ES2366204T3 - Ácido nucleico y proteína correspondiente, denominada 184p1e2, útiles en el tratamiento y la detección de cáncer. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento in vitro para detectar la presencia de una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que se muestra en la figura 2A, 2B o 2C en una muestra de ensayo que comprende: poner en contacto la muestra con un anticuerpo que se une específicamente a la proteína; y detectar la unión de la proteína de la muestra al mismo, proporcionando la presencia elevada de proteína en la muestra de ensayo con relación a la muestra de tejido normal una indicación de la presencia de cáncer de riñón, vejiga y pulmón.

Description

Campo de la invención

La invención que se describe en el presente documento se refiere a un gen y a su proteína codificada, denominada 184P1E2, expresada en determinados tipos de cáncer, y a procedimientos de diagnóstico y terapéuticos y a composiciones útiles en el tratamiento de tipos de cáncer que expresan 184P1E2.

Antecedentes de la invención

El cáncer es la segunda causa más importante de muerte en seres humanos después de las enfermedades coronarias. En todo el mundo, millones de personas mueren por cáncer cada año. Sólo en los Estados Unidos, tal como informa la Sociedad Estadounidense del Cáncer, el cáncer causa anualmente la muerte de más de medio millón de personas, diagnosticándose cada año más de 1,2 millones de casos nuevos. Mientras que las muertes por enfermedades cardiacas han disminuido significativamente, las provocadas por cáncer, en general, están en aumento. Se ha predicho que el cáncer se convertira en la primera causa de muerte en la primera parte del próximo siglo.

A nivel mundial, destacan varios tipos de cáncer como las principales causas de muerte. En particular, los carcinomas de pulmón, próstata, mama, colon, páncreas y ovarios representan las causas principales de muerte porcáncer. Éstos, y virtualmente todos los demás, carcinomas comparten unas características comunes letales. Con muy pocas excepciones, la enfermedad metastática producida por un carcinoma tiene consecuencias fatales. Además, incluso para los pacientes con cáncer que sobrevivien inicialmente al cáncer primario, experiencias

comunes han mostrado que sus vidas se han visto alteradas de forma drástica. Muchos pacientes de cáncer sufren una ansiedad intensa provocada por la toma de conciencia del potencial de recurrencia o de fracaso en el tratamiento. Muchos pacientes de cáncer sufren debilidad física después del tratamiento. Además, muchos pacientes de cáncer sufren una recurrencia.

A nivel mundial, el cáncer de próstata es el cuarto cáncer más prevalente en varones. En Norteamérica y en el Norte de Europa, es de lejos el cáncer más común en varones y es la segunda causa principal de muerte por cáncer en varones. Sólo en los Estados Unidos, más de 30.000 varones mueren anualmente por esta enfermedad, segunda mortal después del cáncer de pulmón. A pesar de la magnitud de estas cifras, no existe aún un tratamiento eficaz contra el cáncer de próstata metastático. La prostatectomía quirúrgica, terapia de radiación, terapia de ablación hormonal, castración quirúrgica y quimioterapia continua son las modalidades de tratamiento principales. Desafortunadamente, estos tratamientos no son eficaces en muchos pacientes y están asociados a menudo con consecuencias no deseadas.

En el frente diagnóstico, la falta de un marcador tumoral prostático que pueda detectar con exactitud tumores localizados en su etapa temprana continúa siendo una limitación significativa en el diagnóstico y el tratamiento de esta enfermedad. Aunque el ensayo de antígeno específico prostático (PSA) en suero ha sido un instrumento útil, se considera generalmente que su especificidad y utilidad general, no obstante, presenta carencias en varios aspectos importantes.

El progreso en la identificación adicional de marcadores específicos para el cáncer de próstata ha mejorado mediante la generación de xenoinjertos de cáncer de próstata que pueden dar lugar a diferentes etapas de la enfermedad en ratones. Los xenoinjertos de LAPC (Cáncer de Próstata de Los Angeles) son xenoinjertos de cáncer de próstata que han sobrevivido al paso en ratones con inmunodeficiencia combinada grave (SCID) y que han mostrado la capacidad de imitar la transición de dependencia andrógena a independencia andrógena (Klein y col., 1997, Nat. Med. 3:402). Márcadores de cáncer de próstata identificados más recientemente incluyen PCTA-1 (Su y col., 1996, Proc. NatI. Acad. Sci. USA 93: 7252), antígeno de membrana específico de la próstata (PSM) (Pinto y col., Clin Cancer Res 1996 Sep 2(9): 1445-51), STEAP (Huberty col., Proc NatI Acad Sci USA. 1999 Dic 7; 96(25): 14523-8) y antígeno de células madre prostáticas (PSCA) (Reiter y col., 1998, Proc. NatI. Acad. Sci. USA 95: 1735).

Mientras que los marcadores identificados previamente tales como PSA, PSM, PCTA y PSCA han facilitado los esfuerzos para diagnosticar y tratar cáncer de próstata, existe la necesidad de identificar marcadores adicionales y dianas terapéuticas para cáncer de próstata y cánceres relacionados con el fin de mejorar el diagnóstico y la terapia.

El carcinoma celular renal (RCC) es responsable de aproximadamente el 3 por ciento de los tumores malignos en adultos. Cuando los adenomas alcanzan un diámetro de 2 a 3 cm, existe un cáncer potencial. En el adulto, los dos tumores malignos renales principales son el adenocarcinoma celular renal y el carcinoma celular transicional de la pelvis renal o la uretra. La incidencia del adenocarcinoma celular renal se estima en más de 29.000 casos en los Estados Unidos, y más de 11.600 pacientes muertos por esta enfermedad en el año 1998. El carcinoma celular transicional es menos frecuente, con una incidencia de aproximadamente 500 casos por año en los Estados Unidos.

Durante muchas décadas, la cirugía ha sido la terapia principal para el adenocarcinoma celular renal. Hasta tiempos recientes, la enfermedad metastática se ha resistido a cualquier terapia sistémica. Con los descubrimientos recientes en terapias sistémicas, en particular las inmunoterapias, el carcinoma celular renal metastático puede tratarse de forma agresiva en pacientes apropiados con posibilidad de respuestas duraderas. No obstante, existe todavía la necesidad de terapias eficaces para estos pacientes.

De todos los casos nuevos de cáncer en los Estados Unidos, el cáncer de vejiga representa aproximadamente el 5 por ciento en varones (el quinto neoplasma más común) y el 3 por ciento en mujeres (el octavo neoplasma más común). La incidencia está aumentando lentamente, paralelamente al aumento de la población de edad avanzada. En 1998, hubo 54.500 casos estimados: 39.500 en varones y 15.000 en mujeres. La incidencia en función de la edad en los Estados Unidos es de 32 por cada 100.000 en varones y de 8 por cada 100.000 en mujeres. La relación histórica varon/mujer de 3:1 puede disminuir en función de los índices de tabaquismo en mujeres. Hubo un número estimado de 11.000 muertes por cáncer de vejiga en 1998 (7.800 en varones y 3.900 en mujeres). La incidencia de cáncer de vejiga y la mortalidad aumentan de manera considerable con la edad y será un problema creciente con el aumento de edad de la población.

La mayor parte de los cánceres de vejiga vuelven a aparecer en la vejiga. El cáncer de vejiga se trata con una combinación de resección transuretral de la vejiga (TUR) y quimioterapia o inmunoterapia intervesical. La naturaleza multifocal y recurrente del cáncer de vejiga muestra las limitaciones de la TUR. Los cánceres más invasivos del músculo no se curan usando únicamente TUR. La cistectomía radical y la diversión urinaria son los medios más eficaces para eliminar el cáncer, pero no se puede negar el efecto que conllevan sobre la función urinaria y sexual. Existe todavía una necesidad significativa de modalidades de tratamiento que sean beneficiosas para pacientes con cáncer de vejiga.

En el año 2000 se estimaron 130.200 casos de cáncer colorrectal en los Estados Unidos, que incluían 93.800 casos de cáncer de colon y 36.400 casos de cáncer rectal. Los cánceres colorrectales son los térceros cánceres más comunes en hombres y mujeres. Las tasas de incidencia disminuyeron significativamente durante el periodo 19921996 (-2,1 % por año). Las investigaciones sugieren que esta disminución se ha debido al aumento de la detección y la eliminación de pólipos, previniendo la progresión de pólipos a cánceres invasivos. Se estimaron 56.300 muertes

(47.700 por cáncer de colon, 8.600 por cáncer rectal) en el año 2000, lo que se traduce en el 11 % de todas las muertes por cáncer en los Estados Unidos.

Actualmente, la cirugía es la forma más común de terapia para el cáncer colorrectal y para cánceres que no se han expandido, y es frecuentemente curativa. La quimioterapia o la quimioterapia más radiación se administran antes o después de la cirugía a la mayor parte de los pacientes con cáncer que haya perforado profundamente la pared intestinal o se haya extendido a los ganglios linfáticos. Ocasionalmente es necesaria una colostomía permanente (creación de una abertura abdominal para eliminar desechos corporales) para el cáncer de colon, que es necesaria con poca frecuecia para el cáncer rectal. Existe todavía la necesidad de modalidades eficaces de diagnóstico y de tratamiento para el cáncer colorrectal.

En el año 2000 hubo 164.100 casos nuevos estimados de cáncer de pulmón y de bronquios, responsables del 14 % de todos los diagnósticos de cáncer en Estados Unidos. La tasa de incidencia de cáncer de pulmón y de bronquios disminuye significativamente en varones, de un máximo de 86,5 por 100.000 en 1984 a 70,0 en 1996. En la década de 1990, la tasa de aumento entre las mujeres comenzó a ralentizarse. En 1996, la tasa de incidencia en mujeres fue de 42,3 por 100.000.

El cáncer de pulmón y de bronquios causó un número estimado de 156.900 muertes en el año 2000, responsables del 28 % de todas las muertes por cáncer. Durante el periodo 1992-1996, la mortalidad por cáncer de pulmón disminuyó significativamente entre varones (-1,7 % por año) mientras que las tasas entre mujeres aumentaron aún significativamente (0,9 % por año). Desde el año 1987, han muerto más mujeres cada año por cáncer de pulmón que por cáncer de mama, que fue, durante 40 años, la causa principal de muerte por cáncer en mujeres. La incidencia del cáncer de pulmón y las tasas de mortalidad decrecientes fueron, muy probablemente, el resultado de la disminución de las tasas de tabaquismo durante los 30 años anteriores, estando la disminución del índice de tabaquismo en mujeres por debajo de la de los varones. Es motivo de preocupación el que, aunque la disminución del tabaquismo en adultos se ha ralentizado, el tabaquismo en jóvenes está aumentando de nuevo.

Las opciones de tratamiento del cáncer de pulmón y de bronquios se determinan según el tipo y estadio del cáncer e incluyen cirugía, terapia de radiación y quimioterapia. Para muchos cánceres localizados, la cirugía es habitualmente el tratamiento elegido. Debido a que la enfermedad se extiende habitualmente con el tiempo, se ha descubierto que la terapia de radiación y la quimioterapia se precisan a menudo en combinación con la cirugía. La quimioterapia sola

o combinada con radiación es el tratamiento elegido para cáncer de pulmón celular pequeño; con este régimen, un porcentaje amplio de pacientes experimentan una remisión, que en algunos casos es duradera. Existe, no obstante, una necesidad constante de enfoques eficaces de tratamiento y diagnóstico para cánceres de pulmón y de bronquios.

Se esperaba una estimación de 182.800 nuevos casos invasivos de cáncer de mama entre mujeres en los Estados Unidos durante el año 2000. Adicionalmente, se esperaba diagnosticar aproximadamente 1.400 nuevos casos de cáncer de mama en varones en el año 2000. Después de aumentar aproximadamente el 4 % en la década de 1980, las tasas de incidencia de cáncer de mama en mujeres se habían equilibrado en la década de 1990 a aproximadamente 110,6 casos por cada 100.000.

Solo en los Estados Unidos, se estimaron 41.200 muertes (40.800 mujeres, 400 varones) en el año 2000 por cáncer de mama. El cáncer de mama está clasificado como la segunda causa de muerte por cáncer en mujeres. De

5 acuerdo con los datos más recientes, las tasas de mortalidad disminuyeron significativamente durante el periodo 1992-1996, siendo la disminición más elevada en mujeres jovenes, tanto de raza blanca como de raza negra. Estas disminuciones fueron probablemente el resultado de una detección temprana y de la mejora del tratamiento.

Considerando las circunstancias médicas y las preferencias de los pacientes, el tratamiento de cáncer de mama puede implicar lumpectomía (eliminación local del tumor) y eliminación de los ganglios linfáticos de debajo del brazo; mastectomía (eliminación quirúrgica de la mama) y eliminación de los ganglios linfáticos de debajo del brazo; terapia de radiación; quimioterapia; o terapia hormonal. Frecuentemente, se usan dos o más procedimientos en combinación. Numerosos estudios han mostrado que durante el primer estadio de la enfermedad las tasas de supervivencia a largo plazo después de lumpectomía más radioterapia son similares a las tasas de supervivencia después de mastectomía radical modificada. Avances significativos en las técnicas de reconstrucción proporcionan

15 varias opciones para la reconstrucción de la mama después de la mastectomía. Recientemente, dicha reconstrucción se ha realizado al mismo tiempo que la mastectomía.

La excisión local de carcinoma ductal in situ (DCIS) con cantidades adecuadas de tejido de mama normal circundante puede evitar la recurrencia local de la DCIS. La radiación de la mama y/o el tamoxifén pueden reducir la probabilidad de que tenga lugar una DCIS en el tejido de mama remanente. Esto es importante porque la DCIS, si se deja sin tratamiento, puede convertirse en un cáncer de mama. No obstante, existen efectos secundarios o secuelas graves con estos tratamientos. Existe, por lo tanto, la necesidad de tratamientos de cáncer de mama eficaces.

En el año 2000 se estimaron 23.100 nuevos casos de cáncer de ovarios en los Estados Unidos. Este representa el 4 % de todos los cánceres entre mujeres y está clasificado como el segundo cáncer ginecológico. Durante el periodo 1992-1996, las tasas de incidencia del cáncer de ovarios disminuyeron significativamente. Como consecuencia del

25 cáncer de ovarios, se estimaron 14.000 muertes en el año 2000. El cáncer de ovarios causa más muertes que cualquier otro cáncer del sistema reproductor femenino.

La cirugía, la terapia de radiación y la quimioterapia son opciones de tratamiento para el cáncer de ovarios. La cirugía incluye habitualmente la eliminación de uno o de los dos ovarios, las trompas de Falopio (salpingoooferectomía) y del útero (histerectomía). En algunos tumores muy tempranos, sólo se elimina el ovario implicado, especialmente en mujeres jóvenes que desean tener hijos. En caso de enfermedad avanzada, se hace un intento para eliminar toda la enfermedad intraabdominal potenciando el efecto de la quimiterapia. Existe aún una necesidad importante de opciones de tratamiento eficaces para el cáncer de ovarios.

Se estimaron 28.300 nuevos casos de cáncer de páncreas en los Estados Unidos en el año 2000. Durante los últimos 20 años, las tasas de cáncer de páncreas han disminuido en varones. Las tasas entre mujeres han

35 permanecido aproximadamente constantes, pero pueden comenzar a disminuir. El cáncer de páncreas causó un número estimado de 28.200 muertes en el año 2000 en los Estados Unidos. Durante los últimos 20 años, ha habido una disminución ligera pero significativa de las tasas de mortalidad entre varones (aproximadamente del 0,9 % por año), mientras que las tasas han aumentado ligeramente en mujeres.

La cirugía, la terapia de radiación y la quimioterapia son opciones de tratamiento para el cáncer de páncreas. Estas opciones de tratamiento pueden prolongar la supervivencia y/o aliviar los síntomas en muchos pacientes, pero no es probable que produzcan una cura para la mayor parte de los mismos. Existe una necesidad significativa de opciones adicionales de terapia y de diagnóstico para el cáncer de páncreas.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un gen, denominado 184P1E2, que se ha descubierto que está sobreexpresado

45 en los cánceres enumerados en la tabla 1. El análisis de expresión por inmunotransferencia (Northern) de la expresión del gen 184P1E2 en tejidos normales muestra un patrón de expresión restringido en tejidos adultos. Se proporcionan las secuencias de nucleótidos (figura 2) y aminoácidos (figura 2 y figura 3) de 184P1E2. El perfil con relación al tejido de 184P1E2 en tejidos adultos normales, en combinación con la sobreexpresión observada en los tejidos enumerados en la tabla 1, muestra que 184P1E2 se sobreexpresa de forma aberrante en al menos algunos tipos de cáncer y, de este modo, sirve como diana diagnóstica, profiláctica, pronóstica y terapéutica útil para cánceres de tejidos tales como los enumerados en la tabla 1.

La invención proporciona un procedimiento in vitro para detectar la presencia de una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la figura 2A, 2B o 2C en una muestra de ensayo que comprende:

poner en contacto la muestra con un anticuerpo que se une específicamente a la proteína; y detectar la unión de la proteína de la muestra al mismo, proporcionando la presencia elevada de proteína en la muestra de ensayo con relación a la muestra de tejido normal una indicación de la presencia de cáncer de riñón, vejiga o pulmón.

La invención proporciona también un anticuerpo o fragmento del mismo que se une de forma inmunoespecífica a un epítopo de una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la figura 2A, 2B o 2C, para su uso en el diagnóstico de cáncer de vejiga, riñón o pulmón.

En el presente documento se describen anticuerpos que se unen a proteínas 184P1E2 y fragmentos de polipéptidos de las mismas, incluidos anticuerpos policlonales y monoclonales, anticuerpos murinos y de otros mamíferos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y anticuerpos totalmente humanos, y anticuerpos etiquetados con un marcador detectable.

Nótese que para determinar la posición inicial de cualquier péptido expuesta en las tablas V-XVIII y XXII a LI (colectivamente tablas de péptidos HLA) con respecto a su proteína parental, por ejemplo, variante 1, variante 2, etc., se hace referencia a tres factores: la variante particular, la longitud del péptido en una tabla de péptidos HLA y los péptidos de búsqueda en la tabla LII. Generalmente se usa un único péptido de búsqueda para obtener los péptidos HLA para una variante particular. La posición de cada péptido de búsqueda con relación a su molécula parental respectiva se enumera en la tabla LII. En consecuencia, si un péptido de búsqueda comienza en la posición “X”, se debe añadir el valor “X-1” a cada posición en las tablas V-XVIII y XXII a LI para obtener la posición real de los péptidos HLA en sus moléculas parentales. Por ejemplo, si un péptido de búsqueda particular comienza en la posición 150 de su molécula parental, se debe añadir 150-1, es decir, 149, a cada posición de aminoácido del péptido HLA para calcular la posición de ese aminoácido en la molecula parental.

En el presente documento se describen epítopos de anticuerpos que comprenden regiones peptídicas, o un oligonucleótido que codifica la región peptídica, que tienen una, dos, tres, cuatro o cinco de las características siguientes:

i) una región peptídica de al menos 5 aminoácidos de un péptido particular de la figura 3, en cualquier aumento de número entero hasta la longitud total de esa proteína en la figura 3, que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor igual o superior a 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, o que tiene un valor igual a 1,0, en el perfil de hidrofilicidad de la figura 5;

ii) una región peptídica de al menos 5 aminoácidos de un péptido particular de la figura 3, en cualquier aumento de número entero hasta la longitud total de esa proteína en la figura 3, que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor igual o inferior a 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1, o que tiene un valor igual a 0,0, en los perfiles de hidropaticidad de la figura 6;

iii) una región peptídica de al menos 5 aminoácidos de un péptido particular de la figura 3, en cualquier aumento de número entero hasta la longitud total de esa proteína en la figura 3, que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor igual o superior a 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, o que tiene un valor igual a 1,0, en el perfil de porcentaje de residuos accesibles de la figura 7;

iv) una región peptídica de al menos 5 aminoácidos de un péptido particular de la figura 3, en cualquier aumento de número entero hasta la longitud total de esa proteína en la figura 3, que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor igual o superior a 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, o que tiene un valor igual a 1,0, en el perfil de flexibilidad promedio de la figura 8; o

v) una región peptídica de al menos 5 aminoácidos de un péptido particular de la figura 3, en cualquier aumento de número entero hasta la longitud total de esa proteína en la figura 3, que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor igual o superior a 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, o que tiene un valor igual a 1,0, en el perfil de giro beta de la figura 9;

Breve descripción de las figuras

Figura 1. La secuencia SSH de 184P1E2 SSH de 132 nucleótidos.

Figura 2. La secuencia de ADNc y aminoácidos de la variante 1 de 184P1E2 (también denominada “184P1E2 v.1” o “184P1E2 variante 1”) se muestra en la figura 2A. La metionina inicial está subrayada. El marco de lectura abierta se extiende desde el ácido nucleico 42-2036 incluido el codón de detención. La secuencia de ADNc y aminoácidos de la variante 2 de 184P1E2 (también denominada “184P1E2 v.2”) se muestra en la figura 2B. La metionina inicial está subrayada. El marco de lectura abierta se extiende desde el ácido nucleico 42-2036 incluido el codón de detención. La secuencia de ADNc y aminoácidos de la variante 3 de 184P1E2 (también denominada “184P1E2 v.3”) se muestra en la figura 2C. La metionina inicial está subrayada. El marco de lectura abierta se extiende desde el ácido nucleico 42-2036 incluido el codón de detención. La secuencia de ADNc y aminoácidos de la variante 4 de 184P1E2 (también denominada “184P1E2 v.4”) se muestra en la figura 2D. La metionina inicial está subrayada. El marco de lectura abierta se extiende desde el ácido nucleico 42-2036 incluido el codón de detención. La secuencia de ADNc y aminoácidos de la variante 5 de 184P1E2 (también denominada “184P1E2 v.5”) se muestra en la figura 2E. La metionina inicial está subrayada. El marco de lectura abierta se extiende desde el ácido nucleico 42-2036 incluido el codón de detención. La secuencia de ADNc y aminoácidos de la variante 6 de 184P1E2 (también denominada “184P1E2 v.6”) se muestra en la figura 2F. La metionina inicial está subrayada. El marco de lectura abierta se extiende desde el ácido nucleico 42-2036 incluido el codón de detención. La secuencia de ADNc y aminoácidos de la variante 7 de 184P1E2 (también denominada “184P1E2 v.7”) se muestra en la figura 2G. La metionina inicial está subrayada. El marco de lectura abierta se extiende desde el ácido nucleico 42-2036 incluido el codón de detención. La secuencia de ADNc y aminoácidos de la variante 8 de 184P1E2 (también denominada “184P1E2 v.8”) se muestra en la figura 2H. La metionina inicial está subrayada. El marco de lectura abierta se extiende desde el ácido nucleico 42-2036 incluido el codón de detención. La secuencia de ADNc y aminoácidos de la variante 9 de 184P1E2 (también denominada “184P1E2 v.9”) se muestra en la figura 2I. La metionina inicial está subrayada. El marco de lectura abierta se extiende desde el ácido nucleico 42-2036 incluido el codón de detención. La secuencia de ADNc y aminoácidos de la variante 10 de 184P1E2 (también denominada “184P1E2 v.10”) se muestra en la figura 2J. La metionina inicial está subrayada. El marco de lectura abierta se extiende desde el ácido nucleico 42-2036 incluido el codón de detención. Tal como se usa en el presente documento, una referencia a 184P1E2 incluye todas sus variantes, incluidas las que se muestran en las figuras 10 y 12.

Figura 3. La secuencia de aminoácidos de 184P1E2 v.1 se muestra en la figura 3A; tiene 664 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos de 184P1E2 v.2 se muestra en la figura 3B; tiene 664 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos de 184P1E2 v.3 se muestra en la figura 3C; tiene 664 aminoácidos. Tal como se usa en el presente documento, una referencia a 184P1E2 incluye todas sus variantes, incluidas las que se muestran en la figura 11.

Figura 4. En la figura 4A se muestra el alineamiento de la secuencia de ácidos nucleicos de 184P1E2 v.1 con peptidilarginina deiminasa tipo III humana. Las diferencias de ácidos nucleicos están subrayadas. En la figura 4B se muestra el alineamiento de la secuencia de aminoácidos de 184P1E2 v.1 con peptidilarginina deiminasa tipo III humana. La variación de aminoácidos en la posición 480 está subrayada. En la figura 4C se muestra el alineamiento de la secuencia de aminoácidos de 184P1E2 v.1 con peptidilarginina deiminasa tipo III de ratón. En la figura 4B se muestra el alineamiento de la secuencia de aminoácidos de 184P1E2 v.1 con peptidilarginina deiminasa tipo III de rata.

Figura 5. Perfil aminoacídico de hidrofilicidad de 184P1E2 variante 1, determinada mediante análisis de secuencia por algoritmo informático usando el procedimiento de Hopp y Woods (Hopp T.P., Woods K.R., 1981. Proc. NatI. Acad. Sci. U.S.A. 78: 3824-3828) accesible en el sitio de Internet de Protscale (www.expasy.ch/cgibin/protscale.pl) a través del servidor de biología molecular ExPasy.

Figura 6. Perfil aminoacídico de hidropaticidad de 184P1E2 variante 1, determinada mediante análisis de secuencia por algoritmo informático usando el procedimiento de Kyte y Doolittle (Kyte J., Doolittle R.F., 1982. J. Mol. Biol. 157:105-132) accesible en el sitio de Internet de Protscale (www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) a través del servidor de biología molecular ExPasy.

Figura 7. Perfil aminoacídico del porcentaje de residuos accesibles de 184P1E2 variante 1, determinada mediante análisis de secuencia por algoritmo informático usando el procedimiento de Janin (Janin J., 1979 Nature 277:491 492) accesible en el sitio de Internet de Protscale (www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) a través del servidor de biología molecular ExPasy.

Figura 8. Perfil aminoacídico de flexibilidad promedio de 184P1E2 variante 1, determinada mediante análisis de secuencia por algoritmo informático usando el procedimiento de Bhaskaran y Ponnuswamy (Bhaskaran R., y Ponnuswamy P.K., 1988. lnt. J. Pept Protein Res. 32:242-255) accesible en el sitio de Internet de Protscale (www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) a través del servidor de biología molecular ExPasy.

Figura 9. Perfil aminoacídico de giro beta de 184P1E2 variante 1, determinada mediante análisis de secuencia por algoritmo informático usando el procedimiento deDeleage and Roux (Deleage, G., Roux B. 1987 Protein Engineering 1:289-294) accesible en el sitio de Internet de Protscale (www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) a través del servidor de biología molecular ExPasy.

Figura 10. Representación esquemática de variantes nucleotídicas de 184P1E2. Las variantes 184P1E2 v.2 a v.10 son variantes con variación nucleotíca única. Las cajas negras muestran la misma secuencia que 184P1E2 v. 1. Los números corresponden a los de 184P1E2 v.1. Los polimorfismos de nucleóitido único (denominado también “SNP”) se indican encima de las cajas.

Figura 11. Representación esquemática de variantes proteicas de 184P1E2. Las variantes nucleotídicas 184P1E2

v.1 , v.2 y v.3 de la figura 10 codifican las variantes proteicas 184P1E2 v.1, v.2 y v.3, respectivamente. Las variantes 184P1E2 v.4 a v.10 codifican la misma proteína que la variante 184P1E2 v.1. Las variantes proteicas 184P1E2 v.2 y

v.3 son variantes con variaciones aminoacídicas únicas. Las cajas negras muestra la misma secuencia que 184P1E2 v.1. Los números corresponden a los de 184P1E2 v.1. Las diferencias aminoacídicas únicas se indican encima de la caja.

Figura 12. Composición exónica del tránscrito original 184P1E2 v.1.

Figura 13. Predicción de estructura secundaria para 184P1E2. Ls estructura secundaria de 184P1E2 variante 1 se predijo usando el procedimiento HNN (red neuronal jerárquica) (Guermeur, 1997, http://pbil.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl? page=npsa_nn.html), accesible a través del servidor de biología molecular ExPasy (http:Ilwww.expasy.chltoolsl). Este procedimiento predice la presencia y localización de las hélices alfa, las cadenas

5 extendidas y las espirales aleatorias a partir de la secuencia primaria de proteínas. También se enumera el porcentaje de la proteína en una estructura secundaria dada.

Figura 14. Expresión de184P1E2 por RT-PCR. El ADNc de cadena primera se preparó a partir del grupo vital 1 (hígado, pulmón y riñón), grupo vital 2 (páncreas, colon y estómago), grupo de cáncer de vejiga, grupo de cáncer de riñón, grupo de cáncer de pulmón y grupo de metástasis de cáncer. La normalización se realizó por PCR usando

10 cebadores a actina y GAPDH. La PCR semicuantitativa, usando cebadores a 184P1E2, se realizó a 26 y 30 ciclos de amplificación. Los resultados muestran fuerte expresión de 184P1E2 en el grupo de cáncer de vejiga. La expresión de 184P1E2 también se detectó en el grupo de cáncer de riñón, grupo de cáncer de pulmón y grupo de metástasis de cáner, pero no en el grupo vital 1 ni el grupo vital 2.

Figura 15. Expresión de 184P1E2 en tejidos normales. Se analizaron dos tejidos multiples por inmunotransferencia

15 (Northern) (Clontech) ambos con 2 µg de ARNm/carril con la secuencia de 184P1E2. El tamaño de los patrones se indica en kilobases (kb) al lado. Los resultados muestran la ausencia de expresión de 184P1E2 en la totalidad de los 16 tejidos normales analizados.

Figura 16. Expresión de184P1E2 en especímenes de cáncer de pacientes y tejidos normales. Se extrajo ARN de un grup de tres cánceres de vejiga (BCP), así como de próstata normal (NP), vejiga normal (NB), riñón normal (NK),

20 colon normal (NO), pulmón normal (NL), mama normal (NBr) y ovario normal (NO). Se realizó el analisis de inmunotransferencia (Northern) con 10 µg de ARN/carril con la secuencia de 184P1E2. El tamaño de los patrones se indica en kilobases (kb) al lado. Se detectó un tránscrito de 4,5 kb de 184P1E2 en el grupo de cáncer de vejiga, pero no en los tejidos normales analizados.

Figura 17. Expresión de 184P1E2 en tejidos de pacientes con cáncer de vejiga. Se extrajo ARN de vejiga normal 25 (NB), líneas celulares de cáncer de vejiga (CL; UM-UC-3, J82, SCaBER), tumores de pacientes con cáncer de vejiga

(T) y sus tejidos adyacentes normales (N). La inmunotransferencia (Northern) con 10 µg de ARN total se realizó con la secuencia de 184P1E2. El tamaño de los patrones se indica en kilobases (kb) al lado. Los resultados muestran una expresión fuerte de 184P1E2 en tejidos de cáncer de vejita de pacientes.

Figura 18. Expresión de 184P1E2 en tejidos de pacientes con cáncer de pulmón. Se extrajo ARN de línea celularese

30 cáncer de pulmón (CL)(CALU-1, A427, NCl-H82, Ncl-146), pulmón normal (N), tumores de pacientes con cáncer de pulmón (T) y sus tejidos adyacentes normales (Nat). La inmunotransferencia (Northern) con 10 µg de ARN total se realizó con la secuencia de 184P1E2. El tamaño de los patrones se indica en kilobases (kb) al lado. Los resultados muestran una expresión fuerte de 184P1E2 en tejidos de cáncer de pulmón de pacientes, pero no en pulmón normal. Se detectó un transcrito de bajo peso molecular en las dos líneas celulares CALU-1 y NCl-146.

35 Descripción detallada de la invención

Índice de secciones

1.) Definiciones

II.) Polinucleótidos 184P1E2

ll.A.) Usos de polinucleótidos 184P1E2

40 ll.A.1.) Supervisión de anomalías genéticas

ll.A.2.) Realizaciones antisentido

II.A.3.) Cebadores y pares de cebadores

ll.A.4.) Aislamiento de moléculas de ácido nucleico que codifican 184P1E2

ll.A.5.) Moléculas de ácido nucleico recombinantes y sistemas huésped-vector

45 III.) Proteínas relacionadas con 184P1E2

III.A.) Realizaciones de proteínas que portan motivos

III B.) Expresión de proteínas relacionadas con 184P1E2

III.C.) Modificaciones de proteínas relacionadas con 184P1E2

lll.D.) Usos de proteínas relacionadas con 184P1E2

IV.) Anticuerpos 184P1E2 V.) Respuestas inmunitarias celulares 184P1E2 VI.) Animales transgénicos 184P1E2 VII.) Procedimientos para la detección de 184P1E2

5 VIII.) Procedimientos para detectar el estado de genes relacionados con 184P1E2 y sus productos IX.) Identificación de moléculas que interactúan con 184P1E2 X.) Procedimientos y composiciones terapéuticos X.A.) Vacunas anti-cáncer X.B.) 184P1E2 como diana para terapia basada en anticuerpos

10 X.C.) 184P1E2 como diana para respuestas inmunitarias celulares

X.C.1 Vacunas de minigenes

X.C.2. Combinaciones de péptidos CTL con péptidos cooperadores

X.C.3. Combinaciones de péptidos CTL con agentes de cebado de células T

X.C.4. Composiciones de vacuna que comprenden DC pulsada con péptidos CTL y/o HTL

15 X.D.) Inmunoterapia adoptiva

X.E.) Administración de vacunas con fines terapéuticos y profilácticos

Xl.) Realizaciones de diagnóstico y de pronóstico de 184P1E2.

XII.) Inhibición del funcionamiento de proteínas 184P1E2

Xll.A.) Inhibición de 184P1E2 con anticuerpos intracelulares

20 Xll.B.) Inhibición de 184P1E2 con proteínas recombinantes

Xll.C.) Inhibición de transcripición o traducción de 184P1E2

Xll.D.) Consideraciones generales para estrategias terapéuticas

XIII.) Kits

1.) Definiciones

25 A menos de que se definan de otro modo, se pretende que todos los términos de la técnica, notaciones y otros términos científicos o terminología científica que se usan en el presente documento tengan los significados que entienden comúnmente los expertos en la técnica a la que pertenecen los presentes inventores. En algunos casos, se definen en el presente documento términos con significados que se entienden comúnmente por motivos de claridad y para tener una referencia inmediata, y la inclusión de dichas definiciones en el presente documento no

30 debe interpretarse necesariamente como que representan una diferencia sustancial sobre lo que se entiende de forma general en la técnica. Muchas de las técnicas y los procedimientos que se describen o a los que se hace referencia en el presente documento se entienden bien y se usan de forma común al usar metodología convencional por parte de los expertos en la técnica, tal como, por ejemplo, las metodologías de clonación molecular usadas generalmente que se describen en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2ª edición (1989) CoId

35 Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, N.Y., Estados Unidos. Cuando proceda, los procedimientos que implican el uso de kits y reactivos disponibles comercialmente se llevan a cabo, generalmente, de acuerdo con los protocolos y/o parámetros definidos por el fabricante, mientras no se indique lo contrario.

Los términos “cáncer de próstata avanzado”, “cáncer de próstata localmente avanzado”, “enfermedad avanzada” y “enfermedad localmente avanzada” significan cánceres de próstata que se han extendido a través de la cápsula

40 prostática, y se pretende que incluyan el estadio 0 de la enfermedad según el sistema de la Asociación Urológica Estadounidense (AUA), los estadios 01 y 02 según el sistema Whitmore-Jewett y los estadio T3 -T4 y N+ de la enfermedad según el sistema TNM (tumor, ganglio linfático, metástasis). En general, la cirugía no está recomendada para pacientes con enfermedad localmente avanzada, y estos pacientes tienen unos resultados sustancialmente menos favorables que pacientes que tienen cáncer de próstata clínicamente localizado (confinado en el órgano). La

45 enfermedad localmente avanzada se identifica clínicamente mediante evidencia palpable de induración más allá del límite lateral de la próstata, o asimetría o induración sobre la base de la próstata. El cáncer de próstata localmente avanzado se diagnostica actualmente patológicamente siguiendo una prostatectomía radical si el tumor invade o penetra en la cápsula prostática, se extiende en el borde quirúrgico o invade la vesícula seminal.

“Alterar los patrones de glucosilación nativos” se pretende que signifique, para los fines del presente documento, eliminar uno o más restos carbohidrato que se encuentran en la secuencia nativa de 184P1E2 (eliminando el sitio de glucosilación subrayado o suprimiendo la glucosilación por medios químicos y/o enzimáticos), y/o añadir uno o más sitios de glucosilación que no están presentes en la secuencia nativa de 184P1E2. Además, la expresión incluye cambios cualitativos en la glucosilación de las proteínas nativas, que implican un cambio en la naturaleza y proporciones de los diversos restos carbohidrato presentes.

El término “análogo” se refiere a una molécula que es estructuralmente similar o comparte atributos similares o que se corresponden con otra molécula (por ejemplo, una proteína relacionada con 184P1E2). Por ejemplo, un análogo de una proteína 184P1E2 puede unirse específicamente a un anticuerpo o célula T que se une específicamente a 184P1E2.

El término “anticuerpo” se usa en el sentido más amplio. Por lo tanto, un anticuerpo puede ser de origen natural o fabricado por el hombre, como los anticuerpos monoclonales producidos mediante tecnología del hibridoma convencional. Los anticuerpos anti-184P1E2 comprenden anticuerpos monoclonales y policlonales, así como fragmentos que contienen el dominio de unión al antígeno y/o una o varias regiones determinantes de la complementariedad de estos anticuerpos.

Un “fragmento de anticuerpo” se define como al menos una porción de la región variable de las moléculas de inmunoglobulina que se une a su diana, es decir, la región de unión al antígeno. En una realización abarca específicamente anticuerpos anti-184P1E2 únicos y clones de los mismos (incluidos anticuerpos agonistas, antagonistas y de neutralización) y composiciones de anticuerpos anti-184P1E2 con especifidad poliepitópica.

El término “secuencias con codones optimizados" se refiere a secuencias de nucleótidos que se han optimizado para una especie de huésped particular reemplazando cualesquiera codones que tengan una frecuencia de uso inferior a aproximadamente el 20 %. Las secuencias de nucleótidos que se han optimizado para la expresión en una especie de huésped por eliminación de secuencias de poliadenilación falsas, eliminación de señales de ayuste exón/intrón, eliminación de repeticiones similares a transposón y/o optimización del contenido de GC además de la optimización de codones se denominan en el presente documento “secuencias de expresión mejorada”.

El término “agente citotóxico” se refiere a una sustancia que inhibe o previene la actividad de expresión de células, el funcionamiento de las células y/o causa la destrucción de células. Se pretende que el término incluya agentes quimioterapéuticos con isótopos radioactivos y toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas con actividad enzimática de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluidos fragmentos y/o variantes de las mismas. Los ejemplos de agentes citotóxicos incluyen, pero no están limitados a, maitansinoides, itrio, bismuto, ricina, cadena A de ricina, doxorubicina, daunorubicina, taxol, bromuro de etidio, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, dihidroxiantracindiona, actinomicina, toxina de la difteria, exotoxina de pseudomonas (PE) A, PE40, abrina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, gelonina, mitogelina, retstrictocina, fenomicina, enomicina, curicina, crotina, caliqueamicina, inhibidor de sapaonaria officinalis y glucocorticoides y otros agentes terapéuticos, así como isótopos radioactivos tales como At211, I131, I125, Y90, Re186 , Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioactivos de Lu. Los anticuerpos también pueden conjugarse con una enzima activadora de un profármaco anticáncer capaz de tranformar el profármaco en su forma activa.

El término “homólogo” se refiere a una molécula que muestra homología con otra molécula, teniendo, por ejemplo, secuencias de restos químicos que son los mismos o similares en las posiciones correspondientes.

“Antígeno leucocitario humano” o HLA es una proteína del complejo de histocompatibilidad principal (MHC) de clase I o de clase II (véase, por ejemplo, Stites y col., IMMUNOLOGY, 8ª ED., Lange Publishing, Los Altos, CA, Estados Unidos (1994)).

Las expresiones “hibridar”, “que hibrida”, “hibrida” y similares, cuando se usan en el contexto de polinucleótidos, se pretende que se refieran a condiciones de hibridación convencionales, preferentemente tales como hibridación en formamida al 50 %/6XSSC/SDSI al 0,1 %/100 µg/ml de ADNss, en las que las temperaturas para la hibridación son superiores a 37 ºC y las temperaturas de lavado en 0,1XSSC/SDS al 0,1 % son superiores a 55 ºC.

Las expresiones “aislado” o “biológicamente puro” se refieren al material que está sustancialmente o esencialmente exento de componentes que acompañan normalmente al material cuando se encuentra en su estado nativo. De este modo, los péptidos “aislados” según la invención no contienen, preferentemente, materiales asociados normalmente con los péptidos en sus ambientes in situ. Por ejemplo, se dice que un polinucleótido está “aislado” cuando está sustancialmente separado de polinucleótidos contaminantes que se corresponden o son complementarios a genes diferentes a los genes 184P1E2 o que codifican polipéptidos diferentes al producto génico de 184P1E2 o fragmentos del mismo. Un profesional experto puede usar de forma sencilla procedimientos de aislamiento de ácidos nucleicos para obtener un polinucleótido 184P1E2 aislado. Se dice que una proteína está “aislada”, por ejemplo, cuando se usan procedimientos físicos, mecánicos o químicos para eliminar de las proteínas 184P1E2 constituyentes celulares que están asociados normalmente a la proteína. Un profesional experto puede usar de forma sencilla procedimientos de purificación estándar para obtener una proteína 184P1E2 aislada. Alternativamente, una proteína aislada puede prepararse por medios químicos.

El término “mamífero” se refiere a cualquier organismo clasificado como mamífero, incluidos ratones, ratas, conejos, perros, gatos, vacas, caballos y seres humanos. En un caso concreto, el mamífero es un ratón. En otro caso concreto, el mamífero es un ser humano.

Los términos “cáncer de próstata metastático” y “enfermedad metastática” significan cánceres de próstata que se han extendido a ganglios linfáticos regionales o a sitios distantes, y se pretende que incluyan el estadio D de la enfermedad según el sistema AUA y el estadio TxNxM+ según el sistema TNM. Como en el caso de cáncer de próstata localmente avanzado, la cirugía no está indicada, generalmente, para pacientes con enfermedad metastática y la terapia hormonal (ablación andrógena) es una modalidad de tratamiento preferente. Los pacientes con cáncer de próstata metastático desarrollan eventualmente un estado resistente a andrógenos entre los meses 12 a 18 a partir de la iniciación del tratamiento. Aproximadamente la mitad de estos pacientes resistentes a andrógenos mueren dentro de un periodo de 6 meses después de desarrollar dicho estado. Los sitios más comunes para la metástasis del cáncer de próstata son los huesos. Las metástasis ósea de cáncer de próstata son a menudo osteoblásticas más que osteolíticas (es decir, dan como resultado la formación neta de hueso. La metástasis ósea se encuentra más frecuentemente en la columna vertebral, y a continuación en el fémur, la pelvis, la caja torácica, el cráneo y el húmero. Otros sitios comunes de metástasis incluyen ganglios linfáticos, pulmones, hígado y cerebro. El cáncer de próstata metastático se diagnostica normalmente mediante apertura o linfadenectomía pélvica laparoscópica, análisis de radionúclidos de cuerpo entero, radiografía del esqueleto y/o biopsia de lesión ósea.

El término “anticuerpo monoclonal” se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos que comprende la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de origen natural que están presentes en cantidades secundarias.

Un “motivo”, tal como un motivo biológico de una proteína relacionada con 184P1B2, se refiere a cualquier patrón de aminoácidos que forman parte de la secuencia primaria de una proteína que está asociado con una función particular (por ejemplo, interacción proteína-proteína, interacción proteína-ADN, etc.) o modificación (por ejemplo, que está fosforilada, glucosilada o amidada), o ubicación (por ejemplo, secuencia secretora, secuencia de localización nuclear, etc.) o una secuencia que está correlacionada con la misma siendo inmunogénica, humoral o celularmente. Un motivo puede ser o bien contiguo o bien capaz de ser alineado en posiciones determinadas que están correlacionadas, generalmente, con una función o propiedad determinada. En el contexto de motivos HLA, el motivo se refiere al patrón de residuos de un péptido de longitud definida, generalmente un péptido de aproxidamente 8 a aproximadamente 13 aminoácidos para un motivo HLA de clase I y de aproximadamente 6 a aproximadamente 25 aminoácidos para un motivo HLA de clase II, que es reconocido por una molécula HLA particular. Los motivos peptídicos para la unión a HLA son normalmente diferentes para cada proteína codificada por cada alelo HLA humano y difieren en el patrón de los residuos de anclaje primarios y secundarios.

Un “excipiente farmacéutico” comprende un material tal como un coadyuvante, un vehículo, agentes de ajuste de pH y tamponadores, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes humectantes, conservantes y similares.

“Farmacéuticamente aceptable” se refiere a no tóxico, inerte y/o a una composición que es fisiológicamente compatible con humanos u otros mamíferos.

El término “polinucleótido” se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de una longitud de al menos 10 bases o pares de bases, o ribonucleótidos o desoxinucleótidos o a una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido, y se pretende que incluya formas mono y bicatenarias de ADN y/o ARN. En la técnica, este término se usa a menudo de forma intercambiable con oligonucleótido. Un polinucleótido puede comprender una secuencia de nucleótidos dada a conocer en el presente documento en la que la timidina (T), tal como se muestra, por ejemplo, en la figura 2, también puede ser uracilo (U); esta definición se refiere a las diferencias entre las estructuras químicas del ADN y ARN, en particular a la observación de que una de cuatro bases principales en el ARN es uracilo (U) en vez de timidina (T).

El término “polipéptido” significa un polímero de al menos aproximadamente 4, 5, 6, 7 u 8 aminoácidos. A lo largo de la memoria descriptiva se usan las denominaciones estándar de tres letras o de una letra para aminoácidos. En la técnica, este término se usa a menudo de forma intercambiable con péptido o proteína.

Un “residuo de anclaje primario” HLA es un aminoácido en una posición específica a lo largo de una secuencia peptídica que se entiende que proporciona un punto de contacto entre el péptido inmunogénico y la molécula de HLA. De uno a tres, generalmente dos, restos de anclaje primarios de un péptido de longitud definida definen generalmente un motivo para un péptido inmunogénico. Se entiende que estos residuos se adaptan en una forma de contacto estrecha con la hendidura de unión peptídica de una molécula HLA, con sus cadenas laterales enterradas en bolsillos específicos de la hendidura de unión. En una realización, por ejemplo, los residuos de anclaje primarios para una molécula HLA de clase I se localizan en la posición 2 (desde la posición amino terminal) y en la posición carboxilo terminal del epítopo peptídico de 8, 9, 10, 11 ó 12 residuos según la invención. En otro caso, por ejemplo, los residuos de anclaje primarios de un péptido que se une a una molécula HLA de clase II están espaciados uno con respecto a otro, más que con respecto a los extremos de un péptido, siendo el péptido, generalmente, de al menos 9 aminoácidos de longitud. Las posiciones de anclaje primarias para cada motivo y supermotivo están establecidas en la tabla IV. Por ejemplo, pueden crearse péptidos análogos anterando la presencia o ausencia de un residuo particular en las posiciones de anclaje primarias y secundarias que se muestran en la tabla IV. Dichos análogos se usan para modular la afinidad de unión y/o la cobertura poblacional de un péptido que comprende un motivo o supermotivo HLA particular.

Una molécula de ADN o ARN “recombinante” es una molécula de ADN o ARN que se ha sometido a manipulación molecular in vitro.

Ejemplos no limitantes de moléculas pequeñas incluyen compuestos que se unen o interactúan con 184P1E2, ligandos que incluyen hormonas, neuropéptidos, quimiolinas, productos olorosos, fosfolípidos y equivalentes funciones de los mismos que se unen y preferentemente inhiben el funcionamiento de la proteína 184P1E2. Dichas moléculas pequeñas no limitantes tienen preferentemente un peso molecular inferior a aproximadamente 10 kDa, más preferentemente inferior a aproximadamente 9, aproximadamente 8, aproximadamente 7, aproximadamente 6, aproximadamente 5 o aproximadamente 4 kDa. En determinados casos, las moléculas pequeñas se asocian físicamente con, o se unen a, la proteína 184P1E2; no se encuentran en rutas metabólicas de origen natural y/o son más solubles en soluciones acuosas que en las no acuosas.

Un experto en la técnica pude determinar fácilmente la “estringencia” de reacciones de hibridación y, generalmente, es un cálculo empírico que depende de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado y la concentración salina. En general, las sondas más largas requieren temperatura más altas para una hibridación apropiada, mientras que las sondas más cortas necesitan temperaturas más bajas. La hibridación depende generalmente de la capacidad de las secuencias de ácidos nucleicos desnaturalizadas para hibridar cuando las cadenas complementarias están presentes en un ambiente con temperaturas inferiores a sus temperaturas de fusión. Cuanto más alto sea el grado de homología deseado entre la sonda y la secuencia hibridable, más alta será la temperatura relativa que puede usarse. Como resultado, se tiene que temperaturas relativamente altas tenderían a hacer las condiciones de reacción más estringentes, mientras que las bajas temperaturas, por lo tanto, menos estringentes. Para detalles adicionales y explicaciones de la estringencia de reacciones de hibridación, véase Ansubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley lnterscience Publishers, (1995).

“Condiciones estringentes” o “condiciones de alta estringencia”, tal como se definen en el presente documento, se identifican por, pero no están limitadas a, las siguientes: (1) uso de fuerza iónica baja y temperatura alta para el lavado, por ejemplo cloruro de sodio 0,015 M /citrato de sodio 0,0015 M /docedilsulfato de sodio al 0,1 % a 50 ºC; (2) uso durante la hibridación de un agente de desnaturalización, tal como formamida, por ejemplo. formamida al 50 % (v/v) con albúmina de suero bovino al 0,1 % /Ficoll al 0,1 % /polivinilpirrolidona al 0,1 % /tampón de fosfato de sodio 50 mM a un pH de 6,5 con cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42 ºC; o (3) uso de formamida al 50 %, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato de sodio 0,075 M), fosfato de sodio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sodio 0,1 %, 5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 g/ml), SDS al 0,1 % y sulfato de dextrano al 10 % a 42 ºC, con lavados a 42 ºC en 02 x SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) y con formamida a 55 ºC, seguido de un lavado de alta estringencia que consta de 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55 ºC. “Condiciones moderadamente estringentes” se describen en, sin están limitadas a las mismas, Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos estringentes que las descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente estringentes es la incubación durante toda la noche a 37 ºC en una solución que comprende: formamida al 20 %, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato de trisodio 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5 x solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10 % y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón cizallado desnaturalizado,seguido por lavado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37-50 ºC. El experto sabrá como ajustar la temperatura, la fuerza iónica, etc, tal como sea necesario para ajustar los factores a la longitud de la sonda y similiares.

Un “supermotivo” HLA es una especifidad de unión peptídica compartida por moléculas de HLA codificada por dos o más alelos HLA.

Tal como se usa en el presente documento “tratar” o “terapéutico” y términos relacionados gramáticamente, se refieren a cualquier mejora de cualquier consecuencia de la enfermedad, tal como prolongación de la supervivencia, morbididad inferior y/o una disminución de efectos secundarios que sean los subproductos de una modalidad terapéutica alternativa; no se requiere la erradicación total de la enfermedad .

Un “animal transgénico” (por ejemplo, un ratón o una rata) es un animal que tiene células que contienen un transgén, habiendo sido introducido dicho transgén en el animal o en un ancestro del animal prenatalmente, por ejemplo, en un estado embrionario. Un “transgén” es un ADN que está integrado en el genoma de una célula a partir de la que se desarrolla el animal transgénico.

Tal como se usa en el presente documento, una "vacuna" de respuesta inmunitaria celular o HLA es una composición que contiene o codifica uno o varios péptidos de los descritos en el presente documento. Existen numerosos casos de vacunas, tales como un cóctel de uno o varios péptidos individuales; uno o varios péptidos descritos en el presente documento comprendidos en un péptidos poliepitópico; o ácidos nucleicos que codifican dichos péptidos o polipéptidos individuales, por ejemplo, un minigén que codifica un péptido poliepitópico. La expresión “uno o varios péptidos” puede incluir cualquier número entero de unidad completa de 1-150 o más, por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145 ó 150 o más péptidos descritos en el presente documento. Opcionalmente, los péptidos o polipéptidos pueden modificarse, por lipidación, adición de secuencias dirigidas o de otras secuencias. Los péptidos HLA de clase I que se describen en el presente documento pueden mezclarse con, o estar unidos a, péptidos HLA de clase II, para facilitar la activación de linfocitos T citotóxicos y de linfocitos T cooperadores. Las vacunas HLA también pueden comprender células que presentan antígenos pulsados con péptidos, por ejemplo, células dendríticas.

El término "variante” se refiere a una molécula que muestra una variación de un tipo descrito o norma, tal como una proteína que tiene uno o varios residuos de aminoácido diferentes en la posición o en las posiciones correspondientes de una proteína descrita de forma específica (por ejemplo, la proteína 148P1E2 que se muestra en la figura 2 o en la figura 3). Un análogo es un ejemplo de una proteína variante. Las isoformas de ayuste y los polimorfismos de un sólo nucleótido (SNP) son otros ejemplos de variantes.

Las “proteínas relacionadas con 184P1E2” incluyen las identificadas de forma específica en el presente documento, variantes de sustitución conservativa, análogos y homólogos que pueden aislarse/generarse y caracterizarse sin la experimentación excesiva siguiendo los procedimientos expuestos en el presente documento o que están fácilmente disponibles en la técnica. Las proteínas de fusión que combinan partes de diferentes proteínas 184P1E2 o fragmentos de las mismas, así como proteínas de fusión de una proteína 184P1E2 y un polipéptido heterólogo están también incluidas. Dichas proteínas 184P1E2 se denominan colectivamente proteínas relacionadas con 184P1E2 o 184P1E2. El término proteína relacionada con 184P1E2 se refiere a un fragmento de polipéptido o una secuencia de proteína 184P1E2 de 4, 5 ,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más de 25 aminoácidos; o de al menos 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650 ó 664 o más aminoácidos.

II.) Polinucleótidos 184P1E2

En el presente apartado se describen polinucleótidos correspondientes o complementarios a la totalidad o a parte de un gen, ARNm y/o secuencia codificadora de 184P1E2, preferentemente en forma aislada, incluidos nucleótidos que codifican una proteína relacionada con 184P1E2 y fragmentos de la misma, ADN, ARN, híbrido ADN/ARN y moléculas relacionadas, polinucleótidos u oligonucleótidos complementarios al gen 184P1E2 o secuencia de ARNm de 184P1E2 o una parte de la misma, y polinucleótidos u oligonucleótidos que hibridan a un gen, ARNm de 184P1E2, o un polinucleótido que codifica 184P1E2 (colectivamente, “polinucleótidos 184P1E2”). En todos los casos a los que se refiere esta sección, T también puede ser U en la figura 2.

Los casos de un polinucleótido 184P1E2 incluyen: un polinucleótido 184P1E2 que tiene la secuencia que se muestra en la figura 2, la secuencia de nucleótidos 184P1E2 tal como se muestra en la figura 2 en la que T es U; al menos 10 nucleótidos contiguos de un polinucleótido que tiene la secuencia tal como se muestra en la figura 2; o, al menos 10 nucleótidos contiguos de un polinucleótido que tiene la secuencia tal como se muestra en la figura 2 en la que T es U. Por ejemplo, los casos de nuecleótidos 184P1E2 comprenden, sin limitación:

(I)

un polinucleótido que comprende, está constituido esencialmente por, o está constituido por una secuencia tal como se muestra en la figura 2, en la que T también puede ser U;

(II)

un polinucleótido que comprende, está constituido esencialmente por, o está constituido por una secuencia tal como se muestra en la figura 2, desde el residuo de nucleótido número 42 hasta el residuo de nucleótido número 2036, incluido el codón de detención, en la que T también puede ser U;

(III) un polinucleótido que comprende, está constituido esencialmente por, o está constituido por una secuencia tal como se muestra en la figura 2B, desde el residuo de nucleótido número 42 hasta el residuo de nucleótido número 2036, incluido el codón de detención, en la que T también puede ser U;

(IV)

un polinucleótido que comprende, está constituido esencialmente por, o está constituido por una secuencia tal como se muestra en la figura 2C, desde el residuo de nucleótido número 42 hasta el residuo de nucleótido número 2036, incluido el codón de detención, en la que T también puede ser U;

(V)

un polinucleótido que comprende, está constituido esencialmente por, o está constituido por una secuencia tal como se muestra en la figura 2D, desde el residuo de nucleótido número 42 hasta el residuo de nucleótido número 2036, incluido el codón de detención, en la que T también puede ser U;

(VI)

un polinucleótido que comprende, está constituido esencialmente por, o está constituido por una secuencia tal como se muestra en la figura 2E, desde el residuo de nucleótido número 42 hasta el residuo de nucleótido número 2036, incluido el codón de detención, en la que T también puede ser U;

(VII) un polinucleótido que comprende, está constituido esencialmente por, o está constituido por una secuencia tal como se muestra en la figura 2F, desde el residuo de nucleótido número 42 hasta el residuo de nucleótido número 2036, incluido el codón de detención, en la que T también puede ser U;

(VIII) un polinucleótido que comprende, está constituido esencialmente por, o está constituido por una secuencia tal como se muestra en la figura 2G, desde el residuo de nucleótido número 42 hasta el residuo de nucleótido número 2036, incluido el codón de detención, en la que T también puede ser U;

(II)

un polinucleótido que comprende, está constituido esencialmente por, o está constituido por una secuencia tal como se muestra en la figura 2H, desde el residuo de nucleótido número 42 hasta el residuo de nucleótido número 2036, incluido el codón de detención, en la que T también puede ser U;

(X)

un polinucleótido que comprende, está constituido esencialmente por, o está constituido por una secuencia tal como se muestra en la figura 2I, desde el residuo de nucleótido número 42 hasta el residuo de nucleótido número 2036, incluido el codón de detención, en la que T también puede ser U;

(XII) un polinucleótido que comprende, está constituido esencialmente por, o está constituido por una secuencia tal como se muestra en la figura 2J, desde el residuo de nucleótido número 42 hasta el residuo de nucleótido número 2036, incluido el codón de detención, en la que T también puede ser U;

(XIII)

un polinucleótido que codifica una proteína relacionada con 184P1E2 que es al menos el 90 % homólogo a una secuencia completa de aminoácidos que se muestra en las figuras 2A-J;

(XIII)

un polinucleótido que codifica una proteína relacionada con 184P1E2 que es al menos el 90 % idéntica a una secuencia completa de aminoácidos que se muestra en las figuras 2A-J;

(XV) un polinucleótido que codifica al menos un péptido expuesto en las tablas V-XVIII y XXII-LI;

(XVI) un polinucleótido que codifica una región peptídica de al menos 5 aminoácidos de un péptido de la figura 3A en cualquier aumento de número entero hasta el 664 que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor superior a 0,5 en el perfil de hidrofilicidad de la figura 5;

(XVII) un polinucleótido que codifica una región peptídica de al menos 5 aminoácidos de un péptido de la figura 3A en cualquier aumento de número entero hasta el 664 que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor inferior a 0,5 en el perfil de hidropacidad de la figura 6;

(XVIII) un polinucleótido que codifica una región peptídica de al menos 5 aminoácidos de un péptido de la figura 3A en cualquier aumento de número entero hasta el 664 que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor superior del perfil de porcentaje de residuos accesibles de la figura 7;

(XIX) un polinucleótido que codifica una región peptídica de al menos 5 aminoácidos de un péptido de la figura 3A en cualquier aumento de número entero hasta el 664 que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor superior del perfil de flexibilidad promedio de la figura 8;

(XX) un polinucleótido que codifica una región peptídica de al menos 5 aminoácidos de un péptido de la figura 3A en cualquier aumento de número entero hasta el 664 que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor superior del perfil de giro beta de la figura 9;

(XXI) un polinucleótido que es totalmente complementario a un polinucleótido de uno cualquiera de (l)-(XX).

(XXII) un péptido que está codificado por cualquiera de (l)-(XXI); y

(XXI) un polinucleótido de cualquiera de (l)-(XXI) o péptido de (XXII) junto con un excipiente farmacéutico y/o en una forma de unidad de dosificación humana.

Tal como se usa en el presente documento, un intervalo se entiende que describe específicamente todas las posiciones unidad del mismo. Los polinucleótidos 184P1E2 pueden codificar porciones específicas de secuencias de ARNm de 184P1E2 (y las que son complementarias a dichas secuencias) tales como las que codifican las proteínas y/o fragmentos de los mismas, por ejemplo: (a) 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185,190, 195, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650 ó 664 o más aminoácidos contiguos de 184P1E2.

Por ejemplo, en el presente documento se describen polinucleótidos y sus péptidos codificados que codifican de aproximadamente el aminoácido 1 a aproximadamente el aminoácido 10 de la proteína 184P1E2 que se muestran en la figura 2 o en la figura 3, polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 10 a aproximadamente el aminoácido 20 de la proteína 184P1E2 que se muestra en la figura 2 o en la figura 3, polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 20 a aproximadamente el aminoácido 30 de la proteína 184P1E2 que se muestra en la figura 2 o en la figura 3, polinucleótidos que codifican de aproximadamente

el aminoácido 30 a aproximadamente el aminoácido 40 de la proteína 184P1E2 que se muestra en la figura 2 o en la figura 3, polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 40 a aproximadamente el aminoácido 50 de la proteína 184P1E2 que se muestra en la figura 2 o en la figura 3, polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 50 a aproximadamente el aminoácido 60 de la proteína 184P1E2 que se muestra 5 en la figura 2 o en la figura 3, polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 60 a aproximadamente el aminoácido 70 de la proteína 184P1E2 que se muestra en la figura 2 o en la figura 3, polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 70 a aproximadamente el aminoácido 80 de la proteína 184P1E2 que se muestra en la figura 2 o en la figura 3, polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 80 a aproximadamente el aminoácido 90 de la proteína 184P1E2 que se muestra en la figura 2 o en la 10 figura 3, polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 90 a aproximadamente el aminoácido 100 de la proteína 184P1E2 que se muestra en la figura 2 o en la figura 3, en incrementos de aproximadamente 10 aminoácidos, finalizando en el aminoácido del extremo carboxi terminal expuesto en la figura 2 o en la figura 3. En consecuencia, dichos polinucleótidos pueden codificar porciones de la secuencia de aminoácidos (de aproximadamente 10 aminoácidos de los 100 aminoácidos a través del aminoácido del extremo carboxi terminal de

15 la proteína 184P1E2. En la que se entiende que cada posición particular de un aminoácido describe esa posición más o menos cinco restos de aminoácidos.

También se describen polinucleótidos que codifican porciones relativamente largas de una proteína 184P1E2. Por ejemplo, polinucleótidos que codifican desde aproximadamente el aminoácido 1 (o 20 ó 30 ó 40, etc.) a aproximadamente el aminoácido 20 (o 30 ó 40 ó 50, etc.) de la proteína 184P1E2 “o variante” que se muestra en la

20 figura 2 ó en la figura 3 pueden generarse mediante una variadad de técnicas bien conocidas en la técnica. Estos fragmentos de polinucleótidos pueden incluir cualquier porción de la secuencia 184P1E2 tal como se muestra en la figura 2.

Los fragmentos de polinucleótidos 184P1E2 pueden codificar uno o varios de los motivos biológicos contenidos en una secuencia de proteína “o variante” 184P1E2, que incluye una o varias secuencias que portan motivos de una

25 proteína "o variante” 184P1E2 expuesta en las tablas V-XVIII y XXIl-LL. Los fragmentos típicos de polinucleótidos codifican una o varias regiones de la proteína “o variante” 184P1E2 que muestra homología con una molécula conocida. Los fragmentos típicos de polinucleótidos pueden codificar una o varios sitios de N-glucosilación, sitios de fosforilación de proteína quinasa dependiente de AMPc y GMPc, sitios de fosforilación de caseína quinasa II o sitios de N-miristoilación y sitios de amidación de proteína o variante 184P1E2.

30 II.A.) Usos de polinucleótidos 184P1E2

II.A.1.) Supervisión de anomalías genéticas

Los polinucleótidos de los párrafos precedentes tienen una serie de usos específicos diferentes. Los mapas génicos de 184P1E2 con respecto a la ubicación cromosómica se exponen en el ejemplo titulado “mapeo cromosómico de 184P1E2.” Por ejemplo, debido a los mapas génicos de 184P1E2 con respecto a este cromosoma, se usan 35 polinucléotidos que codifican distintas regiones de las proteínas 184P1E2 para caracterizar anomalías citogenéticas de esta localización cromosómica, tales como anomalías que se ha identificado que están asociadas con diversos cánceres. En determinados genes, se han identificado diversas anomalías cromosómicas que incluyen reordenamiento como anomalidades citogenéticas frecuentes en una serie de distintos cánceres (véase, por ejemplo, Krajinovic y col., Mutat. Res. 382(3-4): 81-83 (1998); Johansson y col., Blood 86(10): 3905-3914 (1995) y 40 Finger y col., P.N.A.S. 85(23): 9158-9162 (1988)). De este modo, los polinucleótidos que codifican regiones de las proteínas 184P1E2 proporcionan nuevos instrumentos que pueden usarse para delinear, con mayor precisión que lo que era posible anteriormente, anomalías citogenéticas en la región cromosómica que codifica 184P1E2 que pueden contribuir al fenotipo del tumor maligno. En este contexto, estos polinucleótidos satisfacen una necesidad en la técnica para expandir la sensitividad del análisis cromatográfico con el fin de identificar anomalías cromosómicas

45 más sutiles y menos comunes (véase, por ejemplo, Evans y col., Am. J. Obstet. Gynecol 171 (4): 1055-1 057 (1994)).

Además, debido a que 184P1E2 se ha demostrado que se expresa de forma elevada en caso de cáncer de vejiga y de otros tipos de cáncer, los polinucleótidos 184P1B2 se usan en procedimientos de análisis del estado de los productos génicos 184P1B2 en tejidos normales frente a tejidos cancerosos. Normalmente, los polinucleótidos que 50 codifican regiones específicas de las proteínas 184P1E2 se usan para evaluar la presencia de perturbaciones (tales como deleciones, inserciones, mutaciones puntuales o alteraciones que dan como resultado una pérdida de un antígeno, etc.) en regiones específicas del gen 184P1E2, tales como las regiones que contienen uno o varios motivos. Ejemplos de ensayos incluyen los ensayos de RT-PCR y los análisis de polimorfismo de conformaciones monocatenarias (SSCP) (véase, por ejemplo, Marrogi y col., J. Cutan. Pathol. 26(8): 369-378 (1999), que usan

55 ambos polinucleótidos que codifican regiones específicas de una proteína para examinar estas regiones de la proteína.

ll.A.2.) Realizaciones antisentido

En el presente documento se describe AND genómico, ADNc, ribozimes y moléculas antisentido, así como moléculas de ácido nucleico basadas en un esqueleto aternativo o que incluyen bases alternativas, tanto derivadas de fuentes naturales como sintetizadas, e incluyen moléculas capaces de inhibir el ARN o la expresión proteica de 184P1E2. Por ejemplo, las moleculas antisentido pueden ser ARN u otras moléculas, incluidos ácidos nucleicos peptídicos (PNA) o moléculas que no sean ácidos nucleicos tales como derivados de tioato de fosforo, que se unen específicamente al ADN o ARN de un modo dependiente del par de bases. Un profesional experto puede obtener fácilmente estas clases de moléculas de ácidos nucleicos usando los polinucleótido 184P1E2 y las secuencias de polinucleótidos que se divulgan en el presente documento.

La tencnología antisentido conlleva la administración de oligonucleótidos exógenos que se unen a un polinucleótido diana ubicado dentro de las células. El término antisentido se refiere al hecho de que dichos oligonucleótidos son complementarios con las dianas intracelulares, por ejemplo, 184P1E2. Véase, por ejemplo, Jack Cohen, Oligodeoxynucleotides, Antisense lnhibitors of Gene Expression, CRC Press, 1989; y Synthesis 1:1-5 (1988). Los oligonucleótidos 184P1E2 antisentido descritos en el presente documento incluyen derivados tales como Soligonucleótidos (derivados de fosforotioato o S-oligos, véase Jack Cohen, anteriormente), que muestran una acción potenciada de inhibición del crecimiento de células cancerosas. Los S-oligos (nucleósido fosforotioatos) son análogos isoelectrónicos de un oligonucleótido (O-oligo) en el que un átomo de oxígeno que no actúa como puente del grupo fosfato se reemplaza por un átomo de azufre. Los S-oligos pueden prepararse por tratamiento de los Ooligos correspondientes con 1,1-dióxido de 3H-1,2-benzoditiol-3-ona, que es un reactivo de transferencia de azufre. Véase, por ejemplo, lyer, R P. y col., J. Org. ‘Chem. 55:4693-4698 (1990); e lyer, R P. y col., J. Am. Chem. Soc. 112:1253-1254(1990). Los oligonucleótidos antisentido 184P1E2 adicionales incluyen oligonucleótidos antisentido morfolino conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Partridge y col., 1996, Antisense & Nucleic Acid Drug Development 6: 169-1 75).

Los oligonucleótidos antisentido 184P1E2 pueden ser, normalmente, ARN o ADN que sea complementario a, e hibrida de forma estable con, los 100 codones 5’ o los últimos 100 codones 3’ de una secuencia genómica de 184P1E2 o el ARNm correspondiente. No se precisa una complementariedad absoluta, aunque es preferente una grado alto de complementariedad. El uso de un oligonucleótido complementario a esta región permite la hibridación selectiva de ARNm de 184P1E2 y no de ARNm que especifica otras subunidades reguladoras de proteína quinasa. Los oligonucleótidos antisentido 184P1E2 pueden ser fragmentos de 15 a 30 ácidos nucleicos de la molécula de ADN antisentido que tiene una secuencia que hibrida ARNm de 184P1E2. Opcionalmente, el oligonucleótido antisentido 184P1E2 es un oligonucleótido de 30 ácidos nucleicos que es complementario a una región situada en los primeros 10 codones 5’ o los últimos 10 codones 3’ de 184P1E2. Alternativamente, las moléculas antisentido se modifican para usar ribozimas en la inhibición de la expresión de 184P1E2, véase, por ejemplo, L. A. Couture & D. T. Stinchcomb; Trends Genet 12: 510-515 (1996).

II.A.3.) Cebadores y pares de cebadores

Otras realizaciones específicas de los nucleótidos descritos incluyen cebadores y pares de cebadores, que permiten la amplificación específica de polinucleótidos o de cualquier parte específica de los mismos y sondas que hibridan selectiva o específicamente las moléculas de ácido nucleico o cualquier parte de las mismas. Las sondas pueden etiquetarse con un marcador detectable, tal como, por ejemplo, un isótopo radioactivo, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un quelador metálico o una enzima. Dichas sondas y cebadores se usan para detectar la presencia de polinucleótidos 184P1E2 en una muestra y como medio para detectar un célula que expresa una proteína 184P1E2.

Los ejemplos de tales muestras incluyen polipéptidos que comprenden toda la secuencia de ADNc de 184P1E2 humano que se muestra en la figura 2. Los ejemplos de pares de cebadores capaces de amplificar específicamente ARNm de 184P1E2 se describen también en los ejemplos. Tal como entenderá un experto, puede prepararse una gran cantidad de cebadores y sondas diferentes sobre la base de las secuencias proporcionadas por el presente documento y pueden usarse eficazmente para amplificar y/o detectar ARNm de 184P1E2.

Los polinucleótidos 184P1E2 descritos son útiles para diversos propósitos que incluyen, pero no están limitados a, su uso como sondas y cebadores para la amplificación y/o detección del gen o los genes 184P1E2, ARNm de 184P1E2 o fragmentos de los mismos; como reactivos para el diagnóstico y/o el pronóstico de cáncer de próstata y otros tipos de cáncer; como secuencias codificantes capaces de dirigir la expresión de polipéptidos 184P1E2; como instrumento para modular o inhibir la expresión del gen o los genes 184P1E2 y/o traducir el tránscrito o los tránscritos 184P1E2; y como agentes terapéuticos.

También se describe el uso de cualquier sonda tal como se describe en el presente documento para identificar o aislar una secuencia de ácido nucleico de 184P1E2 o relacionada con 184P1E2 a partir de una fuente de origen natural, tal como seres humanos u otros mamíferos, así como de la secuencia de ácido nucleico aislada por sí misma, que comprendería todas o la mayor parte de las secuencias encontradas en la sonda usada.

II.A.4.) Aislamiento de moléculas de ácido nucleico que codifican 184P1E2

Las secuencias de ADNc de 184P1E2 descritas en el presente documento posibiltan el aislamiento de otros polinucleótidos que codifican producto(s) génico(s) de 184P1E2, así como el aislamiento de polinucleótidos que codifican homólogos de producto génico de 184P1E2, isoformas ayustadas alternativamente, variantes alélicas y formas mutantes del produto génico de 184P1E2, asi como polinucleótidos que codifican análogos de proteínas relacionadas con 184P1E2. Pueden usarse diversos procedimientos de clonación molecular para aislar el ADNc de cadena completa que codifica un gen 184P1E2 que son bien conocidos (véase, por ejemplo, Sambrook, J. y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, CoId Spring Harbor Press, Nueva York, 1989; Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel y col., Eds., Wiley and Sons, 1995). Por ejemplo, pueden usarse de forma conveniente metodologías de clonación de fagos lambda usando sistemas de clonación disponibles comercialmente (por ejemplo, Lambda ZAP Express, Stratagene). Pueden identificarse clones de fagos que contienen ADNc de gen 184P1E2 analizando con un ADNc de 184P1E2 o un fragmento del mismo etiquetado. Por ejemplo, en una realización, un ADNc de 184P1E2 (por ejemplo, figura 2) o una porción del mismo puede sintetizarse y usarse como una sonda para lograr ADNc superpuesto y de cadena completa que corresponde a un gen 184P1E2. Un gen 184P1E2 mismo puede aislarse cribando colecciones de ADN genómico, colecciones de cromosomas artificiales bacterianos (BAC), colecciones de cromosomas artificiales de levaduras (YAC) y similares con sondas o cebadores de ADN de 184P1E2.

II.A.5.) Moléculas de ácido nucleico recombinantes y sistemas huésped-vector

También se describen moléculas de ADN o ARN recombinantes que contienen un polinucleótido 184P1E2, un fragmento, un análogo o un homólogo del mismo, incluidos, pero no limitados a, plásmidos, faguémidos, cósmidos, YAC, BAC, así como diversos vectores víricos y no víricos bien conocidos en la técnica, y células transformadas o transfectadas con dichas moléculas de ADN o ARN recombinante. Los procedimientos para generar dichas moléculas son bien conocidos (véase, por ejemplo, Sambrook y col., 1989, anteriormente).

También se describe un sistema huésped-vector que comprende una molécula de ADN recombinante que contiene un polinucleótido 184P1E2, un fragmento, un análogo o un homólogo del mismo en una célula huésped procariota o eucariota adecuada. Los ejemplos de células huésped eucariotas adecuadas incluyen una célula de levadura, una célula vegetal o una célula animal, tal como una célula de mamífero o una célula de insecto (por ejemplo, una célula infectable por baculovirus tal como una célula Sf9 o HighFive). Los ejemplos de células de mamífero adecuadas incluyen diversas lineas celulares de cáncer de próstata tales como DU145 y TsuPrl, otras líneas celulares de cáncer de próstata transducibles, células primarias (PrEC), así como una serie de células de mamífero que se usan de forma rutinaria para la expresión de proteínas recombinantes (por ejemplo, células COS, CHO, 293, 293T). Más particularmente, puede usarse un polinucleótido que comprende la secuencia de codificación de 184P1E2 o un fragmento, análogo u homólogo de la misma para generar proteínas 184P1E2 o fragmentos de la misma usando una serie de sistemas huésped-vector que se usan de forma rutinaria y son ampliamente conocidos en la técnica.

Se encuentra disponible un amplio abanico de sistemas huésped-vector adecuados para la expresión de proteínas 184P1E2 o fragmentos de las mismas, (veáse, por ejemplo, Sambrook y col., 1989, anteriormente; Current Protocols in Molecular Biology, 1995, anteriormente). Los vectores preferentes para la expresión de mamíferos incluyen, pero no están limitados a, pcDNA 3.1 myc-His-tag (Invitrogen) y el vector retrovírico pSRαtkneo (Muller y col., 1991, MCB 11:1785). Usando dichos vectores de expresión, puede expresarse 184P1E2 en diversas líneas celulares de cáncer de próstata y lineas celulares no prostáticas, que incluyen, por ejemplo 293, 293T, rat-1, NIH 3T3 y TsuPrl. Los sistemas huésped-vector son útiles para la producción de una proteína 184P1E2 o un fragmento de la misma. Dichos sistemas huésped-vector pueden usarse para estudiar las propiedades funcionales de 184P1E2 y mutaciones o análogos de 184P1E2.

La proteína 184P1E2 humana recombinante o un análogo u homólogo o fragmento de la misma puede producirse mediante células de mamífero transfectadas con un constructo que codifica un nucleótido relacionado con 184P1E2. Por ejemplo, pueden transfectarse células 293T con un plásmido de expresión que codifica 184P1E2 o un fragmento, análogo u homólogo del mismo; se expresa una proteína relacionada con 184P1E2 en las células 293T, y la proteína 184P1E2 recombinante se aísla usando procedimientos de purificación estándar (por ejemplo, purificación de afinidad usando anticuerpos anti-184P1E2). En otro caso, se subclona una secuencia codificante de 184P1E2 en un vector retrovírico pSRaMSVtkneo y se usa para infectar varias líneas celulares de mamífero, tales como NIH 3T3, TsuPrl, 293 y rat-1 con el fin de establecer líneas celulares de expresión de 184P1E2. También pueden usarse otros varios sistemas de expresión bien conocidos en la técnica. Pueden usarse constructos de expresión que codifican un péptido director unido en marco a una secuencia codificadora de 184P1E2 para generar una forma secretada de proteína 184P1E2 recombinante.

Como se ha tratado en el presente documento, la redundancia en el código genético permite la variación de las secuencias génicas de 184P1E2. En particular, en la técnica se sabe que especies huésped diferentes tienen a menudo preferencias específicas de codones y, de este modo, se puede adaptar la secuencia divulgada como se prefiera para un huésped deseado. Por ejemplo, las secuencias de codones análogas preferentes tienen normalmente codones raros (es decir, codones que tienen una frecuencia de uso inferior a aproximadamente el 20 % en secuencias conocidas del huésped deseado) reemplazados por codones de mayor frecuencia. Las preferencias de codones para una especie específica se calculan, por ejemplo, usando tablas de uso de codones disponibles en INTERNET, tales como en la URL www.dna.affrc.go.jp/~nkamura/condon.htmal.

Se sabe que las modificaciones de secuencia adicionales potencian la expresión proteica en un huésped celular. Éstas incluyen eliminación de secuencias que codifican señales de poliadenilación falsas, señales de sitio de ayuste exón/intrón, repeticiones similares a transpasón y/o otras secuencias bien caracterizadas que son deletorias para la expresión génica. El contenido GC de la secuencia se ajusta a niveles promedio para un huésped celular dado, calculados mediante referencia a genes conocidos expresados en la célula huésped. Cuando sea posible, la secuencia se modifica para evitar estructuras secundarias de ARNm en forma de horquilla predichas. Otras modificaciones útiles incluyen la adición de una secuencia consenso de iniciación traduccional en el inicio del marco de lectura abierto, tal como se describe en Kozak, Mol. CelI Biol., 9:5073-5080 (1989). Los expertos entienden que la norma general de que ribosomas eucarióticos inician la traducción exclusivamente en el codón AUG próximo al 5' se anula sólo en condiciones raras (véase, por ejemplo, Kozak PNAS 92(7): 2662-2666, (1995) y Kozak NAR 15(20): 8125-8148 (1987)).

III.) Proteínas relacionadas con 184P1E2

Las proteínas 184P1E2 descritas en el presente documento pueden comprender un polipéptido que tenga toda la secuencia de aminoácidos de 184P1E2 o parte de la misma tal como se muestra en la figura 2 o en la figura 3. Alternativamente, las proteínas 184P1E2 comprenden polipéptidos variantes, homólogos o análogos que tienen alteraciones en la secuencia de aminoácidos de 184P1E2 que se muestra en la figura 2 o en la figura 3.

En general, las variantes alélicas de origen natural de 184P1E2 comparten un grado alto de identidad estructural y homología (por ejemplo, el 90 % o más de homología). Normalmente, las variantes alélicas de una proteína 184P1E2 contiene sustituciones de aminoácidos conservativas dentro de las secuencias 184P1E2 que se describen en el presente documento o contienen una sustitución de un aminoácido de una posición correspondiente en un homólogo de 184P1E2. Una clase de variantes alélicas de 184P1E2 son proteínas que comparte un alto grado de homología con al menos una región pequeña de una secuencia de aminoácidos de 184P1E2, pero que además contienen una desviación radical de la secuencia, tal como una sustitución no conservativa, truncación, inserción o desplazamiento de fase. En comparaciones de secuencias de proteínas, los términos similaridad, identidad y homología tienen cada uno un significado distinto, tal como se aprecia en el campo de la genética. Además, ortología y paralogía pueden ser conceptos importantes que describen la relación de miembros de una familia de proteínas dada en un organismo con los miembros de la misma familia en otros organismos.

Las abreviaturas de aminácidos se proporcionan en la tabla II. Las sustituciones de aminoácidos conservativas pueden realizarse, frecuentemente, en una proteína sin alterar ni la conformación ni el funcionamiento de la proteína. Las proteínas de la invención pueden comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 sustituciones conservativas. Dichos cambios incluyen sustituir cualquiera de entre isoleucina (I), valina (V) y leucina (L) por cualquier otro de estos aminoácidos hidrófobos; ácido aspártico (D) por ácido glutámico (E) y viceversa; glutamina

(Q) por asparagina (N) y viceversa; y serina (S) por treonina (T) y viceversa. Otras sustituiciones también pueden considerarse conservativas dependiendo del ambiente del aminoácido particular y su papel en la estructura tridimensional de la proteína. Por ejemplo, glicina (G) y alanina (A) pueden ser intercambiables frecuentemente, al igual que alanina (A) y valina (V). La metionina (M), que es relativamente hidrófoba, puede intercambiarse frecuentemente con leucina e isoleucina, y a veces con valina. Lisina (K) y arginina (R) son frecuentemente intercambiables en localizaciones en las que la característica significativa del residuo de aminoácido es su carga, y los diferentes pK de estos dos residuos de aminoácidos no son significativos. Aún pueden considerarse “conservadores” otros cambios en entornos particulares (véase, por ejemplo, la tabla III del presente documento; páginas 13-15 de Biochemistry 2ª edición. LubertStryer ed (Stanford University); Henikoff y col., PNAS 1992 Vol 8910915-10919; Lei y col., J Biol Chem 19 de mayo de 1995; 270(20):11882-6).

En el presente documento se describe una amplia variedad de variantes o análogos aceptadas en la técnica de proteínas 184P1E2 tales como polipéptidos que tienen inserciones, deleciones y sustituciones de aminoácidos. Las variantes de 184P1E2 pueden producirse usando procedimientos conocidos en la técnica tales como mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis mediante barrido de alanina o mutagénesis por PCR. La mutagénesis dirigida al sitio (Carter y col., NucI. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller y col., NucI. Acids Res., 10:6487 (1987)), mutagénesis de casete (Wells y col., Gene, 34:315 (1985)), mutagénesis mediante selección de restricción (Wells y col., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)) u otras técnicas conocidas pueden realizarse sobre el ADN clonado para producir el ADN de variante de 184P1E2.

El análisis de aminoácidos por barrido también puede usarse para identificar uno o varios aminoácidos a lo largo de la secuencia contigua que está implicada en una actividad biológica específica tal como una interacción proteína-proteína. Entre los aminoácidos de barrido preferentes están los aminoácidos neutros, relativamente pequeños. Dichos aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. La alanina es habitualmente un aminoácido de barrido preferente entre este grupo porque elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos probable alterar la conformación de la cadena principal de la variante. La alanina es normalmente preferente porque es el aminoácido más común. Además, con frecuencia se encuentra tanto en posición oculta como expuesta (Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)). Si la sustitución de alanina no produce cantidades suficientes de variante, puede usarse un aminoácido isostérico.

Tal como se definen en el presente documento, las variantes, análogos u homólogos de 184P1E2 tienen el atributo distintivo de tener al menos un epítope que “presenta reactividad cruzada” con una proteína 184P1E2 que tenga una secuencia de aminoácidos de la figura 3. Tal como se usa en esta frase, que “presenta reactividad cruzada” significa un anticuerpo o célula T que se une específicamente a una variante de 184P1E2 que también se une específicamente a una proteína 184P1E2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la figura 3. Un polipéptido deja de ser una variante de una proteína que se muestra en la figura 3 cuanto no contiene ningún epítopo más capaz de ser reconocido por un anticuerpo o célula T que se une específicament a la proteína 184P1E2 inicial. Los expertos en la técnica entienden que los anticuerpos que reconocen proteínas se unen a epítopos de tamaño variable, y una agrupación del orden de aproximadamente cuatro o cinco aminoácidos, contiguos o no, se considera un número típico de aminoácidos en un epítopo mínimo. Véase, por ejemplo, Nair y col., J. lmmunol 2000 165(12): 6949-6955; Hebbes y col., Mol lmmunol (1989) 26(9):865-73; Schwartz y col., J lmmunol (1985) 135(4): 2598-608.

Otras clases de variantes proteicas relacionadas con 184P1E2 comparten el 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 % o más similaridad con una secuencia de aminoácidos de la figura 3, o un fragmento de la misma. Otra clase específica de variantes o análogos de proteínas 184P1E2 comprende uno o varios de los motivos biológicos de 184P1E2 que se describen en el presente documento o que son conocidos actualmente en la técnica. De este modo, también se describen análogos de fragmentos de 184P1E2 (acidos nucleicos o aminoácidos) que han alterado propiedades funcionales (por ejemplo, inmunogénicas) con relación al fragmento inicial. Se aprecia que los motivos actuales o que se convierten en parte de la técnica se aplican a las secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos de la figura 2 o la figura 3.

Se describen en el presente documento polipéptidos que contienen menos aminoácidos que la secuencia de aminoácidos completa de una proteína 184P1E2 que se muestra en la figura 2 o en la figura 3. Por ejemplo, que la secuencia de aminoácidos completa de una proteína 184P1E2 que se muestra en la figura 2 o en la figura 3, se describen en el presente documento. Por ejemplo, los polipéptidos pueden comprender péptidos/proteínas que tienen cualquiera de entre 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más aminoácidos contiguos de una proteína 184P1E2 que se muestra en la figura 2 o en la figura 3.

Además, se describen polipéptidos constituidos por aproximadamente del aminoácido 1 a aproximadamente el aminoácido 10 de una proteína 184P1E2 que se muestra en la figura 2 o en la figura 3, polipéptidos constituidos por aproximadamente del aminoácido 10 a aproximadamente el aminoácido 20 de una proteína 184P1E2 que se muestra en la figura 2 o en la figura 3, polipéptidos constituidos por aproximadamente del aminoácido 20 a aproximadamente el aminoácido 30 de una proteína 184P1E2 que se muestra en la figura 2 o en la figura 3, polipéptidos constituidos por aproximadamente del aminoácido 30 a aproximadamente el aminoácido 40 de una proteína 184P1E2 que se muestra en la figura 2 o en la figura 3, polipéptidos constituidos por aproximadamente del aminoácido 40 a aproximadamente el aminoácido 50 de una proteína 184P1E2 que se muestra en la figura 2 o en la figura 3, polipéptidos constituidos por aproximadamente del aminoácido 50 a aproximadamente el aminoácido 60 de una proteína 184P1E2 que se muestra en la figura 2 o en la figura 3, polipéptidos constituidos por aproximadamente del aminoácido 60 a aproximadamente el aminoácido 70 de una proteína 184P1E2 que se muestra en la figura 2 o en la figura 3, polipéptidos constituidos por aproximadamente del aminoácido 70 a aproximadamente el aminoácido 80 de una proteína 184P1E2 que se muestra en la figura 2 o en la figura 3, polipéptidos constituidos por aproximadamente del aminoácido 80 a aproximadamente el aminoácido 90 de una proteína 184P1E2 que se muestra en la figura 2 o en la figura 3, polipéptidos constituidos por aproximadamente del aminoácido 90 a aproximadamente el aminoácido 100 de una proteína 184P1E2 que se muestra en la figura 2 o en la figura 3, etc. A los largo de la totalidad de la secuencia de aminoácidos de 184P1E2. Además, se describen polipéptidos constituidos por aproximadamente del aminoácido 1 (o 20 ó 30 ó 40. etc.) a aproximadamente el aminoácido 20 (o 130 ó 140 ó 150, etc.) de una proteína 184P1E2 que se muestra en la figura 2 o en la figura 3. Se puede apreciar que las posiciones de inicio y detención en este párafro se refieren a la posición especificada así como a la posición más o menos 5 residuos.

Las proteínas relacionadas con 184P1E2 se generan usando tecnología de síntesis de péptidos estándar o usando procedimientos de escisión química bien conocidos en la técnica. Alternativamente, pueden usarse procedimientos recombinantes para generar moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína relacionada con 184P1E2. Las moléculas de ácidos nucleicos pueden proporcionar un medio para generar fragmentos definidos de una proteína 184P1E2 (o variantes, homólogos o análogos de las mismas).

III.A.) Realizaciones de proteínas que portan motivos

Los polipéptidos 184P1E2 comprenden los residuos de aminoácidos de uno o varios motivos biológicos contenidos dentro de una secuencia de polipéptidos 184P1E2 establecida en la figura 2 o en la figura 3. Varios motivos son conocidos en la técnica, y una proteína puede evaluarse por la presencia de dichos motivos mediante una serie de sitios de Internet disponibles al público (véanse, por ejemplo, las direcciones URL: pfam.wustl.edu/; http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq-search/struc-predict.html; psort.ims.u-tokyo.ac.jp/; www.cbs.dtu.dk/; www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html; www.expasy.ch/tools/snpsitl html; EpimatrixTM y EpimerTM, Brown University, www.brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html; and BIMAS, bimas.dcrt.nih.gov/.).

Las subsecuencias que portan motivos de todas las proteínas variantes de 184P1 E2 se exponen y se identifican en las tablas V-XVIII y XXlI-LI.

La tabla XIX expone diversos motivos de aparición frecuente sobre la base de búsquedas pfam (véase la dirección URL pfam.wustl.edu/). Las columnas de la tabla XIX enumeran (1) abreviatura del nombre del motivo, (2) porcentaje de indentidad encontrado entre los distintos miembros de la familia del motivo, (3) nombre o descripción del motivo

(4) función común más frecuente; se incluye información sobre la posición si el motivo es relevante para la posición.

Los polipéptidos que comprende uno o varios de los motivos 184P1E2 que se han tratado anteriormente son útiles en la elucidación de características específicas de un fenotipo de tumor maligno en vista de la observación de que los motivos 184P1E2 que se han tratado anteriormente están asociados con la desregulación del crecimiento y porque 184P1E2 se sobreexpresa en algúnos tipos de cáncer (véase, por ejemplo, la tabla 1). La caseína quinasa II, AMPc y proteína quinasa dependiente de ampc y proteína quinasa C, por ejemplo, son enzimas que se sabe que están asociadas con el desarrollo del fenotipo de tumores malignos (véanse, por ejemplo, Chen y col., Lab lnvest, 78(2): 165-1 74 (1998); Gaiddon y col., Endocrinology 136(10): 4331-4338 (1995); Hall y col., Nucleic Acids Research 24(6): 1119-1126 (1996); Peterziel y col., Oncogene 18(46): 6322-6329 (1999) y O’Brian, OncoL Rep. 5(2): 305-309 (1998)). Además, tanto la glucosilación como la miristoilación son modificaciones proteicas asociadas también con el cáncer y la progresión del cáncer (véase, por ejemplo, Dennis y col., Biochem. Biophys. Acta 1473(1):21-34 (1999); Raju y col., Exp. CelI Res. 235(1): 145-154 (1997)). La amidación es otra modificación proteica asociada también con el cáncer y la progresión del cáncer (véase, por ejemplo, Treston y col., J. NatI. Cancer lnst. Monogr. (13): 169-1 75 (1992)).

En otra realización, las proteínas descritas en el presente documento comprenden uno o varios de los epítopos inmunorreactivos identificados de acuerdo con procedimientos aceptados en la técnica, tales como los péptidos establecidos en las tablas V-XVIII y XXII-LL. Los epítopos CTL pueden determinarse usando algoritmos específicos para identificar péptidos dentro de una proteína 184P1E2 que sean capaces de unirse de forma óptima a alelos HLA especificados (por ejemplo, tabla IV; EpimatrixTM y EpimerTM, Brown University, URL www.brown.edu/Research/TB-HTV_Lab/epimatrixlepimatrix.html; y BIMAS, URL: bimas.dcrt. nih.gov/.) Además, los procedimientos para identificar péptidos que tengan una afinidad de unión suficiente por moléculas HLA y que estén correlacionados con epítopos que sean inmunogénicos son bien conocidos en la técnica, y se llevan a cabo sin una experimentación excesiva. Además, los procedimientos para identificar péptidos que sean epítopos inmunogénicos son bien conocidos en la técnica, y se llevan a cabo sin una experimentación excesiva tanto in vitro como in vivo.

También son conocidos en la técnica principios para crear análogos de dichos epítopos con el fin de modular la inmunogenicidad. Por ejemplo, se comienza con un epítopo que porta un motivo CTL o HTL (véanse, por ejemplo, los motivos/supermotivos HLA de clase I y HLA de clase II de la tabla IV). El epítopo se convierte en análogo sustituyendo un aminoácido en una de las posiciones especificadas y reemplazándolo por otro aminoácido especificado para dicha posición. Por ejemplo, se puede sustituir un residuo deletéreo en favor de cualquier otro residuo, tal como un residuo preferente tal como se define en la tabla IV; sustituir un residuo menos deletéreo por un residuo preferente tal como se define en la tabla IV; o sustituir un residuo preferente original por otro residuo preferente tal como se define en la tabla IV. Las sustituciones pueden tener lugar en posiciones de anclaje primarias

o en otras posiciones de un péptido; véase, por ejemplo, la tabla IV.

Un variedad de referencias reflejan la técnica con respecto a la identificación y generación de epítopos en una proteína de interés, así como análogos de los mismos. Véanse, por ejemplo, documento WO 97/33602 a Chesnut y col.; Sette, lmmunogenetics 1999 50 (3-4): 201-212; Sette y col., J. lmmunoL 2001 166(2): 1389-1397; Sidney y col., Hum. lmmunol. 199758(1): 12-20; Kondo y col., lmmunogenetics 1997 45(4): 249-258; Sidney y col., J. lmmunol. 1996 157(8): 3480-90; y Falk y col., Nature 351: 290-6 (1991); Hunt y col, Science 255:1261-3 (1992); Parker y col.,

J. lmmunol. 149:3580-7 (1992); Parker y col., J. lmmunol. 152:163-75 (1994)); Kast y col., 1994 152(8): 3904-12; Borras-Cuesta y col., Hum. lmmunol. 2000 61(3): 266-278;Alexander y col.,J. lmmunol. 2000 164(3); 164(3): 16251633;Alexander y col., PMID: 7895164, UI: 95202582; O’Sullivan y col., J. lmmunol. 1991 147(8): 2663-2669; Alexander y col., lmmunity 1994 1(9): 751-761 y Alexander y col., lmmunol. Res. 1998 18(2): 79-92.

Los polipéptidos descritos pueden comprender combinaciones de los distintos motivos establecidos en la tabla XX y/o uno o varios de los epítopos CTL predichos de las tablas V-XVII y XXII, motivos de union celular conocidos en la técnica. Preferentemente, los polipéptidos no contienen inserciones, deleciones o sustituciones ni en los motivos ni en las secuencias de intervención de los polipéptidos. Además, los polipéptidos que incluyen una serie de residuos de aminoácidos N-terminales y/o C-terminales a ambos lados de estos motivos pueden ser deseables (para, por ejemplo, incluir una porción mayor de la arquitectura de los polipéptidos en la que el motivo esté localizado). Normalmente, el número de residuos de aminoácido N-terminales y/o C-terminales en ambos lados del motivo está entre aproximadamente 1 a aproximadamente 100 residuos de aminoácido, preferentemente de 5 a aproximadamente 50 residuos de aminoácido. Las proteínas relacionadas con 184P1E2 se realizan en muchas formas, preferentemente en forma aislada. Una molécula de proteína 184P1E2 purificada estará sustancialmente exenta de otras proteínas o moléculas que impartarn la unión de 184P1B2 al anticuerpo, linfocito T u otro ligando. La naturaleza y grado de aislamiento y purificación dependerá del uso que se pretenda. Las proteínas relacionadas con 184P1E2 incluyen proteínas relacionadas con 184P1E2 purificadas y proteínas relacionadas con 184P1E2 solubles funcionales. En un caso, una proteína 184P1E2 soluble funcional o un fragmento de la misma retiene la capacidad de unirse al anticuerpo, al linfocito T o a otro ligando.

También se describen proteínas 184P1E2 que comprenden fragmentos biológicamente activos de una secuencia de aminoácidos de 184P1E2 que se muestra en la figura 2 o en la figura 3. Dichas proteínas muestran propiedades de la proteína 184P1E2 inicial, tales como la capacidad de provocar la generación de anticuerpos que se unen específicamente a un epítopo asociado con la proteína 184P1E2 inicial; para unirse a dichos anticuerpos, para provocar la activación de HTL O CTL; y/o, para ser reconocidas por HTL o CTL que también se unen específicamente a la proteína inicial.

Los polipéptidos relacionados con 184P1E2 que contienen estrucuturas de interés particular pueden predecirse y/o identificarse usando diversas técnicas analíticas bien conocidas en la técnica, que incluyen, por ejemplo, los procedimientos de análisis de Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyle-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz o Jameson-Wolf, o sobre la base de la inmunogenicidad. Los fragmentos que contienen dichas estructuras son particularmente útiles para generar anticuerpos anti-184P1E2 específicos de subunidad, o linfocitos T o para identificar factores celulares que se unen a 184P1E2. Por ejemplo, pueden generarse perfiles de hidrofilicidad e identificarse fragmentos de péptidos inmunogénicos usando el procedimiento de Hopp, T.P. y Woods, K.R., 1981, Proc. NatI. Acad. Sci. Estados Unidos 78:3824-3828. Pueden generarse perfiles de hidropaticidad e identificarse fragmentos de péptidos inmunogénicos usando el procedimiento de Kyte, J. y Doolittle, R.F., 1982, J. Mol. BioL 151 :105-132. Pueden generarse perfiles de porcentaje (%) de residuos accesibles e identificarse fragmentos de péptidos inmunogénicos usando el procedimiento de Janin J., 1979, Nature 277:491 -492. Pueden generarse perfiles de flexibilidad promedio e identificarse fragmentos de péptidos inmunogénicos usando el procedimiento de Bhaskaran R., Ponnuswamy P.K., 1988, lnt. J. Pept. Protein Res. 32:242-255. Pueden generarse perfiles de giro beta e identificarse fragmentos de péptidos inmunogénicos usando el procedimiento de Deleage, G., Roux B., 1987, Protein Engineering 1:289-294.

Pueden determinarse epítopos CTL usando algoritmos específicos para identificar péptidos en una proteína 184P1E2 que sean capaces de unirse óptimamente a alelos HLA específicados (por ejemplo, usando el sitio de Internet SYFPEITHI con la URL syfpeithi.bmi-heidelberg.com/; los listados de la tabla IV(A)-(E); EpimatrixTM y EpimerTM, Brown University, URL (www.brown.edu/Research/TB-H IV_Lab/epimatrix/epimatrix.html); y BIMAS, URL bimas.dcrt. nih.gov/). Ilustrando esto, se predijeron los epítopos de péptidos 184P1E2 que están presentes en el contexto de moléculas de clase I de MHC humano, por ejemplo, HLA-A1, A2, A3, Ah, A24, B7 y B35 (véanse, por ejemplo, V-XVIII, XXII-Ll). Específicamente, la secuencia de aminoácidos completa de la proteína 184P1E2 y porciones relevantes de otras variantes, es decir, para predicciones de clase I de HLA de 9 residuos flanqueantes a ambos lados de una mutación puntual, para predicciones de HLA de clase II de 14 residuos flanqueantes a ambos lados de una mutación puntual, se introdujeron en un algoritmo de búsqueda de motivos de péptidos HLA que se encuentra en el sitio de Internet enumerado anteriormente de Bioinformatics and Molecular Analysis Section (BIMAS); además del sitio de Internet SYFPEITHI, en la URL syfpeithi.bmi-heidelberg.com/.

El algoritmo de búsqueda de motivos de péptidos HLA fue desarrollado por Dr. Ken Parker sobre la base de la unión de secuencias de péptidos específicas en la hendidura de moléculas HLA de clase I, en particular HLA-A2 (véase, por ejemplo, Falk y col., Nature 351:290-6 (1991); Hunt y col., Science 255:1261-3 (1992); Parker y col., J. lmmunol. 149:3580-7 (1992); Parker y col., J. lmmunol. 152: 163-75(1994)). Este algoritmo permite la localización y clasificación de péptidos octaméricos, nonaméricos y decaméricos a partir de una secuencia de proteína completa para predecir la unión a HLA-A2, así como de otras muchas moléculas de clase I de HLA. Muchos péptidos de unión a HLA de clase I tienen 8, 9, 10 u 11 aminoácidos. Por ejemplo, para HLA-A2 de clase I, los epítopos contienen preferentemente una leucina (L) o metionina (M) en la posición 2 y una valina (V) o leucina (L) en el extremo C terminal (véase, por ejemplo, Parker y col., J. lmmunol. 149:3580-7(1992)). Los resultados seleccionados de péptidos de unión predichos 184P1E2 se muestran en las tablas V-XVIII y XXII-Ll del presente documento. En las tablas V-XVIII y XXII-XLVII, se muestran candidatos seleccionados, nonaméricos y decaméricos, para cada miembro de la familia, junto con su posición, la secuencia de aminoácidos de cada péptido específico y una puntuación de unión estimada. En las tablas XLVIII-LI, se muestran candidatos seleccionados, de quince aminoácidos, para cada miembro de la familia, junto con su posición, la secuencia de aminoácidos de cada péptido específico y una puntuación de unión estimada. La puntuación de unión corresponde a la mitad del tiempo estimado de disociación de complejos que contienen el péptido a 37 ºC a un pH de 6,5. Se ha predicho que los péptidos con la puntuación de unión más alta son los que se unen más estrechamente a HLA de clase I en la superficie celular durante un periodo de tiempo más prolongado y, de este modo, representan las mejores dianas inmunogénicas para el reconocimiento de linfocitos T.

Las unión real de péptidos a un alelo HLA puede evaluarse mediante la estabilización de la expresión de HLA sobre el antígeno que procesa la línea celular defectiva T2 (véase, por ejemplo, Xue y col., Prostate 30:73-8 (1997) y Peshwa y col., Prostate 36:129-38 (1998)). La inmunogenicidad de péptidos específicos puede evaluarse in vitro mediante estimulación de linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+ en presencia de células que presentan antígenos tales como células dendríticas.

Se puede apreciar que todos los epítopos predichos por el sitio de Internet de BIMAS, sitios de Internet de EpimerTM y EpimatrixTM, o especificados por los motivos HLA de clase I o de clase II disponibles en la técnica tal como se exponen en la tabla IV (o determinados usando el sitio de Internet con URL syfpeithi.bmi-heidelberg.com/, o de BIMAS, bimas.dcrt.nih.gov/) pueden aplicarse a una proteína 184P1E2. Tal como se usa en el presente contexto, aplicarse significa que una proteína 184P1E2 se evalúa, por ejemplo, visualmente o mediante procedimientos para hallar patrones sobre una base informática, tal como apreciarán los expertos en la técnica. En el presente documento se describe una proteína 184P1E2 de 8, 9, 10 u 11 residuos de aminoácido que porta un motivo HLA de clase I o una subsecuencia de 9 o más residuos de aminoácido que porta un motivo de HLA de clase II.

III.B.) Expresión de proteínas relacionadas con 184P1E2

Tal como se describe en los ejemplos siguientes, 184P1E2 puede expresarse convenientemente en células (tales como células 293T) transfectarse con un vector de expresión disponible comercialmente tal como el vector de exprsión CMV-driven que codifica 184P1E2 con una etiqueta C-terminal 6XHis y MYC (pcDNA3.1/mycHlS, Invitrogen o Tag5, GenHunter Corporation, Nashville, TN, Estados Unidos). El vector Tag5 proporciona una señal de secreción IgGK que puede usarse para facilitar la producción de una proteína 184P1E2 secretada en células trasfectadas. La 184P1E2 etiquetada con HIS secretada en el medio de cultivo puede purificarse usando, por ejemplo, una columna de níquel mediante procedimientos estándar.

III.C.) Modificaciones de proteínas relacionadas con 184P1E2

Las modificaciones de proteínas relacionadas con 184P1E2 tales como las modificaciones covalentes se describen en el presente apartado. Un tipo de modificaciones covalentes incluye hacer reaccionar residuos de aminoácido dirigidos de un polipéptido 184P1E2 con un agente de derivatización orgánico que sea capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o con los residuos N- o C-terminales de una proteína 184P1E2. Otro tipo de modificación covalente de un polipéptido 184P1E2 comprende alterar el patrón de glucosilación nativo de una proteína descrita en el presente documento. Otro tipo de modificación covalente de 184P1E2 comprende unir un polipéptido 184P1E2 a uno de entre diversos polímeros no proteináceos, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol, o polioxialquielnos, de una forma establecida en los documentos de patente de Estados Unidos Nº. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 ó 4.179.337.

Las proteínas relacionadas con 184P1E2 que se describen en el presente documento también pueden modificarse para formar una molécula quimérica que comprende 184P1E2 fusionada a otra, a un polipéptido heterólogo o a una secuencia de aminoácidos. Dicha molécula quimérica puede sintetizarse química o recombinantemente. Una molécula quimérica puede tener una proteína descrita en el presente documento fusionada a otro antígeno asociado a tumor o a un fragmento del mismo. Alternativamente, una proteína descrita en el presente documento puede comprender una fusión de fragmentos de una secuencia de 184P1E2 (aminoácidos o ácidos nucleicos) de tal modo que se crea una molécula que no es, a lo largo de toda su longitud, directamente homóloga a secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos que se muestra en la figura 2 o en la figura 3. Dicha molécula quimérica puede comprender múltiplos de la misma subsecuencia de 184P1E2. Una molécula quimérica puede comprender una fusión de una proteína relacionada con 184P1E2 con una etiqueta de epítopo de polihistidina que proporciona un epítopo al que se puede unir selectivamente níquel inmovilizado, con citocinas o con otros factores de crecimiento. La etiqueta de epítopo se sitúa generalmente en el extremo amino o carboxilo terminal de una proteína 184P1E2. Alternativamente, la molécula quimérica puede comprender una fusión de una proteína relacionada con 184P1E2 con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica (también denominada como “inmunoadhesina”), dicha fusión podría ser a una región Fc de una molécula IgG. Las fusiones Ig incluyen preferentemente la sustitución de una forma soluble (dominio transmembranal suprimido o inactivado) de un polipéptido 184P1E2 en lugar de al menos una región variable de una molécula Ig. Preferentemente, la fusión de inmunoglobulina incluye las regiones bisagra, CH2 y CH3, o las regiones bisagra, CH1, CH2 y CH3 de una molécula IgG1. Para la producción de fusiones de inmunoglobulina véase, por ejemplo, el documento de patente de Estados Unidos Nº 5.428.130 publicado el 27 de junio de 1995.

III.D.) Usos de proteínas relacionadas con 184P1E2

Las proteínas descritas en el presente documento tienen una serie de uso específicos diferentes. Ya que 184P1E2 se expresa de forma elevada en el cáncer de próstata y en otros tipos de cáncer, las proteínas relacionadas con 184P1E2 se usan en procedimientos que evalúan el estado de productos génicos de 184P1E2 en tejidos normales frente a tejidos carcerosos, elucidando de este modo el fenotipo del tumor maligno. Normalmente, los polipéptidos de regiones específicas de una proteína 184P1E2 se usan para evaluar la presencia de perturbaciones (tales como deleciones, inserciones, mutaciones puntuales, etc.) es estas regiones (tales como regiones que contienen uno o varios motivos). Los ejemplos de ensayos usan anticuerpos o linfocitos T dirigidos a proteínas relacionadas con 184P1B2 que comprenden los residuos de aminoácidos de uno o varios motivos biólogicos contenidos en una secuencia de polipéptido 184P1E2 con el fin de evaluar las características de esta región en tejidos normales frente a tejidos cancerosos o para provocar una respuesta inmunitaria al epítopo. Alternativamente, proteínas relacionadas con 184P1E2 que contienen los residuos de aminoácidos de uno o varios de los motivos biológicos en una proteína 184P1E2 se usan para seleccionar factores que interactúan con esa región de 184P1E2.

Los fragmentos/subsecuencias de proteína 184P1E2 son particularmente útiles para generar y caracterizar anticuerpos de dominio específico (por ejemplo, anticuerpos que reconocen un epítopo extracelular o intracellular de una proteína 184P1E2), para identificar agentes o factores celulares que se unen a 184P1E2 o a un dominio estructural particular de la misma, y, en varios contextos terapéuticos y diagnósticos, que incluyen pero no están limitados a, ensayos de diagnóstico, vacunas contra el cáncer y procedimiento de preparación de dichas vacunas.

Las proteínas codificadas por los genes 184P1E2 o por análogos, homólogos o fragmentos de los mismos, tienen diversos usos, que incluyen, pero no están limitados a, generar anticuerpos, y en procedimientos para identificar ligandos y otros agentes y constituyentes celulares que se unen a un producto génico 184P1E2. Los anticuerpos obtenidos contra una proteína 184P1E2 o fragmento de la misma son útiles en ensayos de diagnóstio y pronóstico, y metodologías de imagen en la gestión de tipos de cáncer humanos caracterizados por la expresión de proteína 184P1E2, como los enumerados en la tabla I. Dichos anticuerpos pueden expresarse intracelularmente y usarse en procedimientos de tratamiento de pacientes que padecen dichos tipos de cáncer. Los ácidos nucleicos o proteínas relacionados con 184P1E2 se usan también en la generación de respuestas de HTL o CTL.

Se usan diversos ensayos inmunológicos útiles para la detección de proteínas 184P1E2, que incluyen pero no están limitados a varios tipos de radioinmunoensayos, ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), ensayos inmunofluorescentes ligados a enzimas (ELIFA), procedimientos inmunocitoquímicos y similares. Pueden etiquetarse y usarse anticuerpos como reactivos inmunológicos capaces de detectar células de expresión de 184P1E2 (por ejemplo, en procedimientos de imagen radioescintigráficos). Las proteínas 184P1E2 también son particularmente útiles en la generación de vacunas contra el cáncer, tal como se describe más adelante en el presente documento.

IV.) Anticuerpos 184P1E2

En el presente apartado se describen anticuerpos que se unen a proteínas relacionadas con 184P1E2. Los anticuerpos preferentes se unen específicamente a una proteína relacionada con 184P1E2y no se unen (o se unen débilmente) a péptidos o proteínas que no están relacionadas con 184P1E2. Por ejemplo, los anticuerpos que se unen a 184P1E2 pueden unirse a proteínas relacionadas con 184P1E2 tales como homólogos o análogos de la misma.

Los anticuerpos 184P1E2 que se describen en el presente apartado son particularmente útiles en ensayos de diagnóstico y pronóstico de cáncer (véase, por ejemplo, la tabla I) y metodologías de imagen. De forma similar, dichos anticuerpos son útiles en el tratamiento, diagnóstico y/o pronóstico de otros tipos de cáncer, en la medida en que también se exprese o sobreexprese 184P1E2 en estos otros tipos de cáncer. Además, los anticuerpos expresados intracelularmente (por ejemplo, anticuerpos monocatenarios) son terapéuticamente útiles para el tratamiento de tipos de cáncer en los que esté implicada la expresión de 184P1E2, tales como tipos de cáncer de próstata avanzado o metastático.

También se describen diversos ensayos inmunológicos útiles para la detección y cuantificación de 184P1E2 y proteínas relacionadas con 184P1E2 mutantes. Dichos ensayos pueden comprender uno o varios anticuerpos 184P1E2 capaces de reconocer y unirse a proteínas relacionadas con 184P1E2, como sea apropiado. Estos ensayos se realizan en varios formatos de ensayo inmunológico bien conocidos en la técnica, que incluyen pero no están limitados a, diversos tipos de radioinmunoensayos, ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), ensayos inmunofluorescentes ligados a enzimas (ELIFA) y similares.

Los ensayos inmunológicos de no anticuerpos también comprenden ensayos de inmunogenicidad de linfocitos T (inhibitorio o estimulatorio), así como ensayos de unión de complejo de histocompatibilidad principal (MHC).

Además, también se describen procedimientos inmunológicos de imagen capaces de detectar cancer de próstata y otros tipos de cáncer que expresan 184P1E2, que incluyen, pero no están limitados a procedimientos de imagen radioescintigráficos usando anticuerpos 184P1E2 etiquetados. Dichos ensayos son clínicamente útiles en la deteccion, seguimiento y pronóstico de tipos de cáncer que expresan 184P1E2 tales como el cáncer de próstata.

Los anticuerpos 184P1E2 también se usan en procedimientos para purificar una proteína relacionada con 184P1E2 y para aislar homólogos de 184P1E2 y moléculas relacionadas con 184P1E2. Por ejemplo, un procedimiento para purificar una proteína relacionada con 184P1E2 comprende incubar un anticuerpo 184P1E2 que se ha acoplado a una matriz sólida, con un lisado u otra solución que contiene una proteína relacionada con 184P1E2 en condiciones que permitan al anticuerpo 184P1E2 unirse a la proteína relacionada con 184P1E2; lavar la matriz sólida para eliminar impurezas; y eludir la proteína relacionada con 184P1E2 del anticuerpo acoplado. Otros usos de anticuerpos 184P1E2 incluyen generar anticuerpos intidiotípicos que imitan una proteína 184P1E2.

Se conocen bien en la técnica diversos procedimientos para la preparación de anticuerpos. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos inmunizando un huésped mamífero usando una proteína, un péptido o un fragmento relacionados con 184P1E2, en forma aislada o inmunoconjugada (Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, Eds., Harlow, y Lane (1988); Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, NY (1989)). Además, la fusión de proteínas de 184P1E2 también puede usarse, tal como una proteína de fusión GST 184P1E2. En una realización particular, se produce una proteína de fusión GST que comprende toda o la mayor parte de la secuencia de aminoácidos de la figura 2 ó la figura 3, usándose después como inmunógeno para generar anticuerpos apropiados. En otra realización, una proteína relacionada con 184P1E2 se sintetiza y se usa como inmunógeno.

Además, se usan técnicas de inmunización de ADN desnudo conocidas en la técnica (con o sin proteína relacionada con 184P1E2 purificada o células que expresan 184P1E2) para generar una respuesta inmunitaria a un inmunógeno codificado (para revisión, véase Donnelly y col., 1997, Ann. Rev. Immunol. 15:617-648).

La secuencia de aminoácidos de una proteína 184P1E2 tal como se muestra en la figura 2 o en la figura 3 puede analizarse para seleccionar regiones específicas de la proteína 184P1E2 para generar anticuerpos. Por ejemplo, los análisis de hidrofobicidad e hidrofilicidad de una secuencia de aminoácidos de 184P1E2 se usan para identificar regiones hidrofílicas en la estructura 184P1E2. Pueden identificarse fácilmente regiones de una proteína 184P1E2 que muestran estructura inmunógena, así como otras regiones y dominios, usando otros varios procedimientos conocidos en la técnica, tales como los análisis de Chou-Fasman, Gamier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz o Jameson-WoIf. Los perfiles de hidrofilicidad pueden generarse usando el procedimiento de Hopp,

T.P. y Woods, K.R., 1981, Proc. NatI. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824-3828. Los perfiles de hidropaticidad pueden generarse usando el procedimiento de Kyte, J. y Doolittle, R.F., 1982, J. Mol. BioL 157:105-1 32. Los perfiles de procentaje (%) de residuos accesibles pueden generarse usando el procedimiento de Janin J., 1979, Nature 277:491-492. Los perfiles de flexibilidad promedio pueden generarse usando el procedimiento de Bhaskaran R., Ponnuswamy P.K., 1988, Int. J. Pept Protein Res. 32:242-255. Los perfiles de giro beta pueden generarse usando el procedimiento de Deleage, G., Roux B., 1987, Protein Engineering 1:289-294. De este modo, se describe en el presente documento cada región identificada por cualquiera de estos programas o procedimientos. Los procedimientos para la generación de anticuerpos 184P1E2 se ilustran posteriormente mediante los ejemplos que se proporcionan en el presente documento. Los procedimientos para preparar una proteína o polipéptido para usar como inmunógeno son bien conocidos en la técnica. También son bien conocidos en la técnica procedimientos para preparar conjugados inmunógenos de una proteína con un vehículo, tal como BSA, KLH u otra proteína vehículo. En algunas circunstacias, se usa la conjugación directa usando, por ejemplo, reactivos de carbodiimidas; en otras circunstancias son eficaces reactivos de unión tales como los suministrados por Pierce Chemical Co., Rockford, IL, Estados Unidos. La administración de un inmunógeno 184P1E2 se realiza a menudo mediante inyección durante un periodo de tiempo adecuado y con el uso de un coadyuvante adecuado, tal como se entiende en la técnica. Durante el programa de inmunización pueden tomarse valoraciones y anticuerpos para determinar la adecuación de la formación del anticuerpo.

Pueden producirse anticuerpos monoclonales 184P1E2 por medio de varios procedimientos bien conocidos en la técncia. Por ejemplo, líneas celulares inmortalizadas que secretan un anticuerpo monoclonal deseado se preparan usando la tecnología del hibridoma estándar de Kohles y Milstein o modificaciones que inmortalizan células B productoras de anticuerpos, como se conoce en general. Las líneas célulares inmortalizadas que secretan los anticuerpos deseados se criban mediante inmunoensayo en el que el antígeno es una proteína relacionada con 184P1E2. Cuando se identifica el cultivo celular inmortalizado apropiado, las células pueden expandirse y producirse los anticuerpos bien a partir de cultivos in vitro o bien a partir de fluido ascítico.

Los anticuerpos o fragmentos pueden producirse por medios recombinantes. También pueden producirse regiones que se unen específicamente a las regiones deseadas de la proteína 184P1E2 en el contexto anticuerpos con regiones quiméricas o determinantes de la complementariedad (CDR) injertadas de múltiples especies originales. También pueden producirse anticuerpos 184P1E2 humanos o humanizados, y se prefieren para su uso en contectos terapéuticos. Los procedimientos para humanizar anticuerpos murinos o no humanos de otro tipo, sustituyendo una

o varias de las CDR del anticuerpo no humano por secuencias de anticuerpo no humano correspondientes, son bien conocidos (véase, por ejemplo, Jones y col. 1986, Nature 321 : 522-525; Riechmann y col., 1988, Nature 332: 323327; Verhoeyen y col., 1988, Science 239: 1534-1 536). Véase también, Carter y col., 1993, Proc. NatL Acad. Sci. USA 89: 4285 y Sims y col., 1993, J. Immunol. 151: 2296.

Los procedimientos para producer anticuerpos monoclonales totalmente humanos incluyen procedimientos de presentación en fagos y procedimientos transgénicos (para revisión, véase Vaughan y col., 1998, Nature Biotechnology 16: 535-539). Pueden generarse anticuerpos monoclonales 184P1E2 totalmente humanos usando tecnologías de clonación que usan colecciones combinatorias de genes Ig humanos grandes (por ejemplo, presentación en fagos) (Griffiths y Hoogenboom, Building an in vitro immune system: human antibodies from phage display libraries. In: Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic and Therapeutic Applications in Man, Clark, M. (Ed.), Nottingham Academic, páginas 45-64 (1993); Burton y Barbas, Human Antibodies from combinatorial libraries. Id., páginas 65-82). También pueden producirse anticuerpos monoclonales 184P1E2 usando ratones transgénicos diseñados para contener loci génicos de inmunoglobulina humana tal como se describe en la solicitud de patente PCT W098/24893, Kucherlapati y Jakobovits y col., publicada el 3 de diciembre de 1997 (véase también Jakobovits, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs 7(4): 607-614; documentos de patente de Estados Unidos Nº 6.162.963, publicado el 19 de diciembre de 2000; 6.150.584, publicado el 12 de noviembre de 2000; y 6.114.598, publicado el 5 de septiembre de 2000). Este procedimiento evita la manipulación in vitro requerida con tecnología de presentación en fagos y produce de forma eficaz anticuerpos humanos auténticos de alta afinidad.

La reactividad de anticuerpos 184P1E2 con una proteína relacionada con 184P1E2 puede establecerse mediante una serie de medios bien conocidos, que incluyen inmunotransferencia (Western), inmunoprecipitación, ELISA y análisis FACS usando, si es apropiado, proteínas relacionadas con 184P1E2, células que expresan 184P1E2o extractos de las mismas. Un anticuerpo 184P1E2 o un fragmento del mismo puede etiquetarse con un marcador detectable o conjugarse con una segunda molécula. Los marcadores detectables adecuados incluyen, pero no están limitados a, un isótopo radioactivo, un compuestos fluorescente, un compuestos bioluminiscente, un compuestos quimioluminiscente, un metal quelante o una enzima. Además, se generan anticuerpos específicos para dos o más epítopos 184P1E2 usando procedimientos conocidos, en general, en la técnica. Pueden generarse también anticuerpos homodiméricos mediante técnicas de reticulación conocidas en la técnica (por ejemplo, Wolff y col., Cancer Res. 53: 2560-2565).

V.) Respuestas inmunitarias celulares 184P1E2

Se ha esbozado el mecanismo por el que los linfocitos T reconocen antígenos. Las composiciones de vacuna de epítopo de péptidos eficaces que se describen en el presente documento inducen a respuestas inmunitarias terapéuticas o profilácticas en segmentos muy amplios de la población mundial. Para entender el valor y la eficacia de dichas composiciones que inducen respuestas inmunitarias celulares, se proporciona una revisión breve de la tecnología relacionada con inmunología.

Un complejo de una molécula HLA y un antígeno peptídico actúan con el ligando que reconocen los linfocitos T restringidos por HLA (Buus, S. y col., Cell 47:1071, 1986; Babbitt, B. P. y col., Nature 31 7:359, 1985; Townsend, A. y Bodmer, H., Annu. Rev. Immunol. 7:601, 1989; Germain, R. N., Annu. Rev. Immunol. 11:403, 1993). Mediante el estudio de análogos de antígeno sustituidos con aminoácidos sencillos y la secuenciación de enlace de forma endógena, se han identificado péptidos procesados de forma natural, residuos críticos que corresponden a motivos requeridos para la unión específica a moléculas de antígeno HLA y se han establecido en la tabla IV (véase también, por ejemplo, Southwood y col., J. Immunol. 160:3363,1998; Rammensee y col., Immunogenetics 41:178, 1995; Rammensee y col., SYFPEITHI, aceso por Internet en la URL syfpeitbi.bmi-heidelberg.com/; Sette, A. y Sidney, J. Curr. Opin. Immunol. 10:478, 1998; Engelhard, V. H., Curr. Opin. Immunol. 6:13, 1994; Sette, A. y Grey, H. M., Curr. Opin. Immunol. 4:79,1992; Sinigaglia, F. y Hammer, J. Curr. Biol. 6:52, 1994; Ruppertetal., Cell 74:929-937, 1993; kondo y col., J. Immunol. 155:4307-4312, 1995; Sidney y col., J. Immunol. 157:3480-3490,1996; Sidney y col., Human Immunol. 45:79-93,1 996; Sette, A. y Sidney, J.lmmunogenetics 1999 Nov; 50(3-4):201-12, Review).

Además, los análisis cristalográficos por rayos X de complejos HLA-péptido han revelado bolsillos dentro de la hendidura/ranura de unión de las moléculas de HLA que acomodan, de un modo específico de alelo, residuos transmitidos por ligandos peptídicos; estos residuos deteminan, a su vez, la capacidad de unión a HLA de los péptidos en los que están presentes. (Véase, por ejemplo, Madden, D.R. Annu. Rev. Immunol. 13:587,1995; Smith y col., Immunity 4:203, 1996; Fremont y col., Immunity 8:305, 1998; Stern y col., Structure 2:245, 1994; Jones, E.Y. Curr. Opin. Immunol. 9:75, 1997; Brown, J. H. y col., Nature 364: 33, 1993; Guo, H. C. y col., Proc. NatI. Acad. Sci. USA 90:8053, 1993; Guo, H. C. y col., Nature 360:364, 1992; Silver, M. L. y col., Nature 360:367, 1992; Matsumura,

M. y col., Science 257:927, 1992; Madden y col., Cell 70:1035, 1992; Fremont, D. H. y col., Science 257:919, 1992; Saper, M. A. , Bjorkman, P. J. y Wiley, D. C., J. Mol. Biol. 219:277,1991.)

En consecuencia, la definición de motivos de unión de HLA específicos de alelos de clase I y clase II, o supermotivos de clase I o clase II permite la identificación de regiones dentro de una proteína que están correlacionadas con la unión a un(os) antígeno(s) de HLA particular(es).

De este modo, mediante un proceso de identificación de motivo de HLA, se han identificado candidatos para vacunas a base de epítopos; dichos candidatos pueden evaluarse posteriormente mediante ensayos de unión HL— péptido para determinar la afinidad de unión y/o el periodo de tiempo de asociación del epítopo y su molécula HLA correspondiente. Puede realizarse un trabajo de confirmación adicional para seleccionar, entre estos candidatos a vacuna, epítopos con características preferentes en términos de cobertura de la población y/o inmunogenicidad.

Pueden usarse diversas estrategias para evaluar la inmunogenicidad celular, que incluyen:

1) Evaluación de cultivos de células T primarias procedentes de individuos normales (véase, por ejemplo, Wentworth, P. A. y col., Mol. Immunol. 32:603, 1995; Cells, E. y col., Proc. NatI. Acad. Sci. USA 91:2105, 1994; Tsai,

V. y col., J. Immunol. 158:1796, 1997; Kawashima, I. y col., Human Immunol. 59:1, 1998). Este procedimiento implica la estimulación de linfocitos sanguíneos periféricos (PBL) de sujetos normales conun péptido de ensayo en presencia de células que presentan antígeno in vitro durante un periodo de varias semanas. Durante este tiempo se produce la activación de las células T específicas para el péptido y se detectan usando, por ejemplo, un ensayo de liberación de linfocina o de 51Cr que implica a células diana sensibilizadas con péptidos.

2) Inmunización de ratones transgénicos a HLA (véase, por ejemplo, Wentworth, P. A. y col., J. Immunol. 26:97, 1996; Wentworth, P. A. y col., Int. Immunol. 8:651, 1996; Alexander, J. y col., J. Immunol. 159:4753, 1997). Por ejemplo, en dichos procedimientos se administran péptidos en coadyuvante de Freund incompleto de forma subcutánea a ratones transgénicos HLA. Varias semanas después de la inmunización, se retiran los esplenocitos y se cultiva in vitro en presencia de péptido de ensayo durante aproximadamente una semana. Las células T específicas de péptido se detectan usando un ensayo de liberación de 51Cr que implica a células diana sensibilizadas a péptidos y células diana que expresan antígeno generado de forma endógena.

3) Demostración de respuestas de células T de recuerdo de individuos inmunes que han sido vacunados eficazmente y/o de pacientes con enfermedad crónica (véase, por ejemplo, Rehermann, B. y col., J. Exp. Med. 181:1047, 1995; Doolan, D. L. y col., Immunity 7:97, 1997; Bertoni, R. y col., J. Clin. Invest. 100:503, 1997; Threlkeld,

S. C. y col., J. Immunol. 159: 1648, 1997; Diepolder, H. M. y col., J. Virol. 71:6011, 1997). En consecuencia, las respuestas de recuerdo se detectan cultivando PBL de sujetos que se han expuesto al antígeno por su enfermedad y, de este modo, han generado una respuesta inmunitaria de forma natural, o de pacientes que se han vacunado contra el antígeno. Los PBL de los sujetos se cultivan in vitro durante 1-2 semanas en presencia de células que presentan péptido de ensayo más antígeno (APL) para permitir la activación de células T de memoria, en comparación con células T sencillas. Al finalizar el periodo de cultivo, la actividad de las células T se detecta usando ensayos que incluyen dianas sensibilizadas con péptidos que implican la liberación de 51Cr, proliferación de células T

o liberación de linfocinas.

VI.) Animales transgénicos 184P1E2

También pueden usarse ácidos nucleicos que codifican una proteína relacionada con 184P1E2 para generar bien animales transgénicos o inactivarla en animales que, a su vez, son útiles en el desarrollo y la selección de reactivos terapéuticamente útiles. De acuerdo con técnicas establecidas, pueden usarse ADNc que codifica 184P1E2 para clonar ADN genómico que codifica 184P1E2. Las secuencias genómicas clonadas pueden usarse después para generar animales transgénicos que contienen células que expresan ADN que codifica 184P1E2. Los procedimientos para generar animals transgénicos, en particular animales tales como ratones o ratas, se han vuelto convencionales en la técnica y se describen, por ejemplo, en los documentos de patente de Estados Unidos Nº 4.736.866, publicado el 12 de abril de 1988 y 4.870.009, publicado el 26 de septiembre de 1989. Normalmente, se dirigirían células particulares para su incorporación en el transgén 184P1E2 con potenciadores específicos de tejido.

Pueden usarse animales transgénicos que incluyen una copia de un transgén que codifica 184P1E2 para examinar los efectos de la expresión aumentada de ADN que codifica 184P1E2. Dichos animales pueden usarse como animales examinadores para reactivos que se piensa que confieren protección de, por ejemplo, afecciones patológicas asociadas para su sobreexpresión. Un animal se trata con un reactivo y una incidencia reducida de una afección patológica, en comparación con animales no tratados que portan el transgén, indicaría una intervención terapéutica potencial para la afección patológica.

Alternativamente, pueden usarse homólogos no humanos de 184P1E2 para construir un animal con 184P1E2 inactivada que tenga un gen defectuoso o alterado que codifique 184P1E2 como resultado de una recombinación homóloga entre el gen endógeno que codifica 184P1E2 y el ADN genómico alterado que codifica 184P1E2 introducido en una célula embrionaria del animal. Por ejemplo, puede usarse ADNc que codifique 184P1E2 para clonar ADN genómico que codifique 184P1E2 según técnicas establecidas. Puede suprimirse o reemplazarse por otro gen una porción del ADN genómico que codifica 184P1E2, tal como un gen que codifique un marcador seleccionable que pueda usarse para llevar un seguimiento de la integración. Normalmente, se incluyen varias kilobases de ADN flanqueante no alterado (tanto en el extremo 5’ como en el 3’) en el vector (véase, por ejemplo, Thomas y Capecchi, Cell, 51:503 (1987) para una descripción de vectores de recombinación homólogos). El vector se introduce en una línea cellular madre embrionaria (por ejemplo, por electroporación) y se seleccionan células en las que el ADN introducido se ha recombinado de forma homóloga con el ADN endógeno (véase, por ejemplo, Li y col., Cell, 69:915 (1992)). Las células seleccionadas se inyectan después a un blastocisto de un animal (por ejemplo, un ratón o una rata) para formar quimeras de agregación (véase, por ejemplo, Bradley, en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, Reino Unido, 1987), páginas 113152). Un embrión quimérico puede implantarse después en un animal adoptivo hembra seudopreñada, y el embrión llevado a su término para crear una progenie del animal inactivada que alojan el ADN recombinado de forma homóloga en sus células germinales puede identificarse mediante técnicas estándar y usarse para criar animales en los que todas las células del animal contengan el ADN recombinado de forma homóloga. Los animales inactivados pueden caracteriazarse, por ejemplo, por su capacidad para defenderse contra determinadas afecciones patológicas

o por el desarrollo de afecciones patológicas debido a la ausencia de polipéptidos 184P1E2.

VII.) Procedimientos para la detección de 184P1E2

También se describen en el presente documento procedimientos para detector polinucleótidos 184P1E2 y proteínas relacionadas con 184P1E2, así como procedimientos para identificar una célula que expresa 184P1E2. El perfil de expresión de 184P1E2 lo hace un marcador de diagnóstico para enfermedad metastatizada. En consecuencia, el estado de productos génicos 184P1E2 proporciona información útil para predecir diversos factores que incluyen susceptibilidad a la enfermedad en estado avanzado, velocidad de la progresión y/o agresividad del tumor. Tal como se ha expuesto en detalle en el presente documento, el estatus de los productos del gen 184P1E2 en muestras de pacientes puede analizarse mediante diversos protocolos que son bien conocidos en la técnica y que incluyen análisis inmunohistoquímico, la variedad de técnicas de inmunotransferencia (Northern) que incluyen hibridación in situ, análisis RT-PCT (por ejemplo sobre muestras microdiseccionadas de captura con láser), análsis de inmunotransferencia (Western) y análisis de haz de tejidos.

Más particularmente, se describen ensayos para la detección de polinucleótidos 184P1E2 en una muestra biológica, tal como suero, hueso, próstata y otros tejidos, orina, semen, preparaciones celulares y similares. Los polinucleótidos 184P1E2 detectables incluyen, por ejemplo, un gen 184P1E2 o un fragmento del mismo, ARNm de 184P1E2, ARNm de 184P1E2 variante de ayuste alternativo y moléculas de ADN o de ARN recombinante que contienen un polinucleótido 184P1E2. Se conocen bien en la técnica una serie de procedimientos para amplificar y/o detectar la presencia de polinucleótidos 184P1E2, y pueden usarse.

En un caso, un procedimeinto para detectar un ARNm de 184P1E2 en una muestra biológica comprende producir ADNc a partir de la muestra mediante transcripción inversa usando al menos un cebador; amplificar el ADNc producido de este modo usando polinucleótidos 184P1E2 como cebadores en sentido correcto y antisentido para amplificar ADNc de 184P1E2 en el mismo; y detectar la presencia del ADNc de 184P1E2 amplificado. Opcionalmente, puede determinarse la secuencia de ADNc de 184P1E2.

En otro caso, un procedimiento para detectar un gen 184P1E2 en una muestra biológica comprende primeramente aislar ADN genómico de la muestra; amplificar el ADN genómico aislado usando polinucleótidos 184P1E2 como cebadores en sentido correcto y antisentido; y detectar la presencia del gen 184P1E2 amplificado. Puede diseñarse cualquier serie de combinaciones de muestra en sentido correcto y antisentido de una secuencia de nucleótido 184P1E2 (véase, por ejemplo, la figura 2) y usarse para este propósito.

Se describen, además, ensayos para detectar la presencia de una proteína 184P1E2 en un tejido u otra muestra biolígica tal como suero, semen, hueso, próstata, orina, preparaciones celulares y similares. Los procedimientos para detectar una proteína relacionada con 184P1E2 son bien conocidos en la técnica en incluyen, por ejemplo, inmunoprecipitación, análisis inmunohistoquímico, análisis de inmunotransferencia (Western), ensayos de unión molecular, ELIS, ELIFA y similares. Por ejemplo, un procedimiento para detectar la presencia de una proteína relacionada con 184P1E2 en una muestra biológica comprende primeramente poner en contacto la muestra con un anticuerpo 184P1E2, un fragmento del mismo reactivo con 184P1E2 o una proteína recombinante que contiene una región de unión al antígeno de un anticuerpo 184P1E2; y después, detectar la unión de la proteína relacionada con 184P1E2 en la muestra.

También se describen en el presente documento procedimientos para identificar una célula que expresa 184P1E2. En un caso, un ensayo para identificar una células que expresa un gen 184P1E2 comprende detectar la presencia de ARNm de 184P1E2 en la célula. Los procedimientos para la detección de ARNm particulares en células son bien conocidos en incluyen, por ejemplo, ensayos de hibridación usando sondas de ADN complementario (tales como la hibridación in situ usando robosondas de 184P1E2 etiquetadas, inmunotransferencia (Northern) y técnicas relacionadas) y diversos ensayos de amplificación de ácido nucleico (tales como RT-PCR usando cebadores complementarios específicos para 184P1E2 y otros procedimientos de detección de tipo amplificación, tales como, por ejemplo, ADN ramificado, SISBA, TMA y similares. (Alternativamente, un ensayo para identificar una célula que expresa un gen 184P1E2 comprende detectar la presencia de proteínas relacionadas con 184P1E2 en la célula o secretadas por la célula. Se conocen bien en la técnica diversos procedimientos para detectar proteínas y se usan para la detección de proteínas relacionadas con 184P1E2 y células que expresan proteínas relacionadas con 184P1E2.

El análisis de expresión de 184P1E2 también es útil como instrumento para identificar y evaluar agentes que modulan la expresión del gen 184P1E2. Por ejemplo, la expresión de 184P1E2 está regulada al alza significativamente en cáncer de próstata, y se expresa en los tipos de cáncer de los tejidos enumerados en la tabla I. La identificación de una molécula o agente biológico que inhibe la expresión o la sobreexpresión de 184P1E2 en células cancerosas tiene valor terapéutico. Por ejemplo, un agente de este tipo puede identificarse usando un análisis que cuantifique la expresión de 184P1E2 mediante RT-PCR, hibridación de ácidos nucleicos o unión al anticuerpo.

VIII.) Procedimientos para supervisar el estado de genes relacionados con 184P1E2 y sus productos

Se sabe que la oncogénesis es un proceso de varias etapas en el que el crecimiento celular se vuelve progresivamente disregulado y las células progresan de un estado fisiológico normal a uno precanceroso y, después, a estados cacerosos (véase, por ejemplo, Alers y col., Lab Invest. 77(5): 437-438(1997) e lsaacs y col., Cancer Surv. 23: 19-32(1995)). En este contexto, el examen de una muestra biológica para evidenciar el crecimiento celular disregulado (tal como la expresión aberrante de 184P1E2 en tipos de cáncer) permite la detección temprana de dicha fisiología aberrante, antes de que un estado patológico como el cáncer haya progresado a un estado en el que las opciones terapéuticas estén más limitadas y o la pronóstico sea peor. En dichos exámenes, el estado de 184P1E2 en una muestra biológica de interés puede compararse, por ejemplo, con el estado de 184P1E2 en una muestra normal correspondiente (por ejemplo, una muestra de ese individuo o, alternativamente, de otro individuo que no esté afectado por una patología). Una alteración en el estado de 184P1E2 en la muestra biológica (en comparación con la muestra normal) proporciona evidencias del crecimiento celular disregulado. Además de usar una muestra biológica que no está afectada por una patología, tal como una muestra normal, también se puede usar un valor normativo predeteminado tal como un nivel normal predeterminado de expresión de ARNm(véase, por ejemplo, Grever y col., J. Comp.Neurol. 9 de diciembre de 1996; 376(2): 306-14 y el docuemento de patente de Estados Unidos Nº 5.837.501) para comparar el estado de 184P1E2 en una muestra.

El término “estado” se usa en el presente contexto según su significado aceptado en la técnica, y se erfiere a la condición o estado de un gen y de sus productos. Normalmente, los expertos usan una serie de parámetros para evaluar la condición o el estado de un gen y de sus productos. Estos incluyen, pero no están limitados a, la localización de los productos génicos expresados (incluida la localización de células de expresión de 184P1E2). Así como el nivel y la actividad biológica de los productos génicos expresados (tales como ARNm de 184P1E2, polinucleótidos y polipéptidos 184P1E2). Normalmente, una alteración del estado de 184P1E2 comprende un cambio en la localización de 184P1E2 y/o de las células que expresan 184P1E2 y/o un aumento de ARNm de 184P1E2 y/o expresión de proteína 184P1E2.

El estado de 184P1E2 en una muestra puede analizarse mediante una serie de medios bien conocidos en la técnica, que incluyen, sin limitación, análisis inmunohistoquímico, hibridación in situ, análsis RT-PCR sbre muestras microdiseccionadas de captura con láser, análisis de inmunotransferencia (Western) y análisis de haz de tejidos. Los protocolos típicos para evaluar el estado de un gen 184P1E2 y sus productos génicos se encuentran, por ejemplo en Ausubel y col. eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology, unidades 2 (Northern Blotting), 4 (Southern Blotting), 15 (Immunoblotting) y 18 (PCR Analysis). De este modo, el estado de 184P1E2 en una muestra biológica se evalúa por medio de diversos procedimientos usados por los expertos, que incluyen, pero no están limitados a, análisis de inmunotransferencia (Souther) genómico (para examinar, por ejemplo, perturbaciones en un gen 184P1E2), análisis de inmunotransferencia (Northern) y/o análisis PCR de ARNm de 184P1E2 (para examinar, por ejemplo, alteraciones en las secuencias de polinucleótidos o niveles de expresión de ARNm de 184P1E2) e inmunotransferencia (Western) y/o análisis inmunohistoquímico (para examinar, por ejemplo, alteraciones en secuencias de polipéptidos, alteraciones en la localización de polipéptidos dentro de una muestra, alteraciones en los niveles de expresión de proteínas 184P1E2 y/o asociaciones de proteínas 184P1E2 con asociados de unión polipeptídicos). Los polinucleótidos 184P1E2 detectables incluyen, por ejemplo, un gen 184P1E2 o fragmento del mismo, ARNm de 184P1E2, variantes de ayuste alternativo, varios ARNm de 184P1E2 y moléculas de ADN o ARN recombinante que contienen polinucleotidos 184P1E2.

El perfil de expresión de 184P1E2 lo hace un marcador diagnóstico para enfermedad local y/o metastizada, y proporciona información sobre el crecimiento o potencial oncogénico de una muestra biológica. En particular, el estado de 184P1E2 proporciona información útil para predecir susceptibilidad a una etapa particular de la enfermedad, la progresión y/o la agresividad del tumor. En el presente documento se describen procedimientos y ensayos para determinar el estado de 184P1E2 y tipos de cáncer de diagnóstico que expresan 184P1E2, tales como los tipos de cáncer de los tejidos enumerados en la tabla L. Por ejemplo, debido a que el ARNm de 184P1E2 está expresado de forma tan elevada en cáncer de próstata y en otros tipos de cáncer con relación al tejido de próstata normal, pueden usarse ensayos para evaluar los niveles de trásncritos de ARNm de 184P1E2 o proteínas 184P1E2 en una muestra biológica para diagnosticar una enfermedad asociada con la disregulación de 184P1E2 y puede proporcionarse información de pronóstico útil para definir opciones terapéuticas apropiadas.

El estado de expresión de 184P1E2 proporciona información que incluye la presencia, etapa y localización de células displásticas, precancerosas y cancerosas, precedir susceptibilidad a varias etapas de la enfermedad y/o evaluar la agresividad del tumor. Además, el perfil de expresión lo hace útil como reactivo de imagen para la enfermedad metastatizada. En consecuencia, el aspecto descrito está dirigido a los diversos procedimientos de pronóstico y diagnóstico molecular para examinar el estado de 184P1E2 en muestras biológicas tal como los individuos que padecen de, o son sospechosos de padecer de, una patología caracterizada por un crecimiento celular disregulado, tal como cáncer.

Tal como se ha descrito anteriormente, el estaod de 184P1E2 en una muestra biológica puede examinarse usando una serie de procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo el estado de 184P1E2 en una muestra biológica tomada de una localización específica del organismo puede examinarse para evaluar la presencia o ausencia de células que expresan 184P1E2 (por ejemplo, las que expresan ARNm o proteínas 184P1E2) en la muestra. Este examen pueden proporcionar evidenacias de crecimiento celular disregulado, por ejemplo, si las células que expresan 184P1E2 se encuentran en una muestra biológica que normalmente no contiene dichas células (tales como ganglios linfáticos), debido a que dichas alteraciones en el estado de 184P1E2 en una muestra biológica están asociadas frecuentemente con el crecimiento celular disregulado. Específicamente, un indicador del crecimiento celular disregulado es la metástasis de células cancerosas desde un órgano de origen (tal como la próstata) a una zona diferente del organismo (tal como ganglios linfáticos). En este contexto, la evidencia de un crecimiento celular disregulado es importante, por ejemplo, porque puede detectarse la metástasis de ganglios linfáticos oculta en una proporción sustancial de pacientes con cáncer de próstata, y dicha metástasis está asociada con indicadores conocidos de progresión de la enfermedad (véase, por ejemplo, Murphy y col., Prostate 42(4): 315317 (2000); Su y col., Semin. Surg. Oncol. 18(1): 17-28 (2000) y Freeman y col., J Urol 1995 agosto 154(2 Pt 1):4748).

En el presente documento se describen procedimientos para supervisar los productos génicos de 184P1E2 deteminando el estado de los productos génicos de 184P1E2 expresados por células de un individuo sospechoso de tener una enfermedad asociada con un crecimiento celular disregulado (tal como hiperplasia o cáncer) y, después, comparando el estado determinado de este modo el estado de los productos génicos de 184P1E2 en una muestra normal correspondiente. La presencia de productos génicos de 184P1E2 aberrantes en la muestra de ensayo con relación a la muestra normal proporciona una indicación de la presencia de crecimiento celular disregulado dentro de la células del individuo.

También se describen en el presente documento ensayos útiles para determinar la presencia de cáncer en un individuo, que comprende la detección de un aumento significativo de la expresión de ARNm o proteína 184P1E2 en una célula de ensayo o muestra de tejido con relación a los niveles de expresión en la célula o tejido normal correspondiente. La presencia de ARNm 184P1E2 puede evaluarse, por ejemplo, en tejidos que incluyen, pero no están limitados a, los enumerados en la tabla I. La presencia de expresión de 184P1E2 significativa en cualquiera de estos tejidos es útil para indicar la emergencia, presencia y/o gravedad de un cáncer, ya que los tejidos normales correspondientes no expresan ARNm de 184P1E2 o lo expresan en niveles más reducidos.

En un caso relacionado, el estado de 184P1E2 se determina en el nivel de proteína más que en el nivel de ácido nucleico. Por ejemplo, un procedimiento de este tipo comprende determinar el nivel de proteína 184P1E2 expresado por las células en una muestra de tejido de ensayo y comparar el nivel determinado de este modo con el nivel de 184P1E2 expresado en una muestra normal correspondiente. En un caso, la presencia de proteína 184P1E2 se evalúa, por ejemplo, usando procedimeintos inmunohistoquímicos. Los anticuerpos 184P1E2 o los asociados de unión capaces de detectar la expresión de proteínas 184P1E2 se usan en diversos formatos de ensayo bien conocidos en la técnica para estos fines.

En otro caso más, se puede evaluar el estado de secuencias de nucleótidos y aminoácidos de 184P1E2 en una muestra biológica con el fin de identificar perturbaciones en la estructura de estas moléculas. Estas perturbaciones pueden incluir inserciones, deleciones, sustituciones y similares. Dichas evaluaciones son útiles porque las preturbaciones en las secuencias de nucleótidos y aminoácidos se observan en un número elevado de proteínas asociadas con un fenotipo disregulado de crecimiento (véase, por ejemplo, Marrogi y col., 1999, J. Cutan. Pathol. 26(8):369-378). Por ejemplo, una mutación en la secuencia de 184P1E2 puede indicar la presencia o promoción de un tumor. Dichos ensayos, por lo tanto, tienen valor diagnóstico y predictivo, ya que una mutación en 184P1E2 indica una pérdida de potencial de funcionamiento o un aumento en el crecimiento del tumor.

Son bien conocidos en la técnica una amplia variedad de ensayos para observar perturbaciones en secuencias de nucleótidos o aminoácidos. Por ejemplo, el tamaño y estructura de secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de productos génicos de 184P1E2 se observan mediante inmunotransferencia (Northern, Southern, Western), PCR y protocolos de secuenciación de ADN expuestos en el presente documento. Además, se conocen bien en la técnica otros procedimientos para observar perturbaciones en secuencias de nucleótidos y de aminoácidos tales como análidos de polimorfismo de conformación monocatenario (véanse, por ejemplo, los documentos de patente de Estados Unidos Nº 5.382.510, publicado el 7 de septiembre de 1999, y 5.952.170, publicado el 17 de enero de 1995).

Adicionalmente, se puede examinar el estado de metilación de un gen 184P1E2 en una muestra biológica. La desmetilación aberrante y/o hipermetilación de islas CpG en las regiones regulatorias 5' del gen tiene lugar frecuentemente en células inmortalizadas y transformadas, y puede derivar en la expresión alterado de varios genes. Por ejemplo, el promotor de hipermetilación de la clase pi glutatión 5-transferasa (una proteína expresada en próstata normal pero no expresada en > 90 % de carcinomas de próstata) parece que silencia permanentemente la transcripción de este gen y es la alteración genómica que se detecta con mayor frecuencia en carcinomas de próstata. (De Marzo y col., Am. J. PathoL 155(6): 1985-1992 (1999)). Además, esta alteración está presente en al menos el 70 % de casos de neoplasia intraepitelial prostática (PIN) de alto grado (Brooks y col., Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 1998, 7:531-536). En otro ejemplo, la expresión del gen específico de tumor LAGE-l (que no se expresa en próstata normal pero sí que se expresa en el 25-50 % de los cánceres de próstata) está inducida por deoxi-azacitidina en células linfoblastoides, sugiriendo que la expresión tumoral se debe a la desmetilación (Lethe y col., Int J. Cancer 76(6): 903-908 (1998)). En la técnica se conocen bien diversos ensayos para examinar el estado de mutilación de un gen. Por ejemplo, se pueden usar, en enfoques de hibridación de Southern, enzimas de restricción sensibles a la metilación que no puedan escindir secuencias que contengan sitios CpG metilados para evaluar el estado de metilación de islas CpG. Además, MSP (PCR específica de metilación) puede perfilar el estado de metilación de todos los sitios CpG presentes en una isla CpG de un gen dado. Este procedimiento implica la modificación inicial de ADN mediante bisulfito de sodio (que convertirá todas las citosinas no metalidas en uracilos), seguida de amplicación usando cebadores específicos para ADN metilado frente a ADN no metilado. Pueden encontrarse también protocolos que implican interferencia de mutilación, por ejemplo, en Current Protocols In Molecular Biology, unidad 12, Frederick M. Ausubel y col. eds., 1995.

La amplificación de genes es un procedimiento adicional para evaluar el estado de 194P1E2. La amplificación de genes se mide en una muestra directamente, por ejemplo, mediante inmunotransferencia convencional (Southern o Northern) para cuantificar la transcripción de ARNm (Thomas, 1980. Proc. NatI. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205), inmunotransferencia en puntos (análisis de ADN) o hibridación in situ, usando una sonda etiquetada apropiadamente, sobre la base de las secuencias proporcionadas en el presente documento. Alternativamente, se usan anticuerpos que reconocen duplex específicos, incluidos duplex de ADN, duplex de ARN y duplex híbridos de ADN-ARN o duplex de ADN-proteína. Los anticuerpos, a su vez, se etiquetan y se lleva a cabo el ensayo cuando el duplex está unido a una superficie, de tal modo que después de la formación de duplex sobre la superficie, la presencia del anticuerpo unido al duplex puede detectarse.

Pueden analizarse convenientemente tejidos o sangre periférica sometidos a biopsia para evaluar la presencia de células cancerosas usando, por ejemplo, análisis de inmunotransferencia (Northern, inmunotransferencia en puntos)

o RT-PCR para detectar la expresión de 184P1E2. La presencia de ARNm de 184P1E2 amplificable mediante RTPCR proporciona una indicación de la presencia de cáncer. Los ensayos RT-PCR son bien conocidos en la técnica. Los ensayos de detección RT-PCR para células tumorales en sangre periférica están siendo evaluados actualmente para su uso en el diagnóstico y tratamiento de una serie de tumores sólidos humanos. En el sector del cáncer de próstata, éstos incluyen ensayos RT-PCR para la detección de células que expresan PSA y PSM (Verkaik y col., 1997, Urol Res. 25:373-384)

También se describe una evaluación de la susceptibilidad que tiene un individuo para desarrollar cáncer. Un procedimiento para predecir la susceptibilidad al cáncer comprende detectar ARNm de 184P1E2 o proteína 184P1E2 en una muestra de tejido, indicando su presencia susceptibilidad al cáncer, correlacionándose el grado de expresión de ARNm de 184P1E2 cone grado de susceptibilidad. En un caso específico, se examina la presencia de 184P1E2 en próstata o en otros tejidos, con la presencia de 184P1E2 en la muestra proporcionando una indicación de susceptibilidad al cáncer de próstata (o la emergencia o existencia de un tumor de próstata). De forma similar, se puede evaluar la integridad de secuencias de nucleótidos o aminoácidos de 184P1E2 en una muestra biológica, con el fin de indentificar perturbaciones en la estructura de estas moléculas, tales como inserciones, deleciones, sustituciones y similares. La presencia de una o varias perturbaciones en los productos génicos de 184P1E2 enla muestra es una indicación de susceptibilidad al cáncer (o la emergencia o existencia de un tumor).

También se describen procedimientos para evaluar la agresividad tumoral. En un caso, un procedimiento para evaluar la agresividad de un tumor comprende deteminar el nivel de ARNm de 184P1E2 o proteína 184P1E2 expresada por células tumorales, comparar el nivel determinado de este modo con el nivel de ARNm de 184P1E2 o proteína 184P1E2 expresado en un tejido normal correspondiente tomado del mismo individuo o una muestra de referencia de tejido normal, indicando el grado de expresión de ARNm de 184P1E2 o proteína 184P1E2 en la muestra tumoral con relación a la muestra normal el grado de agresividad. En un caso específico, la agresividad de un tumor se evalúa determinando la extensión en la que se expresa 184P1E2 en las células tumorales, con niveles altos de expresión indicando tumores más agresivos. Otro caso es la evaluación de la integridad de secuencias de nucleótidos y aminoácidos de 184P1E2 en una muestra biológica, con el fin de identificar perturbaciones en la estructura de estas moléculas tales como inserciones, deleciones, sustituciones y similares. La presencia de una o más perturbaciones indica tumores más agresivos.

Otro caso se refiere a procedimientos para observar la progresión de un tumor maligno en un individuo en función del tiempo. En un caso, los procedimientos para observar la progresión de un tumor maligno en una individuo en función del tiempo comprenden determinar el nivel de ARNm de 184P1E2 o de proteína 184P1E2 expresado por células en una muestra del tumor, comparando los niveles determinados de este modo con los niveles de ARNm de 184P1E2 o de proteína 184P1E2 expresados en una muestra de tejido correspondiente tomados del mismo individuo en un momento diferente, proporcionando el grado de expresión de ARNm de 184P1E2 o de proteína 184P1E2 en la muestra de tumor en función del tiempo información sobre la progresión del cáncer. En un caso específico, la progresión de un cáncer se evalúa determinando la expresión de 184P1E2 en las células tumorales en función del tiempo, indicando la expresión aumentada con el tiempo una progresión del cáncer. También, se puede evaluar la integridad de secuencias de nucleótidos y aminoácidos de 184P1E2 en una muestra biológica, , con el fin de identificar perturbaciones en la estructura de estas moléculas tales como inserciones, deleciones, sustituciones y similares, indicando la presencia de una o más perturbaciones la progresión del cáncer.

Los enfoques de diagnóstico anteriores pueden combinarse con cualquiera de entre una amplia variedad de protocolos de pronóstico y diagnóstico conocidos en la técnica. Por ejemplo, en el presente documento se describen procedimientos para observar una coincidencia entre la expresión de genes 184P1E2 y productos génicos de 184P1E2 (o perturbaciones en genes 184P1E2 y productos génicos de 184P1E2) y un factor que está asociado con el tumor maligno, como medio para el diagnóstico y el pronóstico del estado de una muestra de tejido. Puede usarse una amplia variedad de factores asociados con el tumor maligno, tales como la expresión de genes asociados con el tumor maligno (por ejemplo, la expresión de PSA, PSCA y PSM para cáncer de próstata, etc.) así como observaciones citológicas ordinarias (véase, por ejemplo, Bocking y col., 1984, Anal. Quant. Cytol. 6(2):74-88; Epstein, 1995, Hum. Pathol. 26(2):223-9; Thorson y col., 1998, Mod. Pathol. II(6):543-51; Baisden y col., 1999, Am J. Surg. Pathol. 23(8):918-24). Los procedimientos para observar una coincidencia entre la expresión de genes 184P1E2 y productos génicos 184P1E2 (o perturbaciones en genes 184P1E2 y productos génicos de 184P1E2) y otro factor que esté asociado con el tumor maligno son útiles, por ejemplo, debido a que la presencia de un conjunto de factores específicos que coinciden con la enfermedad proporciona información crucial para el diagnóstico y el pronóstico del estado de una muestra de tejido.

En un caso, los procedimientos para observar una coincidencia entre la expresión de genes 184P1E2 y productos génicos de 184P1E2 (o perturbaciones en genes 184P1E2 y productos génicos de 184P1E2) y otro factor asociado con el tumor maligno conlleva detectar la sobreexpresión de ARNm de 184P1E2 o proteína 184P1E2 en una muestra de tejido, detectar la sobreexpresión de ARNm de PSA o proteína PSA en una muestra de tejido (o expresión de PSCA o PSM), y observar una coincidencia en la sobreexpresión de ARNm de 184P1E2 o proteína 184P1E2 y de ARNm de PSA o proteína de PSA (o expresión de PSCA o PSAM). En un caso específico, la expresión de ARNm de 184P1E2 y PSA en tejidos de próstata se examina, indicando la coincidencia en la sobreexpresión de ARNm de 184P1E2 y PSA en la muestra la existencia de cáncer de próstata, susceptibilidad al cáncer de próstata o la emergencia o estado de un tumor de próstata.

En el presente documento se describen procedimientos para detectar y cuantificar la expresión de ARNm de 184P1E2 o proteína 184P1E2, y las tecnologías estándar de detección y cuantificación de ácidos nucleicos y proteínas son bien conocidas en la técnica. Los procedimientos estándar para la detección y cuantificación de ARNm de 184P1E2 incluyen hibridación in situ usando ribosondas de 184P1E2 etiquetadas, inmunotransferencia (Northern) y técnicas relacionadas usando sondas de polinucleótidos 184P1E2, análisis RT-PCR usando cebadores específicos para 184P1E2 y otros procedimientos de detección de tipo amplificación, tales como, por ejemplo, ADN ramificado, SISBA, TMA y similares. En un caso específico, se usa RT-PCR semicuantitativa para detectar y cuantificar la expresión de ARNm de 184P1E2. Puede usarse para este fin cualquier número de cebadores capaz de amplificar 184P1E2, incluidos, pero sin limitarse a, los diversos conjuntos de cebadores que se describen específicamente en el presente documento. En un caso específico, pueden usarse anticuerpo policlonales o monoclonales específicamente reactivos con la proteína 184P1E2 de tipo silvestre en un ensayo inmunohistoquímico de tejido sometido a biopsia.

IX.) Identificación de moléculas que interactúan con 184P1E2

Las secuencias de ácidos nucleicos y de proteínas de 184P1E2 que se divulgan en el presente docuemento permiten al experto identificar proteínas, moléculas pequeñas y otros agentes que interactúan con 184P1E2, así como rutas activadas por 184P1E2 mediante cualquiera de entre diversos protocolos aceptados por la técnica. Por ejemplo, se puede usar uno de los denominados sistemas de trampa de interacción (también denominado “ensayo de dos hibridos”). En dichos sistemas, las moleculas interactúan y reconstituyen un factor de transcripción que dirige la expresión de un gen comunicador, analizando, a continuación, la expresión de un gen comunicador. Otros sistemas identifican interacciones proteína-proteína in vivo mediante la reconstitución de un activador transcripcional eucariótico, véanse, por ejemplo, los documentos de patente de Estados Unidos Nº 5.955.280, publicado el 21 de septiembre de 1999, 5.925.523, publicado el 20 de junio de 1999, 5.846.722, publicado el 8 de diciembre de 1998, y 6.004.746, publicado el 21 de diciembre de 1999. También están disponibles en la técnica algoritmos para prediciones basadas en el genoma del funcionamiento de las proteínas (véase, por ejemplo, Marcotte y col., Nature

402: 4 de noviembre de 1999, 83-86).

Alternativamente, se pueden cribar colecciones de péptidos para identificar moléculas que interactúan con secuencias de proteínas 184P1E2. En dichso procedimientos, los péptidos que se unen a 184P1E2 se identifican cribando colecciones que codifican una colección aleatoria o controlada de aminoácidos. Los péptidos que codifican las colecciones se expresan como proteínas de fusión de proteínas de recubrimiento de bacteriófagos, las partículas de bacteriófagos se criban, a continuación, contra la(s) proteína(s) 184P1E2.

En consecuencia, los péptidos que tienen una amplia variedad de usos, tales como reactivos terapéuticos, de pronóstico o de diagnóstico, se identifican de este modo sin ningún tipo de información previa sobre la estructura del ligando esperado o molécula receptora. Las colecciones típicas de péptidos y procedimientos de cribado que pueden usarse para identificar moléculas que interactúan con secuencias de proteínas 184P1E2 se divulgan, por ejemplo, en los documentos de patente de Estados Unidos Nº 5.723.286, publicado el 3 de marzo de 1998, y 5.733.731, publicado el 31 de marzo de 1998.

Alternativamente, se usan líneas celulares que expresan 184P1E2 para identificar interacciones proteína-proteína mediadas por 184P1E2. Dichas interacciones pueden examinarse usando técnicas de inmunoprecipitación (véase, por ejemplo, Hamilton B.J. y col. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999,261:646-51). Las proteínas 184P1E2 pueden inmunoprecipitarse a partir de línea celulares que expresan 184P1E2 usando anticuerpos anti-184P1E2. Alternativamente, pueden usarse anticuerpos anti-His-tag en una línea celular diseñada para expresar fusiones de 184P1E2 y un His-tag (vectores mencionados anteriormente). El complejo inmunoprecipitado puede examinarse para evaluar la asociación proteica mediante procedimientos tales como inmunotransferencia (Western), etiquetado con 35S-metionina de proteínas, microsecuenciación de proteínas, tinción de plata y electroforesis en gel en dos dimensiones.

Pueden identificarse moléculas pequeñas y ligandos que interactúan con 184P1E2 mediante la realización de dichos ensayos de cribado. Por ejemplo, pueden identificarse moléculas pequeñas que interfieren con la función proteica, incluidas moléculas que interfieren con la capacidad de 184P1E2 para mediar la fosforilación y la desfosforilación, la interacción con moléculas de ADN o ARN como indicación de la regulación de ciclos celulares, señalización de segundos mensajeros o tumorigénesis. De modo similar, se identifican moléculas pequeñas que modulan el canal iónico relacionado con 184P1E2, bomba de proteínas o funciones de comunicación celular, y se usan para tratar pacientes que tienen un cáncer que expresa 184P1E2 (véase, por ejemplo, Hille, B., Ionic Channels of Excitable Membranes, 2ª edición., Sinauer Assoc., Sunderland, MA, 1992). Además, pueden identificarse ligandos que regulan el funcionamiento de 184P1E2 sobre la base de su capacidad para unirse a 184P1E2 y activar un constructo comunicador. En el documento de patente de Estados Unidos Nº 5.928.868, publicado el 27 de julio de 1999, por ejemplo, se exponen procedimientos típicos y se incluyen procedimientos para formar ligandos híbridos en los que al menos un ligando es una molécula pequeña. En un caso, se usan células diseñadas para expresar una proteína de fusión de 184P1E2 y una proteína que se une a ADN para coexpresar una proteína de fusión de un ligando híbrido/molécula pequeña y una proteína activadora transcripcional de colección de ADNc. Las células contienen, además, un gen comunicador, cuya expresión está condicionada por la proximidad de las proteínas de fusión primera y segunda entre sí, un evento que tienen lugar sólo si el ligando híbrido se une a los sitios diana de ambas proteínas híbridas. Las células que expresan el gen comunicador se seleccionan y se identifica la molécula pequeña desconocida y el ligando desconocido. Este procedimiento proporciona un medio para identificar moduladores que activan o inhiben 184P1E2.

En el presente documento se describe un procedimiento de cribado de una molécula que interactúa con la secuencia de aminoácidos de 184P1E2 que se muestra en la figura 2 o en la figura 3, que comprende las etapas de poner en contacto una población de moléculas con una secuencia de aminoácidos de 184P1E2, permitir que la población de moléculas y la secuencia de aminoácidos de 184P1E2 interactúen en condiciones que faciliten una interacción, determinar la presencia de una molécula que interactúa con la secuencia de aminoácidos de 184P1E2 y, a continuación, separar las moléculas que no interactúan con la secuencia de aminoácidos de 184P1E2 de las moléculas que lo hacen. En un caso específico, el procedimiento comprende también purificar, caracterizar e identificar una molécula que interactúa con la secuencia de aminoácidos de 184P1E2. La molécula identificada puede usarse para modular una función realizada por 184P1E2. Preferentemente, la secuencia de aminoácidos de 184P1E2 se pone en contacto con una colección de péptidos.

X.) Procedimientos y composiciones terapéuticos

La identificación de 184P1E2 como una proteína que se expresa normalemnte en un conjunto restringido de tejidos, pero que también se expresa en cáncer de próstata y en otros tipos de cáncer, abre una serie de enfoques terapéuticos para el tratamiento de dichos tipos de cáncer. Tal como se contempla en el presente documento, las funciones de 184P1E2 como factor de transcripción implicado en la activacion de genes que promueven el tumor o genes represivos que bloquean la tumorigénesis.

En consecuencia, los enfoques terapéuticos que inhiben la actividad de una proteína 184P1E2 son útiles para pacientes que padecen un cáncer que expresa 184P1E2. Estos enfoques terapéuticos se dividen generalmente en dos clases. Una clase comprende diversos procedimientos para inhibir la unión o asociación de una proteína 184P1E2 con su asociado de unión o con otras proteínas. La otra clase comprende diversos procedimientos para inhibir la transcripción de un gen 184P1E2 o la traducción de ARNm de 184P1E2.

X.A) Vacunas contra el cáncer

En este apartado se describen vacunas contra el cáncer que comprenden una proteína relacionada con 184P1E2 o un ácido nucleico relacionado con 184P1E2. En vista de la expresión de 184P1E2, las vacunas contra el cáncer previenen y/o tratan los tipos de cáncer que expresan 184P1E2 con un efecto mínimo o nulo sobre los tejidos que no son tejidos diana. El uso de un antígeno tumoral en una vacuna que genera respuestas inmunitarias inmunitarias humorales y/o mediadas por células como terapia contra el cáncer es bien conocido en la técnica y se ha usado en cáncer de próstata usando inmunógeos PSMA humanos y PAP de roedor (Hodge y col., 1995, Int. J. Cancer 63:231237; Fong y col., 1997, J. Immunol. 159:3113-3117).

Dichos procedimientos pueden ponerse en práctica fácilmente usando una proteína relacionada con 184P1E2, o una molécula de ácido nucleico que codifique 184P1E2 y vectores recombinantes capaces de expresar y presentar el inmunógeno 184P1E2 (que normalmente comprende una serie de anticuerpos o epítopos de célula T). Los expertos entienden que una amplia variedad de sistemas de vacuna para administrar epítopos inmunorreactivos son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Heryln y col., Ann Med 1999 Feb 31(1): 66-78; Maruyama y col., Cancer Immunol Immunother 2000 Jun 49(3):123-32). Brevemente, dichos procedimientos para generar una respuesta inmunitaria (por ejemplo, humoral y/o mediada por células) en un mamífero, comprenden las etapas de: exponer el sistema inmunitario del mamífero a un epítopo inmunorreactivo (por ejemplo, un epítopo presente en una proteína 184P1E2 que se muestra en la figura 3 o un análogo u homólogo de la misma) de tal modo que el mamífero genere una respuesta inmunitaria que sea específica para ese epítopo (por ejemplo, que genere anticuerpos que reconozcan específicamente ese epítopo). En un procedimiento preferente, un inmunógeno 184P1E2 contiene un motivo biológico, véanse, por ejemplo, las tablas V-XVIII y XXII-LI, o un péptido de un intervalo de tamaño de 184P1E2 indicado en la figura 5, la figura 6, la figura 7, la figura 8 y la figura9.

La proteína 184P1E2 completa, regiones inmunogénicas o epítopos de la misma pueden combinarse y adiministrarse por varios medios. Dichas composiciones de vacuna pueden incluir, por ejemplo, lipopéptidos (por ejemplo, Vitiello, A. y col., J. Clin. Invest. 95:341, 1995), composiciones de péptidos encapsuladas en microesferas de poli(DL-lacturo-co-glucólido) (“PLG”) (véase, por ejemplo, Eldridge y col., Molec. Immunol. 28:287-294, 1991: Alonso y col., Vaccine 12:299-306, 1994; Jones y col., Vaccine 13: 675-681, 1995), composiciones de péptidos contenidas en complejos inmunoestimulantes (ISCOMS) (véase, por ejemplo, Takahashi y col., Nature 344:873-875, 1990; Hu y col., Clin Exp Immunol. 113:235-243, 1998), sistemas peptídicos de antígenos múltiples (MAP) (véase, por ejemplo, Tam, J. P., Proc NatI. Acad. Sci. USA. 85:5409-5413, 1988; Tam, J.P., J. Immunol. Methods 196: 1732, 1996), péptidos formulados como péptidos multivalentes; péptidos para usar en sistemas de administración balísticos, péptidos cristalizados de forma típica, vectores de administración víricos (Perkus, M. E. y col., In: Concepts in vaccine development, Kaufmann, S. H. E., ed., p. 379, 1996; Chakrabarti, S. y col., Nature 320:535, 1986; Hu, S. L. y col., Nature 320:537, 1986; Kieny, M.-P. y col., AIDS Bio/Technology 4:790, 1986; Top, F. H. y col.,

J. Infect Dis. 124:148, 1971; Chanda, P. K. y col., Virology 175: 535, 1990), partículas de origen vírico o sintético (por ejemplo, Kofler, N. y col., J. Immunol. Methods. 192:25, 1996; Eldridge, J. H. y col., Sem. Hematol. 30:16,1993; Falo, L D., Jr y col., Nature Med 7:649, 1995), coadyuvantes (Warren, H. S., Vogel, F. R. y Chedid, L. A. Annu Rev. Immunol. 4:369, 1986; Gupta, R. K. y col., Vaccine 11:293, 1993), liposomas (Reddy, R. y col., J. Immunol. 148:1585, 1992; Rock, K. L, Immunol. Today 17:131,1996), o ADNc desnudo o absorbido por partículas (Ulmer, J. B. y col., Science 259:1745, 1993; Robinson, H. L, Hunt, L. A. y Webster, R. G., Vaccine 11:957, 1993; Shiver, J. W. y col., In: Concepts in vaccine development, Kaufmann, S. H. F., ed., p. 423, 1996; Cease, K. B. y Berzofsky, J. A., Annu. Rev. Immunol. 12:923, 1994 y Eldridge, J. H, y col., Sem. Hematol. 30:16, 1993). Las tecnologías de administración dirigidas a toxina, también conocidos como dirigidas mediadas por receptor, tales como las de Avant Immunotherapeutics, Inc. (Needham, Massachusetts, Estados Unidos) también pueden usarse.

En pacientes con cáncer asociado a 184P1E2, también pueden usarse composiciones de vacuna en combinación con otros tratamientos que se usan contra el cáncer, por ejemplo, cirugía, quimioterapia, terapia farmacológica, terapias de radiación, etc., incluido el uso en combinación con coadyuvantes inmunitarios tales como II-2, IL-12, GMCSF y similares.

Vacunas celulares:

Pueden determinarse epítopos CTL usando algoritmos específicos para identificar péptidos en una proteína 184P1E2 que se unen a los alelos HLA correspondientes (véase, por ejemplo, la tabla IV; EpimerTM y EpimatrixTM, Brown University (URL www.brown.edu/ Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html); y BIMAS, (URL bimas.dcrt.nih.gov/; SYFPEITHI en la URL syfpeithi.bmi-heidelberg.com/). En una realización preferente, un inmunógeno 184P1E2 contiene una o varias secuencias de aminoácidos identificadas usando técnicas bien conocidas en la técnica, tales como las secuencias que se muestran en las tablas V-XVIII y XXII-LI o un péptido de 8, 9, 10 u 11 aminoácidos especificados por un motivo/supermotivo de clase I de HLA (por ejemplo, tabla IV (A), tabla IV (D) o tabla IV (F)) y/o un péptido de al menos 9 aminoácidos que comprende un motivo/supermotivo de clase II de HLA (por ejemplo, tabla IV (B) o tabla IV (C)). Como se aprecia en la técnica, la ranura de unión de clase I de HLA se finaliza esencialmente de forma cerrada, de tal modo que sólo los péptidos de un intervalo de tamaños particular pueden adaptarse dentro de la ranura y unirse, generalmente los epítopos de clase I de HLA que tienen 8, 9, 10 u 11 aminoácidos de longitud. Por el contrario, la ranura de unión de clase II de HLA se finaliza de forma esencialmente abierta; por lo tanto, un péptido de aproximadamente 9 o más aminoácidos puede unirse a una molécula de clase II de HLA. Debido a las diferencias de ranura de unión entre la clase I y la II de HLA, los motivos de clase I tienen una longitud específica, es decir, la posición dos de un motivo de clase I es el segundo aminoácido en una dirección amino a carboxilo del péptido. Las posiciones de aminoácidos en un motivo de clase II están relacionadas sólo entre sí, no con el péptido completo, es decir, pueden unirse aminoácidos adicionales al extremo amino y/o carboxilo de una secuencia que porte un motivo. Los epítopos de clase II tienen frecuentemente 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ó 25 aminoácidos de longitud, o más de 25 aminoácidos.

Vacunas basadas en anticuerpos

En la técnica se conoce una amplia variedad de procedimientos para generar una respuesta inmunitaria en un mamífero (por ejemplo, como la primera etapa en la generación de hibridomas). Los procedimientos para generar una respuesta inmunitaria en un mamífero comprenden exponer al sistema inmunitario del mamífero a un epítopo inmunogénico sobre una proteína (por ejemplo, una proteína 184P1F2) de tal modo que se genere una respuesta inmunitaria. En el presente documento se describe un procedimiento para generar una respuesta inmunitaria a 184P1F2 en un huésped poniendo en contacto al huésped con una cantidad suficiente de al menos una célula 184P1F2 o un epítopo de linfocito T citotóxico o un análogo de los mismos, y al menos un intervalo periódico después de poner de nuevo en contacto el huésped con la célula célula 184P1F2 o un epítopo de linfocito T citotóxico o un análogo de los mismos. También se describe un procedimiento para generar una respuesta inmunitaria contra una proteína relacionada con 184P1F2 o un péptido multiepitópico artificial que comprende: administrar inmunógeno 184P1F2 (por ejemplo, una proteína 184P1F2 o un fragmento peptídico de la misma, una proteína de fusión 184P1F2 o un análogo, etc.) en una preparación de vacuna a un ser humano o a otro mamífero. Normalmente, dichas preparaciones de vacuna contienen, además, un coadyuvante adecuado (véase, por ejemplo, el docuemento de patente de Estados Unidos Nº 6.146.635) o un epítopo auxiliar universal tal como un péptido PADRETM (Epimmune Inc., San Diego, CA, Estados Unidos; véase, por ejemplo, Alexander y col., J. ImmunoL 2000 164(3); 164(3): 1625-1633; Alexander y col., Immunity 1994 1(9): 751-761 y Alexander y col., Immunol. Res. 1998 18(2): 79-92). Un procedimiento alternativo comprende generar una respuesta inmunitaria en un individuo contra un inmunógeno 184P1E1: administrando in vivo al músculo o a la piel del cuerpo del individuo una molécula de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica un inmunógeno 184P1E1, uniendo operativamente la secuencia de ADN a secuencias regulatorias que controlan la expresión de la secuencia de ADN; recogiéndose la molécula de ADN por las células, la secuencia de ADN se expresa en las células y se genera una respuesta inmunitaria contra el inmunógeno (véase, por ejemplo, el documento de patente de Estados Unidos Nº 5.962.428). Opcionalmente se puede administrar también un facilitador de vacuna genético tal como lípidos aniónicos, saponinas, lectinas, compuestos estrogénicos, alquilos inferiores hidroxilados, dimetilsulfóxido y urea. Además, puede administrarse un anticuerpo antiidiotípico que imite a 184P1E1, con el fin de generar una respuesta al antígeno diana.

Vacunas de ácidos nucleicos:

Las composiciones de vacuna que se describen en el presente apartado incluyen modalidades mediadas por ácidos nucleicos. Puede administrarse ADN o ARN que codifican proteína(s) a un paciente. Pueden usarse procedimientos de inmunización genéticos para generar respuestas inmunitarias humorales y celulares profilácticas o terapéuticas dirigidas contra células cancerosas que expresan 184P1E2. Pueden inyectarse directamente en los músculos o la piel de un individuo constructos que comprenden ADN que codifica una proteína relacionada con 184P1E2/un inmunógeno 184P1E2 y secuencias reguladoras apropiadas, de tal modo que las células del músculo o de la piel recogen el constructo y expresan la proteína/inmunógeno 184P1E2 coficada. Alternativamente, una vacuna comprende una proteína relacionada con 184P1E2. La expresión del inmunógeno/proteína relacionada con 184P1E2 da como resultado la generación de inmunidad humoral y celular profiláctica o terapéutica contra células que portan una proteína 184P1E2. Pueden usarse varias técnicas profilácticas y terapéuticas de inmunización genética conocidas en la técnica (para una revisión, véase la información y las referencias publicadas en Internet en en el sitio www.genweb.com). La administración basada en ácidos nucleicos se describe, por ejemplo, en Wolff y col., Science 247:1465 (1990) así como en los documentos de patente de Estados Unidos Nº 5.580.859; 5.589.466; 5.804.566; 5.739.118; 5.736.524; 5.679.647 y en el documento WO 98/04720. Los ejemplos de tecnologías de administración basadas en ADN incluyen ADN desnudo, administración facilitada (bupivicaína, polímeros, mediada por péptidos), complejos de lípidos catiónicos y administración mediada por partículas (pistola génica) o mediada por presión (véase, por ejemplo, el documento de patente de Estados Unidos Nº 5.922.687)

Con fines de inmunización terapéutica o profiláctica, las proteínas pueden espresarse mediante vectores víricos o bacterianos. Los diversos sistemas de administración de genes vírica que pueden usarse en la práctica de la presente invención incluyen, pero no están limitados a, virus de la vacuna, virus de la viruela aviar, virus de la viruela del canario, adenovirus, virus de la gripe, poliovirus, virus adenoasociados, lentivirus y virus Sindbis (véase, por ejemplo, Restifo,1996, Curr. Opin. Immunol. 8:658-663; Tsang y col. J. NatI. Cancer Inst. 87:982-990 (1995)). También pueden usarse sistemas de administra no víricos introduciendo ADN desnudo que codifique una proteína relacionada con 184P1E2 en el paciente (por ejemplo, intramuscular o intradérmicamente) para inducir una respuesta antitumoral).

El virus de la vacuna se usa, por ejemplo, como vector para expresar secuencias de nucleótidos que codifican péptidos. Después de la introducción en un huésped, el virus de la vacuna recombinante expresa el péptido inmunogénico de la proteína y, de este modo, facilita una respuesta inmunitaria en el huésped. Los protocolos de vectores de vacuna y procedimientos útiles en inmunización se describen en, por ejemplo, el documento de patente de Estados Unidos Nº 4.722.948. Otro vector es el BCG (Bacilo de Calmette-Guerin). Los vectores BCG se describen en Stover y col., Nature 351 :456-460 (1991). Una amplia variedad de otros vectores útiles para administración terapéutica o inmunización de péptidos, por ejemplo, vectores adenovíricos y víricos adenoasociados, vectores retrovíricos, tipivectores de Salmonela, vectores de toxina de carbunco destoxificados y similares, será aparente para los expertos en la técnica a partir de la descripción del presente documento.

De este modo, los sistemas de administración génica se usan para administrar una molécula de ácidos nucleicos relacionada con 184P1E2. En un caso, se usa ADNc de 184P1E2 humano de longitur completa. En otro caso, se usan moléculas de ácido nucleico de 184P1E2 que codifican específicamente linfocitos T citotóxicos (GTL) y/o epítopos de anticuerpos.

Vacunas ex vivo

También pueden usarse diversas extrategias ex vivo para generar una respuesta inmunitaria. Un enfoque implica el uso de células que presentan antígeno (APC) tales como células dendríticas (DC) para presentar 184P1E2 al sistema inmunitarios de un paciente. Las células dendríticas expresan moléculas de clase I y de clase II de MHC, coestimulante B7 e IL-12 y son, de este modo, células que presentan antígeno muy especializadas. En cáncer de próstata, se están usando células dendríticas autólogas pulsadas con péptidos del antígeno de membrana específico de próstata (PSMA) en un ensayo clínico de fase I para estimular cáncer de próstata en el sistema inmunitario de pacientes (Tjoa y col., 1996, Prostate 28:65-69; Murphy y col., 1996, Prostate 29:371 -380). De este modo, pueden usarse células dendríticas para presentar péptidos 184P1E2 a células T en el contexto de moléculas de clase I ó II de MHC. En un caso, las células dendríticas autólogas están pulsadas con péptidos 184P1E2 capaces de unirse a moléculas de MHC de clase I y/o de clase II. En otro caso, las células dendríticas están pulsada con la proteína 184P1E2 completa. En otro caso más, implica diseñar la sobreexpresión de una gen 184P1E2 en células dendríticas usando varios vectores de implementación conocidos en la técnica, tales como adenovirus (Arthur y col., 1997, Cancer Gene Ther. 4:17-25), retrovirus (Henderson y col., 1996, Cancer Res. 56: 3763-3770), lentivirus, virus adenoasociados, transfección de ADN (Ribas y col., 1997, Cancer Res. 57:2865-2869), o transfección de ARN derivado de tumor (Ashley y col., 1997, J. Exp. Med. 186:1177-1182). También pueden diseñarse células que expresen 184P1E2 para expresar moduladores inmunitarios, tales como GM-CSF, y usarlas como agentes de inmunización.

X.B.) 184P1E2 como diana para terapia basada en anticuerpos

184P1E2 es una diana atractiva par estrategias terapéuticas basadas en anticuerpos. Se conocen en la técnica una serie de estrategias de anticuerpos para dirigir moléculas extracelulares e intracelulares (véase, por ejemplo, destrucción mediada por complemento y ADCC, así como el uso de intracuerpos). Debido a que 184P1E2 es expresado por células cancerosas de varios linajes con relación a células normales correspondientes, la administración sistémica de composiciones inmunorreactivas a 184P1E2 se preparan de modo que muestran sensitividad excelente sin efectos tóxicos, no específicos y/o de no diana provocados por la unión de la composición inmunorreactiva en órganos y tejidos que no son órgano y tejidos diana. Los anticuerpos específicamente reactivos con dominios de 184P1E2 son útiles para tratar tipos de cáncer que expresan 184P1E2 sistemáticamente, como conjugados con una toxina o como agentes terapéuticos, o como anticuerpos desnudos capaces de inhibir la proliferación o el funcionamiento célular.

Los anticuerpos 184P1E2 pueden introducirse en una paciente de tal modo que el anticuerpos se una a 184P1E2 y module una función, tal como una interacción con un asociado de unión y, en consecuencia, medie la destrución de las células tumorales y/o inhiba el crecimiento de las células tumorales. Los mecanismos mediante los que dichos anticuerpos ejercen un efecto terapéutico pueden incluir citolisis mediada por complemento, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo, modulación de la función fisiológica de 184P1E2, inhibición de la unión al ligando o de las rutas de transducción de señal, modulación de la diferenciación de células tumorales, alteración de los perfiles del factor de angiogénesis tumoral y/o apoptosis.

Los expertos en la técnica entienden que pueden usarse anticuerpos para dirigirse y unirse específicamente a moléculas inmunogénicoa tales como una región inmunogénicoa de una secuencia de 184P1E2 que se muestra en la figura 2 o en la figura 3. Además, los expertos entienden que la conjugación de anticuerpos con agentes citotóxidos es rutinaria (véase, por ejemplo, Slevers y col. Blood 93:11 3678-3684 (1 de junio, 1999)). Cuando se administran agentes citotóxicos y/o terapéuticos directamente a las células, tal como conjugándolos con anticuerpos específicos para una molécula expresada por dicha célula (por ejemplo, 184P1E2), el agente citotóxico ejercerá su efecto biológico conocido (por ejemplo, citotoxicidad) sobre esas células.

Se conocen en la técnica una amplia variedad de composiciones y procedimientos de uso de conjugados de anticuerpo-agente citotóxico para destruir células. En el contexto de cánceres, los procedimientos típicos conllevan administrar a un animal que tiene un tumor una cantidad biológicamente eficaz de un conjugado que comprende un agente citotóxico y/o terapéutico seleccionado unido a un agente dirigido (por ejemplo un anticuerpo anti-184P1E2) que se une a un marcador (por ejemplo, 184P1E2) expresado, accesibel para unirse o localizarse sobre las superficies celulares. Normalmente, un procedimiento de administración de un agente citotóxico y/o terapéutico a una células que expresa 184P1E2 comprende conjugar el agente citotóxico a una anticuerpos que se une inmunoespecíficamente a un epítopo 184P1E2 y exponer la célula al conjugado anticuerpo-agente. En otro caso, un procedimiento de tratamiento de un individuo sospechoso de padecer cáncer metastatizado comprende una etapa de administración parenterla a dicho individuo de una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpos conjugado con un agente citotóxico y/o terapéutico.

La inmunoterapia del cáncer usando anticuerpos anti-184P1E2 puede realizarse según diversos enfoques que se han usado satisfactoriamente en el tratamiento de otros tipos de cáncer, que incluyen, pero no están limitados a, cáncer de colon (Arlen y col.,1998, Crit. Rev. Immunol. 18:133-138), mieloma múltiple (Ozaki y col.,1997, Blood

90:31 79-31 86, Tsunenari y col., 1997, Blood 90:2437-2444), cáncer gástrico (Kasprzyk y col., 1992, Cancer Res. 52:2771-2776), linfoma de célula B (Funakoshi y col., 1996, J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 19:93-101), leucemia (Zhong y col., 1996, Leuk. Res. 20:581-589), cáncer colorrectal (Moun y col., 1994, Cancer Res. 54:61 6061 66; Velders y col., 1995, Cancer Res. 55:4398-4403) y cáncer de mama (Shepard y col., 1991, J. Clin. Immunol. 11:117-127). Algunos enfoques terapéuticos implican la conjugación de anticuerpo desnudo con una toxina o isótopo radioactivo, tal como la conjugación de Y91 o I131 con anticuerpos anti-CD2O (por ejemplo, ZevalinTM, IDEC Pharmaceuticals Corp. o BexxarTM, Coulter Pharmaceuticals), mientras que otros implican la administración conjunta de anticuerpos y otros agentes terapéuticos, tales como HerceptinTM (trastuzumab) con paclitaxel (Genentech, Inc.). Los anticuerpos pueden conjugarse con un agente terapéutico. Para tratar cáncer de próstata, por ejemplo, pueden administrarse anticuerpos 184P1E2 junto con radiación, quimioterapia o ablación hormonal. También pueden conjugarse anticuerpos con una toxina tal como calicheamicina (por ejemplo, MylotargTM, Wyeth-Ayerst, Madison, NJ, Estados Unidos, un anticuerpo lgG4 kappa humanizado combinante combinado con el antibiótico antitumoral calicheamicina) o un maitansinoide (por ejemplo, profármaco activado por tumor basado en taxano, TAP, plataforma, ImmunoGen, Cambridge, MA, Estados Unidos, véase también, por ejemplo, el documento de patente de Estados Unidos 5.416.064).

Aunque la terapia de anticuerpos 184P1E2 es útil para todos los estadios del cáncer, la terapia de anticuerpos pueden ser particularmente apropiada en cáncer avanzado o metastático. El tratamiento con la terapia de anticuerpos de la invención está indicado para pacientes que han recibido una o varias series de quimioterapia. Alternativamente, la terapia de anticuerpos de la invención está combinada con un regimen quimioterapéutico o de radiación para pacientes que no han recibido tratamiento quimioterapéutico. Adicionalmente, la terapia de anticuerpos pueden posibilitar el uso de dosis reducidas de quimioterapia concomitante, particularmente para pacientes que no toleran la toxicidad del agente quimioterapéutico muy bien. Fan y col. (Cancer Res. 53: 46374642,1993), Prewett y col. (International J. of Onco. 9:217-224, 1996) y Hancock y col. (Cancer Res. 51: 45754580,1991) describen el uso de diversos anticuerpos conjuntamente con agentes quimioterapéuticos.

Aunque la terapia de anticuerpos 184P1E2 es útil para todos los estadios del cáncer, la terapia de anticuerpos puede ser particularmente apropiada en cáncer avanzado o metastático. El tratamiento con la terapia de anticuerpos está indicado para pacientes que han recibido una o varias series de quimioterapia. Alternativamente, la terapia de anticuerpos de la invención está combinada con un regimen quimioterapéutico o de radiación para pacientes que no han recibido tratamiento quimioterapéutico. Adicionalmente, la terapia de anticuerpos pueden posibilitar el uso de dosis reducidas de quimioterapia concomitante, particularmente para pacientes que no toleran la toxicidad del agente quimioterapéutico muy bien.

Pueden analizarse pacientes con cáncer para evaluar la presencia y el nivel de la expresión de 184P1E2, preferentemente usando evaluación inmunohistoquímica del tejido tumoral, imagen de 184P1E2 cuantitativa u otras técnicas que indican de forma fiable la presencia y el grado de la expresión de 184P1E2. Los análisis inmunohistoquímicos de biopsias de tumor o de especímenes quirúrgicos es preferente para este propósito. Los procedimientos para el análisis inmunohistoquímico de tejidos tumorales son bien conocidos en la técnica.

Los anticuerpos anti-184P1E2 monoclonales que tratan el cáncer de próstata y otros tipos de cáncer incluyen los que inician una respuesta inmunitaria potente contra el tumor o los que son directamente citotóxicos. A este respecto, los anticuerpos monoclonales anti-184P1E2 (mAb) pueden facilitar la lisis de las células tumorales mediante mecanismos de citotoxicidad celular mediada por complemento o dependiente de anticuerpo (ADCC), requiriendo ambos mecanismos una porción intacta de Fc de la molécula de inmunoglobulina para la interacción con los sitios receptores de Fc de la célula efectora sobre proteínas complementarias. Además, los mAb anti-184P1E2 que ejercen un efecto biológico directo sobre el crecimiento tumoral son útiles para tratar tipos de cáncer que expresan 184P1E2. Los mecanismos mediante los que los mAb citotóxicos actúan directamente incluyen: inhibición del crecimiento celular, modulación de la diferenciación celular, modulación de los perfiles del factor de angiogénesis tumoral, y la inducción de apoptosis. El mecanismo o los mecanismos mediante los que un mAb anti-184P1E2 particular ejerce un efecto antitumoral se evalúan usando cualquier número de ensayos in vitro que evalúan la muerte celular tales como ADCC, ADMMC, lisis celular mediada por complemento y otros más, tal como se sabe, en general, en la técnica.

En algunos pacientes, el uso de anticuerpos monoclonales murinos o de otro tipo no humano, o mAb quiméricos humanos/de ratón puede inducir a moderar las respuestas inmunitarias fuertes contra el anticuerpos no humano. Esto puede dar como resultado la eliminación del anticuerpo de la circulación y reducir su eficacia. En los casos más graves, dicha respuesta inmunitaria puede provocar la formación extensiva de complejos inmunitarios que, potencialmente, pueden causar un fallo renal. En consecuencia, los anticuerpos monoclonales que se usan preferentemente en los procedimientos terapéuticos descritos son los que son totalmente humanos o humanizados y que se unen específicamente al antígeno 184P1E2 diana con afinidad elevada pero muestran poca o nula antigenicidad en el paciente.

Los procedimientos terapéuticos contemplan la administración de mAb anti-184P1E2 solos, así como de combinaciones, o cócteles, de diferentes mAb. Dichos cócteles de mAb pueden tener determinadas ventajas en la medida en que contienen mAb que se dirigen a epítopos diferentes, explotan diferentes mecanismos de efectores o combinan mAb directamente citotóxicos con mAb que dependen de la funcionalidad del efector inmunitario. Dichos mAb en combinación pueden mostrar efectos terapéuticos sinérgicos. Además, pueden administrarse mAb anti184P1E2 concomitantemente con otras modalidades terapéuticas, que incluyen, pero no están limitadas a, diversos agentes quimioterapéuticos, bloqueadores de andrógenos, moduladores inmunitarios (por ejemplo, IL-2, GM-CSF), cirugía o radiación. Los mAb anti-184P1E2 se administran en su forma desnuda o conjugada, o pueden tener un(os) agente(s) terapéutico(s) conjugado(s) con ellos.

Las formulaciones de anticuerpos anti-184P1E2 se administran por cualquier vía capaz de suministrar los anticuerpos a una célula tumoral. Las vías de administración incluyen, pero no están limitadas a, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intratumoral, intradérmica y similares. El tratamiento, generalmente, implica la administración repetida de la preparación de anticuerpos anti-184P1E2 a través de una vía de administración aceptable, tal como inyección intravenosa (iv), tipicamente en una dosis en el intervalo de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 ó 25 mg/kg de peso corporal. En general, las dosis en el intervalo de 10-1.000 mg de mAb por semana son eficaces y bien toleradas.

Sobre la base de la experiencia clínica con el mAb HerceptinaTM en el tratamiento de cáncer de mama metastático, una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg de peso corporal del paciente iv, seguida de dosis semanales de aproximadamente 2 mg/kg iv de la preparación de mAb anti-184P1E2 representa un régimen de dosificación aceptable. Preferentemente, la dosis de carga inicial se administra como una infusión de 90 minutos o más prolongada. La dosis de mantenimiento periódica se administra como infusión de 30 minutos o más prolongada, siempre que la dosis inicial haya sido bien tolerada. Como apreciarán los expertos en la técnica, pueden influir diversos factores sobre el régimen de dosificación ideal en un caso particular. Dichos factores incluyen, por ejemplo, la afinidad de unión y la semivida del Ab o de los mAb usados, el grado de expresión de 184P1E2 en el paciente, la extensión de la zona de circulación del antígeno 184P1E2, el nivel de concentración del anticuerpo en el estado estacionario deseado, la frecuencia del tratamiento y la influencia de agetes quimioterapéuticos o de otro tipo de agentes usados en combinación con el procedimiento de tratamiento de la presente invención, así como el estado de salud del paciente particular.

Opcionalmente, debe analizarse a los pacientes para evaluar los niveles de 184P1E2 en una muestra dada (por ejemplo, los niveles de circulación del antígeno 184P1E2 y/o de células que expresan 184P1E2) con el fin de que ayuden a determinar el régimen de dosificación más eficaz, etc. Dichos análisis se usan también para evaluar otros parámetros (por ejemplo, citología de la orina y/o niveles de InmunoCyt en terapia de cáncer de vejiga, o por analogía, niveles de PSA en suero en terapia de cáncer de próstata).

También pueden usarse anticuerpos anti-184P1E2 anti-idiotípicos en terapia contra el cáncer como vacuna para inducir una respuesta inmunitaria en células que expresan una proteína relacionada con 184P1E2. En particular, la generación de anticuerpos anti-idiotípicos es bien conocida en la técnica; esta metodología puede adaptarse fácilmente para generar anticuerpos anti-184P1E2 anti-idiotípicos que imiten un epítopo sobre una proteína relacionada con 184P1E2 (véase, por ejemplo, Wagner y col., 1997, Hybridoma 16: 33-40; Foon y col., 1995, J. Clin. Invest 96:334-342; Herlyn y col., 1996, Cancer Immunol. Immunother. 43:65-76). Dicho anticuerpos anti-idiotípico puede usarse en estrategias de vacuna contra el cáncer.

X.C.) 184P1E2 como diana para respuestas inmunitarias celulares

En el presente apartado se describen vacunas y procedimientos de preparación de vacunas que contienen una cantidad inmunogénicamente eficaz de uno o varios péptidos de unión a HLA. Además, en el presente apartado se describen vacunas que comprenden composiciones de uno o varios de los péptidos descritos. Un péptido puede estar presente en una vacuna individualmente. Alternativamente, el péptido puede existir en forma de homopolímero que comprende múltiples copias del mismo péptido, o en forma de heteropolímero de varios péptidos. Los polímeros tienen la ventaja de una reacción inmunológica aumentada y, cuando se usan diferentes epítopos peptídicos para construir el polímero, la capacidad adicional para indicir anticuerpos y/o OTL que reacciona con diferentes determinantes antigénicos del organismo patogénico o péptido relacionado con tumor se dirigen a una respuesta inmunitaria. La composición puede ser una región de origen natural de un antígeno o puede prepararse, por ejemplo, recombinantemente o mediante síntesis química.

Los vehículos que pueden usarse con vacunas son bien conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, tiroglobulina, albúminas tales como albúmina de suero humano, toxoides de tétano, ácidos poliamínicos tales como poli(L-lisina), poli(ácido L-glutámico), virus de la gripe, proteína del núcleo del virus de la hepatitis B y similares. Las vacunas pueden contener un diluyente fisiológicamente tolerable (es decir, aceptable) tal como agua o solución salina, preferentemente solución salina tamponada con fosfato. Las vacunas incluyen también, normalmente, un coadyuvante. Coadyuvantes tales como coadyuvante de Freund incompleto, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio o alumbre son ejemplos de materiales bien conocidos en la técncia. Adicionalemnte, tal como se divulga en el presente documento, las respuestas CTL pueden incentivarse conjugando péptidos de la invención con lípidos, tales como tripalmitoil-S-glicerilcisteinilseril-serina (P3CSS). Además, se ha descubierto que un coadyuvante tal como con oligonucleótidos que contienen citosina-fosforotiolada-guanina (CpG) aumentan la respuesta de CTL de 10 a 100 veces (véase, por ejemplo, Davila y Celis, J. Immunol. 165:539-547 (2000)).

Después de la inmunización con una composición de péptidos según la invención, mediante inyección, aerosol, vía oral, transdérmica, transmucosal, intrapleural, intratecal o mediante otra vía adecuada, el sistema inmunitario del huésped responde a la vacuna produciendo grandes cantidades de CTL y/o HTL específicos para el antígeno deseado. En consecuencia, el huésped se vuelve al menos parcialmente inmune a desarrollos posteriores de células que expresan o sobreexpresan el antígeno 184P1E2, o deriva al menos algún beneficio terapéutico cuando el antígeno está asociado al tumor.

En algunos casos, puede ser deseable combinar los componentes peptídicos de clase I con componentes que inducen o facilitan respuestas al anticuerpo neutralizador y/o células T cooperadores dirigidas a un antígeno diana. Un caso preferente de dicha composición comprende epítopos de clase I y clase II. Un caso alternativo de dicha composición comprende un epítopo de clase I y/o de clase II, junto con un epítopo de HTL con reactividad cruzada tal como una molécula de PADRETM (Epimmune, San Diego, CA, Estados Unidos) (descrito, por ejemplo, en el documento de patente de Estados Unidos Nº 5.736.142).

Una vacuna también puede incluir células que presentan antígeno (APC), tales como células dendríticas (DC) como vehículo para presentar péptidos. Las composiciones de vacuna pueden crearse in vitro, después de la movilización y recogida de células dendríticas, por lo que la carga de las células dendríticas tiene lugar in vitro. Por ejemplo, las células dendríticas se transfectan, por ejemplo, con un minigen, o se pulsan con péptidos. Las células dendríticas pueden administrarse a continuación a un paciente para facilitar respuestas inmunitarias in vivo. Las composiciones de vacuna, tanto basadas en ADN como en péptidos, también pueden administrarse in vivo en combinación con la movilización de células dendríticas, por lo que la carga de las células dendríticos tiene lugar in vivo.

Preferentemente, los principios siguientes se usan cuando se selecciona una serie de epítopos para su inclusión en una composición poliepitópica para su uso en una vacuna, o para seleccionar epítopos discretos para su inclusión en una vacuna y/o su codificación por ácidos nucleicos tales como un minigen. Es preferente que cada uno de los principios siguientes sea equilibrado con el fin de realizar la selección. Los múltiples epítopos que se van a incorporar en una composición de vacuna dad pueden ser, pero no precisan serlo, contiguos en la secuencia en el antígeno nativo a partir del que se derivan los epítopos.

1.) Se seleccionan epítopos que, después de la administración, imitan las respuestas inmunitarias que se ha observado que se correlacionan con la eliminación del tumor. Para HLA de clase I esto incluye 3-4 epítopos que provienen de al menos un antígeno asociado con tumor (TAA). Para HLA de clase II se usa un razonamiento similar; frente a 3-4 epítopos se selecciona al menos un TAA (véase, por ejemplo, Rosenberg y col., Science 278:14471450). Los epítopos de un TAA pueden usarse en combinación con epítopos procedentes de uno o más TAA adicionales para producir una vacuna que se dirija a tumores con patrones de expresión variable de TAA expresadas frecuentemente.

2.) Se seleccionan epítopos que tienen el requisito de una afinidad de unión establecida que se correlacione con la inmunogenicidad: para HLA de clase I de una CI50 de 500 nM o inferior, a menudo de 200 nM o inferior; y para la clase II de una CI50 de 1.000 nM o inferior.

3.) Se seleccionan péptidos que portan un supermotivo suficiente o un haz suficiente de péptidos que portan motivos específicos de alelos para una cobertura de una población amplia dada. Por ejemplo, es preferente que tengan una cobertura de la población de al menos el 80 %. Un análisis de Monte Carlo, una evaluación estadística conocida en la técnica, puede emplearse para evaluar la amplitud, o la redundancia de, la cobertura a la población.

4.) Cuando se seleccionan epítopos a partir de antígenos relacionados con cáncer, a menudo es útil seleccionar análogos debido a que el paciente puede haber desarrollado tolerancia al epítopo nativo.

5.) Son de particular relevancia los epítopos denominados epítopos “anidados”. Los epítopos anidados tienen lugar cuando se solapan al menos dos epítopos en una secuencia de péptidos dada. Una secuencia de péptidos anidada puede comprender epítopos de célula B, de HLA de clase I y/o de HLA de clase II. Cuando se proporcionan epítopos anidados, un objetivo general es proporcionar el mayor número de epítopos por secuencia. De este modo, un aspecto es evitar proporcionar un péptido que sea de cualquier longitud mayor que el extremo amino del epítopo amino terminal y que el extremo carboxilo del epítopo carboxilo terminal, es generalmente importante cribar la secuencia con el fin de asegurar que no tiene propiedades patológicas u otras propiedades deletéreas biológicas.

6.) Si se crea una proteína poliepitópica, o cuando se crea un minigen, un objetivo es generar el péptido más pequeño que comprende los epítopos de interés. Este principio es similar, si no el mismo, que el usado cuando se selecciona un péptido que comprende epítopos anidados. No obstante, con un péptido poliepitópico artificial, el objetivo de la minimización del tamaño está equilibrado frente a la necesidad de integrar cualquier secuencia espaciadora entre epítopos en la proteína poliepitópica. Los restos de aminoácidos espaciadores pueden introducirse, por ejemplo, para evitar epítopos de unión (un epítopo reconocido por el sistema inmunitario, que no está presente en el antígeno diana, y sólo se crea por la yuxtaposición artificial de epítopos), o para facilitar la escisión entre epítopos y, por lo tanto, potencia la presentación de epítopos. Los epítopos de unión deben evitarse, generalmente, debido a que el receptor puede generar una respuesta inmunitaria a esos epítopos no nativos. De particular importancia es un epítopo de unión que sea un epítopo dominante. Un epítopo dominante puede provocar dicha respuesta entusiasta que disminuya o suprima las respuestas inmunitarias a otros epítopos.

7.) Cuando las secuencias de múltiples variantes de la misma proteína diana estén presentes, los epítopos peptídicos potenciales también pueden seleccionarse sobre la base de su conservancia. Por ejemplo, un criterio de conservancia puede definir que la secuencia completa de un péptido de unión a HLA de clase I o el núcleo total 9mérico de un péptido de unión a clase II pueda conservarse en un porcentaje designado de las secuencias evaluadas para analizar un antígeno de proteína específico.

X.C.1. Vacunas de minigenes

Están disponibles una serie de enfoques diferentes que permiten administrar simultáneamente múltiples epítopes. Los ácidos nucleicos que codifican péptidos que se describen en el presente apartado son particularmente útiles. Los epítopos para su inclusión en un minigen se seleccionan, preferentemente, de acuerdo con directrices establecidas en la sección anterior. Un medio preferente de administración de ácidos nucleicos que codifican dichos péptidos usa constructos de minigen que codifican un péptido que comprende uno o múltiples epítopos.

El uso de minigenes de varios epítopos se describe más adelante y en Ishioka y col., J. Immunol. 162:39153925,1999; An, L. y Whitton, J. L, J. Virol. 71:2292,1997; Thomson, S. A. y col., J. Immunol. 157:822, 1996; Whitton,

J. L. y col., J. Virol. 67:348, 1993; Hanke, R. y col., Vaccine 16:426, 1998. Por ejemplo, puede diseñarse un plásmido de AND de varios epítopos qe codifica epítopos que portan supermotivos y/o motivos derivado de 184P1E2, el epítopo de células T cooperador universal PADRE® o epítopos HTL múltiples de 184P1E2 (véanse, por ejemplo, las tablas V-XVIII y XXII a LI) y una secuencia de señal de translocación de retículo endoplásmico. Una vacuna puede comprender también epítopos que estén derivados de otras TAA.

La inmunogenicidad de un minigen multiepitópico puede confirmarse en ratones transgénicos para evaluar la magnitud de las repuestas de inducción CTL contra los epítopos analizados. Además, la inmunogenicidad de epítopos codificados por ADN in vivo puede correlacionarse con las respuestas in vitro de líneas de CTL específicas contra células diana transfectadas con el plásmido de ADN. De este modo, estos experimentos pueden mostrar que el minigen sirve: 1.) para generar una respuesta CTL y 2.) que las CTL inducidas han reconocido las células que expresan los epítopos codificados.

Por ejemplo, para crear una secuencia de ADN que codifica los epítopos seleccionados (minigen) para la expresión en células humanos, las secuencias de aminoácidos de los epítopos pueden traducirse de modo inverso. Puede usarse una tabla de uso de codones humanos para guiar la elección de codones para cada aminoácido. Estas secuencias de ADN que codifican epítopos puede adjuntarse directamente, de tal modo que cuando se traducen, se crea una secuencia de polipéptidos continua. Para la expresión optimizada y/o inmunogenicidad, pueden incorporarse elementos adicionales en el diseño del minigen. Los ejemplos de secuencias de aminoácidos que pueden traducirse de modo inverso e incluirse en la secuencia del minigen incluyen: epítopos de HLA de clase I, epítopos de HLA de clase II, epítopos de anticuerpos, una secuencia de señal de ubiquitanación y/o una señal dirigida a retícula endoplásmico. Además, la presentación de HLA de epítopos CTL y HTL puede mejorarse incluyen secuencias flanqueantes sintéticas (por ejemplo, polialanina) o de origen natural adyacentes a los epítopos CTL o HTL, estos péptidos grandes que comprenden el epítopo o los epítopos se describen en el presente documento

La secuencia del minigen puede convertirse en ADN ensamblando oligonucleótidos que codifican las cadenas más y menos del minigen. Superponiendo oligonucleótidos (30-100 bases de longitud) puede sintetizarse, fosforilarse, purificarse o fusionarse en condiciones apropiadas usando técnicas bien conocidas. Los extremos de los oligonucleótidos pueden unirse, por ejemplo, usando T4 ADN ligasa. Este minigen sintético, que codifica el polipéptido del epítopo, puede clonarse a continuación dando el vector de expresión deseado.

Se incluyen en el vector, preferentemente, secuencias reguladoras estándar bien conocidas por los expertos en la técnica, para asegurar la expresión en las células diana. Varios elementos del vector son deseables: un promotor con un sitio de clonación cadena abajo para la inseción de minigen; una señal de poliadenilación para la terminación eficaz de la transcripción; un origen de E. coli de replicación y un marcador seleccionable de E. coli (por ejemplo, resistencia a amplicilina o kanamicina). Pueden usarse numerosos promotores para este propósito, por ejemplo, el promotor del citomegalovirus humano (hCMV). Véanse los documentos de patente de Estados Unidos Nº 5.580.859 y 5.589.466 para otras secuencias de promotores adecuadas.

Las modificaciones adicionales de vectores pueden desearse para optimizar la expresión y la inmunogenicidad de minigenes. En algunos casos, se requieren intrones para lograr una expresión génica eficaz, y podrían incorporarse uno o varios intrones sintéticos o de origen natural en la región transcrita del minigen. La inclusión de secuencias de estabilización de ARNm y secuencias para la replicación en células de mamífero también pueden considerarse para aumentar la expresión del minigen.

Una vez se ha seleccionado el vector de expresión, el minigen se clona en una región polienlazadora cadena abajo del promotor. Este plásmido se transforma en una cadena apropiada de E. coli, y el ADN se prepara usando técnicas estándar. La orientación y secuencia de ADN del minigen, así como todos los otros elementos incluidos en el vector se confirman usando mapeo de restricción y análisis de secuencia de ADN. Las células bacterianas que alojan el plásmido correcto pueden almacenarse en forma de un banco de células maestras y un banco de células de operación.

Además, las secuencias inmunoestimulatorias (ISS o CpG) parece que tienen un papel en la inmunogenicidad de vacunas de ADN. Estas secuencias pueden incluirse en el vector, en el exterior del minigen que codifica la secuencia, si se desea potenciar la inmunogenicidad.

En algunos casos, puede usarse un vector de expresión bicistónico que permite la producción tanto de epítopos codificados por minigen como de una segunda proteína (incluida para potenciar o disminuir la inmunogenicidad). Los ejemplos de proteínas o polipéptidos que podrían potenciar de forma beneficiosa la respuesta inmunitaria si se coexpresan incluyen citocina (por ejemplo, IL-2, IL-12, GM-CSF), moléculas que inducen citocinas (por ejempolo, LeIF), moléculas coestimuladoras, o para respuestas de HTL, proteínas de unión pan-DR (PADRETM, Epimmune, San Diego, CA, Estados Unidos). Pueden unirse epítopos cooperadores (HTL) a señales dirigidas de forman intracelular y expresarse de forma separada de epítopos CTL expresados; esto permite la dirección de los epítopos HTl a un compartimento celular diferente del de los epítopos CTL. Si se requiere, esto podría facilitar una entrada más eficaz de epítopos HTL en la ruta de HLA de clase II, mejorando, por lo tanto, la inducción de HTL. En contraste con la inducción de HTL o CTL, disminuir específicamente la respuesta inmunitaria mediante coexpresión de moléculas inmunosupresoras (por ejemplo TGF-β) puede ser beneficioso en determinadas enfermedades.

Pueden producirse cantidades terapéuticas de ADN de plásmido, por ejemplo, mediante fermentación en E. coli, seguida por purificación. Se usan partes alícuotas del banco de células de operación para inocular medio de crecimiento y se cultivan hasta saturación en recipientes agitadores o en un biorreactor según técnicas bien conocidas. El ADN plásmido puede purificarse usando tecnologías estándar de bioseparación tales como resinas de intercambio aniónico en fase sólida suministradas por QIAGEN, Inc. (Valencia, California, Estados Unidos). Si se require, puede aislarse ADN superenrollado de formas circulares o lineales abiertas usando electroforesis en gel u otros procedimientos.

Puede prepararse ADN plásmido purificado por inyección usando diversas formulaciones. La más sencilla de las mismas es la reconstitución de ADN liofilizado en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS). Este enfoque, conocidos como ADN desnudo, se está usando actualmente para la administración intramuscular (im) en ensayos clínicos. Para maximizar los efectos inmunoterapéuticos de vacunas de ADN de minigen, puede ser deseable un procedimiento alternativo para la formulación de ADN plásmido purificado. Se han descrito diversos procedimientos y pueden ponerse a disposición nuevas técnicas. También pueden usarse en la formulación lípidos catiónicos, glucolípidos y loposomas fusogénicos (véase, por ejemplo, tal como se describe en el documento WO 93/24640; Mannino & Gould-Fogerite, BioTechniques 6(7): 682 (1988); el documento de patente de Estados Unidos Nº 5.279.833; el documento WO 91/06309; y Feigner y col., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 84:7413 (1987). Además, también pueden acomplejarse péptidos y compuestos denominados colectivamente como protectores, interactivos, compuestos de no condensación (PINC) para purificar ADN plásmido para influir en variables talese como estabilidad, dispersión intramuscular o el tráfico a órganos o tipos celulares específicos.

Puede usarse sensitización de células diana como ensayo funcional para la expresión y presentación de clase I de HLA de epítopos CTL codificados por minigen. Por ejemplo, el ADN plásmido se introduce en una línea celular de mamífero que sea adecuada como diana para ensayos estándar de liberación de cromo de CTL. El procedimiento de transfección que se use dependerá de la formulación final. Puede usarse electroporación para ADN desnudo, mientras que los lípidos catiónicos permiten dirigir la transfección in vitro. Un plásmido que expresa proteína fluorescente verde (GFP) puede cotransfectarse para permitir el enriquecimiento de células transfectadas usando una selección de celulas activas por fluorescencia (FACS). A continuación, estas células se etiquetan con cromo 51 (51Cr) y se usan como células diana para líneas CTL específicas de epítopo; citólisis, detectada por liberación de 51Cr, indicando tanto la producción de, como la presentación HLA de, epítopos CTL codificados por minigen. La expresión de epítopos HTL puede evaluarse de un modo análogo usando ensayos para evaluar la actividad CTL.

La inmunogenicidad in vitro es un segundo enfoque para el análisis funcional de formulaciones de ADN de minige. Se inmunizan ratones transgénicos que expresan proteínas HLA humanas apropiadas con el producto de ADN. La dosis y vía de administración son dependientes de la formulación (por ejemplo, im para ADN en PBS, intraperitoneal (ip)para ADN acomplejado con lípidos). Veintiun días después de la inmunización, se recolectan esplenocitos y se reestimulan durante una semana en presencia de péptidos que codifican cada epítopo que se analiza. Después, para células efectoras CTL, se realizan ensayos para evaluar la citolisis de células diana etiquetadas con 51Cr cargadas con péptidos usando técnicas estándar. La lisis de células diana que se sensibilizaron mediante epítopos HLA cargados con péptidos, que corresponden a epítopos codificados por minigen, demuestra el funcionamiento de la vacuna de ADN para inducción in vivo de CTL. La inmunogenicidad de epítopos de HTL se confirma en ratones transgénicos de un modo análogo.

Alterntivamente, los ácidos nucleicos pueden administrarse usando administración balística tal como se describe, por ejemplo, en el documento de patente de Estados Unidos Nº 5.204.253. Usando esta técnica, las partículas comprendidas únicamente por ADN. En un caso más, puede adherirse ADN a las partículas, tales como partículas de oro.

También pueden administrarse minigenes usando otros sistemas de administración bacterianos o víricos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, un constructo de expresión que codifica epítopos de la invención pueden incorporarse en un vector vírico tal como una vacuna.

X.C.2. Combinación de péptidos CTL con péptidos cooperadores

Las composiciones de vacuna que comprenden péptidos CTL pueden modificarse, por ejemplo analogarse, para proporcionar atributos deseados, tales como semivida en suero mejorada, cobertura de la población más amplia o inmunogenicidad potenciada.

Por ejemplo, la capacidad de un péptido para inducir la actividad de CTL puede potenciarse uniendo el péptido a una secuencia que contiene al menos un epítopop que es capa de inducir una respuesta de célula T cooperador. Aunque un péptido CTL puede unirse directamente a un péptido T cooperador, a menudo se unen conjugados epítopo CTL/epítopo HTL mediante una molécula espaciadora. El espaciador está comprendido, normalmente, por moléculas neutras relativamente pequeñas, tales como aminoácidos o miméticos de aminoácidos, que están sustancialmente no cargadas en condiciones fisiológicas. Los espaciadores se seleccionan, normalmente, de entre Ala, Gly u otros espaciadores neutros de aminoácidos no polares o aminoácidos neutros no polares. Se entenderá que el espaciador opcionalmente presente necesita no estar comprendid por los mismos residuos y, de este modo, debe ser un heterooligómero o un homooligómero. Cuando está presente, el especiador será, generalmente, al menos de uno de uno dos residuos, más generalmente de tres a seis residuos y a veces de 10 o más residuos. El epítopo de péptido CTL puede unirse a un epítopo de péptido T cooperador bien directamente o bien mediante un espaciador tanto en el extremo amino como en el extremo carboxilo del péptido HTL. El extremo amino del péptido inmunogénico o del péptido T cooperador puede acilarse.

En determinados casos, el péptido T cooperador es uno que está reconocido por células T cooperadores presentes en la mayor parte de una población genéticamente diversa. Esto puede llevarse a cabo seleccionando péptidos que se una a mucha, la mayor parte, o todas las moléculas de clase II de HLA. Los ejemplos de dichos aminoácidos que se une a muchas moléculas de clase II de HLA incluyen secuencias de antígenos tales como toxoide de tétanos en posiciones 830-843 (QYIKANSKFIGITE), proteína circumesporozoito (CS) de Plasmodium falciparum en las posiciones 378-398 (DIEKKIAKMEKASSVFNVVNS, y proteína de 18kD de estreptococos en las posiciones 116-131 (GAVDSILGGVATYGAA). Otros ejemplos incluyen péptidos que portan un supermotivo DR 1-4-7 o cualquiera de los motivos DR3.

Alternativamente, es posible preparar péptidos sintéticos capaces de estimular linfocitos T cooperadores, en una forma restringida por HLA de forma suelta, usando secuencias de aminoácidos que no se encuentran en la naturaleza (véase, por ejemplo, la publicación PCT WO 95/07707). Estos compuestos sintéticos denominados epítopos de unión Pan-DR (por ejemplo, PADRETM, Epimmune, Inc., San Diego, CA, Estados Unidos) están diseñados para unirse preferentemente a la mayor parte de moléculas HLA-DR (humanas HLA de clase II). Por ejemplo, un péptido de epítopo de unión a pan-DR que tiene la fórmula: aKXVAAWTLKAAa, en la que “X” es una cualquiera entre ciclohexilalanina, fenilalanina o tirosina, y a es cualquiera de entre D-alanina o L-alanina, se ha encontrado que se unen a alelos HLA-DR, y para estimularla respuesta de linfocitos T cooperadores de la mayor parte de los individuos, con respecto a su tipo HLA. Una alternativa de un epítopo de unión a pan-DR comprende todos los aminoácidos “L” naturales y puede proporcionar en la forma de ácidos nucleicos que codifican el epítopo.

Los epítopos de péptidos HTl también pueden modificarse para alterar sus propiedades biológicas. Por ejemplo, pueden modificarse para incluir D-aminoácidos para aumentar su resistencia a proteasas y, de este modo, prolongar su semivida en suero, o pueden conjugarse a otras moléculas tales como lípidos, proteínas, carbohidratos y similares para aumentar su actividad biológica. Por ejemplo, un péptido T cooperador puede conjugarse a una o varias cadenas de ácido palmítico en cualquiera de los extremos, amino o carboxilo.

X.C.3. Combinaciones de péptidos CTL con agentes de cebado de células T

En algunos casos puede ser deseable incluir en las composiciones farmacéuticas al menos un componente que cebe linfocitos B o linfocitos T. Se han identificado lípidos como agentes capaces de cebar CTL in vivo. Por ejemplo, pueden unirse residuos de ácido palmítico a grupos amino α y ε de un residuo de lisina y, a continuación, unirse, por ejemplo, a través de uno o varios residuos de unión tales como Gly, Gly-Gly-, Ser, Ser-Ser o similares a un péptido inmunogénico. El péptido lipidado puede administrarse, a continuación, directamente en un micelo o partícula, incorporada en aliposoma, o emulsificarse en un coadyuvante, por ejemplo, coadyuvante de Freund incompleto. En un caso preferente, una composición inmunogénica particularmente eficaz comprende ácido palmítico unido a grupos amino α y ε de Lys, que está unido mediante la unión, por ejemplo, Ser-Ser, a un extremo amino del péptido inmunogénico.

Como otro ejemplo de lípidos de cebado de respuestas CTL, lipoproteínas de E. col., tales como tripalmitoil-Sglicerilcisteinliseril-serina (P3CSS) pueden usarse para cebar CTL específico de virus cuando se unen covalentemente a un péptido apropiado (véase, por ejemplo, Deres y col., Nature 342:561, 1989). Los péptidos pueden acoplarse a P3CSS, por ejemplo, y el lipopéptido administrarse a un individuo para cebar específicamente una respuesta inmunitaria a un antígeno diana. Además, debido a que la inducción de anticuerpos de neutralización también puede cebarse con epítopos conjugados a P3CSS, dos de dichas composiciones pueden combinarse para facilitar de modo más eficaz las respuestas humoral y mediada por células.

X.C.4. Composiciones de vacuna que comprenden DC pulsado con péptidos CTL y/o HTL

Una composición de vacuna puede comprender la administración ex vivo de un coctel de péptidos que portan un epítopo a PBMC, o DC aislado del mismo, a partir de la sangre del paciente. Puede usarse un producto farmacéutico para facilitar la recolección de DC, tal como ProgenipoyetinaTM (Pharmacia-Monsanto, St. Louis, MO, Estados Unidos) o GM-CSF/IL-4. Después de pulsar los DC con péptidos y antes de la reinfusión a los pacientes, los DC se lavan para eliminar el péptido no unido. En este caso, una vacuna comprende DC pulsado con péptidos que presentan epítopos de péptidos pulsados acomplejados con moléculas HLa en su superficie.

El DC puede pulsarse ex vivo con un coctel de péptidos, algunos de los cuales estimulan las respuestas CTL de 184P1E2. Opcionalmente, puede incluirse un péptido de célula T cooperador (HTL), tal como un péptido de clase II de HLA restringido de forma suelta natural o artificial, para facilitar la respuesta CTL. De este modo puede usarse una vacuna para tratar un cáncer que exprese o sobreexprese 184P1E2.

X.Dinmunoterapia adoptiva

Se usan péptidos relacionados con 184P1E2 antigénicos para facilitar una respuesta CTL y/o HTL ex vivo, también. Las células CTL o HTL resultantes pueden usarse para tratar tumores en pacientes que no respondan a otras formas convencionales de terapia o que no respondan a un péptido o ácido nucleico de vacuna terapéutica. Las respuestas CTL o HTL ex vivo a un antígeno particular se inducen mediante incubación en cultivo tisular de células procusoras de CTL o HTL del paciente, o genéticamente compatibles, junto con una fuente de células que presentan antígeno (APC), tales como células dendríticas, y el péptido inmunogénico apropiado. Después de un tiempo de incubación apropiado (normalmente aproximadamente 7-28 días), en el que las células precursoras se activan y expanden en células efectoras, las células se infunden de nuevo al paciente, donde destruirán (CTL) o facilitarán la destrucción (HTL) de sus células diana específicas (por ejemplo, una células tumoral). También pueden usarse células dendríticas transfectadas como células que presentan antígeno.

X.E. Administración de vacunas con fines terapéuticos o profilácticos

Las composiciones farmacéuticas y de vacuna se usan normalmente para tratar y/o prevenir un cáncer que expresa

o sobreexpresan 184P1E2. En aplicaciones terapéuticas, se administran composiciones de péptidos y/o ácidos nucleicos a una paciente en una cantidad suficiente para facilitar una respuesta eficaz de célula B, CTL y/o HTL a un antígeno y para curar o al menos detener o ralentizar síntomas y/o complicaciones. Una cantidad adecuada para realizar lo anterior se define como dosis terapéuticamente eficaz. Las cantidades eficaces para este uso dependerán de, por ejemplo, la composición particular que se administre, el modo de administración, el estado y gravedad de la enfermedad que se está tratando, el peso y estado general de salud del paciente y el juicio del médico que la prescribe.

Las composiciones farmacéuticas, péptidos inmunogénicos o ADN que los codifica, se administran generalmente a un individuo que ya porta un tumor que expresa 184P1E2. Los péptido o el ADN que los codifica pueden administrarse individualmente o como fusión de una o varias secuencias de péptidos. Los pacientes pueden tratarse con los péptidos inmunogénicos de forma separada o conjuntamente con otros tratamientos, tales como cirugía, si es apropiado.

Para uso terapéutico, la administración debe comenzar, generalmente, en el primer diagnóstico de cáncer asociado con 184P1E2. Se sigue con dosis de refuerzo hasta que al menos se abatan sustancialmente los síntomas y durante un periodo después de ello. La composición de vacuna (es decir, incluidos, pero sin limitarse a, cócteles de péptidos, polipéptidos poliepitópicos, minigenes o CTL o células dendríticas pulsadas específicas de TAA) que se administra al paciente puede variar según el estado de la enfermedad o el estado de salud del paciente. Por ejemplo, en un paciente con un tumor que expresa 184P1E2, una vacuna que comprende CTL específica de 184P1E2 puede ser más eficaz en destruir células tumorales en un paciente con enfermedad avanzada que realizaciones alternativas.

Es generalmente importante proporcionar una cantidad del epítopo del péptido administrado mediante un modo de administració suficiente para estimular eficazmente una respuesta de célula T citotóxica; composiciones que estimulan respuestas de células T T cooperadoresambién pueden proporcionarse según la invención.

La dosis para una inmunización terapéutica inicial se encuentra generalmente en un intervalo de dosis unidad en el que el valor inferior es aproximadamente de 1, 5, 50, 500 ó 1.000 µg y el valor máximo es de aproximadamente 10.000; 20.000; 30.000 ó 50.000 µg. Los valores de dosificación para un ser humano varían normalmente de aproximadamente 500 µg a aproximadamente 50.000 µg para pacientes de 70 kilogramos de peso. Pueden administrarse dosis de refuerzo de entre aproximadamente 1,0 µg a aproximadamente 50.000 µg de péptido de acuerdo con un régimen de refuerzo durante semanas o meses, dependiendo de la respuesta y la condición del paciente tal como se determina midiendo la actividad específica de CTL y HTL obtenida de la sangre del paciente. La administración debe continuar hasta que al menos los síntomas clínicos o los ensayos de laboratorio indiquen que la neoplasia se ha eliminado o reducido y durante un periodo posterior. Las dosis, vías de administración y programas de dosificación se ajustan de acuerdo con metodologías conocidas en la técnica.

En determinados casos, los péptidos y composiciones descritos se emplean en estados de enfermedad graves, es decir, en situaciones que ponen en peligro la vida o que potencialmente ponen en peligro la vida. En dichos casos, como resultado de las cantidades mínimas de sustancias extrañas y la naturaleza relativamente no tóxica de los péptidos en composiciones preferentes de la invención, es posible y puede ser deseable, por parte del médico tratante, administrar excesos sustanciales de estas composiciones de péptidos con relación a estas cantidades de dosificación establecidas.

Las composiciones de vacuna también pueden usarse en forma pura como agentes profiláticos. Generalmente, la dosis para una inmunización profiláctica inicial se encuentra, en general, en un intervalo de dosis unidad en el que el valor inferior es de aproximadamente 1, 5, 50, 500 ó 1.000 µg y el valor superior es de aproximadamente 10.000; 20.000; 30.000 ó 50.000 µg. Los valores de dosificación para un ser humano varían normalmente desde aproximadamente 500 µg a aproximadamente 50.000 µg para un ser humano de 70 kg. Se sigue con dosis de refuerzo de entre aproximadamente 1,0 µg a aproximadamente 50.000 µg de péptido administrado a intervalos definidos de desde aproximadamente 4 semanas a seis meses después de la administración inicial de la vacuna. La inmunogenicidad de la vacuna puede evaluarse midiendo la actividad específica del CTL y HTL obtenido de una muestra de sangre del paciente.

Las composiciones farmacéuticas para tratamiento terapéutico se pretenden para administración parenteral, tópica, oral, nasal, intratecal o local (por ejemplo, como crema o pomada tópica). Preferentemente, las composiciones farmacéuticas se administran parenteralmente, por ejemplo, intravenosamente, subcutáneamente, intradérmicamente o intramuscularmente. De este modo, se describen en el presente documento composiciones para administración parenteral que comprenden una solución de los péptidos inmunogénicos disueltos o suspendidos en un vehículo aceptable, preferentemente un vehículo acuoso.

Pueden usarse diversos vehículos acuosos, por ejemplo, agua, agua tamponada, solución salina al 0,8 %, glicina al 0,3 %, ácido hialurónico y similares. Estas composiciones pueden esterilizarse por medio de técnicas convencionales de esterilización bien conocidas, o pueden filtrarse de forma estéril. Las soluciones acuosas resultantes pueden empaquetarse para su uso como tales, o liofilizarse, combinándose la preparación liofilizada con una solución estéril antes de su administración.

Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables si se requieren para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes tamponadores o de ajuste de pH, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes humectantes, conservantes y similares, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina, etc.

La concentración de péptidos en las formulaciones farmacéuticas puede variar ampliamente, es decir, de menos de aproximadamente el 0,1 %, generalmente a o al menos aproximadamente el 2 %, hasta un máximo del 20 % o el 50 % o más en peso, y se seleccionarán principalmente por volúmenes de fluido, viscosidades, etc., según el modo particular de administración seleccionado.

Una forma de dosis unidad humana de una composición está normalmente incluida en una composición farmacéutica que comprende una dosis unidad humana de un vehículo aceptable, en una realización un vehículo acuoso, y se administra en una cantidad/volumen que es conocida por los expertos en la técnica que se usa para la administración de dichas composiciones a seres humanos (véase, por ejemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17ª edición, A. Gennaro, Editor, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, Estados Unidos, 1985). Por ejemplo, una dosis de péptidos para la inmunización inicial puede ser de aproximadamente 1 a aproximadamente

50.000 µg, generalmente de 100-5.000 µg para un paciente de 70 kg. Por ejemplo, para ácidos nucleicos una inmunización inicial puede realizarse usando un vector de expresión en forma de ácido nucleico desnudo administrado im (o SC o ID) en cantidades de 0,5-5 mg en múltiples sitios. El ácido nucleico (0,1 a 1.000 µg) también puede administrarse usando una pistola génica. Siguiendo a un periodo de incubación de 3-4 semanas, se administra una dosis de refuerzo. El refuerzo puede ser virus de la viruela aviar recombinante administrado en una dosis de 5-107 a 5x109 ufp.

Para anticuerpos, un tratamiento generalmente implica la administracion repetida de una preparación de anticuerpos anti-184P1E2, por medio de una vía de administración aceptable tal como inyección intravenosa (iv), normalmente a una dosis en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal. En general, las dosis en el intervalo de 10-500 mg de mAb por semana son eficaces y bien toleradas. Además, una dosis de carga inicial de aproximadamente 4mg/kg de peso corporal del paciente N, seguida de dosis semanales de aproximadamente 2 mg/kg iv de la preparación de mAb anti-184P1E2 representa un régimen de dosificación aceptable. Tal como apreciarán los expertos en la técnica, pueden influir diversos factores sobre la dosis ideal en un caso particular. Dichos factores incluyen, por ejemplo, la semivida de la composición, la afinidad de unión de un Abm, la inmunogenicidad de una sustancia, el grado de expresión de 184P1E2 en el paciente, la amplitud de la zona de circulación del antígeno 184P1E2, el nivel de concentracion en el estado estacionario deseado, la frecuencia del tratamiento y la influencia de quimioterapia o de otros agentes que se usen en combinación con el procedimiento de tratamiento de la invención, así como el estado de salud general de un paciente particular. Las dosis unidad humanas preferentes no limitantes son, por ejemplo, 500 µg – 1 mg, 1 mg – 50 mg, 50 mg – 100 mg, 100 mg – 200 mg, 200 mg-300 mg, 400 mg – 500 mg, 500 mg – 600 mg, 600 mg – 700 mg, 700 mg – 800 mg, 800 mg – 900 mg, 900 mg - 1 g ó 1 mg – 700 mg. En determinadas realizaciones, la dosis está en un intervalo de 2-5 mg/kg de peso corporal, por ejemplo, con un seguimiento de dosis semanales de 1-3 mg/kg; 0,5 mg, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 mg/kg de peso corporal seguidos, por ejemplo, en dos, tres o cuatro semanas por dosis semanales; 0,5 – 10 mg/kg de peso corporal seguidos, por ejemplo, en dos, tres o cuatro semanas por dosis semanales; 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400 mg por m2 de area corporal semanalmente; 1-600 mg por m2 de area corporal semanalmente; 225-400 mg por m2 de area corporal semanalmente, estas dosis pueden seguirse por dosis semanales durante 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 19, 11, 12 o más semanas.

En un caso, las formas de dosis unidad humanas de polinucleótidos comprenden un intervalo de dosificación adecuado o una cantidad eficaz que proporciona cualquier efecto terapéutico. Como apreciará un experto en la técnica, una cantidad terapéuticamente eficaz depende de una serie de factores, que incluyen la secuencia de los polinucleótidos, el peso molecular del polinucleótidos y la vía de administración. Las dosis se seleccionan generalmente por el médico u otro profesional de la salud según diversos parámetros conocidos en la técnica, tales como gravedad de los síntomas, historial del paciente y similares. Generalmente, para un polinucleótido de aproximadamente 20 bases, un intervalo de dosificación puede seleccionarse desde, por ejemplo, un límite inferior seleccionado independientemente tal como aproximadamente 0,1, 0,25, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 ó 500 mg/kg hasta un límite superior seleccionado independientemente, mayor que el límite inferior, de aproximadamente 60, 80, 100, 200, 300, 400, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 ó 10,000 mg/kg. Por ejemplo, una dosis puede ser aproximadamente una cualquiera de las siguientes: 0,1 a 100 mg/kg, 0,1 a 50 mg/kg, 0,1 a 25 mg/kg, 0,1 a 10 mg/kg, 1 a 500 mg/kg, 100 a 400 mg/kg, 200 a 300 mg/kg, 1 a 100 mg/kg, 100 a 200 mg/kg, 300 a 400 mg/kg, 400 a 500 mg/kg, 500 a 1000 mg/kg, 500 a 5000 mg/kg o 500 a

10.000 mg/kg. Generalmente, las vías de administración parenteral pueden requerir dosis mayores de polinucleótidos en comparación con una aplicación más directa del nucleótido al tejido enfermo, como se hace con polinucleótidos de longitud creciente.

En un caso, las formas de dosificación unidad humanas de células T comprenden un intervalo de dosificación adecuado o una cantidad eficaz que proporciona un efecto terapéutico. Como apreciará un experto en la técnica, un efecto terapéutico dependerá de una serie de factores. Las dosis se seleccionan generalmente por un médico u otro profesional de la salud de acuerdo con diversos parámetros conocidos en la técnica, tales como la gravedad de los síntomas, el historial del paciente y similares. Una dosis puede ser de aproximadamente 104 células a aproximadamente 106 células, de aproximadamente 106 células a aproximadamente 108 células, de aproximadamente 108 a aproximadamente 1011 células o de aproximadamente 108 a aproximadamente 5x1010 células. Una dosis puede ser también de aproximadamente 106 células/m2 a aproximadamente 1010 células/m2 o de aproximadamente 106 células/m2 a aproximadamente 108 células/m2.

También pueden administrarse proteínas y/o ácidos nucleicos que codifican las proteínas, por medio de liposomas, que también pueden servir para: 1) dirigir las proteínas a un tejido particular, tal como un tejido linfoide; 2) dirigir selectivamente a las células de la enfermedad; o 3) aumentar la semivida de la composición de péptidos. Los liposomas incluyen emulsiones, espumas, micelos, monocapas insolubles, cristales líquidos, dispersiones de fosfolípidos, capas lamelares y similares. En estas preparaciones, el péptido que se va a administrar se incorpora como parte de un liposoma solo o conjuntamente con una molécula que se une a un receptor prevalente entre células linfoides, tal como anticuerpos monoclonales que se unen al antígeno CD45, o con otras composiciones terapéuticas o inmunogénicas. De este modo, pueden dirigirse liposomas llenos o decorados con un péptido deseado al sitio de células linfoides, donde los liposomas suministran, a continuación, las composiciones de péptidos. Los liposomas para un uso tal como se describe en el presente documento se forman a partir de lípidos que forman la vesícula estándar, que generalmente incluyen fosfolípidos neutros y cargados negativamente y un esterol, tal como el colesterol. La selección de lípidos se realiza, generalmente, considerando, por ejemplo, el tamaño del liposoma, la labilidad ácida y la estabilidad de los liposomas en el torrente sanguíneo. Están disponibles diversos procedimientos para preparar liposomas, tal como se describe, por ejemplo, en Szoka y col., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1 980) y los documentos de patente de Estados Unidos Nº 4.235.871, 4.501.728, 4.837.028 y 5.019.369.

Para células dirigidas del sistema inmunitario, puede incluirse un ligando para incorporarlo al liposoma, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos para determinantes de superficie celular de las células deseadas del sistema inmunitario. Una suspensión de liposomas que contiene un péptido puede administrarse intravenosamente, localmente, tópicamente, etc. en una dosis que varía según, entre otras cosas, el modo de administración, el péptido que se va a administrar y el estado de la enfermedad que se está tratando.

Para composiciones sólidas, pueden usars vehículos sólidos no tóxicos convencionales que incluye, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sodio, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio y similares. Para la administracion oral, una composición farmacéuticamente aceptable no tóxica se forma incorporando cualquiera de los excipientes que se usan normalmente, tales como los vehículos enumerados anteriormente y, en general, 10-95 % de ingrediente activo, es decir, uno o varios péptidos, y más preferentemente a una concentración del 25 % al 75 %.

Para la administración en aerosol, los péptidos inmunogénicos se suministran preferentemente en forma dividida finamente junto con un tensioactivo y un propulsor. Los porcentajes típicos de péptidos son aproximadamente 0,01 &

- 20 % en peso, preferentemente aproximadamente 1 % - 10 %. El tensioactivo, naturalmente, debe ser no tóxico, y preferentemente soluble en el propulsor. Son representativos de dichos agentes los ésteres o ésteres parciales de ácidos grasos que contienen de aproximadamente 6 a 22 átomos de carbono, tales como los ácidos caproico, octanoico, láurico, palmítico, esteárico, linoleico, linolénico, olestérico y oleico con un alchohol polihidroxílico alifático,

o su anhídrido cíclico. Pueden usarse ésteres mixtos tales como glicéridos mixtos o naturales. El tensioactivo puede constituir de aproximadamente el 0,1 al 20 % en peso de la composición, preferentemente de aproximadamente el 0,25 al 5 %. El resto de la composición es, de forma ordinaria, propulsor. También puede incluirse un vehículo, si se desea, tal como, por ejemplo, lecitina para administración intranasal

Xl.) Realización de diagnóstico y pronóstico de 184P1E2.

Tal como se ha divulgado en el presente documento, se usan polinucleótidos, polipéptidos, células T citotóxicas reactivas con (CTL), células T cooperadores reactivas con (HTL) y anticuerpos antipolipéptidos 184P1E2 en ensayos de diagnóstico, pronóstico y terapéuticos que examinan afecciones asociadas con la desregulación del crecimiento celular tales como cáncer, en particular los tipos de cáncer enumerados en la tabla I (véase, por ejemplo, su patrón específico de expresión en tejidos, así como su sobre expresión en determinados tipos de cáncer tal como se describe, por ejemplo, en el ejemplo titulado Análisis de expresión de 184P1E2 en tejidos normales y especimenes de pacientes).

184P1E2 puede analogizarse a un antígeno PSA asociado a próstata, el marcador arquetípico que ha sido usado por médicos durante años para identificar y supervisar la presencia de cáncer de próstata (véase, por ejemplo, Merrill y col., J. Urol. 163(2): 503-5120 (2000); Polascik y col., J. Urol. agosto; 162(2):293-306 (1999) y Fortier y col.,

J. Nat Cancer Inst 91 (1 9):1 635-1 640(1 999)). También se usan otros diversos marcadores de diagnóstico en contextos similares, que incluyen p53 y K-ras (véase, por ejemplo, Tulchinsky y col., Int J Mol Med 1999 Jul 4(1):99102 y Minimoto y col., Cancer Detect Prev 2000;24(1): 1-12). Por lo tanto, esta descripción de polinucleótidos y polipéptidos 184P1E2 (también se usan sondas de polinucleótidos 184P1E2 y anticuerpos anti-184P1E2 para identificar la presencia de estas moléculas) y sus propiedades permiten al experto usar estas moléculas en procedimientos que son análogos a los usados, por ejemplo, en diversos ensayos de diagnóstico dirigidos a examinar afecciones asociadas con cáncer

Los casos típicos de procedimientos de diagnóstico que usan los polinucleótidos, polipéptidos, células T reactivas con y anticuerpos 184P1E2 son análogos a los procedimientos de ensayos de diagnóstico bien establecidos que usan, por ejemplo, polinucleótidos, polipéptidos, células T reactivas y anticuerpos PSA. Por ejemplo, de igual modo que los polinucléotidos PSA se usan como sondas (por ejemplo de análisis de inmunotransferencia (Northern), véase, por ejemplo, Sharief y col., Biochem. Mol. BioL Int 33(3):567-74(1994)) y cebadores (por ejemplo en análisis de PCR, véase, por ejemplo, Okegawa y col., J. Urol. 163(4): 1189-1190 (2000)) para observar la presencia y/o el nivel de ARNm de PSA en procedimientos de supervisión de la sobreexpresión de PSA o la metástasis de cáncer de próstata, los nucleótidos 184P1E2 que se describen en el presente documento se pueden usar del mismo modo para detectar la sobreexpresión de 184P1E2 o la metástasis de cáncer de próstata y de otros tipos de cáncer que expresen este gen. Alternativamente, de igual modo que los polipéptidos se usan para generar anticuerpos específicos de PSA que pueden usarse después para observar la presencia y/o el nivel de proteínas PSA en procedimientos para supervisar la sobreexpresión de proteína PSA (véase, por ejemplo, Stephan y col., Urology 55(4):560-3 (2000)) o la metástasis de células de células de próstata (véase, por ejemplo, Alanen y col., Pathol. Res. Pract. 192(3):233-7 (1996)), los polipéptidos 184P1E2 que se describen en el presente documento pueden usarse para generar anticuerpos para su uso en la detección de la sobreexpresión de 184P1E2 o la metástasis de células de próstata y células de otros tipos de cáncer que expresan este gen.

Específicamente, debido a que la metástasis implica en movimiento de células de cáncer desde un órgano de origen (tal como el pulmón o glándula prostática, etc.) a una zona diferente del organismo (tal como los ganglios linfáticos), pueden usarse ensayos que examinan una muestra biológica para evaluar la presencia de células que expresan polinucleótidos y/o polipéptidos 184P1E2 para proporcionar evidencias de metástasis. Por ejemplo, cuando una muestra biológica de un tejido que no contiene normalmente células que expresan 184P1E2 (ganglios linfáticos) se encuentra que contiene células que expresan 184P1E2 tal como la expresión de 184P1E2 observada en LAPV4 y LAPC9, xenoinjertos aislados de ganglios linfáticos y metástasis ósesa, respectivamente, este hallazgo es indicativo de metástasis.

Alternativamente, pueden usarse polinucleótidos y/o polipéptidos 184P1E2 para proporcionar evidencias de cáncer, por ejemplo, cuando las células de una muestra biológica que no expresan normalmente 184P1E2 o expresan 184P1E2 en niveles diferentes se encuentra que expresan 184P1E2 o tienen una expresión aumentada de 184P1E2 (véase, por ejemplo, la expresión de 184P1E2 en los tipos de cáncer enumerados en la tabla I y en muestras de pacientes, etc. que se muestran en las figuras adjuntas). En dichos ensayos, los operarios pueden desear posteriormente generar evidencias complementarias de metástasis analizando la muestra biológica para evaluar la presencia de un segundo marcador restringido a tejido (además del 184P1E2) tal como PSA, PSCA, etc. (véase, por ejemplo, Alanen y col., Pathol. Res. Pract. 192(3): 233-237 (1996)).

Del mismo modo que los expertos usan los fragmentos de polinucleótido y las variantes de polinucleótido PSA para su uso en procedimientos de supervisión de PSA, de un modo análogo se usan los fragmentos de polinucleótidos y variantes de polinucleótidos de 184P1E2. En particular, los polinucleótidos PSA típicos que se usan en procedimientos de supervisión de PSA son sondas o cebadores que están constituidos por fragmentos de la secuencia de ADNc de PSA. Ilustrando esto, los cebadores que se usan para amplificar por PCR un polinucleótido PSA deben incluir menos que la secuencia completa de PSA para operar en la reacción en cadena de la polimerasa. En el contexto de dichas reacciones PCR, el experto generalmente crea diversos fragmentos de polinucleótidos diferentes que pueden usarse como cebadores con el fin de amplificar porciones diferentes de un polinucleótido de interés o para optimizar las reacciones de amplificación (véase, por ejemplo, Caetano-Anolles, G. Biotechniques 25(3): 472-476,478-480(1998); Robertson y col., Methods Mol. Biol. 98:121-154 (1998)). Una ilustración adicional del uso de dichos fragmentos es proporcionar en el ejemplo titulado Análisis de expresión de 184P1E2 en tejidos normales y especímenes de paceintes, en el que se usa un fragmento de polinucleótido 184P1E2 como sonda para mostrar la expresión de ARN de 184P1E2 en células cancerosas. Además, se usan normalmente secuencias de polinucleótido variantes como cebadores y sondas para los ARNm correspondientes en PCR y análisis de inmunotransferencia (Northern) (véase, por ejemplo, Sawai y col., Fetal Diagn. Ther. 1996 Nov-Dic 11(6):407-13 y Current Protocols In Molecular Biology, Volumen 2, Unidad 2, Frederick M. Ausubel y col. eds., 1995)). Los fragmentos y variants de polinucleótidos son útiles en este contexto en el que son capaces de unirse a una secuencia de polinucleótidos diana (por ejemplo, un polinucleótido 184P1E2 que se muestra en la figura 2 o una variante del mismo) en condiciones de alta estringencia.

Además, se usan polipéptidos PSA que contienen un epítopo que puede ser reconocido por un anticuerpo o célula T que se une específicamente a ese epítopo en procedimientos de supervisión de PSA. También pueden usarse fragmentos de polipéptido y análogos o variantes de polipéptido 184P1E2 de un modo análogo. Esta práctica de usar frgmentos de polipéptido o variantes de polipéptido para generar anticuerpos (tales como anticuerpos anti-PSA

o células T) es típica en la técncia con una amplia variedad de sistemas tales como proteínas de fusión que están siendo usadas por expertos (véase, por ejemplo, Current Protocols In Molecular Biology, Volumen 2, Unida 16, Frederick M. Ausubel y col. eds., 1995). En este contexto, cada una de las funciones de los epítopos proporciona la arquitectura con la que un anticuerpo o célula T es reactivo. Normalmente, los expertos crean diversos fragmentos de polipéptidos diferentes que pueden usarse con el fin de generar respuestas inmunitarias específicas de porciones diferentes de un polipéptido de interés (véase, por ejemplo, el documento de patente de Estados Unidos Nº

5.840.501 y el documento de patente de Estados Unidos Nº 5.939.533). Por ejemplo, puede ser preferente usan un polipéptido que comprende uno de los motivos biológicos de 184P1E2 que se tratan en el presente documetno o una subsecuencia que porta un motivo que se haya identificado por un experto en la técncia sobre la base de motivos disponibles en la técnica. Los fragmentos, variantes o análogos de polipéptidos son útile, normalmente, en este contexto mientras comprendan un epítopo capaz de generar un anticuerpo o célula T específio de una secuencia de polipéptidos diana (por ejemplo, un polipéptido que se muestra en la figura 3).

Tal como se muestra en el presente documento, los polinucleótidos y polipéptidos 184P1E2 (así como las sondas de polinucleótidos 184P1E2 y anticuerpos o células T anti-184P1E2 que se usan para identificar la presencia de estas moléculas) muestran propiedades específicas que los hacen útiles en el diagnóstico de tipos de cáncer tales como los enumerados en la tabla I. Los ensayos de diagnóstico que miden la presencia de productos génicos 184P1E2, con el fin de evaluar la presencia o aparición de una afección patológica que se describe en el presente documento, tal como cáncer de próstata, se usan para identificar pacientes para medidas preventivas o supervisión posterior, como se ha hecho de forma exitosa con PSA. Además, estos materiales satisfacen una necesidad en la técnica para moléculas que tienen características similares o complementarias a PSA en situaciones en las que, por ejemplo, no puede realizarse un diagnóstico definitivo de metástasis de origen prostático sobre la base de un análisis de PSA solo (véase, por ejemplo, Alanen y col., Pathol. Res. Pract. 192(3): 233-237 (1996)) y, en consecuencia, se necesita usar materiales tales como polinucleótidos y polipéptidos 184P1E2 (así como sondas de polinucleótidos 184P1E2 y anticuerpos anti-184P1E2 que se usan para identificar la presencia de estas moléculas) para confirmar una metástasis de origen prostático.

Finalmente, además de su uso en ensayos de diagnóstico, los polinucleótidos 184P1E2 que se divulgan en el presente documento poseen una serie de otras utilidades tales como su uso en la identificación de anomalías cromosómicas asociadas oncogenéticamente en la región cromosómica en la que se mapea el gen 184P1E2 (véase el ejemplo titulado Mapeo cromosómico de 184P1E2, más adelante). Además, aparte de su uso en ensayos de diagnóstico, las proteínas relacionadas con 184P1E2 y los polinucleótidos 184P1E2 que se divulgan en el presente documento tienen otras utilidades tales como su uso en análisis forenses de tejidos de origen desconocido (véase, por ejemplo, Takahama K Forensic Sci Int 1996 Jun 28;80(1-2): 63-9).

Adicionalmente, las proteínas relacionadas con 184P1E2 o los polinucleótidos 184P1E2 pueden usarse para tratar una afección patológica caracterizada por la sobreexpresión de 184P1E2. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos

o de ácidos nucleicos de la figura 2 o la figura 3, o fragmentos de cualquiera de ellas, pueden usarse para generar una respuesta inmunitaria a un antígeno 184P1E2. Pueden usarse anticuerpos u otras moléculas que reaccionan con 184P1E2 para modular el funcionamiento de estas moléculas y, por lo tanto, proporcionan un beneficio terapéutico.

Inhibición del funcionamiento de proteínas 184P1E2

En el presente apartado se describen varios procedimientos y composiciones para inhibir la unión de 184P1E2 a su asociado de unión o su asociación con otra(s) proteína(s), así como procedimientos para inhibir el funcionamiento de 184P1E2

XII.A.) Inhibición de 184P1E2 con anticuerpos intracelulares

En un enfoque, se introduce un vector recombinante que codifica anticuerpos monocatenarios que se unen específicamente a 184P1E2 en células que expresan 184P1E2 mediante tecnologías de transferencia de genes. En consecuencia, los anticuerpos anti-184P1E2 monocatenarios codificados se expresan intracelularmente, se unen a la proteína 184P1E2 y, de este modo, inhiben su función. Los procedimientos para diseñar dichos anticuerpos monocatenarios intracelulares son bien conocidos. Dichos anticuerpos intracelulares, también conocidos como intracuerpos, están dirigidos específicamente a un compartimiento particular dentro de la célula, que proporciona un control sobre se localiza la actividad inhibitoria del tratamiento. Esta tecnología se ha aplicado exitosamente en la técnica (para una revisión, véase Richardson y Marasco, 1995, TIBTECH vol. 13). Los intracuerpos se han mostrado para eliminar virtualmente la expresión de los, de otro modo abundantes, receptores de la superficie celular (véase, por ejemplo, Richardson y col., 1995, Proc. NatI. Acad. Sci. USA 92: 3137-3141; Beerli y col., 1994, J. BioL Chem .289: 23931-23936; Deshane y col., 1994, Gene Ther. 1:332-337).

Los anticuerpos monocatenarios comprenden los dominios variables de la cadena pesada y ligera unidos por un polipéptido enlazador flexible, y se expresan como polipéptidos sencillos. Opcionalmente, los anticuerpos monocatenarios se expresan como un fragmento de región variable monocatenario unido a una región constante de cadena ligera. Se diseñan señales de tráfico intracelulares bien conocidas en vectores de polinucleótidos recombinantes que codifican dichos anticuerpos monocatenarios con el fin de dirigir con precisión el intracuerpo al compartimiento intracelular deseado. Por ejemplo, se diseñan intracuerpos dirigidos al retícula endoplásmico (ER) para incorporar un péptido líder y, opcionalmente, una señal de retención de ER de extremo C, tal como el motivo de aminoácidos KDEL. Los intracuerpos que se pretende que ejerzan actividad en el núcleo se diseñan para que incluyan una señal de localización nuclear. Los restos de lípidos se unen a los intracuerpos con el fin de enlazarse al intracuerpo en el lado citosólico de la membrana plasmática. Los intracuerpos también pueden dirigirse para ejercer una función en el citosol. Por ejemplo, se usan intracuerpos citosólicos para secuestrar factores dentro del citosol, evitando, por lo tanto, que sean transportados a su destino celular natural.

En un caso, se usan intracuerpos para captura 184P1E2 en el núcleo, evitando, por lo tanto, su actividad dentro del núcleo. Se diseñan señales dirigidas nucleares en dichos intracuerpos 184P1E2 con el fin de lograr la dirección deseada. Dichos intracuerpos 184P1E2 se diseñan para unirse específicamente a un dominio de 184P1E2 particular. En otro caso, los intracuerpos 184P1E2 que se unen específicamente a una proteína 184P1E2 se usan para evitar que 184P1E2 logre acceder al núcleo, evitando de este modo que ejerzan cualquier tipo de actividad biológica dentro del núcleo (por ejemplo, evitando que 184P1E2 forme complejos de transcripción con otros factores).

Con el fin de dirigir específicamente la expresión de dichos intracuerpos a células particulares, la transcripción del intracuerpo se sitúa bajo el contro regulador de un promotro y/o potenciador apropiado específico de tumor. Con el fin de dirigir la espresión del intracuerpo específicamente a la próstata puede usarse, por ejemplo, el promotor y/o promotor/potenciador PSA (véase, por ejemplo, el documento de patente de Estados Unidos Nº 5.919.652, publicado el 6 de julio de 1999).

Xll.B.) Inhibición de 184P1E2 con proteínas recombinantes

En otro enforque, se unen proteínas recombinantes a 184P1E2 y, de este modo, inhiben el funcionamiento de184P1E2. Por ejemplo, estas moléculas recombinantes previenen o inhiben que 184P1E2 acceda/se una a su(s) asociado(s) de unión o se asocie con otra(s) proteína(s). Dichas moléculas recombinantes pueden contener, por ejemplo, la(s) parte(s) reactiva(s) de una molécula de anticuerpos específica de 184P1E2. En un caso particular, el dominio de unión de 184P1E2 de un asociado de unión a 184P1E2 se diseña en una proteína de fusión dimérica, comprendiendo, por lo tanot, la proteína de fusión dos dominios de unión a ligando 184P1E2 undiso a la porción Fc de una IgG humana, tal com IgG1 humana. Dicha porción IgG puede contener, por ejemplo, los dominios CH2 y CH3 y la región bisagra, pero no el dominio CH1. Dichas proteínas de fusión diméricas se administran en forma soluble a pacientes que padecen de un cáncer asociado con la expresión de 184P1E2, con lo cual la proteína de fusión dimérica se une a 184P1E2 y bloquea la interacción de 184P1E2 con un asociado de unión. Dichas proteínas de fusión diméricas se combinan posteriormente dado proteínas múltiples usando tecnologías de unión de anticuerpos conocidas.

Xll.C.) Inhibición de la transcripción y traducción de 184P1E2

En el presente apartado se describen varios procedimientos y composiciones para inhibir la transcripción del gen 184P1E2. De forma similar, se describen procedimientos y combinaciones para inhibir la traducción de RNm de 184P1E2 en proteínas.

En un enfoque, un procedimiento para inhibir la transcripción de un gen 184P1E2 comprende poner en contact el gen 184P1E2 con un polinucleótido antisentido 184P1E2. En otro enfoque, un procedimiento para inhibir la traducción de ARNm de 184P1E2 comprende poner en contacto un ARNm de 184P1E2 con un polinucleótido antisentido. En otro enfoque, se usa una ribozima específica de 184P1E2 par escindir el mensaje de 184P1E2, inhibiendo de este modo la traducción. Dichos procedimientos antisentido y basados en ribozima también pueden dirigirse a las regiones reguladoras del gen 184P1E2, tal como elementos promotores y/o potenciadores 184P1E2. De forma similar, se usan proteínas capaces de inhibir un factor de transcripción del gen 184P1E2 para inhibir la transcripció de ARNm de 184P1E2. Los diversos polinucleótidos y composiciones útiles en los procedimientos mencionados anteriormente se han descrito anteriormente. El uso de moléculas antisentido y de ribozimas para inhibir la transcripción y la traducción es bien conocido en la técnica.

Otros factores que inhiben la transcripción de 184P1E2 interfiriendo con la activación transcripcional de 184P1E2 son también útiles para tratar tipos de cáncer que expresan 184P1E2. De forma similar, los factores que interfieren con el procesamiento de 184P1E2 son útiles para tratar tipos de cáncer que expresan 184P1E2.

XII .D.) Consideraciones generales para estrategias terapéuticas

Pueden usarse tecnologías de transferencia génica y terapia génica para suministrar moléculas de polinucleótidos terapéuticos a células tumorales que sintetizan 184P1E2 (es decir, antisentido, ribozimas, polinucleótidos que codifican intracuerpos y otras moléculas que inhiben 184P1E2). Se conocen en la técnica una serie de enfoques de terapia génica. Pueden suministrarse a las células tumorales diana vectores recombinantes que codifican polinucleótidos antisentido 184P1E2, ribozimas, factores capaces de interferir con la transcripción de 184P1E2 y así sucesivamente, usando dichos enfoques de terapia génica.

Los enfoques terapéuticos anteriores pueden combinars con cualquiera de entre una variedad amplia de regímenes quirúrgicos, de quimioterapia o de terapia de radiación. Los enfoques terapéuticos pueden posibilitar el uso de dosis reducidas de quimioterapia (o de otras terapias) y/o una administración menos frecuente, una ventaja para todos los pacientes y particularmente para los que no toleran bien la toxicidad del agente quimioterapéutico.

La actividad antitumoral de una composición particular (por ejemplo, antisentido, ribozimas, intracuerpos), o una combinación de composicioes, puede evaluarse usando diversos sistemas de ensayo in vitro e in vivo. Los ensayos in vitro que evalúan la actividad terapéutica incluyen ensayos de crecimiento celular, ensayos de agar blando y otros ensayos indicativos de la actividad promotora del tumor, ensayos de unión capaces de determinar la extensión a la que la composición terapéutica inhibirá la unión de 184P1E2 a un asociado de unión, etc.

In vivo, el efecto de una composición terapéutica 184P1E2 puede evaluarse en un modelo animal adecuado. Por ejemplo, pueden usarse modelos de cáncer de próstata xenogénicos, en los que se introducen explantes de cáncer de próstata humanos o tejidos de xenoinjerto pasados en animales comprometidos inmunes, tales como ratones desnudos o SOID (Klein y col., 1997, Nature Medicine 3: 402-408). Por ejemplo, la solicitud de patente PCT WO98/16628 y el documento de patente de Estados Unidos Nº 6.107.540 describen diversos modelos de xenoinjertos de cáncer de próstata humanos capaces de recapitular el desarrollo de tumores primarios, micrometástasis y la formación de metástasis osteoblástica caracteristicos de estadios tardíos de la enfermedad. La eficació puede predecirse usando ensayos que midan la inhibición de la formación tumoral, la regresión o la metástasis del tumor y similares.

Los ensayos in vivo que evalúan la promoción de apoptosis son útiles en la evalución de composiciones terapéuticas. En un caso, pueden examinarse xenoinjertos de ratones que portan tumor tratados con la composición terapéutica para evaluar la presencia de focos de apoptosis y compararlos con ratones que portan xenoinjertos de control no tratados. La medida en que se encuentren focos de apoptosis en los tumores de los ratones tratados proporciona una indicación de la eficación terapéutica de la composición.

Las composiciones terapéuticas que se usan en la práctica de los procedimientos anteriores pueden formularse en composiciones farmacéuticas que comprenden un vehículo adecuado para el procedimiento de administracion deseado. Los vehículos adecuados incluyen cualquier materrila que cuando se combina con la composición terapéutica retiene la función antitumoral de la composición terapéutica y es generalmente no reactivo con el sistema inmunitario del paciente. Los ejemplos incluyen, pero no están limitados a; cualquiera de entre una serie de vehículos farmacéuticos estándar tales como soluciones salinas estériles tamponadas con fosfato, agua bacteriostática y similares (véase, en general, Remington’s Pharmaceutical Sciences 16ª edición, A. Osal., Ed., 1980).

Las formulaciones terapéuticas pueden solubilizarse y administrarse por medio de cualquier vía capaz de suministrar la composición terapéutica al sitio del tumor. Las vías de administración potencialmente eficaces incluyen, pero no se limitan a, intravenosa, parenteral, intraperitoneal, intramuscular, intratumoral, intradérmica, intraorgánica, ortotópica y similares. Una formulación preferente para inyección intravenosa comprende la composición terapéutica en una solución de agua bacteriostática conservada, agua no conservada estéril, y/o diluida en bolsas de cloruro de polivinilo o polietileno que contienen cloruro de sodio estéril para inyección al 0,9 %, USP. Las preparaciones de proteínas terapéuticas pueden liofilizarse y almacenarse en forma de polvos estériles, preferentemente al vacío, y reconstituirse después en agua bacteriostática (que contiene, por ejemplo, alcohol bencílico como conservante) o en agua estéril antes de la inyección.

Los protocolos de dosificación y administración para el tratamiento de cáncer que usan los procedimientos anteriores pueden variar con el procedimiento y el cáncer diana, y dependerán generalmente de una serie de otros factores considerados en la técnica.

XII.) Kits

En el presente apartado se describen kits para su uso en las aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas que se describen en el presente documento.Dichos kits pueden comprender un vehículo, un envase o recipiente que está compartimentado para alojar uno o varios recipientes tales como viales, tubos o similares, comprendiendo cada uno de los recipientes uno de los elementos por separado para usar en el procedimiento. Por ejemplo, los recipientes pueden comprender una sonda que está etiquetada o puede ser detectable. Dicha sonda puede ser un anticuerpo o polinucleótido específico de una proteína relacionada con 184P1E2 o un gen o mensaje 184P1E2, respectivamente. Cuando el procedimiento usa hibridación de ácidos nucleicos para detectar un ácido nucleico diana, el kit puede tener también recipientes que contienen nucleótido(s) para la amplificacion de una secuencia de ácido nucleico diana y/o un recipiente que comprende un medio comunicador, tal como una proteína de unión a biotina, tal como avidina o esterptavidian, unida a una molécula comunicadora, tal como una etiqueta enzimática, fluorescente o radioisotópica. El kit puede incluir la totalidad o parte de la secuencia de aminoácidos de la figura 2 o de la figura 3 o análogos de las mismas, o una molécula de ácido nucleico que codifica dichas secuencias de aminoácidos.

El kit comprenderá, tipicamente el recipiente descrito anteriormente y uno o varios de otros recipientes que comprenden materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluidos tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas e insertos de envase con instrucciones de uso.

Puede estar presente una etiqueta en el recipiente que indique que la composición se usa para una terapia específica o aplicación no terapéutica, y también puede indicar directrices para su uso in vivo o in vitro, tales como las descritas anteriormente. También pueden incluirse directrices y/u otro tipo de información en un inserto que se incluya en el kit.

Ejemplos:

A continuación se describen y se ilustran varios aspectos de la invención por medio de los diversos ejemplos siguentes, pretendiendo que ninguno de ellos limite el alcance de la invención.

Ejemplo 1 Aislamiento generado por SSH de un fragmento del gen 184P1E2 Para aislar genes que se sobreexpresan en cáncer de vejiga, se usa el procedimiento de hibridación sustractiva por supresión (SSH) usando ADNc derivado de tejidos de cáncer de vejiga, que incluyen carcinoma celular transicional invasivo. La secuencia de ADNc de SSH de 184P1E2 se derivó de una selección de cáncer de vejiga menos ADNc derivado de vejiga normal en adición a una selección de 9 tejidos normales. El ADNc de 184P1E2 se identificó que

estaba altamente expresado en la selección de tejido de cáncer de vejiga, con ninguna expresión detectada en tejidos normales. La secuencia de ADN SSH de 132 pb (figura 1) mostró homología a la peptidilarginina deiminasa de tipo III

(AB026831) (figura 4A). Se clonó 184P1E2 v.1 de 3183 pb a partir de una colección de ADNc de cáncer de vejiga, revelando un ORF de 664 aminoácidos (figura 2 y figura 3). La proteína 184P1E2 v.1 es la misma que la proteína del GenBank AB026831 con un aminoácido diferente en la posición 480 (figura 4B). Otras variantes de 184P1E2 también se identificaron y están enumeradas en las figuras 2 y 3. 184P1E2 v.3 es 100 % identica a la proteína AB026831 del tipo III de peptidilarginina deiminasa del GenBank (véase la figura 4B y la tabla LIII).

Materiales y Procedimientos Tejidos humanos: Se adquieron tejidos normales y cancerosos del paciente de fuentes diferentes tales como la NDRI (Filadelfia, PA,

Estados Unidos). El ARNm de algunos tejidos normales se adquirió de Clontech, Palo Alto, CA, Estados Unidos. Aislamiento de ARN: Los tejidos se homogenizaron en reactivo Trizol (Life Technologies, Gibco BRL) usando 10 ml/g de ARN completo

aislado de tejido. Se purificó ARN poliA del ARN completo usando kits Mini y Midi de ARNm de Qiagen’s Oligotex. Se cuantificaron mediante análisis espectrofotométrico el ARN completo y ARNm (D.O. 260/280 nm) y se analizó mediante electroforesis en gel.

Oligonucleótidos: Se usaron los siguientes oligonucleótidos purificados mediante HPLC. DPNCDN (cebador de síntesis de ADNc): 5’TTTTGATCAAGCTT303’ Adaptador 1: 5 ‘CTAATACGACrCACTATAGGGCrCGAGCGGCCGCCCGGGCAG3’ 3 ‘GGCCCGTCCTAG5’ Adaptador 2: 5’GTAATACGACrCACI’ATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAG3’ 3’CGGCFCCTAG5’• Cebador de PCR 1: 5’CTAATACGACTCACTATAGGGC3’ Cebador anidado (NP) 1: 5’TCGAGCGGCCG000GGGCAGGA3’ Cebador anidado (NP)2: 5’AGCGTGGTCGCGGCCGAGGA3’ Hibridación sustractiva por supresión: Se usó hibridación sustractiva por supresión (SSH) para identificar ADNc correspondientes a genes que pueden

expresarse diferencialmente en cáncer de vejiga. La reacción SSH usó ADNc de tejidos normales y cancerosos de

vejiga. La secuencia de 184P1E2 génica se derivó de una selección de cáncer de vejiga menos la sustracción de ADN de vejiga normal. La secuencia de ADN SSH (figura 1) se identificó.

El ADNc derivado de una selección de tejidos nornales se usó como fuente para el ADNc conductor, mientras que el ADNc de una selección de tejidos cancerosos de vejiga se usó como fuente del ADNc examinador. Se sintetizaron ADN bicatenarios correspondientes a los ADNc del examinador y conductor a partir de 2 µg de ARN poliA aislado de tejido de xenoinjerto relevante, tal como se ha descrito anteriormente, usando el kit de sustracci9ón de ADNc de selección por PCR de CLONTECH y 1 ng de oligonucleótido DPNCDN como cebador. La síntesis de la cadena primera y de la segunda se realizó tal como se describe en el protocolo del manual del usuario del kit (CLONTECH Protocolo Nº PT1117-1, Catálogo Nº K1804-1). El ADNc resultante se digirió con Dpn II durante 3 horas a 37 ºC. El ADNc digerido se extrajo con fenol/cloroformo (1:1) y se precipitó con etanol.

El ADNc conductor se generó combinando en una relación 1:1 ADNc digerido con Dpn II de una fuente de tejido relevante (véase anteriormente) con una mezcla de ADNc digerido derivado de nueve tejidos normales: estómago, músculo esquelético, pulmón, cerebro, hígado, riñón, páncreas, intestino delgado y corazón.

El ADNc se generó diluyendo 1 µl de ADNc digerido con Dpn II de una fuente de tejido relevante (véaseanteriormente) (400 ng) en 5 µl de agua. El ADNc diluido (2 µg, 160 ng) se ligó a continuación a 2 µl de adaptador 1 y adaptador 2 (10 µM), en reacciones de ligación separadas, en un volumen total de 10 µl a 16 ºC durante la noche, usando 400 u de T4 ADN ligasa (CLONTECH). La ligación se terminó con 1 µl de EDTA 0,2 M y calentando a 72 ºC durante 5 minutos.

La primera hibridación se realizó añadiendo 1,5 µl (600 ng) de ADNc conductor a cada uno de los dos tubos que contenían 1,5 µl (20 ng) de ADNc examinador ligado al adaptador 1 y al adaptador 2. En un volumen fina de 4 µl, las muestras se cubrieron con aceite mineral, se desnaturalizaron en un ciclador térmico MJ Research a 98 ºC durante 1,5 minutos y, a continuación, se dejaron hibridar durante 8 horas a 68 ºC. Las dos hibridaciones se mezclaron, a continuación, con un µl adicional de ADNc conductor desnaturalizado y se dejaron hibridar durante la noche a 68 ºC. A continuación, la segunda hibridación se diluyó en 200 µl de Hepes 20 mM, pH de 8,3, NaCl 50 mM, EDTA 0,2 mM, se calentó a 70 ºC durante 7 minutos y se almacenó a -20 ºC.

Amplificación PCR. Clonación y secuenciación de fragmentos de genes generados a partir de SSH:

Para amplificar fragmentos de genes resultantes de reacciones SSH, se realizaron dos amplificación por PCR. En la reacció PCR primaria, se añadió 1 µl de la mezcla de hibridación final diluida a 1 µl de cebador PCR 1(10 µM), 0,5 µl de mezcla de dNTP (10 µM), 2,5 µl de 10 x tampón de reacción (CLONTECH) y 0,5 µl de 50 x mezcla de ADNc polimerasa (CLONTECH) en un volumen final de 25 µl. La PCR1 se condujo usando las condiciones siguientes: 75 ºC durante 5 minutos, 94 ºC durante 25 s y después 27 ciclos de 94 ºC durante 10 s, 66 ºC durante 30 s, 72 ºC durante 1,5 minutos. Se realizaron cinco reacciones PCR primaris para cada experimento. Los productos se reunieron y se diluyeron 1:10 con agua. Para la reacción PCR secundaria, se añadió 1 µl de la reacción PCR primaria reunida y diluida a la misma mezcla de reacción que se usó para la PCR1, excepto que se usaron cebadores NP1 y NP2 (10 µM) en vez del cebador 1 de PCR. La PCR2 se realizó usando 10-12 ciclos de 94 ºC durante 10 s, 68 ºC durante 30 s y 72 ºC durante 1,5 minutos. Los productos PCR se analizaron usando electroforesis en gel de agarosa al 2 %.

Los productos PCR se insertaron en pCR2.1 usando el kit de clonación de vector T/A (Invitrogen). Se sometió la E. coli transformada a azul/blanco y selección de ampicilina. Las colonias blancas se recogieron y se dispusieron en placas de 96 pocillos y se cultivaron en líquido de cultivo durante la noche. Para identificar insertos, se realizó la amplificación PCR sobre 1 µl de cultivo bacteriano usando las condiciones de PCR1 y NP1 y NP2 como cebadores. Los productos PCR se analizaron usando electroforesis en gel de agarosa al 2 %.

Los clones bacterianos se almacenaron en glicerina al 20 % en una formato de 96 pocillos. El ADN plásmido se preparó, se secuenció y se sometió a búsquedas de homología de ácidos nucleicos con las bases de datos GenBank, dBest y NCI-CGAP.

Análisis de expesión RT-PCR:

Se generaron ADN de primera cadena a partir de 1 µg de ARNm con Cebado de oligo (dT)12-18 usando el sistema de preamplificación Gibco-BRL Superscript Preamplification. Se usó el protocolo del fabricante que incluía una incubación durante 50 minutos a 42 ºC con transcriptasa inversa seguido de tratamiento con ARNasa H a 37 ºC durante 20 min. Después de completar la reacción, el volumen puede aumentarse a 200 µl con agua antes de la normalización. Pueden obtenerse ADNc de primera cadena de 16 tejidos humanos normales de Clontech.

La normalización de los ADNc de primera cadena a partir de múltiples tejidos se realizó usando los cebadores 5’atatcgccgcgctcgtcgtcgacaa3’ y 5’agccacacgcagctcattgtagaagg3’ para amplificar β-actina. El ADNc de primera cadena (5 µl) se amplificó en un volumen total de 50 µl que conteína 0,4 µM de cebadores, 0,2 µM de cada dNTP, tampón 1XPCR (Clontech, Tris-HCL 10mM, MgCI2 1,5 mM, KCI 50mM, pH 8,3) y IX ADN polimerasa de Klentaq (Clontech). Se eliminaron 5 µl de la reacción PCR a 18, 20, y 22 ciclos y se usó electroforesis en gel de agarosa. Se realizó la PCR usando un ciclador térmico MJ Research con las siguientes condiciones: la desnaturalización inicial puede ser a 94 ºC durante 15 s, seguido de 18, 20 y 22 ciclos de 94 ºC durante 15, 65 ºC durante 2 min, 72 ºC durante 5 s. Se llevó a cabo una extensión final a 72 ºC durante 2 min. Después de la electoforesis en gel de agarosa, las intensidades de banda de las bandas de 283 p.b. de β-actina procedentes de múltiples tejidos se comporaron mediante inspección visual. Se calcularon los factores de dilución de ADNc de primera cadena dando como resultado unas intensidades de banda de β-actina en todos los tejidos después de 22 ciclos de PCR. Pueden necesitarse tres rondas de normalización para lograr intensidades de banda iguales en todos los tejidos después de 22 ciclos de PCR

Para determinar los niveles de expresión del gen 184P1E2, se analizaron 5 µl de ADNc de primera cadena normalizado por PCR usando 26 y 30 ciclos de amplificación. El análisis de expresión semicuantitativo puede obtenerse por comparación de los productos PCR en un número de ciclos que de intensidades de banda ligeras, Los cebadores usados para RT-PCR se diseñaron usando la secuencia SSH de 184P1E2 y se enumeran a continuación:

184P1E2.1

5’-AGTGACATGGAAGGAGATGAGTCC-3’

184P1E2.2

5’-ATACCTCCAGCTATGATGCCAAAC-3’

En la figura 14 se muestra un análisis de expresión RT-PCR típico. El ADNc de primera cadena se preparó a partir de grupo vital 1 (hígado, pulmón y riñón), grupo vital 2 (páncreas, colon y estómago), grupo de cáncer de vejiga, grupo de cáncer de riñón, grupo de cáncer de pulmón y grupo de metástasis de cáncer. La normalización se realizó por PCR usando cebadores de actina y GAPDH. La PCR semicuantitativa, usando cebadores de 184P1E2, se realizó en 26 y 30 ciclos de amplificación. Los resultados muestran una expresión fuerte de 184P1E2 en el grupo de cáncer de vejiga. La expresión de 184P1E2 se detecta también en el grupo de cáncer de riñón, el grupo de cáncer de pulmón y el grupo de metástasis de cáncer, pero no en el grupo vital 1 y el grupo vital 2.

Ejemplo 2 Clonación de longitud completa de 184P1E2

La secuencia de ADNc SSH de 184P1E2 se derivó del grupo de cáncer de vejiga menos la sustracción del ADNc de vejiga normal. La secuencia de ADNc SSH (figura 1) se denominó 184P1E2.

La secuencia de ADN SSH de 132 pb (figura 1) mostró homología al tipo III de peptidilarginina deiminasa (AB026831) (figura 4A). Se clonó 184P1E2 v.1 de 3183 pb a partir de una colección de ADNc de cáncer de vejiga, revelando un ORF de 664 aminoácidos (figura 2 y figura 3). La proteína 184P1E2 v.1 esla misma que la proteína AB026831 de GenBank con un aminoácido diferente en la posición 480 (figura 4B). Otras variantes de 184P1E2 se identificaron también, y éstas se enumeraron en las figuras 2 y 3. La 184P1E2v3 es 100 % idéntica a la proteína AB026831 de GEnBank peptidilarginina deiminasa de tipo Ill (véase la figura 4B y la tabla LIII).

La 184P1E2v.1 es 87 % idéntica y 93 % homóloga a la proteína de ratón peptidilarginina deiminasa de tipo III. El alineamiento de aminoácidos de estas dos proteínas se muestra en la figura 4C.

Ejemplo 3 Mapeo cromosómico de 184P1E2

La localización cromosómica pueden implicar a genes en patogénesis patológica. Están disponibles varios enfoques de mapeo cromosómico que incluyen hibridación in situ fluorescente (FISH), paneles hibridos de radiación (RH) humano/hámster (Walter y col., 1994; Nature Genetics 7:22; Research Genetics, Huntsville A1), paneles híbridos de céluals somáticas humano-roedor tales como los disponibles de Coriell Institute (Camden, New Jersey, Estados Unidos) y observadores genómicos que usan homologías BLAST con clones genómicos secuenciados y mapeados (NCBI, Bethesda, Maryland, Estados Unidos).

184P1E2 mapea el cromosoma 1p36.13 usando secuencia de 184P1E2 y el instrumento NCBI BLAST: (http://www.ncbi. nlm. nih.gov/genome/seq/page.cgi?F=HsBlast.html&&ORG=Hs).

Ejemplo 4 Análisis de expresión de 184P1E2 en tejidos normales y especímenes de pacientes

El análisis de expresión por RT-PCR demostró que 184P1E2 se expresa con más fuerza en especímenes de pacientes con cáncer de vejiga (figura 14). Se preparó ADNc de primera cadena a partir del grupo vital 1 (hígado, pulmón y riñón), grupo vital 2 (páncreas, colon y estómago), grupo de cáncer de vejiga, grupo de cáncer de riñón, grupo de cáncer de pulmón y grupo de metástasis de cáncer. La normalización se realizó por PCR usando cebadores de actina y GAPDH. La PCR semicuantitativa, usando cebadores de 184P1E2, se realizó en 26 y 30 ciclos de amplificación. Los resultados muestran una expresión fuerte de 184P1E2 en el grupo de cáncer de vejiga. La expresión de 184P1E2 se detecta también en el grupo de cáncer de riñón, el grupo de cáncer de pulmón y el grupo de metástasis de cáncer, pero no en el grupo vital 1 y el grupo vital 2.

El análisis de inmunotransferencia (Northern) de 184P1E2 en tejidos normales humanos se muestra en la figura 15. No se detecto expresión en ninguno de los 16 tejidos normales analizados.

La expresión de 184P1E2 en especímenes de pacientes con cáncer de vejiga y tejidos humanos normales se muestra en la figura 16. El ARN se extrajo de un grupo de tres cánceres de vejiga, así como de próstata normal (NP), vejiga normal (NB), riñón normal (NK), colon normal (NC), pulmón normal (NL), mama normal (NBr) y ovario normal(NO). La inmunotransferencia (Northern) con 10 µl de ARN total/carril se realizó con secuencia de 184P1E2. Los resultados mostraron la expresión de un trásncrito de 4,5kb de 184P1E2 en el grupo de cáncer de vejiga, pero no en los tejidos normales analizados. El análisis de especímenes de pacientes individuales se muestra en el figura

17. Se extrajo ARN de vejiga normal (NB), de líneas celulares cancerosas de vejiga (CL; UM-UC3, J82 y SCaBER), tumores (T) de pacientes con cáncer de vejiga y tejidos normales adyacentes al cáncer de vejiga (N). La inmunortransferencia (Northern) con 10 µg de ARN total se analizó con secuencia de 184P1E2. Los tamaños estándar en kilobases se indican en un lado. Los resultados muestran una expresión fuerte de 184P1E2 en los tejidos tumorales de vejiga pero no en vejiga normal, ni en las líneas celulares cancerosas de vejiga.

La figura 18 muestra que 184P1E2 se expresó en tejidos de pacientes con cáncer de pulmón. El ARN se extrajo de pulmón normal (N), líneas celulares de cáncer de pulmón (CALU-1, A427, NCI-H82, NCI-146) (todas referidas a un CL), tumores de pacientes con cáncer de pulmón (T) y sus tejidos normales adycentes (Nat). La inmunortransferencia (Northern) con 10 µg de ARN total se analizó con secuencia de 184P1E2. Los resultados muestran una expresión fuerte de 184P1E2 en los tejidos de pacientes con cáncer de pulmón, pero no en pulmón normal. Un trásncrito de peso molecular inferior de aproximadamente 2,0 kb se detectó también en las dos líneas celulares CALU-1 y NCI-H146.

La expresión restringida de 184P1E2 en tejidos normales y la expresión detectada en cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, cáncer de riñón y metástasis de cáncer sugiere que 184P1E2 es una diana terapéutica potente y un marcador de diagnóstico para cánceres humanos.

Ejemplo 5 Variantes de trásncriptos de 184P1E2

Las variantes de trásncritos son variantes de ARNm maduro del mismo gen por transcripción alternativo o ayuste alternativo. Los trásncriptos alternativos son trásncritos del mismo gen pero la transcripción comienza en puntos diferentes. Las varientes de ayuste son variantes de ARNm ayustadas de forma diferente a partir del mismo trásncripto. En eucariotas, cuando un gen de varios exones se transcribe a partir de ADN genómico, el ARN inicial se ayusta para producir ARNm funcional, que tiene sólo exones y se usa para la traducción en una secuencia de aminoácidos. En consecuencia, un gen dado puede tener de cero a muchos trásncritos alternativos y cada trásncrito puede tener de cero a muchas variates se ayuste. Cada variante de trásncrito tiene un carácter de exón único, y puede tener diferentes porciones codificantes y/o no codificantes (extremos 5’ o 3’), del trásncrito original. Las variantes de trásncrito pueden codificar proteínas similares o diferentes con la misma o similar función o puede codificar proteínas con diferentes funciones, y pueden expresarse in el mismo tejido al mismo tiempo o en diferente tejido, o en momentos diferentes, las proteínas codificadas por variantes de trásncritos pueden tener localización celulares o extracelulares similares o diferentes, es decri, ser secretadas.

Las variantes de tránscritos se identifican por diversos procedimientos aceptados en la técnica. Por ejemplo, trásncritos y variantes de ayuste alternativos se identifican en un experimento de clonación de longitud completa, o usando un secuencias de trásncrito de longitud completa o EST. Primeramente, todos los EST humanos están agrupados en grupos que muestran indentidad directa o indirecta con cada uno de los otros. En segundo lugar, los EST del mismo grupo se agruparon posteriormente en subgrupos y se ensamblaron en una secuencia consenso. La secuencia génica original se compara con la(s) secuencia(s) consenso u otros secuencias de longitud completa. Cada secuencia consenso es una variante de ayusta potencial para ese gen (véase, por ejemplo, http://www.doubletwist.com/products/cll_agentsOverview.jhtml). Incluso cuando una variante se identifica que no es un clon de longitud completa, esa porción de la variante es útil para la generación de antígenos y para la clonación posterior de la variante de ayuste de longitud completa, usando técnicas conocidas en la técnica.

Además, están disponibles en la técnica programas informáticos que identifican variantes de trásncritos sobre la base de secuencias genómicas. Los programas de identificación de variantes de trásncritos de base genómica incluyen FgenesH (A. Salamov y V. Solovyev, “Ab initio gene finding in Drosophila genomic DNA”, Genome Research. 2000 abril ;10(4):516-22); Grail (http://compbio.ornl.gov/Grail-bin/EmptyGrailForm) y GenScan (http://genes.mit.edu/GENSCAN.htmI). Para un tratamiento general de protocolos de identificación de variantes de ayuste véase, por ejemplo, Southan, C., A genomic perspective on human proteases, FEBS Lett., 8 de junio, 2001; 498(2-3):214-8; de Souza, S.J. y col., Identification of human chromosome 22 transcribed sequences with ORF expressed sequence tags, Proc. NatI Acad Sci USA. 7 de nov, 2000; 97(23):12690-3.

Para confirmar adicionalmente los parámetros de una variante de trásncrito, están disponibles en la técnica diversas técnicas, tales como clonación de cadena completa, validación proteómica, validación basada en PCR y validación RACE 5', etc. (véase, por ejemplo, Proteomic Validation: Brennan, S.O. y col., Albumin banks peninsula: a new termination variant characterized by electrospray mass spectrometry, Biochem Biophys Acta. 17 de agosto, 1999;1433(1-2):321-6; Ferranti P y col., Differential splicing of pre-messenger RNA produces multiple forms of mature caprine alpha(s1)-casein, Eur J Biochem. 1997 Oct 1;249(1):1-7. Para validación basada en PCR: Wellmann

S. y col., Specific reverse transcription-PCR quantification of vascular endothelial growth factor (VEGF) splice variants by LightCycler technology, Clin Chem. 2001 Abr; 47(4):654-60; Jia, H.P. y col., Discovery of new human beta-defensins using a genomics-based approach, Gene. 2001 Jan 24; 263(1-2):211-8. Para validación basada en PCR y 5’ RACE: Brigle, K.E. y col., Organization of the murine reduced folate carrier gene and identification of variant splice forms, Biochem Biophys Acta. 1997 Ago 7; 1353(2): 191-8).

Se sabe en la técnica que las regiones genómicas se modulan en cánceres. Cuando la región genomica que mapea el gen se modula en un cáncer particular, los trásncritos alternativos o variantes de ayuste del gen se modulan también. En el presente documento se divulga que 184P1E2 tiene un perfil de expreión particular relacionado con cáncer. También pueden estar implicados en cánceres trásncritos alternativos o variantes de ayuste de 184P1E2 en el mismo o diferentes tejidos, sirviendo de este modo como marcadores/antígenos asociados a tumor.

La composición de exón del trásncrito origina, denominado 184P1E2 v.1, se muestra en la figura 12.

Ejemplo 6 Polimorfismo de un solo nucleótido de 184P1E2

Un polimorfismo de un sólo nucleótido (SNP) es una variación de un único par de bases en las secuencias de nucleótidos. En un punto específico del genoma, hay cuatro posibles pares de bases de nucleótidos: A/T, C/G, G/C y T/A. El genotipo se refiere al carácter del par de bases de uno o varios puntos en la misma molécula de ADN (cromosoma de un organismo superior). Los SNP que tienen lugar en un ADNc se denominan SNPc. Estos SNP pueden cambiar aminoácidos de la proteína codificada por el gen y, de este modo, cambiar las funciones de la proteína. Algunos SNP causan enfermedades inheridas y algunos otros contribuyen a variaciones cuantitativas en el fenotipo y reacciones a factores ambientales que incluyen dieta y fármacos entre otros individuales. Por lo tanto, SNP y/o combinaciones de alelos (llamadas haplotipos) tienen muchas aplicaciones que incluyen el diagnóstico de enfermedades inheridas, determinación de reacción y dosificación de fármacos, identificación de genes responsables de enfermedades y descubrimiento de relaciones genéticas entre individuos (P. Nowotny, J. M. Kwon y

A. M. Goate, SNP analysis to dissect human traits, Curr. Opin. Neurobiol. 2001 Oct; 11 (5):637-641; M. Pirmohamed y B. K. Park, Genetic susceptibility to adverse drug reactions, Trends Pharmacol. Sci. 2001 Jun; 22(6):298-305; J. H. Riley, C. J. Allan, E. Lai y A. Roses, The use of single nucleotide polymorphisms in the isolation of common disease genes, Pharmacogenomics. 2000 Feb; 1(1):39-47; R. Judson, J. C. Stephens y A. Windemuth, The predictive power of haplotypes in clinical response, Pharmacogenomics. 2000 feb; 1(1 ):1 5—26).

Los SNP se identifican mediante diversos procedimientos conocidos (P. Bean, The promising voyage of SNP target discovery, Am. Clin. Lab. 2001 Oct-Nov; 20(9):18-20; K. M. Weiss, In search of human variation, Genome Res. 1998 Jul; 8(7):691-697; M. M. She, Enabling large-scale pharmacogenetic studies by high-throughput mutation detection and genotyping technologies, Clin. Chem. 2001 Feb; 47(2):164-172). Por ejemplo, se identifican SNP mediante secuenciación de fragmentos de AND que muestran polimorfismo mediante procedimientos basados en gen tales como polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP) y electroforesis en gel de gradiente de desnaturalización (DGGE). También pueden descubrirse mediante secuenciación directa de muestras de ADN agrupadas de distintos individuos o mediante comparación de secuencias de muestras de diferente ADN. Con la acumulación rápida de datos de secuencias en bases de datos públicas y privadas, se pueden descubrir SNP por comparación de secuencias usando programas informáticos (Z. Gu, L. Hillier y P. Y. Kwok, “Single nucleotide polymorphism hunting in cyberspace,” Hum. Mutat. 1998; 12(4):221-225). Pueden verificarse SNP y el genotipo y el haplotipo de un individuo mediante diversos procedimientos que incluyen la secuenciación directa y microselecciones de alto rendimiento (P. Y. Kwok, “Methods for genotyping single nucleotide polymorphisms,” Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2001; 2:235-258; M. Kokoris, K. Dix, K. Moynihan, J. Mathis, B. Erwin, P. Grass, B. Hines y A. Duesterhoeft, “High-throughput SNP genotyping with the Masscode system,” Mol. Diagn. 2000 Dic; 5(4):329-340).

Usando los procedimientos descritos anteriomente, se identificaron nueve SNP en el trásncrito, 184P1E2 v.1, en posiciones 951 (C/G), 1480 (C/T), 1910 (T/G), 2468 (C/T), 2623 (T/G), 2742 (G/T), 2924 (A/C), 3060 (C/A) y 356 (GIA). Los trásncritos con alelos alternatives se designaron como varientes 184P1E2 v.2, v.3, v.4, v.5, v.6, v.7, v.8,

v.9 y v.10, respectivamente. La figura 10 muestra el alineamiento esquemático de las variantes de nucleótidos. La figura 11 muestra el alineamiento esquemático de variantes de proteínas, que corresponden a las variantes de nucleótidos. Las variantes de nucleótidos que codifican la misma secuencia de aminoácidos que la variante 1 no se muestran en la figura 11. Estos alelos de los SNP, a pesar de mostrarse por separado en el presente documetno, pueden tener lugar en diferentes combinaciones (haplotipos) y en cualquiera de otras variantes de trásncritos que contienen la secuencia contexto de las SNP.

Ejemplo 7 Producción de 184P1E2 recombinante en sistemas eucarióticos

Para expresar 184P1E2 recombinante y variantes de 184P1E2 en células procarioticas, se clonaron secuencias de ADNc de longitud completa o parcial de 184P1E2 y de variantes de 184P1E2 en cualquiera de diversos vectores de expresión conocidos en la técnica. Una o varias de las siguientes regiones de aminoácidos 1-664 de 184P1E2; o cualquiera de entre 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más aminoácidos contiguos de 184P1 E2, variantes o análogos de la misma.

A. Transcripción in vitro y constructos de traducción:

pCRII: Para generar sondas de ARN en sentido correcto y antisentido de 184P1E2 para investigaciones de ARN in situ, se generaron constructos pCRII (Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos) que codifican o bien la totalidad o bien fragmentos de ADNc de 184P1E2. El vector pCRII tiene promotores Sp6 y T7 que flanquean el inserto para conducir la transcripción de ARN de 184P1E2 para su uso como sondas de ARN para experimentos de hibridación in situ. Estas sondas se usan para analizar la expresión en células y tejidos de 184P1E2 en el nivel de ARN. El ARN de 184P1E2 transcrito que representa el ADNc de la región codificante de aminoácidos del gen 184P1E2se usa en sistemas de traducción in vitro tales como el sistema TnTTM Coupled Reticulolysate (Promega, Corp., Madison, WI, Estados Unidos) para sintetizar la proteína 184P1E2.

B. Constructos bacterianos:

Constructos pGEX: Para generar proteínas 184P1E2 recombinantes en bacterias que se fusionan con la proteína glutatión 5-transferasa (GST), la totalidad o partes del vector de fusión T de la familia pGEX (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, Estados Unidos). Estos constructos permiten la expresión controlada de secuencias de proteína 184P1E2 recombinante con GST fusionado en el extremo amino y un epítopo de seis histidina (6X His) en el extremo carboxilo. Las etiquetas GST y 6X His permiten la purificación de la proteína de fusión recombinante a partir de bacterias inducidas con la matriz de afinidad apropiada y permiten el reconocimiento de la proteína de fusión con anticuerpos anti-GST y anti-His. La etiqueta 6X His se genera añadiento codones de 6 histidina al cebador de clonación en el extremo 3’, por ejemplo, del marco de lectura abierto (ORF). Un sitio de escisión proteolítico, tal como el sitio de reconocimiento PreScissionTM en pGEX-6P-1, puede usarse de tal modo que permita la escisión de la etiqueta GST de la proteína relacionada con 184P1E2. El origen del gen de resistencia a ampilicina y pBR322 permite la selección y mantenimiento de plásmidos pGEX en E. coli

Constructos pMAL: Para generar, en bacterias, proteínas 184P1E2 recombinantes que se fusionan con proteína de unión a maltosa (MBP), se fusionan la totalidad o partes de la secuencia codificante de proteínas de ADNc de 184P1E2 con el gen MBP mediante clonación en los vectores pMAL-c2X y pMAL-p2X (New England Biolabs, Beverly, MA, Estados Unidos). Estos constructos permiten la expresión controlada de secuencias de proteína 184P1E2 recombinante con MBP fusionado en el extremo amino y una etiqueta de epítopo 6X His en el extremo carboxilo. Las etiquetas MBP y 6X His permiten la purificación de la proteína recombinante a partir de bacterias con la matriz de afinidad apropiada y permiten el reconocimiento de la proteína de fusión con anticuerpos anti-MBP y anti-His. La etiqueta 6X His se genera añadiento codones de 6 histidina al cebador de clonación en el extremo 3’. Un sitio de reconocimiento FactorXa permite la escisión de la etiqueta pMAL de 184P1E2. Los vectores pMAL-c2X y pMAL-p2X se optimizan para que expresen la proteína recombinante en el citoplasma o periplasma respectivamente. La expresión en periplasma potencia el plegamiento de proteínas con enlaces disulfuro.

Constructos pET: Para expresar 184P1E2 en células bacterianas, se clona la totalidad o partes de la secuencia codificante de proteinas de ADNc de 184P1E2 en la familia pET de vectores (Novagen, Madison, WI, Estados Unidos). Estos vectores permiten la expresión estrechamente controlada de proteína 184P1E2 recombinante en bacterias con y sin fusión a proteínas que potencien la solubilidad, tal como NusA y tioredoxina (Trx), y etiquetas de epítopos, tales como 6X His y S-TagTM que ayudan a la purificación y detección de la proteína recombinante. Por ejemplo, se fabrican constructos usando sistema de fusión pET NusA 43.1 de tal modo que las regiones de la proteína 184P1E2 se expresan como fusiones amino terminales a NusA.

C. Constructos de levaduras:

Constructos pESC: Para expresar 184P1E2 en la especie de levaduras Saccharomyces cerevisiae para genera rproteína recombinante y para estudios funcionales, se clona la totalidad o partes de la secuencia codificante de proteínas de ADNc de 184P1E2 en la familia de vectores pESC, conteniendo cada uno de ellos 1 de 4 marcadores seleccionables, HIS3, TRPI, LEU2, y URA3 (Stratagene, La Jolla, CA, Estados Unidos). Estos vectores permiten la expresión controlada del mismo plásmido de hasta 2 genes diferentes o secuencias clonadas que contienen una de las etiquetas de epítopo FlagTM o Myc en la misma célula de levadura. Este sistema es útil para confirmar interacciones proteína-proteína de 184P1E2. Además, la expresión en levaduras obtiene modificaciones posttraduccionales similares, tales como glucosilaciones y fosforilaciones, que las que se encuentran en células eucarióticas.

Cosntructos pESP: Para expresar 184P1E2 en la especie de levaduras Saccharomyces pombe, se clona la totalidad

o partes de la secuencia codificante de proteínas de ADNc de 184P1E2 en la familia de vectores pESC. Estos vectores permiten la expresión a un nivel elevado de una secuencia de proteína 184P1E2 que está fusionada o bien al extremo amino o bien al extremo carboxilo de GST, lo que ayuda a la purificación de la proteína recombinante. Una etiqueta de epítopo FlagTM permite la detección de la proteína recombinante con anticuerpos anti-FlagTM.

Ejemplo 8 Producción de 184P1E2 recombinante en sistemas eucarióticos

A. Constructos mamíferos:

Para expresar 184P1E2 recombinante en células eucarióticas, pueden clonarse secuencias de longitud total o parcial de ADNc de 184P1E2 en cualquiera de entre diversos vectores de expresión conocidos en la técnica. Una o varias de las regiones de siguientes de 184P1E2 se expresan en estos constructos, aminoácidos 1 a 664, o cualquiera de entre 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 o más aminoácidos contiguos de 184P1E2, variantes, o análogos de la misma. En determinadas realizaciones se expresa una región de una variante específica de 184P1E2 que codifica un aminoácido en una posición específica que difiere del aminoácido de cualquier otra variante encontrada en esa posición. En otras realizaciones, se expresa una región de una variante de 184P1E2 que entra parcial o totalmente dentro de una secuencia que es única de esa variante.

Los constructos pueden transfectarse en uno cualquiera de entre una amplia variedad de células de mamífero tales como células 293T. Los lisados de células 293T trasnsfectados pueden analizarse con suero policlonal anti184P1E2, que se describe en el presente documento.

Constructos pcDNA4/HisMax: Para expresar 184P1E2 en células de mamífero, 184P1E2ORF, o porciones del mismo, de 184P1E2 se clona en pcDNA4/HisMax Versión A (Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos). La expresión de la proteína se conduce por el promotor citomegalovirus (CMV) y el potenciador traduccional SP16. La proteína recombinante tiene epítpos Xpress y seis histidina (6X His) fusionados al extremo amino. El vector pcDNA4/HisMax también contiene la secuencia de la señal de poliadenilación y de terminación transcripcional de la hormona de crecimiento bovina (BGH) para potenciar la estabilidad de ARNm junto con el origen SV4O para la replicación episomal y rescate de vector único en líneas celulares que expresan el antígeno T grande. El gen de resistencia a zeocina permite la selección de células de mamífero que expresan la proteína y el gen de resistencia a ampilicina y origen CoIE1 permite la selección y mantenimiento del plásmido en E. coli.

Constructos pcDNA3.1/MycHis: Para expresar 184P1E2 en células de mamífero, un 184P1E2ORF, o porciones del mismo, de 184P1E2 se clona con el sitio de iniciación de la traducción Kozak consenso en pcDNA3.I/MycHis Versión A (Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos). La expresión de la proteína se conduce por el promotor citomegalovirus (CMV). Las proteínas recombinantes tienen el epítopo myc y el epítopo 6X His fusionados al extremo carboxilo. El vector pcDNA3.I/MycHis también contiene la secuencia de la señal de poliadenilación y de terminación transcripcional de la hormona de crecimiento bovina (BGH) para potenciar la estabilidad de ARNm junto con el origen SV4O para la replicación episomal y rescate de vector único en líneas celulares que expresan el antígeno T grande. Puede usarse el gen de resistencia a neomicina, ya que permite la selección de células de mamífero que expresan la proteína y el gen de resistencia a ampilicina y origen CoIE1 permite la selección y mantenimiento del plásmido en E. coli.

Constructo pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO: Para expresar 184P1E2 en células de mamífero y para permitir la detección de las proteínas recombinantes usando fluorescencia, un ORF de 184P1E2, o porciones del mismo, se clonan con un sitio de iniciación de la traducción Kozak consenso en pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO (Invitrogen, CA, Estdos Unidos). La expresión de la proteína se conduce por el promotor citomegalovirus (CMV). Las proteínas recombinantes tienen la proteína fluorescente verde (GFP) fusionada al extremo carboxilo, lo que facilita la detección no invasiva, in vivo y los estudiso de biología celular. El vector pcDNA3.ICT-GFP-TOPO también contiene la secuencia de la señal de poliadenilación y de terminación transcripcional de la hormona de crecimiento bovina (BGH) para potenciar la estabilidad de ARNm junto con el origen SV4O para la replicación episomal y rescate de vector único en líneas celulares que expresan el antígeno T grande. El gen de resistencia a neomicina permite la selección de células de mamífero que expresan la proteína y el gen de resistencia a ampilicina y origen CoIE1 permite la selección y mantenimiento del plásmido en E. coli. Se fabrican constructos adicionales con una fusión GFP amino-terminal en pcDNA3.1/NT-GFP-TOPO que abarcan lo longitud entera de una proteína 184P1E2.

PAPtag: Un 184P1E2ORF,o porciones del mismo, se clonan en pAPtag-5 (GenHunter Corp. Nashville, TN, Estados Unidos). Este constructo genera una fusión con fosfatasa alcalina en el extreme carboxilo de una proteína 184P1E2 mientras que fusiona la secuencia de señal IgGK al extremo amino. También se generan constructos en los que la fosfatasa alcalina está fusionada con una secuencia de señal lgGK amino-terminal de una proteína 184P1E2. Las proteínas 184P1E2 recombinantes resultantes se optimizan para la secreción en el medio de células de mamífero transfectadas y pueden usarse para identificar proteínas tales como ligandos o receptores que interactúan con proteínas 184P1E2. La expresión de proteínas se conduce por el promotor CMV y las proteínas recombinantes también contienen los epítopos myc y 6X His fusionadas en el extremo carboxilo, lo que facilita la detección y la purificación. El gen de resistencia a zeocina presente en el vector permite la selección de células de mamífero que expresan la proteína recombinante y el gen de resistencia a ampilicina permite la selección del plásmido en E. coli.

ptag5: Un 184P1E2ORF, o porciones del mismo, se clona en pTag-5. Este vector es similar a pAPtag pero sin la fusión a fosfatasa alcalina. Este constructo genera la proteína 184P1E2 con una secuencia de señal IgGK aminoterminal y etiquetas de epítopos myc y 6X His en el extremo carboxilo que facilitan la detección y la purificación de afinidad. La proteína 184P1E2 recombinante resultante se optimiza para la secreción en el medio de células de mamífero y se usa como inmunógeno o ligando para identificar proteínas tales como ligandos o receptores que interactúan con las proteínas 184P1E2. La expresión de la proteína se conduce por el promotor CMV. El gen de resistencia a zeocina permite la selección de células de mamífero que expresan la proteína y el gen de resistencia a ampilicina y origen CoIE1 permite la selección y mantenimiento del plásmido en E. coli.

PsecFc: Un 184P1E2ORF, o porciones del mismo, también se clona en psecFc. El vector psecFc se ensambló clonando la inmunoglobulina humana G1 (lgG) Fc (regiones bisagra, CH2, CH3) en pSecTag2 (Invitrogen, California, Estados Unidos). Este constructo genera una fusión IgG1 Fc en el extremo carboxilo de las proteínas 184P1E2, mientras que fusiona la secuencia de señal IgGK al extremo N. Las fusiones 184P1E2 que usan la región IgG1 Fc murina también se usan. Las proteínas 184P1E2 recombinantes resultantes se optimizan para la secreción en el medio de células de mamífero transfectadas y pueden usarse para identificar proteínas tales como ligandos o receptores que interactúan con proteínas 184P1E2. La expresión de proteínas se conduce por el promotor CMV. El gen de resistencia a higromicina presente en el vector permite la selección de células de mamífero que expresan la proteína recombinante y el gen de resistencia a ampilicina permite la selección del plásmido en E. coli.

Constructos pSRα: Para generar líneas celulares de mamífero que expresan 184P1E2 constitutivamente, 184P1E2ORF, o porciones del mismo, de 184P1E2 se clonan en constructos pSRα. Se generan retrovirus amfotrópicos y ecotrópicos por transfección de constructos pSRα en línea de envase 293T-10A1 o cotransfección de pSRα y un plásmido auxiliar (que contiene secuencias de envase eliminadas) en las células 293, respectivamente. El retrovirus se usa para infectar diversas líneas celulares de mamífero, dado como resultado la integración del gen clonado, 184P1E2, en las líneas celulares huésped. La expresión de la proteína se conduce por una repetición terminal larga (LTR). El gen de resistencia a neomicina presente en el vector permite la selección de células de mamífero que expresan la proteína recombinante y el gen de resistencia a ampilicina permite la selección y mantenimiento del plásmido en E. coli. Los vectores retrovíricos pueden usarse después para infectar y generar diversas líneas celulares, usando, por ejemplo, células PC3, NIH 3T3, TsuPr1, 293 o rat-1.

Se fabrican constructos pSRα adicionales que fusionan una etiqueta de epítopo tal como la etiqueta FLAGTM al extremo carboxilo de las secuencias de 184P1E2 para permitir la detección usando anticuerpos anti-Flag. Por ejemplo, la secuencia de FLAGTM 5’ gat tac aag gat gac gac gat aag 3’ se añade al cebador de clonación en el extremo 3’ del ORF. Se fabrican constructos pSRα adicionales para producir proteínas de fusión GFP y myc/6X His tanto en el extremo amino como en el carboxilo de las proteínas 184P1E2 de longitud completa.

Vectores víricos adicionales: Se fabrican constructos adicionales para el suministro y expresión mediada de fiorma vírica de 184P1E2. La valoración de virus elevada que provoca la expresión de alto nivel de 184P1E2 se logra en sistemas de suministro víricotales como vectores adenovíricos y vectores de amplicón de herpes. Un 184P1E2 que codifica secuencias o fragmentos de las mismas se amplifica por PCR y se subclona en vector de traslación AdEasy (Stratagene). La recombinación y el envase del virus se realizan de acuerdo con las instrucciones del fabricante para generar vectores adenovíricos. Alternativamente, las secuencias codificantes de 184P1E2 o fragmentos de las mismas se clonan en el vector HSV-1 (lmgenex) para generar vectores víricos de herpes. Los vectores víricos se usan después para la infección de diversas líneas celulares tales como células PC3, NIH 3T3, 293 o rat-1.

Sistemas de expresión regulados: Para controlar la expresión de 184P1E2 en células de mamífero, se clonan secuencias codificantes de 184P1E2, o porciones de las mismas, en sistemas de expresión de mamíferos regulados tales como el sistema T-Rex System (Invitrogen), el sistema GeneSwitch System (Invitrogen) y el sistema regulado estrechamente Ecdysone System (Stratagene). Estos sistemas permiten el estudio de los efectos temporales y dependientes de la concentración de 184P1E2 recombinante. Estos vectores se usan después para controlar la expresión de 184P1E2 en diversas líneas celulares tales como células PC3, NIH 3T3, 293 o rat-10.

B. sistemas de expresión de baculovirus

Para generar proteínas 184P1E2 recombinante en un sistema de expresión de baculovirus, se clonan 184P1E2ORF,

o porciones del mismo, en el vector de transferencia de baculovirus pBlueBac 4.5 (Invitrogen), que proporciona una etiqueta His en el extremo N. Específicamente, pBlueBac-184P1E2 se cotransfecta con pBac-N-Blue (Invitrogen) en células de insecto SF9 (Spodoptera frugiperda) para generar baculovirus recombinantes (véase el manual de instrucciones de Invitrogen para más detalles). El baculovirus se recoge después del sobrenadante celular y se purifica mediante ensayo de placa.

La proteína 184P1E2 recombinante se genera después por infección de células de insecto HighFive (Invitrogen) con baculovirus purificados. La proteína 184P1E2 recombinante puede detectarse usando anticuerpos anti-184P1E2 o anti-His-tag. La proteína 184P1E2 puede purificarse y usarse en varios ensayos basados en células o como inmunógeno para generar anticuerpos policlonales o monoclonales específicos de 184P1E2.

Ejemplo 9 Perfiles de antigenicidad y estructura secundaria

La figura 5, la figura 6, la figura 7, la figura 8 y la figura 9 representan gráficamente cinco perfiles de aminoácidos de las variantes 1 a 4 de 184P1E2 respectivamente, estando disponible cada evaluació accediendo al sitio de Internet de ProtScale (URL www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) en el servidor de biología molecular ExPasy.

Estos perfiles: figura 5, hidrofilicidad, (Hopp T.P., Woods K.R., 1981. Proc. NatI. Acad. Sci. U.S.A. 78: 3824-3828); figura 6, hidropaticidad, (Kyte J., Doolittle R.F., 1982. J. Mol. Biol. 157:105-1 32); figura 7, porcentaje de residuos accesibles (Janin J., 1979 Nature 277:491-492); figura 8; flexibilida promedio, (Bhaskaran R. y Ponnuswamy P.K., 1988. Int. J. Pept. Protein Res. 32:242-255); figura 9, giro beta (Deleage, G., Roux B. 1987 Protein Engineering 1:289-294); y opcionalmente otros disponibles en la técnica, tales como los del sitio de Internet de ProtScale, se usaron para identificar regiones antigénicas de la proteína 184P1E2. Cada uno de los perfiles de aminoácidos anteriores de 184P1E2 se generaron usando los parámetros de ProtScale para análisis: 1) Un tamaño de ventana de 9; 2) el 100 % en peso de los bordes de la ventana en comparación con el centro de la ventana y 3) valores de perfil de aminoácidos normalizados para que se encuentrene entre 0 y 1.

Los perfiles de hidrofilicidad (figura 5), hidropaticidad (figura 6) y de porcentaje de residuos accesibles (figura 7) se usaron para determinar tramos de aminoácidos hidrófilos (es decir, valores superiores a 0,5 en los perfiles de hidrofilicidad y de porcentaje de residuos disponibles, y valores inferiores a 0,5 en el perfile de hidropaticidad). Dichas regiones es probable que estén expuestas a un ambiente acuoso, estén presentes en la superficie celular y, de este modo, estén disponibles para el reconocimiento inmunitario, tal como por anticuerpos.

Los perfiles de flexibilidad promedio (figura 8) y de giro beta (figura 9) determinan tramos de aminoácidos (es decir, valores superiores a 0,5 en el perfil de giro beta y en el perfil de flexibilidad promedio) que no están constreñidos en estructuras secundarias tales como láminas beta y hélices alfa. Dichas regiones es también más probable que estén expuestas sobre la proteína y, de este modo, estén accesibles al reconocimiento inmunitario, tal como por anticuerpos.

Las secuencias antigénicas de las proteína 184P1E2 y de las proteínas variantes indicadas, por ejemplo, por los perfiles establecidos en la figura 5, la figura 6, la figura 7, la figura 8 y/o la figura 9 se usan para preparar inmunógenos, o bien p´pptidos o bien ácidos nucleicos que los codifican, para generar anticuerpos anti-184P1E2 terapéuticos y de diagnóstico. El inmunogeno puede ser cualquiera de entre 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más de 50 aminoácidos contiguos, o los ácidos nucleicos correspondientes que los codifican, de las variantes de la proteína 184P1E2 enumeradas en las figuras 2 y 3. en particular, los inmunógenos peptídicos de la invención pueden comprender una región peptídica de al menos 5 aminoácidos de las figuras 2 y 3 en cualquier incremento de número entero que incluya una posición de aminoácido que tenga un valor superior a 0,5 en el perfil de hidrofilicidad de la figura 5; una región peptídica de al menos 5 aminoácidos de las figuras 2 y 3 en cualquier incremento de número entero que incluya una posición de aminoácido que tenga un valor inferior a 0,5 en el perfil de hidropaticidad de la figura 6; una región peptídica de al menos 5 aminoácidos de las figuras 2 y 3 en cualquier incremento de número entero que incluya una posición de aminoácido que tenga un valor superior a 0,5 en el perfil de porcentaje de residuos accesibles de la figura 7; una región peptídica de al menos 5 aminoácidos de las figuras 2 y 3 en cualquier incremento de número entero que incluya una posición de aminoácido que tenga un valor superior a 0,5 en el perfil de flexibilidad promedio de la figura 8 y una región peptídica de al menos 5 aminoácidos de las figuras 2 y 3 en cualquier incremento de número entero que incluya una posición de aminoácido que tenga un valor superior a 0,5 en el perfil de giro beta de la figura 9. Los inmunógenos peptídicos de la invención también pueden comprender ácidos nucleicos que codifican cualquiera de los anteriores.

Todos los inmunógenos de la invención, peptídicos o de ácidos nucleicos, pueden realizarse en forma de dosis unidad para seres humanos, o estar comprendidos en una composición que incluye un excipiente farmacéutico compatible con la fisiología humana.

La estructura secundaria de la variante 1 de 184P1E2, es decir, la presencia predicha y localización de helices alfa, cadenas extendidas y espirales aleatorias, se predice a partir de la secuencia de aminoácidos primaria usando el procedimiento HNN – red neuronal jerárquica (Guermeur, 1997, http://pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat. pl?page=npsa_nn.html), acesible desde el servidor de biología molecular ExPasy (http://www.expasy.ch/tools/). Los análisis indican que la variante 1 de 184P1E2 se compone del 25,30 % de hélice alfa, 22,59 % de cadena extendida y del 52,11 % de espiral aleatoria (figura 13).

El análisis para evaluar la presencia potencial de dominios transmembranales en la variante 1 de 184P1E2 se llevó a cabo usando diversos algoritmos de predicción transmembranal accesibles desde el servidor de biología molecular ExPasy (http://www.expasy.ch/tools/). Los programas no predicen la presencia de dominios transmembranales en 184P1E2, lo que sugiere que es una proteína soluble.

Ejemplo 10 Generación de anticuerpos policlonales 184P1E2

Pueden obtenerse anticuerpos policlonales en un mamífero, por ejemplo, mediante una o varias inyecciones de una agente de inmunización y, si se desea, un coadyuvante. Normalmente, el agente de inmunización y/o el coadyuvante se inyectarán en el mamífero por medio de múltiples inyecciones subcutáneas e introperitoneales. Además de la inmunización con proteína 184P1E2 de longitud completa, se usan algoritmos informáticos en el diseño de inmunógenos que, sobre la base del análisis de secuencias de aminoácidos contienen características de ser antigénicos y disponibles para el reconocimiento por el sistema inmunitario del huésped inmunizado (véase el ejemplo titulado perfiles de antigenicidad). Dichas regiones se predecería que son hidrófilas, flexibles, en conformciones de giro beta, y están expuestas en la superficie de la proteína (véanse, por ejemplo, la figura 5, la figura 6, la figura 7, la figura 8 o la figura 9 para los perfiles de aminoácidos que indican dichas regiones de 184P1E2 y variantes).

Por ejemplo, las proteínas o péptidos de fusión bacteriana 184P1E2 recombinantes que contienen regiones hidrófilas, flexibles, de giro beta de proteínas variantes de 184P1E2 se usan como antígenos para generar anticuerpos policlonales en conejos New Zealand White. Por ejemplo, dichas regiones incluyen, pero no están limitadas a, los aminoácidos 53-73, aminoácidos, los aminoácidos 117-136, los aminoácidos 217-251 y los aminoácidos 366-446 de la variante 1 de 184P1E2. Es útil conjugar el agente de inmunización a una proteína que se sepa que es inmunogénica en el mamífero que va a ser inmunizado. Los ejemplos de dichas proteínas inmunogénicas incluyen, pero no están limitados a, hemocianina de lapa californiana (KLH), albúmina de suero, trioglobulina bovina e inhibidor de tripsina de soja. En una realización, un péptido que codifica los aminoácidos 53-73 de la variante 1 de 184P1E2 se conjuga con KLH y se usa para inmunizar el conejo. Alternativamente, el agente de inmunización puede incluir la totalidad o porciones de las proteínas variantes de 184P1E2, análogos o proteínas de

5 fusión de las mismas. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la variante 1 de 184P1E2 puede fusionarse usand técnicas de ADN recombinante a cualquiera de entre diversos asociados de proteína de fusión que son bien conocidos en la técnica, tales como glutatión-S-transferasa (GST) y proteínas de fusión etiquetadas con HIS. Dichas proteínas de fusión se purifican a partir de bacterias inducidas usando la matriz de afinidad apropiada.

En una realización, una proteína de fusión GST que codifica los aminoácidos 1-251, que comprende varias regiones

10 que se ha predicho que son antigénicas, se produce y se purifica y se usa como inmunógeno. Otras proteínas de fusión bacterianas recombinantes que pueden usarse incluyen proteína de unión a maltosa, LacZ, tioredoxina, NusA,

o una región constante de inmunoglobulina (véase la sección titulada Producción de 184P1E2 en sistemas procarióticos y Current Protocols In Molecular Biology, Volumen 2, Unidad 16, Frederick M. Ausubul y col. eds., 1995; Linsley, P.S., Brady, W., Urnes, M., Grosmaire, L., Damle, N. y Ledbetter, L.(1991) J.Exp. Med. 174, 561-566).

15 Además de proteínas de fusión derivadas de bacterias, se usan también antígenos proteicos expresados en mamíferos. Estos antígenos se expresan a partir de vectores de expresión de mamíferos tales como vectores de fusión Tag5 y Fc (véase el ejemplo titulado Producción de 184P1E2 recombinante en sistemas eucarióticos) y retiene las modificaciones postraslacionales tales como glucosilaciones encontradas en proteínas nativas. En una realización, la secuencia de cadena completa de la variante 1, aminoácidos 1-664, en el vector de secrección de

20 mamífero Tag5. La proteína recombinante se purifica por cromatografía de quelador de metales a partir de sobrenadantes de cultivo hístico de células 293T que expresan de forma estable el vector recombinante. La proteína Tag5 184P1E2 purificada se usa después como inmunógeno.

Durante el protocolo de inmunización, es útil mezclar o emulsionar el antígeno en coadyuvantes que potencien la respuesta inmunitaria del animal huésped. Los ejemplos de coadyuvantes incluyen, pero no están limitados a,

25 coadyuvante completo de Freund (CFA) y coadyuvante MPL-TDM (monofosforilo Lípido A, trehalosa dicorinomicolato sintético).

En un protocolo típico, los conejos se inmunizan inicialmente subcutáneamente con hasta 200 µg, normalmente 100200 µg, de proteína de fusión o péptido conjugado a KLH mezclado en coadyuvante completo de Freund (CFA).a continuación se inyectan a los conejos subcutáneamente cada dos semanas hasta 200 µg, normalmente 100-200

30 µg, del inmunógeno en coadyuvante de Freund incompleto (IFA). Los sangrados de ensayo se toman aproximadamente a los 7-10 días después de cada inmunización y se usan para supervisar la valoración del antisuero por ELISA.

Para analizar la reactividad y la especifidad del suero inmunitaria, tal como suero de conejo derivado de inmunización con un péptido conjugado a KLH que codifica los aminoácidos 53-73 de la variante 1, el ADNc de 35 cadena completa de la variante 1 de 184P1E2 se clona en el vector de expresión pCDNA 3.1 myc-his (Invitrogen, véase el ejemplo titulado Producción de 184P1E2 recombinante en sistemas eucarióticos). Después de la transfección de los constructos en células 293T, se analizan lisados celulares con el suero anti-184P1E2 y conel anticuerpo anti-His (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA, Estados Unidos) para determinar la reactivadad específica a la proteína 184P1E2 desnaturalizada usando la técnica de inmunotrasnferencia (Western). El suero 40 inmunitario se analiza después mediante técnica de inmunotrasnferencia (Western) frente a células 293T-184P1E2. Además, el suero inmunitarios se analiza por microscopía fluorescente, citometría de flujo e inmunoprecipitación frente a 293T y otras células que expresan 184P1E2 recombinante para determinar el reconocimiento específico de proteína nativa. Las técnicas de inmunotransferencia Western, inmunoprecipitación, microscopía fluorescente y citometría de flujo que usan células que expresan de forma endógena 184P1E2 también se llevan a cabo para

45 analizar la reactividad y la especificidad.

El antisuero de conejos inmunizado con proteínas de fusión de variante de 184P1E2, tales como proteínas de fusión GST y MBP, se purifican por depleción de anticuerpos reactivos a la secuencia del asociado de fusión por paso a través de una columna de afinidad que contiene el asociado de fusión bien solo o bien en el contexto de una proteína de fusión irrelevante. Por ejemplo, el antisuero derivado de una proteína de fusión GST-184P1E2 que 50 codifica los aminoácidos 1-251 se purifica primeramente pasándolo a través de una columna de proteína GST acoplada de forma covalente a una matriz de AffiGel (BioRad, Hercules, California, Estados Unidos). El antisuero se purifica de afinidad pasándolo a través de una columna compuesta por una proteína de fusión MBP que también codifica los aminoácidos 1-251 acoplada covalentemente a una matriz de Affigel. El suero se purifica posteriormente mediante cromatografía de afinidad de proteína G para aislar la fracción IgG. Sueros de otros antígenos etiquetados

55 con His y de conejos inmunizados con péptidos, así como sueros agotados de asociados de fusión se purifican de afinidad pasándolos a través de una columna compuesta del inmunógeno de proteína original o péptido libre.

Ejemplo 11 Generación de anticuerpos monoclonales 184P1E2 (mAb)

En una realización, los mAb terapéuticos de variantes de 184P1E2 comprenden los que reaccionan con epítopos específicos para cada proteína variante o específicos a secuencias en común entre las variantes que interrumpen o modulan la función biológica de variantes de 184P1E2, por ejemplo los que interrumpirían la interacción con ligandos y sustratos o interrumpirían su actividad catalítica. Los inmunógenos para la generación de dichos mAb incluyen los diseñados para codificar o contener la secuencia completa de variantes de proteína 184P1E2, regiones de las variantes de proteína 184P1E2 que se ha predicho que son antigénicas por análisis informático de la secuencia de aminoácidos (véanse, por ejemplo, la figura 5, la figura 6, la figura 7, la figura 8 o la figura 9 y el ejemplo titulado Perfiles de antigenicidad”). Los inmunógenos incluyen péptidos, proteínas bacterianas recombinantes y proteínas Tag 5 expresadas en mamíferos y proteínas de fusión lgG FC humanas y murinas. Además, se usan células diseñadas para expresar niveles altos de una variante de 184P1E2 respectiva, tales como células Pre-B de 293Tvariate 1 de 184P1E2 o 300.19-variante 1 de 184P1E2 murina, para inmunizar ratones.

Para generar mAb a una variante de 184P1E2, se inmunizan primeramente ratones intraperitonealmente (IP) con, normalmente, 10-50 µg de inmunógeno proteico o 107 célula que expresan 184P1E2 mezcladas con coadyuvante completo de Freund. A continuación se inmunizan ratones subsiguientemente IP cada 2-4 semanas con, normalmente, 10-50 µg de inmunógeno proteico o 107 célula mezcladas con coadyuvante incompleto de Freund. Alternativamente, se usa en inmunizaciones coadyuvante MPL-TDM. Además de la proteína anterior y de estrategias de inmunización basadas en células, se usa un protocolo de inmunización basado en AND en el que un vector de expresión mamífero que codifica una secuencia de variante de 184P1E2 para inmunizar ratones mediante inyección directa de ADN plásmido. Por ejemplo, la secuencia de la variante 1 de longitud completa, que codifica los aminoácidos 1-664, se clona en el vector de secreción Tag5 mamífero y el vector recombinante se usa como inmunógeno. En otro ejemplo se clona los mismos aminoácidos en un vector de secreción Fc-fusion en el que la secuencia de la variante 1 de 184P1E2 está fusionada en el extremo amino a una secuencia líder lgK y en extremo carboxilo a una secuencia de codificación de la región lgG Fc humana o murina. Este vector recombinante se usa después como inmunógeno. Se usan protocolos de inmunización de plásmidos en combinación con proteínas purificadas expresadas a partir del mismo vector y con células que expresan la variante de 184P1E2 respectiva.

Durante el protocolo de inmunización, los sangrados de ensayo se realizan 7-10 días después de una inyección pa supervisar la valoración y especificidad de la respuesta inmunitaria. Una vez obtenidas la reactividad y la especificidad apropiadas por análisis de ELISA, inmunotransferencia (Western), inmunoprecipitación, microscopía de fluorescencia y citometría de flujo, se realiza la fusión y la generación de hibridomas con procedimientos establecidos bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, 1988).

En una realización para generar anticuerpos monoclonales 184P1E2, se expresa y purifica un antígeno de Tag5variante 1 de 184P1E2 que codifica los aminoácidos 1-664, a partir de células 293T transfectadas de forma estable. Inicialmente, se inmunizan ratones BaIb C intraperitonealmente con 25 µg de la proteína Tag5-variante 1 de 184P1E2 mezclada en coadyuvante completo de Freund. Los ratones se inmunizan subsiguientemente cada dos semanas con 25 µg del antígeno mezclado en coadyuvante incompleto de Freund durante un total de tres inmunizaciones. El ELISA usando el antígeno Tag5 determina la valoración de suero de ratones inmunizados. La reactividad y la especificidad del suero a la proteína variante de longitud completa 184P1E2 se supervisan mediante inmunotransferencia (Western), inmunoprecipitación y citometría de flujo usando células 293T transfectadas con un vector de expresión que codifica ADNc de la variante 1 de 184P1E2 (véase, por ejemplo, el ejemplo titulado Producción de 184P1E2 recombinantes en sistemas eucarióticos). También se usan otras células que expresan la variante 1 de 184P1E2 recombinante o células que expresna la variante 1 de 184P1E2. Los ratones que muestran la mayor reactividad se dejan descansar y se les proporciona antígeno Tag5 en PBS y se sacrifican cuatro días después. Los bazos de los ratones sacrificados se recogen y se fusionan con células de mieloma SPO/2 usando procedimientos estándar (Harlow y Lane, 1988). Los sobrenadantes de HAT seleccionados de pocillos de crecimiento se criban por ELISA, inmunotransferencia (Western), inmunoprecipitación, microscopía fluorescente y citometría de flujo para identificar clones que producen anticuerpos específicos de 184P1E2.

La afinidad de unión de un anticuerpos monoclonal 184P1E2 se determina usando tecnologías estándar. Las medidas de la afinidad cuantifican la fuerza de la unión del anticuerpo al epítopo y se usan para ayudar a definir que anticuerpos monoclonales 184P1E2 se usan preferentemente para diagnóstico o para uso terapéutico, tal como apreciará un experto en la técnica. El sistema BlAcore (Uppsala, Suecia) es un procedimiento preferente para determinar la afinidad de unión. El sistema BlAcore usa resonancia de plasmón superficial (SPR, Welford K. 1991, Opt. Quant. Elect. 23:1; Morton y Myszka, 1998, Methods in Enzymology 295: 268) para supervisar interacciones biomoleculares en tiempo real. El análisis BlAcore genera de forma conveniente constantes de velocidad de asociación, constantes de velocidad de disociación, constantes de disociación en el equilibrio y constantes de afinidad.

Ejemplo 12 Ensayos de unión de HLA de clase I y de clase II

Los ensayos de unión de HLA de clase I y de clase II que usan moléculas HLA purificadas se realizan de acuerdo con protocolos divugados (por ejemplo, publicaciones PCT WO 94/20127 y WO 94/03205; Sidney y col., Current Protocols in Immunology 18.3.1 (1998); Sidney y col., J. Immunol. 154:247 (1995); Sette y col., Mol. Immunol. 31:813 (1994)). Brevemente, las moléculas MHC purificadas (5 a 500 nM) se incuban con varios inhibidores peptídicos no etiquetados y 1-10 nM de péptidos de sondas radioetiquetadas con 125I tal como se ha descrito. Siguiendo la incubación, los complejos MHC-péptido se separan del péptido libre mediante filtración en gel y la fracción de péptido unido se determina. Normalmente, en experimentos preliminares, cada preparación de MHC se valora en presencia de cantidades fijadas de péptidos radioetiquetados para determinar la concentración de moléculas HLA necesaria para unirse al 10-20 % de la radioactividad total: Toda inhibición subsiguiente y ensayos de unión directos se realizan usando estas concentraciones de HLA.

Debido a que en estas condiciones [etiqueta]<[HLA] y CI50≥[HLA], los valores de CI50 medidos son aproximaciones razonables de los valores KD reales. Los inhibidores peptídicos se analizan normalmente a concentraciones que varían de 120 µg/ml a 1,2 ng/ml, y se analizan en dos a cuatro experimentos completamente independientes. Para permitir la comparación de los datos obtenidos en experimentos diferentes, se calcula una cifra de unión relativa para cada péptido por división de CI50 de un control positivo para la inhibición por la CI50 para cada péptido analizado (normalmente versiones no etiquetadas del péptido de sonda radioetiquetada). Para fines de base de datos, y comparaciones interexperimentales, se compilan los valores de unión relativos. Estos valores pueden convertirse subsecuentemente de nuevo en valores CI50 nM dividiendo los CI50 nM de los controles positivos para inhibición por la unión relativa del péptido de interés. Este procedimiento de compilación de datos es preciso y consecuente para la comparación de péptidos que se han analizado en días diferente, o con lotes diferentes de MHC purificados.

Pueden usarse ensayos de unión tal como se han definido anteriormente para analizar supermotivos HLA y/o péptidos que portan motivo HLAB (véase la tabla IV).

Ejemplo 13 Identificación de epítopos candidatos CTL que portan supermotivo o motivo HLA

Las composiciones de vacuna HLA de la invención pueden incluir epítopos múltiples. Los epítopos múltiples pueden comprender múltiples motivos o supermotivos HLA para lograr una cobertura de población amplio. Este ejemplo ilustra la identificación y confirmació de epítopos que portan motivos y supermotivos para la inclusión de dicha composición de vacuna. El cálculo de la cobertura de la población se realiza usando la estrategia que se describe más adelante.

Búsquedas y algoritmos informáticos para la identificación de epítopos que portan motivos y supermotivos

Las búsquedas se realizan para identificar las secuencias de péptidos que portan motivo en el ejemplo titulado Perfiles de antigenicidad y las tablas V-XVIII y XXII-LI usan los datos de secuencias de proteínas del producto génico de 184P1E2 establecidas en ls figurs 2 y 3; los péptiods específicos usados para generar las tablas se enumeran en la tabla LII.

Las búsquedas informáticas para epítopos que portan motivos o supermotivos HLA de clase I o clase II se realizan como sigue. Todas las secuencias de proteína 184P1E2 traducidas se analizan usando un programa informático de búsquedad de cadena de caracteres de texto para identificar secuencias de péptidos potenciales que contienen los motivos de unión a HLA apropiados; dichos programas se producen fácilmente de acuerdo con információn presente en la técnica en vista de divulgaciones de motivo/supermotivo conocidas. Además, dichos cálculos pueden realizarse mentalmente.

Las secuencias de supermotivos A2, A3 y DR identificadas se puntúan usando algoritmos polinómicos para predecir su capacidad de unión a moléculas específicas de HLA de clase I o clase II. Estos algoritmos polinómicos explican la influencia de diferentes aminoácidos en diferentes posiciones, y se basan esencialmente en la premisa de que la afinidad total (o ΔG) de las interacciones péptido-molécula de HLA pueden aproximarse en forma de una función polinómica del tipo:

“ΔG” = a1i x a2i x a3i ………x ani

en la que aji es un coeficiente que representa el efecto de la presencia de una aminoácido dado (j) en un posición dada (i) junto con la secuencia de un péptido de n aminoácidos. La asumpción crucial de este procedimiento es que los efectos de cada posición son esencialmente independientes de todos los demás (es decir, la unión independiente de cadenas laterales individuales). Cuando el residuo está presente en la posición i del péptido, se asume que contribuye una cantidad constante ji a la energía libre de unión del péptido irrespectivo de la secuencia del resto del péptido.

El procedimiento de derivación de coeficientes de algoritmo específicos se ha descrito en Gulukota y col., J. Mol. Biol. 267:1258-126, 1997; (véase también Sidney y col., Human Immunol. 45:79-93, 1996; y Southwood y col., J. Immunol. 160: 3363-3373, 1998). Brevemente, para cada posición i, sea de anclaje o de no anclaje, la media geométrica de la unión relativa promedio (ARB) de todos los péptidos que portan J se calcula con relación a los restantes del grupo, y se usa para estimar ji. Para péptidos de clase II, si son posibles múltiples alineamientos, sólo se usa el alineamiento con la puntación más alta, siguiendo un procedimiento iterativo. Para calcular una puntuación algorítmica de un péptido dado en un conjunto de ensayo, los valores ARB que corresponden a la secuencia del péptido del péptido se multiplican. Si este producto excede un umbral escogido, el péptido se predice que se une. Los umbrales apropiados se eligen como función del grado de estringencia de predicción deseado.

Selección de péptidos con reactividad cruzada de supertipo HLA-A2 Las secuecias proteicas de 184P1E2 se analizan usando un programa informático de identificación de motivos, para identificar secuencias de 8, 9, 10 u 11 aminoácidos que contienen la específidad de anclaje de supermotivo HLA-A2. Típicalmente, estas secuencias se puntúan después usando el protocolo descrito anteriormente y los péptidos correspondientes de las secuencias puntuadas positivas se sintetizan y se analizan para evaluar su capacidad de unión a moléculas HLAA*0201 purificadas in vitro (HLAA*0201 se considera un prototipo de molécula de supertipo A2).

Estos péptidos se analizan después para evaluar su capacidad de unirse a moléculas de supertipo A2 adicionales (A*0202, A*0203, A*0206 y A*6802). Los péptidos que se unen a al menos tres de los cinco alelos de supertipo A2 analizados se consideran normalmente enlazantes de reactividad cruzada de supertipo A2. Los péptidos preferentes se unen con una afinidad igual o inferior a 500 nM a tres o más moléculas de supertipo HLA-A2.

Selección de epítopos que portan HLA-supermotivo A3

La(s) secuencia(s) de proteína 184P1E2 analizadas anteriormente se examinan también para evaluar la presencia de péptidos con anclajes primarios HLA-supermotivo A3. Los péptidos correspondientes a las secuencias que portan HLA-supermotivo A3 se sintetizan a continuación y se analizan para evaluar la unión a moléculas HLAA*0301 y HLAA*1101, las moléculas codificadas por los dos alelos más prevalentees de supertipo A3. Los péptidos que se unen al menos a uno de los dos alelos con afinidades de unión ≤ 500 nM, a menudo ≤ 200 nM, se analizan a continuación para evaluar la reactividad cruzada de unión a los otros alelos de supertipo A3 comunes (por ejemplo, A*3101, A*3301 y A*6801) para identificar los que se unen al menos a tres de las cinco moléculas de HLA-supertipo A3 analizadas.

Selección de epítopos que portan HLA-supermotivo B7

La(s) proteína(s) 184P1E2 analizadas anteriormente se analizan también para evaluar la presencia de péptidos de 8, 9, 10 u 11 aminoácidos con HLA-supermotivo B7. Los péptidos correspondientes se sintetizan y analizan para evaluar su unión a HLAB*0702, la molécula que codifica el alelo de supertipo B7 más común (es decir, el prototipo del alelo de supertipo B7). Los péptidos que se unen a B*0702 con CI50 ≤ 500 nM se identifican usando procedimientos estándar. Estos péptidos se analizan a continuación para evaluar su unión a otras moléculas de supertipo B7 comunes (por ejemplo, B*3501, B*5101, B*5301 y B*5401). Los péptidos capaces de unirse a tres o más de los cinco alelos de supertipo B7 analizados se identifican de este modo.

Selección de epítopos que portan motivos A1 y A24

Para aumentar adicionalmente la cobertura de la población, también pueden incorporse en composiciones de vacuna epítopos HLA-A1 y -A24. También puede realizarse un análisis de la proteína 184P1E2 para identificar secuencias que contienen motivo HLA-A1 y -A24.

Los epítopos de unión de afinidad alta y/o con reactividad cruzada que portan otros motivos y supermotivos se identifican usando una metodología análoga.

Ejemplo 14 Confirmación de inmunogenicidad

Los péptidos candidatos con reactividad cruzada que portan el supermotivo CTL A2 que se identifican como se describe en el presente documento se seleccionan para confirmar la inmunogenicidad in vito. La confirmación se realiza usando la metodología siguiente.

Líneas celulares diana para examen celular:

La línea celular .221A2.1, producida por transferencia del gen HLA-A2.1 en la línea celular 721.221 de linfoblastoide B humano mutante nula HLA-A, -B, -C, se usa como la diana cargada con péptido para medir la actividad de CTL restringida con HLA-A2.1. Esta línea celular se cultiva en medio RPMI-1640 suplementado con antibióticos, piruvato de sodio, aminoácidos no esenciales y FCS termoinactivado al 10 % (v/v). Las células que expresan un antígeno de interés, o transfectantes que comprenden el gen que codifica el antígeno de interés, pueden usarse como dianas celulares para confirmar la capacidad de CTL específicas de péptidos para reconoger el antígeno endógeno.

Cultivos de inducción de CTL primarios:

Generación de células dendríticas (DC): PBMC se congelan en RPMI con 30 g/ml de DNAsa, se lavan dos veces y se resuspenden en medio completo(RPMI-1640 más suero humano AB al 5 %, aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio, L-glutamina y penicilina/estreptomicina). Los monocitos se purifican palqueando10 x 106 PBMC/pocillo en una placa de 6 pocillos. Después de 2 horas a 37 ºC, las células no adherentes se eliminan agitando vigorosamente las placas y aspirando los sobrenadantes. Los pocillos se lavan un total de tres veces con 3 ml de RPMI para eliminar la mayor parte de las células no adherentes o flojamente adherentes. A continuación, se añaden tres mililitros de medio completo que contiene 50 ng/ml de GM-CSF y 1.000 U/mI de IL-4 a cada pocillo. Se añade TNFα a los DC el día 6 a 75 ng/ml y las células se usan para los cultivos de inducción de CTL el día 7.

Inducción de CTL con DC y péptido: Se aislaron células T CD8+ por selección positiva con perlas inmunomagnéticas Dynal (Dynabeads® M-450) y reactivo detacha-bead®. Normalmente se procesaron aproximadamente 200-250x106 PBMC para obtener 24x106 células T CD8 (suficientes para un cultivo en una placa de 48 pocillos). Brevemente, los PBMC se congelaron en RPMI con 30 µg/ml de DNAsa, se lavaron una vez con PBS que contenía un 1 % de suero humano AB y se resuspendieron en PBS/1 % de suero AB a una concentración de 20x106 células/mI. Las perlas magnéticas se lavaron 3 veces con suero PBS/AB, se añadieron a las células (140 µl de perlas/20x106 células) y se incubaron durante 1 hora a 4 ºC con mezclado continuo. Las perlas y las células se lavaron 4x con suero PBS/AB para eliminar las células no adherentes y se resuspendió a 100x106 células/mI (sobre la base del número de células original) en suero PBS/AB que contiene 100µl/ml de reactivo detacha-bead® y 30 µg/ml de DNAsa. La mezcla se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente con mezclado continuo. Las perlas se lavan de nuevo con PBS/AB/DNAsa para recoger las células T CD8+. La DC se recoge y se centrifuga a 1300 rpm durante 5-7 minutos, se lava una vez con PBS con BSA al 1 %, se hace el recuento y se pulsan con 40 µg/ml de péptido a una concentración celular de 1-2x106/ml en presencia de 3 µg/ml de microglobulina durante 4 horas a 20 ºC. La DC se irradia a continuación (4.200 rads), se lava una vez con medio y se hace el recuento de nuevo.

Establecimiento de cultivos de inducción: 0,25 ml de DC generado por citocinas (a 1 x 105 células/mI) se cocultivan con 0,25ml de células T CD8+ (a 2 x106 células/mI) en cada pocillo de una placa de 48 pocillos en presencia de 10 ng/ml de IL-7. Se añade IL-10 humana recombinante humana el día siguiente a una concentración final de 10 ng/ml y se añade IL-2 humana 48 horas más tarde a 10 UI/mI.

Reestimulación de cultivos de inducción con células adherentes pulsadas con péptidos: siete y catorce días después de la inducción primaria, las célula se reestimulan con células adherentes pulsadas con péptidos. Las PBMC se descongelan y se lavan dos veces con RPMI y ADNsa. Las células se resuspenden a 5x106 células/mI y se irradian a ~4200 rads. Las PBMC se plaquean a 2x106 en 0,5 ml de medio completo por pocillo y se incuban durante 2 horas a 37 ºC. Las placas se lavan dos veces con RPMI golpeando la placa para eliminar las células no adherentes y las células adherentes pulsadas con 10 µg/ml de péptido en presencia de 3 µg/ml de β2 microglobulina en 0,25 ml de RPMI/AB al 5 % por pocillo durante 2 horas a 37 ºC. La solución de péptidos de cada uno de los pocillos se aspira y los pocillos se lavan una vez con RPMI. La mayor parte del medio se aspira de los cultivos de inducción (células CD8+) y se lleva a 0,5 ml de medio fresco. Las células se transfieren, a continuación, a los pocillos que contienen las células adherentes pulsadas con péptido. Veinticuatro horas después se añade IL-10 recombinante humana a una concentración final de 10 ng/ml y se añade IL2 el día siguiente y de nuevo 2-3 días más tarde a50 UI/ml (Tsai y col., Critical Reviews in Immunology 18(1 -2):65-75, 1998). Siete días más tarde, los cultivos se analizan para evaluar su actividad CTL en un ensayo de liberación de 51Cr. En algunos experimentos, los cultivos se analizan para evaluar el reconocimiento específico de péptido en el ELISA IFNγ in situ en el momento de la segunda estimulación, seguido por un ensayo de reconocimiento endógeno 7 días después. Después de la expansión, la actividad se mide en ambos ensayos para una comparación lado a lado.

Medida de la actividad CTL lítica por liberación de 51Cr.

Siete días después de la segunda reestimulación, se determina la citotoxicidad en un ensayo de liberación de 51Cr (5 horas) analizando los pocillos uno a uno en un E:T único. Las dianas pulsadas con péptido ses preparan mediante incubación de las células con 10 µg/ml de péptido durante la noche a 37 ºC.

Las células diana adherentes se eliminan de los recipientes de cultivo con tripsina-EDTA Las células diana se etiquetan con 200 µCi de cromato 51Cr (Dupont, Wilmington, DE) durante 1 hora a 37 ºC. Las células etiquetadas se resulspenden a 106 por ml y se diluyen 1:10 con células K562 a una concentración de 3,3 x 106/ml (se usa una línea celular de eritroblas toma sensible a NK para reducir la lisis no específica). Las células diana (100 µl) y los efectores (100 µl) se plaquean en placas de fondo redondo de 96 pocillos y se incuban durante 5 horas a 37 ºC. simultáneamente, se recogen 100 µl de sobrenadante de cada pocillo y se determina el porcentajde de lisis de acuerdo con la fórmula:

[(cpm de la muestra de ensayo - cpm de la muestra de liberación de 51Cr espontánea)/(cprn de la muestra de liberación de 51Cr mázima - cpm de la muestra de liberación de 51Cr espontánea)] x 100.

La liberación máxima y la espontánea se determinan incubando las dianas etiquetadas con Triton X-100 al 1 % y medio solo, respectivamente. Un cultivo positive se define como uno en el que la lisis específica (muestra-fondo) es del 10 % o superior en el caso de pocillos individuales y es el 15 % o superior en las dos relaciones E:T más elevadas cuando se analizan cultivos expandidos.

Medida in situ de la producción de IFNγ humano es un indicador del reconocimiento endógeno y específico de péptido.

Se recubren 2 placas de immulon con anticuerpo monoclonal IFNγ anti-humano de ratón (4 µg/ml de NaHCO3 0,1 M, pH 8,2) durante la noche a 4 ºC. Las placas se lavan con PBS exento de Ca2+, Mg2+/Tween 20 al 0,05 % y se bloquean con PBS/FCS al 10 5 durante dos horas, después de lo cual las CTL (100 µl/pocillo) y ls dianas (100 µl/pocillo) se añaden a cada pocillo, dejando pocillos vacíos para los patrones y los blancos (que sólo reciben medio). Las células diana, bien dianas pulsadas con péptido o bien dianas endógenas, se usan a una concentración de 1x106 células/ml. Las placas se incuban durante 48 horas a 37 ºC con CO2 al 5 %.

Se añade IFN-gamma recombinante humana a los pocillos estándar comenzando por 400 pg o 1200pg/100 microlitros/pocillo y la placa se incuba durante dos horas a 37 ºC. Las placas se lavan y se añaden 100 µl de anticuerpo monoclonal IFN-gamma de ratón biotinilado (2 microgramos/mI en PBS/FCS al 3 %/Tween 20 al 0,05 %) y se incuban durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de lavar de nuevo, se añaden 100 microlitros de HRP-esstreptavidina (1:4000) y las placas se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavan, a continuación, 6x con tampón de lavado, se añaden100 microlitros/pocillo de solución de desarrollo (TMB 1:1) y las placas se dejan desarrollarse durante 5-15 minutos. La reacción se detiene con 50 microlitros/pocillo de H3PO4 1 M y se leen a DO450. Un cultivo se considera positive si mide al menos 50 pg de IFN-gamma/pocillo sobre el fondo y es dos veces el nivel de expresión del fondo.

Expansión CTL.

Los cultivos que demuestran actividad lítica específica contra dianas pulsadas con péptidos y/o dianas tumorales se expanden durante un periodo de dos semanas con anti-CD3. Brevemente, 5 x 104 células CD8+ se añaden a un recipiente T25 que contiene lo siguiente: 1 x 106 PBMC irradiadas (4,200 rad) (autologas o alogénicas) por ml, 2 x 105 células transformadas EBV irradiadas (8.000 rad) por ml y OKT3 (anti-CD3) a 30 ng por ml en RPMI-1640 que contiene suero AB humano al 10 % (v/v), aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio, 2-mercaptoetanol 25 µM, Lglutamina y penicilina/estreptomicina. Se añade IL2 humana recombinante 24 horas después a una concentración final de 200 UI/ml y cada tres días después medio fresco a 50 UI/ml. Las células se dividen si la concentración celular excede 1 x 106/ml y los cultivos se analizan entre los días 13 y 15 a relaciones E:T de 30, 10, 3 y 1:1 mediante el ensayo de liberación de 51Cr a 1 x 106/ml o mediante el ensayo de IFNγ in situ usando las mismas dianas que antes de la expansión.

Los cultivos se expanden en ausencia de anti-CD3 tal como sigue. Los cultivos que demuestran actividad lítica específica contra dianas peptídicas y endógenas se seleccionan y se añaden 5x104 células CD8 a un recipiente T25 que contiene los siguiente: 1x106 PBMC autólogas por ml que se han pulsado con péptido con 10 g/ml de péptido durante 2 horas a 37 ºC y se han irradiado (4.200 rad); 2 x 105 células transformadas EBV irradiadas (8.000 rad) por ml, RPMI-1640 que contiene suero AB humano al 10 % (v/v), aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio, 2-ME 25 mM, L-glutamina y gentamicina.

Inmunogenicidad de péptidos que portan supermotivo A2

Se analizan péptidos de unión con reactividad cruzada con supermitivo A2 en el ensayo celular para evaluar la capacidad de inducir CTL específicas de péptido en individuos normales. En este análisis, un péptido se considera normalmente que es un epítopo si induce CTL específicas de péptido en al menos individuos, y preferentemente, tambén reconoce el péptido expresad de forma endógena.

La inmunogenicidad también puede confirmarse usando PBMC aisladas de pacientes que portan un tumor que expresa 184P1E2. Brevemente, se aislan PBMC de pacientes, se reestimulan con monocitos pulsados con péptidos y se analizan para evaluar su capacidad de reconocer células pulsadas con péptido, así como células transfectadas de forma endógena que expresan el antígeno.

Evaluación de inmunogenicidad A*03/A11

Los péptidos de unión con reactividad cruzada que portan supermotivo HLA-A3 también se analizan para evaluar la inmunogenicidad usando metodología análoga para ese uso para evaluar la inmunogenicidad de los péptidos con supermotivo HLA-A2 .

Evaluación de inmunogenicidad B7

La selección de inmunogenicidadde péptidos de unión con reactividad cruzada de supertipo B7 identificados tal como se ha establecido en el presente documento se confirma de un modo análogo a la confirmacion de péptidos que portan supermotivos A2 y A3.

Los péptidos que portan otros motivos/supermotivos, por ejemplo, HLA-A1, HLA-A24, etc. También se confirman usando metodología similar.

Ejemplo 15: Implementación del supermotivo extendido para mejorar la capacidad de unión de epítopos nativos mediante la creación de análogos

Los motivos y supermotivos HLA (que comprenden los residuos primario y/o secundario) son útiles en la identificación y preparación de péptidos nativos con alta reactividad cruzada, como se demuestra en el presente documento. Además, la definición de motivos y supermotivos HLA también permite diseñar epítopos de alta reactividad cruzada identificando residuos dentro de una secuencia peptídica nativa que puede analogarse para conferir al péptido determinadas características, por ejemplo, mayor reactividad cruzada dentro del grupo de moléculas HLA que comprenden un supertipo, y/o mayor afinidad de unión por algunas o todas las moléculas HLA. Ejemplos de péptidos que se analogan para que muestren una afinidad de unión modulada se establecen en este

ejemplo.

Analogación en residuos de anclaje primarios

Las estrategias de diseño de péptidos se implementan para aumentar adicionalmente la reactividad cruzada de los epítopos. Por ejemplo, los anclajes principales de péptidos que portan supermotivos A2 se alteran, por ejemplo, para introducir una L, I, V o M en la posición 2, e I o V en el extremo C.

Para analizar la reactividad cruzada de los péptidos análogos, cada análogo diseñado se analiza inicialmente para evaluar su unión al prototipo de alelo A*0201 de supertipo A2, a continuación, si la capacidad de unión de A*0201 se mantiene, para evaluar la reactividad cruzada del supertipo A2.

Alternativamente, un péptido se confirma que se une a uno o todos los miembros del supertipo y, a continuación, se analoga para modular la afinidad de unión a cualquiera (uno o varios) de los miembros del supertipo para añadir cobertura poblacional.

La selección de análogos para evaluar la inmunogenicidad en un análisis de selección celular está normalmente restringido por la capacidad del péptido de tipo silvestre (WT) parental para unirse al menos débilment, es decir, para unirse en una CI50 de 5.000 nM o inferior, a tres o más alelos de supertipo A2. El razonamiento para este requerimiento es que los péptidos WT deben estar presentes endogenamente en cantidad suficiente para ser biológicamente relevantes. Se ha demostrado que los péptidos análogos han aumentado la inmunogenicidad y reactividad cruzada mediante células T específicas para el epítopo parental (véase, por ejemplo, Parkhurst y col., J. Immunol. 157:2539, 1996; y Pogue y col., Proc. NatI. Acad. Sci. USA 92:81 66, 1995).

En el examen celular de estos análogos de péptidos, es importante confirmar que CTL específicas de análogo son también capaces de reconocer el péptido de tipo silvestre y, si es posible, células diana que expresan el epítopo de forma endógena.

Analogación de péptidos que portan HLA-supermotivo A3 y B7

Se generan análogos de epítopos que portan HLA-supermotivo A3 usando estrategias similares a las usadas en la analogación de péptidos que portan HLA-supermotivo A2 . Por ejemplo, péptidos que se unen a 3/5 de las moléculas de supertipo A3 se diseñan en residuos de anclaje primarios para que posean un residuo preferente (V, S, M o A) en posición 2.

A continuación, los péptidos análogos se analizan para evaluar su capacidad de unión a A*03 y A*11 (prototipo de alelos de supertipo A3). Estos péptidos que demuestran una capacidad de unión ≤ 500 nM se confirma a continuación que tienen reactividad cruzada con supertipo A3.

De forma similar a los péptidos que portan el motivo A2 y A3, los péptidos que se unen a 3 o más alelos de supertipo B7 pueden mejorarse, cuando sea posible, para lograr aumentar la unión reactiva cruzada o una mayor afinidad de unión o semivida de unión. Los péptidos que portan supermotivo B7 se diseñan, por ejemplo, para que posean un residuo preferente (V, I, L o F) en la posición de anclaje primaria del extremo C, tal como se ha demostrado por Sidney y col. (J. Immunol. 157:3480-3490, 1996).

La analogación en residuos de anclaje primarios de otros epítopos que portan motivos y/o supermotivos se realiza de un modo similar.

Los péptidos análogos se confirman después por inmunogenicidad, normalmente en un ensayo de selección celular. De nuevo, es generalmente importante demostrar que CTL específica de análogo es también capaz de reconocer el péptido de tipo silvestre y, si es posible, dianas que expresan de forma endógena el epítopo.

Analogación en residuos de anclaje secundarios

Además, los supermotivos HLA tienen valor en el diseño de péptidos con alta reactividad cruzada y7o péptidos que se unen a moléculas HLA con afinidd aumentada para identificar residuos particulares en posiciones de anclaje secuencias que están asociadas con dichas propiedades. Por ejemplo, la capacidad de unión de un péptido que porta un supermotivo B7 con un residuo F en la posición 1 se analiza. El péptido se analoga, a continuación, por ejemplo, con L sustituta para F en la posición 1. El péptido analogazo se analiza para evaluar su afinidad de unión aumentada, semivida de unión y/o reactividad cruzada aumentada. Dicho procedimiento identifida péptidos analogados con propiedades potenciadas.

Los análogos diseñados con capacidad de unión mejorada o reactividad cruzada también pueden analizarse para evaluar su inmunogenicidad en ratones transgénicos HLA-B7, siguiendo, por ejemplo, inmunización IFA o inmunización lipopeptídica. Los péptidos analogados se analizan adicionalmente para evaluar su capacidad de estimular una respuesta de memoria uando PBMC para pacientes con tumores que expresan 184P1E2.

Otras estrategias de analogación

Otra forma de analogar péptidos, no relacionada con posiciones de anclaje, implica la sustitución de una cisteína por un ácido α-aminobutírico. Debido a su naturaleza química, la cisteína tiene la propensión a formar puentes disulfuro y alterar suficientemente al péptido estructuralmente de forma que se reduzca su capacidad de unión. La sustitución de ácido α-aminobutírico por cisteína no sólo alivia este problema, sino que se demostrado que aumenta las capacidades de unión y de unión cruzada en algunos casos (véase, por ejemplo, la revisión por Sette y col., en: Persistent Viral Infections, Eds. R. Ahmed e I. Chen, John Wiley & Sons, Inglaterra, 1999).

De este modo, mediante el uso de sustituciones de un solo aminoácido, las propiedades de unión y/o de reactividad cruzada de ligandos peptídicos por moléculas de supertipo HLA puede modularse.

Ejemplo 16 Identificación y confirmación de secuencias derivadas de 184P1E2con motivos de unión HLA-DR

Los epítopos peptídicos que portan un supermotivo o motivo de HLA de clase II se identifican y se confirman tal como se expone a continuación usando metodología similar a la descrita para HLA de clase I péptidos.

Selección de epítopos que portan supermotivo HLA-DR.

Para identificar epítopos HLT derivados de 184P1E2, HLA de clase II, se analiza un antígeno 184P1E2 para evaluar la presencia de secuencias que portan un motivo o supermotivo HLA-DR. Específicamente, se seleccionan secuencias decapentaméricas que comprenden un supermotivos DR, que comprenden un núcleo nonamérico y regiones flanqueantes de extremos N y C de tres residuos (15 aminoácidos en total).

Los protocolos para predecir la unión de péptidos a moléculas DR se han desarrollado (Southwood y col., J. Immunol. 160:3363-3373, 1998). Estos protocolos, específicos para moléculas DR individuales, permiten puntuar y clasificar regiones con núcleos nonaméricos. Cada protocolo no sólo puntúa secuencias de péptidos para evaluar la presencia de anclajes primarioscon supermotivos DR (es decir, en posición 1 y en posición 6) dentro del núcleo nonamérico, sino que adicionalmente examina secuencias para evaluar la presencia de anclajes secundarios. Usando tablas de selección específicas de alelos (vése, por ejemplo, Southwood y col., ibid.), se ha encontrado que estos protocolos seleccionan de forma eficaz secuencias de péptidos con una probabilidad alta de unión a una molécula DR particular. Adicionalmente, se ha encontrado que la realización de estos protocolos en tandem, específicamente los de DR1, DR4w4 y DR7, puede seleccionar de forma eficaz péptidos con reactividad cruzada por DR.

Los péptidos derivados de 184P1E2 identificados anteriormente se analizan para evaluar su capacidad de unión por diversas moléculas HLADR comunes. Todos los péptidos se analizan inicialmente para evaluar su unión a las moléculas DR en un panel primario: DR1, DR4w4 y DR7. La unión de péptidos a al menos dos de estas tres moléculas DR se analiza después para evaluar la unión a moléculas DR2w2 β1, DR2w2 β2, DR6w19 y DR9 en ensayos secundarios. Finalmente, la unión de péptidos a al menos dos de las cuatro moléculas DR del panel secundario, y de este modo, de forma acumulativa, a al menos cuatro de siete moléculas DR diferentes, se selecciona por su unión a las moléculas DR4w15, DR5w11 y DR8w2 en ensayos terciarios. La unión de péptidos a al menos siete de las diez moléculas DR que comprenden los ensayos primario, secundario y terciario se consideran enlazantes DR con reactividad cruzada. Los péptidos derivados de 184P1E2 que se ha encontrado que se unen a alelos HLA-DR tienen un interés particular.

Selección de péptidos con motivos DR3

Debido a que el HLA-DR3 es un alelo que es prevalente en poblaciones de raza blanca, negra e hispana, la capacidad de unión de DR3 es un criterio relevante en la selección de eptopos HTL. De este modo, los péptidos que demuestran ser candidatos también pueden analizarse para evaluar su capacidad de unión a DR3. No obstante, en vista de la especifidad de unión del motivo DR3, la unión de péptidos únicamente a DR3 también puede considerrse como candidatos para su inclusión en una formulación de vacuna.

Para identificar eficazmente péptidos que se unen a DR3, se analizan antígenos 184P1E2 diana para evaluar secuencias que portan uno de los dos motivos de unión específicos de DR3 comunicados por Geluk y col. (J. Immunol. 152:5742-5748, 1994). Los péptidos correspondientes se sintetizan después y se confirma que tienen la capacidad de unión a DR3 con una afinidad de 1 µM o mejor, es dedir, inferior a 1 µM. Se encuentran péptidos que cumplen con estos criterios de unión y se califican como enlazantes de gran afinidad HLA de clase II.

Los epítopos de unión a DR3 identificados de este modo se incluyen en composiciones de vacuna con epítopos de péptidos que portan supermotivos DR.

De forma similar al caso de péptidos que portan motivos HLA de clase I, los péptidos que portan motivos clase II se analogan para mejorar su afinidad o reactividad cruzada. Por ejemplo, un ácido aspártico en posición 4 de una secuencia de núcleo nonamérico es un residuo óptimo para la unión a DR3, y las sustitución por dicho residuo frecuentemente mejora la unión a DR3.

Ejemplo 17 Immunogenicidad de epítopos HTL derivados de 184P1E2

Este ejemplo determina la inmunogenicidad de epítopos que portan supermotivo DR y motivo DR3 inmunogénicos entre los identificados usanod la metodología establecida en el presente documento.

La inmunogenicidad de epítopos HTL se confirma de un modo análogo a la determinación de inmunogenicidad de epítopos CTL, evaluando la capacidad de estimular respuestas HTL y/o usando modelos de ratón transgénico apropiados. La inmunogenicidad se determina seleccionando: 1.) inducción primaria in vitro usando PBMC normal o 2.) respuestas de memoria de pacientes que tienen tumores que expresan 184P1E2.

Ejemplo 18 Cálculo de frecuencias fenotípicas de supertipos HLA en diversos fondos étnicos para determinar la cobertura poblacional

Este ejemplo ilustra el examen de la amplitud de la cobertura poblacional de una composición de vacuna comprendida por múltiples epótopos que comprenden múltiples supermotivos y/o motivos.

Con el fin de analizar la cobertura poblacional, las frecuencias génicas de alelos HLA se determinaron. Se calcularon las frecuencias génicas para cada alelo HLA a partir de frecuencias de antígenos o de alelos usando fórmulas de distribución binomiales gf=l-(SQRT(l-af)) (véase, por ejemplo, Sidney y col., Human Immunol. 45:79-93, 1996). Para obtener frecuencias fenotípicas, se calculan frecuencias génicas acumulativas, y las frecuencias antigénicas acumulativas derivadas del uso de la fórmula inversa [af=1-(1-Cgf)2].

Cuando los datos de frecuencias no están disponibles en el nivle de tipificacion de ADN, se asume la correspondencia con las frecuencias de antígenos definidas serológicamente. Para obtener una cobertura poblacional de supertipo potencial total no se asume un desequilibrio de unión, y sólo se incluyen alelos que se ha confirmado que pertenecen a cada uno de los supertipos (estimación mínima). Las estimaciones de cobertura potencial total se logran mediante combinaciones inter loci añadiendo a la cobertrua A la proporción de población no cubierta con A que puede esperar cubrirse con los alelos B considerados (por ejemplo, total=A+B*(1A)). Los miembros confirmados de los superpitos similares a A3 son A3, A11, A31, A*3301, y A*6801. Aunque los supertipos similares a A3 pueden incluir también A34, A66 y A*7401, estos alelos no se incluyen en cálculos de frecuencia totales. Asimismo, miembros confirmados de la familia de supertipo similar a A2 son A*0201, A*0202, A*0203, A*0204, A*0205, A*0206, A*0207, A*6802 y A*6901. Finalmente, los alelos confirmados de supertipo similar a B7 son: B7, B*350l03, B51, B*5301, B*5401, B*550l2, B*5601, B*6701 y B*7801 (potencialmente también B*1401, B*350406, B*4201 y B*5602).

La cobertura poblacional que se logra combinando los supertipos A2, A3 y B7 es aproximadamente del 86 % en cinco grupos étnicos principales. La cobertura puede extenderse incluyendo péptidos que portan los motivos A1 y A24. En promedio, A1 está presente en el 12 % y A24 en el 29 % de la población a lo largo de cinco grupos étnicos principales(razas blanca, negra norteamericana, china, japonesa e hispana). Juntos, estos alelos están representados con una frecuencia promedio del 39 % en estas mismas poblaciones étnicas. La obertura total a lo largo del etnicidades principales cuando se combinan A1 y A24 con la cobertura de los alelos de supertipos A2, A3 y B7 es > 95 %. Un enfoque análogo puede usarse para estimar la cobertura poblacional lograda con combinaciones de epítopos que portan motivos de clase II.

Estudios de inmunogenicidad en seres humanos (por ejemplo, Bertoni y col., J. Clin. Invest. 100:503, 1997; Doolan y col., Immunity 7:97, 1997; y Threlkeld y col., J. Immunol. 159:1648, 1997) han demostrado que los péptidos de unión con alta reactividad cruzada se reconocen casi siempre como epítopos. El uso de péptidos de unión con alta reactividad cruzada es un criterio de selección importantye en la identificación de epítopos candidatos para su incluisión en una vacuna que sea inmunogénica en una población diversa.

Con un número suficiente de epítopos (tal como se ha divulgado en el presente documento y en la técnica), una cobertura poblacional promedio se predice que va a ser superior al 95 % en cada uno de las poblaciones étnicas principales. El análisis de simulación Monte Carlo de teoría de juego, que es conocido en la técnica (véase, por ejemplo, Osborne, M.J. and Rubinstein, A. A course in game theory MIT Press, 1994), puede usarse para estimar que porcentaje de individuos de una población comprendida en los grupos étnicos de personas de raza blanca, negra norteamericana, japonesa, china e hispana reconocería los epítopes de las vacunas descritos en el presente documento. Un porcentaje preferente es el 90 %. Un porcentaje más preferente es el 95 %.

Ejemplo 19 Reconocimiento CTL de antígenos procesados de forma endógena después del cebado

Este ejemplo confirma que CTL inducida por epítoppos peptídicos analogados o nativos identificados y seleccionados tal como se describe en el presente documento reconoce antígenos sintetizados de forma endógena, es decir, nativos.

Las células efectoras aisladas a partir de ratones transgéncos que están inmunizados con epítopos peptídicos, por ejemplo epítopos que portan supermotivo HLA-A2, se reestimulan in vitro uando células estimuladoras recubiertas con péptido. Seis días más tarde, las células efectoras se analizan para evaluar la citotoxicidad y la líneas celulares que contienen actividad citotóxica específica de péptido se reestimulan adicionalmente. Unos seis días adicionales más tarde, estas células se analizan para evaluar la actividad citotóxica sobre células diana JurkatA2.1/Kb etiquetadas con 51Cr en ausencia o presencia de péptido, y también se analizan células diana etiquetadas con 51Cr que portan el antígeno sintetizado de forma endógena, es decir, células que se transfectan de forma estable con vectores de expresión 184P1E2.

Los resultados demuestran que las líneas CTL obtenidas de animales cebadas con epítope peptídico reconocen antígeno 184P1E2 sintetizado de forma endógena. La elección de un modelo de ratón transgénico para usar para dicho análisis depende del epítopo o de los epítopos que se estén evaluando. Además de ratones transgénicos HLAA*0201/Kb también otros varios modelos de ratón transgénico que incluyen ratones con A11 humano, que también pueden usarse para evaluar epítopos A3, y alelos B7 se han caracterizado y otros (por ejemplo, ratones transgénicos para HLA-A1 y A24) se están desarrollando. Modelos de ratón HLA-DR1 y HLA61 DR3 también se han desarrollado, que pueden usarse para evaluar epítopos HTL.

Ejemplo 20 Actividad de epítopos conjugados CTL-HTL en ratones transgénicos

Este ejemplo ilustra la inducción de CTL y HTL en ratones transgénicos usando composiciones de vacuna de péptido CTL y HTL derivado de 184P1E2. La composición de vacuna que se usa en el presente documento comprende péptidos que se van a administrar a un paciente con un tumor que expresa 184P1E2. La composición peptídica puede comprender múltiples epítopos CTL y/o HTL. Los epítopos se identifican usando metodología tal como se ha descrito en el presente documento. Este ejemplo también ilustra que la inmunogenicidad potenciada puede lograrse por inclusión de uno o varios epítopos HTL en una composición de vacuna CTL; dicha composición de vacuna puede comprender un epítopo HTL conjugado a un epítopo CTL. El epítopo CTL puede ser uno que se una a múltiples miembros de la familia HLA con una afinidad de 500 nM o inferior, o análogos de ese epítopo. Los péptidos pueden lipidarse, si se desea.

Procedimientos de inmunización: la inmunización de ratones transgénicos se realiza tal como se ha descrito (Alexander y col., J. Immunol. 159:4753-4761, 1997). Por ejemplo, ratones A2/Kb, que son transgénicos por el alelo HLA A2.1 humano y se usan para confirmar la inmunogenicidad de epítopos que portan motivo HLAA*0201 o supermotivo HLA-A2, y están cebados subcutáneamente (base de la cola) con 0,1 ml de un péptido en coadyuvante incompleto de Freund, o si la composición del péptido es un conjugado CTL/HTL lipidado, en DMSO/solución salina,

o si la composición peptídica es un polipéptido, en PBS o coadyuvante incompleto de Freund. Siete días después del cebado, los esplenocitos obtenidos de estos animalesse reestimulan con linfoblastos activados con LPS irradiados recubiertos con péptido.

Líneas celulares: Las células diana para ensayos de citotoxicidad específica de péptidos son células Jurkat transfectadas con gen quimérico HLA-A2.1/Kb (por ejemplo, Vitiello y col., J. Exp. Med. 173:1007, 1991)

Activación CTL in vitro: una semana después del cebado, se cultivan célula de bazo (30 x10 6 células/recipiente) a 37 ºC con linfoblastos recubiertos con péptido irradiados (3000 rads) (10 x106 células/recipiente) en 10 ml de medio de cultivo/recipiente T25. Después de seis días, se recogen células efectoras y se analizan para evaluar la actividad citotóxica.

Ensayo para evaluar la actividad citotóxica: se incuban células diana (1,0 a 1,5 x 106) a 37 ºC en presencia de 200 µl de 51Cr. Después de 60 minutos, las células se lavan tres veces y se resuspenden en medio R10. Se añade péptido cuando se requiera a una concentración de 1 µg/ml. Para el ensayo, se añaden 104 células diana etiquetadas con 51Cr a diferentes concentraciones o células efectoras (volumen final de 200 µl) en placas de 96 pocillos con fondo en

U. Después de un periodo de incubación de seis horas a 37 ºC, se elimina una parte alícuota de 0,1 ml de sobrenadante de cada pocillo y se determina la radioactividad en un contador gamma automático Micromedic. El porcentaje de lisis específico se determina mediante la fórmula: porcentaje de liberación específica = 100 x (liberación experimental – liberación espontánea)/(liberación máxima – liberación espontánea). Para facilitar la comparación entre ensayos CTL separados realizados en las mismas condiciones, los datos de % de liberación de51Cr se expresan con unidades líticas/106 células. Una unidad lítica se define arbitrariamente como el número de células efectoras que se requiere para lograr el 30 % de lisis de 10.000 células diana en un ensayo de liberación de51Cr de seis horas. Para obtener unidades líticas específicas/106, las unidades líticas/106 obtenidas en ausencia de péptido se sustraen de las unidades líticas/106 obtenidas en presencia de péptido. Por ejemplo, si se obtiene el 30 % de liberación de 51Cr en una relación de efector (E): diana (T) de 50:1 (es decir, 5 x 105 células efectoras por cada

10.000 dianas) en ausencia de péptido y de 5:1 (es decir, 5 x 104 células efectoras por cada 10.000 dianas) en presncia de péptido, las unidades líticas específicas serían:

[(1/50.000)-(1/500.000)] x 106 = 18 LU.

Los resultados se analizan para evaluar la magnitud de las respuestas CTL de animales inyectados con preparación de vacuna de conjugadoCTL/HTL inmunogénico y se comparan con la magnitud de la respuesta CTL lograda usando, por ejemplo, epítopos CTL tal como se ha expuesto en el ejemplo titulado Confirmación de inmunogenicidad. Pueden realizarse análisis similares a éste para confirmar la inmunogenicidad de conjugados peptídicos que contienen múltiples epítopos CTL y/o múltiples epítopos HTL. De acuerdo con estos procedimientos, se encuentra que la respuesta CTL se induce, y concomitantemente que la respuesta HTL se induce después de la administración de dichas composiciones.

Ejemplo 21 Selección de epítopos CTL y HTL para su inclusión en una vacuna específica de 184P1E2.

Este ejemplo ilustra un procedimiento para seleccionar epítopos de péptidos para composiciones de vacuna de la invención. Los péptidos en la composición pueden estar en forma de una secuencia de ácidos nucleicos, bien única

o bien una o varias secuencias (es decir, minigén) que codifica péptido(s), o puede se péptidos de un sólo epítopo o de varios.

Los principios siguientes se usan cuando se selecciona una pluralidad de epítopos para su inclusión en una composición de vacuna. Cada uno de los principios siguientes se equilibra con el fin de realizar la selección.

Se seleccionan epítopos que, después de la administración, imitan las respuestas inmunitarias que se correlacionan con la eliminación de 184P1E2. El número de epítopos usados depende de observaciones en pacientes que eliminan espontáneamente 184P1E2. Por ejemplo, si se ha observado que pacientes que eliminan espontáneamente células que expresan 184P1E2 generan una respuesta inmunitaria de al menos tres (3) epítopos de antígeno 184P1E2, entonces deberían incluirse al menos tres epítopos para HLA de clase I. Se usa un racionamiento similar para determinar epítopos de HLA de clase II.

A menudo se selecciona epítopos que tienen una afinidad de unión de una CI50 de 500 nM o inferior por una molécula HLA de clase I, o por una de clase II, una CI50 de 1000 nM o inferior; o péptidos de HLA de clase I con altas puntuaciones de unión del sitio de Internet BIMAS, en la URL bimas.dcrt.nih.gov/.

Con el fin de lograr una cobertura amplia de la vacuna a través de una población diversa, péptidos que portan suficientes supermotivos, o un conjunto suficiente de péptidos que portan motivos específicos de alelo, se seleccionan para proporcionar una cobertura poblacional amplia. En una realización, se seleccionan epítopos para proporcionar al menos un 80 % de cobertura poblacional. Un análisis de Monte Carlo, una evaluación estadística conocida en la técncia, puede usarse para evaluar la amplitud, o redundancia, de la cobertura poblacional.

Cuando se crean composiciones poliepitópicas, o un minigén que codifica las mismas, es normalmente deseable general el péptido lo más pequeño posible que abarque los epítopos de interés. Los principios usados son similares, si no los mismos, a los usados cuando se selecciona un péptido que comprende epítopos anidados. Por ejemplo, una secuencia de proteína para la composición de vacuna se selecciona debido a que tiene un número máximo de epítopos contenidos dentro de la secuencia, es decir, tiene una concentración alta de epítopos. Los epítopos pueden anidarse o solaparse (es decir, marco desplazado uno con respecto a otro). Por ejemplo, con epítopos solapados, dos epítopos de 9 aminoácidos y uno de 10 aminoácidos pueden estar presentes en un péptido de 10 aminoácidos. Cada epítopo puede exponerse y unirse a una molécula HLA después de la administración de dicho péptido. Puede generarse un péptido multiepitópico sintéticamente, recombinantemente, o mediante escisión a partir de una fuente nativa. Alternativamente, puede fabricarse un análogo de esta secuencia nativa, con lo que uno o varios de los epítopos comprenden sustituciones que alteran las propiedades de reactividad cruzada y/o de afinidad de unión de los péptidos poliepitópicos. Dicha composición de vacuna se administra para propósitos terapéuticos y profilácticos. Esta realización proporciona la posibilidad de que un aspecto aún no descubierto del procesamiento del sistema inmunitario se aplicará a la secuencia anidada nativa y, por lo tanto, facilitará la producción de composiciones de vacuna que inducen una respuesta inmunitaria terapéutica o profiláctica.

Adicionalmente, dicha realización proporciona la posibilidad de epítopos que portan motivos para un carácter que es actualmente desconocido. Además, está realización (ausencia de creación de cualquier análogo) dirige la respuesta inmunitaria a múltiples secuencias de péptidos que están realmente presentes en 184P1E2, evitando de este modo la necesidad de evaluar epítopos de unión. Finalmente, la realización proporciona una economía de escalacuando se producen composiciones de vacuna de ácidos nucleicos. En relación con esta realización, pueden derivarse programas informáticos de acuerdo con principios de la técncia, que identifican en una secuencia diana el número mayor de epítopos por longitud de secuencia.

Una composición de vacuna comprendida por péptidos seleccionados, cuando se administra, es segura, eficaz y facilita una respuesta inmunitaria similar en magnitud a una respuesta inmunitaria que controla o elimina células que portan o sobreexpresan 184P1E2.

Ejemplo 22 Construcción de plásmido de ADN multiepitópico “Minigén”

Este ejemplo trata de la construccion de un plásmido de expresión minigén. Los plásmidos minigén pueden contener, naturalmente, varias configuraciones de células B, epítopos CTL y/o HTL o análogos de epítopos tal como se han descrito en el presente documento.

Un plásmido de expresión minigén incluye normalmente múltiples epítopos CTL y HTL. En el ejemplo presente, epítopos peptídicos que portan supermotivo HLA-A2, -A3, -B7 y epítopos peptídicos que portan motivo HLA-A1 y A24 se usan conjuntamente con epítopos que portan supermotivo DR y/o epítopos DR3. Epítopos de péptidos que portan motivo o supermotivo de clase I de HLA derivados de 184P1E2, se seleccionan de tal modo que estén representados múltiples supermotivos/motivos para asegurar una cobertura poblacional amplia. Similarmente, se seleccionan epítopos de HLA de clase II a partir de 184P1E2 para proporciona una cobertura poblacional alta, es decir, se seleccinan tanto epítopos que portan supermotivo HLA DR-1-4-7 y epítopos que portan motivo HLA DR-3 para su inclusión en el constructo minigén. Los epítopos CTL y HTL seleccionados se incorporan después en un minigén para le expresión en un vector de expresión.

Dicho constructo puede incluir adicionalmente secuencias que dirigen lso epítopos HTL al retículo endoplásmico. Por ejemplo, la proteína Ii puede fusionarse a uno o varios epítopos HTL tal como se describe en la tecnica, eliminándose la secuencia CLIP de la proteína Ii y reemplazándose por una secuencia de epítopo HLA de clase de modo que el epítopo de HLA de clase II se dirija al retículo endoplásmico, donde el epítopo se une a moléculas HLA de clase II.

Este ejemplo ilustra los procedimientos que se usan para la construcción de un plásmido de expresión que porta minigén. Otros vectores de expresión que también pueden usarse para composiciones de minigén están disponibles y son conocidos por los expertos en la técnica.

El plásmido AND del minigén de este ejemplo contiene una secuencia Kozak consenso y una secuencia de señal de cadena ligera Ig kappa murina de consenso seguida por epítopos CTL y/o HTL seleccionados de acuerdo con los principios expuestos en el presente documento. La secuencia codifica un marco de lectura abierto fusionado con la etiqueta del epítopo del anticuerpo Myc y His codificada por el vector Myc-His pcDNA 3.1.

Oligonucleótidos de solapamiento que pueden, por ejemplo, tener un promedio de aproximadamente 70 nucleótidos de longitud con 15 nucleótidos solapados, se sintetizan en HPLC purificado. Los oligonucleótidos codifican los epítopos seleccionados así como nucleótidos enlazadores apropiados, secuencia Kozak y secuencia de señal. El minigén multiepitópico final se ensambla extendiendo los oligonucleótidos de solapamiento en tres conjuntos de reacciones usando PCR. Una máquina de PCR Perkin/Elmer 9600 se usa y se realizan un total de 30 ciclos usando las condiciones siguientes: 95 ºC durane 15 s, temperatura de fusión (5 º por debajo de la Tm calculada de cada par de cebadores) durante 30 s, y 72 ºC durante 1 min.

Por ejemplo, un minigén se prepara como sigue. Para una primera reacción PCR, 5 g de cada uno de los dos oligonucleótidos se fusionan y se extienden: en un ejemplo que usa ocho oligonucleótidos, es decir, cuatro pares de cebadores, los oligonucleótidos 1+2, 3+4, 5+6 y 7+8 se combinan en reacciones de 100 µl que contienen tampón de polimerasa Pfu (1 x = KCl 10 mM, (NH4)2SO4 10 mM, Tris-cloruro 20 mM, pH 8,75, MgSO4 2 mM, Triton X-100 al 0,1 %, 100 g/ml de BSA), 0,25 mM de cada dNTP y 2,5 U de Pfu polimerasa. Los productos dímeros de longitud completa se purifican en gel, y se mezclan dos reacciones que contienen el producto de 1+2 y 3+4, y el producto de 5+6 y 7+8, se fusionan y se extienden durante 10 ciclos. La mitad de las dos reacciones se mezcla, a continuación, y se realizan 5 ciclos de fusión y extensión antes de añadir los cebadores flanqueantes para amplificar el producto de longitud completa. El producto de longitud completa se purifica en gel y se clona en pCR-blunt (Invitrogen) y los clones individuales se criban para la secuenciación.

Ejemplo 23 El constructo plásmido y el grado al que induce inmunogenicidad.

El grado al que un constructo plásmido, por ejemplo un plásmido construido de acuerod con el ejemplo previo es capaz de inducir inmunogenicidad se confirma in vitro determinando la presentación de epítopos por APC seguida de la transducción o transfección del APC con un constructo de ácido nucleico que expresa el epítopo. Dicho studio determina y permite el uso de APC human. El ensayo determina la capacidad del epítopo para presentarse por la APC en un contexto que es reconocido por una célula T cuantificando la densidad de los complejos epítopo-HLA de clase I sobre la superficie celular. La cuantificación puede realizarse midiendo directamente la cantidad de péptido eluido a partir de la APC (véase, por ejemplo, Sijts y col., J. Immunol. 156:683-692, 1996; Demotz y col., Nature 342:682-684, 1989); o el número de complejos péptido-HLA de clase I puede estimarse midiendo la cantidad de lisis

o liberación de linfocinas inducida por células enfermas o transfectadas, y determinando, a continuación, la concentración de péptido necesaria para obtener niveles equivalentes de lisis o liberación de linfocina (véase, por ejemplo, Kageyama y col., J. Immunol. 154:567-576,1995).

Alternativamente, la inmunogenicidad se confirma mediante inyecciones in vivo a ratones y subsiguientemente examen in vitro de la actividad CTL y HTL, que se analiza usando ensayos de citotoxicidad y de proliferación, respectivamente, tal como se detalla, por ejemplo, en Alexander y col., Immunity 1:751-761, 1994.

Por ejemplo, para confirmar la capacidad de un constructo de minigén de AND que contiene al menos un péptido con supermotivo HLA-A2 para inducir CTL in vivo, se inmunizan ratones transgénicos HLAA2.1/Kb, por ejemplo, intramuscularmente con 100 µg de ADNc desnudo. Como medio de comparación de niveles de CTL inducidos por inmunización de ADNc, también se inmuniza un grupo control de animales con una composición peptídica real que comprende múltiples epítopos sintetizados como polipéptido único tal como serian codificados por un minigén.

Se estimulan esplenocitos de animales inmunizados dos veces con cada una de las respectivas composiciones (epítopos peptídicos codificados en el minigén o los péptidos poliepitópicos) y, a continuación, se analizan para evaluar la actividad citotóxica específica de péptido en un ensayo de liberación de 51Cr. Los resultados indican la magnitud de la respuesta CTL dirigida contra el epítopo restringido por A2, indicando, de este modo, la inmunogenicidad in vivo de la vacuna minigén y vacuna poliepitópica.

Se encuentra, por lo tanto, que el minigén facilita la respuesta inmunitaria dirigeda hacia los epítopos peptídicos de supermotivo HLA-A2 tal como ahce la vacuna peptídica poliepitópica. También se realiza un análisis similar usando otros modelos de ratón transgénico HLA-A3 y HLA-B7 para evaluar la inducción CTL para epítopos con motivos o supermotivos HLA-A3 y HLA-B7, por lo que también se encuentra que el minigén facilita las respuestas inmunitarias dirigidas hacia los epítopos proporcionados.

Para confirmar la capacidad de un minigén que codifica un epítopo de clase II para inducir HTL in vivo, ratones transgénicos DR, o por los epítopos que reaccionan de forma cruzada con la molécula MHC de ratón apropiada, ratones restringidos con l-Ab, por ejemplo, se inmunizan intramuscularmente con 100 µg de ADN plásmido. Como medio de comparación del nivel de HTL inducido por inmunización de AND, se inmuniza también un grupo de animales de control con una composición peptídica real emulsionada en coadyuvante completo de Freund. Se purifican células T CD4+, es decir, HTL, a partir de esplenocitos de animales inmunizados y se estimualn con cada una de las respectivas composiciones (péptidos codificados en el minigén). La respuesta HTL se mide usando un ensayo de proliferación con incorporación de 3H-timidina (véase, por ejemplo, Alexander y copl. Immunity 1:751-761, 1994). Los resultados indican la magnitud de la respuesta HTL, demostrando de este modo la inmunogenicidad in vivo del minigén.

Los minigenes de ADN, construidos tal como se describe en el ejemplo previo, también pueden confirmarse como una vacuna en combinación con un agente de refuerzo usano un protocolo de refuerzo principal. El agente de refuerzo puede constar de proteína recombinante (por ejemplo, Barnett y col., Aids Res. and Human Retroviruses 14, suplemento 3:S299-S309, 1998) o vacunas recombinantes, por ejemplo, que expresan un minigén o ADN que expresa la proteína completa de interés (véase, por ejemplo, Hanke y col., Vaccine 16:439-445, 1998; Sedegah y col., Proc. NatI. Acad. Sci USA 95:7648-53,1998; Hanke y McMichael, Immunol. Letters 66:177-181, 1999; y Robinson y col., Nature Med. 5:526-34, 1999).

Por ejemplo, la eficacia del minigén de ADN que se usa en un protocolo de refuerzo principal se evalúa inicialmente en ratones transgénicos. En este ejemplo, se inmunizan ratones transgénicos A2.1/Kb IM con 100 µg de un mingén de ADN que codifica los péptidos inmunogénicos que incluyen al menos un péptido que porta supermotivo HLA-A2. Después de un periodo de incubación (que varía de 3 a 9 semanas), los ratones se refuerzan IP con 107 ufp/ratón de un virus de vacuna recombinante que expresa la misma secuencia codificada por el minigén de ADN. Los ratones control se inmunizan con 100 µg de vacuna de ADN o recombinante sin secuencia del minigén, o con ADN que codifica minigén, pero sin refuerzo de vacuna. Después de un periodo de incubación de dos semanas, se analizan inmediatamente esplenocitos de los ratones para evaluar la actividad peptídica en un ensayo ELISPOT. Adicionalmente, se estimulan esplenocitos in vitro con epítopos peptídicos restringidos con A2 codificacos en el mingén y vacuna recombinante y, a continuación, se analizan para evaluar su actividad específica de péptido en un ELISA IFN alfa, beta y/o gamma.

Se encuentra que el minigén usaod en un protocolo de refuerzo principal facilita las respuestas inmunitarias superiores frente a péptidos con supermotivo HLA-A2 que con ADN solo. Dicho análisis también puede realizarse usando modelos de ratón transgénico HLA-A11 o HLA-B7 para evaluar la inducción CTL por epítopos de motivo o supermotivo HLA-A3 o HLA-B7 . El uso de protocolos de refuerzo principales en seres humanos se describe más adelante en el ejemplo titulado Inducción de respuestas CTL usando refuerzo principal.

Ejemplo 24 Composiciones de péptidos para usos profilácticos

Las composiciones de vacuna de la presente invención pueden usarse para evitar la expresión de 184P1E2 en personas con riesgo de padecer tumores que portan este antígeno. Por ejemplo, una composición de péptidos poliepitópicos (o un ácido nucleico que comprende los mismos) que contiene múlteples epítopos CTL y HTL tales como los seleccionados en los ejemplos anteriores, que también se seleccionan para dirigirse a más del 80 % de la población, se administra a individuales con riesgo de padecer un tumor asociado a 184P1E2.

Por ejemplo, una composición basada en péptidos se proporciona como un polipéptido único que comprende múltiples epítopos. La vacuna se administra normalmente en una solución fisiológica que comprende un coadyuvante, tal como coadyuvante de Freund incompleto. La dosis de péptido para una inmunización inicial es de aproximadamente 1 a aproximadamente 50.000 µg, generalmente 100-5.000 µg, para un paciente de 70 kg. La administración inicial de vacuna se sigue con dosis de refuerzo en 4 semanas seguido de la evaluación de la magnitud de la respuesta inmunitaria en el paciente, mediante técnicas que determinan la presencia de poblaciones de CTL específica de epítopo en una muestra PBMC. Se administran dosis de refuerzo adicionales si se requieren. La composición se encuentra que es tanto segura como eficaz como profiláctico contra enfermedad asociada a 184P1E2.

Alternativamente, una composición que comprende normalmente agentes de transfeccion se usa para la administracion de una vacuna basadas en ácido nucleico de acuerdo con metodologías conocidas en la técnica y se se divulgan en el presente documento.

Ejemplo 25 Composiciones de vacuna poliepitópicas derivadas de secuencias 184P1E2 nativas

Se analiza una secuencia de poliproteína 184P1E2 nativa, usando preferentemente algoritmos informáticos definidos para cada motivo o supermotivo de clase I y/o de clase II, para identificar regiones relativamente cortas de la poliproteína que comprenden múltiples epítopos. Las regiones relativamente cortas son preferentemente inferiores en longitud que un antígeno nativo completo. Esta secuencia relativamente corta que contiene múltiples epítopos anidados, distintos o solapados, puede usarse para generar un constructo de minigén. El constructo se diseña para que exprese el péptido, que corresponde a la secuencia de proteína nativa. El péptido relativamente corto tiene generalmente una longitud inferior a 250 aminoácidos, frecuentemente inferior a 100 aminoácidos, preferentemente inferior a 75 aminoácidos, y más preferentemente inferior a 50 aminoácidos. La secuencia proteica de la composición de vacuna se selecciona debido a que tiene un número máximo de epítopos contenido dentro de la secuencia, es decir, tiene una concentración alta de epítopos. Tal como se indica en el presente documento, los motivos del epítopo pueden estar anidados o solapados (es decir, un marco desplazado con relación a otro). Por ejemplo, con epítopos solapados, pueden estar presentes en un péptido de 10 aminoácidos dos epítopos de 9 aminoácidos y uno de 10 aminoácidos. Dicha composición de vacuna se administra con fines terapéuticos y profilácticos.

La composición de vacuna incluirá, por ejemplo, múltiples epítopos CTL de antígeno 184P1E2 y al menos un epítopo CTL. Esta secuencia nativa poliepitópica se administra bien como péptido o bien como secuencia de ácidos nucleicos que codifica el péptido. Alternativamente, puede fabricarse un análogo de esta secuencia nativa, por lo que uno o varios de los epítopos comprenden sustituciones que alteran las propiedades de reactividad cruzada y/ afinidad de unión de los péptidos poliepitópicos.

La realización de este ejemplo proporciona la posibilidad de que un aspecto aún no descubierto del procesamiento del sistema inmunitario se aplicará a la secuencia anidada nativa y, por lo tanto, facilitará la producción de composiciones de vacuna que inducen una respuesta inmunitaria terapéutica o profiláctica. Adicionalmente, dicha realización proporciona la posibilidad de epítopos que portan motivos para un carácter o caracteres de HLA que es actualmente desconocido. Además, esta realización (que excluye una realización análoga) dirige la respuesta inmunitaria a múltiples secuencias de péptidos que están realmente presentes en 184P1E2 nativa, evitando, de este modo, la necesidad de evaluación de epítopos de unión. Finalmente, la realización proporciona una economía de escala cuando se producen composiciones de vacuna peptídicas o de ácidos nucleicos.

Con relación a esta realización, están disponibles en la técnica programas informáticos que pueden usarse para identificar en una secuencia diana el número máximo de epítopos por longitud de secuencia.

Ejemplo 26 Composiciones de vacuna poliepitópicas de múltiples antígenos

Los epítopos de péptido 184P1E2 se usan junto con epítopos de otros antígenos asociados al tumor diana para crear una composición de vacuna que sea útile para la prevención o tratamiento de un cáncer que expresa 184P1E2 y otros antígenos de este tipo. Por ejemplo, una composición de vacuna puede proporcionarse en forma de polipéptido único que incorpora múltiples epítopos de 184P1E2, así como antígenos asociados al tumor que se expresan frecuentemente con un cáncer diana asocidado con la expresión de 184P1E2, o pueden administrarse como una composición que comprende un cóctel de uno o varios epítopos discretos. Alternativamente, la vacuna puede administrarse como un constructo de minigén o como células dendríticas que se han cargado con los epítopos del péptido in vitro.

Ejemplo 27 Uso de péptidos para evaluar una respuesta inmunitaria

Los péptidos que se describen en el presente apartado se usan para analizar una respuesta inmunitaria para evaluar la presencia de anticuerpos específicos, CTL o HTL dirigidos a 184P1E2. Dicho análisis puede realizarse de un modo descrito por Ogg y col., Science 279:2103-2106, 1998. En este ejemplo, dichos péptidos se usan como reactivo con fines de diagnóstico o pronóstico, no como inmunógenos.

En este ejemplo se usan complejos tetraméricos (tetámeros) muy sensibles de antígenos leucocíticos humanos para un análisis seccional de, por ejemplo, frecuencias CTL específicas de HLAA*0201 de 184P1E2 de individuos positivos a HLA A*0201 en diferentes estadios de la enfermedad o siguiendo una inmunización que comprende un péptido 184P1E2 que contiene una motivo A*0201. Los compuestos tetraméricos se sintetizan tal como se ha descrito (Musey y col., N. EngI. J. Med. 337:1267, 1997). Brevemente, la cadena pesada de HLA purificada (A*0201 es este ejemplo) y β2-microglobulina se sintetizan por medio de un sistema de expresión procariótica. La cadena pesada se modifica para la deleción de la cola citosólica transmembranal y la adición de COOH terminal de una ssecuencia que contienen un sitio de biotinilación enzimática BirA. La cadena pesada, β2-microglobulina y el péptido se repliegan por dilución. El producto replegado de 45 kD se aísla por cromatografía líquida de proteínas rápida y, a continuación, se biotinilan por BirA en presencia de biotina (Sigma, St. Louis, Missouri, Estados Unidos), adenosina 5’ trifosfato y magnesio Se añade conjugado de estreptavidinficoeritrina en una relación molar 1:4, y el producto tetramérico se concentra hasta 1 mg/mi. El producto resultante se denomina tetrámero-ficoeritrina.

Para el análisis de muestras de sangre de pacientes, se centifugan aproximadamente un millón de PBMC a 300 g durante 5 minutos y se resuspenden en 50 µl de solución salina tamponada con fosfato fría. El análisis tricolor se realiza con la tetrámero-focoeritrina, junto con tricolor anti-CD8 y anti-CD38. Las PBMC se incuban con tetrámero y anticuerpos sobre hielo durante 30 a 60 min y después se lavan dos veces con antes de la fijación de formaldehído. Se aplican aperturas que contienen > 99,98 % de muestras control. Los controles para los tetrámeros incluyen tanto individos negativos a A*0201 como donantes no enfermos positivos a A*0201. El porcentaje de células tintadas con el tetrámero se determina después mediante citometría de flujo. Los resultados indican el número de células en la muestra PBMC que contienen ese CTL restringido a epítopo, indicando de este modo fácilmente la extensión de la respuesta inmunitaria al epítopo 184P1E2 y, de este modo, el estado de exposición a 184P1E2, o la exposición a una vacuna que facilita una respuesta protectora o terapéutica.

Ejemplo 28 Uso de epítopos peptídicos para evaluar respuestas de recuerdo

Los epítopos peptídicos que se describen en el presente apartado se usan como reactivos para evaluar respuestas a células T, tales como respuestas agudas o de recuerdo, en pacientes. Dicho análisis puede realizarse en pacientes que se han recuperado de una enfermedad asociada con 184P1E2 o que se han vacunado con una vacuna 184P1E2.

Por ejemplo, la respuesta CTL restringida de clase I de personas que se han vacunado puede analizarse. La vacuna puede ser cualquier vacuna 184P1E2. Se recogen PBMC de individuos vacunados y determinados como HLA. Se usan después epítopos peptídicos apropiados de la invención que, óptimamente, portan supermotivos o proporcioan reactividad cruzada con múltiples miembros de la familia del supertipo HLA, para análisis de muestras derivadas de individuos que portan ese tipo HLA.

PBMC de individuos vacunados se separan en gradientes de densidad Ficoll-Histopaque (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, Estados Unidos), se lavan tres veces en HBSS (GIBCO Laboratories), se resuspenden en RPMI-1640 (GIBCO Laboratories) se suplementan con L-glutamina (2 mM), penicilina (50 U/ml), estreptomicina (50 µg/ml) y Hepes (10 mM) que contiene un 10 % de suero AB humano termoinactivado (RPMI completo) y se palquean usando formato de microcultivo. Un péptido sintético que comprende un epítopo de la invención se añade a 10 µg/ml de cada pocillo y se añade epítopo 128-140 de núcleo de HBV a 1 µg/ml a cada pocillo como fuente de células T cooperadores durante la primera semana de estimulación.

En el formato de microcultivo, 4 x 105 PBMC se estimulan con péptido en 8 cultivos replicados en placas de fondo redondo de 96 pocillos a 100 µl/pocillo de RPMI completo. Los días 3 y 10, se añaden 100 µl de RPMI completo y 20 U/mI de concentración fina de rlL-2 a cada pocillo. El día 7 los cultivos se transfiere a placas de fondo plano de 96pocillos y se reestimulan con péptido, rlL-2 y 105 células de alimentación autólogas irradiadas (3.000 rad). Los cultivos se analizan para evaluar la actividad citotóxica el día 14. Una respuesta CTL positiva requiere que dos o más de los ocho cultivos replicados muestren una liberación de 51Cr específica superior al 10 %, sobre la base de una comparació con sujetos control no enfermos tal como se ha descrito previamente (Rehermann y col., Nature Med. 2:1104,1108, 1996; Rehermann y col., J. Olin. Invest. 97:1 655-1 665, 1996; y Rehermann y col. J. Olin. Invest. 98:1432-1 440, 1996).

Las líneas celulares diana son B-LCL transformadas con EBV autólogas y alogénicas que se adquieren de la Sociedad Estadounidense de Histocompatibilidad e Inmunogenética (ASHI, Boston, MA, Estados Unidos) o se han establecido a partir de una agrupación de pacientes (Guilhot y col. J. Virol. 66:2670-2678, 1992).

Los ensayos de citotoxicidad se realizan del modo siguiente. Las células diana están constituidas por líneas celulares coincidentes con HLA alogénicas o linfoblastoides B transformados con EBV autólogas que se incuban durante la noche con el epítopo peptídico sintético de la invención a 10 µM y se etiquetan con 100 µCi de 51Cr (Amersham Oorp., Arlington Heights, IL, Estados Unidos) durante 1 hora, después de lo cual se lavan cuatro veces con HBSS.

La actividad citolítica se determina en un ensayo estándar de 4 h, de liberación de 51Cr de pocillos separados, usando placas de 96 pocillos con fondo en forma de U que contiene 3.000 dianas/pocillo. PBMO estimulado se analiza en relaciones efector/diana (E/T) de 20-50:1 el día 14. El porcentaje de citotoxicidad se determina meidante la fórmula: 100 x [(liberación experimental-liberación espontánea)/liberación máxima-liberación espontánea)]. La liberación máxima se determina mediante lisis de dianas por detergente (2 % de Triton X-100; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, Estados Unidos). La liberación espontánea es < 25 % de la liberación máxima para todos los experimentos.

Los resultados de dicho análisis indican que la extensión a la que las poblaciones CTL restringidas con HLA se han estimulado mediante la exposición previa a 184P1E2 o a vacuna 184P1E2.

De forma similar, las respuestas HTL restringidas, de clase II, también pueden analizarse. PBMC purificado se cultiva en una placa de fondo plano de 96 pocillos a una densidad de 1,5 x 105 células/pocillo y se estimulan con 10 µg/ml de péptido sintético de la invención, antígeno 184P1E2 completo, o PHA. Las células se plaquean de forma rutinaria en replicados de 4-6 pocillos para cada afección. Después de siete días de cultivo, el medio se elimina y se reemplaza por medio fresco que contiene 10 U/mI de IL-2. Dos días después, se añade a cada pocillo 1 µCi de 3Htimidina y se continúa con la incubación durante 18 horas adicionales. El ADN celular se recolecta después en esteras de fibra de vidrio y se analizan para evaluar la incorporación de 3H-timidina. Se calcula la proliferación de células T específicas de antígeno como la relación de la incorporación de 3H-timidina en presencia de antígeno dividida por la incorporación de 3H-timidina en ausencia de antígeno.

Ejemplo 29 Inducción de respuesta CTL específica en seres humanos

Un ensayo clínico con seres humanos de una composición inmunogénica que comprende epítopos CTL y HTL de la invención se establece como estudio de aumento de dosis de IND de fase I y se lleva a cabo como ensayo controlado por placebo, doble ciego, aleatorio.

Un ensayo de este tipo se diseña, por ejemplo, como sigue:

Se inscribe a un total de 27 individuos y se dividen en tres grupos:

Grupo I: a 3 sujetos se inyecta placebo y a 6 sujetos se inyectan 5 µg de composición peptídica;

Grupo II: a 3 sujetos se inyecta placebo y a 6 sujetos se inyectan 50 µg de composición peptídica;

Grupo III: a 3 sujetos se inyecta placebo y a 6 sujetos se inyectan 500 µg de composición peptídica;

Después de 4 semanas de la primera inyección, todos los sujetos reciben una inoculación de refuerzo con la misma dosis.

Los puntos finales medidos en este estudio se refieren a la seguridada y tolerabilidad de la composición peptídica, así como a su inmunogenicidad. Las respuestas inmunitarias celulares a la composición peptídica son una indicación de la actividad intrínseca de esta composición peptídica, y pueden observarse, por lo tanto, como una medida de la eficacia biológica. A continuación se resumen los datos clínicos y de laboratorio que se relacionan con los puntos finales de seguridad y eficacia.

Seguridad: La incidencia de acontecimientos adversos se supervise en el grupo de tratamiento con placebo y con fármaco y se evalúan en términos de grado y reversibilidad.

Evaluación de eficacia de vacuna: Para la evaluación de la eficacia de la vacuna, los sujetos se sangran antes y después de la inyección. Se aíslan células de sangre periférica a partir de sangre fresca haparinizada por centrifugación de gradiente de densidad de Ficoll-Hypaque, se toman partes alícuotas en medio congelante y se almacenan congeladas. Las muestras se analizan para evaluar la actividad CTL y HTL.

Se encontró que la vacuna es segura y eficaz

Ejemplo 30 Ensayos de fase II en pacientes que expresan 184P1E2

Los ensayos de fase II se realizan para estudiar el efecto de administra las composiciones de péptidos CTL-HTL a pacientes que tienen un cáncer que expresa 184P1E2. Los objetivos principales del ensayo son determinar una dosificación y un régimen eficaces para inducir CTL en pacientes con cáncer que expresa 184P1E2, para establecer la seguridad de inducri una respuesta CTL y HTL en estos pacientes, y para observar en que medida la activación de CTL mejora el cuadro clínico de estos pacientes, tal como se ha manifestado, por ejemplo, mediante la reducción y/o descenso de lesiones. Dicho estudio se diseña, por ejemplo, tal como sigue:

Los estudios se realizan en múltiples centros. El diseño del ensayo es un protocolo de aumento de dosis, no controlado, de etiqueta abierta, en el que la composición peptídico se administra como dosis única seguida seis semanas después por una inyección de refuerzo única de la misma dosis. Las dosis son 50, 500 y 5.000 microgramos por inyección. Se registran los efectos adversos asociados al fármaco (gravedad y reversibilidad).

Existen tres grupos de pacientes. Al primer grupo se le inyectan 50 microgramos de la composición peptídica, y a los grupos segundo y al tercero 500 y 5.000 microgramos de composición peptídica, respectivamente. La edad de los pacientes dentro de cada grupo varía de 21 a 65 años y están representados diversos orígenes étnicos. Todos ellos tienen un tumor que expresa 184P1E2.

Las manifestaciones clínicas o respuestas de célula T específicas de antígeno se supervisan para evaluar los efectos de la administración de composiciones peptídicas. La composición de vacuna se encuentra que es tanto segura como eficaz en el tratamiento de enfermedad asociada con 184P1E2.

Ejemplo 31 Inducción de respuestas CTL uando un protocolo de refuerzo principal

Un protocolo de refuerzo principal similar en sus principios básicos al que se usa para confirmar la eficacia de una vacuna de ADN en ratones transgénicos, tal como el descrito anteriormente en el ejemplo titulado “El constructo plásmido y el grado en el que induce inmunogenicidad” también puede usarse para la administración de la vacuna a seres humanos. Dicho régimen de vacunas puede incluir una administración inicial de, por ejemplo, ADN desnudo seguida de un refuerzo usando virus recombinantes que codifican la vacuna, o proteína/polipéptido recombinante o una mezcla de péptidos administrada en un coadyuvante.

Por ejemplo, la inmunización inicial puede realizarse usando un vector de expresión, tal como el construido en el ejemplo titulado “Construcción de plásmidos de ADN multiepitópicos “minigén”” en forma de ácidos nucleicos desnudos administrados 1 M (o SC o ID) en cantidades de 0,5-5 mg en múltiples sitios. El ácido nucleico (0,1 a 1000 µg) también puede administrarse usando una pistola génica. Siguiendo a un periodo de incubación de 3-4 semana, se administra una dosis de refuerzo. El refuerzo puede ser virus de la viruela aviar administrados a una dosis de 5107 a 5x109 ufp. Puede administrarse un virus recombinante alternativo, tal como un MVA, virus de la viruela del canario, denovirus o virus adenoasociados, también puede usarse para el refuerzo, o la proteína poliepitópica o una mezcla de los péptidos. Para la evaluación de eficacia de vacuna, las muestras de sangre de pacientes se obtienen antes de la inmunización, así como a intervalos siguiendo la administración de la vacuna inicial y las dosis de refuerzo de la vacuna. Las células mononucleares de sangre periférica se aíslan a partir de sangre fresca heparinizada por centrifugación de gradiente de densidad de Ficoll-Hypaque, se toman partes alícuotas en medio congelante y se almacenan congeladas. Las muestras se analizan para evaluar la actividad CTL y HTL.

El análisis de los resultados indica que se genera una magnitud de respuesta suficiente para lograr inmunidad terapéutica o protectora contra 184P1E2.

Ejemplo 32 Administración de composición de vacuna usando células dendríticas (DC)

Las vacunas que comprenden epítopos de péptidos pueden administrarse usando APCs, o APC profesionales tales como DC. En este ejemplo, se administran péptidos pulsados con DC a un paciente para estimular una respuesta CTL in vivo. En este procedimiento, se aíslan células dendríticas, se expanden y se pulsan con una vacuna que comprende epítopos de péptido CTL y HTL de la invención. Las células dendríticas se infunden de nuevo al paciente para facilitar las respuestas CTL y HTL in vivo. Las CTL y HTL inducidas, a continuación, destruyen o facilitan la destrucción, respectivamente de las células diana que portan la proteína 184P1E2 a partir de la cual se derivan los epítopos de la vacuna.

Por ejemplo, se administra ex vivo un cóctel de péptidos que comprenden epítopo a PBMC, o DC aislado del mismo. Puede usarse un producto farmacéutico para facilitar la recogida de DC, tal como ProgenipoietinTM (Monsanto, St. Louis, MO, Estados Unidos) o GM-CSF/IL-4. Después de pulsar el DC con péptidos, y antes de reinfundirlo a pacientes, el DC se lava y se eliminan los péptidos no unidos.

Tal como se aprecia clínicamente y se determina fácilmente por un experto sobre la base de resultados clínicos, el número de DC reinfundidos al paciente puede variar (véase, por ejemplo, Nature Med 4:328, 1998; Nature Med. 2:52, 1996 y Prostate 32:272, 1997). Aunque se administran normalmente 2-50 x 106 DC por paciente, también puede proporcionarse un número mayor de DC, tal como 107 o 108. Dichas poblaciones celulares contienen normalmente entre el 50 y el 90 % de DC.

En algunas realizaciones, se inyectan PBMC cargadas con péptido a pacientes sin purificación de la DC. Por ejemplo, PBMC generadas después del tratamiento se inyectan con un agente tal como ProgenipoietinTM a pacientes sin purificación de DC. El número total de PBMC que se administran varía frecuentemente de 108 a 1010. Generalmente, la dosis de células inyectada a pacientes se base en el porcentaje de DC en la sangre de cada paciente, tal como se determina, por ejemplo, por análisis inmunofluorescente con anticuerpos anti-DC específicos. De este modo, por ejemplo, si ProgenipoietinTM moviliza el 2 % de DC en la sangre periférica de un paciente dado, y ese paciente debe recibir 5 x 106 DC, entonces se inyecta al paciente un total de 2,5 x 108 PBMC cargadas con péptido. El porcentaje de DC movilizado por un agente tal como ProgenipoietinTM se estima normalmente que se encuentra entre el 2 y el 10 %, peo puede variar tal como se aprecia por un experto en la técnica.

Activación ex vivo de respuestas CTL/HTL

Alternativamente, pueden inducirse respuestas CTL or HTL ex vivo a antígenos 184P1E2 incubando, en cultivo hístico, células precursoras CTL o HTL del paciente o geneticamente compatibles, junto con una fuente de APC, tal como DC, y péptidos inmunogénicos. Después de un periodo de incubación apropiado (normalmente de aproximadamente 7-28 días), en el que las células precursoras se activan y se expanden en células efectoras, las células se infunden al paciante, donde destruirán (CTL) o se facilitará la destrucción (HTL) de sus células diana específicas, es decir, de células tumorales.

Ejemplo 33 Un procedimiento alternativo de identificación y confirmación de péptidos que portan motivos

Otro procedimiento de identificación y confirmación de péptidos que portan motivos es para eluirlos de células que portan moléculas MHC definidas. Por ejemplo, líneas de células B transformadas con EBV usadas para tipificar tejidos se han caracterizado extensamente para determinar que moléculas HLA las expresan. En determinados casos estas células expresan sólo un tipo único de molécula HLA. Estas células pueden transfectarse con ácidos nucleicos que expresan el antígeno de interés, por ejemplo, 184P1E2. Los péptidos producidos por el procesamiento antigénico endógeno de péptidos producidos como resultado de la transfección se unirán después a moléculas HLA dentro de la célula y se transportarán y se dispondrán sobre la superficie celular. A continuación, los péptidos se eluyen de moléculas HLA por exposición a condiciones ligeramente ácidas y se determinan sus secuencias de aminoácidos, por ejemplo, mediante análidos espectral de masas (por ejemplo, Kubo y col., J. Imnunol. 152:3913, 1994). Debido a que la mayor parte de los péptidos que se unen a una molécula HLA particular portan motivos, ésta es una modalidad alternativa para obtener los péptidos que portan motivos correlacionados con la molécula de HLA particular expresada en la célula.

Alternativamente, pueden transfectarse líneas celulares que no expresan moléculas HLA endógenas con un constructo de expresión que codifica un único alelo de HLA. Estas células pueden usarse, después, tal como se ha descrito, es decir, pueden transfectarse a continuación con ácidos nucleicos que codifican 184P1E2 para aislar péptidos correspondientes a 184P1E2 que han estado presentes sobre la superficie celular. Los péptidos obtenidos a partir de dicho análisis portarán motivo(s) correspondiente(s) a la unión a un único alelo HLA que se expresa en la célula.

Tal como apreciará un experto en la técnica, se puede realizar un análisis simiar sobre una célula que porta más de un alelo HLA y subsiguientemente deteminar péptidos específicos pra cada alelo HLA expresado. Además, un experto también reconocerá que pueden usarse medios diferentes a la transfección, tales como carga con un antígeno proteico, para proporcionar una fuente de antígeno a la célula.

Ejemplo 34 Polinucleótidos complementarios

Se usan secuencias complementarias a las secuencias que codifican 184P1E2, o cualquier parte de las mismas, para detectar, aumentar o inhibir la expresión de 184P1E2 de origen natural. Aunque se describe el uso de oligonucleótidos que comprenden de aproximadamente 15 a 30 pares de bases, se usa esencialmente el mismo procedimiento con fragmentos de secuencias más grandes o más pequeños. Se diseñan oligonucleótidos apropiados usando, por ejemplo, el programa informático OLIGO 4.06 (National Biosciences) y la secuencia codificante de 184P1E2. Para inhibir la transcripción, se diseñan oligonucleótidos complementarios a partir de ma yor parte de la secencia única 5’ y se usan para evitar la unión del promotor a la secuencia codificante. Para inhibir la traducción, se diseña un oligonucleótido complementario para evitar la unión ribosómica a un trásncrito que codifica 184P1E2.

Ejemplo 35 Purificación de 184P1E2 recombinante de origen natural usando anticuerpos específicos de 184P1E2

La 184P1E2 de origen natural o recombinante se purifica sustancialmente por cromatografía de inmunoafinidad usando anticuerpos específicos de 184P1 E2. Se construye una columna de inmunoafinidad mediante acoplamiento covalente de anticuerpos anti-184P1E2 a una resina cromatográfica activada, tal como SEPHAROSE activada con CNBr (Amersham Pharmacia Biotech). Después del acoplamiento, la resina se bloquea y se lava de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Se pasan a través de la columna de inmuoafinidad medios que contienen 184P1E2, y la columna se lava en condiciones que permiten la absorbancia preferencial de 184P1E2 (por ejemplo, tampones de fuerza iónica elevada en presencia de detergente). La columna se eluye en condiciones que interrumpen la unión anticuerpo/184P1E2 (por ejemplo, un tampón de pH 2 a pH 3, o una concentración elevada de caotropo, tal como urea o ion tiocianato) y se recoge GCR.P.

Ejemplo 36 Identificación de moléculas que interactúan con 184P1E2

184P1E2, o fragmentos biológicamente activos de la misma, se etiquetna con reactivo 121 1 Bolton-Hunter (véase, por ejemplo, Bolton y col. (1973) Biochem. J. 133:529.) Moléculas candidatas dispuestas previamente en los pocillos de una placa con varios pocillos se incuban con 184P1E2 etiquetada, se lavan, y se analiza cualquier pocillo con comprejo 184P1E2 etiquetado. Los datos obtenidos se usan en diferentes concentraciones de 184P1E2 para calcular valores para el número, la afiniciad y la asociación de 184P1E2 con las moléculas candidatas.

Ejemplo 37 Ensayo in vivo para la promoción del crecimiento del tumor 184P1E2

El efecto de la proteína 184P1E2 sobre el crecimiento celular del tumor se evalúa in vivo evaluando el desarrollo del tumor y el crecimiento de las células que expresan o carecen de 184P1E2. Por ejemplo, se inyecta a ratones SOlD subcutáneamente en cada flanco 1 x 106 de o bien 3T3, líneas celulares de cáncer de pulmón o de vejiga (por ejemplo, células UM-UC3, J82, CaLu1 y A427) que contienen vector vacío tkNeo o 184P1E2. Se pueden usar al menos dos estrategias : (1) expresión 184P1E2 constitutiva con regulación de una promotor tal como un promotor constitutivo obtenido de los genomas de virus tales como el virus polioma, virus de la viruela aviar (documento UK 2.211.504, publicado el 5 de julio de 1989), adenovirus (tales como adenovirus 2), virus del papiloma murino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y virus de simio 40 (SV40), o de promotores mamíferos heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, siempre que dichos promotores sean compatibles con los sistemas celulares del huésped, y (2) expresión regulado bajo control de un sistema de vectores inducible, tal como ecdysona, tetraciclina, etc., siempre que dichos promotores sean compatibles con los sistemas celulares del huésped. El volumen del tumor se supervisa por medidas de calibreen la apariencia de tumores palpables y se sigue durante un tiempo para determina si las células que expresan 184P1E2 crecen a una velocidad rápida y si los tumores producidos por células que expresan 184P1E2 demuestran características de agresividad alterada (por ejemplo, metástasis alterada, vascularización, respuesta reducida a fáramacos quimioterapéuticos).

Adicionalemente, se puede implantar a los ratones1 x 105 de las mismas células ortotopicalmente para determinar si 184P1E2 tiene un efecto sobre el crecimiento local en la vejiga o el pulmón, y si 184P1E2 afecta a la capacidad de las células para metastatizar, especialemente a ganglios linfáticos, adrenal, hígado y huesos (Mild T y col, Oncol Res. 200112:209; Fu X y col, lnt J Cancer. 1991, 49:938).

5 El ensayo también es útil para deteminar el efecto inhibitorio de 184P1E2 de composiciones terapéuticas candidatas, tales como por ejemplo, intracuerpos 184P1E2, moléculas antisentido 184P1E2 y ribozomas.

Ejemplo 38 Inhibición de tumores de vejiga y pulmón mediados por anticuerpos monoclonales 184P1E2 in vivo

La expresión significativa de 184P1E2 en tejidos cancerosos, junto con us expresión restrictiva en tejidos normales hace de 184P1E2 una buena diana para terapia con anticuerpos. De forma similar, 184P1E2 es una diana para inmunoterapia basada en células T. De este modo, la eficacia terapéutica de mAb anti-184P1E2 en modelos de ratón de xenoinjerto de cáncer de vejiga en humanos se evalúa usando líneas celulares recombinantes tales como UM-UC3-184P1E2, J82-184P1E2 y 3T3-184P1E2 (véase, por ejemplo, Kaighn, M.E. y col., Invest Urol, 1979.17(1): p.16-23). De forma similar, mAb anti-184P1E2 se evalúan en modelos de xenoinjerto de cáncer de pulmón usando líneas celulares recombinantes tales como CaLU-184P1E2 y A427-184P1E2.

15 La eficacia de anticuerpos en el crecimiento de tumores y la formación de metástasis se estudia, por ejemplo, en modelos de xenoinjerto de cáncer de vejiga ortotópicos y modelos de xenoinjerto de pulmón en ratones. Los anticuerpos pueden estar no conjugados, tal como se ha expuesto en el presente ejemplo, o pueden estar conjugados a una modalidad terapéutica, como se aprecia en la técnica. Los mAB anti-184P1E2 inhiben la formación tanto de xenoinjertos de pulmón como de vejiga. Los mAb anti-184P1E2 también retrasan el crecimiento de tumores ortotópicos establecidos y prolongan la supervivencia de ratones que portan tumores. Estos resultados indican la utilidad de mAb anti-184P1E2 en el tratamiento de etapas locales de cáncer de pulmón y vejiga. (Véase, por ejemplo, Saffran, D. y col., PNAS 10:1073-1078 o www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.051624698).

La administración de mAb anti-184P1E2 provoca el retraso del crecimiento de tumores ortotópicos establecidos y la inhibición de metástasis a sitios distales, dando como resultado una prolongación significativa de la supervivencia de

25 ratones que portan tumores. Estos estudios indican que 184P1E2 es una diana para inmunoterapia y demuestran el potencial terapéutico de mAb anti-184P1E2 para el tratamiento de estadios avanzados de cáncer de pulmón y vejiga. Este ejemplo demuestra que los anticuerpos monoclonales no conjugados 184P1E2 son eficaces para inhibir el crecimiento de xenoinjertos de tumores de vejiga humanos y de xenoinjertos de pulmón humano cultivado en ratones SOlD; en consecuencia, una combinación de dichos anticuerpos monoclonales eficaces también es eficaz.

Inhibición de tumor usando múltiples mAb 184P1E2 no conjugados

Materiales y Procedimientos

Anticuerpos monoclonales 184P1E2:

Se obtienen anticuerpos monoclonales contra 184P1E2 tal como se describe en el ejemplo titulado Generación de anticuerpos monoclonales (mAB) 184P1E2. Los anticuerpos se caracterizan por ELISA, inmunotransferencia

35 (Western), FACS e inmunoprecipitación para evaluar su capacidad de unión a 184P1E2. Los datos de mapeo del epítopo para los mAb anti-184P1E2, se determinan por ELISA e inmunotransferencia (Western), reconocen epítopos en la proteína 184P1E2. Se realiza el análisis inmunohistoquímico de tejidos y células de cáncer de vejiga con estos anticuerpos.

Los anticuerpos monoclonales se purifican a partir de sobrenadantes de cultivo tisular de hibidoma o ascítico por cromatografía de proteína-G Sefarosa, se dializan contra PBS, se esterilizan con filtración y se almacenan -20 ºC. Las determinaciones de proteína se realizan mediante un ensayo de Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA, Estados Unidos). Se prepara un anticuerpo monoclonal o un cóctel que comprende una mezcla de anticuerpos monoclonales individuales y se usa para el tratamiento de ratones que reciben inyecciones subcutáneas u ortotrópicas de xenoinjertos de tumor UM-UC3 y CaLu1.

45 Líneas celulares

Las líneas celulares de carcinoma de vejiga y pulmón, UM-UC3, J82, CaLu1 y A427, así como la línea de fibroblastos NIH 3T3 (Colección estadounidense de cultivos tipo) se mantienen en DMEM suplementado con Lglutamina y FBS al 10 %.

Se generaron poblaciones celulares UM-UC3-184P1E2, J82-184P1E2, CaLu1-184P1E2, A427-184P1E2 y 3T3184P1E2 mediante transferencia génica retroviral tal como se describe en Hubert, R.S. y col., Proc NatI Acad Sci USA, 1999. 96(25): 14523.

Modelos de xenoinjertos de ratones.

Se generaron tumores subcutáneos (s.c.) por inyección de 1 x 106 células cancerosas mezcladas en una dilución 1:1 con Matrigel (Collaborative Research) en el flanco derecho de ratones SCID macho. Para analizar la eficacia del anticuerpo en la formación de tumor, se iniciaron inyecciones de anticuerpos i.p. el mismo día que las inyecciones de tumor. Como control, se inyectó a los ratones IgG (ICN) o PBS de ratón purificadas o un anticuerpo monoclonal purificado que reconoce un antígeno irrelevante no expresado en células humanas. En estudios preliminares, no se encontraron diferencias entre IgG o PBS de ratón sobre el crecimiento tumoral. Los tamaños tumorales se determinaron por medidad de calibre, y el volumen tumoral se calcula como longitud x anchura x altura. Los ratones con tumores s.c. superiores a 1,5 cm de diámetro se sacrificaron.

Se realizaron inyeccines ortotópicas con anestesia usando quetamina/xilazina. Para estudios ortotópicos de vejiga, se hace una escisión a lo largo del abdomen para exponer la vejiga y se inyectan células tumorales (5 x 105) mezcladas con Matrigel en la cápsula de la vejiga en un volumen de 10 µl. Para supervisar el crecimiento tumoral, los ratones se palpan y se recoge sangre sobre una base semanal para medir niveles de BTA. Para modelos ortotópicos de pulmón, se hace una incisión a través de los músculos abdominales para exponer el pulmón. Se inyectan células tumorales (5 x 105) mezcladas con Matrigel en la región bronquioalveolar del pulmón derecho (McLemore TL y col, Cancer Res. 1988;48:2880). Para supervisar el crecimiento tumoral, se recoge sangre sobre una base seminal para medir niveles de CA 125. Los ratones se segregan en grupos par tratamientos apropiados, inyectándoles mAB anti-184P1E2 o de control i.p.

Crecimiento inhibido por mAb anti-184P1E2 de tumores de de xenoinjerto-cáncer que expresan 184P1E2

El efecto de mAb anti-184P1E2 sobre la formación de tumores se analiza usando modelos ortotópicos UM-UC3 y CaLu1. En comparación con el modelo tumoral s.c., el modelo ortotópico, que requiere la inyección de células tumorales directamente en la vejiga y pulmón del ratón, da como resultado un crecimiento tumoral local, el desarrollo de metástasis en sitios distales, el deterioramiento de la salud del ratón, y subsiguientemente la muerte (Saffran, D., y col., PNAS anteriormente; Fu, X. y col., Int J Cancer, 1992. 52(6): p. 987-90; Kubota, T., J Cell Biochem, 1994. 56(1): p. 4-8). Sus characteristics hacen el modelo ortotópico más representative de la progression de la enfermedad en seres humanos y no permite seguir el efecto terapéutico de mAB en puntos finales clínicamente relevantes.

En consecuencia, las células tumorales se inyectan en la vejiga o en el pulmón del ratón y 2 días después, los ratones se dividen en dos grupos y se tratan con: a) 200-500 µg de Ab anti-184P1E2 o b) PBS tres veces por semana durante dos a cinco semanas.

Una ventaja principal de estos modelos de cáncer ortotópicos es la capacidad de desarrollar metástasis. La formación o metástasis en ratones que portan tumores ortotópicos establecidos se estudia por análisis IHC de secciones de pulmón usando un anticuerpo contra una proteína de superficie celular específica de tumor tal como anti-CK20 para modelos de cáncer de vejiga y anticuerpo anti-CEA para modelos de cáncer de pulmón (Lin S y col., Cancer Detect Prey. 200125:202).

A los ratones que portan tumores ortotópicos se les administran inyecciones de 1000 µg de mAb anti-184P1E2 o PBS durante un periodo de 4 semanas. Se deja a los ratones de ambos grupos que establezan una carga tumoral alta, para asegurar una frecuencia elevada de formación de metástasis en pulmones de ratón. A continuación, los ratones se sacrifican y sus vejigas, hígados, huesos y pulmones se analizan para evaluar la presencia de células tumorales mediante análisis IHC.

Estos estudios demuestran una eficacia antitumoral amplia de los anticuerpos anti-184P1E2 en la iniciación y la progresión de cáncer de próstata y riñón en modelos de ratones de xenoinjerto. Los anticuerpos anti-184P1E2 inhiben la formación tumoral de tumores y también retrasan el crecimiento de tumores ya establecidos y prolongan la supervivencia de ratones tratados. Además, los mAb anti-184P1E2 demuestran un efecto inhibitorio fuerte sobre la expansión de tumores de vejiga y pulmón locales a sitios distales, incluso en presencia de una carga tumoral grande. De este modo, los mAb anti-184P1E2 son eficaces en puntos finales principales clínicamente relevantes (crecimiento tumoral), prolongación de supervivencia y salud.

Ejemplo 39 Uso terapéutico y de diagnóstico de anticuerpos anti-184P1E2 en seres humanos.

Los anticuerpos monoclonales anti-184P1E2 se usan de forma segura y eficaz con fines de diagnóstico, profilácticos, de pronóstico y/o terapéuticos en seres humanos. Los análisis de inmunotransferencia (Western) e inmunohistoquímico de tejidos cancerosos y xenoinjertos cancerosos con mAb anti-184P1E2 muestran una tinción extensiva en el carcinoma pero niveles significativamente inferiores o indetectables en tejidos normales. La detección de 184P1E2 en carcinamas y en enfermedades metastáticas demuestra la utilidad de los mAB como indicador de diagnóstico y/o pronóstico. Los anticuerpos anti-184P1E2 se usan, por lo tanto, en aplicaciones de diagnóstico tales como inmunohistoquímica de especímenes de biopsia de riñón para detectar cáncer en pacientes sospechosos.

Tal como se determina mediante citometría de flujo, los mAb anti-184P1E2 se unen específicamente a células de carcinoma. De este modo, se usan anticuerpos anti-184P1E2 en aplicaciones de imagen de cuerpo entero de diagnóstico, tales como radioinmunocintigrafía y radioinmunoterapia (véase, por ejemplo, Potamianos S. y col., Anticancer Res 20(2A):925-948 (2000)) para la detección de cánceres localizados y matastáticos que muestran la expresión de 184P1E2. La pérdida o liberación de un dominio extracelular de 184P1E2 en el medio extracelular, tal como el que se observa para fosfodiesterasa alcalina BlO (Meerson, N. R., Hepatology 27:563-568 (1998)), permite la detección diagnóstica de 184P1E2 mediante anticuerpos anti-184P1E2 en muestras de suero y/u orina de paciente sospechosos.

Los anticuerpos anti-184P1E2 que se unen específicamente a 184P1E2 se usan en aplicaciones terapéuticas o en el tratamiento de tipos de cáncer que expresan 184P1E2. Se usan anticuerpos anti-184P1E2 como una modalidad no conjugada y como forma conjugada en la que los anticuerpos están unidos a una o varias modalidades terapéuticas

o de imagen bien conocidas en la técnica, tales como profármacos, enzimas o isótopos radioactivos. En estudios preclínicos, se analizan anticuerpos conjugados o no conjugados anti-184P1E2 para evaluar su eficacia en la prevención de tumores y la inhibición de crecimiento en los modelos de xenoinjerto de cáncer de ratones SOID, por ejemplo, modelos de cáncer de pulmón AGS-K3 y AGS-K6, (véase, por ejemplo, el ejemplo titulado “Inhbición mediada por anticuerpos monoclonales 184P1E2 de tumores de vejiga y pulmón in vivo”). Se usan anticuerpos anti184P1E2 conjugados y no conjugados com modalidad terapéutica en ensayos clínicos con seres humanos bien solos o bien en combinación con otros tratamientos tal como se describe en los ejemplos siguientes.

Ejemplo 40 Ensayos clínicos con seres humanos para le tratamiento y el diagnóstico de carcinomas humanos mediante el uso de anticuerpos anti-184P1E2 humanos in vivo

Se usan anticuerpos según la presente invención que reconocen un epítopo de 184P1E2, y se usan en el tratamiento de determinados tumores tales como los que se enumeran en la tabla I. Sobre la base de un número de factores, que incluyen los niveles de expresión de 184P1E2, tumores tales como los enumerados en la tabla I son actualmente indicaciones preferentes. De acuerdo on cada una de estas indicaciones, se realizaron tres enfoques clínicos con exito.

I.) Terapia coadyuvante: en terapia coadyuvante, los pacientes es tratan con anticuerpos anti-184P1E2 en combinación con un agente quimioterapéutico o antineoplásico y/o terapia de radiación. Las dianas cancerosas principales, tales como las enumeradas en la tabla I, se tratan siguiendo protocolos estándar mediante la adición de anticuerpos anti-184P1E2 para normalizar una primera y una segunda línea de terapia. Los diseños de los protocolos se enfocan hacia la eficacia tal como se evalúa por reducción en la masa tumoral y también a la capacidad para reducir los dosis habituales de quimioterapia estándar. Estas reducciones de dosificación permiten una terapia adicional y/o prolongada mediante reducción de la toxicidad relacionada con la dosis del agente quimioterapéutico. Se usan anticuerpos anti-184P1E2 en varios ensayos clínicos coadyuvantes en combinación con los agentes quimioterapéuticos o antineoplásicos adriamicina (carcinoma de próstata avanzado), cisplatino (carcinomas de cabeza y cuello y de pulmón avanzados), taxol (cáncer de mama) y doxorubicina (perclínicos).

II.) Monoterapia: en relación con el uso de los anticuerpos anti-184P1E2 en la monoterapia de tumores, los anticuerpos se administran a pacientes sin un agente quimioterapéutico o antineoplásico. En una realización, la monoterapia se realiza clínicamente en un estadio final de pacientes con cáncer con enfermedad metastática extensiva. Los pacientes muestran alguna estabilización de la enfermedad. Los ensayos demuestran un efecto en pacientes refractorios con tumores cancerosos.

Ill.) Agente de imagen: mediante la unión de un radionúclido (por ejemplo, yodo o itrio (113I, 90Y a anticuerpos anti184P1E2, se usan anticuerpos radioetiquetados como agente de diagnóstico y/o imagen. En dicho papel, los anticuepos etiquetados localizan tanto tumores sólidos como también lesiones metastáticos de células que expresan 184P1E2. Con relación al uso de los anticuerpos anti-184P1E2 como agentes de imagen, los anticuerpos se usan como coadyuvante al tratamiento quirúrgico de tumores sólidos, como criba prequirúrgica o como seguimiento postoperatorio para determinar que tumor permanece y/o retorna. En una realización, se usa un (111In)-anticuerpo 184P1E2 como agente de imagen en un ensayo clínico de fase I humano en pacientes que tienen un carcinoma que expresa 184P1E2 (para analogía, véase, por ejemplo, Divgi y col., J. NatI. Cancer Inst. 83:97-1 04 (1991)). Se realiza un seguimiento a los pacientes con el estándar anterior y cámara gamma posterior. Los resultados indicant que las lesiones primarias y las lesiones metastáticas se identifican.

Dosificación y vías de administración

Tal como apreciarán los expertos en la técnica, las consideraciones de dosificación pueden determinarse mediante comparación con productos análogos que están en la clínica. De este modo, pueden administrarse anticuerpos anti184P1E2 con dosis en el intervalo de 5 a 400 mg/m2, con las dosis inferiores usadas, por ejemplo, con relación a estudios de seguridad. La afinidad de anticuerpos anti-184P1E2 con relación a la afinidad de un anticuerpo conocido por su diana es un parámetro usado por los expertos en la técnica para determinar regímenes de dosificación análogos. Además, los anticuerpos anti-184P1E2 que son totalmente humanos, en comparación con los anticuerpos quiméricos, presentan una eliminación más reducida; en consecuencia, la dodificación en pacientes con dichos anticuerpos anti-184P1E2 totalmente humanos puede ser inferior, quizás en el intervalo de 50 a 300 mg/m2, y permanecer aún eficaz. La dosificación en mg/m2, en oposición a la medida convencional de dosificación en mg/kg, es una medida basada en el área superficial y es una medida de dosificación conveniente que se diseña para incluir pacientes de todos los tamaños desde niños a adultos.

Se usan tres enfoques de administración distintos para adiministrar anticuerpos anti-184P1E2. La administración intravenosa convencional es una técnica de administración estándar para muchos tumores. No obstante, con relación a tumores en la cavidad peritoneal, tales como tumores de los ovarios, conducto biliar, otros conductos y similares, la administración intraperitoneal puede demostrarse como favorable para obtener dosis altas de anticuerpos en el tumor y para minimizar, también, la eliminación del anticuerpo. De un modo similar, determinados tumores sólidos poseen vasculatura que es apropiada para la perfusión regional. La perfusión regional permite una

5 dosis alta de anticuerpo en el sitio de un tumor y minimiza la eliminación a corto plazo del anticuerpo.

Plan de desarrolo clínico (CDP)

Vista general: Los CDP siguen y desarrollan tratamientos de anticuerpos anti-184P1E2 junto con terapia coadyuvante, monoterapia y como un agente de imagen. Los ensayos mostraron inicialmente seguridad y después confirmaron al eficacia en dosis de repetición. Los ensayos son de etiqueta abierta que comparan la quimioterapia

10 estándar con terapia estándar más anticuerpos anti-184P1E2. como se apreciará, un criterio que puede usarse con relación a la inscripción de pacientes es los niveles de expresión de 184P1E2 en tumores determinados por biopsia.

Como con cualquier terapia a base de infusión de proteínas o anticuerpos, los asuntos de seguridad están relacionados principalmente con (i) sindrome de liberación de citocinas, es decir, hipotensión, fiebre, temblores, escalofríos; (ii) el desarrollo de una respuesta inmunogénica al material (es decir, desarrollo de anticuerpos humanos

15 en los pacientes a la terapia con anticuerpos, o respuesta HAHA); y (iii) toxicidad a células normales que expresan 184P1E2. Los ensayos estándar y de seguimiento se usan para supervisar cada uno de estos asuntos de seguridad. Los anticuerpos anti-184P1E2 se encuentra que son seguros después de la administración a seres humanos.

Ejemplo 41 Terapia coadyuvante de ensayos clínicos humanos con anticuerpos anti-184P1E2 humanos y agente quimioterapéutico

20 Un ensayo clínico humano de fase I se inicia para evaluar la seguridad de seis dosis intravenosas de una anticuerpo anti-184P1E2 humano con relación al tratamiento de un tumor sólido, por ejemplo, un cáncer de un tejido enumerado en la tabla I. En el estudio, la seguridad de dosis únicas de anticuerpos anti-184P1E2 cuando se usan como terapia coadyuvante a un agente antineoplásico o quimioterapéutico, tal como cisplatino, topotacano, doxorubicina, adriamicina, taxol o similares, se evalúa. El diseño del ensayo incluye la administración de seis dosis

25 únicas de un anticuerpo anti-184P1E2 con dosis de anticuerpo crecientes de aproximadamente 25 mg/m2 a aproximadamente 275 mg/m2 durante el curso del tratamiento de acuerdo con el esquema siguiente:

Día 0 Día 7 Día 14 Día 21 Día 28 Día 35

Dosis de mAb 25 75 125 175 225 275

mg/m2 mg/m2 mg/m2 mg/m2 mg/m2 mg/m2

Quimioterapia + + + + + +

(dosis estándar)

Los pacientes se somenten a un seguimiento estrecho durante una semana después de cada administración de anticuerpos y quimioterapia. En particular, se evalúa en los pacientes los asuntos de seguridad mencionados 30 anteriormente (i) sindrome de liberación de citocinas, es decir, hipotensión, fiebre, temblores, escalofríos; (ii) el desarrollo de una respuesta inmunogénica al material (es decir, desarrollo de anticuerpos humanos en los pacientes a la terapia con anticuerpos, o respuesta HAHA); y (iii) toxicidad a células normales que expresan 184P1E2. Los ensayos estándar y de seguimiento se usan para supervisar cada uno de estos asuntos de seguridad. También se evalúa en los pacientes el resultado clínico, y particularmente la reducción de la masa tumoral como se evidencia

35 por MRI u otro análsis de imagen.

Se demuestra que los anticuerpos anti-184P1E2 son seguros y eficaces, el ensayo de fase II confirma la eficacia y refina la dosis óptima.

Ejemplo 42 Ensayo clínico humano: monoterapia con anticuerpos anti-184P1E2 humanos

Los anticuerpos anti-184P1E2 son seguros con relación a los ensayos coadyuvantes tratados anteriormente, una

40 fase II y conllevan los mismos análisis de seguridad y resultados que el con la excepción de que los pacientes no reciben quimioterapia simultáneamente con la administración de dosis de anticuerpos anti-184P1E2.

Ejemplo 43 Ensayo clínico humano: imagen de diágnostico con anticuerpos anti-184P1E2

De nuevo, tal como la terapia coadyuvante tratada anteriormente es segura dentro de los criterios de securidad expuestos anteriormente, se realiza un ensayo clínico humano que implica el uso de anticuerpos anti-184P1E2 como

45 agente de imagen de diagnóstico. El protocolo se diseña de un modo sustancialmente similar a los descritos en la técnica, tal como en Divgi y col. J. NatI. Cancer Inst. 83:97-1 04 (1991). Se encuentra que los anticuerpos son seguros y eficaces cuando se usan como modalidad de diagnóstico.

Ejemplo 44 Comparación de homología de 184P1E2 a secuencias conocidas

El gen 184P1E2 es homólogo a un gen clonado previamente, es decir, peptidilarginina deiminasa de tipo III (gi 7706447) humano. El 184P1E2v.1 y el 184P1E2v.2 muestran el 99 % de identidad a la peptidilarginina deiminasa de tipo III publicada a lo largo de la longitud de la proteína (figura 4B y tabla LIII). Mientras el 184P1E2 v.1 difiere de gi 7706447 en un aminoácido en la posición 480 (figura 4B), 184P1E2v.2 difiere de gi 7706447 en dos aminoácidos en las posiciones 304 y 480 (Table LIII). Por el contrario, 184P1E2 v.3 es 100 % identico a la peptidilarginina deiminasa de tipo III publicada (véase la figura 4B y la tabla LIII). Esto indica que 184P1E2 v.1, v.2 y v.3 representan SNP del mismo gen (véase la tabla LIII). La homología a lapeptidilarginina deiminasa se mantiene entre especies, ya que 184P1E2 es muy homóloga a la peptidilarginina deiminasa de tipo III de ratón y rata (figuras 4C y 4D). La proteína 184P1E2 consta de 664 aminoácidos, con un peso molecular calculado de 74,7 kDa, y un pI de 5,3. 184P1E2 es una proteína intracelular, con localización en las mitocondrias y el citosol. 184P1E2 también puede localizarse en el núcleo. Los análisis de motivo revelan la presencia de un motivo de proteína arginina desaminasa (PAD) a lo largo de la longitud total de la proteína, y una señal de cadherina en los aminoácidos 314-362 (tabla XXI).

Las proteínas arginina desaminasas representan una familia de 4 isoformas de arginina desaminasa, todas las cuales catalizan la conversión postraduccional de residuos de arginina a citrulina de un modo dependiente de calcio (Kanno T y col., J lnv. Dermatol 2000, 115:81 3). La peptidilarginina deiminasa III también se conoce como tipo de PAD de foliculo de pelo ya que se expresa principalmente en epidermis y foliculos de pelo (Watanabe K y col. Biochim Biophys Acta 1988, 966:375). La conversión de arginina a citrulina por PAD tiene efectos profundos sobre la estructura primaria de proteínas diana y su función biológica. Por ejemplo, la desminación de la proteína básica mielina potencia su susceptibilidad a la degradación por catepsina, una afección asociada a la patología de la esclerosis múltiple (Pritzker L y col., Biochemistry 2000, 39:5382). Diversas proteínas epidérmicas se desiminan mediante peptidilarginina deiminasa III, incluidas filaggrina, tricohialina y queratina (Senshu T y col., Biochem. Biophy. Res. Comm 1996, 225:71 2). La desiminación de estas sustancias provoca su desnaturalización y la pérdida eventual de integridad celular (Mizoguchi M y col., J. Histochem. Cytockem 1998, 46:1303). La peptidilarginina desaminasa actúa también como regulador de la proliferanción y la supervivencia celular en algunas pero no en todas las células tumorales. Mientras que algunas líneas tumorales, Tales como leucemias agudas, responden a la peptidilarginina desaminasa disminuyendo el arresto celular en fases G1 y/o S del ciclo celular y la apoptosis, otras células no se ven afectadas por la peptidilarginina desaminasa (Gong H y col., Leukemia 2000, 14:826). En otros casos, la peptidilarginina desaminasa proporciona un efecto contra la apoptosis, tal como en células cáncer de próstata tratadas con taxol (Kang S y col, Mol Cell 2000, 10:331).

Tal como se ha mencionado anteriormente, se ha identificado un motivo de cadherina en los aminoácidos 316-342 de la proteína 184P1E2. Las cadherinas son una familia de proteínas que regulan que actúan en la adhesión de células dependiente de calcio. Las cadherinas interactúan preferencialmente consigo mismas, regulando la adhesión celular y las uniones estrechas (Nagafuchi A. Curr Opin Cell Biol. 2001, 13:600). La interrupción del funcionamiento de la cadherina da como resultado un crecimiento celular no regulado y migración celular, observados a menudo en cáncer (Thiery JP, Chopin D. Cancer Metastasis Rev. 1999; 18:31;). Ya que la 184P1E2 es una proteína intracelular, no es probable que, por sí misma, medie en la adhesión célula-célula. No obstante, la presencia de un motivo de cadherina sugiere que 184P1E2 participa en interacciones proteína-proteína.

La presencia de un motivo de peptidilarginina desaminasa y un dominio de interacción proteína-proteína junto con su localización indica que la 184P1E2 funciona regulando interacciones proteicas y la señal de transducción en células de mamífero, regulando de este modo la proliferación, supervivencia, diferenciación celular y también la expresión génica. Estas funciones biológicas tienen un efecto directo sobre el crecimiento y la progresión del tumor.

En consecuencia, cuando la 184P1E2 funciona como reguladro del crecimiento celular, la formación tumoral, la señalización celular o como modulador de la transcripción implicada en la activación de genes asociada con supervivencia, invasión, tumorigénesis o proliferación, la 184P1E2 se usa con fines terapéuticos, de diagnóstico, de pronóstico y/o preventivos. Además, cuando una molécula, tal como una variante o SNP de 184P1E2 se expresa en células cancerosas, tales como las enumeradas en la tabla I, se usan con fines terapéuticos, de diagnóstico, de pronóstico y/o preventivos.

Ejemplo 45 Regulación de la transcripción

La localizacion de 184P1E2 acoplada a la presencia de dominios de interacción de proteínas dentro de su secuencia indica que 184P1E2 modula la regulación transcripcional de genes eucarióticos. La regulación de la expresión génica se confirma, por ejemplo, estudiando la expresión génica en células que expresan o carecen de 184P1E2. con este fin, se realizan dos tipos de experimentos.

En el primer conjunto de experimentos, el ARN de células parentales y que expresan 184P1E2 se extrae y se hibrida con grupos de genes disponibles comercialmente (Clontech) (Smid-Koopman E y col., Br J Cancer. 2000. 83:246). Las células restantes así como las células tratadas con FBS, andrógeno o factores del crecimiento se comparan. Los genes expresados diferencialmente se identifican de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica. Los genes expresados diferencialmente se mapean a continuación a rutas biológicas (Chen K y col. Thyroid. 2001. 11:41.).

En el segundo conjunto de experimentos, la activación de la ruta transcripcional específica se evalúa usando constructos comunicadores de luciferasa disponibles comercialmente (Stratagene) que incluyen: NFkB-luc, SRE-luc, ELK1-luc, ARE-luc, p53-luc y CRE-luc. Estos comunicadores transcripcionales contienen sitios de unión consenso para factores de transcripción conocidos que se encuentran cadena debajo de las rutas de transducción de señal bien caracterizadas, y representa un instrumento bueno para determinar la activación de rutas y seleccionar moduladores positivos y negativos de activación de rutas.

De este modo, 184P1E2 tiene un papel en la regulación génica, y se usa como diana con fines de diagnóstico, de pronóstico, preventivos y/o terapéuticos.

Ejemplo 46 Identificación y confirmación de rutas de transducción de señal potenciales

Se ha informado que muchas proteínas de mamífero interactúan con moléculas señalizadoras y participan en la regulación de rutas señalizadoras (J Neurochem. 2001; 76:21 7-223). En particular, se ha asociado a las cadherinas con la cascada de señalización de β-catenina que controla la transformación y la invasión celular (Gottardi CJ y col., J Cell Biol. 2001, 153:1049). Sobre la base de la presencia de un motivo de cadherina 184P1E2 regula las rutas de señalización importantes para el crecimiento y la invasión celular. Además, la proteína 184P1E2 contiene varios sitios de fosforilación (véase la tabla XX) que indican una asociacion con cascadas de señalización específicas. Usando técnicas de inmunoprecipitación e inmunotransferencia (Western), se identifican proteínas que se asocian con 184P1E2 y median eventos de señalización. Pueden regularse varias rutas conocidas por tener un papel en la biología del cáncer mediante 184P1E2, incluidas las rutas de fosfolípidos tales como P13K, AKT, etc, rutas de adhesión y migración, incluidas FAK, Rho, Rac-1, β-catenina, etc, así como cascadas de mitogénesis/supervivencia tales como ERK, p38, etc. (Cell Growth Differ. 2000,11:279; J Biol Chem. 1999, 274:801; Oncogene. 2000,19:3003,

J. Cell Biol. 1997,138:913.).

Para confirmar que 184P1E2 activa directa o indirectamente rutas de transducción de señal conocidas en células, se realizaron ensayos comunicadores transcripcionales basados en luciferasa (luc) en células que expresan genes individuales. Estos comunicadores transcripcionales contienen sitios de unión a consenso para factores de transcripción conocidos que se encuentran cadena debajo de las rutas de transducción de señal bien caracterizadas. Los comunicadores y ejemplos de estos asociados a factores transcripcionales, rutas de transducción de señal y activación de estímulos se enumeran a continuación.

1.

NFkB-luc, NFkB/Rel; lk-quinase/SAPK; crecimiento/apoptosis/estrés

2.

SRE-luc, SRF/TCF/ELKI; MAPKISAPK; crecimiento/diferenciación

3.

AP-1 -luc, FOS/JUN; MAPKISAPKIPKC; crecimiento/apoptosis/estrés

4.

ARE-luc, receptor andrógeno; esteroides/MAPK; crecimiento/diferenciación/apoptosis

5.

p53-luc, p53; SAPK; crecimiento/diferenciación/apoptosis

6.

CRE-luc, CREB/ATF2; PKA/p38; crecimiento/apoptosis/estrés

7.

TCF-luc, TCF/Lef; β-catenina, adhesión/invasion

Los efectos mediados por genes pueden analizarse en céluls que muestran expresion de ARNm. Pueden introducirse plásmidos comunicadores de luciferasa mediante transfección mediada por lípidos (TFX-50, Promega). La actividad de la luciferase, undicador de la actividad transcripcional relativa, se mide mediante incubación de extreactos celulares con sustrato de luciferasa y la luminiscencia de la reacción se supervisa en un luminómetro.

Las rutas de señalización activadas por 184P1E2 se cartografían y se usan para la identificación y validación de dianas terapéuticas. Cuando 184P1E2 está implicada en la señalización celular, se usa como diana con fines de diagnóstico, pronóstico, preventivos y/o terapéuticos.

Ejemplo 47 Implicación en la progresión tumoral

Sobre la base del papel documentado de la peptidilarginina deiminasa en el crecimiento, la proliferación y la supervivencia celular (Kang S y col., Mol Cell 2000, 10:331), el gen 184P1E2 puede contribuir al crecimiento de las células cancerosas. El papel de 184P1E2 en el crecimiento tumoral se confirma en diversas líneas celulares primarias y transfectadas que incluyen líneas celulares de vejiga y pulmón, asi como líneas NIH 3T3 diseñadas para expresar de forma estable 184P1 E2. Las células parentales que carecen de 184P1E2 y células que expresan 184P1E2 se analizan para evaluar el crecimiento celular usando un ensayo de proliferació bien documentado (Fraser SP, Grimes JA, Djamgoz MB. Prostate. 2000;44:61, Johnson DE, Ochieng J, Evans SL. Anticancer Drugs. 1996, 7:288).

Para confirmar el papel de 184P1E2 en el proceso de transformación, su efecto en ensayos de formación de colonias se investiga. Células NIH-3T3 parentales que carecen de 184P1E2 se comparan con células NIH-3T3 que expresan 184P1E2, usando un ensayo en agar blando en condiciones estringentes y más permisivas (Song Z. y col. Cancer Res. 2000;60:6730).

Para confirmar el papel de 184P1E2 en la invasión y la metástasis de células cancerosas, se usa un ensayo bien establecido, por ejemplo, un ensayo Transwell Insert System (Becton Dickinson) (Cancer Res. 1999; 59:601 0). Se comparan células control, que incluyen líneas celulares de próstata, mama y riñón que carecen de 184P1E2 con células que expresan 184P1E2. Las células se cargan con colorante fluorescente, calceína, y se plaquean en el pocillo superior del inserto Transwell recubierto con una membrana de basamiento análoga. La invasión se determina mediante fluorescencia de células en la cámara inferior relativa a la fluorescencia de la totalidad de la población celular

184P1E2 también puede tener un papel en el ciclo celular y en la apoptosis. Las células parentales y las células que expresan 184P1E2 se comparan para buscar diferencias en la regulación del ciclo celular usando un ensayo BrdU bien establecido (Abdel-Malek ZA. J Cell Physiol. 1988, 136:247). Brevemente, las células se cultivan en condiciones óptimas (suero completo) y limitantes (suero bajo), se etiquetan con BrdU y se tiñemn con AB anti-BrdU y yoduro de propidio. Las células se analizan para evaluar la entrada en las fases G1, S y G2M del ciclo celular. Alternativamente, el efecto de estrés en la apoptosis se evalúa en las céluls parentales de control y en células que expresan 184P1E2, incluidas células normales y tumorales de vejiga y pulmón. Las células diseñadas y parentales se tratan con varios agentes quimioterapéuticos, tales como etopósido, taxol, etc, e inhibidores de la síntesis de proteínas, tales como cicloheximida. Las células se tiñen con anexina V-FITC y se mide la muerte celular mediante análisis FACS. La modulación de muerte cellular por 184P1E2 puede tener un papel crítico en la regulación de la progresión del tumor y en la carga tumoral.

Cuando 184P1E2 tiene un papel en el crecimiento, transformación, invasión o apoptosis celular, se usa como diana con fines de diagnóstico, pronóstico, preventivos y/o terapéuticos.

Ejemplo 48 Implicación en angiogénesis

La angiogénesis o formación de vasos sanguíneos capilares nuevos es necesaria para el crecimiento tumoral (Hanahan D, Folkman J. Cell. 1996, 86:353; Folkman J. Endocrinology. 1998 139:441). Sobre la base del efecto de inhibidores de la fosofodiesterasa en células endoteliales, 184P1E2 tiene un papel en la angiogénesis (DeFouw L y col, Microvasc Res 2001, 62:263). Se han desarrollado varios ensayos para medir la angiogénesis in vitro e in vivo, tales como ensayos de cultivo hístico de formación de tubos celulares endoteliales y proliferación celular endotelial. Usando estos ensayos, así como también en neovascularización in vitro, el papel de 184P1E2 en angiogénesis, potenciación o inhibición se confirma.

Por ejemplo, las células endoteliales diseñadas para expresar 184P1E2 se evalúan usando ensayos de formación de tubos y proliferación. El efecto de 184P1E2 también se confirma en modelos animales in vivo. Por ejemplo, células que bien expresan o bien carecen de 184P1E2 se implantan subcutaneamente en ratones inmunocompromisados. La migración cellular endotelial y la angiogénesis se evalúan 5-15 días después usando técnicas de inmunohistoquímicas. 184P1E2 afecta a la angiogénesis, y se usa como diana con fines de diagnóstico, de pronóstico, preventivos y/o terapéuticos.

Ejemplo 49 Implicación en interacciones proteína-proteína

Se ha demostrado que los motivos de cadherina median en la interacción con otras proteínas, especialmente proteínas de cadherina similares, regulando de este mido la adhesión y el crecimiento celular (Cavallaro U y col., Cancer Lett. 2002, 176:123; Kovacs EM y col., Curr Biol. 2002, 12:379). Usando técnicas de inmunoprecipitación , así como sistemas híbridos de dos levaduras, se identifican las proteínas que se asocina con 184P1E2. Se comparan inmunoprecipitantes de células que expresan 184P1E2 y células que carecen de 184P1E2pra evaluar asociaciones espécificas proteína-proteína.

Se realizan estudios para confirmar la extensión de la asociació de 184P1E2 con moléculas efectoras, tales como proteínas nucleares, factores de transcripción, quinasas, fosfatos etc. Estudios de comparación de células positivas a 184P1E2 y negativas a 184P1E2, así como estudios de comparación de células no estimuladas/restantes y células tratadas con activadores celulares epiteliales, tales como citocinas, factores de crecimiento, andrógenos y Ab antiintegrina revelan interacciones únicas.

Además, se confirman interacciones proteína-proteína usando metodología híbrida de dos levaduras (Curr Opin Chem Biol. 1999, 3:64). Un vector que porta una colección de proteínas fusionadas a un dominio de activación de un factor de transcripción se introduce en levadura que expresa una proteína de fusión 184P1E2-dominio de unión ADN y un constructo comunicador. La interacción proteína-proteína se detecta mediante actividad comunicadora colorimétrica. La asociación específica con moléculas efectoras y factores de transcripción dirige a un experto al modo de acción de 184P1E2, y de este modo identifica dianas terapéuticas, de prognéstico, preventativas y/o de diágnostico para cáncer. Este ensayo y otros similares se usan también para identificar y seleccionar moléculas pequeñas que interactúan con 184P1E2.

De este modo, se encuentra que 184P1E2 se asocia con proteínas y moléculas pequeñas. En consecuencia, 184P1E2 y estas proteínas y moléculas pequeñas se usan con fines de diagnóstico, de pronóstico, preventivos y/o terapéuticos.

Ejemplo 50 Implicación en la desiminación

5 Tal como se ha mencionado previamente, las petidilarginina deiminasas convierten arginina unida a proteína en citrulina, alterando de este modo la estructura y función de proteínas diana (Kanno T y col., J lnv. Dermatol 2000, 115:813). Las petidilarginina deiminasas de 184P1E2 se confirmará en líneas celulares recombinantes, así como en células tumorales primarias de vejiga y pulmón. Se cultivan células que expresan 184P1E2 y células control que carecen de 184P1E2 sobre cubreobjetos de vidrio estériles, y se fijan en paraformaldehído. Los residuos de citrulina

10 localizados en proteínas celulares se alteran químicamente para un mejor reconocimiento usando ferricianuro de potasio. Los residuos de citrulina se detectan usando un anticuerpo específico de citrulina por inmunofluorescencia.

Cuando 184P1E2 funciona como deiminasa, se usa como diana con fines de diagnóstico, de pronóstico, preventivos y/o terapéuticos.

A lo largo de la presente solicitud se hace referencia a varios contenidos de datos de sitios de Internet,

15 publicaciones, solicitudes de patente y documentos de patente. (Se hace referencia a los sitios de Internet por medio de su URL.)

TABLA II: abreviaturas de aminoácidos TABLA III: Matriz de sustituciones aminoacídicas

TABLA I: Tejidos que expresan 184P1E2 cuando existe tumor maligno -vejiga -riñón -pulmón

UNA LETRA

TRES LETRAS NOMBRE COMPLETO

F

Phe fenilalanina

L

Leu leucina

S

Ser serina

Y

Tyr tirosina

C

Cys cisteína

W

Trp triptofano

P

Pro prolina

H

His histidina

Q

Gln glutamina

R

Arg arginina

I

Ile isoleucina

M

Met metionina

T

Thr treonina

N

Asn asparagina

K

Lys lisina

V

Val valina

A

Ala alanina

D

Asp ácido aspártico

E

Glu ácido glutámico

G

Gly glicina

Matriz de sustituciones aminoacídicas adaptada del programa informático GCG 9.0 BLOSUM62 (matriz de sustituciones en bloque). Cuanto más alto es el valor, más probable es encontrar una sustitución en proteínas naturales relacionadas (Vease la URL www.ikp.unibe.ch/manula/blosum62.htlm)

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TABLA IV Motivos/supermotivos HLA clase I/II TABLA IV (A): Motivos/supermotivos HLA clase I/II

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Los residuos en negrita son preferentes, los residuos en cursiva son menos preferentes: Un péptido se considera que porta motivos si tiene anclajes primarios en cada posición de anclaje primario para un motivo o supermotivo tal como se ha especificado en la tabla anterior.

TABLA IV (B): Supermotivo HLA clase II

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TABLA IV (C): Motivos HLA clase II

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TABLA IV (D): Supermotivos HLA clase I

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Nombre

% de identidad promedio Descripción Función potencial

zf-C2H2

34 % Dedo de cinc, tipo C2H2 Proteína de unión a ácido nucleico, opera como factor de transcripción, probable localización nuclear

citocromo b N

68 % Citocromo b(Nterminal)/b6/petB Oxidasa unida a membrana, genera superóxido

ig

19 % Dominio de inmunoglobulina Los dominios son de cien aminoácidos de longitud e incluyen un enlace disulfura en intradominio conservado

WD40

18 % Dominio WD, repetición Gbeta Repeticiones tándem de aproximadamente 40 residuos; cada uno contiene un motivos Trp-Asp. Opera en la transducción de señal e interacción proteica

PDZ

23 % Dominio PDZ Puede operar en moléculas de señalización dirigidas a sitios submembranales

LRR

28 % Repetición rica en leucina Motivos de secuencia corta implicados en interacciones proteína-proteína

pkinasa

23 % Dominio de proteína quinasa Núcleo catalítico conservado común a serina/treonina y tirosina, proteínas quinasas que contienen un sitio de unión a ATP y un sitio catalítico

PH

16 % Dominio PH Homología con pleckstrina que implicada en la señalización intracelular o como constituyente del citoesqueleto

EGF

34 % Dominio similar a EGF 30-40 aminoácidos de longitud encontrados en el domino extracelular de proteínas unidas a membrana o en proteínas secretadas

rvt

49 % Transcriptasa inversa (ADN polimerasa dependiente de ARN)

ank

25 % Repetición ank Proteína citoplásmica, asocia proteínas de membrana integrales al citoesqueleto

oxidored q1

32 % NADHubiquinona/plastoquinona (complejo 1), varias cadenas Asociada a membrana, implicada en la translocación protónica a lo largo de la membrana

efhand

24 % Mano EF Dominio de unión a calcio, costituido por un bucle flanqueante de 12 residuos a ambos lados de un dominio alfa helicoidal de 12 residuos

rvp

79 % Aspartil proteasa retrovírica Aspartil o proteasas ácidas, cetradas sobre un residuo aspartilo catalítico

colágeno

42 % Repetición de triple hélice de colágeno (20 copias) Proteínas extracelulares estructurales implicadas en la formación de tejido conectivo. La secuencia consta de los G-X-Y y las cadenas polipeptídicas forman una hélice triple

fn3

20 % Dominio de fibronectina tipo III Localizado en la región de unión al ligando extracelular de recpetores y tiene aproximadamente 200 residuos de aminoácidos con dos pares de cisternas implicadas en enlaces disulfuro

7tm 1

19 % Receptor 7 transmembranal (familia rodopsina) Siete regiones transmembranales hidrófobas, con el extremo N localizado extracelularmente mientras el extremo C es citoplásmico. Señal a través de proteínas G

Tabla XX: Motivos y modificaciones postraduccionales de 184P1E2

Sitio de N-glucosilación

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Sitio de fosforilación de proteína quinasa dependiente de AMPc y CMPC

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Sitio de fosforilación de proteína quinasa C

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Sitio de fosforilación de caseína quinasa II

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Sitio de N-miristolación

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Sitio de amidación

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Tabla XXI: propiedades proteicas de 184P1E2

184P1E2 v.1

Programa bioinformático URL Resultados

ORF

ORF finder pb42-2036 (incluye detención)

Longitud de proteína

664 aa

Región

TM Pred http://www.ch.embnet.org/ No TM

transmembranal

HMMTop http://www.enzim.hu/hmmtop/ no TM, extremo N extracelular

Sosui

http://www.genome.ad.jpl SOSui/ proteína soluble

TMHMM

http://www.cbs.dtu.dk/services/ no TM

TMHMM

Péptido se señalización

Signal P http://www.cbs.dtu.dk/services/ ninguno

SignalP/

pI

pI/MW tool http ://www. expasy.ch/tools/ pI 5,3

peso molecular

pI/MW tool http ://www. expasy.ch/tools/ 74,7 kDa

localización

PSORT http://psort. nibb.ac.jp/ espacio de matriz 59 %,

Mitochondrial

mitocondrial

membrana interna 29,9 %,

mitocrondrial

espcacio intermembrana 29,9 %,

mitocondrial

membrana externa 29,9 %

PSORT II

http://psort.nibb.ac.jp/ 47,8 % citoplásmico, 21,7 %

Nuclear, 17,4 % mitochondrial

Motivos

Pfam http ://www. sanger.ac.uk/Pfam/ Protein arginana deiminasa (PAD)

Prints

http://www.biochemucl.ac.uk/ firma cadherina, firma piridin

nucleótido reductasa dependiente

de FAD

Blocks

http ://0www. blocks.fhcrc.org/ proteína G410, urocanasa,

familia fosfoglicerato quinasa

desarrollo proteína de señalización

familia Wntl

ORF

ORF finder pb42-2036 (incluye detención)

Longitud de proteína

664 aa

Región

TM Pred http://www.ch.embnet.org/ No TM

transmembranal

HMMTop http://www.enzim.hu/hmmtop/ no TM, extremo N extracelular

Sosui

http://www.genome.ad.jpl SOSui/ proteína soluble

TMHMM

http://www.cbs.dtu.dk/services/ no TM

TMHMM

Péptido se señalización

Signal P http://www.cbs.dtu.dk/services/ ninguno

SignalP/

pI

pI/MW tool http ://www. expasy.ch/tools/ pI 5,3

peso molecular

pI/MW tool http ://www. expasy.ch/tools/ 74,7 kDa

localización

PSORT http://psort. nibb.ac.jp/ espacio de matriz 59 %,

Mitochondrial

mitocondrial

membrana interna 29,9 %,

mitocrondrial

espcacio intermembrana 29,9 %,

mitocondrial

membrana externa 29,9 %

PSORT II

http://psort.nibb.ac.jp/ 47,8 % citoplásmico, 21,7 %

Nuclear, 17,4 % mitochondrial

Motivos

Pfam http ://www. sanger.ac.uk/Pfam/ Protein arginana deiminasa (PAD)

Prints

http://www.biochemucl.ac.uk/ firma cadherina, firma piridin

nucleótido reductasa dependiente

de FAD

Blocks

http ://0www. blocks.fhcrc.org/ proteína G410, urocanasa,

familia fosfoglicerato quinasa

desarrollo proteína de señalización

familia Wntl

ORF

ORF finder pb42-2036 (incluye detención)

Longitud de proteína

664 aa

Región

TM Pred http://www.ch.embnet.org/ No TM

transmembranal

HMMTop http://www.enzim.hu/hmmtop/ no TM, extremo N extracelular

Sosui

http://www.genome.ad.jpl SOSui/ proteína soluble

TMHMM

http://www.cbs.dtu.dk/services/ no TM

TMHMM

Péptido se señalización

Signal P http://www.cbs.dtu.dk/services/ ninguno

SignalP/

pI

pI/MW tool http ://www. expasy.ch/tools/ pI 5,3

peso molecular

pI/MW tool http ://www. expasy.ch/tools/ 74,7 kDa

localización

PSORT http://psort. nibb.ac.jp/ espacio de matriz 59 %,

Mitochondrial

mitocondrial

membrana interna 29,9 %,

mitocrondrial

espcacio intermembrana 29,9 %,

mitocondrial membrana externa 29,9 % PSORT II http://psort.nibb.ac.jp/ 47,8 % citoplásmico, 21,7 % Nuclear, 17,4 % mitochondrial 5 Motivos Pfam http ://www. sanger.ac.uk/Pfam/ Protein arginana deiminasa (PAD)

Prints http://www.biochemucl.ac.uk/ firma cadherina, firma piridin nucleótido reductasa dependiente de FAD

Blocks http ://0www. blocks.fhcrc.org/ proteína G410, urocanasa,

10 familia fosfoglicerato quinasa desarrollo proteína de señalización familia Wntl

15

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TABLA lII: Péptidos de búsqueda 184P1E2: para todos los 184P1E2 v.1-nonámeros, decámeros y pentadecámeros

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5 184P1E2 v.2 184P1E2 v.2 nonámeros WIMTPSTLAPLEVYVCR (aa. 296-312) 184P1E2 v.2 decámeros PWIMTPSTLAPLEVYVCRV (aa.295-313)

10 184P1E2 v.2 pentadecámeros VFRVAPWIMTPSTLAPLEVYVCRVRNNTC (aa. 290-318)

184P1E2 v.3:

184P1E2 v.3 nonámeros DEFLSFVPVPDGKGFRM (aa.472-488)

15 184P1E2 v.3 decámeros VDEFLSFVPVPDGKGFRML (aa.471-489) 184P1E2 v.3 pentadecámeros LAVGHVDEFLSFVPVPDGKGFRMLLASPG (aa.466-494)

Tabla LIII: alineamiento Clustal de las tres variantes 184P1E2 que muestran modificaciones SNP

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Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento in vitro para detectar la presencia de una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que se muestra en la figura 2A, 2B o 2C en una muestra de ensayo que comprende:

   poner en contacto la muestra con un anticuerpo que se une específicamente a la proteína; y

   detectar la unión de la proteína de la muestra al mismo, proporcionando la presencia elevada de proteína en la muestra de ensayo con relación a la muestra de tejido normal una indicación de la presencia de cáncer de riñón, vejiga y pulmón.

2. 2.

   El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa de determinación comprende comparar una cantidad de unión del anticuerpo que se une específicamente a la proteína con la presencia de la proteína en una muestra normal correspondiente.

3. 3.

   El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que el anticuerpo es monoclonal.

4. 4.

   El procedimiento de la reivindicación 3, en el que el anticuerpo monoclonal es una proteína recombinante.

5. 5.

   El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal monocatenario.

6. 6.

   El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humano.

7. 7.

   El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el anticuerpo se etiqueta con un marcador detectable.

8. 8.

   El procedimiento de la reivindicación 7, en el que el marcador detectable se selecciona del grupo constituido por un isótopo radioactivo, un compuesto fluorescente, un compuestos bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un quelador de metales o una enzima.

9. 9.

   El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el anticuerpo comprende adicionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable.

10. 10.

    Un anticuerpo o fragmento del mismo que se une inmunoespecíficamente a un epítopo de una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la figura 2A, 2B o 2C, para su uso en el diagnóstico de cáncer de vejiga, de riñón o de pulmón.