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JP2005530484A - アルブミン融合抗血管形成ペプチド - Google Patents

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Abstract

本発明は、アルブミン（アルブミンの断片または変種を含むが、それらに限定されない）へ融合または接合された、抗レトロウイルス活性を示す、エンドスタチン（その断片および変種を含むが、それらに限定されない）のような血管形成阻害ペプチドを含んでなるタンパク質に関する。これらの融合タンパク質は、ここでは“本発明のアルブミン融合タンパク質”として包括的に称されている。これらの融合タンパク質は、溶解状態で長期貯蔵期間および／または長期または治療活性を示す。本発明は、治療用アルブミン融合タンパク質、組成物、医薬組成物、処方物およびキットを包含している。本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする核酸分子、並びにこれらの核酸を含有したベクター、これらの核酸およびベクターで形質転換された宿主細胞、およびこれらの核酸、ベクターおよび／または宿主細胞を用いて本発明のアルブミン融合タンパク質を作製する方法も包含している。本発明は、血管内皮細胞の増殖および腫瘍血管形成誘導性細胞融合を阻害するための組成物および方法にも関する。本発明は、一次腫瘍および転移物の成長を妨げ、またはその退縮を促進するための；および癌、糖尿病性網膜症、進行性黄斑変性またはリウマチ様関節炎を治療するための組成物および方法にも更に関する。

Description

発明の背景
発明の分野
本発明は、抗血管形成ペプチドおよびアルブミン融合タンパク質の分野に関する。
背景技術
時には血管新生（neoangiogenesis）とも称される血管形成（angiogenesis）は、新たな毛細血管および血管が発育することである。
このプロセスは、胎児発育；月経；排卵；胎盤発育；疾患または虚血、神経再生、骨成長および創傷治癒の分野における側副血管の発育を含めた、いくつかの生物学的状態時に通常生じる。これらすべての現象、特に胎児発育では、内皮細胞の非常に急速な成長、それらの移動および複雑な血管ネットワークへの分化を要する。
しかしながら、正常な成人の場合は、（開始の１〜２週間以内で通常始動および停止する）前記の生物学的現象を除き、血管形成は不要であり、内皮細胞は静止状態にある。
通常、内皮細胞は非常にゆっくり再生して、３〜４年毎に約１回ターンオーバーする。内皮細胞は分裂する能力を失っておらず；むしろ、それらは血管形成の内在促進因子と抑制因子との複雑なバランスにより抑えられている。
新血管が腫瘍成長および転移に必要であるという概念は、１９７０年代にFolkmanにより発表された。過去７年間で、Folkmanの研究室は、血管形成を阻害する数種のペプチドおよびタンパク質、特にアンギオスタチン（angiostatin）、エンドスタチン、およびコラーゲンおよび他の基底膜タンパク質の小さなペプチド誘導体を発見した。
これらの治療剤は、腫瘍細胞を直接攻撃するよりも、むしろ腫瘍細胞へ栄養補給する血管を攻撃することで癌を攻撃する、という新たな手法を提供する。
従来の抗腫瘍療法において、化学療法は、癌細胞の高成長速度を標的としており、癌または臓器特異性癌のサブタイプにより発現される特定の癌遺伝子またはレセプターを標的とするように多くが行われる。腫瘍細胞は本来遺伝的に不安定であるため、それらはそれらの遺伝子構造を変えるか、または薬物耐性になることで、化学療法剤をしばしば欺いている。同様に、ある特定タイプの癌に対して有効な剤は、異なる臓器部位の癌に対して無効である。
標準化学療法で第二の大きな欠点は、高い分裂速度を有する正常細胞−血液および骨髄細胞、胃腸細胞、および毛包の細胞のような細胞に対する重度の毒性である。
そのため、今日化学療法で出会う最大の問題は、特異性の欠如（毒性副作用を生じる）および高腫瘍細胞変異率に起因した薬物耐性である。
内皮細胞を標的にすれば、これらの問題を回避して、転移拡散と戦う手段も提供しうるであろう。内皮細胞は通常増殖しないため、それらは急速に変異する適応能力を備えておらず、薬物耐性を獲得しずらい。
内皮細胞は異なる臓器部位でも同一かどうかという重大な論争が続いているが、それらがそれらの移動および増殖を誘発する生化学シグナルおよび刺激へ同様に応答することは確実である。
そのため、研究者および臨床医は、腫瘍細胞よりもむしろ内皮細胞を標的とすることで、化学療法にしばしば伴う非特異的毒性を克服しうる可能性のある、より普遍的な癌治療へのアプローチを行えるのである。
遺伝的に安定な内皮細胞に影響を与える抗血管形成薬物も、薬物耐性を生じにくい。
最後に、抗血管形成療法は、腫瘍を「餓死」させて、転移拡散に必要な脈管系を消失させるようにデザインされる。特に、腫瘍を標的とする現行癌療法とは異なり、エンドスタチンのような腫瘍血管形成を阻害する剤は腫瘍生命支持系を標的とする。血管形成インヒビターによる有効な治療は、腫瘍を「餓死」させて大きく成長できないようにさせ、一次腫瘍から剥離した現存小転移物が脈管系を発育させて臨床上重要な腫瘍に成長することがないようにするはずである。加えて、これらの剤は進行した一次腫瘍および転移物の退縮を起こさせる。それらは腫瘍血管に対して高度に特異的であるため、それらの使用は正常細胞へのダメージおよび関連副作用を避けられる。
血管形成は、おそらく様々なタイプの癌で異なる役割を果たすであろう。
抗血管形成療法から最も利益を得やすい患者は、早期段階にある局所疾患の患者である；理想的には、医者は治癒手術を行えるか、または攻撃的化学療法を行えるほど局所的に進行した疾患を有する患者で腫瘍負担を軽減しうるであろう。加えて、遺伝的に癌になりやすいことが知られた患者は、予防処置として血管形成インヒビターを摂取してもよい。
癌の大多数は、それらの自然過程で遅く診断される。結果的に、ほとんどの患者の場合で、癌治療医はその原発部位（一次腫瘍）のみでなく離れた部位（転移物）でも疾患をコントロールしなければならない。手術、放射線療法および化学療法はこれらの目標を果たす上で利用しうる主要な手段であるが、多くの癌に伴う高死亡率はこれら治療の不適当性を強調している。
各場合に、これらの治療は次の理由から失敗している：
・治療の毒性が、その疾患に対して治療で得る効果を上回っている。
・悪性細胞は放射線または化学療法に対して耐性を獲得するか、または広く散在しすぎて放射線または手術で治療できないため、すべての癌細胞が治療で根絶されることはない。
細胞毒性化学療法では、癌治療医が治療の効力とその病状とのバランスをはかる必要が多くの場合にある。医薬はその全身効果から力を得ているが、細胞毒性化学療法も−そのほとんどが活発に増殖する細胞を選択する−急速に分裂する正常細胞を破壊する。
正常および癌細胞双方の破壊は、次のようないくつかの歓迎されない副作用を生じる：
・骨髄の破壊による貧血および好中球減少（免疫細胞の喪失〔血小板減少〕）
・胃腸内壁へのダメージによる悪心および嘔吐
・毛包の死
・神経系へのダメージ。
現行療法−手術、放射線および細胞毒性化学療法−は、これらのモダリティーを用いて、できるだけ多く癌治療法を改善してきた。更なる改善の実施に癌分子病原性の知識の活用を要することは確実らしい。
J.Folkman’s 1971 New England Journal of Medicine paper(volume 285,page 1182-1186)は、血管形成が癌の病原性にとり重要であり、腫瘍と相互作用する正常組織が抗癌療法の標的になりうることを紹介した。
一次Lewis肺癌の前臨床効力研究および転移Ｂ１６異種移植片研究では、エンドスタチンの皮下投与後における腫瘍血行停止を証明した。免疫組織化学では、この効果が腫瘍血管形成の阻害で媒介されることを証明した。エンドスタチン療法が継続されたとき、腫瘍は休止状態で留まり、重要なことに薬物耐性または毒性効果の証拠はみられなかった。実際に、この毒性欠如は再び正式な毒物学試験で示され、こうして現在開発中の抗血管形成化合物の多くについて直接的利点を証明した。
ＮＣＩを含めた他の研究グループにより作製されたデータでは、いかなる抗腫瘍効果も示せなかった。しかしながら、相反する結果の理由が特定され、ＮＣＩはエンドスタチンの抗血管形成性に今では満足しているようである。
１９９９年７月に、ＦＤＡは固形腫瘍の患者の治療でエンドスタチンのInvestigational New Drug（ＩＮＤ）申請を承認したため、ＮＣＩおよびEntraMedにその組換えタンパク質で３つの第Ｉ相臨床研究を開始させることができた。
第一の研究は、様々な固形腫瘍の患者について、ボストンのDana-Farber Cancer Instituteで１９９９年９月に開始された。ＮＣＩは、ヒューストンのAnderson Cancer CentreおよびUniversity of Wisconsinで行われた他の第Ｉ相臨床研究のスポンサーになった。患者は２８日サイクルでエンドスタチンの静脈内投与を毎日受け、BostonおよびWisconsinセンターの患者は毎日同用量の薬物を維持したが、ヒューストンの患者は疾患が安定していれば８週間隔で増量した。
その研究から報告された予備結果は、エンドスタチン投与された６１例の患者中、患者１２例が４〜１２月間のエンドスタチン療法を受けたことを示している。１２例中５例の患者は最短で４月間にわたり安定な病状を有し、これら患者のうち２例は１２月間以上にわたり治療を受けた。
Anderson Centreで行われた試験において、ＰＥＴスキャニングではエンドスタチン投与患者で腫瘍血流の有意な減少を示した。この観察はUniversity of Wisconsin研究により追認され、そこでは５６日間のエンドスタチン治療後に、心臓を通る血流は未変化であるにもかかわらず、一部患者の腫瘍で血流が減少したことを示した。尿塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）レベルの用量依存的減少も観察された。
重要なことに、主要な毒性副作用はいずれの研究でも報告されず、薬物耐性も問題とならなかったようである。
全部で３つの第Ｉ相臨床試験からの総合データは、エンドスタチンによく耐えられたが、参加した患者１９例中２例が治療を続けたのみで、患者１２例は病状進行のせいで研究から脱落し、更に患者５例は自発的に研究からはずれたことを示した。
EntraMedは、エンドスタチンの連続注入および皮下投与を評価する１つの第Ｉ相臨床試験をヨーロッパで進行中である。
EntraMedは、腫瘍縮小とは反対に腫瘍進行の時期にあるらしい末期のヒトで、第II相臨床研究を開始することを計画している。
開発中の抗血管形成剤の大部分のように、それら使用の最大可能性は化学および放射線療法との組合せにあるらしい。実際に、一部の前臨床研究ではエンドスタチンが放射線療法と相乗効果を有することを示しており、EntraMedは様々な組合せ療法を調べるいくつかの前臨床研究を進行中である。進行性黄斑変性およびリウマチ様関節炎（ＲＡ）のモデルでエンドスタチンの効力を評価する前臨床研究も進行中である。
アンギオスタチン治療は、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦ双方に関するｍＲＮＡの発現低下と相関していることも示された。ヒト組換え型はＢ１６メラノーマ転移モデルで肺メラノーマを好結果に抑制した。腫瘍細胞の注入後３日目から、動物はアンギオスタチンで１１日間治療された。この治療は肺転移物を６０〜８０％減少させた。
EntraMedは前臨床毒性および薬理結果を出して、１９９９年１２月にＩＮＤ申請を行った。この申請は２０００年２月にＦＤＡに受理され、単一療法としてアンギオスタチンを調べる最初の第Ｉ相臨床研究がフィラデルフィアのThomas Jefferson University Hospitalで２０００年３月に開始された。
EntraMedは同病院で２０００年７月に第二の試験を開始したが、エンドスタチンと異なり、この研究では進行癌の患者で放射線療法との組合せの一部として製品を調べている。これら双方の研究において、アンギオスタチンは静脈内投与されている。
アンギオスタチンのヨーロッパ研究は２０００年１１月に始まり、皮下投与されたときのアンギオスタチンの許容性をみている。
発明の要旨
本発明は、抗血管形成ペプチドまたはその断片もしくは変種をアルブミンまたはその断片もしくは変種へ融合させたタンパク質に関する。これらの融合タンパク質は、ここでは「本発明のアルブミン融合タンパク質」として包括的に称される。本発明のこれら融合タンパク質は、長期インビボ半減期および／または長期または治療活性を示す。
本発明は、治療用アルブミン融合タンパク質、組成物、医薬組成物、処方物およびキットを包含する。本発明はまた、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする核酸分子、並びにこれらの核酸を含有したベクター、これらの核酸およびベクターで形質転換された宿主細胞、およびこれらの核酸、ベクターおよび／または宿主細胞を用いて本発明のアルブミン融合タンパク質を作製する方法も包含する。
本発明はまた、内皮細胞の増殖および／または移動を阻害する；腫瘍誘導性血管形成を阻害する；一次腫瘍および転移物の成長を阻害し、または退縮を促進する；癌、糖尿病性網膜症、進行性黄斑変性またはリウマチ様関節炎およびすべての血管形成関連疾患を治療するための組成物および方法にも関する。
本発明は、哺乳動物で細胞の内側へまたは細胞構造に抗血管形成ペプチドを向かわせる方法；細胞タイプ、標的臓器または特定の細胞学的もしくは解剖学的部位へ本発明のアルブミン融合タンパク質を向かわせる方法；哺乳動物で抗血管形成関連疾患または障害を診断する方法；および抗血管形成ペプチドの投与スケジュールを改善する方法にも関する。
発明の具体的説明
本発明は血管形成阻害ペプチドにカップリングされたアルブミンを含んでなる融合タンパク質に関する。ここで用いられている「タンパク質」および「ペプチド」という用語は限定されず、タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドを含む。これらのペプチドは、血管形成阻害性を有するエンドスタチン（レスチン、アレステン、カンスタチンおよびタムスタチンを含む）またはその断片もしくは変種；血管形成阻害性を有するアンギオスタチンまたはその断片もしくは変種；血管形成阻害性を有するアルファスタチンまたはその断片もしくは変種；血管形成阻害性を有するクリングル５（kringle 5）またはその断片もしくは変種；および、血管形成阻害性を有する抗トロンビンIIIまたはその断片もしくは変種を含むが、それらに全く限定されない。
本発明は、血管形成阻害性を有するエンドスタチン／アンギオスタチンまたはエンドスタチン／アンギオスタチン／クリングル５の融合体またはその断片もしくは変種に限定されないが、それらを含めた、２つ（またはそれ以上）の血管形成阻害ペプチド、必要に応じて異なる血管形成阻害ペプチドにアルブミンがカップリングされた、二官能性（または多官能性）融合タンパク質にも関する。このような二官能性（または多官能性）融合タンパク質は、１タイプのみの血管形成阻害ペプチドを含んでなるアルブミン融合タンパク質と比較して、相乗的抗血管形成効果も示す。
本発明は、１つ（またはそれ以上）の血管形成阻害ペプチド、必要に応じて異なる血管形成阻害ペプチドが、同一でもまたは異なってもよい２つのアルブミン分子またはアルブミンの断片もしくは変種にカップリングされた、融合タンパク質にも関する。
更に、化学的存在物も、生物活性を高めるため、または生物活性を調節するために、本発明の融合タンパク質へ共有結合させるか、または組み合わせて用いてよい。
本発明のアルブミン融合タンパク質は、インビボで血管形成阻害ペプチドの半減期を長期化させると予想される。上記アルブミン融合ペプチドのインビトロまたはインビボ半減期は、連結アルブミンを欠くペプチドの半減期よりも２倍、５倍またはそれ以上伸びている。更に、少なくとも一部はペプチドの半減期延長のおかげで、本発明のアルブミン融合タンパク質は治療用ペプチドの投薬スケジュールの頻度を減少させられると期待される。投薬スケジュール頻度は、連結アルブミンを欠く治療用ペプチドの投薬スケジュールの頻度と比較して、少なくとも１／４、または少なくとも１／２以下に減少する。
本発明のアルブミン融合タンパク質は、インビトロおよび／またはインビボにおいて、溶解状態（または医薬組成物中）のとき、ペプチドの貯蔵期間を長期化させる、および／またはペプチドおよび／またはその活性を安定化させる。治療剤でもあるこれらのアルブミン融合タンパク質は、非特異的結合のようなファクターによるタンパク質の喪失を防ぐために、大過剰のキャリアタンパク質（例えばアルブミン、未融合）でタンパク質溶液を処方する必要性を減らせると予想される。
本発明は、アルブミン融合タンパク質をコードする核酸分子、これらの核酸を含有するベクター、これらの核酸ベクターで形質転換された宿主細胞、およびこれらの核酸、ベクターおよび／または宿主細胞を用いて本発明のアルブミン融合タンパク質を作製する方法も包含する。本発明は、核酸分子によりコードされたアルブミン融合タンパク質を発現するように必要に応じて修飾され、本発明の核酸分子を含有するように修飾されたトランスジェニック生物を更に含んでいる。
本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質および製薬上許容される希釈物または担体を含んでなる医薬処方物も包含する。このような処方物はキットまたは容器中へ入れてもよい。このようなキットまたは容器へ、タンパク質の貯蔵期間延長に関する説明書も入れてよい。このような処方物は、医薬処方物を患者へ投与する工程を含んでなる、哺乳動物またはヒトのような患者で血管形成関連疾患、病状または関連障害を予防、治療または改善する方法で用いてよい。
本発明は、本発明のアルブミン融合血管形成阻害ペプチドを上記の哺乳動物へ投与することを含んでなる、適度に高い濃度での血管形成阻害ペプチドによる哺乳動物の治療に伴う副作用（例えば、注射部位反応、頭痛、悪心、発熱、エネルギーレベル増加、発疹無力症、下痢、めまい、アレルギー反応、異常低好中球レベル）をできるだけ最少に抑えるための方法も包含する。
本発明は、哺乳動物へ投与することを含んでなる、血管形成により引き起こされる血管形成関連疾患または障害を予防、治療または改善する方法を包含しており、このような予防、治療または改善では、疾患または障害を治療、予防または改善するために有効な量で血管形成阻害ペプチド（またはその断片もしくは変種）を含んでなる本発明のアルブミン融合タンパク質が望まれる。本発明では、エンドスタチンのような血管形成阻害ペプチドは「治療用タンパク質」とも称される。
本発明は、エンドスタチンペプチドまたはエンドスタチンのモノマーのマルチコピー（その断片および変種を含む）をアルブミンまたはアルブミンのマルチコピー（その断片および変種を含む）へ融合させたアルブミン融合タンパク質を包含する。
本発明は、哺乳動物においてエンドスタチンペプチドの半減期を伸ばすための方法も包含する。その方法では、エンドスタチンペプチドをアルブミンへ連結させてアルブミン融合エンドスタチンペプチドを形成し、そのアルブミン融合エンドスタチンペプチドを哺乳動物へ投与することを要する。典型的には、アルブミン融合エンドスタチンペプチドの半減期は、連結アルブミンを欠くエンドスタチンペプチドの半減期より少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍または少なくとも５０倍伸びている。
抗腫瘍活性を示す、アルブミンをエンドスタチンへ融合させた融合タンパク質が、ここでは例示されている。このような抗腫瘍活性には一次腫瘍または転移物の成長の阻害があるが、それに限定されない。更に、本発明は、癌、糖尿病性網膜症、進行性黄斑変性またはリウマチ様関節炎を治療するための、アルブミンをエンドスタチンへ融合させたこのような融合タンパク質の使用に関する。
本発明の様々な態様が、以下で更に詳細に記載されている。
エンドスタチン
エンドスタチンは、１９９６年に血管内皮腫細胞系から初めて単離された、コラーゲンXVIIIの２０ｋＤａ Ｃ末端断片として、１９９７年に初めて記載された（M.O’Reilly,et al.,Cell 88:277-285）。エンドスタチンの抗血管形成効果を記載した最初の研究では、バキュロウイルスおよびE.coli発現系で産生された組換えネズミ種を用いた。この分子は、細胞接着分子（ＣＡＭ）アッセイにおいて、インビトロで内皮細胞増殖の選択的阻害を証明した。
血管内皮細胞（ＶＥＣ）を取囲む基底層の成分、コラーゲンXVIIIは、エンドスタチンの親タンパク質であり、亜鉛が抗血管形成活性に必要であることが知られている。ＶＥＣが血管形成源に向けて移動し始める前に、それらは基底層分解を始めねばならない。細胞培養研究によると、エンドスタチンの一次機能は、プロテイナーゼコラゲナーゼによる内皮細胞マトリックス（ＥＣＭ）改造をおそらく妨げることによる、ＶＥＣ増殖の阻害であるらしい。
エンドスタチンは約１８，０００〜約２０，０００ドルトン（１８〜２０ｋＤａ）の分子量を有し、培養内皮細胞で内皮細胞増殖を阻害しうる。そのタンパク質の１タイプは、ネズミコラーゲンタイプXVIIIのＣ末端断片に相当する、ＵＳ５，８５４，２０５で特定されているような、Ｎ末端アミノ酸配列His Thr His Gln Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn Thr Pro Leu Ser（配列番号１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１））で更に特徴付けられる。本例で用いられているヒトコラーゲンタイプXVIIIのＣ末端断片の相当Ｎ末端アミノ酸配列は、His Ser His Arg Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn Ser Pro Leu Ser（配列番号２）である。
本発明で有用なエンドスタチンペプチドには、エンドスタチンの断片または変種、例えば天然エンドスタチンペプチドのアナログ、ホモログ、断片または誘導体であるあらゆる分子、例えば参考のためここへ特に組み込まれるＵＳ５，８５４，２０５で記載されているものがある。本発明のアルブミン融合タンパク質で有用なその活性断片および変種は、参考のためここに組み込まれる、表１で掲載された特許およびレファレンスで記載されたものを含めた、当業界で知られている方法を用いて特定しうる。本発明で有用なエンドスタチンペプチドは、配列番号１または配列番号２に相当するエンドスタチンペプチドの単一生物活性を有することのみを要する。
本発明で有用なエンドスタチンペプチドは、抗血管形成活性を示すが、追加の有利な特徴、例えばバイオアベイラビリティおよび／または安定性の向上、または宿主免疫認識の減少を更に呈してもよい。
本発明のアルブミン融合タンパク質で有用なその活性断片および変種は、参考のためここに組み込まれる、表１で掲載された特許およびレファレンスで記載されたものを含めた、当業界で知られている方法を用いて特定しうる。
エンドスタチン（またはその断片もしくは変種）がＯ−グリコシル化しうる酵母で発現されるとき、エンドスタチン（またはその断片もしくは変種）のＯ−グリコシル化の効果または生物活性を最少に抑えるために、いかなるセリンまたはトレオニンも修飾または数的に減少させてよい。一方、または加えて、過少にグリコシル化する（即ち、Ｏ−グリコシル化に欠陥のある）酵母株も用いてよい。
アンギオスタチン
アンギオスタチンは、１９９４年に初めて発見され、抗血管形成活性を有することが示された、プラスミノーゲンの断片である。アンギオスタチンは内皮細胞（ＥＣ）の表面でＡＴＰシンターゼと結合し、ＥＣ移動および細管形成を阻害し、更にはＥＣおよび腫瘍細胞の双方でアポトーシスを誘導する。
「アンギオスタチン」は、インビトロでｂＦＧＦのような内在増殖因子の血管形成活性に打ち勝つ能力と、米国特許第５，８８５，７９５の図１Ａおよび１Ｂで示されているように、ほぼプラスミノーゲンアミノ酸番号９８で始まるプラスミノーゲンの内部部分とのアミノ酸配列相同性および構造的類似性により特定されてきた。アンギオスタチンは、還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動で調べると約３８ｋＤａ〜４５ｋＤａの分子量を有し、完全ネズミプラスミノーゲン分子のアミノ酸番号９８で始まるネズミプラスミノーゲンの断片の場合と実質的に類似したアミノ酸配列を有するタンパク質を含んでなる。
アンギオスタチンのアミノ酸配列は種間でやや異なる。例えば、ヒトアンギオスタチンのアミノ酸配列は上記ネズミプラスミノーゲン断片の配列と実質的に類似しているが、活性ヒトアンギオスタチン配列は完全ヒトプラスミノーゲンアミノ酸配列のアミノ酸番号９７または９９で始まる。更に、ヒトプラスミノーゲンの断片はマウス腫瘍モデルで示されるように、類似の抗血管形成活性を有する。活性アンギオスタチン分子におけるアミノ酸の数は様々であると理解すべきであり、内皮阻害活性を有するすべてのアミノ酸配列は本発明に含まれると考えられる。例えば、米国特許５，８８５，７９５参照。
本発明で有用な「アンギオスタチン」ペプチドには、その断片または変種、例えば天然アンギオスタチンのアナログ、ホモログ、断片または誘導体であるあらゆる分子、例えば参考のためここで特に組み込まれるＵＳ５，８８５，７９５で記載されているものがある。
アンギオスタチンは、プラスミノーゲン分子のクリングル領域により特定される特別な三次元構造を有している（Robbins,K.C.," The plasminogen-plasmin enzyme system" Hemostasis and Thrombosis,Basic Principles and Practice,2nd Edition,ed.by Colman,R.W.et al.J.B.Lippincott Company,pp.340-357,1987）。プラスミノーゲン分子のＮＨ２末端部分において、構造的に関連したモチーフであって、実質的な配列相同性を有したこのようなクリングル領域は、５つある。アンギオスタチンの三次元構造は、プラスミノーゲンクリングル領域１〜３およびクリングル領域４の一部を包含すると考えられる。プラスミノーゲン分子の各クリングル領域は約８０のアミノ酸を含み、３つのジスルフィド結合を含んでいる。このシステインモチーフは、他の生物活性タンパク質にも存在することが知られている。これらのタンパク質には、プロトロンビン、肝細胞増殖因子、散乱因子およびマクロファージ刺激タンパク質があるが、それらに限定されない（Yoshimura,T,et al.," Cloning,sequencing,and expression of human macrophage stimulating protein(MSP,MST1) confirms MSP as a member of the family of kringle proteins and locates the MSP gene on Chromosome 3" J.Biol.Chem.,Vol.268,No.21,pp.15461-15468,1993）。インビボで抗血管形成活性を有する三次元クリングル様構造またはシステインモチーフを有したいかなる単離タンパク質またはペプチドも、本発明の一部であると考えられる。
本発明で有用なアンギオスタチンペプチドは抗血管形成活性を示すが、追加の有利な特徴、例えばバイオアベイラビリティおよび／または安定性の向上、または宿主免疫認識の減少を更に呈してもよい。
本発明のアルブミン融合タンパク質で有用な活性断片およびその変種は、参考のためここに組み込まれる、表１で掲載された特許およびレファレンスで記載されたものを含めた、当業界で知られている方法を用いて特定しうる。
クリングル５
クリングル５は、アンギオスタチン構造の外部にあるが、プラスミノーゲンには存在する、プラスミノーゲンの内部断片である。クリングル５は、プラスミノーゲンの始め４クリングルドメインと約５０％の配列同一性および構造類似性を示す（Cao,Y,et al," Kringle domains of human Angiostatin" J.Biol.Chem.Vol.271,No.46,pp.29461-29467,1996；Cao,Y,et al," Kringle 5 of Plasminogen is a novel Inhibitor of Endothelial Cell Growth" J.Biol.Chem.Vol.272,No.36,pp.22924-22928,1997；Lu,H,et al," Kringle 5 causes cell cycle arrest and apoptosis of endothelial cells" Biochem.Biophysical Research Communications,Vol.258,pp.668-673,1999）。
本発明で有用なクリングル５ペプチドは、抗血管形成活性を示すが、追加の有利な特徴、例えばバイオアベイラビリティおよび／または安定性の向上、または宿主免疫認識の減少を更に呈してもよい。
本発明のアルブミン融合タンパク質で有用な活性断片およびその変種は、参考のためここに組み込まれる、表１で掲載された特許およびレファレンスで記載されたものを含めた、当業界で知られている方法を用いて特定しうる。
アルブミン
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびヒトアルブミン（ＨＡ）という用語は、ここでは互換的に用いられる。「アルブミン」および「血清アルブミン」という用語は広く、ヒト血清アルブミン（とその断片および変種）および他種からのアルブミン（とその断片および変種）を包含する。
ここで用いられている「アルブミン」とは、アルブミンの１以上の機能活性（例えば、生物活性）を有した、アルブミンタンパク質またはアミノ酸配列、またはアルブミン断片もしくは変種に包括的に関する。特に、「アルブミン」とは、ヒトアルブミンまたはその断片（ＥＰ２０１２３９、ＥＰ３２２０９４、ＷＯ９７／２４４４５、ＷＯ９５／２３８５７参照）、特にここでの図２７、配列番号１８と、米国仮出願第６０／３５５，５４７およびＷＯ０１／７９４８０の図１５および配列番号１８で示されているようなヒトアルブミンの成熟型、あるいは他の脊椎動物からのアルブミンまたはその断片、あるいはこれら分子またはその断片のアナログまたは変種に関する。
本発明のアルブミン融合タンパク質で用いられているヒト血清アルブミンタンパク質は、配列番号１８において下記組の点変異のうち一方または双方を含んでいる：Ｌｅｕ−４０７->Ａｌａ、Ｌｅｕ−４０８->Ｖａｌ、Ｖａｌ−４０９->ＡｌａおよびＡｒｇ−４１０->Ａｌａ；またはＡｒｇ−４１０->Ａｌａ、Ｌｙｓ−４１３->ＧｌｎおよびＬｙｓ−４１４->Ｇｌｎ（例えば、参考のためそれ全体でここに組み込まれるＷＯ９５／２３８５７参照）。他の態様では、上記組の点変異のうち一方または双方を含んだ本発明のアルブミン融合タンパク質は、酵母Ｙａｐ３ｐタンパク質分解に対して改善された安定性／耐性を有し、酵母宿主細胞で発現された組換えアルブミン融合タンパク質の産生を増す。
ここで用いられている、治療用タンパク質のインビボ半減期、治療活性または貯蔵期間を長期化または延長する上で十分なアルブミンの部分とは、非融合状態にある治療用タンパク質のインビボ半減期、治療活性または貯蔵期間と比較して、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分のインビボ半減期、治療活性または貯蔵期間を安定化、長期化または延長するために、鎖長または構造上十分なアルブミンの部分に関する。アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は上記のようなＨＡ配列の全鎖長を含んでもよく、または治療活性を安定化または長期化しうる１以上の断片を含んでもよい。このような断片は鎖長が１０以上のアミノ酸でも、またはＨＡ配列からの約１５、２０、２５、３０、５０またはそれ以上の隣接アミノ酸を含んでも、またはＨＡの特定ドメインの一部または全部を含んでもよい。
本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、正常ＨＡの変種でもよい。本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分も、ここで記載されているような治療用タンパク質の変種でよい。「変種」という用語には、保存的または非保存的な挿入、欠失および置換を含み、このような改変が、治療用タンパク質の治療活性を発揮させるアルブミンまたはその活性部位または活性ドメインの腫脹性、有用なリガンド結合性および非免疫原性のうち１以上を実質的に変化させることはない。
特に、本発明のアルブミン融合タンパク質は、ヒトアルブミンの天然多形性変種およびヒトアルブミンの断片、例えばＥＰ３２２０９４で開示された断片（即ちＨＡ（Ｐｎ）、ここでｎは３６９〜４１９である）を含んでもよい。アルブミンは、いかなる脊椎動物、特にいかなる哺乳動物、例えばヒト、ウシ、ヒツジまたはブタに由来するものでもよい。非哺乳動物アルブミンにはメンドリおよびサケのものがあるが、それらに限定されない。アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、治療用タンパク質部分とは異なる動物に由来してもよい。
一般的に言うと、ＨＡ断片または変種は少なくとも１００のアミノ酸鎖長、必要に応じて少なくとも１５０のアミノ酸鎖長である。ＨＡ変種はＨＡの少なくとも１つの全ドメイン、例えばドメイン１（配列番号１８のアミノ酸１−１９４）、２（配列番号１８のアミノ酸１９５−３８７）、３（アミノ酸３８８−５８５）、１＋２（配列番号１８の１−３８７）、２＋３（配列番号１８の１９５−５８５）または１＋３（配列番号１８のアミノ酸１−１９４＋配列番号１８のアミノ酸３８８−５８５）からなるか、またはそれを含んでなる。各ドメインは、２つの相同的サブドメイン、即ち１−１０５、１２０−１９４、１９５−２９１、３１６−３８７、３８８−４９１および５１２−５８５と、残基Ｌｙｓ１０６−Ｇｌｕ１１９、Ｇｌｕ２９２−Ｖａｌ３１５およびＧｌｕ４９２−Ａｌａ５１１を含んでなるフレキシブルなサブドメイン間リンカー領域から、それ自体が構成されている。
本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、ＨＡの少なくとも１つのサブドメインまたはドメイン、またはその保存的修飾物を含んでもよい。融合体がサブドメインをベースにしているならば、隣接リンカーの一部または全部も、治療用タンパク質部分へ連結するために、必要に応じて用いてよい。
アルブミン融合タンパク質
本発明は、一般的に、アルブミン融合タンパク質と、疾患または障害を治療、予防または改善する方法に関する。ここで用いられている「アルブミン融合タンパク質」とは、治療用タンパク質（またはその断片もしくは変種）の少なくとも１つの分子へアルブミン（またはその断片もしくは変種）の少なくとも１つの分子の融合により形成されるタンパク質に関する。本発明のアルブミン融合タンパク質は、例えば互いの遺伝子融合により（即ち、治療用タンパク質の全部または一部をコードするポリヌクレオチドがアルブミンの全部または一部をコードするポリヌクレオチドと枠内で結合された核酸の翻訳により、アルブミン融合タンパク質が形成される）、互いに結合された、治療用タンパク質の少なくとも１つの断片または変種とヒト血清アルブミンの少なくとも１つの断片または変種とを含んでなる。アルブミン融合タンパク質の個別部分、治療用タンパク質およびアルブミンタンパク質は、アルブミン融合タンパク質の「一部分」、「領域」または「部分」と称されることもある。
一つの態様において、本発明は、治療用タンパク質および血清アルブミンタンパク質を含んでなる、またはそれらからなる、アルブミン融合タンパク質を提供する。他の態様において、本発明は、治療用タンパク質および血清アルブミンタンパク質の生物活性および／または治療活性断片を含んでなる、またはそれらからなる、アルブミン融合タンパク質を提供する。他の態様において、本発明は、治療用タンパク質および血清アルブミンタンパク質の生物活性および／または治療活性変種を含んでなる、またはそれらからなる、アルブミン融合タンパク質を提供する。別な態様において、アルブミン融合タンパク質の血清アルブミンタンパク質成分は、血清アルブミンの成熟部分である。
別な態様において、本発明は、治療用タンパク質と、血清アルブミンの生物活性および／または治療活性断片を含んでなる、またはそれらからなる、アルブミン融合タンパク質を提供する。別な態様において、本発明は、治療用タンパク質と、血清アルブミンの生物活性および／または治療活性変種を含んでなる、またはそれらからなる、アルブミン融合タンパク質を提供する。一部の態様において、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分は、治療用タンパク質の成熟部分である。
別な態様において、本発明は、治療用タンパク質の生物活性および／または治療活性断片または変種と、血清アルブミンの生物活性および／または治療活性断片または変種とを含んでなる、またはそれらからなる、アルブミン融合タンパク質を提供する。一部の態様において、本発明は、治療用タンパク質の成熟部分および血清アルブミンの成熟部分を含んでなる、またはそれらからなる、アルブミン融合タンパク質を提供する。
一つの態様において、アルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端部分としてＨＡおよびＣ末端部分として治療用タンパク質を含んでなる。一方、Ｃ末端部分としてＨＡおよびＮ末端部分として治療用タンパク質を含んでなるアルブミン融合タンパク質も用いてよい。
他の態様において、アルブミン融合タンパク質はアルブミンのＮ末端およびＣ末端の双方へ治療用タンパク質を融合させている。一つの態様において、ＮおよびＣ末端で融合された治療用タンパク質は同一の治療用タンパク質である。別な態様において、ＮおよびＣ末端で融合された治療用タンパク質は異なる治療用タンパク質である。もう１つの態様において、ＮおよびＣ末端で融合された治療用タンパク質は、同様の疾患、障害または症状を治療または予防するために用いられる、異なる治療用タンパク質である。もう１つの態様において、ＮおよびＣ末端で融合された治療用タンパク質は、通常患者で同時に生じることが当業界で知られた疾患または障害を治療または予防するために用いられる、異なる治療用タンパク質である。
アルブミン部分が治療用タンパク質部分のＮ末端およびＣ末端で融合されたアルブミン融合タンパク質に加えて、本発明のアルブミン融合タンパク質はＨＡの内部領域中へ対象の治療用タンパク質またはペプチドを挿入することにより作製してもよい。例えば、ＨＡ分子のタンパク質配列内には、ジスルフィド結合により安定化されるいくつかのループまたはターンが、α−ヘリックスの最後と最初との間に存在している。ＨＡの結晶構造（ＰＤＢアイデンティファイアー１ＡＯ６、１ＢＪ５、１ＢＫＥ、１ＢＭ０、１Ｅ７Ｅ〜１Ｅ７Ｉおよび１ＵＯＲ）から調べたところ、そのループは大部分が分子の本体から離れて伸びている。これらのループは、特別な生物活性を有するアルブミン分子を本質的に作製する上で、治療活性ペプチド、特に機能化に二次構造を要するもの、または治療用タンパク質の挿入または内部融合に有用である。
本発明のアルブミン融合タンパク質を作製するためにペプチドまたはポリペプチドが挿入されるヒトアルブミン構造中のループには、Ｖａｌ５４−Ａｓｎ６１、Ｔｈｒ７６−Ａｓｐ８９、Ａｌａ９２−Ｇｌｕ１００、Ｇｌｎ１７０−Ａｌａ１７６、Ｈｉｓ２４７−Ｇｌｕ２５２、Ｇｌｕ２６６−Ｇｌｕ２７７、Ｇｌｕ２８０−Ｈｉｓ２８８、Ａｌａ３６２−Ｇｌｕ３６８、Ｌｙｓ４３９−Ｐｒｏ４４７、Ｖａｌ４６２−Ｌｙｓ４７５、Ｔｈｒ４７８−Ｐｒｏ４８６およびＬｙｓ５６０−Ｔｈｒ５６６がある。他の態様では、ペプチドまたはポリペプチドが成熟ヒトアルブミン（配列番号１８）のＶａｌ５４−Ａｓｎ６１、Ｇｌｎ１７０−Ａｌａ１７６および／またはＬｙｓ５６０−Ｔｈｒ５６６ループ中に挿入される。
挿入されるペプチドは、特定の生物活性についてスクリーニングされたファージディスプレーまたは合成ペプチドライブラリーから、または望ましい機能を有した分子の活性部分から誘導される。さらに、ランダムペプチドライブラリーは特定ループ内で、またはＨＡ分子の特定ループ中へのランダム化ペプチドの挿入により作製してもよく、そこではアミノ酸のすべての可能な組合せが表わされている。
このようなライブラリーは、下記方法の１つにより、ＨＡまたはＨＡのドメイン断片上で作製しうる：
（ａ）ＨＡまたはＨＡドメイン断片の１以上のペプチドループ内におけるアミノ酸のランダム化変異。ループ内における１つ、それ以上または全部の残基はこうして変異させうる；
（ｂ）鎖長Ｘｎ（Ｘはアミノ酸であり、ｎは残基の数である）のランダム化ペプチドのＨＡまたはＨＡドメイン断片の１以上のループの置換またはその中への挿入（即ち、内部融合）；
（ｃ）（ａ）および／または（ｂ）に加えて、Ｎ、ＣまたはＮおよびＣ末端ペプチド／タンパク質融合。
ＨＡまたはＨＡドメイン断片は、異なる標的に対する異なるループの異なるスクリーンから誘導されたペプチドを同一ＨＡまたはＨＡドメイン断片へグラフトすることにより、多機能化してもよい。
ヒト血清アルブミンのループ中へ挿入されるペプチドは、治療用タンパク質ペプチドまたはそのペプチド断片もしくはペプチド変種である。更に詳しくは、本発明は、鎖長が少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５または少なくとも４０のアミノ酸のペプチド断片またはペプチド変種をヒト血清アルブミンのループ中へ挿入したアルブミン融合タンパク質を包含する。本発明は、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５または少なくとも４０のアミノ酸のペプチド断片またはペプチド変種をヒト血清アルブミンのＮ末端へ融合させたアルブミン融合タンパク質も包含する。本発明は、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５または少なくとも４０のアミノ酸のペプチド断片またはペプチド変種をヒト血清アルブミンのＣ末端へ融合させたアルブミン融合タンパク質も包含する。
通常、本発明のアルブミン融合タンパク質は１つのＨＡ由来領域および１つの治療用タンパク質由来領域を有する。しかしながら、各タンパク質の複数領域も、本発明のアルブミン融合タンパク質を作製する上で用いてよい。同様に、２以上の治療用タンパク質も、本発明のアルブミン融合タンパク質を作製する上で用いてよい。例えば、治療用タンパク質はＨＡのＮおよびＣ末端の双方へ融合される。各構造において、治療用タンパク質部分は同一でもまたは異なる治療用タンパク質分子でもよい。二官能性アルブミン融合タンパク質の構造は、Ｘ−ＨＡ−Ｙ、Ｙ−ＨＡ−Ｘ、Ｘ−Ｙ−ＨＡ、ＨＡ−Ｘ−Ｙ、ＨＡ−Ｘ−Ｙ−ＨＡ、ＨＡ−Ｙ−Ｘ−ＨＡ、ＨＡ−Ｘ−Ｘ−ＨＡ、ＨＡ−Ｙ−Ｙ−ＨＡ、ＨＡ−Ｘ−ＨＡ−Ｙ、Ｘ−ＨＡ−Ｙ−ＨＡまたはこの複数の組合せ、またはＨＡ配列内のいずれかの位置においてＸおよび／またはＹを挿入したものとして表わせる。
二または多官能性アルブミン融合タンパク質は、機能、半減期などに応じて、様々な比率で作製しうる。
二または多官能性アルブミン融合タンパク質は、ＨＡの反対端にあるタンパク質またはペプチドを介して標的臓器または細胞タイプへ融合体の治療用タンパク質部分を向かわせうるように作製してもよい。
公知の治療用分子の融合体に代わるものとして、典型的には６、８、１２、２０、２５またはＸｎ（Ｘはアミノ酸であり、ｎは残基の数である）ランダム化アミノ酸のＨＡまたはＨＡのドメイン断片のＮ、ＣまたはＮおよびＣ末端への融合体として構築されたライブラリーのスクリーニングにより、ペプチドは得ることができ、そこではアミノ酸のすべての可能な組合せが表わされた。このアプローチの特別な利点は、ペプチドがＨＡ分子へ結合されたままで選択され、したがって、いずれか他の方法により得られるペプチドの場合のように、修飾されてからＨＡへ結合される場合よりも、ペプチドの性質が選別しうることである。
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質は、各部分間で物理的距離を大きくして、例えば同族レセプターと結合する際の、治療用タンパク質部分の接近性を最大化するために、融合部分間にリンカーペプチドを含有してもよい。リンカーペプチドは、それがフレキシブルまたはより硬くなるように、アミノ酸から構成される。
したがって、上記のように、本発明のアルブミン融合タンパク質は下記式：Ｒ２−Ｒ１；Ｒ１−Ｒ２；Ｒ２−Ｒ１−Ｒ２；Ｒ２−Ｌ−Ｒ１−Ｌ−Ｒ２；Ｒ１−Ｌ−Ｒ２；Ｒ２−Ｌ−Ｒ１；またはＲ１−Ｌ−Ｒ２−Ｌ−Ｒ１を有していてもよい。ここでＲ１は少なくとも１つの治療用タンパク質、ペプチドまたはポリペプチド配列（その断片または変種を含む）であり、必ずしも同一の治療用タンパク質ではなく、Ｌはリンカーであり、かつ、Ｒ２は血清アルブミン配列（その断片または変種を含む）である。リンカーの例としては、（ＧＧＧＧＳ）Ｎ（配列番号３）、（ＧＧＧＳ）Ｎ（配列番号４）または（ＧＧＳ）Ｎがあり、ここでＮは１以上の整数であり、Ｇはグリシンを表わし、Ｓはセリンを表わす。Ｒ１が２以上の治療用タンパク質、ペプチドまたはポリペプチド配列であるとき、これらの配列は必要に応じてリンカーで連結してもよい。
他の態様において、治療用タンパク質を含んでなる本発明のアルブミン融合タンパク質は、アルブミンへ融合されていない同治療用タンパク質の貯蔵期間、インビボ半減期または治療活性と比較して、長い貯蔵期間、インビボ半減期または治療活性を有している。貯蔵期間とは、典型的には、溶解状態またはある他の貯蔵処方時における治療用タンパク質の治療活性が治療活性の過度な喪失なしに安定である期間に関する。治療用タンパク質の多くは、それらの非融合状態時で高度に不安定である。下記のように、これら治療用タンパク質の典型的貯蔵期間は、本発明のアルブミン融合タンパク質中への組込みで著しく長期化している。
貯蔵期間が「長期化」または「延長」された本発明のアルブミン融合タンパク質は、同一の貯蔵および取扱い条件に付された標準と比較して、大きな治療活性を示す。標準は非融合全鎖長治療用タンパク質である。アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分がアナログ、変種であるか、またはそれ以外に改変されているか、またはそのタンパク質の完全配列を含まないとき、治療活性の長期化はアナログ、変種、改変ペプチドまたは不完全配列の非融合相当物と比較される。例として、本発明のアルブミン融合タンパク質は、標準と同一の貯蔵および取扱い条件に付されて、所定の時点で比較されたとき、標準の治療活性の約１００％以上、または治療活性の約１０５％、１１０％、１２０％、１３０％、１５０％または２００％以上を留めている。しかしながら、治療活性は治療用タンパク質の安定性に依存しており、１００％以下のこともある。
貯蔵期間は、貯蔵が始まったときの治療活性を基準とした、貯蔵後に残留する治療活性として評価してもよい。治療活性の長期化または延長で示されるような、貯蔵期間が長期化または延長された本発明のアルブミン融合タンパク質は、同一条件に付されたとき、相当する非融合治療用タンパク質の治療活性の約５０％以上、治療活性の約６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上を留めている。
治療用タンパク質
上記のように、本発明のアルブミン融合タンパク質は、遺伝子融合で互いに結合された、治療用タンパク質の少なくとも１つの断片または変種と、ヒト血清アルブミンの少なくとも１つの断片または変種とを含んでなる。
ここで用いられている「治療用タンパク質」とは、１以上の治療および／または生物活性を有するエンドスタチン（レスチン、アレステン、カンスタチンおよびタムスタチンを含む）またはその断片もしくは変種；１以上の治療および／または生物活性を有するアンギオスタチンまたはその断片もしくは変種；１以上の治療および／または生物活性を有するアルファスタチンまたはその断片もしくは変種；１以上の治療および／または生物活性を有するクリングル５またはその断片もしくは変種；１以上の治療および／または生物活性を有する抗トロンビンIIIまたはその断片もしくは変種のような、血管形成阻害ペプチドに関する。そのため、本発明のアルブミン融合タンパク質は治療用タンパク質の少なくとも１つの断片または変種を含有してもよい。加えて、「治療用タンパク質」という用語は、治療用タンパク質の内在または天然相関物に関することもある。変種には変異体、アナログ、ミメティックおよびホモログを含み、治療用タンパク質の内在または天然相関物を含める。
「治療活性」を示すポリペプチドまたは「治療活性」であるタンパク質とは、ここで記載されたまたは当業界で知られている１種以上の治療用タンパク質のような、治療用タンパク質に付随する１種以上の公知生物および／または治療活性を有したポリペプチドを意味する。非制限例として、「治療用タンパク質」は、疾患、症状または障害を治療、予防または改善する上で有用なタンパク質である。
ここで用いられている「治療活性」または「活性」とは、その効果がヒトで望まれる治療成果、あるいは非ヒト哺乳動物または他の種もしくは生物で望まれる効果と符合する、活性に関する。治療活性はインビボまたはインビトロで測定される。例えば、望ましい効果は細胞培養物でアッセイされる。このようなインビトロまたは細胞培養物アッセイは、当業界で記載されているように、多くの治療用タンパク質について通常利用しうる。
有用アッセイの例には、参考のためここで特に組み込まれる、表１のレファレンスおよび文献に記載されたもの、および本例で記載されたものがあるが、それらに限定されない。本発明の融合タンパク質により示される抗血管形成または抗腫瘍活性は、例えば、ここで記載されているような、血管形成を阻害する融合タンパク質の能力、または腫瘍成長または増殖を阻害するそれらの能力について試験しうる、簡単に行えるインビトロアッセイにより測定される。これらのアッセイを用いて、融合タンパク質が所定の腫瘍に対して示す相対的な抗血管形成または抗腫瘍活性のようなパラメーターが調べられる。
本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に相当する治療用タンパク質は、１以上のオリゴ糖基の結合で修飾してもよい。グリコシル化と称される修飾は、タンパク質の物理的性質に劇的な影響を与え、タンパク質の安定性、分泌および局在化に重要なこともある。このような修飾は、参考のためここに組み込まれる、米国仮出願第６０／３５５，５４７およびＷＯ０１／７９４８０で詳細に記載されている。
本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に相当する治療用タンパク質、並びにそのアナログおよび変種は、それらが発現される宿主細胞により、または他の発現条件により、１以上の部位におけるグリコシル化がそれら核酸配列の操作結果として改変されるように修飾してよい。例えば、グリコシル化異性体は、グリコシル化部位を除くまたは導入することにより、例えばアスパラギンからグルタミンへの置換のような、アミノ酸残基の置換または欠失により産生してもよく、あるいは非グリコシル化組換えタンパク質は、それらをグリコシル化しない宿主細胞、例えばE.coliまたはグリコシル化欠陥酵母で、タンパク質を発現させることにより産生してもよい。これらアプローチの例は、参考のため組み込まれる、当業界で知られた米国仮出願第６０／３５５，５４７およびＷＯ０１／７９４８０で更に詳細に記載されている。
表１は、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に相当する治療用タンパク質の非網羅リストを掲載している。「治療用タンパク質Ｘ」欄では、治療用タンパク質分子を開示しており、その後の括弧書では、その治療用タンパク質分子またはその断片もしくは変種を含んでなる、またはそれらからなる、科学およびブランド名を記載している。ここで用いられている「治療用タンパク質Ｘ」とは、（ＣＡＳおよびGenebank受入番号から得られるアミノ酸配列により特定されるような）個別の治療用タンパク質分子、またはこの欄で開示された所定の治療用タンパク質分子に関連した治療用タンパク質の全体グループに関する。これら項目の各々に関連した情報は、特にそこで記載されたアミノ酸配列に関して、それら全体で参考のため各々組み込まれる。「ＰＣＴ／特許レファレンス」欄では、治療用タンパク質分子について記載する特許および／または公開特許出願に対応した米国特許番号、またはＰＣＴ国際出願番号を掲載している。「ＰＣＴ／特許レファレンス」欄で引用された特許および／または公開特許出願の各々は、参考のためそれら全体でここに組み込まれる。特に、各引用「ＰＣＴ／特許レファレンス」の配列リストで掲載された特定ポリペプチドのアミノ酸配列、例えば各引用「ＰＣＴ／特許レファレンス」の詳細な説明で掲載されたこれらアミノ酸配列の変種（変異体、断片など）、例えば各引用「ＰＣＴ／特許レファレンス」の詳細な説明で掲載された治療適応症、および各引用「ＰＣＴ／特許レファレンス」の詳細な説明、更に詳しくは実施例で掲載された特定ポリペプチドについての活性アッセイが、参考のためここに組み込まれる。「生物活性」欄は、治療用タンパク質分子に伴う生物活性を記載している。「関連情報」欄で引用されたレファレンスの各々は、特に対応生物活性のアッセイについてレファレンス（例えば、方法セクション参照）で記載された各活性アッセイの記載に関して、参考のためそれら全体でここに組み込まれる。「好ましい適応症Ｙ」欄では、治療用タンパク質Ｘ、または治療用タンパク質Ｘ部分を含んでなる本発明のアルブミン融合タンパク質により治療、予防、診断または改善される、疾患、障害および／または症状について記載している。
Figure 2005530484
様々な態様において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、表１の対応列で掲載されたアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に相当する治療用タンパク質の治療活性および／または生物活性に相当する治療活性および／または生物活性を発揮しうる（例えば、表１の「生物活性」および「治療用タンパク質Ｘ」欄参照）。別な態様において、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療活性タンパク質部分はレファレンス配列の断片または変種であり、表１の「生物活性」欄で開示された対応治療用タンパク質の治療活性および／または生物活性を発揮しうる。
ポリペプチドおよびポリヌクレオチド断片および変種
断片
本発明は、表１で記載された治療用タンパク質、アルブミンタンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質の断片に更に関する。
タンパク質のＮ末端から１以上のアミノ酸の欠失が、治療用タンパク質、アルブミンタンパク質および／またはアルブミン融合タンパク質の１以上の生物学的機能の変化または喪失をもたらすとしても、他の治療活性および／または機能活性（例えば、生物活性、マルチマー化する能力、リガンドと結合する能力）はなお留まることがある。例えば、ポリペプチドの完全または成熟型を認識する抗体を誘導しうるおよび／またはそれと結合しうる、Ｎ末端欠失ポリペプチドの能力は、完全ポリペプチドの残基が過半数に満たないでＮ末端から除去されたとき、通常留められる。完全ポリペプチドのＮ末端残基を欠く具体的なポリペプチドがこのような免疫活性を留めているかどうかは、ここで記載された当業界で知られる常法により、簡単に調べられる。多数の欠失Ｎ末端アミノ酸残基を有する変異タンパク質がある生物または免疫活性を留めていることは、ないわけではない。事実、わずか６アミノ酸残基から構成されるペプチドでも、しばしば免疫応答を励起する。
したがって、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に相当する治療用タンパク質の断片には、全鎖長タンパク質、並びにレファレンスポリペプチド（例えば、表１で開示されているような治療用タンパク質）のアミノ酸配列のアミノ末端から１以上の残基を欠失させたポリペプチドを含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも、本発明に包含される。
加えて、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン融合タンパク質部分に相当する血清アルブミンポリペプチドの断片には、全鎖長タンパク質、並びにレファレンスポリペプチド（例えば、血清アルブミン）のアミノ酸配列のアミノ末端から１以上の残基を欠失させたポリペプチドを含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも、本発明に包含される。
更に、本発明のアルブミン融合タンパク質の断片には、全鎖長アルブミン融合タンパク質、並びにアルブミン融合タンパク質のアミノ末端から１以上の残基を欠失させたポリペプチドを含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも、本発明に包含される。
しかも上記のように、レファレンスポリペプチド（例えば、治療用タンパク質および／または血清アルブミンタンパク質）のＮ末端またはＣ末端から１以上のアミノ酸の欠失が、タンパク質の１以上の生物学的機能の変化または喪失をもたらすとしても、他の機能活性（例えば、生物活性、マルチマー化する能力、リガンドと結合する能力）および／または治療活性はなお留まることがある。例えば、ポリペプチドの完全または成熟型を認識する抗体を誘導しうるおよび／またはそれと結合しうる、Ｃ末端欠失ポリペプチドの能力は、完全または成熟ポリペプチドの残基が過半数に満たないでＣ末端から除去されたとき、通常留められる。レファレンスポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端残基を欠く具体的なポリペプチドが治療活性を留めているかどうかは、ここで記載された当業界で知られる常法により、簡単に調べられる。
本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に相当する治療用タンパク質（例えば、表１で掲載された治療用タンパク質）のアミノ酸配列のカルボキシ末端から１以上の残基を欠失させたポリペプチドを更に提供する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも、本発明に包含される。
加えて、本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分に相当するアルブミンタンパク質（例えば、血清アルブミン）のアミノ酸配列のカルボキシ末端から１以上の残基を欠失させたポリペプチドを提供する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも、本発明に包含される。
更に、本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質のカルボキシ末端から１以上の残基を欠失させたポリペプチドを提供する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも、本発明に包含される。
加えて、上記いずれのＮまたはＣ末端欠失も、ＮおよびＣ末端欠失レファレンスポリペプチド（例えば、表１で掲載された治療用タンパク質、または血清アルブミン（例えば、配列番号１８）、または本発明のアルブミン融合タンパク質）を作製するために組み合わせうる。本発明は、アミノおよびカルボキシル末端の双方から１以上のアミノ酸を欠失させたポリペプチドも提供する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも、本発明に包含される。
本出願は、ここで掲載されたレファレンスポリペプチド配列（例えば、治療用タンパク質、血清アルブミンタンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質）と少なくとも６０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のポリペプチドを含有したタンパク質、またはその断片にも関する。一部の態様において、本出願は、上記のようなＮおよびＣ末端欠失のアミノ酸配列を有するレファレンスポリペプチドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のポリペプチドを含んでなるタンパク質に関する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも、本発明に包含される。
本発明の他のポリペプチド断片は、アミノ酸配列が断片である、治療用タンパク質または血清アルブミンタンパク質のポリペプチド配列の治療活性および／または機能活性（例えば、生物活性）を示すアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる断片である。
他のポリペプチド断片は生物活性断片である。生物活性断片とは、本発明のポリペプチドの活性と、必ずしも同一ではなく、類似した活性を示すものである。断片の生物活性には、望ましい活性の改善、または望ましくない活性の減少も含む。
変種
「変種」とは、レファレンス核酸またはポリペプチドとは異なるが、その本質的性質を留めた、ポリヌクレオチドまたは核酸に関する。通常、変種はレファレンス核酸またはポリペプチドと全体的に近似し、多くの領域では同一である。
ここで用いられている「変種」とは、治療用タンパク質（例えば、表１の「治療」欄参照）、アルブミンタンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質とは配列が異なるが、ここで他に記載されまたは当業界で他に知られているような、少なくとも１つのその機能性および／または治療性（表１の「生物活性」欄で開示されているような治療活性および／または生物活性）を留めた、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分、またはアルブミン融合タンパク質に関する。通常、変種は、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に相当する治療用タンパク質、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分に相当するアルブミンタンパク質、および／または本発明のアルブミン融合タンパク質のアミノ酸配列と全体的に非常に類似しているが、多くの領域では同一である。これらの変種をコードする核酸も本発明に包含される。
本発明は、例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に相当する治療用タンパク質のアミノ酸配列（例えば、表１のレファレンスで開示されたアミノ酸配列またはその断片もしくは変種）、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分に相当するアルブミンタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号１８またはその断片もしくは変種）、および／または本発明のアルブミン融合タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも６０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含んでなる、またはからなるタンパク質にも関する。これらポリペプチドの断片も提供される（例えば、ここで記載されている断片）。本発明に包含される別なポリペプチドは、ストリンジェントハイブリッド形成条件下（例えば、約４５℃で６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）で結合ＤＮＡを濾過するハイブリッド形成、次いで約５０〜６５℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで１回以上の洗浄）、高ストリンジェント条件下（例えば、約４５℃で６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）で結合ＤＮＡを濾過するハイブリッド形成、次いで約６８℃で０．１×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳで１回以上の洗浄）または当業者に知られた他のストリンジェントハイブリッド形成条件下（例えば、Ausubel,F.M.et al.,eds.,1989,Current protocol in Molecular Biology,Green publishing associates,Inc.,and John Wiley & Sons Inc.,New York,page 6.3.1-6.3.6 and 2.10.3参照）で、本発明のアミノ酸配列をコードする核酸分子の相補体とハイブリッド形成するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドである。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明に包含される。
本発明の対象アミノ酸配列と少なくとも、例えば、９５％「同一」のアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、本ポリペプチドのアミノ酸配列が対象配列と同一であるが、本ポリペプチド配列が対象アミノ酸配列の１００アミノ酸毎に５以内のアミノ酸改変を有しうることを意味する。換言すると、対象アミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、本配列で５％以内のアミノ酸残基が挿入、欠失または他のアミノ酸と置換しうる。レファレンス配列のこれら改変は、レファレンスアミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端で、あるいはこれら末端間のいずれで生じても、レファレンス配列の各残基内でまたはレファレンス配列内の１以上の隣接基で個別に散在してもよい。
実際問題として、いずれか具体的なポリペプチドが、例えば本発明のアルブミン融合タンパク質またはその断片（例えば、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分またはアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分）のアミノ酸配列と少なくとも６０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるかどうかは、従来どおりに公知のコンピュータープログラムを用いて調べることができる。このようなプログラムおよびそれらを用いる方法は、参考のためここに組み込まれる、例えば米国仮出願第６０／３５５，５４７およびＷＯ０１／７９４８０（ｐ．４１−４３）で記載されており、当業界で周知である。
本発明のポリヌクレオチド変種は、コード領域、非コード領域または双方で改変を含んでよい。ポリヌクレオチド変種には、サイレント置換、付加または欠失を生じるが、コードされたポリペプチドの性質または活性は変えない改変をもつものも含む。このようなヌクレオチド変種は、遺伝コードの縮重に基づくサイレント置換により作製してもよい。ポリペプチド変種には、５０以下、４０以下、３０以下、２０以下、１０以下または５〜５０、５〜２５、５〜１０、１〜５または１〜２のアミノ酸がいずれかの組合せで置換、欠失または付加されたものを含む。ポリヌクレオチド変種は、様々な理由から、例えば具体的宿主でのコドン発現を最適化するために作製しうる（微生物宿主、例えば酵母またはE.coliに好まれるものへヒトｍＲＮＡのコドンを改変する）。
別な態様では、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分をコードするポリヌクレオチドが、酵母または哺乳動物細胞での発現用に最適化されている。更に別の態様では、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分をコードするポリヌクレオチドが、酵母または哺乳動物細胞での発現用に最適化されている。更にもう１つの態様では、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、酵母または哺乳動物細胞での発現用に最適化されている。
別な態様において、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドは、ここで記載されているようなストリンジェントハイブリッド形成条件下で、治療用タンパク質をコードする野生型ポリヌクレオチドとハイブリッド形成しない。別な態様において、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドは、ここで記載されているようなストリンジェントハイブリッド形成条件下で、アルブミンタンパク質をコードする野生型ポリヌクレオチドとハイブリッド形成しない。もう１つの態様において、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドは、ここで記載されているようなストリンジェントハイブリッド形成条件下で、治療用タンパク質部分またはアルブミンタンパク質部分をコードする野生型ポリヌクレオチドとハイブリッド形成しない。
追加の態様において、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分をコードするポリヌクレオチドは、その治療用タンパク質の天然配列を含んでなるわけではなく、またはそれからなるわけでもない。別な態様において、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分をコードするポリヌクレオチドは、アルブミンタンパク質の天然配列を含んでなるわけではなく、またはそれからなるわけでもない。別な態様において、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、治療用タンパク質部分またはアルブミンタンパク質部分の天然配列を含んでなるわけではなく、またはそれからなるわけでもない。
追加の態様において、治療用タンパク質は、天然野生型ポリヌクレオチドが存在しないように、バイオパンニング(biopanning)によりランダムペプチドライブラリーから選択される。
天然変種は「対立遺伝子変種」と称され、生物の染色体で所定の座を占める遺伝子の数種代替型のうち１つに関する（Genes II,Lewin,B.,ed.,John Wiley & Sons,New York(1985)）。これらの対立遺伝子変種はポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドレベルが様々であり、本発明に含まれる。一方、非天然変種は変異誘発技術または直接合成により作製しうる。
タンパク質エンジニアリングおよび組換えＤＮＡテクノロジーの公知方法を用いて、本発明のポリペプチドの特徴を改善または改変するために変種が作製される。例えば、１以上のアミノ酸が、生物学的機能の実質的喪失なしに、本発明のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端から欠失される。例えば、Ron et al.,J,Biol.Chem.268:2984-2988(1993)（ＫＧＦ変種）およびDobeli et al.,J.Biotechnology,7:199-216(1988)（インターフェロンγ変種）参照。
更に、変種が天然タンパク質の場合と類似した生物活性を多くの場合に留めていることを、十分な証拠が証明している（例えば、Gayle et al.,J.Biol.Chem.268:22105-22111(1993)(ＩＬ−１ａ変種)）。更に、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端から１以上のアミノ酸を欠失させると、１以上の生物学的機能の改変または喪失をもたらすとしても、他の生物活性はなお留められることがある。例えば、分泌型を認識する抗体を誘導しうる、および／またはそれと結合しうる欠失変種の能力は、分泌型の残基が過半数に満たないでＮ末端またはＣ末端から除去されたとき、おそらく留められるであろう。タンパク質のＮまたはＣ末端残基を欠く具体的ポリペプチドがこのような免疫活性を留めているかどうかは、ここで記載され当業界で他に知られた常法により、簡単に調べられる。
そのため、本発明は機能活性（例えば、生物活性および／または治療活性）を有したポリペプチド変種を更に含んでいる。別な態様において、本発明は、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に相当する治療用タンパク質の１以上の生物および／または治療活性に相当する機能活性（例えば、生物活性および／または治療活性、例えば表１の「生物活性」欄で開示されたもの）を有した、アルブミン融合タンパク質の変種を提供する。このような変種には、活性に影響をほとんど有しないような、当業界で知られた一般的規則に従い選択される欠失、挿入、逆転、反復および置換を含む。
他の態様において、本発明の変種は保存的置換を有している。「保存的置換」とは、脂肪族または疎水性アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの置換；酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの置換；アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの置換；塩基性残基Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓの置換；芳香族残基Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐの置換；小サイズアミノ酸Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＭｅｔおよびＧｌｙの置換のような、グループ内の交換を意味する。
表現型がサイレントのアミノ酸置換をどのように行うかに関するガイダンスは、例えばBowie et al.," Deciphering the Message in Protein Sequences:Tolerance to Amino Acid Substitutions" ,Science,247:1306-1310(1990)で示されており、そこでは改変しうるアミノ酸配列の許容性を研究するための主戦略が２つあることを著者は示している。
著者が述べているように、タンパク質はアミノ酸置換に対して驚くほど許容性である。その著者は、どのアミノ酸変更がタンパク質のあるアミノ酸位置で許容されそうかを更に示している。例えば、（タンパク質の三次構造内に）ほとんど埋没されたアミノ酸残基は非極性側鎖を必要とし、表面側鎖の特徴は通常ほとんど保存されていない。更に、許容される保存的アミノ酸置換には、脂肪族または疎水性アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの置換；酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの置換；アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの置換；塩基性残基Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓの置換；芳香族残基Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐの置換；小サイズアミノ酸Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＭｅｔおよびＧｌｙの置換がある。
保存的アミノ酸置換の他にも、本発明の変種には、（ｉ）置換アミノ酸残基が遺伝コードでコードされたまたはそうでない、非保存アミノ酸残基の１以上の置換を含んだポリペプチド、(ii)置換基を有するアミノ酸残基の１以上の置換を含んだポリペプチド、(iii)他の化合物、例えばポリペプチドの安定性および／または溶解性を増す化合物（例えば、ポリエチレングリコール）と融合された、または化学的に接合されたポリペプチド、または(iv)例えばＩｇＧ Ｆｃ融合領域ペプチドのような追加アミノ酸を含んだポリペプチドがある。このような変種ポリペプチドは、ここでの開示から当業者の範囲内に属すると思われる。
例えば、他の荷電または中性アミノ酸による荷電アミノ酸のアミノ酸置換を含んだポリペプチド変種は、低凝集性のような、改善された特徴を有するタンパク質をもたらすことがある。医薬処方物の凝集は、凝集物の免疫活性のせいで、活性を減少させ、クリアランスを増加させる。Pinckard et al.,Clin.Exp.Immunol.2:331-340(1967)；Robbins et al.,Diabetes 36:838-845(1987)；Cleland et al.,Crit.Rev.Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377(1993)参照。
特定の態様において、本発明のポリペプチドは、ここで記載された治療用タンパク質および／またはヒト血清アルブミンおよび／または本発明のアルブミン融合タンパク質のアミノ酸配列の断片または変種を含んでなるか、またはそれからなり、その断片または変種は、レファレンスアミノ酸配列と比較して、１〜５、５〜１０、５〜２５、５〜５０、１０〜５０または５０〜１５０アミノ酸残基の付加、置換および／または欠失を有している。ある態様において、アミノ酸置換は保存的である。これらのポリペプチドをコードする核酸も本発明に包含される。
本発明のポリペプチドは、ペプチド結合または修正ペプチド結合、例えばペプチドアイソスターで互いに結合されたアミノ酸から構成され、２０遺伝子コードアミノ酸以外のアミノ酸を含有してもよい。ポリペプチドは、翻訳後プロセッシングのような自然プロセスまたは当業界で周知の化学的修飾技術により修飾してもよい。このような修飾は、基本テキスト、更に詳細な専門研究論文、および多数の研究文献で詳しく記載されている。修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端を含めて、ポリペプチドのどの箇所で生じてもよい。同一タイプの修飾が所定ポリペプチドの数部位に同一または異なる程度で存在しうることは明らかであろう。しかも、所定ポリペプチドは多くのタイプの修飾を含んでよい。ポリペプチドは、例えばユビキチン化の結果として分岐させてもよく、それらは分岐があるまたはない環状でもよい。環状、分岐および分岐環状ポリペプチドは翻訳後自然プロセスから得ても、または合成法により作製してもよい。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリスチル化、酸化、ペギル化、タンパク質分解プロセッシング、ホスホリル化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなタンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介付加、およびユビキチン化がある。
更に、化学的存在物も、例えばBiotechnology,10:324(1999)のCurrent Opinionsで開示された方法により、特定の機能または生物活性を高めるまたは調節するために、本発明のアルブミン融合タンパク質へ共有結合させてよい。
更に、向標的存在物も、特定の機能または生物活性をある細胞またはステージ特異性タイプ、組織タイプまたは解剖学的構造へ向けるために、本発明のアルブミン融合タンパク質へ共有結合させてよい。本発明のアルブミン融合タンパク質を方向づけることにより、剤の作用は局在化される。更に、このような向標的化のおかげで、必要部位に本発明のアルブミン融合タンパク質を蓄積させることにより、より高い局在化濃度が得られることから、必要な本発明のアルブミン融合タンパク質の用量を減少させうる。本発明のアルブミン融合タンパク質は、架橋剤の使用により、および組換えＤＮＡ技術により、向標的部分と接合させることができ、こうすることにより、リガンドがタンパク質であるとき、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列、またはその機能部分がリガンドのヌクレオチド配列の近くでクローニングされて、複合体が融合タンパク質として発現される。向標的剤として、モノクローナル抗体またはその活性部分、例えばＦａｂまたはＦ（ａｂ′）２断片、内皮細胞表面レセプターにより認識されるリガンド（天然または合成）またはその機能部分、あるいは内皮細胞のタンパク質または構造と相互作用するいずれか他の剤がある。
活性抗体部分、例えば抗体のＦａｂまたはＦ（ａｂ′）２断片は抗原／標的結合性を留めているが、低い非特異的結合性を有している。ＦａｂまたはＦ（ａｂ′）２断片は、例えば固定プロテインＡを用いたプロテアーゼ切断と、ImmunoPure ＦａｂおよびImmunoPure Ｆ（ａｂ′）２製造キット（Pierce）を用いたペプシン／パパイン切断により得られる。抗体の他の活性部分も、別々な重および軽鎖への抗体または抗体断片の開裂により得られる。
本発明のアルブミン融合タンパク質／抗体複合体または遺伝子融合体により標的とされる分子には、内皮細胞表面分子、細胞外マトリックス成分、例えばコラーゲン、フィブロネクチンまたはラミニン、または他の血管壁構造がある。内皮表面抗原に対するモノクローナル抗体の例は、グリコシル化内皮細胞表面貫膜タンパク質ＣＤ３４を認識するＴｕｋ３(Dako)およびＱＢｅｎｄ１０(Serotec)である。内皮細胞表面抗原に対する他のモノクローナル抗体には、ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−１としても知られる）に対する９Ｇ１１、ＪＣ７０およびＢｙ１２６（British Bio-technology）、およびトロンボスポンジンレセプターであるＣＤ３６抗原に対するＥＳＩＶＣ７がある（Kuzu et al(1992)J.Clin.Pathol.45,143-148）。ＱＢｅｎｄ２０、ＱＢｅｎｄ３０およびＱＢｅｎｄ４０(Serotec)が、内皮細胞表面抗原を認識する他のモノクローナル抗体の例である。
向標的抗体が向かう内皮細胞表面分子は非特異的であり、異なる組織からのいくつか異なる内皮細胞タイプを認識するか、またはある内皮細胞タイプに特異的なこともある。抗体Ａ１０−３３／１(Serotec)は転移メラノーマの内皮細胞を認識し、Ｈ４−７／３３(Serotec)は小毛細血管の内皮細胞および様々な腫瘍細胞を認識し、ＨＭ１５／３(Serotec)は洞様毛細血管内皮細胞を認識し、１Ｆ／１０(Serotec)は連続内皮の２５０ｋＤ表面タンパク質と結合する。うっ血または炎症に関与する抗原に対する抗体も用いうる。抗体４Ｄ１０(Serotec)およびＢＢ１１（Benjamin et al(1990)Biochem.Biophys,Res.Commun.171,348-353）は急性炎症組織の内皮細胞上に存在するＥＬＡＭ−１を認識する。抗体４Ｂ９（Carlo,T.and Harlan,J,(1990)Immunol.Rev.114,1-24）はＶＣＡＭ接着性タンパク質を認識する。抗体８４Ｈ１０（Makgabo,M.et al(1988)Nature 331,86-88）はＩＣＡＭ１接着性タンパク質を認識する。抗体ＥＮ７／５８(Serotec)は、炎症内皮上および内皮細胞へ接着する細胞上に存在する抗原を認識する。抗体ＫＧ７／３０は、炎症組織および腫瘍の内皮表面上に存在するＦＶIII関連タンパク質を認識する。
サイトカインＩＬ−１よびＴＮＦは、インビトロで様々な末梢血白血球への接着性を獲得するように、培養内皮細胞を刺激する（Bevilaqua,M.et al(1985)J.Clin.Invest.76,2003；Schleimer,R.et al(1986)J.Immunol.136,649；Lamas,A.et al(1988)J.Immunol.140,1500；Bochner,B.et al(1988)J.Clin.Invest.81,1355）。この接着性は、ＩＣＡＭ−１、ＥＬＡＭ−１、ＧＭＰ−１４０（ＰＡＤＧＥＭまたはＣＤ６２としても知られる）およびＶＣＡＭ−１を含めて、いくつかの接着分子の内皮細胞での誘導と関連している。これらの接着分子は標的細胞の表面上でカウンターレセプターを認識する。ＶＣＡＭ−１は、ＶＬＡ−４として知られ、ＣＤ４９ｄ／ＣＤ２９およびインテグリンファミリーのメンバーとしても知られる抗原を認識する（Elices,M.et al(1990)Cell 60,577；Schwartz,B.et al(1990)J.Clin.Invest.85,2019）。ＩＣＡＭ−１は、ＬＦＡ−１として知られ、インテグリンファミリーのもう１つのメンバー、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８としても知られる抗原を認識する（Martin,S.et al(1987)Cell 51,813-819；Fujita,H.et al(1991)Biochem.Biophys.Res.Comm.177,664-672）。ＥＬＡＭ−１およびＧＭＰ−１４０（ＧＭＰ−１４０はＣＤ６２またはＰＡＤＧＥＭとしても知られる）は、Lewis-Ｘとして知られ、ＣＤ１５またはシアリル−LewisＸとしても知られる抗原を認識する（Larsen,E.et al(1990)Cell 63,467-474；McEver,R.(1991)J.Cell.Biochem.45,156-161；Shimizu,Y.et al(1991)Nature 349,799；Picker,L.et al(1991)Nature 349,796-798；Polley,M.et al(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.88,6224-6228；Lowe,J.et al(1990)Cell 63,475-484；Tiemeyer,M.et al(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.88,1138-1142）。
内皮細胞の表面上で発現されるレセプターまたは応答細胞の表面上のカウンターレセプターに対するモノクローナル抗体は、この細胞−細胞認識に必要な成分の相互作用を阻止することが示され、認識の様式を確立する上で役立つ（レファレンスに関しては上記参照）。
そのため、本発明の一つの態様は、本発明の融合タンパク質を哺乳動物へ投与することにより、哺乳動物における細胞の内側または細胞構造へ抗血管形成ペプチドを向かわせる方法の提供である。
本発明のもう１つの態様では、本発明のアルブミン融合タンパク質の複合体、および内皮細胞と特異的に結合する部分を提供する。
本発明のアルブミン融合タンパク質は、内皮細胞表面のレセプターと相互作用する天然または合成リガンドへ、架橋または組換えＤＮＡ技術により接合しうる。このようなリガンドには、増殖因子、例えば血管透過性因子（Gitay-Goren,H.et al(1992)J.Biol.Chem.267,6093-6098；Bikfalin,A.et al(1991)J.Cell.Phys,149,50-59；Tischer.E,et al(1991)266,11947-11954；Conn,G.et al(1990)PNAS 87.2628-2632；Keck,P.et al(1989)Science 246,1309-1312；Leung,D.W.et al(1989)Science 246,1306-1309）；血小板由来増殖因子（Beitz,J.et al(1991)PNAS 88,2021-2025）；トランスフェリンおよびウロキナーゼのような他の生体分子（Haddock,R.et al(1991)J.Biol.Chem.266,21466-21473）がある。複合体のリガンドドメインは、そのリガンド向けの内皮細胞表面レセプターにより認識され、本発明のアルブミン融合タンパク質を内皮へ向かわせる。
本発明のアルブミン融合タンパク質は、接着分子向けのカウンターレセプターへその剤を架橋することでも、特定の接着分子の方へ向けることができる。ＥＬＡＭ−１媒介接着の例で、カウンターレセプターはLewis-Ｘまたはシアリル化Lewis-Ｘとして知られる炭水化物決定基である。この末端構造を有する（Kameyama,A.et al(1991)Carbohydrate.Res.209,C1-C4）または天然源、例えばＬＮＦIII(Calbiochem)から精製された合成炭水化物は入手可能である。末端Lewis-Ｘまたはシアリル化Lewis-Ｘ決定基は、本発明のアルブミン融合タンパク質内の遊離スルフィドリル基と架橋しうる。これが、ＥＬＡＭ−１接着分子を呈する内皮細胞へ、その剤を特異的に向かわせるのである。
この部分は、ＩＣＡＭ−１、ＥＬＡＭ−１、ＧＭＰ−１４０またはＶＣＡＭ−１のような、内皮細胞表面レセプターに対するモノクローナル抗体でもよい。一方、この部分はカウンターレセプター自体でも、またはその機能性部分でもよい。融合は、ｉ）当業界で公知の技術で、モノクローナル抗体またはカウンターレセプターである、その部分の化学的架橋により、またはii）その部分が、それが１本のポリペプチド鎖であるとき、適切な宿主でその剤との遺伝子融合体として発現される、組換えＤＮＡ技術により行える。
いくつかの細胞特異的またはステージ特異的抗体が記載されてきた。これらには、例えば内皮細胞接着分子に対する抗体、例えば抗体ＢＢ１１（抗ＥＬＡＭ、Benjamin,C.et al(1990)Biochem.Biophys,Res.Commun.171,348-353）、抗体４Ｂ９（抗ＶＣＡＭ、Carlo,T.and Harlan,J.(1990)Immunol.Rev.114,1-24）および抗体８４Ｈ１０（抗ＩＣＡＭ１、Makgobo,M.et al(1988)Nature 331,86-88）がある。これらの抗体、またはそれらと同様の抗体は、本発明のアルブミン融合タンパク質へ共有結合させうる。これは、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、抗体の重または軽鎖をコードする遺伝子に、またはｓｃＦｖとして開裂される、遺伝子融合により行える。一方、剤はいくつかの二官能性架橋試薬、例えばジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）；ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３）；ジメチルアジピミデート−２ ＨＣｌ（ＤＭＡ）；ジメチルピメリミデート−２ ＨＣｌ（ＤＭＰ）；ジメチルスベリミデート−２ ＨＣｌ（ＤＭＳ）；ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）；ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）；ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＭＢＳ）；スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）；スルホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（スルホ−ＳＭＰＢ）；Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）；スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（スルホ−ＳＩＡＢ）；スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）；スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）；または１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＤＦＤＮＢ）（Pierce）のうち１つで抗体へ架橋しうる。
悪性転換および血管形成に関連する抗原を認識する抗体も用いうる：例えば、ＥＮ２／３（Serotec）は悪性転換内皮細胞の抗原特徴を認識する；ＥＮ７／４４（Serotec）は増殖、移動および出芽内皮細胞上に存在する血管形成関連抗原を認識する；Ｈ３−５／４７は乾癬および関節炎組織の血管芽細胞、血管腫、血管肉腫および血管周囲細胞で内皮細胞を認識する。
一方、向標的部分により認識される存在物は、腫瘍細胞で特異的に発現される適切な存在物でもよく、本発明のアルブミン融合タンパク質を向かわせたくない細胞では、その存在物が発現されず、またはこのような頻度では少なくとも発現されない。認識される存在物は多くの場合に抗原である。抗原の例として、下記表Ｘで掲載されたものがある。これら抗原の多くと特異的に結合するモノクローナル抗体は既に知られているが、いかなる場合にも、モノクローナル抗体技術に関する今日の技術によれば、ほとんどの抗原に対する抗体が作製しうる。抗原特異性部分は、抗体全体（通常、便宜上および特異性から、モノクローナル抗体）、その一部もしくは部分（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ′）２または「最小認識単位」）または合成抗体もしくはその一部である。抗体の一部のみを含む化合物は、Ｆｃ部分のせいで非特異的結合しにくいことから、有利かもしれない。選択抗原に対する適切なモノクローナル抗体は、公知の技術、例えば" Monoclonal Antibodies:A manual of techniques" ,H.Zola(CRC Press,1988)および" Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techniques and Applications" ,J.G.R.Hurrell(CRC Press,1982)で開示されたものにより作製しうる。この明細書で挙げられたすべてのレファレンスは、参考のためここに組み込まれる。二特異性抗体は細胞融合、一価断片の再会合または抗体全体の化学的架橋により作製してもよく、得られた二重特異性抗体の一部は細胞特異性抗原に対するもので、他は本発明のアルブミン融合タンパク質に対するものである。二重特異性抗体は本発明のアルブミン融合タンパク質へ結合させて投与されるか、またはそれが最初に投与されてから、本発明のアルブミン融合タンパク質が投与される。前者が好ましい。二重特異性抗体の作製方法はCorvalan et al(1987)Cancer Immunol.Immunother.24,127-132,133-137 and 138-143で開示されている。二重特異性抗体、キメラ抗体および一本鎖抗体はWilliams,Tibtech,February 1988,Vol.6,36-42,Ne
uberger et al(8th Interational Biotehnology Symposium,1988,part 2,792-799)およびTan and Morrison(Adv.Drug Deliverly Reviews 2(1988),129-142)で一般的に記載されている。適切に作製された非ヒト抗体は公知の手法で、例えばヒト抗体のフレームワーク中へマウス抗体のＣＤＲ領域を挿入することにより「ヒト化」しうる。ＩｇＧクラス抗体が好ましい。
Figure 2005530484
ＣＭＬまたはＡＬＬの治療へ適用されるならば、リガンド結合分子は白血病関連抗原に対するモノクローナル抗体になる。これらの例は：Foon,K.A.et al 1986 Blood 68(1),1-31," Review:Immunologic Classification of Leukemia and Lymphoma" で記載された抗ＣＡＬＬＡ（共通急性リンパ芽球白血病関連抗原）、Ｊ５、ＢＡ−３、ＲＦＢ−１、ＢＡ−２、ＳＪ−９Ａ４ Ｄｕ−ＡＬＬ−１、抗３−３、抗３−４０、ＳＮ１およびＣＡＬＬ２である。リガンド結合分子は、骨髄系細胞表面抗原を同定する抗体、またはＢもしくはＴリンパ球と各々反応性である抗体でもよい。このような抗体の例は、Foon,K.A.同上で記載されているような、ヒト骨髄系細胞表面抗原を同定するもの、またはヒトＢもしくはＴリンパ球と反応性のものである。追加の例は抗体Ｂ４３であり、Ｂリンパ球と反応性であるＣＤ２２およびＣＤ１９も用いうる。
一方、認識される存在物は抗原性でもまたはそうでなくてもよく、他の手法で認識または選択的に結合させてもよい。例えば、それはメラノーマ細胞で多数発現されるメラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）のレセプターのような特徴的細胞表面レセプターである。例えば、向標的部分は、例えば細胞表面酵素用の基質もしくはそのアナログとしてまたはメッセンジャーとして、非免疫的に存在物と特異的に結合する化合物またはその一部である。メラノーマ細胞の場合、向標的部分はＭＳＨレセプターと結合するＭＳＨ自体またはその一部である。このようなＭＳＨペプチドは、例えばAl-Obeidi et al(1980)J.Med.Chem.32,174で開示されている。特異性は間接的でもよい：第一の細胞特異性抗体が投与されてから、本発明の複合体が第一の抗体へ向けられる。好ましくは、認識される存在物は関連程度まで体液中へ分泌されず、そうでなければ必須の特異性が得られないからである。
本発明のこの態様の複合体の向標的部分は、連結化合物で慣用的ないずれかの手法により、例えば、Goodchild,前掲またはConnolly(1985)Nucl.Acids Res.13(12),4485-4502またはＰＣＴ／ＵＳ８５／０３３１２で一般的に記載されたような、ジスルフィド、アミドまたはチオエーテル結合により、本発明のアルブミン融合タンパク質へ連結させてよい。
本発明に包含される追加の翻訳後修飾には、例えば、Ｎ連結またはＯ連結炭水化物鎖、Ｎ末端またはＣ末端のプロセッシング、アミノ酸主鎖への化学的存在物の付着、Ｎ連結またはＯ連結炭水化物の化学修飾、および原核宿主細胞発現の結果としてＮ末端メチオニン残基の付加または欠失がある。アルブミン融合タンパク質は、例えば、薬物のような化学療法剤で、および／またはタンパク質の検出および単離を行えるように、酵素、蛍光、アイソトープおよび／または親和性ラベルのような検出可能ラベルで修飾してもよいが、それらに限定されない。このような修飾の例は、例えば、参考のためここに組み込まれる、当業界で周知の、米国仮出願第６０／３５５，５４７およびＷＯ０１／７９４８０（ｐ．１０５−１０６）で示されている。
機能活性
「機能活性を有するポリペプチド」とは、全鎖長プロタンパク質および／または治療用タンパク質の成熟型に伴う１以上の既知機能活性を示せるポリペプチドに関する。このような機能活性には、生物活性、抗原性〔抗ポリペプチド抗体と結合しうる（または結合に際してポリペプチドと競合しうる）能力〕、免疫原性（本発明の特定ポリペプチドと結合する抗体を産生しうる能力）、本発明のポリペプチドとマルチマーを形成しうる能力、およびポリペプチドのレセプターまたはリガンドと結合しうる能力があるが、それらに限定されない。
「生物活性を有するポリペプチド」とは、用量依存的にまたはそれなしで、特定の生物学的アッセイで測定されるような、成熟型を含めた、本発明の治療用タンパク質の活性と類似した、但し必ずしもそれと同一ではない、活性を示す、ポリペプチドに関する。用量依存性が存在する場合に、それはポリペプチドの場合と同一でなく、本発明のポリペプチドと比較して、むしろ所定活性で用量依存性と実質的に類似していることを要する。
他の態様において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、アルブミンと融合していないときの治療用タンパク質（またはその断片もしくは変種）に伴う生物および／または治療活性を少なくとも１つ有している。
本発明のアルブミン融合タンパク質は、当業界で公知のルーチンな修飾アッセイ、およびここで記載されたアッセイを用いて、機能活性（例えば、生物活性）についてアッセイしうる。特に、アルブミン融合タンパク質は、表１の「関連文献」欄で掲載されたアッセイを用いて、機能活性（例えば、生物活性または治療活性）についてアッセイしうる。加えて、当業者は、表１の対応列に掲載されたアッセイを用いて、活性について、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に相当する治療用タンパク質の断片をルーチンでアッセイしうる。更に、当業者は、当業界で知られた、および／または米国仮出願第６０／３５５，５４７およびＷＯ０１／７９４８０の例セクションで記載されたようなアッセイを用いて、活性について、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分に相当するアルブミンタンパク質の断片をルーチンでアッセイしてもよい。
加えて、ここで記載された（例および表１参照）、そうでなければ当業界で知られたアッセイは、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分および／またはアルブミン部分に関連した生物活性および／または治療活性（インビトロまたはインビボ）を発揮しうる、本発明のアルブミン融合タンパク質とその断片、変種および誘導体の能力を測定するために、ルーチンで適用される。他の方法も当業者に公知であり、本発明の範囲内に属する。
抗血管形成活性
血管形成の内在促進因子と抑制因子との自然バランスは、抑制作用が優性となるバランスである。Rastinejad et al.,Cell 56:345-355(1989)。血管新生が正常生理条件下で生じる稀な場合、例えば創傷治癒、臓器再生、胎児発育および女性生殖プロセスにおいて、血管形成は厳格に調節され、空間的および時間的に制限される。特徴的固形腫瘍成長のような病的血管形成の条件下では、これらの調節コントロールが崩れる。非調節血管形成だと病気になり、多くの新生物または非新生物疾患を進行させる。固形腫瘍成長および転移、関節炎、一部タイプの眼疾患および乾癬を含めたいくつかの重度疾患は、異常血管新生で維持されている。例えば、Moses et al.,Biotech.9:630-634(1991)；Folkman et al.,N.Engl.J.Med.,333:1757-1763(1995)；Auerbach et al.,J.Microvasc.Res.29:401-411(1985)；Folkman,Advances in Cancer Research,eds.Klein and Weinhouse,Academic Press,New York,pp.175-203(1985)；Patz,Am.J.Opthalmol.94:715-743(1982)；Folkman et al.,Science 221:719-725(1983)のレビュー参照。いくつかの病的状態のとき、血管形成のプロセスは病状に寄与する。例えば、固形腫瘍の成長が血管形成に依存していることを示唆する重要なデータが蓄積してきた。Folkman and Klagsbrun,Science 235:442-447(1987)。
本発明は、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの投与による血管新生を伴う疾患または障害の治療法を提供する。そのポリヌクレオチドおよびポリペプチド、即ち本発明の作働剤または拮抗剤で治療しうる悪性および転移症状には、ここで記載された、そうでなければ当業界で知られた悪性腫瘍、固形腫瘍および癌があるが、それらに限定されない（このような障害のレビューに関しては、Fishman et al.,Medicine,2d Ed.,J.B.Lippincott Co.,Philadelphia(1985)参照）。こうして、本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの治療有効量を治療の必要な個体へ投与することを含んでなる、血管形成関連疾患および／または障害の治療方法を提供する。例えば、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、癌または腫瘍を治療するために、様々な追加方法で利用しうる。本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで治療しうる癌には、前立腺、肺臓、乳房、卵巣、胃、膵臓、喉頭、食道、精巣、肝臓、耳下腺、胆管、結腸、直腸、子宮頸部、子宮、子宮内膜、腎臓、膀胱、甲状腺癌を含めた固形腫瘍；一次腫瘍および転移物；メラノーマ；グリオブラストーマ；カポジ肉腫；平滑筋肉腫；非小細胞肺癌；結腸直腸癌；進行悪性疾患；および白血病のような血液腫瘍があるが、それらに限定されない。例えば、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、皮膚癌、頭部および頸部腫瘍、乳房腫瘍およびカポジ肉腫のような癌を治療するため、局所的に送達される。
更に他の態様では、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、例えば膀胱内投与により、表在型の膀胱癌を治療するために利用しうる。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、注入またはカテーテルで、腫瘍中へまたは腫瘍部位近くへ直接送達してもよい。もちろん、当業者に明らかなように、適切な投与様式は治療される癌に応じて様々である。他の送達様式もここで記載されている。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、血管形成を伴う、癌以外の他の障害を治療する上でも有用なことがある。これらの障害には、良性腫瘍、例えば血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマおよび化膿性肉芽腫；じゅく状斑；眼血管形成疾患、例えば糖尿病網膜症、未熟児の網膜腫、黄斑変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障；水晶体後線維増殖症、ルベオーシス、網膜芽細胞腫、ブドウ膜炎および目の翼状片（異常血管成長）；リウマチ様関節炎；乾癬；創傷治癒遅延；子宮内膜症；脈管形成；顆粒形成；過形成性瘢痕（ケロイド）；骨折癒着不能；強皮症；トラコーマ；血管癒着；心筋血管形成；冠状副行；大脳副行；動静脈奇形；虚血性辺縁血管形成；Osler-Webber症候群；斑血管新生；毛細血管拡張症；血友病関節；血管線維腫；線維筋性形成異常；創傷顆粒形成；クローン病；およびアテローム性動脈硬化症があるが、それらに限定されない。
例えば、本発明の一つの態様において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを過形成性瘢痕またはケロイドへ投与する工程を含んでなる、過形成性瘢痕およびケロイドを治療するための方法が提供される。
本発明の一つの態様において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、これら病変の進行を妨げるために、過形成性瘢痕またはケロイド中へ直接注射される。この療法は過形成性瘢痕およびケロイド（例えば、熱傷）の発生に至ることが知られた症状の予防処置に特に有用であり、必要に応じて、増殖期が進行する時間（受傷時から約１４日間）を経た後で、過形成性瘢痕またはケロイドが生じる前に開始される。上記のように、本発明は、例えば角膜血管新生、血管新生緑内障、増殖性糖尿病網膜症、水晶体後線維増殖症および黄斑変性を含めた、目の血管新生疾患を治療するための方法も提供する。
更に、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで治療しうる、血管新生を伴う眼障害には、血管新生緑内障、糖尿病網膜症、網膜芽細胞腫、水晶体後線維増殖症、ブドウ膜炎、未熟児黄斑変性の網膜症、角膜移植片血管新生と、他の目炎症疾患、眼腫瘍および脈絡膜または虹彩血管新生に関連した疾患があるが、それらに限定されない。例えば、Walman et al.,Am.J.Ophthal.85:704-710(1978)およびGartner et al.,Surv.Ophthal.22:291-312(1978)のレビュー参照。
このため、本発明の一つの態様において、血管の形成が阻害されるように、角膜に対して治療有効量の化合物（例えば、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド）を患者へ投与する工程を含んでなる、角膜血管新生（角膜移植片血管新生を含む）のような目の血管新生疾患を治療するための方法が提供する。簡単に言えば、角膜は血管を通常欠く組織である。しかしながら、ある病的状態のとき、辺縁の角膜周囲血管叢から角膜中へ毛細血管が伸びることがある。角膜で血管新生されるようになると、それは曇るようになり、患者の視力の低下をもたらす。角膜が完全に混濁化すると、失明は完全になる。例えば、角膜感染（例えば、トラコーマ、単純ヘルペス角膜炎、リーシュマニア症およびオンコセルカ症）、免疫プロセス（例えば、移植拒絶およびStevens-Johnson症候群）、アルカリ熱傷、外傷、（何らかの原因の）炎症、中毒および栄養欠乏状態を含めた、およびコンタクトレンズ装着の合併症として、様々な障害が角膜血管新生をもたらしうる。
本発明の更に別の態様において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは（眼用製剤で常用される保存剤および抗菌剤のいずれかと組み合わせて）塩水で局所投与用に製造され、点眼形で投与される。溶液または懸濁液は純粋形で製造して、１日に数回投与してもよい。一方、上記のように製造された抗血管形成組成物は角膜へ直接投与してもよい。他の態様では、抗血管形成組成物は、角膜と結合するムコ接着性ポリマーで製造される。別な態様において、抗血管形成因子または抗血管形成組成物は従来のステロイド療法へ補助剤として利用しうる。局所療法は、血管形成応答（例えば、化学熱傷）を誘導する高い可能性を有していることが知られた角膜病変部で、予防的に有用かもしれない。これらの場合に、治療は、おそらくステロイドと組み合わせて、後発の合併症の防止に役立てるため、直ちに始めてよい。
他の態様において、上記の化合物は顕微鏡誘導下で眼科医により角膜支質中へ直接注入してもよい。注入部位は個別病変部の形態に応じて様々であるが、投与の目標は脈管構造の最先端（即ち、血管と正常角膜との間に散在する）に組成物を入れることである。ほとんどの場合に、これは最先端血管から角膜を「保護する」ために辺縁周囲角膜注射を行う。この方法は角膜血管新生を予防的に防ぐために角膜傷害後直ちに利用してもよい。この状況下では、角膜病変部とその望ましくない辺縁血液供給可能部位との間に散在する辺縁周囲角膜で物質が注射しうる。このような方法は、移植角膜の毛細血管侵襲を防ぐためにも、類似手法で利用しうる。持続的放出型の場合、注射は１年に２〜３回要するのみである。ステロイドも、注射自体に起因する炎症を抑えるために、注射溶液へ加えうる。
本発明の別な態様において、血管の形成が阻害されるように、目への治療有効量の本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを患者に投与する工程を含んでなる、血管新生緑内障を治療するための方法が提供される。一つの態様において、初期型の血管新生緑内障を治療するために、化合物は目に局所投与してもよい。他の態様では、化合物は前眼房角の領域中への注射によりインプラントしてもよい。他の態様で、化合物が房水中へ連続放出されるような箇所へ、化合物を入れてもよい。本発明の別な態様において、血管の形成が阻害されるように、目への治療有効量の本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを患者に投与する工程を含んでなる、増殖性糖尿病網膜症を治療するための方法が提供される。
本発明の更に別な態様において、増殖性糖尿病網膜症は、網膜でポリヌクレオチド、ポリペプチド、拮抗剤および／または作働剤の局所濃度を高めるために、房水または硝子体中への注射により治療してもよい。この治療は光凝固を要する重度疾患の発生前に開始しうる。
本発明の別な態様において、血管の形成が阻害されるように、目への治療有効量の本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを患者に投与する工程を含んでなる、水晶体後線維増殖症を治療するための方法が提供される。化合物は、硝子体内注射および／または眼内インプラントにより局所投与してよい。
加えて、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで治療しうる障害には、血管腫、関節炎、乾癬、血管線維腫、じゅく状斑、創傷治癒遅延、顆粒形成、血友病関節、過形成性瘢痕、骨折癒着不能、Osler-Webber症候群、化膿性肉芽腫、強皮症、トラコーマおよび血管癒着があるが、それらに限定されない。
更に、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで治療、予防、診断および／または予後しうる障害および／または状態には、固形腫瘍、白血病のような血液腫瘍、腫瘍転移、カポジ肉腫、良性腫瘍、例えば血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマおよび化膿性肉芽腫、リウマチ様関節炎、乾癬、眼血管形成疾患、例えば糖尿病網膜症、未熟児の網膜腫、黄斑変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖症、ルベオーシス、網膜芽細胞腫およびブドウ膜炎、創傷治癒遅延、子宮内膜症、脈管形成、顆粒形成、過形成性瘢痕（ケロイド）、骨折癒着不能、強皮症、トラコーマ、血管癒着、心筋血管形成、冠状副行、大脳副行、動静脈奇形、虚血性辺縁血管形成、Osler-Webber症候群、斑血管新生、毛細血管拡張症、血友病関節、血管線維腫、線維筋性形成異常、創傷顆粒形成、クローン病、アテローム性動脈硬化症、胚着床制御月経に必要な血管新生を妨げることによる避妊薬、病的結果として血管形成を有する疾患、例えばネコ引掻き病（Rochele minalia quintosa）、潰瘍（Helicobacter pylori）、バルトネラ症および桿菌血管腫症があるが、それらに限定されない。
避妊法の一つの態様では、胚着床を阻止する上で十分な量の化合物が、性交および受精が行われる前または後に投与され、こうして有効な避妊法、おそらく「事後避妊」法をもたらす。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、月経を制御する上で用いても、子宮内膜症の治療で腹膜洗浄液としてまたは腹膜着床のために投与してもよい。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、縫合肉芽腫を防ぐために、手術縫合糸中へ配合してもよい。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、様々な外科処置に利用しうる。例えば、本発明の一つの態様において、組成物（例えば、スプレーまたはフィルムの形）は、正常周辺組織を悪性組織から隔離する、および／または周辺組織への疾患の広がりを防ぐために、腫瘍の切除前に患部を被覆またはそこへ噴霧して利用しうる。本発明の他の態様において、組成物（例えば、スプレーの形）は、望ましい箇所で腫瘍を被覆するか、または血管形成を阻害するために、内視鏡操作で送達してもよい。本発明の更に他の態様において、本発明の抗血管形成組成物で被覆された外科用メッシュは、外科用メッシュが利用しうるあらゆる処置で利用しうる。例えば、本発明の一つの態様において、抗血管形成組成物を担持した外科用メッシュは、構造を支えるため、およびある量の抗血管形成因子を放出させるために、腹部癌切除術中（例えば、結腸切除後）に利用しうる。
本発明の別な態様において、癌の局所再発および新血管の形成が部位で阻害されるように、切除後における腫瘍の切除辺縁部へ、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを投与することを含んでなる、腫瘍切除部位を処置するための方法が提供される。本発明の一つの態様において、抗血管形成化合物は腫瘍切除部位へ直接投与される（例えば、抗血管形成化合物で腫瘍の切除辺縁部を綿棒で塗る、ブラシで塗るまたは被覆することにより塗布される）。一方、抗血管形成化合物は投与前に公知の外科用ペースト中へ配合してもよい。本発明の特別な態様では、抗血管形成化合物が悪性の肝臓切除後、および神経外科手術後に適用される。
本発明の一つの態様において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、例えば乳房、結腸、脳および肝臓腫瘍を含めた様々な腫瘍の切除辺縁部へ投与してもよい。例えば、本発明の一つの態様において、新血管の形成が部位で阻害されるように、抗血管形成化合物が切除後における神経腫瘍の部位へ投与される。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、米国仮出願第６０／３５５，５４７およびＷＯ０１／７９４８０で記載されているような他の抗血管形成因子と一緒に投与してもよい。
融合タンパク質の発現
本発明のアルブミン融合タンパク質は、酵母、微生物、例えば細菌、またはヒトもしくは動物細胞系からの分泌により、組換え分子として産生してもよい。必要に応じて、ポリペプチドは宿主細胞から分泌される。
ここで例示されたアルブミン融合タンパク質の発現向けに、ＷＯ９５／３３８３３で例示されたようなＨＳＰ１５０遺伝子の酵母株分断物(disrupted)、ＷＯ００／４４７７２で例示されたようなＰＭＴ１遺伝子の酵母株分断物〔ｒＨＡプロセス〕（アルブミン融合体のＯ連結グリコシル化を減少／消失させるように働く）またはＷＯ９５／２３８５７で例示されたようなＹＡＰ３遺伝子の酵母株分断物が、酵母ＰＲＢ１プロモーター、ＷＯ９０／０１０６３で例示されたＨＳＡ／ＭＦα−１融合リーダー配列、酵母ＡＤＨ１ターミネーター、ＬＥＵ２選択マーカーおよびＵＳ５，６３７，５０４で例示された崩壊ベクターｐＳＡＣ３５と組み合わせて、好結果に用いられた。
本発明で有用と予想される他の酵母株、プロモーター、リーダー配列、ターミネーター、マーカーおよびベクターは、参考のためここに組み込まれる、当業界で周知の、米国仮出願第６０／３５５，５４７およびＷＯ０１／７４９８０（ｐ．９４−９９）で記載されている。
本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質を発現するように形質転換された細胞、必要に応じて酵母細胞も含む。形質転換宿主細胞自体に加えて、本発明では、栄養培地中における、それら細胞の培養物、必要に応じてモノクローナル（クローン的に均一な）培養物、またはモノクローナル培養物から誘導された培養物も考えている。そのポリペプチドが分泌されるならば、培地は細胞と一緒に、あるいはそれらが濾過または遠心で除去されるならば細胞なしで、そのポリペプチドを含有する。細菌（例えば、E.coliおよびBacillus subtilis）、酵母（例えば、Saccharomyces cerevisiae、Kluyveromyces lactisおよびPichia pastoris）、糸状菌（例えば、Aspergillus）、植物細胞、動物細胞および昆虫細胞を含めて、多くの発現系が公知であり、用いうる。
望ましいタンパク質は、例えば宿主染色体または遊離プラスミドに挿入されたコード配列から、従来の手法で産生される。酵母は、いずれかの常法、例えばエレクトロポレーションにより、望ましいタンパク質のコード配列で形質転換される。エレクトロポレーションによる酵母の形質転換のための方法は、Becker & Guarente(1990)Methods Enzymol.194,182で開示されている。
好結果に形質転換された細胞、即ち本発明のＤＮＡ構築物を含有した細胞は、周知の技術により同定しうる。例えば、発現構築物の導入から得られた細胞は、望ましいポリペプチドを産生するために増殖させうる。細胞は回収および溶離され、それらのＤＮＡ分がSouthern(1975)J.Mol.Biol.98,503またはBerent et al.(1985)Biotech.3,208により記載されたような方法を用いてＤＮＡの存在について試験される。一方、上澄中におけるタンパク質の存在は抗体を用いて検出しうる。
有用な酵母プラスミドベクターにはｐＲＳ４０３−４０６およびｐＲＳ４１３−４１６があり、これらはStratagene Cloning Systems,La Jolla,CA 92037,USAから通常入手しうる。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５およびｐＲＳ４０６は酵母組込みプラスミド（ＹＩｐ）であり、酵母選択マーカーＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２およびＵＲＡ３を組み込んでいる。プラスミドｐＲＳ４１３−４１６は酵母動原体プラスミド（ＹＣｐ）である。
酵母で発現用のアルブミン融合タンパク質を作製するためのベクターにはｐＰＰＣ０００５、ｐＳｃＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡおよびｐＣ４：ＨＳＡがあるが、それらはAmerican Type Culture Collection,10801 University Boulevard,Manassas,Virginia 20110-2209に２００１年４月１１日付で寄託され、参考のためここに組み込まれる仮出願第６０／３５５，５４７およびＷＯ０１／７９４８０で記載されている。
酵母でアルブミン融合タンパク質を発現させるために有用であると予想されるもう１つのベクターは、参考のためそれ全体でここに組み込まれる、Sleep et al.,BioTechnology 8:42(1990)で記載されたｐＳＡＣ３５ベクターである。プラスミドｐＳＡＣ３５は、ＵＳ５，６３７，５０４で記載された崩壊クラスのベクターに属する。
相補的付着末端を介してＤＮＡをベクターへ作働可能に連結させるために、様々な方法が開発された。例えば、相補的ホモポリマー領域がベクターＤＮＡへ挿入されるＤＮＡセグメントへ加えられる。次いで、ベクターおよびＤＮＡセグメントが、組換えＤＮＡ分子を形成するために、相補的ホモポリマーの尾部間で水素結合させることにより結合される。
１以上の制限部位を含んだ合成リンカーは、ＤＮＡセグメントをベクターへ結合させる代替法を提供する。エンドヌクレアーゼ制限切断で得られたＤＮＡセグメントは、３′，５′−エキソヌクレアーゼ分解活性で突出γ一本鎖末端を除去して、へこんだ３′末端を重合活性でふさぐ酵素、バクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼまたはE.coli ＤＮＡポリメラーゼＩで処理される。したがって、これら活性の組合せで平滑末端ＤＮＡセグメントを得る。次いで、平滑末端セグメントは、バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼのような平滑末端ＤＮＡ分子の連結を触媒しうる酵素の存在下で、モル大過剰のリンカー分子とインキュベートされる。そのため、反応の産物は末端にポリマーリンカー配列を有するＤＮＡセグメントである。次いで、これらのＤＮＡセグメントは適切な制限酵素で開裂され、そのＤＮＡセグメントのものと適合しうる末端を生じる酵素で開裂された発現ベクターへ連結される。
様々な制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する合成リンカーが、いくつかの市販元から商業的に入手しうる。
本発明に従いＤＮＡを修飾する望ましい手法は、例えばＨＡ変種が作製されるのであれば、Saiki et al.(1988)Science 239,487-491で開示されたようなポリメラーゼ連鎖反応を用いることである。この方法において、酵素的に増幅されるＤＮＡは、増幅ＤＮＡ中へ自ら入り込む２種の特異的オリゴヌクレオチドプライマーにより隣接される。特異的プライマーは、当業界で公知の方法を用いて、発現ベクター中へのクローニングに用いうる制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含有してもよい。
アルブミン融合タンパク質を発現させるための宿主として本発明の実施に際して有用と考えられる酵母の例示属は、Pichia（以前はHansenulaとして分類されていた）、Saccharomyces、Kluyveromyces、Aspergillus、Candida、Torulopsis、Torulaspora、Schizosaccharomyces、Citeromyces、Pachysolen、Zygosaccharomyces、Debaromyces、Trichoderma、Cephalosporium、Humicola、Mucor、Neurospora、Yarrowia、Metschunikowia、Rhodosporidium、Leucosporidium、Botryoascus、Sporidiobolus、Endomycopsisなどである。属には、Saccharomyces、Schizosaccharomyces、Kluyveromyces、PichiaおよびTorulasporaからなる群より選択されるものを含む。Saccharomyces spp.の例はS.cerevisiae、S.italicusおよびS.rouxiiである。他の種類の例およびそれらの形質転換方法は、参考のためここに組み込まれる、米国仮出願第６０／３５５，５４７およびＷＯ０１／７９４８０（ｐ．９７−９８）で記載されている。
S.cerevisiaeの形質転換方法はＥＰ２５１７４４、ＥＰ２５８０６７およびＷＯ９０／０１０６３で一般的に記載されており、それらすべてが参考のためここに組み込まれる。
S.cerevisiae用の適切なプロモーターには、ＰＧＫ１遺伝子、ＧＡＬ１またはＧＡＬ１０遺伝子、ＣＹＣ１、ＰＨＯ５、ＴＲＰ１、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、グルコキナーゼ、α−接合因子フェロモン（接合因子フェロモン）の遺伝子に伴うもの、ＰＲＢ１プロモーター、ＧＵＴ２プロモーター、ＧＰＤ１プロモーター、および他のプロモーターの５′調節領域の一部または上流活性化部位との５′調節領域の一部のハイブリッドを要するハイブリッドプロモーター（例えば、ＥＰ−Ａ−２５８０６７のプロモーター）がある。
Schizosaccharomyces pombeで使用上便利な調節プロモーターは、Maundrell(1990)J.Biol.Chem.265,10857-10864で記載されたようなｎｍｔ遺伝子からのチアミン抑制性プロモーター、およびHoffman & Winston(1990)Genetics 124,807-816で記載されたようなグルコース抑制性ｊｂｐｌ遺伝子プロモーターである。
外来遺伝子の発現用にPichiaを形質転換する方法は、例えば、Cregg et al.(1993)および様々なPhillips特許（例えば、参考のためここに組み込まれるＵＳ４，８５７，４６７）で開示され、Pichia発現キットはInvitrogen BV,Leek,NetherlandsおよびInvitrogen Corp.,San Diego,Californiaから市販されている。適切なプロモーターにはＡＯＸ１およびＡＯＸ２がある。Gleeson et al.(1986)J.Gen.Microbiol.132,3459-3465はHansenulaベクターおよび形質転換の情報を含み、適切なプロモーターはＭＯＸ１およびＦＭＤ１である；ＥＰ３６１９９１，Fleer et al.(1991)およびRhone-Poulenc Rorerによる他の文献では、Kluyveromyces spp.で外来タンパク質を発現する方法を開示している。
転写終結シグナルは、転写終結およびポリアデニル化用の適正なシグナルを含む真核生物遺伝子の３′隣接配列でもよい。適切な３′隣接配列は、例えば、用いられた発現コントロール配列へ自然に連結された遺伝子のものでもよく、即ちプロモーターに相当してもよい。一方、それらは異なってもよく、その際にはS.cerevisiae ＡＤＨ１遺伝子の終結シグナルが必要に応じて用いられる。
望ましいアルブミン融合タンパク質は分泌リーダー配列と一緒に初めは発現されることがあり、その配列は選択された酵母で有効ないかなるリーダーでもよい。S.cerevisiaeで有用なリーダーには、接合因子αポリペプチド（ＭＦα−１）からのもの、およびＥＰ−Ａ−３８７３１９のハイブリッドリーダーがある。このようなリーダー（またはシグナル）は、成熟アルブミンが周辺培地中へ放出される前に、酵母により開裂される。別のこのようなリーダーには、ＪＰ６２−０９６０８６（９１１０３６５１６として許可）で開示されたS.cerevisiaeインベルターゼ（ＳＵＣ２）、酸ホスファターゼ（ＰＨＯ５）、ＭＦα−１のプレ配列、０グルカナーゼ（ＢＧＬ２）およびキラー毒素；S.diastaticusグルコアミラーゼII；S.carlsbergensis α−ガラクトシダーゼ（ＭＥＬ１）；K.lactisキラー毒素；およびCandidaグルコアミラーゼのものがある。
アルブミン融合タンパク質の組換えおよび合成産生の別法
本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、これらのポリヌクレオチドを含有するベクター、宿主細胞および生物を含む。本発明は、合成および組換え技術により、本発明のアルブミン融合タンパク質を産生する方法も含む。ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞および生物は、当業界で公知の方法により単離および精製される。
本発明で有用なベクターは、例えば、ファージ、プラスミド、コスミド、ミニ染色体、ウイルスまたはレトロウイルスベクターである。
本発明のポリヌクレオチドをクローニングおよび／または発現するために利用しうるベクターは、そのポリヌクレオチドの複製および／または発現が望まれる宿主細胞でポリヌクレオチドを複製および／または発現しうるベクターである。一般的に、ポリヌクレオチドおよび／またはベクターは、哺乳動物細胞（例えばヒト（例えばＨｅＬａ）、サル（例えばＣｏｓ）、ウサギ（例えばウサギ網状赤血球）、ラット、ハムスター（例えば、ＣＨＯ、ＮＳＯおよびベビーハムスター腎臓細胞）またはマウス細胞（例えばＬ細胞））、植物細胞、酵母細胞、昆虫細胞または細菌細胞（例えばE.coli）を含めた、真核または原核のいずれかの細胞で利用しうる。例えば、様々なタイプの宿主細胞向けに適したベクターの例に関して、F.Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience(1992) and Sambrook et al.(1989)参照。しかしながら、複製欠失のあるレトロウイルスベクターが用いられた場合、ウイルス増殖は相補的宿主細胞のみで通常生じることに留意しなければならない。
これらのポリヌクレオチドを含有した宿主細胞は、例えば医薬、診断試薬、ワクチンおよび治療剤に有用なタンパク質を大量に発現させるために用いうる。タンパク質は、当業界で知られたまたはここで記載された方法により、単離および精製される。
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、宿主で増殖用の選択マーカーを含有したベクターへ結合させてもよい。通常、プラスミドベクターは、沈降物、例えばリン酸カルシウム沈降物、または荷電脂質との複合物中に導入される。ベクターがウイルスであるならば、それは適切なパッケージング細胞系を用いてインビトロでパッケージングされ、次いで宿主細胞中へ導入される。
ポリヌクレオチドインサートは、ポリヌクレオチドが発現される宿主細胞と適合しうる適切なプロモーターへ作働可能に連結すべきである。そのプロモーターは強プロモーターおよび／または誘導プロモーターである。プロモーターの例として、いくつか挙げると、ファージラムダＰＬプロモーター、E.coli ｌａｃ、ｔｒｐ、ｐｈｏＡおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、およびレトロウイルスＬＴＲのプロモーターがある。他の適切なプロモーターも当業者にはわかるであろう。発現構築物は、転写開始、終結のための部位、および転写領域には、翻訳のためのリボソーム結合部位を更に含有する。その構築物により発現される転写物のコード部分は、翻訳されるポリペプチドの始めに翻訳開始コドン、およびその終わりに終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を適切な部位で含有しうる。
示されたように、発現ベクターは少なくとも１つの選択マーカーを含有しうる。このようなマーカーには、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、Ｇ４１８、グルタミンシンターゼ、または真核細胞培養用のネオマイシン耐性、およびE.coliおよび他の細菌で培養向けのテトラサイクリン、カナマイシンまたはアンピシリン耐性遺伝子がある。適切な宿主の代表例には、細菌細胞、例えばE.coli、StreptomycesおよびSalmonella typhimurium細胞；真菌細胞、例えば酵母細胞（例えば、Saccharomyces cerevisiaeまたはPichia pastoris（ＡＴＣＣ受入Ｎｏ．２０１７８））；昆虫細胞、例えばDrosophila S2およびSpodoptera Sf9細胞；動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＮＳＯ、２９３およびBowesメラノーマ細胞；および植物細胞があるが、それらに限定されない。上記宿主細胞用に適した培地および条件は、当業界で公知である。
一つの態様において、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、原核または真核細胞の特定分画へ本発明のタンパク質を局在化させる、および／または原核または真核細胞から本発明のタンパク質を分泌させる、シグナル配列へ融合させてもよい。例えば、E.coliの場合では、タンパク質の発現を周辺腔へ向けたいであろう。細菌の周辺腔へポリペプチドの発現を向けるために、本発明のアルブミン融合タンパク質が融合されるシグナル配列またはタンパク質（またはその断片）の例には、ｐｅｌＢシグナル配列、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）シグナル配列、ＭＢＰ、ｏｍｐＡシグナル配列、ペリプラズムE.coli熱不安定エンテロトキシンＢサブユニットのシグナル配列、およびアルカリホスファターゼのシグナル配列があるが、それらに限定されない。いくつかのベクターが、New England Biolabs市販のｐＭＡＬシリーズのベクター（特に、ｐＭＡＬ−ｐシリーズ）のように、タンパク質の局在化を指示する融合タンパク質の構築向けに市販されている。特別な態様において、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、グラム陰性菌でこのようなポリペプチドの発現および精製の効力を高めるために、ｐｅｌＢペクチン酸リアーゼシグナル配列へ融合される。米国特許第５，５７６，１９５および５，８４６，８１８参照；その内容は参考のためそれら全体でここに組み込まれる。
哺乳動物細胞で分泌を指示するために本発明のアルブミン融合タンパク質へ融合されるシグナルペプチドの例には、ＭＰＩＦ−１シグナル配列（例えば、GenBank受入Ｎｏ．ＡＡＢ５１１３４のアミノ酸１−２１）、スタンニオカルシンシグナル配列（ＭＬＱＮＳＡＶＬＬＬＬＶＩＳＡＳＡ、配列番号５）およびコンセンサスシグナル配列（ＭＰＴＷＡＷＷＬＦＬＶＬＬＬＡＬＷＡＰＡＲＧ、配列番号６）があるが、それらに限定されない。バキュロウイルス発現系と共に用いうる適切なシグナル配列は、ｇｐ６７シグナル配列（例えば、GenBank受入Ｎｏ．ＡＡＡ７２７５９のアミノ酸１−１９）である。
選択マーカーとしてグルタミンシンターゼ（ＧＳ）またはＤＨＦＲを用いたベクターは、各々薬物メチオニンスルホキシミンまたはメソトレキセートの存在下で増幅させうる。グルタミンシンターゼベースのベクターの利点は、グルタミンシンターゼ陰性の細胞系（例えば、ネズミミエローマ細胞系ＮＳＯ）の利用可能性である。グルタミンシンターゼ発現系は、追加インヒビターを入れて内在遺伝子の機能を妨げることにより、グルタミンシンターゼ発現細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）でも機能しうる。グルタミンシンターゼ発現系およびその成分はＰＣＴ文献：ＷＯ８７／０４４６２、ＷＯ８６／０５８０７、ＷＯ８９／０１０３６、ＷＯ８９／１０４０４およびＷＯ９１／０６６５７で詳述されており、これらは参考のためそれら全体でここに組み込まれる。加えて、グルタミンシンターゼ発現ベクターはLonza Biologics,Inc.(Portsmouth,NH)から得られる。ネズミミエローマ細胞でＧＳ発現系を用いたモノクローナル抗体の発現および産生は、参考のためここに組み込まれるBebbington et al.,Bio/technology 10:169(1992)およびBiblia and Robinson Biotechnol.Prog.11:1(1995)で記載されている。
本発明は、ベクター構築物を含有した宿主細胞、例えばここで記載されているものにも関し、当業界で公知の技術を用いて１以上の異種コントロール領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）と作働可能に結合された本発明のヌクレオチドを含有する宿主細胞を更に包含する。宿主細胞は哺乳動物細胞（例えば、ヒト由来細胞）のような高等真核細胞でもまたは酵母細胞のような下等真核細胞でもよく、宿主細胞は細菌細胞のような原核細胞でもよい。挿入遺伝子配列の発現を調節するか、または望ましい特別な方式で遺伝子産物を修飾およびプロセッシングする宿主株が選択される。あるプロモーターからの発現はあるインデューサーの存在下で高められる；こうして遺伝子工学ポリペプチドの発現が制御しうる。更に、異なる宿主細胞はタンパク質の翻訳および翻訳後プロセッシングおよび修飾（例えば、リン酸化、開裂）について特徴および特別なメカニズムを有している。発現される外来タンパク質の望ましい修飾およびプロセッシングを保証するために、適切な細胞系が選択される。
本発明の核酸および核酸構築物の宿主細胞中への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、トランスダクション、感染または他の方法により行える。このような方法は多くの標準実験マニュアル、例えばDavis et al.,Basic Methods In Molecular Biology(1986)で記載されている。本発明のポリペプチドは実際に組換えベクターを欠く宿主細胞により発現させうる、と特に考えられている。
ここで記載されたベクター構築物を含有した宿主細胞を包含することに加えて、本発明は、内在遺伝物質を欠失または置き換える（例えば、治療用タンパク質に相当するコード配列は、治療用タンパク質に相当するアルブミン融合タンパク質で置き換えてもよい）および／または遺伝物質を含有する（例えば、例えば治療用タンパク質に相当する本発明のアルブミン融合タンパク質のような異種ポリヌクレオチド配列が含有させうる）ように工学処理された脊椎動物源、特に哺乳動物源の一次、二次および不死化宿主細胞も包含する。内在ポリヌクレオチドと作働可能に結合された遺伝物質は、内在ポリヌクレオチドを活性化、変化および／または増幅させうる。
加えて、当業界で公知の技術は、相同的組換え（例えば、１９９７年６月２４日付で発行された米国特許第５，６４１，６７０；国際公開第ＷＯ９６／２９４１１；国際公開第ＷＯ９４／１２６５０；Koller et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:8932-8935(1989)；Zijlstra et al.,Nature 342:435-438(1989)参照；それら各々の開示は参考のためそれら全体でここに組み込まれる）により、治療用タンパク質をコードする内在ポリヌクレオチド配列と、異種ポリヌクレオチド（例えば、アルブミンタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはその断片もしくは変種）および／または異種コントロール領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）を作働可能に結合させるために用いてもよい。
有利には、本発明のアルブミン融合タンパク質は、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈降、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、疎水性電荷相互作用クロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた周知の方法により、組換え細胞培養物から回収および精製しうる。一部の態様では、高性能液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製に用いうる。
一部の態様において、本発明のアルブミン融合タンパク質は上記の１以上のクロマトグラフィー法を用いて精製される。他の態様では、本発明のアルブミン融合タンパク質は次のクロマトグラフィーカラム、ＱセファロースＦＦカラム、ＳＰセファロースＦＦカラム、Ｑセファロース高性能カラム、ブルーセファロースＦＦカラム、ブルーカラム、フェニルセファロースＦＦカラム、ＤＥＡＥセファロースＦＦまたはメチルカラムのうち１以上を用いて精製される。
加えて、本発明のアルブミン融合タンパク質は、参考のためそれ全体でここに組み込まれる国際公開第ＷＯ００／４４７７２で記載されたプロセスを用いて精製してもよい。当業者であれば、本発明のアルブミン融合タンパク質の精製で使用のために、ここで記載されたプロセスを容易に改変しうるであろう。
本発明のアルブミン融合タンパク質は、例えば細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞を含めた原核または真核宿主から組換え技術により産生された産物より回収しうる。組換え産生操作で用いられた宿主に応じて、本発明のポリペプチドはグリコシル化されても、またはグリコシル化されなくてもよい。加えて、本発明のアルブミン融合タンパク質は、宿主媒介プロセスの結果として、一部の場合に開始修飾メチオニン残基も含有してよい。こうすると、翻訳開始コドンによりコードされたＮ末端メチオニンが、全真核細胞で翻訳後にタンパク質から高効力で通常除去されることは、当業界で周知である。ほとんどのタンパク質のＮ末端メチオニンはほとんどの原核細胞で効率的に除去されるが、一部のタンパク質の場合には、Ｎ末端メチオニンが共有結合されたアミノ酸の性質に応じて、この原核除去プロセスは非効率的である。
本発明のアルブミン融合タンパク質、および治療用タンパク質またはその断片もしくは変種と結合する抗体は、マーカー配列、例えば精製を促すためのペプチドへ融合させてもよい。一つの態様において、マーカーアミノ酸配列はヘキサヒスチジンペプチド、例えばｐＱＥベクターでもたらされるタグ（QIAGEN,Inc.,9259 Eton Avenue,Chatsworth,CA,91311）であり、特にその多くが市販されている。例えばGentz et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:821-824(1989)で記載されているように、ヘキサヒスチジンは融合タンパク質の精製に便宜をもたらす。精製に有用な他のペプチドタグには、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から誘導されるエピトープに相当する「ＨＡ」タグ（Wilson et al.,Cell 37:767(1984)）および「ＦＬＡＧ」タグがあるが、それらに限定されない。
更に、本発明のアルブミン融合タンパク質は、細胞毒素、例えば細胞静止または細胞致死剤、治療剤のような治療部分、または放射性金属イオン、例えば２１３Ｂｉのようなα放出体へ接合してもよい。このような剤の例は、参考のためここに組み込まれる、米国仮出願第６０／３５５，５４７およびＷＯ０１／７９４８０（ｐ．１０７）で記載されている。
アルブミン融合タンパク質は、本発明のアルブミン融合タンパク質により結合される、それと結合または会合するポリペプチドのイムノアッセイまたは精製に特に有用な固形担体へ付着させてもよい。このような固形担体には、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリビニルクロリドまたはポリプロピレンがあるが、それらに限定されない。
ポリペプチドの溶解性、安定性および循環時間の向上、または免疫原性の低下のような追加の利点を発揮しうる、本発明のアルブミン融合タンパク質の化学的修飾誘導体も、本発明により提供される（米国特許４，１７９，３３７参照）。ポリエチレングリコールの使用を伴う例は、参考のためここに組み込まれる、ＷＯ０１／７９４８０（ｐ．１０９−１１１）で記載されている。
本発明のアルブミン融合タンパク質の存在および量は、当業界で知られる周知のイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡを用いて調べてもよい。
ポリペプチドの使用
ここで特定されたポリペプチドの各々は様々な手法で用いうる。以下の記載は例示とみなすべきであり、公知の技術を利用している。
本発明のアルブミン融合タンパク質は、哺乳動物、好ましくはヒトで様々な障害の治療、予防および／または予後に有用である。このような障害には表１の「生物活性」欄で記載されたものがあるが、それらに限定されない。
本発明のアルブミン融合タンパク質は、内皮細胞の増殖および腫瘍誘導性血管形成のインヒビターとして用いうる。
更に、本発明のアルブミン融合タンパク質は疾患または症状を治療または予防するために用いうる。例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質は、一次腫瘍および転移物の成長を妨げるまたはその退縮を促進するための；癌、糖尿病性網膜症、進行性黄斑変性またはリウマチ様関節炎を治療するための予防または治療剤として用いうる。
アルブミン融合タンパク質は、生物学的サンプル、例えばインビボ診断で、ポリペプチドのレベルをアッセイするために用いうる。例えば、本発明の放射線標識アルブミン融合タンパク質は身体におけるポリペプチドの画像診断に用いうる。アッセイの例は、例えば、参考のためここに組み込まれる米国仮出願第６０／３５５，５４７およびＷＯ０１７９４８０（ｐ．１１２−１２２）で記載されており、当業界で周知である。タンパク質のインビボ画像診断用のラベルまたはマーカーには、Ｘ−ラジオグラフィー、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、電子スピン緩和（ＥＳＲ）、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）またはコンピューター断層撮影法（ＣＴ）により検出しうるものがあるが、それらに限定されない。Ｘ−ラジオグラフィーの場合、適切なラベルには、検出可能な放射線を放射するが、被験者に過度に有害でない、バリウムまたはセシウムのような放射性同位元素がある。ＮＭＲおよびＥＳＲに適したマーカーには、本発明のアルブミン融合タンパク質を発現する細胞系へ入れられる栄養素のラベリングによりアルブミン融合タンパク質中へ取り込まれる、重水素のような、検出可能な特徴的スピンをもつものがある。
適切な検出可能画像化部分、例えば放射性同位元素、例えば１３１Ｉ、１１２Ｉｎ、９９ｍＴｃ（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、イオウ（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５ｍＩｎ、１１３ｍＩｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、テクネチウム（９９Ｔｃ、９９ｍＴｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ）、放射線不透過性物質、または核磁気共鳴により検出しうる物質で標識されたアルブミン融合タンパク質は、免疫系障害について試験される哺乳動物へ（例えば、非経口、皮下または腹腔内）導入される。被験者のサイズおよび用いられる画像化システムが診断画像を作るために必要な画像化部分の量を決定する、と当業界では理解されるであろう。放射性同位元素部分について、ヒト被験者の場合では、投入される放射線の量が９９ｍＴｃで通常約５〜２０ミリキュリーである。その際に、標識されたアルブミン融合タンパク質は、１以上のレセプター、リガンドまたは基質（本発明のアルブミン融合タンパク質を作製するために用いられる治療用タンパク質のものに相当する）が位置する体内部位（例えば、臓器、細胞、細胞外空間またはマトリックス）で、優先的に蓄積してくる。一方、アルブミン融合タンパク質が治療用抗体の少なくとも１つの断片または変種を含んでなる場合に、標識されたアルブミン融合タンパク質は、（本発明のアルブミン融合タンパク質を作製するために用いられる）治療用抗体により結合されるものに相当するポリペプチド／エピトープが位置する体内部位（例えば、臓器、細胞、細胞外空間またはマトリックス）で、優先的に蓄積してくる。インビボ腫瘍画像診断はS.W.Burchiel et al.," Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments" (Chapter 13 in Tumor Imaging:The Radiochemical Detection of Cancer,S.W.Burchiel and B.A.Rhodes,eds.,Masson Publishing Inc.(1982))で記載されている。そこで記載されたプロトコールは、本発明のアルブミン融合タンパク質向けに、当業者により簡単に修正しうる。
このように、本発明の一つの態様は、本発明の標識融合タンパク質を哺乳動物へ投与し、標識融合タンパク質の少なくとも一部を血管形成依存性疾患または障害の部位へ到達させ、血管形成依存性疾患または障害の部位で融合タンパク質を検出することを含んでなる、哺乳動物で抗血管形成関連疾患または障害を画像診断する方法の提供である。このような方法は、例えば、血管形成関連疾患または障害が治療に応答するかどうかを調べるために用いてもよい。このような方法では、例えば、最初に哺乳動物で腫瘍の数またはサイズを調べ、次いで腫瘍の数が治療後に増加または減少するかどうか、および／または腫瘍が治療後に成長または移動するかどうかを調べる。
本発明のアルブミン融合タンパク質は、宿主細胞の形質転換を評価する手法として、または生物学的サンプルにおいて、組換え細胞からの治療用タンパク質、アルブミンタンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質のタンパク質発現を測定するために用いられる抗体を産生するために用いることもできる。更に、本発明のアルブミン融合タンパク質は、ここで記載された生物活性を試験するために用いうる。
トランスジェニック生物
本発明のアルブミン融合タンパク質を発現するトランスジェニック生物も本発明に含まれる。トランスジェニック生物は、組換え、外来またはクローン化遺伝物質が移入された遺伝子修飾生物である。このような遺伝物質はトランスジーンと称されることが多い。トランスジーンの核酸配列は、コードされたタンパク質の最良発現および分泌に必要かもしれない、１以上の転写調節配列および他の核酸配列、例えばイントロンを含有しうる。トランスジーンは、生物からの、または生物により産生された産物からの、例えば生物の乳、血液、尿、卵、毛または種子からの回収を促すやり方で、コードタンパク質の発現を指示するようにデザインしてもよい。トランスジーンは、標的動物の種と同様の種またはそれとは異なる種のゲノムから誘導される核酸配列からなる。トランスジーンは、特定の核酸配列が通常みられないゲノムの座に、またはトランスジーンの正常な座に組み込まれる。
「生殖細胞系トランスジェニック生物」という用語は、遺伝情報を子孫へ伝えうるトランスジェニック生物の能力を付与することにより、遺伝子改変または遺伝情報が生殖細胞系中へ導入された、トランスジェニック生物に関する。このような子孫がその改変または遺伝情報の一部または全部を実際に有しているならば、それらもトランスジェニック生物である。その改変または遺伝情報は、レシピエントが属する生物の種に外来、具体的な個別のレシピエントのみに外来であっても、またはレシピエントにより既に保有された遺伝情報でもよい。最後の場合に、改変または導入された遺伝子は、在来遺伝子とは別に発現されることもある。
トランスジェニック生物は、トランスジェニックのヒト、動物または植物である。トランスジェニックは、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、胚幹細胞での遺伝子標的化と組換えウイルスおよびレトロウイルス感染を含めた様々な異なる方法により作製しうる（例えば、米国特許第４，７３６，８６６；米国特許第５，６０２，３０７；Mullins et al.(1993)Hypertension 22(4):630-633；Brenin et al.(1997)Surg.Oncol.6(2)99-111；Tuan(ed.),Recombinant Gene Expression Protocols,Methods in Molecular Biology No.62,Humana Press(1997)参照）。組換えコンピテント哺乳動物細胞中への核酸断片の導入方法は、マルチ核酸分子の同時形質転換を行わせる、どのような方法によるものでもよい。トランスジェニック動物を作製するための詳細な操作は、米国特許第５，４８９，７４３および米国特許第５，６０２，３０７の開示を含めて、当業者に容易に利用しうる。追加の情報は、参考のためここに組み込まれる、米国仮出願第６０／３５５，５４７およびＷＯ０１／７９４８０（ｐ．１５１−１６２）で記載されている。
遺伝子療法
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする構築物は、治療有効量のアルブミン融合タンパク質を送達する遺伝子療法プロトコールの一部として用いうる。細胞中への核酸のインビボ導入のための１つのアプローチは、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする核酸を含有したウイルスベクターの使用による。ウイルスベクターによる細胞の感染は、標的細胞の大部分がその核酸を受け取れる、という利点を有している。加えて、ウイルスベクター内でコードされた分子は、例えばウイルスベクターに含有されたｃＤＮＡにより、ウイルスベクター核酸を取り込んだ細胞で効率的に発現される。望ましいアルブミン融合タンパク質の血漿半減期延長は、潜在的な低発現レベルすら補えるかもしれない。
レトロウイルスベクターおよびアデノ関連ウイルスベクターは、インビボでアルブミン融合タンパク質をコードする外来核酸分子の移入用の組換え遺伝子送達系として用いうる。これらのベクターは細胞中への核酸の効率的送達を行い、移入された核酸は宿主の染色体ＤＮＡ中へ安定的に組み込まれる。このようなベクターの例、それらを用いる方法、それらの利点および非ウイルス送達法は、参考のためここに組み込まれる、米国仮出願第６０／３５５，５４７およびＷＯ０１／７９４８０（ｐ．１５１−１５３）で詳細に記載されている。
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする遺伝子用の遺伝子送達系は、いくつかの方法で患者へ導入される。例えば、遺伝子送達系の医薬製剤は、例えば静脈注射により全身導入でき、標的細胞へのタンパク質の特異的導入は、遺伝子送達ビヒクルにより得られるトランスフェクションの特異性、レセプター遺伝子の転写調節配列制御発現による細胞タイプまたは組織タイプ発現、またはそれらの組合せから優先的に生じる。他の態様において、組換え遺伝子の初期送達は更に制限されており、動物への導入は全く局在化されている。例えば、遺伝子送達ビヒクルはカテーテル（米国特許５，３２８，４７０）または定位注射（例えば、Chen et al.(1994)PNAS 91:3054-3057）により導入しうる。遺伝子療法構築物の医薬製剤は許容される希釈物中の遺伝子送達系から本質的になるか、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれた徐放性マトリックスを含むことができる。アルブミン融合タンパク質が組換え細胞、例えばレトロウイルスベクターから完全なままで産生されうる場合は、医薬製剤はアルブミン融合タンパク質を産生する１以上の細胞を含むことができる。別な遺伝子療法は、参考のためここに組み込まれる、米国仮出願第６０／３５５，５４７およびＷＯ０１／７９４８０（ｐ．１５３−１６２）で記載されている。
医薬または治療組成物
本発明のアルブミン融合タンパク質は、非経口（例えば、皮下または筋肉内）注射または静脈内注入を含めた、いずれかの常法により投与される。治療は所定の期間にわたり１回の投薬または複数回の投薬からなる。更に、１回分の用量または複数回分の用量が、アルブミンへ融合されていない治療用タンパク質の場合よりも少ない回数で投与される。
本発明のアルブミン融合タンパク質は単独で投与することが可能であるが、１種以上の許容される担体と一緒に医薬処方物としてそれを提供することが望ましい。担体は、アルブミン融合タンパク質と適合できて、そのレシピエントに有害でないという意味で、「許容しうる」ものでなければならない。典型的には、担体は無菌で無発熱物質の水または塩水である。本発明のアルブミン融合タンパク質は、溶液中での貯蔵期間延長のおかげで、無菌無発熱物質水、塩水または他の等張液のような水性担体中での処方に特によく合う。例えば、本発明の医薬組成物は、例えば分配される数週間、数ヶ月間前またはそれ以上前に、予め水性形で適切に処方される。
アルブミン融合タンパク質を含有した処方物は、水性処方物中でのアルブミン融合タンパク質の貯蔵期間延長を考慮にいれて製造される。上記のように、これら治療用タンパク質の多くの貯蔵期間はＨＡへの融合後に著しく増加または長期化する。
エアゾール投与が適する場合に、本発明のアルブミン融合タンパク質は標準操作を用いてエアゾールとして処方しうる。「エアゾール」という用語は、細気管支または鼻腔中へ吸入されうる、本発明のアルブミン融合タンパク質のガス入り懸濁相を含有している。特に、エアゾールは、計量吸入器もしくはネブライザー、またはミストスプレー器で生じさせるように、本発明のアルブミン融合タンパク質の液滴のガス入り懸濁物を含有している。エアゾールは、例えば吸入器から吸入により送達される、空気または他のキャリアガス中に懸濁された本発明の化合物の乾燥粉末組成物も含有している。
処方物は便宜上単位剤形で供与し、製剤業界で周知の方法により製造してもよい。このような方法は、１種以上の補助成分からなる担体とアルブミン融合タンパク質とを混合する工程を含んでいる。一般的に、処方物は、液体担体、微細固形担体または双方と活性成分を均一かつ完全に混合し、必要であれば、製品に成形することにより製造される。
非経口投与に適した処方物には、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤および処方物を所定のレシピエントに適合させる溶質を含有した水性および非水性無菌注射液；懸濁剤および増粘剤を含有した水性および非水性無菌懸濁液がある。処方物は単位用量またはマルチ用量容器、例えば密封アンプル、バイアルまたはシリンジで供与され、フリーズドライ（凍結乾燥）条件下で貯蔵されて、使用直前に無菌液体担体、例えば注射用水の添加のみを要する。即時注射溶液および懸濁液は無菌粉末から調製される。投薬処方物は、本発明のアルブミン融合タンパク質の多くが血清半減期延長を示すとすれば、治療用タンパク質の非融合標準処方物と比較して低いモル濃度または低い用量で、治療用タンパク質部分を含有しうる。
例として、本発明のアルブミン融合タンパク質が１以上の治療用タンパク質領域を含んでなるとき、投薬剤形は、治療用タンパク質そのものの場合と比べたアルブミン融合タンパク質の血清半減期および貯蔵期間の長期化を考慮しながら、治療用タンパク質の効力と比較したアルブミン融合タンパク質の効力に基づき計算できる。例えば、全鎖長治療用タンパク質に融合された全鎖長ＨＡからなるアルブミン融合タンパク質において、相当用量が単位の関係で剤の重量増加に繋がるが、投与回数は減少しうる。
本発明の処方物または組成物は、アルブミン融合タンパク質成分の貯蔵期間延長に関する説明書またはパッケージインサートと一緒にパッケージングされるか、またはそれと共にキットへ入れられる。例えば、このような説明書またはパッケージインサートは、本発明のアルブミン融合タンパク質の貯蔵期間延長または長期化を考慮にいれた、時間、温度および光のような推奨貯蔵条件を扱う。このような説明書またはパッケージインサートは、管理された病院、診療所またはオフィス条件の外部、野外で使用を要することもある処方物での貯蔵の容易性のような、本発明のアルブミン融合タンパク質の特別な利点についても扱える。上記のように、本発明の処方物は水性形でもよく、治療活性の過大な喪失なしに、理想とはいかない環境下でも貯蔵しうる。
本発明は、製薬上許容される担体中で本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（「アルブミン融合ポリヌクレオチド」）の有効量の対象者への投与による、疾患または障害（例えば、ここで開示された疾患または障害のうち１以上）の治療および／または予防の方法も提供する。
投与される本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドの有効量は、当業者に周知の方法を用いた、表１のレファレンスで記載されたようなルーチンのインビトロおよびインビボ研究からのデータを用いることを含めて、生物学的半減期、バイオアベイラビリティおよび毒性のようなパラメーターを扱う当業者に周知の操作を介して決定しうる。
アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、個別患者の臨床条件（特に、アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチド単独での治療の副作用）、送達の部位、投与の方法、投与のスケジュール、および従事者に公知の他のファクターを考慮にいれて、良好な医療実務に従い処方および投与される。こうして、ここでの目的に合わせた「有効量」がこのような考慮により定められる。
例えば、送達される物質の有効量の決定は、例えば、物質の化学構造および生物活性、患者の年齢および体重、治療を要する正確な症状およびその重篤度、および投与の経路を含めたいくつかのファクターに依存しうる。治療の頻度は、１回当たりで投与されるアルブミン融合タンパク質またはポリヌクレオチド構築物の量、対象者の健康および病歴のようないくつかのファクターに依存する。正確な量、投与の回数および投与のタイミングは、担当医または獣医師により決定される。
本発明のアルブミン融合タンパク質およびポリヌクレオチドは、あらゆる動物、好ましくは哺乳動物および鳥へ投与しうる。好ましい哺乳動物には、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ウマおよびブタがあるが、ヒトが特に好ましい。
一般論として、本発明のアルブミン融合タンパク質は、非融合治療用タンパク質よりも（非融合治療用タンパク質のモルベースで）少ない用量で、または少ない頻度で投与される。治療有効量とは、患者で症状の改善、病状の安定化または生存期間の延長、または生活の質の改善をもたらすために十分な化合物の量に関する。
本発明のアルブミン融合タンパク質は、それらが「古典薬」の連続注入をシミュレートしうる、即ち同一の阻害活性に少ないタンパク質相当量で済むという点で、有利である。半減期の長期化のおかげで、ＣＴ−Ｅｎｄｏは例えば３日毎にｓ．ｃ．で、ＮＴ−Ｅｎｄｏは例えば２日毎に投与される。
本発明のアルブミン融合タンパク質は次の追加利点を有する：(ｉ)個別腫瘍の具体的な成長特徴（例えば、早いおよび遅い成長）に合わせた、腫瘍の血管形成表現型に基づく用量最適化デザイン；(ii)副作用の減少もしくは軽減または効力の改変をもたらす、長期適用時における薬物の望ましくない蓄積の制御／回避。更に、ペプチドが性質上疎水性であるとき、アルブミンへのそれらの融合はそれらの溶解性を改善するため、バイオアベイラビリティの向上ももたらし、高濃度処方を可能にするはずである。
アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、経口、経直腸、非経口、槽内、膣内、腹腔内、局所（粉末、軟膏、ゲル、滴剤または経皮パッチとして）、経口腔または経口もしくは経鼻スプレーとして投与しうる。「製薬上許容される担体」とは、無毒性固形、半固形または液体フィラー、希釈物、封入物質または処方補助物のあらゆるものに関する。ここで用いられている「非経口」という用語は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節腔内注射および注入を含めた投与様式に関する。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、例えば、参考のためここに組み込まれる米国仮出願第６０／３５５，５４７およびＷＯ０１／７９４８０（ｐ．１２９−１３０）で記載されたような持続的放出系でも、適切に投与される。
非経口投与の場合、一つの態様において、アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、製薬上許容される担体、即ち用いられる用量および濃度でレシピエントに無毒性であって処方物の他成分と適合しうるものと、単位注射剤形（溶液、懸濁液または乳濁液）で、望ましい純度でそれを混合することにより、通常処方される。例えば、処方物は、治療剤に有害であることが知られた酸化剤および他の化合物を必要に応じて含有しない。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、単独で、または他の治療剤と組み合わせて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与しうるアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチド剤には、化学療法剤、抗生物質、ステロイドおよび非ステロイド抗炎症剤、慣用的免疫療法剤、および／または、例えば、参考のためここに組み込まれる米国仮出願第６０／３５５，５４７およびＷＯ０１／７９４８０（ｐ．１３２−１５１）で記載されたような治療剤があるが、それらに限定されない。組合せ剤は、協同して、例えば混合物として、別々に但し同時または併合して；または連続的に投与される。これには、組合せ剤が治療用混合物として一緒に投与される方式、更には、組合せ剤が別々に但し同時に、例えば同一個体へ別々な静脈系を介して投与される処置も含む。「組合せ」投与には、初回、次いで２回目に行われる化合物または剤の１種の別々な投与を更に含む。
本発明で使用に適した医薬組成物には、活性成分がその所定目的を果たせる有効量で含有された組成物を含む。
本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質を含んでなる医薬組成物の１種以上の諸成分で１以上の容器を満たした、製薬パックまたはキットも提供する。必要に応じて、医薬または生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する政府機関により規定された告知書がこのような容器に付されており、その告知書はヒト投与用の製造、使用または販売について機関による承認を表示している。
本発明について一般的に記載してきたが、説明のためであって制限するためではない下記例を参考にすると、本発明はより簡単に理解されるであろう。
更に記載せずとも、当業者であれば、これまでの記載および以下の実施例を用いて、本発明で認められた改変を行いおよび利用して、請求項記載の方法を実施しうる、と考えられる。したがって、下記研究例は本発明のある態様を特に示しており、開示の残りを制限するとは決して解釈すべきでない。
例１
ヒトエンドスタチンｃＤＮＡのクローニング
ヒト胎児腎臓５′-STRETCH Plus ｃＤＮＡライブラリー(Clonetech)からのＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出で抽出し、エタノール沈降させ、次いでＲＮアーゼＡで切断して、ＤＮＡサンプルに存在するあらゆるＲＮＡを除去した。ＤＮＡを１００ｎｇから１０ｐｇまで（１０倍ずつ）連続希釈した。ＢａｍＨＩ部位をエンドスタチンの５′末端へ、およびＨｉｎｄIII部位をエンドスタチンの３′末端へクローニングしうるように、ＰＣＲプライマーＪＨ００５およびＪＨ０１８をデザインした。各プライマーのＤＮＡ配列は次のとおりであった：
Figure 2005530484
マスターミックスを次のように調製した：２ｍＭ ＭｇＣｌ２ ＰＣＲ緩衝液、１０μＭ ＰＣＲ ｄＮＴＰ、０．２μＭ ＪＨ００５、０．２μＭ ＪＨ０１８、２Ｕ FastStart Ｔａｑ．ＤＮＡポリメラーゼ。鋳型ＤＮＡ（１０ｐｇ、１００ｐｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ）１μＬを反応ミックス４９μＬへ加えた。全反応容量は５０μＬであった。Perkin-Elmer Thermal Cycler 9600を次のようにプログラムした：（ホールド）９５℃で４分間の変性、次いで（サイクル）９５℃で３０秒間の変性、４５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で６０秒間の４０サイクル、次いで（ホールド）７２℃で６００秒間、次いで（ホールド）４℃での伸長。ＰＣＲ増幅の産物をゲル電気泳動により分析したところ、予想サイズ（０．５７ｋｂ）の単一ＤＮＡバンドが観察された。Gene Clean III Kit（BIO101 Inc.）を用いて、修飾エンドスタチンｃＤＮＡ断片を１％(w/v)アガロースＴＡＥゲルから単離した。
エンドスタチンｃＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIIIで完全に切断し、ＷＯ９９／００５０４で記載されたＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIII切断ｐＢＳＴ＋へ連結して、プラスミドｐＤＢ２４４６を作製した。
例２
Ｃ末端およびＮ末端アルブミン−エンドスタチン発現プラスミドの構築
Ｃ末端アルブミン−エンドスタチン発現プラスミドの構築
アルブミンのＣ末端アミノ酸がヒトエンドスタチンの最初のＮ末端アミノ酸で後続されたＣ末端ｒＨＡ−エンドスタチン融合体を構築した。
アルブミンおよびエンドスタチンコード領域間の結合部位を作り出せるように、２本鎖オリゴヌクレオチドリンカーをデザインした。アルブミンｃＤＮＡ内のＢｓｕ３６Ｉ部位からエンドスタチンｃＤＮＡの５′領域内のＳｅｘＡＩ部位まで及ぶように、オリゴヌクレオチドペアＪＨ０１２／ＪＨ０１３をデザインした。ＡｃｃＩ部位をリンカーの３′末端中へ工学的に導入して、特許出願ＷＯ００／４４７７２で以前に記載されたｐＤＢ２２４３中へリンカーをクローニングさせた。酵母ＰＲＢ１プロモーターおよび酵母ＡＤＨ１ターミネーターを含有したプラスミドｐＤＢ２２４３が、適切な転写プロモーターおよび転写ターミネーター配列を供与した。
Figure 2005530484
オリゴヌクレオチドリンカーＪＨ０１２／ＪＨ０１３をｐＤＢ２２４３からの６．１３ｋｂ Ｂｓｕ３６Ｉ−ＡｃｃＩ断片へ連結して、プラスミドｐＤＢ２４４２を作製した。
特許出願ＷＯ００／４４７７２で以前に記載されたｐＤＢ２２４３のＸｈｏＩ部位中へＨｉｎｄIIIクローニング部位を挿入しうるように、合成自己相補性オリゴヌクレオチドＪＨ０１１をデザインした。
Figure 2005530484
プラスミドｐＤＢ２４４３を酵母ＡＤＨ１転写ターミネーターのすぐ下流にある唯一ＸｈｏＩで直線化させた。オリゴヌクレオチドＪＨ０１１をそれ自体にアニーリングさせて、２本鎖リンカーを作製した。リンカーをＸｈｏＩ直線化ｐＤＢ２２４３へ連結させて、プラスミドｐＤＢ２４４１を作製したが、これはＡＤＨ１ターミネーターのどちらの側にもＨｉｎｄIII部位を有していた。プラスミドｐＤＢ２４４１をＨｉｎｄIIIで完全に切断し、０．３７ｋｂ ＡＤＨ１ターミネーター断片を精製し、仔ウシ腸ホスファターゼで処理されたＨｉｎｄIII切断ｐＤＢ２４４６へ連結させ、プラスミドｐＤＢ２４５０を作製した。
アルブミン−エンドスタチン融合体の構築に際する次の工程は、ＳｅｘＡＩ制限エンドヌクレアーゼの使用に依存していた。ＳｅｘＡＩはＤｃｍ感受性制限酵素である。ｄｃｍ−、ｄａｍ−E.coli株ＧＭ２１６３（New England Biolabs、遺伝子型：Ｆ−、ａｒａ−１４、ｌｅｕＢ６、ｆｈｕＡ３Ｉ、ｌａｃＹ１、ｔｓｘ７８、ｇｌｎＶ４４、ｇａｌＫ２、ｇａｌＴ２２、ｍｃｒＡ、ｄｃｍ−６、ｈｉｓＧ４、ｒｆｂＤ１、ｒｐｓＬ１３６、ｄａｍ１３：：Ｔｎ９、ｘｙｌＡ５、ｍｔｌ−１、ｒｈｉ−１、ｍｃｒＢ１、ｈｓｄＲ２）をプラスミドｐＤＢ２４５０およびｐＤＢ２４４２で独立して形質転換させた。ｄｃｍ−、ｄａｍ−ｐＤＢ２４５０およびｐＤＢ２４４２プラスミドＤＮＡを精製し、ＢａｍＨＩおよびＳｅｘＡＩで完全に切断した。ｐＤＢ２４５０からのＳｅｘＡＩ／ＢａｍＨＩ断片（０．８７ｋｂ）をｐＤＢ２４４２からのＳｅｘＡＩ／ＢａｍＨＩ（５．８ｋｂ）断片へ連結させて、プラスミドｐＤＢ２４５６を作製した。
適切な酵母ベクター配列を、ＥＰ−Ａ−２８６４２４で一般的に開示され、Sleep,D.et al.(1991)Bio/Technology 9,183-187で記載された「崩壊」プラスミドｐＳＡＣ３５により得た。ＮｏｔＩ Ｃ末端アルブミン−エンドスタチン発現カセットをｐＤＢ２４５６から単離し、精製し、仔ウシ腸ホスファターゼで処理されたＮｏｔＩ切断ｐＳＡＣ３５へ連結して、ＬＥＵ２選択マーカーと同じ発現方向でＮｏｔＩ発現カセットを含有したプラスミドｐＤＢ２４５２を作製した。
Ｎ末端エンドスタチン−アルブミン融合体発現プラスミドの構築
組換えアルブミン発現ベクターｐＡＹＥ６４５およびｐＡＹＥ６４６はＵＫ特許出願０２１７０３３．０で以前に記載されていた。ＨＳＡ／ＭＦα−１融合リーダー配列と、適切な転写プロモーターおよび転写ターミネーター配列を供与する酵母ＰＲＢ１プロモーターおよび酵母ＡＤＨ１ターミネーターとを含有したプラスミドｐＡＹＥ６４５は、ＵＫ特許出願０２１７０３３．０で記載されている。プラスミドｐＡＹＥ６４５を制限酵素ＡｆｌIIで完全に切断し、制限酵素ＨｉｎｄIIIで部分的に切断し、酵母ＰＲＢ１プロモーターの３′末端およびアルブミンコード配列を含んでなるＤＮＡ断片を単離した。特許出願ＷＯ００／４４７７２で記載されたプラスミドｐＤＢ２２４１をＡｆｌII／ＨｉｎｄIIIで切断し、酵母ＰＲＢ１プロモーターの５′末端および酵母ＡＤＨ１ターミネーターを含んでなるＤＮＡ断片を単離した。次いでｐＡＹＥ６４５からのＡｆｌII／ＨｉｎｄIII ＤＮＡ断片をＡｆｌII／ＨｉｎｄIII ｐＤＢ２２４１ベクターＤＮＡ断片中へクローニングして、プラスミドｐＤＢ２３０２を作製した。プラスミドｐＤＢ２３０２をＰａｃＩ／ＸｈｏＩで完全に切断して、６．１９ｋｂ断片を単離し、窪み末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰで平滑末端化し、再連結して、プラスミドｐＤＢ２４６５を作製した。プラスミドｐＤＢ２４６５をＣｌａＩで直線化し、窪み末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰで平滑末端化し、再連結して、プラスミドｐＤＢ２５３３を作製した。プラスミドｐＤＢ２５３３をＢｌｎＩで直線化し、窪み末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰで平滑末端化し、再連結して、プラスミドｐＤＢ２５３４を作製した。プラスミドｐＤＢ２５３４をＢｍｇＢＩ／ＢｇｌIIで完全に切断し、６．９６ｋｂ ＤＮＡ断片を単離し、２種の２本鎖オリゴヌクレオチドリンカーのうち一方、即ちＶＣ０５３／ＶＣ０５４およびＶＣ０５７／ＶＣ０５８へ連結してプラスミドｐＤＢ２５４０を作製し、ＶＣ０５５／ＶＣ０５６およびＶＣ０５７／ＶＣ０５８へ連結してプラスミドｐＤＢ２５４１を作製した。
Figure 2005530484
Figure 2005530484
ＢｇｌIIおよびＡｇｅＩで直線化されたｐＤＢ２５４０中へＮ末端アルブミン融合体としてエンドスタチンｃＤＮＡをクローニングしうるように、ＰＣＲプライマーＪＨ０２９およびＪＨ０３０をデザインした。
Figure 2005530484
Figure 2005530484
マスターミックスを次のように調製した：２ｍＭ ＭｇＣｌ２ ＰＣＲ緩衝液、１０μＭ ＰＣＲ ｄＮＴＰ、０．２μＭ ＪＨ０２９、０．２μＭ ＪＨ０３０、２Ｕ FastStart Ｔａｑ．ＤＮＡポリメラーゼ。ｐＤＢ２４４６（１０ｐｇ、１００ｐｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ）１μＬを反応ミックス４９μＬへ加えた。全反応容量は５０μＬであった。Perkin-Elmer Thermal Cycler 9600を次のようにプログラムした：（ホールド）９５℃で４分間の変性、次いで（サイクル）９５℃で３０秒間の変性、４５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で６０秒間の２０サイクル、次いで（ホールド）７２℃で６００秒間、次いで（ホールド）４℃での伸長。ＰＣＲ増幅の産物をゲル電気泳動により分析したところ、予想サイズ（０．５９ｋｂ）のバンドが観察された。Gene Clean III Kit（BIO101 Inc.）を用いて、０．５９ｋｂ ＤＮＡ断片を１％(w/v)アガロースＴＡＥゲルから単離した。
ＰＣＲ ＤＮＡ断片を制限エンドヌクレアーゼＢｇｌII／ＡｇｅＩで完全に切断し、０．５９ｋｂ断片を６．１５ｋｂ ｐＤＢ２５４０ ＢｇｌII／ＡｇｅＩベクターＤＮＡ断片へ連結して、プラスミドｐＤＢ２５５６を作製した。
適切な酵母ベクター配列を、ＥＰ−Ａ−２８６４２４で一般的に開示され、Sleep,D.et al.(1991)Bio/Technology 9,183-187で記載された「崩壊」プラスミドｐＳＡＣ３５により得た。３．５４ｋｂ ＮｏｔＩ Ｎ末端エンドスタチン−アルブミン発現カセットをｐＤＢ２５５６から単離し、精製し、仔ウシ腸ホスファターゼで処理されたＮｏｔＩ切断ｐＳＡＣ３５へ連結して、ＬＥＵ２選択マーカーと反対方向でＮｏｔＩ発現カセットを含有するプラスミドｐＤＢ２５５７を作製した。
例３
ヒトアンギオスタチンｃＤＮＡのクローニング
肝臓がプラスミノーゲンの主生産源であるため、ヒト肝臓５′-STRETCH Plus ｃＤＮＡライブラリー(Clonetech)をヒトアンギオスタチンｃＤＮＡ源として選択した。ＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出で抽出し、エタノール沈降させ、次いでＲＮアーゼＡで切断して、ＤＮＡサンプルに存在するあらゆるＲＮＡを除去した。ＤＮＡを１００ｎｇから１０ｐｇまで（１０倍ずつ）連続希釈した。ＢａｍＨＩ部位をアンギオスタチンの５′末端（ＪＨ００４）へ、およびＨｉｎｄIII部位をアンギオスタチンの３′末端（ＪＨ００３）へ導入しうるように、２種の変異誘発ＰＣＲプライマーＪＨ００３およびＪＨ００４をデザインした。
Figure 2005530484
プライマーＪＨ００３およびＪＨ００４を用いてＰＣＲによりアンギオスタチンｃＤＮＡを増幅させた。マスターミックスを次のように調製した：２ｍＭ ＭｇＣｌ２ ＰＣＲ緩衝液、１０μＭ ＰＣＲ ｄＮＴＰ、０．２μＭ ＪＨ００３、０．２μＭ ＪＨ００４、２Ｕ FastStart Ｔａｑ．ＤＮＡポリメラーゼ(Roche)。ＤＮＡ（１０ｐｇ、１００ｐｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ）１μＬを反応ミックス４９μＬへ加えた。全反応容量は５０μＬであった。Perkin-Elmer Thermal Cycler 9600を次のようにプログラムした：（ホールド）９５℃で４分間の変性、次いで（サイクル）９５℃で３０秒間の変性、４５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で６０秒間の４０サイクル、次いで（ホールド）７２℃で６００秒間、次いで（ホールド）４℃での伸長。ＰＣＲ増幅の産物をゲル電気泳動により分析したところ、予想サイズ（０．７９ｋｂ）の単一ＤＮＡバンドが観察された。Gene Clean III Kit（BIO101 Inc.）を用いて、修飾アンギオスタチンｃＤＮＡ断片を１％(w/v)アガロースＴＡＥゲルから単離した。アンギオスタチン断片をＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄIIIで完全に切断し（０．７９０ｋｂ）、ＷＯ９９／００５０４で記載されたＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄIII切断ｐＢＳＴ＋へ連結して、プラスミドｐＤＢ２４４７を作製した。ヒトアンギオスタチンｃＤＮＡのＤＮＡ配列を得て、National Centre For Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）からの公に入手可能なｃＤＮＡ配列と並べてみた。この分析では、そのＤＮＡ配列がヒトプラスミノーゲンと１００％相同性を有することを示した（ＲＩＤ：９９８４８８０８３−２３３００−１２２４７）。
例４
Ｃ末端およびＮ末端アルブミン−アンギオスタチン発現プラスミドの構築
Ｃ末端アルブミン−アンギオスタチン発現プラスミドの構築
ｒＨＡおよびアンギオスタチンｃＤＮＡ間の結合部位を作り出せるように、オリゴヌクレオチドペアをデザインした。ｒＨＡ内のＢｓｕ３６Ｉ部位をアンギオスタチンの５′領域内のＢｍｒＩ部位へ連結しうるように、オリゴヌクレオチドペアＪＨ０２１およびＪＨ０２２をデザインした。
Figure 2005530484
プラスミドｐＤＢ２４４７をＢｍｒＩで部分的に切断し、次いでＢａｍＨＩで完全に切断して、３．９５ｋｂベクターを作製した。２本鎖オリゴヌクレオチドリンカーＪＨ０２１／２２をＢａｍＨＩ ＢｍｒＩ切断ｐＤＢ２４４７と連結させて、プラスミドｐＤＢ２４５８を作製した。プラスミドｐＤＢ２４５８をＨｉｎｄIIIで直線化し、仔ウシ腸ホスファターゼで処理して、３′リン酸を除去した。上記のプラスミドｐＤＢ２４４１をＨｉｎｄIIIで完全に切断し、Gene Clean III Kit（BIO101 Inc.）を用いて、０．３７ｋｂ ｍＡＤＨ１ターミネーター断片を１％(w/v)アガロースＴＡＥゲルから単離した。０．３７ｋｂ ＨｉｎｄIII ｍＡＤＨ１ターミネーター断片をＨｉｎｄIII直線化ｐＤＢ２４５８と連結させて、プラスミドｐＤＢ２４５９を作製した。
ヒトアンギオスタチンｃＤＮＡのＤＮＡ配列は、１つの可能なＮ連結グリコシル化部位についてコードしている。Ｎ連結グリコシル化用の部位をＰＣＲ変異誘発により消失させた。アスパラギン残基（コドンＡＡＣ）をグルタミン残基（コドンＣＡＡ）で置換する変化をヌクレオチド配列内へ導入しうるように、ＰＣＲプライマーＪＨ０２５およびＪＨ０２５をデザインした。
Figure 2005530484
マスターミックスを次のように調製した：２ｍＭ ＭｇＣｌ２ ＰＣＲ緩衝液、１０μＭ ＰＣＲ ｄＮＴＰ、０．２μＭ ＪＨ０２５、０．２μＭ ＪＨ０２６、２Ｕ FastStart Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ(Roche)。ｐＤＢ２４４７（１０ｐｇ、１００ｐｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ）１μＬを反応ミックス４９μＬへ加えた。全反応容量は５０μＬであった。Perkin-Elmer Thermal Cycler 9600を次のようにプログラムした：（ホールド）９５℃で４分間の変性、次いで（サイクル）９５℃で３０秒間の変性、４５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で６０秒間の２０サイクル、次いで（ホールド）７２℃で６００秒間、次いで（ホールド）４℃での伸長。ＰＣＲ増幅の産物をゲル電気泳動により分析したところ、予想サイズ（０．４６ｋｂ）の単一ＤＮＡバンドが観察された。Gene Clean III Kit（BIO101 Inc.）を用いて、修飾アンギオスタチンｃＤＮＡ断片を１％(w/v)アガロースＴＡＥゲルから単離した。非グリコシル化アンギオスタチンｃＤＮＡ断片をＮｓｉＩ、ＮｃｏＩで完全に切断し、単離された０．４４ｋｂを３．９３ｋｂ ＮｓｉＩ、ＮｃｏＩ ｐＤＢ２４５９と連結して、プラスミドｐＤＢ２４８０を作製した。
酵母ＰＲＢ１プロモーターおよび酵母ＡＤＨ１ターミネーターを含有する、特許出願ＷＯ００／４４７７２で以前に記載されたプラスミドｐＤＢ２２４３が、適切な転写プロモーターおよび転写ターミネーター配列を供与した。プラスミドｐＤＢ２２４４をＢａｍＨＩ、Ｂｓｕ３６Ｉで完全に切断し、５．８４ｋｂ断片を単離し、ｐＤＢ２４８０からのＢａｍＨＩ、Ｂｓｕ３６Ｉアンギオスタチン−ｍＡＤＨ１ term断片と連結させて、ｐＤＢ２５０１を作製した。プラスミドｐＤＢ２５０１を制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩで切断して、非グリコシル化アルブミン−アンギオスタチン発現カセットを作製した。
適切な酵母ベクター配列を、ＥＰ−Ａ−２８６４２４で一般的に開示され、Sleep,D.et al.(1991)Bio/Technology 9,183-187で記載された「崩壊」プラスミドｐＳＡＣ３５により得た。ＮｏｔＩ Ｃ末端非グリコシル化アルブミン−アンギオスタチン発現カセットをｐＤＢ２５０１から単離し、精製し、仔ウシ腸ホスファターゼで処理されたＮｏｔＩ切断ｐＳＡＣ３５へ連結して、ＬＥＵ２選択マーカーと同じ発現方向でＮｏｔＩ発現カセットを含有するプラスミドｐＤＢ２５０８、およびＬＥＵ２選択マーカーと反対の発現方向でＮｏｔＩ発現カセットを含有するプラスミドｐＤＢ２５０９を作製した。
Ｎ末端アンギオスタチン−アルブミン発現プラスミドの構築
非グリコシル化アンギオスタチンｃＤＮＡを２種のプライマーＣＦ９６およびＣＦ９７で変異誘発ＰＣＴにより修飾した。
Figure 2005530484
マスターミックスを次のように調製した：２ｍＭ ＭｇＣｌ２ ＰＣＲ緩衝液、１０μＭ ＰＣＲ ｄＮＴＰ、０．２μＭ ＣＦ９６、０．２μＭ ＣＦ９７、２Ｕ FastStart Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ(Roche)。ｐＤＢ２５０１（１０ｐｇ、１００ｐｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ）１μＬを反応ミックス４９μＬへ加えた。全反応容量は５０μＬであった。Perkin-Elmer Thermal Cycler 9600を次のようにプログラムした：（ホールド）９５℃で４分間の変性、次いで（サイクル）９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で６０秒間の２０サイクル、次いで（ホールド）７２℃で６００秒間、次いで（ホールド）４℃での伸長。ＰＣＲ増幅の産物をゲル電気泳動により分析したところ、予想サイズ（０．８３ｋｂ）の単一ＤＮＡバンドが観察された。Gene Clean III Kit（BIO101 Inc.）を用いて、修飾アンギオスタチンｃＤＮＡ断片を１％(w/v)アガロースＴＡＥゲルから単離した。非グリコシル化アンギオスタチンｃＤＮＡ断片をＢｇｌＩ、ＣｌａＩで完全に切断し、単離された０．８３ｋｂを６．１５ｋｂ ＢｇｌＩ、ＣｌａＩ ｐＤＢ２５４１と連結して、プラスミドｐＤＢ２７６３を作製した。
適切な酵母ベクター配列を、ＥＰ−Ａ−２８６４２４で一般的に開示され、Sleep,D.et al.(1991)Bio/Technology 9,183-187で記載された「崩壊」プラスミドｐＳＡＣ３５により得た。ＮｏｔＩ Ｎ末端非グリコシル化アンギオスタチン−アルブミン発現カセットをｐＤＢ２７６３から単離し、精製し、仔ウシ腸ホスファターゼで処理されたＮｏｔＩ切断ｐＳＡＣ３５へ連結して、ＬＥＵ２選択マーカーと同じ発現方向でＮｏｔＩ発現カセットを含有するプラスミドｐＤＢ２７６５、およびＬＥＵ２選択マーカーと反対の発現方向でＮｏｔＩ発現カセットを含有するプラスミドｐＤＢ２７６４を作製した。
例５
Ｎ末端およびＣ末端アルブミン−クリングル５融合体の構築
Ｃ末端アルブミン−（ＧＧＳ） ４ ＧＧ−クリングル５発現プラスミドの構築
Ｃ末端アルブミン融合体用のプラスミノーゲンクリングル５のクローニングを、標準条件下でフォワードプライマー５′−ＴＧＴＡＴＧＴＴＴＧＧＧＡＡＴＧＧＧＡＡＡＧ−３′およびリバースプライマー５′−ＡＣＡＣＴＧＡＧＧＧＡＣＡＴＣＡＣＡＧＴＡＧ−３′を用いて、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリー（Ambion）のＰＣＲ増幅で始めた。次いで、フォワードプライマー５′−ＧＴＧＧＧＡＴＣＣＧＧＴＧＧＴＴＧＴＡＴＧＴＴＴＧＧＧＡＡＴＧＧＧＡＡＡＧ−３′およびリバースプライマー５′−ＣＡＣＡＡＧＣＴＴＡＴＴＡＡＣＡＣＴＧＡＧＧＧＡＣＡＴＣＡＣＡＧＴＡＧ−３′を用いたネステッドＰＣＲでＤＮＡ断片を作製してから、それを製造業者の説明に従いｐＣＲ４−ＴＡ−ＴＯＰＯ（Invitrogen）中へクローニングした。得られたプラスミドをｐＣＲ４−クリングル５−Ｃと名づけた。Ｃ末端クリングル５ＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIIによる切断でｐＣＲ４−クリングル５−Ｃから単離した。プラスミドｐＤＢ２５７５をＨｉｎｄIIで部分的に切断し、次いでＢａｍＨＩで完全に切断した。望ましい６．５５ｋｂ ＤＮＡ断片を単離し、プラスミドｐＣＲ４−クリングル５−Ｃから０．２６ｋｂ ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIII断片と連結させて、プラスミドｐＤＢ２７１７を作製した。
適切な酵母ベクター配列を、ＥＰ−Ａ−２８６４２４で一般的に開示され、Sleep,D.et al.(1991)Bio/Technology 9,183-187で記載された「崩壊」プラスミドｐＳＡＣ３５により得た。プラスミドｐＤＢ２７１７をＮｏｔＩで完全に切断し、３．２７ｋｂ Ｃ末端アルブミン−（ＧＧＳ）４ＧＧ−クリングル５発現カセットを単離し、次いでＮｏｔＩ仔ウシ腸ホスファターゼ処理ｐＳＡＣ３５へ連結させて、ＬＥＵ２選択マーカーと同じ発現方向でＮｏｔＩ発現カセットを含有するプラスミドｐＤＢ２７４８、およびＬＥＵ２選択マーカーと反対の発現方向でＮｏｔＩ発現カセットを含有するプラスミドｐＤＢ２７４９を作製した。
Ｎ末端クリングル５−（ＧＧＳ） ４ ＧＧ−アルブミン発現プラスミドの構築
Ｎ末端アルブミン融合体用のプラスミノーゲンクリングル５のクローニングを、標準条件下でフォワードプライマー５′−ＧＴＧＡＧＡＴＣＴＴＧＴＡＴＧＴＴＴＧＧＧＡＡＴＧＧＧＡＡＡＧ−３′およびリバースプライマー５′−ＣＡＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＣＡＣＴＧＡＧＧＧＡＣＡＴＣＡＣＡＧＴＡＧ−３′を用いて、クローンｐＣＲ４−クリングル５−Ｃに含まれるクリングル５配列のＰＣＲ増幅により行った。増幅ＤＮＡ断片を制限エンドヌクレアーゼＢｇｌIIおよびＢａｍＨＩで切断し、ｐＬＩＴＭＵＳ２９（New England Biolabs）中へクローニングした。得られたプラスミドをｐＣＲ４−クリングル５−Ｎと名づけた。プラスミドｐＣＲ４−クリングル５−ＮをＢａｍＨＩおよびＢｇｌIIで完全に切断した。０．２６ｋｂ ＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ、ＢｇｌII切断ｐＤＢ２５７３へ連結させて、プラスミドｐＤＢ２７７１を作製した。適切な酵母ベクター配列を、ＥＰ−Ａ−２８６４２４で一般的に開示され、Sleep,D.et al.(1991)Bio/Technology 9,183-187で記載された「崩壊」プラスミドｐＳＡＣ３５により得た。プラスミドｐＤＢ２７７１をＮｏｔＩで完全に切断し、３．２７ｋｂ Ｎ末端クリングル５−（ＧＧＳ）４ＧＧ−アルブミン発現カセットを単離し、次いでＮｏｔＩ仔ウシ腸ホスファターゼ処理ｐＳＡＣ３５へ連結させて、ＬＥＵ２選択マーカーと同じ発現方向でＮｏｔＩ発現カセットを含有するプラスミドｐＤＢ２７７３、およびＬＥＵ２選択マーカーと反対の発現方向でＮｏｔＩ発現カセットを含有するｐＤＢ２７７４を作製した。
例６
酵母形質転換および培養条件
ＷＯ９５／２３８５７、ＷＯ９５／３３８３３およびＷＯ９４／０４６８７で開示された酵母株を、Sleep,D.et al.(2001)Yeast 18,403-421で記載されているように、ロイシン原栄養体性に形質転換させた。形質転換株を緩衝化最少培地（ＢＭＭ、Kerry-Williams,S.M.et al.(1998)Yeast 14,161-169で記載）上に点在させ、更なる分析用に十分増殖するまで３０℃でインキュベートした。
例７
アルブミンエンドスタチン融合タンパク質の発現
ｒＨＡ融合体をシェークフラスコで発現させ、培養発現レベルを測定した。ｒＨＡ−エンドスタチンは、培養上澄中で発現レベルが高かった。エンドスタチン−ｒＨＡは、発現が培養上澄中でほどほどに高かった。
例８
アルブミンエンドスタチン融合体の精製
Ｃ末端エンドスタチン精製：
Ｃ末端エンドスタチンをＷＯ００／４４７７２で記載されているような標準ｒＨＡ ＳＰ−ＦＦ（Pharmacia）条件を用いて精製したが、但しそれは溶離用緩衝液中で過剰２５０ｍＭ ＮａＣｌを要した。次いで、溶離液をＷＯ００／４４７７２で記載されているような標準ｒＨＡ ＤＥ−ＦＦ（Pharmacia）条件を用いて精製したが、但し過剰２００ｍＭ ＮａＣｌが溶離用緩衝液中に含有されていた（この塩濃度は最適ではなかったため、変えてもよい）。次いで、精製物質を濃縮し、ＰＢＳに対してダイアフィルトレーションした。
Ｎ末端エンドスタチン精製：
Ｎ末端エンドスタチンを標準ｒＨＡ ＳＰ−ＦＦ条件を用いて精製したが、但しそれは溶離用緩衝液中で過剰２５０ｍＭ ＮａＣｌを要した。次いで、溶離液をｐＨ８および２．５ｍＳ・ｃｍ−１に調整し、１５ｍＭ四ホウ酸カリウム中で平衡化された標準ｒＨＡ ＤＥ−ＦＦを用いて精製した。標準ｒＨＡ溶離用緩衝液を用いてＤＥ−ＦＦを溶離させた。次いで、精製物質を濃縮し、ＰＢＳに対してダイアフィルトレーションした。
発酵力価はＣおよびＮ末端融合体で各々２．２および０．９ｍｇ・ｍｌ−１であり、全体精製回収率は高かった。必要な純度に応じて精製回収率を更に改善し、特にＮ末端融合体の発酵力価を高めることは、双方とも可能かもしれない。
例９
アルブミンエンドスタチン融合体の特徴
４〜１２％勾配ＳＤＳ非還元ゲルにサンプルをのせて、抗エンドスタチンまたは抗ＨＳＡ抗体でウェスタンブロットを行うことにより、精製後のタンパク質を特徴付けた。結果は図１３で示されている。ゲルへ次のようにのせた：
レーン サンプル 投入
１ − −
２ マジックマーカー −
３ − −
４ Ｃ末端エンドスタチン １μｇ
５ Ｎ末端エンドスタチン １μｇ
６ ＨＳＡ １μｇ
７ エンドスタチン標準 １μｇ
タンパク質は次表で特徴付けられている：
Figure 2005530484
例１０
アルブミンエンドスタチン融合タンパク質の薬物動態
エンドスタチン抗原レベルをエンドスタチン、エンドスタチンとのＣ末端アルブミン融合体（ＣＴ−エンドスタチン）またはエンドスタチンとのＮ末端アルブミン融合体（ＮＴ−エンドスタチン）のｉ．ｖ．またはｓ．ｃ．注射後にマウス血清で測定した。
マウスに試験物質を１回注射した。各サンプル時点で各群５匹のマウスから採血し、血清をＥＬＩＳＡ分析用に集めた。
ＰＫデータ：
「古典的」エンドスタチンと比較したｓ．ｃ．およびｉ．ｖ．適用後におけるＣＴ−およびＮＴ−エンドスタチンのデータは、類似した結果を示す：
エンドスタチン（古典的）： ４．５ｈｒ
ＣＴ−エンドスタチン： ５６ｈｒ
ＮＴ−エンドスタチン： ２９ｈｒ
表４はｓ．ｃ．投与後の薬物動態結果を示している。ｓ．ｃ．適用後の平均エンドスタチン濃度＋／−Ｓ．Ｄ．が図１４で示されている。
Figure 2005530484
表５はｉ．ｖ．投与後の薬物動態結果を示している。図１５はｉ．ｖ．投与後の平均エンドスタチン濃度＋／−Ｓ．Ｄ．を示している。
Figure 2005530484
得られたデータは、２１日効力試験で必要とされるような反復投薬をシミュレートするために用いた。蓄積研究では、１５０〜４００ｎｇ／ｍｌの好ましい治療枠内に留まる、４つの投薬スケジュールを示唆した。この問題を解明するために、ＡＦＰ−エンドスタチンの反復投薬を試験するＰＫ研究を行った。４つの投薬スケジュールを下記表６で示されたように試験した。
Figure 2005530484
マルチｓ．ｃ．投与後の薬物動態結果が、表７および図１６〜１９で示されている。
Figure 2005530484
例１１
アルブミンエンドスタチン融合タンパク質のインビトロ効力
ＣＴ−エンドスタチンおよびＮＴ−エンドスタチンは、インビトロ移動アッセイ（ＨＵＶＥＣ）で古典的エンドスタチンと比較すると、類似した効力を示す。これらの結果は図２０で示されている。
例１２
アルブミンエンドスタチン融合タンパク質のインビボ効力
ＣＴ−エンドスタチンおよびＮＴ−エンドスタチンは、マウスの膵臓腫瘍モデルにおいて、古典的エンドスタチンと比較すると、インビボで類似した効力を示す。
ＣＴ−エンドスタチンは、１回投薬スキームで良い効力を示す：
−７例中２例で用量応答および腫瘍縮小
−これまでで最良の古典データである２４時間毎の１００ｍｇ／ｋｇに代わる７２時間毎の３．６ｍｇ／ｋｇ（Kisker et al.,Cancer Res.61:7669-7674(2001)）
ＣＴ−エンドスタチンｓ．ｃ．によるＢｘＰｃ３（ヒト膵臓癌細胞系）の処置結果が図２１〜２４で示されている。
例１３
アルブミンアンギオスタチン融合タンパク質の発現
ｒＨＡ融合体をシェークフラスコ培養物中で発現させ、発現レベルを測定した。培養上澄中の発現レベルはｒＨＡ−アンギオスタチン、ｒＨＡ−３ｘＦＬＡＧ−アンギオスタチン、ｒＨＡ−アンギオスタチン（Ｎ２１１Ｑ）およびｒＨＡ−３ｘＦＬＡＧ−アンギオスタチン（Ｎ２１１Ｑ）で低かった；これら融合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルが図２７で示されている。各レーンへ次のようにのせた：
レーンサンプル
１．ｒＨＡ−３ｘＦＬＡＧ−アンギオスタチン（Ｎ２１１Ｑ）
２．ｒＨＡ−アンギオスタチン（Ｎ２１１Ｑ）
３．ｒＨＡ−アンギオスタチン
４．ｒＨＡ−アンギオスタチン
５．ｒＨＡ
例１４
アルブミンアンギオスタチン融合タンパク質の精製
Ｃ末端アンギオスタチン精製
Ｃ末端アンギオスタチンは高レベルの切込み物質を含有していた。標準ｒＨＡ ＳＰ−ＦＦ条件を用い、洗液として通常溶離液を用い、２００ｍＭ ＮａＣｌ含有標準緩衝液を用いて溶離させて、それを精製した。ＳＰ−ＦＦカラムの溶離液を図２５で示されたようにＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。抗アンギオスタチンまたは抗ＨＳＡ抗体を用いたＳＰ−ＦＦ溶離液のウェスタンブロットが図２６で示されている。次いで標準ｒＨＡ ＤＥ−ＦＦ条件を用いて溶離液を精製したが、但しそれは溶離用緩衝液中で過剰１０ｍＭ ＮａＣｌを要した。次いで精製物質を濃縮し、ＰＢＳに対してダイアフィルトレーションした。
この融合タンパク質で行われた精製は産生プロセス向けに良好な基礎を形成しているが、酵母抗原クリアランスを分析しかつ回収率を最良にする上で、更なる研究を要するであろう。産生された最終量は低かったが、これは低回収率のためというよりも、むしろ主に０．１ｍｇ．ｍｌ−１以下の発酵力価のせいであった。回収率は一般的に良かったが、必要な純度に応じたＤＥ−ＦＦにより改善できた。しかしながら、全体収率の向上が必要であれば、最大の増加は発現レベルの向上からもたらされるであろう。
参考文献
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ＵＳ５８５４２２１
ＵＳ５８８５７９５
ＷＯ９４／０４６８７
ＷＯ９５／２３８５７
ＷＯ９５／３３８３３
ＷＯ９７／１５６６６
ＷＯ００／４４７７２
本発明は本発明の個別態様の単一説明として記載された具体的態様により範囲が制限されることはなく、機能的に相当する方法および成分は本発明の範囲内である。実際に、本発明の様々な修正が、ここで示されおよび記載されたものに加えて、先の記載および添付図面から当業者に明らかとなるであろう。このような修正も添付された請求の範囲内に属するとみなされる。
上記すべての参考文献は、参考のためそれ全体で組み込まれる。
Ｎ末端エンドスタチン−アルブミン融合体読み取り枠のＤＮＡ配列（このＤＮＡ配列は一次翻訳産物をコードし、したがって最初の７２ヌクレオチドは、本例では酵母からの分泌に際して除去される２４アミノ酸リーダー配列をコードしている）。 Ｎ末端エンドスタチン−アルブミン融合タンパク質のアミノ酸配列（このアミノ酸は図１で示されたＤＮＡ配列の一次翻訳産物を表わし、したがって酵母で分泌に際して除去される２４アミノ酸リーダー配列を含んでいる。そのため、そのタンパク質配列は本腫瘍阻害例で用いられるタンパク質の配列を表わしていない）。 Ｃ末端アルブミン−エンドスタチン融合体読み取り枠のＤＮＡ配列（このＤＮＡ配列は一次翻訳産物をコードし、したがって最初の７２ヌクレオチドは、本例では酵母からの分泌に際して除去される２４アミノ酸リーダー配列をコードしている）。 Ｃ末端アルブミン−エンドスタチン融合タンパク質のアミノ酸配列（このアミノ酸は図３で示されたＤＮＡ配列の一次翻訳産物を表わし、したがって酵母で分泌に際して除去される２４アミノ酸リーダー配列を含んでいる。そのため、そのタンパク質配列は本腫瘍阻害例で用いられるタンパク質の配列を表わしていない）。 Ｎ末端アンギオスタチン（非グリコシル化）−アルブミン融合体読み取り枠のＤＮＡ配列。 Ｎ末端アンギオスタチン（非グリコシル化）−アルブミン融合タンパク質のアミノ酸配列。 Ｃ末端アルブミン−アンギオスタチン（非グリコシル化）融合体読み取り枠のＤＮＡ配列。 Ｃ末端アルブミン−アンギオスタチン（非グリコシル化）融合タンパク質のアミノ酸配列。 Ｎ末端クリングル５−（ＧＧＳ）４ＧＧ−アルブミン融合体読み取り枠のＤＮＡ配列。 Ｎ末端クリングル５−（ＧＧＳ）４ＧＧ−アルブミン融合タンパク質のアミノ酸配列。 Ｃ末端アルブミン−（ＧＧＳ）４ＧＧ−クリングル５融合体読み取り枠のＤＮＡ配列。 Ｃ末端アルブミン−（ＧＧＳ）４ＧＧ−クリングル５融合タンパク質のアミノ酸配列。 ４〜１２％勾配ＳＤＳゲルおよびウェスタンブロット：Ａ．コロイド性ブルーゲル．Ｂ．抗エンドスタチンウェスタンブロット：Ｃ．抗ＨＳＡウェスタンブロット。 ｓ．ｃ．適用後の平均エンドスタチン濃度＋／−ＳＤ。 ｉ．ｖ．適用後の平均エンドスタチン濃度＋／−ＳＤ。 ＰＫデータ．処置＝Ｃ末端エンドスタチン７２ｈ、経路＝ｓ．ｃ．、投入用量＝１．８、維持用量＝１．２。 ＰＫデータ．処置＝Ｃ末端エンドスタチン２４ｈ、経路＝ｓ．ｃ．、投入用量＝１．５、維持用量＝０．５。 ＰＫデータ．処置＝Ｎ末端エンドスタチン７２ｈ、経路＝ｓ．ｃ．、投入用量＝１、維持用量＝０．９。 ＰＫデータ．処置＝Ｎ末端エンドスタチン２４ｈ、経路＝ｓ．ｃ．、投入用量＝０．８、維持用量＝０．２５。 移動アッセイ（ＨＵＶＥＣ）におけるアルブミン融合エンドスタチンおよび古典的エンドスタチンの効力．その融合体に関するすべての濃度または用量はエンドスタチン相当量と関連している。。 アルブミン融合Ｃ末端エンドスタチンｓ．ｃ．でのＢｘ Ｐｃ−３の処置後における腫瘍容量 コントロール＝○----○；１．２ｍｇ／ｋｇ／７２ｈ＝□----□（白抜き四角）；０．５ｍｇ／ｋｇ／２４ｈ＝●----●．その融合体に関するすべての濃度または用量はエンドスタチン相当量と関連している。 アルブミン融合Ｃ末端エンドスタチンｓ．ｃ．でのＢｘ Ｐｃ−３の処置後における腫瘍容量 コントロール＝○----○；０．４ｍｇ／ｋｇ／７２ｈ＝◆----◆；１．２ｍｇ／ｋｇ／７２ｈ＝□----□（白抜き四角）；３．６ｍｇ／ｋｇ／７２ｈ＝（黒塗り四角）．その融合体に関するすべての濃度または用量はエンドスタチン相当量と関連している。 アルブミン融合Ｎ末端エンドスタチンｓ．ｃ．でのＢｘ Ｐｃ−３の処置後における腫瘍容量 コントロール＝（黒塗り四角）；０．８ｍｇ／ｋｇ／７２ｈ＝□----□（白抜き四角）；０．７５ｍｇ／ｋｇ／４８ｈ＝○----○；０．４ｍｇ／ｋｇ／２４ｈ＝●----●．その融合体に関するすべての濃度または用量はエンドスタチン相当量と関連している。 アルブミン融合Ｎ末端エンドスタチンｓ．ｃ．でのＢｘ Ｐｃ−３の処置後における腫瘍容量 コントロール＝○----○；０．２５ｍｇ／ｋｇ／４８ｈ＝▲----▲；０．７５ｍｇ／ｋｇ／４８ｈ＝（黒塗り四角）；２．２５ｍｇ／ｋｇ／４８ｈ＝△----△．その融合体に関するすべての濃度または用量はエンドスタチン相当量と関連している。 ＳＰ−ＦＦで精製されたＣ末端ｒＨＡアンギオスタチンのＳＤＳ ＰＡＧＥ。 Ｃ末端ｒＨＡアンギオスタチンのウェスタンブロット分析。 アルブミンまたはアンギオスタチン−アルブミン融合タンパク質を発現する酵母細胞上澄のＳＤＳ ＰＡＧＥ。 ヒトアルブミンの成熟型のアミノ酸配列（配列番号１８）およびそれをコードするポリヌクレオチド（配列番号１７）。

Claims (50)

  1. 血管形成阻害ペプチドまたはその断片もしくは変種と、アルブミンまたはその断片もしくは変種とを含んでなる、アルブミン融合タンパク質。
  2. 少なくとも１つのエンドスタチンまたはその断片もしくは変種を含んでなる、請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質。
  3. 少なくとも１つのアンギオスタチンまたはその断片もしくは変種を含んでなる、請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質。
  4. 少なくとも１つのクリングル５（Kringle 5）またはその断片もしくは変種を含んでなる、請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質。
  5. アルブミン融合タンパク質が少なくとも２つの血管形成阻害ペプチドまたはその断片もしくは変種を含んでなる、請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質。
  6. 少なくとも２つの血管形成阻害ペプチドまたはその断片もしくは変種が、異なるアミノ酸配列を有している、請求項５に記載のアルブミン融合タンパク質。
  7. 第一の血管形成阻害ペプチドまたはその断片もしくは変種と、第二の血管形成阻害ペプチドまたはその断片もしくは変種とを含んでなり、第一の血管形成阻害ペプチドまたはその断片もしくは変種が第二の血管形成阻害ペプチドまたはその断片もしくは変種と異なるものである、請求項５に記載のアルブミン融合タンパク質。
  8. アルブミンまたはその断片もしくは変種が、非融合状態にある血管形成阻害ペプチドまたはその断片もしくは変種のインビボ半減期と比較して、血管形成阻害ペプチドまたはその断片もしくは変種のインビボ半減期を長期化しうる能力を有している、請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質。
  9. １以上の追加の血管形成阻害ペプチドまたはその断片もしくは変種、または１以上の追加のアルブミンまたはその断片もしくは変種を更に含んでなる、請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質。
  10. 融合タンパク質が化学的部分を更に含んでなる、請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質。
  11. 血管形成阻害ペプチドまたはその断片もしくは変種が、アルブミンのＮ末端またはアルブミンの断片もしくは変種のＮ末端へ融合されている、請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質。
  12. 血管形成阻害ペプチドまたはその断片もしくは変種が、アルブミンのＣ末端またはアルブミンの断片もしくは変種のＣ末端へ融合されている、請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質。
  13. 血管形成阻害ペプチドまたはその断片もしくは変種が、アルブミンの内部領域またはアルブミンの断片もしくは変種の内部領域へ融合されている、請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質。
  14. 血管形成阻害ペプチドまたはその断片もしくは変種が、リンカーにより、アルブミンまたはアルブミンの断片もしくは変種から分離されている、請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質。
  15. アルブミン融合タンパク質が下記式を含んでなる、請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質：
    Ｒ２−Ｒ１；Ｒ１−Ｒ２；Ｒ２−Ｒ１−Ｒ２；Ｒ２−Ｌ−Ｒ１−Ｌ−Ｒ２；Ｒ１−Ｌ−Ｒ２；Ｒ２−Ｌ−Ｒ１；またはＲ１−Ｌ−Ｒ２−Ｌ−Ｒ１
    ［式中、Ｒ１は、断片または変種を含めた、少なくとも１つの治療用タンパク質、ペプチドまたはポリペプチド配列であり、必ずしも同一の治療用タンパク質ではなく、Ｌはリンカーであり、かつ、Ｒ２は、断片または変種を含めた、血清アルブミン配列である］。
  16. アルブミン融合タンパク質のインビボ半減期が、非融合状態にある血管形成阻害ペプチドのインビボ半減期よりも長い、請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質。
  17. アルブミンまたはその断片もしくは変種へ融合された血管形成阻害ペプチドまたはその断片もしくは変種のインビトロ生物活性が、非融合状態にある血管形成阻害ペプチドまたはその断片もしくは変種のインビトロ生物活性よりも大きい、請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質。
  18. アルブミンまたはその断片もしくは変種へ融合された血管形成阻害ペプチドまたはその断片もしくは変種のインビボ生物活性が、非融合状態にある血管形成阻害ペプチドまたはその断片もしくは変種のインビボ生物活性よりも大きい、請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質。
  19. 酵母で発現される、請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質。
  20. 酵母がグリコシル化欠陥である、請求項１９に記載のアルブミン融合タンパク質。
  21. 酵母がグリコシル化およびプロテアーゼ欠陥である、請求項１９に記載のアルブミン融合タンパク質。
  22. 哺乳動物細胞により発現される、請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質。
  23. 培養で哺乳動物細胞により発現される、請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質。
  24. 請求項１〜２３のいずれか一項に記載のアルブミン融合タンパク質と、担体とを含んでなる、組成物。
  25. 請求項１〜２３のいずれか一項に記載のアルブミン融合タンパク質の有効量と、製薬上許容される担体または賦形剤とを含んでなる、医薬組成物。
  26. 請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質の有効量を投与する工程を含んでなる、患者で血管形成関連疾患または障害を治療する方法。
  27. 請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質の有効量を投与する工程を含んでなる、血管形成阻害ペプチドにより治療可能な固形腫瘍または血液癌の患者を治療する方法。
  28. 非融合状態にある血管形成阻害ペプチドまたはその断片もしくは変種のインビボ半減期と比較して、血管形成阻害ペプチドまたはその断片もしくは変種のインビボ半減期を延長させるのに十分な、アルブミンまたはアルブミンの断片もしくは変種へ、血管形成阻害ペプチドまたはその断片もしくは変種を融合させる工程を含んでなる、血管形成阻害ペプチドまたはその断片もしくは変種のインビボ半減期を延長する方法。
  29. 哺乳動物において血管形成阻害ペプチドの半減期を延長させるための方法であって、
    血管形成阻害ペプチドをアルブミンへ連結させて、アルブミン融合血管形成阻害ペプチドを形成し、
    該アルブミン融合血管形成阻害ペプチドを哺乳動物へ投与し、それによって該アルブミン融合血管形成阻害ペプチドの半減期を連結アルブミンを欠く血管形成阻害ペプチドの半減期より少なくとも２倍延長する、
    ことを含んでなる、方法。
  30. 請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる、核酸分子。
  31. 請求項３０に記載の核酸分子を含んでなる、ベクター。
  32. 請求項３０に記載の核酸分子を含有する、宿主細胞。
  33. 請求項１に記載のアルブミン融合血管形成阻害ペプチド、または有効濃度の該アルブミン融合タンパク質を発現しうる核酸、を哺乳動物へ投与することを含んでなる、血管形成阻害ペプチドでの哺乳動物の治療に伴う副作用を最少に抑えるための方法。
  34. 請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質の製造方法であって、
    (ａ) 細胞または生物で発現しうるアルブミン融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸を用意し、
    (ｂ) 細胞または生物で核酸を発現させてアルブミン融合タンパク質を形成させ、かつ
    (ｃ) アルブミン融合タンパク質を精製する
    ことを含んでなる、方法。
  35. アルブミン融合タンパク質がグリコシル化欠陥酵母株で発現される、請求項３４に記載の方法。
  36. ペプチドアルブミン融合体がグリコシル化コンピテント酵母株で発現される、請求項３４に記載の方法。
  37. 血管形成依存性腫瘍を有する患者へ投与されたときに、血管形成依存性腫瘍の腫瘍塊を有効に退縮させうるような量で、アルブミン融合タンパク質が供与される、請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質を含んでなる組成物。
  38. 血管形成依存性腫瘍の成長を有効に阻害しうるような量で、融合タンパク質が供与される、請求項１に記載の融合タンパク質を含んでなる組成物。
  39. 血管形成関連疾患が血管形成依存性癌である、請求項２６に記載の方法。
  40. 血管形成関連疾患が、血管形成依存性癌；良性腫瘍；リウマチ様関節炎；乾癬；眼血管形成疾患；Osler-Webber症候群；心筋血管形成；斑血管新生；毛細血管拡張症；血友病関節；血管線維腫；創傷顆粒形成；腸癒着、アテローム性動脈硬化症、強皮症、過形成性瘢痕、ネコ引掻き病およびHelicobacter pylori潰瘍からなる群より選択される、請求項２６に記載の方法。
  41. 腫瘍退縮を生じさせるために十分な量で、請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質、または有効濃度の請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質を発現しうる核酸を、治療の必要な患者へ投与することを含んでなる、血管形成依存性腫瘍の患者を治療する方法。
  42. 腫瘍血行停止を生じさせるために十分な量で、請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質、または有効濃度の請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質を発現しうる核酸を、治療の必要な患者へ投与することを含んでなる、血管形成依存性腫瘍の患者を治療する方法。
  43. 製薬上許容される担体と、治療有効量の請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質または有効濃度の請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質を発現しうる核酸とを含んでなる、血管形成依存性疾患または障害に対する免疫を哺乳動物で誘導するためのワクチン組成物。
  44. 哺乳動物がヒトである、請求項４３に記載のワクチン組成物。
  45. 請求項４３に記載のワクチン組成物の治療有効量を哺乳動物へ投与することを含んでなる、哺乳動物で血管形成依存性癌腫瘍に対する免疫を誘導するための方法。
  46. 哺乳動物がヒトである、請求項４５に記載の方法。
  47. 細胞タイプ、標的臓器または特定の細胞学的もしくは解剖学的部位へアルブミン融合タンパク質を向かわせるように適合化された向標的部分を更に含んでなる、請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質。
  48. 哺乳動物の抗血管形成関連疾患または障害を診断する方法であって、
    (ａ) 請求項１に記載の標識融合タンパク質を投与し、
    (ｂ) 標識融合タンパク質の少なくとも一部を血管形成依存性疾患または障害の部位へ到達させ、かつ
    (ｃ) 融合タンパク質が血管形成依存性疾患または障害の部位で検出されるかどうかを調べる
    ことを含んでなる、方法。
  49. アルブミンまたはその断片もしくは変種へ抗血管形成ペプチドを融合させて融合タンパク質を作製し、哺乳動物へ融合タンパク質を投与することを含んでなる、哺乳動物で細胞の内側へまたは細胞構造に抗血管形成ペプチドを向かわせる方法。
  50. アルブミンまたはその断片もしくは変種へ抗血管形成ペプチドを融合させて融合タンパク質を作製し、哺乳動物へ融合タンパク質を投与することを含んでなる、抗血管形成ペプチドの投与スケジュールを改善する方法でっって、
    (ａ) 個別腫瘍の具体的な成長特徴に合わせた、腫瘍の血管形成表現型に基づく用量の最適化を計画し、かつ
    (ｂ) 副作用の減少もしくは軽減または効力の改変をもたらす、長期適用時における薬物の望ましくない蓄積の制御／回避する
    ことを含んでなる、方法。
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