la descripción
consiste en un método para identificar la evidencia de un neoplasma
en un individuo examinando un nivel de expresión del gen
20P1F12/TMPRSS2 en una muestra biológica de prueba obtenida del
individuo y comparando después el nivel de expresión del gen
20P1F12/TMPRSS2 en la muestra biológica de prueba (p. ej. una
muestra sospechada de contener evidencia de un estado patológico)
obtenida del individuo respecto del nivel de expresión del gen
20P1F12/TMPRSS2 encontrado en una muestra biológica normal
comparable (p. ej. una muestra no sospechada de contener evidencia
de un estado patológico) en donde las diferencias en el nivel de
los productos génicos de 20P1F12/TMPRSS2 en la muestra biológica de
prueba en relación con la muestra biológica normal están asociadas
al neoplasma. Preferiblemente, la muestra biológica de prueba se
evalúa examinando el nivel de expresión del ARNm de 20P1F12/TMPRSS2
o la expresión de la proteína 20P1F12/TMPRSS2. En los métodos
especialmente preferidos, el neoplasma es un cáncer de próstata,
vejiga, ovario, pulmón, riñón o colon. En otro método preferido, el
neoplasma es un cáncer metastásico.
Un ejemplo preferido típico de la descripción
consiste en un método para detectar un cáncer en un individuo
examinando la expresión del gen 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra
biológica de prueba obtenida del individuo y examinado después al
individuo para determinar la presencia de un factor asociado al
crecimiento celular desregulado, donde una coincidencia de la
expresión del gen 20P1F12/TMPRSS2 en la muestra biológica de prueba
obtenida del individuo y la presencia del factor asociado al
crecimiento celular desregulado es indicativa del cáncer. En este
contexto, puede utilizarse una amplia variedad de factores asociados
al crecimiento celular desregulado como este otro factor tal como
la expresión de genes asociados de otra manera al crecimiento
celular desregulado (incluyendo expresión de mucina,
laminina-5, PSA, PSCA y PSM) así como observaciones
citológicas groseras (véase, p. ej., Pyke et al. Cancer Res.
septiembre de 1995 15;55(18) 4132-9; Bocking
et al., Anal Quant Cytol. 6(2):74-88
(1984); Eptsein, Hum Pathol. 1995
Feb;26(2):223-9 (1995); Thorson et
al., Mod Pathol. Junio de
1998;11(6):543-51; Baisden et al., Am
J Surg Pathol. 23(8):918-24 91999)). En
métodos especialmente preferidos, el cáncer es un cáncer de
próstata, vejiga, ovario, pulmón, riñón o colon. En otro método
preferido, el neoplasma es un cáncer metastásico. En los ejemplos
específicos de este método, se utiliza análisis Southern, análisis
Northern, análisis por reacción en cadena de la polimerasa o un
inmunoensayo para examinar el nivel de expresión del ARNm de
20P1F12/TMPRSS2 o el nivel de expresión de la proteína
20P1F12/TMPRSS2. La 20P1F12/TMPRSS2 evaluada en la muestra
biológica de prueba puede ser secretada a partir de células de
cáncer de próstata, vejiga, ovario, pulmón o colon, o células de
cáncer metastásico.
Las secuencias de proteínas 20P1F12/TMPRSS2
descritas en la presente memoria permiten que el técnico experto
identifique moléculas que interactúan con ellas a través de
cualquier protocolo dentro de una variedad de protocolos aceptados
en la técnica. Por ejemplo, se puede utilizar uno de la variedad de
sistemas así llamados sistemas de trampas de interacción (también
denominados "ensayo de doble híbrido"). En tales sistemas, las
moléculas que interactúan reconstituyen un factor de transcripción y
dirigen la expresión de un gen indicador, cuya expresión después se
analiza. Los sistemas típicos identifican interacciones
proteína-proteína in vivo a través de la
reconstitución de un activador transcripcional eucariota y se
describen, por ejemplo, en las Patentes Estadounidenses Nos.
5.955.280, 5.925.523, 5.846.722 y 6.004.746.
Tal como se trata en el Ejemplo 12, se pueden
detectar moléculas que interactúan con las secuencias de proteínas
20P1F12/TMPRSS2 examinando un panel conocido de moléculas que
posiblemente interactúan con 20P1F12/
TMPRSS2 (sobre la base de observaciones con moléculas similares tales como PSA) tales como suero y serpinas de semen. Alternativamente, se pueden identificar moléculas que interactúan con secuencias de proteínas 20P1F12/
TMPRSS2 rastreando bibliotecas de péptidos. En tales métodos, los péptidos que se unen a moléculas receptoras seleccionadas tales como 20P1F12/TMPRSS2 se identifican rastreando bibliotecas que codifican una colección aleatoria o controlada de aminoácidos. Los péptidos codificados por las bibliotecas se expresan como proteínas de fusión de proteínas de envoltura de bacteriófagos, y las partículas de bacteriófagos después se examinan contra los receptores de interés. Péptidos que poseen una amplia variedad de usos, tales como reactivos terapéuticos o diagnósticos, pueden así identificarse sin ninguna información previa acerca de la estructura del ligando esperado o la molécula receptora. Se describen bibliotecas de péptidos típicas y métodos de selección que pueden utilizarse para identificar moléculas que interactúan con secuencias de proteínas 20P1F12/TMPRSS2, por ejemplo, en las Patentes Estadounidenses Nos. 5.723.286 y 5.733.731.
TMPRSS2 (sobre la base de observaciones con moléculas similares tales como PSA) tales como suero y serpinas de semen. Alternativamente, se pueden identificar moléculas que interactúan con secuencias de proteínas 20P1F12/
TMPRSS2 rastreando bibliotecas de péptidos. En tales métodos, los péptidos que se unen a moléculas receptoras seleccionadas tales como 20P1F12/TMPRSS2 se identifican rastreando bibliotecas que codifican una colección aleatoria o controlada de aminoácidos. Los péptidos codificados por las bibliotecas se expresan como proteínas de fusión de proteínas de envoltura de bacteriófagos, y las partículas de bacteriófagos después se examinan contra los receptores de interés. Péptidos que poseen una amplia variedad de usos, tales como reactivos terapéuticos o diagnósticos, pueden así identificarse sin ninguna información previa acerca de la estructura del ligando esperado o la molécula receptora. Se describen bibliotecas de péptidos típicas y métodos de selección que pueden utilizarse para identificar moléculas que interactúan con secuencias de proteínas 20P1F12/TMPRSS2, por ejemplo, en las Patentes Estadounidenses Nos. 5.723.286 y 5.733.731.
Alternativamente, pueden utilizarse líneas
celulares que expresan 20P1F12/TMPRSS2 para identificar
interacciones proteína-proteína mediadas por
20P1F12/TMPRSS2. Esta posibilidad puede examinarse utilizando
técnicas de inmunoprecipitación conocidas en la técnica incluyendo
las descritas como generadoras de los datos que se muestran en la
Figura 22 (véase también Hamilton, B.J., et al., 1999.
Biochern. Biophys. Res. Commun. 261:646-51).
Típicamente, la proteína 20P1F12/TMPRSS2 puede inmunoprecipitarse a
partir de 20P1F12/TMPRSS2 que expresa líneas celulares canceríosas
utilizando anticuerpos anti-20P1F12/TMPRSS2.
Alternativamente, pueden utilizarse anticuerpos contra colas de
histidina en la línea celular manipulada genéticamente para expresar
20P1F12/TMPRSS2 (los vectores se mencionan más arriba). El complejo
inmunoprecipitado puede examinarse para determinar la asociación de
proteínas mediante procedimientos tales como transferencia Western,
marcado de proteínas con ^{35}S-metionina,
microsecuenciación de proteínas, tinción con plata y electroforesis
en gel bidimensional.
Los ejemplos relacionados de tales ensayos de
selección incluyen métodos para identificar moléculas pequeñas que
interactúan con 20P1F12/TMPRSS2. Los métodos típicos se tratan, por
ejemplo, en la Patente Estadounidense No. 5.928.868 e incluyen
métodos para formar ligandos híbridos en los que al menos un ligando
es una molécula pequeña. En un ejemplo ilustrativo, el ligando
híbrido se introduce en células que a su vez contienen un primer y
un segundo vector de expresión. Cada vector de expresión incluye ADN
para expresar una proteína híbrida que codifica una proteína blanco
unida a una secuencia codificadora para un módulo transcripcional.
Las células además contienen un gen indicador, la expresión del
cual está condicionada por la proximidad entre la primera y segunda
proteínas híbridas, un evento que sucede solamente si el ligando
híbrido se une a sitios blanco en ambas proteínas híbridas. Se
seleccionan aquellas células que expresan el gen indicador y se
identifica la molécula pequeña desconocida o la proteína híbrida
desconocida.
Un ejemplo típico consiste en un método para
seleccionar una molécula que interactúa con una secuencia de
aminoácidos de 20P1F12/TMPRSS2 que se muestra en la Figura 1, que
comprende las etapas de poner en contacto una población de
moléculas con la secuencia de aminoácidos de 20P1F12/TMPRSS2,
permitiendo que la población de moléculas y la secuencia de
aminoácidos de 20P1F12/TMPRSS2 interactúen en condiciones que
faciliten una interacción, determinando la presencia de una
molécula que interactúa con la secuencia de aminoácidos de
20P1F12/TMPRSS2 y separando después las moléculas que no
interactúan con la secuencia de aminoácidos de 20P1F12/TMPRSS2 de
las moléculas que sí interactúan con la secuencia de aminoácidos de
20P1F12/TMPRSS2. En un ejemplo específico, el método además incluye
purificar una molécula que interactúa con la secuencia de
aminoácidos de 20P1F12/TMPRSS2. En un ejemplo preferido, la
secuencia de aminoácidos de 20P1F12/TMPRSS2 se pone en contacto con
una biblioteca de péptidos.
La descripción además proporciona kits para las
aplicaciones diagnósticas y terapéuticas descritas o sugeridas más
arriba. Tales kits pueden comprender un medio portador que está
compartimentalizado para recibir en apretado confinamiento uno o
más medios contenedores tales como ampollas, tubos y similares,
comprendiendo cada uno de los medios contenedores uno de los
elementos separados a ser utilizado en el método. Por ejemplo, uno
de los medios contenedores puede comprender un vector que codifica
una proteína 20P1F12/TMPRSS2. Alternativamente, uno de los medios
contenedores puede comprender una sonda que está o puede estar
marcada de manera detectable. Dicha sonda puede ser un anticuerpo
(por ejemplo, para usar en un ensayo ELISA) o polinucleótido
específico para la proteína o gen/ARNm de 20P1F12/TMPRSS2,
respectivamente. Cuando el kit utiliza hibridización de ácidos
nucleicos para detectar el ácido nucleico blanco, el kit también
puede contener envases que contienen nucleótidos) para la
amplificación de la secuencia de ácido nucleico blanco y/o un envase
que comprende un medio indicador, tal como una proteína de unión a
la biotina, tal como avidina o estreptoavidina, unida a una molécula
indicadora, tal como un marcador enzimático, fluorescente o
radioisotópico.
El kit típicamente comprenderá el envase
descrito más arriba y uno o más envases que comprende materiales
deseables desde el punto de vista comercial y del usuario,
incluyendo tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y
prospectos con instrucciones para el uso. Puede estar presente una
etiqueta en el envase para indicar que la composición se utiliza
para una terapia específica o aplicación no terapéutica, y también
puede indicar instrucciones para el uso in vivo o in
vitro, tales como las descritas más arriba.
Todas las líneas celulares del cáncer humano
utilizadas en este estudio se obtuvieron a partir de ATCC. Todas las
líneas celulares se mantuvieron en DMEM con suero bovino fetal al
10%. Las PrEC (células epiteliales primarias de próstata) se
obtuvieron de Clonetics y se hicieron crecer en medio PrEBM
suplementado con factores de crecimiento (Clonetics).
Todos los xenoinjertos de cáncer de próstata
humana originalmente fueron provistos por Charles Sawyers (UCLA)
(Klein et al., 1997; Craft et al. Cancer Res. octubre
1 de 1999 1;59(19):5030-6). Rutinariamente se
pasaron xenoinjertos de LAPC-4 AD y
LAPC-9 AD como pequeños trozos de tejido en machos
SCID receptores. Los xenoinjertos de LAPC-4 AI y
LAPC-9 AI se obtuvieron tal como se describió
previamente (Klein et al., 1997; Craft et al. Cancer
Res. octubre 1 de 1999 1;59(19):5030-6) y se
pasaron a machos castrados o a ratones SCID hembra.
Los tejidos humanos para ARN y los análisis de
proteínas se obtuvieron del Human Tissue Resource Center (HTRC) en
UCLA (Los Angeles, CA) y de QualTek, Inc. (Santa Barbara, CA). Una
muestra de tejido de hiperplasia prostática benigna se obtuvo de un
paciente.
Se homogeneizaron tejido tumoral y líneas
celulares en Reactivo Trizol (Life Technologies, Gibco BRL)
utilizando 10 ml/g de tejido o 10 ml/10^{8} células para aislar el
ARN total. El ARN Poli A se purificó a partir del ARN total
utilizando el kit Qiagen's Oligotex ARNm Mini y Midi. El ARN total y
el ARNm se cuantificaron mediante análisis espectrofotométrico (D.O.
260/280 nm) y se analizaron mediante electroforesis en gel.
Se utilizaron los siguientes oligonucleótidos
purificados por HPLC.
RSACDN (cebador de síntesis de ADNc):
5'TTTTGTACAAGCTT_{30}3' | (SEC ID NO.: 6) |
\newpage
Adaptador 1:
5'CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT3' | (SEC ID NO.: 7) |
3'GGCCCGTCCA5' | (SEC ID NO.: 14) |
\vskip1.000000\baselineskip
Adaptador 2:
5'GTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAGGT3' | (SEC ID NO.: 8) |
3'CGGCTCCA5' | (SEC ID NO.: 15) |
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador 1 de PCR:
5'CTAATACGACTCACTATAGGGC3' | (SEC ID NO.: 9) |
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador anidado (NP)1:
5'TCGAGCOGCCGCCCGGGCAGGT3 | (SEC ID NO.: 10) |
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador anidado (NP)2:
5'AGCGTGGT000GGCCGAGGT3' | (SEC ID NO.: 11) |
\vskip1.000000\baselineskip
La Hibridización Sustractiva por Supresión (SSH)
se utilizó para identificar ADNc correspondientes a genes que pueden
sufrir regulación por aumento en el cáncer de próstata dependiente
de andrógenos en comparación con la hiperplasia prostática
benigna.
Los ADNc de doble hebra correspondientes al
xenoinjerto de LAPC-4 AD (problema) y el tejido BPH
(control) se sintetizaron a partir de 2 \mug de poli(A)+ARN
aislado de xenoinjerto y tejido BPH, según se describe más arriba,
utilizando el kit de Sustracción de ADNc PCR-Select
de CLONTECH y 1 ng de oligonucleótido RSACDN como cebador. La
síntesis de la primera y segunda hebras se realizaron según se
describe en el protocolo del manual para el usuario del kit
(Protocolo No. PT1117-1 de CLONTECH, Catálogo Núm.
K1804-1). El ADNc resultante se digirió con Rsa I
durante 3 horas a 37ºC. El ADNc digerido se extrajo con
fenol/cloroformo (1:1) y se precipitó con etanol.
El ADNc control (BPH) se generó combinando en
una relación 4 a 1 ADNc de BPH digerido con Rsa I con ADNc digerido
de hígado de ratón, con el fin de asegurar que los genes murinos se
sustrajeron del ADNc problema (LAPC-4 AD).
El ADNc problema (LAPC-4 AD) se
generó diluyendo 1 \mul de ADNc AD de LAPC-4
digerido con Rsa I (400 ng) en 5 \mul de agua. El ADNc diluido (2
\mul, 160 ng) después se ligó a 2 \mul del adaptador 1 y el
adaptador 2 (10 \muM), en reacciones de ligación separadas, en un
volumen total de 10 \mul a 16ºC durante toda la noche, utilizando
400 u de T4 ADN ligasa (CLONTECH). La ligación se completó con 1
\mul de EDTA 0,2 M y calentamiento a 72ºC durante 5 minutos.
La primera hibridización se realizó añadiendo
1,5 \mul (600 ng) del ADNc control a cada uno de dos tubos que
contenían 1,5 \mul (20 ng) de ADNc problema ligado al adaptador 1
y al adaptador 2. En un volumen final de 4 \mul, las muestras se
cubrieron con aceite mineral, se desnaturalizaron en un ciclador
térmico MJ Research a 98ºC durante 1,5 minutos, y después se dejaron
hibridizar durante 8 horas a 68ºC. Las dos hibridizaciones después
se mezclaron juntas con 1 \mul adicional de ADNc control
desnaturalizado fresco y se dejaron hibridizar durante toda la noche
a 68ºC. La segunda hibridización después se diluyó en 200 \mul de
Hepes 20 mm, pH 8,3, NaCl 50 mM, EDTA 0,2 mM, se calentó a 70ºC
durante 7 minutos y se conservó a -20ºC.
Para amplificar fragmentos génicos resultantes
de reacciones a partir de SSH, se realizaron dos amplificaciones por
PCR. En la reacción por PCR primaria se añadió 1 \mul de la mezcla
de hibridización final diluida a 1 \mul del cebador 1 de PCR (10
\muM), 0,5 \mul de mezcla de dNTP (10 \muM), 2,5 \mul 10 x
tampón de reacción (CLONTECH) y 0,5 \mul de 50 x Mezcla de
polimerasa de ADNc Advantage (CLONTECH) en un volumen final de 25
\mul. Se efectuó la PCR 1 utilizando las siguientes condiciones:
75ºC durante 5 minutos, 94ºC durante 25 segundos, después 27 ciclos
de 94ºC durante 10 segundos, 66ºC durante 30 segundos, 72ºC durante
1,5 minutos. Se realizaron cinco reacciones por PCR primarias
separadas para cada experimento. Los productos se combinaron y se
diluyeron con agua 1:10. Para la reacción por PCR secundaria, se
añadió 1 \mul de la reacción por PCR primaria combinada y diluida
a la misma mezcla de reacción utilizada para PCR 1, excepto que se
utilizaron los cebadores NP1 y NP2 (10 pM) en vez del cebador 1 de
PCR. Se realizó la PCR 2 utilizando 10-12 ciclos de
94ºC durante 10 segundos, 68ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 1,5
minutos. Los productos de PCR se analizaron utilizando
electroforesis en gel de agarosa al 2%.
Los productos de PCR se insertaron en pCR2.1
utilizando el kit de clonación del vector T/A (Invitrogen). E.
Coli transformadas se sometieron a selección azul/blanca y por
ampicilina. Se tomaron las colonias blancas y se arreglaron en
placas de 96 pocillos y se hicieron crecer en cultivo líquido
durante toda la noche. Para identificar los insertos, se realizó
amplificación por PCR en 1 ml de cultivo bacteriano utilizando las
condiciones de PCR1, y NP1 y NP2 como cebadores. Los productos de
PCR se analizaron utilizando electroforesis en gel de agarosa al
2%.
Se conservaron los clones bacterianos en
glicerol al 20% en un formato de 96 pocillos. Se preparó el ADN
plásmido, se secuenció, y se sometió a búsquedas por homologías de
ácidos nucleicos de las bases de datos de GenBank, dBest y
NCI-CGAP.
Se generaron ADNc de primera hebra a partir de 1
\mug de ARNm con cebado de oligonucleótidos
(dT)12-18 utilizando el sistema
Gibco-BRL Superscript Preamplification. Se utilizó
el protocolo de los fabricantes y se incluyó una incubación durante
50 minutos a 42ºC con transcriptasa inversa seguida de tratamiento
con ARNasa H a 37ºC durante 20 minutos Después de completar la
reacción, el volumen se incrementó hasta 200 \mul con agua antes
de la normalización. Se obtuvieron de Clontech ADNc de primera hebra
de 16 tejidos humanos normales diferentes.
La normalización de los ADNc de primera hebra de
tejidos múltiples se realizó utilizando los cebadores
5'ATATCGCCGCGCTCGTCGTCGACAA3' (SEC ID NO.: 28) y 5'AGCCACACGCAGCTCATTGTAGAAGG3' (SEC ID NO.: 29) para amplificar la \beta-actina. El ADNc de primera hebra (5 \mul) se amplificó en un volumen total de 50 \mul que contenía cebadores 0,4 \muM, 0,2 \muM de cada dNTPs, tampón 1XPCR (Clontech, Tris-HCl 10 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, KCl 50 mM, pH8,3) y ADN polimerasa 1X Klentaq (Clontech). Se extrajeron cinco \mul de la reacción por PCR a 18, 20 y 22 ciclos y se utilizaron para la electroforesis en gel de agarosa. Se realizó la PCR utilizando un ciclador térmico MJ Research en las siguientes condiciones: la desnaturalización inicial fue a 94ºC durante 15 segundos, seguida de 18, 20 y 22 ciclos de 94ºC durante 15, 65ºC durante 2 minutos, 72ºC durante 5 segundos. Se realizó una extensión final a 72ºC durante 2 minutos. Después de la electroforesis en gel de agarosa, las intensidades de banda de las bandas de \beta-actina de 283 pb de múltiples tejidos se compararon por inspección visual. Los factores de dilución para los ADNc de primera hebra se calcularon para dar intensidades de banda de \beta-actina iguales en todos los tejidos después de 22 ciclos de PCR. Se requirieron tres vueltas de normalización para lograr intensidades de banda iguales en todos los tejidos después de 22 ciclos de PCR.
5'ATATCGCCGCGCTCGTCGTCGACAA3' (SEC ID NO.: 28) y 5'AGCCACACGCAGCTCATTGTAGAAGG3' (SEC ID NO.: 29) para amplificar la \beta-actina. El ADNc de primera hebra (5 \mul) se amplificó en un volumen total de 50 \mul que contenía cebadores 0,4 \muM, 0,2 \muM de cada dNTPs, tampón 1XPCR (Clontech, Tris-HCl 10 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, KCl 50 mM, pH8,3) y ADN polimerasa 1X Klentaq (Clontech). Se extrajeron cinco \mul de la reacción por PCR a 18, 20 y 22 ciclos y se utilizaron para la electroforesis en gel de agarosa. Se realizó la PCR utilizando un ciclador térmico MJ Research en las siguientes condiciones: la desnaturalización inicial fue a 94ºC durante 15 segundos, seguida de 18, 20 y 22 ciclos de 94ºC durante 15, 65ºC durante 2 minutos, 72ºC durante 5 segundos. Se realizó una extensión final a 72ºC durante 2 minutos. Después de la electroforesis en gel de agarosa, las intensidades de banda de las bandas de \beta-actina de 283 pb de múltiples tejidos se compararon por inspección visual. Los factores de dilución para los ADNc de primera hebra se calcularon para dar intensidades de banda de \beta-actina iguales en todos los tejidos después de 22 ciclos de PCR. Se requirieron tres vueltas de normalización para lograr intensidades de banda iguales en todos los tejidos después de 22 ciclos de PCR.
Para determinar los niveles de expresión del gen
20P1F12, se analizaron 5 \mul del ADNc de primera hebra
normalizado mediante PCR utilizando 25, 30 y 35 ciclos de
amplificación utilizando los siguientes pares de cebadores, que
fueron diseñados con la ayuda de (MIT; para más detalles, véase,
www.genome.wi.mit.edu):
5' AGT CTT CCT GCT GAG TCC TTT CC 3' | (SEC ID NO.: 12) |
5' CAA GGG CAC TGT CTA TAT TCT CAC C 3' | (SEC ID NO.: 13) |
El análisis semicuantitativo de la expresión se
logró comparando los productos de PCR en los números de ciclos que
dan intensidades de banda suaves.
Se realizaron varios experimentos de SSH según
se describe en Materiales y Métodos, supra, y llevaron al
aislamiento de numerosos clones de fragmentos génicos candidatos.
Todos los clones candidatos se secuenciaron y se sometieron a
análisis de homología contra todas las secuencias de las bases de
datos públicas importantes de genes y EST con el fin de proporcionar
información acerca de la identidad del gen correspondiente y para
ayudar a guiar la decisión de analizar un gen particular para la
expresión diferencial.
Uno de los clones de ADNc, denominado 20P1F12,
mostró identidad con una serina-proteasa
recientemente descrita: TMPRSS2 (Paoloni-Giacobino
et al., 1997, Genomics 44: 309-320). El
fragmento de ADNc de 20P1F12 aislado tiene 388 pb de longitud y
posee la secuencia nucleotídica que se muestra en la Figura 4. El
análisis de expresión diferencial por RT-PCR mostró
que el gen 20P1F12 se expresa en aproximadamente iguales niveles en
próstata normal y en los xenoinjertos de LAPC-4 y
LAPC-9 (Figura 5, panel A). Otro análisis de
expresión por RT-PCR de los ADNc de primera hebra
de 16 tejidos normales mostró los más elevados niveles de expresión
de 20P1F12 en próstata. Se observó un nivel de expresión
sustancialmente más bajo en varios otros tejidos normales (p. eas,
riñón, hígado y pulmón) (Figura 5, paneles B y C).
Se realizaron análisis de transferencia Northern
sobre un panel de 16 tejidos humanos normales utilizando una sonda
marcada de 20P1F12/TMPRSS2 (correspondiente al ADNc 20P1F12 SSH de
la Figura 4) para confirmar la especificidad prostática de la
expresión de 20P1F12/TMPRSS2 inicialmente establecida por el
análisis de expresión por RT-PCR. Los resultados,
que se muestran en la Figura 6, confirman y extienden el Análisis
por RT-PCR y muestran que la expresión de
20P1F12/TMPRSS2 es relativamente específica de la próstata, ya que
la expresión en próstata es mayor que la expresión en pulmón, riñón,
páncreas o colon. No se observó expresión detectable en ninguno de
los otros 11 tejidos normales utilizados en este panel.
Además, los niveles de expresión de
20P1F12/TMPRSS2 en los xenoinjertos de LAPC-4 y
LAPC-9 también se examinaron mediante análisis de
transferencia Northern. Se realizó la transferencia Northern en 10
\mug de ARN total preparado a partir de líneas celulares y
xenoinjertos de LAPC utilizando ADNc de 20P1F12/TMPRSS2 marcado al
azar con hexámeros (Boehringer Mannheim). Los resultados, que se
muestran en las Figuras 6 y 7, indican niveles de expresión
similares en los xenoinjertos y en tejido normal, observándose
expresión de menor nivel sólo en el xenoinjerto de
LAPC-9 AI. Otro análisis de transferencia Northern
de la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 en un gran panel de células
cancerosas se describe en el Ejemplo 4, más abajo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aisló un ADNc de longitud completa que
codifica el gen 20P1F12/TMPRSS2 a partir de una biblioteca de
próstata humana y se denominó 20P1F12-GTC1. Las
secuencias de nucleótidos y aminoácidos de
20P1F12-GTC1 se muestran en la Figura 1. Se
depositó el plásmido p20P1F12-GTC1 (portador del
ADNc 20P1F12-GTC1) en ATCC (Manassas, Virginia) el
12 de febrero de 1999 y se le otorgó el Número de Designación ATCC
207097. El ADNc 20P1F12-GTC1 de aproximadamente 3,5
kb codifica una proteína de 492 aminoácidos que es casi, pero no
completamente, idéntica a la secuencia previamente descrita (Figura
2). Existen varias diferencias en la secuencia nucleotídica del
ADNc 20P1F12-GTC1 en relación con la secuencia de
TMPRSS2 publicada, seis de las cuales determinan aminoácidos
codificados diferentes, según se muestra en la alineación de
aminoácidos de la Figura 3. Específicamente, cuatro de las
diferencias de aminoácidos están en el dominio de proteasa, tres de
las cuales son diferencias no conservadoras de aminoácidos que
podrían afectar la función y/o especificidad de la proteasa. Un
examen minucioso de la secuencia muestra 8 diferencias en la
secuencia nucleotídica que dan lugar a 6diferencias de aminoácidos
en las posiciones 160, 242, 329, 449, 489 y 491 en comparación con
la secuencia previamente publicada. Las seis diferencias se
confirmaron mediante la secuenciación de clones adicionales de ADNc
20P1F12/TMPRSS2 y fragmentos génicos obtenidos a partir de
bibliotecas de ADNc de próstata normal, LAPC-4 y
LAPC-9. Todas estas diferencias ocurren en el
dominio asociado a la membrana, dos de las cuales (aminoácidos 160 y
242) residen en el dominio rico en cisteína del receptor barredor
(SRCR), mientras que las otras se localizan dentro del dominio de
proteasa. No está claro cómo estas diferencias de secuencias de
aminoácidos podrían afectar la actividad biológica. Sin embargo, es
posible que 20P1F12/TMPRSS2 y TMPRSS2 se expresen de manera
diferencial en vista de los datos de los solicitantes que muestran
un patrón de expresión de ARNm divergente en tejidos humanos
normales.
\vskip1.000000\baselineskip
Para analizar la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 en
tejidos y líneas celulares de cáncer, se realizó transferencia
Northern sobre ARN obtenido a partir de los xenoinjertos de LAPC y
un panel de líneas celulares de cáncer de próstata y no próstata.
Los resultados muestran altos niveles de expresión de
20P1F12/TMPRSS2 en todos los xenoinjertos de LAPC y en las líneas
celulares de cáncer de colon (Figura 7). Se detectaron niveles de
expresión similares en próstata, LAPC-4 AD,
LAPC-4 Al, LAPC-9 AD y LNCaP. Se
observaron niveles inferiores de 20P1F12/TMPRSS2 en células
LAPC-9 AI y AI PC-3, no observándose
ninguna expresión en DU145. También se detectaron altos niveles de
expresión de 20P1F12/TMPRSS2 en tres de cuatro líneas celulares de
cáncer de colon, incluyendo LoVo, T84 y
Colo-205.
Tal como se observó más arriba, el primer
informe acerca de 20P1F12/TMPRSS2 (Paoloni-Giacobino
et al., 1997, Genomics 44: 309-320)
identificó un ADNc que codifica una proteína que está sumamente
relacionada con, pero es estructuralmente distinta de, la
20P1F12/TMPRSS2 descrita en la presente memoria. Por otra parte, el
gen TMPRSS2 descrito por Paoloni-Giacobino et
al. también mostró un patrón de expresión muy diferente en
relación con el perfil de expresión de 20P1F12/TMPRSS2.
Recientemente, sin embargo, se ha publicado un segundo informe que
confirma este dato relacionado tanto con la secuencia como con el
patrón de expresión de 20P1F12/TMPRSS2 en varios tejidos (Lin et
al., 1999 Cancer Res. septiembre
1;59(17):4180-4).
\vskip1.000000\baselineskip
TMPRSS2 representa un blanco terapéutico
potencial para los cánceres de próstata y colon. Como antígeno
asociado a la superficie celular así como fragmento de proteasa
secretada, el mismo puede ser un blanco particularmente bueno para
la terapia de anticuerpos. A fin de explorar esta posibilidad y
además caracterizar la proteína 20P1F12/TMPRSS2, se generaron
anticuerpos monoclonales dirigidos contra una proteína de fusión
GST-20P1F12/TMPRSS2. Específicamente, se generaron
MAb de ratón hacia una región carboxilo-terminal de
la proteasa (residuos 362-440) fusionados a una
glutatión-S-transferasa (GST)
bacteriana. Se generó la proteína de fusión a GST por PCR utilizando
los siguientes cebadores para amplificar la secuencia de
20P1F12/TMPRSS2:
5'-TTGAATTC
CAAACCAGTGTGTCTGCCC-3' (SEC ID NO.: 16), 5'-AAGCTCGAGTCGTCACCCTGGCAAGAAT-3' (SEC ID NO.: 17). El producto de PCR se insertó en pGEX-4T-3 utilizando los sitios de clonación EcoRI y XhoI. La proteína de fusión a GST se purificó y se utilizó para inmunizar ratones. El inmunógeno comprendió una región de aproximadamente 8 kD dentro del dominio de proteasa, específicamente los residuos de aminoácidos 362 hasta 440 (véase la Figura 1).
CAAACCAGTGTGTCTGCCC-3' (SEC ID NO.: 16), 5'-AAGCTCGAGTCGTCACCCTGGCAAGAAT-3' (SEC ID NO.: 17). El producto de PCR se insertó en pGEX-4T-3 utilizando los sitios de clonación EcoRI y XhoI. La proteína de fusión a GST se purificó y se utilizó para inmunizar ratones. El inmunógeno comprendió una región de aproximadamente 8 kD dentro del dominio de proteasa, específicamente los residuos de aminoácidos 362 hasta 440 (véase la Figura 1).
Se inmunizaron ratones con
GST-TMPRSS2 purificada y se generaron hibridomas.
Los sobrenadantes de hibridoma se examinaron para hallar
anticuerpos específicos mediante transferencia Western utilizando
lisados de células 293T transfectadas con 20P1F12/TMPRSS2. Se
examinaron 1.205 pocillos mediante Transferencia Western utilizando
conjuntos de 3-5 pocillos y equipo Western de calles
múltiples (cada pocillo fue positivo respecto de la proteína de
fusión a GST y el producto de ruptura por ELISA). Los subclones se
obtuvieron por clonación por dilución limitante y análisis mediante
transferencia Western. Se identificaron siete hibridomas que
específicamente reconocen 20P1F12/TMPRSS2 mediante Transferencia
Western y se designaron 1F9 (IgG1, K), 2D10 (IgG1, K), 2F8 (IgG1,
K), 6B11 (IgG1, K), 3G3 (IgG1, K), 8C6 (IgG1, K) y 908 (IgG2a, K).
Un clon, 1F9, se utilizó posteriormente para todos los estudios. Se
realizó la transferencia Western de tejido, xenoinjerto y lisados de
líneas celulares de cáncer sobre 20 \mug de proteína de lisados
celulares. La normalización de extractos se logró sondeando
extractos celulares con anticuerpos
anti-GRB-2 (Transduction
Laboratories) o mediante la visualización de las cantidades totales
de proteína de las calles mediante tinción de membranas con Ponceau
S.
\vskip1.000000\baselineskip
Para los estudios de mapeo de epitopos, los mAb
anti-TMPRSS2 1F9 2F8 y 8C6, se biotinilaron a razón
de aproximadamente 4-7 moléculas de biotina por
molécula de anticuerpo utilizando el kit
"EZ-Link"
Sulfo-NHS-LC-Biotinylaton
kit (Pierce, Rockford, IL) conforme al protocolo del fabricante.
Estos anticuerpos biotinilados se utilizaron en un ELISA
competitivo en presencia y ausencia de un exceso de 50 veces cada
uno de los otros 7 anticuerpos anti-TMPRSS2 no
marcados (1F9, 2D10, 2F8, 303, 6B11, 8C6 y 9G8) utilizando el
dominio de proteasa de GST-TMPRSS2 (AA
255-492) como antígeno blanco. Las placas de ELISA
se revistieron con 100 ng/pocillo de dominio de proteasa de
GST-TMPRSS2 y se bloquearon con FBS que contenía 3%
de leche. Las placas después se incubaron con o sin mAb no marcado
en exceso (12,5 \mug/ml) durante 1 hora a temperatura ambiente
(TA). Las placas se lavaron y después se incubaron con 250 ng/ml de
mAbs 2F8 o 8C6 biotinilado, o 100 ng/ml de mAb 1F9 durante 1,5 horas
a TA. Las placas se lavaron y después se incubaron con una dilución
1:2000 del conjugado avidina-HRP (Neutralite,
Fisher Scientific) durante 1 hora. Las placas se lavaron, se
desarrollaron con sustrato TMB, se neutralizaron con H_{2}SO_{4}
1M y se obtuvieron las DO de los pocillos a 450 nm.
La Tabla 2 más abajo proporciona los resultados
de estos estudios de mapeo de epitopos. Los datos de la Tabla 2 son
el promedio \pm intervalo de determinaciones por duplicado.
1F9-B, 2F8-B, 8C6-B:
formas biotiniladas de mAb. En la Tabla 2, los mAb no marcados que
compiten por la unión de anticuerpos biotinilados se indican en
negrita.
Los anticuerpos descriptos más arriba son útiles
para analizar y caracterizar los polipéptidos 20P1F12/TMPRSS2. Se
identifican dos bandas principales de proteína de aproximadamente 54
(el peso molecular (PM) previsto de
20P1F12/TMPRSS2) y aproximadamente 32 kilodaltons en ensayos de traducción in vitro utilizando el ADNc de 20P1F12/TMPRSS2 y 1F9. La transferencia Western de lisados celulares de LNCaP, LAPC-4 y LAPC-9 identifica dos bandas principales de proteínas de aproximadamente 70 y 32 kilodaltons (kD) (Figura 8b). Se determinaron los pesos moleculares de las bandas de proteínas de la transferencia Western utilizando la función de calculo de pesos moleculares del software de análisis de imágenes AlphaEase (Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA) con marcadores de pesos moleculares pre-teñidos (BioRad) como calibradores. Dado que el peso molecular (PM) previsto de 20P1F12/TM2RSS2 es de 54 kD, este dato sugiere que la isoforma de 70 kD está modificada, posiblemente por glicosilación. La forma de 32 kD es un fragmento escindido proteolíticamente que contiene los epitopos carboxilo-terminales reconocidos por los anticuerpos.
20P1F12/TMPRSS2) y aproximadamente 32 kilodaltons en ensayos de traducción in vitro utilizando el ADNc de 20P1F12/TMPRSS2 y 1F9. La transferencia Western de lisados celulares de LNCaP, LAPC-4 y LAPC-9 identifica dos bandas principales de proteínas de aproximadamente 70 y 32 kilodaltons (kD) (Figura 8b). Se determinaron los pesos moleculares de las bandas de proteínas de la transferencia Western utilizando la función de calculo de pesos moleculares del software de análisis de imágenes AlphaEase (Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA) con marcadores de pesos moleculares pre-teñidos (BioRad) como calibradores. Dado que el peso molecular (PM) previsto de 20P1F12/TM2RSS2 es de 54 kD, este dato sugiere que la isoforma de 70 kD está modificada, posiblemente por glicosilación. La forma de 32 kD es un fragmento escindido proteolíticamente que contiene los epitopos carboxilo-terminales reconocidos por los anticuerpos.
Pueden generarse mAb adicionales de
20P1F12/TMPRSS2 mediante inmunización basada en células utilizando
células LAPC-9 que expresan 20P1F12/TMPRSS2 como
agente de selección para ELISAs basados en células. Además, pueden
generarse mAb de 20P1F12/TMPRRSS2 utilizando una proteína
20P1F12/TMPRSS2 purificada tal como el fragmento del dominio de
proteasa secretado como inmunógeno. Por ejemplo, 20P1F12/TMPRSS2
recombinante que posee una cola de histidina
amino-terminal puede expresarse en un sistema de
baculovirus utilizando pBlueBac4.5 (Invitrogen). 20P1F12/TMPRSS2
marcada con His después puede purificarse utilizando una columna de
níquel, cuantificarse y utilizarse como inmunógeno.
Alternativamente, el dominio de proteasa de 20P1F12/TMPRSS2 puede
purificarse a partir de una muestra biológica (p. ej. plasma
seminal) utilizando cromatografía de inmunoafinidad con un
anticuerpo anti-20P1F12/TMPRSS2 tal como el
anticuerpo 1F9 descrito en la presente memoria. La selección de
monoclonales puede realizarse utilizando ELISAs basados en células
con, por ejemplo, células LNCaP y PC-3/TMPRSS2.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó el análisis inmunohistoquímico de
tejidos fijados con formalina y embebidos en parafina con MAb 1F9
sobre secciones de tejido de 4 micrones. Después del tratamiento
con vapor en citrato de sodio (10 mM, pH 6,0), se incubaron los
portaobjetos con 10 \mug/ml de MAb 1F9 seguido de incubación con
IgG biotinilada anti-ratón de conejo. Se llevaron a
cabo estudios de inhibición competitiva en presencia de 50 \mug/ml
de GST o proteína de fusión GST-20P1F12/TMPRSS2.
Las reacciones se visualizaron utilizando peroxidasa de rábano
conjugada con avidina (Vector Labs, Burlingame, CA).
\vskip1.000000\baselineskip
Para estudiar las características de la proteína
20P1F12/TMPRSS2, se clonó el ADNc de 20P1F12 (Figura 1) en pADNc
3.1 Myc-His (Invitrogen), que proporciona una cola
de 6 histidinas en el extremo carboxilo-terminal.
La construcción se transfectó a células 293T y se analizó mediante
biotinilación de la superficie celular. Las proteínas biotiniladas
de la superficie celular se purificaron por afinidad utilizando
estreptavidina-sefarosa. El análisis de
transferencia Western de las proteínas purificadas por afinidad con
estreptavidina utilizando un anticuerpo anti-His
demostró la presencia de proteínas 20P1F12/TMPRSS2 en varias
muestras biológicas (véase, p. ej., la Figura 9a y Figura 23). Por
lo tanto, 20P1F12/TMPRSS2 puede encontrarse tanto en la superficie
celular como ser secretada por las células.
Para examinar la 20P1F12/TMPRSS2 endógena
localizada en la superficie de células LNCaP y PC-3
de cáncer de próstata, se purificaron por afinidad proteínas
biotiniladas de la superficie celular con
estreptavidina-sefarosa y se sondearon con
anticuerpos anti-20P1F12/TMPRSS2. La Transferencia
Western de proteínas purificadas con estreptavidina sugiere la
biotinilación de la superficie celular de 20P1F12/TMPRSS2 endógena
en ambas células LNCaP y PC-3 apareciendo como
bandas de proteínas de 32 y 70 kD (Figura 9b). En controles
adicionales, la proteína 20P1F12/TMPRSS2 no se detectó en
precipitados con estreptavidina de células no biotiniladas (Figura
8b).
Resulta interesante que células 293T
transfectadas con 20P1F12/TMPRSS2 marcada con His en el extremo
carbo-
xilo-terminal expresan fundamentalmente la proteína de 70 kD (Figura 9a). Como el dominio de proteasa de 20P1F12/
TMPRSS2 se localiza en el extremo carboxilo-terminal, el fragmento de 32 kD es el resultado de la ruptura auto-catalítica (véase el Ejemplo 10 más abajo), y posiblemente es inhibido por la cola de histidina. La molécula relacionada, la hepsina (TMPRSSI), parece ser capaz de autoactivación de una manera dependiente de la concentración (Vu et al., 1997, J. Biol. Chem. 272: 31315-31320). Esta ruptura auto-catalítica puede explotarse para identificar moléculas pequeñas que inhiben la actividad de 20P1F12/TMPRSS2. Pueden hacerse crecer células en presencia o ausencia de inhibidores de moléculas pequeñas para buscar específicamente la inhibición de la ruptura. Tal como se trató más arriba, dichas moléculas pequeñas pueden emplearse como agentes terapéuticos del cáncer.
xilo-terminal expresan fundamentalmente la proteína de 70 kD (Figura 9a). Como el dominio de proteasa de 20P1F12/
TMPRSS2 se localiza en el extremo carboxilo-terminal, el fragmento de 32 kD es el resultado de la ruptura auto-catalítica (véase el Ejemplo 10 más abajo), y posiblemente es inhibido por la cola de histidina. La molécula relacionada, la hepsina (TMPRSSI), parece ser capaz de autoactivación de una manera dependiente de la concentración (Vu et al., 1997, J. Biol. Chem. 272: 31315-31320). Esta ruptura auto-catalítica puede explotarse para identificar moléculas pequeñas que inhiben la actividad de 20P1F12/TMPRSS2. Pueden hacerse crecer células en presencia o ausencia de inhibidores de moléculas pequeñas para buscar específicamente la inhibición de la ruptura. Tal como se trató más arriba, dichas moléculas pequeñas pueden emplearse como agentes terapéuticos del cáncer.
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El PM predicho de 20P1F12/TMPRSS2 es
significativamente más pequeño que el PM aparente detectado por la
Transferencia Western. Esto sugiere que 20P1F12/TMPRSS2 puede ser
glicosilada. La secuencia GTC1 indica que existen tres sitios
potenciales de glicosilación con la secuencia de consenso de NXSIT
(residuos 128, 213, 249). Para explorar la posibilidad de que
20P1F12/TMPRSS2 sea glicosilada, 20P1F12/TMPRSS2 marcada con His se
transfectó a células 293T y se purificó utilizando
Níquel-agarosa (Invitrogen). La proteína purificada
por afinidad se eluyó con EDTA 50 mM, pH 8,0, y se desglicosiló
utilizando N-glicosidasa F (Boehringer Mannheim) de
acuerdo con el protocolo de los fabricantes. La proteína no tratada
y glicosilada se analizó mediante transferencia Western utilizando
anticuerpos anti-His. Los resultados muestran un
cambio de PM de 5-8 kD de 20P1F12/TMPRSS2 con el
tratamiento con N-glicosidasa F (Fig 10), que
indica que 20P1F12/TMPRSS2 es realmente una proteína glicosilada.
La 20P1F12/TMPRSS2 desglicosilada aún exhibía un PM de al menos
5-10 kD mayor que el tamaño previsto, indicando que
la reacción de desglicosilación no estaba completa (o que la
glicosilación está unida a O), o que 20P1F12/
TMPRSS2 puede exhibir modificaciones pos-traduccionales adicionales (tales como fosforilación, sulfatación).
TMPRSS2 puede exhibir modificaciones pos-traduccionales adicionales (tales como fosforilación, sulfatación).
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La transferencia Northern muestra que la
expresión de 20P1F12/TMPRSS2 parece reducirse en el xenoinjerto de
LAPC-9 independiente de andrógenos y en las líneas
celulares PC-3 y DU145 independientes de andrógenos
(Figura 6), sugiriendo que 20P1F12/TMPRSS2 puede ser un gen
regulado por andrógenos. Para explorar esta posibilidad, células
LNCaP, que son dependientes de andrógenos y expresan niveles
significativos de 20P1F12/TMPRSS2, se privaron de andrógenos
durante una semana haciéndolas crecer en un medio que contenía suero
fetal bovino (FBS) tratado con 2% de carbón vegetal. Las células
después se estimularon con mibolerona, un análogo sintético de
andrógenos, en varios puntos de tiempo. Las células se cosecharon
para obtener ARN y realizar una transferencia Northern. Como
control de carga, la misma transferencia también se sondeó con
\beta-actina. Los resultados (Figura 11) muestran
una clara reducción de la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 durante la
privación de andrógenos (Figura 11). La adición de mibolerona
incrementó la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 de manera significativa,
indicando que es un gen sensible a los andrógenos. La expresión del
antígeno específico de la próstata (PSA) en las mismas muestras se
monitoreó como control positivo para la regulación por andrógenos
(Figura 11).
Para determinar el tiempo óptimo de inducción de
20P1F12/TMPRSS2, células privadas de andrógenos se estimularon con
mibolerona durante varios puntos de tiempo. Las células se
cosecharon para el aislamiento de ARN y proteínas para realizar
transferencia Northern y Western, respectivamente. Los resultados
(Figura 12) muestran la inducción del mensaje de 20P1F12/TMPRSS2
dentro de las tres horas siguientes a la estimulación e incrementada
a lo largo de las 24 horas posteriores a la adición de hormonas.
Además, la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 parece reducirse levemente
en los xenoinjertos de LAPC-4.
Para analizar los niveles de proteína, se
realizó la transferencia Western de lisados celulares utilizando el
mAb 1F9. Los controles adicionales de la expresión de
20P1F12/TMPRSS2 incluyeron células PC-3 infectadas
con un retrovirus que codifica tanto neo como 20P1F12/TMPRSS2. Las
células PC-3 infectadas se seleccionaron en G418
durante 2-3 semanas y se cosecharon para la
transferencia Western. Los resultados mostraron la expresión de
20P1F12/TMPRSS2 en las células infectadas con un virus de
20P1F12/TMPRSS2, y ninguna expresión detectable de 20P1F12/TMPRSS2
en las células neo.
Cuando se observan las células LNCaP privadas de
andrógenos, la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 es aún detectable, pero
visiblemente reducida cuando se compara con células estimuladas con
andrógenos. Sin embargo, el primer punto de tiempo de expresión
inducida aparece después de las 9 horas de estimulación, indicando
que la expresión proteica de 20P1F12/TMPRSS2 queda a la zaga de la
inducción por ARN (Figura 12). Por otra parte, la Figura 21 muestra
la inducción por andrógenos y la liberación del fragmento
auto-proteolítico de 32 kD a los sobrenadantes de
células LAPC4 y LNCaP y la aparición de un nuevo complejo proteico
inmunoreactivo anti-TMPRSS2 de 103 kD.
Estos resultados demuestran que
20P1F12/TMPRSS2 es un gen regulado por andrógenos, similar a otras
proteasas específicas de la próstata, tales como PSA y hK2 (Young
et al., 1995, S. Androl. 16:97).
\vskip1.000000\baselineskip
20P1F12/TMPRSS2 exhibe expresión específica de
la próstata y parece estar regulada por andrógenos. Para determinar
el efecto de la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 en una línea celular
heteróloga de cáncer no prostático, se utilizó el retrovirus de
20P1F12/TMPRSS2 para infectar células NIH 3T3. La morfología de las
células infectadas con retrovirus de 20P1F12/TMPRSS2 se comparó con
la morfología de células de control (neo) infectadas con el virus.
Una población de células infectadas exhibió un aspecto vacuolar
distinto en comparación con las células de control (Figura 13), que
parecen correlacionarse con altos niveles de expresión. Después del
pasaje de esta población de células infectadas, las células
portadoras de vacuolas gradualmente desaparecieron con expresión
aparentemente reducida de 20P1F12/TMPRSS2.
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La función de 20P1F12/TMPRSS2 se evaluó en
células de mamíferos manipuladas genéticamente para expresar
20P1F12/TMPRSS2. Para este fin, 20P1F12/TMPRSS2 se clonó en
diversos vectores, incluyendo pADNc 3.1
myc-His-tag (Invitrogen), el
vector retroviral pSR\alphatkneo (Muller et al., 1991, MCB
11:1785), y pIND (Invitrogen), un sistema de expresión inducible
por ecdisona. Al utilizar estos vectores de expresión,
20P1F12/TMPRSS2 se expresó en varias líneas celulares, incluyendo
PC-3. La expresión de 20P1F12/TMPRSS2 se monitoreó
utilizando anticuerpos anti-20P1F12TMt'RSS2
mediante Western y análisis FACS. La 20P1F12/TMPRSS2 purificada se
utiliza para identificar el sustrato.
Dichas líneas celulares de mamíferos que
expresan 20P1F12/TMPRSS2 pueden entonces probarse en diversos
ensayos in vitro, incluyendo proliferación celular, adhesión
celular, invasión celular utilizando un sistema de cultivo de
invasión en membrana (MICS) (Welch et al., Int. I. Cáncer 43:
449-457) en el cultivo de tejidos, y ensayos in
vivo, incluyendo formación de tumores en ratones SCID. El
fenotipo celular de 20P1F12/TMPRSS2 se compara con el fenotipo de
células que no expresan 20P1F12/TMPRSS2.
Para evaluar el papel funcional de los
diferentes dominios en 20P1F12/TMPRSS2, se generan las siguientes
mutantes de eliminación y mutantes puntuales: (i) ASRCR (supresión
de 93 a.a.); (ii) dLDLRA (supresión de 35 a-a.); y
(iii) mutante de la tríada catalítica: H296Q, D345N, S441A (mutantes
puntuales únicas). Las mutantes de 20P1F12/TMPRSS2 se clonaron en
vectores retrovirales psR\alphatkneo para la expresión en células
de mamíferos. Las mutantes resultantes son útiles para elucidar la
importancia de los diferentes dominios y residuos. (Véase, p. ej.,
el Ejemplo 10 más abajo). Además, estas mutantes son útiles para
determinar si tales mutantes funcionan como moléculas negativas
dominantes. La actividad negativa dominante puede manifestarse en
células que expresan 20P1F12/TMPRSS2 endógena, tales como LNCaP. La
actividad negativa dominante puede deberse a interacciones con
sustratos a través del dominio de proteasa o a través de dominios de
interacción proteína-proteína. Las moléculas
mutantes de 20P1F12/TMPRSS2 se prueban en los mismos ensayos in
vitro e in vivo que 20P1F12TTMPRSS2 de tipo salvaje
(véase más arriba). Tales moléculas negativas dominantes de
20P1F12/TMPRSS2 pueden ser útiles terapéuticamente. Por ejemplo,
una 20P1F12/TMPRSS2 dominante negativa puede introducirse en células
cancerosas (tales como células de cáncer de vejiga, ovario, pulmón,
riñón o colon, o células de cáncer metastásico) a través de
vectores de terapia génica capaces de administrar y expresar la
secuencia codificadora correspondiente en células de tumor de
próstata.
Determinar las características de la expresión
de 20P1F12/TMPRSS2 en tejidos de ratón normal y en ratones
transgénicos proporciona información adicional acerca de la función
de 20P1F12/TMPRSS2. El análisis de transferencia Northern que
utiliza sondas diseñadas a partir de las secuencias de
20P1F12/TMPRSS2 provistas en la presente memoria pueden utilizarse
para definir el patrón de expresión de la 20P1F12/TMPRSS2 murina.
Además, puede analizarse la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 durante el
desarrollo en el embrión del ratón. Los datos resultantes
identificarán una fuente de tejido para clonar el gen del ratón y
predecir qué tejidos serían afectados en un estudio de ratón
knock-out transgénico.
Pueden generarse ratones transgénicos y
utilizarse para definir el papel biológico de 20P1F12/TMPRSS2 en un
ámbito in-vivo. En un enfoque, los genes
20P1F12/TMPRSS2 humanos o de ratón se utilizan para generar ratones
transgénicos. La sobreexpresión de formación tumoral espontánea en
ratones se puede estudiar utilizando ratones transgénicos. En otro
enfoque, los knock-outs del gen 20P1F12/TMPRSS2 se
generan en ratones. Dichos ratones también pueden cruzarse con
otros modelos de ratón con cáncer de próstata, tales como el modelo
TRAMP (Greenberg et al., 1995, PNAS 92:3439), para estudiar
la influencia sobre la agresividad y la metástasis del cáncer de
próstata y para observar cambios en el avance de la enfermedad.
Los experimentos que prueban la interacción
funcional de 20P1F12/TMPRSS2 con inhibidores de la
serina-proteasa también proporcionarán información
acerca de la función de 20P1F12/TMPRSS2. Para este fin, la
inhibición se logra utilizando inhibidores de molécula pequeña o
inhibidores biológicos.
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Se generaron MAbs de ratón contra el dominio de
proteasa de 20P1F12/TMPRSS2. La transferencia Western de los
extractos proteicos de células 293T utilizando el MAb 1F9, mostró
igual expresión de dos especies de proteínas con pesos moleculares
aparentes de 70 y 32 kilodaltons (kd) sólo en las células
transfectadas con 20P1F12/TMPRSS2 y no en células de control
transfectadas con el vector (Figura 15). El peso molecular (PM)
predicho de 20P1F12/TMPRSS2 es de 54 kd, sugiriendo que la isoforma
de 70 kd está modificada, posiblemente mediante glicosilación. La
secuencia de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 contiene tres posibles
sitios de glicosilación ligados a N en los residuos 128, 213 y 249.
Estudios preliminares que utilizan proteína 20P1F12/TMPRSS2 tratada
con endoglicosidasa F indican que la proteína está realmente
glicosilada. La forma de 32 kd puede ser un fragmento de ruptura
proteolítica que contiene los epitopos
carboxilo-terminales reconocidos por el
anticuerpo.
El análisis de tejido y líneas celulares
humanas, que expresan niveles variables de 20P1F12/TMPRSS2 mediante
transferencia Northern, mostró el mismo patrón de expresión de la
proteína que en las células 293T transfectadas con 20P1F12/TMPRSS2.
La expresión de 20P1F12/TMPRSS2 se detectó en los lisados proteicos
de células LAPC-4 AD, LAPC-9 AD y
LNCaP, pero no en las células PC-3 y DU145
independientes de andrógenos. El análisis de tres especímenes de
cáncer de próstata combinado con tejido adyacente normal mostró una
expresión significativa de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 en todas las
muestras, incluyendo los tejidos de próstata normal. También se
detectó alta expresión en la línea celular Colo-205
de cáncer de colon (Figura 14).
Resulta interesante que, según se muestra en la
Figura 23, en el lisado tisular entero de la próstata de una
víctima de accidente normal, masculina, de 28 años (panel C), la
relación entre las especies de 70 kD y 32 kb de 20P1F12/TMPRSS2
parece ser diferente de la observada en el lisado tisular entero de
próstatas de individuos que sufren de cáncer (panel B),
proporcionando evidencia de que la inducción de la proteólisis puede
correlacionarse con la enfermedad.
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Nuestro análisis muestra que la expresión de
20P1F12/TMPRSS2 es menor en el xenoinjerto de LAPC-9
independiente de andrógenos y las líneas celulares
PC-3 y DU145 independientes de andrógenos, en
comparación con los xenoinjertos y líneas celulares dependientes de
andrógenos. La castración de ratones macho que albergan tumores
LAPC-9 dependientes de andrógenos produce una
reducción dramática de la expresión de 20P1F12/TMPRSS2. A fin de
extender estos descubrimientos, células LNCaP, que son dependientes
de andrógenos y expresan significativos niveles de 20P1F12/TMPRSS2,
fueron privadas de andrógenos durante una semana. La expresión de la
proteína 20P1F12/TMPRSS2 en las células privadas de andrógenos se
comparó con la expresión en células tratadas con mibolerona. Los
resultados muestran que la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 fue
significativamente reducida durante la privación de andrógenos
(Figura 16A). La estimulación de células LNCaP privadas de
andrógenos con mibolerona durante 9 y 24 horas produjo un
incremento en la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 que es comparable con
los niveles observados en células LNCaP no tratadas. Los niveles de
proteína PSA se midieron en paralelo, mostrando una similar
regulación.
Las células PC-3, que
normalmente no expresan el receptor de andrógenos (Tilley et
al., 1990, Cáncer Res. 1990, 50:5382-5386) y
crecen de una manera independiente de los andrógenos, expresan poco
o nada de 20P1F12/TMPRSS2. Sin embargo, las células
PC-3 que se han manipulado genéticamente para
expresar el receptor de andrógenos de tipo salvaje exhiben bajos
niveles de expresión de 20P1F12/TMPRSS2 cuando son tratadas con
mibolerona (Figura 16A). Esto indica que la expresión de
20P1F12/TMPRSS2 en células de cáncer de próstata depende de una
señal del receptor de andrógenos y la restauración de esta vía en
células de cáncer de próstata independientes de andrógenos reactiva
la expresión de 20P1F12/TMPRSS2. La expresión de PSA en células
PC-3 también puede serr inducida por la expresión
heteróloga del receptor de andrógenos y la estimulación concomitante
de andrógenos (Dal et al., 1996, Steroids
61:531-539). Estos estudios demuestran que, de
manera similar a PSA, la expresión de la proteína 20P1F12/TMPRSS2
es críticamente dependiente de la vía del receptor de
andrógenos.
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Las predicciones estructurales para
20P1F12/TMPRSS2 sugieren que esta es una proteína transmembrana de
tipo II con un dominio de proteasa. El tamaño del fragmento de
20P1F12/TMPRSS2 escindido de 32 kD sugiere que contiene la región
proteasa entera. La ruptura de este dominio por lo tanto produce la
liberación de la proteasa al espacio extracelular. Para probar
esta hipótesis, se recolectó el medio de células LNCaP y LAPC4
privadas de andrógenos y estimuladas con andrógenos. Después se
analizó el medio para determinar la presencia de la proteína
20P1F12/TMPRSS2 mediante inmunoprecipitación y transferencia Western
utilizando MAb anti-20P1F12/TMPRSS2. Los resultados
muestran clara detección de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 escindida en
el medio de las células estimuladas con andrógenos, pero no en las
células privadas de andrógenos (Figura 16B). La cantidad de proteasa
presente en el medio se correlaciona directamente con la cantidad
de proteína 20P1F12/TMPRSS2 presente en los extractos celulares,
que se incrementa con el aumento de la dosis de mibolerona (Figura
16B). La proteasa de 20P1F12/TMPRSS2 secretada también se detecta en
los sueros de ratones que albergan células LNCaP.
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Se examinó la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 en
biopsias y muestras quirúrgicas de cáncer de próstata mediante
análisis inmunohistoquímico. La tinción específica de la proteína
20P1F12/TMPRSS2 se validó utilizando células LNCaP que fueron
privadas de andrógenos durante una semana y después se dejaron o
bien sin tratar, o se estimularon con mibolerona durante 9 horas. A
continuación las células se fijaron, se embebieron en parafina y se
tiñeron con el anticuerpo anti-20P1F12/TMPRSS2 1F9.
La tinción de 20P1F12/TMPRSS2 de LNCaP privadas de andrógenos
mostró muy escasa tinción de las células. Por el contrario, la
mayoría de las células estimuladas con andrógenos mostraron fuerte
tinción intracelular (Figura 17A, B). Las células LNCaP que
crecieron en un medio regular exhibieron similar tinción que las
células estimuladas con andrógenos. La mayor parte de la tinción
apareció localizada en las estructuras granulares dentro de la
célula.
El análisis de 20 especímenes clínicos mostró
tinción moderada a fuerte en los epitelios glandulares de todas las
muestras probadas de próstata normal, PIN y cáncer de próstata
(Figura 17C y D, y Tabla 1 más abajo). La señal pareció ser la más
fuerte en el lado apical de las células secretoras, y en algunos
casos se vio tinción granular como se observó en LNCaP. La tinción
del tejido prostático fue específica, ya que el inmunógeno
GST-20P1F12/TMPRSS2 pudo inhibir competitivamente la
tinción del tejido de cáncer de próstata, mientras que GST sola no
pudo. De manera similar al PSA, se descubrió que la proteína
20P1F12/TMPRSS2 se acumula dentro del lumen de las glándulas
epiteliales (Figura 17E, F), indicando que la proteína
20P1F12/TMPRSS2 es secretada por el epitelio secretor.
No se detectó ninguna expresión de la proteína
en las capas de células basales de las muestras de próstata normal
examinadas. Este patrón de tinción está en oposición al análisis de
hibridización de ARN in situ, que mostró la expresión del
ARN de 20P1F12/TMPRSS2 fundamentalmente en la capa celular basal de
glándulas prostáticas normales (Lin et al., 1999).
El análisis de varios tejidos no prostáticos no
mostró ninguna tinción en la mayoría de los tejidos (Tabla 1),
incluyendo riñón y pulmón, que expresan algún mensaje de
20P1F12/TMPRSS2. La expresión de la proteína se detectó en muestras
de páncreas normales, tejidos de colon normal y tejidos de cáncer de
colon (Tabla 1). La tinción pancreática se limitó a las células
acinares exocrinas piramidales. No se detectó tinción alguna en los
islotes de Langerhans. La tinción en colon normal apareció
fundamentalmente en la envoltura mucosa (Figura 17G). La tinción en
el cáncer de colon fue en general más profunda que en los tejidos de
colon normal. La acumulación significativa de 20P1F12/TMPRSS2 (como
se muestra mediante la tinción con el anticuerpo directo al dominio
de proteasa) también se detectó en las áreas luminales (Figura 17H),
proporcionando evidencia de secreción del antígeno. Por otra parte,
según se ilustra, por ejemplo, en la Figura 17H, en el cáncer la
arquitectura tisular se ve afectada, lo que posiblemente produce la
fuga de 20P1F12/TMPRSS2 al torrente sanguíneo de manera análoga al
PSA.
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Se generaron mutantes puntuales únicas de
20P1F12/TMPRSS2 utilizando un método de PCR de dos etapas. Los
residuos de arginina 240, 252 y 255 se mutaron a glutaminas, y la
serina 441 se mutó a alanina. Utilizando un clon de ADNc de
longitud completa como molde, se generó un fragmento de PCR
5'-20P1F12/TWRSS2 utilizando un cebador mutagénico
(5'-GGCCCTCCAGCGTCACCC-3' (SEC ID
NO.: 18) para la mutante S441A,
5'-CCGCAGGC
TATACATTGTAAAGAAACC-3' (SEC ID NO: 19) para R240Q, 5'-TCCTGCTCTGTTGGCTTGAGTTCA-3' (SEC ID NO: 20) para R252Q y 5'-CCCACAATCTGGCTCTGGCG-3' (SEC ID NO: 21) para R255Q) y un cebador de 20P1F12/TMPRSS2 específico de 5' que contenía el codón de inicio, una secuencia kozak, y un sitio EcoRI para clonación (5'CGAATTCGCAAGATGGCTTTGAAC-3') (SEC ID NO: 22). El fragmento 3' se generó mediante PCR utilizando el complemento inverso del cebador mutagénico (5'-GGGTGACGCTGGAGGGCC-3' (SEC ID NO: 23) para S441A, 5'-GGTTTCTTTACAATGTATAGCCTGCGG-3' (SEC ID NO: 24) para R240Q, 5'-TGAACTCAAGC
CAACAGAGCAGGA-3' (SEC ID NO: 25) para la mutante R252Q y 5'-CGCCAGAGCCAGATTGTGGG-3' (SEC ID NO: 26) para R255Q) y un cebador de 20P1F12/TMPRSS2 específico de 3' que contenía el codón de detención y un sitio XbaI para clonación (5'CGTCTAGATTAGCCGTCTGCCCTCA-3') (SEC ID NO: 27). Para la segunda vuelta de PCR, los fragmentos 3' y 5' se utilizaron como moldes. El producto final de PCR se digirió con EcoRI y Xbal, y se clonó en pSR\alphaMSV-tkNeo. La expresión de la proteína se analizó después de la transfección en células 293T.
TATACATTGTAAAGAAACC-3' (SEC ID NO: 19) para R240Q, 5'-TCCTGCTCTGTTGGCTTGAGTTCA-3' (SEC ID NO: 20) para R252Q y 5'-CCCACAATCTGGCTCTGGCG-3' (SEC ID NO: 21) para R255Q) y un cebador de 20P1F12/TMPRSS2 específico de 5' que contenía el codón de inicio, una secuencia kozak, y un sitio EcoRI para clonación (5'CGAATTCGCAAGATGGCTTTGAAC-3') (SEC ID NO: 22). El fragmento 3' se generó mediante PCR utilizando el complemento inverso del cebador mutagénico (5'-GGGTGACGCTGGAGGGCC-3' (SEC ID NO: 23) para S441A, 5'-GGTTTCTTTACAATGTATAGCCTGCGG-3' (SEC ID NO: 24) para R240Q, 5'-TGAACTCAAGC
CAACAGAGCAGGA-3' (SEC ID NO: 25) para la mutante R252Q y 5'-CGCCAGAGCCAGATTGTGGG-3' (SEC ID NO: 26) para R255Q) y un cebador de 20P1F12/TMPRSS2 específico de 3' que contenía el codón de detención y un sitio XbaI para clonación (5'CGTCTAGATTAGCCGTCTGCCCTCA-3') (SEC ID NO: 27). Para la segunda vuelta de PCR, los fragmentos 3' y 5' se utilizaron como moldes. El producto final de PCR se digirió con EcoRI y Xbal, y se clonó en pSR\alphaMSV-tkNeo. La expresión de la proteína se analizó después de la transfección en células 293T.
20P1F12/TMPRSS2 se expresa predominantemente
como una proteína de 32 KD que es muy posiblemente el resultado de
la ruptura proteolítica. Para determinar si esta ruptura se debe a
la actividad catalítica de 20P1F12/
TMPRSS2, el residuo de serina 441 de la tríada catalítica del dominio de proteasa se mutó a alanina (S441A). El ADNc de 20P1F12/TMPRSS2 mutante se clonó en un vector retroviral para la expresión en células 293T. El análisis de transferencia Western de extractos celulares de células 293T transfectadas o bien con 24P1F12/TMPRSS2 de tipo salvaje o con la mutante de S441A mostró que en oposición a la proteína de tipo salvaje, 20P1F12/TMPRSS2 S441A apareció como una especie de proteína única con un peso molecular aparente de 70 kD. Resulta interesante que 20P1F12/TMPRSS2 con una myc-cola de histidina carboxilo-terminal también mostró la expresión predominante de la proteína marcada de longitud completa, aunque se detectó algún producto de ruptura. Esto sugiere que la myc-cola de histidina en el extremo carboxilo-terminal del dominio de proteasa ejerce alguna actividad inhibidora sobre la ruptura proteolítica (Figura 18). Estos resultados de estos experimentos demuestran que la ruptura proteolítica de 20P1F12/TMPRSS2 en células y tejidos es una consecuencia de la actividad auto-catalítica.
TMPRSS2, el residuo de serina 441 de la tríada catalítica del dominio de proteasa se mutó a alanina (S441A). El ADNc de 20P1F12/TMPRSS2 mutante se clonó en un vector retroviral para la expresión en células 293T. El análisis de transferencia Western de extractos celulares de células 293T transfectadas o bien con 24P1F12/TMPRSS2 de tipo salvaje o con la mutante de S441A mostró que en oposición a la proteína de tipo salvaje, 20P1F12/TMPRSS2 S441A apareció como una especie de proteína única con un peso molecular aparente de 70 kD. Resulta interesante que 20P1F12/TMPRSS2 con una myc-cola de histidina carboxilo-terminal también mostró la expresión predominante de la proteína marcada de longitud completa, aunque se detectó algún producto de ruptura. Esto sugiere que la myc-cola de histidina en el extremo carboxilo-terminal del dominio de proteasa ejerce alguna actividad inhibidora sobre la ruptura proteolítica (Figura 18). Estos resultados de estos experimentos demuestran que la ruptura proteolítica de 20P1F12/TMPRSS2 en células y tejidos es una consecuencia de la actividad auto-catalítica.
El dominio de proteasa de 20P1F12/TMPRSS2
pertenece a la familia S1 de serina-proteasas con
actividad de ruptura después de los residuos de Arg o Lys. El
examen de la secuencia proteica revela la presencia de tres residuos
de Arg (aminoácidos 240, 252, 255) cerca de la región
amino-terminal del dominio de proteasa de
20P1F12/TMPRSS2. Para identificar el sitio real de ruptura del
dominio de proteasa, se mutaron los tres residuos de Arg a residuos
de Gln. Las mutantes se expresaron en células 293T mediante
transfección transitoria y se analizaron por transferencia Western.
Solamente la mutación R255Q produjo una pérdida de la ruptura
auto-catalítica, identificando la unión Arg 255
-Ile 256 como el sitio de ruptura proteolítica. Estos resultados se
indican en la Figura 34.
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar si la autocatálisis y la
generación del fragmento de proteína 20P1F12/TMPRSS2 de 32kD pueden
tener relevancia biológica y clínica en el cáncer de próstata y
colon, se monitoreó la expresión de la proteína 20P1F12/TMPRSS2 en
muestras clínicas de suero humano de cáncer de colon y próstata y en
suero de ratones portadores de xenoinjertos de LNCaP de cáncer de
próstata. El análisis por inmunoprecipitación/Western de estas
muestras de suero con mAb 1F9 anti-20P1F12/TMPRSS2
demuestra la expresión del fragmento de ruptura de 32 kD, en el
suero de ratón con LNCaP y en muestras de cáncer de próstata y
colon, pero no en 2 muestras de sueros masculinos normales
analizadas (Figuras 23A y B). La banda que representa el fragmento
de 32 kD en las muestras de suero humano corre a un peso molecular
más bajo que el fragmento de los sobrenadantes de LNCaP debido a la
presencia predominante de inmunoglobulina de cadena liviana del
mismo peso molecular que se arrastró en la inmunoprecipitación. La
presencia del fragmento proteolítico de 20P1F12/TMPRSS2 en las
muestras de cáncer pero no en las de suero normal sugiere que
20P1F12/TMPRSS2 puede ser un marcador diagnóstico sérico para cáncer
de próstata y colon, así como para cáncer de vejiga, ovario y
pulmón y cáncer metastásico. Al igual que en los sobrenadantes del
cultivo tisular de células LNCaP, se detectó un complejo
inmunorreactivo anti-20P1F12/TMPRSS2 de 103 kD en
muestras de suero en las que se expresó el fragmento de 32 kD. La
descripción provista en la presente memoria proporciona evidencia
de que el fragmento de 32 kD codifica una
serina-proteasa biológicamente activa y que la
banda nueva de 103 kD puede representar un complejo del dominio de
proteasa de 20P1F12/TMPRSS2 de 32 kD y un inhibidor sérico de la
serina-proteasa (serpina). Dichos complejos séricos
se describen bien para las calicreínas específicas de próstata PSA
y hK2, que están presentes, cada una, en suero tanto en forma libre
como en complejos con la serpina
alfa-1-antiquimotripsina (Véase, p.
ej., Grauer, LS, et al. Detection of human
glandularkallidrein, hK2, as its precursor form and in complex with
protease inhibitors in prostate carcinoma serum. J. Androl.
19:407-411, 1998; Christensson A et al. FERUM
prostate specific antigen complexed to alpha
1-antichymotrypsin as an indicator of prostate
cancer. J. Urol. 150:100-105, 1993; Clements IA. The
human kallikrein gene family: a diversity of expresión and
function. Mol. Cell. Endocrinol. 99:C1-C6, 1994).
Resulta interesante que el análisis de la expresión de
20P1F12/TMPRSS2 en el tejido de la próstata de un individuo de sexo
masculino normal joven (28 años) muestra la expresión predominante
del 20P1F12/TMPRSS2 de longitud completa en comparación con
muestras de pacientes y líneas celulares de cáncer de próstata
(Figura 23C). Esta observación proporciona evidencia de que la
proporción relativa de fragmento de ruptura respecto de
20P1F12/TMPRSS2 de longitud completa puede aumentar en la enfermedad
comparada con el tejido sano de próstata y colon.
Debido a las similitudes entre PSA y
20P1F12/TMPRSS2 en cuanto a ser serina-proteasas
reguladas por andrógenos específicas de la próstata, investigamos
si la función natural de 20P1F12/TMPRSS2, como PSA, puede ser la de
una serina-proteasa secretada en el fluido seminal.
El análisis Western de plasma seminal normal demuestra un alto
nivel de expresión del fragmento de ruptura de 32 kD de
20P1F12/TMPRSS2 así como de un fragmento levemente más pequeño de
30 kD (Figura 24A). No se observa expresión detectable de la
proteína 20P1F12/TMPRSS2 de longitud completa de 70 kD en plasma
seminal como se aprecia en lisados tisulares, sin embargo se
observa una banda inmunorreactiva nueva de peso molecular más alto,
90 kD, que puede representar un complejo covalente del dominio de
proteasa de 20P1F12/TMPRSS2 y una serpina de plasma seminal. La
inmunoprecipitación/análisis Western de 20P1F12/TMPRSS2 en
sobrenadantes de LNCaP y fluido seminal demuestra expresión del
fragmento de 32 kD en ambos, pero complejos diferentes de mayor
peso molecular en suero que contiene sobrenadantes (103 kD) en
comparación con el plasma seminal (90 kD). Se encuentran PSA
complejado con
alfa-1-antiquimotripsina en suero
pero con inhibidor de la proteína C en plasma seminal (España et
al. Thromb. Res. 64:309-320, 1991; Christensson
et al. Bur. J. Biochem. 220:45-53, 1994).
Una situación similar puede existir para 20P1F12/TMPRSS2 en el
sentido que la banda de suero de 103 kD y la banda de plasma
seminal de 90 kD representan complejos con serpinas distintas y que
la concentración relativa de serpinas en estos fluidos puede regir
la formación del complejo. Resulta interesante que una banda más
liviana de 90 kD también se observa en la inmunoprecipitación del
sobrenadante de LNCaP (Figura 24B).
Además, según se muestra en la Figura 26, se
aprecia un alto nivel de expresión del fragmento de ruptura de
20P1F12/TMPRSS2 de 32 kD en líneas celulares de cáncer de colon y
muestras de tejido de cáncer de colon en comparación con tejido de
colon normal. Específicamente, los lisados de especímenes clínicos
que representan tejido de cáncer de colon combinado o tejido
adyacente normal (lado izquierdo de la transferencia) y de líneas
celulares de cáncer de colon (lado derecho de la transferencia), y
de xenoinjertos de LAPC4 y LAPC9 de cáncer de próstata se
sometieron a análisis de transferencia Western
anti-TMPRSS2 utilizando mAb 1F9. Las flechas
indican la posición del fragmento auto-catalítico de
32 kD y la proteína 20P1F12/TMPRSS2 de longitud completa de 70 kD.
Se ve una mayor expresión del fragmento de 32 kD en el tejido de
cáncer de colon que en el tejido adyacente normal combinado.
Asimismo, la especie inmunorreactiva predominante presente en líneas
celulares de cáncer de colon también es el fragmento de 32 kD.
Resulta interesante que existe muy poca expresión de la proteína
20P1F12/TMPRSS2 de longitud completa en las muestras de colon pero
existe una fuerte expresión de bandas inmunorreactivas
anti-TMPRSS2 de 90 kD y 50 kD en los tejidos de
colon que pueden representar un complejo del fragmento de 32 kD.
\vskip1.000000\baselineskip
Puede utilizarse una variedad de metodologías
bien conocidas en la técnica para examinar el uso de
20P1F12/
TMPRSS2 como blanco diagnóstico y/o terapéutico para el cáncer de próstata y colon y para caracterizar y cuantificar la proteína 20P1F12/TMPRSS2 en fluidos clínicos de pacientes con cáncer de próstata y colon. Por ejemplo, se puede además desarrollar ELISA de captura sensible utilizando el panel existente de mAbs según se describe en el Ejemplo 5 más arriba (6 IgG1, 1 IgG2a). Dichos protocolos de ELISA pueden encontrarse, por ejemplo, en Current Protocols In Molecular Biology, Unidad II, Frederick M. Ausubul et al. eds., 1995. Además, tal como se ilustra más arriba, el experto en la técnica puede analizar un espectro de muestras clínicas para evaluar la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 y la formación de complejos en diferentes contextos utilizando, por ejemplo, una estrategia Western. Dichas estrategias Western se describen, por ejemplo, en Current Protocols In Molecular Biology, Unidad 10, Frederick M. Ausubul et al. eds., 1995. Además, el experto en la técnica puede determinar el uso potencial de Abs contra el complejo 20P1F12/TMPRSS2-pareja de unión (de manera análoga a la observada con PSA y Abs anti-serpina) en el desarrollo de ELISA. Por otra parte, se pueden generar paneles de mAbs contra el dominio de proteasa así como contra dominios diferentes de la proteasa (SRCR, LDL, intracelular, etc.).
TMPRSS2 como blanco diagnóstico y/o terapéutico para el cáncer de próstata y colon y para caracterizar y cuantificar la proteína 20P1F12/TMPRSS2 en fluidos clínicos de pacientes con cáncer de próstata y colon. Por ejemplo, se puede además desarrollar ELISA de captura sensible utilizando el panel existente de mAbs según se describe en el Ejemplo 5 más arriba (6 IgG1, 1 IgG2a). Dichos protocolos de ELISA pueden encontrarse, por ejemplo, en Current Protocols In Molecular Biology, Unidad II, Frederick M. Ausubul et al. eds., 1995. Además, tal como se ilustra más arriba, el experto en la técnica puede analizar un espectro de muestras clínicas para evaluar la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 y la formación de complejos en diferentes contextos utilizando, por ejemplo, una estrategia Western. Dichas estrategias Western se describen, por ejemplo, en Current Protocols In Molecular Biology, Unidad 10, Frederick M. Ausubul et al. eds., 1995. Además, el experto en la técnica puede determinar el uso potencial de Abs contra el complejo 20P1F12/TMPRSS2-pareja de unión (de manera análoga a la observada con PSA y Abs anti-serpina) en el desarrollo de ELISA. Por otra parte, se pueden generar paneles de mAbs contra el dominio de proteasa así como contra dominios diferentes de la proteasa (SRCR, LDL, intracelular, etc.).
Además, puede utilizarse una variedad de
metodologías bien conocidas en la técnica para identificar y
caracterizar bandas nuevas inmunorreactivas de 20P1F12/TMPRSS2 de
alto peso molecular en suero (103 kD) y semen (90 kD). Por ejemplo,
el experto en la técnica puede detectar un panel conocido de
moléculas que posiblemente interactúan con 20P1F12/TMPRSS2 (sobre
la base de observaciones con moléculas similares tales como PSA)
tales como serpinas de suero y semen para identificar la formación
de complejos de 20P1F12/TMPRSS2. Dichas moléculas candidatas
también incluyen
alfa-1-antiquimotripsina (complejos
de PSA y hK2 en suero), inhibidor de la proteína C (complejos de
PSA y hK2 en semen),
alfa-2-macroglobulina,
alfa-1-antitripsina,
alfa-2-antiplasmina,
anti-trombina III y otras serpinas.
Alternativamente, se puede aislar y secuenciar la pareja de unión
utilizando técnicas conocidas de purificación y secuenciación de
proteínas (tales como columnas de afinidad, etc.).
Además, puede utilizarse una variedad de
metodologías bien conocidas en la técnica para identificar y
caracterizar la actividad proteolítica y la especificidad de
sustrato de 20P1F12/TMPRSS2. En particular, se pueden emplear
ensayos de proteasa utilizando 20P1F12/TMPRSS2 purificada o
recombinante (tanto la molécula de longitud completa como el
fragmento del dominio de proteasa) para examinar, por ejemplo, los
efectos de los polipéptidos 20P1F12/TMPRSS2 sobre el crecimiento
tumoral in vitro e in vivo. Además, se pueden ensayar
sustratos potenciales in vivo (que pueden ser blancos
naturales en semen) tales como semenogelina I y II (blancos de PSA y
hK2), fibronectina (blanco de PSA y hK2), PSA (blanco de hK2),
kininógeno de alto peso molecular (blanco de hKl, hK2), la
liberación de bradiquinina y la autocatálisis. Además, al utilizar
técnicas conocidas en la técnica pueden utilizarse, sustratos
peptídicos fluorescentes para determinar la especificidad de la
ruptura.
Además, puede utilizarse una variedad de
metodologías bien conocidas en la técnica para examinar los efectos
in vivo e in vitro de mAb
anti-20P1F12/TMPRSS2 sobre el crecimiento tumoral.
Por ejemplo, se pueden examinar los efectos de dichas moléculas en
la captación tumoral y metástasis en el modelo SCID (véase, p. ej.,
Sato et al., Cáncer Res. abril de 1997
15;57(8):1584-9).
Alternativamente, se pueden examinar los efectos
de dichas moléculas sobre la proliferación/invasión/crecimiento de
colonias in vitro, utilizando, por ejemplo, los ensayos en
matrigel descritos más abajo y conocidos en la técnica como
proveedores de modelos para sistemas de cáncer (véase, p. ej., Bae
et al., Breast Cancer Res. Tret. 24(3):
241-55 (1993)).
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se describe en los datos proporcionados
en este Ejemplo, 20P1F12/TMPRSS2 es una proteasa que exhibe
actividades anti-invasivas que son análogas a las
observadas con PSA.
A fin de comparar el potencial invasivo de las
células tumorales expuestas a 20P1F12/TMPRSS2 en diversos
contextos, estas poblaciones se ensayaron para determinar su
potencial invasivo utilizando un sistema Transwell Insert System
(Becton Dickinson). Siguiendo las instrucciones de los fabricantes,
las células se cargaron con un colorante fluorescente, a saber
calceína, y se sembraron en placa en el pocillo superior del inserto
trans-pocillo. Después se determinó la invasión
midiendo la fluorescencia de las células en la cámara inferior en
relación con la fluorescencia de la población completa de células.
Todos los ensayos se realizaron por triplicado.
En estos experimentos, se confió en los
boletines informativos técnicos de Becton Dickinson que describen
las cámaras de invasión y ensayo para facilitar el desempeño de los
ensayos descritos. Dos boletines informativos relevantes son: (i)
Technical Bulletin 427: an improved MATRIGEL Invasion Chamber y (ii)
Technical Bulletin 428: A Fluorescence Blocking Membrane Insert
Enhances Analysis of Cell Motility Assays, y la información de
ambos boletines informativos se utilizó para optimizar nuestro
sistema de ensayo. Los materiales comprados fueron (i) insertos
FIuoroBlock de 8 micrones y (ii) Matrigel. Los insertos se
revistieron con Matrigel, se secaron durante toda la noche y se
rehidrataron por un mínimo de 2 horas. Después, por ejemplo según se
muestra en la Figura 27, las células PC3 progenitoras y manipuladas
genéticamente se marcaron con el indicador fluorescente, calceína,
y se incubaron en los insertos revestidos con matrigel. La invasión
se detectó midiendo la fluorescencia de las células que migraron
desde la cámara superior a través del inserto revestido con
matrigel, hasta la cámara inferior. Como control para "recuento
total de células" o "invasión total", las células se
sembraron en placa directamente en la cámara inferior. La invasión
porcentual se calculó mediante la siguiente fórmula: (fluorescencia
de las células que migraron al pocillo inferior/fluorescencia de
células totales) x 100. Véanse también los procedimientos tratados
en Cancer Res. diciembre de 1999
1;59(23):6010-4; Clin Exp Metastasis. Agosto
de 1998;16(6):513-28 y J Urol. marzo de
2000;163(3):985-92.
Los ensayos en matrigel in vitro
utilizados en la presente memoria son modelos bien conocidos para
estudiar la invasión de células de cáncer que se reconoce guardan
una correlación con la condición específica de la invasión de
células de cáncer (p. ej., el movimiento de las células del cáncer
de próstata desde la próstata a los ganglios linfáticos) que sucede
en patologías que incluyen cáncer de próstata, vejiga, ovario,
pulmón, riñón y colon. En consecuencia, este modelo proporciona una
herramienta particularmente útil para identificar los mecanismos
involucrados en la invasión de células endoteliales y tumorales de
membranas basales y para la selección de agentes
anti-invasivos.(véase, p. ej., Albini, Pathol.
Oncol. Res. 1998, 4(3): páginas 230-241;
Hazan et al., J Cell Biol. 21 de febrero de
2000;148(4):779-90 y Xing et al,
Endocrinology septiembre de 1999;
140(9):4056-64). En consecuencia este sistema
se utiliza ampliamente para evaluar agentes terapéuticos en una
gran variedad de cánceres (véase, p. ej., Festuccia et al.,
Clin. Exp. Metastasis 1998, 16(6): páginas
513-528, Festuccia et al., Oncol. Res. 1999,
11(1): páginas 17-31, Hiscox et al.,
Clin. Exp. Metastasis 1995, 13(5): páginas
396-404 y Rao et al., J. Neurooncol. 1994,
18(2): páginas 129-138).
En los resultados que se muestran en las Figuras
27A-27C, se ensayaron células PC3 progenitoras y
células PC3 que expresan de manera estable 20P1F12/TMPRSS2 para
determinar su potencial invasivo utilizando un sistema Transwell
Insert System (Becton Dickinson). Las células se cargaron con un
colorante fluorescente, a saber calceína, y se sembraron en placa
en el pocillo superior del inserto trans-pocillo. La
invasión se determinó midiendo la fluorescencia de células en la
cámara inferior en relación con la fluorescencia de la población
completa de células. Los datos de las Figuras
27A-27C muestran que las células que expresan
20P1F12/TMPRSS2 tienen capacidades invasivas reducidas y
proporcionan evidencia de que la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 inhibe
la invasión de tumores in vivo.
En los resultados que se muestran en la Figura
28, se muestra que 20P1F12/TMPRSS2 tiene actividad proteolítica. En
particular, GST-20P1F12/TMPRSS2 recombinante
purificada puede escindir un sustrato universal, a saber caseína,
de una manera dependiente de la dosis. Utilizando un kit adquirido
en Molecular Probes, (análisis de proteasas EnzChek, catalogo #
E-6638) y siguiendo el protocolo del fabricante, se
analizó GST-20P1F12/TMPRSS2 recombinante purificada
(aa 2S5-492) para determinar la actividad de
proteasa utilizando caseína fluorescente marcada con tiocarbamoílo
(FTC) como sustrato (Molecular Probes). Se incubaron diferentes
dosis de GST-20P1F12/TMPRSS2 a 37ºC con caseína FTC
durante un período de 6 horas. Se leyó la fluorescencia a intervalos
de 10 minutos utilizando un fluorómetro. Se detecta la ruptura de
la caseína por parte de 20P1F12/TMPRSS2 por el aumento de la
fluorescencia. El ensayo se realizó por triplicado y se corrió en un
período de 6 horas, realizando la lectura cada 10 minutos.
En los resultados que se muestran en la Figura
29, se demuestran los efectos de la proteína de fusión
20P1F12/
TMPRSS2 recombinante purificada sobre la invasión. Células PC3 cargadas con calceína se sembraron en placa en la cámara de invasión en medio solo o en presencia de proteína de fusión de 20P1F12/TMPRSS2 recombinante purificada, p. ej. GST-TMPRSS2 (aa 255-492). Se utilizó GST purificada como control. La invasión se determinó midiendo la fluorescencia de células en la cámara inferior en relación con la fluorescencia de la población completa de células. Los datos de la Figura 29 demuestran cómo el fragmento proteasa de 20P1F12/TMPRSS2 reduce la invasión de células PC3 a través de la matriz extracelular y proporciona evidencia de que el dominio de proteasa de 20P1F12/TMPRSS2 puede inhibir la formación de tumores in vivo.
TMPRSS2 recombinante purificada sobre la invasión. Células PC3 cargadas con calceína se sembraron en placa en la cámara de invasión en medio solo o en presencia de proteína de fusión de 20P1F12/TMPRSS2 recombinante purificada, p. ej. GST-TMPRSS2 (aa 255-492). Se utilizó GST purificada como control. La invasión se determinó midiendo la fluorescencia de células en la cámara inferior en relación con la fluorescencia de la población completa de células. Los datos de la Figura 29 demuestran cómo el fragmento proteasa de 20P1F12/TMPRSS2 reduce la invasión de células PC3 a través de la matriz extracelular y proporciona evidencia de que el dominio de proteasa de 20P1F12/TMPRSS2 puede inhibir la formación de tumores in vivo.
En los resultados que se muestran en la Figura
30, células PC3 cargadas con calceína se sembraron en placa en la
cámara de invasión en medio solo o en presencia de 1 ng/ml de
proteína de fusión de 20P1F12/TMPRSS2 recombinante purificada, p.
ej. GST-20P1F12/TMPRSS2 (aa
255-492). Se añadió control o mAb
anti-20P1F12/TMPRSS2 (1F9) a las muestras
indicadas. La invasión se determinó midiendo la fluorescencia de
células en la cámara inferior en relación con la fluorescencia de
la población completa de células. El ensayo se realizó por
triplicado. Los datos de la Figura 30 demuestran cómo un anticuerpo
anti-20P1F12/TMPRSS2 puede suprimir la actividad
inhibidora de la invasión de 20P1F12/TMPRSS2 y proporciona
evidencia confirmatoria de que esta molécula puede inhibir la
formación de tumores in vivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se observó más arriba, el técnico
experto puede generar células knock out in vitro y comparar
las células que expresan o carecen de la proteína 20P1F12/TMPRSS2
con el fin de confirmar el papel de 20P1F12/TMPRSS2 en el avance,
invasión y angiogénesis tumoral. Como las células LNCaP se expresan
endógenamente y secretan importantes cantidades de proteína
20P1F12/TMPRSS2, se seleccionó esta línea como modelo experimental
para los estudios preliminares confirmatorios utilizando
morfolino-oligonucleótidos antisentido.
En un primer estudio confirmatorio, demostramos
que el 100% de las células expuestas a
morfolino-oligonucleótidos retienen estos
oligonucleótidos 24 horas después de la carga (Figura 31). En un
segundo estudio confirmatorio, demostramos la capacidad de eliminar
específicamente la expresión de 20P1F12/TMPRSS2 de longitud completa
en células LNCaP utilizando estos
morfolino-oligonucleótidos antisentido (Figura 32,
calles 3 y 4).
Este sistema KO in vitro permite comparar
directamente células KO antisentido y LNCaP progenitoras utilizando
ensayos funcionales, y confirman los resultados generados utilizando
otros sistemas modelos. En particular, pueden compararse células
LNCaP deficientes en 20P1F12/TMPRSS2 progenitoras y antisentido
utilizando el bien descrito sistema transwell por su capacidad para
invadir el matrigel. En paralelo, estas células pueden compararse
en su capacidad para formar tumores en ratones SCID. También pueden
evaluarse utilizando un ensayo de angiogénesis in vitro que
mide la proliferación de células endoteliales y la formación de
tubos.
\vskip1.000000\baselineskip
Métodos: se manipularon genéticamente células
PC3 para que expresaran el ADNc de TMPRSS2 por infección utilizando
transferencia estándar de genes retrovirales. Como control, se
infectó una población separada de células PC3 con una construcción
retroviral vacía que solamente contenía el gen de resistencia a la
neomicina. Estas poblaciones celulares se seleccionaron para que
tuvieran resistencia a fármacos utilizando el análogo de neomicina
G418 y se denominan PC3-TMPRSS2 y
PC3-neo, respectivamente. La expresión de la
proteína TMPRSS2 en células PC3-TMPRSS2 se confirmó
mediante análisis de transferencia Western.
Para las inyecciones de células, ambas
poblaciones se hicieron crecer en cultivo hasta la fase logarítmica,
se cosecharon mediante tripsinización y se
re-suspendieron en medio y Matrigel con una dilución
de 1:1 y una densidad de 1 x 10^{7} células/ml. Se dividieron
ratones SCID machos en 2 grupos (n = 7 por grupo) y se inyectaron
en el flanco subcutáneo derecho con 100 microlitros (1 x 10^{6})
de ambas poblaciones celulares. Cuando los tumores se hicieron
palpa-
bles, se realizaron dos veces por semana mediciones con calibre que consistieron en longitud X ancho X altura (mm^{3}).
bles, se realizaron dos veces por semana mediciones con calibre que consistieron en longitud X ancho X altura (mm^{3}).
Resultados y Conclusiones: Las mediciones
tumorales comenzaron en el día 21, y se realizaron dos veces por
semana durante las siguientes 3 1/2 semanas (véase la Figura 37). En
los puntos de tiempo iniciales (días 21 y 24) no existieron
diferencias en el crecimiento entre los tumores
PC3-TMPRSS2 y PC3-neo. Sin embargo,
comenzando el día 28, los volúmenes medios tumorales fueron mayores
en los ratones inyectados con PC3-TMPRSS2 y
continuaron creciendo a mayor ritmo hasta la finalización del
experimento (día 45). El incremento en el crecimiento para los
ratones inyectados con PC3-TMPRSS2 fue del 25%, 76%,
81%, 100%, 156%, y 102% los días 28, 31, 35, 38, 42 y 45,
respectivamente, en comparación con los ratones inyectados con
PC3-neo.
El hecho de que el incremento en el porcentaje
fue progresivamente mayor en cada punto de tiempo confirma que los
tumores que expresan TMPRSS2 mostraron una tasa de crecimiento
aumentada. Este experimento se repitió y nuevamente produjo tumores
más grandes y una tasa aumentada del crecimiento de
PC3-TMPRSS2 en comparación con los tumores
PC3-neo.
Esto demuestra que la expresión constitutiva de
TMPRSS2 da lugar a crecimiento aumentado y puede estar involucrada
en la tumorigénesis en pacientes con cáncer de próstata. Es posible
que TMPRSS2, funcionando como proteasa, pueda activar
proteolíticamente las proteínas de la superficie celular,
componentes de la matriz extracelular o factores de crecimiento,
todo lo cual podría potencialmente estimular el crecimiento tumoral.
También es posible que la porción de TMPRSS2 que queda sobre la
superficie celular, que contiene el dominio LDLRA/SRCR, podría
entregar una señal de crecimiento positivo ya sea por sí misma o
después de la unión directa a un ligando extracelular. Si el
fragmento serina-proteasa de TMRPSS2 facilita la
formación tumoral o el crecimiento tumoral, la administración de
inhibidores de serina-proteasa puede emplearse para
el tratamiento terapéutico.
\vskip1.000000\baselineskip
Métodos: Se ha demostrado previamente que el
xenoinjerto de LAPC-9 expresa el ARN y la proteína
TMPRSS2 mediante análisis de transferencia Northern y Western,
respectivamente. Antes de la inyección de células tumorales
LAPC-9 en ratones SCID, se preparó una suspensión
de células únicas tal como se describió previamente (Craft et
al, Cancer Research, 1999). Se cosecharon los tumores de los
ratones SCID, se molieron en trozos muy pequeños utilizando tijeras
y fórceps, se lavaron una vez en medio de Iscove, y se digirieron en
una solución de pronasa al 1% durante 20 minutos a temperatura
ambiente. Después de la digestión, la suspensión de células se lavó
dos veces en medio de Iscove que contenía 10% de FBS, después se
re-suspendió en medio PrEGM (Clonetics,
Walkersville, MD). Después de la incubación durante toda la noche,
las células se cosecharon, se lavaron una vez en PrEGM, y después
se pasaron a través de un filtro de nylon de 100 micrones para
eliminar grandes grumos y desechos. Las células que pasaron a
través del filtro se recolectaron, se centrifugaron, se
re-suspendieron en medio PrEGM y se contaron antes
de la inyección.
Para la inyección subcutánea, se prepararon
tumores LAPC-9 en células únicas según se describe
más arriba y se mezclaron a una dilución de 1:1 con Matrigel
(Collaborative Research, Bedford, MA). Ratones SCID machos
recibieron una única inyección subcutánea de 0,5 x 10^{6} células
en un volumen de 100 \mul en el flanco derecho. Para probar el
efecto de MAb1F9 anti-TMPRSS2 en la formación de
tumores, se administraron 500 \mug de anticuerpo purificado
mediante inyección intraperitoneal comenzando el mismo día como
inyecciones de células tumorales (día 0) y continuando los días 3,
5, 7, 9 y 12. Como control, los ratones inyectados con tumores se
inyectaron con FBS (n = 8 para el grupo de FBS; n = 6 para el grupo
de 1F9). Se tomaron los tamaños de los tumores sobre tumores
palpables mediante mediciones de calibre vernier y se calculó el
volumen medio de los tumores como longitud X ancho X altura. Las
mediciones de volumen tumoral se registraron rutinariamente
1-2 veces por semana. Se extrajo sangre a los
ratones en los puntos de tiempo indicados en la sección de
Resultados y se determinaron los niveles medios de PSA circulante
en el suero utilizando un kit de ELISA para PSA (Amgen, Toronto,
Canadá).
Resultados y Conclusiones: En la Figura 38 se
muestra el efecto del MAb 1F9 anti-TMPRSS2 sobre la
formación de tumores LAPC-9 en ratones SCID machos
inyectados con células tumorales LAPC-9 y 500
microgramos de 1F9. Tanto la tasa de crecimiento tumoral como el
tamaño de los tumores LAPC-9 aumentaron en los
ratones tratados con anticuerpo 1F9 en comparación con los ratones
de control tratados con FBS (Figura 38A). Como correlato
independiente del crecimiento tumoral, se determinaron los niveles
de PSA circulante en ratones tratados y no tratados. Se observaron
niveles de PSA circulante significativamente mayores en los ratones
tratados con 1F9 versus los ratones tratados con FBS (Figura 38B).
Este experimento se repitió 2 veces más con resultados similares, y
sugiere que el tratamiento con 1F9 aumenta la formación de tumores
LAPC-9 en ratones SCID.
Los mecanismos para el aumento del crecimiento
tumoral mediado por anticuerpos podrían incluir, sin limitación,
las siguientes posibilidades. En primer lugar, el anticuerpo puede
unirse al dominio serina-proteasa de TMPRSS2 y
activar su actividad catalítica, de manera tal que ahora promueve el
crecimiento tumoral. En segundo lugar, el anticuerpo, uniéndose al
dominio de serina-proteasa de TMPRSS2, podría
inhibir posibles interacciones con un inhibidor de la
serina-proteasa (p. ej., serpina) tornando de este
modo a TMPRSS2 constitutivamente activa. En tercer lugar, el
anticuerpo puede secuestrar el dominio de proteasa de TMPRSS2 en o
cerca de la superficie de la célula tumoral, permitiéndole
catalizar su sustrato (p. ej., un factor de crecimiento) que después
estimule el crecimiento tumoral.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizó suero de tres ratones inmunizados con
proteína del dominio Tag5 TMPRSS2 LDLRAISRCR (aminoácidos
111-255) para teñir células LNCaP que expresan
TMPRSS2, y células 293T que carecen de expresión de TMPRSS2. Se
incubaron las células LNCaP y 293T con dilución 1:50 de suero de
ratón pre-inmune (línea clara) o suero
anti-LDLRAISRCR (línea oscura), se lavaron y después
se incubaron con una dilución 1:200 de anticuerpo secundario
conjugado con IgG FITC anti-ratón de cabra. Después
del lavado, se analizaron 5.000 células para tinción fluorescente
en el citómetro de flujo Coulter Epics XL. Los cambios fluorescentes
específicos de la población teñida con
anti-LDLRAISRCR en Células LNCaP se indican con
flechas en comparación con suero pre-inmune, pero no
en células 293T.
Estos datos indican dos hallazgos: 1) que el
dominio LDLRA/SRCR se expresa sobre la superficie de las células
LNCaP y 2) que pAb LDLRA/SRCR anti-TMPRSS2
específicamente reconoce este dominio sobren la superficie de estas
células.
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Se analizaron muestras clínicas de suero de 28
individuos normales y 40 pacientes con cáncer de próstata para
determinar la presencia de anticuerpos reactivos ante dominios
LDLRA/SRCR de TMPRSS2 mediante ELISA. En resumen, la proteína Tag5
purificada que codifica los aminoácidos 111-255 de
TMPRSS2, que contiene los dominios LDLRA y SRCR, se diluyó en
tampón de carbonato 50 mM (pH 9.6) y se utilizó para cubrir una
placa de ELISA durante toda la noche a razón de 100 ng/pocillo. Los
pocillos después se bloquearon durante 2 horas a 37ºC con FBS que
contenía 2% de BSA. Después se añadieron 50 \muI de suero diluido
1:100 en FBS que contenía 1% de BSA por triplicado a los pocillos
revestidos con la proteína Tag5 así como a pocillos bloqueados con
BSA no revestidos y se incubaron a temperatura ambiente durante 1
hora. Los pocillos se lavaron 4 veces con FBS que contenía
Tween-20 al 0,2% (FBS-T) y se
incubaron con 50 \mul de una dilución 1:5.000 de anticuerpo
secundario Ig marcado con HRP anti-humano de cabra
en FBS-T que contenía 1% de BSA. Los pocillos
después se lavaron nuevamente 4 veces y después se desarrollaron
con sustrato de TMB (200 ul/pocillo). La reacción se interrumpió
mediante la adición de 50 \mul de (H_{2}SO_{4}) 1M y se
determinó la densidad óptica (DO) de los pocillos a 450 nM. Se
determinaron los títulos relativos (Figura zA) de las muestras de
suero sustrayendo la DO media de los pocillos no revestidos (fondo)
de los pocillos revestidos con la proteína Tag5 y después
normalizando la DO a una curva estándar en cada placa obtenida
utilizando varias diluciones de un pAb de ratón dirigido al dominio
LDLRA/SRCR.
El título medio de la población de sueros de
cáncer de próstata fue 4,27X10^{-5} \pm 2,80X10^{-5}
(media\pmDE) que fue significativamente diferente del de la
población normal, 2,58X10^{-5} \pm+ 3,08X10^{-5} (*P=0,0152,
ensayo t de 2 colas), tal como se describe en la Figura zB. Como
observación, los valores negativos del título surgieron del hecho
de que la ordenada al origen de la curva estándar fue mayor que 0 y
mayor que la DO de una muestra experimental.
Estos datos indican que la proteína TMPRSS2 es
inmunogén. Por otra parte, los pacientes con cáncer de próstata
expresan niveles incrementados de anticuerpos
anti-dominio LDLRAISRCR en comparación con las
personas normales. De este modo, los pacientes con cáncer de
próstata pueden tener una respuesta inmune humoral elevada a la
proteína TMPRSS2 expresada en el tejido canceroso. Por consiguiente,
el dominio LDLRA/SRCR se utiliza como blanco terapéutico y/o
diagnóstico para cánceres que expresan TMPRSS2, tales como cáncer de
próstata. Por otra parte, los títulos séricos de anticuerpos
anti-dominio LDLRA/SRCR se utilizan como modalidad
diagnóstica para cánceres que expresan TMPRSS2, tales como cáncer de
próstata.
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Una reducción en la intensidad de la señal del
anticuerpo biotinilado en presencia de un exceso de anticuerpo no
marcado indica que el mAbs compite por los mismos sitios o sitios de
unión superpuesta (se muestran en negrita). Tal como se indica en
la Tabla 2, se observa una reducción en la intensidad de la señal
del IF9 biotinilado (1F9-B) en presencia de los
mAbs 2D10, 3G3 y 6B11, y él mismo, pero no por 2F8, 8C6 y 9G8. Estos
resultados indican que los mAbs IF9, 2D10, 3G3, 6B11 comparten el
mismo epitopo (o se superponen) que es distinto de los de 2F8, 8C6
y 9G8. MAb 2F8-B compite consigo mismo y con los
mAbs 8C6 y 9G8 indicando que estos mAbs comparten el mismo epitopo
o epitopos superpuestos. MAb 8C6-B compite consigo
mismo y moderadamente con mAb 2F8. En resumen, estos resultados
indican que el panel de anticuerpos anti-TMPRSS2
reconoce diferentes epitopos dentro del dominio de proteasa de
TMPRSS2.
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Los residuos en negrita son los preferidos, los
restos en cursiva son menos preferidos: Se considera que un péptido
es portador de motivos si posee anclas primarias en cada posición de
ancla primaria para un motivo o supermotivo según se especifica en
la tabla anterior.
\vskip1.000000\baselineskip
A lo largo de la presente solicitud, se hace
referencia a diversas publicaciones, sitios web, patentes y
solicitudes de patentes. (Se hace referencia a los sitios web
mediante sus direcciones de Localizador Uniforme de Recurso, o URL,
en la Red Global Mundial.)
Claims (13)
1. Un método para detectar el cáncer de vejiga
en un individuo que comprende:
evaluar el nivel de expresión de un producto
génico 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra biológica;
evaluar el nivel de expresión de un producto
génico 20P1F12/TMPRSS2 en una muestra normal correspondiente; y
comparar el nivel de expresión del producto
génico en la muestra biológica respecto del de la muestra normal
correspondiente, en donde el producto génico es una proteína que
comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:2 o un ARNm que
codifica la secuencia de aminoácidos, y en donde un incremento en
los niveles de expresión del producto génico en la muestra biológica
en comparación con la correspondiente muestra normal es indicativo
de cáncer de vejiga.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en donde el ARNm es complementario a la secuencia codificadora de
SEC ID NO: 1.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1
o 2, en donde se evalúa el nivel de expresión de la proteína en la
muestra biológica observando la presencia o ausencia de un complejo
inmunorreactivo que comprende la proteína y un anticuerpo o
fragmento de unión al antígeno del mismo.
4. El método de acuerdo con las reivindicaciones
1 o 2, en donde se evalúa el nivel de expresión del producto génico
por un método seleccionado de análisis Southern, análisis Northern,
análisis por reacción en cadena de la polimerasa e inmunoensayo.
5. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en donde se evalúa el nivel de
expresión de la proteína en la muestra biológica por un inmunoensayo
que mide una concentración de una proteína libre, una concentración
de la proteína complejada con un anticuerpo o fragmento de unión al
antígeno del mismo, o una relación que compara una concentración de
una proteína libre con una concentración de la proteína complejada
con un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo.
6. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en donde la muestra biológica se
selecciona de sangre, suero, materia fecal, orina, semen y tejido
biopsiado.
7. Una composición inmunogén para el uso en la
inhibición del crecimiento de un cáncer de vejiga, en donde la
composición inmunogén comprende la secuencia de aminoácidos de SEC
ID NO: 2 o una porción inmunogén de la misma, o un vector que
comprende una secuencia nucleotídica que codifica la SEC. ID NO:
2;
y un vehículo fisiológicamente aceptable, en
donde la composición inmunogén es capaz de provocar una respuesta
inmune de un mamífero.
8. La composición inmunogén de la reivindicación
7, en donde la porción inmunogén de la misma comprende los
aminoácidos 255-492 de la secuencia expuesta en la
SEC ID NO: 2.
9. La composición inmunogén de una cualquiera de
las reivindicaciones 7 u 8, en donde el vector es un vector
viral.
10. Un anticuerpo o fragmento de unión al
antígeno del mismo que se une específicamente a la proteína que
comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2, acoplado a un
agente citotóxico para el uso en el tratamiento del cáncer de
vejiga.
11. El anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 10, en donde el anticuerpo o fragmento de unión al
antígeno del mismo se une a un epitopo dentro de un dominio de la
proteína predominantemente asociado a la superficie celular.
12. El anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 11, en donde el epitopo comprende los aminoácidos
255-492 de la secuencia expuesta en SEC ID NO:
2.
13. Un método para inhibir el crecimiento de una
célula neoplásica de vejiga in vitro que comprende poner en
contacto la célula neoplásica de vejiga con un anticuerpo o
fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente
a la proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID
NO: 2, acoplada a un agente citotóxico.
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