MX2009002560A

MX2009002560A - Vacuna.

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Publication number: MX2009002560A
Application number: MX2009002560A
Authority: MX
Inventors: Herve De Hemptinne; Michel Duchene; Anne Mary; Marc Sonveaux
Original assignee: Glaxosmithkline Biolog Sa
Priority date: 2006-09-07
Filing date: 2007-09-07
Publication date: 2009-03-20
Also published as: PT2097102E; CN103585624A; JP2010502678A; BRPI0716518B8; CO6160334A2; US8945582B2; CY1113419T1; SI2097102T1; CO6160335A2; JP2016020361A; WO2008028957A2; JP2015028041A; IL197272A0; US20100040647A1; JP5814507B2; EA016417B1; EP2097102B1; JP2010502679A; PL2066344T3; MX2009002561A

Abstract

La dosis estándar de las vacunas de polio contiene 40 unidades de antígeno-D del poliovirus inactivado tipo 1 (Mahoney), 8 unidades de antígeno-O del poliovirus inactivado tipo 2 (MEF-1), y 32 unidades de antígeno-O del poliovirus inactivado tipo 3 (Saukett). La presente invención enseña que las dosis reducidas del poliovirus inactivado pueden mantener un nivel adecuado o mejorado de protección contra la polio.

Description

VACUNA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al campo de las vacunas para proteger contra polio, y en particular a vacunas de combinación para proteger contra las enfermedades de polio, difteria, tétanos, y tosferina. ANTECEDENTES Las vacunas de combinación (que proporcionen protección contra múltiples patógenos) son muy deseables para minimizar el número de inmunizaciones requeridas para conferir protección contra múltiples patógenos, para reducir los costos de administración, y para aumentar los índices de aceptación y cobertura. El fenómeno bien documentado de la competencia (o interferencia) antigénica complica el desarrollo de vacunas de múltiples componentes. La interferencia antigénica se refiere a la observación de que la administración de múltiples antígenos con frecuencia da como resultado una respuesta disminuida a ciertos antígenos en relación con la respuesta inmune observada cuando estos antígenos se administran individualmente. Se conocen vacunas de combinación que pueden prevenir Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, y opcionalmente el poliovirus inactivado (IPV), y/o el virus de Hepatitis B, y/o la infección por Haemophilus tipo B (véanse, por ejemplo, las Publicaciones Internacionales Números WO Después de muchos años de investigación, la dosis estándar de las vacunas de polio aceptada como efectiva dentro de la comunidad de las vacunas en la actualidad, contiene 40 unidades de antígeno D del poliovirus inactivado tipo 1 (Mahoney), 8 unidades de antígeno D de poliovirus inactivado tipo 2 (MEF-1), y 32 unidades de antígeno D de poliovirus inactivado tipo 3 (Saukett) (por ejemplo, lnfanrix-IPVMR). De una manera sorprendente, los presentes inventores han encontrado que las dosis reducidas de poliovirus Inactivado pueden mantener un nivel adecuado o mejorado de protección contra la polio. Estas vacunas llevan ventajas considerables, incluyendo la capacidad para proporcionar más dosis de vacunas de poliovirus inactivado para los individuos que lo necesiten. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN De conformidad con lo anterior, la presente invención proporciona diferentes vacunas de poliovirus inactivado de dosis reducida (que pueden tener solamente componentes de poliovirus inactivado, o pueden tener componentes de poliovirus inactivado combinados con otros antigenos). De conformidad con lo anterior, en un aspecto, la presente invención proporciona una vacuna de poliovirus inactivado de la invención, la cual comprende el poliovirus inactivado tipo 1 en una dosis mayor de 10 unidades de antígeno D, y menos de 20 unidades de antígeno D, por ejemplo, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, ó 19 unidades de antígeno D. En una modalidad, la presente invención proporciona una vacuna de poliovirus inactivado de la invención, la cual comprende el poliovirus inactivado tipo 3 en una dosis de 8 a 20 unidades de antígeno D, por ejemplo 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ó 20 unidades de antígeno D. En otra modalidad, la presente invención proporciona una vacuna de poliovirus inactivado de la invención, la cual comprende el poliovirus inactivado tipo 2 en una dosis de 2 a 4 unidades de antígeno D, por ejemplo 2, 3, ó 4 unidades de antígeno D. En una modalidad adicional, la presente invención proporciona una vacuna de poliovirus inactivado de la invención, la cual comprende además una vacuna de toxoide de difteria y/o toxoide de tétanos y/o de tosferina en la forma de una vacuna Pw de células enteras muertas, o antígenos de tosferina acelulares. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una vacuna de poliovirus inactivado de la invención, la cual es una vacuna de combinación de DTP-IPV libre de tiomersal que comprende el poliovirus inactivado tipo 1 en una dosis de entre 10 y 36 unidades de antígeno D. En otra modalidad, la presente invención proporciona una vacuna de combinación de DTP-IPV libre de tiomersal de la invención, la cual comprende el poliovirus inactivado tipo 2 en una dosis de 2 a 7 unidades de antígeno D, por ejemplo 5, 6, ó 7 unidades de antígeno D.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una vacuna de combinación de DTP-IPV libre de tiomersal de la invención, la cual comprende el poliovirus inactivado tipo 3 en una dosis de 8 a 29 unidades de antígeno D, por ejemplo 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, ó 29 unidades de antígeno D. En una modalidad adicional, las vacunas de la presente invención también pueden comprender uno o más antígenos seleccionados a partir del grupo que consiste en: antígeno superficial de Hepatitis B, antígenos de Haemophilus influenzae B, antígenos de Neisseria meningitidis A, antígenos de Neisseria meningitidis C, antígenos de Neisseria meningitidis W, antígenos de Neisseria meningitidis Y, flictena o antígenos de Neisseria meningitidis B, antígenos de hepatitis A, y antígenos de Salmonella typhi, en particular antígenos de sacáridos capsulares de estas bacterias. También se proporcionan métodos para la elaboración de las vacunas de la invención. DEFINICIONES El término "vacuna" es opcionalmente sustituible con el término "composición inmunogénica", y viceversa. "Unidades de antígeno D" (también referidas como "Unidades Internacionales" o Ul): La forma antigénica D del poliovirus induce anticuerpos neutralizantes protectores. Las unidades de antígeno D referidas en la presente (por ejemplo, en las vacunas de la invención) son las unidades totales medidas de antígeno D de cada tipo de antígeno de poliovirus inactivado a granel no adsorbido antes de la formulación de la vacuna final, que se agregan en cada dosis humana de la vacuna formulada (típicamente un volumen final de 0.5 mililitros). Los métodos confiables para medir las unidades de antígeno D son bien conocidos en este campo, y son publicados, por ejemplo, por la Farmacopea Europea. Por ejemplo, las unidades de antígeno D se pueden medir utilizando la prueba ELISA, como se describe en el Ejemplo 1 ("cuantificación de antígeno D mediante ELISA") que se encuentra más adelante. La Farmacopea Europea proporciona una muestra de prueba (Preparación de referencia biológica de la Farmacopea Europea - disponible en Ph. Eur. Secretariat, por ejemplo Código P 2160000), para la estandarización de estos métodos entre los fabricantes (Pharmeuropa Special Issue, Bio 96-2). Por consiguiente, en este campo se entiende bien el valor de la unidad de antígeno D. El término "dosis" en la presente, es típicamente una administración de la vacuna de la invención, la cual es típicamente una inyección. Una dosis humana típica es de 0.5 mililitros. Desde luego, se pueden administrar diferentes dosis en un programa de administración de vacuna. El término "IPV", o una vacuna que comprenda estos componentes en la misma, pretende significar el poliovirus inactivado tipo 1 (por ejemplo, Mahoney, como se utiliza de preferencia, o Brunhilde como es comerciado por Statens Serum Institut bajo el nombre de DiTeKiPol), tipo 2 (por ejemplo, MEF-1), o tipo 3 (por ejemplo, Saukett), o una combinación de cualesquiera dos o los tres de estos tipos. Un ejemplo de una vacuna de poliovirus inactivado de dosis completa (o estándar) (40-8-32 unidades de antígeno D de poliovirus inactivado tipos 1, 2, y 3, respectivamente), para los propósitos de esta invención, podría ser la Poliorix® (GSK Biologicals S. A.). Por consiguiente, cuando se menciona en la presente que el X% de una dosis estándar de poliovirus inactivado está presente en una vacuna de la invención, esto significa que las unidades de antígeno D que igualan a X% de 40, 8, y/o 32 unidades de antígeno D de poliovirus inactivado tipos 1, 2, y/o 3, respectivamente (medidas en cada tipo de antígeno de poliovirus inactivado a granel), se formulan dentro de cada dosis de esta vacuna. Los términos "lipopolisacárido" (LPS) y "lipo-oligosacárido" (LOS) son intercambiables. El término "sacárido", a través de toda esta memoria descriptiva, puede indicar polisacárido u oligosacárido, e incluye ambos. El antígeno de sacárido capsular puede ser un polisacárido de longitud completa, o se puede extender hasta sacáridos y oligosacáridos de tamaño bacteriano (que tienen naturalmente un bajo número de unidades de repetición, o que son polisacáridos de un tamaño reducido para mejor manejo, pero que todavía son capaces de inducir una respuesta inmune protectora en un huésped), los cuales son bien conocidos en la técnica de las vacunas (véase, por ejemplo, la Patente Europea Número EP 497525). El término "ácido nucleico" en la presente, puede comprender ácido desoxirribonucleico (ADN) de una sola cadena o de doble cadena, o ácido ribonucleico (ARN) de una sola cadena o de doble cadena, o una mezcla de los mismos. El término "componente(s)" de un patógeno, o "componente(s) que proporciona protección contra este patógeno" dentro de las vacunas de la invención en la presente, pretende significar uno o más antígenos a partir de ese patógeno. Los términos "alrededor de" o "aproximadamente" en la presente, se toman para significar + 10 por ciento del valor mencionado, pero se debe mantener dentro del contexto de uso. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Evolución de la potencia relativa (RP) de DTPwSF-HB-IPV "Método de Producción 3" con la dosis del poliovirus inactivado (IPV). Se examinó la potencia del poliovirus inactivado de dosis reducida de las formulaciones del "método de producción 3" in vivo en comparación con la formulación de referencia (formulación Poliorix y DTPalPVHB). La potencia relativa del poliovirus inactivado se midió en dosis del 100 por ciento, 50 por ciento, 25 por ciento, y 12.5 por ciento de la dosis estándar de poliovirus inactivado (40/8/32 unidades de antígeno D para los tipos 1/2/3). Figura 2. Evolución de la potencia relativa (RP) de la hoja de cálculo de la formulación de DTPwSF-HB-HPV. Se examinó la potencia del poliovirus inactivado de dosis reducida para ambas formulaciones del "método de producción 3" y del "método de producción 4" in vivo en comparación con las formulaciones de referencia (formulación Poliorix y DTPalPVHB). La potencia relativa se midió tanto para el "método de producción 3" como para el "método de producción 4" a un 25 por ciento de la dosis estándar del poliovirus inactivado (40/8/32 unidades de antígeno D para los tipos 1/2/3) en comparación con un placebo con el 25 por ciento de poliovirus inactivado solamente. Figura 3. Potencia relativa de poliovirus inactivado tipos 1, 2, y 3 en el tiempo 0 y a los 8 meses. Se midió la potencia relativa del poliovirus inactivado [en relación con DTPaHBIPV (Padiarix) (Figura 3a) o Poliorix (Figura 3b)], para determinar si el componente Hib tiene un efecto sobre la potencia del poliovirus inactivado, y para evaluar la estabilidad del poliovirus inactivado a través del tiempo con diferentes dosis de poliovirus inactivado. DESCRIPCIÓN DETALLADA La presente invención proporciona una vacuna (por ejemplo, una vacuna de combinación), la cual comprende antígenos de poliovirus (IPV), y opcionalmente Corynebacterium diphtheriae (D), Clostridium tetani (T), Bordetella pertussis (P) o Hepatitis B. Los Antígenos de la Invención Componentes de la vacuna del poliovirus inactivado Las vacunas de la invención pueden estar comprendidas del poliovirus inactivado tipo 1 o del poliovirus inactivado tipo 2 o del poliovirus inactivado tipo 3, o de los poliovirus inactivados tipos 1 y 2, o de los poliovirus inactivados tipos 1 y 3, o de los poliovirus inactivados tipos 2 y 3, o de los poliovirus inactivados tipos 1, 2, y 3.

Los métodos para la preparación de poliovirus inactivado (IPV) son bien conocidos en este campo. En una modalidad, el poliovirus inactivado debe comprender los tipos 1, 2, y 3, como es común en la técnica de las vacunas, y puede ser la vacuna de polio de Salk, la cual es inactivada con formaldehído (véase, por ejemplo, Sutter y colaboradores, 2000, Pediatr. Clin. North Am. 47:287; Zimmerman & Spann 1999, Am. Fam. Physician 59:113; Salk y colaboradores, 1954, Official Monthly Publication of the American Public Health Association (Publicación Oficial Mensual de la Asociación Americana de Salud Pública) 44(5):563; Hennesen, 1981, Develop. Biol. Standard 47:139; Budowsky, 1991, Adv. Virus Res.39:255). En una modalidad, el poliovirus inactivado no es adsorbido (por ejemplo, antes de mezclarse con otros componentes, si están presentes). En otra modalidad, los componentes de poliovirus inactivado de la invención pueden ser adsorbidos sobre una sal de aluminio, tal como hidróxido de aluminio (por ejemplo, antes o después de mezclarse con otros componentes, si están presentes). En otra modalidad, los componentes de poliovirus inactivado de la invención pueden ser absorbidos sobre una sal de aluminio, tal como fosfato de aluminio. En una modalidad adicional, los componentes de poliovirus inactivado pueden ser absorbidos sobre una mezcla de tanto hidróxido de aluminio como fosfato de aluminio. Si son adsorbidos, uno o más componentes de poliovirus inactivado pueden ser adsorbidos por separado o juntos como una mezcla. El poliovirus inactivado se puede estabilizar mediante un proceso de secado particular, como se describe en la Publicación Internacional Número WO2004/039417. El poliovirus se puede hacer crecer en un cultivo celular. El cultivo celular puede ser una línea celular VERO, o PM C, que es una línea celular continua derivada a partir de riñon de mono. Las células VERO pueden ser convenientemente microportadores cultivados. El cultivo de las células VERO antes y durante la infección viral puede involucrar el uso de material derivado de bovino, tal como suero de becerro, y este material se debe obtener de fuentes que estén libres de encefalitis espongiforme bovina (BSE). El cultivo también puede involucrar materiales tales como hidrolizado de lactalbúmina. Después del crecimiento, los viriones se pueden purificar empleando técnicas tales como ultrafiltración, diafiltración, y cromatografía. Antes de su administración a los pacientes, los virus se deben inactivar, y esto se puede lograr mediante su tratamiento con formaldehído. Los virus se pueden cultivar, purificar, e inactivar individualmente, y luego se pueden combinar para dar una mezcla concentrada a granel para el uso en la vacuna de poliovirus inactivado, o para agregarse a los componentes adsorbidos de antígeno de difteria y tétanos, y de tosferina, para las vacunas que comprenden DTPw-IPV o DTPa-IPV. Los antígenos en las vacunas de la invención estarán presentes en "cantidades ¡nmunológicamente efectivas", es decir, la administración de la cantidad a un individuo, ya sea en una sola dosis o como parte de una serie, que sea efectiva para el tratamiento o la prevención de la enfermedad. El tratamiento de dosificación puede ser un programa de una sola dosis o un programa de múltiples dosis (por ejemplo, incluyendo dosis de refuerzo). Las dosis convencionales de las vacunas de polio en la actualidad tienden a contener 40 unidades de antígeno de poliovirus inactivado tipo 1, 8 unidades de antígeno D de poliovirus inactivado tipo 2, y 32 unidades de antígeno D de poliovirus inactivado tipo 3 (por ejemplo, lnfanrix-IPVMR). Sin embargo, los presentes inventores han encontrado de una manera sorprendente que se pueden utilizar dosis reducidas de poliovirus inactivado para obtener una buena respuesta inmune. En una modalidad, una dosis de vacuna de poliovirus inactivado de la presente invención puede comprender entre 10 y 36 unidades de antígeno D de poliovirus inactivado tipo 1 (por ejemplo, de 11 a 32, de 12 a 28, de 13 a 24, de 14 a 20, o de 15 a 19 unidades de antígeno D). En otra modalidad, una dosis de vacuna de poliovirus inactivado de la presente invención puede comprender poliovirus inactivado tipo 1 en una dosis de 10 a 20 unidades de antígeno D, o una dosis mayor de 10 unidades de antígeno D y menor de 20 unidades de antígeno D. En otra modalidad, una dosis de vacuna de la presente invención puede comprender del 26 al 49 por ciento, del 30 al 45 por ciento, del 33 al 40 por ciento, del 35 al 37 por ciento, o aproximadamente o exactamente una tercera parte de una dosis estándar de 40 unidades de antígeno D de poliovirus inactivado tipo 1 (equivalente a aproximadamente 10.4 a 19.6, 12 a 18, 13.2 a 16, 14 a 14.8, ó 13.3 unidades de antígeno D). En otra modalidad, una dosis de vacuna de poliovirus inactivado de la presente invención puede comprender de 11 a 32 unidades de antígeno D, de 12 a 28 unidades de antígeno D, de 13 a 24 unidades de antígeno D, o de 14 a 20 unidades de antígeno D de poliovirus inactivado tipo 1. De una manera alternativa, una dosis de vacuna de poliovirus inactivado de la presente invención puede comprender de 10 a 19.5 unidades de antígeno D, de 12 a 19 unidades de antígeno D, de 14 a 18.5 unidades de antígeno D, o de 15 a 17 unidades de antígeno D; por ejemplo, alrededor de, o exactamente 16 unidades de antígeno D de poliovirus inactivado tipo 1. En una modalidad adicional, las vacunas de la presente invención pueden comprender menos de 4 unidades de antígeno D, de 2 a 4 unidades de antígeno D (equivalentes a del 25 al 50 por ciento de una dosis estándar de 8 unidades de antígeno D), o alrededor o exactamente 3 unidades de antígeno D de poliovirus inactivado tipo 2 (equivalente al 37.5 por ciento de una dosis estándar de 8 unidades de antígeno D). En otra modalidad, la vacuna de la presente invención puede comprender aproximadamente o exactamente una tercera parte de una dosis estándar de 8 unidades de antígeno D de poliovirus inactivado tipo 2 (equivalente a aproximadamente 2.7 unidades de antígeno D). En una modalidad adicional, las vacunas de la presente invención pueden comprender de 2 a 7 unidades de antígeno D de poliovirus inactivado tipo 2. En otra modalidad, una dosis de vacuna de poliovirus inactivado de la presente invención puede comprender de 3 a 6 unidades de antígeno D, o de 4 a 5 unidades de antígeno D de poliovirus inactivado tipo 2. De una manera alternativa, una dosis de vacuna de poliovirus inactivado de la presente invención puede comprender de 2 a 4.5 unidades de antígeno D, de 2.5 a 4 unidades de antígeno D, o de 3 a 3.5 unidades de antígeno D de poliovirus inactivado tipo 2. En una modalidad adicional, las vacunas de la presente invención pueden comprender de 8 a 20 unidades de antígeno D, más de 8 y menos de 20 unidades de antígeno D, de 9 a 19 unidades de antígeno D, de 10 a 18 unidades de antígeno D, de 11 a 17 unidades de antígeno D, de 12 a 16 unidades de antígeno D, o de 13 a 15 unidades de antígeno D; por ejemplo, alrededor o exactamente 14 unidades de antígeno D de poliovirus inactivado tipo 3 (equivalentes a del 25 al 62.5 por ciento, del 28.125 al 9.375 por ciento, del 31.25 al 46.875 por ciento, o al 43.75 por ciento de una dosis estándar de 32 unidades de antígeno D). En otra modalidad, la vacuna de la presente invención puede comprender aproximadamente o exactamente una tercera parte de una dosis estándar de 32 unidades de antígeno D de poliovirus inactivado tipo 3 (equivalente a aproximadamente 10.7 unidades de antígeno D). En una modalidad adicional, una dosis de vacuna de poliovirus inactivado de la presente invención puede comprender de 8 a 29 unidades de antígeno D, de 9 a 26 unidades de antígeno D, de 10 a 23 unidades de antígeno D, de 11 a 20 unidades de antígeno D, de 12 a 17 unidades de antígeno D, o de 13 a 14 unidades de antígeno D de poliovirus inactivado tipo 3. De una manera alternativa, una dosis de vacuna de poliovirus inactivado de la presente invención puede comprender de 8 a 19.5 unidades de antígeno D, de 9 a 19 unidades de antígeno D, de 10 a 18.5 unidades de antígeno D, de 11 a 18 unidades de antígeno D, de 12 a 17.5 unidades de antígeno D, de 13 a 17 unidades de antígeno D, o de 14 a 16 unidades de antígeno D; por ejemplo, alrededor o exactamente 15 unidades de antígeno D. Componentes de vacuna DTP Las vacunas DTP son vacunas bien conocidas que previenen o tratan la difteria, el tétanos, y la enfermedad por B. pertussis. Las vacunas de la invención pueden comprender componentes de difteria, tétanos, y/o tosferina. El antígeno de difteria típicamente es un toxoide de difteria. La preparación de toxoides de difteria (DT) está bien documentada. Se puede utilizar cualquier toxoide de difteria adecuado. Por ejemplo, el toxoide de difteria se puede producir mediante la purificación de la toxina a partir de un cultivo de Corynebacterium diphtheriae, seguida por destoxificación química, pero de una manera alternativa, se hace mediante la purificación de un análogo recombinante o genéticamente destoxificado de la toxina (por ejemplo, CRM197, u otros mutantes, como se describen en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números US 4,709,017, US 5,843,711, US 5,601,827, y US 5,917,017). En una modalidad, el toxoide de difteria está presente en una cantidad de 5 a 50, de 7 a 30 Lf, o de aproximadamente o exactamente 7.5 Lf ó 25 Lf por dosis de 0.5 mililitros. En una modalidad adicional, el toxoide de difteria está presente en una dosis baja de menos de 5 Lf, o de 1 a 4 Lf, o de aproximadamente o exactamente 2 Lf por dosis de 0.5 mililitros. En una modalidad, el toxoide de difteria de la invención puede ser adsorbido sobre una sal de aluminio, tal como hidróxido de aluminio. En otra modalidad, el toxoide de difteria de la invención puede ser adsorbido sobre una sal de aluminio, tal como fosfato de aluminio. En una modalidad adicional, el toxoide de difteria puede ser adsorbido sobre una mezcla de tanto hidróxido de aluminio como fosfato de aluminio. El antígeno de tétanos de la invención es típicamente un toxoide de tétanos. Los métodos para la preparación de los toxoides de tétanos (TT) son bien conocidos en este campo. En una modalidad, el toxoide de tétanos se produce mediante la purificación de la toxina a partir de un cultivo de Clostridium tetani, seguida por destoxificación química, pero de una manera alternativa, se hace mediante la purificación de un análogo recombinante o genéticamente destoxificado de la toxina (por ejemplo, como se describe en la Patente Número EP 209281). Se puede utilizar cualquier toxoide de tétanos adecuado. "Toxoide de tétanos" puede abarcar los fragmentos inmunogénicos de la proteína de longitud completa (por ejemplo, el Fragmento C - véase la Patente Europea Número EP 478602). En una modalidad, el toxoide de tétanos está presente en una cantidad de 2.5 a 30 Lf, de 3 a 20 Lf, de 5 a 15 Lf, o exactamente o aproximadamente de 10 Lf por dosis de 0.5 mililitros. En una modalidad, el toxoide de tétanos de la invención puede ser absorbido sobre una sal de aluminio, tal como hidróxido de aluminio. En otra modalidad, el toxoide de tétanos de la invención puede ser adsorbido sobre una sal de aluminio, tal como fosfato de aluminio. En una modalidad adicional, el toxoide de tétanos puede ser adsorbido sobre una mezcla de tanto hidróxido de aluminio como fosfato de aluminio. El componente de tosferina de la invención puede ser ya sea acelular (Pa) en donde se utilizan antígenos de tosferina purificados, o bien de células enteras (Pw), en donde se utiliza tosferina de células enteras muertas como el componente de tosferina. Las células enteras se pueden inactivar mediante varios métodos conocidos, incluyendo los métodos sin mercurio. Estos métodos pueden incluir inactivación por calor (por ejemplo, de 55°C a 65°C, o de 56°C a 60°C, durante 5 a 60 minutos, o durante 10 a 30 minutos, por ejemplo 60°C durante 30 minutos), formaldehído (por ejemplo, al 0.1 por ciento a 37°C, durante 24 horas), glutaraldehído (por ejemplo, al 0.05 por ciento a temperatura ambiente, durante 10 minutos), acetona-I (por ejemplo, tres tratamientos a temperatura ambiente), o acetona II (por ejemplo, tres tratamientos a temperatura ambiente, y un cuarto tratamiento a 37°C) (véanse, por ejemplo, Gupta y colaboradores, 1987, J. Biol. Stand. 15:87; Gupta y colaboradores, 1986, Vaccine, 4:185). Los métodos para la preparación de Bordetella pertussis de células enteras muertas (Pw) adecuados para esta invención se dan a conocer en la Publicación Internacional Número WO 93/24148, así como los métodos de formulación adecuados para la producción de vacunas de DT-TT-Pw-HepB. En el pasado se ha utilizado el tiomersal en la preparación de Bordetella pertussis de células enteras muertas (véase más adelante). Sin embargo, en una modalidad, no se utiliza en el proceso de formulación de las vacunas de la presente invención. Típicamente se utiliza una dosis de Pw de 5 a 50 IOU, de 7 a 40 IOU, de 9 a 35 IOU, de 11 a 30 IOU, de 13 a 25 IOU, de 15 a 21 IOU, o alrededor o exactamente 20 IOU. Las vacunas de Pa acelulares también son bien conocidas, y pueden comprender dos o más antígenos a partir de: toxoide de tosferina (PT), hemaglutinina filamentosa (FHA), pertactina (PRN), aglutinógenos 2 y 3. En una modalidad, la vacuna de Pa comprende toxoide de tosferina, hemaglutinina filamentosa, y pertactina. Los kits o las vacunas de la invención pueden comprender el toxoide de tosferina destoxif icado mediante un método conocido de tratamiento con formaldehído, o por medio de mutaciones (derivado de toxoide de tosferina. Se ha encontrado que las sustituciones de residuos dentro de las subunidad S1 de la proteína dan como resultado una proteína que retiene sus propiedades inmunológicas y protectoras de toxoide de tosferina, pero con una toxicidad reducida o ninguna toxicidad (Patente Europea Número EP 322533). Las mutaciones destoxificantes discutidas en las rei indicaciones de la Patente Europea Número EP son ejemplos de los mutantes destoxif icados del toxoide de tosferina de la presente invención. Estos mutantes se pueden utilizar en dosis menores de 20 a 25 microgramos. En una modalidad, el toxoide de tosferina se utiliza en una cantidad de 2 a 50 microgramos, de 5 a 40 microgramos, de 10 a 30 microgramos, o exactamente o aproximadamente 25 microgramos por dosis de 0.5 mililitros. En otra modalidad, el toxoide de tosferina se utiliza en una cantidad de exactamente o aproximadamente 2.5 u 8 microgramos por dosis de 0.5 mililitros. En una modalidad, la hemaglutinina filamentosa se utiliza en una cantidad de 2 a 50 microgramos, de 5 a 40 microgramos, de 10 a 30 microgramos, o exactamente o aproximadamente 25 microgramos por dosis de 0.5 mililitros. En otra modalidad, la hemaglutinina filamentosa se utiliza en una cantidad de exactamente o aproximadamente 2.5 u 8 microgramos por dosis de 0.5 mililitros. En una modalidad, la pertactina se utiliza en una cantidad de 0.5 a 20 microgramos, de 0.8 a 15 microgramos, de 2 a 10 microgramos, o de exactamente o aproximadamente 8 microgramos por dosis de 0.5 mililitros. En otra modalidad, la pertactina se utiliza en una cantidad de exactamente o alrededor de 0.8 ó 2.5 microgramos por dosis de 0.5 mililitros. En una modalidad, el componente de tosferina de la invención puede ser adsorbido sobre una sal de aluminio, tal como hidróxido de aluminio. En otra modalidad, el componente de tosferina de la invención puede ser adsorbido sobre una sal de aluminio, tal como fosfato de aluminio. En una modalidad adicional, el componente de tosferina puede ser adsorbido sobre una mezcla de tanto hidróxido de aluminio como fosfato de aluminio. Por ejemplo, en una modalidad, cuando menos la pertactina es adsorbida sobre hidróxido de aluminio, con el toxoide de tosferina/hemaglutinina filamentosa adsorbidos sobre hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, o una mezcla de ambos. Antígenos Adicionales Las formulaciones de vacuna de la invención, que opcionalmente también comprenden DTP (DTPw ó DTPa), pueden comprender adicionalmente uno o más antígenos seleccionados a partir del grupo que consiste en: antígeno superficial de Hepatitis B, antígenos de Haemophillus influenzae b, antígenos de Neisseria meningitidis A, antígenos de Neisseria meningitidis C, antígenos de Neisseria meningitidis W-135, antígenos de Neisseria meningitidis Y, flictena o antígenos purificados de Neisseria meningitidis B, antígenos de hepatitis A, antígenos de Salmonella typhi, y HTS,S. Típicamente, se puede utilizar el sacárido capsular, o los antígenos de lipo-oligosacárido de estos patógenos. Los antígenos típicamente estarán presentes en una concentración de cuando menos 1 microgramo/mililitro cada uno, por ejemplo de 1 a 20 microgramos/mililitro, de 2 a 15 microgramos/mililitro, de 2.5 a 10 microgramos/mililitro, de 3 a 8 microgramos/mililitro, o de 4 a 6 microgramos/mililitro. En general, la concentración de cualquier antígeno será suficiente para provocar una respuesta inmune contra este antígeno. Se prefiere que no se remueva la eficacia protectora de los antígenos individuales mediante su combinación, aunque se puede reducir su inmunogenicidad real (por ejemplo, las titulaciones ELISA). Los antígenos adicionales, en una modalidad de la invención, pueden ser adsorbidos sobre una sal de aluminio, tal como hidróxido de aluminio. En otra modalidad, los antígenos adicionales de la invención pueden ser adsorbidos sobre una sal de aluminio, tal como fosfato de aluminio. En una modalidad adicional, los antígenos adicionales pueden ser adsorbidos sobre una mezcla de tanto hidróxido de aluminio como fosfato de aluminio, o pueden no ser adsorbidos. Cuando se utiliza un antígeno de sacárido capsular o de lipo-oligosacárido, se puede conjugar con una proteína portadora que comprenda epítopos auxiliares-T, con el objeto de mejorar la inmunogenicidad. La invención también puede comprender "proteínas portadoras" libres. Como una alternativa a la utilización de antígenos de proteína en las composiciones de la invención, se pueden utilizar ácidos nucleicos que codifiquen el antígeno. Los componentes de proteína de las composiciones de la invención, por lo tanto, pueden ser reemplazados por ácido nucleico (por ejemplo, ADN, que puede estar en la forma de un plásmido) que codifique la proteína. De una manera similar, las composiciones de la invención pueden comprender proteínas que imiten a los antígenos de sacárido, por ejemplo mimótopos o anticuerpos anti-idiotípicos. Éstos pueden reemplazar a los componentes de sacárido individuales, o pueden complementarlos. Antígeno de Hepatitis B La preparación del antígeno superficial de Hepatitis B (HBsAg) está bien documentada. Véanse, por ejemplo, Hartford y colaboradores, 1983, Hartford y colaboradores, 1983, Develop. Biol. Standard 54:125; Gregg y colaboradores, 1987, Biotechnology 5:479, Patente Europea Número EP0226846; y Patente Europea Número EP0299108. Éste se puede preparar como sigue. Un método involucra la purificación del antígeno en una forma de partículas a partir del plasma de los portadores crónicos de Hepatitis B, debido a que se sintetizan grandes cantidades de HBsAg en el hígado, y se liberan hacia la corriente sanguínea durante una infección por el virus de Hepatitis B. Otro método involucra la expresión de la proteína mediante métodos de ADN recombinante. El HBsAg se puede preparar mediante su expresión en la levadura Saccharomyces cerevisiae, pichia, células de insecto (por ejemplo, H¡5), o células de mamífero. El HBsAg se puede insertar en un plásmido, y se puede controlar su expresión a partir del plásmido mediante un promotor, tal como el promotor "GAPDH" (a partir del gen de deshidrogenase de gliceraldehído-3-fosfato). La levadura se puede cultivar en un medio sintético. Entonces se puede purificar el HBsAg mediante un proceso que involucra pasos tales como precipitación, cromatografía de intercambio de iones, y ultra-filtración. Después de la purificación, el HBsAg se puede someter a diálisis (por ejemplo, con cisteína). El HBsAg se puede utilizar en una forma de partículas. Como se utiliza en la presente, la expresión "antígeno superficial de Hepatitis B" o "HBsAg" incluye cualquier antígeno HBsAg o fragmento del mismo que exhiba la antigenicidad del antígeno superficial del virus de Hepatitis B. Se entenderá que, en adición a la secuencia de 226 aminoácidos del antígeno HBsAg S (véase Tiollais y colaboradores, 1985, Nature 317:489, y las referencias en el mismo), el HBsAg, como se describe en la presente, si se desea, puede contener toda o parte de una secuencia pre-S, como se describe en las referencias anteriores y en la Patente Europea Número EP0278940. En particular, el HBsAg puede comprender un polipéptido que comprenda una secuencia de aminoácidos que comprenda los residuos 133-145 seguidos por los residuos 175-400 de la proteína-L del HBsAg en relación con el marco de lectura abierta sobre un virus de Hepatitis B del serotipo ad (este polipéptido es referido como L*; véase la Patente Europea Número EP0414374). El HBsAg, dentro del alcance de la invención, también puede incluir al polipéptido pre-S1-preS2 -S descrito en la Patente Europea Número EP0198474 (Endotronics), o análogos del mismo, tales como aquéllos descritos en la Patente Europea Número EP0304578 (McCormick y Jones). El HBsAg, como se describe en la presente, también puede referirse a los mulantes, por ejemplo, el "mutante de escape" descrito en la Publicación Internacional Número WO 91/14703 o en la Patente Europea Número EP0511855A1, en especial el HBsAg en donde la sustitución de aminoácido en la posición 145 es hasta arginina a partir de glicina. El HBsAg puede estar en una forma de partículas. Las partículas pueden comprender, por ejemplo, la proteína S sola, o pueden ser partículas compuestas, por ejemplo, L*, S) en donde L* es como se define anteriormente, y S denota la proteína-S del HBsAg. Esta partícula está convenientemente en la forma en la que se vaya a expresar en levadura. En una modalidad, el HBsAg es el antígeno utilizado en EngerixBMR (GlaxoSmithKIine Biologicals S.A.), el cual se describe adicionalmente en la Publicación Internacional Número W093/24148.

En una modalidad, el HBsAg está presente en una cantidad de 5 a 20 microgramos, de 8 a 15 microgramos, o de aproximadamente o exactamente 10 microgramos por dosis de 0.5 mililitros. El antígeno superficial de Hepatitis B puede ser adsorbido sobre fosfato de aluminio, lo cual se puede hacer antes de mezclarse con los otros componentes (descritos en la Publicación Internacional Número W093//24148). El componente de Hepatitis B debe estar sustancialmente libre de tiomersal (el método de preparación de HBsAg sin tiomersal se ha publicado anteriormente en la Patente Europea Número EP EP1307473). Antígenos de Haemophilus influenzae b Las vacunas que comprenden antígenos a partir de Haemophilus influenzae tipo B se han descrito en la Publicación Internacional Número WO97/00697. Las vacunas de la invención pueden utilizar cualquier antígeno de Haemophilus influenzae tipo B adecuado. El antígeno puede ser un sacárido capsular (PRP) a partir de Haemophilus influenzae tipo B conjugado con una proteína portadora (Hib). El sacárido es un polímero de ribosa, ribitol, y fosfato. El antígeno de Hib puede ser adsorbido opcionalmente sobre fosfato de aluminio, como se describe en la Publicación Internacional Número WO97/00697, o puede no ser adsorbido, como se describe en la Publicación Internacional Número WO02/00249, o puede no haberse sometido a un proceso específico de adsorción. Un antígeno "que no es adsorbido sobre una sal adyuvante de aluminio" significa en la presente, por ejemplo, que no está involucrado un paso de adsorción expreso o dedicado para el antígeno sobre una sal adyuvante de aluminio fresca en el proceso de formulación de la composición. Hib se puede conjugar con cualquier portador que pueda proporcionar cuando menos un epítopo auxiliar-T (cuyos ejemplos se describen más adelante), y puede ser toxoide de tétanos, toxoide de difteria, CRM-197 (muíante de toxina de difteria), o Proteína D. Hib se puede liofilizar, y se puede reconstituir extemporáneamente (por ejemplo, con diluyente, comprendiendo de manera opcional otros componentes antigénicos de las vacunas de la invención). En una modalidad, Hib está presente en una cantidad de 5 a 20 microgramos, de 8 a 15 microgramos, o de aproximadamente o exactamente 10 microgramos de sacárido por dosis de 0.5 mililitros.

En una modalidad adicional, Hib está presente en una dosis baja (por ejemplo, de 1 a 6 microgramos, de 2 a 4 microgramos, o de alrededor o exactamente 2.5 microgramos de sacárido), como se describe en la Publicación Internacional Número WO02/00249. Antígenos de Neisseria meningitidis tipos A, C, W, ó Y Las vacunas de la invención pueden comprender además un sacárido capsular de una bacteria seleccionada a partir del grupo que consiste en N. meningitidis tipo A (MenA, opcionalmente conjugada con una proteína portadora), N. meningitidis tipo C (MenC, opcionalmente conjugada con una proteína portadora), N. meningitidis tipo W135 (MenW, opcionalmente conjugada con una proteína portadora), y N. meningitidis tipo Y (MenY, opcionalmente conjugada con una proteína portadora). Las vacunas de la invención pueden comprender uno o más antígenos a partir de las diferentes cepas de N. meningitidis, que se pueden utilizar solos o en cualquier combinación de 2, 3, ó 4 componentes, como se detalla en seguida: MenA, MenC, MenW, MenY, ó MenA + MenC, MenA + MenW, MenA + MenY, MenC + MenW, MenC + MenY, MenW + MenY ó MenA + MenC + MenW, MenA + enC + MenY, MenA + MenW + MenY, MenC + MenW + MenY ó MenA + MenC + MenW + MenY. En una modalidad, los componentes de Neisseria meningitidis de la invención pueden ser adsorbidos sobre una sal de aluminio, tal como hidróxido de aluminio. En otra modalidad, los componentes de Neisseria meningitidis de la invención pueden ser adsorbidos sobre una sal de aluminio, tal como fosfato de aluminio. En una modalidad adicional, los componentes de Neisseria meningitidis pueden ser adsorbidos sobre una mezcla de tanto hidróxido de aluminio como fosfato de aluminio. En una modalidad, los componentes de Neisseria meningitidis pueden no ser adsorbidos sobre un adyuvante, por ejemplo una sal adyuvante de aluminio. Flictena o antígenos de Neisseria meningitidis tipo B Las vacunas de la invención también pueden comprender un componente MenB, tal como una vesícula o flictena de membrana externa, como se describe en las Publicaciones Internacionales Números WO01/09350, WO03/105890, WO04/014417, ó WO04/014418, o un antígeno de sacárido capsular MenB conjugado (o un derivado del mismo) (véase, por ejemplo, la Publicación Internacional Número WO96/40239), o un lipo-oligosacárido meningocócico L2 ó L3, o L2 y L3, libre o conjugado (de acuerdo con la Publicación Internacional Número WO 2004/014417). En una modalidad, los componentes MenB de la invención pueden ser adsorbidos sobre una sal de aluminio, tal como hidróxido de aluminio. En otra modalidad, los componentes MenB de la invención pueden ser adsorbidos sobre una sal de aluminio, tal como fosfato de aluminio. En una modalidad adicional, los componentes MenB pueden ser adsorbidos sobre una mezcla de tanto hidróxido de aluminio como fosfato de aluminio. En una modalidad, los componentes MenB pueden o ser adsorbidos sobre un adyuvante, por ejemplo una sal adyuvante de aluminio. Antígenos de Salmonella typhi Las vacunas de la invención pueden comprender además el sacárido Vi a partir de Salmonella typhi, el cual puede ser el producto registrado Typherix®, descrito en la Patente Europea Número EP1107787, o un conjugado del mismo (por ejemplo, con una proteína portadora, como se describe en la presente). El proceso de conjugación se puede llevar a cabo como se describe en la Publicación Internacional Número WO 2007/000343. En una modalidad, los sacáridos Vi de la invención pueden ser adsorbidos sobre una sal de aluminio, tal como hidróxido de aluminio. En otra modalidad, los sacáridos Vi de la invención pueden ser adsorbidos sobre una sal de aluminio, tal como fosfato de aluminio. En una modalidad adicional, los sacáridos Vi pueden ser adsorbidos sobre una mezcla de tanto hidróxido de aluminio como fosfato de aluminio. En una modalidad, los sacáridos Vi pueden no ser adsorbidos sobre un adyuvante, por ejemplo, una sal adyuvante de aluminio. Antígenos de Hepatitis A El componente que proporciona protección contra hepatitis A puede ser una vacuna de hepatitis A atenuada muerta, por ejemplo el producto conocido como Havrix (marca comercial registrada de GlaxoSmithKIine Biologicals S.A.), que es una vacuna atenuada muerta derivada a partir de la cepa HM-175 del virus de hepatitis A (HAV) (véase "Inactivated Candidate Vaccines for Hepatitis A" por F.

E. Andre y colaboradores, 1980, Prog. Med. Virol. 37:72, y la monografía del producto "Havrix" publicada por Smith Iine Beecham Biologicals 1991). Flehming y colaboradores, (1990, Prog. Med. Virol. 37:56) han revisado los aspectos clínicos, la virología, la inmunología, y la epidemiología de la hepatitis A, y han discutido los planteamientos para los desarrollos de vacunas contra esta infección viral común. Como se utiliza en la presente, la expresión "antígeno del virus de hepatitis A" se refiere a cualquier antígeno capaz de estimular al anticuerpo neutralizante para el virus de hepatitis A en seres humanos. En una modalidad, el antígeno del virus de hepatitis A comprende partículas de virus atenuadas inactivadas, o en otra modalidad, puede ser una capsida del virus de hepatitis A, o una proteína viral del virus de hepatitis A, que convenientemente se puede obtener mediante tecnología de ADN recombinante. En una modalidad, el componente de hepatitis A de la invención puede ser adsorbido sobre una sal de aluminio, tal como hidróxido de aluminio. En otra modalidad, el componente de hepatitis A de la invención puede ser adsorbido sobre una sal de aluminio, tal como fosfato de aluminio. En una modalidad adicional, el componente de hepatitis A puede ser adsorbido sobre una mezcla de tanto hidróxido de aluminio como fosfato de aluminio.

Antígenos de Malaria Las vacunas de la invención pueden comprender además antígenos de malaria. El antígeno de malaria puede ser el RTS.S (proteína híbrida entre CS y HBsAg - descrita en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US 6,306,625 y en la Patente Europea Número EP 0614465). En una modalidad, el RTS,S se puede utilizar en las vacunas de la invención en lugar del HBsAg. También se pueden utilizar otros antígenos de malaria en las vacunas de la invención, incluyendo la proteína CS, RTS, TRAP, proteína de 16kD de B 2992, AMA-1, MSP1, incluyendo opcionalmente CpG (Publicaciones Internacionales Números WO2006/029887, WO98/05355, WO01/00231). En una modalidad, los antígenos de malaria de la invención pueden ser adsorbidos sobre una sal de aluminio, tal como hidróxido de aluminio. En otra modalidad, los antígenos de malaria de la invención pueden ser adsorbidos sobre una sal de aluminio, tal como fosfato de aluminio. En una modalidad adicional, los antígenos de malaria pueden ser adsorbidos sobre una mezcla de tanto hidróxido de aluminio como fosfato de aluminio. En una modalidad, el antígeno de malaria es auxiliado por una emulsión de aceite en agua y/o un derivado de lípido A (tal como MPL) y/o esterol (tal como colesteroi), y/o tocol (tal como a-tocoferol). En otra modalidad, los antígenos de malaria pueden no ser adsorbidos sobre un adyuvante, por ejemplo una sal adyuvante de aluminio.

Conjugados Los conjugados de sacárido capsular bacteriano de la invención pueden comprender cualquier péptido, polipéptido, o proteína portadora que comprenda cuando menos un epítopo auxiliar-T. Las proteínas portadoras utilizadas se pueden seleccionar a partir del grupo que consiste en: toxoide de tétanos, toxoide de difteria, CRM197, toxina de difteria recombinante (como se describe en cualquiera de las Patentes Números US 4,709,017, WO 93/25210, WO 95/33481, ó WO 00/48638), neumolisina (opcionalmente químicamente destoxificada, o un mutante destoxificado) a partir de S. pneumoniae (véase, por ejemplo, la Publicación Internacional Número WO 2004/081515, y las referencias referidas en la misma), OMPC a partir de N. meningitidis (Patente Europea Número EP 0372501), y proteína D (PD) a partir de H. influenzae (Patente Europea Número EP 594610). Otros portadores pueden incluir péptidos sintéticos (Patentes Europeas Números EP 0378881 y EP 0427347), proteínas de choque por calor (Publicaciones Internacionales Números WO 93/17712 y WO 94/03208), proteínas de tosferina (Publicación Internacional Número WO 98/58668 y Patente Europea Número EP 0471177), citoquinas (Publicación Internacional Número WO 91/01146), linfocinas (Publicación Internacional Número WO 91/01146), hormonas (Publicación Internacional Número WO 91/01146), factores de crecimiento (Publicación Internacional Número WO 91/01146), proteínas artificiales que comprenden múltiples epítopos de células-T CD4+ humanos a partir de diferentes antígenos derivados de patógenos (Falugi y colaboradores, 2001, Eur. J. Immunol. 31 :3816), proteína superficial neumococica PspA (Publicación Internacional Número WO 02/091998), proteínas de absorción de hierro (Publicación Internacional Número WO 01/72337), toxina A ó B a partir de C. difficile (Publicación Internacional Número WO 00/61761), PhtD neumocócico (Publicación Internacional Número WO 00/37105), PhtDE neumocócico (por ejemplo, Publicaciones Internacionales Números WO 01/98334 y WO 03/054007), PhtX, etc. Los sacáridos pueden estar todos sobre el mismo portador, en particular todos los sacáridos a partir de un organismo particular, por ejemplo, los sacáridos MenA, MenC, MenW, y MenY, pueden conjugarse todos con TT, DT, ó CRM-197. Sin embargo, debido al efecto conocido de la supresión del portador, puede ser conveniente que en cada una de las composiciones de la invención, los antígenos de sacárido contenidos en las mismas (antígenos '?') se conjuguen con más de un portador. Por consiguiente (n-1) de los sacáridos podrían ser llevados (por separado) sobre un tipo de portador, y uno sobre un portador diferente, o (n-2) sobre uno, y 2 sobre dos portadores diferentes, etc. Por ejemplo, en una vacuna que contenga cuatro conjugados de sacárido bacterianos, 1 , 2, o los cuatro se podrían conjugar con diferentes portadores). Sin embargo, la proteína D se puede utilizar para diferentes (2, 3, 4, o más) sacáridos en una composición sin un efecto de supresión del portador notorio. Hib puede estar presente como un conjugado de TT, DT, ó CR 197, y MenA, MenC, MenY, y MenW pueden ser conjugados de TT, DT, CRM197, o PD. Vi puede estar presente como un conjugado de TT, DT, ó CRM197. La proteína D es un portador útil, debido a que proporciona un antígeno adicional que puede proporcionar protección contra H. influenzae. En una modalidad, todos los sacáridos se conjugan con la misma proteína portadora. Vi se puede conjugar con una proteína portadora, por ejemplo, mediante un método que utiliza la química de condensación de carbodi-imida (por ejemplo, EDAC) (dado que la subunidad de repetición Vi comprende grupos de ácido carboxílico) . Esto se podría lograr ya sea mediante: (i) una sola reacción de carbodi-imida entre COOH de Vi y NH2 de la proteína, o (ii) una doble reacción de carbodi-imida que puede presentarse ya sea entre COOH de Vi y NH2 de una molécula enlazadora homobifuncional, y COOH de la proteína y NH2 de la molécula enlazadora homobifuncional, o entre COOH de Vi y NH2 de la molécula enlazadora heterobif uncional y NH2 de la proteína y COOH de la molécula enlazadora heterobifuncional. La conjugación se puede utilizar en conjunto con las proteínas portadoras libres. En una modalidad, cuando está presente una proteína portadora dada, tanto en forma libre como conjugada, en una composición de la invención, la forma no conjugada no es más del 5 por ciento de la cantidad total de la proteína portadora en la composición como un todo, o en otra modalidad, está presente en menos del 2 por ciento en peso.

J J El sacárido se puede enlazar a la proteína portadora mediante cualquier método conocido (por ejemplo, por Likhite, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,372,945, y por Armor y colaboradores, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,474,757), con cualquier enlazador adecuado cuando sea necesario. El sacárido típicamente se activará o se f uncionalizará antes de la conjugación. La activación puede involucrar, por ejemplo, agentes cianilantes, tales como CDAP (tetrafluoro-borato de 1-ciano-dimetil-amino-piridinio) (Publicaciones Internacionales Números WO 95/08348 & WO 96/29094). La reacción de cianilación se puede llevar a cabo bajo condiciones relativamente suaves, lo cual evita la hidrólisis de los sacáridos sensibles al álcali. Esta síntesis permite tener el acoplamiento directo con una proteína portadora. Otras técnicas adecuadas utilizan carbodi-imidas, hidrazidas, ésteres activos, norborano, ácido p-nitro-benzoico, N-hidroxi-succinimida, S-NHS, EDC, ó TSTU. Los enlaces por medio de un grupo enlazador se pueden hacer utilizando cualquier procedimiento conocido, por ejemplo, los procedimientos descritos en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números US 4,882,317 y US 4,695,624. Un tipo de enlace involucra la aminación reductiva del sacárido, el acoplamiento del grupo amino resultante con un extremo de un grupo enlazador de ácido adípico (Patente Europea Número EP 0477508, Porro y colaboradores, 1985, Mol. Immunol. 22:907, Patente Europea Número EP 0208375), y luego el acoplamiento de una proteína con el otro extremo del grupo enlazador de ácido adípico. Otros enlazadores incluyen B-propionamido (Publicación Internacional Número WO00/10599) , nitrofenil-etilamina (Gever y colaboradores, 1979, Med. Microbiol. Immunol. 165:171), haluros de haloacilo (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US 4,057,685), enlaces glicosídicos (Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números US 4,673,574; US 4,761,283; US 4,808,700), ácido 6-amino-caproico (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US 4,459,286), ADH (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US 4,965,338), las fracciones C4 a C12 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US 4,663,160), etc. Como una alternativa a la utilización de un enlazador, se puede utilizar el enlace directo. Los enlaces directos con la proteína pueden comprender la oxidación del sacárido, seguida por aminación reductiva con la proteína, como se describe, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números US 4,761,283 y US 4,356,170, o una reacción de CDAP directa. Después de la conjugación, los sacáridos libres y conjugados se pueden separar. Existen muchos métodos adecuados para esta separación, incluyendo cromatografía hidrofóbica, ultra-filtración tangencial, diaf iltración, etc. (véase también Lei y colaboradores, 2000, Dev. Biol. (Basilea); 103:259; Publicación Internacional Número WO 00/38711; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US 6,146,902). En una modalidad, si una vacuna comprende un sacárido dado en la forma tanto libre como conjugada, la forma no conjugada no es más del 20 por ciento en peso de la cantidad total de ese sacárido en la composición como un todo (por ejemplo, =15 por ciento, < 10 por ciento, <5 por ciento, <2 por ciento, <1 por ciento). Una cantidad de sacárido que sea capaz de conferir protección a un huésped (una cantidad efectiva) puede ser determinada por la persona experta. En una modalidad, cada dosis comprenderá de 0.1 a 100 microgramos de sacárido; en otra modalidad, cada dosis comprenderá de 0.1 a 50 microgramos; en una modalidad adicional, cada dosis comprenderá de 0.1 a 10 microgramos; en todavía otra modalidad, cada dosis comprenderá de 1 a 5 microgramos. Adyuvantes Las vacunas de la invención pueden incluir un excipiente farmacéuticamente aceptable, tal como una adyuvante adecuado. Los adyuvantes adecuados incluyen una sal de aluminio, tal como hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio, pero también puede ser una sal de calcio, hierro, o zinc, o puede ser una suspensión insoluble de tirosina acilada, o azúcares acilados, o pueden ser sacáridos catiónicamente o aniónicamente derivados, polifosfacenos, microesferas biodegradables, monofosforil-lípido A (MPL), derivados de lípido A (por ejemplo, de una toxicidad reducida), MPL 3-0-desacilado, quil A, Saponina, QS21, tocol (Patente Europea Número EP 0382271), adyuvante incompleto de Freund (Difco Laboratories, Detroit, MI), adyuvante Merck 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ), AS-2 (Smith-Kline Beecham, Filadelfia, PA), oligonucleótidos CpG, bioadhesivos y mucoadhesivos, micropartículas, liposomas, formulaciones de éter de polioxletileno, formulaciones de éster de polioxietileno, péptidos de muramilo, o compuestos de imidazoquinolona (por ejemplo, ¡miquamod y sus homólogos). Los inmunomoduladores humanos adecuados para utilizarse como adyuvantes en la invención incluyen citoquinas, tales como interleucinas (por ejemplo, IL-I, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, etc.), factor estimulante de colonias de macrofagos (M-CSF), factor de necrosis tumoral (TNF), factor estimulante de colonias de macrofagos de granulocitos (GM-CSF), que también se pueden utilizar como adyuvantes. En una modalidad de la invención, la composición adyuvante de las formulaciones induce una respuesta inmune predominantemente del tipo TH1. Los altos niveles de citoquinas tipo TH1 (por ejemplo, IFN-?, TNFa, IL-2, e IL-12) tienden a favorecer la inducción de las respuestas inmunes mediadas por células a un antígeno administrado. Dentro de una modalidad, en donde una respuesta es predominantemente del tipo TH1, el nivel de citoquinas del tipo TH1 aumentará hasta un grado mayor que el nivel de citoquinas del tipo TH2. Los niveles de estas citoquinas pueden ser fácilmente evaluados empleando ensayos convencionales. Para una revisión de las familias de citoquinas, véase Mosmann y Coffman, 1989, Ann. Rev. Immunol.7:145.

De conformidad con lo anterior, los sistemas adyuvantes adecuados que promueven una respuesta predominantemente TH1 incluyen los derivados de lípido A (por ejemplo, de una toxicidad reducida), monofosforil-lípido A (MPL) o un derivado del mismo, en particular el monofosforil-lípido A 3-des-O-acilado (3D-MPL), y una combinación de monofosforil-lípido A, opcionalmente monofosforil-lípido A 3-des-O-acilado junto con una sal de aluminio. Un sistema mejorado involucra la combinación de un monofosforil-lípido A y un derivado de saponina, en particular la combinación de QS21 y 3D-MPL, como se da a conocer en la Publicación Internacional Número WO 94/00153, o una composición menos reactogénica, en donde el QS21 se apaga con colesterol, como se da a conocer en la Publicación Internacional Número WO 96/33739. Una formulación de adyuvante particularmente potente que involucra QS21, 3D-MPL, y tocoferol en una emulsión de aceite en agua, se describe en la Publicación Internacional Número WO 95/17210. La vacuna puede comprender adicionalmente una saponina, la cual puede ser QS21. La formulación también puede comprender una emulsión de aceite en aguay tocoferol (Publicación Internacional Número WO 95/17210). Los oligonucleótidos que contienen CpG no metilados (Publicación Internacional Número WO 96/02555) también son inductores preferenciales de una respuesta de TH1, y son adecuados para utilizarse en la presente invención. Las vacunas de la invención también pueden comprender combinaciones de aspectos de uno o más de los adyuvantes de la invención identificados anteriormente. Cualquier adyuvante de la invención puede ser adsorbido por, o se puede combinar con, el componente de poliovirus inactivado de la invención. Cuando se hace referencia a hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio, la referencia se hace a todos los adyuvantes de hidróxido de aluminio y/o fosfato de aluminio, como son descritos por Hem y White (Pharm. Biotechnol. 1995; 6:249-276). En una modalidad, el fosfato de aluminio también puede ser referido como hidroxi-fosfato de aluminio. En otra modalidad, el fosfato de aluminio tiene una carga negativa a un pH de 7.4. Típicamente, el punto isoeléctrico (pl) del fosfato de aluminio es de 5 a 7, o de 6 a 7, o de alrededor o exactamente 5. En una modalidad adicional, el fosfato de aluminio tiene una proporción molar de fosfato:aluminio de 0.3 a 0.9, o de 0.3 a 0.6, o de 0.8 a 0.9. En una modalidad, el hidróxido de aluminio tiene una carga positiva a un pH de 7.4. Típicamente, el punto isoeléctrico del hidróxido de aluminio es de 8 a 11, de 9 a 11, de 10 a 11, o de alrededor o exactamente 11. Típicamente, el contenido total de aluminio es de 200 a 1,000 microgramos, de 300 a 900 microgramos, de 400 a 800 microgramos, de 500 a 700 microgramos, o de alrededor o exactamente 630 microgramos de Al3+ por dosis de 0.5 mililitros. Éste puede ser todo de hidróxido de aluminio o todo de fosfato de aluminio. De una manea alternativa, el contenido de Al3+ puede ser a partir de una mezcla de hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio en la siguiente proporción: 1:8-8:1, 1:4-4:1, 3:8-8:3, 1:2-2:1 ó 1:1 de fosfato de aluminio'.hidróxido de aluminio. En una modalidad, se utiliza una proporción de 12:1-4:1, 11:1-5:1, 10:1-6:1, 9:1-7:1, u 8:1 de fosfato de aluminio:hidróxido de aluminio. Aunque la mayor parte del aluminio es proporcionada por los antígenos previamente adsorbidos antes de mezclarse para formar una vacuna de combinación, se puede agregar algo de aluminio en forma libre durante la formulación de la vacuna de combinación de la invención, por ejemplo antes del paso de ajuste del pH descrito en la presente. Típicamente, el contenido de aluminio libre por dosis de 0.5 mililitros puede ser de 0 a 300 microgramos, de 50 a 250 microgramos, de 75 a 200 microgramos, de 100 a 150 microgramos, o de alrededor o exactamente 115 microgramos de Al3+. El Al3+ libre puede ser todo de AI(OH)3 o todo de AIPO,,, o una mezcla de AI(OH)3 y AIPO4, en la siguiente proporción (peso:peso, AI3+:AI3+): 1:1-1:6, 1:1.1-1:5, 1:1.2-1:4, 1:1.3-1:3, 1:1.4-1:2, por ejemplo 23/92 ó 69/46 ó 6:1-1:1, 5:1-1.1:1, 4:1-1.2:1, 3:1-1.3:1, 2:1-1.4:1, por ejemplo 46/69 ó 92/23. De una manera alternativa, ciertos componentes de las vacunas de la invención pueden no ser expresamente adsorbidos sobre un adyuvante, en particular de sales de aluminio. El poliovirus inactivado puede no ser adsorbido o puede ser adsorbido sobre AI(OH)3, o sobre una mezcla de AI(OH)3 y AIPO4. El toxoide de difteria puede ser adsorbido sobre AI(OH)3 ó AIP04; el toxoide de tétanos puede ser adsorbido sobre AI(OH)3 ó AIP0 , el Pw puede ser adsorbido sobre, o se puede mezclar con, AIP04, la pertactina puede ser adsorbida sobre AI(OH)3; la hemaglutinina filamentosa puede ser adsorbida sobre AI(OH)3; el toxoide de tosferina puede ser adsorbido sobre AI(OH)3; HB puede ser adsorbido sobre AIP0 , H ib puede ser adsorbido sobre AIP04 o puede no ser adsorbido, Men ACWY pueden ser adsorbidos sobre AI(OH)3 ó AIPO4, o pueden no ser adsorbidos, el componente enB puede ser adsorbido sobre AI(OH)3 ó AIPO4, o puede no ser adsorbido; Vi puede ser adsorbido sobre AI(OH)3 ó AIPO4, o puede no ser adsorbido; HepA puede ser adsorbido sobre AI(OH)3 ó AIPO4.

Los antígenos que son previamente adsorbidos sobre una sal de aluminio, se pueden adsorber previamente de una manera individual antes de mezclarse. En otra modalidad, una mezcla de antígenos puede ser previamente adsorbida antes de mezclarse con los adyuvantes adicionales. En una modalidad, el poliovirus inactivado puede ser adsorbido por separado o como una mezcla de poliovirus inactivado tipos 1, 2, y 3, o cuando se mezcla con los componentes D y T adsorbidos. El significado de "antígeno adsorbido" se toma, por ejemplo, para significar más del 20 por ciento, 30 por ciento, 40 por ciento, 50 por ciento, 60 por ciento, 70 por ciento, 80 por ciento, ó 90 por ciento adsorbido. El significado de los términos "fosfato de aluminio" e "hidróxido de aluminio", como se utilizan en la presente, incluye todas las formas de hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio que son adecuadas para auxiliares de vacunas. Por ejemplo, el fosfato de aluminio puede ser un precipitado de fosfato de aluminio insoiuble (amorfo, semi-cristalino, o cristalino), el cual se puede preparar opcionalmente, pero no exclusivamente, mediante la mezcla de sales de aluminio y sales de ácido fosfórico solubles. El "hidróxido de aluminio" puede ser un precipitado de hidróxido de aluminio soluble (amorfo, semi-cristalino, o cristalino), el cual se puede preparar opcionalmente, pero no exclusivamente, mediante la neutralización de una solución de sales de aluminio. Son particularmente adecuadas las diferentes formas de geles de hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio disponibles en las fuentes comerciales, por ejemplo, Alhydrogel (hidróxido de aluminio, suspensión al 3 por ciento en agua), y Adjuphos (fosfato de aluminio, suspensión al 2 por ciento en suero) suministrados por Brenntag Biosector (Dinamarca). Componentes no ¡nmunológicos de las vacunas de la invención Las vacunas de la invención típicamente, en adición a los componentes antigénicos y adyuvantes mencionados anteriormente, comprenden uno o más "vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables", los cuales induzcan cualquier excipiente que no induzca por sí mismo la producción de anticuerpos dañinos para el individuo que reciba la composición. Los excipientes adecuados son típicamente macromoléculas grandes que se metabolizan lentamente, tales como proteínas, sacáridos, poli-ácidos lácticos, poli-ácidos glicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, sacarosa (Paoletti y colaboradores, 2001, Vaccine, 19:2118), trehalosa (Publicación Internacional Número WO 00/56365), agregados de lactosa y lípido (tales como gotitas de aceite o liposomas). Estos vehículos son bien conocidos por los expertos ordinarios en este campo. Las vacunas también pueden contener diluyentes, tales como agua, suero, glicerol, etc. Adicionalmente, puede haber presentes sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias reguladoras del pH, y similares. Un vehículo típico es el suero fisiológico regulado con fosfato estéril, sin pirógeno. Está disponible una discusión completa de los excipientes farmacéuticamente aceptables en la referencia: Gennaro, 2000, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a Edición, ISBN:0683306472. Las composiciones de la invención se pueden liofilizar, o pueden estar en una forma acuosa, es decir, como soluciones o suspensiones. Las formulaciones líquidas de este tipo permiten que las composiciones se administren directamente desde su forma empacada, sin la necesidad de reconstitución en un medio acuoso, y por lo tanto, son ideales para inyección. Las composiciones se pueden presentar en frascos, o se pueden presentar en jeringas llenadas listas para usarse. Las jeringas se pueden suministrar con o sin agujas. Una jeringa incluirá una sola dosis de la composición, mientras que un frasco puede incluir una sola dosis o múltiples dosis (por ejemplo, dos dosis). En una modalidad, la dosis es para un ser humano. En una modalidad adicional, la dosis es para un humano adulto, adolescente, niño, bebé, o de menos de un año de edad, y se puede administrar mediante inyección. Las vacunas líquidas de la invención también son adecuadas para reconstituir otras vacunas a partir de una forma liofilizada.

Cuando se va a utilizar una vacuna para la reconstitución extemporánea, la invención proporciona un kit, el cual puede comprender dos frascos, o puede comprender una jeringa llenada lista para usarse y un frasco, utilizándose el contenido de la jeringa para reconstituir el contenido del frasco antes de la inyección. Las vacunas de la invención se pueden empacar en una forma de dosis unitaria o en una forma de múltiples dosis (por ejemplo, dos dosis). Para las formas de múltiples dosis, se prefieren los frascos en lugar de las jeringas previamente llenadas. Los volúmenes de dosificación efectivos se pueden establecer rutinariamente, pero una dosis típica de la composición para inyección para seres humanos, tiene un volumen de 0.5 mililitros. En una modalidad, las vacunas de la invención tienen un pH de entre 6.0 y 8.0; en otra modalidad, las vacunas de la invención tienen un pH de entre 6.3 y 6.9, por ejemplo de 6.6 + 0.2. Las vacunas se pueden regular a este pH. Se puede mantener un pH estable mediante el uso de un regulador. Si una composición comprende una sal de hidróxido de aluminio, se puede utilizar un regulador de histidina (Publicación Internacional Número WO03/009869). La composición debe ser estéril y/o debe estar exenta de pirógeno.

Las composiciones de la invención pueden ser isotónicas con respecto a los seres humanos. Las vacunas de la invención pueden incluir un antimicrobiano, en particular cuando se empaquen en un formato de múltiples dosis. Se debe evitar el tiomersal, debido a que éste conduce a una pérdida de potencia del componente de poliovirus inactivado. Se pueden utilizar otros antimicrobianos, tales como 2-fenoxi-etanol o parabenos (metil-, etil-, o propil-parabenos) . De preferencia está presente cualquier conservador en niveles bajos. El conservador se puede agregar exógenamente, y/o puede ser un componente de los antígenos a granel que se mezclen para formar la composición (por ejemplo, presente como un conservador en los antígenos de tosferina) . En una modalidad, las vacunas de la invención están libres de tiomersal o sustancialmente libres de tiomersal. "Libres de tiomersal" o "sustancialmente libres de tiomersal" significa que no hay suficiente tiomersal presente en la formulación final para impactar negativamente la potencia del componente de poliovirus inactivado. Por ejemplo, si se utiliza tiomersal durante el proceso de purificación del antígeno superficial de Pw o de Hepatitis B, se debe remover sustancialmente antes de mezclarse con el poliovirus inactivado. El contenido de tiomersal en la vacuna final debe ser menor de 0.025 microgramos/microgramo de proteína, de 0.02 microgramos/-microgramo de proteína, de 0.01 microgramos/microgramo de proteína, o de 0.001 microgramos/microgramo de proteína, por ejemplo de 0 microgramos/microgramo de proteína. En una modalidad, no se agrega tiomersal ni se utiliza en la purificación de cualquiera de los componentes. Véase, por ejemplo, la Patente Europea Número EP1307473 para la Hepatitis B, y véase anteriormente para los procesos de Pw en donde se logra la aniquilación sin la presencia de tiomersal. Las vacunas de la invención pueden comprender detergente, por ejemplo un Tween (polisorbato) , tal como Tween 80. Los detergentes están en general presentes en bajos niveles, por ejemplo, del <0.01 por ciento. Las vacunas de la invención pueden incluir sales de sodio (por ejemplo, cloruro de sodio) para dar tonicidad. La composición puede comprender cloruro de sodio. En una modalidad, la concentración del cloruro de sodio en la composición de la invención está en el intervalo de 0.1 a 100 miligramos/mililitro (por ejemplo, de 1 a 50 miligramos/mililitro, de 2 a 20 miligramos/mililitro, de 5 a 15 miligramos/mililitro), y en una modalidad adicional, la concentración del cloruro de sodio es de 10 + 2 miligramos/mililitro de NaCI, por ejemplo de aproximadamente 9 miligramos/mililitro. Las vacunas de la invención generalmente incluirán un regulador del pH. Es típico un regulador de fosfato o de histidina. Las vacunas de la invención pueden incluir iones de fosfato libres en solución (por ejemplo, mediante el uso de un regulador de fosfato), con el objeto de favorecer la no adsorción de los antígenos. La concentración de los iones de fosfato libres en la composición de la invención, en una modalidad, es de entre 0.1 y 10.0 mM, o en otra modalidad es de entre 1 y 5 mM, o n una modalidad adicional es de aproximadamente 2.5 mM. Propiedades de las vacunas de la invención En una modalidad, las vacunas de la invención se formulan como una vacuna para su administración in vivo al huésped, de tal manera que los componentes individuales de la composición se formulan de tal manera que la inmunogenicidad de los componentes individuales no es sustancialmente perjudicada por otros componentes individuales de la composición. Mediante "no es sustancialmente perjudicada", se pretende significar que, después de la inmunización, se obtiene una titulación de anticuerpo contra cada componente que es mayor del 60 por ciento, del 70 por ciento, del 80 por ciento, o del 90 por ciento, o es del 95 al 100 por ciento de la titulación obtenida cuando se administra el antígeno en aislamiento. Por consiguiente, en las modalidades preferidas, no se presenta un efecto (significativamente) perjudicial para los otros componentes (en términos de eficacia protectora) en la combinación, comparándose con su administración en aislamiento. Formulaciones de vacunas En una modalidad, las vacunas de la invención se formulan como una vacuna para su administración in vivo al huésped, de tal manera que confieran una titulación de anticuerpo superior al criterio para la seroprotección para cada componente antigénico, para un porcentaje aceptable de sujetos humanos. Ésta es una prueba importante en la evaluación de la eficacia de una vacuna a través de toda la población. Los antígenos con una titulación de anticuerpo asociada arriba de la cual se considera que un huésped se seroconvierte contra el antígeno, son bien conocidos, y estas titulaciones son publicadas por organizaciones tales como la Organización Mundial de la Salud. En una modalidad, se seroconvierte más del 80 por ciento de una muestra de sujetos estadísticamente significativa; en otra modalidad, se seroconvierte más del 90 por ciento de una muestra de sujetos estadísticamente significativa; en una modalidad adicional, se seroconvierte más del 93 por ciento de una muestra de sujetos estadísticamente significativa; y en todavía otra modalidad, se seroconvierte del 96 al 100 por ciento de una muestra de sujetos estadísticamente significativa. La cantidad de antígeno en cada dosis de vacuna se selecciona como una cantidad que induzca una respuesta inmunoprotectora sin efectos secundarios adversos significativos en las vacunas típicas. Esta cantidad variará dependiendo de cuáles inmunógenos específicos sean empleados. En términos generales, se espera que cada dosis comprenderá de 1 a 1,000 microgramos del inmunogeno total, o de 1 a 100 microgramos, o de 1 a 40 microgramos, o de 1 a 5 microgramos. Se puede aseverar una cantidad óptima para una vacuna particular mediante estudios que involucren la observación de las titulaciones de anticuerpos y de otras respuestas en los sujetos. Un curso de vacunación primaria puede incluir de dos a tres dosis de vacuna, dadas con una separación de 1 a 2 meses, por ejemplo, siguiendo las recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud para la inmunización con DTP (es decir, en el primer año de vida). Pueden seguir dosis de refuerzo en los segundo y/o siguientes años de vida. Potencia de polio medida mediante la prueba de seré-neutralización en ratas. Para los propósitos de la invención, se debe llevar a cabo el ensayo para la evaluación cuantitativa de la potencia de la vacuna del poliovirus inactivado de las vacunas que contengan poliovirus inactivado de la invención, utilizando una sola dosis de vacuna, y esto se debe hacer mediante la determinación de la proporción de la titulación media geométrica de la vacuna de prueba (GMT) a la titulación media geométrica de la vacuna de referencia, y se reporta como la respuesta relativa (RR) o la potencia relativa (RP). La titulación media geométrica de la vacuna de referencia puede ser la titulación media geométrica obtenida con cualquier vacuna de poliovirus inactivado que comprenda 40-8-32 unidades de antígeno D de poliovirus inactivado tipos 1-2-3, respectivamente, y puede ser la titulación media geométrica obtenida con la vacuna conocida Poliorix®. Típicamente, la prueba de potencia relativa se lleva a cabo como sigue: Se determina la potencia de poliovirus tipos 1, 2, y 3 en ratas, mediante seroneutralización: Los grupos de 10 ratas sanas (Sprague-Dawley (OFA), o cualquier raza validada de antemano) se inoculan intramuscularmente con diluciones (1/1.25; 1/3.125; 1/7.81) de las muestras de prueba o del material de referencia en suero regulador de fosfato. Si es necesario, se puede extender el intervalo de dilución hasta cuatro diluciones mediante la inoculación de vacuna no diluida, y las tres diluciones previamente mencionadas. Se utilizan 10 ratas inoculadas con el diluyente como controles negativos. Se observa a las ratas una vez a la semana para detectar cualquier reacción anormal. De 20 a 22 días después de la inoculación, cada animal se anestesia profundamente, y se sangra, y se recolecta el suero para analizarse mediante la prueba de seroneutralización. Para la prueba de seroneutralización, los sueros se inactivan mediante incubación a 56°C durante 30 minutos en un baño de agua. Se preparan tres series de dilución de los sueros, una para cada tipo de polio, en microplacas, utilizando el medio de dilución apropiado. Las placas se almacenan a +4°C. Para los tres tipos de virus de polio, se agrega una cantidad previamente determinada del virus (de 30 a 300 CCID50) a las diluciones de sueros. Las tres suspensiones de virus se diluyen tomando en cuenta sus titulaciones respectivas. La dilución final se denomina como la "dilución de trabajo". Cada dilución de trabajo se agrega a las microplacas correspondientes. Luego las placas se sellan y se incuban a 37°C + 1°C durante 16 horas. Entonces se agregan las células HEP-2, y las microplacas se incuban a 37°C + 1°C durante 7 días. El efecto citopatogénico (CPE) del virus se lee utilizando un microscopio invertido después de la coloración con azul Coomassie. La presencia de los anticuerpos contra la poliomielitis inhibe el crecimiento del virus y la aparición del efecto citopatogénico correspondiente. Las titulaciones contra el virus de polio (tipo 1, 2, y 3) corresponden al recíproco de la última dilución sin ningún efecto citopatogénico. En cada grupo, se registran los animales con anticuerpos neutralizantes, y se determina la titulación de anticuerpos de cada muestra de suero para los diferentes tipos de poliovirus. La titulación del anticuerpo neutralizante se expresa como el log2 del inverso de la dilución más alta de la muestra de suero que inhibe totalmente el efecto citopatogénico del poliovirus en las células Hep-2. También se determina, para cada grupo de ratas, la titulación media geométrica por dilución (GMT) y por tipo de virus. Empaque de las vacunas de la invención Las vacunas de la invención se pueden empacar en diferentes tipos de recipientes, por ejemplo, en frascos, en jeringas, etc. Un frasco de múltiples dosis típicamente comprenderá una compuerta de plástico re-sellable a través de la cual se pueda insertar una aguja estéril para remover una dosis de vacuna, que se vuelve a sellar una vez que se ha removido la aguja. La vacuna se puede suministrar en diferentes recipientes (por ejemplo, dos o tres). El contenido de los recipientes se puede mezclar extemporáneamente antes de administrarse a un huésped en una sola inyección, o se puede administrar de una manera concomitante en diferentes sitios. La dosis de la vacuna o de cada vacuna si se administra un kit de una manera concomitante (en dos o más recipientes) será típicamente de 0.5 mililitros. En una modalidad de este aspecto de la invención, se proporciona un kit que comprende dos vacunas multivalentes para conferir protección en un huésped contra la enfermedad provocada por poliovirus, Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, y opcionalmente uno o más de Hepatitis B, Haemophillus influenzae tipo B, Neisseria meningitidis tipo C, Neisseria meningitidis tipo W, Neisseria meningitidis tipo Y, Neisseria meningitidis tipo B, Salmonella typhi, Hepatitis A, ó Malaria. El kit comprende un primer recipiente que comprende: (1) (a) el poliovirus inactivado (IPV) de la invención, (b) toxoide de difteria (DT ó D) (véase anteriormente), (c) toxoide de tétanos (TT ó T) (véase anteriormente), (d) Bordetella pertussis de células enteras muertas (Pw), o dos o más componentes de tosferina acelulares (Pa) (véase anteriormente), (e) opcionalmente antígeno superficial de Hepatitis B (HepB ó HB) (véase anteriormente), (f) opcionalmente un conjugado de una proteína portadora y el sacárido capsular de H. influenzae tipo B (Hib) (véase anteriormente), (g) opcionalmente cualquiera o ambos conjugados de una proteína portadora y un sacárido capsular de un N. meningitidis tipo A (MenA) o N. meningitidis tipo C (MenC) (véase anteriormente), y un segundo recipiente que comprende: (2A) (a) conjugados de una proteína portadora y un sacárido capsular de N. meningitidis tipo A (MenA), N. meningitidis tipo C (MenC), N. meningitidis tipo W (MenW), y/o N. meningitidis tipo Y (MenY) (véase anteriormente para las diferentes combinaciones de sacáridos Men de la invención), y (b) opcionalmente un conjugado de una proteína portadora y el sacárido capsular de H. influenzae tipo B (Hib); o (2B) (a) un conjugado de una proteína portadora y el sacárido capsular de H. influenzae tipo B (Hib), y (b) opcionalmente un conjugado de una proteína portadora y el sacárido Vi de Salmonella typhi. El kit puede comprender opcionalmente un tercer recipiente que comprende: (3) (a) opcionalmente el antígeno superficial de Hepatitis B; (b) opcionalmente un conjugado de una proteína portadora y el sacárido Vi de Salmonella typhi. Los recipientes pueden en cualquier caso comprender adicionalmente antígenos de HepA y/o antígenos de MenB y/o RTS.S y/o antígenos de Streptococcus pneumonía.

En cualquier caso, no debe estar presente el mismo antígeno en ambos recipientes. En una modalidad, el primer recipiente tiene, en adición a los componentes a), b), c), d), también los componentes e), f), g), e)+f), e) + g), f) + g) ó e) + f) + g). En una modalidad, la vacuna del primer recipiente puede ser líquida, y la vacuna del segundo recipiente puede ser líquida o puede estar liofilizada (por ejemplo, en la presencia de un recipiente estabilizante conocido, tal como sacarosa o trehalosa). Los recipientes del kit se pueden empacar por separado, u opcionalmente, se pueden empacar juntos. En una modalidad, el kit se proporciona con una lista de instrucciones para la administración de las vacunas en los dos o más recipientes. En una modalidad, cuando un recipiente de un kit contiene cierto conjugado de sacárido, el mismo conjugado no está presente en los otros recipientes del kit. Los inventores creen que un kit proporcionado de la manera anterior puede presentar convenientemente los diferentes antígenos ante el sistema inmune de un huésped de una manera óptima. El kit puede proporcionar a un practicante médico un método óptimo para inmunizar a un huésped con una o más de las siguientes ventajas: eficacia protectora para todos los antígenos, reactogenicidad mínima, interferencia mínima de supresión del portador, interferencia mínima de adyuvante/antígeno, o interferencia mínima de antígeno/antígeno. De esta manera, se pueden alcanzar estas metas con el número mínimo (2) de administraciones, presentándose opcionalmente en la misma cita al practicante. En una modalidad, las vacunas de los primero y segundo recipientes se administran de una manera concomitante en diferentes sitios (como se describe más adelante bajo "administración de las vacunas de la invención"), y en una modalidad alternativa, los inventores prevén que el contenido de los primero y segundo recipientes se pueda mezclar (opcionalmente de una manera extemporánea) antes de su administración como una sola vacuna. Preparación de las vacunas de la invención La presente invención también proporciona un método para producir una formulación de vacuna, el cual comprende el paso de mezclar los componentes de la vacuna junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable. En una modalidad de la presente invención, se proporciona una vacuna como se describe en la presente, para utilizarse en un medicamento para el tratamiento o la prevención de enfermedades causadas por la infección por poliovirus, y opcionalmente por Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, virus de Hepatitis B, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis tipo A, Neisseria meningitidis tipo C, Neisseria meningitidis tipo W, Neisseria meningitidis tipo Y, Salmonella typhi, ó Hepatitis A. En otra modalidad de la invención, se proporciona un uso de las vacunas de la invención, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de las enfermedades causadas por la infección por poliovirus, y opcionalmente por Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, virus de Hepatitis B, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis tipo A, Neisseria meningitidis tipo C, Neisseria meningitidis tipo W, Neisseria meningitidis tipo Y, Salmonella typhi, ó Hepatitis A. Adicionalmente, también se proporciona un método para inmunizar a un huésped humano contra la enfermedad causada por el poliovirus, y opcionalmente por Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, virus de Hepatitis B, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis tipo A, Neisseria meningitidis tipo C, Neisseria meningitidis tipo W, Neisseria meningitidis tipo Y, Salmonella typhi, ó Hepatitis A, cuyo método comprende administrar al huésped una dosis inmunoprotectora de la vacuna de la invención. La cantidad de antígeno en cada dosis de vacuna se selecciona como una cantidad que induzca una respuesta inmunoprotectora sin efectos secundarios adversos significativos en las vacunas típicas. Esta cantidad variará dependiendo de cuál inmunogeno específico se emplee, y de cómo se presente. En una modalidad, cada dosis comprenderá de 0.1 a 100 microgramos de sacárido; en otra modalidad, cada dosis comprenderá de 0.1 a 50 microgramos; en una modalidad adicional, cada dosis comprenderá de 0.1 a 10 microgramos; y en todavía otra modalidad, cada dosis comprenderá de 1 a 5 microgramos de sacárido.

En una modalidad, el contenido de antígenos de proteína en la vacuna estará en el intervalo de 1 a 100 microgramos; en otra modalidad, el contenido de antígenos de proteína en las vacunas estará en el intervalo de 5 a 50 microgramos; en una modalidad adicional, el contenido de los antígenos de proteína en las vacunas estará en el intervalo de 5 a 25 microgramos. La preparación de vacunas se describe en general en Vaccine Design ["The subunit and adjuvant approach" (Editores Powell M. F. y Newman M. J.) (1995) Plenum Press, Nueva York]. La encapsulación dentro de liposomas es descrita por Fullerton, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,235,877. La conjugación de las proteínas con las macromoléculas se da a conocer, por ejemplo, en Likhite, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,372,945, y en Armor y colaboradores, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,474,757. El uso de Quil A es dado a conocer por Daisgaard y colaboradores, 1977, Acta Vet Scand. 18:349. El 3D-MPL está disponible en Ribi Immunochem, EUA, y se da a conocer en la Solicitud de Patente Británica Número 2220211 y en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,912,094. El QS21 se da a conocer en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,057,540.

En una modalidad adicional de la invención, se proporciona una vacuna multivalente que comprende el poliovirus inactivado (IPV) de la invención, y opcionalmente Bordetella pertussis de células enteras muertas (Pw), toxoide de tétanos (TT), toxoide de difteria (DT), un conjugado de una proteína portadora y el sacárido capsular de H. influenzae tipo B (Hib - opcionalmente conjugado con TT, DT, ó CRM197), en donde la cantidad del conjugado por dosis de 0.5 mililitros de la vacuna a granel es de 1 a 8 microgramos, y la inmunogenicidad del conjugado es equivalente o mejor sobre las composiciones que comprenden mayores cantidades del conjugado. Opcionalmente, también se puede incluir en el antígeno superficial de Hepatitis B. En una modalidad, la cantidad de conjugado por dosis de 0.5 mililitros de vacuna a granel es menor de 10 microgramos (de sacárido en el conjugado); en otra modalidad, la cantidad de conjugado es de 1 a 7 microgramos; en otra modalidad, la cantidad de conjugado es de 2 a 6 microgramos; o en una modalidad adicional es de aproximadamente 2.5, 3, 4, ó 5 microgramos. Se apreciará que ciertos componentes, por ejemplo los componentes de DTPw, se pueden combinar por separado antes de agregar el HBsAg adsorbido u otros componentes. También se proporciona un método para la elaboración de las vacunas de la invención, el cual comprende el paso de mezclar el poliovirus inactivado tipo 1, el poliovirus inactivado tipo 2, y/o el poliovirus inactivado tipo 3 con un excipiente farmacéuticamente aceptable. Un proceso típico para la preparación de la vacuna a granel de la invención con antígenos adicionales agregará los componentes del poliovirus inactivado a una mezcla de los componentes D y T, es decir, los componentes DT se mezclan con los componentes del poliovlrus ¡nactivado. Este orden de mezcla permite que se ajuste la concentración iónica y/o el pH de la composición (por ejemplo, pH <7) antes de la adición de los componentes de Pa ó Pw. Típicamente, si se incluye en la composición, primero se agrega el HB previamente adsorbido sobre AIPO4, seguido por la adición del DT previamente adsorbido sobre AI(OH)3 ó AIPO4, seguido por la adición del TT previamente adsorbido sobre AI(OH)3 ó AIPO4, seguido por la adición del poliovirus inactivado opcionalmente previamente adsorbido sobre AI(OH)3, antes del ajuste del pH, por ejemplo, hasta un pH de 5.9 a 7.2, o hasta un pH de 6 a 7, o hasta un pH de 6.2 a 6.8, o hasta un pH de 6.4 a 6.6, y entonces se puede hacer la adición del Pw previamente adsorbido sobre AIPO4. Opcionalmente, los antígenos Hib, Vi, MenA, MenC, MenW, MenY, MenB y/o HepA, se pueden agregar en cualquier punto de este proceso. En una modalidad, los antígenos Hib, Vi, MenA, MenC, MenW, MenY, MenB y/o HepA se agregan antes del ajuste del pH. En una modalidad, uno o más antígenos de la invención son adsorbidos sobre fosfato de aluminio o sobre hidróxido de aluminio, o sobre una mezcla de ambos. En otra modalidad, los antígenos de la invención se mezclan con un excipiente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, la composición de vacuna de la invención se puede preparar en el siguiente orden: se agrega el HBsAg previamente adsorbido, seguido por el toxoide de difteria previamente adsorbido, seguido por el toxoide de tétanos previamente adsorbido y el poliovirus inactivado, y entonces se ajusta el pH hasta aproximadamente 6.5 antes de agregar el Pw previamente adsorbido. En otra modalidad, la composición de vacuna de la invención se puede preparar en el siguiente orden: se agrega el toxoide de tétanos previamente adsorbido, seguido por el poliovirus inactivado, seguido por el HBsAg previamente adsorbido, seguido por el toxoide de difteria previamente adsorbido, entonces se ajusta el pH hasta aproximadamente 6.5 antes de agregar el Pw previamente adsorbido. En general, las composiciones de vacuna combinadas de acuerdo con cualquier aspecto de la invención se pueden preparar como sigue: el poliovirus inactivado, DTPw, HepB, MenA, MenC, MenW, MenY, MenB, Vi, Hepatitis A, u otros componentes, se adsorben previamente sobre un adyuvante adecuado, en especial hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio, o una mezcla de ambos. Después de dar tiempo para tener una adsorción completa y estable de los componentes respectivos, los diferentes componentes se combinan bajo condiciones apropiadas. Los conjugados de Hib, Vi, MenA, MenC, MenW y/o MenY pueden o no ser adsorbidos sobre la sal adyuvante de aluminio antes de mezclarse con la vacuna de DTPw. En una modalidad, las vacunas de la invención se preparan entre 15°C y 30°C (por ejemplo, entre 19°C y 27°C, o a 23 + 4°C). Administración de las vacunas de la invención La invención proporciona un método para elevar una respuesta inmune en un mamífero, el cual comprende el paso de administrar una cantidad efectiva de una vacuna de la invención. Las vacunas se pueden administrar profilácticamente (es decir, para prevenir la infección). La respuesta inmune de preferencia es protectora, y preferiblemente involucra anticuerpos. El método puede presentar una respuesta de refuerzo. En seguida de una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir una o varias inmunizaciones de refuerzo (subsiguientes) adecuadamente separadas. El tratamiento de dosificación puede ser un programa de una sola dosis o un programa de múltiples dosis. Se pueden utilizar múltiples dosis en un programa de inmunización primaria y/o en un programa de inmunización de refuerzo. Un programa de dosis primaria, el cual puede ser en el primer año de vida, puede ser seguido por un programa de dosis de refuerzo. El tiempo adecuado entre las dosis primarias (por ejemplo, entre 4 y 16 semanas), y entre las dosis primarias y de refuerzo, se puede determinar rutinariamente. En una modalidad, el mamífero es un ser humano. Cuando la vacuna es para uso profiláctico, el ser humano de preferencia es un niño (por ejemplo, un bebé o un infante), o un adolescente; cuando la vacuna es para uso terapéutico, el ser humano de preferencia es un adulto. Una vacuna pretendida para niños también se puede administrar a adultos, por ejemplo, para evaluar la seguridad, dosificación, inmunogenicidad, etc. Las preparaciones de vacuna de la presente invención se pueden utilizar para proteger o tratar a un mamífero susceptible a infección, por medio de la administración de esta vacuna directamente a un paciente. El suministro directo se puede llevar a cabo mediante administración parenteral (intramuscularmente, intraperitonealmente, intradérmicamente, subcutáneamente, intravenosamente, o al espacio intersticial de un tejido); o mediante administración rectal, oral, vaginal, tópica, transdérmica, intranasal, ocular, aural, pulmonar, u otra administración a las mucosas. En una modalidad, la administración es mediante inyección intramuscular en el muslo o en el antebrazo. La inyección puede ser por medio de una aguja (por ejemplo, una aguja hipodérmica) , pero de una manera alternativa, se puede utilizar una inyección sin aguja. Una dosis intramuscular típica es de 0.5 mililitros. Las infecciones bacterianas afectan a diferentes áreas del cuerpo, y de esta manera, las composiciones de la invención se pueden preparar en diferentes formas. Por ejemplo, las composiciones se pueden preparar como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas. La composición se puede preparar para administración pulmonar, por ejemplo como un inhalador, utilizando un polvo fino o aerosol. La composición se puede preparar como un supositorio o un pesario. La composición se puede preparar para administración nasal, aural, u ocular, por ejemplo, como aerosol, gotas, gel, o polvo (véanse, por ejemplo, Almeida y Alpar, 1996, J. Drug Targeting, 3:455; Bergquist y colaboradores, 1998, APMIS, 106:800). Se ha reportado la administración intranasal de éxito de las vacunas de DTP (Ryan y colaboradores, 1999, Infecí. Immun., 67:6270; Nagai y colaboradores, 2001, Vaccine, 19:4824). En una modalidad, las vacunas de los primero y segundo (y tercero cuando sea aplicable) recipientes, se administran de una manera concomitante en diferentes sitios, y en una modalidad alternativa, los inventores prevén que el contenido de los primero y segundo recipientes se pueda mezclar (opcionalmente de una manera extemporánea) antes de su administración como una sola vacuna. La invención se puede utilizar para provocar una inmunidad sistémica y/o mucosa. Una manera de verificar la eficacia del tratamiento terapéutico involucra monitorear la infección bacteriana después de la administración de la composición de la invención. Una manera de verificar la eficacia del tratamiento profiláctico involucra monitorear las respuestas inmunes contra los antígenos después de la administración de la composición. La inmunogenicidad de las composiciones de la invención se puede determinar mediante su administración a los sujetos de prueba (por ejemplo, niños de 12 a 16 meses de edad, o modelos animales - Publicación Internacional Número WO 01/30390), y luego se determinan los parámetros inmunológicos estándares. Estas respuestas inmunes en general se determinarán alrededor de 4 semanas después de la administración de la composición, y se compararán con los valores determinados antes de la administración de la composición. En lugar de evaluar la eficacia protectora real en los pacientes, también se conocen modelos animales e in vitro convencionales, y se correlaciona la protección para evaluar la eficacia de las vacunas de DTP. Los términos "que comprende", "comprenden", y "comprende" en la presente, son pretendidos por los inventores como opcionalmente sustituibles con los términos "que consisten en", "consisten en", y "consiste en", respectivamente, en cada caso. Esto no cambia el significado normal de estos términos, y solamente se pretende proporcionar una base para la sustitución, y no hacerlos equivalentes en su significado. Todas las referencias y publicaciones citadas se incorporan como referencia a la presente.

EJEMPLOS Los Ejemplos se proporcionan exclusivamente para propósitos de ilustración, y no pretenden limitar el alcance de la invención. Ejemplo 1: Pruebas sobre las formulaciones de poliovirus inactivado de dosis baja. Para todas las formulaciones del Ejemplo 1 , los antígenos son adsorbidos mediante la adición de la sal de aluminio antes de la formulación, excepto el poliovirus inactivado, el cual se agrega sin adsorción. Las siguientes tablas presentan el método de adsorción para D, T, Pw, y HBsAg.

AIP04 I D (7.5 Lf/ 0.075 mg Al3+) I Agitación de 15 hasta 20 minutos a temperatura ambiente0 Ajustar el pH a un pH de 5.1 +/- 0.1 I Agitación desde 15 hasta 20 minutos a temperatura ambiente0 I Verificar el pH de 5.1 +/- 0.1 Agitación desde 15 hasta 45 minutos a temperatura ambiente0 I Maduración de 7 días +/- 8 horas a 37°C +/- 1 °C sin agitación (recipiente de vidrio) con agitación (recipiente de acero inoxidable) Agitación desde 15 hasta 45 minutos a temperatura ambiente0 Ajustar el pH a un pH de 6.1 +/- 0.1 Agitación desde 15 hasta 20 minutos a temperatura ambiente0 Verificar el pH de 6.1 +/- 0.1 I Almacenar un mínimo de 7 días +2/+8°C antes de la formulación Tabla 1 Método de producción para adsorción de toxoide de difteria AI(OH)3 Tipo SUPERFOS T (3.25LÍ/ 0.070 mg Al3+) I Agitación desde 15 minutos hasta 20 minutos a temperatura ambiente I Ajustar a un pH 6.1 +/- 0.1 I Agitación desde 15 minutos hasta 20 minutos a temperatura ambiente Verificar el pH de 6.1 +/- 0.1 I Agitación desde 16 horas hasta 24 horas a temperatura ambiente NaCI 1500 mM (hasta 150 mM) Agitación desde 15 minutos hasta 45 minutos a temperatura ambiente Ajustar a un pH de 6.1 +/- 0.1 Agitación desde 15 minutos hasta 20 minutos a temperatura ambiente Verificar el pH de 6.1 +/- 0.1 Almacenar un mínimo de 14 días a +2°C/+8°C antes de la formulación Tabla 2 Método de producción para adsorción de toxoide de tétanos AIP04 0.17 mg Al37d (Brenntag) I Ajustar el pH a un pH de 6.5 +/- 0.1 Agitación desde 15 minutos hasta 20 minutos a temperatura ambiente0 Verificar el pH de 6.5 +/- 0.1 Pw 20IOU/d I Agitación desde 15 minutos hasta 45 minutos a temperatura ambiente0 Medir el pH I Almacenamiento a +2°C/+8°C Tabla 3 Método de producción para adsorción de Pw COMPOSICIÓN FINAL por dosis Antígenos Adyuvante [Al3+] (mg) Al3+ 0.170 mg AIP04 NaCI 150 mM pH 6.8 Volumen aproximadamente 65 µ? HBsAg 10 pg Al3+ 0.20 mg AIP04 Agitación desde 15 minutos hasta 30 minutos a temperatura ambiente0 Ajustar el pH a un pH de 5.3 +/- 0.1 Agitación desde 15 minutos hasta 30 minutos a temperatura ambiente0 Verificar el pH a un pH de 5.3 +/- 0.1 I Agitación durante 20 horas +/- 4 horas a temperatura ambiente0 (adsorción) I Ajustar el pH a un pH de 6.1 +/- 0.1 Agitación desde 15 minutos hasta 30 minutos a temperatura ambiente0 Verificar el pH a un pH de 6.1 +/- 0.1 Almacenar durante 1 días a temperatura ambiente0 (maduración) Almacenamiento a 2°C-8°C Tabla 4 Método de producción para adsorción de HBsAg Se probaron varias formulaciones diferentes: • Una combinación de toxoide de difteria, toxoide de tétanos, células enteras de tosferina, y antígeno superficial de Hepatitis B: DTPwSF-HB como una referencia (DTPwSF significa que es una formulación libre de tiomersal), formulada con el método de producción 1 (Tabla 5). • Producto Poliorix® de GlaxoSmithKIine Biologicals S.A. (poliovirus ¡nactivado independiente, no adsorbido), como referencia no adsorbida en la dosis estándar, formulada con el método de producción 2 (Tabla 5). • Una combinación de toxoide de difteria, toxoide de tétanos, células enteras de tosferina, antígeno superficial de Hepatitis B, y poliovirus inactivado: DTPwSF-HB-IPV con la adición del IPV antes del Pw, formulada con el método de producción 3 (Tabla 5). • Una combinación de toxoide de difteria, toxoide de tétanos, células enteras de tosferina, antígeno superficial de Hepatitis B, y poliovirus inactivado: DTPWSF-HB-IPV con la adición del poliovirus inactivado justo después del T adsorbido. Este método de adición permite la absorción del poliovirus inactivado sobre AI(OH)3. Esta vacuna se formula con el método de producción 4 (Tabla 5). Un placebo conteniendo sales de aluminio, poliovirus inactivado, y reguladores de ios otros antígenos. Debido a que el poliovirus inactivado es el único en este placebo, no hay competencia por la adsorción. Por consiguiente, el poliovirus inactivado se adsorbe completamente. Esta vacuna se formula con el método de producción 5 (Tabla 5). Las vacunas formuladas con los métodos de producción 2, 3, 4, y 5 se produjeron con un intervalo de dosis de poliovirus inactivado de entre el 12.5 por ciento y el 100 por ciento de la dosis estándar de poliovirus inactivado de 40/8/32 Unidades Internacionales/O.5 mililitros.

Paso Método de producción 1: DTPWSF-HB 1 Agua para inyección para alcanzar un volumen de dosis final de 0.5 mililitros.

Paso Método de producción 1: DTP SF-HB 2 Agregar NaCI 1.5M para alcanzar una concentración de 150 mM. 3 Agregar 115 microgramos de Al3+ como el AIP04. 4 Agregar 10 microgramos de HBsAg adsorbido. 5 Agregar 7.5 Lf de toxoide de difteria adsorbido. 6 Agregar 3.25 Lf de toxoide de tétanos adsorbido. 7 Agitación . 8 Ajustar el pH a 6.5 +/- 0.1. 9 Agitación. 10 Agregar 20 IOU de Pw adsorbido. 11 Agitación. 12 Almacenar de +2°C a +8°C.

Paso Método de producción 2: IPV independiente 1 Agregar el IPV en una dosis de: Tipo 1 Tipo 2 Tipo 3 Paso Método de producción 2: IPV independiente 40 IU 8 IU 32 IU 20 IU 4 IU 16 IU 10 IU 2 IU 8 IU 5 IU 1 IU 4 IU 2 Agregar el regulador M199 para alcanzar un volumen final de 0.5 mililitros. 9 Agitación. 10 Ajustar el pH a 6.9 +/- 0.2. 14 Almacenar de +2°C a +8°C.

Paso Método de producción 3: DTPwSF-HB-IPV 1 Agua para inyección para alcanzar un volumen de dosis final de 0.5 mililitros. 2 Agregar NaCI 1.5M para alcanzar una concentración final de 150 mM. 3 Agregar 115 microgramos de Al3+ como AIP0 .

Paso Método de producción 3: DTPwSF-HB-IPV 4 Agregar 10 microgramos de HBsAg adsorbido. 5 Agregar 7.5 Lf de toxoide de difteria adsorbido. 6 Agregar 3.25 Lf de toxoide de tétanos adsorbido. 7 Agitación. 8 Agregar el IPV en una dosis de: Tipo 1 Tipo 2 Tipo 3 40 IU 8 IU 32 IU 20 IU 4 IU 16 IU 10 IU 2 IU 8 IU 5 IU 1 IU 4 IU 9 Agitación. 10 Ajustar el pH a 6.5 +/- 0.1. 11 Agitación. 12 Agregar 20 IOU de Pw adsorbido. 13 Agitación. 14 Almacenar de +2°C a +8°C.

Paso Método de producción 4: DTPwSF-HB-IPV 1 Agua para inyección para alcanzar un volumen de dosis final de 0.5 mililitros. 2 Agregar NaCI 1.5M para alcanzar una concentración final de 150 mM. 3 Agregar 3.25 Lf de toxoide de tétanos adsorbido. 4 Agregar el IPV en una dosis de: Tipo 1 Tipo 2 Tipo 3 40 IU 8 IU 32 IU 20 IU 4 IU 16 IU 10 IU 2 IU 8 IU 5 IU 1 IU 4 IU 5 Agitación. 6 Agregar 115 microgramos de Al3+ como AIPCV 7 Agregar 10 microgramos de HBsAg adsorbido. 8 Agregar 7.5 Lf de toxoide de difteria adsorbido. 9 Agitación.

Paso Método de producción 4: DTPwSF-HB-IPV 10 Ajustar el pH a 6.5 +/- 0.1. 11 Agitación. 12 Agregar 20 IOU de Pw adsorbido. 13 Agitación. 14 Almacenar de +2°C a +8°C.

Tabla 5. Método de producción por dosis de 0.5 mililitros Método de producción 5: Placebo De acuerdo con el método de producción 3; sin embargo, se han omitido todos los antígenos diferentes del poliovirus inactivado (IPV).

Para la formulación del método de producción 1: HBsAg, D, y T se adsorben por separado sobre AIP04, AIP04, y AI(OH)3, respectivamente. Los tres antígenos se agregan en secuencia a una suspensión que contiene agua, NaCI, y AIP0 libre. La mezcla se agita durante 60 a 75 minutos. Luego se ajusta el pH a 6.5 antes de la adición del Pw adsorbido. Para la formulación del método de producción 3, los tres antígenos adsorbidos se agregan en secuencia a una suspensión que contiene agua, NaCI, y AIP04 libre. La mezcla se agita durante 60 a 75 minutos antes de la adición del poliovirus inactivado. El pH se ajusta a 6.5 antes de la adición de los antígenos de Pw. Para la formulación del método de producción 4, el antígeno T se adsorbe sobre AI(OH)3. Se agrega el antígeno T previamente adsorbido a una suspensión que contiene agua y NaCI, seguido por los poliovirus inactivados tipos 1, 2, y 3. La mezcla se agita durante 60 a 75 minutos antes de la adición del AIP04 libre. Entonces se agrega el HBsAg previamente adsorbido, seguido por el antígeno D previamente adsorbido, y la mezcla se agita entonces durante 60 a 75 minutos adicionales. El pH se ajusta a 6.5 antes de la adición de los antígenos de Pw. El método de producción 3 se seleccionó eventualmente debido a la facilidad de fabricación, ya que este protocolo solamente involucró un paso de agitación. Durante el proceso de fabricación de la vacuna, no se utiliza tiomersal, y no se agrega al producto de vacuna final. La siguiente tabla presenta la composición de las formulaciones para una dosis de 0.5 mililitros.

Tabla 6. Composición de las formulaciones por dosis de 0.5 mililitros 10 15 20 (*) El contenido de antígeno D es el valor dirigido para la dilución del volumen de polio inactivado concentrado durante la formulación.

Determinación de la potencia de polio sobre ratas mediante se ro neutralización. Se determinó la potencia de la vacuna mediante una prueba de seroneutralización después de la inoculación intramuscular de las ratas (Sprague-Dawley (OFA) o cualquier raza validada de antemano). Los grupos de 10 ratas sanas limpias se inocularon ¡ntramuscularmente (0.5 mililitros) con diluciones de las muestras de prueba, del material de referencia en suero regulador de fosfato, o de diluyente (suero regulador de fosfato). Las 10 ratas inoculadas con el diluyente se utilizaron como controles negativos. De 20 a 22 días después de la inoculación (período de inmunización), cada animal se anestesió profundamente antes de la recolección de sangre mediante punción cardíaca. Las muestras de sangre se centrifugaron (a aproximadamente 800 g), y se analizaron los sueros. Prueba de Seroneutralización: Los sueros se inactivaron mediante incubación a 56°C durante 30 minutos. Se prepararon tres series de dilución de los sueros, una para cada tipo de polio, en microplacas, utilizando el medio de dilución apropiado. Para los tres tipos de virus de polio, se agregó una cantidad previamente determinada del virus a las diluciones de los sueros. Las tres suspensiones de virus se diluyeron tomando en cuenta sus titulaciones respectivas. La dilución final se denomina como "dilución de trabajo". Cada dilución de trabajo se agregó a las microplacas correspondientes. Luego se sellaron las placas y se incubaron a 37°C + 1°C durante 16 horas. Entonces se agregaron las células Hep-2, y las microplacas se incubaron a 37°C +.1°C durante 7 días. El efecto citopatogénico (CPE) del virus se leyó utilizando un microscopio invertido después de la coloración con azul Coomassie. La presencia de los anticuerpos contra la poliomielitis inhibe el crecimiento del virus y la aparición de efecto citopatogénico correspondiente. Las titulaciones contra el virus de polio (tipos 1, 2, y 3) corresponden al recíproco de la última dilución sin ningún efecto citopatogénico. En cada grupo, los animales con los anticuerpos neutralizantes se registran, y se determina la titulación de anticuerpos de cada muestra de suero para los diferentes tipos de poliovirus. La titulación de anticuerpo neutralizante se expresa como el log2 del inverso de la dilución más alta de la muestra de suero que inhibe totalmente el efecto citopático del poliovirus sobre las células Hep-2. Entonces se determina la titulación media geométrica por dilución (GMT) y por tipo de virus para cada grupo de ratas. Para cada tipo de virus, también se calculó la dilución de la vacuna, y subsiguientemente la cantidad de antígeno D que indujo a los anticuerpos neutralizantes en el 50 por ciento de las ratas (ED50) mediante el análisis probit. La ED50 se expresó en unidades de antí genos D. Con el objeto de cuantificar la potencia en relación con aquélla de la vacuna de referencia (usualmente Poliorix®, pero también puede ser una vacuna de DTPaHBIPV, tal como Pediarix®), se midió la potencia relativa (RP) definida como la proporción de dos respuestas a la dosis equivalentes en una prueba de múltiples dosis. En este planteamiento, se calcula la potencia de la vacuna de prueba mediante el ensayo de líneas paralelas, como se describe en Finney, 1978 (Statistical Method in Biological Assay, Charles Griffin & Company Ltd., Londres, 1978). Determinación de la potencia de polio tipos 1, 2, y 3 mediante ELISA. La determinación de la potencia de polio mediante ELISA se lleva a cabo en uno o dos pasos, dependiendo de si la medición se está llevando a cabo sobre el poliovirus inactivado no adsorbido a granel contra las vacunas formuladas, respectivamente: 1. Desorción para la vacuna adsorbida final (para la medición en unidades de antígeno D en las vacunas formuladas - no se requiere para la medición en el antígeno de poliovirus inactivado a granel no adsorbido); 2. Prueba ELISA para la cuantificación del contenido de antígeno D de la vacuna desorbida y no adsorbida y/o polio a granel. Paso de desorción Después de la centrifugación durante 10 minutos de la vacuna adsorbida bajo prueba, se llevan a cabo tres desorciones sucesivas, mediante la adición de un regulador de fosfato de desorción al gránulo, la mezcla y la incubación a temperatura ambiente. El primero y el segundo períodos de desorción son de 2 horas, siendo el período de incubación para la tercera extracción de una noche a temperatura ambiente. Las cosechas de las tres extracciones se reservan y se diluyen con la solución reguladora de fosfato (PBS) sin Ca y Mg, conteniendo albúmina de suero bovino (BSA) y Tween 20.

Los tres antígenos de poliovirus se cuantifican mediante ELISA como se describe en seguida. Cuantificación del antígeno D mediante ELISA: Las placas de microtitulación se recubren con IgG anti-poliovirus (tipos 1, 2, ó 3) de conejo específica, diluida con regulador de carbonato/bicarbonato (pH de 9.6), y se incuban durante la noche a 4°C. Después de lavarse, se agrega la solución de saturación (suero regulador de fosfato sin Ca y Mg + albúmina de suero bovino al 1 por ciento). Se agregan por duplicado los controles (suero regulador de fosfato) y las diluciones en serie de las muestras de vacuna y del estándar no adsorbido hecho en casa. La preparación estándar trivalente hecha en casa contiene los antígenos calibrados tipos 1, 2, y 3. El calibrador es la Referencia Biológica de la Farmacopea Europea (EPBRP). Para todos los siguientes pasos, las placas de microtitulación se incuban durante 1 hora con 30 minutos a 37°C, y se lavan. Se agrega IgG de virus anti-polio de conejo (tipos 1, 2, ó 3) conjugada con peroxidasa, diluida con regulador de fosfato (sin Ca y Mg + Tween 20) conteniendo albúmina de suero bovino. Se agrega la solución de sustrato, que contiene la tetrametil-benzidina disuelta en sulfóxido de dimetilo (DMSO), y diluida en regulador de acetato que contiene H202 al 0.003 por ciento, seguida por una incubación de 15 a 30 minutos en la oscuridad. Entonces se agrega la solución de bloqueo, que contiene H2S04. Dentro de una hora, se lee la densidad óptica (O.D.) de cada pozo utilizando un fotómetro establecido a 450 nanómetros con una referencia a 620 nanómetros. La concentración del antígeno D en las muestras de prueba se calcula a partir de la curva estándar obtenida mediante la graficación de los valores de densidad óptica contra las concentraciones de antígeno estándar. Como un complemento a la Potencia mediante ELISA, se puede detectar cualquier antígeno de poliovirus inactivado no adsorbido mediante el método de verificación de que esté completa: Verificación de que está completa la adsorción de polio tipos 1, 2, y 3 no enlazados con adyuvante mediante ELISA. Se llevan a cabo dos centrifugaciones sucesivas. Luego se cosecha el sobrenadante, y se prueba no diluido por duplicado en microplacas mediante ELISA. Las placas de microtitulación se recubren con la IgG anti-poliovirus (tipos 1, 2, ó 3) de conejo específica, diluida con regulador de carbonato/bicarbonato (pH de 9.6), y se incuban durante la noche a 4°C. Después de lavarse, se agrega la solución de saturación (suero regulador de fosfato sin Ca y Mg + albúmina de suero bovino al 1 por ciento). Se agregan por duplicado los controles (suero regulador de fosfato), el sobrenadante, y el estándar no adsorbido hecho en casa. Para todos los siguientes pasos, las placas de microtitulación se incuban durante 1 hora con 30 minutos a 37°C, y se lavan. Se agrega la IgG anti-poliovirus (tipos 1, 2, ó 3) de conejo conjugada con peroxidasa, diluida con regulador de fosfato (sin Ca y Mg + Tween 20) que contiene albúmina de suero bovino. Se agrega la solución de sustrato, que contiene la tetrametil-benzidina disuelta en sulfóxido de dimetilo (DMSO), y diluida en regulador de acetato que contiene H202 al 0.003 por ciento, seguida por una incubación de 15 a 30 minutos en la oscuridad. Entonces se agrega la solución de bloqueo, que contiene H2S0 . Dentro de una hora, se lee la densidad óptica (O.D.) de cada pozo utilizando un fotómetro prestablecido a 450 nanómetros con una referencia a 620 nanómetros. La verificación de que está completa se considera positiva (antígeno en el sobrenadante) si la densidad óptica media de la muestra es más alta que los valores de densidad óptica medios de los controles + tres desviaciones estándares, y si la densidad óptica media de la muestra es mayor de 0.1. En el caso de que la verificación de que está completa sea positiva, se mide el contenido de antígeno mediante el método ELISA, como se describe en el segundo paso de la Potencia de Polio Tipos 1, 2, y 3 mediante ELISA. Método de medición de unidades de opacidad internacionales (IOU). Se puede determinar la concentración celular (IOU) utilizando ya sea una solución estándar de IRPO (Preparación de Opacidad de Referencia Internacional) visual, o bien la medición de absorbencia a 660 nanómetros. Entonces se determina la opacidad de la suspensión de una sola cepa mediante la aplicación de la ecuación de "opacidad asignada" como sigue: AO = LO/KOxCO; en donde AO = opacidad asignada, LO = opacidad de cosecha viva, KO = opacidad de cosecha muerta, y CO = opacidad del concentrado. RESULTADOS Determinación de la potencia de polio en ratas mediante seroneutralización en la dosis estándar de 40:8:32. Se llevaron a cabo experimentos para determinar la potencia de poliovirus inactivado tipos 1, 2, y 3. Los resultados se muestran en la siguiente Tabla 8 (en el presente documento, 40:8:32 unidades de antígeno D de poliovirus inactivado tipos 1, 2, y 3, respectivamente, son equivalentes al 100 por ciento de la dosis de poliovirus inactivado). Tabla 8 Potencia de poliovirus inactivado tipos 1, 2, y 3 en tres formulaciones de vacuna diferentes Potencia de IPV Descripción (ED50 expresada en Unidades Internacionales/dosis) Tipo 1 Tipo 2 Tipo 3 Ref. Poliorix 20.78 8.88 40.02 Ref.DTPaHBIPV 3.21 0.57 8.62 Potencia de IPV Descripción (ED50 expresada en Unidades Internacionales/dosis) Tipo 1 Tipo 2 Tipo 3 DTPWSF-HB-IPV Método de <1.93 0.64 <2.57 producción 3 La formulación de DTPwSF-HB-IPV (100 por ciento de IPV) presenta potencias del poliovirus inactivado mejores que la del poliorix de referencia, y similares o mejores que la referencia de DTPaHBIPV. Evaluación de la potencia del poliovirus inactivado con dosificaciones reducidas de poliovirus inactivado. Se mide la potencia mediante los métodos in vitro e in vivo descritos anteriormente. Se examinó la potencia mediante ELISA de una dosis reducida de poliovirus inactivado para ambas formulaciones de los métodos de producción 3 y 4 in vitro, y se comparó con la referencia de DTPalPVHB, como se muestra en la Tabla 9. Se probaron dos lotes para cada formulación para el método de producción 3. Se calculó el porcentaje de recuperación con respecto al contenido de antígeno tomado a partir del poliovirus inactivado a granel para cada formulación (por ejemplo, 40/8/32 para la formulación que contiene el 100 por ciento de poliovirus inactivado; 20/8/16 para la formulación que contiene el 50 por ciento de poliovirus inactivado; 10/4/8 para la formulación que contiene el 25 por ciento de poliovirus inactivado; 5/2/4 para la formulación que contiene el 12.5 por ciento de poliovirus inactivado).

Tabla 9 Muestra T1 T2 T3 Verificación Verificación Verificación Potencia de de que está Potencia de de que está Potencia de de que está polio (% de completa polio (% de completa polio (% de completa recuperación) (%de recuperación) (%de recuperación) (%de recuperación) recuperación) recuperación) DTPalPVHB 82% NP 99% NP 93% NP Referencia DTPwSF- HB-IPV 1 "Método de 48% 47% 94% <5% 24% 74% producción 3" 100% IPV DTPwSF- HB-IPV 2 80% <5% 100%, <5.0% 81% 17% "Método de Muestra T1 T2 T3 Verificación Verificación Verificación Potencia de de que está Potencia de de que está Potencia de de que está polio (% de completa polio (% de completa polio (% de completa recuperación) (%de recuperación) (%de recuperación) (%de recuperación) recuperación) recuperación) producción 3" 100% IPV DTPwSF-HB-IPV 1 "Método de 48% 31% 98% <5% 29% 64% producción 3" 50% IPV DTPwSF-HB-IPV 2 "Método de 71% <5% 99% <5% 91% >5% producción 3" 50% IPV DTPwSF-HB-IPV 1 "Método de 54% 34% 115% <5% 33% 71% producción 3" 25% IPV DTPWSF- 81% <5% 115% <5% 107% <5% Muestra T1 T2 T3 Verificación Verificación Verificación Potencia de de que está Potencia de de que está Potencia de de que está polio (% de completa polio (% de completa polio (% de completa recuperación) (%de recuperación) (%de recuperación) (%de c ? recuperación) recuperación) recuperación) HB-I PV 2 "Método de producción 3" 25% IPV 0 DTPwSF- HB-I PV "Método de 50% 24% 1 10% <5% 28% 60% producción 3" 12.5% 5 I PV DTPwSF- HB-I PV "Método de 41 % 48% 93% <5% 23% 51 % 0 producción 4" 100%I PV DTPWSF- HB-I PV 47% 37% 98% <5% 28% 69% "Método de 5 Muestra T1 T2 T3 Verificación Verificación Verificación Potencia de de que está Potencia de de que está Potencia de de que está polb (% de completa polio (% de completa polio (% de completa recuperación) (%de recuperación) (%de recuperación) (%de D c recuperación) recuperación) recuperación) producción 4" 50% I PV DTPWSF- HB-I PV 0 "Método de 51 % 28% 80% <5% 33% 61 % producción 4" 25% I PV DTPWSF- HB-I PV 5 "Método de 42% 22% 100% <5% 40% 58% producción 4" 12.5% I PV 0 Placebo "Método de producción 86% <5% 98% <5% 107% <5% 5" 100% I PV 5 Muestra T1 T2 T3 Verificación Verificación Verificación Potencia de de que está Potencia de de que está Potencia de de que está polio (% de completa polio (% de completa polio (% de completa recuperación) (%de recuperación) (%de recuperación) (%de D c recuperación) recuperación) recuperación) Placebo "Método de 94% <5% 110% <5% 111 % <5% producción 5" 50% IPV 0 Placebo "Método de 80% <5% 100% <5% 104% <5% producción 5" 25% IPV Placebo 5 "Método de producción 72% <5% 100% <5% 98% <5% 5" 12.5% IPV La Tabla 9 muestra que la verificación de que está completa la adsorción es similar para todas las dosis de poliovirus inactivado. El Tipo 1 y el Tipo 3 son fuertemente desorbidos (17 por ciento - 74 por ciento), mientras que el Tipo 2 se queda bien adsorbido. Los tres tipos son bien adsorbidos para la formulación de placebo para todas las dosis de poliovirus inactivado. La adsorción es similar que para la vacuna de referencia de DTPalPVHB. Existe una variabilidad de la verificación de que está completa en el poliovirus inactivado, debido al hecho de que el método de cuantif icación de verificación de que está completa no está validado para las formulaciones de DTPwHB IPV ni para las concentraciones más bajas de poliovirus inactivado (<40/8/32 unidades de antígeno D/0.5 mililitros). Se examinó la potencia relativa (expresada en comparación con la vacuna de Poliorix de referencia) de una dosis reducida de poliovirus inactivado para ambas formulaciones de los métodos de producción 3 y 4 in vivo, en comparación con las formulaciones de referencia, como se muestra en las Figuras 1 y 2. Se probaron dos lotes para cada formulación para el método de producción 3. La Figura 1 muestra que la potencia del poliovirus inactivado de DTPwSF-HB-IPV con el 100 por ciento de poliovirus inactivado es ligeramente mayor que la potencia del poliovirus inactivado en DTPaHBIPV. Se puede ver que la potencia del poliovirus inactivado de DTPwSF-HB-IPV al 50 por ciento a partir de la formulación del método de producción 3 es similar al DTPaHBIPV al 100 por ciento. La potencia del poliovirus inactivado para DTPwSF-HB-IPV al 25 por ciento del método de producción 3 es ligeramente más baja que para el Poliorix®. También se encontró que el 12.5 por ciento de la dosis de poliovirus inactivado no fue suficiente para obtener una buena potencia del poliovirus inactivado. La Figura 2 muestra que la potencia del poliovirus inactivado es similar para la formulación del método de producción 3, y para la formulación del método de producción 4. También se muestra que existe una tendencia a tener una mejor potencia para el placebo que para DTPwSF-HB-IPV. Por consiguiente, estos datos confirman que es suficiente una dosis reducida de poliovirus inactivado para obtener una buena potencia in vivo. Ejemplo 2: Factibilidad de no utilizar tiomersal en las vacunas de la invención. La prueba de eficacia conservadora (PET) permite hacer la demostración de la actividad antimicrobiana de la vacuna probada. La prueba consiste en: Estímulo de la preparación de vacuna, en su paso de recipiente final, con un inoculo prescrito de microorganismos adecuados, Almacenamiento de la preparación inoculada a una temperatura prescrita, Retiro de muestras del recipiente a intervalos de tiempo especificados, y conteo de los organismos en las muestras tomadas. El procedimiento de prueba de eficacia conservadora se describe en la Farmacopea Europea (5.1.3), y en la USP (<51>). De acuerdo con estos lineamientos, se evalúa la actividad antimicrobiana mediante la comparación de la reducción en el número de microorganismos viables con los criterios mencionados en la siguiente tabla (Tabla 7).

Tabla 7 Criterios de EP y USP Nr*: No se recuperó. Ni: No aumentó.

Ejemplo 3: Efecto del componente de Hib sobre la potencia del poliovirus inactivado y sobre la estabilidad del poliovirus inactivado a través del tiempo. Se midió la potencia relativa del poliovirus inactivado como se describe en el Ejemplo 1 , para determinar los efectos que pueda tener el componente de Hib sobre la potencia del poliovirus inactivado, y para evaluar la estabilidad del poliovirus inactivado a través del tiempo con diferentes dosis de poliovirus inactivado. Las vacunas investigadas fueron DTPwHBIPV (40-8-32), DTPwHBIPV con Hib reconstituido y almacenado durante 8 meses, DTPwHBIPV (20-4-16), DTPwHBIPV (20-4-16) con Hib reconstituido y almacenado durante 8 meses, DTPwHBIPV (20-4-16) y almacenado durante 8 meses, DTPwHBIPV (10-2-8) y DTPwHBIPV (10-2-8) con Hib reconstituido y almacenado durante 8 meses. Los valores de potencia relativa se midieron en relación con DTPalPVHB (Pediarix) (Figura 3a) o con Poliorix (Figura 3b). Se encontró que el componente de Hib no tiene impacto alguno sobre la potencia del poliovirus inactivado. Se encontró que la potencia relativa del poliovirus inactivado se mantiene a los 8 meses (Figura 3).

Ejemplo 4: Efecto de la proporción de AIP0 /AI(OH)3 sobre el aspecto visual, la adsorción de D y T, y la potencia del poliovirus inactivado. Se llevaron a cabo formulaciones con cambios en la composición de aluminio. La formulaciones de DTPWSF-HB-IPV normalmente contienen 630 microgramos de aluminio: 560 microgramos de Al3+ como AIP04, 70 microgramos de Al3+ como AI(OH)3. Se utilizan sales de aluminio para adsorber D, T, Pw, y HBsAg. Se agregan 115 microgramos de Al3+ del AIP04 libre durante la formulación. Las formulaciones se llevaron a cabo con las siguientes proporciones de Al3+ libre.

Tabla 10 Proporción de AIP04/AI(OH)3 Tabla 11 Método de producción para DTPwHB-IPV Paso Método de producción 3: DTPwSF-HB-IPV Agua para inyección para alcanzar un volumen 1 de dosis final de 0.5 mililitros.

Agregar NaCI 1.5M para alcanzar una 2 concentración final de 150 mM. 3 Agregar 115 microgramos de Al3+ en diferentes Paso Método de producción 3: DTPWSF-HB-IPV concentraciones de AI(OH)3/AIP04. 4 Agregar 10 microgramos de HBsAg adsorbido. 5 Agregar 7.5 Lf de toxoide de difteria adsorbido.

Agregar 3.25 Lf de toxoide de tétanos 6 adsorbido. 7 Agitación.

Agregar el poliovirus inactivado en una dosis 8 de 40/8/32 Unidades Internacionales. 9 Agitación. 10 Ajustar el pH a 6.5 + 0.1. 11 Agitación. 12 Agregar 20 IOU de Pw adsorbido. 13 Agitación. 14 Almacenar de +2°C a +8°C.

Se observó el aspecto visual y, hasta la proporción de 69/46, iene una acumulación aceptable. Las formulaciones se llevaron a cabo con el mismo método de producción y un intervalo de dosis para el poliovirus inactivado entre el 0 por ciento y el 100 por ciento de la dosis regular de poliovirus inactivado. El porcentaje de adsorción de los toxoides de D y T se midió mediante ELISA. La estabilidad de la adsorción fue seguida por un tratamiento de 7 días a 37°C. Los resultados se presentan en las Tablas 12 y 14.

Tabla 12 Porcentaje de desorción de toxoide de D en DTPwHB-IPV con el intervalo de dosis del poliovirus inactivado PROPORCIÓN DE AI(OH)3/AIP04 Dosis de IPV 0/115 23/92 46/69 T0 7d37°C T0 7d37°C T0 7d37°C 0% <1% 25% <1% 6% / 25% <1% 29% <1 % 15% <1% 5% PWSF 50% 3% 41% <1% 26% <1% 17% 100% 4% 49% <1% 23% <1% 11% Tabla 13 Porcentaje de desorción del toxoide de T en DTPwHB-IPV intervalo de dosis de poliovirus inactivado Siguió la adsorción del poliovirus inactivado. La estabilidad de adsorción fue seguida por un tratamiento de 21 días a 25°C.

Tabla 14 Porcentaje de desorción del poliovirus inactivado en DTPwHB- IPV con un intervalo de dosis de poliovirus inactivado Estimación de Ag no adsorbido IPV PROPORCIÓN DE AI(OH)3/AIP04 0/115 23/92 46/69 Dosis Tipo T0 21d25°C T0 21d25°C T0 21d25°C 0% N/A N/A N/A N/A N/A ACUMULACIÓN Tipo 1 -10-20% -20-30% -10-20% -20-30% <10% -20-30% 25% Tipo 2 <10% <10% <10% <10% <10% <10% Tipo 3 >30% >30% -20-30% >30% <10% >30% Tipo 1 >30% >30% -10-20% >30% -10-20% >30% 50% Tipo 2 -10-20% -10-20% <10% <10% <10% <10% Tipo 3 >30% >30% -10-20% >30% -10-20% >30% Tipo 1 >30% >30% -10-20% >30% -10-20% >30% 100% Tipo 2 -10-20% -10-20% <10% <10% <10% <10% Tipo 3 >30% >30% -20-20% >30% 30% >30% El aumento del contenido de AI(OH)3 en las formulaciones permite tener una mejora de adsorción para D, T, e IPV. La mejor proporción de adsorción obtenida fue con la proporción de AI(OH)3/AIP04 de 46/69. En esta proporción: • La adsorción de T y D está completa en el TO. La desorción después de un estudio de estabilidad acelerada de 7 días a 37°C presenta un <20 por ciento de desorción para D, un <30 por ciento para T. • Cada tipo de poliovirus inactivado es adsorbido. La desorción del Tipo 3 ocurre a los 21 días a 25°C. Se probaron las formulaciones con la proporción de 46/69 in vivo, y se compararon con Tetravac, Poliorix, y una vacuna de DTPalPV. Tabla 15 Resultados de potencias in vivo Muestra ED50 Tipo 1 Tipo 2 Tipo 3 DTPw-HB-IPV 100%/HIB <1.93 <0.64 2.57 Proporción 46/69 DTPw-HB-IPV <1.59 0.46 <1.67 50%/HIB Muestra ED50 Tipo 1 Tipo 2 Tipo 3 Proporción 46/69 DTPw-HB-IPV 25%/HIB 3.08 0.96 3.25 Proporción 46/69 Tetravac 8.53 0.39 9.15 Poliorix 9.52 2.64 15.06 DTPaHBIP V <5.18 <0.64 15.01 No hay diferencias significativas (EC50) entre las formulaciones de DTPw-HB-IPV. Los DTPaHBIPV, Tetravac, y Poliorix dan resultados similares, inferiores a las formulaciones de DTPwHBIPV (excepto por el Tipo 2 para el cual las formulaciones son equivalentes) . Ejemplo 5: Evaluación clínica de la vacuna de investigación de DTPwHB-IP V/Hib con dosificaciones reducidas de poliovirus inactivado. Se planea un estudio de factibilidad en Fase II, para evaluar la inmunogenicidad, la reactogenicidad, y la seguridad de tres formulaciones diferentes de la vacuna de DTPw-HBV-IPV/Hib de investigación de GSK Biologicals, comparándose con las vacunas comerciales de DTPw-HBV/Hib e IPV administradas de una manera concomitante. • Indicación/Poblaciones: Inmunización primaria para bebés sanos en la primera semana de vida contra las enfermedades de difteria, tétanos, tosferina, Hepatitis B, poliomielitis, y Haemophilus influenzae tipo b. Grupos de estudio: Vacuna de DPTw-HBV-IPV (dosis estándar)/Hib. Vacuna de DTPw-HBV-IPV (49 por ciento de dosis estándar)/H¡b. Vacuna de DTPw-HBV-IPV (26 por ciento de dosis estándar)/Hib. Vacunas de DTPw-HBV/Hib + IPV. • Objetivos Co-primarios: Los objetivos co-primarios se evaluarán de una manera en secuencia: es decir, los segundo y tercer objetivos se evaluarán solamente si se ha satisfecho el anterior. Demostrar la no inferioridad de la vacuna de DTPw-HBV-IPV (dosis estándar)/Hib para la vacuna de poliovirus inactivado coadministrada con la vacuna de DTPw-HBV/Hib en términos de respuesta al anticuerpo para los tres tipos de poliovirus, un mes después del curso de vacunación primaria. El objetivo de la no inferioridad se alcanzará si el límite superior del Cl al 95 por ciento asintótico estandarizado sobre la diferencia entre grupos (DTPw-HBV/Hib + IPV menos DTPw-HBV-IPV (dosis estándar)/Hib) en términos de índices de seroprotección para cada uno de los tres tipos de poliovirus es de <10 por ciento. V Demostrar la no inferioridad de la vacuna de DTPw-HBV-IPV (49 por ciento de la dosis estándar)/Hib para la vacuna de poliovirus ¡nactivado co-administrada con la vacuna de DTPw-HBV/Hib en términos de respuesta al anticuerpo para los tres tipos de poliovirus, un mes después del curso de vacunación primaria. El objetivo de la no inferioridad se alcanzará si el límite superior del Cl al 95 por ciento asintótico estandarizado sobre la diferencia entre grupos (DTPw-HBV/Hib + IPV menos DTPw-HBV-IPV (49 por ciento de la dosis estándar)/Hib) en términos de índices de seroprotección para cada uno de los tres tipos de poliovirus es de <10 por ciento. Demostrar la no inferioridad de la vacuna de DTPw-HBV-IPV (26 por ciento de la dosis estándar)/Hib para la vacuna de poliovirus ¡nactivado co-administrada con la vacuna de DTPw-HBV/Hib en términos de respuesta al anticuerpo para los tres tipos de poliovirus, un mes después del curso de vacunación primaria. El objetivo de la no inferioridad se alcanzará si el límite superior del Cl al 95 por ciento asintótico estandarizado sobre la diferencia entre grupos (DTPw-HBV/Hib + IPV menos DTPw-HBV-IPV (26 por ciento de la dosis estándar)/Hib) en términos de índices de seroprotección para cada uno de los tres tipos de poliovirus es de <10 por ciento.

• Objetivos Secundarios: Inmunogenicidad Evaluar la inmunogenicidad de la vacuna candidata de DTPw-HBV-IPV/Hib en términos de la respuesta a todos los antígenos de vacuna, en comparación con las vacunas de DTPw-HBV/Hib y de IPV co-administradas. Reactogenicidad Evaluar la reactogenicidad y seguridad de las vacunas en estudio, en términos de síntomas solicitados, síntomas no solicitados, y eventos adversos graves. • Programa de Vacunación Programa de vacunación primaria de tres dosis a las 6, 10, y 14 semanas de edad. Todos los sujetos reciben una dosis de Hepatitis B al nacer. • País: Filipinas. • Muestreo de Sangre: Antes y después de la vacunación 3. • Formulaciones de Vacuna: Tabla 16 Formulaciones de vacunas Vacuna Formulación/Dosis Presentación Volumen DTPw-HBV- Toxoide de difteria: no Líquido blancuzco 0.5 mililitros de IPV/Hib de GSK menos de 30 IU (7.5 Lf). en frascos de una la vacuna Vacuna Formulación/Dosis Presentación Volumen Biologicals Toxoide de tétanos: no sola dosis. reconstituida. menos de 60 IU (3.25 Lf). Bordetella pertussis, muerta: no menos de 4 IU (20 OU). r-ADN HBsAg: 10 g. Aluminio como sales: 0.66 mg.

Componente de Poliovirus inactivado tipo IPV (dosis 1 : 40 unidades de estándar) antígeno D. Poliovirus inactivado tipo 2: 8 unidades de antígeno D. Poliovirus inactivado tipo 3: 32 unidades de antígeno D.

Componente de 49 por ciento de dosis IPV (49 por estándar completa de IPV ciento de dosis (40-8-32). estándar) Vacuna Formulación/Dosis Presentación Volumen Componente de 26 por ciento de dosis IPV (26 por estándar completa de IPV ciento de dosis (40-8-32). estándar) Conjugado de polisacárido Gránulo secado capsular de Haemophillus por congelación en influenzae tipo b: 2.5 pg. frascos de una sola y toxoide de tétanos: 5-10 dosis.

Lactosa: 12.6 mg. Aluminio como sales: 30 DTPw-HBV- Toxoide de difteria: no Líquido blancuzco 1 mililitro de la IPV/Hib menos de 30 IU (7.5 Lf). en frascos de dos vacuna (ZilbrixMR Hib) Toxoide de tétanos: no dosis. reconstituida. de GSK menos de 60 IU (3.25 Lf). Biologicals Bordetella pertussis, muerta: no menos de 4 IU (20 OU). r-ADN HBsAg: 10 pg. Aluminio como sales: 0.66 mg.

Vacuna Formulación/Dosis Presentación Volumen Tiomersal: 8 pg.

Conjugado de polisacárido Gránulo secado capsular de Haemophillus por congelación en influenzae tipo b: 2.5 pg. frascos de dos y toxoide de tétanos: 5-10 dosis. pg- Lactosa: 12.6 mg. Aluminio como sales: 30 pg- IPV de GSK Poliovirus inactivado tipo Líquido blancuzco 0. 5 mililitros.

Biologicals 1 : 40 unidades de en frascos de una (Pol¡or¡xMR) antígeno D. sola dosis. Poliovirus inactivado tipo 2: 8 unidades de antígeno D. Poliovirus inactivado tipo 3: 32 unidades de antígeno D. 2-fenoxi-etanol, máximo 2.5 mg. Polisorbato, máximo 5 pg. Formaldehído, máximo Vacuna Formulación/Dosis Presentación Volumen 100 Mg. Suero regulado con fosfato. Contiene aminoácidos para inyección, cantidad suficiente hasta 0.5 mililitros.

PRE-ADSORCIÓN DE LOS ANTÍGENOS La formulación de DTPw-HBV-IPV combina el toxoide de difteria, el toxoide de tétanos, tres cepas de Bordetella pertussis, el antígeno superficial mayor purificado (HBsAg) del virus de Hepatitis B (HBV), y el poliovirus inactivado (IPV). Estos antígenos, excepto el poliovirus inactivado, se pre-adsorbieron primero sobre sal de aluminio antes de mezclarse con la sal de aluminio, el regulador de cloruro de sodio, y agua para inyección. Adsorción del toxoide de difteria El concentrado purificado de difteria se adsorbió sobre fosfato de aluminio en una proporción de 15 Lf de toxoide difteria/0.15 miligramos de Al3+. Los dos componentes se agitaron durante 15 hasta 45 minutos a temperatura ambiente. El pH se ajustó a un pH de 5.1 ± 0.1, seguido por agitación durante 15 hasta 45 minutos. La mezcla se almacenó durante una semana a 37°C. Después de agitar durante 15 hasta 45 minutos a temperatura ambiente, el pH se ajustó a un pH de 6.1 + 0.1. El concentrado adsorbido se almacenó a +2°C -+ 8°C durante cuando menos 7 días antes de la formulación final de la vacuna de DTPw-HB-IPV. La Figura 1 que se encuentra posteriormente resalta el proceso de manufactura de adsorción del volumen de difteria previamente adsorbido. Diagrama de flujo de adsorción de toxoide de difteria AIP04 ? D (15 Lf/0.15 mg Al3+) I Agitación durante 15 hasta 45 minutos a temperatura ambiente 1 Ajusfar y verificar el pH (5.1 + 0.1) 4 Agitación durante 15 hasta 45 minutos a temperatura ambiente 4 Adsorción durante 7 días a 37°C l Agitación durante 15 hasta 45 minutos a temperatura ambiente i Ajusfar y verificar el pH (6.1 + 0.1) l Almacenar un mínimo de 7 días a +2°C - +8°C antes de la formulación Adsorción de toxoide de tétanos El concentrado de tétanos purificado se adsorbió sobre hidróxido de aluminio en una proporción de 3.25 Lf/0.07 mg de Al3+. Los dos componentes se agitaron durante 15 hasta 20 minutos. El pH se ajustó a un pH de 6.1 + 0.1. La mezcla se almacenó bajo agitación durante 16 hasta 24 horas a temperatura ambiente. Se agregó una solución en cloruro de sodio de una concentración nominal de 1,500 mM (hasta 150 mM). Después de agitar durante 15 hasta 45 minutos a temperatura ambiente, el pH se ajustó a 6.1 + 0.1. El concentrado adsorbido se almacenó a +2°C - +8°C durante cuando menos 14 días antes de la formulación final de la vacuna de DTPw-HBV-IPV. Diagrama de flujo de adsorción de toxoide de tétanos AI(OH)3 l T (3.25 Lf/0.07 mg Al3+) I Agitación durante 15 hasta 20 minutos a temperatura ambiente I Ajustar y verificar el pH a 6.1 + 0.1 4 Agitación durante 16 horas hasta 24 horas a temperatura ambiente I NaCI 1500 mM (hasta 150 mM) l Agitación durante 15 hasta 45 minutos a temperatura ambiente I Ajustar y verificar el pH (6.1 + 0.1) I Almacenar un mínimo de 14 días a +2°C - +8°C antes de la formulación Adsorción del antígeno de Hepatitis B. El volumen de HBsAg purificado estéril se mezcló con una suspensión estéril de fosfato de aluminio con el objeto de obtener una suspensión que contiene, por 10 microgramos de HBsAg, 0.2 miligramos de Al3+ (como fosfato de aluminio), NaCI 150 mM, en un volumen final de aproximadamente 50 microlitros. Procedimiento de adsorción de HBsAg HBsAg (10 g/0.5 mi) I Al3+ (0.2 mg/0.5 mi) (AIP04) I Agitación durante 15 a 20 minutos a temperatura ambiente I Ajustar y verificar el pH (5.3 + 0.1) l Agitación durante 16 a 24 horas a temperatura ambiente l Ajustar el pH a 6.1 + 0.1 I Almacenar durante 14 días a temperatura ambiente I Almacenamiento a 4°C Adsorción del antígeno de Pw. La solución de AIP04 se transfirió asépticamente a un recipiente estéril. La solución se agitó durante 5 a 10 minutos, y el pH se ajustó a 6.5 + 0.1 con HCI 1M o con HCI 0.5M directamente en el recipiente. La solución se agitó durante 15 a 20 minutos. El pH se verificó (6.5 + 0.1) y se ajustó si era necesario. Antes de la adsorción, se mezcló la cosecha reservada de tosferina (PPH) durante un mínimo de 15 minutos antes de usarse, y luego se agregó la PPH al recipiente estéril que contenía el AIP04. La suspensión se agitó durante un mínimo de 15 minutos a temperatura ambiente, y se pudo almacenar durante la noche a temperatura ambiente. Si el producto se almacenaba durante la noche a temperatura ambiente, se tenía que volver a suspender durante un mínimo de 30 minutos antes de la distribución. Se tomaron muestras para la prueba. El volumen adsorbido de Pw se distribuyó en frascos de vidrio estériles, y se almacenaron a 2-8°C.

Diagrama de flujo de adsorción de Pw Transferir AIP0 a un recipiente de acero inoxidable estéril I Ajusfar el pH a 6.5 + 0.1 l Agitación durante 15 a 20 minutos a temperatura ambiente 1 Verificar el pH y ajusfar si es necesario (6.5; 0.1) i Agregar el PPH al recipiente de acero inoxidable estéril I Agitación durante mínimo 15 minutos a temperatura ambiente I Distribución en frascos de vidrio l Almacenamiento del Pw adsorbido a 2-8°C FORMULACIÓN FINAL DE DTPW-HBV-IPV El proceso se hizo como sigue: Se mezcló la solución de cloruro de sodio y agua para inyección con el objeto de alcanzar una concentración final de NaCI 150 mM. Se agregó AIP04 con el objeto de obtener una concentración de Al3+ libre de 0.15 miligramos/dosis. Se agregaron los concentrados adsorbidos de HEF, difteria, y tétanos, con el objeto de obtener una concentración final de 10 microgramos de HBsAg, 7.5 Lf de toxoide de difteria, y 3.25 Lf de toxoide de tétanos por dosis de 0.5 mililitros. Se agregó el poliovirus inactivado con el objeto de obtener una concentración final de 40/8/32 o de 19.6/3.9/15.7 o de 10.4/2.1/8.3 Ul/d. Agitación suave durante 60 hasta 120 minutos a temperatura ambiente. Se ajustó el pH a 6.5 + 0.1. - Agitación durante 15 hasta 20 minutos a temperatura ambiente. Se verificó el pH: 6.5 + 0.1. Se agregó el concentrado de Pw adsorbido con el objeto de obtener una concentración final de 20 IOU por dosis de 0.5 mililitros. Agitación durante 15 a 45 minutos a temperatura ambiente. Se midió el pH. El volumen final se almacenó entre +2°C y +8°C, hasta llenarse.

Diagrama de flujo de formulación de la vacuna de DTPw-HBV Agua para inyección hasta 0.5 mi l NaCI 1.5M a 150 mM I AIP04 (115 Al3+) l HBsAg adsorbido: 10 pg l Difteria adsorbida: 7.5 Lf I Tétanos adsorbido: 3.25 Lf ! IPV 40/8/32 ó 19.6/3.9/15.7 ó 10.4/2.1/8.3 lU/d I Agitación durante 60 minutos hasta 120 minutos a temperatura ambiente 1 Ajusfar y verificar el pH (6.5 + 0.1) 4 Pw adsorbido: 20 IOU I Agitación durante 15 minutos hasta 45 minutos a temperatura ambiente Ejemplo 6: Evaluación clínica de la vacuna de DTPa-HBV- IPV/Hib de investigación, con dosificaciones reducidas de HIV e IPV. Se planea un estudio de exploración en Fase II, para evaluar la inmunogenicidad, la reactogenicidad, y la seguridad de cuatro formulaciones diferentes de la vacuna de DTPa-HBV-IPV/Hib de investigación de GSK Biologicals contra la vacuna comercial de DTPa-HBV-IPV/Hib, y se administraron de una manera concomitante las vacunas comerciales de DTPw-HBV-IPV/Hib y de IPV. • Indicación/Poblaciones: Inmunización primaria de bebés sanos en la primera semana de vida contra las enfermedades de difteria, tétanos, tosferina, Hepatitis B, poliomielitis, y Haemophillus influenzae tipo b. · Grupos de Estudio: Vacuna de DTPa-HBV-IPV (49 por ciento de dosis estándar)/Hib: 5 microgramos. Vacuna de DTPa-HBV-IPV (49 por ciento de dosis estándar)/Hib: 2.5 microgramos. Vacuna de DTPa-HBV-IPV (26 por ciento de dosis estándar)/Hib: 5 microgramos. Vacuna de DTPa-HBV-IPV (26 por ciento de dosis estándar)/Hib: 2.5 microgramos. Vacuna de DTPa-HBV-IPV/Hib. Vacunas de DTPw-HBV/Hib + IPV. • Objetivos Primarios: Evaluar la inmunogenicidad de las vacunas candidatas de DTPa-HBV-IPV/Hib en términos de la respuesta al PRP y a los tres antígenos de polio (polio 1, 2, y 3).

• Objetivos Secundarios: Inmunogenicidad Evaluar la inmunogenicidad de todas las vacunas en estudio en términos de la respuesta a todos los antígenos de vacuna. Reactogenicidad Evaluar la reactogenicidad y la seguridad de las vacunas en estudio, en términos de síntomas solicitados, síntomas no solicitados, y eventos adversos graves. • Programa de Vacunación Programa de vacunación primaria de tres dosis a las 6 semanas de edad. Todos los sujetos reciben una dosis de Hepatitis B al nacer. • País: TBC. · Muestreo de Sangre: Antes y después de la vacunación 3. • Formulaciones de Vacuna: La vacuna está constituida de dos partes: una parte líquida (DTPa-HB-IPV) y una parte secada por congelación (Hib). Los D, T, PT, FHA, PRN, y HBsAg se pre-adsorben preliminarmente. Se mezclan agua y NaCI con los diferentes antígenos. La mezcla se agita para homogeneizarse, y se ajusta el pH. La composición final de la parte de DTPa-HB-IPV de la vacuna se presenta en la siguiente tabla.

Tabla 17 Composición para una dosis humana de 0.5 mililitros de DTPa- HBV-IPV El Hib se adsorbe previamente. El Hib previamente adsorbido se mezcla con sacarosa o lactosa antes del secado por congelación. La cantidad de Hib será de 2.5 ó de 5 ó de 10 microgramos por dosis humana. El contenido de aluminio será de 30 a 120 microgramos de Al3+ como AIP04 por dosis humana.

Claims

I 19 REIVINDICACIONES

1. Una vacuna de poliovirus inactivado, la cual comprende: (a) toxoide de difteria; (b) toxoide de tétanos; (c) Bordetella pertussis de células enteras muertas, sustancialmente libre de tiomersal; o dos o más componentes de tosferina acelulares (Pa) (por ejemplo, toxoide de tosferina (PT), hemaglutinina filamentosa (FHA), y pertactina (PRN)); y (d) poliovirus inactivado tipo 1 en una dosis mayor de 10 unidades de antígeno D y menos de 20 unidades de antígeno D.

2. La vacuna de la reivindicación 1, en donde el poliovirus inactivado tipo 1 está presente en del 26 al 49 por ciento, del 30 al 45 por ciento, del 33 al 40 por ciento, o del 35 al 37 por ciento de una dosis estándar de 40 unidades de antígeno D.

3. La vacuna de la reivindicación 1 ó 2, la cual comprende adicionalmente el poliovirus inactivado tipo 3 en una dosis de 8 a 20 unidades de antígeno D, de 9 a 19 unidades de antígeno D, de 10 a 18 unidades de antígeno D, de 11 a 17 unidades de antígeno D, de 12 a 16 unidades de antígeno D, o de 13 a 15 unidades de antígeno D; por ejemplo, de alrededor o exactamente 14 unidades de antígeno D.

4. La vacuna de la reivindicación 3, en donde el poliovirus inactivado tipo 3 está en una dosis mayor de 8 y menor de 20 unidades de antígeno D.

5. La vacuna de las reivindicaciones 1 a 4, la cual comprende adicionalmente el poliovirus inactivado tipo 2 en una dosis de 2 a 4 unidades de antígeno D.

6. La vacuna de la reivindicación 5, en donde el poliovirus inactivado tipo 2 está presente en una dosis mayor de 2 unidades de antígeno D y menor de 4 unidades de antígeno D, o en una dosis de alrededor o exactamente 3 unidades de antígeno D.

7. La vacuna de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el toxoide de difteria es adsorbido sobre hidróxido de aluminio o sobre fosfato de aluminio o sobre una mezcla de ambos.

8. La vacuna de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el toxoide de tétanos es adsorbido sobre hidróxido de aluminio o sobre fosfato de aluminio o sobre una mezcla de ambos.

9. La vacuna de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el Bordetella pertussis de células enteras muertas es adsorbido sobre hidróxido de aluminio o sobre fosfato de aluminio o sobre una mezcla de ambos.

10. La vacuna de las reivindicaciones 1 a 9, en donde los dos o más componentes de tosferina acelulares (Pa) (por ejemplo, toxoide de tosferina (PT), hemaglutinina filamentosa (FHA), y pertactina (PRN)), son adsorbidos sobre hidróxido de aluminio o sobre fosfato de aluminio o sobre una mezcla de ambos.

11. La vacuna de las reivindicaciones 1 a 10, la cual comprende el poliovirus inactivado tipo 1 adsorbido sobre hidróxido de aluminio o sobre fosfato de aluminio o sobre una mezcla de ambos.

12. La vacuna de las reivindicaciones 1 a 11, la cual comprende el poliovirus inactivado tipo 2 adsorbido sobre hidróxido de aluminio o sobre fosfato de aluminio o sobre una mezcla de ambos.

13. La vacuna de las reivindicaciones 1 a 12, la cual comprende el poliovirus inactivado tipo 3 adsorbido sobre hidróxido de aluminio o sobre fosfato de aluminio o sobre una mezcla de ambos.

14. La vacuna de las reivindicaciones 1 a 13, la cual comprende los poliovirus inactivados tipos 1, 2, y 3, adsorbidos sobre una sal de aluminio.

15. La vacuna de las reivindicaciones 1 a 14, la cual comprende los poliovirus inactivados tipos 1, 2, y 3, adsorbidos sobre hidróxido de aluminio o sobre fosfato de aluminio o sobre una mezcla de ambos.

16. La vacuna de las reivindicaciones 1 a 15, la cual comprende adicionaimente el antígeno superficial de Hepatitis B, sustancialmente libre de tiomersal, opcionalmente adsorbido sobre fosfato de aluminio.

17. La vacuna de las reivindicaciones 1 a 16, la cual comprende adicionaimente un conjugado de una proteína portadora y el sacárido capsular de Haemophilus influenzae tipo B (Hib), opcionalmente adsorbido sobre fosfato de aluminio o no adsorbido sobre un adyuvante.

18. La vacuna de las reivindicaciones 1 a 17, la cual comprende adicionalmente uno o más conjugados de una proteína portadora y un sacárido capsular de una bacteria seleccionada a partir del grupo de Neisseria meningitidis tipo A, Neisseria meningitidis tipo C, Neisseria meningitidis tipo W, y Neisseria meningitidis tipo Y, opcionalmente adsorbidos sobre hidroxido de aluminio o sobre fosfato de aluminio o sobre una mezcla de ambos, o no adsorbido sobre un adyuvante.

19. La vacuna de las reivindicaciones 1 a 18, la cual comprende adicionalmente una vesícula de membrana externa de Neisseria meningitidis tipo B (MenB) o lipo-oligosacárido o un sacárido capsular MenB conjugado, o un derivado de los mismos, opcionalmente adsorbido sobre hidroxido de aluminio o sobre fosfato de aluminio o sobre una mezcla de ambos, o no adsorbido sobre un adyuvante.

20. La vacuna de las reivindicaciones 1 a 19, la cual comprende adicionalmente un sacárido Vi de Salmonella typhi conjugado con una proteína portadora, opcionalmente adsorbido sobre hidroxido de aluminio o sobre fosfato de aluminio o sobre una mezcla de ambos, o no adsorbido sobre un adyuvante.

21. La vacuna de las reivindicaciones 1 a 20, la cual comprende adicionalmente un antígeno de Hepatitis A, opcionalmente adsorbido sobre hidroxido de aluminio o sobre fosfato de aluminio o sobre una mezcla de ambos.

22. Un método para prevenir o tratar una infección por poliovirus, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheria, y Bordetella pertussis, mediante la administración de la vacuna de las reivindicaciones 1 a 21 a un ser humano que lo necesite.

23. Un método para prevenir o tratar una infección por poliovirus, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheria, y Bordetella pertussis, y opcionalmente una o más de infección por Hepatitis B, Haemophilus influenzae b, Neisseria meningitidis tipo A, Neisseria meningitidis tipo C, Neisseria meningitidis tipo W, Neisseria meningitidis tipo Y, Neisseria meningitidis tipo B, Salmonella typhi, y Hepatitis A, mediante la administración de la vacuna de las reivindicaciones 1 a 21.

24. El uso de la vacuna de las reivindicaciones 1 a 21, en la fabricación de un medicamento para la prevención de una enfermedad causada por poliovirus, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheria, y/o Bordetella pertussis.

25. El uso de la vacuna de las reivindicaciones 1 a 21, en la fabricación de un medicamento para la prevención de una enfermedad causada por poliovirus, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheria, y Bordetella pertussis, y opcionalmente por una o más de Hepatitis B, Haemophilus influenzae b, Neisseria meningitidis tipo A, Neisseria meningitidis tipo C, Neisseria meningitidis tipo W, Neisseria meningitidis tipo Y, Neisseria meningitidis tipo B, Salmonella typhi, y Hepatitis A.

26. La vacuna, el método, o el uso de las reivindicaciones 1 a 25, en donde el poliovirus inactivado tipo 1 es a partir de la cepa Mahoney.

27. La vacuna, el método, o el uso de las reivindicaciones 1 26, en donde el poliovirus inactivado tipo 2, si está presente, es partir de la cepa MEF-1.

28. La vacuna, el método, o el uso de las reivindicaciones 1 27, en donde el poliovirus inactivado tipo 3, si está presente, es partir de la cepa Saukett.