JPS6013718A - Ｂ型肝炎ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、Ｂ型肝炎ワクチンの凍結乾燥製剤に関する。

さらに詳しくは、アルミニウムゲルおよび安定化剤の存
在下で凍結乾燥を行うことを特徴とするＢ型肝炎ワクチ
ンの凍結乾燥製剤を提供するものである。

、Ｂ型肝炎ワクチンは、わが国でも開発が進められてい
るが、米国ではすでに市販されている。米国において製
品化されているＢＷ肝炎ワクチンは−Ｂ型肝炎ウィルス
表面抗原（ＨＢ　ｓ　Ａｇ　）含量２０／Ａグ／−の液
状製剤である。

Ｂ型肝炎ワクチンは、ＨＢｓＡｇ陽性人血漿からＨＢｓ
Ａｇを高度に精製したものから製剤される。したがって
極めて貴重なものである。

Ｂ型肝炎ワクチンは、Ｂｆｉ肝炎発症患者および一見健
康な潜在的ウィルス保菌者（以下単に健康キャリアとい
う）に接触する機会の多い医療従事者、研究者や患者お
よび健康キャリアの家族、新生児等へ血液を介してＢ型
肝炎ウィルスが感染するのを防止する効果がある。とこ
ろで、この健康キャリアは日本の総人口の２〜３％、東
南アジア−アフリカではその人口の１０〜１５％に達す
るといわれている。これらの背景からＢ型肝炎ワクチン
製剤は、日本国内はもとより広く世界各地において使用
することを可能ならしめる必要がある。加えて貴重な原
料の有効な活用を勘案すれば、安定性がすぐれ長期保存
に充分に耐え得る製剤の提供は必須の要件である。

本発明者らは、Ｂ型肝炎ワクチンの液状製剤において保
存中に力価が低下していく恐れがあることを考慮し−こ
れを凍結乾燥製剤化することにより、保存安定性を格段
に向上させる目的で研究を実施した。

一般に不活化ワクチンは、ワクチン投与後の抗体産性を
高めるため、免疫アジュバントとしてたとえばアルミニ
ウムゲルを加えて製剤化されることが多い。Ｂ型肝炎ワ
クチンは製剤化に際してこのアルミニウムゲルを添加す
る。ところでＢ型肝炎ワクチンを凍結乾燥製剤化する場
合、ＨＢ　ｓ　Ａｇを単独に凍結乾燥したのでは−ワク
チンとして使用するに際して、ＨＢ　ｓ　Ａｇをあらか
じめ注射用生理食塩水あるいは注射用蒸留水等で溶解し
−これをアルミニウムゲル含有液と混合して使用ワクチ
ン液として調製する必要があり、調製手順一温度条件一
振とう混合条件等により一団３ｓＡｇのアルミニウムゲ
ルへの吸着がワクチンの最少使用単位容器ごとに種々差
を生じ−したがって使用ワクチンの抗体産生能にバラツ
キが生じる恐れがある。このことから本発明者らはＢ型
肝炎ワクチンの凍結乾燥製剤化に際しては、ＨＢ　ｓ　
Ａｇをアルミニウムゲルに吸着させた状態でワクチンの
最少使用単位容器に分注し一凍結乾燥させることがぜひ
とも必要であると考えた。かくすればワクチンの同一製
造ロットにおいて、各最少使用単位容器のワクチンの抗
原力価を同一に調製することが可能である。

一方、ＨＢ　ｓ　Ａｇは通常の液状製剤にみられるよう
な条件においてそのまま凍結乾燥を行うと、乾燥の過程
において力価が低下する欠点を伴う。したがって安定化
剤の存在下凍結乾燥を行うことが必要であるが、ＨＢｓ
Ａｇをアルミニウムゲルの存在下凍結乾燥を行う条件に
ついては全く未知のことであり、さらにこの条件が凍結
乾燥製剤の保存安定性におよはｒ影響についても予測で
きないものである。

本発明者らは一以上のような問題点を解決すべく鋭意検
討を重ねた結果、抗原力価の低下や性状の悪化を伴わず
に、ＨＢｓＡｇにアルミニウムゲルを吸着した状態で凍
結乾燥することを可能とならしめ、かつ乾燥品の保存安
定性も液状製剤に比して格段に良好となる凍結乾燥の条
件と一安定化のための製剤の配合組成とを見出すことに
より本発明を完成した。

本発明は精製ＨＢｓＡｇをアルミニウムゲルに吸着させ
たのち、この懸濁液に安定化剤および必要であれば防腐
剤をそれぞれ溶解させ一次にこの液を凍結乾燥させて得
られるＢ型肝炎ワクチンの凍結乾燥製剤を提供するもの
である。

精製ＨＢｓＡｇは−ＨＢｓＡｇ陽性人血漿から超遠心分
離法、イオン交換クロマトグラフィー法−ゲル濾過クロ
マトグラフィー法など既知のＩ（Ｂ　ｓ　Ａｇの精製法
により得ることができる。精製ＨＢ　ｓ　Ａｇはワクチ
ン材料として用いる場合、あらかじめ不活化操作が実施
される。たとえば６０℃１０時間の加熱処理および０．
０５　ｖ／ｖ％ホルマリンで３７℃９６時間の処理を実
施する。

上記のように不活化処理した精製ＨＢ　ｓ　Ａｇは一水
溶液中で蛋白濃度として（ｌ　ｌ　ｗ／ｖ％以下、好ま
しくは０．０２　ｗ／ｖ以下に調製される。ＨＢ　ｓ　
Ａｇのアルミニウムゲルへの吸着は、アルミニウムゲル
をＨＢ　ｓＡｇに対して３〜１０倍重量用いて行なう。

この吸着操作は−ＨＢｓＡｇ含有液にアルミニウムゲル
含有液を混合することで達成できるし、Ｉ４ＢｓＡｇ　
含有液に塩化アルミニウム含有液の所定量を加え、この
混合液に適当な濃度の水酸化ナトリウム水浴液を加えて
、水酸化アルミニウムゲルを生成させると同時にＨＢｓ
Ａｇを吸着させることでも達成できる。この場合水酸化
ナトリウム水浴液三 に替えてリン−ナトリウム水浴液を用いることによって
、リン酸アルミニウムゲルにＨＢ　ｓ　Ａｇを吸着させ
ることもできる。なお、用いられるＨＢ　ｓ　Ａｇ含有
液には通常生理食塩液のような中性塩水石液が用いられ
る。このような中性塩としては塩化ナトリウムのほか、
塩化カリウム、塩化マグネシウムが含まれるが、好まし
くは塩化ナトリウムで−これに適宜上記化の中性塩が添
加される。これらの中性塩は０．１〜３　ｗ／ｖ％程度
、通常０．５〜２−／％程度で含まれる。

上記ＨＢ　ｓ　Ａｇを吸着したアルミニウムゲル懸濁液
に安定化剤および所望により防腐剤を添加して凍結乾燥
する。

用いられる安定化剤としては、アミノ酸類および糖類の
一方または好ましくは双方が含まれ−さらに好ましくは
これに膠質剤を併用する。アミノ酸類としては、グリシ
ン、アラニン−グルタミン酸１ナトリウム、アルギニン
−リジンなどまたはそれらの塩が挙げられ、それらの１
種もしくは２種以上を用い、その添加量は通常０．１〜
２．Ｑ″７ｖ％７ｖ％程度糖類としては、グルコース、
キシロース、ガラクトース、フラクトースなどの単糖類
、ラクトース、マルトース、サッカロースなどの二軸類
、マンニット、ソルビット、キシリットなどの糖アルコ
ール類が挙げられ、これらの１種もしくは２種以上を用
い、その添加量は通常０１〜ｌ　５　ｗ／ｖ％程度であ
る。また膠原剤としては、ゼラチン−人アルブミン、デ
キストランなどが挙げられ−それらの添加量は通常０〜
Ｑ、ｌ　ｗ／ｖ％程度である。また所望により−チメロ
サールなどの％ 防腐剤を０００５〜ｏ、　ｉ　ｗ／ソ呈度添加する。さ
らに、前記中性塩をこの段階で追加添加して製剤中の中
性塩含量を前記範囲に調整してもよい。

アルミニウムゲル−安定化剤を添加した不活化処理剤精
製ＨＢｓＡｇ含有液は、包装単位に従い２０μｇ〜１０
００μｇのＨＢｓＡｇを含むように小分容器に分注する
。この分注液は急速凍結乾燥または緩速凍結乾燥し、凍
結乾燥製剤とする。凍結乾燥の条件としては、例えば−
５０℃、常圧にて予備凍結を６時間行ない、次に圧力を
Ｑ、Ｑ４Ｔｏｒｒに下げ−＋５℃設定温度にて１５分間
１次乾燥を行う、この時点での品温は一３８℃程度であ
る。次に＋３０℃設定温度にて一圧力０．００５Ｔｏ　
ｒ　ｒで８時間２次乾燥を行う。

この凍結乾燥製剤は、その組成として少くともＨＢｓＡ
ｇ−中性塩、アルミニウムゲル、安定化剤を含有する。

かくして提供された製剤は、力価の低下がなく、その保
存安定性がよ（−使用時の浴解性が速やかできわめてす
ぐれたＢ型肝炎ワクチンの凍結乾燥製剤である。

本発明により得られる製剤、の使用に際しては、注射用
蒸留水または注射用生理食塩水を加えてＨＢ　ｓ　Ａｇ
蛋白濃度５　Ｐｇ／ｍ１〜４０　μｇ／ｍｌ　、および
塩濃度を生理的にほぼ等張な浴液として皮下接種する。

投与量は、通常、成人に対しては１回量としてＨＢ　ｓ
　Ａｇ蛋白５　Ｐｇ〜４０Ｐｇである。

本発明製剤について、生物学的製剤基準（厚生省監修、
昭和５４年７月）の一般試験法に準じモルモットを用い
て異常毒性否定試験を実施し、何ら異常を認めなかった
。

本発明製剤について一臨床試験を第■相まで実施し、本
発明製剤が安全であり、有効であることを確認した。

つぎに実施例および比較例と挙げて本発明をさらに具体
的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。

実施例１ ショ糖および塩化セシウムを用いた密度勾配遠心分離法
で得た精製ＨＢ　ｓ　Ａｇを不活化処理して得られた不
活化処理精製ＨＢ　ｓ　Ａｇの生理食塩液溶液（ＨＢｓ
Ａｇ蛋白濃度１２８Ｐｇ／ｍＡ’）に、ＨＢｓＡｇ蛋白
に対し８重量倍の水酸化アルミニウムに相当する塩化ア
ルミニウムの水溶液を加えて混合する。この液にｌＮ−
ＮａＯＨを加えてｐＨ６，７に調整し、水酸化アルミニ
ウムゲルの生成と同時にＨＢ　ｓ　Ａｇを吸着させる。

このＨＢ　ｓ　Ａｇ吸着アルミニウムゲル懸濁液を分割
し、各々遠心沈降機により上清を分離した後、ＨＢ　ｓ
　Ａｇ吸着アルミニウムゲルに安定化剤、防腐剤の組成
を変えた水ｍ液を加えて第１表に示す様な組成のワクチ
ン液を調製する。

これらＭ波谷１−を各々２−バイアルに入れ、＝５０℃
、常圧にて６時間予備凍結後、圧力を０１Ｑ４Ｔｏｒｒ
に下げ一５℃にて１５分間１次乾燥し一ついで３０℃に
て圧力Ｑ、　Ｑ　５　Ｔｏｒｒで８時間２次乾燥して凍
結乾燥品を得る。

上記の凍結乾燥品に各々２ｍｌの蒸留水を加え５分間振
とうし、その後で遠心沈降分離により上清を分離し一上
清へのＨＢ　ｓ　Ａｇの遊離量をＲＰＨＡ法にて測定し
た。その結果を第２表に示す。このＲＰＨＡキ’／）は
Ｉｌ（ＢｓＡｇ　ｌ　ｉｂｆ　／　−（７）標準液（７
）Ｔｉｔｅｒが１　：　１２８であり、乾燥品番サンプ
ルには１：８．０ＯＯＴｉ　ｔ　ｅ　ｒ以上のＨＢ　ｓ
　Ａｇが含有されているが、上記結果は溶解時における
ＨＢ　ｓ　Ａｇの遊離がほとんどないことを示すもので
ある。

第２表 前記実施例１で調整した試料庭１〜５のサンプルを１−
づつ、各５−バイアルに入れ同様に凍結乾燥を行った。

乾燥品に各々２ｍ１Ｃｖ生理食塩水を加え、さらにクエ
ン酸ナトリウムを加えてアルミニウムゲルを完全に溶解
した。この溶解液中のＨＢ　ｓ　Ａｇの力価をラジオイ
ムノアッセイ法により測定し一同様の方法で測定した凍
結乾燥前のＨＢ　ｓ　Ａｇの力価と比較した。結果を第
３表に示す。

第３表 ※凍結乾燥前の抗原力価に対する凍結乾燥後の相対値 比較例１ 不活化処理済精製ＨＢｓＡｇを通常の不活化ワクチン製
剤と同様にして、　ＨＢｓＡｇ蛋白濃度８０μｇ肩水酸
化アルミニウムゲル３５（Ｉｇ／ｒｎｌ−塩化ナトリウ
ム８５■／−、チメロサール５０μｇ／Ｗ−ホルマリン
０００５■／ｖ％の溶液となし〜３７℃および４°Ｃて
保存し、製造時と保存経過週ごとの抗原力価をラジオイ
ムノアッセイ法（ＡＵＳＲＩＡ−ｌｉ、ダイナボッ）Ｒ
Ｉ研究所製を使用〕で測定して比較した。なお各サンプ
ルは測定前処理としてクエン酸ナトリウムバッファーを
加えて、水酸化アルミゲルを溶解し、ＨＢｓＡｇを遊離
させて測定に供した。

その結果、第４表に示すとおり、４℃においては２３週
経過後において抗原価の低下は見られないか、３７℃に
おいては急激な減少をみた。

第４表 ※製造時の抗原価に対する相対力価 実施例２ 塩化アルミニウムの水溶液にｌ　Ｎ　−ＮａＯＨを加え
てＰＨ６，７に調整し、水酸化アルミニウムゲルを生成
させる。この水酸化アルミニウムゲル懸濁液を分割し、
各々遠心沈降分離機により上清を分離、除去した後、水
酸化アルミニウムゲルに実施例１で用いたのと同一のＨ
ＢｓＡｇの生理食塩液溶液を所定量添加して−ＨＢｓＡ
ｇ吸着水酸化アルミニウムゲル懸濁液を調製する。

また別に、塩化アルミニウムの水溶液にＩＭ−リン酸三
ナトリウムを加えてｐＨ６，８に調製し一リン酸アルミ
ニウムゲルを生成させる。以下水酸化アルミニウムゲル
の場合と同様にしてＨＢｓＡｇ吸着リン酸アルミニウム
ゲル懸濁液を調製する。

これらのＨＢ　ｓ　Ａｇ吸着アルミニウムゲル懸濁液に
、安定化剤−防腐剤の水浴液を加えて第５表に示す様な
組成のワクチン液を調製する。これらの浴波谷１ｍｌを
各々２−バイアルに入れて実施例１と同様にして凍結乾
燥して所望の凍結乾燥品を得る。

上記凍結乾燥品に各々２ｒｎＡの蒸留水を加え５分間振
とうし、その後で遠心沈降機により上清を分離し一上清
へのＩ（Ｂ　ｓ　Ａｇの遊離量をＲＰＩ（Ａ法にて測定
した。その結果を第６表に示す。

第６表 上記実施例２て調製した試料に１〜５のサンプルを１−
ずつ、各５ｍＡ！バイアルに入れ凍結乾燥した。乾燥品
に各々２ｄの注射用生理食塩水を加え、さらにクエン酸
ナトリウムを加えてアルミニウムゲルを完全に俗解した
。この溶解液中のＨＢｓＡｇの力価をラジオイムノアッ
セイ法により測定し、凍結乾燥前のＨＢｓＡｇの力価と
比較した。結果を第７表に示す。

第７表 実施例３ イオン交換クロマトグラフィーによって１−］ＢｓＡｇ
陽性人血漿から精製したＨＢｓＡｇを不活化処理し−Ｈ
ＢｓＡｇ蛋白濃度１００μｇ／ｍｌであるｌ−ｌＢｓＡ
ｇの生理食塩液溶液をワクチン原液とする。このワクチ
ン原液１・６００　ｍｌに、塩化アルミニウム８００ｍ
ｇを含有する水浴液８０−を加え混合する。この液にｌ
Ｎ−ＮａＯＨを加えｐＨを６．７に調整する。

この懸濁液を遠心沈降機にかけ、沈澱と上清とに分離し
た上清を除去する。残った沈・澱にラクトース１０Ｗ／
■％、ｌ−グルタミン酸１ナトリウム０、４　Ｗ／ｖ％
、アルギニン０．４　Ｗ／ｖ％、ゼラチン０゜０８　Ｗ
／ｖ％、チメロサール０．　ＯＯ５Ｗ／ｖ％の濃度で含
有する生理食塩液浴液５００−を加えて混合する。

このワクチン液を２−バイアルに０．２５ｍ１ずつ分注
し実施例１と同様にして凍結乾燥を行う。

この２１ｒ乾燥品をクエン酸ナトリウムバッファーでア
ルミニウムゲルを溶解後−ラジオイムノアッセイ法（Ａ
ＵＳＲＩＡ−４）を用いて抗原含量を測定した。原液を
対照品として相対力価として算出した結果を第８表に示
す。

第８表 上記実施例３で得た凍結乾燥ワクチンをモルモットを用
いて原液との免疫原性を比較した。

ＨＢｓＡｇ量０．５μ２．１μｇ＝２μｇの接種量で各
５匹ずつのモルモットに背部皮下に注射した。５週間後
採血し、その血漿についてＰ　ＨＡ法で抗体価を測定し
た。同様の方法で原液接種の場合の抗体価を対照として
測定した。その結果を第９表に示す。

原液接種の場合の抗体価に対する凍結乾燥ワクチン接種
の場合の相対力価の平均は４．１１４でありアルミニウ
ムゲル添加によるアジュバント効果が認められた。

第９表 前記実施例３において調製した凍結乾燥ワクチンを用い
て保存安定性試験を実施した。

設定温度において所定期間保存したサンプルに一クエン
酸ナトリウムバッファーを加えてアルミニウムゲルを溶
解後−抗原量をラジオイムノアッセィ法により測定した
。

製造時のＨＢ　ｓ　Ａｇに対する相対力価として、測定
結果を第１０表に示す。

保存開始１年後において一３７℃保存においても安定で
あり、液状ワクチンとの差は著明である。

また３７℃保存各サンプルについてモルモットを用いた
異常毒性否定試験を実施したが、何ら異常所見を認めな
かった。

第１０表 手続補正書（自発〕 昭和５９年１０月１　日 昭和５８年特許願第１２２９４５　号 ２、発明の名称 Ｂ型肝炎ワクチン ３補正をする者 事件との関係　特許出願人 注所　熊本県熊本市清水町大窪６６８番地名称　財団法
人化学及血清療法研究所 ７補正の内存 （１）明ｉｉ第６頁１６行、「ｗ／ｖＪとあるをｒＷ／
　ｖ％」と補正する。

（２）同書第８頁１２行、「膠原剤Ｉとあるを「膠質ｉ
１」」と補正する。

（３ン同団第１０頁７行、「第■層」とあるを「第１Ｉ
ＭＪと補正する。

（４）同書第１１頁１０行、ｒｏ、０５Ｊとあるを「０
．００５Ｊと補正する。

（５）同書第１３頁４〜９行、「このＲＰ　ＨＡキット
は・・・（中略用・・示すものである。」とあるを下記
のとおり補正する。

「測定に使用したＲ　Ｐ　ＨＡキットの感度はＨＢｓＡ
ｇｌμＳ’／ｍＡ！の標準液に対し１：１２８である、
乾燥品番サンプルには１６μ７のＨＢｓＡｇ　、すなわ
ち、１　：　１０００Ｔｉｔｅｒ以上のＨＢｓＡｇが含
有されているのに、分離された遠心上清にはＨＢ　ｓ　
Ａ　ｇが同キットでそれぞれ１：２以下しか検出されな
かった。」 （６）同書第１３頁下から３行、「調整」とあるを「調
製」と補正する。

（７）向書第１４頁２〜４１１、［この溶解液中の・・
・（中略）・・・測定し、」ｌとあるを下記のとおり補
正する。

「この溶解液中の１−（Ｂ　ｓ　Ａ　ｇの力価（ＨＢｓ
抗体との結合価ンを、’　５ａｉｔｏ　ｅｔ、　ａｌ、
、　Ａｐｐｌ　１ｃａｔｉｏｎｏｆ　Ｐａｒａｌｌｅｌ
　Ｌｉｎｅ　Ｂｉｏａｑｓａｙ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｔ。

Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏ
ｎ　ｏｆ　１４ＢｓＡｇ　ｉｎ且ａｄｉｏｉｒｎｎｕｉ
ｎｏａｓｓａｙ、　Ｊａｐａｎ　Ｊ、Ｍｅｄ、Ｓｃｉ、
　Ｂｉｏｌ、。

３２：　４７−５２．　１９７９“に記載されているラ
ジオイムノアッセイ方法で対照としてＡｕ５ｔｒｉａ　
［ｆ用いて測定し、」 以」ニ

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）不活化処理済精製Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原に、
   アルミニウムゲルおよび安定化剤を添加し、凍結乾燥し
   て得られるＢ型肝炎ワクチンの凍結乾燥製剤。
2. （２）　アルミニウムゲルが水酸化アルミニウムゲルま
   たはリン酸アルミニウムゲルである特許請求範囲第（１
   ）項記載の製剤。
3. （３）安定化剤として、アミノ酸またはその塩および糖
   類を特徴する特許請求範囲第（１）項記載の製剤。
4. （４）安定化剤として、アミノ酸またはその塩、糖類お
   よび膠質剤を添加する特許請求範囲第（１）項記載の製
   剤。
5. （５）　アミノ酸またはその塩がグリシン、アラニン、
   グルタミン酸１ナトリウム、アルギニンおよびリジンか
   ら選ばれる少くとも１種である特許請求範囲第（２）項
   または（３）項記載の製剤。
6. （６）　糖類が、グルコース、キシロース、ガラクトー
   ス、フラクトース、ラクトース、マルトース、サッカロ
   ース、マンニットーンルビットおよびキシリットから選
   ばれる少なくとも１種である特許請求範囲第（２）項ま
   たは（３）項記載の製剤。
7. （７）膠質剤が、ゼラチン、人アルブミンまたはデキス
   トランである特許請求範囲第（４）項記載の製剤。