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ES2314555T3 - Purificacion de antigenos de vhb para uso en vacunas. - Google Patents

Purificacion de antigenos de vhb para uso en vacunas. Download PDF

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ES2314555T3
ES2314555T3 ES05077471T ES05077471T ES2314555T3 ES 2314555 T3 ES2314555 T3 ES 2314555T3 ES 05077471 T ES05077471 T ES 05077471T ES 05077471 T ES05077471 T ES 05077471T ES 2314555 T3 ES2314555 T3 ES 2314555T3
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ES
Spain
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antigen
thiomersal
vaccine
procedure
hbsag
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ES05077471T
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English (en)
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Koen De Heyer
Peter Schu
Michelle Serantoni
Omer Van Opstel
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GlaxoSmithKline Biologicals SA
Original Assignee
GlaxoSmithKline Biologicals SA
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Abstract

Un procedimiento para producir una vacuna de hepatitis B inmunogénica, estable sin indicios de tiomersal, comprendiendo el procedimiento: (a) expresar el antígeno superficial de hepatitis B (HBsAg) como proteína recombinante en Saccharomyces cerevisiae; (b) procesar las células de la levadura para proporcionar una preparación bruta de antígeno; (c) someter la preparación bruta de antígeno a cromatografía de permeación sobre gel, en la que el tampón de elución que se usa en la cromatografía de permeación sobre gel no contiene tiomersal. (d) someter al eluyente que contiene antígeno de la etapa (c) a cromatografía de intercambio iónico; (e) añadir cisteína a la mezcla de eluyente que contiene antígeno obtenida después de la etapa (d); (f) someter a la preparación de la etapa (e) a ultracentrifugación con cloruro de cesio; y (g) combinar el HBsAg purificado con un excipiente farmacéuticamente aceptable para producir una vacuna de hepatitis B inmunogénica, estable; en el que no se añade tiomersal a la vacuna resultante.

Description

Purificación de antígenos de VHB para uso en vacunas.
Esta invención se refiere a un procedimiento nuevo de fabricación de vacuna para hepatitis B, vacuna que es para uso en el tratamiento o la profilaxis de infecciones por virus de hepatitis B (VHB).
La infección crónica por virus de hepatitis B (VHB), para la que actualmente hay tratamiento limitado, constituye un problema global de salud pública de enormes dimensiones. Portadores crónicos de VHB, que se estima ascienden a más de 300 millones en todo el mundo, corren el riesgo de desarrollar hepatitis crónica activa, cirrosis y carcinoma hepatocelular primario.
Muchas vacunas que están actualmente disponibles requieren conservantes para prevenir el deterioro. Un conservante usado frecuentemente es tiomersal que es un compuesto que contiene mercurio. El documento EP 314240 describe una preparación de HBsAg en la que se incluye tiomersal en la composición de la vacuna final. Han surgido algunas preocupaciones acerca del uso de mercurio en vacunas, aunque los comentaristas han resaltado que los peligros potenciales de las vacunas que contienen tiomersal no deberían exagerarse (Offit; P.A. JAMA Vol. 283; Nº 16). No obstante, sería ventajoso encontrar procedimientos de preparación de vacunas nuevos y potencialmente más seguros para sustituir el uso de tiomersal en el procedimiento de fabricación. Así, hay necesidad de desarrollar vacunas que estén exentas de tiomersal, en particular vacunas de hepatitis B.
En un primer aspecto la presente invención proporciona un procedimiento para producir una vacuna de hepatitis B inmunogénica, estable sin indicios de tiomersal, comprendiendo el procedimiento:
(a)
expresar el antígeno superficial de hepatitis B (HBsAg) como proteína recombinante en Saccharomyces cerevisiae;
(b)
procesar las células de levadura para proporcionar una preparación bruta de antígeno;
(c)
someter la preparación bruta de antígeno a cromatografía de permeación sobre gel, en la que el tampón de elución que se usa en la cromatografía de permeación sobre gel no contiene tiomersal;
(d)
someter al eluyente que contiene antígeno de la etapa (c) a cromatografía de intercambio iónico;
(e)
añadir cisteína a la mezcla de eluyente que contiene antígeno obtenida después de la etapa (d);
(f)
someter a la preparación de la etapa (e) a ultracentrifugación con cloruro de cesio; y
(g)
combinar el HBsAg purificado con un excipiente farmacéuticamente aceptable para producir una vacuna de hepatitis B inmunogénica, estable;
en el que no se añade tiomersal a la vacuna resultante.
La preparación de antígeno está generalmente sin indicios de tiomersal cuando no es detectable tiomersal en el producto de antígeno usando espectrometría de absorción de mercurio, según se describe en este documento.
La preparación de antígeno de hepatitis preferiblemente comprende menos de 0,025 \mug de mercurio por 20 \mug de proteína, según se mide adecuadamente por espectrometría de absorción.
Preferiblemente la purificación se lleva a cabo en ausencia de tiomersal, y el antígeno purificado está completamente exento de tiomersal.
Preferiblemente el antígeno es estable, adecuadamente tan estable sustancialmente como un antígeno de hepatitis B purificado en presencia de tiomersal, según se perfila en el Ejemplo 1 de este documento por ejemplo.
Preferiblemente el antígeno de hepatitis B es inmunogénico.
Preferiblemente el agente reductor se añade durante el procedimiento de purificación de antígeno, preferiblemente después del crecimiento de células que expresan el antígeno.
El agente reductor es cisteína.
Por consiguiente la presente invención preferiblemente proporciona un procedimiento para producir un antígeno de hepatitis B estable inmunogénico sin indicios de tiomersal que comprende purificación del antígeno en presencia de cisteína.
Preferiblemente la purificación se lleva a cabo en presencia de una solución de cisteína.
Preferiblemente, la cisteína, en forma de solución o polvo, se añade durante el procedimiento a una concentración final entre 1 y 10 mM, preferiblemente 1 a 5 mM. Más preferiblemente, la cisteína se añade a una concentración final de aproximadamente 2 mM.
Preferiblemente la cisteína es L-cisteína.
Preferiblemente la cromatografía de intercambio iónico es cromatografía de intercambio aniónico.
El procedimiento de la invención proporciona así un antígeno de hepatitis B exento de tiomersal en el que antígeno es al menos tan inmunogénico y antigénico como el antígeno de hepatitis B fabricado en presencia de tiomersal.
El procedimiento de la invención proporciona así un antígeno de hepatitis B inmunogénico que tiene una relación media de proteína ELISA mayor de 1,5 y un contenido en RF1 con un valor IC50 que es al menos una 3 veces menor que el del antígeno superficial de hepatitis B fabricado en presencia de tiomersal.
El antígeno de hepatitis B obtenido se puede usar tanto para el tratamiento como para la profilaxis de infecciones de hepatitis B, especialmente tratamiento o profilaxis, por ejemplo, de infecciones crónicas de hepatitis B.
Una formulación de vacuna que comprende un antígeno de hepatitis B obtenido mediante el procedimiento de la presente invención se proporciona en conjunción con un adyuvante. Preferiblemente el adyuvante es una sal de aluminio o un estimulador preferencial de respuesta celular TH1.
Preferiblemente el antígeno es un antígeno superficial de hepatitis B.
La preparación de antígeno superficial de hepatitis B está bien documentada. Véanse por ejemplo, Harford y col., en Develop. Biol. Standard 54, página 125 (1983), Gregg y col., en Biotechnology, 5, página 479 (1987), EP-A-0226846, EP-A-0299108 y las referencias, incluidas en los mismos.
Según se usa en este documento la expresión "antígeno superficial de hepatitis B" o "HBsAg" incluye cualquier antígeno HBsAg o fragmento del mismo que manifiesta la antigenicidad de antígeno superficial de VHB. Se entenderá además de la secuencia de aminoácidos 226 del antígeno HBsAg S (véanse Tiollais y col., Nature, 317, 489 (1985) y sus referencias) HBsAg según se describe en este documento puede contener, si se desea, toda o parte de la secuencia pre-S según se describe en las referencias anteriores y en EP-A-0278940. HBsAg según se describe en este documento también se puede referir a variantes, por ejemplo, el "mutante de escape" que se describe en WO 91/14703.
HBsAg también se puede referir a polipéptidos descritos en EP-A-0198474 ó EP-A-0304578.
Normalmente el HBsAg estará en forma de partículas. En una realización particularmente preferida el HBsAg estará constituido esencialmente por el antígeno S de HBsAg anteriormente mencionado en este documento.
La vacuna puede incluir ventajosamente un excipiente farmacéuticamente aceptable tal como un adyuvante adecuado. Están comercialmente disponibles adyuvantes adecuados tales como, por ejemplo, adyuvante incompleto y adyuvante completo de Freund (Difco Laboratories, Detroit, MI); adyuvante 65 de Merck (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ); AS-2 (SmithKlineBeecham, Philadelphia, PA); sales de aluminio tales como gel de hidróxido de aluminio (alúmina) o fosfato de aluminio; sales de calcio, hierro o cinc; una suspensión insoluble de tirosina acilada; azúcares acilados; polisacáridos derivatizados catiónicamente o aniónicamente; microesferas biodegradables; lípido A y quil A monofosforilado. También se pueden usar como adyuvantes citoquinas, tales como GM-CSF o interleucina-2, -7, ó -12.
Las formulaciones de vacuna pueden contener un adyuvante que induce una respuesta inmune predominantemente de tipo TH1. Niveles altos de citoquinas de tipo Th1 (por ejemplo IFN-\gamma, TNF\alpha, IL-2 e IL-12) tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes mediadas por células a un antígeno administrado. En el caso de que una respuesta sea predominantemente de tipo Th-1, el nivel de citoquinas de tipo Th-1 aumentará en mayor medida que el nivel de citoquinas de tipo Th-2. Los niveles de esas citoquinas pueden ser fácilmente evaluados usando ensayos estándar.
Para una revisión de familias de citoquinas, véase Mosmann and Coffman, Ann. Rev. Inmunol. 7:145-173, 1989.
Adyuvantes adecuados para uso en la obtención de una respuesta predominantemente de tipo Th-1 incluyen, por ejemplo una combinación de lípido A monofosforilado, preferiblemente lípido A monofosforilado 3-des-O-acilado (3D-MPL) junto con una sal de aluminio. Otros adyuvantes conocidos que inducen preferencialmente una respuesta inmune de tipo TH-1 incluyen oligonucleótidos que contienen CpG. Los oligonucleótidos se caracterizan porque el dinucleótido CpG no está metilado. Oligonucleótidos de este tipo son bien conocidos y se describen, por ejemplo en WO 96/02555. También se describen secuencias de ADN inmunoestimuladoras, por ejemplo, por Sato y col., Science 273:352, 1996. Otro adyuvante preferido es una saponina, preferiblemente QS21 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA), que se puede usar sola o en combinación con otros adyuvantes. Por ejemplo, un sistema potenciado implica la combinación de lípido A monofosforilado y derivado de saponina, tal como la combinación de QS21 y 3D-MPL según se describe en WO 94/00153, o una composición menos reactogénica en la que QS21 se atenúa con colesterol, según se describe en WO 96/33739. Otras formulaciones preferidas comprenden emulsión aceite en agua y tocoferol. Una formulación de adyuvante particularmente potente que implica QS21, 3D-MPL y tocoferol en emulsión aceite en agua se describe en WO 95/17210.
Una formulación de adyuvante particularmente potente que implica QS21, 3D-MPL y tocoferol en emulsión aceite en agua se describe en WO 95/17210 y es una formulación preferida.
Las vacunas que comprenden un antígeno superficial de hepatitis B pueden comprender adicionalmente un adyuvante que induce TH-1. El adyuvante que induce TH-1 se selecciona entre el grupo de adyuvantes que comprende: 3D-MPL, QS21, una mezcla de QS21 y colesterol, y oligonucleótido CpG. Vacunas que comprenden un antígeno superficial de hepatitis B pueden ser adyuvadas con un lípido A monofosforilado o derivado del mismo, QS21 y tocoferol en una emulsión aceite en agua.
Las vacunas pueden comprender adicionalmente una saponina, más preferiblemente QS21. Otra formulación particular adecuada de adyuvante que incluye CpG y una saponina se describe en WO 00/09159 y es una formulación preferida. Lo más preferiblemente la saponina en esa formulación particular es QS21. Preferiblemente la formulación comprende adicionalmente una emulsión aceite en agua y tocoferol.
Las formulaciones de vacunas pueden comprender un antígeno superficial de hepatitis B en conjunción con un adyuvante y comprender adicionalmente uno o más antígenos que se seleccionan entre el grupo constituido por: toxoide de difteria (D), toxoide de tétanos (T), antígenos acelulares de tosferina (Pa), virus inactivado de polio (VIP), antígeno de haemophilus influenzae (HiB), antígeno de hepatitis A, virus de herpes simplex (VHS), clamidia, GSB, HPV, streptococcus pneumoniae y antígenos de neisseria. También se pueden combinar en las formulaciones de vacuna antígenos que confieren protección frente a otras enfermedades.
Las formulaciones de vacunas pueden comprender un antígeno superficial de hepatitis B en conjunción con un adyuvante y un virus inactivado de polio.
Se pueden usar composiciones de vacunas de hepatitis B para tratamiento y/o profilaxis de infecciones por virus de hepatitis B, que comprenden administrar a un sujeto animal o ser humano, que sufre o es susceptible de infección por virus de hepatitis B, una cantidad segura y eficaz de una vacuna de este tipo.
Se puede usar un antígeno superficial de hepatitis B en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de pacientes que sufren infección por virus de hepatitis B, tal como infección por virus de hepatitis B crónica.
Las vacunas van a contener una cantidad inmunoprotectora de antígeno y se pueden preparar mediante técnicas convencionales.
La preparación de vacunas se describe en general en Pharmaceutical Biotechnology, Vol. 61 Vaccine Design - the subunit and adyuvant approach, edited by Powell and Newman, Plenum Press, 1995. New Trends and Developments in Vaccines, edited by Voller y col., University Park Press, Baltimore, Maryland, EE.UU. 1978. La encapsulación dentro de liposomas se describe, por ejemplo, por Fullerton, patente de EE.UU. 4.235.877. La conjugación de proteínas con macromoléculas se describe, por ejemplo, por Likhite, patente de EE.UU. 4.372.945 y por Armor y col., patente de EE.UU. 4.474.757. El uso de Quil A se describe por Dalsgaard y col., Acta Vet Scand, 18:349 (1977). 3D-MPL está disponible de Ribi immunochem, EE.UU. y se describe en la solicitud de patente británica Nº 2220211 y en la patente de EE.UU. 4.912.094. QS21 se describe en la patente de EE.UU. Nº 5.057.540.
La presente invención se ilustra, pero no se limita, con los siguientes ejemplos, en los que:
La Figura 1 ilustra el procedimiento de producción exento de tiomersal para Engerix B®;
La Figura 2 ilustra un análisis SDS-PAGE de lotes de antígeno en solución madre; y
La Figura 3 ilustra proteínas residuales de levadura en lotes de antígeno en solución madre producidos mediante el procedimiento exento de tiomersal.
Ejemplo 1
(Ejemplo comparativo)
Procedimiento de producción de antígeno superficial de hepatitis B en presencia de tiomersal
El antígeno superficial de hepatitis B (HBsAg) de la vacuna monovalente de hepatitis B (Engerix®) de SB Biologicals se expresa como proteína recombinante en Saccharomyces cerevisiae (véase Harford y col., loc. cit.). Se produce intracelularmente proteína 24 kD y se acumula en las células recombinantes de la levadura. Al final de la fermentación se recolectan las células de levadura y se interrumpen en presencia de un tensioactivo suave tal como Tween 20 para liberar la proteína deseada. Posteriormente el homogeneizado de células, que contiene las partículas de antígeno superficial soluble, se prepurifica en una serie de precipitaciones y luego se concentra por la vía de ultrafiltración.
Se realiza purificación adicional del antígeno recombinante en posteriores separaciones cromatográficas. En una primera etapa el concentrado de antígeno bruto se somete a cromatografía de permeación de gel sobre un medio de Sepharose 4B. Hay presente tiomersal en el tampón de elución en la etapa de cromatografía de permeación sobre gel. El tampón de elución tenía la siguiente composición: Tris 10 mM, etilenglicol 5%, pH 7,0, tiomersal 0,50 mg/L. En este tampón se incluye tiomersal para controlar la biocarga. La mayor parte de este tiomersal se retira durante las posteriores etapas de purificación que incluyen cromatografía de intercambio de iones, ultracentrifugación y desalación (permeación sobre gel) de modo que las preparaciones de antígeno en solución madre purificadas que se preparan mediante el procedimiento original contienen aproximadamente 1,2 \mug y menos de 2 \mug de tiomersal por 20 \mug de proteína.
Se realiza una etapa de cromatografía de intercambio iónico usando una matriz DEAE y esta mezcla se somete luego a una ultracentrifugación en gradiente de cesio sobre 4 capas pre-establecidas de diferentes concentraciones de cloruro de cesio. Se separan las partículas de antígeno de los componentes de células contaminantes según su densidad en el gradiente y se eluyen al final del procedimiento de centrifugación. Luego se retira el cloruro de cesio de esta mezcla mediante una segunda permeación de gel sobre gel de Sepharose.
Cuando se prepara HBsAg mediante el procedimiento que contiene tiomersal en el tampón de permeación sobre gel 4B, se recuperan concentraciones por encima de 30 mg/ml en las fracciones mezcladas que contienen HBsAg del gradiente de CsCl, correspondientes a una concentración equivalente de HBsAg según se ensaya mediante el kit AUSZYME de Abbott Laboratories.
La etapa de ultracentrifugación de CsCl elimina útilmente lípidos residuales, ADN y contaminantes de proteínas menores de la preparación de HBsAg. Se realiza mediante centrifugación zonal en un rotor Ti 15 de Beckman Instruments, Fullerton, California a una velocidad de 30.000 rpm durante aproximadamente 40 a 60 horas. La muestra que se ha de purificar se aplica a capas de solución de CsCl con concentraciones finales de CsCl de 0,75, 1,5, 2,5 y 3,25 M. Al final de la centrifugación el gradiente se eluye en fracciones. Se pueden identificar las fracciones que contienen HBsAg mediante absorbancia UV a 280 nm o mediante diluciones de prueba de las fracciones con el kit AUSZYME. La banda de HBsAg está a una densidad de 1,17 a 1,23 g/cm^{3}.
La solución que contiene HBsAg purificado se filtra a esterilidad antes de ser usada para elaborar una formulación de vacuna.
La purificación desde el lisato de células de levadura es compleja puesto que el antígeno se produce intracelularmente y para obtener antígeno puro en solución madre es necesaria una serie de técnicas de separación diseñadas para eliminar diferentes tipos de contaminantes (levadura). Las etapas de purificación son importantes, puesto que el producto que se ha de purificar es una partícula de lipoproteína que contiene múltiples copias de polipéptido de antígeno superficial y esta estructura tiene que mantenerse a lo largo del procedimiento de purificación. Una particularidad de este procedimiento es que produce partículas de antígeno superficial que son enteramente inmunogénicas sin necesidad de tratamiento químico adicional para potenciar inmunogenicidad (compárese con EPO 135435).
Los detalles del procedimiento de producción se describen adicionalmente en la patente europea 0199698.
Ejemplo 2 Producción y caracterización de HBsAg derivado de levadura mediante un procedimiento exento de tiomersal 1. Producción y purificación de HBsAg derivado de levadura 1.1 Resumen del procedimiento de producción
Se puede producir antígeno superficial de hepatitis B mediante fermentación de una cepa apropiada de Saccharomyces cerevisiae, por ejemplo la que se describe en Harford y col., (loc. cit.).
Al final de la fermentación a gran escala de la cepa de levadura recombinante, se recolectan las células y fuerza su apertura en presencia de un tensioactivo suave tal como Tween 20. El antígeno superficial se aísla luego mediante un procedimiento multietapa de extracción y purificación exactamente según se describe anteriormente en el Ejemplo 1 hasta la etapa de la primera permeación de gel sobre Sepharose 4B.
1.2 Procedimiento de purificación exento de tiomersal
En el procedimiento exento de tiomersal se han introducido los dos cambios siguientes en comparación con el procedimiento descrito en el Ejemplo 1.
1.
El tampón de elución en la etapa de cromatografía de permeación sobre gel 4B ya no contiene tiomersal.
2.
Se añade cisteína (concentración final 2mM) a la mezcla de eluato de la etapa de cromatografía de intercambio de anión.
Se encontró que la omisión de tiomersal del tampón de permeación sobre gel 4B puede dar como resultado la precipitación de las partículas de HBsAg durante la etapa de centrifugación en gradiente de densidad de CsCl con pérdida de producto y agregación o apelotonamiento del antígeno recuperado.
La adición de cisteína a concentración final de 2 mM a la mezcla de eluato de la etapa precedente de cromatografía de intercambio de anión previene la precipitación y la pérdida de antígeno durante la centrifugación de densidad de CsCl.
La cisteína es una sustancia preferida para este tratamiento y es un aminoácido que se produce naturalmente y puede ser retirado en una etapa de desalación posterior en una columna de permeación sobre gel usando Sepharose 4BCLFF como relleno de columna.
No hay otros cambios en el procedimiento de fabricación en comparación con el procedimiento descrito en el Ejemplo 1.
El procedimiento exento de tiomersal produce antígeno en solución madre de pureza y propiedades comparables a las de antígeno del procedimiento del Ejemplo 1.
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1.2a
Se piensa que el tiomersal añadido al tampón 4B a 50 \mug/ml se descompone y el etilmercurio resultante puede atacar covalentemente a grupos sulfhidrilo libres sobre los restos cisteína de la proteína. La proteína contiene 14 restos cisteína de los cuales 7 están situados entre las posiciones 101 y 150.
Se cree que esta región de la proteína se sitúa en la superficie de la partícula y contiene la principal región antigénica de HBsAg que incluye la región a inmunodominate y el sitio de reconocimiento para el anticuerpo monoclonal RF1 (Waters J y col., Postgrad. Med. J., 1987:63 (Suppl. 2): 51-56, y Ashton-Rickardt and Murray J. Med. Virology, 1989: 29: 196). El antígeno purificado con tiomersal presente en el tampón de permeación sobre gel 4B contiene aproximadamente 0,5-0,6 \mug de mercurio al final del procedimiento de purificación. Este mercurio no se retira completamente mediante simple diálisis.
En un experimento, se midieron 0,56 pg de mercurio por 20 \mug de proteína sobre preparación de antígeno en solución madre. Esta preparación fue dializada durante 16 horas a temperatura ambiente frente a NaCl 150 mM, tampón de NaPO_{4} 10 mM pH 6,9. Al final de la diálisis, se midió una concentración de 0,33 \mug de Hg por 20 \mug de proteína.
En contraposición, la diálisis en presencia de un agente reductor tal como L-cisteína de 0,1 a 5,0 mg/ml, DTT a 50 mM ó 2-mercaptoetanol a 0,5 M, seguida de una segunda diálisis pare retirar el agente reductor, da como resultado una reducción del contenido de mercurio de la preparación de antígeno a menos de 0,025 \mug de mercurio por 20 \mug de proteína. Éste es el límite más bajo de detección del método.
El contenido de mercurio se determinó mediante espectrofotometría de absorción. El antígeno se diluye en una solución que contiene 0,01% peso/volumen de dicromato potásico (K_{2}Cr_{2}O_{7}) y 5% volumen/volumen de ácido nítrico. Se preparan soluciones patrón con tiomersal como fuente de mercurio. La absorción atómica de la muestra y de las soluciones patrón se mide después de vaporización en un generador de vapor, con un cátodo específico para mercurio a 253,7 nm. Como ensayo en blanco, se mide la absorción atómica del líquido de dilución. El contenido de mercurio de la muestra se calcula por la vía de las curvas de calibración que se obtienen de las soluciones patrón. Los resultados se expresan como \mug mercurio por 20 \mug de proteína.
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1.3 Producción de antígeno en solución madre exento de tiomersal
Las etapas del procedimiento para purificación de antígeno en solución madre se muestran en la Figura 1.
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1.4 Composición de vacuna formulada sin tiomersal
En la Tabla 1 se proporciona una composición cuantitativa típica para vacuna de hepatitis B sin conservante y formulada a partir de antígeno preparado mediante el procedimiento exento de tiomersal. Tabla 1:
1
La composición se puede variar mediante adición de 3D-MPL y/u otros adyuvantes.
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2. Caracterización de antígeno en solución madre y vacuna producidos mediante el procedimiento exento de tiomersal 2.1 Pruebas y análisis sobre antígeno en solución madre purificado 2.1.1 Base de comparación
Se prepararon tres lotes de antígeno en solución madre mediante el procedimiento exento de tiomersal según este ejemplo (Ejemplo 1.2) y se identifican como HEF001, HEF002 y HEF003. Se compararon éstos con un lote de antígeno en solución madre (HEP2055) preparado mediante el procedimiento previo (según se describe en el Ejemplo 1) en presencia de tiomersal.
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2.1.2 Pruebas y análisis sobre antígeno en solución madre
Se probaron los tres lotes de antígeno en solución madre producidos mediante el procedimiento exento de tiomersal y los resultados se resumen en la Tabla 2.
El contenido de proteína se midió por el método de Lowry y col., (J. Biol. Chem. 1951:193:265).
El contenido de endotoxina se midió por una técnica de coagulación de gel de Limulus usando un kit comercialmente disponible de Cape Cod Associates, 704 Main St., Falmouth, MA 02540, EE.UU. El reactivo está normalizado frente a US Pharm. Endotoxin Reference Standard.
Se midió Tween 20 por el método de Huddleston and Allred (J. Amer. Oil Chemist Soc., 1965:42:983).
El contenido de HBsAg se midió por el kit comercialmente disponible AusZYME de Abbott Laboratories, One Abbott Park Road, Abbott Park, IL 60064, EE.UU. Se empleó el procedimiento de análisis B del fabricante. Para establecer la curva de respuesta a la dosis se usó como patrón una partida de antígeno en solución madre purificado mediante el procedimiento que contiene tiomersal.
Se midieron polisacáridos por el método de Dubois y col., (Anal. Chem. 1956:28:350).
Se midieron lípidos usando un kit comercialmente disponible (Merckotest Total Lipids 3321) de E. Merck, B.P. 4119, Darmstad D-6100, Alemania.
Se midió el contenido de ADN por el método de umbral usando aparato y reactivos disponibles de Molecular Devices Corp., Gutenbergstraße 10, Ismaning, Munich, Alemania.
Los valores encontrados en las pruebas y análisis están en el intervalo observado para lotes de antígeno en solución madre que se fabrican usando tiomersal en el tampón de elución de la etapa de permeación sobre gel de Sepharose 4B, con excepción de la actividad antigénica por ELISA. Los valores para esta medición para las tres preparaciones HEF son más altos (1,63-2,25) que los encontrados para el lote de antígeno en solución madre HEP2055 que tiene una relación ELISA/proteína de 1,13. Las relaciones ELISA/proteína medidas por el kit AUSZYME para partidas de antígeno en solución madre que contienen tiomersal generalmente son aproximadamente 1,0 y dentro del intervalo 0,8-1,2 y muy raramente exceden de 1,4.
2.1.3 Análisis de gel SDS-PAGE
Se analizaron las preparaciones de antígeno en solución madre mediante análisis SDS-PAGE en condiciones reductoras y tinción con azul de Coomassie. Todas las muestras mostraron una banda principal a 24K con indicios de una proteína dímera. Todas las muestras se calificaron que eran de alta pureza (>99% de pureza) según se evaluaron por la ausencia de bandas visibles de proteínas contaminantes.
Se analizaron muestras (1 \mug) de las preparaciones de antígeno en solución madre mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras y tinción de plata (Figura 2). En condiciones reductoras las muestras presentaron una banda intensa que migró a 24K con indicios de formas dímeras y multiméricas. Los patrones de gel son indistinguibles de los de HEP2055 como referencia de comparación. Las muestras también se trataron en condiciones no reductoras. En estas condiciones menos material migra a 24K y se aumenta la cantidad de polipéptido que migra a posiciones dímeras y multiméricas. Los lotes de antígeno en solución madre exento de tiomersal parece que tienen un grado algo más alto de polimerización que el lote de HEP2055 de referencia de comparación.
La identidad del polipéptido 24K revelada por tinción con azul de Coomasie o plata fue confirmada mediante inmunotransferencia de Western con anticuerpos policlonales de conejo generados frente a HBsAg de plasma. Las preparaciones de antígeno en solución madre muestran una banda principal a 24K junto con formas dímeras y trímeras. La técnica revela indicios menores de productos de rotura de la proteína de antígeno superficial. No hay diferencias entre el antígeno en solución madre preparado mediante el procedimiento exento de tiomersal y el lote HEP2055.
Se analizó la presencia de proteínas de levadura residuales mediante análisis SDS-PAGE en condiciones reductoras e inmunotransferencia de Western con antisuero policlonal de conejo generado frente a proteínas de levadura (Figura 3). La técnica es cualitativa y no permite cuantificación de las impurezas.
Se muestra un patrón de banda constante en los tres lotes de antígeno en solución madre preparados mediante el procedimiento exento de tiomersal y en el lote HEP2055 con una excepción.
Una banda de tinción intensa presente a \pm23K en el antígeno en solución madre de HEP2055 está virtualmente ausente en las 3 preparaciones de HEF. La inmunotransferencia de Western muestra que el procedimiento de purificación exento de tiomersal da como resultado un producto de antígeno más puro.
TABLA 2 Resultados de pruebas y análisis sobre antígeno en solución madre purificado, exento de tiomersal
2
2.1.4 Otras pruebas y análisis bioquímicos 2.1.4.1 Contenido de ADN
Se midió el contenido de ADN de los 3 lotes de antígeno en solución madre por el método de umbral (Molecular Device Corp.). Las cantidades medidas fueron menos de 10 pg de ADN por 20 \mug de proteína (Tabla 2); el mismo nivel de contenido de ADN observado con antígeno en solución madre producido mediante el procedimiento actual aprobado.
2.1.4.2 Composición de aminoácidos
Se determinó la composición de aminoácidos de los tres lotes de antígeno en solución madre HEF después de hidrólisis ácida con HCl 6N mediante cromatografía de los aminoácidos sobre una columna de intercambio iónico con detección de ninhidrina después de la columna. No se determinaron prolina ni triptófano. Los resultados se dan en la Tabla 3.
Las composiciones encontradas están en buena conformidad con las determinadas sobre HEP2055 y con la composición esperada derivada de la secuencia de ADN. Aunque el número de restos glicina medidos para HEP2055 está próximo a la composición esperada, un valor de 16 a 17 restos es más habitualmente medido para preparaciones de antígeno en solución madre. El número medio de restos cisteína encontrado es el esperado de 14, lo que muestra es que no se unen cisteínas extra a la partícula como resultado del tratamiento en la etapa de gradiente de CsCl.
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2.1.4.3 Cuantificación de cisteína libre
Se midió la cantidad de cisteína libre presente en las preparaciones de antígeno en solución madre obtenidas según el procedimiento descrito después de oxidación de las partículas con ácido perfórmico sin hidrólisis ácida previa. Se separaron los restos de cisteína libre oxidada sobre una columna de intercambio iónico con detección por ninhidrina después de la columna. El límite de detección de cisteína por este procedimiento es 1 \mug por ml.
No se pudo medir cisteína libre en las 3 preparaciones de antígeno HEF cuando se probaron a las concentraciones iniciales de proteína dadas en la Tabla 2.
La técnica mide ambos restos de proteína libre presentes en el tampón y restos de cisteína que están unidos a la proteína de HBsAq por enlace bisulfuro pero que no forman parte de la secuencia de polipéptido.
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2.1.4.4 Análisis de secuencia N-terminal
La presencia de posibles contaminantes de proteína y productos de degradación en los tres lotes de antígeno en solución madre producidos por el procedimiento modificado fue evaluada por análisis de secuencia N-terminal basado en la degradación de Edman. Se detectó la secuencia N-terminal MENITS... de la proteína de HBsAg sin interferencia de otras secuencias. También se confirmó que la metionina N-terminal estaba bloqueada por acetilación en 60-75%, según se observó previamente para polipéptido de HBsAg producido mediante el procedimiento convencional.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 3 Composición de aminoácidos de HBsAg
3 
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2.1.4.5 Análisis de dispersión de luz láser
Se hicieron comparaciones de tamaño de partícula mediante dispersión de luz láser entre partículas de HBsAg producidas usando el procedimiento modificado y el lote de referencia HEP2055 (Tabla 4). Los pesos moleculares medios determinados muestran buena coherencia entre las preparaciones.
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TABLA 4 Pesos moleculares de partícula de HBsAg mediante dispersión de luz láser
4 
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2.1.4.6 Microscopía electrónica
Se examinaron las preparaciones de antígeno en solución madre mediante microscopía electrónica después de fijación y tinción con acetato de uranilo.
Las partículas observadas fueron similares en todas las muestras y conformadas a las partículas subesféricas o similares a adoquinado de \pm 20 nm típicas de HBsAg. Las partículas observadas en los 3 lotes HEF fueron indistinguibles de HEP2055.
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2.1.5 Análisis inmunológico 2.1.5.1 Reactividad con anticuerpo monoclonal RF1
Se probaron las tres preparaciones de antígeno en solución madre respecto a su reactividad con el anticuerpo monoclonal RF1 mediante análisis de inhibición ELISA. Se ha mostrado que el anticuerpo monoclonal RF1 protege a los chimpancés frente a la provocación con VHB y se considera que reconoce un epitopo conformacional protector sobre la partícula de HBsAg (Iwarson S y col., 1985, J. Med. Virol., 16:89-96).
El hibridoma de RF1 se puede propagar en la cavidad peritoneal de ratones BalbC o en cultivo tisular.
Fluido ascítico diluido a 1/50000 en tampón de saturación (PBS que contiene 1% de BSA, 0,1% de Tween 20) se mezcló 1:1 con diversas diluciones en PBS de las muestras de HBsAg que se han de probar (oscilando las concentraciones finales entre 100 \mug y 0,05 \mug/ml).
Se incubaron las muestras en inmunoplacas de Nunc (96 U) durante 1 hr a 37ºC antes de ser transferidas para estar durante 1 hr a 37ºC en placas revestidas con una preparación estándar de HBsAg. La preparación estándar de HBsAg fue un lote de antígeno en solución madre (Hep 286) purificado mediante el procedimiento que contiene tiomersal. Después de una etapa de lavado con PBS que contiene 0,1% de Tween 20, se añadió IgG anti-ratón de oveja conjugada con biotina diluida a 1/1000 en tampón de saturación y se incubó durante 1 hr a 37ºC. Después de una etapa de lavado, se añadió el complejo de estreptavidina-biotina peroxidasa diluido a 1/1000 en tampón de saturación a los mismos pocillos y se incubó durante 30 min a 37ºC. Se lavaron las placas y se incubaron con una solución de 0,04% de OPDA, 0,03% de H_{2}O_{2} en tampón de citrato 0,1 M pH 4,5 durante 20 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detuvo con H_{2}SO_{4} 2N y se midieron las densidades ópticas (D.O.) a 490/630 nm y se representaron gráficamente.
Se calculó la IC50, definida como la concentración de antígeno (concentración de inhibidor) que inhibe el 50% de la unión de anticuerpo a HBsAg revestido, usando una ecuación de 4 parámetros y se expresó en ng/ml.
También se probó una serie de lotes de antígeno HEP que incluye HEP2055, junto con antígeno de Herpes simplex gD como control negativo. El análisis mide la capacidad de cada antígeno de prueba para inhibir la unión de RF1 a una preparación de antígeno estándar (HEP 286) unido a las placas de microvaloración.
La Tabla 5 da la concentración de cada antígeno que se ha encontrado que inhibe 50% de la unión de RF1 al antígeno fijado.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 5 Inhibición de unión de anticuerpo monoclonal RF1 a HBsAg
5
Esto muestra que antígeno preparado mediante el procedimiento modificado tiene un aumento en la presentación del epitopo de RF1 en comparación con antígeno en solución madre HEP.
Se realizó el mismo tipo de análisis de inhibición usando sueros humanos de vacunas Engerix B® en lugar de RF1 mAb y no revelaron diferencias entre los lotes de antígeno HEP y los de antígenos HEF.
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2.1.5.2 Afinidad de unión a RF1 monoclonal
Se midieron los parámetros cinéticos de anticuerpo monoclonal RF1 cuando se une a los 3 lotes de antígenos HEF y al HEP2055 mediante resonancia superficial de plasmones usando un aparato Biacore 2000 de Amersham Pharmacia Biotech, Amersham Place, Little Chalfont, Bucks, UK.
Los parámetros cinéticos medidos fueron:
ka: la constante de velocidad de asociación (M^{-1}S^{-1})
kd: la constante de velocidad de disociación (S^{-1})
Ka: la constante de equilibrio o de afinación (M^{-1})
donde
Ka = \frac{ka}{kd}
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Los valores encontrados se dan en la Tabla 6.
TABLA 6 Constantes de afinidad de la unión de RF1 a HBsAg
6 
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Los tres lotes de antígeno HEF dieron valores similares de constantes de asociación/disociación y afinidad de unión. En contraposición HEP2055 tiene una afinidad más débil para unirse a RF1.
Esto es coherente con los resultados del análisis de inhibición de ELISA que mostraron que antígeno preparado mediante el procedimiento exento de tiomersal tuvieron un aumento de la presentación de epitopo de RF1.
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2.2 Prueba y análisis sobre vacuna formulada con antígeno producido mediante el procedimiento modificado
Se adsorbieron los tres lotes de antígeno HEF sobre hidróxido de aluminio y se formularon como vacuna según la composición que se muestra en la Tabla 1. La presentación es la dosis de adultos en viales (20 \mug de proteína de antígeno en 1 ml). Los lotes se identifican como DENS001A4, DENS002A4 y DENS003A4.
Se midió la potencia de la vacuna por análisis in-vitro de contenido de antígeno usando el kit de ELISA AUZYME de Abbott Laboratories y un lote clásico de vacuna formulada con 500 g/ml de tiomersal como estándar. Se midió la potencia de la vacuna usando el método B según se describe en PharmaEuropa Special Issue Bio97-2 (Diciembre 1997). Los tres lotes de HEF dan valores altos para el contenido de antígeno, casi el doble que el contenido indicado de 20 \mug de proteína de antígeno.
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2.2.1 Reactividad de vacuna DENS con anticuerpo monoclonal RF1
La antigenicidad de la vacuna absorbida se comprobó adicionalmente en un análisis de inhibición con anticuerpo monoclonal RF1. El análisis mide la capacidad de la muestra de vacuna para inhibir la unión de RF1 al antígeno en solución madre fijado (HEP286).
Fluido ascítico diluido a 1/50000 en tampón de saturación (PBS que contiene 1% de BSA, 0,1% de Tween 20) se mezcló 1:1 con diversas diluciones en PBS de las muestras de vacuna que se han de probar (oscilando la concentración entre 20 \mug y 0,05 \mug/ml).
Se incubaron las mezclas en inmunoplacas de Nunc (96 U) durante 2 hr a 37ºC con agitación antes de ser transferidas a placas revestidas con HBsAg. La preparación de HBsAg usada para el revestimiento fue un lote de antígeno en solución madre (Hep 286) purificado mediante el procedimiento que contiene tiomersal. Estas placas se incuban luego durante 2 horas a 37ºC con agitación. Después de una etapa de lavado con PBS que contiene 0,1% de Tween 20, se añadió IgG anti-ratón de oveja conjugada con biotina diluida a 1/1000 en tampón de saturación y se incubó durante 1 hr a 37ºC. Después de una etapa de lavado, se añadió el complejo de estreptavidina-biotina peroxidasa diluido 1/1000 en tampón de saturación a los mismos pocillos y se incubó durante 30 min a 37ºC. Se lavaron las placas y se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente con una solución que contenía de 0,04% de OPDA, 0,03% de H_{2}O_{2} en tampón de citrato 0,1 M pH 4,5. La reacción se detuvo con H_{2}SO_{4} 2N y se midieron las densidades ópticas (D.O.) a 490/630 nm y se representaron gráficamente.
Se calculó la IC50, definida como la concentración de antígeno (concentración de inhibidor) que inhibe el 50% de la unión de anticuerpo a HBsAg revestido, usando una ecuación de 4 parámetros y se expresó en ng/ml.
Se comparó vacuna preparada con antígeno en solución madre producido mediante el procedimiento modificado con vacuna Engerix B® formulada con antígeno en solución madre HEP clásico y sin tiomersal como conservante.
Los análisis se realizaron por triplicado.
Los resultados se dan en la Tabla 7 y muestran que se requiere aproximadamente la mitad de la cantidad de vacuna DENS para conseguir 50% de inhibición de unión de RF1 en comparación con vacuna Engerix B® exenta de conservante. Esto refleja un aumento de presentación de epitopo de RF1 sobre el antígeno HEF/DENS y es coherente con las pruebas hechas con anticuerpo RF1 sobre el antígeno en solución madre purificado.
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TABLA 7 Inhibición de unión de RF1 mediante vacuna formulada
8 
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2.2.2 Inmunogenicidad de vacuna DENS en ratones
Se realizó un estudio en ratones Balb/C a fin de comparar la inmunogenicidad de tres lotes DENS con Engerix B® producida según el procedimiento de fabricación actual de antígeno y la formulada con tiomersal.
Se probaron los siguientes lotes:
# DENS001A4
# DENS002A4
# DENS003A4
# ENG2953A4/Q como referencia
En suma, se inmunizaron intramuscularmente grupos de 12 ratones dos veces en un intervalo de 2 semanas con dosis de vacuna correspondientes a 1/10 (2 \mug) ó 1/50 (0,4 \mug) de la dosis de seres humanos adultos. Se monitorizaron la respuesta de anticuerpo a HBsAg y el perfil isotípico inducido por la vacunación desde sueros extraídos en el día 28.
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Diseño experimental
Grupos de 12 ratones Balb/C se inmunizaron intramuscularmente en ambas patas (2x50 \mul) en días 0 y 15 con las siguientes dosis de vacuna:
TABLA 8 Grupos y dosis de vacuna
9 
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En los días 15 (2 semanas después de I) y 28 (2 semanas después de II) se extrajo sangre del seno retroorbital.
Para el diseño de este experimento (4 formulaciones x 2 dosis con 12 ratones por grupo), se estimó de antemano la potencia con el programa estadístico PASS. El programa estadístico PASS (potencia y tamaño de muestra) se obtuvo de NCSS, 329 North 1000 East, Kaysville, Utah 84037. Para el análisis de varianza de dos factores, una diferencia de GMT entre formulaciones de 2,5 veces con un error alfa de 5% se debería detectar con una potencia > 90%.
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Resultados Serología
Se midieron las respuestas humorales (Ig total e isotipos) mediante análisis ELISA usando HBsAg (Hep 286) como antígeno de revestimiento y anticuerpos anti-ratón conjugados con biotina para revelar la unión de anticuerpo anti-HBs. Solamente se analizaron sueros después de II.
La Tabla 9 muestra las respuestas de Ig anticuerpo anti-HBs media y GMT medidas sobre sueros individuales a las 2 semanas después de II.
Respuestas anticuerpo comparables fueron inducidas por las formulaciones de hepatitis B clásica y de DENS: oscilando GMT entre 2304 y 3976 EU/ml para los lotes DENS en comparación con 2882 EU/ml para vacuna monovalente de hepatitis B (Engerix B®) de SB Biologicals a dosis de 2 \mug, y oscilando GMT entre 696 y 1182 EU/ml para los lotes DENS en comparación con 627 EU/ml para vacuna monovalente de hepatitis B (Engerix B®) de SB Biologicals a dosis de 0,4 \mug.
\bullet
Según lo esperado, se observa un claro efecto del intervalo de dosis del antígeno para todas las formulaciones a dosis de 2 \mug y 0,4 \mug con una diferencia en GMT de 3 a 6 veces.
\bullet
Se observaron cuatro ratones que no respondieron (valoraciones <50 EU/ml) sin conexiones claras con las dosis o lotes de antígeno usados para la inyección (Grupos 1, 2, 3 y 8; un ratón por grupo). Sobre la base del análisis estadístico (prueba de Grubbs) esos ratones se descartaron de análisis posteriores.
TABLA 9 Respuesta anticuerpo en ratones al día 28 (2 semanas después de II)
10 
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Análisis estadístico
Se realizó un análisis de varianza de dos factores sobre las valoraciones de anti-HBs tras la transformación logarítmica de datos después de II, usando las vacunas (4 lotes) y dosis de antígeno (2 \mug y 0,4 \mug) como factores. Este análisis confirmó que se observaba una diferencia estadísticamente significativa entre las dos dosis de antígeno (valor de p < 0,001) y no mostraron diferencia significativa alguna entre los lotes de vacuna (valor de p = 0,2674). Según se ha mencionado previamente se estimó de antemano la potencia y el diseño del experimento fue tal que se podía detectar una diferencia de GMT de 2,5 veces entre formulaciones con un error alfa de 5% con una potencia > 90%.
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Perfil isotípico
La Tabla 10 muestra el reparto isotípico (IgG1, IgG2a e Ig2b) calculado a partir de un análisis sobre sueros mezclados después de II.
\bullet
Según lo esperado, se induce una clara respuesta TH2 por esas vacunas basadas en alúmina puesto que se observan principalmente anticuerpos IgG1.
No se observa diferencia entre los lotes DENS ni vacuna monovalente de hepatitis B de SB Biologicals en términos de perfil isotípico.
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TABLA 10 Reparto de isotipos de IgG en sueros del día 28 mezclados
11
Ejemplo 3 Formulación de vacunas combinadas
El antígeno en solución madre de la invención es particularmente adecuado para formulación de una vacuna combinada que comprende VIP.
Estudios de estabilidad realizados sobre lotes iniciales de una vacuna combinada de DTPa-VHB-VIP indicaron una caída en potencia del componente de VIP, particularmente de antígeno de tipo 1 de poliomielitis, cuando se usa en un inmunoanálisis in vitro (determinación de contenido de antígeno D mediante ELISA) y una prueba de potencia in vivo en ratas. No se observó pérdida de potencia para tipo 3. Para tipo 2 la pérdida de potencia estuvo dentro del intervalo esperado (no más de 10% de pérdida por año de almacenamiento).
Se iniciaron estudios para determinar la causa de esta pérdida de potencia en la vacuna combinada de DTPa-VHB-VIP. A partir de la observación de que la estabilidad de vacuna de DTPa-VIP de SB Biologicals es satisfactoria (no más de 10% de pérdida de contenido de antígeno por año de almacenamiento), se concluyó que el componente de VHB había de ser probablemente responsable de la inestabilidad de VIP in la vacuna de DTPa-VHB-VIP.
El componente de VHB usado en la formulación de DTPa-VHB-VIP inicial es el HBsAg derivado de levadura, purificado de ADN-r, también usado para la fabricación de vacuna monovalente de hepatitis B de SB Biologicals y preparado según se describe en el Ejemplo 1.
Como primera tentativa para determinar qué elemento en el componente de VHB era perjudicial para VIP, se analizó HBsAg en solución madre respecto a la presencia de tiomersal. Se había encontrado previamente (Davisson y col., 1956, J. Lab. Clin. Med. 47:8-19) que tiomersal usado como conservante en vacunas de DTP "era pernicioso para virus de poliomielitis" en una combinación de DTP-VIP. Esta observación fue considerada por los fabricantes de vacuna que han sustituido tiomersal con otros conservantes para formular sus vacunas que contienen VIP. Más recientemente, se ha vuelto a investigar el efecto de tiomersal sobre la potencia de VIP bajo condiciones de almacenamiento a largo plazo a +4ºC. Se reseñó la pérdida de potencia de antígeno de virus de polio de tipo 1 hasta niveles indetectables después de 4-6 meses (Sawyer, L.A. y col., 1994, Vaccine 12: 851-856).
Usando espectroscopía de adsorción atómica, se detectaron aproximadamente 0,5 \mug de mercurio (Hg) por 20 \mug de HBsAg en antígeno purificado según el Ejemplo 1.
Esta cantidad de mercurio (como tiomersal y cloruro de etilmercurio, el producto de degradación de tiomersal) puede reducir a niveles indetectables la respuesta de ELISA para contenido de antígeno D de tipo 1 en un concentrado en solución madre de VIP incubado a 37ºC durante 7 días.
Se estableció un procedimiento para liberar mercurio presente en la solución madre de HBsAg. Se postuló que se podría unir mercurio a grupos tiol sobre la partícula de HBsAg y por lo tanto podría ser liberado en presencia de agentes reductores. Después de experimentación con otros agentes reductores, se seleccionó L-cisteína como el agente para liberación de mercurio de la partícula de HBsAg. Después de diálisis de solución madre de HBsAg frente a solución salina que contiene L-cisteína 5,7 mM, no se detectó mercurio en el retenido (límite de detección del método de prueba: 25 ng Hg/20 \mug de HBsAg). El antígeno dializado se mezcló con concentrado en disolución madre de VIP y se evaluó la estabilidad del virus de tipo 1 midiendo el contenido de antígeno D después de incubación a 37ºC durante 7 días. Los concentrados de solución madre de VIP no mezclado y mezclado con HBsAg no tratado con cisteína se usaron como controles. Se obtuvo la valoración de ELISA de referencia sobre muestras almacenadas de +2ºC a +8ºC durante 7 días. Los resultados se resumen en la Tabla 11:
TABLA 11
12
Los datos obtenidos en estas preparaciones de laboratorio demuestran claramente que la estabilidad del virus de polio tipo 1 se mejora significativamente si se trata HBsAg con cisteína para retirar mercurio residual antes de mezclar con VIP.
Los datos presentados anteriormente también muestran una pérdida de contenido de antígeno D de 23% para la preparación de VIP de referencia después de incubación durante 7 días a 37ºC. Esto confirma la inestabilidad inherente del virus de polio tipo 1 Mahoney, según se ha reseñado anteriormente (Sawyer, L.A. y col., (1994), Vaccine 12: 851-856).
Aunque los lotes comerciales de vacunas de DTPa-VHB-VIP y DTPa-VHB-VIP-Hib han sido preparados usando un procedimiento de diálisis con L-cisteína 5,7 mM para retirar mercurio residual y conservar la estabilidad de VIP, el procedimiento de diálisis no es adecuado para producción a gran escala e implica una serie de etapas suplementarias para preparar HBsAg exento de tiomersal y de mercurio. En contraposición, el HBsAg de la presente invención, preparado sin tiomersal, se puede usar directamente en formulaciones de vacunas combinadas especialmente las que contienen VIP.
4. Resumen
El procedimiento previamente usado para purificación de antígeno superficial derivado de levadura contiene una etapa de permeación sobre gel en la que se incluye el compuesto antimicrobiano tiomersal que contiene mercurio en el tampón de elución para controlar la biocarga.
El tiomersal no se depura completamente durante las etapas posteriores del procedimiento de modo que hay presentes aproximadamente 1,2 \mug de tiomersal por 20 \mug de proteína en el antígeno en solución madre purificado.
A fin de producir un antígeno en solución madre completamente exento de tiomersal (mercurio) el procedimiento de purificación ha sido alterado en dos etapas.
\bullet
Se omite tiomersal del tampón de elución en la etapa de permeación sobre gel 4B.
\bullet
Se añade cisteína (concentración final 2mM) a la mezcla de eluato de la etapa de cromatografía de intercambio iónico. Esto previene la precipitación de antígeno durante la centrifugación en gradiente de densidad de CsCl.
No hay otros cambios en el procedimiento de producción.
Se ha caracterizado el antígeno en solución madre producido mediante el procedimiento modificado. Las pruebas y análisis fisicoquímicos muestran que el antígeno exento de tiomersal es indistinguible en sus propiedades del antígeno producido mediante el procedimiento que se usaba previamente. Las partículas de antígeno tienen los mismos constituyentes.
La identidad e integridad del polipéptido de HBsAg no está afectada por el procedimiento modificado según se comprueba mediante análisis SDS-PAGE, inmunoensayo de Western usando anticuerpos anti-HBsAg policlonales, análisis de secuencia N-terminal y composición de aminoácidos. Microscopía electrónica y análisis de dispersión de luz láser muestran que las partículas son de la forma y tamaño típicos esperados para HBsAg derivado de levadura. Análisis mediante inmunoanálisis de Western con suero de proteína anti-levadura muestra que el antígeno producido mediante el procedimiento exento de tiomersal tiene un patrón similar de proteínas de levadura contaminantes. Sin embargo, la cantidad de banda contaminante que migra a 23K está muy reducida en los 3 lotes de HBsAg producidos usando el procedimiento modificado.
Los análisis inmunológicos muestran que las partículas exentas de tiomersal tienen una mayor antigenicidad. Las partículas son más reactivas con el kit AUSZYME de Abbott (conteniendo una mezcla de anticuerpos monoclonales) dando relaciones ELISA/proteína de 1,6 a 2,25. Esta mayor antigenicidad también se muestra con el anticuerpo monoclonal protector RF1. El antígeno exento de tiomersal que se requiere para inhibir la unión de RF1 a un antígeno fijado estándar es aproximadamente 4 a 7 veces menor. Las curvas de inhibición de unión de antígeno exento de tiomersal y clásico caen en dos familias distintas. Esta diferencia también se muestra mediante mediciones de la constante de afinidad de unión para RF1 usando resonancia superficial de plasmones. Las afinidades de unión de preparaciones son 3 a 4 veces más altas en comparación con el lote de antígeno en solución madre clásico.
Las preparaciones de antígeno en solución madre se formularon como vacuna mediante adsorción en hidróxido de aluminio y sin conservante.
Las pruebas de potencia in vitro usando el kit AUSZYME ELISA de Abbott y vacuna monovalente de hepatitis B de SB Biologicals como patrón mostraron que se obtenían valores altos de potencia in vitro. El contenido de antígeno medido por esta prueba fue casi el doble que el valor indicado de 20 \mug de proteína por ml.
También se vio una mayor reactividad de la vacuna preparada a partir de antígeno exento de tiomersal en un análisis de inhibición con anticuerpo monoclonal RF1 respecto a unión a antígeno fijado. Se requirió aproximadamente la mitad de la cantidad de vacuna exenta de tiomersal para dar 50% de inhibición de la unión de RF1 a antígeno fijado en comparación con antígeno purificado mediante el procedimiento que se usaba previamente y formulado sin conservante.
Esta mayor antigenicidad de la vacuna exenta de tiomersal con respecto a RF1 es coherente con los resultados de la prueba de potencia in vitro (contenido de antígeno) y con las pruebas de anticuerpo RF1 realizadas sobre preparaciones de antígeno en solución madre.
Se realizó una prueba de inmunogenicidad en ratones usando vacunaciones iniciadora e impulsora con dos semanas de separación y dosis de 2 y 0,4 \mug de antígeno. Se sangraron los ratones el día 28, 14 días después de la vacunación impulsora. Se analizaron los sueros respecto a valoración de anticuerpo y composición de isotipo. Se observó un claro efecto de la dosis de antígeno para las dos dosis administradas pero no hubo diferencia estadísticamente significativa en la respuesta en términos de valoraciones de anticuerpos (GMT) entre vacunas exentas de tiomersal y exentas de conservante.
No se observaron diferencias sustanciales en perfiles de isotipos.

Claims (10)

1. Un procedimiento para producir una vacuna de hepatitis B inmunogénica, estable sin indicios de tiomersal, comprendiendo el procedimiento:
(a)
expresar el antígeno superficial de hepatitis B (HBsAg) como proteína recombinante en Saccharomyces cerevisiae;
(b)
procesar las células de la levadura para proporcionar una preparación bruta de antígeno;
(c)
someter la preparación bruta de antígeno a cromatografía de permeación sobre gel, en la que el tampón de elución que se usa en la cromatografía de permeación sobre gel no contiene tiomersal.
(d)
someter al eluyente que contiene antígeno de la etapa (c) a cromatografía de intercambio iónico;
(e)
añadir cisteína a la mezcla de eluyente que contiene antígeno obtenida después de la etapa (d);
(f)
someter a la preparación de la etapa (e) a ultracentrifugación con cloruro de cesio; y
(g)
combinar el HBsAg purificado con un excipiente farmacéuticamente aceptable para producir una vacuna de hepatitis B inmunogénica, estable;
en el que no se añade tiomersal a la vacuna resultante.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que se añade la cisteína a una concentración final entre 1 y 10 mM.
3. Un procedimiento según la reivindicación 2, en el que se añade la cisteína a una concentración final de aproximadamente 2 mM.
4. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la cromatografía de intercambio iónico es cromatografía de intercambio aniónico.
5. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la vacuna se combina adicionalmente con un adyuvante.
6. Un procedimiento según la reivindicación 5, en el que el adyuvante es una sal de aluminio.
7. Un procedimiento según la reivindicación 6, en el que el adyuvante es gel de hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio.
8. Un procedimiento según la reivindicación 8, en el que el adyuvante es un adyuvante que induce Th-1.
9. Un procedimiento según la reivindicación 9, en el que el adyuvante que induce Th-1 es 3D-MPL; QS21; 3D-MPL y QS21; o un oligonucleótido CpG.
10. Un procedimiento según la reivindicación 9, en el que el adyuvante es 3D-MPL y una sal de aluminio.
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