ES2295332T3 - Uso de inhibidores de il-18 para el tratamiento y/o prevencion de cardiopatias. - Google Patents

Abstract

El uso de un inhibidor de IL-18 para fabricar un medicamento para el tratamiento y/o prevención de la cardiopatía, en el que el inhibidor de IL-18 está seleccionado entre un inhibidor de la caspasa-1 (ICE), anticuerpos contra IL-18, anticuerpos contra cualquiera de las subunidades del receptor de IL-18, y proteína de unión de IL-18, o sus isoformas, muteínas, proteínas fusionadas o derivados funcionales, que inhiben la actividad biológica de la IL-18.

Description

Uso de inhibidores de IL-18 para el tratamiento y/o prevención de cardiopatías.

Campo de la invención

La presente invención está comprendida en el campo de las enfermedades cardiovasculares. Más específicamente, se refiere al uso de un inhibidor de IL-18 para el tratamiento y/o prevención de la cardiomiopatía.

Fundamento de la invención

La citoquina interleuquina 18 (IL-18) ha sido descrita inicialmente como un factor de inducción del interferón-\gamma (IFN-\gamma) (Nakamura et al., 1989). Esta leuquina es una señal precoz en el desarrollo de respuestas de células cooperadoras de linfocitos T, de tipo 1 (TH1). La IL-18 actúa junto con IL-12, IL-2, antígenos, mitógenos y, posiblemente, otros factores adicionales, induciendo la producción de IFN-\gamma. La IL-18 intensifica la producción de GM-CSF e IL-2, potencia la proliferación de células T inducidas anti-CD3, y aumenta la mortandad de células mortíferas naturales con mediación de Fas.

Se produce IL-18 madura a partir de su precursor mediante la enzima de conversión de IL-18 (ICE, caspasa-1).

El receptor de la IL-18 consiste en dos componentes, por lo menos, que cooperan en la unión del ligando. Sitios de unión de alta y baja afinidad para la IL-18, fueron descubiertos en células T murinas estimuladas por IL-12 (Yoshimoto et al., 1998), lo que sugiere un complejo de receptor de varias cadenas. Dos subunidades del receptor han sido identificadas hasta la fecha, ambas de las cuales pertenecen a la familia de receptores de la IL-1 (Pamet et al., 1996; Kim et al., 2001). La transducción de la señal de la IL-18 implica la activación de NF-\kappaB (DiDonato et al., 1997). El complejo de receptores de la IL-18 consiste en dos cadenas de receptores: una cadena de unión del ligando, denominada la cadena IL-18R\alpha, y una cadena de transducción de la señal, denominada la cadena IL-18R\beta. La cadena de IL-18R fue aislada inicialmente como una proteína de la superficie celular que se une a IL-18 radiomarcada; la proteína ha sido purificada y su secuencia de aminoácidos ha revelado identidad con un receptor orfón anteriormente indicado que se denomina la proteína relacionada con el IL-1R (IL-1Rrp) (Torigoe et al., 1997).

Recientemente, ha sido aislada de la orina humana una proteína soluble que posee alta afinidad para la IL-18, y los cDNAs humano y del ratón así como el gen humano han sido clonados (Novick et al., 1999; documento WO 99/09063). La proteína ha sido designada proteína de unión de IL-18 (IL-18BP).

La IL-18BP no es el dominio extracelular de uno de los receptores de IL-18 conocidos, sino una proteína secretada que circula de modo natural. Esta proteína pertenece a una nueva familia de proteínas secretadas, que incluyen, además, diversas proteínas codificadas por Poxvirus (Novick et al., 1999) La IL-18BP urinaria así como recombinante une específicamente la IL-18 con una alta afinidad y modula la afinidad biológica de la IL-18.

El gen de la IL-18BP ha sido localizado en el cromosoma humano 11q13 y no se encontró exón que codifique un dominio transmembranal en una secuencia genómica de 8,3kb. Cuatro variantes o isoformas de corte y empalme de la IL-18BP generadas por corte y empalme alternativo de mRNA han sido encontradas en los seres humanos, hasta la fecha. Estas isoformas han sido designadas IL-18BP a, b, c y d, participando todas ellas del mismo extremo N terminal y diferenciándose en el extremo C terminal (Novick et al., 1999). Estas isoformas varían en su aptitud para fijar IL-18. De las cuatro, las isoformas hIL-18BP a y c son conocidas por tener capacidad de neutralización de la IL-18. La isoforma de la IL-18BP a humana tiene reacción cruzada con la IL-18 murina.

Las enfermedades cardiacas se definen como trastornos que afectan al músculo cardiaco o a los vasos sanguíneos del corazón. (The Merck Manual Home Edition, www.merck.com). Un trastorno vascular es un problema de los vasos sanguíneos tal como mala circulación causada por bloqueo. Las enfermedades cardiacas se denomina también trastornos cardiovasculares.

La enfermedad cardiaca isquémica es una causa común de fallo cardiaco y es la causa más frecuente de muerte en las sociedades occidentales. Esto es debido habitualmente a ateromas en las arterias coronarias. Las lesiones del miocardio incluyen la fibrosis isquémica y el infarto agudo. En condiciones normales la corriente sanguínea en las arterias coronarias está estrechamente equilibrado con las demandas metabólicas del músculo cardiaco. La enfermedad cardiaca isquémica resulta cuando el aporte de sangre se hace insuficiente, debido o bien a que el propio suministro de sangre está perjudicado o bien a que el miocardio se hace hipertrófico y solicita una mayor demanda del suministro de sangre. La corriente sanguínea coronaria es, normalmente, independiente de la presión aórtica. Existe un mecanismo autorregulador eficaz que regula la corriente sanguínea a través del lecho vascular coronario.

Cuando se desarrolla una obstrucción en una arteria coronaria principal, habitualmente debido a aterosclerosis o arteriosclerosis, la corriente sanguínea coronaria es inicialmente preservada, debido a que disminuye la resistencia periférica distal a la obstrucción. Cuando el lumen del vaso está ocluido en más del 75%, se desarrolla isquemia, en particular si la circulación colateral coronaria está desarrollada pobremente.

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El músculo cardiaco es sumamente activo desde el punto de vista metabólico y las mitocondrias constituyen más del 30% del volumen de las fibras individuales. El metabolismo aeróbico es esencial, ya que hay muy pocas reservas de fosfatos de alta energía. La muerte del músculo cardiaco ocurre cuando los niveles de adenosina trifosfato (ATP) en el tejido son muy bajos y cuando ha cesado virtualmente la glicolisis anaeróbica. Como ocurre con otros tejidos, la causa precisa de muerte es incierta, pero los daños letales para el músculo cardiaco están asociados con daño de la membrana y con la entrada súbita de calcio en el citoplasma celular. Después de períodos breves de isquemia el flujo sanguíneo cardiaco puede ser restablecido (reperfusión). Sin embargo, después de un intervalo crítico es imposible la reperfusión, probablemente como resultado de tumefacción de las células endoteliales capilares.

La aterosclerosis explica la gran mayoría de enfermedades de las arterias coronarias. La enfermedad cardiaca isquémica puede ser también el resultado de una baja perfusión arterial coronaria. La apoplejía, en especial como resultado de hemorragia, es una causa frecuente de ello.

Como se ha indicado anteriormente, la enfermedad cardiaca isquémica está causada por un desequilibrio entre el flujo sanguíneo del miocardio y la demanda metabólico del miocardio. El flujo sanguíneo puede resultar disminuido adicionalmente mediante episodios superpuestos tales como vasoespasmo, trombosis, o cambios circulatorios que conducen a hipoperfusión.

La perfusión de las arterias coronarias depende de la diferencia de presión entre el seno ostial (presión aórtica diastólica) y el seno coronario (presión atrial derecha). El flujo sanguíneo coronario resulta reducido durante la sístole debido a efectos Venturi en los orificios coronarios y compresión de las arterias intramusculares durante la contracción ventricular. Los factores que reducen el flujo sanguíneo coronario incluyen presión aórtica diastólica disminuida, presión intraventricular aumentada y contracción miocárdica, estenosis de las arterias coronarias, estenósis de la válvula aórtica y regurgitación y presión atrial derecha aumentada.

Con frecuencia se utiliza terapia trombolítica con agentes tales como la estreptoquinasa o el activador del plasminógeno tisular (TPA) para lisar un trombo recién formado. Tal terapia con lisis de los trombos puede restablecer la corriente sanguínea en la mayoría de los casos. Esto ayuda a evitar daño importante para el miocardio, si la actuación es precoz (menos de una hora o así) en el curso de los acontecimientos y puede, por lo menos, reducir el daño posterior.

La angina de pecho es un complejo de síntomas de enfermedad cardiaca isquémica que se caracteriza por ataques paroxísticos de dolor en el pecho, habitualmente subesternal o precordial. Está ocasionada por isquemia miocárdica que se produce poco después de inducción del infarto. Puede ocurrir la muerte cardiaca súbita, que es la muerte inesperada procedente de causas cardiacas, habitualmente dentro de una hora después de un episodio cardiaco o sin la iniciación de síntomas. Es la causa de muerte de 300.000-400.000 personas al año.

Otras formas de enfermedad cardiaca incluyen la cardiomiopatía alcohólica, el prolapso de la válvula aórtica, la estenosis de la válvula aórtica, las arritmias, el choque cardiogénico, la enfermedad cardiaca congénita, la cardiomiopatía dilatada, el ataque cardiaco, el fallo cardiaco, la tumoración cardiaca, la estenosis pulmonar de las válvulas cardiacas, la cardiomiopatía hipertrófica, la cardiomiopatía idiopática, la enfermedad cardiaca isquémica, la cardiomiopatía isquémica, la regurgitación mitral, el prolapso de la válvula mitral, la cardiomiopatía periparto y la angina estable.

El infarto de miocardio es una forma adicional de la enfermedad cardiaca isquémica. La patogénesis puede incluir el trombo intracoronario oclusivo, es decir, un trombo que descansa sobre una placa estenótica ulcerada o fisurada. Los trombos intracoronarios oclusivos causan el 90% de los infartos de miocardio agudos transmurales. Puede haber vasoespamos con o sin aterosclerosis coronaria y posible asociación con la agregación de plaquetas. También pueden estar presentes embolias en los infartos de miocardio.

El aspecto morfológico grosero de un infarto de miocardio puede variar. El infarto transmural implica el grosor total de la pared ventricular izquierda, desde el endocardio al epicardio. El infarto subendocardiaco implica zonas multifocales de necrosis confinadas al 1/3-1/2l interno de la pared ventricular izquierda. Las complicaciones de los infartos de miocardio pueden incluir arritmias y defectos de conducción, con posible "muerte súbita", extensión del infarto o nuevo infarto, fallo cardiaco congestivo (edema pulmonar), choque cardiogénico, pericarditis, trombosis mural, con posible embolización, rotura de la pared del miocardio, con posible taponamiento, rotura de los músculos papilares, con posible insuficiencia valvular, y formación de aneurismas ventriculares.

El infarto de miocardio (MI) se define como una necrosis isquémica del miocardio que resulta habitualmente de una disminución abrupta del flujo sanguíneo coronario a un segmento del miocardio.

En >90% de los pacientes con MI agudo, un trombo agudo, con frecuencia asociado con rotura de placa, ocluye la arteria (previamente obstruida parcialmente por una placa aterosclerótica) que suministra a la zona dañada. La función plaquetaria alterada, inducida por cambio endotelial de la placa aterosclerótica, contribuye presumiblemente a la trombogénesis. Ocurre trombolisis espontánea en aproximadamente 2/3 de los pacientes por lo que 24 horas más tarde, se encuentra oclusión trombótica en solo un 30%, aproximadamente.

El infarto de miocardio es causado frecuentemente por embolización arterial (por ejemplo, estenosis mitral o aórtica, endocarditis infectiva y endocarditis marántica). Se ha indicado infarto de miocardio en pacientes con espasmo coronario y de otro modo, arterias coronarias normales. La cocaína ocasiona espasmo arterial coronario intenso y los usuarios de ella pueden presentar angina o infarto de miocardio inducidos por la cocaína. Estudios de autopsias y de angiografías coronarias han puesto de manifiesto que trombosis coronaria inducida por cocaína puede tener lugar en arterias coronarias normales o estar sobrepuestas sobre ateromas preexistentes.

El infarto de miocardio es, predominantemente, una enfermedad del ventrículo izquierdo, pero el daño puede extenderse al ventrículo derecho (RV) o al atrio. El infarto del ventrículo derecho resulta, habitualmente, de oclusión de la arteria coronaria derecha o de una arteria circunfleja izquierda dominante, y está caracterizado por alta presión de llenado del ventrículo derecho, con frecuencia con regurgitación grave de la válvula tricúspide y rendimiento cardiaco reducido. Algún grado de disfunción del ventrículo derecho ocurre en aproximadamente la mitad de los pacientes con un infarto inferior-posterior, produciendo anomalía hemodinámica en el 10 a 15%.

La capacidad del corazón para continuar funcionando como una bomba está directamente relacionada con la extensión del daño del miocardio.

Los infartos transmurales implican el grosor total del miocardio, desde el epicardio al endocardio, y están caracterizados, habitualmente, por ondas Q anormales en los ECG. Los infartos no transmurales o subendocardiacos no se extienden a través de la pared ventricular y solamente causan anomalías del segmento ST y de las ondas T. Los infartos subendocardiacos implican, habitualmente, el tercio interior del miocardio donde la tensión de la pared es máxima y la corriente sanguínea del miocardio es la más vulnerable a los cambios circulatorios. También pueden seguir a una hipotensión prolongada. Debido a que la profundidad transmural de necrosis no puede ser determinada con precisión clínicamente, los infartos son mejor clasificados mediante la ECG como onda Q y onda no Q. El volumen de miocardio destruido puede ser estimado por la extensión y duración de la elevación de CK.

La cardiomiopatía isquémica es otra enfermedad dentro de la enfermedad cardiaca isquémica. En esta condición, puede existir infarto de miocardio previo, pero la enfermedad resulta de aterosclerosis coronaria grave que implica todas las ramas principales. El resultado es un suministro vascular inadecuado, que conduce a pérdida de miocitos. La pérdida de miocitos asociada con fibrosis en la forma de deposición de colágeno intersticial, da por resultado un consentimiento disminuido que junto con la dilatación cardiaca acompañante, da por resultado una sobrecarga de los miocitos remanentes. Esto mantiene el proceso en marcha, con compensación por hipertrofia de los miocitos que continúan. Puede haber incluso compensación por medio de hiperplasia así como también hipertrofia, lo que puede explicar el enorme tamaño (2 a 3 veces el tamaño normal) del corazón que resulta. Finalmente, el corazón no puede compensar por más tiempo, y se origina el fallo cardiaco que sigue con arritmias y/o episodios isquémicos. Así pues, clínicamente, hay fallo cardiaco progresivo, lento, con o sin historia previa de un infarto de miocardio o dolor anginoso. La cardiomiopatía isquémica es responsable de tanto como el 40% de la mortalidad producida por la enfermedad cardiaca isquémica.

Durante la isquemia así como también la reperfusión del corazón, se producen numerosos mediadores endógenos, tales como segundos mensajeros de moléculas pequeñas. que afectan a la función del miocardio. Al cabo de minutos de un episodio isquémico, la fuerza de contracción del miocardio disminuye y la recuperación general de la fuerza de contracción depende en gran medida de la duración del período isquémico (Daemen et al., 1999). Por ejemplo, durante un episodio isquémico, la homeostasis del Ca^{+2} resulta perturbada, se generan radicales libres derivados del oxigeno y síntesis de óxido nítrico (NO) y tiene lugar liberación. Además, hay también producción local de citoquinas, en particular TNF\alpha e IL-1\beta (Bolli, 1990). En el corazón intacto, estas citoquinas contribuyen a la disfunción miocardiaca inducida por isquemia, por inducir expresión génica de NO sintasa inducible (iNOS) (Daemen et al., 1999), ciclooxigenasa-2) y fosfolipasa A2 así como moléculas de adhesión vascular y diversas quimioquinas. Como resultado de ello, hay una depresión inmediata de la fuerza de contracción del miocardio mediada por mensajeros de moléculas pequeñas, seguido de infiltración de neutrófilos con mediación de citoquinas, que dañan, además, el músculo cardiaco. Corazones de animales estudiados en ausencia de sangre o de productos sanguíneos, elaboran TNF\alpha (Herskowitz et al., 1995) e IL-1\beta durante un enfrentamiento isquémico. Los cardiomiocitos pierden también fuerza de contracción debido a la acción de estas citoquinas endógenas (Meldrum et al., 1998).

La mayor parte de los datos experimentales que conciernen a la disfunción miocárdica que cursa con mediación del TNF\alpha e IL-1\beta han sido obtenidos de estudios realizados en animales. Sin embargo, tejidos de miocardio humano obtenidos de pacientes sometidos a procedimientos electivos de "bypass" cardiopulmonar, han sido estudiados en condiciones controladas, ex vivo (Gurevitch et al., 1996; Cleveland et al., 1997). En este modelo experimental, trabéculas atriales humanas se suspenden en un baño de solución tampón fisiológicamente oxigenado, sin sangre, y luego se exponen a un episodio de isquemia simulada. Durante este tiempo, la fuerza de contracción disminuye espectacularmente; cuando el tejido vuelve a exponerse al oxígeno, la fuerza de contracción retorna pero está disminuida (reducción del 60-70%) y se observa evidencia de daño miocárdico por liberación de creatina quinasa (CK) (Gurevitch et al., 1996; Cleveland et al., 1997). Cuando la bioactividad del TNF es neutralizada específicamente durante la isquemia/reperfusión (I/R), se observa un mayor retorno de la fuerza de contracción lo que sugiere que la actividad del TNF miocárdico endógeno contribuye a la disfunción contráctil inducida por el episodio isquémico (Cain et al., 1999).

Daemen et al., (1999) han estudiado el daño tisular producido como consecuencia de isquemia, seguida de reperfusión, empleando un modelo murino de isquemia renal. Estos investigadores han indicado que la regulación al alza del mRNA de IL-18 renal coincidía con la activación de las caspasa-1 el día 1 que sigue a la isquemia. El mRNA de IFN-\gamma e IL-12 habían sido seguidamente regulados al alza el día 6 después de la isquemia. Combinada, pero no separada, la neutralización in vivo del IFN-\gamma que induce las citoquinas IL-12 e IL-18 redujo la regulación al alza de MHC de clase I y II dependiente del IFN-gamma en una extensión similar a la de la neutralización del IFN-\gamma.

Inhibidores de la IL-18 y su implicación en enfermedades han sido descritos en la técnica anterior.

Por ejemplo, el documento WO 98/24804 describe inhibidores de la enzima de conversión de la interleuquina-1\beta (ICE). Este documento indica, además, que la ICE puede desempeñar un papel importante en la muerte celular programada o apoptosis, y que una aplicación terapéutica de inhibición de la apoptosis puede incluir el tratamiento del infarto de miocardio.

El documento WO 01/58956 describe anticuerpos anti-IL-18. Entre muchos diferentes usos terapéuticos hipotéticos diferentes de estos anticuerpos, se mencionan el fallo cardiaco, el infarto de miocardio y la cardiomiopatía.

El documento WO 01/85201 se refiere al uso de inhibidores de la IL-18 en la aterosclerosis.

Seta et al., Heart 2000; 84: 668-669 describen la implicación de IL-18 en el infarto de miocardio agudo y sugieren que la IL-18 es un marcador del daño cardiaco en pacientes con infarto agudo de miocardio.

El documento WO 01/03719 describe la osteoprotegerina, un miembro de la superfamilia de receptores del factor de la necrosis tumoral y su implicación en la regulación del metabolismo óseo. Este documento se refiere también a la terapia de combinación con diversos compuestos, entre los que se citan los inhibidores de la IL-18 y los inhibidores del TNF. No se mencionan en este documento enfermedades cardiacas.

No obstante, no se ha descrito que la IL-18 desempeñe un papel en la cardiomiopatía.

Sumario de la invención

La invención está basada en el descubrimiento de que un inhibidor de la IL-18 mejoraba sustancialmente la función de contracción del corazón en un modelo de isquemia/reperfusión de miocardio atrial humano suprafusionado. La inhibición de la caspasa-1 (ICE) atenuaba también la depresión de la fuerza de contracción después de isquemia y reperfusión.

Además, la administración de un inhibidor de la IL-18 en un modelo murino de infarto de miocardio dio por resultado una supervivencia potenciada y una mejora importante de la función ventricular.

Estos estudios demuestran que los inhibidores de la IL-18 son adecuados para el tratamiento o prevención de la disfunción miocárdica.

La presente invención se refiere, por consiguiente, al uso de un inhibidor de la IL-18 para fabricar un medicamento para el tratamiento y/o prevención de la cardiomiopatía.

Con objeto de aplicar un enfoque terapéutico genético para liberar el inhibidor de la IL-18 al tejido o célula enfermo, la invención se refiere, además, al uso de un vector de expresión que comprende la secuencia codificante de un inhibidor de la IL-18 para el tratamiento y/o prevención de la cardiomiopatía.

Descripción breve de los dibujos

Fig. 1 muestra el efecto de la IL-18BP sobre la disfunción contráctil del miocardio inducida por isquemia.

(A)

Respuesta cinética a daño isquémico. Después de equilibrar (eq,), trabéculas testigo fueron suprafusionadas bajo condiciones de normoxia a lo largo de todo el experimento. Las trabéculas fueron sometidas a isquemia/reperfusión en ausencia o presencia de IL-18BP (5 \mug/ml). El eje vertical indica el tanto por ciento de fuerza desarrollada comparada con la iniciación del experimento (tiempo cero). Los datos han sido derivados de trabéculas de un paciente único y son representativas de los métodos usados para calcular el cambio medio en la fuerza desarrollada, a los 90 minutos.

(B)

Fuerza post-isquémica desarrollada después de la neutralización de la IL-18 con 1 ó 5 \mug/ml de IL-18.BP. Los resultados están expresados como cambios medios en tanto por ciento de la fuerza desarrollada con relación al testigo una vez completada la reperfusión (90 minutos). Los números entre paréntesis indican IL-18BP en \mug/ml. N=6. * p<0,01 en comparación con I/R (isquemia/reperfusión).

Fig. 2: muestra el contenido de proteína de la IL-18 miocárdica. Se homogeneizaron trabéculas después de 90 minutos de suprafusión en condiciones de normoxia (testigo) o 45 minutos después de 30 minutos de isquemia (I/R). Las trabéculas procedentes de los mismos sujetos fueron equilibradas. Los niveles de IL-18 están indicados sobre el eje vertical en pg/ml. N=4. * p<0,01.

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Fig. 3: muestra los niveles de mRNA de IL-18 e IL-18BP en estado estacionario, en tejido atrial testigo e isquémico. Los niveles de mRNA de IL-18 e IL-18BP fueron determinados mediante RT-PCR. Los datos indicados proceden de uno de dos sujetos evaluados. A muestra el gel de agarosa teñido con bromuro de etidio, en el que los productos de la PCR fueron separados, y B muestra los resultados de la cuantificación de la cantidad de producto de la PCR como cambio, veces, respecto al testigo (GAPDH).

Fig. 4: muestra el efecto de inhibición del ICE sobre la fuerza post-isquémica desarrollada. Los resultados están expresados como cambio medio, en tanto por ciento, de la fuerza desarrollada con respecto al testigo después de isquemia/reperfusión (I/R). Los números entre paréntesis indican la concentración de ICEi en \mug/ml. N=7. *p<0,01 comparada con la I/R.

Fig. 5: muestra la actividad de creatina quinasa (CK) tisular que sigue a la I/R. La CK es expresada en unidades de actividad por miligramo de peso de tejido húmedo. Las condiciones experimentales están indicadas bajo el eje horizontal. Testigo e I/R, N=6; IL-18BP (5 \mug/ml). N=5; ICEi (10 y 20 \mug/ml), N=5 cada; * p<0,05 comparado con I/R.

Fig. 6: muestra el cambio medio de la fuerza desarrollada con relación a la fuerza desarrollada después del período de equilibrio, fijada en el 100% (n=5), de las trabéculas incubadas con 10 \mug/ml durante 15 minutos, antes de la adición de TNF\alpha (1 ng/ml). El TNF\alpha y la IL-18BP se añadieron en cada cambio de baño.

Fig. 7: muestra la respuesta temporal de trabéculas atriales humanas a IL-18 en condiciones de normoxia. Se añadió IL-18 madura (100 ng/ml) a trabéculas atriales a todo lo largo del período experimental de 90 minutos. El eje vertical indica el cambio medio en tanto por ciento desde la fuerza desarrollada de la línea de base. La línea de base se determinó al final del período de equilibrio (no indicado). (n=6). * P < 0,05, ** P < 0,001 en comparación con el testigo en el mismo intervalo y para el resto del período experimental.

Fig. 8: muestra la preservación de actividad de la creatina quinasa tisular miocelular después de exposición a I/R, TNF\alpha (1 ng/ml) y TNF\alpha (10 ng/ml)+ IL-18BP. La actividad de CK está expresada en unidades de actividad de CK por miligramo de peso de tejido húmedo. (n=6).

Descripción detallada de la invención

La presente invención está basada en el descubrimiento de que los inhibidores de la IL-18 ejercen un efecto beneficioso en las enfermedades cardiacas, en particular en las enfermedades cardiacas isquémicas. Como se expone en los ejemplos que figuran más adelante, se pusieron de manifiesto varios inhibidores diferentes de la IL-18 que exhibían un efecto beneficioso importante sobre la fuerza post-isquémica del músculo cardiaco desarrollada.

Además de esto, fue ensayado un inhibidor de la IL-18 en un modelo in vivo de infarto de miocardio que dio por resultado una supervivencia elevada y una función ventricular mejorada significativamente.

La invención, por consiguiente, se refiere al uso de un inhibidor de la IL-18 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de la cardiomiopatía. La cardiomiopatía es cualquier anomalía estructural o funcional del miocardio ventricular.

El término "prevención", en el contexto de esta invención, se refiere no solamente a una prevención completa de un cierto efecto, sino también a una prevención, parcial o sustancial, de atenuación, reducción, mengua o disminución del efecto antes o en los primeros momentos de iniciación de la enfermedad.

El término "tratamiento", en el contexto de esta invención, se refiere a cualquier efecto beneficioso sobre la progresión de la enfermedad, incluyendo atenuación, reducción, mengua o disminución del desarrollo patológico después del comienzo de la enfermedad.

La expresión "inhibidor de IL-18", en el contexto de esta invención, se refiere a cualquier molécula que modula la producción y/o acción de IL-18, de tal modo que la producción y/o la acción de la IL-18 resulta atenuada, reducida o parcial, sustancial o completamente evitada o bloqueada.

Los inhibidores de la acción de la IL-18 pueden ser anticuerpos de la IL-18 tales como anticuerpos policlonales o monoclonales.

En la presente invención, el inhibidor de IL-18 está seleccionado entre inhibidores de la caspasa-1 (ICE), anticuerpos dirigidos contra la IL-18, anticuerpos dirigidos contra cualquiera de las subunidades del receptor de la IL-18 y proteínas de unión de IL-18, isoformas, muteínas, proteínas fusionadas, o sus derivados funcionales, que inhiben la actividad biológica de la IL-18

La expresión "proteínas de unión de IL-18" se usa en esta memoria como sinónimo de "proteína de unión de IL-18" ó "IL18BP". Esta expresión comprende proteínas de unión de IL-18 según se define en el documento WO 99/09063 o como ha sido definido por Norvick et al., 1999, incluyendo variantes de corte y empalme y/o isoformas de proteínas de unión de IL-18, según ha sido definido por Kim et al., 2000, que se unen a IL-18. En particular son útiles según la presente invención, las isoformas a y c humanas de la IL-18BP. Las proteínas útiles según la presente invención, pueden estar glicosiladas o no glicosiladas, pueden derivar de fuentes naturales, tales como la orina, o pueden ser producidas, de preferencia, recombinantemente. La expresión recombinante puede ser llevada a cabo en sistemas de expresión procarióticos tales como E. coli, o en sistemas de expresión eucarióticos, y preferiblemente, en sistemas de expresión de mamíferos.

Tal como se usa en esta memoria, el término "muteínas" se refiere a análogos de una IL-18BP, o análogos de una IL-18BP viral, en los que uno o más de los restos de aminoácidos de una IL-18BP natural o IL-18BP viral han sido reemplazados por restos de aminoácidos diferentes, o están suprimidos, o uno o más restos de aminoácidos han sido añadidos a la secuencia natural de una IL-18BP, o una IL-18BP viral, sin cambiar considerablemente la actividad de los productos que resultan en comparación con la de IL-18BP o IL-18BP, de tipo salvaje. Estas muteínas se preparan mediante síntesis conocidas y/o técnicas de mutagénesis dirigida al sitio, o cualquier otra técnica conocida adecuada para ello.

Las muteínas, según la presente invención, incluyen proteínas codificadas por un ácido nucleico, tal como DNA o RNA, que se hibrida con DNA o RNA, que codifica una IL-18BP o que codifica una IL-18BP viral, según la presente invención, en condiciones restrictivas. La expresión "condiciones restrictivas" se refieren a las condiciones de hibridación y lavado subsiguiente, que los expertos en la técnica indican como "restrictiva". Véanse Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, referencia bibliografía anterior, Interscience, N.Y., 6,3 y 6,4 (1987, 1992), y Sambrook et al., referencia bibliográfica anterior. Sin limitación, los ejemplos de condiciones restrictivas incluyen condiciones de lavado 12-20ºC por debajo de la Tm calculada del híbrido en estudio en, por ejemplo, 2 x SSC y SDS al 0,5% durante 5 minutos, 2 x SSC y SDS al 0,1% durante 15 minutos; 0,1 x SSC y SDS al 0,5% a 37ºC durante 30-60 minutos y luego una 0,1 x SSC y SDS al 0,5% a 68ºC durante 30-60 minutos. Los expertos en la técnica comprenderán que las condiciones restrictivas dependen también de la longitud de las secuencias de DNA, sondas de oligonucleótidos (tales como 10-40 bases) o sondas de oligonucleótidos mixtas. Si se usan sondas mixtas, es preferible usar cloruro de tetrametilamonio (TMAC) en lugar de SSC. Véase Ausubel, referencia bibliográfica anterior.

Cualquier muteína tal posee una secuencia de aminoácidos suficientemente duplicativa de la de una IL-18BP, o suficientemente duplicativa de una IL-18BP viral, tal que tiene una actividad comparable con la de la IL-18BP. Una actividad de la IL-18BP es su capacidad de fijación de IL-18. En tanto la muteína posea una actividad sustancial de unión a la IL-18, podrá ser usada en la purificación de IL-18, por ejemplo mediante cromatografía de afinidad, y por tanto podrá considerarse que posee una actividad sustancialmente similar a la de la IL-18BP. Por consiguiente, puede determinarse si una muteína dada posee sustancialmente la misma actividad que la IL-18BP por medio de experimentación rutinaria, que comprende someter una muteína tal, por ejemplo, a un ensayo sencillo de competición de "sandwich" para determinar si se une o no a una IL-18 apropiadamente marcada, tal como un radioinmunoensayo o un ensayo ELISA.

En una realización preferida, cualquiera de tales muteínas posee por lo menos un 40% de identidad u homología con la secuencia de o bien una IL-18BP o un homólogo de IL-18BP codificado viralmente, según se define en el documento WO 99/09063. Más preferiblemente, posee por lo menos 50%, por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80% ó, lo más preferible, por lo menos 90%, de identidad u homología con ellas.

Las muteínas de polipéptidos de la IL-18BP o las muteínas de IL-18BPs virales que pueden usarse según la presente invención, o el ácido nucleico que codifican, incluyen un conjunto finito de secuencias que se corresponden sustancialmente como péptidos o polinucleótidos de sustitución que pueden obtenerse rutinariamente por cualquier experto en la técnica, sin experimentación indebida, basándose en las enseñanzas y guía que se presentan en esta memoria.

Los cambios preferidos para las muteínas según la presente invención, son los que se conocen como sustituciones "conservativas". Las sustituciones conservativas de aminoácidos de polipéptidos o proteínas de IL-18BP o IL-18BPs virales, pueden incluir aminoácidos sinónimos comprendidos dentro de un grupo, que poseen propiedades fisicoquímicas suficientemente similares de tal modo que la sustitución entre miembros del grupo puede preservar la función biológica de la molécula (Grantham, 1974). Esta claro que también pueden llevarse a cabo inserciones y deleciones de aminoácidos en las secuencias anteriormente definidas sin alterar su función, en particular si las inserciones o deleciones solamente implican unos pocos aminoácidos, por ejemplo, menos de treinta y, preferiblemente, menos de diez, y no remueven ni desplazan aminoácidos que son críticos para una conformación funcional, por ejemplo, restos de cisteína. Las proteínas y muteínas producidas por tales deleciones y/o inserciones están comprendidas dentro del alcance de la presente invención.

Preferiblemente, los grupos de aminoácidos sinónimos son los definidos en la Tabla 1. Más preferiblemente los grupos de aminoácidos sinónimos son los definidos en la Tabla 2; y, lo más preferible, los grupos de aminoácidos sinónimos son los definidos en la Tabla 3.

TABLA 1 Grupos preferidos de aminoácidos sinónimos

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TABLA 2 Grupos más preferidos de aminoácidos sinónimos

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TABLA 3 Los grupos más preferidos de aminoácidos sinónimos

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Ejemplos de producción de sustituciones de aminoácidos en proteínas, que pueden usarse para obtener muteínas de polipéptidos o proteínas de IL-18BP, o muteínas de IL-18BPs virales, para usar en la presente invención, incluyen cualesquiera etapas de métodos conocidos, tales como las presentadas en las patentes de EE.UU. 4.959.314, 4.588.585 y 4.737.462 otorgadas a Mark et al.; 5.116.943 a Koths et al., 4.965.195 a Namen et al.; 4.879.111 a Chong et al.; y 5.017.691 a Lee et al.; y proteínas sustituidas con lisina presentadas en la patente de EE.UU. No. 4.904.584
(Shaw et al.)

La expresión "proteína fusionada" se refiere a un polipéptido que comprende una IL-18BP, o una IL-18BP viral, o una muteína o uno de sus fragmentos, fusionado con otra proteína que, por ejemplo, tiene un tiempo de permanencia prolongado en fluidos corporales. Una IL-18BP o una IL-18BP viral puede, por tanto, fusionarse a otra proteína, polipéptido o semejante, por ejemplo, una inmunoglobulina o uno de sus fragmentos.

"Derivados funcionales" tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a derivados de IL-18BPs o una IL-18BP viral, y sus muteínas y proteínas fusionadas, que pueden prepararse a partir de los grupos funcionales presentes como cadenas laterales sobre los restos o los grupos de los extremos N terminal o C terminal, por medios conocidos en la técnica, y están incluidos en la invención en tanto permanezcan aceptables desde el punto de vista farmacéutico, es decir, no destruyan la actividad de la proteína que es sustancialmente similar a la actividad de la IL-18BP o 18BPs virales, y no comuniquen propiedades tóxicas a las composiciones que les contienen.

Estos derivados pueden incluir, por ejemplo, cadenas laterales del polietilenglicol, que pueden enmascarar sitios antigénicos y prolongar la permanencia en fluidos corporales de una IL-18BP o una IL-18BP viral. Otros derivados incluyen ésteres alifáticos de los grupos carboxilo, amidas de los grupos carboxilo por reacción con amoniaco o con aminas primarias o secundarias, derivados acilados en el N de grupos amino libres de los restos de aminoácidos formados con grupos acilo (por ejemplo, grupos alcanoilo o aroilo carbocíclicos) o derivados acilados en el O de grupos hidroxilo libres (por ejemplo, los de restos serilo o treonilo) formados con grupos acilo.

En otra realización preferida de la inhibición, el inhibidor de la IL-18 es un anticuerpo dirigido contra la IL-18 o su receptor, el IL-18R. Anticuerpos dirigidos a algunas de las subunidades del IL-18R, denominadas IL-18R\alpha y \beta, pueden usarse según la presente invención.

Los anticuerpos según la invención pueden ser policlonales o monoclonales, quiméricos, humanizados o incluso totalmente humanos. Los anticuerpos recombinantes y sus fragmentos se caracterizan por unión de alta afinidad a la IL-18 o IL-18R in vivo, y baja toxicidad. Los anticuerpos que pueden ser usados en la invención están caracterizados por su aptitud para tratar pacientes durante un período de tiempo suficiente para tener una regresión o alivio del estado patógeno o de cualquier síntoma o grupo de síntomas relacionados con el estado patógeno calificado de bueno a excelente, y una toxicidad baja.

Anticuerpos de neutralización son producidos con facilidad en animales tales como conejos, cabras o ratones, por inmunización con IL-18 o IL-18R\alpha ó \beta. Son particularmente útiles los ratones inmunizados para suministrar fuentes de células B para la fabricación de hibridomas, que a su vez son cultivados para producir cantidades grandes de anticuerpos monoclonales anti-IL-18.

Los anticuerpos quiméricos son moléculas de inmunoglobulinas caracterizadas por dos o más segmentos o porciones derivadas de diferentes especies animales. En general, la región variable del anticuerpo quimérico deriva de un anticuerpo de un mamífero no humano, tal como un anticuerpo monoclonal de un murino, y la región constante de la inmunoglobulina deriva de una molécula de una inmunoglobulina humana. Preferiblemente, ambas regiones y la combinación poseen baja inmunogenicidad, según se determina rutinariamente (Elliott et al., 1994). Los anticuerpos humanizados son moléculas de inmunoglobulinas creadas mediante técnicas de ingeniería genética, en las que las regiones constantes murinas han sido reemplazadas con contrapartes humanas, al tiempo que retienen las regiones murinas de unión antigénica. El anticuerpo quimérico ratón-humano que resulta, posee, preferiblemente, en los seres humanos, una inmunogenicidad reducida y características farmacocinéticas mejoradas. (Knight et al., 1993).

Así pues, en otra realización preferida el anticuerpo de la IL-18 o IL-18R es un anticuerpo humanizado. Ejemplos preferidos de anticuerpos anti-IL-18 humanizados están descritos en la Solicitud de Patente Europea EP 0 974 600, por ejemplo.

Todavía, en otra realización preferida, el anticuerpo es totalmente humano. La tecnología para producir anticuerpos humanos está descrita con detalle en los documentos WO 00/76310, WO 99/53049, US 6.162.963 ó AU5336100.

Un método de preparación de anticuerpos totalmente humanos consiste en la "humanización" del sistema inmunitario humoral del ratón, es decir, la producción de cepas de ratón capaces de producir Ig humana (Xenomice), mediante la introducción de locus de inmunoglobulina (Ig) humana en ratones en los que los genes de Ig endógena han sido inactivados. Los loci de Ig son complejos en términos tanto de su estructura física como de la transposición génica y de los procesos de expresión requeridos para producir en último término una respuesta inmunitaria amplia. La diversidad de anticuerpos es generada, principalmente, mediante transposición combinatoria entre diferentes genes V, D y J presentes en los loci de las Ig. Estos loci contienen también los elementos reguladores interdispersos, que regulan la expresión de anticuerpos, la exclusión alélica, la conmutación de clases y la maduración de la afinidad. La introducción en ratones de transgenos de Ig humana sin someter a transposición, ha demostrado que la maquinaria de recombinación en el ratón es compatible con genes humanos. Además, los hibridomas que secretan hu-mAbs de diversos isotipos, específicos, antigénicos, pueden ser obtenidos mediante inmunización por Xenomice con un antígeno.

Anticuerpos totalmente humanos y métodos para su producción son conocidos en la técnica (Mendez et al., (1997); Buggemann et al (1991); Tomizuka et al., (2000) Patente WO 98/24893).

En una realización de la invención altamente preferida, el inhibidor de la IL-18 es una IL-18BP o una isoforma, una muteína, una proteína fusionada o un derivado funcional de la misma. Estas isoformas, muteínas, proteínas fusionadas o derivados funcionales, retienen la actividad biológica de la IL-18BP, en particular la unión a IL-18 y, de preferencia, poseen esencialmente al menos una actividad similar a la de la IL-18BP. Idealmente, tales proteína tienen una actividad biológica potenciada en comparación con la de la IL-18BP sin modificar.

Las secuencias de la IL-18BP y sus variantes/isoformas de corte y empalme pueden ser tomadas del documento WO 99/09063 o del trabajo de Norvick et al., 1999, así como de la publicación de Kim et al., 2000.

Los derivados funcionales de la IL-18BP pueden conjugarse a polímeros con objeto de mejorar propiedades de la proteína, tales como la estabilidad, la semivida, la biodisponibilidad, la tolerancia por el cuerpo humano, o la inmunogenicidad. Para conseguir este objetivo, la IL-18BP puede ser ligada, por ejemplo, a polietilenglicol (PEG). La ligadura con PEG puede llevarse a cabo mediante métodos conocidos, descritos, por ejemplo, en el documento WO 92/13095.

Por consiguiente, en una realización preferida de la presente invención, los inhibidores de IL-18 y en particular la IL-18BP, están ligados a PEG.

En otra realización preferida de la invención, el inhibidor de IL-18 comprende una fusión de inmunoglobulinas, es decir, el inhibidor de IL-18 es una proteína fusionada que comprende la totalidad o parte de una proteína de unión de IL-18, que está fusionada a toda o una parte de una inmunoglobulina. Métodos de preparación de proteínas de fusión de inmunoglobulinas son bien conocidos en la técnica, tales como los descritos en el documento WO 01/03737, por ejemplo. Los expertos en la técnica podrán comprender que la proteína de fusión de la invención que resulta, retiene la actividad biológica de la IL-18BP, en particular la unión a la IL-18. La fusión puede ser directa o por medio de un péptido corto de engarce que puede ser tan corto como de 1 a 3 restos de aminoácidos de longitud o más largo, por ejemplo una longitud de 13 a 20 aminoácidos. Dicho engarce puede ser un tripéptido de la secuencia E-F-M (Glu-Phe-Met), por ejemplo, o una secuencia de engarce de 13 aminoácidos que comprende Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met introducida entre la secuencia de la IL-18BP y la secuencia de la inmunoglobulina. La proteína de fusión que resulta posee propiedades mejoradas, tales como un tiempo de permanencia prolongado en los fluidos del cuerpo (semivida), una actividad específica aumentada, o un nivel de expresión aumentado, o está facilitada la purificación de la proteína de fusión.

En una realización preferida, la IL-18BP está fusionada a la región constante de una molécula de Ig. Preferiblemente, está fusionada a las regiones de la cadena pesada, tales como los dominios CH2 y CH3 de la IgG1 humana, por ejemplo. La generación de proteínas de fusión específicas que comprenden IL-18BP y una parte de una inmunoglobulina, está descrita en el ejemplo 11 del documento WO 99/09063, por ejemplo. Otras isoformas de moléculas de IgG son adecuadas asimismo para generar proteínas de fusión según la presente invención, tales como las isoformas IgG_{2} ó IgG_{4}, u otras clases de Ig, tales como IgM ó IgA, por ejemplo. Las proteínas de fusión pueden ser monoméricas o multiméricas, hetero- u homomultiméricas.

Todavía en otra realización de la invención, se usa un inhibidor de la IL-18 en combinación con un antagonista del TNF. Los antagonistas del TNF ejercen su actividad de varios modos. En primer lugar, los antagonistas pueden unirse a la propia molécula de TNF o secuestrarla, con suficiente afinidad y especificidad para neutralizar parcial o sustancialmente el epítopo o epitópos del TNF responsables de la unión del receptor del TNF (denominados en lo sucesivo "antagonistas secuestrantes"). Un antagonista secuestrante puede ser, por ejemplo, un anticuerpo dirigido contra el TNF.

Alternativamente, los antagonistas del TNF pueden inhibir el camino de señalización del TNF activado por el receptor de la superficie celular después de la unión del TNF (denominados en lo sucesivo "antagonistas de señalización"). Ambos grupos de antagonistas son útiles tanto aislados o juntos, en mezcla con un inhibidor de la IL-18, en el tratamiento terapéutico o en la prevención de enfermedades cardiacas.

Los antagonistas del TNF son identificados y evaluados con facilidad mediante exploración de rutina de candidatos a ellos, por sus efectos sobre la actividad del TNF nativo sobre líneas celulares susceptibles, in vitro, por ejemplo células B humanas, en las que el TNF ocasiona proliferación y secreción de inmunoglobulinas. El ensayo contiene formulación de TNF en diluciones variables del antagonista candidato, por ejemplo, desde 0,1 a 100 veces la cantidad molar de TNF usada en el ensayo, y testigos sin TNF o solamente antagonista (Tucci et al., 1992).

Los antagonistas secuestrantes son los antagonistas del TNF preferidos para ser usados según la presente invención. Entre los antagonistas secuestrantes son preferidos los polipéptidos que fijan TNF con alta afinidad y que poseen inmunogenicidad baja. Son particularmente preferidas las moléculas solubles del receptor del TNF y los anticuerpos neutralizantes del TNF. Por ejemplo, son útiles en la presente invención el TNF-RI y el TNF-RII solubles. Son más particularmente preferidas según la presente invención, las formas truncadas de estos receptores que comprenden los dominios extracelulares de los receptores o partes funcionales de los mismos. Receptores de TNF de tipo I y tipo II, solubles, truncados, están descritos, por ejemplo, en el documento EP914431.

Las formas truncadas de los receptores del TNF son solubles y han sido detectadas en la orina y el suero como proteínas de unión inhibidoras del TNF de 30 kDa y 40 kDa, denominadas respectivamente TBPI y TBPII (Engelmann et al., 1990). El uso simultáneo, secuencial o separado del inhibidor de IL-18 con el antagonista del TNF, es preferido según la invención.

En otra realización preferida, el TNF-RI(TBPI) soluble, humano, es el antagonista del TNF para ser usado según la invención. Las moléculas del receptor del TNF soluble, natural y recombinante, y métodos para su producción, se han descrito en las Patentes Europeas EP 308 378, EP 398 327 y EP 433 900.

Derivados, fragmentos, regiones y partes biológicamente activas de las moléculas del receptor, que se asemejan en funcionalidad a las moléculas del receptor, pueden usarse también en la presente invención. Tales equivalentes o derivados biológicamente activos de la molécula del receptor hacen referencia a la parte del polipéptido, o de la secuencia que codifica la molécula del receptor, que tiene un tamaño suficiente y es capaz de fijar el TNF con una afinidad tal que la interacción con el receptor del TNF unido a la membrana es inhibida o bloqueada.

El inhibidor de IL-18 puede ser usado simultánea, secuencial o separadamente con el inhibidor del TNF.

Según la presente invención, el medicamento puede comprender además agentes conocidos que se usan para el tratamiento de enfermedades cardiacas, tales como nitratos, por ejemplo, nitroglicerina, diuréticos, inhibidores de ACE, digitálicos, beta-bloqueantes o bloqueantes del calcio, en mezcla con un inhibidor de la IL-18. Los componentes activos pueden usarse simultánea, secuencial o separadamente.

En otra realización preferida de la presente invención, el inhibidor de la IL-18 se usa en una cantidad de 0,001 a 100 mg/kg, aproximadamente, o 1 a 10 mg/kg ó 2 a 5 mg/kg, aproximadamente

El inhibidor de la IL-18 según la invención se administra, de preferencia, sistémicamente, y de preferencia, por vía subcutánea o intramuscular.

La invención se refiere, además, al uso de un vector de expresión que comprende la secuencia codificante de un inhibidor de la IL-18 seleccionado entre anticuerpos contra la IL-18, anticuerpos contra cualquiera de las subunidades del receptor de la IL-18, y proteínas de unión de la IL-18, o sus isoformas, muteínas y proteínas fusionadas que inhiben la actividad biológica de la IL-18, para preparar un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de la cardiomiopatía. Por tanto, se considera un enfoque de terapia génica con objeto de suministrar el inhibidor de la IL-18 al sitio en el que es requerido. Con la finalidad de tratar y/o prevenir una enfermedad cardiaca, el vector de la terapia génica que comprende la secuencia de un inhibidor de la IL-18, puede ser inyectado directamente en el tejido enfermo, por ejemplo, evitándose de este modo los problemas implicados con la administración sistémica de vectores de terapia génica, tales como la dilución de los vectores, que alcanzan y hacen blanco en las células o tejidos diana, así como de efectos secundarios.

El uso de un vector para inducir y/o potenciar la producción endógena de un inhibidor de la IL-18 en una célula normalmente silenciosa para expresar un inhibidor de la IL-18, o que expresa cantidades del inhibidor que no son suficientes, en donde el inhibidor de la IL-18 está seleccionado entre proteínas de unión de la IL-18 o sus isoformas que inhiben la actividad biológica de la IL-18, está contemplado también según la invención. El vector puede comprender secuencias reguladoras funcionales en las células deseadas para expresar el inhibidor de IL-18. Tales secuencias reguladoras pueden ser promotoras o potenciadoras, por ejemplo. La secuencia reguladora puede ser introducida luego en el locus correcto del genoma mediante recombinación homóloga, ligando operablemente de este modo la secuencia reguladora con el gen, cuya expresión se requiere que sea inducida o potenciada. A la tecnología se hace referencia habitualmente como "Activación génica endógena" (EGA) y está descrita en el documento WO 91/09955.

Ha de entenderse por los expertos en la técnica que también es posible parar directamente la expresión de la IL-18, sin usar un inhibidor de la IL-18, con la misma técnica. Para hacer esto, un elemento de regulación negativo, tal como, por ejemplo, un elemento de silenciación, puede ser introducido en el locus del gen de IL-18, conduciendo así a una regulación en descenso o a la prevención de la expresión del IL-18. Los expertos en la técnica podrán comprender que tal regulación en descenso o silenciación de la expresión de IL-18 tiene el mismo efecto que el uso de un inhibidor de la IL-18 con el objeto de prevenir y/o tratar la enfermedad.

El inhibidor de la IL-18 para usar según la presente invención puede ser administrado, preferiblemente, en forma de una composición farmacéutica, opcionalmente en mezcla con una cantidad eficaz desde el punto de vista terapéutico de un inhibidor del TNF.

La IL-18BP y sus isoformas, muteínas, proteínas fusionadas, derivados funcionales, fracciones activas o derivados permutados circularmente, según se ha descrito anteriormente, son los ingredientes activos preferidos de las composiciones farmacéuticas.

La definición de "farmacéuticamente aceptable" se entiende que incluye cualquier vehículo, que no interfiere con la eficacia de la actividad biológica del ingrediente activo y que no es tóxico para el hospedante al que se administra. Por ejemplo, para administración parenteral, la proteína o proteínas activas pueden formularse en una forma farmacéutica unitaria de administración para inyección, en vehículos tales como solución salina, solución de dextrosa, albúmina sérica y solución de Ringer.

Los ingredientes activos de la composición farmacéutica según la invención, pueden ser administrados a un individuo de una diversidad de modos. Las vías de administración incluyen las vías intradérmica, transdérmica (por ejemplo, en formulaciones de cesión lenta), intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, oral, intracraneal, epidural, tópica e intranasal. Puede utilizarse cualquier otra vía de administración eficaz desde el punto de vista terapéutico, por ejemplo, absorción a través de tejidos epitelial o endotelial, o mediante terapia génica en la que se administra al paciente una molécula de DNA que codifica el agente activo (por ejemplo, por medio de un vector), lo que hace que el agente activo sea expresado y secretado in vivo. Además, la proteína o proteínas según la invención, pueden ser administradas junto con otros componentes de agentes biológicamente activos tales como tensioactivos, excipientes, vehículos y diluyentes, farmacéuticamente aceptables.

Para administración parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea o intramuscular) la proteína o proteínas activas pueden ser formuladas como una solución, suspensión, emulsión o polvo liofilizado en asociación con un vehículo parenteral farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, agua, solución salina o solución de dextrosa) y aditivos que mantienen la isotonicidad (por ejemplo, manitol) o la estabilidad química (por ejemplo, agentes conservantes y tampones). La formulación se esteriliza mediante las técnicas comúnmente utilizadas para ello.

La biodisponibilidad de la proteína o proteínas activas según la invención, puede mejorarse también usando procedimientos operatorios de conjugación que aumenten la semivida de la molécula en el cuerpo humano, por ejemplo, ligando la molécula a polietilenglicol, según se describe en la Solicitud de Patente PCT WO 92/13095.

Las cantidades terapéuticamente eficaces de la proteína o proteínas activas es función de muchas variables que incluyen el tipo de antagonista, la afinidad del antagonista para la IL-18, cualquier actividad citotóxica residual puesta de manifiesto por los antagonistas, la vía de administración, el estado clínico del paciente (incluyendo el deseo de mantener un nivel no tóxico de actividad de la IL-18 endógena).

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" es tal que cuando se administra, el inhibidor de IL-18 da como resultado la inhibición de la actividad biológica de la IL-18. La dosis administrada a un individuo en forma de una sola dosis o de dosis múltiples, puede variar dependiendo de diversos factores que incluyen las propiedades farmacocinéticas del inhibidor de la IL-18, la vía de administración, el estado y características del paciente (sexo, edad, peso, salud, tamaño), la extensión de los síntomas, los tratamientos concurrentes, la frecuencia de tratamiento y el efecto deseado. El ajuste y manipulación de los intervalos de dosificación establecidos están dentro de la capacidad de los expertos en la técnica así como los métodos in vitro e in vivo para determinar la inhibición de IL-18 en un individuo.

Según la invención, el inhibidor de IL-18 se usa en una cantidad de aproximadamente 0,001 a 100 mg/kg de peso, o aproximadamente 0,1 a 5 mg/kg de peso o aproximadamente 1 a 3 mg/kg de peso o aproximadamente 2 mg/kg de peso.

La vía de administración que se prefiere, según la invención, es la administración por vía subcutánea. La administración intramuscular es, además, preferida según la invención. Con objeto de administrar el inhibidor de IL-18 directamente al lugar de su acción, también se prefiere administrarlo tópicamente.

En otras realizaciones preferidas, el inhibidor de IL-18 se administra diariamente o un día si y otro no.

Las dosis diarias se administran habitualmente en dosis divididas o en forma de cesión prolongada, eficaces para obtener los resultados deseados. Las segundas o subsiguientes administraciones, pueden llevarse a cabo con una dosis que es la misma, menor o mayor que la dosis inicial o previa administrada al individuo. Una segunda o subsiguiente administración puede ser efectuada durante o antes del comienzo de la enfermedad.

Según la invención, el inhibidor de IL-18 puede ser administrado profilácticamente o terapéuticamente a un individuo antes, simultánea o secuencialmente con otros regímenes o agentes terapéuticos (por ejemplo, regímenes de varios fármacos), en una cantidad terapéuticamente eficaz, en particular con un inhibidor del TNF y/u otro agente cardioprotector. Los agentes activos que se administran simultáneamente con otros agentes terapéuticos pueden ser administrados en la misma o en diferentes composiciones.

La invención se refiere, además, a un método de preparación de una composición farmacéutica que comprende mezclar una cantidad eficaz de un inhibidor de la IL-18 y/o un antagonista del TNF, con un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico.

La invención se refiere, además, a un método de tratamiento de una enfermedad cardiaca, que comprende administrar a un paciente necesitado de ello, una cantidad farmacéuticamente eficaz de un inhibidor de la IL-18, opcionalmente en combinación con una cantidad farmacéuticamente eficaz de un antagonista del TNF.

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Ejemplos Ejemplo 1 La inhibición de IL-18 reduce la disfunción isquémica miocárdica in vitro Material y métodos

Reactivos La isoforma IL-18BPa fue expresada con una marca (His)_{6} en el extremo N-terminal, en células de ovario de hámster Chino y purificada hasta homogeneidad. La capacidad de la IL-18BPa-(His)_{6} para neutralizar IL-18 ha sido descrita (Kim et al., 2000). El inhibidor de ICE (ICEI)Ac-Try-Val-Ala-Asp-clorometilcetona (YVAD) fue adquirido de Alexis Biochemicals (San Diego) y solubilizado en DMSO a 10 mg/ml. El ICEi fue diluido en solución de Tyrode antes de ser usado. En células mononucleares de sangre periférica humana, el ICEi reduce la secreción inducida por endotoxina, de IL-1\beta madura en un 92%, medido mediante el ensayo ELISA (Cistron Biotechnology, Pine Brook, NJ).

Trabéculas atriales aisladas Los pacientes sometidos a cirugía electiva de "bypass" de arterias coronarias con un oxigenador de bombeo, requieren la inserción de una cánula en el atrio derecho. En ese momento, un pequeño segmento del apéndice atrial derecho es rutinariamente extirpado y desechado. Se obtuvieron trabéculas procedentes de este tejido desechado. Se colocó tejido atrial humano en solución tampón de Tyrode modificada, oxigenda, a 4ºC. La solución de Tyrode modificada se preparó diariamente con agua destilada desionizada y contenía D-glucosa, 5,0 mmol/litro, CaCl_{2}, 2,0 mmol/litro, NaCl, 118,0 mmol/litro, KCl, 4,0 mmol/litro, MgSO_{4}.7H_{2}O, 1,2 mmol/litro, NaHCO_{3}, 25,0 mmol/litro y NaH_{2}PO_{4}, 1,2 mmol/litro. La solución de Tyrode sin sustrato contenía cloruro de colina, 7 mmol/litro, para mantener la osmolaridad. A menos que se indique de otro modo, los compuestos químicos y los reactivos fueron obtenidos de Sigma. Dos a cuatro trabéculas (4-7 mm de largo y <1,0 mm de diámetro) fueron fijadas a un transductor de fuerza y sumergidas en un baño de 30 ml, caliente (37ºC) de solución de Tyrode modificada; durante la normoxia se hizo burbujear una mezcla de 92,5% de O_{2}/7,5% de CO_{2}. Esta mezcla gaseosa proporcionó una presión parcial de O_{2} de >350 mm de Hg (1 mm de Hg = 133 Pa), una presión parcial de CO_{2} de 36-40 mm de Hg y un pH de 7,35-7,45. Cada uno de estos parámetros fue comprobado rutinariamente con un analizador automatizado de gases en sangre. La temperatura del baño de órganos se mantuvo en 37ºC todo el tiempo del experimento. Durante isquemia simulada, la mezcla gaseosa se cambió a 92,5% de N_{2}/7,5% de CO_{2}. Esta mezcla produjo una presión parcial de O_{2} de <50 mm de Hg. La solución tampón se cambió cada 20 minutos excepto durante el período de 30 minutos de la isquemia simulada.

Diseño experimental Las trabéculas fueron equilibradas durante 90 minutos para aumentar la fuerza de estiramiento de la línea de base a 1.000 mg y permitir la estabilización de la fuerza desarrollada. Las trabéculas que fallaron en la generación de más de 250 mg de fuerza desarrollada fueron excluidas del estudio. Durante los 90 minutos de equilibrado, se efectuó la marcación de pasos (pacing) con electrodos de platino (Radnoti Glass, Monrovia, CA) para la estimulación del campo. Los electrodos fueron colocados sobre cada lado de las trabéculas, estimulados (estimulador Grass SD9, Warwick, RI) con impulsos de 6 ms a un voltaje 20% por encima del umbral, y marcados los pasos en 1 Hz durante la normoxia y en 3 Hz durante la isquemia. Las contracciones fueron monitorizadas mediante transductores de fuerza (Grass, FT03) y registradas con un preamplificador y digitador computerizado (MacLab Quad Bridge, MacLab/8e, AD Instruments, Milford, MA) y monitorizadas continuamente con un ordenador Macintosh.

Después de equilibrar, las trabéculas de un paciente fueron estudiadas bajo tres condiciones experimentales: condiciones testigo que consistían en 90 minutos de suprafusión normóxica; I/R que consistía en 30 minutos de isquemia simulada seguida de 45 minutos de reperfusión; y la tercera condición que consistía en una intervención anticitoquina. En el último caso, la anticitoquina se añadió al baño de suprafusión inmediatamente antes del comienzo de la isquemia y estuvo presente durante los 45 minutos de reperfusión.

Actividad preservada de CK trabecular El final de la actividad de la CK del tejido en reperfusión (90 minutos) se determinó según ha sido descrito (Kaplan et al., 1993). Los tejidos fueron homogeneizados en 100 vol. de solución tampón de extracción, isotónica, enfriada con hielo (Cleveland et al., 1997, Kaplan et al., 1997, Kaplan et al., 1993). El ensayo se llevó a cabo con un kit de CK (Sigma) usando un espectrofotómetro automatizado. Los resultados están presentados como unidades de actividad de CK por mg (peso húmedo del tejido).

Aislamiento de RNA y PCR asociada con transcripción inversa Trabéculas recién obtenidas fueron homogeneizadas en Tri-Reagent (Molecular Research Center, Cincinnati), y se aisló el RNA total por extracción con cloroformo y precipitación con isopropanol. El RNA se solubilizó en agua tratada con pirocarbonato de dietilo, se trató con DNAsa y se cuantificó usando GeneQuant (Amersham Pharmacia Biotech). Métodos de cDNA han sido descritos (Reznikov et al., 2000). Para cada PCR se usó la secuencia siguiente: precalentamiento a 95ºC durante 15 minutos, luego ciclos de 94ºC durante 40 s, 55ºC durante 45 s y 72ºC durante 1 minuto con una fase final de extensión a 72ºC durante 10 minutos. El número óptimo de ciclos se determinó como 35. Han sido indicados los cebadores para la gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (GAPDH) y la IL-18 humana (Reznikov et al., 2000) y para la IL-18BPa humana (Kim et al., 2000). Los productos de la PCR fueron separados sobre un de gel de agarosa al 1,5% que contenía 0,5xTBE (Tris 50 mM/ácido bórico 45 mM/ EDTA 0,5 mM, pH 8,3) con bromuro de etidio a 0,5 mg/ml, se visualizó mediante iluminación UV y se fotografió. Se llevó a cabo una densitometría sobre la imagen negativa (soporte lógico (sofware) IMAGEQUANT, Molecular Dynamics), y la absorbancia relativa de los productos de la PCR de IL-18 e IL-18BP fue corregida frente a la absorbancia obtenida para la GAPDH.

Determinaciones de IL-18 Trabéculas recién obtenidas fueron homogeneizadas según se ha descrito anteriormente para las medidas de CK. La IL-18 se analizó con electroquimiluminiscencia de fase líquida (ECI, Igen, Gaithersburg, MD). mAB de ratón anti-IL-18 humana (R and D Systems) se marcó con rutenio (Igen). Además, anticuerpo de cabra anti-IL-18 humana, (R and D), purificado por afinidad, se marcó con biotina (Igen). El anticuerpo biotinilado se diluyó hasta obtener una concentración final de 1 \mug/ml en PBS (pH 7,4) que contenía BSA al 0,25%, Tween-20 al 0,5% y azida al 0,01% (solución tampón ECL). Por cada tubo de ensayo, 25 \mul del anticuerpo biotinilado fueron preincubados a temperatura ambiente con 25 \mul de bolas paramagnéticas recubiertas con esreptavidina (Dynal, Great Neck, NY) a 1 \mug/\mul durante 30 minutos, agitando fuertemente. Las muestras a ensayar (25 \mul) o patrones, se añadieron a los tubos, seguido de 25 \mul de anticuerpo rutenilado (concentración final, 1 \mug/\mul, diluido en solución tampón ECIL Los tubos fueron agitados luego durante 24 horas. La reacción se apagó mediante la adición de PBS a 200 \mul por tubo y se determinó la quimiluminiscencia con un Analizador Origen (Igen). El límite de detección para la IL-18 es 16 pg/ml.

Tejido atrial humana de microscopía confocal, obtenido durante la inserción de la cánula del oxigenador de bombeo, se colocó en un soporte de plástico 1 cm (Meldrum et al., 1998), se encajó y se congeló en medio de congelación de tejidos (Triangle Biomedical Sciences, Durham, NC) sobre isopentano enfriado con hielo seco. Se cortaron secciones congeladas (5 \mum) sobre un criostato CM 1850 de Leica (Leica, Deerfield, IL). Los cortes fueron fijados durante 10 minutos en paraformaldehído al 4%, secados al aire e incubados durante 20 minutos en PBS suplementado con suero normal de cabra al 10%. Se incubaron secciones en una dilución 1:100 de anticuerpo de conejo anti-IL-18 humana (Peprotech, Rocky Hill, NJ) o IgG de conejo no inmune a 1 \mug/ml como testigo negativo. Los anticuerpos fueron diluidos con PBS que contenía BSA al 1%. Después de incubar durante la noche a 4ºC, las secciones fueron lavadas tres veces con BSA al 0,5% en PBS. Las secciones fueron incubadas luego con un anticuerpo secundario de cabra anti-conejo conjugado a Alexa488 (Molecular Probes) durante 60 minutos, a temperatura ambiente, en oscuridad. Los núcleos fueron teñidos de azul con bisbencimida/Sigma) a 1 \mug/100 ml. Después de la tinción, las secciones fueron lavadas y examinadas con el sistema de exploración de barrido de laser confocal de Leica DM RXA (Leica) y analizadas con el soporte lógico SLIDEBOOK para Macintosh (Intelligent Imaging Innovations, Denver).

Análisis estadístico Los resultados obtenidos son expresados como la media\pmSEM. Los cambios medios de la fuerza desarrollada fueron calculados con relación al valor del testigo (control) a 90 minutos para cada tejido de los pacientes. Se determinaron las significaciones estadísticas de diferencias entre grupos mediante ANOVA factorial con análisis post-hoc de Bonferroni-Dunn. Los análisis estadísticos fueron llevados a cabo con el soporte lógico STAT-VIEW 4.51 (Abacus Concepts, Calabasas, CA).

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Resultados El efecto de neutralización de IL-18 endógena con IL-18BP sobre la fuerza postisquémica desarrollada

La Fig. 1A demuestra la respuesta cinética de las trabéculas a daño de I/R. Se muestran los 15 minutos finales de equilibrio normalizados al 100% al comienzo del período de experimentación. Trabéculas que sirven de testigo son suprafusionadas en condiciones de normoxia durante todo el experimento. Como se pone de manifiesto, existe una reducción (10%) de la fuerza desarrollada en las trabéculas testigo. Las trabéculas sometidas a isquemia exhibían una disminución rápida de la función contráctil; en la reperfusión, la fuerza de contracción retorna a aproximadamente el 25% de la fuerza desarrollada por el testigo. Por el contrario, las trabéculas expuestas a isquemia pero en presencia de IL-18BP volvieron al 55% de la fuerza desarrollada por el testigo. Para determinar la respuesta de I/R de tejidos cardiacos procedentes de varios pacientes, el nivel de fuerza desarrollada en las trabéculas que sirven de testigo a los 90 minutos fue fijado en 100% para todas las muestras de los pacientes, y se calculó el cambio relativo de la fuerza desarrollada, en tanto por ciento, para los grupos experimentales.

Como muestra la Fig. 1B, la fuerza post-isquémica desarrollada en las trabéculas sin tratar (I/R) se redujo a una media del 35% de las trabéculas testigo. Sin embargo, en presencia de IL-18BP, esta reducción se atenuó a un valor medio del 66,2% del testigo, a 1 \mug/ml y al 76% del testigo a 5 \mug/ml, respectivamente. Estos resultados sugieren que la I/R conduce a liberación de IL-18 biológicamente activa después del procesamiento por ICE de la IL-18 precursora endógena. Por consiguiente, la IL-18 se midió en tejido atrial recién obtenido. Como muestra la Fig. 2, IL-18 basal estaba presente en las trabéculas obtenidas antes de la inserción de la cánula del oxigenador de bombeo en el atrio derecho. Al cabo de 90 minutos de equilibrado, 30 minutos de isquemia y 45 minutos de reoxigenación, las trabéculas fueron homogeneizadas y se determinaron los niveles de IL-18. Había un aumento de 4,5 veces de IL-18 en el tejido después de I/R (Fig. 2).

Los niveles de mRNA en estado estacionario para IL-18 e IL-18BP fueron determinados también en estos tejidos. Se observó la expresión génica basal para IL-18 e IL-18BP en los homogeneizados atriales pre-isquémicos recién obtenidos (Fig.3 A, B). De modo semejante al aumento de proteína de IL-18, la I/R indujo un aumento adicional en los niveles de mRNA de la IL-18, en estado estacionario (4,7 veces de aumento). También se observó expresión génica de IL-18BP en tejido atrial recién obtenido y que había aumentado solo modestamente (1,3 veces) después de I/R.

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Ubicación de la IL-18 en el miocardio humano Debido a que proteína de la IL-18, medida mediante ECL, y mRNA de IL.18 están presentes en homogeneizados de miocardio recién obtenidos, se usó tinción histoquímica para determinar la ubicación de la IL-18. Se obtuvo tejido atrial inmediatamente antes de la inserción de la cánula del oxigenador de bombeo y se congeló de repente (no se indica). Se observó IL-18 en los macrófagos miocárdicos residentes y dentro de las células endoteliales vasculares. La IL-18 de los macrófagos y de las células endoteliales está presente antes de que tenga lugar isquemia alguna relacionada con la operación y se encuentra presente en ausencia de contacto con cualquier superficie extraña. La ubicación de la IL-18 en los macrófagos residentes y en las células endoteliales está en consonancia con estudios previos de IL-18 constitutiva, precursora, preformada, en monocitos periféricos humanos recién obtenidos, procedentes de sujetos sanos (Puren et al., 1999). Por tanto, puede llegarse a la conclusión de que existe IL-18 precursora, preformada, en el miocardio de pacientes bajo programas de "bypass" de arterias coronarias, para la enfermedad cardiaca isquémica.

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El efecto de inhibición de ICE sobre la fuerza post-isquémica desarrollada

Debido a que la IL-18BP atenúa eficazmente la disfunción miocardiaca inducida por isquemia, se formuló la hipótesis de que la inhibición de la conversión de IL-18 precursora, preformada, en IL-18 madura, podría atenuar asimismo la disfunción miocárdica inducida por isquemia. Por consiguiente, el YVAD, inhibidor específico de ICE, se añadió al baño de suprafusión antes del comienzo de la isquemia. La inhibición de ICE mediante la adición de YVAD se continuó durante todo el período isquémico y durante la reperfusión. La inhibición de ICE con mediación de YVAD dio por resultado la atenuación de la disfunción miocárdica inducida por isquemia, como se puso de manifiesto mediante la mejora de la función de contracción desde 35% del testigo en I/R hasta el 60%, a 10 \mug/ml, y 75,8% a 20 \mug/ml (Fig. 4). Estos resultados confirman que la IL-18 biológicamente activa existente en el miocardio humano es el resultado de segmentación por ICE de la IL-18 precursora, preformada. Además, estos resultados sugieren que la isquemia miocárdica puede activar ICE latente.

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Preservación de la viabilidad celular

Se emplearon niveles intracelulares de CK para determinar el grado de viabilidad celular después de I/R. En este ensayo, cuanto mayor es el valor de CK mayor es el número de células viables. Cada una de las intervenciones anticitoquina dio por resultado la preservación de la viabilidad celular. Como demuestra la Fig. 5, la inhibición de IL.18BP e ICE (10 y 20 \mug/ml), aumentó los niveles de CK intracelular, después de I/R, desde 1.399 a 5.921, 5.675, 6.624 y 4.662 unidades de actividad de CK por mg (tejido húmedo), respectivamente. Estas observaciones sugieren que la inhibición de la activación de IL-18 inducida por I/R, preserva la viabilidad miocelular en este modelo ex vivo.

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Efecto de la neutralización de la función miocárdica inducida por TNF\alpha

Como muestra La Fig. 6, la fuerza desarrollada (DF) de las trabéculas, se redujo en 18% al cabo de 90 minutos de exposición a TNF\alpha exógeno. La neutralización de la IL-18 endógena sobre la función contráctil del miocardio humano expuesto a TNF\alpha exógeno por incubación con IL-18BP durante diez minutos antes de la adición del TNF\alpha, redujo la magnitud de la caída de la fuerza desarrollada (DF), véase la Fig. 6. Después de 90 minutos, la fuerza desarrollada en el grupo testigo había disminuido en 18%, mientras que en las trabéculas expuestas a TNF\alpha creció 58% en comparación con el control. Sin embargo, en las trabéculas con IL-18BP expuestas a TNF\alpha la fuerza desarrollada había disminuido sólo 30% en comparación con el testigo. Estos resultados sugieren que los efectos directos del TNF\alpha sobre la depresión contráctil miocárdica, están mediados, al menos en parte, por IL-18 endógena, biológicamente activa.

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Efecto de IL-18 exógena sobre la fuerza desarrollada

Seguidamente, se determinó el efecto directo de IL-18 exógena sobre la función contráctil del miocardio. Se añadió IL-18 a trabéculas suprafusionadas al cabo de 90 minutos de equilibrio y con cada uno de los cambios de baño. Como muestra la Figura 7, la IL-18 conduce a una disminución lenta pero progresiva de la fuerza desarrollada durante el período de experimentación. Después de 90 minutos de exposición continua a IL-18, la fuerza desarrollada había disminuido 42%. Estos resultados demuestran que la IL-18 exógena, a semejanza del TNF\alpha, actúa como sedante miocárdico.

Es interesante observar que la IL-18 no es tan potente como sedante miocárdico, como es el TNF\alpha.

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Preservación de la viabilidad celular

Las casasas están asociadas frecuentemente con la apoptosis. Para determinar la viabilidad celular en trabéculas expuestas a TNF\alpha, se midió la creatina quinasa (CK) intracelular, tisular. En este ensayo, niveles altos de CK indican células viables. Como está representado en la Fig. 8, las trabéculas testigo sometidas a 90 minutos de superfusión normóxica, contenían 6801\pm276 unidades de actividad de CK por miligramo de peso de tejido húmedo. Por el contrario, las trabéculas expuestas a 30/45 minutos de daño por I/R ó 90 minutos de exposición a TNF\alpha, ponían de manifiesto niveles disminuidos de CK preservada de 1774\pm181 y 3246\pm217 unidades/mg, respectivamente. Las trabéculas expuestas al TNF\alpha en presencia de IL-18BP contenían 5605\pm212 unidades/mg de tejido. Es interesante observar que las trabéculas tratadas con el TNF\alpha tenían mayores niveles de CK preservados en comparación con las trabéculas de I/R. Este fue un descubrimiento inesperado ya que la magnitud de la fuerza desarrollada al final del período experimental era similar para la I/R y el TNF\alpha.

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Ejemplo 3 La IL-18BP protege del infarto de miocardio IL-18BP in vivo Método Electrotransferencia intramuscular in vivo de plásmido de expresión de IL-18BP murina

Ratones C57BL/6 recibieron con intervalos de 3 semanas, 3 inyecciones con un plásmido de expresión que contenía el cDNA para IL-18BP (denominado pcDNA3-IL18BP, que se describe en el documento WO 01/85201). Los ratones testigo fueron inyectados con el plásmido vano testigo. cDNA de la isoforma d de IL-18BP murina, aislado como se ha descrito (número de catálogo Q9ZOM9) (Kim et al., 2000) fue subclonado en los sitios EcoR1/Not1 del vector de expresión pcDNA3 de células de mamífero bajo la regulación del promotor de citomegalovirus (Invitrogen). El plásmido testigo era una construcción similar exento de cDNA terapéutico. El grupo testigo contenía 31 ratones; el grupo experimental que recibió IL-18BP comprendía 27 ratones.

La IL-18BP o el plásmido de expresión testigo (60 \mug) se inyectaron en ambos músculos cranialis tibiales del ratón anestesiado según se ha descrito anteriormente (Mallat et al., 1999). En breve, impulsos eléctricos transcutáneos (8 impulsos eléctricos de onda rectangular de 200 V/cm, 20 msec de duración a 2Hz) fueron suministrados por un electropulsador PS-15 (Genetronics, Francia) usando dos electrodos de placa de acero inoxidable, colocados con una separación de 4,2 a 5,3 mm en cada lado de la pata.

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Inducción de infarto en el ventrículo izquierdo

Veinticuatro horas después de la administración del plásmido de IL-18BP o del plásmido vano, los ratones fueron anestesiados mediante inyección IP de xilazina y ketamina, ventilados y sometidos a toracotomía. La arteria coronaria principal izquierda se ligó permanentemente después usando una sutura de proleno 8-0, con objeto de inducir infarto de miocardio, después de lo cual se cerró el pecho y se dejó que los animales se recuperaran de la anestesia. La mortalidad pre-operativa fue menor del 20%. La mortalidad post-operativa fue 48% en el grupo testigo y 26% en el grupo experimental, y tuvo lugar casi exclusivamente, 4-5 días después de la ligadura.

Siete días después de efectuar la ligadura, los ratones fueron reanestesiados y se determinaron las dimensiones del ventrículo izquierdo (LV) mediante ecocardiografía en estado de pecho cerrado, usando un ecocardiógrado HDI 500 de ATL. El acortamiento fraccionado del LV se calculó a partir de los diámetros finales diastólico y sistólico medidos. Al término de la medida ecocardiográfica, el corazón fue retirado, fijado y más tarde cortado en secciones. Las secciones histológicas fueron teñidas luego con rojo sirio para determinar el tamaño del infarto.

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Resultados

El diámetro diastólico del ventrículo izquierdo siete días después de la ligadura en los ratones supervivientes era el siguiente:

0,53+0,01 mm (n=20) en los ratones tratados con IL-18BP frente a 0,59+0,01 mm en los ratones testigo (n=16), p<0,01.

El diámetro sistólico del ventrículo izquierdo siete días después de la ligadura en los ratones supervivientes era el siguiente.

0,45+0,02 mm en los ratones tratados con IL-18BP frente a 0,52+0,02 en los ratones testigo, p<0,01.

Acortamiento fraccionario del ventrículo izquierdo: 15+1% en los ratones tratados con IL-18BP frente a 11+1% en los ratones testigo, p<0,01.

Conclusión: La IL-18BP reduce la mortalidad de ratones después de infarto de miocardio inducido por ligadura coronaria total del ventrículo izquierdo en un 50%. Además de esto, la función del ventrículo izquierdo mejoró significativamente, como ponen de manifiesto los diámetros sistólico y diastólico reducidos del ventrículo izquierdo.

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Claims (17)

1. El uso de un inhibidor de IL-18 para fabricar un medicamento para el tratamiento y/o prevención de la cardiopatía, en el que el inhibidor de IL-18 está seleccionado entre un inhibidor de la caspasa-1 (ICE), anticuerpos contra IL-18, anticuerpos contra cualquiera de las subunidades del receptor de IL-18, y proteína de unión de IL-18, o sus isoformas, muteínas, proteínas fusionadas o derivados funcionales, que inhiben la actividad biológica de la IL-18.

2. El uso según la reivindicación 1, en el que el inhibidor de IL-18 es un anticuerpo dirigido contra la IL-18.

3. El uso según la reivindicación 1, en el que el inhibidor de IL-18 es un anticuerpo dirigido contra el receptor \alpha de la IL-18.

4. El uso según la reivindicación 1, en el que el inhibidor de IL-18 es un anticuerpo dirigido contra el receptor \beta de la IL-18.

5. El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado o humano.

6. El uso según la reivindicación 1, en el que el inhibidor de ICE es la Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-clorometilcetona (YVAD).

7. El uso según la reivindicación 1, en el que el inhibidor de IL-18 es una proteína de unión de IL-18 o una isoforma, una muteína, una proteína fusionada o un derivado funcional de la misma, que inhibe la actividad biológica de la IL-18.

8. El uso según la reivindicación 6, en el que el inhibidor de IL-18 está glicosilado en uno o más sitios.

9. El uso según la reivindicación 6 ó 7, en el que la proteína fusionada comprende una fusión de una inmunoglobulina (Ig).

10. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que el derivado funcional comprende al menos un resto unido a uno o más grupos funcionales, que ocurren como una o más cadenas laterales sobre los restos de aminoácidos.

11. El uso según la reivindicación 9, en el que el resto es un resto de polietileno

12. El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el medicamento comprende, además, un antagonista del Factor de la Necrosis Tumoral (TNF).

13. El uso según la reivindicación 11, en el que el inhibidor de IL-18 se usa simultánea, secuencial o separadamente con el antagonista del TNF.

14. El uso según la reivindicación 11 ó 12, en el que el antagonista del TNF es el TBPI y/o el TBPII.

15. El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el inhibidor de IL-18 se usa en una concentración que varía entre aproximadamente 0,001 a 100 mg/kg, o aproximadamente 1 a 10 mg/kg ó 2 a 5 mg/kg.

16. El uso de un vector de expresión que comprende la secuencia codificante de un inhibidor de IL-18, para preparar un medicamento para el tratamiento y/o prevención la cardiomiopatía, en el que el inhibidor de IL-18 está seleccionado entre anticuerpos contra la IL-18, anticuerpos contra cualquiera de las subunidades del receptor de IL-18, y proteínas de unión de IL-18, o sus isoformas, muteínas, proteínas fusionadas o derivados funcionales, que inhiben la actividad biológica de la IL-18.

17. El uso de un vector de expresión para inducir y/o potenciar la producción endógena de un inhibidor de IL-18 en una célula, para preparar un medicamento para el tratamiento y/o prevención de la cardiomiopatía, en el que el inhibidor de IL-18 está seleccionado entre proteínas de unión de IL-18 o sus isoformas, que inhiben la actividad biológica de la IL-18.