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ES2340249T3 - Antigenos transmembrana de tipo serpentina expresados en canceres de prostata humanos y sus usos. - Google Patents

Antigenos transmembrana de tipo serpentina expresados en canceres de prostata humanos y sus usos. Download PDF

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ES2340249T3
ES2340249T3 ES00983938T ES00983938T ES2340249T3 ES 2340249 T3 ES2340249 T3 ES 2340249T3 ES 00983938 T ES00983938 T ES 00983938T ES 00983938 T ES00983938 T ES 00983938T ES 2340249 T3 ES2340249 T3 ES 2340249T3
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protein
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antibody
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Daniel E. H. Afar
Rene S. Hubert
Arthur B. Raitano
Douglas C. Saffran
Steve Chappell Mitchell
Mary Faris
Aya Jakobovits
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Abstract

Polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos de longitud completa mostrada en las figuras 9A-D.

Description

Antígenos transmembrana de tipo sepentina expresados en cánceres de próstata humanos y sus usos.
La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud de patente de Estados Unidos número 09/455.486, solicitada el 6 de diciembre de 1999.
Campo de la invención
La invención descrita aquí se refiere a un gen nuevo y a la proteína codificada y antígeno tumoral, denominado STEAP-2, y a métodos de diagnóstico y terapéutico y a composiciones útiles en el tratamiento de varios cánceres, particularmente incluyendo cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, cáncer de ovario y cáncer pancreático.
Antecedentes de la invención
El cáncer es la segunda causa de muerte humana próxima a la enfermedad coronaria. En el mundo, millones de personas mueren de cáncer cada año. Sólo en los Estados Unidos, el cáncer causa la muerte de casi medio millón de personas anualmente, con 1,4 millones de nuevos casos diagnosticados cada año. Mientras que las muertes por enfermedad coronaria han disminuido significativamente, las resultantes del cáncer se encuentran generalmente en ascenso. En la parte inicial del próximo siglo, se prevé que el cáncer sea la causa principal de muerte.
En el mundo, diversos cánceres destacan como enfermedades mortales principales. En particular, los carcinomas de pulmón, próstata, mama, colon, páncreas y ovarios representan las causas principales de muerte por cáncer. Estos y prácticamente todos los carcinomas comparten una característica letal común. Con muy pocas excepciones, la enfermedad metastásica de un carcinoma es mortal. Además, incluso para aquellos pacientes de cáncer que sobreviven inicialmente a sus cánceres primarios, la experiencia común ha demostrado que sus vidas quedan significativamente alteradas. Muchos pacientes de cáncer experimentan ansiedades impulsadas por la conciencia de la posible recaída o fallo en el tratamiento. Muchos pacientes de cáncer experimentan debilidades físicas después del tratamiento. Muchos pacientes de cáncer experimentan una recaída.
En el mundo, el cáncer de próstata es el cuarto cáncer más frecuente en los hombres, En norte América y el norte de Europa, es de lejos el cáncer masculino más común y es la segunda causa principal de muerte por cáncer en los hombres. Sólo en los Estados Unidos, por encima de 40.000 hombres mueren anualmente de esta enfermedad - siguiendo sólo al cáncer de pulmón. A pesar de la magnitud de estas cifras, no existe aún un tratamiento eficaz para el cáncer de próstata metastásico. La prostatactomía quirúrgica, la terapia por radiación, la terapia de ablación de hormonas, y la quimioterapia continúan siendo las modalidades de tratamiento principales. Desafortunadamente, estos tratamientos son inefectivos para muchos y se asocian frecuentemente con consecuencias indeseables.
En la parte del diagnóstico, la falta de un marcador de tumor de próstata que pueda detectar de manera precisa tumores localizados en una fase inicial, sigue siendo una limitación significativa en el tratamiento de esta enfermedad. Aunque el ensayo PSA de suero ha sido una herramienta muy útil, se considera ampliamente que carece de especificidad y utilidad general en varios aspectos importantes.
El progreso en la identificación de marcadores específicos adicionales para el cáncer de próstata se ha mejorado mediante la generación de xenoinjertos de cáncer de próstata que pueden recapitular diferentes estadios de la enfermedad en ratones. Los xenoinjertos de LAPC (Cáncer de Próstata de Los Ángeles) son xenoinjertos de cáncer de próstata que han sobrevivido al paso en ratones con deficiencia inmune combinada severa (SCID) y han mostrado la capacidad de mimetizar la progresión de la enfermedad, incluyendo la transición de dependencia de andrógeno a independencia de andrógeno y el desarrollo de lesiones metastásicas (Patente de Estados Unidos No. 6,107,540; Klein et al., 1997, Nat. Med. 3: 402). Marcadores de cáncer de próstata identificados más recientemente incluyen PCTA-1 (Su et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7252), antígeno de célula madre de próstata (PSCA) (Reiter et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 1735), y STEAP (Hubert et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 14523).
Mientras que los marcadores identificados previamente, tales como PSA, PSM, PCTA y PSCA han facilitados los esfuerzos por diagnosticar y tratar el cáncer de próstata, existe la necesidad de identificar marcadores adicionales y dianas terapéuticas para la próstata y cánceres relacionados con el fin de mejorar adicionalmente el diagnóstico y la terapia.
Descripción resumida de la invención
La presente invención es tal como se define en las reivindicaciones que se acompañan.
La presente descripción se refiere a una familia nueva de antígenos transmembrana de tipo serpentina de la superficie celular. Dos de las proteínas en esta familia se expresan exclusivamente o predominantemente en la próstata, así como en el cáncer de próstata, y así los miembros de esta familia se han denominado "STEAP". (Antígeno epitelial de seis dominios transmembrana de la próstata). En la presente invención se describen y caracterizan STEAP humanos concretos. Los STEAP humanos muestran un grado elevado de conservación estructural entre los mismos, pero no muestran una homología estructural significativa con ninguna proteína humana conocida.
El miembro prototipo de la familia de STEAP, STEAP-1, parece ser una proteína de membrana de tipo Illa expresada predominantemente en células de próstata en tejidos humanos normales. Estructuralmente, STEAP-1 es una proteína de 339 aminoácidos caracterizada por una topología molecular de seis dominios transmembrana y extremos N y C intracelulares, que sugieren que se pliega en forma de "serpentina" en tres bucles extracelulares y dos intracelulares. La expresión de la proteína STEAP-1 se mantiene a niveles elevados a lo largo de varias etapas del cáncer de próstata. Además, la STEAP-1 se sobreexpresa ampliamente en otros cánceres humanos particulares. En particular, la expresión de la superficie celular de STEAP-1 se ha confirmado definitivamente en un conjunto de células de próstata y de cáncer de próstata, células de cáncer de pulmón, células de cáncer de vejiga y células de cáncer de colon. Estas características indican que STEAP-1 es un antígeno tumoral de la superficie celular específico expresado a niveles elevados en cánceres de próstata, vejiga, colon y otros cánceres.
Un segundo miembro de la familia, STEAP-2, es una proteína de 454 aminoácidos con una topología molecular prevista similar a la de STEAP-1. STEAP-2, como STEAP-1, es específica de la próstata en tejidos humanos normales y también se expresa en el cáncer de próstata. La alineación de los ORFs (marcos de lectura abiertos) de STEAP-2 y STEAP-1 muestra una identidad del 54,9% sobre un solapamiento de 237 residuos de aminoácidos y la localización de los seis dominios transmembrana putativos en STEAP-2 coinciden con la localización de los dominios transmembrana en STEAP-1 (figuras 11A-B).
STEAP-3 y STEAP-4 también se describen en la presente invención. Éstas también están relacionadas estructuralmente y muestran perfiles de expresión únicos. En particular, STEAP-3 y STEAP-4 parecen mostrar unos patrones de restricción de tejido diferentes. En las figuras 11A-B se muestra una alineación de las secuencias de aminoácidos de los cuatro STEAP.
La presente invención proporciona polinucleótidos que corresponden o son complementarios a todo o parte del gen de STEAP-2 tal como se describe aquí, ARNm, y/o secuencias codificantes, preferiblemente en forma aislada, incluyendo polinucleótidos que codifican las proteínas STEAP-2 y fragmentos de las mismas, ADN, ARN, híbrido ADN/ARN y moléculas relacionadas, polinucleótidos o oligonucleótidos complementarios al gen de STEAP-2 o secuencias de ARNm o partes de las mismas, y polinucleótidos u oligonucleótidos que se hibridan al gen de STEAP-2, ARNm o polinucleótidos que codifican STEAP-2. También se proporcionan medios para aislar ADNcs y los genes que codifican STEAP-2. También se proporcionan moléculas de ADN recombinante que contienen los polinucleótidos de STEAP-2, células transformadas o transducidas con dichas moléculas, y los sistemas del vector huésped para la expresión de los productos génicos de STEAP-2.
La presente invención proporciona proteínas STEAP-2 y fragmentos de polipeptídicos de las mismas. La presente invención proporciona además anticuerpos que se unen a proteínas STEAP tal como se reivindican y fragmentos polipeptídicos de las mismas, incluyendo anticuerpos policlonales y monoclonales, anticuerpos murinos y otros mamíferos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y totalmente humanos, y anticuerpos marcados con un marcador detectable y anticuerpos conjugados a radionucleidos/radioisótopos, toxinas u otras composiciones terapéuticas. La presente invención proporciona además métodos para detectar la presencia de polinucleótidos y proteínas de STEAP-2 en varias muestras biológicas, así como métodos para identificar células que expresan una STEAP-2. La presente invención proporciona además varias composiciones terapéuticas y estrategias para tratar el cáncer de próstata y otros cánceres, incluyendo, particularmente, terapia con anticuerpos, vacunas y pequeñas moléculas.
La presente invención proporciona además métodos para detectar la presencia de polinucleótidos y proteínas de STEAP-2 en varias muestras biológicas, así como métodos para identificar células que expresan STEAP-2. La presente invención proporciona además varias composiciones terapéuticas y estrategias para tratar el cáncer de próstata y otros cánceres, incluyendo, particularmente, terapia con anticuerpos, vacunas y pequeñas moléculas, para tratar cánceres de próstata. La naturaleza extracelular de esta proteína presenta una serie de estrategias terapéuticas que utilizan moléculas que reconocen STEAP-2 y su función, así como moléculas que reconocen otras proteínas, factores y ligandos que interaccionan con STEAP-2. Estas estrategias terapéuticas incluyen terapia con anticuerpos con anticuerpos anti-STEAP-2, terapias con moléculas pequeñas, y terapias con vacunas. Además, dada su expresión favorecida en el cáncer de próstata, la STEAP-2 es útil como marcador de diagnóstico, estadificación y/o pronóstico para el cáncer de próstata y, de manera similar, puede ser un marcador para otros cánceres que expresan esta proteína. La STEAP-1 también proporciona un marcador excelente para identificar la metástasis del cáncer de próstata.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Estructura de STEAP-1. 1A-B: Secuencias de nucleótidos y aminoácidos deducidas del ADNc del clon 10 de STEAP-1 (8P1B4) (SEC ID NOS. 1 y 2, respectivamente). La metionina de inicio se indica en negrita en la posición de residuos de aminoácidos 1 y los seis dominios transmembrana putativos se indican en negrita y están subrayados. 1C: Representación esquemática de la orientación transmembrana de STEAP-1; los residuos de aminoácidos que limitan los dominios extracelulares previstos se indican y corresponden al esquema de numeración de las figuras 1A-B. 1D: secuencia 5' no codificante rica en G/C del gen de STEAP-1 (SEC ID No. 3) determinada mediante el solapamiento de secuencias del clon 10 y el clon 3.
Figura 2. Expresión predominante de STEAP-1 en tejido de próstata. La primera cadena de ADNc se preparó de 16 tejidos normales, los xenoinjertos LAPC (4AD, 4AI y 9AD) y células HeLa. La normalización se realizó mediante PCR utilizando cebadores para la acción y GADPH. La PCR semicuantitativa, utilizando cebadores derivados de ADNc de STEAP-1 (8P1D4) (Figura 1A-B), muestra la expresión predominante de STEAP-1 en próstata normal y los xenoinjertos de LAPC. Se utilizaron los siguientes cebadores para amplificar STEAP-1:
8P1D4.1 5' ACTTTGTTGATGACCAGGATTGGA 3' (SEC ID NO: 4)
8P1D4.2 5' CAGAACTTCAGCACACACAGGAAC 3' (SEC ID NO: 5). 
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 2A. Los carriles son los siguientes: 1 cerebro; 2 próstata; 3 LAPC-4 AD; 4 LAPC-4 Al; 5 LAPC-9 AD; 6 HeLa; 7 ADNc murino; 8 control negativo.
Figura 2B. Los carriles son los siguientes: 1 cerebro; 2 corazón; 3 riñón; 4 hígado; 5 pulmón; 6 páncreas; 7 placenta; 8 músculo esquelético.
Figura 2C. Los carriles son los siguientes: 1 colon; 2 ovario; 3 leucocitos; 4 próstata; 5 intestino delgado; 6 bazo; 7 testículos; 8 timo.
Figura 3. Análisis de transferencia Northern de la expresión de STEAP-1 en varios tejidos humanos normales y xenoinjertos del cáncer de próstata, que muestra la expresión predominante de STEAP-1 en el tejido de próstata.
Figura 3A: Se sondaron dos transferencias Northern de tejidos múltiples (Clontech) con un clon 10 de ADNc de STEAP de longitud completa (Figura 1A-B). Los patrones del tamaño en kilobases (kb) se indican en el lateral. Cada carril contiene 2 \mug de ARNm que se normalizó utilizando una sonda de \beta-actina. A1 cerebro; A2 amígdala; A3 núcleo candado; A4 cerebelo; A5 córtex cerebral; A6 lóbulo frontal; A7 hipocampo; A8 bulbo raquídeo; B1 lóbulo occipital; B2 putamen; B3 sustancia negra; B4 lóbulo temporal; B5 tálamo; B6 núcleo sub-talámico; B7 médula espinal; C1 corazón; C2 aorta; C3 músculo esquelético; C4 colon; C5 vejiga; C6 útero; C7 próstata; C8 estómago; D1 testículos; D2 ovario; D3 páncreas; D4 glándula pituitaria; D5 glándula adrenal; D6 glándula tiroidal; D7 glándula salivar; D8 glándula mamaria; E1 riñón; E2 hígado; E3 intestino delgado; E4 bazo; E5 timo; E6 leucocitos periféricos; E7 nódulo linfático; E8 médula ósea; F1 apéndice; F2 pulmón; F3 tráquea; F4 placenta; G1 cerebro fetal; G2 corazón fetal; G3 riñón fetal; G4 hígado fetal; G5 bazo fetal; G6 timo fetal; G7 pulmón fetal.
Figura 3B: Transferencia de puntos (blot) de ARN de tejidos múltiples (Clontech, Human Master Blot cat# 7770-1) sondada con el clon 10 de ADNc de STEAP-1 (Figura 1A-B), que muestra una expresión aproximadamente cinco veces superior en la próstata en relación a otros tejidos con una expresión detectable significativa.
Figura 4A-B. Secuencia de nucleótidos (SEC ID NO: 6) del clon de GHT9 de STEAP-1 correspondiente al mensaje de 4 kb en las transferencias northern (Figura 3A). La secuencia contiene un intrón de 2399 pares de bases en relación con la secuencia del clon 10 de STEAP-1 de la Figura 1A-B; las regiones codificantes son los nucleótidos 96-857 y 3257-3510 (indicadas en negrita). El codón ATG de partida está en negrita y subrayado, el codón STOP está en negrita y subrayado, y los límites intrón-exón está subrayados.
Figura 5. Expresión de STEAP-1 en líneas de células de próstata y de cánceres múltiples y xenoinjertos de cáncer de próstata. Los filtros de xenoinjertos y líneas celulares se prepararon con 10 \mug de ARN total por carril. Las transferencias (blots) se analizaron utilizando el clon 10 de STEAP-1 como sonda. Todas las muestras de ARN se normalizaron mediante tinción con bromuro de etidio y el posterior análisis con una sonda de \beta-actina. Figura 5A: Expresión en varias líneas celulares de cáncer y xenoinjertos y próstata. Los carriles son los siguientes: (1) células PrEC, (2) tejido de próstata normal, (3) xenoinjerto LAPC-4 AD, (4) xenoinjerto LAPC-4 AI, (5) xenoinjerto LAPC-9 AD, (6) xenoinjerto LAPC-9 AI, (7) células LNCaP, (8) células PC-3, (9) células DU145, (10) células PANC-1, (11) células BxPC-3, (12) células HPAC, (13) células Capan-1, (14) células CACO-2, (15) células LOVO, (16) células T84, (17) células COLO-205, (18) células KCL-22 (leucemia linfocítica aguda, ALL), (19) células HT1197, (20) células SCABER, (21) células UM-UC-3, (22) células TCCSUP, (23) células J82, (24) células 5637, (25) células RD-ES (sarcoma de Ewing, EWS), (26) células CAMA-1, (27) células DU4475, (28) células MCF-7, (29) células MDA-MB-435s, (30) células NTERA-2, (31) células NCCIT, (32) células TERRA-1, (33) células TERA-2, (34) células A431, (35) células HeLa, (36) células OV-1063, (37) células PA-1, (38) células SW 626, (39) células CAOV-3. Figura 5B: Expresión de STEAP-1 en xenoinjertos de LAPC desarrollados subcutáneamente (sc) en comparación con la expresión en los xenoinjertos de LAPC-4 y LAPC-9 desarrollados en la tibia (it) de ratones.
Figura 6A-B. Análisis de transferencia western de la expresión de la proteína STEAP-1 en tejidos y múltiples líneas celulares. Se sondaron transferencias western de lisados celulares preparados a partir de xenoinjertos de cáncer de próstata y líneas celulares de próstata con una preparación de anticuerpos policlonales anti-STEAP-1. Las muestras contienen 20 \mug de proteína y se normalizaron con sondaje anti-Grb-2 de las transferencias western.
Figura 7A-B. Biotinilación de la superficie celular de STEAP-1. Figura 7A: Biotinilación de la superficie celular de células 293T transfectadas con vector solo o con vector que contiene ADNc que codifica STEAP-1 etiquetada con 6 His. Los lisados celulares se inmunoprecipitaron con anticuerpos específicos, se transfirieron a una membrana y se sondaron con estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante. Los carriles 1-4 y 6 corresponden a inmunoprecipitados a partir de lisados preparados a partir de células 293T que expresan STEAP-1. Los carriles 5 y 7 son inmunoprecipitados de células transfectadas en vector. Los inmunoprecipitados se realizaron utilizando los siguientes anticuerpos: (1) no inmune de ovejas, (2) anti-antígeno T grande, (3) anti-CD71 (receptor de transferrina), (4) anti-His, (5) anti-His, (6) anti-STEAP-1, (7) anti-STEAP-1. Figura 7B: Líneas celulares de cáncer de próstata (LNCaP, PC-3, DU145), cáncer de vejiga (UM-UC-3, TCCSUP) y cáncer de colon (LOVO, COLO) se biotinilaron (+) o no (-) antes de la lisis. Las transferencias western de proteínas purificadas en gel-estreptavidina se sondaron con anticuerpos anti-STEAP-1. Los marcadores de peso molecular se indican en kilodaltons (kD).
Figura 8. Análisis inmunohistoquímico de la expresión de STEAP-1 utilizando anticuerpo policlonal anti-STEAP-1. Los tejidos se fijaron en formalina al 10% y se insertaron en parafina. Las secciones se tejido se tiñeron utilizando anticuerpos policlonales anti-STEAP-1 dirigidos hacia el péptido N-terminal. Figura 8A: células LNCaP sondadas en presencia de péptido 1 STEAP-1 N-terminal, Figura 8B: LNCaP más péptido 2 no específico, Figura 8C: tejido de próstata normal, Figura 8D: carcinoma de próstata de grado 3, Figura 8E: carcinoma de próstata, Gleason 7 de grado 2, Figura 8F: xenoinjerto LAPC-9 AD, Figura 8G: vejiga normal, Figura 8H: colon normal. Todas las imágenes están aumentadas 400 veces.
Figura 9A-D. Secuencias de nucleótidos (SEC ID NO: 7) y de aminoácidos deducida (SEC ID NO: 8) del ADNc del clon GTD3 de STEAP-2 (98P4B6). La metionina de partida y la secuencia Kozak se indican en negrita y los dominios transmembrana putativos están subrayados en negrita. La 5' UTR muestra un contenido elevado de GC del 72%.
Figura 10A-E. Secuencias de nucleótidos (SEC ID NO: 9) y de aminoácidos deducida (SEC ID NO: 10) de STEAP-3. La región Kozak está en negrita.
Figura 10F. Secuencias de nucleótidos (SEC ID NOS: 11-14, respectivamente) de ls entradas de la base de datos dbEST correspondientes a los miembros adicionales de la familia STEAP obtenidos mediante la búsqueda con la secuencia de proteína de STEAP-1.
Figura 11. Comparaciones de la estructura primaria de las proteínas de la familia STEAP.
Figura 11A-B. Alineación de la secuencia de aminoácidos de de STEAPs 1-4 (SEC ID NOS: 2, 8, 10 y 15, respectiveamente) utilizando el programa PIMA (programa PIMA 1.4 en la dirección de Internet: <http:\\dot.imgen.bcm.tmc.
edu:9331\multi-align\multialign.html>); los dominios transmembrana identificados por el programa SOSUI (disponible en la dirección de Internet www.tuat.ac.jp\\simmitaku\adv_sosiu\submit.html) están en negrita. Se muestran los resultados de la agrupación por unión máxima por PIMA; se muestran en negrita los residuos idénticos.
Figura 11C. La alineación de la secuencia de aminoácidos de STEAP-1 (clon 10 de 8P1D4; SEC ID NO: 2) y STEAP-2 (clon GTD3 de 98P4B6; SEC ID NO: 8). La alineación se realizó utilizando el programa de alineación SIM de la página web del Baylor College of Medicine Search Launcher. Los dominios transmembrana se indican en negrita. Los resultados muestran una identidad del 54,9% en un solapamiento de 237 residuos (Valoración. 717.0; frecuencia de espacio: 0,0%).
Figura 11D. Alineación de las secuencias de aminoácidos de STEAP-1 (SEC ID NO: 2) y STEAP-3 (clon GTD3 de 98P4B6; SEC ID NO: 10). Los residuos idénticos se indican con asteriscos. Resultados SIM: identidad del 40,9% en un solapamiento de 264 residuos; Valoración: 625.0; frecuencia de espacio: 0.0%.
Figura 11E. Alineación de las secuencias de aminoácidos de STEAP-2 (SEC ID NO: 8) y STEAP-3 (clon GTD3 de 98P4B6; SEC ID NO: 10). Los residuos idénticos se indican con asteriscos. Resultados SIM: identidad del 47,8% en un solapamiento de 416 residuos; Valoración: 1075.0; frecuencia de espacio: 0,2%.
Figura 12. Expresión de ARNm de STEAP-3 en tejidos normales mediante transferencia northern (Figura 12A-B) y RT-PCR (Figura 12B). Para el análisis por RT-PCR, el ADNc de la primera cadena se preparó de 16 tejidos normales. La normalización se realizó por PCR utilizando cebadores para actina y GADPH. La PCR semicuantitativa, que utiliza cebadores para AI139607, muestra la expresión predominante de AI139607 en placenta y próstata después de 25 ciclos de amplificación. Se utilizaron los siguientes cebadores para amplificar AI139607:
AI139607.1 5'TTAGGACAACTTGATCACCAGCA 3' (SEC ID NO: 16)
AI139607.2 5'TGTCCAGTCCAAACTGGGTTATTT 3' (SEC ID NO: 17). 
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Figura 12A. Los carriles son los siguientes (de izquierda a derecha): Panel 1: corazón, cerebro, placenta, pulmón, hígado, músculo esquelético, riñón y páncreas; Panel 2: bazo, timo, próstata, testículos, ovario, intestino delgado, colon y glóbulos blancos.
Figura 12B. Los carriles son los siguientes: 1 cerebro; 2 corazón; 3 riñón; 4 hígado; 5 pulmón; 6 páncreas; 7 placenta; 8 músculo esquelético.
Figura 12C. Los carriles son los siguientes: 1 colon; 2 ovario; 3 leucocitos; 4 próstata; 5 intestino delgado; 6 bazo; 7 testículos; 8 timo.
Figura 13. Expresión predominante de STEAP-4/R80991 en hígado. El ADNc de la primera cadena se preparó de 16 tejidos normales. La normalización se realizó por PCR utilizando cebadores para actina y GADPH. La PCR semicuantitativa, que utiliza cebadores para R80991, muestra la expresión predominante de R80991 en hígado después de 25 ciclos de amplificación. Se utilizaron los siguientes cebadores para amplificar R80991:
R80991.1 5' AGGGAGTTCAGCTTCGTTCAGTC 3' (SEC ID NO: 18)
R80991.2 5' GGTAGAACTTGTAGCGGCTCTCCT 3' (SEC ID NO: 19). 
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Figura 13A. Los carriles son los siguientes: 1 cerebro; 2 corazón; 3 riñón; 4 hígado; 5 pulmón; 6 páncreas; 7 placenta; 8 músculo esquelético.
Figura 13B. Los carriles son los siguientes: 1 colon; 2 ovario; 3 leucocitos; 4 próstata; 5 intestino delgado; 6 bazo; 7 testículos; 8 timo.
Figura 14. Expresión predominante de STEAP-2 (98P4B6) en tejido de próstata. El ADNc de la primera cadena se preparó de 8 tejidos normales, los xenoinjertos de LAPC (4AD, 4AI y 9AD) y células HeLa. La normalización se realizó por PCR utilizando cebadores para actina y GADPH. La PCR semicuantitativa, que utiliza cebadores para 98P4B6, muestra la expresión predominante de 98P4B6 en próstata normal y los xenoinjertos de Se utilizaron los siguientes cebadores para STEAP II:
98P4BG.1 5' GACTGAGCTGGAACTGGAATTTGT 3' (SEC ID NO: 20)
98P4B6.2 5' TTTGAGGAGACTTCATCTCACTGG 3' (SEC ID NO: 21). 
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Figura 14A. Los carriles son los siguientes: 1 cerebro; 2 próstata; 3 LAPC-4 AD; 4 LAPC-4 AI; 5 LAPC-9 AD 6 HeLa; 7 ADNc murino 8 control negativo.
Figura 14B. Los carriles son los siguientes: 1 colon; 2 ovario; 3 leucocitos; 4 próstata; 5 intestino delgado; 6 bazo; 7 testículos; 8 timo.
Figura 15. Expresión del gen STEAP-2/98P4B6 específico de próstata en tejidos normales y en xenoinjertos de cáncer de próstata determinada mediante análisis de transferencia Northern. Los filtros de tejido normal humano (A y B) se obtuvieron de CLONTECH y contienen 2 \mug de ARNm por carril. El filtro del xenoinjerto (C) se prepare con 10 \mug de ARN total por carril. Las transferencias (blots) se analizaron utilizando el clon 98P4B6 derivado de SSH como sonda. Todas las muestras de ARN se normalizaron mediante tinción con bromuro de etidio.
Figura 15A. Los carriles son los siguientes: 1 corazón; 2 cerebro; 3 placenta; 4 pulmón; 5 hígado; 6 músculo esquelético; 7 riñón; 8 páncreas.
Figura 15B. Los carriles son los siguientes: 1 bazo; 2 timo; 3 próstata; 4 testículos; 5 ovario; 6 intestino delgado; 7 colon; 8 leucocitos.
Figura 15C. Los carriles son los siguientes: 1 próstata; 2 LAPC-4 AD; 3 LAPC-4 AI; 4 LAPC-9 AD; LAPC-9 AI.
Figura 16. Expresión de STEAP-2 en próstata y selección de las líneas celulares cancerosas determinadas mediante análisis de transferencia Northern. Los filtros de xenoinjerto y líneas celulares se prepararon con 10 \mug de ARN total por carril. Las transferencias se analizaron utilizando un clon 98P4B6 derivado de SSH como sonda. Todas las muestras de ARN se normalizaron mediante tinción con bromuro de etidio. Los carriles son los siguientes: 1 próstata; 2 LAPC-4 AD; 3 LAPC-4 AI; 4 LAPC-9 AD; 5 LAPC-9 AI; 6 TsuPr1; 7 DU145; 8 LNCaP; 9 PC-3; 10 LAPC-4 CL; 11 PrEC; 12 HT1197; 13 SCaBER; 14 UM-UC-3; 15 TCCSUP; 16 J82; 17 5637; 18 RD-ES; 19 293T; 20 PANC-1; 21 BxPC-3; 22 HPAC; 23 Capan-1; 24 LS180; 25 SK-CO-1; 26 CaCo-2; 27 LoVo; 28 T84; 29 Colo-205; 30 BT-20; 31 CAMA-1; 32 DU4475; 33 MCF-7; 34 MDA-MB-435s; 35 NTERA-2; 36 NCCIT; 37 TERA-1; 38 TERA-2; 39 A431; 40 HeLa; 41 OV-1063; 42 PA-1; 43 SW626; 44 CAOV-3.
Figura 17. Localización cromosómica de los miembros de la familia de STEAP. La localización cromosómica de los genes de STEAP descritos aquí se determinó utilizando el panel de híbridos de radiación GeneBridge4 (Research Genetics, Huntsville Al). La localización para STEAP-2 y AI139607 se realiza utilizando panel de híbridos de radiación Stanford G3 (Research Genetics, Huntsville Al).
Figura 18. Representación esquemática de los límites intrón-exón en el ORF del gen de STEAP-1 humano. Se identificaron un total de 3 intrones (i) y 4 exones (e).
Figura 19. Análisis de zootansferencia southern de gen de STEAP-1 en varias especies. Se preparó ADN genómico de diferentes organismos incluyendo, humano, mono, perro, ratón, pollo y Drosophila. Se digirieron diez microgramos de cada muestra de ADN con EcoRI, se transfirieron en nitrocelulosa y se sondaron con una sonda de STEAP-1. Los patrones de tamaño se indican en el lateral en kilobases (kb).
Figura 20. Análisis de transferencia southern de BAC de ratón con una sonda de STEAP-1. El ADN se preparó a partir de células humanas para aislar el ADN genómico y de clon BAC de ratón (12P11) que contiene el gen de STEAP de ratón. Cada muestra de ADN se digirió con EcoRI, se transfirió en nitrocelulosa y se sondó. Ocho microgramos de ADN genómico se compararon con 250 ng de ADN de BAC de ratón. Los carriles son los siguientes: (1) cadena de 1 kb; (2) genómico femenino humano; (3) 12P11 BAC mus; (4) genómico femenino humano; (5) 12P11 BAC mus; (6) 3T3.
Figura 21A. Tinción inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo policlonal de oveja dirigido contra STEAP-1 y que muestra tinción pericelular en una muestra de cáncer de vejiga.
Figura 21B. Tinción inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo policlonal de oveja dirigido contra STEAP-1 y que muestra tinción pericelular en una segunda muestra de cáncer de vejiga.
Figura 21C. Tinción inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo policlonal de oveja dirigido contra STEAP-1 y que muestra tinción pericelular en una muestra de cáncer de pulmón.
Figura 21D. Tinción inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo policlonal de oveja dirigido contra STEAP-1 y que muestra tinción pericelular en una segunda muestra de cáncer de pulmón.
Figura 22A. Expresión de STEAP-2 en próstata normal mostrada mediante hibridación in situ de ARN con una sonda antisentido.
Figura 22B. Expresión de STEAP-2 en próstata normal mediante hibridación in situ de ARN utilizando una sonda de sentido como control.
Figura 23A. Expresión de STEAP-2 en cáncer de próstata mostrada mediante hibridación in situ de ARN con una sonda antisentido.
Figura 23B. Expresión de STEAP-2 en el control de cáncer de próstata para hibridación in situ de ARN utilizando una sonda de sentido.
Figura 24. Expresión de STEAP-2 en varios tejidos de cáncer examinada utilizando RT-PCR. El carril 1 representa una muestra de un xenoinjerto de LAPC4 AD, el carril 2 es un xenoinjerto de LAPC9 AD; el carril 3 es un xenoinjerto de LAPC9 AD2 (desarrollado con un explante óseo humano); el carril 4 es LAPC9 AD IT (desarrollado intratibialmente); el carril 5 es tejido agrupado de pacientes con cáncer de colon; el carril 6 es tejido agrupado de pacientes con cáncer de pulmón; M representa un carril marcador; el carril 7 es tejido de próstata normal de un paciente; el carril 8 es tejido de cáncer de próstata de un paciente; el carril 9 es tejido agrupado de pacientes con cáncer de riñón; el carril 10 es tejido agrupado de pacientes con cáncer de vejiga; el carril 11 son células HeLa; y el carril 12 es un blanco con agua.
Figura 25. Análisis de transferencia de puntos (dot) de ARN de la expresión de STEAP-2 en 76 tejidos normales, que muestra la expresión específica de próstata. Fuentes de tejido de ARN: A1 cerebro completo; A2 cerebelo, izquierdo; A3 sustancia negra; A4 corazón; A5 esófago; A6 colon, transversal; A7 riñón; A8 pulmón; A9 hígado; A10 HL60, leucemia; A11 cerebro fetal; B1 córtex cerebral; B2 cerebelo, derecho; B3 núcleo accumbens; B4 aorta; B5 estómago; B6 colon, descendente; B7 músculo esquelético; B8 placenta; B9 páncreas; B10 HeLa, S3; B11 corazón fetal; C1 lóbulo frontal; C2 cuerpo calloso; C3 tálamo; C4 atrio, izquierdo; C5 duodeno; C6 recto; C7 bazo; C8 vejiga; C9 glándula adrenal; C10 K562, leucemia; C11 riñón fetal; D1 lóbulo parietal; D2 amígdala; D3 glándula pituitaria; D4 atrio, derecho; D5 yeyuno; D6 blanco; D7 timo; D8 útero; D9 glándula tiroides; D10 MOLT-4, leucemia; D11 hígado fetal; E1 lóbulo occipital; E2 núcleo caudado; E3 médula espinal; E4 ventrículo, izquierdo; E5 íleo; E6 blanco; E7 leucocitos; E8 próstata; E9 glándula salivar; E10 RAJI, linfoma; E11 bazo fetal; F1 lóbulo temporal; F2 hipocampo; F3 blanco; F4 ventrículo, derecho; F5 válvula ileocecal; F6 blanco; F7 nódulo linfático; F8 testículos; F9 glándula mamaria; F10 DAUDI, linfoma; F11 timo fetal; G1 giro paracentral; G2 bulbo raquídeo; G3 blanco; G4 septum interventricular; G5 apéndice; G6 blanco; G7 médula ósea; G8 ovario; G9 blanco; G10 SW480, cáncer de colon; G11 pulmón fetal; H1 pons; H2 putamen; H3 blanco; H4 punta del corazón; H5 colon, ascendente; H6 blanco; H7 tráquea; H8 blanco; H9 blanco; H10 A549, cáncer de pulmón; H11 blanco.
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Figura 26. Transferencia western con anti-fosfotirosina (4G10 mAb) que muestra que la expresión de STEAP-2 en células PC3 es suficiente para inducir la fosforilación de varias proteínas en residuos de tirosina, incluyendo p150, p120 y p75. Un revestimiento utilizando Ab anti-Grb2 muestra que el gel se cargó por igual.
Figura 27A. La transferencia western que utiliza anti-fosfo-p38 que muestra que la expresión de STEAP-1 o STEAP-2 en células PC3 activa la p38 quinasa, en comparación con los controles neo-Pc3. TNF-NaSaI y NaSaI, activadores p38 conocidos, sirvieron como controles positivos.
Figura 27B. Transferencia western, como en la Figura 27A, que utiliza anti-p38 para demostrar la carga igual de proteína en los geles.
Figura 28A. Transferencia western que utiliza anti-fosfo-ERK para examinar la activación del mecanismo de ERK en FBS al 1%. Las células PC3 que expresan Ras (control positivo), STEAP-1, STEAP-2 o neo (control negativo), se desarrollaron en FBS al 1%. Los resultados muestran que, aunque la expresión del gen de control neo no tiene efecto en la fosforilación de ERK, la expresión de STEAP-1 y la STEAP-2 induce la fosforilación de ERK. Se utilizó un anticuerpo anti-ERK para confirmar la presencia de ERK en todos los carriles.
Figura 28B. Transferencia western que utiliza anti-fosfo-ERK para examinar la activación del mecanismo de ERK en FBS al 0,1% y 10%. Las células PC3 que expresan STEAP-1 o neo (control negativo), se desarrollaron en FBS al 0,1% o 10%. Los resultados confirman que la expresión de STEAP-1 es suficiente para inducir la activación de la cascada de señalización de ERK.
Figura 29. Señalización en células PC3-STEAP-1 mediada por odorantes.
Figura 29A. La transferencia western anti-fosfotirosina de células PC3, que expresan de forma estable neo, se desarrolló durante la noche en FBS al 0,1% para permitir la ocupación del receptor, y a continuación, se trató con citralva, etilvanilina o IBMP. El tratamiento con FBS al 10% se utilizó como control.
Figura 29B. La transferencia western anti-fosfotirosina de células PC3, que expresan de forma estable STEAP-1, se trató tal como se describe para la Figura 29A. Los resultados muestran que citralva y etilvanilina inducen específicamente la fosforilación de p136-140 en células PC3-STEAP-1. Además, la citralva induce la fosforilación de novo de una proteína a 160-200kDa.
Figura 30. Activación de la cascada de ERK mediante odorantes. La transferencia western anti-ERK de células PC3, que expresa de forma estable neo o STEAP-1, se desarrolló durante la noche en FBS al 0,1%. A continuación, las células se trataron con citralva durante 5 minutos. El tratamiento con FBs al 10% se utilizó como control. Los lisados de células completas se utilizaron como control. Los lisados de células completas se analizaron utilizando anti-fosfo-ERK. Los resultados muestran que la citralva induce la fosforilación de ERK, y, por tanto, la activación del mecanismo de ERK, de una manera específica de STEAP-1.
Figura 31A. Análisis inmunohistoquímico anti-STEAP-1 en el tumor de cáncer de próstata ortotópico de LAPC-9 (200 aumentos). Las células que expresan STEAP-1 muestran tinción perinuclear.
Figura 31B. Análisis inmunohistoquímico anti-STEAP-1 en la metástasis de nódulos linfáticos de LAPC-9 (400 aumentos). Las células que expresan STEAP-1 muestran tinción perinuclear.
Figura 31C-D. Análisis inmunohistoquímico anti-STEAP-1 en la metástasis de pulmón de LAPC-9 (800 aumentos). Las células que expresan STEAP-1 muestran tinción perinuclear.
Figura 31E-F. Análisis inmunohistoquímico anti-PSA en una micrometástasis en pulmón de cáncer de próstata de LAPC-9 (800 aumentos). Las células que expresan PSA muestran tinción perinuclear.
Figura 32A. Detección inmunohistoquímica de STEAP-1 que muestra una tinción pericelular intensa en la metástasis de nódulos linfáticos de un paciente humano.
Figura 32B. Detección inmunohistoquímica de STEAP-1 que muestra una tinción pericelular intensa en la metástasis ósea de un paciente humano.
Figura 33. Transferencia western que muestra que el pAb anti-STEAP-1 murino reconoce la proteína STEAP-1 en líneas celulares modificadas y proteína STEAP-1 endógena en células LNCaP. Los lisados de células LNCaP y 293T transfectadas con STEAP-1 etiquetada con pcDNA 3.1 MYC/HIS o vector vacío neo, y células RAT1 modificadas para expresar STEAP-1 o un gen de control neo, se separaron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a nitrocelulosa. A continuación, la transferencia se sometió a análisis western anti-STEAP utilizando una dilución 1:1000 de suero de ratones inmunizados con una proteína de fusión GST-STEAP-1.
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Descripción detallada de la invención
La presente descripción se refiere a una familia nueva de antígenos transmembrana de tipo serpentina de la superficie celular. Dos de las proteínas en esta familia se expresan exclusivamente o predominantemente en la próstata, así como en el cáncer de próstata, y así los miembros de esta familia se han denominado "STEAP". (Antígeno epitelial de seis dominios transmembrana de la próstata). En la presente invención se describen y caracterizan STEAP humanos concretos. Los STEAP humanos muestran un grado elevado de conservación estructural entre los mismos, pero no muestran una homología estructural significativa con ninguna proteína humana conocida. La presente descripción se refiere a métodos y composiciones para el diagnóstico y terapia del cáncer de próstata y otros cánceres, cuyos métodos utilizan polinucleótidos aislados que corresponden a genes de STEAP humanos, proteínas codificadas por los genes de STEAP y fragmentos de las mismas, y anticuerpos capaces de reconocer específicamente y unirse a proteínas STEAP.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos de la técnica, notaciones y otra terminología científica utilizada aquí pretenden tener los significados entendidos habitualmente por los expertos en la materia a la que pertenece la invención. En algunos casos, los términos con significados entendidos habitualmente se definen aquí por claridad y/o para una referencia preparada, y la inclusión de dichas definiciones en la presente invención no debería interpretarse necesariamente para representar una diferencia sustancial sobre lo que se entiende generalmente en la técnica. Las técnicas y procedimientos descritos aquí o a los que se hace referencia son bien entendidos en general y se utilizan habitualmente utilizando metodología convencional por los expertos en la materia, tal como, por ejemplo, las metodologías de clonación molecular ampliamente utilizadas descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd. Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Según sea apropiado, los procedimientos que implican el uso de kits y reactivos disponibles comercialmente se llevan a cabo generalmente según los protocolos y/o parámetros definidos por el fabricante a menos que se indique lo contrario.
Tal como se utiliza aquí, "cáncer de próstata avanzado", "cáncer de próstata localmente avanzado", "enfermedad avanzada" y "enfermedad localmente avanzada" significan cánceres de próstata que se han extendido a lo largo de la cápsula de la próstata y pretenden incluir la enfermedad en la etapa C según el sistema de la American Urological Association (AUA), la enfermedad en la etapa C1-C2 bajo el sistema de Whitmore-Jewett, y la enfermedad en la etapa T3-T4 y N+ bajo el sistema TNM (tumor, nódulo, metástasis). En general, la cirugía no se recomienda para pacientes con enfermedad localmente avanzada y estos pacientes presentan resultados sustancialmente menos favorables en comparación con pacientes que tienen un cáncer de próstata clínicamente localizado (confinado a un órgano). La enfermedad localmente avanzada se define clínicamente mediante evidencia palpable de induración más allá del límite lateral de la próstata, o la asimetría o induración por encima de la base de la próstata. El cáncer de próstata localmente avanzado actualmente se diagnostica patológicamente siguiendo una prostatectomía radical si el tumor invade o penetra la cápsula prostática, se extiende en el margen quirúrgico o invade las vesículas seminales.
Tal como se utiliza aquí, los términos "cáncer de próstata metastásico" significa cánceres de próstata que se han extendido a nódulos linfáticos regionales o a sitios distantes y pretenden incluir la enfermedad en la etapa D bajo el sistema AUA y la etapa TxNxM+ bajo el sistema TNM. Como en el caso del cáncer de próstata localmente avanzado, la cirugía generalmente no está indicada para pacientes con enfermedad metastásica, y la terapia hormonal (ablación de andrógeno) es la modalidad de tratamiento preferida. Los pacientes con cáncer de próstata metastásico finalmente desarrollan un estado refractario a andrógeno en 12 a 18 meses desde el inicio del tratamiento, y aproximadamente la mitad de estos pacientes mueren en 6 meses desde entonces. El sitio más común para la metástasis del cáncer de próstata es el hueso. La metástasis en hueso por el cáncer de próstata son, en general, característicamente osteoblásticos más que osteolíticos (es decir, dan lugar a una formación de huesos neta). Las metástasis en hueso se encuentran de manera más frecuente en la espina dorsal, seguido del fémur, pelvis, caja torácica, cráneo y húmero. Otros sitios comunes para la metástasis incluyen nódulos linfáticos, pulmón, hígado y cerebro. El cáncer de próstata metastásico se diagnostica habitualmente mediante una linfadenectomía pélvica abierta o laparoscópica, escaneo con radionucleidos de todo el cuerpo, radiografía esquelética y/o biopsia de la lesión ósea.
Tal como se utiliza aquí, el término "polinucleótido" significa una forma polimérica de nucleótidos de por lo menos 10 bases o parejas de bases de longitud, ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido, y pretende incluir formas de cadena única o doble de ADN.
Tal como se utiliza aquí, el término "polipéptido" significa un polímero de por lo menos 10 aminoácidos. A lo largo de la memoria, se utilizan las designaciones estándar de tres letras o una letra para aminoácidos.
Tal como se utiliza aquí, los términos "hibridar", "hibridando", "se hibrida" y similar, utilizados en el contexto de polinucleótidos, pretenden referirse a condiciones de hibridación convencionales, preferiblemente, tal como hibridación en formamida al 50%/6XSSC/SDS al 0,1% SDS/100 \mug/ml ssDNA, donde las temperaturas para la hibridación son superiores a 37ºC y las temperaturas para el lavado en 0,1XSSC/SDS al 0,1% están por encima de 55ºC, y más preferiblemente en condiciones de hibridación astringentes.
La "astringencia" de las reacciones de hibridación se determina fácilmente por un experto en la materia y generalmente es un cálculo empírico dependiente de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado, y la concentración de sal. En general, las sondas más largas requieren mayores temperaturas para una correcta hibridación, mientras que sondas más cortas necesitan temperaturas más bajas. La hibridación depende generalmente de la capacidad del AND desnaturalizado para rehibridarse cuando están presentes las cadenas complementarias en un medio por debajo de su temperatura de fusión. Cuanto mayor es el grado de homología deseada entre la sonda y la secuencia hibridable, mayor es la temperatura relativa que se puede utilizar. Como resultado, se deduce que temperaturas relativas superiores tenderían a hacer las condiciones de reacción más astringentes, mientras que temperaturas inferiores menos. Para detalles adicionales y explicación de la astringencia de reacciones de hibridación, véase Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).
"Condiciones astringentes" o "condiciones de astringencia elevada", definidas aquí, se pueden identificar por aquellas en las que: (1) se utilizan fuerza iónica baja y temperatura elevada para lavar, por ejemplo, cloruro sódico 0,015 M/citrato sódico 0,0015 M/dodecil sulfato sódico al 0,1% a 50ºC; (2) se utiliza durante la hibridación un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50% (v/v) con albúmina de suero bovino al 0,1%/Ficoll al 0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/tampón fosfato sódico 50 mM a pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75 mM 42ºC; o (3) utilizan formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato sódico 0,075 M), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), pirofosfato sódico al 0,1%, 5 x solución de Denhardt, ADNcon esperma de salmón sonicado (50 \mug/ml), SDS al 0,1%, y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2 x SSC (cloruro sódico/citrato sódico) y formamida al 50% a 55ºC, seguido de un lavado de alta astringencia que consiste en 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55ºC.
"Condiciones moderadamente astringentes" se pueden definir tal como se describen por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo, temperaturas, fuerza iónica y% SDS) menos astringentes que las descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente astringentes es incubación durante la noche a 37ºC en una solución que comprende formamida al 20%, 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM citrato trisódico), 50 mM fosfato sódico (pH 7,6), 5 x solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10%, y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón cortado desnaturalizado, seguido de lavado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37-50ºC. El experto en la materia reconocerá cómo ajustar a temperatura, la fuerza iónica, etc. según sea necesario para acomodar factores, tales como la longitud de la sonda y similares.
En el contexto de las comparaciones de las secuencias de aminoácidos, el término "identidad" se utiliza para expresar el porcentaje de los residuos de aminoácidos en las mismas posiciones relativas que son las mismas. También en este contexto, el término "homología" se utiliza para expresar el porcentaje de residuos de aminoácidos en las mismas posiciones relativas que son idénticas o son similares, utilizando el criterio de aminoácidos conservados del análisis BLAST, tal como se entiende en general en la técnica. Por ejemplo, los valores del % de identidad se pueden generar por WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology, 266: 460-480 (1996): http://blastwustl/edu/blast/READMEhtml). A continuación, se proporcionan más detalles relativos a las sustituciones de aminoácidos, que se consideran conservativas bajo dicho criterio.
A los largo de las subsecciones siguientes se proporcionan definiciones adicionales.
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Polinucleótidos de STEAP
En la presente invención se describen polinucléotidos correspondientes o complementarios a todo o parte de un gen de STEAP-2, ARNm y/o secuencia codificante, preferiblemente en forma aislada, incluyendo polinucleótidos que codifican una proteína STEAP-2 y fragmentos de la misma, ADN, ARN, híbrido ADN/AN, y moléculas relacionadas, polinucleótidos u oligonucleótidos complementarios a un gen o secuencia de ARNm de STEAP-2 o una parte de los mismos, y polinucleótidos u oligonucleótidos que se hibridan a un gen de STEAP-2, ARNm o a polinucleótidos que codifican STEAP-2 (colectivamente, "polinucleótidos de STEAP-2"). Tal como se utiliza aquí, los genes y proteínas de STEAP pretenden incluir los genes y proteínas de STEAP-1, STEAP-2 y STEAP-3, y el gen y proteína correspondiente del Banco de Genes de número de acceso R80991 (STEAP-4), y los genes y proteínas correspondientes con otras proteínas de STEAP y variantes estructuralmente similares de los anteriores. Dichas otras proteínas y variantes de STEAP tendrán generalmente secuencias codificantes que son altamente homogéneas a la secuencia codificante de STEAP y, preferiblemente, comprenderán por lo menos aproximadamente un 50% de identidad de aminoácidos y por lo menos aproximadamente un 60% de homología de aminoácidos (utilizando criterio BLAST), más preferiblemente que comprende una homología del 70% o superior (utilizando el criterio BLAST).
Las secuencias génicas de los miembros de la familia de STEAP descritas aquí codifican proteínas de STEAP que comparten dominios únicos de las secuencias de aminoácidos altamente conservadas que los distinguen de otras proteínas. Las proteínas que incluyen una o más de estos dominios únicos altamente conservados se pueden relacionar con los miembros de la familia de STEAP o pueden representar nuevas proteínas STEAP. En referencia a las Figuras 11A-B, que es una alineación de las secuencias de aminoácidos de las secuencias completas de las proteínas STEAP-1, STEAP-2 y STEAP-3, así como la secuencia de STEAP-4 parcial, está claro que las STEAP están estrechamente relacionadas a nivel estructural. En relación a la Figura 11C, que es una alineación de las secuencias de aminoácidos de las secuencias completas de proteínas STEAP-1 y STEAP-2, la estrecha conservación estructural es clara, particularmente en los dominios transmembranas previstos. Las secuencias de STEAP-1 y STEAP-2 comparten una identidad del 54,9% sobre un solapamiento de 237 aminoácidos. Las alineaciones de las secuencias de aminoácidos adicionales entre las STEAP se muestran en las figuras 11D y 11E. Estas alineaciones muestran que STEAP-1 y STEAP-3 son idénticas en un 40,9% sobre una región de 264 aminoácidos, mientras que STEAP-2 y STEAP-3 son idénticas en un 47,8% sobre una región de 416 aminoácidos.
Un polinucleótido de STEAP puede comprender un polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos de STEAP-1 humana tal como se muestra en las Fig. 1A-B, la secuencia de nucleótidos de STEAP-2 humana tal como se muestra en las Fig. 9A-D, la secuencia de nucleótidos de STEAP-3 humana tal como se muestra en las Fig. 10A-E, o la secuencia de nucleótidos de STEAP-4 tal como se muestra en las Fig. 10F, o una secuencia complementaria a las mismas, o un fragmento de polinucleótido de cualquiera de las anteriores. Otra realización comprende un polinucleótido que codifica las secuencias de aminoácidos de las proteínas STEAP-1, STEAP-2, STEAP-3 o STEAP-4, una secuencia complementaria a las mismas, o un fragmento de polinucleótido de cualquiera de las anteriores. Otra realización comprende un polinucleótido que es capaz de hibridarse bajo condiciones de hibridación astringentes al ADNc de STEAP-1 humano mostrado en las Fig. 1A-B, el ADNc de STEAP-2 humano mostrado en las Fig. 9A-D, el ADNc de STEAP-3 humano mostrado en las Fig. 10AE, o la STEAP-4 mostrada en la Fig. 10F, o a un fragmento de polinucleótido de las mismas.
Las realizaciones habituales descritas en la presente invención incluyen polinucleótidos de STEAP-2 que codifican partes específicas de una secuencia de ARNm de STEAP-2, tal como las que codifican la proteína y fragmentos de la misma. En la presente invención se describen polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 1 a aproximadamente el aminoácido 10 de una proteína STEAP mostrada en las figuras 11A-B, polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 20 a aproximadamente el aminoácido 30 de una proteína STEAP mostrada en las figuras 11A-B, polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 30 a aproximadamente el aminoácido 40 de una proteína STEAP mostrada en las figuras 11A-B, polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 40 a aproximadamente el aminoácido 50 de una proteína STEAP mostrada en las figuras 11A-B, polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 50 a aproximadamente el aminoácido 60 de una proteína STEAP mostrada en las figuras 11A-B, polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 60 a aproximadamente el aminoácido 70 de una proteína STEAP mostrada en las figuras 11A-B, polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 70 a aproximadamente el aminoácido 80 de una proteína STEAP mostrada en las figuras 11A-B, polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 80 a aproximadamente el aminoácido 90 de una proteína STEAP mostrada en las figuras 11A-B y polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 90 a aproximadamente el aminoácido 100 de una proteína STEAP mostrada en las figuras 11A-B, etc. Siguiendo este esquema, en la presente invención se describen polinucleótidos (de por lo menos 10 aminoácidos) que codifican partes adicionales de la secuencia de aminoácidos de una proteína STEAP. Dichas partes de una proteína STEAP incluyen los aminoácidos 100-339 de una proteína STEAP-1 mostrada en las figuras 11A-B, o los aminoácidos 100-454 de una proteína STEAP-2 mostradas en las figuras 11A-B, o los aminoácidos 100-459 de una proteína STEAP-3 mostrada en las figuras 11A-B, y los aminoácidos 100-133 de una proteína STEAP-4 mostrada en las figuras 11A-B. También se contemplan polinucleótidos que codifican partes más grandes de la proteína STEAP. Por ejemplo, se pueden generar polinucleótidos que codifican desde aproximadamente el aminoácido 1 (ó 20 ó 30 ó 40, etc.) a aproximadamente el aminoácido 20 (ó 30 ó 40 ó 50, etc.) de una proteína STEAP mostrada en las figuras 11A-B mediante una variedad de técnicas conocidas en el sector.
Las realizaciones ilustrativas adicionales descritas en la presente invención incluyen fragmentos de polinucleótidos de STEAP-2 que codifican uno o más motivos biológicos contenidos en la secuencia de la proteína STEAP-2. Los fragmentos de polinucleótidos descritos en la presente invención pueden codificar una o más de las regiones de STEAP que muestran homología con otros miembros de la familia de STEAP, tales como uno o más de los dominios transmembrana. Los fragmentos de polinucleótidos descritos aquí pueden codificar secuencias que son únicas a una o más variantes de empalme alternativo de STEAP. Los fragmentos de polinucleótidos descritos aquí pueden codificar una parte inmunogénica de una proteína STEAP. Un ejemplo de una parte inmunogénica de proteína STEAP es de los residuos de aminoácidos 14 a 28 de la secuencia de aminoácidos de STEAP-1 mostrada en las Fig. 1A-B (WKMKPRRNLEEDYL; SEC ID NO: 22).
Los polinucleótidos de los párrafos anteriores tienen un conjunto de diferentes usos específicos. Como las STEAP se expresan de manera diferencial en cáncer de próstata y otros cánceres, estos polinucleótidos se pueden utilizar en métodos que valoran el estado de los productos génicos de STEAP en tejidos normales frente a cancerosos. Habitualmente, los polinucleótidos que codifican regiones específicas de una proteína STEAP se pueden utilizar para valorar la presencia de perturbaciones (tales como eliminaciones, inserciones, mutaciones puntuales, etc.) en regiones específicas de los productos génicos de STEAP. Entre los ensayos de ejemplo se incluyen tanto ensayos RT-PCR como análisis de polimorfismos conformacional de cadena única (SSCP) (véase, por ejemplo,. Marrogi et al, J. Cutan. PathoL 26 (8): 369-378 (1999), ambas utilizan polinucleótidos que codifican regiones específicas de una proteína a examinar estas regiones en la proteína. También están disponibles ensayos y métodos para analizar secuencias para detectar polimorfismos de nucleótidos individuales (Irizarry, et al, 2000, Nature Genetics 26 (2): 223-236.)
Otras realizaciones contempladas específicamente descritas aquí son ADN genómico, ADNc, ribozimas y moléculas antisentido, incluyendo moléculas antisentido morfolino, así como moléculas de ácido nucleico basadas en un esqueleto alternado o incluyendo bases alternadas, tanto si son de origen natural como si son sintetizadas. Por ejemplo, las moléculas antisentido pueden ser ARNs u otras moléculas, incluyendo ácidos nucleicos peptídicos (PNA) o moléculas que no son ácidos nucleicos, tales como derivados de fosforotioato, que específicamente se unen a ADN o ARN de una manera dependiente de la pareja de bases. Un experto en la materia puede obtener fácilmente estas clases de moléculas de ácido nucleico utilizando los polinucleótidos de STEAP y las secuencias de polinucleótidos descritas aquí.
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La tecnología antisentido comprende la administración de oligonucleótidos exógenos que se unen a un polinucleótido diana situado en las células. El término "antisentido" se refiere al hecho de que dichos oligonucleótidos son complementarios a sus dianas intercelulares, por ejemplo, STEAP. Véase, por ejemplo, Jack Cohen, OLIGODEOXYNUCLEOTIDES, Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, 1989; and Synthesis 1: 1-5 (1988). Los oligonucleótidos antisentido de STEAP descritos aquí incluyen derivados, tales como S-oligonucleótidos (derivados de fosforotioato o S-oligos, véase Jack Cohen, supra), que muestran una mayor acción inhibidora del crecimiento de células cancerosas. Los S-oligos (fosforotioatos de nucleósidos) son análogos isoelectrónicos de un oligonucleótido (O-oligo) en el que un átomo de oxígeno no puente del grupo fosfato es sustituido por un átomo de azufre. Los S-oligos descritos aquí se pueden preparar mediante el tratamiento de los correspondientes O-oligos con 3H-1,2-benzoditiol-3-ona-1,1-dióxido, que es un reactivo de transferencia de azufre. Véase, Iyer, R. P. et al, J. Org. Chem. 55: 4693-4698 (1990); e Iyer, R. P. et al., J. Am. Chem. Soc. 112: 1253-1254 (1990). Oligonucleótidos antisentido de STEAP adicionales incluyen oligonucleótidos antisentido morfolino conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Partridge et al., 1996, Antisense & Nucleic Acid Drug Development 6: 169-175).
Los oligonucleótidos antisentido STEAP tal como se describen aquí pueden ser habitualmente ARN o ADN que son complementarios y se hibridan de forma estable con los primeros 100 codones N-terminales o los últimos 100 codones C-terminales, o se solapan con el sitio de inicio ATG, del genoma de STEAP o el correspondiente ARNm. Aunque no es necesaria la complementariedad absoluta; se prefieren altos grados de complementariedad. El uso de un oligonucleótido complementario a esta región permite la hibridación selectiva a ARNm de STEAP y no a ARNm que especifica otras subunidades reguladoras de proteína quinasa. Preferiblemente, los oligonucleótidos antisentido de STEAP son un fragmento de 15 a 30 unidades de la molécula de ADN antisentido que tiene una secuencia que se hibrida a ARNm de STEAP. Opcionalmente, el oligonucleótidos antisentido de STEAP es un oligonucleótido de 30 unidades que es complementario a una región en los primeros 10 codones N-terminales y los últimos 10 codones C-terminales de STEAP. Alternativamente, las moléculas antisentido se modifican para utilizar ribozimas en la inhibición de la expresión de STEAP. L. A. Couture & D. T. Stinchcomb; Trends Genet 12: 510-515 (1996).
Algunas realizaciones específicas adicionales incluyen cebadores y parejas de cebadores, que permiten la amplificación específica de los polinucleótidos de la invención o de cualquier parte específica de la misma, y sondas que se hibridan selectivamente o específicamente a moléculas de ácido nucleico de la invención o a cualquier parte de las mismas. Las sondas se pueden marcar con un marcador detectable, tal como, por ejemplo, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un quelante metálico o enzima. Dichas sondas y cebadores se pueden utilizar para detectar la presencia de un polinucleótidos de STEAP en una muestra y como medio para detectar una célula que expresa una proteína STEAP. Ejemplos de dichas sondas incluyen polinucleótidos que comprenden toda o parte de una secuencia de ADNc de STEAP humana mostrada en las figuras 1A-B (SEC ID NO: 1), Fig. 9A-D (SEC ID NO: 7) o Fig. 10A-E (SEC ID NO: 9). Ejemplos de parejas de cebadores capaces de amplificar específicamente ARNm de STEAP también se describen en los ejemplos siguientes. Tal como se entenderá por un experto en la materia, se pueden preparar un gran número de cebadores diferentes y sondas en base a las secuencias proporcionadas aquí y se utilizan de manera eficaz para amplificar y/o detectar un ARNm de STEAP.
Tal como se utiliza aquí, se dice que un polinucleótido es "aislado" cuando está sustancialmente separado de polinucleótidos contaminantes que corresponden o son complementarios a genes diferentes del gen de STEAP o que codifica polipéptidos diferentes del producto génico de STEAP o fragmentos de los mismos. Un experto en la materia puede utilizar fácilmente procedimientos de aislamiento de ácidos nucleicos para obtener un polinucleótido de STEAP aislado.
Los polinucleótidos de STEAP descritos aquí son útiles para un conjunto de objetivos, incluyendo, pero sin limitación, su uso como sondas y cebadores para la amplificación y/o detección del gen o genes de STEAP, ARNm, o fragmentos de los mismos; como reactivos para el diagnóstico y/o pronóstico del cáncer de próstata y otros cánceres; como herramientas para identificar moléculas que inhiben la entrada de calcio específicamente en células de la próstata; como secuencias codificantes capaces de dirigir la expresión de polipéptidos STEAP; como herramientas para modular o inhibir la expresión del gen o genes de STEAP y/o la traducción del transcrito o transcritos de STEAP; y como agentes terapéuticos.
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Características moleculares y bioquímicas de las STEAP
La presente descripción se refiere a una familia nueva de proteínas, denominadas STEAP. En la presente invención se describen específicamente cuatro STEAP mediante las características estructurales, moleculares y bioquímicas. Tal y como se describe en los ejemplos que se indican, las STEAP se han caracterizado de diversas maneras. Por ejemplo, se realizaron análisis de secuencias codificantes de nucleótidos y de aminoácidos con el fin de identificar elementos estructurales conservados en la familia de STEAP. Se realizaron análisis de RT-PCT y transferencia Northern amplios de ARNm de STEAP con el fin de establecer el rango de tejidos normales y cancerosos que expresan los diversos mensajes de STEAP. Se realizaron análisis de transferencia Western, inmunohistoquímico y citrometria de flujo para determinar los perfiles de expresión de proteína, la localización en la superficie celular y topología molecular general de STEAP.
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El miembro prototipo de la familia de STEAP, STEAP-1, es una proteína transmembrana de seis dominios de la superficie celular de 339 aminoácidos con una homología no identificable con ninguna proteína humana conocida. Las secuencias de nucleótidos de ADNc y de aminoácidos deducida de STEAP-1 humana se muestran en Fig. 1A-B. Un esquema topológico general de la proteína STEAP-1 integrada en la membrana celular se muestra en Fig. 1B. La expresión de STEAP-1 es predominantemente específica en tejidos normales. Específicamente, un análisis amplio de la expresión de ARNm y proteínas de STEAP-1 en tejidos humanos normales muestra que la proteína STEAP-1 se expresa predominantemente en próstata y, en un grado mucho más pequeño, en vejiga. El ARNm de STEAP-1 también es relativamente específico de próstata, con sólo un nivel de expresión muy bajo detectado en otros tejidos tejidos normales. En el cáncer, el ARNm y proteína de STEAP-1 se expresan de manera consistente a niveles elevados en cáncer de próstata (incluyendo tumores dependientes e independientes de andrógeno) y durante todas las etapas de la enfermedad. La STEAP-1 también se expresa en otros cánceres. Específicamente, el ARNm de STEAP-1 se expresa a niveles muy elevados en cáncer de vejiga, colon, pancreático y ovario (así como otros cánceres). Además, la expresión en la superficie celular de la proteína STEAP-1 se ha establecido en cánceres de próstata, vejiga, pulmón y colon. Por lo tanto, la STEAP-1 tiene todas las características distintivas de una Diana diagnóstica y terapéutica excelente para el tratamiento de ciertos cánceres, incluyendo particularmente carcinomas de próstata,
colon y vejiga.
Un segundo miembro de la familia, STEAP-2, es una proteína de 454 aminoácidos codificada por un gen distinto y que tiene una topología molecular prevista similar a la STEAP-1. Las secuencias de nucleótidos de ADNc y de aminoácidos deducida de STEAP-2 se muestran en Fig. 9A-D. La alineación de aminoácidos de las secuencias de STEAP-1 y STEAP-2 muestra una grado elevado de conservación estructural (identidad del 54,9% sobre un solapamiento de 237 residuos de aminoácidos y las localizaciones de los seis dominios transmembrana putativos en STEAP-1 y STEAP-2 coinciden (Figs. 11A-B, 11C). La homología estructural entre estas STEAP-1 y STEAP-2 es máxima en las regiones abarcadas por el primer bucle extracelular putativo hasta el quinto dominio transmembrana. Sin embargo, ciertas diferencias estructurales significativas entre STEAP-1 y STEAP-2 son claras. Por ejemplo, STEAP-2 muestra un extremo N-terminal intracelular largo de 205 aminoácidos (en comparación con 69 aminoácidos en STEAP-1) y un extremo C-terminal intracelular corto de 4 aminoácidos (en comparación con 26 aminoácidos en STEAP-1). Además, los genes de STEAP-1 y STEAP-2 se localizan en el cromosoma 7, pero en diferentes brazos. Estas diferencias podrían implicar diferencias significativas en la función y/o interacción con mecanismos de señalización intracelular.
La STEAP-2 se expresa sólo en próstata normal entre los tejidos humanos analizados (Figs. 14 y 15) y también se expresa en cáncer de próstata (figura 15), y de este modo, muestra cierta similitud en el perfil de expresión a STEAP-1. Sin embargo, STEAP-2 muestra un perfil de expresión de ARNm diferente en relación con STEAP-1 en muestras de cáncer de próstata (compara figuras 3 y 15) y en otros cánceres que no son de próstata analizados (comparar las figuras 5 y 16). Estas diferencias en los perfiles de expresión de STEAP-1 y STEAP-2 sugieren que se regulan de manera diferencial.
STEAP-3 y STEAP-4 parecen estar estrechamente relacionadas tanto con STEAP-1 y STEAP-2 a nivel estructural y ambas parecen ser también proteínas transmembrana. STEAP-3 está más relacionada con STEAP-2 (47,8% de identidad) que con STEAP-1 (40,9% de identidad). STEAP-3 y STEAP-4 muestran perfiles de expresión únicos. STEAP-3, por ejemplo, parece tener un patrón de expresión que está predominantemente limitado a placenta y, en menor grado, se observa la expresión en próstata, pero no en otros tejidos normales analizados. STEAP-4 parece expresarse predominantemente en hígado mediante análisis RT-PCR. Ni STEAP-3 ni STEAP-4 parecen expresarse en xenoinjertos de cáncer de próstata que muestran un nivel elevado de expresión de STEAP-1 y STEAP-2.
Las proteínas STEAP muestran características de proteínas implicadas en mecanismos de señalización celular. Específicamente, STEAP-1 y STEAP-2, cuando se expresan en células PC3, activan la fosforilación de p38, una proteína implicada en la cascada de señalización de MAPK. Además, la expresión de STEAP-2 induce la fosforilación de tirosina, y STEAP-2 media la activación de la tirosina quinasa en células tratadas con odorantes. Estos hallazgos dan soporte al uso de moléculas relacionadas con STEAP y células modificadas para expresar STEAP en ensayos de alto rendimiento para identificar moléculas capaces de alterar los mecanismos de señalización celular, conduciendo a la identificación de nuevos agentes terapéuticos. En una realización, el ensayo identifica moléculas capaces de inhibir la función de STEAP, cuyas moléculas son capaces así de modular la progresión del cáncer u otra enfermedad asociada con el crecimiento celular desregulado.
Tres de las cuatro STEAP descritas aquí se localizan en el cromosoma humano 7 (STEAP-1, -2 y 3). De forma destacada, STEAP-1 se localiza en 7p22 (7p22.3), una región amplia de ganancia alélica descrita para cánceres de próstata primarios y reincidentes (Visakorpi et al., 1995 Cancer Res. 55: 342, Nupponen et al., 1998 American J. Pathol. 153: 141), sugiriendo que el favorecimiento de la expresión de STEAP-1 en cáncer podría incluir mecanismos genómicos. Además, tanto STEAP-2 como STEAP-3 se localizan en el cromosoma 7q21, sugiriendo que estos dos genes surgieron por duplicación génica.
Otras moléculas de la superficie celular que contienen seis dominios transmembrana incluyen canales iónicos (Dolly and Parcej, 1996 J Bioenerg Biomembr 28: 231) y canales de agua o acuaporinas (Reizer et al., 1993 Crit Rev Biochem Mol Biol. 28: 235). Los estudios estructurales muestran que ambos tipos de moléculas se ensamblan en complejos tetraméricos para formar canales funcionales (Christie, 1995, Clin Exp Pharmacol Physiol 22: 944, Walz et al., 1997 Nature 387: 624, Cheng et al., 1997 Nature 387: 627). La tinción inmunohistoquímica de STEAP-1 en la glándula de la próstata parece concentrarse en los límites célula-célula con menos tinción detectada en la parte luminal. Esto puede sugerir un papel para STEAP-1 en las uniones estrechas, uniones comunicantes, comunicación celular, adhesión o como proteína de transporte.
Para analizar estas posibilidades, los ovocitos de xenopus (u otras células) que expresan STEAP se puede analizar utilizando experimentos de fijación de voltaje (voltaje clamp) y control en parche (patch-clamp) para determinar si STEAP funciona como canal iónico. El volumen de las células de ovocitos también se puede medir para determinar si STEAP muestra propiedades de canales de agua. Si las STEAP funcionan como proteínas de canal o de unión comunicante, pueden actuar como dianas excelentes para la inhibición utilizando, por ejemplo, anticuerpos, moléculas pequeñas y polinucleótidos capaces de inhibir la expresión o función. El patrón de expresión limitado en tejido normal, y los niveles elevados de expresión en tejido canceroso sugieren que la interferencia con la función de STEAP puede matar selectivamente células cancerosas.
Dado que la familia de genes de STEAP se expresa predominantemente en tejido epitelial, parece posible que las proteínas STEAP funcionen como canales iónicos, proteínas de transporte o proteínas de unión comunicante en la función de las células epiteliales. Los canales iónicos se han implicado en la proliferación e invasión de células del cáncer de próstata (Lalani et al., 1997, Cancer Metastasis Rev 16: 29). Las células de cancer de próstata de rata y humano contienen una subpoblación de células con niveles de expresión más elevados o más bajos de canales de sodio. Los niveles más elevados de la expresión de canales de sodio se correlacionan con una invasión más agresiva in vitro (Smith et al, 1998, FEBS Lett. 423: 19). De manera similar, se ha observado que un bloqueo específico de los canales de sodio inhibe la invasión de células PC-3 in vitro (Laniado et al, 1997, Am. J. Pathol. 150: 1213), mientras que una inhibición específica de los canales de potasio en células LNCaP inhibía la proliferación celular (Skryma et al., 1997, Prostate 33: 112). Estos hechos sugieren un papel para los canales de iones en el cáncer de próstata y también demuestran que las moléculas pequeñas que inhiben la función del canal iónico pueden interferir con la proliferación del cáncer de próstata.
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Aislamiento de las moléculas de ácido nucleico que codifican STEAP
Las secuencias de ADNc de STEAP descritas aquí permiten el aislamiento de otros polinucleótidos que codifican el producto o productos génicos de STEAP, así como el aislamiento de polinucleótidos que codifican homólogos de productos génicos de STEAP, isoformas con empalme alternativo, variantes alélicas, y formas mutantes del producto génico de STEAP. Se conocen diversos métodos de clonación molecular que se pueden utilizar para aislar ADNcs de longitud completa que codifican un gen de STEAP. (Véase, por ejemplo, Sambrook, J. et al Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2d edition., Cold Spring Harbor Press, New York, 1989; Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel et al, Eds., Wiley and Sons, 995). Por ejemplo, se pueden utilizar de manera conveniente metodologías de clonación de fagos lambda, utilizando sistemas de clonación disponible comercialmente (por ejemplo, Lambda ZAP Express, Stratagene). Los clones de fagos que contiene ADNc de genes de STEAP se pueden identificar mediante sondeo con ADNc de STEAP marcado o un fragmento del mismo. Por ejemplo, en una realización, un ADNc de STEAP o una parte del mimo se puede sintetizar y utilizar como sonda para recuperar ADNc de solapamiento y de longitud completa correspondientes a un gen de STEAP. El propio gen de STEAP se puede aislar mediante cribado de bibliotecas de ADN genómico, bibliotecas de cromosomas artificiales bacterianos (BACs), bibliotecas de cromosomas artificiales de levadura (YACs), y similares, con sondas de ADN de STEAP o cebadores.
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Moléculas de adn recombinante y sistemas huésped-vector
Se describen en la presente invención moléculas de ADN o ARN recombinante que contienen un polinucleótido de STEAP, incluyendo, pero sin limitación, fagos, plásmidos, fagémidos, cósmidos, YACs, BACs, así como varios vectores virales y no virales conocidos en la técnica, y células transformadas o transfectadas con dichas moléculas de ADN o ARN recombinantes. Tal como se utiliza aquí, una molécula de ADN o ARN recombinante es una molécula de ADN o ARN que se ha sometido a manipulación molecular in vitro. Los métodos para generar dichas moléculas son bien conocidos (véase, por ejemplo, Sambrook et al, 1989, supra).
Se describe en la presente invención un sistema de húesped-vector que comprende una molécula de ADN recombinante que contiene un polinucleótido de STEAP en una célula huésped procariota o eucariota adecuada. Ejemplos de dichas células huésped eucariotas adecuadas incluyen una célula de levadura, una célula vegetal, o una célula de animal, tal como una célula de mamífero o una célula de insecto (por ejemplo, una célula infectable con baculovirus, tal como una célula Sf9). Ejemplos de dichas células de mamífero adecuadas incluyen varias líneas celulares de cáncer de próstata, tales como LNCaP, PC-3, DU145, LAPC-4, TsuPr1, otras líneas de células de cáncer de próstata transfectable o transducible, así como un conjunto de células de mamífero utilizadas rutinariamente para la expresión de proteínas recombinantes (por ejemplo, células COS, CHO, 293, 293T). Más particularmente, un polinucleótido que comprende una secuencia codificante de una STEAP se puede utilizar para generar proteínas de STEAP o fragmentos de las mismas utilizando cualquier conjunto de sistemas de huésped-vector utilizados rutinariamente y ampliamente conocidos en la técnica.
Están disponibles una amplia variedad de sistemas de huésped-vector adecuados para la expresión de proteínas STEAP o fragmentos de las mismas, véase, por ejemplo, Sambrook et al, 1989, supra; Current Protocols in Molecular Biology, 1995, supra). Los vectores preferidos para la expresión en mamíferos incluyen, pero sin limitación, pcDNA 3.1 myc-His-tag (Invitrogen) y el vector retroviral pSRatkneo (Muller et al, 1991, MCB 11: 1785). Utilizando los vectores de expresión, STEAP se puede expresar preferiblemente en varias líneas de células de cáncer de próstata y que no son de próstata, incluyendo, por ejemplo, 293, 293T, rat-1, 3T3, PC-3, LNCaP y TsuPr1. Los sistemas huésped-vector tal como se describen aquí son útiles para la producción de una proteína STEAP o fragmento de la misma. Dichos sistemas huésped-vector se pueden emplear para estudiar las propiedades funcionales de STEAP y mutaciones de STEAP.
Las proteínas codificadas por los genes de STEAP, o por fragmentos de los mismos, presentarán una variedad de usos, incluyendo, pero sin limitación, la generación de anticuerpos y en métodos para identificar ligandos y otros agentes y constituyentes celulares que se unen a un producto génico de STEAP. Los anticuerpos desarrollados contra una proteína STEAP p un fragmento de la misma pueden ser útiles en ensayos de diagnóstico y pronóstico, metodologías de obtención de imágenes (incluyendo, particularmente, imágenes de cáncer), y métodos terapéuticos en el tratamiento de cánceres humanos caracterizados por la expresión de una proteína STEAP, incluyendo, pero sin limitación, el cáncer de próstata, Se contemplan varios ensayos inmunológicos útiles para la detección de proteínas STEAP, incluyendo, pero sin limitación, varios tipos de radioinmunoensayos, ensayos por inmunoabsorción unido a enzimas (ELISA), ensayos por inmunofluorescencia unido a enzima (ELIFA), métodos inmunocitoquímicos, y similares. Dichos anticuerpos se pueden marcar y utilizar como reactivos inmunológicos para la obtención de imágenes capaces de detectar células de próstata (por ejemplo, en métodos de obtención de imágenes radioescintigráficas). Las proteínas STEAP son también particularmente útiles en la generación de vacunas contra el cáncer, tal como se describe a continuación.
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Proteínas STEAP
Otro aspecto de la presente invención proporciona varias proteínas STEAP-2 y fragmentos polipeptídicos de las mismas. Tal como se utiliza aquí, una proteína STEAP se refiere a una proteína que tiene o incluye la secuencia de aminoácidos de STEAP-1 humana proporcionada en las figuras 1A-B, STEAP-2 humana proporcionada en las figuras Fig. 9A-D, STEAP-3 humana proporcionada en las figuras 10A-E, la secuencia de aminoácidos de otros homólogos de STEAP de mamífero (por ejemplo, STEAP-4) y variantes, así como variantes alélicas y mutantes por sustitución conservativa de estas proteínas que tienen actividad biológica de STEAP, hasta el punto de que dichas variantes y homólogos se pueden aislar/generar y caracterizarse sin una gran experimentación siguiendo los métodos descritos a continuación. También se incluyen proteínas de fusión que combinan partes de diferentes proteínas STEAP o fragmentos de las mismas, así como proteínas de fusión de una proteína STEAP y un polipéptido heterólogo. A dichas proteínas STEAP se les hará referencia colectivamente como las proteínas STEAP o STEAP. Tal como se utiliza aquí, el término "polipéptido STEAP" se refiere a un fragmento de polipéptido o una proteína de STEAP de por lo menos 10 aminoácidos, preferiblemente por lo menos 15 aminoácidos.
Una realización específica de una proteína STEAP comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de STEAP-1 humana tal como se muestra en las Fig. 1A-B. Otra realización de una proteína STEAP comprende un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácido de STEAP-2 tal como se muestra en las Fig. 9A-D. Otra realización comprende un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de STEAP-3 tal como se muestre en las Fig. 10A-E. Otra realización comprende un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos parcial de STEAP-4 mostrada en las Fig. 11A-B.
En general, los variantes alélicos naturales de STEAP humana compartirán un alto grado de identidad y homología estructural (por ejemplo, 90% o más de identidad). Habitualmente, las variantes alélicas de las proteínas STEAP contendrán sustituciones de aminoácidos conservativas en las secuencias de STEAP descritas aquí o contendrán una sustitución de un aminoácido de una posición correspondiente en un homólogo de STEAP. Una clase de variantes alélicas de STEAP será proteínas que comparten un grado elevado de homología con por lo menos una región pequeña de una secuencia de aminoácidos de STEAP particular, pero contendrá además una salida de radical de la secuencia, tal como una sustitución no conservativa, truncamiento, inserción o desplazamiento del marco.
Las sustituciones conservativas de aminoácidos se pueden realizar frecuentemente en una proteína sin alterar la conformación o la función de la proteína. Dichos cambios incluyen sustituir cualquiera entre isoleucina (I), valina (V), y leucina (L) por cualquier otro de estos aminoácidos hidrofóbicos; ácido aspártico (D) por ácido glutámico (E) y viceversa; glutamina (Q) por asparagina (N) y viceversa; yn serina (S) por treonina (T) y viceversa. Otras sustituciones también se pueden considerar conservativas dependiendo del medio del aminoácido concreto y su papel en la estructura tridimensional de la proteína. Por ejemplo, la glicina (G) y la alanina (A) pueden ser frecuentemente intercambiables, como la alanina (A) y la valina (V). La metionina (M), que es relativamente hidrofóbica, se puede intercambiar frecuentemente por leucina e isoleucina, y algunas veces por valina. La lisina (K) y la arginina (R) son frecuentemente intercambiables en puntos en los que la característica significativa del residuo de aminoácido es su carga y los diferentes pK de estos dos residuos de aminoácidos no son significativos. En medios particulares se pueden considerar otros cambios como conservativos.
Las proteínas STEAP, incluyendo variantes, comprenden por lo menos un epítopo en común con una proteína STEAP que tiene la secuencia de aminoácidos mostradas en las figuras 11A-B, de manera que un anticuerpo que se une específicamente a una proteína STEAP o variante también se unirá específicamente a la proteína STEAP que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en las figuras 11A-B. Una clase de variantes de proteína STEAP comparte el 90% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos de las figuras 11A-B. Una clase más específica de variantes de proteínas STEAP comprende un motivo SCP de proteína extracelular tal como se ha descrito anteriormente. Las variantes de proteína STEAP preferidas son capaces de mostrar una o más funciones defensina descritas aquí incluyendo, por ejemplo, la capacidad de inducir la muerte del tumor o de quimioatraer y/o inducir la migración de células.
Las proteínas STEAP pueden tomar varias formas, preferiblemente en forma aislada. Tal como se utiliza aquí, se dice que una proteína está "aislada" cuando se utilizan métodos físicos, mecánicos o químicos para extraer la proteína STEAP de los constituyentes celulares que están normalmente asociados con la proteína. Un experto en la materia puede utilizar fácilmente métodos de purificación estándar para obtener una proteína STEAP aislada. Una molécula proteica STEAP purificada estará sustancialmente libre de otras proteínas o moléculas que perjudican la unión de STEAP a anticuerpo u otro ligando. La naturaleza y el grado de aislamiento y purificación dependerá del uso pretendido. Las realizaciones de una proteína STEAP incluyen una proteína STEAP purificada y una proteína STEAP soluble funcional. En una forma, dichas proteínas STEAP solubles funcionales o fragmentos de las mismas mantienen la capacidad de unirse al anticuerpo u otro ligando.
En la presente invención también se describen polipéptidos STEAP que comprenden fragmentos biológicamente activos de la secuencia de aminoácidos de STEAP, tal como un polipéptido correspondiente a la parte de las secuencias de aminoácidos para STEAP-1 tal como se muestra en las Fig. 1A-B, STEAP-2 tal como se muestra en las Fig. 9A-D, STEAP-3 tal como se muestra en las Fig. 10A-E, o STEAP-4 tal como se muestra en las Fig. 11A-B. Los polipéptidos de la presente invención muestran propiedades de una proteína STEAP-2, tal como la capacidad de obtener la generación de anticuerpos que se unen específicamente a un epítopo asociado con una proteína STEAP-2. Los polipéptidos que comprenden las secuencias de aminoácidos que son únicas para una proteína STEAP particular (en relación con otras proteínas STEAP) se pueden utilizar para generar anticuerpos que reaccionarán específicamente son esa proteína STEAP concreta. Por ejemplo, en referencia a la alineación de los aminoácidos de las estructuras de STEAP mostradas en las Figs. 11A-E, el experto en la materia entenderá fácilmente que cada molécula contiene tramos de secuencia única a su estructura. Estos tramos únicos se pueden utilizar para generar anticuerpos específicos para una STEAP concreta. De forma similar, se pueden utilizar regiones de secuencia conservada para generar anticuerpos que se pueden unir a múltiples STEAP.
Las realizaciones de la invención descritas aquí incluyen un amplia variedad de variantes aceptadas en la técnica de proteínas STEAP-2, tales como polipéptidos que tienen inserciones, deleciones y sustituciones de aminoácidos. Las variantes de STEAP se pueden fabricar utilizando métodos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida de sitio, rastreo de alanina y mutagénesis de PCR. La mutagénesis dirigida de sitio [Carter et al., Nucl Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10: 6481 (1987)], la mutagénesis en cassette [Wells et al, Gene, 34: 315 (1985)], mutagénesis por selección de resrticción [Wells et al, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)] u otras técnicas conocidas que se pueden realizar sobre el ADN clonado para producir el ADN variante de STEAP. El análisis de aminoácidos por rastreo se puede utilizar para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de rastreo preferidos están los aminoácidos neutros relativamente pequeños. Dichos aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina, y cisteína. La alanina es habitualmente un aminoácido de rastreo preferido dentro de este grupo porque elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos probable que altere la conformación de la cadena principal de la variante. La alanina es también habitualmente preferido porque es el aminoácido más común. Además, se encuentra frecuentemente en posiciones escondidas y expuestas [Creighton; The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)]. Si la sustitución de alanina no produce cantidades adecuadas de variante, se puede utilizar un aminoácido isostérico.
Tal como se ha descrito anteriormente, las realizaciones descritas aquí incluyen polipéptidos que contienen menos que la secuencia de aminoácidos completa de una proteína STEAP-2 mostrada en las figuras 11A-B. Por ejemplo, las realizaciones representativas descritas aquí incluyen polipéptidos que consisten en aproximadamente el aminoácido 1 a aproximadamente el aminoácido 10 de una proteína STEAP mostrada en la figura 11 AB, polipéptidos que consisten en aproximadamente el aminoácido 20 a aproximadamente el aminoácido 30 de una proteína STEAP mostrada en la figura 11 A-B, polipéptidos que consisten en aproximadamente el aminoácido 30 a aproximadamente el aminoácido 40 de una proteína STEAP mostrada en la figura 11 A-B, polipéptidos que consisten en aproximadamente el aminoácido 40 a aproximadamente el aminoácido 50 de una proteína STEAP mostrada en la figura 11 A-B, polipéptidos que consisten en aproximadamente el aminoácido 50 a aproximadamente el aminoácido 60 de una proteína STEAP mostrada en la figura 11 A-B, polipéptidos que consisten en aproximadamente el aminoácido 60 a aproximadamente el aminoácido 70 de una proteína STEAP mostrada en la figura 11 A-B, polipéptidos que consisten en aproximadamente el aminoácido 70 a aproximadamente el aminoácido 80 de una proteína STEAP mostrada en la figura 11 A-B, polipéptidos que consisten en aproximadamente el aminoácido 80 a aproximadamente el aminoácido 90 de una proteína STEAP mostrada en la figura 11 A-B, polipéptidos que consisten en aproximadamente el aminoácido 90 a aproximadamente el aminoácido 100 de una proteína STEAP mostrada en la figura 11 A-B, etc. Siguiendo este esquema, se describen en la presente invención polipéptidos que consisten en partes de la secuencia de aminoácidos 100-339 de una proteína STEAP-1 mostrada en las figuras 11A-B, o los aminoácidos 100-454 de una proteína STEAP-2 mostrada en las figuras 11A-B, o los aminoácidos 100-459 de una proteína STEAP-3 mostrada en las figuras 11A-B, o los aminoácidos 100-133 de una proteína STEAP-4 mostrada en las figuras 11A-B. También se contemplan polipéptidos que consiste en partes más grandes de la proteína STEAP. Por ejemplo, se pueden generar polipéptidos que consisten en aproximadamente el aminoácido 1 (ó 20 ó 30 ó 40, etc.) a aproximadamente el aminoácido 20 (ó 30 ó 40 ó 50, etc.)
de una proteína STEAP mostrada en las figuras 11A-B mediante una variedad de técnicas conocidas en el sector.
Las realizaciones ilustrativas adicionales descritas aquí incluyen polipéptidos STEAP que contienen los residuos de aminoácidos de uno o más de los motivos biológicos contenidos en la secuencia del polipéptido STEAP-2 tal como se muestra en la Figura 11AB. Los polipéptidos que contienen uno o más de estos motivos u otras regiones seleccionadas de interés descritas aquí incluirán habitualmente de 5 a 25 o más residuos de aminoácidos adicionales de la secuencia de proteína STEAP adyacente en uno o ambos lados del motivo o motivos seleccionados. En una realización, los polipéptidos habituales de la invención pueden contener una o más de las regiones de STEAP-2 que muestran homología a una o más de otras proteínas STEAP. En otra realización, los polipéptidos habituales pueden contener una o más partes inmunogénicas de una proteína STEAP-2. Un ejemplo de parte inmunogénica de una proteína STEAP es de los residuos de aminoácidos 14 a 28 de la secuencia de aminoácidos de STEAP-1 tal como se muestra en la FIG 1AB (WKMKPRRNLEEDDYL; SEC ID NO: 22). Los polipéptidos tal como se describen aquí pueden contener uno o más péptidos de unión a HLAA2 previstos, tales como los aminoácidos 165-173 de STEAP-1, aminoácidos 86-94 de STEAP-1, aminoácidos 262-270 de STEAP-1, aminoácidos 302-310 de STEAP-1, aminoácidos 158-166 de STEAP-1, aminoácidos 227-235 de STEAP-2, aminoácidos 402-410 de STEAP-2, aminoácidos 307-315 de STEAP-2, aminoácidos 306-314 de STEAP-2, y aminoácidos 100-108 de STEAP-2. En otra realización, los polipéptidos consisten en todo o parte de un fragmento de STEAP-2, tal como los aminoácidos 1-245, 2-204, 121-454,153-165, 182-454, 183-387, 276-453, 345-358, o 419-454 de la proteína STEAP-2 mostrada en la figura 8. Las realizaciones relacionadas incluyen polipéptidos que contienen combinaciones de los diferentes motivos descritos anteriormente, siendo las realizaciones preferibles aquellas que no contienen inserciones, deleciones o sustituciones en los motivos o en las secuencias que intervienen de estos polipéptidos.
Los polipéptidos STEAP se pueden generar utilizando tecnología de síntesis de péptidos estándar o utilizando métodos de división química conocidos en la técnica en base a las secuencias de aminoácidos de las proteínas STEAP humanas descritas aquí. Alternativamente, se pueden utilizar métodos recombinantes para generar moléculas de ácido nucleico que codifican un fragmento de polipéptido de una proteína STEAP. En este aspecto, las moléculas de ácido nucleico que codifican STEAP descritas aquí proporcionan medios para generar fragmentos de proteínas STEAP definidos. Los polipéptidos STEAP son particularmente útiles en la generación y caracterización de anticuerpos específicos de dominio (por ejemplo, anticuerpos que reconocen un epítopo extracelular o intracelular de una proteína STEAP), en la identificación de agentes o factores celulares que se unen a STEAP o un dominio estructural del mismo particular, y en varios contextos terapéuticos, incluyendo, pero sin limitación, vacunas contra el cáncer. Los polipéptidos STEAP que contienen estructuras particularmente interesantes se pueden predecir y/o identificar utilizando varias técnicas analíticas conocidas en el sector, incluyendo, por ejemplo, los métodos de análisis de Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz o Jameson-Wolf, o en base a la inmunogenicidad. Los fragmentos que contienen dichas estructuras son particularmente útiles en la generación de anticuerpos anti-STEAP específicos de subunidades o en la identificación de factores celulares que se unen a STEAP.
En una realización específica descrita en los ejemplos siguientes, se puede expresar de forma práctica una forma secretada de STEAP en células 293T transfectadas con un vector de expresión dirigido por CMV que codifica STEAP con una etiqueta 6XHIs y MYC C-terminal (pcDNA3.1/mycHIS, Invitrogen). La STEAP etiquetada con HIS secretada en el medio de cultivo se puede purificar utilizando una columna de níquel y técnicas estándar. Alternativamente, se puede utilizar un sistema de etiquetas AP. En los ejemplos siguientes se describen varias construcciones para la expresión de STEAP.
En la presente invención se describen modificaciones de STEAP, tales como modificaciones covalentes. Un tipo de modificación covalente incluye reaccionar residuos de aminoácidos marcados de un polipéptido STEAP con un agente derivatizante orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los residuos N o C terminales de la STEAP. Otro tipo de modificación covalente del polipéptido STEAP comprende alterar el patrón de glicosilación nativo del polipéptido. "Alterar el patrón de glicosilación nativo" se entiende para los objetivos de la presente invención eliminar uno o más grupos de carbohidratos que se encuentran en la STEAP de secuencia nativa (mediante la eliminación del sitio de glicosilación subyacente o mediante la eliminación de la glicosilación por medios químicos y/o enzimáticos), y/o añadir uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en la STEAP de secuencia nativa. Además, la frase incluye cambios cualitativos en la glicosilación de las proteínas nativas, lo que implica un cambio en la naturaleza y las proporciones de los diversos grupos de carbohidrato presentes. Otro tipo de modificación covalente de STEAP comprende la unión de los polipéptidos STEAP a uno de un conjunto de polímeros no proteináceos, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la manera indicada en las Patentes US Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4.301,144; 4,670,417; 4,791,192 ó 4,179,337.
La STEAP también se puede modificar de manera que forme una molécula quimérica que comprende STEAP fusionada a otro polipéptido o secuencia de aminoácidos heterólogos. En una realización, dicha molécula quimérica comprende una fusión de la STEAP con un epítopo etiqueta de polihistidina, que proporciona un epítopo al que se puede unir selectivamente níquel inmovilizado. El epítopo etiqueta se sitúa generalmente en los extremos amino o carboxilo de la STEAP. En una realización alternativa, la molécula quimérica puede comprender una fusión de la STEAP con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica (también referida como "inmunoadhesina"), dicha fusión podría ser a la región Fc de una molécula IgG. Las fusiones de Ig incluyen preferiblemente la sustitución de una forma soluble (dominio transmembrana eliminado o desactivado) de un polipéptido STEAP en lugar de por lo menos una región variable en una molécula de Ig. En una realización particularmente preferida, la fusión a inmunoglobulina incluye las regiones bisagra, CH2 y CH3, o la bisagra, CH2, CH2 y CH3 de una molécula IgG1. Para la producción de fusiones de inmunoglobulinas, véase también la Patente Us No. 5,428,130 concedida el 27 de junio de 1995.
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Anticuerpos de STEAP
Otro aspecto de la presente invención proporciona anticuerpos que se unen a proteínas y polipéptidos STEAP-2. Los anticuerpos más preferidos se unirán selectivamente a una proteína STEAP-2 y no se unirán (o se unirán débilmente) a proteínas y polipéptidos que no son STEAP. Los anticuerpos anti-STEAP que se contemplan particularmente incluyen anticuerpos monoclonales y policlonales, así como fragmentos que contienen el dominio de unión a antígeno y/o una o más regiones determinantes de complementariedad de estos anticuerpos. Tal como se utiliza aquí, un fragmento de anticuerpo se define como por lo menos una parte de la región variable de la molécula de inmunoglobulina que se une a su diana, es decir, la región de unión a antígeno.
Para algunas aplicaciones, puede ser deseable generar anticuerpos que reaccionan específicamente con una proteína STEAP particular y/o un epítopo en un dominio estructural particular. Por ejemplo, los anticuerpos preferidos útiles para la terapia contra el cáncer y para la obtención de imágenes de diagnóstico son aquellos que reaccionan con un epítopo en una región extracelular de la proteína STEAP expresada en células cancerosas. Dichos anticuerpos se pueden generar utilizando las proteínas STEAP descritas aquí o utilizando péptidos derivados de dominios extracelulares previstos de las mismas, como inmunógeno. En este aspecto, en referencia al esquema topológico de la proteína STEAP-1 mostrado en la FIG 1B, se pueden seleccionar regiones en los bucles extracelulares entre los dominios transmembrana indicados para utilizar en el diseño de inmunógenos apropiados para desarrollar anticuerpos específicos extracelulares.
Los anticuerpos de STEAP-2 descritos aquí pueden ser particularmente útiles en las estrategias terapéuticas contra el cáncer de próstata, ensayos de diagnóstico y pronóstico, y las metodologías de obtención de imágenes. De manera similar, dichos anticuerpos pueden ser útiles en el tratamiento, diagnóstico y/o pronóstico de otros cánceres, en tanto en cuanto STEAP-2 también se exprese o sobreexpresa en otros tipos de cáncer. La presente invención proporciona varios ensayos inmunológicos útiles para la detección y cuantificación de proteínas y polipéptidos STEAP-2 y STEAP-2 mutantes. Dichos ensayos comprenden en general uno o más anticuerpos de STEAP-2 capaces de reconocer y unirse a una proteína STEAP-2 o STEAP-2 mutante, según sea apropiado, y se pueden aplicar en varios formatos de ensayo inmunológico conocidos en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, varios tipos de radioinmunoensayos, ensayos por inmunoabsorción unido a enzima (ELISA), ensayos por inmunofluoerescencia unido a enzima (ELIFA), y similares. Además, también se describen aquí métodos de obtención de imágenes inmunológicas capaces de detectar el cáncer de próstata incluyendo, pero sin limitación, métodos radioescintigráficos de obtención de imágenes utilizando anticuerpos de STEAP marcados. Dichos ensayos se pueden utilizar clínicamente en la detección, seguimiento y pronóstico del cáncer de próstata, particularmente el cáncer de próstata avanzado.
Los anticuerpos de STEAP también se pueden utilizar en métodos para purificar proteínas y polipéptidos STEAP y STEAP mutantes y para aislar homólogos de STEAP y moléculas relacionadas. Por ejemplo, en una realización, el método de purificación de una proteína STEAP comprende incubar un anticuerpo STEAP, que se ha acoplado a una matriz sólida, con un lisado u otra solución que contiene STEAP bajo condiciones que permiten que el anticuerpo STEAP se una a STEAP; lavar la matriz sólida para eliminar impurezas; y eluir la STEAP del anticuerpo acoplado. Otros usos de los anticuerpos de STEAP de la presente invención incluyen la generación anticuerpos anti-idiotípicos que mimetizan la proteína STEAP.
Los anticuerpos de STEAP también se pueden utilizar terapéuticamente mediante, por ejemplo, la modulación o inhibición de la actividad biológica de una proteína STEAP o reconocimiento y destrucción de células cancerosas que expresan una proteína STEAP. La terapia con anticuerpos del cáncer de próstata y otros cánceres se describe más específicamente en una subsección separada a continuación.
Son conocidos en la técnica varios métodos para la preparación de anticuerpos. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos mediante la inmunización de un huésped mamífero adecuado utilizando una proteína, péptido o fragmento de STEAP en forma aislada o inmunoconjugada (Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, Eds., Harlow, and Lane (1988); Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, NY (1989)). Ejemplos de inmunógenos proteicos incluyen STEAP recombinante (expresado en un sistema de baculovirus, sistema de mamíferos, etc.), dominios extracelulares de STEAP o bucles extracelulares de proteína STEAP conjugada a una o más regiones constantes de anticuerpos, STEAP etiquetado con AP, etc. Además, también se pueden utilizar proteínas de fusión de STEAP, tales como una fusión de STEAP con GST, proteína de unión a maltosa (MBP), proteína verde fluorescente (GFP), HisMax-TOPO o MycHis (véase los ejemplos a continuación).
En una realización particular, se puede producir una proteína de fusión GST que comprende toda o la mayor parte de una secuencia de aminoácidos del marco de lectura abierto mostrada en las 11A-B y utilizarse como inmunógeno para generar anticuerpos apropiados. Las células que expresan o sobreexpresan STEAP también se pueden utilizar para inmunizaciones. De manera similar, se puede utilizar cualquier célula diseñada para expresar STEAP. Dichas estrategias pueden dar lugar a la producción de anticuerpos monoclonales con mayor capacidad para reconocer STEAP endógena. Otro inmunógeno útil comprende péptidos STEAP unidos a la membrana plasmática de glóbulo rojos de ovejas.
Las secuencias de aminoácidos de las proteínas STEAP mostradas en las figuras 11A-B se pueden utilizar para seleccionar regiones específicas de una proteína STEAP para generar anticuerpos. Por ejemplo, los análisis de hidrofobicidad y hidrofilicidad de la secuencia de aminoácidos de STEAP se pueden utilizar para identificar regiones hidrofílicas en la estructura de STEAP. Las regiones de la proteína STEAP que muestran estructura inmunogénica, así como otras regiones y dominios, se pueden identificar fácilmente utilizando otros métodos conocidos en la técnica, tales como análisis Chou-Fasman, Gamier Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz o Jameson-Wolf. Se pueden seleccionar péptidos de STEAP que se prevé que se unen a HLA-A2 para la generación de anticuerpos o se usan para generar una respuesta a CTL. Dichos péptidos de unión a HLA-A2 previsto incluyen, pero sin limitación, aminoácidos 165-173 de STEAP-1, aminoácidos 86-94 de STEAP-1, aminoácidos 262-270 de STEAP-1, aminoácidos 302-310 de STEAP-1, aminoácidos 158-166 de STEAP-1, aminoácidos 227-235 de STEAP-2, aminoácidos 402-410 de STEAP-2, aminoácidos 307-315 de STEAP-2, aminoácidos 306-314 de STEAP-2, y aminoácidos 100-108 de STEAP-2. Tal como se describe en los ejemplos siguientes, se ha demostrado la inmunogenicidad con STEAP, que se utilizó para generar anticuerpos policlonales y monoclonales utilizando conejos y ratones, respectivamente. Esta respuesta de células B (producción de anticuerpos) es el resultado de una respuesta inicial de células T obtenida por las partes inmunogénicas de STEAP.
Los métodos para preparar una proteína o polipéptido para su uso como inmunógeno y para preparar conjugados inmunogénicos de una proteína con un portador, tal como BSA, KLH, u otras proteínas portadoras son conocidos en la técnica. En algunas circunstancias, se puede utilizar la conjugación directa utilizando, por ejemplo, reactivos de carbodiimida; en otros ejemplos, pueden ser eficaces reactivos de unión, tales como los suministrados por Pierce Chemical Co., Rockford, IL. La administración de un inmunógeno de STEAP se realiza generalmente mediante la inyección sobre un periodo adecuado y con el uso de un adyuvante adecuado, como se entiende en general en la técnica. Durante la pauta de programación de inmunización, se pueden tomar títulos de anticuerpos para determinar la adeqüidad de la formación de anticuerpos.
Se prefieren anticuerpos monoclonales de STEAP y se pueden producir mediante varios medios conocidos en la técnica. Por ejemplo, las líneas celulares inmortalizadas que secretan un anticuerpo monoclonal deseado se pueden preparar utilizando la tecnología de hibridoma estándar de Kohler y Milstein o modificaciones que inmortalizan células \beta productoras, tal como se conoce en general. Las línias celulares inmortalizadas que secretan los anticuerpos deseados se criban mediante inmunoensayo en el que el antígeno es la proteína STEAP o fragmento de STEAP. Cuando se identifica el cultivo de células inmortalizadas apropiadas que secretan el anticuerpo deseado, las células se pueden expandir y los anticuerpos se pueden producir a partir de cultivos in vitro o de fluidos ascíticos.
Los anticuerpos o fragmentos también se pueden producir utilizando tecnología actual mediante medios recombinantes. También se pueden producir regiones que se unen específicamente a las regiones deseadas de la proteína STEAP en el contexto de anticuerpos quiméricos o con injertos CDR de especies de múltiples orígenes. Los anticuerpos de STEAP humanizados o humanos también se pueden producir y se prefieren para su uso en contextos terapéuticos. Son bien conocidos métodos para humanizar anticuerpos murinos y otros anticuerpos no humanos mediante la sustitución de una o más de las CDR de anticuerpos no humanos para las correspondientes secuencias de anticuerpos humanos (véase, por ejemplo, Jones et al., 1986, Nature 321: 522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332: 323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239: 1534-1536). Véase también, Carter et al., 1993, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89: 4285 and Sims et al., 1993, J. Immunol. 151: 2296. Los métodos para producir anticuerpos monoclonales totalmente humanos incluyen las tecnologías de expresión de fagos y animales transgénicos (para su revisión, véase Vaughan et al., 1998, Nature Biotechnology 16: 535-539).
Los anticuerpos monoclonales de STEAP totalmente humanos se pueden generar utilizando tecnologías de clonación que utilizan amplias bibliotecas combinatorias de genes de Ig humanos (es decir, expresión en fagos) (Griffiths and Hoogenboom, Building an in vitro immune system: human antibodies from phage display libraries. In: Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic and Therapeutic Applications in Man. Clark, M. (Ed.), Nottingham Academic, pp 45-64 (1993); Burton and Barbas, Human Antibodies from combinatorial libraries. Id., pp 65-82). Los anticuerpos monoclonales de STEAP totalmente humanos también se pueden producir utilizando ratones transgénicos diseñados para contener loci de genes de inmunoglobulinas humanas tal como se describe en la Patente US No. 6,150,584 y en la solicitud de patente PCT WO98/24893, publicada el 3 de diciembre de 1997 (véase también, Jakobovits, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs 7 (4): 607-614). Este método evita la manipulación in vitro requerida con la tecnología de expresión en fagos y produce de manera eficaz anticuerpos humanos auténticos de afinidad elevada.
La reactividad de los anticuerpos STEAP con una proteína STEAP se puede establecer mediante una serie de medios conocidos, incluyendo transferencia western, inmunoprecipitación, ELISA y análisis FACS utilizando, según sea apropiado, proteínas, péptidos STEAP, células que expresan STEAP o extractos de las mismas.
Un anticuerpo de STEAP o fragmento del mismo de la presente invención se puede marcar con un marcador detectable o conjugarse a una segunda molécula, tal como una citotoxina u otro agente terapéutico, y se utiliza para reconocer la segunda molécula en una célula positiva en STEAP (Vitetta, E.S. et al., 1993, Immunotoxin therapy, in DeVita, Jr., V.T. et al., eds., Cancer. Principles and Practice of Oncology, 4th ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphia, 2624-2636). Ejemplos de agentes citotóxicos incluyen, pero sin limitación, ricina, cadena A de ricina, doxorubicina, maitansinoides, daunorubicina, taxol, bromuro de etidio, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colquicina, dihidroxi antracin diona, actinomicina, difteria toxina, exotoxinas de Pseudomonas (PE) A, PE40, abrina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, curicina, crotina, caliqueamicina, inhibidor de sapaonaria officinalis, y glucocorticoide y otros agentes quimioterapéuticos, así como radioisótopos, tales como ^{212}Bi,^{131}I,^{131}In, ^{90}Y, y ^{186}Re. Los marcadores detectables adecuados incluyen, pero sin limitación, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un quelante metálico o una enzima. Los anticuerpos también se pueden conjugar a una enzima activadora de profármacos anticancerosos capaz de convertir el profármaco en su forma activa. Véase, por ejemplo, la Patente US No. 4,975,287.
Además, se pueden generar anticuerpos biespecíficos específicos para dos o más epítopos de STEAP utilizando métodos conocidos generalmente en la técnica. Además, se pueden modificar las funciones efectoras de los anticuerpos para aumentar el efecto terapéutico de los anticuerpos STEAP en células cancerosas. Por ejemplo, se pueden modificar residuos de cisteína en la región Fc, permitiendo la formación de enlaces disulfuro intercatenarios y la generación de homodímeros que pueden tener una mayor capacidad para la internalización, ADCC y/o citólisis mediada por complemento (véase, por ejemplo, Caron et al., 1992, J. Exp. Med. 176: 1191-1195; Shopes, 1992, J. Immunol. 148: 2918-2922). Los anticuerpos homodiméricos también se pueden generar mediante técnicas de reticulación conocidas en el sector (por ejemplo, Wolff et al., Cancer Res. 53: 2560-2565).
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Animales transgénicos con STEAP
También se pueden utilizar ácidos nucleicos que codifican STEAP o sus formas modificadas para generar animales transgénicos o animales "knock out" que, a su vez, son útiles en el desarrollo y cribado de reactivos terapéuticamente útiles. Un animal transgénico (por ejemplo, un ratón o rata) es un animal que tiene células que contienen un transgén, el cual se introdujo en el animal o un progenitor del animal en una etapa prenatal, por ejemplo embrionaria. Un transgén es un ADN que está integrado en el genoma de una célula a partir del cual se desarrolla un animal transgénico. En una realización, el ADNc que codifica STEAP se puede utilizar para clonar ADN genómico que codifica STEAP según las técnicas establecidas y las secuencias genómicas utilizadas para generar animales transgénicos que contienen células que expresan ADN que codifica STEAP.
Los métodos para generar animales transgénicos, particularmente animales, tales como ratones o ratas, se han convertido en convencionales en la técnica y se describen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nos. 4,736,866 y 4,870,009. Habitualmente, las células particulares se marcarían para la incorporación de transgén para STEAP con potenciadores específicos de tejido. Los animales transgénicos que incluyen una copia de un transgén que codifica STEAP introducido en la línea germinal del animal en una etapa embrionaria se puede utilizar para examinar el efecto del aumento de la expresión de ADN que codifica STEAP. Dichos animales se pueden utilizar como animales de prueba para reactivos pensados para conferir protección de, por ejemplo, afecciones patológicas asociadas con su sobreexpresión. Según este aspecto de la invención, se trata un animal con el reactivo y una incidencia reducida de la afección patológica, en comparación con animales no tratados que portan el transgén, indicaría una potencial intervención terapéutica para la afección patológica.
Alternativamente, se pueden utilizar homólogos no humanos de STEAP para construir un animal "knock out" con STEAP que tiene un gen defectuoso o alterado que codifica STEAP como resultado de la recombinación homóloga entre el gen endógeno que codifica STEAP y el ADN genómico alterado que codifica STEAP introducido en una célula embrionaria del animal. Por ejemplo, el ADNc que codifica STEAP se puede utilizar para clonar el ADN genómico que codifica STEAP según técnicas establecidas. Una parte del ADN genómico que codifica STEAP se puede eliminar o sustituir por otro gen, tal como un gen que codifica un marcador seleccionable que se puede utilizar para seguir la integración. Una parte del ADN genómico que codifica STEAP se puede eliminar o sustituir por otro gen, tal como un gen que codifica un marcador seleccionable que se puede utilizar para seguir la integración.
Habitualmente, se incluyen en el vector varias kilobases de ADN flanqueante no alterado (ambos en los extremos 5' y 3') (véase, por ejemplo, Thomas and Capecchi, 1987, Cell 51: 503 para una descripción de vectores de recombinación homóloga). El vector se introduce en una línea de células madre embrionarias (por ejemplo, mediante electroporación) y se seleccionan células en las que el ADN introducido se ha recombinado de forma homóloga con el ADN endógeno (véase, por ejemplo, Li et al., 1992, Cell 69: 915). A continuación, las células seleccionadas se inyectan en un blastocito de un animal (por ejemplo, un ratón o rata) para formar quimeras de agregación (véase, por ejemplo, Bradley, in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed., IRL, Oxford, 1987, pp. 113-152).
A continuación, se puede implantar un embrión quimérico en un animal adoptado hembra pseudopreñada adecuado y el embrión nació para crear un animal "knock out". La progenie que alberga el ADN recombinado homólogamente en sus células germinales se puede identificar mediante técnicas estándar y se utilizan para criar animales en los que todas las células del animal contienen el ADN recombinado homólogamente. Los animales knockout se puede caracterizar, por ejemplo, por su capacidad de defenderse contra ciertas afecciones patológicas y por su desarrollo de afecciones patológicas debido a la ausencia del polipéptido STEAP.
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Seguimiento ("monitorización") del estado de STEAP y sus productos
Los ensayos que evalúan el estado de un gen de STEAP y los productos génicos de STEAP en un individuo pueden proporcionar información sobre el crecimiento o potencial oncogénico de una muestra biológica de este individuo. Por ejemplo, dado que el ARNm de STEAP se expresa de manera elevada en próstata y no en la mayoría de los tejidos normales, y dado que su expresión se asocia con ciertos cánceres, se pueden utilizar ensayos que evalúan los niveles relativos de transcritos de ARNm o proteínas STEAP en una muestra biológica para diagnosticar una enfermedad asociada con la desregulación de STEAP, tal como cáncer o hiperplasia prostática benigna (BPH) y puede proporcionar información de pronóstico útil en la definición de opciones terapéuticas apropiadas. De manera similar, se pueden utilizar en este contexto ensayos que evalúan la integridad de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de STEAP en una muestra biológica.
El hallazgo de que el ARNm de STEAP se expresa en próstata y otros cánceres, y no en la mayoría de tejido normal, proporciona la evidencia de que este gen está asociado con el crecimiento desregulado celular y, por tanto, identifica este gen y sus productos como diana que el experto en la materia puede utilizar para evaluar las muestras biológicas de individuos sospechosos de presentar una enfermedad asociada con la desregulación de STEAP. En otro ejemplo, debido a que la expresión de STEAP está normalmente limitada a la próstata, se pueden evaluar muestras biológicas tomadas de otros tejidos para detectar la expresión de STEAP como indicación de metástasis. Por ejemplo, tal como se muestra en la figura 31A-F, los anticuerpos dirigidos a STEAP-1 proporcionan un marcador superior para la detección de la metástasis, en comparación con el marcador de cáncer de próstata convencional, PSA. Dicho marcador puede ser útil tanto en la evaluación de biopsias de tejidos como parte de estrategias de obtención de imágenes in vivo. En este contexto, la evaluación del estado de la expresión del gen de STEAP y sus productos se pueden utilizar para obtener información de la potencial enfermedad de una muestra de tejido. Los términos "estado de la expresión" en este contexto se utilizan para referirse ampliamente al conjunto de factores implicados en la expresión, función y regulación de un gen y sus productos, tales como el nivel de expresión de ARNm, la integridad de los productos génicos de expresión (tales como secuencias de ácido nucleicos y aminoácidos) y modificaciones transcripcionales y traduccionales de estas moléculas.
El estado de expresión de STEAP puede proporcionar información útil para predecir la susceptibilidad por etapas concretas de una enfermedad, progresión y/o agresividad de un tumor. La presente invención proporciona métodos y ensayos para determinar el estado de expresión de STEAP-2 y el diagnóstico de cánceres que expresan STEAP-2, tales como cánceres de la próstata. El estado de expresión de STEAP en muestras de pacientes se puede analizar mediante una serie de medios conocidos en la técnica, incluyendo sin limitación, análisis inmunohistoquímico, hibridación in situ, análisis RT-PCR en muestras microdiseccionadas capturadas por láser, análisis de transferencia western de muestras clínicas y líneas celulares y análisis de tejidos. Los protocolos típicos para la evaluación del estado de expresión del gen de STEAP y los productos génicos se pueden encontrar, por ejemplo, en Current Protocols In Molecular Biology, Units 2 [Northern Blotting], 4 [Southern Blotting], 15 [Immunoblotting] and 18 (PCR Analysis), Frederick M. Ausubul et al. eds., 1995.
En la presente invención se describen métodos para el seguimiento de productos génicos de STEAP mediante la determinación del estado de los productos génicos de STEAP expresados por células en una muestra de tejido a analizar de un individuo sospechoso de tener una enfermedad asociada con el crecimiento celular desregulado (tal como hiperplasia o cáncer) y, a continuación, la comparación del estado así determinado con el estado de productos génicos de STEAP en una muestra normal correspondiente, proporcionando la presencia del estado aberrante o alterado de productos génicos de STEAP en la muestra a analizar en relación con la muestra normal una indicación de la presencia del crecimiento celular desregulado en las células del individuo.
En la presente invención se describen adicionalmente métodos de examen de una muestra biológica para evidenciar el crecimiento celular desregulado. En una realización, el método comprende comparar el estado de STEAP en la muestra biológica con el estado de STEAP en una muestra normal correspondiente, donde las alteraciones en el estado de STEAP en la muestra biológica está asociado con el crecimiento celular desregulado. El estado de STEAP en la muestra biológica se puede evaluar mediante, pro ejemplo, el examen de los niveles de expresión de ARNm de STEAP o los niveles de expresión de la proteína STEAP. En una realización, se identifica una alteración en el estado de STEAP por la presencia de células que expresan STEAP en una muestra biológica de un tejido en el que las células que expresan STEAP están normalmente ausentes.
Se describen en la presente invención ensayos útiles en la determinación de la presencia de cáncer en un individuo, que comprende detectar un incremento significativo en al expresión de ARNm o la proteína STEAP en una célula o muestra de tejido a analizar en relación con los niveles de expresión en la correspondiente célula o tejido normal. La presencia de ARNm de STEAP se puede evaluar, por ejemplo, en muestras de tejido que incluyen, pero sin limitación, colon, pulmón, próstata, páncreas, vejiga, mama, ovario, cerviz, testículos, cabeza y cuello, cerebro, estómago, huesos, etc. La presencia de una expresión significativa de STEAP en cualquiera de estos tejidos puede ser útil para indicar la emergencia, presencia y/o gravedad de estos cánceres o una metástasis del cáncer que se origina en otro tejido, ya que los correspondientes tejidos normales no expresan el ARNm de STEAP o lo expresan a niveles inferiores.
En una realización relacionada, el estado de expresión de STEAP se puede determinar a nivel de proteína mejor que a nivel de ácido nucleico. Por ejemplo, dicho método o ensayo comprendería determinar el nivel de proteína STEAP expresada por las células en una muestra de tejido a analizar y comparar el nivel determinado de esta manera con el nivel de STEAP expresada en una muestra normal correspondiente. En una realización, se evalúa la presencia de proteína STEAP, por ejemplo, utilizando métodos inmunohistoquímicos. Los anticuerpos de STEAP o parejas de unión capaces de detectar la expresión de proteína STEAP se pueden utilizar en un conjunto de formatos de ensayo conocidos en la técnica para este objetivo. Tal como se muestra en los ejemplos que se acompañan, la imunorreactividad de STEAP está asociada con el cáncer de próstata, vejiga y pulmón, así como BPH y metástasis de cáncer de próstata.
En otras realizaciones relacionadas, se puede evaluar la integridad de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de STEAP en una muestra biológica a efectos de identificar perturbaciones en la estructura de estas moléculas, tales como inserciones, deleciones, sustituciones y similares. Dichas realizaciones son útiles porque las perturbaciones en las secuencias de nucleótidos y aminoácidos se observan en un gran número de proteínas asociadas con un fenotipo del crecimiento desregulado (véase por ejemplo, Marrogi et al, J. Cutan. Pathol 26 (8): 369-378 (1999)). En este contexto, se conocen en la técnica una amplia variedad de ensayos para observar perturbaciones en las secuencias de nucleótidos y aminoácidos. Por ejemplo, el tamaño y la estructura de las secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos de los productos génicos de STEAP se pueden observar mediante los protocolos northern, southern, western, PCR y secuenciación de ADN descritos aquí. Además, existen otros métodos conocidos en la técnica para observar perturbaciones en las secuencias de nucleótidos y aminoácidos, tales como el análisis de polimorfismos en conformación monocatenaria (véase, por ejemplo, las Patentes U.S. Nos. 5,382,510 y 5,952,170).
En otra realización, se puede examinar el estado de metilación del gen de STEAP en una muestra biológica. La desmetilación y/o hipermetilación aberrante de las islas CpG en regiones reguladoras 5' del gen aparecen frecuentemente en células inmortalizadas y transformadas y puede dar lugar a una expresión alterada de varios genes. Por ejemplo, la hipermetilación del promotor de la glutatión S-transferasa de la calse-pi (una proteína expresada en próstata normal, pero no expresada en más del 90% de los carcinomas de próstata) parece silenciar permanentemente la transcripción de este gen y es la alteración genómica más frecuentemente detectada en carcinomas de próstata (De Marzo et al., 1999, Am. J. Pathol. 155 (6): 1985-1992). Además, esta alteración está presente en por lo menos el 70% de los casos de neoplasia intraepitelial prostática (PIN) de grado elevado (Brooks et al., 1998, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 7: 531-536).
En otro ejemplo, la expresión del gen específico del tumor LAGE-I (que no se expresa en próstata normal, pero sí en el 25-50% de los cánceres de próstata) es inducida por desoxi-azacitidina en células linfoblastoides, sugiriendo que la expresión tumoral es debida a la desmetilación (Lethe et al., 1998, Int. J. Cancer 76 (6): 903-908). En este contexto, en la técnica se conocen un conjunto de ensayos para examinar el estado de metilación de un gen. Por ejemplo, se puede utilizar en estrategias de hibridación Southern, enzimas de restricción sensibles a la metilación que no pueden dividir secuencias que contienen sitios CpG metilados con el fin de valorar el estado de metilación global de las islas CpG.
Además, la MSP (PCR específica de metilación) puede retratar rápidamente el estado de metilación de todos los sitios CpG presentes en una isla CpG de un gen determinado. Este procedimiento implica la modificación inicial del ADN por bisulfito sódico (que convertirá todas las citosinas no metiladas en uracilo) seguido de la amplificación utilizando cebadores específicos para ADN metilado frente a no metilado. Los protocolos que implican la interferencia de la metilación también se pueden encontrar por ejemplo en Current Protocols In Molecular Biology, Units 12, Frederick M. Ausubel et al. eds., 1995.
En la presente invención se describen ensayos útiles en la determinación de la presencia de cáncer en un individuo, que comprende detectar una cambio significativo en las variantes por empalme alternativo de STEAP expresadas en una célula o muestra de tejido a analizar en relación con los niveles de expresión en la correspondiente célula o tejido normal. El seguimiento de las variantes por empalme alternativo de STEAP es útil porque los cambios en el empalme alternativo de las proteínas se sugieren como una de las etapas en la serie de sucesos que conducen a la progresión de los cánceres (véase, por ejemplo, Carstens et al., Oncogene 15 (250: 3059-3065 (1997)).
La amplificación génica proporciona un método adicional de valoración del estado de STEAP. La amplificación génica se puede medir en una muestra directamente, por ejemplo, mediante transferencia southern, transferencia northern convencionales para cuantificar la transcripción del ARNm [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 (1980)], transferencia por puntos (análisis de ADN), o hibridación in situ, utilizando una sonda marcada apropiadamente, en base a las secuencias proporcionadas en la presente invención. Alternativamente, se pueden utilizar anticuerpos que pueden reconocer cadenas dobles específicas, incluyendo cadenas dobles de ADN, cadenas dobles de ARN, cadenas dobles híbridas de ADN y ARN o cadenas dobles de ADN-.proteína. Los anticuerpos a su vez se pueden marcar y el ensayo se puede llevar a cabo cuando la cadena doble se une a una superficie, de manera que tras la formación de la cadena doble en la superficie, se puede detectar la presencia de anticuerpo unido a la cadena doble.
Además de los tejidos descritos anteriormente, se puede analizar de manera conveniente la sangre periférica por la presencia de células cancerosas, incluyendo, pero sin limitación, cánceres de próstata, utilizando RT-PCR para detectar la expresión de STEAP. La presencia de ARNm de STEAP amplificable por RT-PCR proporciona una indicación de la presencia del cáncer. Los ensayos de detección por RT-PCR para células tumorales en sangre periférica se evalúan actualmente para su uso en el diagnóstico y tratamiento de un conjunto de tumores sólidos humanos. En el campo del cáncer de próstata, éstos incluyen ensayos RT-PCR para la detección de células que expresan PSA y PSM (Verkaik et al, 1997, UroL Res. 25: 373-384; Ghossein et al., 1995, J. Clin. Oncol. 13: 1195-2000; Heston et al, 1995, Clin. Chem. 41: 1687-1688). Los ensayos RT-PCR son conocidos en la técnica.
En la presente invención se describen métodos para predecir la susceptibilidad de desarrollar cáncer en un individuo. En una realización, un método para predecir la susceptibilidad al cáncer comprende detectar ARNm de STEAP o la proteína STEAP en una muestra de tejido, indicando su presencia la susceptibilidad al cáncer, donde el grado de expresión de ARNm de STEAP presente es proporcional al grado de susceptibilidad. En una realización específica, se examina la presencia de STEAP en tejido de próstata, proporcionando la presencia de STEAP en la muestra una indicación de la susceptibilidad al cáncer de próstata (o la aparición o existencia de un tumor de próstata). En una relación más estrechamente relacionada, se puede evaluar la integridad de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de STEAP en una muestra biológica a efectos de identificar perturbaciones en la estructura de estas moléculas, tales como inserciones, deleciones, sustituciones y similares, proporcionando la presencia de una o más perturbaciones en los productos génicos de STEAP una indicación de la susceptibilidad al cáncer (o la aparición o existencia de un tumor).
En la presente invención también se describen métodos para evaluar la agresividad del tumor. En una realización, un método para evaluar la agresividad del tumor comprende determinar el nivel de ARNm de STEAP o proteína STEAP expresado por células en una muestra del tumor, comparando el nivel determinado de esta manera con el nivel de ARNm de STEAP o proteína STEAP expresado en un tejido normal correspondiente tomado del mismo individuo o una muestra de referencia de tejido normal, donde el grado de expresión de ARNm de STEAP o de proteína STEAP en la muestra del tumor en comparación con la muestra normal indica el grado de agresividad. En una realización específica, la agresividad de los tumores de próstata se evalúa mediante la determinación del grado en el que se expresa la STEAP en las células tumorales, indicando una mayor expresión tumores más agresivos. En una realización estrechamente relacionada, se puede evaluar la integridad de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de STEAP en una muestra biológica a efectos de identificar perturbaciones en la estructura de estas moléculas, tales como inserciones, deleciones, sustituciones y similares, indicando la presencia de una o más perturbaciones tumores más agresivos.
También se describen en la presente invención métodos para observar la progresión de un tumor en un individuo con el tiempo. En una realización, los métodos para observar la progresión de un tumor en un individuo con el tiempo comprenden la determinación del nivel de ARNm de STEAP o proteína STEAP expresada por células en una muestra del tumor, la comparación del nivel así determinado con el nivel de ARNm de STEAP o proteína STEAP expresado por células en una muestra del tumor, la comparación del nivel así determinado con el nivel de ARNm de STEAP o proteína expresada expresado en una muestra de tejido equivalente extraída del mismo individuo en un tiempo diferente, donde el grado de expresión de ARNm de STEAP o proteína STEAP en la muestra de tumor con el tiempo proporciona información sobre la progresión del cáncer. En una realización específica, la progresión del cáncer se evalúa mediante la determinación del grado en el que la expresión de STEAP en las células tumorales se altera con el tiempo, indicado niveles con mayor expresión una progresión del cáncer. En una realización estrechamente relacionada, se puede evaluar la integridad de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de STEAP en una muestra biológica a efectos de identificar perturbaciones en la estructura de estas moléculas, tales como inserciones, deleciones, sustituciones, y similares, indicando la presencia de una o más perturbaciones una progresión del cáncer.
Las estrategias de diagnóstico anteriores se pueden combinar con cualquier de una amplia variedad de protocolos de pronóstico y diagnóstico conocidos en la técnica. Por ejemplo, otra realización descrita aquí está dirigida a métodos para observar una coincidencia entre la expresión del gen de STEAP y los productos génicos de STEAP (o perturbaciones en el gen de STEAP y productos génicos de STEAP) y un factor que se asocia con tumores como medio de diagnóstico y pronóstico del estado de una muestra de tejido. En este contexto, se puede utilizar una amplia variedad de factores asociados con tumores, tales como la expresión de genes asociados en cualquier caso con tumores (incluyendo la expresión de PSA, PSCA y PSM), así como observaciones citológicas generales (véase, por ejemplo, Bocking et al, 1984, AnaL Quant. Cytol. 6 (2): 74-88; Epstein, 1995, Hum. PathoL 1995 Feb; 26 (2): 223-9; Thorson et al., 1998, Mod. PathoL 11 (6): 543-51; Baisden et al., 1999, Am. J. Surg. PathoL 23 (8): 918-24). Los métodos para observar una coincidencia entre la expresión del gen de STEAP y los productos génicos de STEAP (o perturbaciones en el gen de STEAP y productos génicos de STEAP) y un factor adicional que se asocia con tumores son útiles, por ejemplo, porque la presencia de un grupo o constelación de factores específicos que coinciden proporciona información crucial para el diagnóstico y pronóstico del estado de una muestra de tejido.
En una realización típica, los métodos para observar una coincidencia entre la expresión del gen de STEAP y los productos génicos de STEAP (o perturbaciones en el gen de STEAP y productos génicos de STEAP) y un factor que se asocia con tumores comprende la detección de la sobreexpresión de ARNm de STEAP o la proteína STEAP en un muestra de tejido, la detección de la sobreexpresión de ARNm de PSA o proteína PSA en una muestra de tejido, y la observación de una coincidencia de la sobreexpresión de ARNm de STEAP o proteína STEAP y el ARNm de PSA o proteína PSA. En una realización específica, se examina la expresión de ARNm de STEAP y PSA en tejido de próstata. En una realización preferida, la coincidencia de la sobreexpresión de ARNm de STEAP y PSA en la muestra proporciona una indicación del cáncer de próstata, la susceptibilidad por el cáncer de próstata o la aparición o existencia de un tumor de próstata.
En la presente invención se describen métodos para detector y cuantificar la expresión del ARNm de STEAP o proteína STEAP y utilizan tecnologías estándar de detección y cuantificación de ácidos nucleicos y proteínas conocidas en la técnica. Los métodos estándar para la detección y cuantificación de ARNm de STEAP incluyen hibridación in situ utilizando ribosondas de STEAP marcadas, transferencia Northern y técnicas relacionadas que utilizan sondas de polinucleótidos de STEAP, análisis por RT-PCR utilizando cebadores específicos para STEAP y otros métodos de detección de tipo amplificación, tales como, por ejemplo, ADN ramificado, SISBA, TMA y similares. En una realización específica, se puede utilizar RT-PCR semi-cuantitativa para detectar y cuantificar la expresión de ARNm de STEAP tal como se describe en los ejemplos siguientes. Se puede utilizar para este objetivo cualquier cantidad de cebadores capaces de amplificar STEAP., incluyendo, pero sin limitación, varios grupos de cebadores descritos específicamente aquí. Se pueden utilizar para este objetivo métodos estándar para la detección y cuantificación de proteína. En una realización específica, se pueden utilizar anticuerpos policlonales o monoclonales especialmente reactivos con la proteína STEAP de tipo salvaje en un ensayo inmunohistoquímico de tejido de biopsia. Los anticuerpos dirigidos contra la proteína STEAP también se pueden utilizar para detectar STEAP en una muestra de paciente (por ejemplo, sangre, orina, semen u otra muestra) utilizando técnicas convencionales, tales como clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y/o ELISA.
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Identificación de moléculas que interaccionan con STEAP
Las secuencias de proteína STEAP descritas aquí permiten al experto en la materia identificar proteínas, moléculas pequeñas y otros agentes que interacciona con STEAP y mecanismos activados por STEAP a través de cualquiera de un conjunto de protocolos aceptados en la técnica. Por ejemplo, se puede utilizar uno del conjunto de sistemas denominados atrapamiento por interacción (también referido como "ensayo de dos híbridos"). En dichos sistemas, las moléculas que interaccionan reconstituyen un factor de transcripción y la expresión directa de un gen informador, la expresión del cual se analiza a continuación. Los sistemas habituales identifican interacciones proteína-proteína in vivo a través de la reconstitución de un activador transcripcional eucariota y se describen, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos Nos.5,955,280, 5,925,523, 5,846,722 y 6,004,746.
Alternativamente, se pueden identificar moléculas que interaccionan con las secuencias de proteína STEAP mediante el cribado de bibliotecas de péptidos. En dichos métodos, se identifica péptidos se unen a moléculas receptoras seleccionadas, tales como STEAP, mediante cribado de bibliotecas que codifican una colección de aminoácidos aleatorios o controlados. Los péptidos codificados por las bibliotecas se expresan como proteínas de fusión de proteínas de la cubierta de bacteriófagos y las partículas de bacteriófagos se criban a continuación contra los receptores de interés. Los péptidos que tienen una amplia variedad de usos, tales como reactivos terapéuticos o de diagnóstico, se pueden identificar así sin ninguna información anterior sobre la estructura de molécula ligando o receptora esperada. Las bibliotecas de péptidos habituales y los métodos de cribado que se pueden utilizar para identificar moléculas que interaccionan con secuencias de proteínas STEAP se describen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nos. 5,723,286 y 5,733,731.
Alternativamente, las líneas celulares que expresan STEAP se pueden utilizar para identificar interacciones proteína-proteína mediadas por STEAP. Esta posibilidad se puede examinar utilizando técnicas de inmunoprecipitación mostradas por otros (Hamilton BJ, et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999,261: 646-51). Habitualmente, la proteína STEAP se puede inmunoprecipitar a partir de las líneas de células de cáncer de próstata que expresan STEAP utilizando anticuerpos anti-STEAP. Alternativamente, los anticuerpos contra etiquetas de His se pueden utilizar en una línea celular diseñada para expresar STEAP (vectores mencionados anteriormente). El complejo inmunoprecipitado se puede examinar por la asociación a proteínas mediante procedimientos, tales como transferencia western, marcaje con ^{35}S-metionina de proteínas, microsecuenciación de proteínas, tinción de plata y electroforesis en gel
bidimensional.
Las moléculas pequeñas que interaccionan con STEAP se pueden identificar a través de realizaciones relacionadas de dichos ensayos de cribado. Por ejemplo, se pueden identificar moléculas pequeñas que interfieren con la función de STEAP, incluyendo moléculas que interfieren con la capacidad de STEAP de unirse a células y/o de modular la formación, progresión, migración y/o apoptosis de tumores. Los métodos típicos se describen por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos No. 5,928,868 e incluyen métodos para formar ligandos híbridos en los que por lo menos un ligando es una molécula pequeña. En una realización ilustrativa, el ligando híbrido se introduce en células que a su vez contienen un primer y un segundo vector de expresión. Cada vector de expresión incluye ADN para la expresión de una proteína híbrida que codifica una proteína diana unida a una secuencia codificante para un módulo transcripcional. Las células contienen además un gen informador, la expresión del cual se acondiciona en la proximidad de la primera y la segunda proteínas híbridas entre sí, un suceso que tiene lugar sólo si el ligando híbrido se une a sitios dianas en ambas proteínas híbridas. Se seleccionan las células que expresan el gen informador y se identifican la molécula pequeña desconocida o la proteína híbrida desconocida.
En la presente invención se describe un método de cribado de una molécula que interacciona con una secuencia de aminoácidos de STEAP mostrada en las figuras 11A-B, que comprende las etapas de contactar una población de moléculas con la secuencia de aminoácidos de STEAP, permitir que la población de moléculas y la secuencia de aminoácidos de STEAP interaccionen bajo condiciones que facilitan una interacción, determinar la presencia de una molécula que interacciona con la secuencia de aminoácidos de STEAP y, a continuación, separar moléculas que no interaccionan con la secuencia de aminoácidos de STEAP de moléculas que no interaccionan con la secuencia de aminoácidos de STEAP. En una realización específica, el método incluye además purificar una molécula que interacciona con la secuencia de aminoácidos de STEAP. En una realización preferida, la secuencia de aminoácidos de STEAP se pone en contacto con una biblioteca de péptidos. En los siguientes ejemplos, se describen ensayos adicionales para identificar moléculas que modulan la función de STEAP.
En la presente invención también se describe un método de cribado de una molécula que modula la actividad de STEAP o un mecanismo relacionado con STEAP. El método comprende poner en contacto una molécula con una célula que expresa una proteína STEAP y determinar la actividad de STEAP o un mecanismo relacionado con STEAP. La determinación puede ser a través del uso de uno de los ensayos de fosforilación descritos en los ejemplos siguientes, tales como transferencia western con un anticuerpo dirigido a una molécula de señalización fosforilada. Las alteraciones en la fosforilación de la molécula de señalización indican una molécula candidata que modula la actividad de STEAP o un mecanismo relacionado con STEAP.
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Método terapéutico y composiciones
La identificación de STEAP como proteína del cáncer de próstata abre un conjunto de estrategias terapéuticas al tratamiento del cáncer de próstata y otros cánceres asociados a STEAP. Tal como se ha descrito anteriormente, la STEAP es una proteína transmembrana y su interacción con otras células y moléculas juega probablemente un papel en la regulación del medio de la próstata y el inicio, desarrollo y/o progresión del cáncer. STEAP se puede dirigir a terapia mediante estrategias dirigidas a inhibir la actividad de la proteína STEAP, inhibir la unión o asociación de la proteína STEAP con otras células y moléculas, inhibir la transcripción o traducción de STEAP, y/o a través del uso de vacunas contra el cáncer basadas en STEAP. La estrategia terapéutica se puede diseñar por tanto para inhibir una función de la molécula para la reconocer la propia molécula STEAP.
El perfil de expresión de STEAP es reminiscente de MAGEs, PSA y PMSA, que son genes específicos de tejido que favorecen la expresión en melanomas y otros cánceres (Van den Eynde and Boon, Int J Clin Lab Res. 27: 81-86, 1997). Debido a su expresión específica de tejido y los niveles de expresión elevados en cáncer, estas moléculas se están investigando actualmente como dianas para vacunas contra el cáncer (Durrant, Anticancer Drugs 8: 727-733, 1997; Reynolds et al., Int J Cancer 72: 972-976, 1997). El patrón de expresión de STEAP proporciona evidencia de que así mismo es una diana ideal para una estrategia de vacuna contra el cáncer para el cáncer de próstata, ya que su expresión no se detecta en la mayoría de tejidos normales.
Por consiguiente, se espera que las estrategias terapéuticas que reconocen motivos concretos de STEAP, o se dirigen a inhibir la actividad de la proteína STEAP, sean útiles para pacientes que padecen de cáncer de próstata y otros cánceres que expresan STEAP. Las estrategias terapéuticas dirigidas a inhibir la actividad de la proteína STEAP se encuentran generalmente en dos clases. Una clase comprende varios métodos para inhibir la unión o asociación de la proteína STEAP con su compañero de unión o con otras proteínas. Otra clase comprende una variedad de métodos para inhibir la transcripción del gen de STEAP o la traducción del ARNm de STEAP.
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STEAP como Diana para la terapia basada en anticuerpos
La naturaleza de la superficie celular y los perfiles de expresión de las STEAP en cánceres que incluyen cáncer de próstata indican que son dianas prometedoras para la terapia con anticuerpos del cáncer de próstata y otros cánceres que expresan STEAP. Los resultados experimentales descritos en los ejemplos de la presente invención proporcionan evidencia convincente de que STEAP-1 y STEAP-2 se expresan ampliamente y de manera uniforme sobre la superficie de las células epiteliales glandulares en las células de próstata y del cáncer de próstata. En particular, los resultados del análisis inmunohistoquímico muestran que la superficie de las células epiteliales de próstata humana (normal y cáncer) parece estar recubierta de manera uniforme con STEAP-1. El análisis bioquímico confirma la localización en la superficie celular de STEAP-1 sugerido inicialmente por sus 6 elementos estructurales primarios transmembrana putativos y por la tinción pericelular claramente evidente por tinción inmunohistoquímica.
STEAP-1 y STEAP-2 se expresan uniformemente a niveles elevados sobre la superficie del epitelio glandular de la próstata, una situación ideal para estrategias de intervención inmunoterapéutica que reconocen epítopos de STEAP extracelulares. Se esperaría que la administración sistémica de composiciones inmunoreactivas a STEAP diera lugar a un contacto extenso de la composición con las células epiteliales de la próstata a través de la unión a epítopos extracelulares de STEAP. Además, dada la casi ausencia de la expresión de la proteína STEAP-1 en tejidos humanos normales, existe una razón amplia para esperar una sensibilidad extraordinaria sin efectos tóxicos, no específicos y/o no dirigidos causados por la unión de la composición inmunoterapéutica a STEAP-1 en órganos y tejidos no diana.
Además de la expresión de STEAP-1 a nivel elevado en células de próstata y del cáncer de próstata, parece que STEAP-1 se sobreexpresa sustancialmente en una variedad de otros cánceres humanos, incluyendo cánceres de vejiga, pulmón, colon, pancreático y de ovario. En particular, la expresión de ARNm de STEAP-1 a nivel elevado se detecta en todos los tejidos y líneas celulares de cáncer de próstata analizados, y en la mayoría de las líneas celulares de cáncer pancreático, de colon y vejiga analizadas. La expresión a nivel elevado de STEAP-1 también se observa en algunas líneas celulares de cáncer de ovario. Se observa un nivel de expresión inferior en ciertas líneas celulares de cáncer de mama, testicular y cervical. También se detecta un nivel de expresión muy elevado en una línea celular del sarcoma de Ewing. Los solicitantes han demostrado que la proteína STEAP de la superficie celular se expresa en cánceres de vejiga, pulmón y colon, mientras que no existe una proteína de STEAP-2 de la superficie celular (o intracelular) detectable. Los anticuerpos específicamente reactivos con dominios extracelulares de STEAP-1 pueden ser útiles para tratar estos cánceres de manera sistemática, como conjugados de toxina o de agente terapéutico o como anticuerpos desnudos capaces de inhibir la proliferación o función celular.
La proteína STEAP-2 también se expresa en el cáncer de próstata y en otros cánceres también, incluyendo cánceres de colon y pulmón. El análisis de ARNm de STEAP-2 mediante RT-PCR y transferencia northern muestran que la expresión se limita a la próstata en tejidos normales, también se expresa en algunos cánceres de próstata, pancreático, de colon, testicular, de ovario y otros cánceres. Por lo tanto, los anticuerpos reactivos con STEAP-2 pueden ser útiles en el tratamiento del cáncer de próstata y otros cánceres. De manera similar, la expresión de STEAP-3 y STEAP-4 (así como otras STEAP) se puede asociar con algunos cánceres. De este modo, los anticuerpos reactivos con estas proteínas miembros de la familia de STEAP también pueden ser útiles terapéuticamente.
Los anticuerpos de STEAP se pueden introducir en un paciente, de manera que el anticuerpo se une a STEAP en las células de cáncer y media en la destrucción de las células y el tumor, inhibe el crecimiento de las células o el tumor y/o elimina la función de STEAP en el tumor primario, en micrometástasis circulante y/o en metástasis establecida. El grado de vascularización del tumor puede proporcionar una guía sobre qué estrategia de liberación se recomienda. De manera similar, se esperaría que el grado y/o estadio de la enfermedad proporcionara información útil en este aspecto. Por ejemplo, un tumor más avanzado de grado superior es más probable que produzca metástasis, sugiriendo una administración sistémica con el fin de tratar o prevenir la aparición de metástasis. Los mecanismos por los cuales los anticuerpos ejercen un efecto terapéutico pueden incluir citólisis mediada por complemento, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo, modular la función fisiológica de STEAP, inhibir la unión a ligando o los mecanismos de transducción de señal, modular la diferenciación de células tumorales, alterar los perfiles de factores de angiogénesis tumoral y/o inducir apoptosis. Los anticuerpos de STEAP conjugados a agentes tóxicos o terapéuticos también se pueden utilizar terapéuticamente para liberar el agente tóxico o terapéutico directamente a células tumorales que portan STEAP.
La inmunoterapia contra el cáncer que utiliza anticuerpos anti-STEAP puede seguir los conocimientos de varias estrategias que se han utilizado con éxito en el tratamiento de otros tipos de cáncer, incluyendo, pero sin limitación, cáncer de colon (Arlen et al., 1998, Crit. Rev. Immunol. 18: 133-138), mieloma múltiple (Ozaki et al., 1997, Blood 90: 3179-3186; Tsunenari et al., 1997, Blood 90: 2437-2444), cancer gástrico (Kasprzyk et al., 1992, Cancer Res. 52: 2771-2776), linfoma de células B (Funakoshi et al., 1996, J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 19: 93-101), leukemia (Zhong et al., 1996, Leuk. Res. 20: 581-589), cancer colorrectal (Moun et al., 1994, Cancer Res. 54: 6160-6166); Velders et al., 1995, Cancer Res. 55: 4398-4403), y cáncer de mama (Shepard et al., 1991, J. Clin. Immunol. 11: 117-127). Ciertas estrategias terapéuticas implican la conjugación de anticuerpo desnudo a una toxina, tal como la conjugación de ^{131}I a anticuerpos anti-CD20 (por ejemplo, Bexxar, Coulter Pharmaceutical), mientras que otras implican la coadministración de anticuerpos y otros agentes terapéuticos, tales como Herceptin^{TM} (trastuzumab) con paclitaxel (Genentech, Inc.). Para el tratamiento del cáncer de próstata, por ejemplo, los anticuerpos de STEAP se pueden administrar conjuntamente con radiación, quimioterapia o ablación hormonal.
Aunque la terapia con anticuerpos de STEAP puede ser útil para todas las etapas del cáncer, la terapia con anticuerpos puede ser particularmente apropiada en cánceres avanzados o metastásicos. El tratamiento con la terapia con anticuerpos de la presente invención se puede indicar para pacientes que han recibido previamente uno o más tratamientos quimioterapéuticos, mientras que puede ser preferido la combinación de la terapia con anticuerpos de la presente invención con una régimen quimioterapéutico o de radiación para pacientes que no han recibido tratamiento quimioterapéutico. Adicionalmente, la terapia con anticuerpos puede permitir el uso de dosis reducidas de quimioterapia concomitante, particularmente para pacientes que no toleran muy bien la toxicidad del agente quimioterapéutico.
Puede ser deseable para algunos pacientes de cáncer evaluar la presencia y nivel de la expresión de STEAP, preferiblemente utilizando valoraciones inmunohistoquímicas del tejido tumoral, obtención de imágenes con STEAP cuantitativo, u otras técnicas capaces de indicar de manera fiable la presencia y el grado de expresión de STRAP. El análisis inmunohistoquímico de biopsias tumorales o muestras quirúrgicas puede ser preferible para este objetivo. Los métodos para el análisis inmunohistoquímico de tejidos tumorales son conocidos en la técnica.
Los anticuerpos monoclonales anti-STEAP útiles en el tratamiento del cáncer de próstata y otros cánceres incluyen aquellos capaces de iniciar una respuesta inmune potente contra el tumor y aquellos que son capaces de dirigir la citotoxicidad. En este aspecto, los anticuerpos monoclonales (mAbs) anti-STEAP pueden producir la lisis de células tumorales mediante mecanismos de citotoxicidad celular mediada por complemento o de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC), los cuales requieren una parte Fc intacta de la molécula de inmunoglobulina para la interacción con sitios de receptor de Fc de células efectoras o proteínas complementarias. Además, los mAbs anti-STEAP que ejercen un efecto biológico directo sobre el crecimiento del tumor son útiles en la práctica de la invención. Los mecanismos potenciales por los cuales pueden actuar directamente dichos mAbs citotóxicos incluyen la inhibición del crecimiento celular, modulación de la diferenciación celular, modulación de los perfiles del factor angiogénico del tumor, y la inducción de la apoptosis. El mecanismo por el cual un mAb anti-STEAP particular ejerce un efecto anti-tumoral se puede evaluar utilizando cualquier conjunto de ensayos in vitro diseñados para determinar ADCC,
ADMMC, lisis celular mediada por complemento y así sucesivamente, tal como se conoce en general en la técnica.
La actividad antitumoral de un mAb anti-STEAP particular, o combinación de mABs anti-STEAP, se puede evaluar in vivo utilizando un modelo animal adecuado. Por ejemplo, modelos de cáncer de próstata xenogénicos en los que se introducen los explantes de cáncer de próstata humanos o tejidos de xenoinjertos pasados en animales inmunes comprometidos, tales como ratones desnudos o SCID, son apropiados en relación al cáncer de próstata y han sido descritos (Patente de Estados Unidos No. 6,107,540; Klein et al., 1997, Nature Medicine 3:402-408). Por ejemplo, la Solicitud de Patente PCT W098/16628, Sawyers et al., publicada el 23 de Abril, 1998, describe varios modelos de xenoinjerto de cáncer de próstata humano capaz de recapitular el desarrollo de tumores primarios, micrometástasis, y la formación de metástasis osteoblástica característica de estadios tardíos de la enfermedad. La eficacia puede ser predecida usando ensayos que miden la inhibición de la formación del tumor, la regresión del tumor o metástasis, y similares.
El uso de anticuerpos monoclonales murinos u otros anticuerpos no-humanos, o mAbs quiméricos humano/ratón puede inducir de moderadas a fuertes respuestas inmunes en algunos pacientes. En algunos casos, esto dará lugar a la depuración del anticuerpo de la circulación y una eficacia reducida. En los casos más graves, tal respuesta inmune puede llevar a la formación extensa de complejos inmunes que, potencialmente, pueden causar fallo renal. Por consiguiente, los anticuerpos monoclonales preferidos usados en la práctica de los métodos terapéuticos de la invención son aquellos que son completamente humanos o están humanizados y que se unen específicamente al antígeno STEAP diana con alta afinidad pero muestran una antigenicidad baja o inexistente en el paciente.
Los métodos terapéuticos de la invención contemplan la administración de mAbs anti-STEAP únicos así como combinaciones, o cócteles, de diferentes mAbs. Estos cócteles de mAb pueden tener ciertas ventajas en tanto en cuanto contienen mAbs que reconocen diferentes epítopos, explotan diferentes mecanismos efectores o combinan directamente mAbs citotóxicos con mAbs que dependen de la funcionalidad efectora inmune. Estos mAbs en combinación pueden exhibir efectos terapéuticos sinérgicos. Además, la administración de mAbs anti-STEAP puede estar combinada con otros agentes terapéuticos, incluyendo, pero sin limitación, a varios agentes quimioterapéuticos, bloqueantes de andrógenos, e inmunomoduladores (por ejemplo, IL-2, GM-CSF). Los mAbs anti-STEAP pueden ser administrados en sus formas desnudas o conjugadas, o pueden tener agentes terapéuticos conjugados a los mismos.
Los anticuerpos monoclonales anti-STEAP utilizados en la práctica del método de la presente invención se pueden formular en composiciones farmacéuticas que comprenden un portador adecuado para el método de liberación deseado. Los portadores adecuados incluyen cualquier material que cuando se combina con los mAbs anti-STEAP mantiene la función anti-tumoral del anticuerpo y es no reactiva con los sistemas inmunes del sujeto. Entre los ejemplos se incluyen, pero sin limitación, cualquiera de un conjunto de portadores farmacéuticas estándar, tales como soluciones salinas tamponadas en fosfato estériles, agua bacteriostática, y similar.
Las formulaciones de anticuerpos anti-STEAP se pueden administrar a través de cualquier ruta capaz de liberar los anticuerpos al sitio del tumor. Las rutas potencialmente eficaces de administración incluyen, pero sin limitación, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intratumoral, intradérmica, y similar. La ruta de administración preferida es mediante inyección intravenosa. Una formulación preferida para inyección intravenosa comprende los mAbs anti-STEAP en una solución de agua bacteriostática conservada, agua no conservada estéril, y/o diluidos en bolsas de cloruro de polivinilo o polietileno que contienen Cloruro de Sodio para Inyección estéril al 0,9%, USP. La preparación de mAB anti-STEAP se puede liofilizar y guardar como un polvo estéril, preferiblemente al vacío y a continuación se reconstituye en agua bacteriostática que contiene, por ejemplo, el conservante alcohol bencílico, o en agua estéril antes de la inyección.
El tratamiento generalmente implicará la administración repetida de la preparación del anticuerpo anti-STEAP mediante una ruta de administración aceptable, tal como la inyección intravenosa (IV), habitualmente a una dosis en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal. Una dosis en el intervalo de 10-500 mg de mAb por semana puede ser efectiva y bien tolerada. En base a la experiencia clínica con el mAb Herceptina en el tratamiento de cáncer de mama metastásico, una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg de peso corporal del paciente IV seguida por dosis semanales de aproximadamente 2 mg/kg IV de la preparación de mAb anti-STEAP puede representar un régimen de dosis aceptable. Preferiblemente, la dosis de carga inicial se administra como una infusión de 90 minutos o más larga. La dosis de mantenimiento periódica puede ser como una infusión de 30 minutos o más larga, siempre que la dosis inicial sea bien tolerada. Sin embargo, como entenderá un experto en la materia, varios factores influirán en el régimen de dosis ideal en un caso particular. Estos factores pueden incluir, por ejemplo, la afinidad de unión y la vida media del Ab o mAbs usados, el grado de sobreexpresión de STEAP en el paciente, la extensión del antígeno STEAP escindido circulante, el nivel de concentración deseado del anticuerpo en estado estacionario, frecuencia del tratamiento, y la influencia de agentes quimioterapéuticos usados en combinación con el método de tratamiento de la invención.
Óptimamente, los pacientes deberían ser evaluados por el nivel del cobertizo del antígeno STEAP escindido circulante en suero a fin de ayudar en la determinación del régimen de dosis más eficaz y factores relacionados. Estas evaluaciones también pueden ser usadas para monitorizar objetivos mediante terapia, y puede ser útil para evaluar el éxito terapéutico en combinación con la evaluación de otros parámetros (tales como niveles de PSA en suero en la terapia contra el cáncer de próstata).
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Inhibición de la función de la proteína STEAP
La presente invención describe varios métodos y composiciones para inhibir la unión de STEAP a su compañero de unión o ligando, o su asociación con otras proteína o proteínas, así como métodos para inhibir la función de STEAP.
Inhibición de STEAP con Proteínas Recombinantes
En una estrategia, se utilizan moléculas recombinantes que son capaces de unirse a STEAP evitando así que STEAP acceda/se una a su compañero o compañeros de unión o se asocie con otra proteína o proteínas, para inhibir la función de STEAP. Estas moléculas recombinantes pueden, por ejemplo, contener la parte o partes reactivas de una molécula anticuerpo específica de STEAP. En una realización particular, se puede diseñar el dominio de unión a STEAP de un compañero de unión de STEAP en una proteína de fusión dimérica que comprende dos dominios de unión a ligando de STEAP conectados a la parte de Fc de una IgG humana, tales como una IgG1 humana. Esta parte de IgG puede contener, por ejemplo, los dominios C_{H}2 y C_{H}3 y la región bisagra, pero no el dominio C_{H}1. Estas proteínas de fusión diméricas pueden ser administradas en forma soluble a pacientes que sufren un cáncer asociado a la expresión de STEAP, incluyendo, pero sin limitación, el cáncer de próstata, donde la proteína de fusión dimérica se une específicamente a STEAP bloqueando así la interacción de STEAP con un compañero de unión y/o modulando la función de STEAP. Estas proteínas de fusión diméricas pueden ser además combinadas en proteínas multiméricas usando tecnologías de unión de anticuerpos conocidas.
Inhibición de STEAP con Anticuerpos Intracelulares
En otra estrategia, se pueden introducir vectores recombinantes que codifican anticuerpos de cadena única que específicamente se unen a STEAP en células que expresan STEAP mediante tecnologías de transferencia de genes, en donde el anticuerpo anti-STEAP de cadena única codificado se expresa intracelularmente, se une a la proteína STEAP, y así inhibe su función. Son conocidos métodos para diseñar estos anticuerpos intracelulares de cadena única. Estos anticuerpos intracelulares, también conocidos como "intracuerpos", pueden ser dirigidos específicamente a un compartimento particular de la célula, proporcionando control sobre donde se focaliza la actividad inhibidora del tratamiento. Esta tecnología ha sido aplicada con éxito en la técnica (para revisar, ver Richardson and Marasco, 1995, TIBTECH vol. 13). Se ha observado que los intracuerpos eliminan prácticamente la expresión de receptores en la superficie celular que en cualquier otro modo son abundantes. Ver, por ejemplo, Richardson et al, 1995, Proc. Nad. Acad. Sci. USA 92:3137-3141; Beerli et al, 1994, J. Biol. Chem. 289:23931-23936; Deshane et al, 1994, GeneTher. 1: 332-337.
Los anticuerpos de cadena única comprenden los dominios variables de la cadena pesada y ligera unida por un polipéptido conector flexible, y se expresan como un único polipéptido. Opcionalmente, los anticuerpos de cadena única pueden expresarse como un fragmento de la región variable de la cadena simple unido a la región constante de la cadena ligera. Se pueden diseñar señales de circulación intracelular bien conocidas en vectores de polinucleótidos recombinantes que codifican estos anticuerpos de cadena única con el fin de dirigir de forma precisa el intracuerpo expresado al compartimento intracelular deseado. Por ejemplo, los intracuerpos dirigidos al retículo endoplasmático (RE) pueden diseñarse para incorporar un péptido líder y, opcionalmente, una señal en el RE de retención en el C-terminal, tal como el motivo de aminoácido KDEL. Los intracuerpos con intención de ejercer la actividad en el núcleo se pueden diseñar para incluir una señal de localización nuclear. Se pueden unir grupos de lípidos a los intracuerpos con el fin de unir el intracuerpo al lado citosólico de la membrana plasmática. Los intracuerpos también pueden ser dirigidos para ejercer funciones en el citosol. Por ejemplo, los intracuerpos citosólicos se pueden utilizar para secuestrar factores en el citosol, evitando así que sean transportados a su destino celular natural.
En una realización, los intracuerpos STEAP se diseñan para unirse específicamente a un dominio de STEAP particular. Por ejemplo, los intracuerpos citosólicos que se unen específicamente a la proteína STEAP se pueden utilizar para evitar que moléculas relacionadas con STEAP consigan acceder al núcleo, evitando así que ejerzan cualquier actividad biológica en el núcleo.
Con el fin de dirigir la expresión de dichos intracuerpos específicamente a células tumorales particulares, se puede colocar la trascripción del intracuerpo bajo el control regulador de un promotor y/o potenciador específico de tumor adecuado. Con el fin de dirigir la expresión del intracuerpo específicamente en la próstata, por ejemplo, se puede utilizar el promotor y/o promotor/potenciador de PSA (Ver, por ejemplo, Patente de Estados Unidos No. 5,919,652).
Inhibición de la Transcripción o Traducción de STEAP
En otra clase de estrategias terapéuticas, la presente invención describe varios métodos y composiciones para inhibir la trascripción del gen de STEAP. De forma similar, la presente invención también describe métodos y composiciones para inhibir la traducción del ARNm del STEAP en la proteína.
En una estrategia, un método para inhibir la transcripción del gen de STEAP comprende poner en contacto el gen de STEAP con un polinucleótido antisentido de STEAP. En otra estrategia, un método para inhibir la traducción del ARNm de STEAP comprende poner en contacto el ARNm de STEAP con un polinucleótido antisentido. En otra estrategia, se puede utilizar una ribozima específica de STEAP para cortar el mensaje de STEAP, inhibiendo así la traducción. Estos métodos basados en antisentido y ribozima también pueden dirigirse a las regiones reguladoras del gen de STEAP, tales como el promotor y/o elementos potenciadores de STEAP. De forma similar, las proteínas capaces de inhibir el factor de trascripción del gen de STEAP pueden utilizarse para inhibir la trascripción del ARNm de STEAP. Los diferentes polinucleótidos y composiciones útiles en los métodos mencionados anteriormente han sido descritos más arriba. El uso de moléculas antisentido y ribozimas para inhibir la trascripción y traducción es conocido en la técnica.
Otros factores que inhiben la trascripción de STEAP mediante la interferencia de la activación transcripcional de STEAP pueden también ser útiles para el tratamiento de cánceres que expresan STEAP. De forma similar, los factores que son capaces de interferir con el procesado de STEAP pueden ser útiles para el tratamiento de cánceres que expresan STEAP. Los métodos para el tratamiento del cáncer que utilizan estos factores también están en el alcance de la presente invención.
Consideraciones generales para estrategias terapéuticas
Las tecnologías de transferencia de genes y terapia génica pueden utilizarse para liberar moléculas de polinucleótidos terapéuticas a células tumorales que sintetizan STEAP (es decir, antisentido, ribozima, polinucleótidos que codifican intracuerpos y otras moléculas inhibidoras de STEAP). En la técnica se conocen un conjunto de terapias génicas. Los vectores recombinantes que codifican polinucleótidos antisentido de STEAP, ribozimas, factores capaces de interferir en la trascripción de STEAP, y así sucesivamente, pueden liberarse a células tumorales diana usando dichas estrategias de terapia génica.
Las estrategias terapéuticas anteriores se pueden combinar con cualquiera de una amplia variedad de regímenes de quimioterapia o terapia por radiación. Estas estrategias terapéuticas también permiten el uso de dosis reducidas de quimioterapia y/o administración menos frecuente, particularmente en pacientes que no toleran bien la toxicidad del agente quimioterapéutico.
La actividad antitumoral de una composición particular (por ejemplo, antisentido, ribozima, intracuerpo), o una combinación de dichas composiciones, se puede evaluar usando varios sistemas de ensayo in vitro e in vivo. Los ensayos in vitro para evaluar potenciales agentes terapéuticos incluyen ensayos de crecimiento celular, ensayos de agar blando y otros ensayos indicativos de la actividad promotora del tumor, ensayos de unión capaces de determinar el grado en el que una composición terapéutica inhibirá la unión de STEAP a un compañero de unión, etc.
In vivo, el efecto de una composición terapéutica de STEAP puede evaluarse en un modelo de animal adecuado. Por ejemplo, los modelos de cáncer de próstata xenogénicos en los que se introducen los explantes de cáncer de próstata humanos o tejidos de xenoinjertos pasados en animales inmunes comprometidos, tales como ratones desnudos o SCID, son apropiados en relación al cáncer de próstata y han sido descritos (Patente de Estados Unidos No. 6,107,540; Klein et al, 1997, Nature Medicine 3:402-408). Por ejemplo, la Solicitud de Patente PCT W098/16628, Sawyers et al, publicada el 23 de Abril, 1998, describe varios modelos de xenoinjerto de cáncer de próstata humano capaz de recapitular el desarrollo de tumores primarios, micrometástasis, y la formación de metástasis osteoblástica característica de estadios tardíos de la enfermedad. La eficacia puede ser predecida usando ensayos que miden la inhibición de la formación del tumor, la regresión del tumor o metástasis, y similares. Ver, también, los ejemplos siguientes.
Los ensayos in vivo que califican la inducción de apoptosis también pueden ser útiles para evaluar las composiciones terapéuticas potenciales. En una realización, los xenoinjertos de ratones portadores tratados con la composición terapéutica pueden examinarse por la presencia de focos apoptóticos y compararse con el ratón portador del xenoinjerto de control no tratado. El grado en el que se encuentran los focos apoptóticos en los tumores de los ratones tratados proporciona una indicación de la eficacia terapéutica de la composición.
Las composiciones terapéuticas usadas en la práctica de los métodos anteriores pueden ser formuladas en composiciones farmacéuticas, incluyendo composiciones de vacuna, que comprenden un portador adecuado para el método de liberación adecuado. Entre los portadores adecuados se incluyen cualquier material que cuando se combina con la composición terapéutica retiene la función antitumoral de la composición terapéutica y no es reactivo con el sistema inmune de los pacientes. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, cualquiera de un conjunto de portadores farmacéuticos estándar, tales como soluciones salinas tamponadas con fosfato estériles, agua bacteriostática, y similares (ver, en general, Remington's Pharmaceutical Sciences 16th Edition, A. Osal., Ed., 1980).
Las formulaciones terapéuticas pueden solubilizarse y administrarse mediante una ruta capaz de liberar la composición terapéutica al sitio del tumor. Las rutas de administración potencialmente eficaces incluyen, pero sin limitación, intravenosa, parenteral, intraperitoneal, intramuscular, intratumoral, intradérmica, intraorgánica, ortotópica, y similares. Una formulación preferida para la inyección intravenosa comprende la composición terapéutica en una solución de agua conservada bacteriostática, agua estéril no conservada, y/o diluida en cloruro de polivinilo o bolsas de polietileno que contienen Cloruro Sódico para Inyección estéril al 0,9%, USP. Las preparaciones terapéuticas de la proteína se pueden liofilizar y guardar como polvos estériles, preferiblemente al vacío, y a continuación se reconstituye en agua bacteriostática que contiene, por ejemplo, el conservante alcohol bencílico, o en agua estéril antes de la inyección.
Los protocolos de dosis y administración para el tratamiento de cánceres usando los métodos anteriores variarán con el método y el cáncer diana y generalmente dependerá de un conjunto de otros factores apreciados en la técnica.
Vacunas contra el cáncer
La presente invención proporciona además vacunas contra el cáncer que comprenden una proteína STEAP-2 o fragmento de la misma, así como vacunas basadas en el DNA. En vista de la expresión de STEAP limitada a la próstata -y al tumor-, se espera que las vacunas de STEAP contra el cáncer sean efectivas en la prevención específica y/o tratamiento de cánceres que expresan STEAP sin crear efectos no específicos en los tejidos que no son diana. El uso de un antígeno de tumor en una vacuna para la generación de inmunidad humoral e inmunidad mediada por células para el uso en la terapia anti-cáncer se conoce bien en la técnica y ha sido empleado en el cáncer de próstata usando inmunógenos PSMA humano y PAP de roedores (Hodge et al, 1995, Int. J. Cancer 63: 231-237; Fong et al., 1997, J. Immunol. 159: 3113-3117). Estos métodos se pueden llevar a la práctica fácilmente usando una proteína STEAP, o fragmento de la misma, o una molécula de ácido nucleico que codifica STEAP y vectores recombinantes capaces de expresar y presentar apropiadamente el inmunógeno de STEAP.
Por ejemplo, se pueden utilizar sistemas de liberación de genes virales para liberar una molécula de ácido nucleico que codifica STEAP. Varios sistemas de liberación de genes virales que se pueden utilizar en la práctica de este aspecto de la invención incluyen, pero sin limitación, vaccinia, viruela aviar, viruela del canario, adenovirus, gripe, poliovirus, virus adeno-asociados, lentivirus, y virus sindbus (Restifo, 1996, Curr. Opin. Immunol. 8: 658-663). Los sistemas de liberación no virales también pueden utilizarse usando DNA desnudo que codifica una proteína STEAP o fragmento de la misma introducido en el paciente (por ejemplo, intramuscularmente) para inducir una respuesta antitumoral. En una realización, se puede utilizar ADNc de STEAP humano de longitud completa.
En una realización, una vacuna de STEAP contra el cáncer se basa en la identificación de péptidos inmunogénicos en la secuencia de aminoácidos de STEAP mostrada en las figuras 11A-B. Tal como se describe posteriormente en los ejemplos siguientes, se ha observado que STEAP induce las respuestas de las células T y B. Los polipéptidos STEAP-1 y STEAP-2 se han utilizado para generar una respuesta inmune en ratones y conejos para la producción de anticuerpos monoclonales y policlonales. Por tanto, se pueden seleccionar partes específicas de STEAP, y polinucleótidos que codifican estas partes, para la producción de una vacuna contra el cáncer. Un ejemplo de dicha parte de una proteína STEAP son los residuos de aminoácidos 14 a 28 de la secuencia de aminoácidos STEAP-1 mostrada en las figuras 1A-B (WKMKPRRNLEEDDYL; SEC ID NO: 22).
En otra realización, se pueden utilizar moléculas de ácido nucleico de STEAP que codifican epítopos de linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos. Se pueden determinar epítopos de CTL usando algoritmos específicos (por ejemplo, Epimer, Brown University) para identificar péptidos en una proteína STEAP que son capaces de unirse óptimamente a alelos específicos de HLA. Un algoritmo adecuado es el algoritmo HLA Peptide Motif Search disponible en la web de Bioinformatics and Molecular Analysis Section (BIMAS) (http://bimas.dcrt.nih.gov/). Este algoritmo se basa en el enlace de secuencias peptídicas específicas en el surco de las moléculas de HLA de clase I y específicamente de HLA-A2 (Falk et al, 1991, Nature 351:290-6; Hunt et al, 1992, Science 255:1261-3; Parker et al, 1992, J. Immunol. 149:3580-7; Parker et al., 1994, J. Immunol. 152:163-75). El algoritmo HLA Peptide Motif Search permite la localización y clasificación de péptidos de 8 unidades, 9 unidades, y 10 unidades de una secuencia proteica completa para predecir la unión a HLA-A2, así como a otras moléculas de Clase I. La mayoría de péptidos de unión a HLA-A2 tienen 9 unidades, favorablemente conteniendo una leucina en la posición 2 y una valina o leucina en la posición 9 (Parker et al., 1992, J. Immunol. 149:3580-7). La unión real de los péptidos al HLA-A2 se puede evaluar mediante estabilización de la expresión de HLA-A2 en la línea celular T2 defectuosa en el procesado del antígeno (Xue et al, 1997, Prostate 30:73-8; Peshwa et al, 1998, Prostate 36: 129-38). La inmunogenicidad de péptidos específicos se pueden evaluar in vitro mediante la estimulación de CTL CD8+ en presencia de células dendríticas (Xue et al.; Peshwa et al, supra).
Los péptidos STEAP específicos previstos para unirse a HLA-A2 y preferidos para su uso en vacunas contra el cáncer incluyen péptidos que corresponden con los aminoácidos 165-173 de STEAP-1, los aminoácidos 86-94 de STEAP-1, los aminoácidos 262-270 de STEAP-1, los aminoácidos 302-310 de STEAP-1, los aminoácidos 158-166 de STEAP-1, los aminoácidos 227-235 de STEAP-2, los aminoácidos 402-410 de STEAP-2, los aminoácidos 307-315 de STEAP-2, los aminoácidos 306-314 de STEAP-2, y los aminoácidos 100-108 de STEAP-2.
También se pueden utilizar varias estrategias ex vivo. Una estrategia implica el uso de células dendríticas para presentar el antígeno de STEAP al sistema inmune del paciente. Las células dendríticas expresan MHC de clase I y II, el coestimulador B7, e IL-12, y por tanto, son células presentadoras de antígenos altamente especializadas. En el cáncer de próstata, se están utilizando células dendríticas autólogas pulsadas con péptidos del antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA) en un ensayo clínico de fase I para estimular el sistema inmune del paciente con cáncer de próstata (Tjoa et al, 1996, Prostate 28: 65-69; Murphy et al., 1996, Prostate 29: 371-380). Pueden utilizarse células dendríticas para presentar los péptidos STEAP a las células T en el contexto de moléculas de MHC de clase I y II. En una realización, las células dendríticas autólogas se pulsan con péptidos STEAP capaces de unirse a moléculas MHC. En otra realización, las células dendríticas se pulsan con la proteína STEAP completa. Otra realización implica el diseño de la sobreexpresión del gen de STEAP en células dendríticas usando varios vectores de aplicación conocidos en la técnica, tales como adenovirus (Arthur et al, 1997, Cancer Gene Ther. 4: 17-25), retrovirus (Henderson et al, 1996, Cancer Res. 56: 3763-3770), lentivirus, virus adeno-asociados, transfección del ADN (Ribas et al, 1997, Cancer Res. 57: 2865-2869), y transfección de ARN derivada de tumores (Ashley et al, 1997, J. Exp. Med. 186: 1177-1182). También se pueden diseñar células que expresan STEAP para expresar inmunomoduladores, tales como GM-CSF, y usarse como agentes inmunizantes.
También se pueden utilizar anticuerpos anti-idiotípicos anti-STEAP en la terapia anticancerosa como vacuna para inducir una respuesta inmune en células que expresan una proteína STEAP. Específicamente, la generación de anticuerpos anti-idiotípicos es conocida en la técnica y se puede adaptar fácilmente para generar anticuerpos anti-idiotípicos anti-STEAP que mimetizan un epítopo en una proteína STEAP (ver, por ejemplo, Wagner et al., 1997, Hybridoma 16: 33-40; Foon et al., 1995, J Clin Invest 96: 334-342; Herlyn et al, 1996, Cancer Immunol Immunother 43: 65-76). Este anticuerpo anti-idiotípico se puede utilizar en estrategias de vacunas contra el cáncer.
Se pueden utilizar métodos de inmunización genética para generar respuestas inmunes humorales y celulares profilácticas o terapéuticas dirigidas contra células cancerosas que expresan STEAP. Se pueden inyectar construcciones que comprenden ADN que codifica una proteína/inmunógeno de STEAP y secuencias reguladoras apropiadas directamente en el músculo o piel de un individuo, de manera que las células del músculo o la piel incorporan la construcción y expresan la proteína/inmunógeno de STEAP codificada. La expresión del inmunógeno de la proteína STEAP da lugar a la generación de una inmunidad humoral y celular profiláctica o terapéutica contra el cáncer de próstata y otros cánceres que expresan STEAP. Se pueden utilizar varias técnicas de inmunización genéticas profilácticas y terapéuticas conocidas en la técnica (para revisar, ver información y referencias publicadas en la dirección de Internet www.genweb.com).
Composiciones de diagnóstico y kits
Para el uso en las aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas descritas o sugeridas anteriormente, la invención también describe kits. Estos kits pueden comprender un medio portador, estando dividido en compartimentos para recibir de forma confinada uno o más recipientes, tales como viales, tubos, y similares, comprendiendo cada uno de los medios recipientes uno de los elementos separados para ser usados en el método. Por ejemplo, uno de los medios recipientes puede comprender una sonda que está o puede estar marcada de manera detectable. Esta sonda puede ser un anticuerpo o polinucleótidos específicos para una proteína STEAP o un gen o mensaje de STEAP, respectivamente. Cuando el kit utiliza la hibridación a ácidos nucleicos para detectar el ácido nucleico diana, el kit también puede tener recipientes que contienen nucleótido o nucleótidos para la amplificación de la secuencia de ácidos nucleicos diana y/o un recipiente que comprende un medio informador, tal como una proteína de unión a la biotina, tal como avidina o estreptavidina, unida a una molécula informadora, tal como un marcador enzimático, fluorescente, o radioisótopo.
El kit tal como se describe en la presente invención comprende habitualmente el recipiente descrito anteriormente y uno o más de otros recipientes que comprenden materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, incluyendo tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas, y prospectos con instrucciones de uso. Puede estar presente un marcador en el recipiente para indicar que la composición se usa para una terapia específica o una aplicación no terapéutica, y también puede indicar indicaciones para cualquier uso tanto in vivo como in vitro, tal como se describió anteriormente.
Por consiguiente, la presente invención también proporciona composiciones de diagnóstico que comprenden moléculas relacionadas con STEAP. Estas moléculas incluyen varios polinucleótidos de STEAP-2, cebadores, sondas, proteínas, fragmentos, anticuerpos descritos aquí. Las moléculas incluidas en la composición de diagnóstico pueden estar opcionalmente marcadas con un marcador detectable. Composiciones de diagnóstico de STEAP pueden comprender además tampones, diluyentes, y otros ingredientes, según se desee, apropiados.
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Ejemplos
Varios aspectos de la invención se describen e ilustran adicionalmente mediante varios ejemplos que se indican a continuación, ninguno de los cuales pretende limitar el alcance de la invención.
Ejemplo 1 Aislamiento generado por SSH de fragmento de ADNc del gen de STEAP Materiales y Métodos Xenoinjertos LAPC
Los xenoinjertos LAPC se obtuvieron del Dr. Charles Sawyers (UCLA) y se generaron tal como se ha descrito (Klein et al, 1997, Nature Med. 3: 402-408; Craft et al, 1999, Cancer Res. 59: 5030-5036). Los xenoinjertos LAPC-4 dependientes e independientes de andrógeno (LAPC-4 AD y AI, respectivamente) y xenoinjertos LAPC-9 dependientes e independientes de andrógeno (LAPC-9 AD y Al, respectivamente) se desarrollaron en ratones SCID machos intacto o en machos castrados, respectivamente, y se hicieron pases como pequeños trozos de tejido en machos receptores. Xenoinjertos LAPC-4 Al se derivaron de tumores LAPC-4 AD y los xenoinjertos LAPC-9 Al se derivaron de tumores LAPC-9 AD. Para generar los xenoinjertos Al, se castraron ratones machos portadores de tumores LAPC AD y se mantuvieron durante 2-3 meses. Después del recrecimiento de los tumores LAPC, los tumores se cultivaron y se hicieron pases en los machos castrados o en ratones SCID hembra.
Los xenoinjertos LAPC-4 AD se desarrollaron intratibialmente tal como se indica a continuación. El tejido tumoral de xenoinjerto LAPC-4 AD desarrollado subcutáneamente se dividió en secciones de 1-2 mm, mientras que el tejido se bañó en un medio Iscoves 1X, el tejido troceado se centrifugó a continuación a 1,3K rpm durante 4 minutos, el sobrenadante se resuspendió en 10 ml de medio Iscoves 1X enfriado en hielo y se centrifugó a 1,3K rpm durante 4 minutos. El residuo celular se resuspendió a continuación en Iscoves 1X con pronasa E al 1% y se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente con agitación por vaivén suave seguido de la incubación en hielo durante 2-4 minutos. El filtrado se centrifugó a 1,3K rmp durante 4 minutos, y la pronasa se eliminó del residuo celular aspirado mediante la resuspensión en 10 mL de Iscoves y recentrifugación. A continuación, se emplacaron grupos de células en medio PrEGM y crecieron durante la noche. A continuación, las células se recogieron, se filtraron, se lavaron con RPMI 2 veces, y se contaron. Aproximadamente 50.000 células se mezclaron con un volumen igual de Matrigel enfriado en hielo con hielo, y se inyectaron quirúrgicamente en la metáfisis de la tibia proximal de ratones SCID mediante una aguja de medida 27. Después de 10-12 semanas, se recuperaron los tumores LAPC-4 que crecieron en la médula ósea.
Líneas celulares y tejidos
Se obtuvieron líneas celulares (por ejemplo, HeLa) de ATCC y se mantuvieron en DMEM con suero de ternera fetal al 5%. Los tejidos humanos para ARN y análisis de proteínas se obtuvieron del Human Tissue Resource Center (HTRC) en UCLA (Los Angeles, CA) y de QualTek, Inc. (Santa Barbara, CA).
Aislamiento del ARN
El tejido tumoral y las líneas celulares se homogenizaron en reactivo Trizol (Life Technologies, Gibco BRL) usando 10 ml/g de tejido o 10 ml/10^{8} células para aislar el ARN total. Se purificó Poli A ARN del ARN total usando los kits Mini y Midi de ARNm Oligotex de Qiagen. Se cuantificaron el ARN total y el ARNm mediante análisis espectrofotométrico (D.O. 260/280 nm) y se analizaron mediante electroforesis en gel.
Oligonucleótidos
Se usaron los siguientes oligonucleótidos purificados por HPLC.
DPNCDN (cebador de síntesis de ADNc):
5'TTTTGATCAAGCTT303' (SEC ID NO: 23) 
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Adaptador 1:
1
Adaptador 2:
2
Cebador de PCR 1:
5'CTAATACGACTCACTATAGGGC3' (SEC ID NO: 28) 
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Cebador anidado (NP) 1:
5'TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGA3' (SEC ID NO: 29) 
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Cebador anidado (NP) 2:
5'AGCGTGGTCGCGGCCGAGGA3' (SEC ID NO: 30) 
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Hibridación sustractiva y supresora
Se utilizó Hibridación sustractiva y supresora (SSH) para identificar ADNcs correspondientes a genes que puede aumentar su expresión en cáncer de próstata dependiente de andrógeno en comparación con hiperplasia prostática benigna (BPH).
Se sintetizaron ADNcs de doble cadena correspondientes al xenoinjerto LAPC-4 AD (de prueba) y el tejido de BPH (conductor) a partir de 2 \mug de ARN poli(A)+ aislado de xenoinjerto y tejido BPH, tal y como se describe anteriormente, utilizando el kit de Sustracción de ADNc de selección por PCR de CLONTECH y 1 ng de oligonucleótido RSACDN como cebador. Se llevó a cabo la síntesis de primera y segunda cadena tal y como se describe en el protocolo de manual de usuario del kit (CLONTECH Protocolo Nº PT1117-1, Catálogo Nº K1804-1). Se digirió el ADNc resultante con Rsa I durante 3 horas a 37ºC. Se extrajo el ADNc digerido con fenol/cloroformo (1:1) y se precipitó con etanol.
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Se generó ADNc (BPH) conductor mediante la combinación en una proporción de 4 a 1 ADNc de BPH digerido con Rsa I con ADNc digerido de hígado de ratón, con el objetivo de asegurar que se sustrajeran los genes de múrido del ADNc de prueba (LAPC-4 AD).
Se generó ADNc de prueba (LAPC-4 AD) mediante la dilución de 1 \mul de ADNc de LAPC-4 AD (400 ng) digerido con Rsa I en 5 \mul de agua. A continuación se unió el ADNc diluido (2 \mul, 160 ng) con 2 \mul de adaptador 1 y adaptador 2 (10 \muM), en reacciones de unión separadas, en un volumen total de 10 \mul a 16ºC durante toda la noche, utilizando 400 u de ADN ligasa de T4 (CLONTECH). Se terminó la unión con 1 \mul de EDTA 0,2 M y calentando a 72ºC durante 5 min.
Se realizó la primera hibridación mediante la adición de 1,5 \mul (600 ng) de ADNc conductor a cada uno de los dos tubos que contenían 1,5 \mul (20 ng) de ADNc de de prueba ligado a adaptador 1 y adaptador 2. En un volumen final de 4 \mul, las muestras se revistieron con aceite mineral, se desnaturalizaron en un ciclador térmico MJ Research a 98ºC durante 1,5 minutos, y a continuación se dejó hibridar durante 8 horas a 68ºC. A continuación, se mezclaron las dos hibridaciones con 1 \mul adicional de ADNc conductor desnaturalizado nuevo y se dejó que hibridara toda la noche a 68ºC. A continuación, se diluyó la segunda hibridación en 200 \mul de Hepes 20 mM, pH 8,3, NaCl 50 mM, EDTA 0,2 mM, se calentó a 70ºC durante 7 min. y se guardó a -20ºC.
Amplificación por PCR. Clonación y secuenciación de fragmentos de genes generados a partir de SSH
Para amplificar fragmentos de genes resultantes de reacciones SSH, se realizaron dos amplificaciones por PCR. En la reacción de PCR primaria se añadió 1 \mul de la mezcla de hibridación final diluida a 1 \mul de cebador 1 de PCR (10 \muM), 0,5 \mul de mezcla de dNTP (10 \muM), 2,5 \mul de 10 x tampón de reacción (CLONTECH) y 0,5 \mul de 50x Advantage cDNA polymerase Mix (CLONTECH) en un volumen final de 25 \mul. Se realizó la PCR 1 utilizando las siguientes condiciones: 75ºC durante 5 min., 94ºC durante 25 s., a continuación 27 ciclos de 94ºC durante 10 s., 66ºC durante 30 s., 72ºC durante 1,5 min. Se realizaron cinco reacciones PCR primarias separadas para cada experimento. Se agruparon los productos y se diluyeron 1:10 con agua. Para la reacción de PCR secundaria, se añadió 1 \mul de la reacción PCR primaria agrupada y diluida a la misma mezcla de reacción utilizada para PCR 1, excepto que se utilizaron los cebadores NP1 y NP2 (10 pM) en lugar del cebador 1 de PCR. Se realizó la PCR 2 utilizando 10-12 ciclos de 94ºC durante 10 s., 68ºC durante 30 s., 72ºC durante 1,5 minutos. Se analizaron los productos de PCR utilizando electroforesis en gel de agarosa al 2%.
Se insertaron los productos de PCR en pCR2.1 utilizando el kit de clonación de vector T/A (Invitrogen). Se sometió E. coli transformado a selección azul/blanco y de ampicilina. Se recogieron las colonias blancas y se dispusieron en placas de 96 pocillos y se crecieron en cultivo líquido durante toda la noche. Para identificar insertos, se realizó una amplificación por PCR en 1 ml de cultivo bacteriano utilizando las condiciones de PCR1 y como cebadores NP1 y NP2. Se analizaron los productos de PCR utilizando electroforesis en gel de agarosa al 2%.
Se guardaron clones bacterianos en glicerol al 20% en un formato de 96 pocillos. Se preparó ADN plasmídico, se secuenció, y se sometió a búsquedas por homología de ácido nucleico de las bases de datos Genbank, dbEST, y NCI-CGAP.
Análisis de expresión por RT-PCR
Se generaron ADNcs de la primera cadena a partir de 1 \mug de ARNm con oligo (dT)12-18 para cebar utilizando el sistema Gibco-BRL Superscript Preamplification. Se utilizó el protocolo de los fabricantes y se incluyó una incubación durante 50 min a 42ºC con la transcriptasa inversa seguido de tratamiento de con RNasa H a 37ºC durante 20 min. Después de completar la reacción, el volumen se incrementó hasta 200 \mul con agua antes de la normalización. Los ADNcs de la primera cadena de 16 tejidos humanos normales diferentes se obtuvieron de Clontech.
Se realizó la normalización de los ADNcs de la primera cadena de múltiples tejidos mediante el uso de los cebadores 5'atatcgccgcgctcgtcgtcgacaa3' (SEC ID Nº: 31) y 5'agccacacgcagctcattgtagaagg 3' (SEC ID Nº: 32) para amplificar la \beta-actina. Se amplificó el ADNc de la primera cadena (5 \mul) en un volumen total de 50 \mul que contenía cebadores 0,4 \muM, 0,2 \muM de cada dNTP, tampón 1X PCR (Clontech, Tris-HCl 10 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, KCl 50 mM, pH 8,3) y 1x ADN polimerasa Klentaq (Clontech). Se extrajeron cinco \mul de la reacción de PCR en los ciclos 18, 20 y 22 y se utilizaron para electroforesis en gel de agarosa. Se realizó la PCR utilizando un ciclador térmico MJ Research bajo las condiciones siguientes: la desnaturalización inicial fue a 94ºC durante 15 s., seguida de los ciclos 18, 20, y 22 de 94ºC durante 15, 65ºC durante 2 min, 72ºC durante 5 s. Se llevó a cabo una extensión final a 72ºC durante 2 min. Después de la electroforesis en gel de agarosa, se compararon las intensidades de banda de las bandas de \beta-actina de 283 pb de múltiples tejidos mediante inspección visual. Se calcularon factores de dilución para los ADNcs de la primera cadena para dar como resultado intensidades iguales de banda de \beta-actina en todos los tejidos después de 22 ciclos de PCR. Se requirieron tres rondas de normalización para conseguir intensidades de banda iguales en todos los tejidos después de 22 ciclos de PCR.
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Para determinar los niveles de expresión del gen 8P1D4, se analizaron 5 \mul de ADNc de la primera cadena normalizado mediante PCR utilizando 25, 30 y 35 ciclos de amplificación utilizando los siguientes pares de cebadores:
5' ACT TTG TTG ATG ACC AGG ATT GGA 3' (SEC ID Nº: 4)
5' CAG AAC TTC AGC ACA CAC AGG AAC 3' (SEC ID Nº: 5) 
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Se llevó a cabo un análisis de expresión semicuantitativo mediante la comparación de los productos de PCR en los números de ciclo que dan intensidades de banda débiles.
Resultados
Se realizaron varios experimentos de SSH tal y como se describe en Materiales y Métodos, supra, y condujeron al aislamiento de numerosos clones de fragmentos de genes candidatos. Se secuenciaron todos los clones candidatos y se sometieron a análisis de homología contra todas las secuencias en las bases de datos públicas principal de genes y EST con el objetivo de proporcionar información sobre la identidad del gen correspondiente y para ayudar a guiar en la decisión de analizar un gen concreto por su expresión diferencial. En general, los fragmentos de genes que no tenían homología con ninguna secuencia conocida en cualquiera de las bases de datos buscadas, y de ese modo consideradas que representan genes nuevos, así como fragmentos de genes que muestran homología con marcadores de secuencia expresados secuenciados previamente (ESTs), se sometieron a análisis de la expresión diferencial mediante RT-PCR y/o análisis Northern.
Uno de los clones de ADNc, designado 8P1D4, tenía 436 pb de longitud y mostró una homología con una secuencia EST en la base de datos de genes de tumores NCI-CGAP. Posteriormente se aisló el ADNc de longitud completa que codificaba el gen 8P1D4 utilizando este ADNc y se renombró como STEAP-1. La secuencia de nucleótidos de ADNc de 8P1D4 corresponde a los residuos de nucleótidos 150 a 585 en la secuencia de ADNc de STEAP-1, tal y como se muestra en la Fig. 1A-B. Otro clon, designado 28P3E1, de 561 pb de longitud mostró homología con diversas secuencias EST en la base de datos de genes de tumores NCI-CGAP o en otras bases de datos. Parte de la secuencia de 28P3E1 (356 pb) es idéntica a la EST derivada de tejido fetal humano. Después de que se obtuviera y se secuenciara el ADNc de STEAP-1 de longitud completa, era evidente que este clon también correspondía a STEAP-1 (más específicamente, a los residuos 622 hasta el extremo 3' de la secuencia de nucleótidos de STEAP-1 tal como se muestra en la Fig. 1A-B).
El análisis de expresión diferencial mediante RT-PCR utilizando cebadores derivados del clon de ADNc 8P1D4 mostró que el gen de 81PD4 (STEAP-1) se expresó en niveles aproximadamente iguales en próstata normal y los xenoinjertos LAPC-4 y LAPC-9 (Fig. 2, panel A). El análisis de expresión de RT-PCR adicional de los ADNcs de la primera cadena de tejidos normales 1 G mostró los mayores niveles de expresión de 8P1D4 en próstata. La expresión a nivel sustancialmente inferior en otros tejidos normales (es decir, colon, ovario, intestino delgado, bazo y testículos) sólo fue detectable a 30 ciclos de amplificación en cerebro, páncreas, colon e intestino delgado (Fig. 2, paneles B y C).
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Ejemplo 2 Aislamiento de ADNc que codifica el STEAP-1 de longitud completa
Se utilizó el fragmento de gen 8P1D4 de 436 pb (Ejemplo 1) para aislar ADNcs adicionales que codificaban el gen 8P1D4/STEAP-1. En resumen, se cribó una biblioteca de ADNc de próstata humana normal (Clontech) con una sonda marcada generada a partir del ADNc de 8P1D4 de 436 pb. Uno de los clones positivos, clon 10, tiene 1195 pb de longitud y codifica una proteína de 339 aminoácidos que tiene secuencia de nucleótidos y secuencias de aminoácidos codificadas que no tienen una homología significativa con ningún gen o proteína humanos conocidos (homología con la Proteína de Lesión de Riñón de rata recientemente descrita en la Solicitud Internacional W098/53071). La proteína codificada contiene por lo menos 6 motivos transmembrana previstos que implican una orientación en la superficie celular (ver Fig. 1A-B, motivos transmembrana previstos subrayados). Estas características estructurales llevaron a la designación "STEAP", por "Six Transmembrane Epithelial Antigen of the Prostate".
La identificación posterior de proteínas STEAP adicionales condujeron a la redesignación del producto del gen 8P1D4 como "STEAP-1". El ADNc de STEAP-1 y las secuencias de aminoácidos codificadas se muestran en la Fig. 1A-B y corresponden a las SEC ID Nº: 1 y 2, respectivamente. Se depositó el clon 10 de ADNc de STEAP-1 con la American Type Culture Collection ("ATCC") (10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 USA) como clon 10.1 del plásmido 8P1D4 el 26 de Agosto, 1998 como ATCC Número de Acceso 98849. El clon de ADNc de STEAP-1 se puede escindir del mismo utilizando la digestión doble de EcoRI/XbaI (EcoRI en el extremo 5', XbaI en el extremo 3').
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Ejemplo 3 Análisis de expresión de proteínas y genes de STEAP-1
Con el objetivo de empezar a caracterizar las características biológicas de STEAP-1, se realizó una evaluación extensa de la expresión de ARNm de STEAP-1 y de proteína STEAP-1 a lo largo de una variedad de muestras de tejido humano. Esta evaluación incluyó transferencia Northern, transferencia Western y análisis inmunohistoquímico de la expresión de STEAP-1 en un gran número de tejidos humanos normales, xenoinjertos y líneas celulares de cáncer de próstata humano, y otras diversas líneas celulares de cáncer humano.
Ejemplo 3A
Análisis por transferencia Northern de la expresión de ARNm de STEAP-1 en tejidos humanos normales
El análisis inicial de la expresión de ARNm de STEAP-1 en tejidos humanos normales se realizó mediante la transferencia Northern de dos "blots" de múltiples tejidos obtenidos de Clontech (Palo Alto, California), que comprenden un total de 16 tejidos humanos normales diferentes, utilizando el clon 10 de STEAP-1 marcado como sonda. Se normalizaron cuantitativamente muestras de ARN con sonda de \beta-actina. Los resultados se muestran en la Fig. 3A. Se detectó el nivel más alto de expresión en próstata normal, con un nivel de expresión aproximadamente 5-10 veces inferior detectada en colon e hígado. Estas transferencias northern mostraron dos transcritos de aproximadamente 1,4 kb y 4,0 kb, el primero de los cuales corresponde al ADNc de clon 10 de STEAP-1 de longitud completa, que codifica el marco de lectura abierto de STEAP-1 completo. El transcrito más amplio se clonó por separado como un ADNc de 3627 pb de una biblioteca de próstata normal, la secuencia de la cual contiene un intrón de 2399 pb
(Fig. 4).
Se extendió este análisis inicial mediante el uso de la sonda de STEAP-clon 10 para analizar una matriz de "blots" de puntos de ARN de 37 tejidos humanos normales (Clontech, Palo Alto, CA; Human Master Blot^{TM}). Los resultados se muestran en la Fig. 3B y muestran una fuerte expresión de STEAP-1 sólo en próstata. Se detectó un nivel muy bajo de expresión de ARN de STEAP-1 en hígado, pulmón, tráquea y tejido hepático fetal, a un nivel quizás 5 veces inferior en comparación con la próstata. No se detectó expresión en ninguno de los tejidos restantes. En base a estos análisis, la expresión significativa de STEAP-1 parece ser específica de la próstata en tejidos normales.
Ejemplo 3B
Análisis por transferencia Northern de la expresión de ARNm de STEAP-1 en xenoinjertos y líneas celulares de cáncer de próstata
Para analizar la expresión de STEAP-1 en tejidos y líneas celulares de cáncer humano, se analizaron los ARNs derivados de xenoinjertos de cáncer de próstata humana y un extenso panel de líneas celulares de cáncer de próstata y no de próstata mediante transferencia Northern utilizando el clon 10 de ADNc de STEAP-1 como sonda. Se normalizaron cuantitativamente todas las muestras de ARN mediante tinción con bromuro de etidio y posterior análisis con una sonda de \beta-actina marcada.
Los resultados, presentados en la Fig. 5, muestran un alto nivel de expresión de STEAP-1 en todos los xenoinjertos de LAPC y todas las líneas celulares de cáncer de próstata. La expresión en los xenoinjertos LAPC-9 fue superior en comparación con los xenoinjertos de LAPC-4, sin que se observaran diferencias significativas entre las sublíneas andrógeno-dependiente y andrógeno-independiente (Fig. 5A). La expresión en los xenoinjertos LAPC-4 fue comparable a la expresión en próstata normal. Se detectaron niveles inferiores de expresión en células PrEC (Clonetics), que representan el compartimento de células basales de la próstata. El análisis de líneas celulares de cáncer de próstata mostró niveles de expresión más altos en LNCaP, una línea celular de carcinoma de próstata dependiente de andrógeno. También se detectó expresión significativa en las líneas celulares andrógeno-independientes PC-3 y DU145. También se detectaron niveles altos de expresión de STEAP en tumores LAP-4 y LAP-9 que se desarrollaron en la tibia de ratones como modelo de metástasis en hueso del cáncer de próstata (Fig. 5B).
De manera significativa, también se detectó una expresión muy elevada de STEP-1 en muchas de las líneas celulares de cáncer humano no prostático analizadas (Fig. 5A). Se observó un nivel de expresión particularmente alto en células RD-ES, una línea celular derivada de sarcoma de Ewing (EWS). Adicionalmente, también se detectó un nivel de expresión muy alto en varias de las líneas celulares de cáncer de colon (por ejemplo, CaCo-2, LoVo, T84 y Colo-205), líneas celulares de carcinoma de vejiga (por ejemplo, SCABER, UM-UC-3, TCCSUP y 5637), líneas celulares de cáncer ovárico (por ejemplo, OV-1063 y SW 626) y líneas celulares de cáncer pancreático (por ejemplo, HPAC, Capan-1, PANC-1 y BxPC-3). Estos resultados, combinados con la ausencia de una expresión elevada en los tejidos normales correspondientes (Fig. 3), indican que en general se favorece la expresión de STEAP-1 en estos tipos (así como otros tipos) de cánceres humanos.
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Ejemplo 3C
Análisis por transferencia Western de la expresión de proteína STEAP-1 en cáncer de próstata y otros cánceres
Se sintetizó un péptido de 15 unidades correspondiente a los residuos de aminoácidos 14 a 28 de la secuencia de aminoácidos de STEAP-1 tal y como se muestra en la Fig. 1A-B (WKMKPRRNLEEDDYL; SEC ID Nº: 22) y se utilizó para inmunizar ovejas para la generación de anticuerpos policlonales de oveja hacia el extremo amino de la proteína (anti-STEAP-1) tal y como se indica a continuación. Se conjugó el péptido a KLH (hemocianina de lapa californiana). Inicialmente se inmunizó la oveja con 400 \mug de péptido en adyuvante de Freund completo. Posteriormente, se estimó el animal cada dos semanas con 200 \mug de péptido en adyuvante de Freund incompleto. Se purificó por afinidad el anticuerpo anti-STEAP de suero de oveja utilizando el péptido STEAP acoplado con affigel 10 (Bio Rad). Se guardó el anticuerpo purificado en solución salina tamponada con fosfato con ázida sódica al 0,1%.
Para evaluar la especificidad del anticuerpo, se clonó el ADNc de STEAP-1 en un vector de expresión retroviral (pSR\alphatkneo, Muller et al., 1991, MCB 11:1785). Se infectaron células NIH 3T3 con retrovirus que codificaban STEAP-1 y se seleccionaron en G418 durante 2 semanas. El análisis por transferencia de extractos de proteínas de células NIH 3T3 infectadas y no infectadas mostró la expresión de una proteína con un peso molecular aparente de 36 kD sólo en las células infectadas (Fig. 6, carriles marcadas "3T3 STEAP" y "3T3").
Se utilizó el anticuerpo policlonal anti-STEAP-1 para sondar "blots" western de lisados celulares preparados a partir de un conjunto de tejidos de xenoinjertos de cáncer de próstata, líneas celulares de cáncer de próstata y otras líneas celulares de cánceres que no son de próstata. Se normalizaron cuantitativamente las muestras de proteína (20 \mug cada una) mediante el sondeo de los "blots" con un anticuerpo anti-Grb-2.
Los resultados se muestran en la Fig. 6. Se detectó la proteína STEAP-1 en todos los xenoinjertos del cáncer de próstata LAPC, todas las líneas celulares del cáncer de próstata, una muestra de cáncer de próstata primario y su control de próstata normal correspondiente. Se detectó la expresión de proteína STEAP-1 más elevada en el xenoinjerto LAPC-9 y en las células LNCaP, de acuerdo con el análisis de transferencia northern descrito inmediatamente antes. También se observó una expresión de nivel elevado en la línea celular de carcinoma de vejiga UM-UC-3. También fue detectable la expresión en líneas celulares de otros cánceres (Fig. 6).
Ejemplo 3D
Análisis inmunohistoquímico de la expresión de la proteína STEAP-1 en biopsia de tumor de próstata y muestras quirúrgicos
Para determinar la extensión de la expresión de proteína STEAP-1 en materiales clínicos, se prepararon secciones de tejido a partir de un conjunto de biopsias y muestras quirúrgicas de cáncer de próstata para análisis inmunohistoquímico. Se fijaron los tejidos en formalina al 10%, se incrustaron en parafina, y se seccionaron de acuerdo con el protocolo estándar. Se utilizaron como control positivo las secciones fijadas con formalina e incrustadas en parafina de células LNCaP. Se tiñeron las secciones con un anticuerpo policlonal anti-STEAP-1 de oveja dirigido contra un epítopo N-terminal de STEAP-1 (tal y como se describe inmediatamente antes). Se tiñeron las secciones de LNCaP en presencia de una cantidad en exceso del péptido N-terminal de STEAP-1 inmunógeno utilizado para generar el anticuerpo policlonal (péptido 1) o un péptido no específico derivado de una región distinta de la proteína STEAP-1 (péptido 2; YQQVQQNKEDAWIEH; SEC ID Nº: 33).
Se muestran los resultados en la Fig.8. Las células LNCaP mostraron un tinción pericelular uniformemente intensa en todas las células (Fig. 8B). El péptido N-terminal de STEAP en exceso (péptido 1) era capaz de inhibir competitivamente la tinción con anticuerpo (Fig. 8A), mientras que el péptido 2 no tuvo ningún efecto (Fig. 8B). De un modo similar, se observó tinción pericelular uniformemente intensa en los xenoinjertos de cáncer de próstata de LAPC-9 (Fig. 8F) y LAPC-4. Estos resultados son claros y sugieren que la tinción es específica de STEAP. Además, estos resultados muestran la localización STEAP en la membrana plasmática, corroborando los descubrimientos bioquímicos presentados en el Ejemplo 4 de más adelante.
Los resultados obtenidos con las diversas muestras clínicas se muestran en la Fig. 8C (tejido prostático normal), la Fig. 8D (carcinoma prostático de grado 3), y la Fig. 8E (carcinoma prostático de grado 4), y también se incluyen en los resultados resumidos mostrados en la Tabla 1. Se observó una tinción de leve a intensa en el epitelio glandular de todas las muestras de cáncer de próstata, así como en todas las muestras derivadas de próstata normal o enfermedad benigna (por ejemplo, BPH). La señal parece ser más intensa en la membrana celular de las células epiteliales, especialmente en las uniones célula-célula (Fig. 8C-E) y también se inhibe con péptido 1 de N-terminal de STEAP en exceso. También se observa cierta tinción de células basales en próstata normal (Fig. 8C), que es más evidente cuando se examinan las glándulas atróficas. STEAP-1 parece expresarse en todos los estadios del cáncer de próstata desde los grados más bajos (Fig. 8D), grados más altos (Fig. 8E) y cáncer de próstata metastásico (representado por LAPC-9; Fig. 8F; Ver también la metástasis en paciente humano mostrada en la Fig. 32A-B) mostraron todos una tinción intensa.
La tinción inmunohistoquímica de un gran panel de tejidos no prostáticos normales no mostró expresión de STEAP-1 detectable en la mayoría de estos tejidos normales (Tabla 1). La vejiga normal mostró niveles bajos de tinción en la superficie celular del epitelio de transición (Fig. 8G). El páncreas, estómago, útero, trompas de Falopio y pituitaria mostraron niveles bajos de tinción citoplasmática (Tabla 1). No está claro si la tinción citoplasmática observada es específica o es debido a la unión no específica del anticuerpo, ya que la transferencia northern mostró entre poca y ninguna expresión de STEAP-1 en páncreas (Fig. 3). Estos resultados indican que la expresión en la superficie celular de STEAP-1 en tejidos normales parece estar restringida a la próstata y la vejiga.
TABLA 1 Tinción inmunohistoquímica de tejidos humanos con anticuerpo policlonal de oveja anti-STEAP-1
3
Ejemplo 3E
Análisis inmunohistoquímico de la expresión de la proteína STEAP-1 en cáncer de vejiga y de pulmón
Para determinar la extensión de la expresión de la proteína STEAP-1 en otros cánceres, se sometieron tejidos de muestras clínicas de cáncer de vejiga y pulmón a análisis inmunohistoquímico utilizando el anticuerpo policlonal y procedimientos tal y como se describe en el ejemplo 3D. Los resultados, mostrados en las Figuras 21 A-D, revelaron un patrón de tinción pericelular similar al observado con tejido de cáncer de próstata.
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Ejemplo 4 Caracterización bioquímica de la proteína STEAP-1
Para caracterizar inicialmente la proteína STEAP-1, se clonó el clon 10 de ADNc en el plásmido pcDNA 3.1 Myc-His (Invitrogen), que codifica una etiqueta de 6His en el extremo carboxilo, se transfectó en células 293T y se analizó mediante citometría de flujo utilizando un anticuerpo monoclonal anti-His (His-probe, Santa Cruz), así como el anticuerpo policlonal anti-STEAP-1 descrito anteriormente. Se realizó la tinción de las células en células intactas, así como en células permeabilizadas. Los resultados indicaron que sólo las células permeabilizadas se tiñeron con ambos anticuerpos, sugiriendo que ambos extremos de la proteína STEAP-1 se localizan intracelularmente. Por tanto, es posible que uno o más de los extremos de la proteína STEAP-1 estén asociados con orgánulos intracelulares más que con la membrana plasmática.
Para determinar si la proteína STEAP-1 se expresa en la superficie celular, se marcaron células 293T transfectadas con STEAP-1 intactas con un reactivo de biotinilación que no entra en las células vivas. A continuación, se inmunoprecipitó STEAP-1 a partir de extractos celulares utilizando los anticuerpos anti-His y anti-STEAP. Se inmunoprecipitaron antígeno T grande de SV40, una proteína intracelular que se expresa a niveles altos en células 293T, y el receptor endógeno de transferrina de la superficie celular como controles negativo y positivo, respectivamente. Después de la inmunoprecipitación, se transfirieron las proteínas a una membrana y se visualizaron con estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante. Los resultados de este análisis se muestran en la Fig. 7. Sólo se marcaron con biotina el receptor de transferrina (control positivo) y STEP-1, mientras que el antígeno T grande de SV40 (control negativo) no se marcó de forma detectable (Fig. 7A). Dado que sólo se marcaron proteínas de la superficie celular con esta técnica, está claro a partir de estos resultados que STEAP-1 es una proteína de superficie celular. En combinación con los resultados obtenidos del análisis de citometría de flujo, está claro que STEAP-1 es una proteína de superficie celular con extremos amino y carboxilo intracelulares.
Además, los resultados anteriores junto con las previsiones estructurales secundarias de STEAP-1, muestra que STEAP-1 es una proteína de membrana de tipo IIIa con una topología molecular de seis dominios transmembrana potenciales, 3 bucles extracelulares, 2 bucles intracelulares y dos extremos intracelulares. En la Fig. 1B se muestra una representación esquemática de la topología de la proteína STEAP-1 en relación con la membrana celular.
Además, se analizaron directamente células de cáncer de próstata, vejiga y colon por la expresión en la superficie celular de STEAP-1 mediante estudios de biotinilación. En resumen, se purificaron por afinidad las proteínas de superficie celular biotiniladas con gel de estreptavidina y se sondaron con el anticuerpo policlonal anti-STEAP descrito anteriormente. La transferencia Western de las proteínas purificadas con estreptavidina mostró claramente la biotinilación de la superficie celular de STEAP-1 endógeno en todas las células de cáncer de próstata (LNCaP, PC-3, DU145), vejiga (LJM-UC-3, TCCSUP) y colon (LoVo, Colo) evaluadas, así como en las células NIH 3T3 infectadas con un retrovirus que codifica STF-AP-1, pero no en células NIH 3T3 no expresantes utilizadas como control negativo (Fig. 7B). En un control negativo adicional, no se detectó proteína STEAP-1 en precipitados con estreptavidina de células que expresan STEAP no biotinilado (Fig. 7B).
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Ejemplo 5 Construcciones para la expresión recombinante de STEAP-1 Construcciones pGEX
Para expresar STEAP-1 en células bacterianas, se fusionaron partes de STEAP-1 al gen de Glutatión S-transferasa (GST) mediante clonación en pGEX-6P-1(Amersham Pharmacia Biotech, NJ). Se realizaron todas las construcciones para generar secuencias de proteína STEAP-1 recombinante con GST fusionado en el extremo N terminal y un epítopo de seis histidinas en el extremo C terminal. Se generó el epítopo etiqueta de seis histidinas mediante la adición de los codones de histidina al cebador de clonación en el extremo 3' del ORF. Un sitio de reconocimiento de Precisión permite la división de la etiqueta GST de STEAP-1. El gen de resistencia a la ampicilina y el origen de pBR322 permiten la selección y el mantenimiento del plásmido en E. coli. Los fragmentos siguientes de STEAP-1 se clonaron en pGEX-6P-1.
Aminoácidos de 148 a 251; aminoácidos de 144 a 339; aminoácidos de 39 a 253; aminoácidos de 70 a 136; aminoácidos de 254 a 313.
Y en pGEX-4T: Aminoácidos de 2 a 247; aminoácidos 135-318; y aminoácidos 144-339.
Construcciones adicionales de ejemplo que pueden realizarse en pGEX-6P-1 que abarcan las siguientes regiones de la proteína STEAP-1 incluyen:
Aminoácidos de 1 a 339; aminoácidos de 1 a 144.
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Construcción pcDNA3. 1/M ycHis
Para expresar STEAP-1 en células de mamífero, se clonó el ORF de STEAP-1 de 1.017 pb (con consenso Kozak de inicio traduccional) en pcDNA3.1/MycHis-Version B (Invitrogen, Carlsbad, CA). La expresión de proteína es dirigida a partir del promotor de citomegalovirus (CMV). La proteína recombinante tiene el myc y seis histidinas fusionadas al extremo C. El vector pcDNA3.1 /MycHis también contiene la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (BGH) y la secuencia de finalización de a trascripción para aumentar la estabilidad de ARNm junto con el origen de SV40 para la replicación episomal y el rescate del vector simple en líneas celulares que expresan el antígeno T grande. El gen de resistencia a Neomicina permite la selección de células de mamífero que expresan la proteína y el gen de resistencia a ampicilina y el origen de ColE1 permiten la selección y el mantenimiento del plásmido en E. coli.
Construcciones pSRa
Para generar líneas celulares de mamífero que expresan STEAP-1 constitutivamente, se clonó el ORF de 1.017 pb (con consenso Kozak de inicio traduccional) en construcciones pSRa. Se generaron retrovirus anfotrópicos y ecotrópicos mediante transfección de construcciones pSRa en la línea de empaquetamiento 293T-10A1 o co-transfección de pSRa y un plásmido auxiliar (\varphi-) en células 293, respectivamente. Puede utilizarse el retrovirus para infectar un conjunto de líneas celulares de mamífero, dando lugar a la integración del gen clonado, STEAP-1, en las líneas celulares huésped. La expresión de proteína es dirigida a partir de una repetición terminal larga (LTR). El gen de resistencia a Neomicina permite la selección de células de mamífero que expresan la proteína y el gen de resistencia a ampicilina y el origen de ColE1 permiten la selección y el mantenimiento del plásmido en E. coli. Se realizaron construcciones pSRa adicionales que fusionaron la etiqueta FLAG a los extremos C y N para permitir la detección utilizando anticuerpos anti-FLAG. Se añadió la secuencia FLAG 5' gat tac aag gat gac gac gat aag 3' (SEC ID Nº: 34) al cebador de clonación en el extremo 3' del ORF. Se realizó otra construcción pSRa que contenía los aminoácidos de 182 a 454. Esta forma truncada de la proteína STEAP-1 ayudará a determinar la función de la región N-terminal extracelular larga.
Se está realizando una construcción pSRa adicional para producir una proteína de fusión myc/6 HIS de la proteína STEAP-1 de longitud completa.
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Ejemplo 6 Identificación y análisis estructural de otras STEAPs humanas
STEAP-1 no presenta homología con ningún otro gen humano conocido. En un intento por identificar genes adicionales que sean homólogos a STEAP-1, la secuencia de proteína de STEAP-1 se utilizó como una sonda electrónica para identificar miembros de la familia en base de datos (dbEST) de EST (etiqueta de secuencia expresada) pública. Utilizando la función "tblastn" en NCBI (national Center for Biotechnology Information), se consultó la base de datos dbEST con la secuencia de la proteína STEAP-1. Este análisis reveló homólogos de STEAP-1 o miembros de la familia STEAP putativos adicionales, tal y como se describe adicionalmente más adelante.
Además, los experimentos de clonación de SSH también identificaron un fragmento de ADNc relacionado con STEAP-1, clon 98P4B6. Se aisló este clon de la clonación de SSH utilizando ADNc de próstata normal como evaluador y ADNc de LAPC-4 AD como conductor. Se aisló posteriormente una secuencia parcial más grande del clon 98P4B6 de una biblioteca de próstata normal; este clon codifica un ORF de 173 aminoácidos con estrecha homología con la estructura primaria de STEAP-1, y de este modo se designó STEAP-2. Se aisló un ADNc de STEAP-2 de longitud completa de 2454 pb de una biblioteca de próstata. En la Fig. 9A-D se muestran las secuencias de nucleótidos y las secuencias de aminoácidos de ORF codificadas de STEAP-2. En las Figs. 11A-B y 11C se muestra una alineación de aminoácidos de las estructuras primarias de STEAP-1 y de STEAP-2 parcial. STEAP-1 y 2 comparten un 61% de identidad sobre su solapamiento de 171 residuos de aminoácidos (Fig. 11C). Se ha depositado el ADNc de STEAP-2 con la American Type Culture Collection ("ATCC"; 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 USA) como plásmido 98P4B6-GTD3 en el 2 de julio de 1999 como ATCC Número de Acceso PTA-311.
El ADNc de STEAP-2 (98P4B6-GTD3) contiene una 5'UTR (región no traducida) de 355 pb que es un 72% rica en GC, sugiriendo que contiene elementos reguladores traduccionales. El ADNc codifica un marco de lectura abierto (ORF) de 454 aminoácidos (a.a.) con seis dominios transmembrana potenciales. Esto está en contraste con STEAP-1, que tiene 399 a.a. de longitud. La alineación con STEAP-1 demuestra un 54,9% de identidad sobre un solapamiento de 237 aminoácidos. De un modo destacado, las localizaciones de los seis dominios transmembrana putativos en STEAP-2 coinciden con las localizaciones de los dominios transmembrana en STEAP-1 (ver alineación). La homología de STEAP-2 con STEAP-1 es la más alta en las regiones abarcadas por desde el primer bucle extracelular putativo hasta el quinto dominio transmembrana. Este análisis y la secuencia de STEAP-2 sugieren algunas diferencias significativas entre STEAP-1 y STEAP-2: STEAP-2 muestra un extremo N terminal largo de 205 a.a. (en comparación con los 69 a.a. en STEAP-1) y un extremo C terminal intracelular corto de 4 a.a. (en comparación con los 26 a.a. en STEAP-1). Estas diferencias podrían implicar diferencias significativas en la función y/o la interacción con mecanismos de señalización intracelular. Para identificar un EST de ratón único correspondiente a STEAP-2, se utilizó el único extremo N terminal de STEAP-2 para consultar la base de datos dbEST. Se aisló una EST de ratón (AI747886, riñón de ratón) que podía utilizarse en la identificación de STEAP-2 de ratón y en el análisis de expresión de STEAP-2
en ratón.
También se identificaron dos ESTs que codificaban ORFs que portaban una estrecha homología con las secuencias de STEAP-1 y STEAP-2 mediante sondeo electrónico con la secuencia de la proteína STEAP-1. Se designaron provisionalmente estas ESTs (AI139607 y R80991) como STEAP-3 y STEAP-4. Posteriormente se clonó un ADNc de longitud completa que codificaba STEAP-3, y en la Fig. 10A-E se muestran sus secuencias de nucleótidos y de aminoácidos deducidos. Se ha depositado el ADNc de STEAP-3 con la American Type Culture Collection ("ATCC"; 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 USA) en el 8 de diciembre de 1999 como plásmido pSTEAP-3 EBB4 como ATCC Número de Acceso PTA-1033. En la Fig. 10F se reproducen las secuencias de nucleótidos de las ESTs correspondientes a las STEAPs.
En la Fig. 11A-B se muestra una alineación de aminoácidos de las estructuras de STEAP-1, STEAP-2, STEAP-3 y la secuencia parcial de la STEAP-4 putativa. Esta alineación muestra una estrecha similitud estructural entre las cuatro proteínas de la familia STEAP, en concreto en los dominios transmembrana previstos. Tal y como se indica anteriormente, STEAP-1 y STEAP-2 demuestran un 54,9% de identidad sobre un solapamiento de 237 aminoácidos. STEAP-1 y STEAP-3 presentan una identidad del 40,9% sobre una región de 264 aminoácidos, mientras que STEAP-2 y STEAP-3 presentan una identidad del 47,8% sobre una región de 416 aminoácidos.
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Ejemplo 7 Construcciones para la expresión recombinante de STEAP-2 Construcciones pGEX
Para expresar STEAP-2 en células bacterianas, partes de STEAP-2 se fusionaron al gen de la Glutatión S-transferasa (GST) mediante la clonación en pGEX-6P-1 (Amersham Pharmacia Biotech, NJ). Todas las construcciones se produjeron para generar secuencias de proteína STEAP-2 recombinante con GST fusionada en el extremo N-terminal y un epítopo de seis histidinas en el extremo C-terminal. El epítopo etiqueta de seis histidinas se generó mediante la adición de los codones de histidina al cebador de clonación en el extremo 3' del ORF. El sitio de reconocimiento PreScission^{TM} permite la división de la etiqueta de GST de STEAP-2. El gen de resistencia a ampicilina y el origen pBR322 permiten la selección y mantenimiento del plásmido en E. coli. Se clonaron los siguientes fragmentos de STEAP-2 en pGEX-6P-1:
Aminoácidos 287 a 390; aminoácidos 285 a 454; aminoácidos 193 a 454.
Las construcciones de ejemplo adicionales que se pueden producir en pGEX-6P-1 que comprenden las siguientes regiones de la proteína STEAP-2 incluyen:
Aminoácidos 1 a 193; aminoácidos 1 a 454.
Y en pGEX-4T: aminoácidos 2-204; 183-387; y 276-453.
Construcción pCRll
Para generar ribosondas sentido y antisentido para ARN en investigaciones in situ, se generó una construcción pCRII utilizando las pb 367 a 877 del ADNc de STEAP-3 GTD3. El vector pCRII tiene los promotores Sp6 y T7 que flanquean el inserto para dirigir la producción de ribosondas de ARN de STEAP-2 que se utilizaron en experimentos de hibridación in situ de ARN.
Construcción pcDNA4/H isMax-TOPO
Para expresar STEAP-2 en células de mamífero, se clonó el ORF de STEAP-2 de 1.362 pb en pcDNA4/HisMax-TOPO Version A (cat# K864-20, Invitrogen, Carlsbad, CA). La expresión de la proteína está dirigida a partir del promotor del citomegalovirus (CMV) y el potenciador traduccional SP163. La proteína recombinante tiene Xpress^{TM} y seis epítopos histidina fusionados al extreme N-terminal. Además de esta construcción que contiene sólo el ORF de 1.362 pb, se construyó una construcción adicional con el extremo C-terminal de la proteína recombinante que contenía una fusión de 28 aminoácidos resultante de las secuencias del vector antes del codón de terminación. El vector pcDNA4/HisMax-TOPO también contiene la señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovino (BGH) y la secuencia de terminación de la transcripción para aumentar la estabilidad del ARNm junto con el origen SV40 para la replicación episomal y el rescate del vector simple en líneas celulares que expresan el antígeno T grande. El gen de resistencia a Zeocina permite la selección de células de mamífero que expresan la proteína y el gen de resistencia a ampicilina y el origen ColE1 permite la selección y mantenimiento del plásmido en E. coli.
Construcción pcDNA3.1 /MycHis
Para expresar STEAP-2 en células de mamíferos, se clonó el ORF de STEAP-2 de 1.362 pb (con consenso Kozak inicial) en pcDNA3.1/MycHis Version A (Invitrogen, Carlsbad, CA). La expresión de la proteína está dirigida a partir del promotor del citomegalovirus (CMV). La proteína recombinante tiene myc y seis histidinas fusionadas al extremo C-terminal. El vector pcDNA3.1/MycHis también contiene la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovino (BGH) y la secuencia de terminación de la transcripción para aumentar la estabilidad del ARNm junto con el origen SV40 para la replicación episomal y el rescate del vector simple en líneas celulares que expresan el antígeno T grande. El gen de resistencia a neomicina permite la sección de células de mamífero que expresan la proteína y el gen de resistencia a ampicilina y el origen ColE1 permiten la selección y mantenimiento del plásmido en E. coli. Las construcciones de pcDNA3.1/MycHis adicionales se generaron utilizando los aminoácidos 6 a 454, 121-454 y 182-454 de STEAP-2.
pBlueBacHIS2a
Para expresar STEAP-1 en células de insecto SF9, se clonó el ORF de STEAP-1 en pBlueBacHIS2A (Invitrogen, California). La expresión de proteína está dirigida por el promotor de polihedrina. Las etiquetas poli His y Xpress N-terminales permite la detección y purificación de la proteína STEAP-1 recombinante. El sitio de reconocimiento de enteroquinasa C-terminal permite la división de estas etiquetas. El gen de resistencia a ampicilina y el origen ColE1 permiten la selección y mantenimiento del plásmido en E. coli. Tras la cotransfección con ADN de AcMNPV, tiene lugar una recombinación homóloga entre estas secuencias dando lugar a un virus recombinante que porta el gen de interés y la polihedrina. Están presentes un conjunto de sitios para enzimas de restricción para la subclonación simplificada. Además, un gen informador (\beta-galactosidasa) identifica de forma conveniente placas recombinantes para eliminar el cribado tedioso de placas.
Construcción pcDNA3.1CT-G FP-T OPO
Para expresar STEAP-2 en células de mamífero y para permitir la detección de la proteína recombinante utilizando fluorescencia, se clonó el ORF de 1.362 pb (con consenso Kozak inicial) en pcDNA3.1CT-GFP-TOPO (Invitrogen, CA). La expresión de proteína está dirigida a partir del promotor del citomegalovirus (CMV). La proteína recombinante tiene la Proteína Verde Fluorescente (GFP) fusionada al C-terminal lo que facilita la detección in vivo no invasiva y estudios de biología celular. El vector pcDNA3.1/MycHis también contiene la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovino (BGH) y la secuencia de terminación de la transcripción para aumentar la estabilidad de ARNm junto con el origen SV40 para la replicación episomal y el rescate del vector simple en líneas celulares que expresan el antígeno T grande. El gen de resistencia a neomicina permite la sección de células de mamífero que expresan la proteína y el gen de resistencia a ampicilina y el origen ColE1 permiten la selección y mantenimiento del plásmido en E. coli.
Se construye una construcción adicional con una fusión a GFP N-terminal pcDNA3.1NT-GFP-TOPO que comprende la longitud completa de la proteína STEAP-2.
Construcciones pSRa
Para generar líneas celulares de mamífero que expresan STEAP-2 constitutivamente, se clonó el ORF de 1362 pb en construcciones pSRa. Se generan retrovirus anfotrópicos y ecotrópicos mediante la transfección de construcciones pSRa en la línea de empaquetamiento 293T-10A1 o la cotransfección de pSRa y un plásmido auxiliar (\varphi-) en células 293, respectivamente. El retrovirus se puede utilizar para infectar un conjunto de líneas celulares de mamífero, dando lugar a la integración del gen clonado, STEAP-2, en las líneas celulares huésped. La expresión de proteína es dirigida a partir de una repetición terminal larga (LTR). El gen de resistencia a neomicina permite la sección de células de mamífero que expresan la proteína y el gen de resistencia a ampicilina y el origen ColE1 permiten la selección y mantenimiento del plásmido en E. coli. Se realizaron construcciones pSRa adicionales que fusionaron la etiqueta FLAG a los extremos C y N terminales para permitir la detección utilizando anticuerpos anti-FLAG. La secuencia FLAG 5' gat tac aag gat gac gac gat aag 3' (SEC ID NO: 34) se añadió al cebador de clonación en el extremo 3' del ORF. Se realizó otra construcción pSRa que contenía los aminoácidos 182 a 454. esta forma truncada de la proteína STEAP-2 ayudará a determinar la función de la región N-terminal extracelular larga.
Además, se puede realizar una construcción pSRa para producir una proteína de fusión myc/6 HIS de la proteína STEAP de longitud completa.
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Ejemplo 8 Análisis de expresión de STEAP-2 y otros miembros de la familia STEAP
Ejemplo 8A
Expresión específica de tejido de miembros de la familia STEAP en tejidos humanos normales
El análisis RT-PCR de STAP-2 muestra la expresión en todos los xenoinjertos de cáncer de próstata LAPC y en próstata normal (fig. 14, panel A). El análisis de 8 tejidos humanos normales muestra una expresión específica de próstata después de 25 ciclos de amplificación (fig. 14, panel B). Se detectó una expresión de nivel inferior en otros tejidos sólo después de 30 ciclos de amplificación. La transferencia Northern para STEAP-2 muestra un patrón de 2 transcritos (aproximadamente 3 y 8 kb de tamaño) expresados sólo en la próstata (y a niveles significativamente inferiores en los xenoinjertos LAPC) sin expresión detectable en cualquier de los otros 15 tejidos humanos normales analizados (fig. 15, panel C). De este modo, la expresión de STEAP-2 en tejidos normales humanos parece ser altamente específica de próstata.
El análisis de expresión de los miembros de la familia STEAP en tejidos normales se realizó mediante transferencia Northern y/o RT-PCR. Todos los miembros de la familia STEAP parecieron mostrar patrones de expresión limitada en tejido. La expresión de STEAP-3/AI139607 se muestra en la figura 12A (Northern) y la figura 12B (RT-PCR). La expresión de STEAP-4/R80991 se muestra en la Fig. 13.
Ejemplo 8B
Expresión de STEAP-2 en varias líneas celulares de cáncer
Los resultados de la RT-PCR anterior sugirió que los diferentes miembros de la familia STEAP muestran patrones de expresión en tejido diferentes. De manera destacada, STEAP-2, que parece muy específica de próstata, parece expresarse a niveles inferiores en xenoinjertos LAPC. Esto contrasta con STEAP-1, que se expresa de forma muy elevada tanto en tejido normal como en tejido de próstata tumoral.
Para caracterizar mejor esta diferencia sugerida en el perfil de expresión de STEAP-2 en el cáncer de próstata (en relación a STEAP-1), se realizó la transferencia Northern sobre ARN derivado de los xenoinjertos LAPC, así como varias líneas celulares de cáncer de próstata y otros cánceres, utilizando una sonda específica de STEAP-2 (clon de ADNc marcado 98P4B6). Los resultados se muestran en la figura 16 y se pueden resumir de la siguiente manera. STEAP-2 se expresa de forma elevada en próstata normal y en algunos xenoinjertos y líneas celulares del cáncer de próstata. Más particularmente, se observó una expresión muy elevada en el xenoinjerto LAPC-9AD y las células INCaP. No se observó la expresión o se observó de forma significativamente atenuada en los otros xenoinjertos y líneas celulares del cáncer de próstata. También se observó de forma evidente una expresión muy elevada en la línea celular RD-ED del sarcoma de Ewing. A diferencia de STEAP-1, que se expresó de forma elevada en las líneas de células de cáncer derivadas de tumores de vejiga, colon, páncreas y ovarios, la STEAP-2 mostró una expresión de baja a no detectable en las mismas líneas celulares (comparar con la figura 5). De manera destacada, STEAP-2 tampoco se detectó en células PrEC, que son representativas del compartimento de células basales normales de la próstata. Estos resultados sugieren que la expresión de STEAP-1 y STEAP-2 se regulan de manera diferencial. Mientras que STEAP-1 puede ser un gen que en general se favorece su expresión en el cáncer, STEAP-2 puede ser un gen que está más limitado a la próstata normal y al cáncer de próstata.
Ejemplo 8C
Análisis de la expresión in situ del ARN de STEAP-2 en próstata normal y cáncer de próstata
La expresión del ARN de STEAP-2 se evaluó utilizando hibridación in situ con una sonda antisentido marcada y utilizando una sonda sentido marcada como control. Las cuatro de cuatro muestras de tejido de próstata normal examinadas fueron positivas para STEAP (Figuras 22A-B). Así mismo, cinco de cinco muestras de tejido de cáncer de próstata fueron positivas utilizando ARN hibridación in situ de ARN de STEAP (Figuras 23A-B). Una muestra PIN y una muestra de células LNCaP que se examinaron fueron positivas también.
Ejemplo 8D
Análisis de la expresión de STEAP-2 en tejidos de cáncer
La expresión de STEAP-2 en varios tejidos de cáncer se examinó utilizando RT-PCR. Los resultados se muestran en la figure 24, en la que el carril 1 representa una muestra de un xenoinjerto LAPC4 AD; el carril 2 es un xenoinjerto LAPC9 AD; el carril 3 es un xenoinjerto LAPC9 AD2 (crecimiento con explante óseo humano); el carril 4 es LAPC9 AD IT (crecido intratibialmente); el carril 5 es tejido agrupado de pacientes con cáncer de colon; el carril 6 es tejido agrupado de pacientes con cáncer de pulmón; M representa un carril marcador; el carril 7 es tejido de próstata normal de paciente; el carril 8 es tejido de cáncer de próstata de paciente; el carril 9 es tejido agrupado de pacientes con cáncer de rincón: el carril 10 es tejido agrupado de pacientes con cáncer de vejiga; el carril 11 son células HeLa; y el carril 12 es un blanco de agua. La mayor expresión se encuentra en los tres xenoinjertos LAPC9 AD. Se observa también una expresión elevada en el xenoinjerto LAPC4 AD y en próstata normal y cáncer de pulmón. Se detectó también una expresión significativa en cáncer de colon y vejiga. Se detectó una expresión inferior en muestras de pacientes con cáncer de próstata y riñón.
Ejemplo 8E
Análisis de la expresión de STEAP-2 en tejidos normales
La expresión de STEAP-2 en 76 tejidos humanos normales se examinó utilizando un análisis de transferencia de puntos de muestras de ARN. Tal como se muestra en la figura 25, la STEAP-2 se expresa a niveles muy elevados sólo en próstata normal.
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Ejemplo 9 Localización cromosómica de los genes de STEAP
La localización cromosómica de STEAP-1 se determinó utilizando el panel del híbrido de radiación (RH) humano/hámster GencBridge 4 (Walter et al, 1994, Nat. Genetics 7: 22) (Research Genetics, Huntsville Al), mientras que STEAP-2 y los homólogos de STEAP-2 se localizaron utilizando el panel de híbrido de radiación Stanford G3 (Stewart et al., 1997. Genome Res. 7: 422).
Se utilizaron los siguientes cebadores PCR para STEAP-1:
8P1D4.1 5' ACTTTGTTGATGACCAGGATTGGA 34 (SEC ID NO: 4)
8P1D4.2 5' CAGAACTTCAGCACACACAGGAAC 3' (SEC ID NO: 5) 
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El vector de localización STEAP-1 resultante para los 93 ADN del panel del híbrido de radiación (210000020110
1010001000000101110101221000 111001110110101000100010001010010 21000001111001010000), y el programa de localización disponible en la dirección de internet <http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/
rhmapper.pl>, localizó el gen de STEAP-1 en el cromosoma 7p22.3, telomérico a D7S531.
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Se utilizaron los siguientes cebadores PCR para 98P4B6/STEAP-2:
98P4B6.1 5' GACTGAGCTGGAACTGGAATTTGT 3' (SEC ID NO: 20)
98P4B6.2 5' TTTGAGGAGACTTCATCTCACTGG 3' (SEC ID NO: 21) 
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El vector resultante (00000100100000000000000000000000100100 00000000100 01000000000000010000-1010
1010010011), y el programa de localización disponible en la dirección de internet <http://www.shgc.stanford.edu/RH/
rhserverformnew.html> localiza el gen 98P4B6 (STEAP-2) en el cromosoma 7q21.
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Se utilizaron los siguientes cebadores PCR para AI 139607:
AI139607.1 5' TTAGGACAACTTGATCACCAGCA 3' (SEC ID NO: 16)
AI139607.2 5' TGTCCAGTCCAAACTGGGTTATTT3' (SEC ID NO: 17) 
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El vector resultante (00000000100000000000000000001000100000200000001 00 0100000001000000-10001000
1010000010), y el programa de localización disponible en la dirección de internet <http://www.shgc.stanford.edu/RH/ rhserverformnew.html>, localiza AI139607 en el cromosoma 7q21.
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Se utilizaron los siguientes cebadores PCR para R80991:
R80991.3 5' ACAAGAGCCACCTCTGGGTGAA 3' (SEC ID NO: 35)
R80991.4 5' AGTTGAGCGAGTTTGCAATGGAC 3' (SEC ID NO: 36) 
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El vector resultante (0000000000020000102000000001000000000000000000 00100000000010000-1110000000
1001000001), y el programa de localización disponible en la dirección de internet <http://www.shgc.stanford.edu/RH/ rhserverformnew.html> localiza R80991 en el cromosoma 2q14-q21, próximo a D2S2591.
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En resumen, los resultados anteriores muestran que tres de los miembros putativos de la familia de STEAP humana se localizan en el cromosoma 7, tal como se representa esquemáticamente en la figura 17. En particular, el gen de STEAP-1 se localiza en la región telomérica lejana del brazo corto del cromosoma 7, en 7p22.3, mientras que STEAP-2 y AI139607 se localizan en el brazo largo del cromosoma 7, en 7q21 (Fig. 17). R80991 se localiza en el cromosoma2 q14-q21.
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Ejemplo 10 Identificación de los límites intrón-exón de STEAP-1
Los clones genómicos para STEAP-1 se identificaron mediante la búsqueda en GenBank de clones BAC que contenían secuencias de STEAP-1, dando lugar a la identificación de los números de acceso AC004969 (PAC DJ1121E10) y AC005053 (BAC RG041D11). Utilizando las secuencias derivadas de los clones PAC y BAC para STEAP, se definieron los límites intrón-exón (Fig. 18). Se identificaron un total de 4 exones y 3 intrones en la región codificante del gen de STEAP. El conocimiento de la estructura exacta de exón-intrón del gen de STEAP-1 se puede utilizar para diseñar los cebadores en las secuencias intrónicas que, a su vez, se pueden utilizar para la amplificación genómica de exones. Dicha amplificación permite el análisis del polimorfismo conformacional monocatenario (SSCP) para buscar polimorfismos asociados con el cáncer. Los exones mutantes o polimórficos se pueden secuenciar y comparara con la STEAP de tipo salvaje. Dicho análisis puede ser útil para identificar pacientes que son más susceptibles de un cáncer de próstata agresivo, así como otros tipos de cáncer, particularmente cánceres de colon, vejiga, páncreas, ovario, cervical y testicular.
El análisis de transferencia northern muestra que el gen de STEAP-1 existe en varias especies incluyendo ratón (Fig. 19). Por lo tanto, se cribó una biblioteca de BAC de ratón (Mouse ES 129-V release I, Genome Systems, FRAC-4431) con el ADNc humano para STEAP-1 (clon 10, Ejemplo 2). Se identificó un clon positivo, 12P11, y se confirmó mediante transferencia southern (Fig. 20). La información del límite intrón-exón para STEAP humana se puede utilizar para identificar las secuencias codificantes de STEAP-1 de ratón.
El clon genómico de STEAP-1 de ratón se puede utilizar para estudiar el papel biológico de STEAP-1 durante el desarrollo y la tumorigénesis. Específicamente, el clon genómico de STEAP-1 de ratón se puede insertar en un vector con el gen knock-out (K/O) para la alteración dirigida del gen en ratones, utilizando métodos generalmente conocidos en la técnica. Además, se puede elucidar el papel de STEAP en los procesos metabólicos y la función de las células epiteliales. Dichos ratones K/O se pueden cruzar con otros modelos de ratón con cáncer de próstata, tales como el modelo TRAMP (Greenberg et al., 1995, PNAS 92: 3439), para determinar si STEAP incluye en el desarrollo y progresión de cánceres de próstata más o menos agresivos y metastásicos.
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Ejemplo 11 Péptidos de unión a HLA-A2 de STEAP-1 y STEAP-2 previstos
Las secuencias de aminoácidos completas de las proteínas STEAP-1 y STEAP-2 se introdujeron en el algoritmo HLA Peptide Motif Search hallado en la página web de Bioinformatics and Molecular Analysis Section (BIMAS) (http://bimas.dcrt.nih.gov/). El algoritmo HLA Peptide Motif Search fue desarrollado por el Dr. Ken Parker basándose en la unión de las secuencias peptídicas específicas en el surco de las moléculas HLA de Clase I y específicamente HLA-A2 (Falk et al., 1991, Nature 351: 290-6; Hunt et al., 1992, Science 255: 1261-3; Parker et al., 1992, J. Immunol. 149: 3580-7; Parker et al., 1994, J. Immunol. 152: 163-75). Este algoritmo permite la localización y la clasificación de péptidos de 9, 9 y 10 unidades de una secuencia de proteína completa para la unión prevista a HLA-2, así como otras moléculas HLA de Clase I. La mayoría de los péptidos de unión a HLA-A2 tienen 9 unidades que contienen favorablemente una leucina (L) en la posición 2 y una valina (V) o leucina (L) en la posición 9.
Los resultados de los péptidos de unión prevista de STEAP-1 y STEAP-2 se muestran en la Tabla 2 siguiente. Para ambas proteínas, la clasificación de los 5 máximos candidatos se muestran junto con su localización, la secuencia de aminoácidos de cada péptido específico, y una valoración estimada de la unión. La valoración de unión corresponde al tiempo de vida media de disociación de complejos que contienen el péptido a 37ºC a pH 6,5. Se prevé que los péptidos con la valoración de unión más elevada (es decir, 10776.470 para el péptido STEAP-1 165; 1789.612 para el péptido STEAP-2) son los que están unidos más estrechamente a HLA de Clase I en la superficie celular y, de este modo, representan las dianas más inmunogénicas para el reconocimiento de células T. La unión real de péptidos a HLA-A2 se puede evaluar mediante la estabilización de a expresión de HLA-A2 en la línea celular T2 defectuosa en el procesado de antígeno (Refs. 5,6). La inmunogenicidad de péptidos específicos se puede evaluar in vitro mediante la estimulación de linfocitos citotóxicos T (CTL) CD8+ en presencia de células dendríticas (Xue et al., 1997, Prostate 30: 73-8; Peshwa et al, 1998, Prostate 36:129-38).
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 2 Unión prevista de las secuencias de péptidos STEAP-1 y STEAP-2 con la mayor afinidad para HLA-A2
5
Ejemplo 12 Inducción por STEAP-2 de la fosforilación de tirosina de proteínas celulares
Las proteínas multi-membrana tienen la capacidad de transmitir la señal desde la membrana e inician las cascadas de señalización que regulan un conjunto de sucesos más abajo ("downstream") en las cascadas, incluyendo la expresión génica, diferenciación celular, migración y proliferación (Biochim. Biophys. Acta 1997; 1348: 56-62, J. Virol. 1995; 69: 675-83). Con el fin de determinar la implicación de STEAP-1 y STEAP-2 en los sucesos de señalización más abajo ("downstream"), se investigó el efecto de STEAP-1 y STEAP-2 en la fosforilación de tirosina de células PCR (figura 26). Las células PC3, que expresan de manera estable neo, STEAP-1 o STEAP-2, se desarrollaron durante la noche en suero bovino fetal (FBS) al 1% para reducir la ocupación del receptor y la actividad base. A continuación, las células se incubaron durante 5 minutos en presencia de FBS al 1% o al 10%, se lisaron y se analizaron mediante transferencia western con antifosfotirosina (mAb 4G10). Se utilizó un revestimiento utilizando Ab anti-Grb2 para mostrar que el gel se cargó por igual.
Los resultados (Figura 26) muestran que la expresión de STEAP-2 en células PC-induce la fosoforilación de varias proteínas en los residuos de tirosina, incluyendo p150, p120 y p75. En cambio, la expresión de STEAP-1 indujo la desfosforilación de p150. Varias de las proteínas fosforiladas corresponden a proteínas de señalización conocidas, indicando que STEAP-1 y STEAP-2 pueden controlar la activación de cascadas de señalización específica.
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Ejemplo 13 Activación mediada por STEAP-1 y STEAP-2 de cascadas MAPK
Varias proteínas multi-transmembrana inducen respuestas biológicas específicas mediante la activación de cascadas de proteína quinasa, incluyendo los mecanismos MAPK (Curr. Med. Chem. 2000; 7: 911-43, Life Sci. 2000; 67: 335-6, Biol. Chem. 2000; 275: 4660-9). Con el fin de determinar si la expresión de STEAP-1 y STEAP-2 es suficiente para regular mecanismos de señalización específicos que en otro caso no son activos en las células PC3 restantes, el efecto de estos genes en la activación de la cascada MAPK p38 se investigó en la línea celular de cáncer de próstata PC3 (Figuras 27A-B). La activación de la p38 quinasa depende de su fosforilación en los residuos de tirosina y serina. La p38 fosforilada se puede diferenciar del estado no fosforilado mediante un mAb fosfo-p38. Este Ab específico de fósforo se utilizó para estudiar el estado de fosforilación de p38 en líneas celulas PC3 diseñadas.
Las células PC3 que expresan de manera estable STEAP-1, STEAP-2 o neo se desarrollaron durante la noche en FBS al 1% o al 10%. Se analizaron los lisados celulares completos mediante transferencia western. Las células PC3 tratadas con los activadores conocidos p28, NaSaI o TNF, se utilizaron como control positivo. Los resultados muestran que mientras que la expresión del gen neo de control no tiene efecto en la fosforilación de p38, la expresión de STEAP-1 y STEAP-2 en células Pc3 es suficiente para inducir la activación del mecanismo de p38 (Figura 27A). Los resultados se verificaron utilizando transferencia western con un Ab anti-p38, que muestra una carga de proteína igual en los geles (figura 27B).
En otro grupo de experimentos, se examinó (Figuras 28A-B) la suficiencia de la expresión de STEAP-1 o STEAP-2 en la línea celular del cáncer de próstata PC3 para activar el mecanismo MAPK mitogénico, concretamente la cascada ERK. La activación de ERK depende de su fosforilación en residuos de tirosina y serina. La ERK fosforilada se pueden diferenciar del estado no fosforilado mediante un mAb fosfo-ERK. Este Ab específico de fósforo se utilizó para estudiar el estado de fosforilación de ERK en líneas celulas PC3 diseñadas. Las células PC3, que expresan una forma activada de Ras, se utilizaron como control positive.
Los resultados muestran que mientras que la expresión del gen neo de control no presenta efecto sobre la fosforilación de ERK, la expresión de STEAP-2 en células PC3 es suficiente para inducir un incremento de por lo menos 3 veces en la fosforilación de ERK (Figura 28A). La expresión de STEAP-1 también indujo cierta fosforilación de ERK en células PC3 desarrolladas en FBS al 1%. Estos resultados se verificaron utilizando transferencia western anti-ERK (Figura 28A) y confirman la activación del mecanismo ERK por STEAP-1 y STEAP-2.
Dado que el FBS contiene varios componentes que pueden contribuir a la activación de ERK mediada por receptor, se examinó el efecto de STEAP-1 en niveles bajos y óptimos de FIis. Las células PC3 que expresan neo o STEAP-1 se desarrollaron en FBS al 0,1% o 10% durante la noche. Las células se analizaron mediante transferencia western anti-fosfo-ERK. Este experimento muestra que STEAP-1 induce la fosforilación de ERK en FBS al 0,1%, y confirma que la expresión de STEAP-1 es suficiente para inducir la activación de la cascada de señalización de ERK en ausencia de estímulos adicionales.
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Ejemplo 14 Activación mediada por ligando de STEAP-1
Se ha observado que diversos factores activan las proteínas multi-transmembrana y median en los sucesos de señalización más abajo ("downstream") en las cascadas, incluyendo, iones, leucotrienos, ácido lipofosfatídico, etc. (Cell Biochem. Biophys. 1999; 30: 213-42). Un grupo de compuestos conocidos por activar proteínas multi-transmembrana son odorantes (Neuron 2000; 25: 503-4). En este ejemplo, se cribaron 3 clases de odorantes por su capacidad para inducir la activación de señalización mediada por tirosina quinasa en células PC3 (Figura 29).
Las células PC3, que expresan de manera estable neo o STEAP-1, se desarrollaron durante la noche en FBS al 0,1% para permitir la ocupación del receptor. A continuación, las células se trataron durante 5 minutos con las concentraciones indicadas (0,1-10 \muM) de citralva, etilvanilina o IBMO. El tratamiento con FBS al 10% se utilizó como control. Los lisados celulares completos (20 \mug) generados a partir de las diferentes condiciones de tratamiento se separaron mediante SDS-PAGE y se analizaron mediante transferencia western anti-fosfotirosina.
Este experimento muestra que, mientras que las 3 clases de odorantes inducen cierta fosforilación de tirosina en células PC3-STEAP-1, sólo IBMP presentaba un efecto medible en la fosforilación de células PC3-neo que no expresan el gen STF-AP-1. Además, tanto la citralva como la etilvanilina indujeron un incremento en la fosforilación de p136-140 y p200-210 en células PC3-STEAP-1 de manera específica de STEAP-1. Además, la citralva indujo la fosforilación de novo de una proteína de 160-200kDa. Los resultados demuestran que STEAP-1 media en la activación de los mecanismos de tirosina quinasa en células tratadas con odorantes.
El descubrimiento de que la citralva inducía la fosforilación de tirosina de proteínas de una manera mediada por STEAP-1 sugiere que STEAP-1 puede iniciar la activación de una o más cascadas de señalización. Con el fin de identificar una potencial cascada de señalización asociada con la activación odorante de STEAP-1, se estudió el efecto de los odorantes en la activación de la cascada MAPK en células PC3 (figura 30). Las células PC3, que expresan de forma estable neo o STEAP-1, se desarrollaron durante la noche en FBS al 0,15. A continuación, las células se trataron con citralva durante 5 minutos. El tratamiento con FBS al 10% se utilizó como control. Tal como se observó utilizando mAb específico de fósforo (anti-fosfo-ERK), la citralva activó el mecanismo ERK de una manera específica de STEAP-2. Estos resultados también confirman los descubrimientos descritos en las figuras 27-289, de que la expresión de STEAP-1 solo es suficiente para inducir la activación del mecanismo ERK.
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Ejemplo 15 Identificación de potenciales mecanismos de transducción de señales
Para confirmar que STEAP activa directa o indirectamente mecanismos de traducción de señal conocidos en células y definir los sucesos más abajo ("downsteam") del mecanismo mediados por STEAP, se llevan a cabo ensayos con informador transcripcional basado en luciferasa (luc) en células que expresan STEAP. Estos informadores transcripcionales contienen sitios de unión a consenso para factores de transcripción conocidos que se encuentran más abajo ("downstream") de los mecanismos de transducción de señal bien caracterizados. Los informadores y ejemplos de sus factores de transcripción asociados, mecanismos de transducción de señal, y estímulos de activación se indican a continuación.
1. NFkB-luc, NFkB/Rel; Ik-quinasa/SAPK; crecimiento/apoptosis/estrés
2. SRE-luc, SRF/TCF/ELK1; MAPK/SAPK; crecimiento/differenciación
3. AP-1-luc. FOS/JUN; MAPK/SAPK/PKC; crecimiento/apoptosis/estrés
4. ARE-luc, receptor de andrógeno; esteroides/MAPK; crecimiento/diferenciación/apoptosis
5. p53-luc, p53; SAPK; crecimiento/diferenciación/apoptosis
6. CRE-luc, CREB/ATF2; PKA/p38; crecimiento/apoptosis/estrés.
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Los efectos mediados por STEAP se pueden analizar en células que muestran expresión de ARNm. Los plásmidos de informador de luciferasa se pueden introducir mediante transfección mediada por lípidos (TFX-50, Promega). La actividad de luciferasa, un indicador de la actividad transcripcional relativa, se mide mediante la incubación de extractos celulares con sustrato luciferina y la luminiscencia de la reacción se monitoriza en un luminómetro.
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Ejemplo 16 Ensayos in vitro de la función de STEAP
El perfil de expresión de STEAP en el cáncer de próstata sugiere un papel funcional en el inicio, progresión y/o mantenimiento del tumor. La función se STEAP se puede evaluar en células de mamífero utilizando estrategias in vitro. Para la expresión en mamíferos, se puede clonar STEAP en un conjunto de vectores apropiados, incluyendo pcDNA 3.1 myc-His-tag y el vector retroviral pSRatkneo (Muller et al., 1991, MCB 11: 1785). Utilizando dichos vectores de expresión, se pude expresar STEAP en varias líneas de células de cáncer, incluyendo, por ejemplo, PC-3, NIH 3T3, LNCaP y 293T. La expresión de STEAP se puede monitorizar utilizando anticuerpos anti-STEAP.
Las líneas celulares de mamífero que expresan STEAP se pueden analizar en varios ensayos in vitro e in vivo, incluyendo la proliferación celular en cultivos de tejidos, la activación de señales apoptóticos, la formación de tumores primarios y metastásicos en ratones SCId, y la invasión in vitro utilizando un sistema de cultivo por invasión de membrana (MICS) (Welch et al., Int. J. Cancer 43: 449-457). El fenotipo de células con STEAP se compara con el fenotipo de células que carecen de la expresión de STEAP. Además, se pueden analizar las células tratadas con y sin proteína STEAP añadida exógenamente por los parámetros de crecimiento alterado.
Las líneas celulares que expresan STEAP también se pueden analizar por la alteración de propiedades invasivas y migratorias mediante la medición del paso de células a través de una cámara de membrana porosa recubierta con matrigel (Becton Dickinson). El paso de células a través de la membrana a la cara opuesta se monitoriza utilizando un ensayo fluorescente (Becton Dickinson Technical Bulletin #428) utilizando células indicadoras cargadas con calceína-Am (Sondas Moleculares). Las líneas celulares analizadas incluyen células PC3, 3T3 LNCaP parentales y que sobreexpresan STEAP. Para analizar si STEAP presenta propiedades quimiotrayentes, se monitorizan las células indicadoras parentales por el paso a través de la membrana porosa hacia un gradiente de medio condicionado con STEAP en comparación con el medio de control. Este análisis también se puede utilizar para calificar y cuantificar la neutralización específica del efecto inducido por STEAP por las composiciones terapéuticas candidatas contra el cáncer.
Con el fin de establecer si STEAP se une a proteínas celulares expresadas en células de cáncer de próstata y otras células de cáncer o células normales, se pueden establecer dos estrategias. En la primera estrategias, se utiliza un ensayo in vitro para STEAP etiquetado con HISEP recombinante que se une a varias líneas celulares. En otra estrategia, se genera una proteína de fusión recombinante de fosfatasa alcalina-STEAP utilizando el sistema AP-TAG de GenHunter Corporation (Nashville, TN, cat# Q202), y se utiliza la fusión AP-TAG para analizar la unión de STEAP a un conjunto de líneas celulares de cáncer de próstata tal como se ha descrito (Cheng and Flanagan, 1994, cell 79: 157-168). Después de lavar las células y añadir el sustrato AP BCIP, que forma un precipitado azul insoluble tras la desfosforilación, se determina la unión a STEAP mediante la identificación de células que se vuelven azul bajo microscopio de luz.
Se pueden examinar varias líneas celulares de cáncer, que incluyen, sin limitación, varias líneas celulares de cáncer de próstata (por ejemplo, LNCaP, PC-3, DU145, TSUPR, LAPC4). También se pueden examinar otras líneas celulares, tales como la línea de células de próstata PREC, 293T, células PIN, y NIH 3T3, etc. Adicionalmente, se pueden analizar los xenoinjertos LAPC y otros xenoinjertos de cáncer de próstata. Las constantes de la velocidad de disociación en equilibrio se pueden calcular para evaluar la fuerza de la interacción de unión. Además, se puede determinar el número de receptores de la superficie celular por célula. Las líneas o tejidos celulares con la mayor capacidad de unión para STEAP serían preferentes para la clonación de un compañero de unión de STEAP.
En otro ensayo funcional, las células NIH-3T3 que expresan de forma estable STEAP se pueden analizar por su capacidad para formar colonias en agar blando. En estos experimentos, las células utilizadas en dicho procedimiento (por ejemplo, células NIH-3T3), se pueden transfectar para expresar de manera estable STEAP o neo o Ras activado (como el gen de análisis, los controles negativos y positivos, respectivamente) con el fin de evaluar las capacidades transformantes de STEAP. Habitualmente, los experimentos se llevan a cabo por duplicado y los análisis se evaluan aproximadamente 4 semanas después del emplacado celular. Cuando las observaciones experimentales demuestran que STEAP induce un incremento en la formación de colonias en relación con un control negativo (por ejemplo, neo), dichos resultados indican que STEAP presenta capacidades de transformación significativas.
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Ejemplo 17 Ensayo in vivo para la inducción del crecimiento de tumores por STEAP
El efecto de la proteína STEAP sobre el crecimiento de células tumorales se puede evaluar in vivo mediante la sobreexpresión génica en ratones que portan tumores. Por ejemplo, a los ratones SCID se les puede inyectar subcutáneamente en cada costado con 1 x 10^{6} de una línea celular de próstata que contiene vector vacío de tkNEo o STEAP. Se pueden utilizar por lo menos dos estrategias: (1) Expresión de STEAP constitutiva bajo la regulación de un promotor LTR, y (2) la expresión regulada bajo el control de un sistema de vectores inducibles, tales como ecdisona, tet, etc. A continuación, se monitoriza el volumen del tumor en la aparición de tumores palpables y seguido con el tiempo para determinar si las células que expresan STEAP crecen a una velocidad más elevada. Adicionalmente, los ratones se pueden implantar con 1 x 10^{5} de las mismas células ortotópicamente para determinar si STEAP tiene un efecto sobre el crecimiento local en el tejido diana (es decir, próstata) o sobre la capacidad de las células para producir metástasis, específicamente en pulmones, nódulos linfáticos, hígado, médula ósea, etc. El efecto de STEAP en la formación y crecimiento de tumores óseos se puede valorar mediante la inyección de células de tumores de próstata intratibialmente, tal como se describe en el ejemplo 1.
Estos ensayos también son útiles para determinar el efecto inhibidor de STEAP de las composiciones terapéuticas candidatas, tales como, por ejemplo, anticuerpos de STEAP, moléculas antisentido de STEAP y ribozimas.
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Ejemplo 18 Detección de metástasis del cáncer de próstata en ratones y humanos utilizando anticuerpos policlonales anti- STEAP-1 Ratones
Se realizó un análisis inmnohistoquímico de STEAP-1 sobre tejidos fijados por formalina de 4 \mum derivados de ratones que portan tumores de cáncer de próstata LAPC-9 ortotópicas y sus metástasis derivadas en pulmón y nódulos linfáticos. Se analizaron varias secciones del pulmón utilizando anticuerpo policlonal anti-STEAP-1 de oveja y anticuerpo policlonal anti-PSA de conejo (pAb). El examen microscópico de tejido teñido se utilizó para detectar células de cáncer de próstata LAPC-9 y los resultados se muestran en las figuras 31A-F.
El pAb anti-STEAP-1 de oveja detectó fácilmente células de cáncer de próstata humano en la próstata de ratón (Figura 31A), así como en la metástasis a nódulos linfáticos (Figura 31B) y pulmón (Figure 31C-D). Las micrometástasis pequeñas (Figura 31C) y grandes (Figura 31D) en el pulmón se detectaron fácilmente utilizando el pAb anti-STEAP-1. Para confirmar que las metástasis en pulmón tenían como origen el cáncer de próstata, se realizó una inmunohistoquímica sobre secciones de pulmón en serie utilizando el pAb anti-PSA (Figura 31E-F). La tinción intensa en la superficie celular observada con el pAb anti-STEAP permite una detección más sencilla de las micrometástasis en comparación con el uso del anticuerpo policlonal anti-PSA.
Humanos
Se utilizó el Ab policlonal de STEAP-1 en un ensayo inmunohistoquímico similar de muestras de cáncer de próstata metastásico de pacientes humanos. Se detectó una expresión elevada de STEAP-1 en las metástasis estudiadas en nódulos linfáticos y huesos. Tal como se muestra en las figuras 32A (metástasis en nódulos linfáticos) y 32B (metástasis en huesos), se observa tinción pericelular intensa en estas muestras de pacientes humanos, confirmando que STEAP-1 es un marcador excelente para la detección de cáncer de próstata metastásico.
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Ejemplo 19 Construcciones de fusión de Fc-bucle extracelular de STEAP-1, STEAP-2 y STEAP-3
Para expresar y secretar los bucles extracelulares de STEAP-1, STEAP-2, y STEAP-3 en medio acondicionado de líneas celulares de mamífero, se pueden clonar fragmentos de estos genes en el vector pFc para generar fusiones C-terminales de la región Fc de IgG1 humana. El vector pFc se generó mediante clonación de Fc de inmunoglobulina G1 humana (bases 74-768 del GenBank acceso X70421) seguido del sitio de división por IgA proteasa (Roche, Cat 1461265) codificado por 5' cctcgacctccaacaccgggg 3' (SEC ID NO: 47) en pTag-5 (GenHunter Corp. Nashville, TN) utilizando XhoI y ApaI. Esta construcción genera una fusión de Fc de IgG1 en el extremo C-terminal de regiones extracelulares de STEAP-1, STEAP-2 y STEAP-3, a la vez que se fusiona la secuencia señal de IgGK con el extremo N-terminal.
Las proteínas recombinantes resultantes se optimizan para la secreción en el medio de las células de mamífero transfectadas y se pueden utilizar para identificar proteínas, tales como ligandos o receptores, que interaccionan con las proteínas STEAP-1, STEAP-2, y STEAP-3. Estas fusiones de proteínas también se pueden utilizar como inmunógeno para generar anticuerpos. La expresión de proteína está dirigida a partir del promotor de CMV. El gen de resistencia a Zeosina permite la selección de células de mamífero que expresan la proteína y el gen de resistencia a ampicilina permite la selección del plásmido en E. coli.
Los siguientes bucles extracelulares de las proteínas STEAP-1, STEAP-2 y STEAP-3 son adecuados para la clonación en pFc:
STEAP-1
revihplatshqqyfykipily (SEC ID NO: 37)
\quad
rrsyrykllnwayqqvqqnkedawiehdvwrmei (SEC ID NO: 38)
\quad
widikqfvwytpptf (SEC ID NO: 39)
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STEAP-2
ysfvrdvihpyamqqsdfykipiei (SEC ID NO: 40)
\quad
trserylflnmayqqvhanienswneeevwrie (SEC ID NO: 41)
\quad
krafeeeyyrfy (SEC ID NO: 42)
\vskip1.000000\baselineskip
STEAP-3
ypyvyekkdntfrmaisipnrifp (SEC ID NO: 43)
\quad
yyvrwrlgnltvtqailkkenpfstssawlsdsy (SEC ID NO: 44)
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Ejemplo 20 Generación de anticuerpos policlonales para STEAP-2
Se utilizaron tres inmunógenos para generar anticuerpos específicos para STEAP-2. Dos inmunógeno eran péptidos que codifican los aminoácidos 153-165 (ALQLGPKDASRQV; SEC ID NO: 45) y aminoácidos 345-358 (IENSW
NEEEVWRIE; SEC ID NO: 46) de la secuencia de proteína STEAP-2. El primer péptido se encuentra en el extremo N-terminal de STEAP-2, que es intracelular utilizando el programa de predicción de topología de membrana SOSUI. El último péptido se encuentra en la región entre los dominios transmembrana 3 y 4, y se prevé que esta región codifique el segundo de los 3 bucles extracelulares. Un tercer inmunógeno era una proteína de fusión de glutatión S-transferasa (GST) que comprende los aminoácidos 2-204 de la secuencia de proteína STEAP-2. La proteína de fusión recombinante GSt-STEAP-2 se purificó a partir de bacterias inducidas mediante cromatografía por afinidad con glutatión-sefarosa.
Además de los antígenos anteriores, los péptidos que codifican otras regiones de la proteína STEAP-2, o proteínas producidas por bacterias y virus de baculovirus que codifican secuencias de longitud completa o parciales de la proteína STEAP-2, se utilizan para generar un conjunto de anticuerpos específicos de STEAP-2. Estos anticuerpos están dirigidos a regiones que pueden modular la función de STEAP-2.
Generación de anticuerpos policlonales (pAbs)
Para generar pAbs para STEAP-2, se utilizaron la proteína de fusión con GST purificada y los péptidos acoplados a la hemocianina de lapa californiana (KLH) para inmunizar conejos individuales tal como se indica a continuación. Los conejos se inmunizaron con 200 \mug de antígeno de proteína de fusión o de KLH-péptido mezclado en adyuvante de Freund completo. A continuación, se inyectaron los conejos cada dos semanas con 200 \mug de inmunógeno en adyuvante de Freund incompleto. Se tomaron muestras de sangre aproximadamente 7-10 días después de cada inmunización. El título del antisuero de péptido 153-165 fue de por lo menos de 25.000 y del antisuero del péptido 345-358 de por lo menos 10.000 determinado mediante ELISA con los respectivos inmunógenos. El título del suero de fusión con GST fue de por lo menos 300.000. El antisuero de péptido se purifica por afinidad mediante el paso del suero sobre una columna de afinidad compuesta del péptido respectivo acoplado covalentemente a matriz Affigel (BioRad). El suero desarrollado para la fusión con GST se semipurifica en primer lugar mediante la eliminación de anticuerpos reactivos a GST mediante el paso sobre una columna de afinidad de GST. A continuación, el anticuerpo específico de STEAP-2 se aísla mediante el paso sobre una columna de afinidad de GST-STEAP-2. Alternativamente, el antisuero específico de STEAP-2 se aísla mediante cromatografía de afinidad utilizando la proteína de fusión de proteína de unión a maltosa (MBP)-STEAP-2 que codifica los mismos aminoácidos.
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Ejemplo 21 Generación de anticuerpos monoclonales para proteínas STEAP
Para generar mAbs para proteínas STEAP-1, STEAP-2, STEAP-3, o STEAP-4, se inmunizaron ratones Balb C intraperitonealmente con 20-50 \mug de péptido acoplado con KLH o con polipéptidos recombinantes bacterianos, tales como proteínas de fusión con GST, regiones codificantes de la respectiva secuencia de proteína del miembro de STEAP mezclada en adyuvante de Freund completo. A continuación, los ratones se inmunizaron posteriormente cada 2-4 semanas con 20-50 \mug de inmunógeno mezclado en adyuvante incompleto de Freund. Alternativamente, se utiliza el adyuvante Ribi para inmunizaciones iniciales. Se toman muestras de sangre 7-10 días después de inmunización para monitorizar el título y especificidad de la respuesta inmune.
El suero de ratones inmunizados con una proteína de fusión con GST que comprende los aminoácidos 148-251 de STEAP-1 consiguió un título de por lo menos 8 x 10^{6} determinado por ELISA y reconoció específicamente la proteína STEAP-1 mediante transferencia western (Figura 33). Una vez se obtiene una reactividad y especificidad apropiada determinadas por ELISA, a continuación se lleva a cabo análisis por transferencia western y citometría de flujo, fusión y generación de hibridomas utilizando los procedimientos establecidos conocidos en la técnica (Harlow and Lane, 1988).
La figura 33 es una transferencia western que muestra que pAb murino anti-STEAP-1 reconoce la proteína STEAP-1 en líneas celulares diseñadas y proteína STEAP-1 endógena en células LNCaP. Los lisados de células LNCaP y células 293T transfectadas con STEAP-1 etiquetado con pcDNA 3.1 MYC/HIS o vector vacío neo y células RAT1 diseñadas para expresar STEAP-1 o un gen de control neo, se separaron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a nitrocelulosa. La transferencia se sometió a continuación a un análisis western anti-STEAP utilizando una dilución de 1:1000 de suero de ratones inmunizados con una proteína de fusión GST-STEAP-1.
También se utilizan antígenos y estrategias de inmunización alternativos para generar mAbs con reactividad y especificidad específicas para varias regiones de las proteínas STEAP. Dichos antígenos pueden incluir proteínas recombinantes producidas por baculovirus o proteínas de fusión de Fc de IgG humana expresada y secretada en mamífero que codifican varias regiones de cada secuencia de proteína de miembros de la familia STEAP, tales como los dominios extracelulares previstos. También se utiliza una estrategia de inmunización basada en células en la que el ADNc de un miembro de la familia de STEAP se sobreexpresa en células, tales como fibroblastos de ratones NIH3T3 o células prc-B murina 300.19 y se utilizan células completas o preparaciones de membranas a partir de estas células como inmunógenos. Además, se utiliza un protocolo de inmunización basado en ADN en el que el vector de expresión en mamífero que codifica el ADNc de STEAP-1 o STEAP-2, tal como pcDNA 3.1, para inmunizar ratones mediante inyección directa del ADN plasmídico. Este protocolo se utiliza solo o en combinación con estrategias basadas en proteínas y/o células.
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Referencias citadas en la descripción
Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al respecto.
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> 129.17WOI1
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 09/455,486
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1999-12-06
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1130
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (64)...(1083)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
6 
\hskip1cm
7 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 339
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
9 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 111
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
10 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
actttgttga tgaccaggat tgga 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cagaacttca gcacacacag gaac 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3627
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
11 
\hskip1cm
110 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2453
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (355)...(1719)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm
12 
\hskip1cm
13 
\hskip1cm
14 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 454
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm
15 
\hskip1cm
150 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4419
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (85)...(1464)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm
16 
\hskip1cm
17 
\hskip1cm
18 
\hskip1cm
19 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 458
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm
20 
\hskip1cm
200 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 322
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm
21 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 183
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm
22 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 448
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm
23 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 401
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 11, 56, 233, 250, 310, 326, 377, 398
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = a, t, c, o g
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm
24 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 118
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip1cm
25 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttaggacaac ttgatcacca gca 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial <220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgtccagtcc aaactgggtt attt 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agggagttca gcttcgttca gtc 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggtagaactt gtagcggctc tcct 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gactgagctg gaactggaat ttgt 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tttgaggaga cttcatctca ctgg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\hskip1cm
26 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttttgatcaa gctt 
\hfill
14 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctaatacgac tcactatagg gctcgagcgg ccgcccgggc ag 
\hfill
42 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggcccgtcct ag 
\hfill
12 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtaatacgac tcactatagg gcagcgtggt cgcggccgag 
\hfill
40 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cggctcctag 
\hfill
10 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctaatacgac tcactatagg gc 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgagcggcc gcccgggcag ga 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agcgtggtcg cggccgagga 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atatcgccgc gctcgtcgtc gacaa 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agccacacgc agctcattgt agaagg 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\hskip1cm
27 
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<210> 34
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<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia FLAG
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<400> 34
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\hskip-.1em\dddseqskip
gattacaagg atgacgacga taag 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
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<211> 22
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
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\hskip-.1em\dddseqskip
acaagagcca cctctgggtg aa 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agttgagcga gtttgcaatg gac 
\hfill
23 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> sitio de division de la proteasa IgA
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
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\hskip-.1em\dddseqskip
cctcgacctc caacaccggg g 
\hfill
21 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
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<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo Sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\hskip1cm
28 
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<210> 39
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<211> 34
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<212> PRT
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<213> Homo Sapiens 
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<400> 39
\hskip1cm
29 
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<210> 40
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<211> 15
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<212> PRT
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<213> Homo Sapiens 
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<400> 40
\hskip1cm
30 
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<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo Sapiens 
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<400> 41
\hskip1cm
31 
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<210> 42
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<211> 33
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<212> PRT
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<213> Homo Sapiens 
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<400> 42
\hskip1cm
32 
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<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
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<212> PRT
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<213> Homo Sapiens 
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<400> 43
\hskip1cm
33 
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<210> 44
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<211> 24
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<212> PRT
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<213> Homo Sapiens 
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<400> 44
\hskip1cm
34 
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<210> 45
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<211> 34
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<212> PRT
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<213> Homo Sapiens 
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<400> 45
\hskip1cm
35 
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<210> 46
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<211> 13
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<212> PRT
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<213> Homo Sapiens 
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<400> 46
\hskip1cm
36 
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<210> 47
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<211> 14
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<212> PRT
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<213> Homo Sapiens 
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<400> 47
\hskip1cm
37 
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Claims (26)

1. Polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos de longitud completa mostrada en las figuras 9A-D.
2. Polipéptido según la reivindicaicón 1, que comprende la secuencia de aminoácidos de STEAP-2 mostrada en las figuras 9A-D.
3. Polipéptido STEAP-2 que comprende
(a)
los residuos de aminoácidos 1 a 205 mostrados en las figuras 9A-D, o
(b)
los residuos de aminoácidos 229 a 254 mostrados en las figuras 9A-D, o
(c)
los residuos de aminoácidos 278 a 303 mostrados en las figuras 9A-D.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Polinucleótido aislado seleccionado del grupo que consiste en:
(a)
un polinucleótido que codifica un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3;
(b)
un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos desde la posición 355 a, e incluyendo, la posición 1719 mostrada en las figuras 9A-D;
(c)
un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos desde la posición 355 a, e incluyendo, la posición 970 mostrada en las figuras 9A-D;
(d)
un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos desde la posición 1039 a, e incluyendo, la posición 1115 mostrada en las figuras 9A-D;
(e)
el ADNc contenido en el plásmido 98P4B6-GTD3 depositado con la American Culture Collection con el No. de Acceso PTA-311; en el que T también puede ser U; y
(f)
un polinucleótido que es totalmente complementario con un polinucléotido de 4(a)-4(e).
\vskip1.000000\baselineskip
5. Polinucleótido según la reivindicación 4, marcado con un marcador detectable.
6. Vector de expresión recombinante que contiene un polinucleótido según la reivindicación 4.
7. Célula huésped que contiene el vector de expresión según la reivindicación 6.
8. Proceso para producir un polipéptido STEAP-2 que comprende cultivar una célula huésped según la reivindicación 7, bajo condiciones suficientes para la producción del polipéptido y recuperar el polipéptido STEAP-2.
9. Anticuerpo o fragmento del mismo, que se une específicamente a un epítopo en los aminoácidos 1-205, 229-254, 278-303, 100-108, 227-235, ó 306-314, de la secuencia de aminoácidos mostrada en las figuras 9A-D.
10. Anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 9, que es monoclonal.
11. Proteína recombinante que comprende la región de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal o fragmento del anticuerpo según la reivindicación 10.
12. Anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 9 o la reivindicación 10, o la proteína recombinante según la reivindicación 11, que está marcado con un marcador detectable.
13. Anticuerpo o fragmento del mismo o proteína recombinante según la reivindicación 12, en los que el marcador detectable comprende un radioisótopo, quelante metálico, enzima o compuesto fluorescente, bioluminiscente o quimioluminiscente.
14. Anticuerpo o fragmento del mismo o proteína recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 9-13, que es un anticuerpo humano.
15. Anticuerpo o fragmento del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 9-10 y 12-13, que comprende residuos de la región de unión a antígeno murino y residuos de anticuerpo humano.
\newpage
16. Ratón transgénico que produce un anticuerpo o fragmento de anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 9-10 ó 14-15.
17. Hibrioma que produce un anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 10 ó 14-15.
18. Anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo según la reivindicación 10 que se conjuga con una toxina, un radioisótopo o un agente terapéutico.
19. Análisis para detectar la presencia de un polipéptido STEAP-2 en una muestra que comprende poner en contacto la muestra con un anticuerpo, fragmento o proteína recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 9-12 y detectar la unión del polipéptido STEAP-2 en la muestra a los mismos.
20. Análisis para detectar la presencia de un polipéptido STEAP-2 en una muestra que comprende:
(a)
poner en contacto la muestra con una sonda de polinucleótidos que se hibrida específicamente a un polinucleótido según la reivindicación 4; y
(b)
detectar la presencia de un complejo de hibridación formado mediante la hibridación de la sonda con el polinucleótido de STEAP-2 en la muestra, donde la presencia del complejo de hibridación indica la presencia del polinucleótido de STEAP-2 en la muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
21. Análisis para detectar la presencia de un polinucleótido de ARNm de STEAP-2 en una muestra biológica que comprende.
(a)
producir ADNc a partir de la muestra mediante transcripción inversa utilizando por lo menos un cebador;
(b)
amplificar el ADNc producido de esta manera utilizando polinucleótidos de STEAP-2 como cebadores de sentido y antisentido para amplificar los ADNc de STEAP-2 en la misma;
(c)
detectar la presencia del ADNc de STEAP-2 amplificado,
donde los polinucleótidos de STEAP-2 utilizados como los cebadores de sentido y antisentido son capaces de amplificar el polinucleótido según la reivindicación 4.
\vskip1.000000\baselineskip
22. Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento del mismo o proteína recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 9-15 o la reivindicación 18, un polipéptido STEAP-2 según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o un polinucleótido de STEAP-2 según cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5, y un portador fisiológicamente aceptable.
23. Composición de vacuna que comprende un polipéptido STEAP-2 según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o un polinucleótido de STEAP-2 según la reivindicación 4, y un portador fisiológicamente aceptable.
24. Uso de un vector que condifica un anticuerpo monoclonal de cadena única que comprende los dominios variables de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un polipéptido STEAP-2 según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer que expresa STEAP-2, de manera que el vector libera la secuencia codificante del anticuerpo monoclonal de cadena única a las células cancerosas y el anticuerpo de cadena única codificado se expresa intracelularmente en las mismas.
25. Anticuerpo o fragmento según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 9, 10, 12-15 y 18 para su uso en un método de tratamiento de un cáncer que expresa STEAP-2.
26. Uso de un anticuerpo o fragmento según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 9, 10, 12-15 y 18 en la fabricación de un medicamento para un método de tratamiento de un cáncer que expresa STEAP-2.
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