ES2218185T3 - Metodo para la purificacion de adn plasmidico exento de rnasa y de solvente organico, usando filtracion de flujo tangencial. - Google Patents
Metodo para la purificacion de adn plasmidico exento de rnasa y de solvente organico, usando filtracion de flujo tangencial.Info
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Abstract
Procedimiento de purificación de ADN plasmídico a partir de las células procariotas que lo contienen, comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes: (a) digestión de las células, (b) incubación de las células en presencia de un álcali y detergente durante 4 a 24 horas, aproximadamente, para producir la lisis y solubilización de las mismas, (c) separación de los contaminantes del lisado de las células para obtener una solución del plásmido, (d) filtración de la solución con un equipo de filtración de flujo tangencial para obtener un retenido que contenga el ADN plasmídico, y (e) recogida del retenido, de tal modo que no se usan enzimas en ninguna de las etapas para digerir el ARN.
Description
Método para la purificación de ADN plasmídico
exento de RNASA y de solvente orgánico, usando filtración de flujo
tangencial.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la purificación de ADN plasmídico. Más
específicamente, se proporciona un método simple y escalable, que
utiliza la filtración de flujo tangencial, lo cual da lugar a un
rendimiento de plásmido de alta pureza superior al rendimiento del
método clásico basado en el método de lisis alcalina.
La purificación de ADN plasmídico a partir de
cultivos celulares es un requisito previo de muchos estudios y usos
farmacéuticos. En general, los métodos para la purificación de
plásmidos pueden ser considerados procedimientos en dos pasos, que
implican una etapa inicial de disrupción celular y aislamiento del
plásmido, seguida de una o más etapas ulteriores de purificación.
Los métodos más frecuentes para el aislamiento inicial son versiones
modificadas de dos abordajes: uno basado en la liberación del
plásmido mediante cocción (Holmes and Quigley, Anal.
Biochem., 114: 193-197 (1981) y el
segundo basado en la solubilización de las membranas de las células
bacterianas en pH alcalino, mediada por detergentes (Birnboim and
Doly, Nucleic Acid Res., 7: 1513-1523
(1979). Ambos métodos dan lugar a la liberación del ADN plasmídico
de su localización en el citosol.
Además del uso común de la ultracentrifugación en
gradientes de cloruro de cesio (Clewell and Helinski, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 62: 1150-1152 (1969), la
purificación y recuperación corriente abajo ha implicado típicamente
la precipitación selectiva del plásmido de los contaminantes (Lis
and Schleif, Nucleic Acids Res., 2:
383-389 (1975); Ishaq et al., Biotechniques,
9: 19-24 (1990); Kondo et al., Anal.
Biochem., 198: 30-35 (1991); Chakrabarti
et al., Biotech. Appl. Biochem., 16:
211-215 (1992) y/o el uso de columnas de
cromatografía (Horn et al., Human Gene Ther., 6:
565-573 (1995); Patente U.S. nº 5.707.812; Chandra
et al., Anal Biochem., 203: 169-172
(1992); Marquet et al., Biopharm., 26-37
(1995); Johnson and Ilan, Anal. Biochem., 132:
20-25 (1983); Vincent and Goldstein, Anal.
Biochem., 110: 123-127 (1981). Los
protocolos basados en cromatografía en columna se basan en
metodologías de fase inversa (Edwardson et al., Anal.
Biochem., 152: 215-220 (1986); Johnson
et al., Biotechniques, 4: 64-70
(1986); van Helden and Hoal in New Nucleic Acids Techniques,
Walker, Ed (Humana Press: Clifton, NJ, 1988),
pp.61-74)), de fase normal (Marko et al., Anal.
Biochem., 121: 382-387 (1982)), intercambio
iónico (Perbal en A Practical Guide to Molecular Cloning,
(Wiley: New York, 1984) pp. 165-175; Colman et
al., Eur. J. Biochem., 91: 303-310
(1978); Garon and Petersen, Gene Anal. Tech., 4:
5-8 (1987); Kim and Rha, Biotech. Bioeng.,
33: 1205-1209 (1989); Ohmiya et al., Anal.
Biochem., 189: 126-130 (1990), de exlusión por
tamaño (van Helden and Hoal, supra; Perbal, supra,
Cornelis et al., Plasmid, 5: 221-223
(1981), Micard et al., Anal. Biochem., 148:
121-126 (1985); Moreau et al., Anal.
Biochem., 166: 188-193 (1987); Raymond et
al., Anal. Biochem., 173: 125-133 (1988);
Hansen and Rickett, Anal. Biochem., 179:
167-170 (1989) y en modo mixto (Flanagan et
al., Anal. Biochem., 153: 299-304 (1986).
Las alternativas a estos enfoques para la
purificación de plásmidos comprenden el uso de membranas de 0,2
micras como sustitutivo de una etapa de centrifugación durante la
lisis alcalina en un formato de placa de 96 pocillos (Ruppert et
al., Anal. Biochem., 230: 130-134)
(1995)), el uso de separación en dos fases acuosas (Cole,
Biotechniques, 11: 18-24 (1991) y el uso de
membranas de intercambio iónico (van Huynh et al., Anal.
Biochem., 211: 61-65 (1993)).
Típicamente, estos métodos han requerido etapas adicionales de
purificación que implican la extracción basada en disolventes
orgánicos (por ejemplo, fenol o cloroformo) o de precipitación (por
ejemplo, con isopropanol, o etanol), así como la adición de enzimas
exógenas (por ejemplo, RNasa, proteinasa K) para obtener plásmidos
de una pureza adecuada.
Técnicas adicionales para la purificación de ADN
plasmídico implican los métodos de purificación de ADN basados
en el polietilenglicol (Lis y Schleif, supra; la patente
U.S. nº 5.707.812) en la que se añade un alcohol polimérico de
cadena corta al lisado, de tal forma que el lisado se une a la
columna o membrana que se usa para la purificación); la purificación
de ADN plasmídico con fenol-ácido (Zasloff et al., Nucleic
Acids Res., 5: 1139-1153 (1978)), y diferentes
métodos para la purificación de ADN plasmídico en pequeña escala con
fines de investigación (Sambrook et al., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2ª ed. (Cold Spring Harbor Laboratory
Press: New York, 1989); Ausubel et al., eds., Current
Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons; New
York, 1989)). Las técnicas para la separación de ADN y ARN han sido
revisadas en Roman and Brown, J. Chromatogr., 592:
3-12 (1992).
La técnica de filtración de flujo tangencial
(TFF), o filtración de flujo cruzado, es una técnica de separación
en la que el flujo es dirigido a través de la superficie de la
membrana con un movimiento de barrido (Gabler, ASM News, 50:
299 (1984)). Esta acción de barrido ayuda a que el material retenido
en la membrana no forme una capa en la superficie del filtro, una
situación conocida como polarización por concentración . La TFF se
utiliza para concentrar y/o desalar las soluciones retenidas por la
membrana (retenido) o para recoger el material que pasa a través de
la membrana (filtrado). Los materiales de un tamaño menor que el del
poro de la membrana (o con el punto de corte del peso molecular
nominal (NMWC)) pueden pasar a través de la membrana y pueden ser
despirogenados, clarificados o separados de las especies de mayor
peso molecular o tamaño. Los materiales con un tamaño o NMWC
superior al del poro son retenidos en la membrana y son
concentrados, lavados o separados de las especies de menor peso
molecular. Los principios, teorías y dispositivos utilizados para la
TFF han sido descritos por Michaels et al., "Tangential
Flow Filtration" en Separations Technology, Pharmaceutical and
Biotechnology Applications (W. P. Olson, ed., Interpharm Press,
Inc., Buffalo Grove, IL, 1995). Véanse también en las patentes U.S.
5.256.294 y 5.490.937 una descripción del alto rendimiento de la
filtración de flujo tangencial (HP-TFF) que supone
una mejora del TFF; y en documento WO 87/04169 una descripción de la
ultrafiltración por afinidad de flujo tangencial, que implica la
mezcla de la solución a purificar con un gel de afinidad que se une
selectivamente a la sustancia que se va a purificar y posteriormente
se somete el líquido a TFF, con lo que pasan a través del filtro
todos los componentes, excepto el material unido.
Métodos adicionales para la purificación de
virus, ácidos nucleicos, bacteriófagos y otros materiales
patológicos usando separación física, como TFF u otras técnicas de
filtración de flujo cruzado han sido descritos en diversas
publicaciones (Richards and GoldmintZ, J. Virol. Methods, 4:
147-153 (1982); Fernández et al., Acta
Biotechnol., 12: 49-56 (1992); Matsushita
et al., Kagaku Kogaku Ronbunshu, 20:
725-728 (1994); Rembhotkar and Khatri, Anal.
Biochem., 176: 373-374 (1989); WO 98/05673,
publicada el 12 de febrero de 1998; EP 307,373; Sekhar et al.,
Hum. Gene Ther., 7: 33-38 (1996).
Con la creciente utilización de ADN plasmídico
como productos biofarmacéuticos en aplicaciones de terapia génica en
lugar de cómo vector de clonación, existe una creciente necesidad de
procedimientos sencillos, potentes y escalables para el aislamiento
de cantidades intermedias y grandes de esta molécula a partir de
procariotas transformados. El uso de los métodos actualmente
disponibles para la purificación de plásmidos que generen grandes
cantidades de material de investigación o para ensayo clínico es
limitado por muchas razones. Los esquemas de purificación implican
el uso de grandes cantidades de disolventes orgánicos inflamables
(por ejemplo etanol, isopropanol), sustancias químicas tóxicas (por
ejemplo, bromuro de etidio, fenol y cloroformo). Las
ultracentrífugas y "columnas spin", aunque adecuadas para
generar pequeñas cantidades de material de investigación, no son
adecuadas para generar las cantidades necesarias para las
aplicaciones biofarmacéuticas.
Además, muchos de los procedimientos actuales de
purificación de plásmidos requieren la adición de RNasa, típicamente
de origen bovino. Los materiales derivados de fuente bovina son cada
vez menos deseables para la fabricación de productos farmacéuticos
debido al riesgo de encefalopatía espongiforme bovina (BSE) (Hill
et al., Nature, 389: 448-450 (1997).
En general, es preferible evitar la adición de enzimas a las
preparaciones de plásmidos ya que dichas moléculas han de ser
separadas posteriormente.
Los protocolos de purificación que implican el
uso de cromatografía de filtración con gel tienen el inconveniente
de la pequeña capacidad de carga de la operación; en una
publicación, las cargas se limitaban aproximadamente al dos por
ciento del volumen de la columna (McClung and Gonzales, Anal.
Biochem., 177: 378-382 (1989).
De acuerdo con lo anterior, la presente invención
proporciona un procedimiento para la purificación de ADN plasmídico
a partir de las células procariotas que los contiene, comprendiendo
dicho procedimiento las etapas siguientes:
- (a)
- digestión de las células,
- (b)
- incubación de las células durante 4 a 24 horas para llevar a cabo la lisis y solubilización sin efectuar digestión enzimática del ARN,
- (c)
- separación de los contaminantes del lisado de las células para proporcionar una solución de ADN plasmídico
- (d)
- filtración de la solución a través de un dispositivo de filtración de flujo tangencial para obtener un retenido que contiene el ADN plasmídico, y
- (e)
- recogida del retenido; de modo que las enzimas no se utilizan en ninguna de las etapas anteriores para digerir ARN.
Preferiblemente, las células son células
bacterianas. También es preferible que la etapa c) se lleve a cabo
mediante centrifugación para separar en el lisado los contaminantes
del ADN plasmídico, obteniéndose una solución sobrenadante que
contiene los ADN plasmídicos.
En otra realización, la innovación proporciona
una composición que comprende el ADN plasmídico preparado según el
procedimiento anterior.
Se proporciona un método sencillo, escalable,
basado en la filtración, para la purificación de ADN plasmídico para
obtener plásmido de alta pureza con un alto rendimiento. Este método
incluye la modificación del clásico método de extracción basado en
la lisis alcalina, ampliando la etapa de solubilización de menos de
30 minutos a 4-24 horas. La extracción es seguida
del novedoso uso de la TFF para la purificación de los contaminantes
restantes. Este método no implica el uso de disolventes orgánicos,
RNasa, proteinasa K, centrifugacióna a alta velocidad o columnas de
cromatografía. El uso de disolventes orgánicos plantea problemas
legales y de seguridad ya que puede haber cantidades mínimas de los
mismos en el producto final; además, tales disolventes son tóxicos e
inflamables, lo que conlleva graves riesgos y problemas para su
eliminación y ambientales si se utilizan en las cantidades
requeridas para la purificación a gran escala. El método proporciona
típicamente 15-20 mg de ADN plasmídico por litro de
cultivo bacteriano y resulta en la eliminación de más del 99% del
ARN y más del 95% de la proteína que permanece tras el procedimiento
de lisis alcalina. El plásmido aislado según este procedimiento
tiene una capacidad de transfección comparable a la del plásmido
aislado utilizando el clásico método basado en el gradiente de
cloruro de cesio.
Como este ADN plasmídico está altamente
purificado, puede ser utilizado en terapia génica y en otras
técnicas de aporte génico, por ejemplo, en las que implican un
transportador lipídico en las que se logran altas eficiencias,
reproducibles, de transfección. El procedimiento que se describe es
fácilmente escalable para operar con mayor capacidad, en función de
las necesidades.
Las figuras 1 A y 1 B muestran la purificación de
ADN plasmídico del ARN, evaluada mediante cromatografía de exclusión
por tamaño. La figura 1A es un análisis del sobrenadante de acetato
potásico antes de la purificación mediante TFF. La figura 1 B
muestra el análisis del acervo final del TFF. Los valores indican el
porcentaje de la absorbencia total a 260 nm.
Tal como se utiliza en la presente memoria,
"filtrado" se refiere a la porción de una muestra que pasa a
través de la membrana de filtración.
Tal como se utiliza en la presente memoria,
"retenido" alude a la porción de una muestra que no pasa a
través de la membrana de filtración.
"Filtración de flujo tangencial", "TFF"
o "filtración cruzada" alude a un procedimiento de filtración
en el que una mezcla de muestra circula a través de la parte
superior de la membrana, y la aplicación de una presión hace que el
soluto y las moléculas pequeñas pasen a través de la membrana.
Típicamente, la solución fluye paralelamente a la membrana del
filtro, de tal forma que el flujo liquido limpia continuamente la
superficie del filtro e impide que se obstruya por los solutos no
filtrables. La existencia de una presión diferencial a través de la
membrana hace que el líquido y los solutos filtrables fluyan a
través del filtro. Esto puede realizarse como un procedimiento de
flujo continuo ya que la solución pasa repetidamente sobre la
membrana en tanto que el líquido que pasa a través del filtro es
continuamente drenado a un circuito separado.
Tal como se utiliza en la presente memoria, los
"contaminantes del lisado" son todos los componentes no
deseados de una mezcla en la que está contenido el ADN plasmídico
deseado, incluyendo el ADN cromosómico, proteínas del huésped,
detritus celulares, restos de membranas celulares, hidratos de
carbono, pequeños nucleótidos degradados, ARN y lipopolisacáricos
del huésped, etc.
La expresión "sin efectuar digestión enzimática
del ARN" significa la ausencia de una enzima como RNasa que
digiera el ARN (incluyendo el ARN celular o del huésped).
Tal como se utiliza en la presente memoria,
"punto de corte del peso molecular" se refiere al peso
molecular del soluto globular que es retenido en un 90% por dicha
membrana. Véase Filtrom Catalog, 1995/96, p. 5. El peso molecular
real de las partículas que pasan a través o son retenidas por una
membrana dependerá del tamaño y de la conformación y la carga de
cada molécula determinada, de la naturaleza del poro de la membrana
o matriz y de la conductividad y pH de la solución.
Tal como se utiliza en la presente memoria, un
plásmido "purificado" es el que ha sido separado de
contaminantes como endotoxina, proteína y ARN y preferiblemente
compuesto al menos por 95% de plásmido y aproximadamente 5% de ARN,
más preferiblemente 98% de plásmido y aproximadamente 2% de ARN,
medido por cromatografía de exclusión por tamaño y absorbencia a 260
nm. Preferiblemente la concentración de endotoxina en dicha
preparación purificada de plásmido es inferior a 300.000 EU/ml y más
preferiblemente inferior a 30.000 EU/ml.
Se ha encontrado que el ADN plasmídico puede ser
altamente purificado con alto rendimiento a partir de las células
procariotas en las que está localizado usando TFF, sin RNasa.
Preferiblemente, el ADN plasmídico en esta invención tiene un tamaño
que oscila entre 2 Kb y 5 Kb, aproximadamente, más preferiblemente
entre 2 y 15 Kb y la TFF usa un punto de corte del peso molecular
superior a 500 kD, aproximadamente, preferiblemente de 500 kD a 1000
kD, aproximadamente.
El ADN plasmídico de esta invención es aislado, o
extraído, de los componentes del cultivo de células procariotas,
preferiblemente fermentaciones bacterianas y más preferiblemente de
E. coli. El ADN plasmídico aislado de las células procariotas
incluye plásmidos que ocurren de forma natural y plásmidos
recombinantes que contienen un gen de interés, por ejemplo, genes
marcadores o genes terapéuticos. La fermentación puede ser realizada
en cualquier medio líquido adecuado para el crecimiento de las
células que se utilicen.
El ADN plasmídico que se purifica en esta
invención puede ser ADN extracromosómico de cualquier tipo, siempre
que tenga el tamaño especificado en el rango previamente mencionado.
Los plásmidos pueden estar en un alto número de copias, bajo número
de copias, plásmidos autorreplicables, ser de ADN monocatenario o
bicatenario, superenrrollado o fragmentos de ADN. Pueden contener un
rango de elementos genéticos que comprenden genes seleccionables,
"polilinkers", orígenes de la replicación, promotores,
potenciadores, secuencias señal, sitios de poliadenilación y
secuencias de terminación. Los plásmidos pueden contener genes de
mamíferos, básicamente de cualquier origen, preferiblemente un gen
terapéutico y más preferiblemente un gen que codifique un
polipéptido humano de interés. Tales genes terapéuticos comprenden
genes funcionales o fragmentos de genes que pueden expresarse en un
huésped adecuado para complementar a un gen defectuoso o
infraexpresado en la célula huésped, así como genes o fragmentos de
genes que, cuando se expresan, inhiben o suprimen la función de un
gen en la célula huésped, incluyendo secuencias antisentido
(complementarias) ribozimas, inhibidores transdominantes y
similares.
Antes de la digestión y lisis de las células para
extraer el ADN plasmídico, se suelen recoger las células del medio
de cultivo. Es adecuado cualquier método convencional de recogida de
las células de un medio líquido, como la centrifugación, la
filtración y la sedimentación.
La primera etapa del procedimiento que
describimos aquí implica la digestión de las células. La digestión
puede realizarse con cualquier método convencional (por ejemplo,
mediante la técnica de Birnboim and Doly, supra) pero es
preferible realizarla mediante la adición de una enzima digestiva
como la lisozima, mezclando e incubando la mezcla a una temperatura
inferior a la temperatura ambiente, preferiblemente en hielo.
La segunda etapa del procedimiento consiste en la
lisis y solubilización de las células, lo que da lugar a la
digestión química del ARN. Esta etapa se lleva a cabo durante un
tiempo que oscila entre 4 y 24 horas, preferiblemente entre 6 y 24
horas, más preferiblemente entre 10 y 24 horas, todavía más
preferible entre 15 y 24 horas y aún más preferible entre 20 y 24
horas. Típicamente, las células son resuspendidas en tampón tras su
recogida y tratadas durante el tiempo indicado con uno o más agentes
que lisan y solubilizan las células. Entre los ejemplos de dichos
agentes están los álcalis (por ejemplo, una base diluida, como
hidróxido sódico) y/o un detergente. Preferiblemente, se emplean
ambos, el álcali y el detergente. En otra innovación preferida, para
una máxima eliminación de la endotoxina, el detergente es, por
ejemplo, dodecil sulfato de sodio (SDS), ácido cólico, ácido
desoxicólico o TRITON X-114™, más preferiblemente
SDS o ácido desoxicólico. Para lograr la máxima liberación y
eliminación del ADN genómico contaminante, el detergente será
preferiblemente aniónico, más preferiblemente SDS, ácido cólico o
ácido desoxicólico y más preferiblemente SDS o ácido
desoxicólico.
La etapa de lisis y solubilización se realiza en
ausencia de enzimas que digieran el ARN, como la RNasa.
Preferiblemente, el procedimiento se realiza también en ausencia de
tratamiento enzimático que podría debilitar las paredes celulares
debido a posibles contaminaciones por virus animales. También es
deseable usar métodos que no rompan el ADN cromosómico para así
facilitar su eliminación, evitándose de esta forma la contaminación
del producto final del ADN plasmídico. El procedimiento preferido de
lisis para las células bacterianas es la lisis alcalina descrita por
Birnboim and Doly, supra, o modificaciones del mismo, como se
indica en el presente ejemplo 1.
Tras la lisis y solubilización, se tratan las
células para eliminar los contaminantes del lisado, incluyendo los
detritus celulares como proteínas, paredes o membranas celulares,
ADN cromosómico y proteínas del huésped. Esta etapa de eliminación
de contaminantes típicamente implica la precipitación,
centrifugación, filtración y/o sedimentación, dependiendo del tipo
de células y del procedimiento de lisis empleado. Si se ha utilizado
la lisis alcalina, preferiblemente se acidifica el lisado resultante
para precipitar el ADN cromosómico y las proteínas del huésped.
Posteriormente se eliminan los detritus celulares y demás impurezas
con métodos estándar, como centrifugación, filtración o
sedimentación, preferiblemente mediante centrifugación. El
sobrenadante resultante es a continuación y opcionalmente filtrado
con tierra de diatomeas para clarificarlo y reducir la concentración
de ARN del huésped con respecto al sobrenadante. El ADN plasmídico
puede precipitarse del filtrado clarificado usando un agente
precipitante en condiciones adecuadas y recogedo y resuspendido en
un tampón. Posteriormente, el ARN y los lipopolisacáridos del
huésped, en contraposición con el ADN plasmídico, pueden ser
preferiblemente precipitados del tampón con un agente precipitante,
en las condiciones apropiadas para este fin. Finalmente, el filtrado
es preferiblemente recogido, se vuelve a precipitar el ADN
plasmídico, usando un agente precipitante, en las condiciones
apropiadas, y el ADN plasmídico precipitado es resuspendido para su
uso en la siguiente etapa de filtración TFF.
La siguiente etapa del procedimiento es la
filtración de la solución a través de un dispositivo de TFF. Antes
de dicha filtración, se puede tratar el ADN plasmídico con un
alcohol polimérico de cadena corta, con el fin de que no se una a
las membranas de la TFF. En la figura 1 de WO 98/05673 se presenta
un diagrama esquemático de un procedimiento de TFF. En las figuras
2, 3 y 4 de la patente U.S. nº 5.256.294 se muestran aparatos para
la realización de HP-TFF. La membrana de filtración
se selecciona basándose, por ejemplo, en el tamaño y conformación
del ADN plasmídico a purificar y tendrá un punto de corte del peso
molecular superior a unos 500 daltos (kD), preferiblemente entre 500
y 1.000 kD. Generalmente, las membranas útiles en la TFF presente
son las descritas por Gabler, supra. Son típicamente
membranas sintéticas del tipo microporoso (MF) o de ultrafiltración
(UF), no siendo normalmente utilizables las del tipo de ósmosis
inversa (RO) debido al pequeño rango del tamaño de los poros.
El tipo MF típicamente tiene un tamaño de poros
de 0,1 a 10 micrómetros y pueden hacerse para que retengan todas las
partículas de un tamaño superior al determinado. Las membranas de
tipo UF tienen un tamaño menor de poro y se caracterizan por el
tamaño de las proteínas globulares que son retenidas. Existen en
incrementos desde 1.000 a 1.000,000 de peso molecular nominal
(dalton) límite, correspondientes aproximadamente a 0,001 a 0,05
micrómetros. Las membranas de tipo UF, que normalmente son
asimétricas, con una fina película o piel en la superficie superior
que es responsable de su poder de separación, son las más adecuadas
para su uso en la presente invención.
El procedimiento de la presente invención está
bien adaptado para ser utilizado a escala comercial o
semiindustrial. Puede realizarse de forma semicontinua, es decir, en
un flujo continuo de la solución que conteniene el ADN plasmídico
deseado, pasando al filtro de flujo tangencial, hasta que se haya
filtrado un gran lote completo, seguido de un paso de separación de
contaminantes del ADN deseado en un flujo continuo. Entre los pasos
de filtración se pueden intercalar pasos de lavado. A continuación
pueden tratarse lotes frescos de la solución. De esta forma, se
puede llevar a cabo un procedimiento cíclico continuo para obtener
grandes cantidades del producto deseado, en una forma aceptablemente
pura, en tiempos relativamente cortos.
En estas condiciones, el ADN plasmídico será
retenido en el retenido en tanto que las sustancias contaminantes,
incluyendo muchas proteínas, membranas celulares, carbohidratos,
pequeños nucleótidos degradados, etc., pasan a través de la membrana
al filtrado. Entre las casas comerciales de los dispositivos de
filtración están Pall-Filtron (Northborough, MA),
Millipore (Bedford, MA) y Amicon (Danvers, MA). Para la finalidad
presente, es adecuado cualquier dispositivo útil para la realización
de una TFF, por ejemplo, un dispositivo de placa plana, un cartucho
bobinado, una fibra hueca, un dispositivo tubular o de lámina única,
un dispositivo de canal abierto, etc.
El área de la superficie de la membrana de
filtración utilizada dependerá de la cantidad de ADN plasmídico a
purificar. La membrana puede ser de un material con baja afinidad de
unión, para minimizar las pérdidas por adsorción, y preferiblemente
duraderas, lavables y químicamente compatibles con los tampones a
utilizar. Existen diversos tipos comercializados de membranas
adecuadas, por ejemplo, de acetato de celulosa, de polisulfona, de
poliétersulfona y de difluoruro de polivinilideno. Preferiblemente,
las membranas serán de polisulfona o poliétersulfona.
La filtración se realiza usando flujo tangencial
para hacer circular el tampón de la muestra a medida que cruza la
superficie de la membrana. Durante la TFF se aplica una presión a
través de la membrana, lo que permite que pasen las pequeñas
moléculas a través de la misma en tanto que el retenido es
recirculado. Típicamente, el flujo se ajustará para mantener una
presión transmembranosa constante. En general, la filtración va a
proceder más rápidamente cuanto mayor sea la presión y el caudal
pero los altos caudales pueden dar lugar a rotura de los ácidos
nucleicos y pérdidas por su paso a través de la membrana. Además,
diversos dispositivos de TFF pueden tener ciertos límites de la
presión de operación. Por lo tanto, la presión debe ser ajustada de
acuerdo con las especificaciones del fabricante. En los dispositivos
de placa plana, la presión debe ser del orden de 5 a 30 psi, más
preferentemente de 10 a 15 psi. La bomba de circulación se
selecciona para poder asegurar la mínima rotura de los ácidos
nucleicos. Típicamente la bomba de circulación es una bomba
peristáltica o de diafragma en el canal de alimentación y la presión
es controlada ajustando la válvula de retenido.
La filtración se realizará generalmente en modo
de diafiltración. Opcionalmente, la solución de la muestra puede ser
inicialmente filtrada sin la adición de tampón hasta que esté
concentrada en un volumen deseado. Una vez concentrada se añade el
tampón de diafiltración y se continua con la filtración para lavar
el retenido de las pequeñas moléculas contaminantes y eliminar los
disolventes y sales no deseables. La diafiltración puede ser
continua o discontinua. Preferiblemente será continua y se realizará
hasta que se hayan intercambiado de 5 a 500 equivalentes de volumen.
En general, se realizará más diafiltración cuando haya más
contaminantes unidos a los ácidos nucleicos, dependiendo de la
pureza requerida.
Para mejorar adicionalmente el rendimiento del
ADN plasmídico purificado tras la TFF, el retenido de la solución
puede, opcionalmente, ser recirculado a través de la unidad de
filtración con la válvula del permeado cerrada durante varios
minutos para separar el ADN plasmídico residual. Se recoge el
retenido y se añade tampón de diafiltración adicional para lavar la
membrana del filtro. Se recoge de nuevo el retenido y se mezcla con
el retenido inicial que contiene el ADN plasmídico purificado. A
continuación se concentra la solución de alimentación y se dializa
contra un tampón, por ejemplo, TRIS™, para obtener ADN plasmídico
purificado.
El ADN plasmídico purificado por el procedimiento
de TFF descrito puede ser utilizado directamente o ser
adicionalmente purificado, dependiendo del grado y tipo de
contaminación de la muestra inicial y del uso al que va dirigido. El
ADN plasmídico así purificado puede ser utilizado para una serie de
aplicaciones, por ejemplo, en aplicaciones de biología molecular,
como clonación o expresión de genes, o con fines diagnósticos
usando, por ejemplo, PCR, RT-PCR, formación de
dendrímeros, etc. Con fines terapéuticos, por ejemplo, para usar en
terapia génica, como vacunas o en inmunización genética, puede ser
deseable purificar adicionalmente el ADN plasmídico obtenido en la
etapa de TFF. Para la purificación ulterior del ADN plasmídico se
puede emplear la cromatografía de intercambio iónico.
La muestra con el ADN plasmídico se carga en la
columna en un tampón de carga que consiste en una concentración
salina inferior a la concentración de elución de la columna del ADN
plasmídico. Típicamente, la concentración salina estará
aproximadamente entre 10 y 50 mS, dependiendo de la resina empleada.
Para las resinas de intercambio aniónico más débiles se usará una
solución con una conductividad más baja en tanto que para las
resinas de intercambio aniónico más fuertes se usarán soluciones con
mayor conductividad. A continuación se lava la columna con varios
volúmenes de la misma de tampón para eliminar las sustancias que se
unen débilmente a la resina. Las fracciones son eluídas de la
columna usando un débil gradiente continuo de salino, según los
métodos convencionales, por ejemplo, usando hasta 1,5 M NaCl en
tampón Tris-HCl. Se recogen fracciones de la muestra
de la columna. Para preparaciones a escala intermedia (por ejemplo,
de unos 100 mg a unos 3 gramos), las fracciones típicamente serán al
menos de 50 ml a 2 litros donde se espera encontrar el pico de ADN
plasmídico y se incrementará el volumen después de haber pasado el
pico. En cada fracción se realizarán determinaciones analíticas del
rendimiento y pureza del ADN plasmídico. Además, se puede realizar
análisis de lisado de amebocitos de Limulus (LAL) en cada
fracción para determinar las concentraciones residuales de
endotoxina. Se mezclan las fracciones que contengan bajas
concentraciones de endotoxina y altas concentraciones de ADN
plasmídico.
Cuando el ADN plasmídico purificado según el
protocolo mencionado debe unirse a un transportador lípido para usar
en terapia génica, es deseable llevar el ADN plasmídico a un tampón
con baja conductividad, preferiblemente mediante diafiltración. Un
tampón de baja conductividad es cualquier tampón de menos de 10 mS,
preferiblemente menos de 1 mS.
En diversos lugares del protocolo anterior, es
ventajoso determinar el rendimiento y la pureza del ADN plasmídico.
Típicamente, tales análisis se realizan antes y después de cada
etapa de purificación, así como en cada fracción que contenga ácidos
nucleicos, por ejemplo en la cromatografía de intercambio iónico
preparativa. Los métodos preferidos para realizar estas
determinaciones analíticas comprenden la cromatografía líquida de
alto rendimiento (HPLC) o la cromatografía de exclusión por tamaño
(SEC) para el análisis de la pureza, la estimación
espectrofotométrica del rendimiento, la tinción con plata y el
SDS-PAGE para el análisis de proteínas y la
electroforesis en gel de agarosa y "Southern blotting"
(transferencia Southern) para el análisis del ADN.
La invención se pondrá más claramente de
manifiesto haciendo referencia a los planos adjuntos. Sin embargo,
no deberán ser considerados como limitativos del alcance de la
invención. La literatura y las menciones a las patentes se
incorporan expresamente a título de referencia.
Para la purificación de plásmido del Factor VII,
se cultivaron E. coli transformados con el gen del factor
VIII (patentes U.S. nº 5.618.788 y nº 5.633.150) en un fermentador
de 10 l y se trataron con cicloheximida para maximizar la producción
de ADN plasmídico.
Para la purificación de plásmidos distintos del
plásmido del Factor VIIII, células E. coli competentes para
la transformación (DH5a, Gibco-BRL) fueron
transformadas siguiendo el protocolo del fabricante para la
amplificación de los plásmidos resistentes a la ampicilina (Amp®).
Se cultivaron las colonias durante la noche en medio LB suplementado
con carbenicilina (50 mg/ml).
La lisis alcalina de E. coli se basó en el
procedimiento de Birnboim y Doly, supra, con las
modificaciones que se indican más adelante. Las células de E.
coli se suspendieron en 8 ml de glucosa 50M /
TRIS-HCl 25 mM / EDTA 10 mM (GTE), pH 8, por gramo
de células (peso húmedo). A continuación se añadió un total de 0,8
ml de una solución de lisozima (2 mg/ml en GTE) (Canadian Lysozyme
Company, Abbotsford, British Columbia) y, tras mezclar, se incubaron
las células durante 30 minutos, en hielo. Se añadió a la mezcla un
total de 16 ml de una solución conteniendo NaOH 0,2M y SDS al 1% (u
otro detergente, según esté indicado) por gramo de células y se
incubó durante la noche (o como se indique), a la temperatura
ambiente, con suave agitación continua. Se añade un total de 12 ml
de acetato de potasio 5M, pH 4,8, por gramo de células y, tras
mezclar, se pone la mezcla en un baño de hielo. A los 10 minutos de
incubación, se centrifuga la mezcla a 13.0000 g durante 30 minutos.
Se recoge el sobrenadante y se clarifica pasándolo a través de
varias capas de MIRACLOTH™ (Calbiochem-Novabiochem
Corporation, San Diego, CA).
El ADN plasmídico aislado de E. coli como
se ha descrito más arriba, se purifica en un dispositivo de TFF (las
cassettes de las membranas TFF y los portacassettes proceden de Pall
Filtron Corporation, Nothborough, MA) usando 0,5 pies cuadrados de
una membrana de poliétersulfona por cada 10-15 g de
células procesadas. (Ésta es la cantidad típicamente encontrada tras
cultivar durante la noche con agitación). El punto de corte del peso
molecular nominal de la membrana fue 500 o 1.000 kDa. La tasa de
alimentación al dispositivo de TFF se ajustó a 0,5 litros/minuto/pie
cuadrado de membrana. Los experimentos indicaron que las membranas
de ultrafiltración requerían 15-20 minutos de
equilibrado con el sobrenadante clarificado en condiciones de
operación normales antes de iniciar la ultrafiltración para
minimizar las pérdidas iniciales de rendimiento del filtrado. Todos
los experimentos se llevaron a cabo manteniendo una presión
transmembranosa constante (TMP). En varios experimentos se determinó
que la TMP preferida era aproximadamente 10-15 psi.
En estas condiciones, la tasa de filtración era aproximadamente 1,5
litros/hora/pie cuadrado de membrana. Para la purificación del
plásmido la solución de alimentación se concentró dos veces y se
dializó frente a 8-10 diavolúmenes de
Tris-HCl 20 mM, pH 7,6.
El aislamiento del plásmido usando gradientes de
cloruro de cesio se realizó según se describe en Clewell and
Helinski, supra, y en Miller, Met. Enzimol., 152:
145-170 (Berger and Kimmel, eds.) Academic Press:
San Diego, CA, 1987).
Se analizaron las muestras inyectando 100 \mul
en una columna TSK-G5000PW™ (7,5 x 300 mm)
(Tosohaas, Montomeryville, PA) que fue equilibrada en
Tris-HCL 20 mM, pH 7,5. Se corrió la columna con una
velocidad de 1 ml/min. El efluente se monitorizó por su absorbencia
a 260 nm. Los volúmenes de elución del plásmido se compararon con el
de una estándar aislada con el método del cloruro de cesio.
Los plásmidos así purificados fueron
transfectados a células de riñón de embrión humano 293, mantenidas
en medio PS19 conteniendo suero bovino fetal al 10% inactivado por
el calor. Los complejos de transfección lípido/ADN se formaron
usando lipofectina (BRL, Gaithersburg, MD) y 1\mug. de ADN
plasmídico por complejo, según las instrucciones del fabricante. Se
añadió esta mezcla a las células en pocillos de 35 mm (placas de 6
pocillos), seguido de la adición del medio. A las 24 horas de la
transfección, se retiró el medio y se analizó la actividad de Factor
VIII, usando el kit COATEST VIII:C/4™ (Chromogeni AB, Moelndal,
Sweden), según las instrucciones del fabricante.
La concentración de las proteínas se determinó
siguiendo el método de Bradford (Bradford, Anal. Biochem.,
72: 248-254 (1976), usando albúmina de suero
bovino como estándar.
Se analizaron diversos detergentes aniónicos,
catiónicos y no iónicos para determinar su capacidad para producir
plásmidos solubles tras la digestión con lisozima. Como clase, los
detergentes aniónicos son los más efectivos para la liberación de
los plásmidos. Además, la digestión con la enzima de restricción
EcoR1 (New England Biolabs, Beverly, MA) de las preparaciones
del plásmido obtenidas con detergentes aniónicos no indicaban la
presencia de ADN genómico contaminante. Finalmente, se observó que
los detergentes aniónicos, como clase, producen preparaciones
solubilizadas de plásmidos con un contenido mucho menor de
endotoxina (Tabla 1).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Se investigó el efecto del incremento del tiempo
de exposición al hidróxido sódico en presencia de dos detergentes
aniónicos diferentes. El incremento del tiempo de incubación se
siguió de una disminución del tamaño global y de la cantidad de ARN
contaminante, aparentemente dependiente del tiempo. A las 24 horas
de incubación, se podía detectar escaso ARN, tanto en las
preparaciones solubilizadas con SDS como en las solubilizadas con
colato. Sin limitar ninguna teoría, se piensa que tras la ampliación
de la exposición a las condiciones de alcalinidad, el ARN
contaminante puede estar lo bastante degradado como para permitir la
purificación de ADN plasmídico del ARN y de otro contaminantes de
menor peso molecular (por ejemplo, proteínas, endotoxina) mediante
TFF. Para maximizar la purificación se seleccionó la membrana con el
mayor tamaño del poro que todavía mostrara retención del plásmido.
Cumplían este requisito las membranas con un punto de corte del peso
molecular nominal de 500.000 y 1.000.000 Da. Un experimento inicial
usando plásmido expuesto a hidróxido sódico y SDS durante periodos
de 4 y 24 horas indicó que para la eliminación del ARN mediante TFF
era preferible la exposición de 24 horas.
Cuando se comparaban usando geles de azarosa, el
plásmido aislado como se ha descrito más arriba, con incubación
durante 4 a 24 horas con hidróxido sódico/SDS, seguido de
purificación UF/DE, era comparable al preparado usando un gradiente
de CsCl estándar. La cantidad de ARN copurificado en la preparación
de plásmido se evualuó usando cromatografía de exclusión por tamaño.
Como se muestra en la Figura 1, se eliminó en la etapa de filtración
más del 99% del ARN contaminante. La concentración proteica en los
acervos resultantes de la TFF oscilaba entre 10 y 30 \mug/ml, lo
que constituye una reducción superior al 95% del total de las
proteínas presentes en el sobrenadante de acetato de potasio. En
cinco preparaciones separadas, el rendimiento de plásmido de Factor
VIII fue 2,2\pm0,8 mg de plásmido/g de células (peso húmedo). El
promedio de la concentración de endotoxina fue 2.400 \pm 1.700
EU/ml (n = 3).
El plásmido conteniendo el gen del factor VIII se
aisló mediante el método de TFF y se comparó con el mismo plásmido
aislado mediante procedimientos convencionales con CsCl (Millar,
supra) con respecto a la capacidad para la transfección de
células 293-HEK. Como puede observarse en la Tabla
2, el ADN plasmídico aislado usando el procedimiento de lisis
alcalina modificada y TFF tiene una actividad comparable a la del
plásmido aislado usando gradientes de CsCl.
| Plásmido | Factor VIII (ELISA) | Actividad de factor VIII |
| (mU/ml) | (mU/ml) | |
| Purificado con TFF (4 horas de | 4,0 | 11,1 |
| incubación con NaOH) | ||
| Purificado con TFF (24 horas | 3,8 | 9,9 |
| de incubación con NaOH) | ||
| CsCl (fermentador) | 2,6 | 6,3 |
| CsCl (matraz de agitación) | 8,6 | 14,7 |
La robustez del método TFF fue evaluada usando el
procedimiento con seis plásmidos diferentes de tamaño variable que
habían sido transformados en E. coli y cultivados durante la
noche en matraces de agitación. Como se puede observar en la Tabla
3, independientemente del tamaño del plásmido a recuperar, cada
preparación resultó en un mínimo de 2 mg de ADN plasmídico
purificado por gramo de células (peso húmedo).
| Tamaño del | Masa (kDa) | Recuperación (mg | Rendimiento (mg de plásmido/ |
| plásmido (kb) | de plásmido) | g de "pellet" celular) | |
| 5,6 | 3.600 | 31 | 2,8 |
| 5,8 | 3.700 | 29 | 2,6 |
| 6,0 | 3.900 | 20 | 2,0 |
| 6,2 | 4.000 | 22 | 2,2 |
| 7,9 | 5.100 | 72 | 7,3 |
| 10,0 | 10.000 | No determinado | 2,2 |
Se ha descrito un método simple y escalable para
la purificación de grandes cantidades de plásmido competente para la
transfección, basado en una etapa ampliada (de 4 a 24 horas) de
lisis/solubilización, seguido de purificación, usando una etapa de
TFF. Este método produce 7-20 mg de plásmido/litro
del cultivo durante la noche, lo cual es varias veces superior a los
valores referidos previamente (Ishaq et al., supra; Kondo
et al., supra; Chakrabarti et al., supra; Chandra
et al., supra; Miller, supra). Además, el plásmido
aislado con este procedimiento ha mostrado una actividad en el
ensayo de transfección celular comparable a los plásmidos aislados
usando los métodos clásicos.
Las concentraciones de endotoxina observadas
usando el método TFF fueron superiores a las referidas con los
métodos de purificación alternativos (Miller, supra). Sin
embargo, al contrario que en observaciones previas (Cotten et
al., Gene Ther., 1: 239-246 (1994); Weber
et al., Biotechniques, 19: 930-940
(1995)), estas concentraciones de endotoxina no afectan adversamente
a la capacidad de transfección celular y expresión de proteína del
plásmido. Además, estas concentraciones de endotoxina pueden ser
eliminadas sustancialmente, según sea necesario, mediante ulterior
purificación, por ejemplo con cromatografía de intercambio
iónico.
El procedimiento de purificación basado en TFF
aquí descrito es fácilmente escalable usando principios estándar de
escalación de la TFF. Finalmente, la amplia aplicabilidad de este
procedimiento ha sido demostrada por su efectivo funcionamiento con
diferentes plásmidos de distintos pesos moleculares.
Claims (15)
1. Procedimiento de purificación de ADN
plasmídico a partir de las células procariotas que lo contienen,
comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes:
- (a)
- digestión de las células,
- (b)
- incubación de las células en presencia de un álcali y detergente durante 4 a 24 horas, aproximadamente, para producir la lisis y solubilización de las mismas,
- (c)
- separación de los contaminantes del lisado de las células para obtener una solución del plásmido,
- (d)
- filtración de la solución con un equipo de filtración de flujo tangencial para obtener un retenido que contenga el ADN plasmídico, y
- (e)
- recogida del retenido,
de tal modo que no se usan enzimas en ninguna de
las etapas para digerir el ARN.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que las células son células bacterianas.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que las células son E. coli.
4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que el ADN plasmídico tiene una tamaño que oscila entre 2 y 50
kilobases, aproximadamente.
5. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que la etapa (a) se lleva a cabo usando lisozima.
6. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que la etapa (b) se realiza durante 10 a 24 horas.
7. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que la etapa (b) se lleva a cabo durante 20 a 24 horas.
8. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que el detergente es iónico.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el
que el detergente es aniónico.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, en
el que el detergente es dodecilsulfato de sodio, ácido cólico o
ácido desoxicólico.
11. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la etapa (c) se realiza separando mediante centrifugación los
contaminantes del lisado del ADN plasmídico para obtener una
solución de ADN plasmídico como sobrenadante.
12. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el equipo de filtración presenta una membrana con un corte
de peso molecular superior a aproximadamente 500 kDa.
13. Procedimiento según la reivindicación 1, que
comprende además la recuperación del ADN plasmídico del
retenido.
14. Procedimiento según la reivindicación 1, que
comprende además la dialización del retenido contra un tampón.
15. Procedimiento según la reivindicación 1, que
comprende además someter al retenido a cromatografía de intercambio
iónico.
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