JP4699757B2 - 水性二相系でのプラスミドの回収 - Google Patents
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Description
S.C.Ribeiro et al:Isolation of Plasmid DNA from Cell Lysates by Aqueous Two−Phase Systems,2002,Wiley Periodicals P.A.Harris et al:Enzyme purification using temperature−induced phase formation,Bioseparation 2:237−246,1991 Patricia A.Alred et al:Partitioning of ectdysteroids using temperature−induced phase separation,Journal of Chromatography,628(1993)205−214 Persson et al:Purification of recombinant apolipoprotein A−1 expressed in Escherichia coli using aqueous two−phase extraction followed by temperature−induced phase separation,Journal of Chromatography B,711(1998)97−109
「生物学的溶液」との用語は、通常は細胞残渣、タンパク質、RNAのような望ましくない混入成分と共にプラスミドDNAを含んだ任意の溶液を包括的に指す。
(a)逆溶解性を呈する第一のポリマー、第一のポリマーと非混和性の第二のポリマー、及び適宜塩を含む組成物を提供するステップと、
(b)この溶液をプラスミドDNAを含む水溶液と接触させるステップと、
(c)相分離を行ない、続いて水相を単離するステップと、
(d)単離した相の温度を、第一のポリマーの曇り点よりも高くプラスミドDNAが劣化する温度よりも低い温度まで上昇させ、続いてこれにより形成される水相を単離するステップと、適宜
(e)単離された上相からプラスミドDNAを回収するためのクロマトグラフィのステップと、
を備える。
式中、CTは関心のある分子の上相での濃度、CBは関心のある分子の下相での濃度である。
〔図面の詳細な説明〕
図1は、本発明による系でのプラスミドDNA精製の模式図であって、熱分離性ポリマーはEO50PO50であり、第二のポリマーはデキストランT500(Amersham Biosciences AB、スウェーデン、ウプサラ)である。第一の系では、様々な形態のプラスミドDNAが上相に分配される。次いで、上相を新たな容器に単離して、曇り点(CP)よりも高い温度まで加熱する。新たな二相系が得られ、プラスミドDNAはポリマーを含まない水相に回収される。
4/6=4%(w/w)EO50PO50/6%(w/w)デキストランT500、
3/7=3%(w/w)EO50PO50/7%(w/w)デキストランT500、
3/8=3%(w/w)EO50PO50/8%(w/w)デキストランT500、
2.5/9=2.5%(w/w)EO50PO50/9%(w/w)デキストランT500
である。
〔材料及び方法〕
(薬品)
ポリマーBreox PAG50A1000(EO50PO50)(Mr3900)は、Laporte Performance Chemicals(英国サウサンプトン)から取得され、分子量500,000のデキストランT500はAmersham Biosciences AB(スウェーデン、ウプサラ)から入手可能である。Na2HPO4はMerck Eurolabから取得された。JV4インサート(3.433kb)を有する高コピー数プラスミドpUC19(2.686kb)はAmersham Biosciencesから寄贈された。このプラスミドを本書では以下pJV4と呼ぶ(Vasi、1999年)。
(培養)
プラスミドpJV4は、Lauriaブロス(食塩10g/L、トリプトン10g/L及び酵母エキス5g/L)500mLを用いて2.0Lのバッフル付き振盪フラスコ内でE.coli TG1α株で一晩培養した。培養液でのアンピシリン濃度は100μg/mLであり、37℃において250rpmで一晩成長させた。
(アルカリ溶菌)
修正アルカリ溶菌法を用いた。一晩培養した細胞培養液500mLを4℃で10分間にわたってSorvall SLA3000ロータでの9000rpmの遠心分離によって採取した。上清を慎重に取り除いて、細菌沈殿物5gを、グルコース61mm、Tris10mM、EDTA(pH8)50mMから成る懸濁緩衝液36mL内でボルテックスによって再懸濁した。細胞が完全に再懸濁された後に、磁気攪拌機で穏やかにかき混ぜながら溶菌緩衝液P2(0.2M NaOH、1%SDS)78mLを加えた。この混合物を攪拌しながら室温で10分間インキュベートし、完全な混合物(1相)が得られることを確実にした。氷冷した中和緩衝液(5M酢酸カリウム、pH5.5)の容積58.6mLをライセートに加えた。溶液を少なくとも20分間にわたって磁気攪拌機上で氷浴内に保った。ゲノムDNA、タンパク質及び細胞残渣を含む白色沈殿物が形成された。次いで、4℃で30分間にわたってSS−34−ロータで10,000rpmの遠心分離によって沈殿物を除去した。次いで上清を慎重に取り出して未使用の試験管に入れ、冷蔵室で貯蔵する。
アルカリ性ライセートは、Sephadex(商標)G−25(Amersham Biosciences AB、スウェーデン、ウプサラ)マトリクス上でのゲル濾過によって脱塩された。さらに明確に述べると、SephadexビーズをXK50/30カラム(Amersham Biosciences AB、スウェーデン、ウプサラ)に充填し、総ベッド容積を225mLとした。カラムをAKTA(商標)エクスプローラ10システム(Amersham Biosciences AB、スウェーデン、ウプサラ)に組み入れて、移動相(5mMリン酸ナトリウム緩衝液)と平衡させた。脱塩したいサンプル(50mL〜100mL)をサンプルポンプP−950によって5mL/minの流量でカラムにポンプ供給した。カラムからの溶出液を紫外吸光度及び伝導度によって監視し、5mMリン酸ナトリウム緩衝液内の含核酸溶出液の適当な分別を確実にした。
(水性二相系)
4.5%(w/w)デキストランT500及び4.5%(w/w)EO50PO50を含んだ合計重量10gの系を、10mL目盛付き試験管に適量のデキストランの25%原液及び100%EO50PO50原液を計量することにより作製した。用いた緩衝液塩は50mM Na2HPO4で、1M原液から系に加えた。透明な脱塩後のアルカリライセートを加えて最終的な重量を10gとした。系を、全てのポリマーが溶解するまで慎重に混合し、次いで室温での遠心分離(1600g、10分)によって各相を分離した。上相及び下相の容積を測定した。各相を分離して新たな容器に単離した。上相を3分間にわたって55℃の水浴内に配置し、次いで、2分間にわたって遠心分離して、水相1相と濃縮ポリマー相1相とを得た。
(アガロースゲル電気泳動)
この相系から得られた上相及び下相をアガロースゲル上で分析した。アガロースゲルは、Amersham Biosciences ABのHoefer(商標)HE33ミニサブマリン型電気泳動ユニットで泳動させた。15μg/mLの臭化エチジウム(Quantum Biotechnologies、米国)を含んだ0.8%(w/w)アガロース(Duchefa、オランダ)ゲルを、90Vで30分間にわたって泳動させた。ゲルを紫外線下で分析して撮影した。
〔実施例1の結果〕
(ポリマー濃度及び塩の影響)
水性二相系でのプラスミドDNAを含んだ脱塩後のアルカリ細胞ライセートの分配は、ポリマー濃度及び塩組成のような様々な要因の影響を受ける可能性がある。目的は、一次水性二相系で、EO50PO50相へのプラスミドの一方的分配を得ることにあった。二相系でのポリマー濃度を変化させることにより、プラスミドDNAをさらに徹底して上相へ分配することができる。EO50PO50及びデキストランT500の異なる濃度で構成される二相系での脱塩後のアルカリライセート中のプラスミドDNAの分配について検討した。両相とも、ポリマー濃度を低下させると上相へのさらに徹底した分配が得られた(図2)。アガロースゲル電気泳動による定性分析によれば、ポリマー濃度を、7%(w/w)デキストランT500/7%EO50PO50(w/w)から4.5%(w/w)デキストランT500/4.5%(w/w)EO50PO50に低下させることにより、プラスミドDNAを上相に分配し得ることが分かる。文献には(Albertson、1986年)、適当な塩の添加によって、DNAを各相の間で実効的に移動させることが記載されている。二相系で塩の支配的効果を得るためには、塩濃度を緩衝液の少なくとも10倍にしなければならない。二相系への塩の添加によって、陰イオン及び陽イオンが2相の異なるポリマー相の間で強制的に分配され、これにより相の間に電位が発生する。HPO4 2−陰イオンはデキストラン相に親和性を有する。これにより系に電気化学的推進力が発生する。例えばプラスミドDNAのような負に帯電した物質がこの系に添加されると、DNAは上相に分配される(図2)。
(熱分離性系でのプラスミドDNAの分配)
ライセートを4.5%(w/w)デキストランT500、4.5%(w/w)EO50PO50及び50mM Na2HPO4を含んだ系で分配した。この系は「材料及び方法」の項に従って製造された。系を混合して、相分離の後に、各相を分離して別々の容器に単離した。上相は55℃の水浴に配置した。この系の相は、水相1相と、濃厚なポリマー相1相との新たな二つの相に分離した。熱分離ステップを用いて、EO50PO50ポリマーから目的のプラスミドを分離して低ポリマー溶液(<1%)の水相にプラスミドを単離した。相を臭化エチジウムで染色したアガロースゲル電気泳動で分析した(図2)。アガロースゲル電気泳動から、第一のステップで全ての形態のプラスミドDNAが上相に分配され、熱分離ステップでプラスミドDNAが専ら上側の水相に分配されていることが分かる(図2)。また、アガロースゲル電気泳動(図2)から、一次系で混入RNAが下相へ高い度合いまで分配されることが分かる。アガロースゲルをSYBRグリーン(Molecular Probes)で染色することにより、臭化エチジウムでのDNAの染色に比較して25倍高いDNA検出感度を達成することができる(図2)。さらに高感度の染色法を用いることにより、プラスミドDNAを一次系の上相及び熱分離性系の水相に分配し得たことが決定的に示される。一次ステップでも熱分離ステップでもプラスミドDNAは下相には分配されない。
(全タンパク質の分配)
プラスミド単離工程での一次精製ステップでは、主な目的はプラスミドDNAを含む溶液内の優位の混入物を除去することにある。アルカリ溶菌ステップで細菌を溶解させる際に、タンパク質、RNA、ゲノムDNA、細胞及び細胞残渣が放出される。アルカリ溶菌の中和ステップの後に、ライセートを遠心分離するとこれら混入物の殆どは除去されるが、サンプルにはかなりの混入物が依然存在する。第一のステップでの全タンパク質の分配を分析したところ、K値は1.4であった。これにより上相の全タンパク質の収率は65%となる。この系では第一のステップでタンパク質の35%を廃棄することができる。熱分離ステップではタンパク質の収率は100%である。このように、この系ではタンパク質を35%まで廃棄することができる。
(プラスミドDNAの濃度)
一次精製ステップを設計する際の課題の一つは、対象溶液の作業容積を減少させることである。二相系では、上相の容積を減少させることによりこのことを達成することができる。相図の接続線に沿って移動することにより、物質の分配を変えずに二つの相の容積比を変化させることができる。下相のデキストラン濃度を上昇させるとより大きい容積の下相が生成され、従って上相の容積が減少する。以下のように構成された4種の異なる系について検討した。4.5%(w/w)EO50PO50/4.5%(w/w)デキストランT500、4%(w/w)EO50PO50/6%(w/w)デキストランT500、3%(w/w)EO50PO50/7%(w/w)デキストランT500、3%(w/w)EO50PO50/8%(w/w)デキストランT500、2.5%(w/w)EO50PO50/9%(w/w)デキストランT500。アガロースゲルでの系分析(図4)によれば、上相の容積が減少してもプラスミドDNAの徹底した分配が依然得られることが判明している。2.5%(w/w)EO50PO50/9%(w/w)デキストランT500を含む系では、上相及び下相の容積比(VT/VB)は0.24であった。これにより単離されたプラスミドの上相での濃度は、アルカリライセートに比較して3倍になる。これらの系の全てで、RNAは下相に部分的に廃棄される。
(群分離クロマトグラフィによるプラスミドDNAの分析)
プラスミドDNAの分析は、群分離クロマトグラフィで行なった。プラスミドDNAの全ての形態とRNAとの間の分離を達成することができる。結果は、熱分離後の上側水相でのプラスミドの全収率は、出発材料に比較して103.3%であることを示す。クロマトグラフィの結果によると同じサンプルのRNAの収率は27%である。これは、水性二相系は混入RNAの63%を除去し得ることを意味している。
TG1/pJV4細胞の細胞ペースト合計量75gを溶解して、さらに実施例1に記載されているようにして処理した。最終的な準備の後の最終ライセート容積は2Lであった。
(透析濾過)
透析濾過では、100,000Da遮断のポリスルホン中空ファイバーカートリッジ(A/G Technology Corporation、米国マサチューセッツ州Needham)を用いた(ロット番号96992057061、管腔id0.5mm、表面積650平方メートル)。用いる前に、カートリッジをMilliQ水で洗浄してグリセロール汚染を除去した。系をMilliQ水5Lで10分間にわたって再循環させ、次いで、新しい5mMリン酸ナトリウム緩衝液で10分間にわたって再循環させた。容積350mLの透明なライセートを5mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.0に対して透析濾過した。完全な緩衝液交換のために、5mMリン酸ナトリウム緩衝液の4種のサンプル容積を用いた。透析濾過後の最終保持液容積は300mLであり、350mLから300mLへの容積減少があった。透析濾過後に、カラムを5mM緩衝液100mLで洗浄してカラムから付着したプラスミドDNAを除去した。
(水性二相系)
系を実施例1に記載されているようにして製造した。
〔実施例2の結果〕
(透析濾過後のプラスミドDNAの熱分離性系での分配)
透析濾過後のライセートを、4.5%(w/w)EO50PO50、4.5%(w/w)デキストランT500及び50mM Na2HPO4で構成される水性二相系で分配した。全ての薬品及び透析濾過されたライセートをガラス製試験管に加えて最終的な重量を10gとした。次いで、系を室温での遠心分離(1600g、10分間)によって分離した。相は上相1相及び下相1相に分離し、これらの各相を新たな容器に単離した。上相を55℃の水浴に配置した。この系の相は、水相1相と、濃厚なポリマー相1相との新たな2相に分離した。熱分離ステップは、EO50PO50ポリマーから目的のプラスミドを分離して、低ポリマー溶液(<1%)の水相にプラスミドを単離するために利用された(図1)。水性二相系抽出で得られた相をアガロースゲル電気泳動及びサイズ排除クロマトグラフィ(群分離)で分析した。群分離からの結果は、プラスミドの上相への一方的分配を示した(表1)。プラスミドDNAの濃度の計算は標準曲線から行なわれる。アガロースゲル電気泳動(図5)から、レーン4において、第一の抽出ステップでは下相にプラスミドは分配されないが多量のRNAが廃棄されていることが分かる。このように、透析濾過によるアルカリライセートの脱塩が達せられ、続いて水性二相系での抽出を行なうことができる。熱分離後の上相に100%の収率を達成することができる。
TG1/pJV4細胞の細胞ペースト合計量75gを溶解して、さらに実施例1に記載されているようにして処理した。最終的な準備の後の最終ライセート容積は2Lであった。
(限外濾過)
透析濾過について上に記載したものと同じ遮断の同じカートリッジを限外濾過でも用いた。容積1000mLの透明なライセートについて、容積225mLに達するまで限外濾過を行なった。次いで、限外濾過後のライセートを5mM NaP緩衝液800mLに対して透析した。緩衝液がなくなるまで溶液を透析した。次いで、ライセートを72mLの最終的な容積まで再度限外濾過し、さらに水性二相系で抽出した。
〔実施例3の結果〕
(限外濾過後のプラスミドDNAの熱分離性系での分配)
限外濾過後のライセートを、上述のような水性二相系で分配した。アガロースゲル電気泳動(図6)から、プラスミドについて殆ど一方的な分離が達成されたことが分かる。この系では下相にプラスミドの少量の損失が出た。この原因はおそらく、系でのプラスミド濃度が例えば2mg/mLと高かったためか、又はもう一つの可能性としては緩衝液交換が不十分だったためであろう。限外濾過及び二相系抽出で得られたサンプルの結果を表2に掲げる。限外濾過後のライセートは、出発材料から13.9倍に濃縮されている。限外濾過されたライセートにRNA及びDNAの沈澱は見られなかった。限外濾過によって緩衝液交換及びライセート濃縮の両方を達成することができる。限外濾過後のライセートは、水性二相系と相溶であったが、水性二相系の容量限度又は不完全な緩衝液交換のいずれかによって下相に幾分かのプラスミドDNA損失が出た。熱分離後の上相でのプラスミドDNAの収率は85%であった。
Claims (18)
- 水性二相系でのプラスミドDNAの精製方法であって、
(a)逆溶解性を呈するとともに両親媒性でプラスミドDNAと相互作用できる第一のポリマー、第一のポリマーと非混和性で親水性の第二のポリマー、及び適宜塩を含む組成物を用意するステップと、
(b)上記組成物をプラスミドDNAを含む水溶液と接触させるステップと、
(c)相分離を行なって、プラスミドDNAを水性上相に分配させるとともに、RNAを主に下相に分配させ、続いて水性上相を単離するステップと、
(d)単離した水性上相の温度を、第一のポリマーの曇り点よりも高くプラスミドDNAが劣化する温度よりも低い温度まで上昇させ、続いてこれにより形成される水性上相を単離するステップと、適宜
(e)ステップ(d)で単離した水性上相からプラスミドDNAを回収するためのクロマトグラフィを実施するステップと、
を含む方法。 - 第一のポリマーが、水溶液での曇り点が60℃未満である、請求項1記載の方法。
- 第一のポリマーが、ポリアルキレングリコール、ポリ(オキシアルキレン)ポリマー、ポリ(オキシアルキレン)共重合体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリビニルカプロラクタム、ポリビニルメチルエーテル、アルコキシル化界面活性剤、アルコキシル化デンプン、アルコキシル化セルロース、アルキルヒドロキシルアルキルセルロース、シリコーンで改質したポリエーテル、及びポリN−イソプロピルアクリルアミド、並びにこれらの共重合体から成る群から選択される、請求項1又は請求項2記載の方法。
- 第一のポリマーが、エチレンオキシド及びプロピレンオキシドで構成される共重合体であり、好ましくは50%のエチレンオキシド及び50%のプロピレンオキシドで構成される、請求項1乃至請求項3のいずれか1項項記載の方法。
- 第二のポリマーが、ヒドロキシアルキルセルロース、ヒドロキシアルキルデンプン、デンプン、デキストラン、及びプルランから成る群から選択される、請求項1乃至請求項4のいずれか1項項記載の方法。
- 第一のポリマーの量と第二のポリマーの量との重量比が1:1である、請求項1乃至請求項5のいずれか1項項記載の方法。
- 第一のポリマーの量がステップ(a)で用意される組成物の4.5%(w/w)であり、第二のポリマーの量がステップ(a)で用意される組成物の4.5%(w/w)である、請求項6記載の方法。
- プラスミドDNAを含む水溶液は細胞ライセートであり、ステップ(b)の前に細胞ライセートを脱塩するステップを含む請求項1乃至請求項7のいずれか1項項記載の方法。
- ステップ(b)による接触が室温での混合を含む、請求項1乃至請求項8のいずれか1項項記載の方法。
- ステップ(c)及び/又はステップ(d)による単離が遠心分離による、請求項1乃至請求項9のいずれか1項項記載の方法。
- 水性二相系での細胞ライセートからのプラスミドDNAの精製のためのキットであって、60℃未満の温度で逆溶解性を呈するとともに両親媒性でプラスミドDNAと相互作用できる第一のポリマー、第一のポリマーと非混和性で親水性の第二のポリマー、及び適宜塩を一区画に含み、これらの取扱説明書を含むキット。
- 第一のポリマーはエチレンオキシド及びプロピレンオキシドで構成される、請求項11記載のキット。
- 第二のポリマーは、ヒドロキシアルキルセルロース、ヒドロキシアルキルデンプン、デンプン、デキストラン及びプルランから成る群から選択される、請求項11又は請求項12記載のキット。
- 第一のポリマーの量と第二のポリマーの量との重量比が1:1である、請求項11乃至請求項13のいずれか1項項記載のキット。
- プラスミドDNAを含む水溶液と混合する前に既に脱塩されている細胞ライセートからのプラスミドDNAの精製のための請求項11乃至請求項14のいずれか1項項記載のキット。
- 請求項1乃至請求項10のいずれか1項項記載の方法に用いられる請求項11乃至請求項15のいずれか1項項記載のキット。
- 細胞ライセートからのプラスミドDNAの精製のための60℃未満の温度で逆溶解性を呈するポリマーの水性二相系での用法。
- 前記ポリマーがエチレンオキシドとプロピレンオキシドの共重合体である、請求項17記載の用法。
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