ES2231991T3 - Modulo de trimerizacion. - Google Patents

Abstract

Un complejo polipeptídico trimérico que comprende tres polipéptidos monoméricos, en el que (i) cada uno de dichos polipéptidos monoméricos comprende un elemento estructural de trimerización de tetranectina (TTSE), siendo dicho TTSE un polipéptido que presenta una identidad entre su secuencia de aminoacidos y la secuencia consenso que se muestra en la Fig. 2 del 68%, y (ii) al menos uno de dichos polipéptidos monoméricos esta ligado covalentemente a, al menos, un resto heterólogo.

Description

Módulo de trimerización.

La presente invención se refiere al diseño de polipéptidos triméricos usando elementos estructurales polipeptídicos derivados de la familia de proteínas de la tetranectina y su uso en el diseño racional de novo de moléculas multifuncionales incluyendo la aplicación de las moléculas multifuncionales en la tecnología de bancos de proteínas, tal como la tecnología de presentación en fagos (phage display), sistemas diagnósticos y terapéuticos, tales como terapia génica humana y obtención de imágenes.

Antecedentes de la invención

La tetranectina es una lectina del tipo C trimérica que se une a Ca^{2+} que está presente en el plasma sanguíneo y en la matriz extracelular de ciertos tejidos. El grupo de proteínas de la tetranectina comprende tetranectina aislada en el hombre y en el ratón y los homólogos de lectina del tipo C con relación próxima aislados en el cartílago del ganado vacuno (Neame y Boynton, número de acceso de la base de datos PATCHX: u22298) y en el tiburón de arrecife (Neame y cols., 1992, Neame y cols., 1996 y número de acceso de la base de datos P26258 y PIR2: A37289).

La cadena polipeptídica de la tetranectina madura de 181 residuos aminoacídicos se codifica en tres exones tal como muestra el clonado y caracterización molecular del gen (Berglung y Petersen, 1992; Wewer y Albrechtsen, 1992). El exón 3 del gen de la tetranectina humana codifica una unidad funcional y estructural aparte, una forma alargada única denominada dominio de reconocimiento de carbohidratos (CRD) con tres puentes disulfuro intracatenarios. Se considera que el CRD de la tetranectina pertenece a una clase aparte de lectinas del tipo C (Day, 1994) que está claramente relacionada con las lectinas de tipo C por homología entre las secuencias, conservación de la topología de los disulfuros (Fuhlendorff y cols., 1987) y por la presencia de un conjunto de residuos aminoacídicos casi conservados que se sabe están implicados en la unión de los iones de calcio.

Una conferencia publicada (Holtet y cols. 1996) ha propuesto que la tetranectina es un trímero y que la trimerización está gobernada por el péptido codificado por el exón 1. Se propuso que el péptido codificado por el exón 1 era "necesario y suficiente para gobernar la trimerización" mientras que el polipéptido codificado por el exón 2 se propuso que estaba "implicado en la unión a plasminógeno sensible a lisina".

La tetranectina se identificó al principio como una proteína plasmática que se unía a plasminógeno al unirse al dominio kringle-4 del plasminógeno. Resultados recientes no publicados (Graversen y cols., manuscrito para PNAS) prueba (1) que el sitio de la tetranectina implicado en la unión a plasminógeno reside completamente en el dominio CRD (codificado por el exón 3), (2) que la unión es sensible al calcio y (3) que el sitio de unión a kringle-4 en la tetranectina solapa el sitio de unión a carbohidratos putativo del dominio CRD. Por lo tanto, existen ahora indicios definitivos y sorprendentes de que los exones 1 y 2 de TN, es decir, la unidad de trimerización de TN no exhibe afinidad de unión por el plasminógeno. En consecuencia, una proteína artificial que contenga una unidad del TTSE como parte de su arquitectura no es de esperar que interactúe con el plasminógeno o la plasmina debido a propiedades heredadas de la tetranectina.

También se ha reseñado que tetranectina se une a polisacáridos sulfatados como la heparina (Clemmensen (1989) Scand J. Clin. Lab. Invest. Vol 49: 719-725). Los inventores tienen resultados nuevos que demuestran que los dominios CRD de la tetranectina no están implicados en esta interacción entre la proteína y los polisacáridos. De hecho, el sitio de la tetranectina está localizado en la región terminal del extremo N del exón 1 y puede suprimirse mediante eliminación o mutagénesis de los residuos de lisina del extremo N (Graversen y cols., manuscrito), procedimientos que no inhiben la trimerización. TTSE que incluyen la mayoría o todo el exón 1 de TN por lo tanto, confieren afinidad por los polisacáridos sulfatados a cualquier proteína que comprenda un TTSE como parte de su estructura. Si se desea, sin embargo, esta afinidad puede reducirse o suprimirse mediante truncado o mutagénesis de los residuos de lisina del extremo N en la parte del TTSE que corresponde a los residuos aminoacídicos 8-10 del extremo N del exón 1 (Graversen y cols., sin publicar). Con respecto a la terapia génica que está también dentro del alcance de la presente invención, existe únicamente un número limitado de estrategias básicas para la terapia génica que podrían ser prometedoras en modelos preclínicos hasta la fecha. Las dos estrategias principales por ejemplo, para el tratamiento de tumores malignos son la vacunación contra tumores asistida por genes de citoquinas y la activación de profármacos selectiva. Mientras que la primera estrategia se basa en el fuerte efecto inmunoestimulador de un número relativamente pequeño de linfocitos T citotóxicos modificados genéticamente o células tumorales, la segunda se basa en la conversión de un profármaco no tóxico en un producto tóxico mediante un gen que codifica enzimas en la que el efecto tóxico se ejerce también sobre células tumorales que se dividen no trasducidas debido a un denominado efecto del espectador. De forma alternativa, pueden diseñarse estrategias en las que el fenotipo maligno de una célula se invierta ya sea inactivando un oncogén o reestableciendo un gen supresor de tumores inactivado. En ambos casos, es necesaria una transferencia génica muy eficiente a las células de un tumor. Aunque pueden obtenerse eficiencias elevadas de transferencia génica in vitro e incluso in vivo en ciertas circunstancias, la corrección del fenotipo maligno por inversión del cambio oncogénico principal en las células tumorales es poco probable que produzca células normales. De este modo, sería preferible la inducción de la muerte selectiva de células tumorales usando la presente invención y el desarrollo de procedimientos que permitan tal inducción tendrá gran
importancia.

Un problema principal relacionado con la terapia génica es la incorporación de material exógeno al genoma. Los virus, sin embargo, han tenido solamente un éxito parcial en la superación de este problema. Por lo tanto, los esfuerzos iniciales de la terapia génica están dirigidos todavía al diseño de virus de forma que pudieran ser utilizados como vectores para portar genes terapéuticos a pacientes. En el todavía muy inmaduro procedimiento in vivo de la terapia génica somática, en el que un vector podría inyectarse directamente en el torrente sanguíneo o, más preferiblemente, mediante administración transmucosa, la presente invención puede utilizarse debido al sorprendente número de formas en las que puede dirigirse la terapia génica.

Para muchas aplicaciones en la terapia génica futura, es probable que se use un sistema híbrido sintético que incorpore componentes víricos diseñados para lograr una unión y penetración en el núcleo específicas de diana, genes inmunosupresores de varios virus y algún mecanismo que permita una integración específica de sitio, quizá utilizando secuencias de AAV o una proteína integrasa retroviral diseñada. Además, las secuencias reguladoras de la célula diana misma se utilizarán para permitir un control fisiológico de la expresión de los genes insertados. Todos estos componentes se ensamblarían in vitro en una formulación tipo liposoma tomando medidas adicionales para reducir la capacidad inmunógena tal como ocultamiento mediante PEG.

Tal como se ha mencionado, uno de los problemas actuales de la terapia génica es la administración eficiente de ácidos nucleicos a todas las células que sea posible de una población específica de células del cuerpo y, a menudo, no es posible encontrar, por ejemplo, un vector vírico apropiado que encuentre esa población celular particular de forma eficiente y selectiva (Review on aspects of gene therapy: SCHAPER W e Ito, W. D. Current Opinion in Biotechnology, 1996, volumen 7, 635-640. Nature Biotechnology 1998 volumen 16 es un volumen completo dedicado a la administración de proteínas y genes).

Dada la posibilidad de la generación in vitro de un anticuerpo humano contra virtualmente cualquier antígeno diana mediante tecnología de macrófagos, se deduce que pueden usarse TTSE, en los que una de las subunidades se modifique con una entidad de integración o asociación a la membrana, como herramienta practicable para generar un vehículo lipomial ensamblado en bacterias o preferentemente ensamblado artificialmente que permitirá la administración selectiva del material contenido mediante infección o transfección de cualquier población celular contra la que pueda generarse un anticuerpo específico de ese tipo. Además, los vehículos pueden, con el uso del TTSE, individualizarse seleccionando los anticuerpos específicos de un paciente o ensamblando unidades del TTSE conjugadas con scFv que se seleccionan de un conjunto de anticuerpos seleccionados por los marcadores particulares de la enfermedad.

Sumario de la invención

Sorprendentemente los presentes inventores han encontrado que el polipéptido de la tetranectina humana (y sus derivados) es capaz de formar trímeros muy estables que tienen un número de características y usos ventajosos. De forma notable, la molécula de tetranectina incluye un elemento estructural de trimerización que puede usarse como vehículo de otras entidades químicas, proporcionando así una molécula portadora de una versatilidad no observada hasta la fecha.

El conocimiento publicado anteriormente en el campo de proporcionar polipéptidos de elección para la formación de trímeros incluye la descripción en el documento WO 95/31540 de Hoppe y Reid que describe un módulo de trimerización derivado de estructuras de hélices arrolladas de colectina y su aplicación al diseño de proteínas trimerizadas artificialmente. Varias áreas interesantes de aplicación son comunes a esa publicación de patente y a la presente descripción. Sin embargo, en varios aspectos, las propiedades de los módulos de trimerización derivados de la familia de proteínas de la tetranectina tal como se describen en la presente memoria son marcadamente diferentes en su arquitectura fundamental y representan propiedades sorprendentemente mejoradas comparadas con la unidad de trimerización de la colectina:

(1) Aunque las estructuras espaciales de ambos módulos de trimerización a un nivel superficial parecen similares porque ambas son estructuras de hélices arrolladas ternarias de tamaño espacial equivalente a grandes rasgos, la base estructural para adoptar esta configuración espacial es marcadamente diferente entre los dos grupos de proteínas. De hecho, es tan diferente, que la creencia habitual anterior al trabajo de Holtet y cols. sobre el entrecruzamiento de la tetranectina humana (Holtet y cols., 1996) era que esta familia de proteínas eran tetrámeros (de ahí el nombre). En consecuencia, las secuencias de la familia de la tetranectina de los módulos de trimerización no se ajustan al motivo común descrito para la familia de la colectina (documento WO 95/31450, página 8).

(2) La estabilidad térmica del módulo de trimerización de tetranectina (tal como se muestra en los ejemplos) es tal que puede demostrarse que el trímero existe incluso a 60ºC (Ejemplo 4, tetranectina trimerizada) o a aproximadamente 70ºC (Ejemplo 3, ubicuitina trimerizada), mientras que una unidad de trímero de colectina se desintegra a aproximadamente 50-55ºC (documento WO 95/31540, Ejemplo 1, página 36 del mismo).

(3) Aunque sigue siendo incierto si el dominio de trimerización de la colectina posiblemente permite la unión de las parejas de fusión en los extremos C del módulo de trimerización y aunque no se ha reseñado ningún ejemplo de unión exitosa o que se haya reivindicado exitosa de una proteína exógena (excepto por el compañero de fusión de GST) a la región del extremo N del módulo de trimerización de tetranectina, la información que se describe en la presente memoria demuestra que el módulo de trimerización de tetranectina es más versátil porque permite la unión de proteínas exógenas a cualquiera, así como a ambos, extremo o extremos de forma simultánea (Ejemplos 1-4). Esto tiene consecuencias importantes ya que el módulo de trimerización de tetranectina puede utilizarse para construir moléculas que son capaces de interactuar (cada extremo con una valencia de unión de hasta 3) de forma simultánea con dos compañeros de interacción voluminosos tales como por ejemplo superficies celulares.

(4) La ausencia virtual de intercambio de subunidades entre monómeros de un trímero que ha sido trimerizado usando los módulos de trimerización de la tetranectina que se describen en la presente memoria se correlaciona, por los primeros principios de la termodinámica, con la sorprendentemente elevada estabilidad térmica del complejo. Por lo tanto será aparente que las ventajas inherentes a las aplicaciones de la tecnología de "escoger y mezclar", tal como se describe en la presente memoria, pueden usarse con resultados muy ventajosos debido a la vida útil en depósito esperada que es mucho mayor para los productos con funciones heterotípicas de la presente invención.

Las construcciones polipeptídicas CIIH6FXTN123, H6FXTN123, H6FXTN12 y H6FXTN23 que implican todas partes de la molécula de la tetranectina has sido preparadas previamente (véase por ejemplo el documento WO 94/18227), pero estas construcciones se han proporcionado todas con vistas a facilitar la expresión y/o purificación del resto derivado de tetranectina de las construcciones. Al mejor entender de los inventores, no existen publicaciones que reseñen uso alguno de derivados de tetranectina como "bloques de construcción" a los que pudieran acoplarse otros restos químicos de forma ventajosa.

Por lo tanto, en su aspecto más amplio, la presente invención se refiere a una construcción polipeptídica monomérica que comprende al menos un elemento estructural de trimerización de tetranectina (en lo sucesivo denominado TTSE) que esté unido covalentemente a, al menos, un resto heterólogo, siendo dicho TTSE capaz de forma un complejo estable con otros dos TTSE, con la condición de que el resto heterólogo sea diferente de cualquiera de las proteínas de fusión CIIH6FXTN123, H6FXTN123, H6FXTN12, H6FXTN23, cuyas secuencias se muestran en las SEC. ID. Nº: 24-27. Se prefiere que el resto heterólogo sea uno que no facilite exclusivamente la expresión y/o purificación de la construcción polipeptídica monomérica.

La invención se refiere además a moléculas oligoméricas que comprenden al menos dos construcciones polipeptídicas monoméricas y la invención se refiere también a procedimientos para preparar las construcciones polipeptídicas monoméricas y los oligómeros. La invención se refiere además a un kit que comprende construcciones polipeptídicas monoméricas en envases separados, listos para usar con una estrategia de uso de los monómeros de "escoger y mezclar". Esta estrategia de escoger y mezclar es para uso terapéutico así como diagnóstico, por ejemplo, la existencia de un tumor con un epítopo conocido y específico para el que hay disponible un anticuerpo. El kit puede comprender entonces un primer TTSE conjugado con un anticuerpo relevante, un segundo componente que puede comprender un TTSE acoplado a un compuesto de obtención de imágenes. En un segundo aspecto, el segundo componente puede comprender un fármaco o un profármaco relevante para tratar el tumor. En un aspecto adicional más, un tercer componente del TTSE que sea un compuesto de control, por ejemplo que indique el progreso del rastreo.

Como es claro a partir de esta ilustración, la presente invención se refiere a una gran cantidad de combinaciones que permiten un diseño individual para un gran número de circunstancias.

Finalmente, la invención se refiere también a fragmentos que incluyen secuencias de ácidos nucleicos que codifican las construcciones polipeptídicas monoméricas, así como a vectores y células que contienen estos fragmentos de ácidos nucleicos.

Leyendas de las figuras

Fig. 1: secuencia de aminoácidos de la región del extremo amínico de tetranectina.

Secuencia de aminoácidos (con códigos de una letra) desde E1 a L51 de tetranectina (SEC. ID. Nº: 7). El exón 1 comprende los residuos E1 a D16 y el exón 2, los residuos V17 a V49, respectivamente. La hélice alfa se extiende desde L51 a K52 que es el residuo aminoacídico del extremo C de la hélice alfa.

Fig. 2: Alineamiento de las secuencias de aminoácidos del elemento estructural de trimerización de la familia de proteínas de la tetranectina. Secuencias de aminoácidos (código de una letra) que corresponden a los residuos V17 a K52, que comprenden el exón 2 y los tres primeros residuos del exón 3 de la tetranectina humana (SEC. ID. Nº: 7); la tetranectina murina (Sørensen y cols., Gene, 152: 243-245, 1995); la proteína homóloga de la tetranectina aislada del cartílago del tiburón de arrecife (Neame y Boynton, 1992, 1996); y la proteína homóloga de la tetranectina asilada de cartílago bovino (Neame y Boynton, número de acceso de la base de datos PATCHX: u22298). Los residuos en las posiciones a y d de las repeticiones de heptadas se consignan en negrita. La secuencia consenso consignada del elemento estructural de trimerización de la familia de proteínas de la tetranectina comprende los residuos presentes en las posiciones a y d en las repeticiones de heptadas que se muestran en la figura además de los otros residuos conservados de la región. "hy" denota un residuo hidrófobo alifático.

Figura 3: Construcción de los plásmidos de expresión pTH6FXtripa y pTH6FXtripb.

Los fragmentos de ADN amplificados tripa y tripb que albergan la secuencia de aminoácidos de la tetranectina (SEC. ID. Nº: 7) desde E1 a T48 y E1 a K52, respectivamente, fusionados en el extremo 5' de las secuencias de nucleótidos que codifican un sitio de escisión IQGR para FX_{a} (SEC. ID. Nº: 4) y los sitios de reconocimiento de las endonucleasas de restricción BgIII y KpnI, se escindieron con las enzimas de restricción BclI y HindIII y se ligaron entre los sitios BamHI y HindIII del plásmido de expresión pT7H6 (Christensen y cols., 1991) usando procedimientos estándar.

Fig. 4: Secuencia prevista de aminoácidos de las proteínas de fusión H6FXtripa (SEC. ID. Nº: 28) y H6FXtripb (SEC. ID. Nº: 29) codificadas por los plásmidos de expresión pTH6FXtripa y pTH6FXtripb, respectivamente.

Fig. 5: Construcción de los plásmidos de expresión pTH6FXTN123 y pTCIIH6FXTN123.

El fragmento de ADN amplificado que corresponde al monómero de tetranectina maduro de longitud completa (SEC. ID. Nº: 7) desde E1 a V181 fusionado en el extremo 5' de las secuencias de nucleótidos que codifican un sitio de escisión de IEGR para FX_{a} (SEC. ID. Nº: 10) se cortó con las enzimas de restricción BamHI y HindIII y se ligó en los sitios correspondientes de los plásmidos de expresión pT7H6 (Christensen y cols., 1991) y pTCIIH6 usando procedimientos estándar. pTCIIH6 se derivó de pT7H6 sustituyendo el fragmento NdeI - HindIII de pT7H6 por el fragmento NdeI - HindIII de pLcII (Nagai y Thøgersen, 1987) que codifica los 32 primeros residuos de la proteína cII del fago lambda MVRANKRNEALRIESALLNKIAMLGTEKTAEG (SEC. ID. Nº: 11) fusionados en el extremo 3' de una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia H6 GSHHHHHHGS (SEC. ID. Nº: 12).

Fig. 6: Secuencia de aminoácidos prevista de las proteínas de fusión H6FXTN123 (SEC. ID. Nº: 25) y
CTIIH6FXTN123 (SEC. ID. Nº: 24) codificadas por los plásmidos de expresión pTH6FXTN123 y pTCIIH6FXTN123, respectivamente.

Fig. 7: Construcción de los plásmidos de expresión pTH6FXTN12, pTH6FXTN23 y pTH6FXTN3.

Los fragmentos de ADN amplificados que corresponden a los derivados de tetranectina TN12 y TN3 de E1 a V49 y A45 a V181, respectivamente (SEC. ID. Nº: 7) fusionados en el extremo 5' a las secuencias de nucleótidos que codifican el sitio de escisión de IEGR para FX_{a} (SEC. ID. Nº: 10) se cortó con las enzimas de restricción BamHI y HindIII y se ligó en los sitios correspondientes de los plásmidos de expresión pT7H6 (Christensen y cols., 1991) usando procedimientos estándar. El fragmento de ADN amplificado que corresponde al derivado de tetranectina TN23 de V17 a V181 (SEC. ID. Nº: 7) fusionado en el extremo 5' a las secuencias de nucleótidos que codifican el sitio de escisión de IQGR para FX_{a} (SEC. ID. Nº: 4) se cortó con las enzimas de restricción BamHI y HindIII y se ligó en los sitios correspondientes de los plásmidos de expresión pT7H6 (Christensen y cols., 1991) usando procedimientos estándar.

Fig. 8: Secuencia de aminoácidos prevista de las proteínas de fusión H6FXTN12 (SEC. ID. Nº: 26); H6FXTN23 (SEC. ID. Nº: 27) y H6FXTN3 (SEC. ID. Nº: 30) codificadas por los plásmidos de expresión pTH6FXTN12,
pTH6FXTN12, respectivamente.

Fig. 9: Análisis por filtración en gel de TN123, TN23 y TN3.

La filtración en gel para análisis de los derivados de tetranectina recombinantes TN123, TN23 y TN3 se realizó en una columna de Superose 12 HR 10/30 (Pharmacia, Suecia) con un volumen total de 25 ml en NaCl 100 mM y Tris-HCl 50 mM a pH 8 y un caudal de 0,2 ml/minuto. Las barras verticales en los máximos en los máximos de los picos identifican los perfiles de elución de cada una de las tres proteínas.

Fig. 10: Análisis de entrecruzamiento de TN123 y CIIH6FXTN123.

Muestras de TN123, CIIH6FXTN123 y mezclas de ambos se incubaron con DMSI y se analizaron por SDS-PAGE (gel al 12%). Antes de la adición de DMSI, se sometieron mezclas de proteínas a intercambio de subunidades incubando a 70ºC durante cantidades de tiempo variables. Marcador proteínico de 94, 68, 43 y 30 kDa, de la parte superior a la inferior (carril M). Proteína de fusión CIIH6FXTN123 (carril 1). TN123 (carril 2). CIIH6FXTN123 tratada con DMSI (carriles 3 y 6). TN123 tratada con DMSI (carril 4). Muestras idénticas de mezclas de CIIH6FXTN123 y TN123 tratadas con DMSI sin exposición térmica (carriles 5 y 7) y tratadas térmicamente durante 2,5 segundos, 15 segundos, 2,5 minutos y 10 minutos, respectivamente, antes del tratamiento con DMSI (carriles 8-11).

Fig. 11: Análisis de entrecruzamiento de los derivados recombinantes de tetranectina TN123, TN23, TN3 y H6FXTN12.

Las proteínas recombinantes TN123, TN23, TN3 y H6FXTN12 o mezclas de TN123 y cada una de las otras se analizaron por SDS-PAGE. Marcador proteínico de 94, 68, 43, 30, 20 y 14,4 kDa, de la parte superior a la inferior (carril M). TN123 entrecruzada con DMSI (carril 1). TN123 y H6-rTN12 entrecruzadas con DMSI sin y con tratamiento térmico a 70ºC durante dos minutos (carriles 2 y 3). H6FXTN12 entrecruzado con DMSI (carriles 4 y 5). Mezcla de TN123 y TN23 sin y con tratamiento térmico a 70ºC durante dos minutos (carriles 7 y 8). Entrecruzamiento de TN23 (carril 9). Mezcla de TN123 y TN23 sin entrecruzamiento (carril 10). TN123 entrecruzada con DMSI (carril 11). Entrecruzamiento de TN123 y TN3 sin y con tratamiento térmico durante dos minutos (carriles 12 y 13). Entrecruzamiento de TN3 (carril 14). Mezcla de TN123 y TN3, sin entrecruzamiento (carril 15).

Fig. 12: Análisis basado en el entrecruzamiento de la estabilidad térmica del trímero.

En experimentos paralelos TN123 y la proteína de fusión H6FXtripb-UB (SEC. ID. Nº: 31) se entrecruzaron con DMSI a temperaturas diferentes y las muestras se analizaron por SDS-PAGE. Marcador proteínico de 94, 68, 43, 30, 20 y 14,4 kDa, de la parte superior a la inferior (carril M). TN123 sin entrecruzamiento (carril 1). TN123 entrecruzado con DMSI durante 15 minutos a 37ºC, 50ºC, 60ºC y 70ºC (carriles 2 a 5), respectivamente. La proteína de fusión H6FXtripb-UB (SEC. ID. Nº: 31) sin entrecruzamiento (carril 6). H6FXtripb-UB entrecruzada con DMSI durante 15 minutos a 37ºC, 50ºC, 60ºC y 70ºC (carriles 7 a 10), respectivamente y H6FXtripb-UB incubada a 70ºC durante 15 minutos (carril 11).

Fig. 13: Construcción del plásmido de expresión pTH6FXtripb-UB.

El fragmento de ADN amplificado que comprende la secuencia de nucleótidos (SEC. ID. Nº: 16) que codifica la secuencia de aminoácidos de la ubicuitina (SEC. ID. Nº: 19) desde Q2 a G76 se cortó con las enzimas de restricción BclI y HindIII y se ligó entre los sitios BamHI y HindIII del plásmido de expresión pT7H6FXtripb (Ejemplo 1) usando procedimientos estándar.

Fig. 14: Secuencia de aminoácidos prevista de la proteína de fusión H6FXtripb-UB (SEC. ID. Nº: 31) codificada por el plásmido de expresión pTH6FXtripb-UB.

Fig. 15: Construcción del plásmido de expresión pTH6FXscFv (CEA6) tripb.

El fragmento de ADN, amplificado con el par de cebadores de las SEC. ID. Nº: 21 y 22, que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC. ID. Nº: 20 que codifica el anticuerpo monocatenario CEA6, scFv (CEA6), se cortó la secuencia de aminoácidos de Q1 a A261 con las enzimas de restricción de BamHI y KpnI y se ligó entre los sitios BgIII y KpnI del plásmido de expresión pT7H6FXtripb (Ejemplo 1) usando procedimientos estándar.

Fig. 16: Secuencia de aminoácidos prevista de la proteína de fusión H6FXscFv (CEA6) tripb codificada por el plásmido de expresión pH6FXscFv (CEA6) tripb.

Fig. 17: Construcción del plásmido de expresión pTH6FXtripbscFX (CEA6).

El fragmento de ADN, amplificado con los pares de cebadores que tienen las SEC. ID. Nº: 21 y 23, que comprenden la secuencia de nucleótidos (SEC. ID. Nº: 20) que codifican el anticuerpo monocatenario CEA6, scFv (CEA6), se cortó la secuencia de aminoácidos desde Q1 a A261 con las enzimas de restricción BamHI y HindIII y se ligó entre los sitios BamHI y HindIII del plásmido de expresión pT7H6FXtripb (Ejemplo 1) usando procedimientos estándar.

Fig. 18: Secuencia de aminoácidos prevista de la proteína de fusión H6FXtripbscFv (CEA6) codificada por el plásmido de expresión pH6FXtripbscFv (CEA6).

Fig. 19: Construcción del plásmido de expresión pTH6FXscFv (CEA6) tripbscFX (CEA6).

El fragmento de ADN, amplificado con el par de cebadores de las SEC. ID. Nº: 21 y 23, que comprende la secuencia de nucleótidos (SEC. ID. Nº: 20) que codifica el anticuerpo monocatenario CEA6, scFv (CEA6), se cortó la secuencia de aminoácidos desde Q1 a A261 con las enzimas de restricción BamHI y HindIII y se ligó entre los sitios BamHI y HindIII del plásmido de expresión pT7H6FXscFv (CEA6) tripb (Ejemplo 4) usando procedimientos estándar.

Fig. 20: Secuencia de aminoácidos prevista de la proteína de fusión H6FXscFv (CEA6) tripbscFv (CEA6) (SEC. ID. Nº: 34) codificada por el plásmido de expresión pH6FXscFv (CEA6) tripbscFv (CEA6).

Fig. 21: Análisis de entrecruzamiento de la proteína de fusión H6FXtripbscFv (CEA6) (SEC. ID. Nº: 33).

En experimentos paralelos se entrecruzaron las proteínas de fusión H6FXtripbscFv (CEA6) (SEC. ID. Nº: 33) y TN123 a temperatura ambiente durante 30 minutos con 0 mg/ml, 0,5 mg/ml, 1,0 mg/ml, 1,5 mg/ml y 2,0 mg/ml de DMSI, respectivamente. Carril 1: H6FXtripbscFv (CEA6) sin DMSI, H6FXtripbscFv (CEA6) con 0,5 mg/ml de DMSI (carril 2), H6FXtripbscFv (CEA6) con 1,0 mg/ml de DMSI (carril 3), H6FXtripbscFv (CEA6) con 1,5 mg/ml de DMSI (carril 4) y H6FXtripbscFv (CEA6) con 2,0 mg/ml de DMSI (carril 5). Marcador proteínico de 94, 68, 43, 30, 20 y 14,4 kDa, de la parte superior a la inferior (carril M). Carril 6: TN123 sin DMSI, TN123 con 0,5 mg/ml de DMSI (carril 7), TN123 con 1,0 mg/ml de DMSI (carril 8), TN123 con 1,5 mg/ml de DMSI (carril 9) y TN123 con 2,0 mg/ml de DMSI (carril 10).

Descripción detallada de la invención

El término "elemento estructural de trimerización" (TTSE) que se usa en la presente memoria descriptiva y reivindicaciones se pretende que se refiera a la porción de una molécula polipeptídica de la familia de la tetranectina que es responsable de la trimerización entre los monómeros del polipéptido de tetranectina. El término se pretende también que incluya variantes de un TTSE de un miembro natural de la familia de la tetranectina, variantes que han sido modificadas en su secuencia de aminoácidos sin afectar de forma adversa, en grado sustancial, las propiedades de trimerización comparadas con las de la molécula natural miembro de la familia de la tetranectina. Ejemplos específicos de variantes de ese tipo se describirán en detalle en la presente memoria pero, en general, se prefiere que el TTSE se derive de tetranectina humana, tetranectina murina, lectina tipo C de cartílago bovino o lectina tipo C de cartílago de tiburón. Se prefieren especialmente construcciones polipeptídicas monoméricas que incluyen al menos un TTSE derivado de tetranectina humana.

La secuencia polipeptídica de 49 residuos codificada por los exones 1 y 2 de tetranectina (Fig. 1) parece ser exclusiva del grupo de proteínas de la tetranectina (Fig. 2) ya que no se ha establecido homología significativa entre las secuencias y otras secuencias polipeptídicas conocidas. En la preparación de las investigaciones experimentales de la arquitectura de la tetranectina, se produjo una colección de proteínas recombinantes, incluyendo dicha colección tetranectina completa, el dominio de CRD (que corresponde aproximadamente al polipéptido codificado por el exón 3), un producto que corresponde al polipéptido codificado por los exones 2+3, un producto que corresponde a los exones 1+2 (Holtet y cols., 1996; Ejemplo 2). Tal como se detalla en el Ejemplo 2, los investigadores ahora tienen una noción diferente: tetranectina es de hecho un trímero, pero el polipéptido codificado por el exón 2 es capaz, de hecho, de efectuar la trimerización por si mismo tal como evidencia la observación de que la proteína recombinante que corresponde a los exones 2+3 es, de hecho, trimérica en solución.

El análisis de la estructura tridimensional de los cristales de la tetranectina recombinante de longitud completa (Nielsen y cols., 1996; Nielsen, 1996; Larsen y cols., 1996; Kastrup, 1996) ha demostrado que el polipéptido codificado en el exón 2 más tres residuos codificados en el exón 3 forman una estructura de triple hélice alfa arrollada.

A partir de la combinación de la secuencia y de los datos sobre la estructura, se hace evidente que la trimerización de la tetranectina es generada, de hecho, por un elemento estructural (Fig. 2), que comprende los residuos aminoacídicos codificados por el exón dos y los tres primeros residuos del exón 3 mediante una inusual secuencia de repeticiones de heptadas, que aparentemente es exclusiva de la tetranectina y otros miembros de su grupo: Esta secuencia de aminoácidos (Fig. 2) se caracteriza por dos copias de repeticiones de heptadas (abcdefg) con residuos hidrófobos en las posiciones a y d tal como otras hélices alfa arrolladas. Estas dos repeticiones de heptadas son seguidas en secuencia por una tercera copia inusual de la repetición de heptadas, en la que la glutamina 44 y la glutamina 47 no sólo sustituyen los residuos hidrófobos en las posiciones a y d, sino que están directamente implicadas en la formación de la estructura de enrollamiento arrollado en forma de triple hélice alfa. Estas repeticiones de heptadas están además flanqueadas por dos medias repeticiones con residuos hidrófobos en la posición d y a, respectivamente.

Se sabe que la presencia de residuos hidrófobos con ramificaciones beta en las posiciones a o d en un hélice alfa arrollada influye el estado de la oligomerización. En el elemento estructural de la tetranectina sólo está presente una valina conservada (número 37). En la posición de la secuencia 29 en la tetranectina, no parece preferirse ningún residuo alifático particular.

En resumen, es aparente que la estructura de hélice arrollada tricatenaria en la tetranectina en gran medida está gobernada por las interacciones que son inesperadas en lo que respecta a esas características entre el grupo de proteínas conocidas en forma de hélice arrollada.

Los TTSE forman moléculas triméricas sorprendentemente estables (Ejemplos 2, 3 y 4). Las observaciones experimentales, de que (1) una parte sustancial de las proteínas recombinantes existe en el estado oligomérico de -y puede entrecruzarse en forma de- moléculas triméricas incluso a 70ºC y (2) que el intercambio de monómeros entre los diferentes trímeros únicamente puede detectarse después de la exposición a temperatura elevada son indicios de una estabilidad extremadamente elevada del elemento estructural de la trimerización de tetranectina. Esta característica debe reflejarse en la secuencia de aminoácidos del elemento estructural. En particular, la presencia y posición de la repetición que contiene glutamina en el alineamiento secuencial de repeticiones de heptadas se consideran, junto con la presencia y posición relativa de los otros residuos conservados en la secuencia consenso (Fig. 2), importantes para la formación de estas moléculas triméricas estables. Para la mayoría de los usos prácticos, el residuo de cisteína 50 debería mutarse a serina, treonina, metionina o cualquier otro residuo aminoacídico para evitar la formación de un puente disulfuro no deseado entre cadenas que, eventualmente, produciría una multimerización, agregación y precipitación incontroladas de un producto polipeptídico que incluyera esta secuen
cia.

En particular, junto con el polipéptido codificado por el exón 1 de estabilización del trímero (residuos de tetranectina 1 a 16, véase el Ejemplo 2), el elemento estructural de trimerización de tetranectina es un módulo polipeptídico verdaderamente autónomo que mantiene su integridad estructural y su propensión a generar un complejo homotrimérico muy estable independientemente de que esté unido o no por un enlace peptídico a cualquiera o en ambos extremos a otras proteínas. Esta propiedad única se demuestra en los ejemplos que se acompañan, que proporcionan una prueba experimental de que las secuencias polipeptídicas derivadas de proteínas heterólogas pueden trimerizarse fácilmente cuando se unen en forma de proteínas de fusión al elemento estructural de trimerización de tetranectina. Esto sigue siendo válido independientemente de si las secuencias polipeptídicas heterólogas están situadas en el extremo amínico o en el extremo carboxílico del elemento de trimerización permitiendo la formación de un ensamblaje molecular que contiene hasta seis copias de una secuencia polipeptídica particular o de entidades funcionales o la formación de un ensamblaje molecular que contiene hasta seis secuencias polipeptídicas diferentes, contribuyendo cada con una sus propiedades funcionales individuales.

Dado que tres TTSE de la tetranectina humana natural forman una triple hélice alfa arrollada, se prefiere que el complejo estable formado por los TTSE de la invención forme también una triple hélice alfa arrollada.

La "familia de la tetranectina" son polipéptidos que comparten la secuencia consenso que se muestra en la Fig. 2 o una secuencia que sea homóloga, a nivel de secuencia, a esta secuencia consenso. Por lo tanto, se prefieren construcciones polipeptídicas monoméricas de la invención que comprendan una secuencia polipeptídica que tenga al menos una identidad entre la secuencia y la secuencia consenso que se muestra en la Fig. 2 del 68%, pero se prefieren identidades entre secuencias mayores, tales como al menos el 75%, al menos el 81%, al menos el 87% y al menos el 92%.

Con el término "resto heterólogo" se quiere decir en la presente memoria cualquier entidad química que pueda ligarse covalentemente a un TTSE y al que el TTSE no está unido covalentemente de forma natural. Por lo tanto, el resto heterólogo puede ser cualquier resto de interacción covalente conocido en la técnica por su capacidad de proporcionar las propiedades de unión, detección o efectoras deseadas. El resto heterólogo puede ser una estructura de unión de ligandos tal como una molécula de receptor o la parte de unión de ligandos de una molécula de receptor, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo de unión a antígenos o una molécula que tiene características de anticuerpo tales como, por ejemplo, los "diacuerpos" que se describen en el documento EP-A-0 672 142 u otras moléculas de unión de ligandos tales como avidina o estreptavidina, o una lectina; una toxina tal como ricina; un marcador detectable tal como una molécula marcada con fluorescencia, una molécula marcada radioactivamente, una molécula marcada enzimáticamente; una sustancia que puede activarse in situ, tal como una molécula que puede inducirse mediante un campo magnético o por radiación para que sea radioactiva o químicamente activa; una enzima tal como una peroxidasa; un resto radioactivo tal como una molécula que emite partículas \gamma, \alpha, \beta^{-} o \beta^{+}, por ejemplo, una molécula que comprende uno o más isótopos radioactivos que se seleccionan de ^{14}C, ^{3}H, ^{32}P, ^{33}P^{, 25}S, ^{38}S, ^{36}Cl, ^{22}Na, ^{24}Na, ^{40}K, ^{42}K, ^{43}K y cualesquiera isótopos que se utilizan convencionalmente con el fin de facilitar la detección de sondas o con el fin de proporcionar radiación localizada de forma que se efectúe la muerte celular; una citoquina tal como un interferón o un leucotrieno; PNA; un polímero no proteínico tal como un alcaloide polimérico, un polialcohol, un polisacárido, un lípido y una poliamina; un resto de fotoentrecruzamiento, es decir una entidad química que efectúa un entrecruzamiento al ser fotoactivado; y un grupo que facilita la conjugación de la construcción polipeptídica monomérica con una diana.

El resto heterólogo está preferiblemente ligado covalentemente al TTSE mediante un enlace peptídico al extremo N o C de la cadena peptídica del TTSE, mediante un enlace peptídico a una cadena lateral del TTSE o mediante un enlace a un residuo de cisteína, pero será útil cualquier forma de material de acoplamiento covalentemente material heterólogo a una cadena polipeptídica. El experto en la técnica conocerá tales posibilidades, por ejemplo, consultando las enseñanzas del documento WO 95/31540 a este respecto que se incorporan a la presente memoria como referencia.

Sin embargo, un aspecto interesante de la invención se refiere a una construcción polipeptídica monomérica de la invención que comprende dos restos heterólogos que se ligan mediante enlaces peptídicos al extremo N y C, respectivamente. Esta estrategia introduce un número de posibilidades en términos, por ejemplo, de ligamiento de entidades mayores con oligómeros de la invención acoplando actividades específicas a cada extremo de los monómeros (tal como se explica en detalle a continuación, los oligómeros de la invención pueden utilizar también una versión de este principio, en el que por ejemplo un extremo N y un extremo C de un oligómero se unen mediante enlaces peptídicos a restos heterólogos independientes).

En general, un complejo entre dos o tres monómeros se describe de la forma siguiente: tres monómeros que tienen un TTSE cada uno forman un trímero que se designa (1+1+1), mientras que un dímero formado entre un monómero con dos TTSE y un monómero con un TTSE se designa (1+2). Por supuesto pueden formarse otros trímeros (no deseados), por ejemplo (2+2+1), en los que dos TTSE no "se usan", pero se prefiere que los oligómeros de la invención usen todos su TTSE disponibles durante la formación de complejos. Debería notarse también que el término "construcción polipeptídica monomérica" se usa para designar una única cadena polipeptídica que puede tener o no grupos distintos de los peptídicos acoplados covalentemente a la cadena polipeptídica, mientras que "polipéptido dimérico" o "dímero", "polipéptido trimérico" o "trímero" y "oligómero" (es decir, un dímero o trímero) en el presente contexto se usa para designar complejos no covalentes de construcciones polipeptídicas monoméricas, es decir, las definiciones tradicionales de monómeros y multímeros no son de aplicación en la presente memoria descriptiva y reivindicaciones.

El TTSE tal como ejemplifica el exón 2 o los exones 1 y 2 de la tetranectina humana, preferiblemente modificado de tal forma que sólo pueda usarse la heterotrimerización entre subunidades diferentes (1+1+1) o (1+2) (véase la descripción más adelante) como mediadores de afinidad general, que puede acoplarse químicamente a cada miembro de una selección de moléculas diana. Después de una conjugación de ese tipo con TTSE, las moléculas diana pueden homotrimerizarse o heterotrimerizase según se desee para cualquier aplicación. Puede ser todavía más ventajoso un uso similar de la dimerización, usando como compañero un polipéptido que alberga dos secuencias del TTSE alineadas, separadas por una secuencia de conexión de longitud y carácter adecuados, ya que en un caso así sería posible un control absoluto de la estequiometría en la formación de complejos. Por lo tanto, una realización importante de la invención es una construcción polipeptídica monomérica de la invención que comprende 2 TTSE que están ligados covalentemente mediante un resto espaciador que permite que los 2 TTSE participen en la formación de complejos sin que un tercer TTSE sea parte de la construcción polipeptídica monomérica, pero igualmente importante es la realización de la invención en la que la construcción polipeptídica monomérica comprende un único TTSE, de forma que permita la trimerización entre tres monómeros y por lo tanto proporcione el grado óptimo de versatilidad con respecto al número de unidades funcionales que pueden incorporarse fácilmente a un único complejo.

En las realizaciones en las que hay presentes dos TTSE en el mismo monómero, se prefiere que el resto espaciador tenga una longitud y una conformación que favorezca la formación de complejos que implican los dos TTSE que están ligados covalentemente mediante el resto espaciador. De este modo, pueden disminuirse los problemas que surgen de la formación indeseada de trímeros con los formatos (2+1+1), (2+2+2) y (2+2+1) (en los que sólo un TTSE de cada monómero participa en la formación de complejos). El diseño y preparación de restos espaciadores adecuados son conocidos en la técnica y se efectúan convenientemente preparando polipéptidos de fusión que tienen el formato TTSE^{1}-espaciador-TTSE^{2}, en los que el resto espaciador es un fragmento polipeptídico (a menudo uno relativamente inerte) de forma que se eviten las reacciones no deseadas entre el espaciador y el entorno o los TTSE.

Un escenario típico, en el que una modificación de ese tipo puede ser ventajosa es el caso de la detección inmunológica en la que un conjugado químico de un anticuerpo con enzimas tales como peroxidasa se usa para fines de tinción in situ en tejidos o en transferencias Western.

Un ejemplo de aplicación similar, pero diferente, sería el uso del TTSE para mediar la conjugación, por ejemplo, de fosfatasa alcalina y un oligonucleótido que permitiría la identificación in situ de un ARNm dado en una muestra de tejido de forma concurrente con la identificación de cualquier otra molécula de ARNm, por ejemplo, mediante la interconexión de un segundo oligonucleótido apropiado y una molécula de señalización/visualización usando, por ejemplo, el par de afinidad de biotina - avidina /estreptavidina para la conjugación. La ventaja de tener dos o más sistemas de afinidad selectiva disponibles para la conjugación de sondas de oligonucleótidos y moléculas de detección es que pueden detectarse tantas secuencias diferentes simultáneamente como conjuntos de afinidad haya disponibles.

En lo que se refiere a las reacciones químicas necesarias para explotar TTSE como agente de contribución de la afinidad, el péptido que corresponde al exón 2 tendrá afinidad suficiente para la mayor parte de los fines, pero la incorporación de todos o algún segmento del polipéptido del exón 1 servirá para aumentar la afinidad y estabilidad. Las propiedades de mutantes de tetranectina en los que se han sustituido mucho residuos hidrófilos (es decir lys y glu), que están en su mayor parte en el exterior de la estructura de hélice arrollada, por alanina parecen similares a la proteína nativa, lo que sugiere que, de hecho, es posible sustituir todos los residuos de glu, asp y lys por una combinación de gln, asn, arg o ala sin interferir mucho en la estabilidad de la estructura trimérica y así generar una secuencia que, como péptido sintético bloqueado en el extremo N, sería muy fácil de convertir en un componente de un éster químicamente estable activo, por ejemplo un éster de N-hidroxisuccinimida de un péptido acetilado, que podría reaccionar con (y por lo tanto unirse a) cualquier cadena lateral de lisina expuesta en una molécula diana de interés. La síntesis peptídica, las reacciones químicas de activación y acoplamiento de ese tipo serán fácilmente diseñadas y aplicadas por una persona de experiencia en la técnica de la química peptídica, al igual que cualquier otra reacción química de conjugación, tal como la unión y uso de restos fotoactivables tales como, por ejemplo, fenilazidas.

En conclusión, parece que la estructura más importante en TTSE nativo es la secuencia consenso que se muestra en la Fig. 2 y que pueden permitirse amplias variaciones en la cadena polipeptídica. Por lo tanto, una realización ventajosa de la construcción polipeptídica monomérica de la invención es una en la que al menos un residuo aminoacídico que se selecciona del grupo que consiste en los residuos aminoacídicos nº 6, 21, 22, 24, 25, 27, 28, 31, 32, 35, 39, 41, 42 se sustituye(n) por un una residuo aminoacídico que no altera la hélice, refiriéndose la numeración de los residuos aminoacídicos a los residuos aminoacídicos de la SEC. ID. Nº: 7. Se ha demostrado que todos estos residuos no están implicados directamente en las interacciones intermoleculares que establece el complejo trimérico entre tres TTSE de los monómeros de tetranectina naturales y por lo tanto se espera que estos aminoácidos puedan sustituirse con seguridad por cualquier aminoácido que no tenga un efecto adverso sobre la formación de la hélice (de forma notable, prolina, que introduce un pliegue rígido en una cadena polipeptídica).

Otra realización ventajosa de la construcción polipeptídica monomérica de la invención es una que no posee ningún grupo amínico y/o carboxílico libre. Esto favorecerá la síntesis de un TTSE mediante síntesis peptídica de fase sólida o líquida, dado que no habría necesidad de introducir grupos protectores durante la síntesis de los péptidos.

Dado que se cree que la secuencia consenso de la Fig. 2 es importante y dado que esta secuencia consenso incluye la repetición de heptadas descrita anteriormente, se prefiere, de acuerdo con la invención que el TTSE comprenda una la heptada repetida que tenga la fórmula a-b-c-d-e-f-g (en la dirección N a C), en la que los residuos a y d generalmente sean aminoácidos hidrófobos. Sin embargo, dado que "a" y "d" en la tercera de las heptadas completas de todos los miembros conocidos de la familia de la tetranectina están constituidos por glutamina, lo más preferido es que el TTSE comprenda la repetición de heptadas 3 veces y que la última vez que aparezca la heptada tenga un residuo de glutamina que corresponda a los residuos a y d.

Dado que el exón 2 de los miembros nativos de la familia de la tetranectina parece contener los elementos necesarios para efectuar una trimerización estable, se prefiere que la construcción polipeptídica monomérica no contenga partes sustanciales de tetranectina que estén codificada por el exón 3 y/o carezca de partes sustanciales de tetranectina que estén codificada por el exón 1. Sin embargo, dado que el material codificado por el exón 1 parece estabilizar la tetranectina natural trimérica, se prefiere especialmente que todo o parte del exón 1 sea parte de la construcción polipeptídica monomérica y también parece ser racional incluir los tres primeros aminoácidos codificados por el exón 3, dado que se sabe que estos participan en la formación de la triple hélice alfa arrollada en la tetranectina humana.

Una realización particularmente interesante de la invención es la posibilidad de diseñar ensamblajes moleculares orientados, en los que una o más entidades funcionales están localizadas en el extremo N del elemento de trimerización y una o más entidades están localizadas en el extremo C del elemento. Las entidades de ese tipo incluidas en una unidad molecular específica. Un diseño de ese tipo puede usarse además si una o más entidades funcionales, por razones estructurales o funcionales, parecen ser incompatibles en la misma construcción. Tal puede ser el caso si una o más de las entidades funcionales son expresadas por dominios proteínicos grandes o voluminosos que por razones estéricas pueden evitar la formación de la unidad molecular trimérica debido a restricciones estéricas.

La posibilidad de construir proteínas de fusión bipolares de tres vías en las que una función esté colocada en el extremo N de la estructura de hélice arrollada y una función diferente esté colocada en el extremo C es además ventajosa en aplicaciones en las que es deseable una separación espacial grande entre las dos funciones para un funcionamiento óptimo. Ejemplos de una aplicación de ese tipo son por ejemplo el uso de dominios de unión (por ejemplo módulos de unión derivados de anticuerpos) para reconocimiento y unión a sitios de unión localizados en o cerca de estructuras grandes tales como membranas celulares en los casos en los que es ventajoso dejar espacio para la unión del otro extremo de la molécula de trimerización a una diana diferente pero también voluminosa.

Por lo tanto, tal como se describe anteriormente, los oligómeros de la invención pueden usarse para unir, por ejemplo, superficies voluminosas mediante el oligómero de acuerdo con la invención que comprende al menos un resto heterólogo que está situado en el extremo N de un TTSE y al menos un resto heterólogo que está posicionado en el extremo C de un TTSE. Los dos restos heterólogos pueden ser parte de la misma construcción polipeptídica monomérica o partes de dos construcciones polipeptídicas monoméricas diferentes.

La extraordinariamente elevada estabilidad de cualquier trímero que contenga el módulo de trimerización de tetranectina en condiciones fisiológicas de tamponación y temperatura (es decir, ausencia de agentes de desnaturalización, temperatura que no exceda 40ºC) combinada con la facilidad con la que puede efectuarse el intercambio de subunidades monoméricas entre los trímeros mediante incubación a temperatura moderadamente elevada o en presencia de agentes de desnaturalización proporciona una oportunidad única de usar el módulo de trimerización como vehículo para permitir la construcción de conjugados de "escoger y mezclar" preparados a partir de colecciones de moléculas homotriméricas fabricadas de antemano. Para ilustrar la versatilidad de esta oportunidad de diseño mediante un ejemplo teórico, se asume que (1) se ha seleccionado una colección de veinte construcciones de anticuerpos diferentes (por ejemplo en el formato de Fv monocatenario) cada uno con su propia especificidad de unión característica y después se han convertido en moléculas homotriméricas mediante fusión con un módulo de trimerización de tetranectina y, asumiendo que se han preparado de forma similar un conjunto de veinte moléculas efectoras diferentes (por ejemplo dominios de toxinas) y también se han conjugado con el módulo de trimerización de tetranectina. Un usuario provisto de las colecciones prefabricadas de veinte construcciones de anticuerpos diferentes y veinte construcciones de toxinas diferentes - 40 reactivos diferentes en total - tiene oportunidad de preparar 400 conjugados diferentes de toxina y anticuerpo, simplemente mezclando un primer componente preferido de una colección de reactivos con un segundo reactivo preferido de la otra colección y después sometiendo esta mezcla binaria a condiciones, es decir, calentamiento suave o incubación con un nivel adecuado de agente de desnaturalización, para lograr un intercambio de subunidades entre todas las especies moleculares triméricas de la mezcla. Después de la etapa de intercambio de subunidades, el reactivo heterobifuncional deseado estará presente en la mezcla como componente principal de la mezcla y puede usarse entonces como tal para lograr un fin dado o, de forma alternativa aplicar una simple etapa de purificación para aislar este reactivo binario heterofuncional de cualquier especie trimérica monofuncional mediante una simple etapa de purificación de proteínas estándar, que se diseña fácilmente usando técnicas estándar conocidas en el campo de la purificación de proteínas.

Puede lograrse una mejora adicional de la versatilidad de la tecnología de "escoger y mezclar" incluyendo un marcador de purificación por afinidad específico en cada grupo de módulo de trimerización y conjugado de sonda/efector/indicador, fusionados directamente en línea o, alternativamente, fusionados mediante un conector escindible (un segmento polipeptídico que contiene, por ejemplo un factor X_{a} o un sitio de reconocimiento / escisión de de enteroquinasas) al marcador de afinidad. Más específicamente, si cada uno de los bancos de proteínas se marcara con marcadores de afinidad a, b y c, respectivamente, que fueran reconocidos por las sustancias de unión A, B y C, respectivamente, podrían obtenerse heterotrímeros puros compuestos por un miembro de cada banco de proteínas, en un procedimiento de purificación por afinidad en tres etapas diseñado para permitir la recuperación selectiva sólo de los trímeros que mostraran afinidad por las sustancias A y B y C. Si, por cualquier razón, fuera deseable eliminar los marcadores de afinidad subsiguientemente, y las construcciones hubieran sido preparadas para incluir conectores escindibles, el aislamiento del heterodímero puro, liberado de todos los marcadores de afinidad, podría lograrse mediante tres etapas de purificación por afinidad adicionales, diseñadas para aislar sólo el material que no pudiera unirse ni a la sustancia A ni a la sustancia B ni a la sustancia C.

Obviamente, el alcance del diseño de "escoger y mezclar" de complejos heterofuncionales que puedan ser preparados por el usuario son de aplicación no sólo a la formación de una heterofunción binaria, sino que serían de aplicación por extensión lógica a la formación de heterofunciones ternarias: para imaginarse la riqueza de posibilidades que es inherente al concepto de heterofunción ternaria, en un ejemplo teórico adicional en la línea del anterior, tres grupos de colecciones de reactivos, que cada una comprendiera 20 características funcionales diferentes, es decir, una colección con un total de 60 homotrímeros diferentes permitiría una preparación de "escoger y mezclar" de 8.000 moléculas trifuncionales diferentes.

El módulo de trimerización de tetranectina básico, de forma esencialmente indiscriminada, formará homotrímeros y heterotrímeros con cualquier molécula que también contenga un módulo de trimerización. Para algunas aplicaciones, puede ser ventajoso tener disponibles derivados diseñados específicamente del módulo de trimerización de tetranectina, que hayan sido diseñados de nuevo para impedir la formación de homotrímeros y por lo tanto permitir sólo la heterotrimerización. De este modo, una realización importante de la construcción polipeptídica monomérica de la invención se construye/diseña de forma que se desfavorezca la formación de complejos entre TTSE idénticos; esto tiene también la implicación de que los oligómeros de la invención pueden estar formados de forma ventajosa por construcciones polipeptídicas monoméricas que se diseñan de forma que desfavorezcan la formación de trímeros que incluyan dos construcciones polipeptídicas monoméricas que tengan TTSE idénticos. Una forma de desfavorecer la formación de homotrimerización sería la mutagénesis de "knobs into holes".

El diseño/rediseño puede lograrse mediante la introducción de sustitución de aminoácidos en sitios del polipéptido íntimamente implicados en la formación y estabilidad del trímero y, simultáneamente, en una construcción diferente introducir una sustitución de aminoácido de compensación, eliminando en conjunto la simetría entre los componentes monoméricos individuales de la estructura de triple hélice de forma que el perfil de complementariedad estructural sólo permita la formación de heterotrímeros, pero sea incompatible con algunas o cada una de las especies homotriméricas.

Todavía otra forma diferente de usar el módulo de trimerización de tetranectina como vehículo para lograr la formación racional de bifuncionalización requeriría la interconexión del extremo C de un monómero al extremo N de un segundo monómero en la estructura de triple hélice. El requisito básico de un polipéptido intermedio es que las distancias espaciales que se dejan entre sus extremos N y C deben ser compatibles con el espaciamiento inherente a los requisitos estructurales que proporciona la arquitectura del módulo de trimerización de tetranectina. La construcción de un polipéptido conector intermedio dispuesto de acuerdo con tales criterios sería conseguida fácilmente por una persona de experiencia media en la técnica de la ingeniería proteínica, ya que se conoce una amplia colección de ejemplos de uso de secuencias espaciadoras, usualmente flexibles, tanto en la naturaleza como en las proteínas de diseño. Debido a la contribución entrópica esperada a la energía de interacción en un módulo en el que dos de los tres componentes del módulo de trimerización de tetranectina están ligados covalentemente entre si, una molécula de ese tipo mostraría una gran preferencia de selección de cualquier molécula que contenga solamente una copia única del componente del módulo de trimerización de tetranectina, dado que esta selección se vería favorecida energéticamente. Por lo tanto, la conjugación de un componente proteínico funcional con un componente de módulo de trimerización de tetranectina dimerizado covalentemente y la conjugación de un componente proteínico funcional diferente a una copia única del elemento de la secuencia de trimerización proporcionaría la formación preferencial de un complejo bifuncional 1:1 y la supresión de la formación de cualquier otro
complejo.

Los monómeros de la invención pueden prepararse por procedimientos generalmente conocidos en la técnica, usando de forma exclusiva o combinada las técnicas de producción de proteínas recombinantes, síntesis peptídica (de fase sólida o fase líquida) y el acoplamiento químico tradicional de restos heterólogos a una cadena peptídica o a residuos específicos de ella. Por lo tanto, la invención se refiere también a un procedimiento para preparar la construcción polipeptídica monomérica de la invención, comprendiendo el procedimiento

- aislar la construcción polipeptídica monomérica de un cultivo que comprende una célula hospedadora que porta y expresa un fragmento de ácido nucleico que codifica la construcción polipeptídica monomérica.

- sintetizar, mediante síntesis peptídica química, la construcción polipeptídica monomérica y subsiguientemente aislar la construcción polipeptídica monomérica de la mezcla de reacción,

- preparar un TTSE en un cultivo que comprende una célula hospedadora que porta y expresa un fragmento de ácido nucleico que codifica el TTSE, subsiguientemente ligar covalentemente al menos un resto heterólogo al TTSE y, a partir de ese punto, aislar la construcción polipeptídica monomérica resultante, o

- sintetizar, mediante síntesis peptídica química, un TTSE, subsiguientemente ligar covalentemente al menos un resto heterólogo al TTSE y, a partir de ese punto, aislar la construcción polipeptídica monomérica resultante de la mezcla de reacción.

y opcionalmente someter la construcción polipeptídica monomérica a procesamiento adicional.

El fragmento de ácido nucleico que se menciona anteriormente es también parte de la invención y se define como un fragmento de ácido nucleico en forma aislada que codifica un TTSE tal como se define en la presente memoria o que codifica la parte polipeptídica de una construcción polipeptídica monomérica de acuerdo con la invención, con la condición de que el fragmento de ácido nucleico sea diferente de uno que codifique los miembros naturales de la familia de la tetranectina y que el fragmento de ácido nucleico sea diferente de uno que codifique cualquiera de las proteínas de fusión CIIH6FXTN123, H6FXTN123, H6FXTN12, H6FXTN23, cuyas secuencias se muestran en las SEC. ID. Nº: 24-27.

La célula hospedadora mencionada anteriormente (que es también parte de la invención) puede prepararse mediante técnicas de ingeniería genética tradicionales que comprenden insertar un fragmento de ácido nucleico (normalmente un fragmento de ADN) que codifica la parte polipeptídica de una construcción polipeptídica monomérica de la invención en un vector de expresión adecuado, transformar una célula hospedadora adecuada con el vector y cultivar la célula hospedadora en condiciones que permitan la expresión de la parte polipeptídica de la construcción polipeptídica monomérica. El fragmento de ácido nucleico que codifica el polipéptido ser controlado por un promotor adecuado que puede ser un promotor inducible o constitutivo. Dependiendo del sistema de expresión, el polipéptido puede recuperarse de la fase extracelular, del periplasma o del citoplasma de la célula hospedadora.

Los sistemas de vectores y células hospedadoras adecuados son notorios en la técnica, tal como evidencia la gran cantidad de bibliografía y materiales disponibles para la persona experta. Dado que la presente invención se refiere también al uso de fragmentos de ácidos nucleicos de la invención en la construcción de vectores y en células hospedadoras, a continuación se proporciona una descripción general que se refiere a tales usos y a las consideraciones particulares en la práctica de este aspecto de la invención.

En general, por supuesto, se prefieren procariotas para la clonación inicial de secuencias nucleicas de la invención y para construir los vectores útiles en la invención. Por ejemplo, además de las cepas particulares mencionadas en la descripción más específica a continuación, pueden mencionarse a modo de ejemplo, cepas tales como E. coli K12 cepa 924 (nº de ATCC 31446), E. coli B y E. coli X 1776 (nº de ATCC 31537). Se pretende que estos ejemplos, por supuesto, sean ilustrativos y no limitantes.

También se prefieren procariotas para la expresión, dado que hay disponibles estrategias de purificación y plegado eficientes de proteínas. Pueden usarse las cepas mencionadas anteriormente, así como E. coli W3110 (F-, lambda-, prototrófica, nº de ATCC 273325), bacilos tales como Bacillus subtilis u otras enterobacterias tales como Salmonella typhimurium o Serratia marcesans y varias especies de Pseudomonas.

En general, en relación con estos hospedadores se usan vectores plasmídicos que contienen secuencias de replicación y de control que se derivan de especies compatibles con la célula hospedadora. El vector ordinariamente porta un sitio de replicación, así como secuencias marcadoras que son capaces de proporcionar una selección fenotípica de las células transformadas. Por ejemplo, E. coli se transforma típicamente usando pBR322, un plásmido que se deriva de una especie de E. coli (véase, por ejemplo, Bolivar y cols., 1977). El plásmido pBR322 contiene genes para resistencia a la ampicilina y la tetraciclina y, de este modo, proporciona un modo fácil de identificar células transformadas. El plásmido pBR u otro plásmido microbiano o macrófago también debe contener, o ser modificado para que contenga, promotores que pueden ser usados por el microorganismo para su expresión.

Esos promotores usados más comúnmente en la construcción de ADN recombinante incluyen la \beta-lactamasa (penicillinasa) y sistemas promotores de la lactosa (Chang y cols., 1978; Itakura y cols., 1977; Goeddel y cols., 1979) y un sistema promotor del triptófano (trp) (Goeddel y cols., 1979; publicación de solicitud EPO 0036776). Aunque estos son los promotores usados más habitualmente, se han descubierto y utilizado otros promotores microbianos y se han publicado los detalles relativos a sus secuencias de nucleótidos, permitiendo al experto ligarlos funcionalmente con vectores plasmídicos (Siebwenlist y cols., 1980). Ciertos genes de procariotas pueden ser expresados eficientemente en E. coli a partir de sus propias secuencias promotoras, evitando la necesidad de añadir otro promotor por medios artificiales.

Además de los procariotas, pueden usarse también microbios eucariotas, tales como cultivos de levaduras. Saccharomyces cerevisiae, o levadura de pan común es el de uso más habitual entre los microorganismos eucariotas, aunque hay disponibles comúnmente un número de otras cepas. Para la expresión en Saccharomyces, se usa comúnmente por ejemplo el plásmido YRp7, (Stinchcomb y cols., 1979; Kingsman y cols., 1979; Tschemper y cols., 1980). Este plásmido ya contiene el gen trpl que proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo el nº de ATCC 44076 o PEP4-1 (Jones, 1977). La presencia de la lesión trpl como característica del genoma de la célula hospedadora de levadura proporciona entonces un entorno efectivo para detectar la transformación por el crecimiento en ausencia de triptófano.

Secuencias promotoras adecuadas en vectores de levaduras incluyen los promotores de 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzman y cols., 1980) u otras enzimas glucolíticas (Hess y cols., 1969; Holland y cols., 1978), tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucosinasa. En la construcción de plásmidos de expresión adecuados, las secuencias de terminación asociadas a estos genes se ligan también en el vector de expresión en posición 3' de la secuencia cuya expresión se desea para proporcionar la poliadenilación del ARNm y la terminación.

Otros promotores, que tienen la ventaja adicional de una trascripción controlada mediante condiciones de crecimiento son la región promotora de la alcohol deshidrogenasa-2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas de degradación asociadas al metabolismo del nitrógeno y la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa mencionada anteriormente y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Es adecuado cualquier vector plasmídico que contenga una secuencia de promotor, origen de replicación y terminación compatibles con levaduras.

Además de microorganismos, también pueden usarse como hospedadores cultivos de células derivadas de organismos multicelulares. En principio, cualquier cultivo celular de ese tipo es operable, ya sea a partir de cultivos de vertebrados o de invertebrados. Sin embargo, el interés por las células de vertebrados ha sido mayor y la propagación de vertebrados en cultivo (cultivo tisular) se ha convertido en un procedimiento rutinario en los últimos años (Tissue Culture, 1973). Ejemplos de líneas celulares hospedadoras de ese tipo son las células VERO y HeLa, líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO) y W318, BHK, COS-7 293 y MDCK.

Los vectores de expresión para tales células ordinariamente incluyen (si fuera necesario) un origen de replicación, un promotor localizado delante del gen a expresar, junto con cualesquiera sitios de unión de ribosomas, sitios de ayuste de ARN, sitio de poliadenilación y secuencias de terminación de la transcripción necesarios.

Para usar células de mamíferos, a menudo las funciones de control de los vectores de expresión son proporcionadas por material vírico. Por ejemplo, los promotores que se usan comúnmente se derivan de polioma, Adenovirus 2 y lo más frecuentemente del virus simio 40 (SV40). Los promotores temprano y tardío del virus SV40 son particularmente útiles porque ambos se obtienen fácilmente a partir del virus en forma de un fragmento que también contiene el origen de replicación vírico de SV40 (Fiers y cols., 1978). También pueden usarse fragmentos de SV40 menores o mayores, con la condición de que se incluya la secuencia de aproximadamente 250 pb que se extiende desde el sitio HindIII hacia el sitio BglI localizado en el origen de replicación vírico. Además, también es posible, y a menudo deseable, utilizar secuencias promotoras o de control que normalmente están asociadas a la secuencia génica deseada, con la condición de que tales secuencias de control sean compatibles con los sistemas de células hospedadoras.

Un origen de replicación puede proporcionarse bien construyendo el vector para que incluya un origen exógeno, tal como el que puede derivarse de SV40 u otro virus (por ejemplo, Polioma, Adenovirus, VSV, BPV) o puede ser proporcionado por el mecanismo de replicación cromosómico de la célula hospedadora. Si el vector está integrado en el cromosoma de la célula hospedadora, éste último es a menudo suficiente.

Al producir las construcciones polipeptídicas monoméricas puede ser necesario procesar los polipéptidos adicionalmente, por ejemplo, introduciendo funciones no proteínicas en el polipéptido, sometiendo el material a condiciones de plegamiento adecuadas (por ejemplo, usando las estrategias aplicables de forma general que se sugieren en el documento WO 94/18227) o escindiendo restos peptídicos no deseados del monómero (por ejemplo, fragmentos peptídicos potenciadores de la expresión que no son deseados en el producto final).

A la vista de la descripción anterior, los procedimientos para producir de forma recombinante la construcción polipeptídica monomérica de la invención son también una parte de la invención, así como los vectores que portan y/o son capaces de replicar los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención en una célula hospedadora o una línea celular. De acuerdo con la invención, el vector de expresión puede ser, por ejemplo, un plásmido, un cósmico, un minicromosoma o un macrófago. Especialmente interesantes son los vectores que se integran en el genoma de la célula hospedadora/línea celular después de introducirlos en el hospedador.

Otra parte de la invención son las células transformadas (útiles en los procedimientos descritos anteriormente) que portan y son capaces de replicar los fragmentos de ácidos nucleicos de la invención; la célula hospedadora puede ser un microorganismo tal como una bacteria, una levadura, o un protozoo, o una célula derivada de un organismo multicelular tal como un hongo, una célula de insecto, una célula vegetal o una célula de mamífero. Especialmente interesantes son las células de las especies bacterianas Escherichia, Bacillus y Salmonella y una bacteria preferida es E. coli.

Todavía otra parte más de la invención se refiere a una línea celular estable que produce la parte polipeptídica de una construcción polipeptídica monomérica de acuerdo con la invención y preferiblemente la línea celular porta y expresa un ácido nucleico de la invención.

Basándose en las descripciones anteriores, estará claro para la persona experta que también los oligómeros que resultan de la formación de complejos entre las construcciones monoméricas de la invención son partes importantes de la invención. Por lo tanto, la invención se refiere también a un oligómero que está compuesto por dos construcciones polipeptídicas monoméricas de acuerdo con la invención que comprenden al menos tres TTSE o que están formadas por tres construcciones polipeptídicas monoméricas de acuerdo con la invención que cada una sólo contiene un único TTSE.

Tal como se explica en la presente memoria y se muestra en los ejemplos, los oligómeros de la invención son estables a temperaturas de hasta 70ºC y por lo tanto es especialmente preferido que los oligómeros de la invención sean estables a temperaturas superiores a las fisiológicas, por ejemplo, que los oligómeros sean estables en el intervalo de temperaturas de 50-70ºC.

También una parte de la invención es un procedimiento para preparar un oligómero dimérico de la invención que comprende

- mezclar una construcción polipeptídica monomérica que incluye dos TTSE (construcción 1) con una construcción polipeptídica monomérica que incluye sólo un TTSE (construcción 2),

- efectuar la formación de un complejo entre los dos TTSE de la construcción 1 y el TTSE de la construcción 2 (esto puede hacerse mediante tratamiento térmico, se decir, calentando a una temperatura que asegure la desnaturalización seguido de enfriamiento subsiguiente permitiendo la renaturalización o esto puede hacerse desnaturalizando/renaturalizando mediante cambios en el entorno químico) y

- aislar el dímero resultante y opcionalmente someter el dímero a procesamiento adicional (véase la descripción anterior del procesamiento adicional, pero debería mencionarse también que el procesamiento adicional podría incluir el acoplamiento no covalente de restos interesantes y relevantes al oligómero dimérico).

En consecuencia, el procedimiento para producir un oligómero trimérico es también parte de la invención y comprende las etapas de

- mezclar tres construcciones polipeptídicas monoméricas de la invención entre sí,

- efectuar la formación de complejos entre un TTSE de cada construcción polipeptídica monomérica, y

- aislar el trímero resultante y opcionalmente someter el oligómero trimérico a procesamiento adicional.

Las consideraciones que son de aplicación a la formación de complejos y el procesamiento adicional mencionado anteriormente son de aplicación también a este procedimiento.

A la vista de la descripción detallada anteriormente del aspecto de "escoger y mezclar" de la invención, la invención se refiere también a un kit que comprende

- un primer estuche que comprende, al menos, un medio de envase, conteniendo cada al menos un medio de envase una construcción polipeptídica monomérica de la invención,

- un segundo estuche que comprende al menos un medio de envase, conteniendo cada al menos un medio de envase del segundo estuche una construcción polipeptídica monomérica de la invención, siendo el segundo estuche diferente del primer estuche en lo que se refiere a la elección y/o número de construcciones polipeptídicas monoméricas que se incluyen en él y, opcionalmente

- un tercer estuche que comprende al menos un medio de envase, conteniendo cada al menos un medio de envase del tercer estuche una construcción polipeptídica monomérica de la invención, siendo el segundo estuche diferente del primer y segundo estuches en lo que se refiere a la elección y/o número de construcciones polipeptídicas monoméricas que se incluyen en él.

Se prefiere que el al menos un medio de envase en cada estuche contenga construcciones polipeptídicas monoméricas diferentes entre si y se prefiere especialmente que todos los medios de envase comprendidos en el kit comprendan construcciones polipeptídicas monoméricas diferentes entre si.

Un aspecto muy importante de la invención es la posibilidad de generar un sistema diseñado especialmente para las circunstancias individuales. La idea básica es que la selección artificial de restos heterólogos y opcionalmente componentes activos y entidades funcionales produzcan un sistema único tal como se describirá adicionalmente a continuación.

El uso del TTSE como vehículo para ensamblar fragmentos de anticuerpos scFv o Fab monovalentes para obtener entidades oligoméricas y multivalentes ofrece ventajas de diseño también en cuando a la generación de anticuerpos artificiales quiméricos que tienen propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas deseables. Los pequeños derivados tales como fragmentos de scFv monoméricos o "minicuerpos" bivalentes son aclarados rápidamente del sistema circulatorio, mientras que las Ig completas permanecen durante mucho tiempo más. A la inversa, los derivados más pequeños tales como scFv y minicuerpos exhiben mejores propiedades de extravasación. Por lo tanto es de esperar que los anticuerpos de una especificidad deseada puedan optimizarse para las necesidades de diagnóstico o terapéuticas particulares diseñando las propiedades farmacológicas, usando el TTSE como vehículo para la oligomerización controlada, por ejemplo, de fragmentos scFv.

Un ejemplo de un diseño de ese tipo serían los requisitos para administrar a un tumor una dosis elevada de un anticuerpo conjugado con un agente para la obtención de imágenes o una toxina, asegurando a la vez una exposición sistémica o imágenes de fondo lo menores posible. En un caso de ese tipo, podría diseñarse un fragmento scFv conjugado con un TTSE que exhibiera una unión fuerte multivalente al tumor y un aclaración rápida del exceso de conjugado de la circulación.

En consecuencia, un aspecto adicional de la presente invención también se refiere al uso de una construcción polipeptídica monomérica o a un oligómero de acuerdo con la presente invención como vehículo para ensamblar fragmentos de anticuerpos en forma de entidades oligoméricas o multivalentes para generar anticuerpos artificiales quiméricos que tengan propiedades farmacocinéticas y/o farmacodinámicas preseleccionadas.

El uso de sistemas de administración específicos desempeña también un papel importante en relación con la presente invención porque tales sistemas pueden utilizarse con respecto a un uso diferente de la presente invención tanto con respecto a una aplicación terapéutica más general como con respecto a la terapia génica. Ejemplos de sistemas de administración de fármacos y rastreo adecuados se describen en Nature 392 supl. (30 de abril de 1998).

En consecuencia, la eficiencia de la administración puede aumentarse adicionalmente si el sistema de administración, por ejemplo un liposoma se suministra con una unidad molecular, un ligando "infectador o un transfectador" reconocido por una unidad receptora de internalización específica para las células diana. Por ejemplo, las células que presentan receptores endocitóticos tales como miembros de la familia de receptores LDL pueden ser infectados o transfectados incluso más eficientemente ya sea incluyendo una unidad del TTSE en el heterodímero que contiene el anticuerpo o una unidad del TTSE independiente conjugada con uno o más de los dominios de la proteína asociada al receptor, RAP (Ellgaard, L., Holtet, T. L., Nielsen, P. R., Etzerodt, M., Gliemann, J. & Thøgersen, H. C. Eur J Biochem, 1997, vol. 244, 544-551) que es reconocido como ligando de todos los receptores en esta abundante familia de receptores mediadores de la endocitosis.

En consecuencia, en un aspecto adicional, la invención se refiere al uso de una construcción polipeptídica monomérica o a un oligómero de acuerdo con la invención para la terapia génica dirigida que implica la administración selectiva del material para transfección o infección de la población específica de células.

La perspectiva final de una terapia génica mediada por TTSE de ese tipo sería el desarrollo de un vector vírico que no encontrara ninguna otra diana en el paciente sino las células que presentan el complejo de receptor artificial.

En otro aspecto adicional, la invención se refiere al uso de una construcción polipeptídica monomérica o a una construcción oligomérica de acuerdo con la invención en la que el al menos un resto heterólogo comprende un resto que se selecciona de una estructura de unión a ligandos tal como una molécula de receptor o la parte de unión a ligandos de una molécula de receptor y en el que la terapia génica implica la administración de ácidos nucleicos a la población deseada de células mediante el uso de un vector vírico dirigido a células que presentan el complejo de receptores artificiales que corresponde al resto heterólogo.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de una construcción polipeptídica monomérica o a una construcción oligomérica de acuerdo con la invención en el que el al menos un TTSE está modificado con una entidad de integración o de asociación a la membrana que tiene afinidad por la población específica de células del cuerpo relevante para la terapia génica.

Además, recientemente ha sido publicado un análisis reciente del potencial para obtención de imágenes y terapéutico de un abanico de derivados de anticuerpos conocidos por Paul Carter y Margaret Merchant de Genentech Inc. (Current Opinion in Biotechnology, 1997, volumen 8, 449-454). Como continuación directa de sus conclusiones, será aparente que la oligomerización de derivados de anticuerpos tales como los derivados scFv pueden extender la tecnología actual en el campo de diseño de anticuerpos en muchos aspectos importantes, algunos de los cuales se detallarán a continuación (en referencia al análisis de Carter y Merchant).

Uno de los problemas notorios inherentes a los anticuerpos monoclonales de ratón que han sido "humanizados" injertando el sitio de combinación del antígeno murino sobre una estructura de Ig humana es que la capacidad antigénica del producto quimérico en los pacientes humanos es, a menudo, difícil de suprimir completamente, lo que produce reacciones inmunitarias al producto de anticuerpo humanizado diagnóstico o terapéutico que, algunas veces, ponen en peligro la vida. Es de esperar que el riesgo de tales efectos secundarios se reduzca mucho si el anticuerpo diseñado se ensambla a partir de proteínas o fragmentos de proteínas puramente humanos. Dado que la unidad de trimerización del TTSE que se describe aquí es idéntica a una porción de la tetranectina humana que ya está presente en el plasma y tejido humanos, existen buenas razones para esperar que el TTSE no provocará una respuesta antigénica en un sujeto humano si se introduce como componente de un producto quimérico que no sea en otros aspectos antigénico en seres humanos.

En consecuencia, en un aspecto, la presente invención se refiere al uso de una construcción polipeptídica monomérica o a un oligómero de acuerdo con la presente invención como componente de un producto quimérico que tiene una capacidad antigénica baja en seres humanos comparada con formulaciones que comprenden uno o más componentes de origen distinto del humano.

Carter y Merchant analizan adicionalmente la tecnología actual para el radiomarcado de derivados de anticuerpos. De nuevo, la oligomerización usando TTSE ofrece soluciones más elegantes a problemas asociados al marcado, ya que el TTSE ofrece la posibilidad de construir una o dos de las unidades monoméricas del TTSE en forma de un complejo heterotrimérico para albergar el sitio que porta el marcador. De este modo, en este formato, el marcado puede confinarse a la parte distinta del anticuerpo del complejo, dejando la molécula de unión a antígenos sin ninguna modificación y el complejo puede además formularse "en campo" y cuando sea necesario.

En muchas rutas de transducción de señales mediadas por receptores, se disparan señales mediante la agrupación de moléculas de receptores en la membrana celular. Los TTSE por lo tanto, tienen aplicaciones importantes en el estudio y explotación de la señalización de los receptores, ya que los ligandos pueden presentarse como oligómeros mediante conjugación con una unidad del TTSE.

Esto también tiene una aplicación importante en las tecnologías de presentación en macrófagos para descubrir nuevos ligandos y nuevos receptores ya que el diseño de una unidad del TTSE fusionada en línea con una molécula de ligando candidata permitirá la presentación de una proteína de la cubierta de macrófago heterotrimérica, en la que sólo una de las unidades monoméricas está conjugada con la proteína de la cápside del macrófago. Esto puede lograrse mediante la inserción apropiada de codones ámbar en el sitio de fusión de la proteína de la cápside del macrófago con el segmento de ligando del TTSE de la proteína de fusión de tres vías codificada por el macrófago recombinante. En las células de E. coli apropiadas, la presencia de este codón ámbar producirá la terminación de la traducción en la mayoría de las lecturas y, por lo tanto, la mayor parte del producto de las proteínas de fusión que se segrega al compartimiento periplasmático de la bacteria infectada por macrófagos será proteína de fusión del TTSE-ligando soluble, mientras que una minoría de la proteína de fusión contendrá también una molécula de proteína de macrófago. La mayoría de los trímeros que se generarán por lo tanto contendrán, como mucho, una unidad monomérica que asegurará la integración (presentación) en la partícula de macrófago recombinante madura.

Una ventaja adicional de la tecnología de presentación que se describe anteriormente se refiere al hecho de que es especialmente útil para la selección basada en una afinidad relativamente baja dada la contribución entrópica beneficiosa obtenida por la proximidad de los tres restos que se unen en una disposición espacial confinada.

En consecuencia, la presente invención en un aspecto importante, se refiere también a tecnología de bancos de proteínas en las que se usan los TTSE descritos anteriormente.

La trimerización de los candidatos a ligandos recombinantes es especialmente importante ya que, para muchos receptores, la señal intracelular es inducida por la agrupación de receptores, que sólo se produce si el ligando externo exhibe una unión multivalente al receptor, de forma que actúe de puente entre dos o más moléculas de receptor.

En una realización preferida, la construcción polipeptídica monomérica o la construcción oligomérica de acuerdo con la invención es para la terapia génica dirigida que implica la administración selectiva del material para la transfección o infección de la población específica de células. El al menos un resto heterólogo puede comprender un resto que se selecciona de una estructura de unión de ligandos tal como una molécula de receptor o la parte de unión a ligandos de una molécula de receptor y en la que la terapia génica implica la administración de ácidos nucleicos a la población deseada de células mediante el uso de un vector vírico dirigido a las células que presentan el complejo de receptor artificial que corresponde al resto heterólogo.

Tal como se menciona anteriormente, un aspecto importante de la invención es que la construcción polipeptídica monomérica y/o el oligómero pueden usarse como componente de un producto quimérico que tiene una capacidad antigénica baja en seres humanos. Dado que la construcción es de origen humano, se cree que la capacidad antigénica en seres humanos es baja comparada con formulaciones que comprenden uno o más componentes de origen distinto del humano.

Un uso primario de una construcción polipeptídica monomérica o un oligómero de acuerdo con la invención es el de administrar un anticuerpo conjugado con agentes para obtención de imágenes o con toxinas a una diana tal como un tumor o uso como vehículo que administra una sustancia a una célula o tejido diana, tal como un vehículo para ensamblar fragmentos de anticuerpos en forma de entidades oligoméricas o multivalentes para generar anticuerpos artificiales quiméricos que tienen propiedades farmacocinéticas y/o farmacodinámicas preseleccionadas.

La sustancia en cuestión es una o más que se seleccionan del grupo de restos heterólogos así como un fármaco. También está dentro del alcance de la invención una construcción marcada en la que el marcador está acoplado a una o dos de las unidades monoméricas del TTSE.

Tal como se explica de forma detallada anteriormente, un uso importante y sorprendente de la construcción polipeptídica monomérica o el oligómero de acuerdo con la presente invención es para la tecnología de banco de proteínas, tal como la tecnología de presentación en macrófagos. La presente invención se refiere también a cualquier molécula polinucleotídica tal como ARN, ADN o APN así como a cualquier vector que codifica uno o más TTSE.

Un uso adicional de acuerdo con la invención incluye la preparación y uso de una composición farmacéutica que comprende la construcción del TTSE y opcionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable. La composición puede administrarse por una vía que se selecciona del grupo que consiste en la vía intravenosa, la vía intraarterial, la vía transmembranosa del tejido bucal, anal, vaginal o conjuntivo, la vía intranasal, la vía pulmonar, la vía transdérmica, la vía intramuscular, la vía subcutánea, la vía intratecal, inoculación en tejido tal como un tumor o mediante un implante.

En una realización preferida la construcción polipeptídica monomérica o el oligómero está incluido en un
liposoma.

A partir de la memoria descriptiva de la presente invención es obvio que el tratamiento o prevención de una enfermedad puede ser un aspecto adicional que comprende la administración al sujeto que lo necesite de una cantidad efectiva de una composición farmacéutica referida anteriormente.

Un aspecto de las diversas posibilidades de acuerdo con la invención relativas a cómo se dirige la terapia génica humana, incluye el caso en el que al menos un TTSE se modifica con una entidad de integración o de asociación a la membrana que tiene afinidad por la población específica de células del cuerpo relevantes para la terapia génica.

Tal como se usa en el campo farmacéutico convencional, la presente invención incluye un procedimiento en el que la construcción polipeptídica monomérica o el oligómero se administra por una vía que se selecciona de la vía intravenosa, la vía intraarterial, la vía transmembranosa del tejido bucal, anal o vaginal, la vía intranasal, la vía pulmonar, la vía transdérmica, la vía intramuscular, la vía subcutánea, la vía intratecal, la bucal, inoculación en tejido tal como un tumor o mediante un implante.

Finalmente, la presente invención se refiere también al campo diagnóstico, como fácilmente reconocerá la persona experta en la técnica, el TTSE descrito en la presente memoria descriptiva puede referirse también a un procedimiento de diagnóstico que comprende una construcción que comprende la construcción polipeptídica monomérica o el oligómero, junto con un componente de diagnóstico acoplado al mismo.

Ejemplo 1 Diseño y construcción de los vectores de expresión de E. coli pTH6trip para la producción de proteínas de fusión quiméricas trimérizadas

El clon del plásmido pT7H6FXTN123 (Ejemplo 2) se usó como plantilla de amplificación en dos reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) (Saiki y cols., 1988) con los pares de cebadores trip-N (SEC. ID. Nº: 1) y trip-Ca (SEC. ID. Nº: 2) y trip-N (SEC. ID. Nº: 1) y trip-cb (SEC. ID. Nº: 3), respectivamente. Los fragmentos de ADN amplificados, tripa, que comprendían las secuencias nucleotídicas que codificaban un sitio de escisión IQGR para la proteasa de restricción FX_{a} (SEC. ID. Nº: 4) seguido de dos sitios para las nucleasas de restricción BglII y KpnI, la secuencia nucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de la tetranectina de Glu 1 a Lys 52 (SEC. ID. Nº: 5) seguida de sitios de reconocimiento para las tres endonucleasas de restricción BamHI, HindIII y EcoRI, respectivamente, y tripb, que comprende secuencias nucleotídicas que codifican un sitio de escisión IQGR para la proteasa de restricción FX_{a} (SEC. ID. Nº: 4) seguido de dos sitios para las nucleasas de restricción BglII y KpnI, la secuencia nucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de tetranectina de Glu 1 a Val 49 (SEC. ID. Nº: 6) seguida de sitios de reconocimiento para las tres endonucleasas de restricción BamHI, HindIII y EcoRI, respectivamente, se subclonaron en el plásmido pT7H6 (Christensen y cols., 1991), proporcionando pTtripa y pTtripb, respectivamente (Fig. 3 y 4).

Ejemplo 2 Tetranectina, localización del elemento estructural de trimerización y estabilidad de la triple hélice alfa enrollada

El ADNc que codifica el marco de lectura correspondiente a la cadena simple de la tetranectina madura (SEC. ID. Nº: 7) se clonó mediante amplificación específica en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Saiki y cols., 1998) de las secuencias nucleotítidicas desde el residuo aminoacídico Glu1 a Val181 usando ADNc cebado con oligo-dT de 1 cadena sintetizado a partir de ARN de placenta humana total como plantilla. Los cebadores usados en la PCR eran la SEC. ID. Nº: 8 y la SEC. ID. Nº: 9. La extracción de ARN y la síntesis de ADNc se realizaron usando procedimientos estándar. El marco de lectura amplificado que codificaba la subunidad monomérica de la tetranectina se ligó, mediante la PCR, en el extremo 5' a secuencias nucleotídicas que codificaban la secuencia de aminoácidos SEC. ID. Nº: 10 que constituyen un sitio de escisión IEGR para la proteasa de restricción bovina FX_{a} (Nagai y Thøgersen, 1987). Un residuo de glicina debido al diseño específico del cebador 5' de la PCR (SEC. ID. Nº: 8), se insertó entre el residuo de arginina del extremo C del sitio de escisión para FX_{a} (SEC. ID. Nº: 10) y el residuo Glu1 de la tetranectina. El fragmento de ADN amplificado se subclonó en el vector de expresión de E. coli pT_{7}H_{6} (Christensen y cols., 1991) produciendo el plásmido pT_{7}H_{6}FX-TN123 que expresa el monómero de tetranectina H6FXTN123 (SEC. ID. Nº: 25) y en pT_{7}CIIH_{6}, que es un derivado de pT_{7}H_{6}, en el que los 32 residuos aminoacídicos del extremo amínico de la proteína lambda CII (SEC. ID. Nº: 11) se insertan en posición relativa 5' de los seis residuos de histidina (SEC. ID. Nº: 12) tal como se detalla en la Fig. 5, proporcionando pT_{7}CIIH_{6}FX-TN123 que expresa la proteína de fusión de la tetranectina CIIH6FXTN123 (SEC. ID. Nº: 24). La secuencia de aminoácidos de las proteínas expresadas se muestra en la Fig. 6 (en la SEC. ID. Nº: 7 se proporciona la secuencia de aminoácidos de la proteína de la tetranectina madura). Además, se construyeron tres derivados adicionales de tetranectina (Fig. 8): H6FXTN12 que comprendía los residuos aminoacídicos Glu1 a Val49 de la tetranectina (SEC. ID. Nº: 6), H6FXTN123 que comprendía los residuos aminoacídicos Val17 a Val181 de la tetranectina (SEC. ID. Nº: 7) y H6FXTN3 (SEC. ID. Nº: 30) que comprendía los residuos aminoacídicos Ala45 a Val181 de la tetranectina (SEC. ID. Nº: 7). Estos tres derivados de la tetranectina se construyeron mediante amplificación específica en una PCR usando pT_{7}H_{6}FX-TN123 como plantilla y el par de cebadores de la SEC. ID. Nº: 8 y la SEC. ID. Nº: 13, la SEC. ID. Nº: 14 y la SEC. ID. Nº: 9, y la SEC. ID. Nº: 15 y la SEC. ID. Nº: 9, respectivamente. Los fragmentos de ADN amplificados se subclonaron en el vector de expresión de E. coli pT_{7}H_{6} produciendo los plásmidos pT_{7}H_{6}FX-TN12, pT_{7}H_{6}FX-TN23 y pT_{7}H_{6}FX-TN3, respectivamente (Fig. 7).

Para preparar la tetranectina recombinante y sus derivados; cada uno de los plásmidos pT_{7}H_{6}FX-TN123, pT_{7}CIIF_{6}
FX-TN123, pT_{7}H_{6}FX-TN12, pT_{7}H_{6}FX-TN23 y pT_{7}H_{6}FX-TN3 se cultivaron a media escala (4 x 1 litro; medio 2xTY, MgSO_{4} 5 mM y 100 \mug de ampicilina) en células de E. coli BL21, tal como describen Studier y cols. (1990). Los cultivos con crecimiento exponencial a 37ºC se infectaron a una DO_{600} de 0,8 con bacteriófago lambda CE6 con una multiplicidad de aproximadamente 5. Los cultivos se cultivaron a 37ºC durante otras tres horas y las células se recolectaron por centrifugación.

Las células se volvieron a suspender en 150 ml de NaCl 0,5 M, Tris-HCl 10 mM a pH 8 y EDTA 1 mM a pH 8. Se añadió fenol (100 ml, ajustado a pH 8) y la mezcla se sometió a ultrasonidos para extraer la proteína total. La proteína se precipitó de la fase de fenol mediante 2,5 volúmenes de etanol y centrifugación.

El sedimento de proteína se disolvió en un tampón que contenía cloruro de guanidino 6 M, Tris-HCl 50 mM a pH 8 y ditioeritriol 0,1 M. Tras la filtración en gel Sephadex G-25 (Pharmacia, Suecia) en urea 8 M, NaCl 1 M, Tris-HCl 50 mM a pH 8 y 2-mercaptoetanol 10 mM, la preparación de proteína cruda se aplicó a una columna de NTA activado con NI^{2+}-agarosa (NI^{2+}NTA-agarosa, 75 ml prelavada con urea 8 M, NaCl 1 M, Tris-HCl 50 mM a pH 8 y 2-mercaptoetanol 10 mM) para purificar (Hochuli y cols., 1988) y plegar las proteínas de fusión H6FXTN123, CIIH6FXTN123, H6FXTN12, H6FXTN23 y H6FXTN3.

Para este estudio los investigadores eligieron preparar su propia matriz de Ni^{2+}NTA-agarosa. Se realizó un acoplamiento de carbodiimida del ligado metálico ácido N-(5-amino-1-carboxipentil)iminodiacético (ruta de síntesis tal como describen Döbeli y Hochuli (documento EP-A-0 253 303)) a una matriz de azarosa rígida (Sepharose CL-6B, Pharmacia, Suecia):

8 g de ácido N-(5-amino-1-carboxipentil)iminodiacético del procedimiento de síntesis en 50 ml se ajustó a pH 10 mediante la adición de 29 g de Na_{2}CO_{3} (10 H_{2}O) y se añadió a una suspensión en agitación de Sepharose CL-6B activada en Na_{2}CO_{3} 1 M. La reacción se dejó hasta la mañana siguiente. La Sepharose CL-6B (inicialmente 100 ml de suspensión) se activó tras la eliminación de agua mediante acetona con 7 g de 1,1'-carbonildiimidazol agitando durante 15 a 30 minutos. Después de activar, la Sepharose CL-6B se lavó con acetona seguida de agua y Na_{2}CO_{3} 1 M.

La matriz de NTA-agarosa se introdujo en una columna y se "cargó" con Ni^{2+} pasando lentamente 5 volúmenes de columna de una solución de NiSO_{4} al 10%. La cantidad de Ni^{2+} en la matriz de NTA-agarosa preparada por este procedimiento se ha determinado que es de 14 \mumol por ml de matriz. Después de cargar, la columna de Ni^{2+}NTA-agarosa se lavó con dos volúmenes de columna de agua, un volumen de columna de Tris-HCl 1 M a pH 8 y dos volúmenes de columna de tampón de carga antes de mezclar agitando la matriz de Ni^{2+}NTA-agarosa con los extractos de proteína bruta en un vaso de precipitados durante 15 a 30 minutos. Todos los tampones preparados para cromatografía líquida se desgasificaron a vacío antes de añadir el reductor y/o de usar. La mezcla de matriz de Ni^{2+}NTA-agarosa y el extracto bruto se introdujo en columnas de cristal estándar para cromatografía líquida (diámetro interno: 2,6 cm) hasta un volumen de aproximadamente 40 ml. Las columnas se lavaron con 200 ml de urea 8 M, NaCl 1 M, Tris-HCl 50 mM a pH8 y 2-mercaptoetanol 10 mM (Tampón I) y 100 ml de cloruro de guanidino 6 M, Tris-HCl 50 mM a pH 8 y 2-mercaptoetanol 10 mM (Tampón II) y las proteínas de fusión derivadas de tetranectina adsorbidas H6FXTN123, H6CIIFXTN123, H6FXTN23 y H6FXTN3 se volvieron a plegar usando el procedimiento de plegamiento cíclico tal como se ha descrito (Thøgersen y cols., documento WO 94/18227).

La proteína de fusión H6FXTN12 se plegó eliminando el cloruro de guanidino y el 2-mercaptoetanol del tampón II en gradiente con 5 volúmenes de columna en Tris-HCl 50 mM a pH 8 y NaCl 0,5 M. Después de completar los procedimientos de plegado, las proteínas de fusión derivadas de tetranectina se eluyeron de las columnas de Ni^{2+}NTA-agarosa con un tampón que contenía NaCl 0,5 M, Tris-HCl 50 mM, EDTA 25 mM a pH 8. Las proteínas de fusión de tetranectina H6FXTN123, H6FXTN23 y H6FXTN3 se escindieron con FX_{a} a 4ºC hasta la mañana siguiente con una relación molar de 1:300. Después de la escisión con FX_{a}, las muestras de proteína se concentraron 10 veces mediante ultrafiltración sobre membranas YM10 (Amicon). Después de una dilución de diez veces de la muestra de proteína con CaCl_{2} 2 mM, los derivados de tetranectina recombinantes TN123, TN23 y TN3 se aislaron mediante cromatografía de intercambio de iones en Q-Sepharose (Pharmacia, Suecia) con 10 volúmenes de columna en gradiente lineal desde Tris-HCl 10 mM a pH 8, CaCl_{2} 2 mM a Tris-HCl 10 mM a pH 8, CaCl_{2} 2 mM y NaCl 0,5 M. Después de eluir de las columnas de Ni^{2+}NTA-agarosa, las proteínas de fusión H6CIIFXTN123 y H6FXTN12 se concentraron del mismo modo por un factor de 10 con membranas YM10 y se filtraron con gel en tampón que contenía Tris-HCl 25 mM a pH 8, NaCl 25 mM y CaCl_{2} 2 mM, antes de la purificación del monómero plegado correctamente mediante cromatografía de intercambio de iones en Q-Sepharose tal como se ha descrito.

La tetranectina de longitud completa recombinante (TN123) producida por estos procedimientos ha sido analizada para determinar la unión a al kringle 4 del plasminógeno y a fucoidan inmovilizado, la expresión de sitios antigénicos y la localización de puentes disulfuro. En todos los criterios analizados, la TN123 producida se comportaba de forma idéntica a la tetranectina humana aislada de forma natural (no se muestran datos). Además, TN123 y TN3 han sido cristalizadas (Kastrup y cols., 1996) y también se ha determinado la estructura, todo lo aporta indicios de que, de hecho, se ha producido un producto único y plegado de forma biológicamente activa.

Análisis analítico por filtración en gel de proteínas rTN

Se realizaron análisis por filtración en gel de los derivados de tetranectina recombinante TN123, TN3 y TN23 (Fig. 9) en una columna de Superose 12 HR 10/30 (Pharmacia, Suecia) con un volumen total de 25 ml en NaCl 100 mM y Tris-HCl 50 mM a pH 8 y un caudal de 0,2 ml/minuto. El valor de K_{av} se define mediante K_{av}= (Ve-Vo)/(Vc-Vo).

Los análisis por filtración en gel de TN123 y TN23 muestran que ambas proteínas se encuentran exclusivamente en forma de trímeros en solución (valores de K_{av} de 0,27 y 0,29 respectivamente) mientras que TN3 apareció monomérico (K_{av}: 0,41).

Entrecruzamiento químico de tetranectina y derivados

Los derivados de tetranectina recombinantes TN123, TN3 y TN23 junto con las proteínas de fusión
CIIH6FXTN123 y H6FXTN12 o mezclas de estos derivados a concentraciones de 1 mg/ml en tampón de entrecruzamiento (borato sódico 0,1 M a pH 9,1) se incubaron con suberimidato de dimetilo (DMSI, Sigma). Se incubaron alícuotas de 10 \mul de solución de proteínas con alícuotas de 1 \mul de solución madre de DMSI (20 mg/ml en tampón de entrecruzamiento) durante 30 minutos a 25ºC antes de la adición de 2 \mul de tampón de inactivación (Tris-HCl 3 M, a pH 9). Se indujo el intercambio de subunidades entre homooligómeros preformados sometiendo mezclas de proteínas a tratamiento de choque térmico. Se mezclaron alícuotas de 5 \mul de cada solución proteínica (soluciones madre de 1 mg/ml) a 0ºC en tubos de microcentrifugadora de polipropileno estándar, se transfirieron a un baño de agua a 70ºC durante los periodos de tiempo que se indica y después se incubaron adicionalmente durante 15 minutos a 25ºC antes de hacerlas reaccionar con DMSI.

Antes del análisis por SDS-PAGE (geles al 12%) de los productos entrecruzados, las muestras de reacción se hirvieron en presencia de SDS y mercaptoetanol.

El análisis de entrecruzamiento de TN123 y la proteína de fusión CIIH6FXTN123 mostró que no había intercambio de subunidades entre los homooligómeros preformados en una mezcla de TN123 y CIIH6FXTN123 después de 16 horas a temperatura ambiente (Fig. 10). El intercambio de subunidades pudo inducirse incubando la mezcla de proteínas a 70ºC durante 15 segundos o más antes de enfriar a temperatura ambiente y añadir DMSI. El análisis por SDS-PAGE demostró la presencia de cuatro bandas de trímeros mayores de 95 kDa (que corresponden a dos homotrímeros y dos heterodímeros y tres bandas de dímeros (que corresponden a dos homodímeros y un heterodímero) en el gel entre 43 y 55 kDa, con una abundancia relativa de acuerdo con la asociación aleatoria de subunidades monoméricas en forma de trímeros después del intercambio de subunidades. Debe observarse, que los marcadores de peso molecular sólo se han incluido en los geles de SDS-PAGE para la calibración en bruto y orientación de los geles.

La organización trimérica de la tetranectina se corroboró adicionalmente mediante estudios de entrecruzamiento de las proteínas H6FXTN12, TN23 y TN3 y mezclas entre ellas (Fig. 11). El derivado de tetranectina TN3, que contenía únicamente el CRD, no podía entrecruzarse incluso a concentraciones elevadas de proteínas y no interfería con el entrecruzamiento de rTN123. Del mismo modo, el derivado TN23, que contenía el exón 2 y el CRD apareció monomérico después del entrecruzamiento y se encontró que no interfería con la trimerización de TN123 durante el intercambio de subunidades. Las moléculas TN23 diméricas que se encontraron en abundancia reducida en la muestra probablemente refleja dímeros con puentes de disulfuro plegados de forma errónea. La proteína de fusión H6FXTN12 formaba homotrímeros al entrecruzar y generaba heterotrímeros con TN123 tras el intercambio de subunidades. Debido a la diferencia del tamaño de la tetranectina de longitud completa (TN123) y H6FXTN12, las nueve bandas de proteínas posibles que resultaban del entrecruzamiento químico son: los cuatro trímeros [(TN123)_{3}, (TN123)_{2}(H6FXTN12), (TN123)(H6FXTN12)_{2} y (H6FXTN12)_{3}] a aproximadamente 95 kDa, 50 kDa, 37 kDa y 20 kDa, respectivamente; los tres dímeros [(TN123)_{2}, (TN123)(H6FXTN12) y (H6FXTN12)_{2}] a aproximadamente 45 kDa, 30 kDa y 15 kDa, respectivamente; y los dos monómeros TN123 a 23 kDa y H6FXTN12 a 9 kDa.

Tomados conjuntamente, el análisis por filtración en gel y el análisis de entrecruzamiento de los derivados de tetranectina muestran que la tetranectina, al igual que el grupo de la colectina de las lectinas de tipo C, es una molécula trimérica y que los residuos aminoacídicos que se demostró que estaban directamente implicados en la trimerización del monómero de tetranectina están localizados en el exón 2 de la proteína (Val17 - Val49). Además, el intercambio de subunidades entre las moléculas triméricas sólo podía observarse después de la desnaturalización térmica. Los residuos aminoacídicos Glu1 a Asp16 de la tetranectina son críticos para el entrecruzamiento químico con DMSI y, más importante, parecen estabilizar la molécula trimérica porque el análisis del entrecruzamiento de la mezcla de TN123 y TN23 no mostraba disminución de la formación de TN123 después de la desnaturalización térmica y posible intercambio de subunidades (Fig. 11). La estabilidad del trímero de tetranectina se corroboró mediante análisis de entrecruzamiento con DMSI a diferentes temperaturas. Se preincubaron 15 \mul de TN123 a una concentración de 0,3 mg/ml durante 10 minutos a 37ºC, 50ºC, 60ºC o 70ºC antes de la adición de 2 \mul de DMSI (20 mg/ml). La reacción se dejó seguir durante 15 minutos antes de inactivar la reacción con 5 \mul de Tris-HCl 3 M a pH 9,1 y las mezclas de reacción se dejaron enfriar a temperatura ambiente. El análisis por SDS-PAGE de muestras reducidas (Fig. 12) mostró que los trímeros son fácilmente detectables incluso a 60ºC, aunque un patrón de competición de especimenes entrecruzados aumenta con temperaturas crecientes. La aparición de otros especimenes de entrecruzamiento se debe probablemente al desplegado del CRD. La estabilidad del elemento estructural de trimerización de tetranectina se analizó adicionalmente usando una proteína quimérica diseñada en el Ejemplo 3.

Ejemplo 3 Diseño y construcción de la proteína quimérica TRIPB-UB - el elemento estructural de trimerización de tetranectina y ubiquitina

Se usó un clon de plásmido, pLCMHF/UB, generosamente proporcionado por el Dr. O. Wilborg que alberga un inserto de ADNc de ubiquitina humana (SEC. ID. Nº: 16) como plantilla y la SEC. ID. Nº: 7 junto con la SEC. ID. Nº: 18 se usaron para amplificación en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Saiki y cols., 1998) de la secuencia de nucleótidos que codifica los residuos aminoacídicos Ile1 a Gly 76 de la ubiquitina humana (SEC. ID. Nº: 19). El fragmento de ADN amplificado, tras la digestión con las endonucleasas de restricción BamHI y HindIII, se ligó entre los sitios BamHI y HindIII de pTtripb (Ejemplo 1) proporcionando pTtripb-UB (Fig. 13) usando procedimientos estándar.

Para preparar la proteína de fusión quimérica H6FXtripb-UB (Fig. 14, SEC. ID. Nº: 31) se cultivó el plásmido pTtripb-UB a media escala (4 x 1 litro; medio 2xTY, MgSO_{4} 5 mM y 100 \mug de ampicilina) en células de E. coli BL21, tal como describieron Studier y cols. (1990). Los cultivos con crecimiento exponencial a 37ºC se infectaron a una DO_{600} de 0,8 con bacteriófago lambda CE6 con una multiplicidad de aproximadamente 5. Los cultivos se cultivaron a 37ºC durante otras tres horas y las células se recolectaron por centrifugación. Las células se volvieron a suspender en 150 ml de NaCl 0,5 M, Tris-HCl 10 mM a pH 8 y EDTA 1 mM a pH 8. Se añadió fenol (100 ml, ajustado a pH 8) y la mezcla se sometió a ultrasonidos para extraer la proteína total. La proteína se precipitó de la fase de fenol mediante 2,5 volúmenes de etanol y centrifugación. El sedimento de proteína se disolvió en un tampón que contenía cloruro de guanidino 6 M, Tris-HCl 50 mM a pH 8 y ditioeritriol 0,1 M. Tras la filtración en gel Sephadex G-25 (Pharmacia, Suecia) en urea 8 M, NaCl 1 M, Tris-HCl 50 mM a pH8 y 2-mercaptoetanol 10 mM, la preparación de proteína cruda se aplicó a una columna de NTA activado con NI^{2+}-agarosa para purificar (Hochuli y cols., 1988) y plegar la proteína de fusión H6FXtripb-UB.

La síntesis y carga de la matriz de NTA activado con Ni^{2+}-agarosa se describe en el Ejemplo 2. Todos los tampones para la cromatografía líquida se desgasificaron antes de su uso. La proteína de fusión H6FXtripb-UB se plegó eliminando la urea y el 2-mercaptoetanol del tampón II en gradiente con 5 volúmenes de columna en Tris-HCl 50 mM a pH 8 y NaCl 0,5 M. Después de completar los procedimientos de plegado, las proteínas de fusión derivadas de tetranectina se eluyeron de las columnas de Ni^{2+}NTA-agarosa con un tampón que contenía NaCl 0,5 M, Tris-HCl 50 mM, EDTA 25 mM a pH 8 y se filtraron en gel con una columna Sephadex G50 (Pharmacia) con tampón de borato sódico 0,1 M a pH 9 para el análisis de entrecruzamiento químico con DMSI.

El experimento de análisis de entrecruzamiento se diseñó tanto para analizar el estado oligomérico de la proteína de fusión quimérica como la estabilidad térmica del trímero de la proteína de fusión presumido tal como se describe en el Ejemplo 2: Muestras de 15 \mul de proteína de fusión H6FXtripb-UB, a una concentración de aproximadamente 1,0 mg/ml, se preincubaron 10 minutos a 37ºC, 50ºC, 60ºC o 70ºC antes de la adición de 2 \mul de DMSI (20 mg/ml). Las reacciones se dejaron seguir durante 15 minutos antes de inactivar mediante 5 \mul de Tris-HCl 3 M a pH 9,1 y las mezclas de reacción se dejaron enfriar a temperatura ambiente. El análisis por SDS-PAGE de muestras reducidas (Fig. 12) mostró (1) que la proteína de fusión H6FXtripb-UB es un trímero en solución (monómero en 17 kDa, dímero en 35 kDa y trímero en 43 kDa) y (2) que hay presente una cantidad sustancial de moléculas triméricas incluso a 70ºC. La aparición de otros productos de entrecruzamiento más grandes es probablemente debida al entrecruzamiento de trímeros a través de la parte de ubiquitina de la proteína de fusión.

Ejemplo 4 Diseño y construcción de anticuerpos scFv CEA6 trimerizados y hexamerizados scFv (CEA6)-TRIPB, TRIPB-scFv (CEA6) y scFv (CEA6)-TRIPB-scFv (CEA6)

Un clon de plásmido, pUC19MCH/CEA6, generosamente proporcionado por el Dr. Kevin Pritchard, Cambridge Antibody Technology Ltd., Melbourne, Reino Unido, que albergaba una secuencia de nucleótidos (SEC. ID. Nº: 20) que codificaba el anticuerpo CEA6 en formato de Fv monocatentario (scFv), seguido en secuencia por un "marcador myc" (que es un marcador de purificación/detección general) se usó como plantilla en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Saiki y cols., 1988) en la que se amplificó la secuencia de nucleótidos que codificaba el scFv + marcador myc usando los pares de cebadores (SEC. ID. Nº: 21 y SEC. ID. Nº: 22) y (SEC. ID. Nº: 21 y SEC. ID. Nº: 23) para generar los fragmentos "A" y "B" de la PCR.

El fragmento "A" de la PCR se trató con las enzimas de restricción BamHI y KpnI y el fragmento resultante se insertó en pTripb cortado con BglII/KpnI (Ejemplo 1) para obtener el vector pTH6FXscFv (CEA6) - tripb (Fig. 15) que codificaba la proteína de fusión H6FXscFv (CEA6) - TRIPB (Fig. 16). El fragmento "B" de la PCR se trató con las enzimas de restricción BamHI y HindIII y el fragmento resultante se insertó en pTripb cortado con BamHI y HindIII (Ejemplo 1) para obtener el vector pTH6FXtripb-scFv (CEA6) (Fig. 17) que codificaba la proteína de fusión H6FXTRIPB-scFv (Fig. 18, SEC. ID. Nº: 33) usando procedimientos estándar.

Para generar el vector de expresión pTH6FXscFv (CEA6)-tripb-scFv (CEA6) (Fig. 19) que codificaba la proteína de fusión H6FXscFv (CEA6)-TRIPB-scFv (CEA6) (Fig. 20, SEC. ID. Nº: 34), el inserto del vector pTH6FXtripb-scFv (CEA6) se escindió usando las enzimas de restricción BamHI y HindIII y se insertó en el vector pTH6FXscFv (CEA6) - tripb que había sido tratado con las enzimas de restricción BamHI y HindIII.

Para preparar las proteínas de fusión quiméricas H6FXscFv (CEA6) - TRIPB (SEC. ID. Nº: 32), H6FXTRIPB-scFv (CEA6) (SEC. ID. Nº: 33) y H6FXscFv (CEA6) - TRIPB- scFv (CEA6) (SEC. ID. Nº: 34), se cultivaron los plásmidos pTH6FXscFv (CEA6) - TRIPB, pTH6FXtripb-scFv (CEA6) y pTH6FXscFv (CEA6) - tripb - scFv (CEA6) a pequeña escala (1 litro; medio 2xTY, MgSO_{4} 5 mM y 100 \mug de ampicilina) en células de E. coli BL21, tal como describen Studier y cols. (1990). Los cultivos con crecimiento exponencial a 37ºC se infectaron a una DO_{600} de 0,8 con bacteriófago lambda CE6 con una multiplicidad de aproximadamente 5. Los cultivos se cultivaron a 37ºC durante otras tres horas y las células se recolectaron por centrifugación. Las células se volvieron a suspender en 50 ml de NaCl 0,5 M, Tris-HCl 50 mM a pH 8 y EDTA 1 mM a pH 8. Se añadió fenol (50 ml, ajustado a pH 8) a cada uno y las mezclas se sometieron a ultrasonidos para extraer la proteína total. Después de clarificación y centrifugado (25 minutos a 10.000 g), las fracciones de proteínas brutas se precipitaron de las fases de fenol mediante la adición de 2,5 volúmenes de etanol y centrifugación. Los sedimentos de proteína se disolvieron en un tampón (15-25 mol) que contenía cloruro de guanidino 6 M, Tris-HCl 50 mM a pH 8 y ditioeritriol 0,1 M. Tras la filtración en gel Sephadex G-25 (Pharmacia, Suecia) en urea 8 M, NaCl 1 M, Tris-HCl 50 mM a pH8 y 2-mercaptoetanol 10 mM, las preparaciones de proteínas crudas se aplicaron a columnas de NTA activado con NI^{2+}-agarosa (75 ml de volumen de columna) para purificar (Hochuli y cols., 1988). Después se hizo fluir tampón de lavado (guanidina 6 M en HCl, Tris-HCl 50 mM a pH 8 y 2-mercaptoetanol 10 mM) a través de las columnas hasta que se obtuvieron líneas iniciales estables. Después pudieron eluirse proteínas de fusión virtualmente puras aplicando un gradiente de pH a cada columna (gradiente de 1000 ml en urea 8 M y 2-mercaptoetanol 10 mM obtenido por mezclado lineal (por volumen) de las soluciones que contenían dihidrogenofosfato sódico 50 mM (tampón a pH 5) e hidrogenofosfato disódico 50 mM (tampón a pH 8).

Como preparación del plegado in vitro por el procedimiento de Thøgersen y cols. (documento WO 94/18227), se mezclaron 20 mg de cada proteína de fusión purificada en suspensiones de "tampón B" de plegado (descrito a continuación) con alícuotas de las suspensiones de matriz de NTA activado con Ni^{2+}-agarosa suficientes para generar columnas de aproximadamente 75 ml de volumen de lecho envasado. Cada proteína de fusión se sometió después al procedimiento de plegado iterativo tal como se describe para el kringle 4 del plasminógeno en la solicitud de patente de Thøgersen y cols. (documento WO 94/18227), pero el plegado de las proteínas de fusión que contenían scFv se llevó a cabo a 10ºC usando un tampón que contenía NaCl 0,5 M, Tris-HCl 50 mM a pH 8, glutationa 2 mM y glutationa oxidada 0,2 mM como "tampón A" y un tampón que contenía urea 8 M, NaCl 1 M, Tris-HCl 50 mM a pH 8 y glutationa 2 mM como "tampón B".

Después de completar el procedimiento de plegado, cada columna se lavó con 300 ml de tampón que contenía NaCl 0,5 M y Tris-HCl 50 mM a pH 8 para eliminar la glutationa. La fracción plegada de cada proteína se eluyó después de la matriz de NTA-agarosa mediante la adición de EDTA 20 mM al tampón de elución. Después de añadir urea sólida para lograr una concentración final de aproximadamente 8 M a cada muestra de proteína y dilución o diálisis para reducir las concentraciones de NaCl por debajo de 5 mM, la purificación final de cada producto de proteína de fusión correctamente plegada se logró después mediante cromatografía de intercambio de iones (S-Sepharose, Pharmacia, 1,6 (d. i.) en una columna de 90 centímetros con un tampón que contenía urea 8 M, Tris-HCl 5 mM (de una solución madre 1 M a pH 8) y acetato sódico 25 mM (de una solución madre 1 M a pH 5), eluida a 2 ml/minuto). Tras la diálisis con tampones acuosos (por ejemplo solución salina tamponada con fosfato) cada proteína de fusión pura y plegada correctamente se recuperó con rendimientos de 2-6 mg por litro de cultivo. Puede demostrarse, por análisis por filtración en gel, por análisis de entrecruzamiento químico, por mediciones de afinidad in vitro y por la eficacia in vivo, que cada proteína forma un complejo molecular homotrimérico: El estado oligomérico de la proteína de fusión H6FXtripb-scFv-(CEA6) se analizó mediante análisis de entrecruzamiento químico con DMSI: en experimentos paralelos, se incubaron muestras de H6FXtripb-scFv-(CEA6) a 0,34 mg/ml y TN123 a 0,28 mg/ml en borato sódico 0,1 M a temperatura ambiente con cantidades crecientes (0-40 \mug en 12 \mul en total) de DMSI durante 30 minutos. Las reacciones se inactivaron mediante la adición de 5 \mul de Tris-HCl 3 M a pH 9 y las muestras se analizaron por SDS-PAGE en condiciones reductoras (Fig. 21). Se demuestra así que, al igual que la tetranectina, la proteína de fusión H6FXtripb-scFv-(CEA6) de aproximadamente 38 KDa es un trímero en solución.

Referencias

Berglund, L., Petersen, T.E. 1992. The gene structure of tetranectin, a plasminogen binding protein. FEBS Lett. 309:15-19.

Bolivar, F. et al. (1977). Construction and characterization of new cloning vehicles, II. A multipurpose cloning system. Gene 2:95-113.

Carter, Paul and Merchant, Margaret of Genentech Inc. (1997). Current Opinion in Biotechnology 8:449-454.

Chang, A. et al. (1978). Phenotypic expression in E. coli of a DNA sequence coding for mouse dihydrofolate reductase. Nature 275:617-624.

Christensen, J.H., Hansen, P.K., Lillelund, O., Thøgersen,.H.C. (1991). Sequence-specific binding of the N-terminal three-finger fragment of transcription factor IIIA to the internal control region of a 5S RNA gene. FEBS Lett. 281:181-184.

Clemmensen (1989). Scand J. Clin. Lab. Invest. 49:719-725

Day, A.J. (1994). The C-type carbohydrate recognition domain (CRD) superfamily. Biochem. Soc. Trans. 22:83-87.

Ellgaard, L., Holtet, T.L., Nielsen, P.R., Etzerodt, M., Gliemann, J. and Thøgersen, H.C. (1997). Eur. J. Biochem. 244:544-551.

Fiers, W. et al. (1978).Complete nucleotide sequence of SV40 DNA. Nature 273:113-120.

Fuhlendorff, J., Clemmensen, I. and Magnusson, S. (1987). Primary structure of tetranectin, a plasminogen kringle 4 binding plasma protein: Homology with asialoglycoprotein receptors and cartilage proteoglycan core protein. Biochemistry 26:6757-6764.

\newpage

Goeddel, D.V. et al. (1979). Direct expression in Escherichia coli of a DNA sequence coding for human growth hormone. Nature 281:544-548.

Hess, B. et al. (1969). Cooperation of Glycolytic Enzymes. Advances in Enzyme Regulation 7:149-166.

Hitzman, R.A. et al. (1980). Isolation and Characterization of the Yeast 3-Phosphoglycerokinase Gene (PGK) by an Immunological Screening Technique. Journal of Biological Chemistry 25:12073-12080.

Hochuli, E., Bannwarth, W., Döbeli, H., Gentz, R. and Stüber, D. (1988). Genetic approach to facilitate purification of recombinant proteins with a novel metal chelate adsorbent. Bio/Technology 6:1321-1325.

Holland, M. et al. (1978). Isolation and Identification of Yeast Messenger Ribonucleic Acids Coding for Enolase, Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase, and Phosphoglycerate Kinase. Biochemistry 17:4900-4907.

Holtet, T.L., Graversen, J.H., Thøgersen, H.C. and Etzerodt, M. (1996).Domains and shared motifs in plasminogen - ligand interaction. Poster 21st Annual Lorne Conference on Protein Structure and Function, held Melbourne, Australia, February 4-8, 1996.

Itakura, K. et al. (1977). Expression in Escherichia coli of a Chemically Synthesized Gene for the Hormone Somatostatin. Scsence 198:1056-1063.

Jones, E.W. (1977). Proteinase Mutants of Saccharomyces Cerevisiae. Genetics 85:23-33.

Kastrup, J.S. (1996). Lecture at Minisymposium held by EU HCM contract CHRX-CT93-0143: Protein Crystallography I in Hamburg, Germany, December 13-14, 1996.

Kastrup, J.S., Rasmussen, H., Nielsen, B.B., Larsen, I.K., Holtet, T.L., Graversen, J.H., Etzerodt, M. and Thøgersen, H.C. (1996). The human plasminogen binding protein tetranectin: Crystallization and preliminary X-ray analysis of the C-type lectin domain and the full length protein. Acta Cryst. D 53:1087111.

Kingsman A.J. et al. (1979). Replication in Saccharomyces cerevisiae of plasmid pBR313 carrying DNA from the yeast trpl region. Gene 7:141-152.

Larsen, I.K., Nielsen, B.B., Rasmussen, H. and Kastrup, J.S. (1996). Poster, 17th International Crystallography Congress, Seattle, USA held Augüst 8-17, 1996.

Nagai, K. and Thøgersen, H.C. (1987). Synthesis and sequence-specific proteolysis of hybrid proteins produced in Escherichia coli. Meth. in Enzymol. 152:461-481.

Nature Biotechnology (1998), 16:431-462.

Neame, P.J. and Boynton, R.E. (1996), Protein Soc. Symposium, (Meeting date 1995; 9th Meeting: Tech. Prot. Chem VII).. Proceedings pp. 401-407 (Ed., Marshak, D.R.; Publisher: Academic, San Diego, Calif.).

Neame, P.J., Young, C.N, and Treep, J.T. (1992). Prot. Sci. 1:161-168.

Nielsen, B.B. (1996). Lecture, Lundbeck Centre Neuro-Medicinal Chemistry Minisymposium held November 5, 1996 at the Royal Danish School of Pharmacy, Copenhagen.

Nielsen, B.B., Larsen, I.K., Rasmussen, H. and Kastrup, J.S. (1996). Lecture, Danish Crystallographer's Meeting, held June 3-4, 1996 at the Royal Danish School of Pharmacy, Copenhagen.

Saiki, R.K., Gelfand, D.H., Stoffel, S., Scharf, S.J., Higuchi, R., Horn, G.T., Mullis, K.B. and Erlich, H.A. (1988). Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239:487-491.

Schaper, W. and Ito, W.A. (1996). Therapeutic targets in cardiovascular disorders. Current opinion in Biotechnology 7:635-640.

Siebenlist, U. et al. (1980). E. coli RNA Polymerase Interacts Homologously with Two Different Promoters. Cell 20:269-281.

Stinchomb, D.T. et al. (1979). Isolation and characterisation of a yeast chromosomal replicator. Nature 282:39-43.

Studier, W., Rosenberg, A.H., Dunn, J.J. and Dubendorff, J.W. (1990). Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Meth. in Enzymol. 185:60-89.

Tschumper, G. et al. (1980). Sequence of a yeast DNA fragment containing a chromosomal replicator and the TRP1 gene Gene 10:157-166.

Wewer, U.M. and Albrechtsen, R. (1992). Tetranectin, a plasminogen kringle 4-binding protein_Cloning and gene expression pattern in human colon carecer. Lab. Invest. 67:253-262.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Thøgersen, Hans Christian

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: Ristrupvej 41

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Mundelstrup

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO O PROVINCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Dinamarca

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 8381

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Módulo de trimerización

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 34

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

FORMA DE LECTURA INFORMATIZADA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE SOPORTE: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: Compatible con IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: FastSEQ para Windows Versión 2.0

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO E SOLICITUD:

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 47 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTGATCAAT CCAGGGAAGA TCTCCTGGTA CCGAGCCACC AACCCAG

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCAAGCTTAT TAGGATCCCG TCTGCAGGGC CTG

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 40 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGAAGCTTA TTAGGATCCC TTAGGGAGA CCTCTGCAG

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ninguno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Ser Ile Gln Gly Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 52 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ninguno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

1

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 49 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ninguno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 6:

2

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 181 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ninguno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

3

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTGGATCCA TCGAGGGTAG GGGCGAGCCA CCAACCCAG

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGAAGCTTA CACGATCCCG AACTG

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ninguno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Ser Ile Glu Gly Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ninguno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Val Arg Ala Asn Lys Arg Asn Glu Ala Leu Arg Ile Glu Ser Ala}

\sac{Leu Leu Asn Lys Ile Ala Met Leu Gly Thr Glu Lys Thr Ala Glu Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ninguno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Ser His His His His His His Gly Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ninguno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGAAGCTTA GACCGTCTGC AGGGC

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ninguno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGCGGATCCA TCCAGGGTAG GGTTGTGAAC ACAAAGATG

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTGGATCCA TCGAGGGTAG GGCCCTGCAG ACGGTC

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 227 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 16:

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGCTGATCAC AGATCTTTGT GAAGACC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCAAGCTTG CATGCTTAGG ATCCACCACG AAGTCTCAA

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 76 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ninguno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

5

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 786 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ninguno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

6

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTGGATCCC AGGTTCAGCT GCAGC

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCGGTACCG GCCCCATTCA GATCC

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCCAAGCTTA GGCCCCATTC AGATCC

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 228 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ninguno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

7

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 197 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ninguno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 65 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ninguno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 26:

\vskip1.000000\baselineskip

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 180 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ninguno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 27:

\vskip1.000000\baselineskip

10

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 73 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ninguno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 28:

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 69 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ninguno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 29:

\vskip1.000000\baselineskip

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 152 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ninguno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 30:

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 145 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ninguno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 31:

\vskip1.000000\baselineskip

15

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 330 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ninguno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 32:

\vskip1.000000\baselineskip

17

18

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 331 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ninguno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 33:

\vskip1.000000\baselineskip

19

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 592 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ninguno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 34:

\vskip1.000000\baselineskip

21

22

Claims (38)

1. Un complejo polipeptídico trimérico que comprende tres polipéptidos monoméricos, en el que (i) cada uno de dichos polipéptidos monoméricos comprende un elemento estructural de trimerización de tetranectina (TTSE), siendo dicho TTSE un polipéptido que presenta una identidad entre su secuencia de aminoácidos y la secuencia consenso que se muestra en la Fig. 2 del 68%, y (ii) al menos uno de dichos polipéptidos monoméricos está ligado covalentemente a, al menos, un resto heterólogo.

2. Un complejo polipeptídico trimérico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la identidad entre su secuencia y la secuencia consenso es al menos del 75%.

3. Un complejo polipeptídico trimérico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la identidad entre su secuencia y la secuencia consenso es al menos del 81%.

4. Un complejo polipeptídico trimérico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la identidad entre su secuencia y la secuencia consenso es al menos del 87%.

5. Un complejo polipeptídico trimérico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la identidad entre su secuencia y la secuencia consenso es al menos del 92%.

6. Un complejo polipeptídico trimérico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el TTSE comprende la secuencia consenso que se muestra en la Figura 2.

7. Un complejo polipeptídico trimérico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el TTSE se deriva de tetranectina humana, tetranectina murina, lectina tipo C de cartílago bovino o lectina tipo C de cartílago de tiburón.

8. Un complejo polipeptídico trimérico de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el TTSE se deriva de tetranectina humana y comprende los residuos aminoacídicos V17 a V49 (exón 2) que se muestran en la Figura 1.

9. Un complejo polipeptídico trimérico de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el TTSE que se deriva de tetranectina humana comprende además los residuos aminoacídicos C50 a K52 (exón 3) que se muestran en la SEC. ID. Nº: 7.

10. Un complejo polipeptídico trimérico de acuerdo con la reivindicación 9, en el que residuo aminoacídico C50 se muta a otro residuo aminoacídico, que incluye un residuo aminoacídico que se selecciona del grupo que consiste en serina, treonina y metionina.

11. Un complejo polipeptídico trimérico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que polipéptido monomérico comprende además los residuos aminoacídicos E1 a D16 (exón 1) que se muestran en la Figura 1.

12. Un complejo polipeptídico trimérico de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el al menos un residuo aminoacídico del exón 2 que se selecciona del grupo que consiste en los residuos aminoacídicos nº 21, 22, 24, 25, 27, 28, 31, 32, 35, 39, 41, 42 se sustituyen por un residuo aminoacídico que no rompe la hélice, refiriéndose el número de los residuos aminoacídicos a los residuos aminoacídicos de la SEC. ID. Nº: 7.

13. Un complejo polipeptídico trimérico de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el residuo aminoacídico nº 6 se sustituye por un residuo aminoacídico que no rompe la hélice, refiriéndose el número del residuo aminoacídico a los residuos aminoacídicos de la SEC. ID. Nº: 7.

14. Un complejo polipeptídico trimérico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el TTSE comprende una heptada repetida que tiene la fórmula a-b-c-d-e-f-g (del extremo N al C), en el que una mayoría de los residuos aminoacídicos a y d son aminoácidos hidrófobos.

15. Un complejo polipeptídico trimérico de acuerdo con la reivindicación 14, en el que la heptada se repite 3 veces y en el que los residuos aminoacídicos localizados en las posiciones a y d de la secuencia de la tercera aparición de la repetición de la heptada son residuos de glutamina.

16. Un complejo polipeptídico trimérico de acuerdo con la reivindicación 1 que es estable a temperaturas de hasta 70ºC, incluyendo el intervalo de temperatura de 50-70ºC.

17. Un complejo polipeptídico trimérico de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende hasta 6 restos heterólogos.

18. Un complejo polipeptídico trimérico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el al menos un resto heterólogo es un polipéptido.

19. Un complejo polipeptídico trimérico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el al menos un resto heterólogo se selecciona del grupo que consiste en una estructura de unión a ligandos; una toxina; un marcador detectable; una sustancia que puede activarse in situ; una enzima; un resto radioactivo; una citoquina; un polímero no proteínico tal como un alcaloide polimérico, un polialcohol, un polisacárido, un lípido y una poliamina; un agente de fotoentrecruzamiento; y un grupo que facilita la conjugación del polipéptido con una diana.

20. Un complejo polipeptídico trimérico de acuerdo con la reivindicación 19, en el que la estructura de unión a ligandos se selecciona del grupo que consiste en una molécula de receptor, la parte de unión a ligandos de una molécula de receptor, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo de unión a antígenos y una molécula que tiene características de anticuerpo.

21. Un complejo polipeptídico trimérico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho al menos un resto heterólogo está posicionado en el extremo C del polipéptido monomérico.

22. Un complejo polipeptídico trimérico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho al menos un resto heterólogo está posicionado en el extremo N del polipéptido monomérico.

23. Un complejo polipeptídico trimérico de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende al menos un resto heterólogo que está posicionado en el extremo N del polipéptido monomérico y al menos un resto heterólogo que está posicionado en el extremo C del polipéptido monomérico.

24. Un complejo polipeptídico trimérico de acuerdo con la reivindicación 23, en el que el al menos un resto heterólogo que está posicionado en el extremo N del polipéptido monomérico es diferente del al menos un resto heterólogo que está posicionado en el extremo C del polipéptido monomérico.

25. Un complejo polipeptídico trimérico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el al menos un resto heterólogo está ligado covalentemente al polipéptido monomérico mediante un enlace peptídico al extremo N o C de la cadena polipeptídica monomérica, mediante un enlace peptídico a la cadena lateral del polipéptido monomérico, mediante un enlace a un residuo de cisteína o cuando hay más de un resto heterólogo, a combinaciones de estas
localizaciones.

26. Un complejo polipeptídico trimérico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que carece de grupos aminícos y/o carboxílicos libres.

27. Un complejo polipeptídico trimérico de acuerdo con la reivindicación 1, que es homotrimérico.

28. Un complejo polipeptídico trimérico de acuerdo con la reivindicación 1, que es heterotrimérico.

29. Un procedimiento para preparar un complejo polipeptídico trimérico de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende (i) la expresión o síntesis de los polipéptidos monoméricos de acuerdo con la reivindicación 1, (ii) efectuar la formación de complejos entre dichos polipéptidos monoméricos y (iii) aislar el complejo polipeptídico trimérico resultante y opcionalmente someter dicho complejo polipeptídico trimérico a procesamiento adicional.

30. Un kit que comprende un complejo polipeptídico trimérico de acuerdo con la reivindicación 1.

31. Un complejo polipeptídico trimérico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-28 para usar como medicamento.

32. Uso de un complejo polipeptídico trimérico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-28 como componente de un producto quimérico que tiene una capacidad antigénica baja en seres humanos comparado con formulaciones que comprenden uno o más componentes de origen distinto al humano.

33. Uso de un complejo polipeptídico trimérico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-28 como vehículo para ensamblar fragmentos de anticuerpos en forma de entidades oligoméricas o multivalentes para generar anticuerpos artificiales quiméricos que tienen propiedades farmacocinéticas y/o farmacodinámicas preseleccio-
nadas.

34. Uso de un complejo polipeptídico trimérico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-28 para tecnología de banco de proteínas, tal como tecnología de presentación en macrófagos.

35. Uso de un complejo polipeptídico trimérico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-28 para la preparación de una composición farmacéutica.

36. Uso de acuerdo con la reivindicación 35, en el que la composición farmacéutica comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable.

37. Uso de acuerdo con la reivindicación 35 ó 36 en el que la composición farmacéutica es para administrarse por una vía que se selecciona del grupo constituido por la vía intravenosa, la vía intraarterial, la vía transmembranosa del tejido bucal, anal, vaginal o conjuntivo, la vía intranasal, la vía pulmonar, la vía transdérmica, la vía intramuscular, la vía subcutánea, la vía intratecal, inoculación en tejido tal como un tumor o mediante implante.

38. Uso de acuerdo con la reivindicación 35 en el que el polipéptido trimérico está comprendido en un liposoma.