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EP2229449A2 - Verfahren zur enzymatischen reduktion von alpha- und beta-dehydroaminosäuren - Google Patents

Verfahren zur enzymatischen reduktion von alpha- und beta-dehydroaminosäuren

Info

Publication number
EP2229449A2
EP2229449A2 EP08860523A EP08860523A EP2229449A2 EP 2229449 A2 EP2229449 A2 EP 2229449A2 EP 08860523 A EP08860523 A EP 08860523A EP 08860523 A EP08860523 A EP 08860523A EP 2229449 A2 EP2229449 A2 EP 2229449A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
reduction
carried out
reductase
formula
cofactor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP08860523A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Rainer STÜRMER Dr.
Bernhard HAUER Prof.Dr.
Thomas FRIEDRICH Dr.
Kurt FABER Prof.Dr.
Melanie HALL Dr.
Clemens STÜCKLER
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF SE
Original Assignee
BASF SE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
Priority to EP08860523A priority Critical patent/EP2229449A2/de
Publication of EP2229449A2 publication Critical patent/EP2229449A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids

Definitions

  • the invention relates to a process for the enzymatic reduction of alpha- and beta-dehydroamino acids of the general formulas (1) and (2).
  • the invention relates to a process for the enzymatic preparation of amino acids of the general formula (3) or (4) from alpha-dehydroamino acids of the general formula (1) or (2) R
  • R 1, R 2 are independently H, dC 6 - (- COOR) has, alkenyl, an optionally substituted carbocyclic or heterocyclic aromatic or nonaromatic radical, or a Alkylaryrest, or a carboxyl group - alkyl, C 2 -C 6
  • R 3 is H, formyl, acetyl, propionyl, benzyl, benzyloxycarbonyl, BOC, Alloc,
  • R is H, C 1 -C 6 -alkyl, aryl,
  • the process according to the invention can be carried out either with purified or enriched enzyme itself or with microorganisms which naturally or recombinantly express this enzyme or with cell homogenates derived therefrom.
  • dC 6 -alkyl in particular methyl, ethyl, propyl, butyl, pentyl or hexyl, and the corresponding mono- or polysubstituted analogs, such as i-propyl, i-butyl, sec-butyl, tert , Butyl, i-pentyl or neopentyl; in particular the said C 1 -C 4 -alkyl radicals being preferred;
  • Carbo and heterocyclic aromatic or nonaromatic rings in particular optionally fused rings having 3 to 12 carbon atoms and optionally 1 to 4 heteroatoms, such as N, S and O, in particular N or O.
  • Examples may be mentioned cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopenty, cyclohexyl, cycloheptyl , the mono- or polyunsaturated analogs thereof, such as cyclobutenyl, cyclopentenyl, cyclohexenyl, cycloheptenyl, cyclohexadienyl, cycloheptadienyl; Phenyl and naphthyl; and 5- to 7-membered saturated or unsaturated heterocyclic radicals having 1 to 4 heteroatoms selected from O, N and S, which heterocycle may optionally be fused to another heterocycle or carbocycle.
  • heterocyclic radicals derived from pyrrolidine, tetrahydrofuran, piperidine, morpholine, pyrrole, furan, thiophene, pyrazole, imidazole, oxazole, thiazole, pyridine, pyran, pyrimidine, pyridazine, pyrazine, cumarone, indole and quinoline.
  • the cyclic radicals but also the abovementioned alkyl and alkenyl radicals one or more times, such as. B. 1-, 2- or 3-fold, be substituted.
  • halogen in particular F, Cl, Br; - OH, -SH, -NO 2 , -NH 3 , -SO 3 H, C r C 4 alkyl and C 2 -C 4 alkenyl, C r C 4 alkoxy; and hydroxy-dC 4 alkyl; wherein the alkyl and alkenyl radicals are as defined above and the alkoxy radicals are derived from the above-defined corresponding alkyl radicals.
  • Alloc stands for allyoxylcarbonyl (protective) group
  • the o.g. cyclic radicals can be both carbocycles, i. only C atoms form the cycle as well as heterocycles, i. Heteroatoms such as O; S; N, are included in the cycle. If desired, these carbocycles or heterocycles may also be substituted.
  • Particularly advantageous embodiments of the invention are the enzymatic reduction of dehydroalanine and dehydroaspartate.
  • the reductases (also sometimes referred to as enoate reductases) suitable for the method of the invention have a polypeptide sequence according to SEQ ID NO: 1, 2, or 3 or a polypeptide sequence which is at least 80%, e.g. at least 90%, or at least 95% and especially at least 97%, 98% or 99% sequence identity with SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 or 6.
  • a polypeptide having SEQ ID NO: 1 is known under the name YqjM from Bacillus subtilis. (UniprotKB / Swissprot entry P54550)
  • a polypeptide of SEQ ID NO: 2 is encoded by the OPR1 gene from tomato. (U-niprotKB / Swissprot entry Q9XG54)
  • a polypeptide of SEQ ID NO: 3 is encoded by the OYPR3 gene from tomato. , (U-niprotKB / Swissprot entry Q9FEW9).
  • a polypeptide with the SEQ ID NO: 4 is known under the name OYE1 from Saccharomyces carlsbergensis (Genbank Q02899).
  • a polypeptide having SEQ ID NO: 5 is encoded by the OYE2 gene from baker's yeast (Saccharomyces cerevisiae gene locus YHR179W) (Genbank Q03558).
  • a polypeptide having SEQ ID NO: 6 is encoded by the OYE3 gene from baker's yeast (Saccharomyces cerevisiae gene locus YPL171 C) (Genbank P 41816).
  • reductases can be obtained starting from SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6 by targeted or randomized mutagenesis methods known to the person skilled in the art.
  • microorganisms preferably in the genera Alishewanella, Alterococcus, Aquamonas, Aranicola, Arsenophonus, Azotivirga, Brenneria, Buchnera (aphid P-endosymbionts), Budvicia, Buttiauxella, Candidatus Phlomobacter, Cedecea, Citrobacter, Dickeya, Edwardsieila, Enterobacter , Erwinia, Escherichia, Ewingella, Grimontella, Hafnia, Klebsiella, Kluyvera, Leclercia, Leminorel Ia, Moellerella, Morganella, Obesumbacterium, Pantoea, Pectobacterium, Photorhabdus, Plesiomonas, Pragia, Proteus, Providen
  • the reductase can be used in purified or partially purified form or else in the form of the microorganism itself. Methods for recovering and purifying dehydrogenases from microorganisms are well known to the person skilled in the art.
  • the enantioselective reduction with the reductase preferably takes place in the presence of a suitable cofactor (also referred to as cosubstrate).
  • cofactors for the reduction of the ketone is usually NADH and / or NADPH.
  • reductases can be used as cellular systems which inherently contain cofactor, or alternative redox mediators are added (A. Schmidt, F. Hollmann and B. Buehler "Oxidation of Alcohols" in K. Drauz and H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Or- ganic Synthesis 2002, Vol. III, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheim).
  • the enantioselective reduction with the reductase preferably takes place in the presence of a suitable reducing agent which regenerates the oxidized cofactor in the course of the reduction.
  • suitable reducing agents are sugars, in particular hexoses, such as glucose, mannose, fructose, and / or oxidizable alcohols, in particular ethanol, propanol or isopropanol, and formate, phosphite or molecular hydrogen.
  • a second dehydrogenase e.g.
  • Glucose dehydrogenase using glucose as the reducing agent or formate dehydrogenase in the use of formate as a reducing agent can be used as a free or immobilized enzyme or in the form of free or immobilized cells. They can be produced either separately or by coexpression in a (recombinant) reductase strain.
  • a preferred embodiment of the claimed process is the regeneration of the cofactors by an enzymatic system in which a second dehydrogenase, more preferably a glucose dehydrogenase, is used.
  • the reductases used according to the invention can be used freely or immobilized.
  • An immobilized enzyme is an enzyme which is fixed to an inert carrier.
  • Suitable support materials and the enzymes immobilized thereon are known from EP-A-1149849, EP-A-1 069 183 and DE-OS 100193773 and from the references cited therein. The disclosure of these documents is hereby incorporated by reference in its entirety.
  • Suitable support materials include, for example, clays, clay minerals, such as kaolinite, diatomaceous earth, perlite, silica, alumina, sodium carbonate, calcium carbonate, cellulose powder, anion exchange materials, synthetic polymers, such as polycarbonate.
  • the support materials are usually used in a finely divided, particulate form for the preparation of the supported enzymes, with porous forms being preferred.
  • the particle size of the carrier material is usually not more than 5 mm, in particular not more than 2 mm (sieving line).
  • Carrier materials are, for example, calcium alginate, and carrageenan. Enzymes as well as cells can also be crosslinked directly with glutaraldehyde (cross-linking to CLEAs).
  • the reaction can be carried out in aqueous or non-aqueous reaction media or in 2-phase systems or (micro) emulsions.
  • the aqueous reaction media are preferably buffered solutions which generally have a pH of from 4 to 8, preferably from 5 to 8.
  • the aqueous solvent may also contain, besides water, at least one alcohol, e.g. Ethanol or isopropanol or dimethyl sulfoxide.
  • Non-aqueous reaction media are to be understood as meaning reaction media which contain less than 1% by weight, preferably less than 0.5% by weight, of water, based on the total weight of the liquid reaction medium.
  • the reaction can be carried out in an organic solvent.
  • Suitable organic solvents are, for example, aliphatic hydrocarbons, preferably having 5 to 8 carbon atoms, such as pentane, cyclopentane, hexane, cyclohexane, heptane, octane or cyclooctane, halogenated aliphatic hydrocarbons, preferably having one or two carbon atoms, such as dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, Dichloroethane or tetrachloroethane, aromatic hydrocarbons, such as benzene, toluene, xylenes, chlorobenzene or dichlorobenzene, aliphatic acyclic and cyclic ethers or alcohols, preferably having from 4 to 8 carbon atoms, such as ethanol, isopropanol, diethyl ether, methyl tert-butyl ether, ethyl tert - butyl
  • ethers in particular tetrahydrofuran.
  • an aqueous-organic reaction medium such as.
  • water / isopropanol in any mixing ratio such as 1: 99 to 99: 1 or 10:90 to 90:10, or an aqueous reaction medium are performed.
  • the substrate (1) or (2) is preferably used in a concentration of 0.1 g / l to 500 g / l, more preferably from 1 g / l to 50 g / l in the enzymatic reduction and can continuously or discontinuously after be guided.
  • the substrates (1) or (2) can be used both as E / Z mixtures and isomerically pure.
  • the enzymatic reduction is generally carried out at a reaction temperature underneath the deactivation of the reductase used and above -10 0 C. It is particularly preferably in the range of 0 to 100 0 C, in particular from 15 to 60 0 C and especially from 20 to 40 0 C, for example at about 30 0 C.
  • the substrate (1) or (2) with the reductase, the solvent and optionally the coenzymes, optionally a second dehydrogenase for the regeneration of the coenzyme and / or other reducing agents submit and mix the mixture, z. B. by stirring or shaking.
  • the mixture can be circulated through the reactor until the desired conversion is achieved.
  • the reduction will lead to a conversion of at least 70%, particularly preferably at least 85% and in particular of at least 95%, based on the substrate contained in the mixture.
  • the progress of the reaction ie the sequential reduction of the double bond can be followed by conventional methods such as gas chromatography or high pressure liquid chromatography.
  • "functional equivalents" or analogues of the specifically disclosed enzymes are different polypeptides which furthermore have the desired biological activity, such as substrate specificity.
  • “functional equivalents” are understood as meaning enzymes which catalyze the model reaction and which has at least 20%, preferably 50%, particularly preferably 75%, very particularly preferably 90% of the activity of an enzyme comprising one of the amino acid sequences listed under SEQ ID NO: 1, 2 or 3.
  • functional equivalents are preferably stable between pH 4 to 10 and advantageously have a pH optimum between pH 5 and 8 and a temperature optimum in the range from 20 ° C. to 80 ° C.
  • “functional equivalents” are in particular also understood as meaning mutants which, in at least one sequence position of the abovementioned amino acid sequences, have a different amino acid than the one specifically mentioned but nevertheless have one of the abovementioned biological activities
  • “Functional equivalents” thus include those represented by a or multiple amino acid additions, substitutions, deletions and / or inversions of available mutants, said changes may occur in any sequence position, as long as they lead to a mutant with the property profile according to the invention.
  • functional equivalence also exists when the reactivity patterns between mutant and unmodified polypeptide are qualitatively consistent, i. For example, the same substrates are reacted at different speeds. Examples of suitable amino acid substitutions are given in the following table:
  • Precursors are natural or synthetic precursors of the polypeptides with or without the desired biological activity.
  • “Functional derivatives” of polypeptides of the invention may also be produced at functional amino acid side groups or at their N- or C-terminal end by known techniques
  • Such derivatives include, for example, aliphatic esters of carboxylic acid groups, amides of carboxylic acid groups obtainable by reaction with ammonia or with a primary or secondary amine; N-acyl derivatives of free amino groups prepared by reaction with acyl groups; or O-acyl derivatives of free hydroxy groups prepared by reaction with acyl groups.
  • “functional equivalents” include proteins of the abovementioned type in deglycosylated or glycosylated form as well as modified forms obtainable by altering the glycosylation pattern.
  • “functional equivalents” also include polypeptides that are accessible from other organisms, as well as naturally occurring variants. For example, it is possible to determine regions of homologous sequence regions by sequence comparison and to determine equivalent enzymes on the basis of the specific requirements of the invention.
  • “Functional equivalents” also include fragments, preferably single domains or sequence motifs, of the polypeptides of the invention having, for example, the desired biological function.
  • Fusion proteins are also fusion proteins which comprise one of the abovementioned polypeptide sequences or functional equivalents derived therefrom and at least one further, functionally different, heterologous sequence in radioactive form. tional N- or C-terminal linkage (ie without mutual significant functional impairment of the fusion protein parts).
  • heterologous sequences are eg signal peptides or enzymes.
  • Homologs of the proteins of the invention can be prepared by screening combinatorial libraries of mutants, e.g. Shortening mutants, to be identified.
  • a variegated library of protein variants can be generated by combinatorial mutagenesis at the nucleic acid level, e.g. by enzymatic ligation of a mixture of synthetic oligonucleotides.
  • degenerate gene set allows for the provision of all of the more sequences in a mixture that encode the desired set of potential protein sequences.
  • Methods of synthesizing degenerate oligonucleotides are known to those skilled in the art (eg, Narang, SA (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al., (1984) Science 198: 1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 1 1: 477).
  • REM Recursive ensemble mutagenesis
  • the invention furthermore relates to nucleic acid sequences (single-stranded and double-stranded DNA and RNA sequences, such as, for example, cDNA and mRNA) which code for an enzyme having reductase activity according to the invention. Preference is given to nucleic acid sequences which, for example, encode amino acid sequences according to SEQ ID NO: 1, 2 or 3 characteristic partial sequences thereof.
  • nucleic acid sequences mentioned herein can be prepared in a manner known per se by chemical synthesis from the nucleotide units, for example by fragment condensation of individual overlapping, complementary nucleic acid units of the double helix.
  • the chemical synthesis of oligonucleotides can be carried out, for example, in a known manner by the phosphoamidite method (Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, pages 896-897).
  • the attachment of synthetic oligonucleotides and filling of gaps with the aid of the Klenow fragment of the DNA polymerase and ligation reactions and general cloning methods are described in Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A laboratory manual, CoId Spring Harbor Laboratory Press.
  • the pH in the process according to the invention is advantageously maintained between pH 4 and 12, preferably between pH 4.5 and 9, more preferably between pH 5 and 8, min. 98% ee achieved.
  • growing cells can be used which contain nucleic acids encoding the reductase, nucleic acid constructs or vectors.
  • dormant or open cells can be used.
  • open cells is meant, for example, cells which have been rendered permeable by treatment with, for example, solvents, or cells which have been treated by enzyme treatment, by mechanical treatment (e.g.
  • the crude extracts thus obtained are advantageously suitable for the process according to the invention.
  • purified or purified enzymes can be used for the process.
  • immobilized microorganisms or enzymes that can be used advantageously in the reaction.
  • the process according to the invention can be operated batchwise, semi-batchwise or continuously.
  • the operation of the process may advantageously be carried out in bioreactors, e.g. in Biotechnology, Volume 3, 2nd Edition, Rehm et al. Ed., (1993), especially Chapter II.
  • the products prepared in the process according to the invention can be isolated from the reaction medium by methods familiar to the person skilled in the art and, if desired, purified. These include distillation processes, chromatographic processes, extraction processes and crystallization processes. The cleaning of the products can be significantly increased depending on the requirement by combining several of these methods.
  • the asymmetric bioreduction of the substrates was carried out according to the following general procedure using the isolated enzymes YqjM, OPR1, OPR3 and Cymomonas mobilis reductase.
  • the enzyme preparation (100-200 ⁇ g) was 50 mM pH 1.5 (0.8 ml) with the cofactor NADH or NADPH (15 mM) was added to a solution of the substrate (5 mM) in Tris buffer and the reaction was performed at 30 0 C under Shaking (140rpm) performed. After 48 hours, the reaction mixture was extracted with ethyl acetate and the reaction products were analyzed by GC.
  • NADH / FDH system To a mixture of substrate (5 mM) oxidized cofactor NAD + (100 ⁇ M), ammonium (2OmM) in Tris buffer 5OmM pH 7.5 (0.8 ml) was added FDH (10u) after the enzyme (100-200 ⁇ g) was added and the reaction was carried out at 30 ° C. (140 rpm) for 48 hours.
  • OPR1 An aliquot of OPR1 was added to a Tris-HCl buffered solution (0.8 ml, 50 mM, pH 7.5) containing the substrate methyl 2-acetamido-acrylate (5 mM), the co-substrate 2-propanol (3-60 mM, 0.6 -12 moles equiv.) and the oxidized cofactor NAD + (100 ⁇ M).
  • the ADH-A was added (about 2-3 U) and the mixture stirred at 30 0 C and 120 rpm for 42 h.
  • the product was extracted with ethyl acetate (2 ⁇ 0.5 ml), the combined organic phases were dried over Na 2 SC> 4 and the samples obtained were analyzed with achiral GC.
  • ADH_A was expressed in Ecoli BL21 (DE3) (vector pETv22b). After a thermal shock at 65 ° C for 20 min. , the ADH solution was used without further purification.
  • the product was identified by comparison with authentic independently synthesized reference material by coinjection in GC-MS and achiral GC.
  • the conversion wetting was determined using a 6% cyanopropylphenyl phase capillary column (Varian CP-1301, 30 m, of 0.25 mm, 12:25 microns)
  • Detector temperature 240 0 C in- jector temperature 250 0 C, split ratio 30: 1st Temperature program for methyl 2-acetamidoacrylate and N-acetyl-alanine methyl ester: 120 0 C for 2 min, 10 ° C / min to 160 0 C, 30 ° C / min to 200 0 C, held for 2 min. Retention times: 4.89 min and 5.12 min.
  • the enantiomeric excess was determined using a modified - Cyclodextrin capillary column (Chiraldex ® B-TA, 40 m, 0.25mm). Detector temperature 200 0 C, I njector temperature 180 0 C, split ratio 20: 1. Temperature program: 130 0 C for 5 min, 2 ° C / min to 135 0 C, 15 ° C / min to 180 0 C, held for 2 min. Retention times: ⁇ R / S) - and ⁇ S / R) - 5.18 and 5.35 min, resp. The absolute configuration is "S", proven by comparison with authentic samples.
  • GC-FID analyzes were performed on a Varian 3800 gas chromatograph with H 2 as the carrier gas (14.5 psi).
  • Substrate product cofactor reductase c. % E.e. % E.e. % E.e. % C.% E.e. %
  • Substrate product cofactor c. % E.e. % c. % E.e. % c. % E.e. %
  • G6PDII glucose-6-phosphate dehydrogenase / glucose-6-phosphate.

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Abstract

Verfahren zur enzymatischen Herstellung von Aminosäuren der allgemeinen Formel (3) oder (4) aus alpha-Dehydroaminosäuren der allgemeinen Formel (1) oder (2) wobei R1, R2 unabhängig voneinander für H, C1-C6- Alkyl, C2-C6-Alkenyl, einen gegebenenfalls substituierten carbo- oder heterocyclischen, aromatischen oder nichtaromatischen Rest oder einen Alkylaryrest, oder einen Carboxylrest ( - COOR) steht, R3 für H, Formyl, Acetyl, Propionyl, Benzyl, Benzyloxycarbonyl, BOC, Alloc steht, R für H, C1-C6- Alkyl, Aryl steht, durch Reduktion einer Verbindung der Formel (1) oder (2) in Gegenwart einer Reduktase.

Description

Verfahren zur enzymatischen Reduktion von alpha- und beta-Dehydroaminosäuren
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Reduktion von alpha- und beta- Dehydroaminosäuren der allgemeinen Formeln (1 ) und (2).
Aufgabenstellung
Es bestand die Aufgabe, ein Verfahren zur enzymatischen Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel (3) und (4) bereitzustellen, das insbesondere in hoher chemischer Ausbeute und sehr guter Stereoselektivität abläuft.
Kurzfassung der Erfindung
Obige Aufgabe wurde gelöst durch Verwendung der Reduktasen YqjM, OPR1 , OPR3 und funktionaler Äquivalente davon zur Reduktion von alpha-Dehydroaminosäuren der allgemeinen Formeln (1 ) und (2).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Herstellung von Aminosäuren der allgemeinen Formel (3) oder (4) aus alpha-Dehydroaminosäuren der allgemeinen Formel (1 ) oder (2) R
(1) (2)
(3) (4) wobei R 1 , R2 unabhängig voneinander für H, d-C6- Alkyl, C2-C6- Alkenyl, einen gegebenenfalls substituierten carbo- oder heterocyclischen, aromatischen oder nichtaromatischen Rest oder einen Alkylaryrest, oder einen Carboxylrest (- COOR) steht,
R3 für H, Formyl, Acetyl, Propionyl, Benzyl, Benzyloxycarbonyl, BOC, Alloc steht,
R für H, CrC6- Alkyl, Aryl steht,
durch Reduktion einer Verbindung der Formel (1 ) oder (2) in Gegenwart einer Reduktase
(i) umfassend wenigstens eine der Polypeptidsequenzen SEQ ID
NO:1 , 2, 3, 4, 5, 6 oder mit einer funktional äquivalenten Polypeptidsequenz, die mindestens 80% Sequenz- identität mit SEQ ID NO:1 , 2, 3, 4, 5, 6 aufweist.
Grundsätzlich ist das erfindungsgemäße Verfahren sowohl mit gereinigten oder angereicherten Enzym selbst als auch mit Mikroorganismen, welche dieses Enzym natürlich oder rekombinant exprimieren, oder mit davon abgeleiteten Zellhomogenaten durch- führbar.
Werden keine anderen Angaben gemacht, so bedeutet: d-C6-Alkyl insbesondere Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl oder Hexyl, sowie die entsprechenden ein- oder mehrfach verzweigte Analoga, wie i-Propyl, i-Butyl, sec- Butyl, tert. -Butyl, i-Pentyl oder Neopentyl; wobei insbesondere die genannten d-C4- Alkylreste bevorzugt sind;
C2-C6-Alkenyl insbesondere die einfach ungesättigten Analoga der oben genannten Alkylreste mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, wobei insbesondere die entsprechenden C2-C4-Alkenylreste bevorzugt sind,
Carbo- und heterocyclische aromatische oder nichtaromatische Ringe insbesondere gegebenenfalls kondensierte Ringe mit 3 bis 12 Kohlenstoffatomen und gegebenenfalls 1 bis 4 Heteroatomen, wie N, S und O, insbesondere N oder O. Als Beispiele können genannt werden Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopenty, Cyclohexyl, Cycloheptyl, die ein- oder mehrfach ungesättigten Analoga davon, wie Cyclobutenyl, Cyclopentenyl, Cyclohexenyl, Cycloheptenyl, Cyclohexadienyl, Cycloheptadienyl; Phenyl und Naphthyl; sowie 5- bis 7-gliedrige gesättigte oder ungesättigte heterocyclische Reste mit 1 bis 4 Heteroatomen, die ausgewählt sind unter O, N und S, wobei der Heterocyc- lus gegebenenfalls mit einem weitern Heterocyclus oder Carbocyclus kondensiert sein kann. Insbesondere sind zu nennen heterocyclische Reste abgeleitet von Pyrrolidin, Tetrahydrofuran, Piperidin, Morpholin, Pyrrol, Furan, Thiophen, Pyrazol, Imidazol, Oxa- zol, Thiazol, Pyridin, Pyran, Pyrimidin, Pyridazin, Pyrazin, Cumaron, Indol und Chinolin. Gegebenenfalls können die cyclischen Reste, aber auch die oben genannten Alkyl- und Alkenylreste ein- oder mehrfach, wie z. B. 1-, 2- oder 3-fach, substituiert sein. Als Beispiel für geeignete Substituierte sind zu nennen: Halogen, insbesondere F, Cl, Br; - OH, -SH, -NO2, -NH3, -SO3H, CrC4-Alkyl und C2-C4-Alkenyl, CrC4 -Alkoxy; und Hydro- xy-d-C4-Alkyl; wobei die Alkyl- und Alkenyl-Reste wie oben definiert sind und die Al- koxy-Reste von den oben definierten korrespondierenden Alkylresten abgeleitet sind.
- BOC steht für tert. Butoxycarbonyl - (Schutz )-Gruppe
- Alloc steht für Allyoxylcarbonyl - (Schutz )-Gruppe
Die o.g. zyklischen Reste können sowohl Carbocyclen sein, d.h. nur C-Atome bilden den Cyclus, als auch Heterozyklen, d.h. Heteroatome wie O;S;N, sind im Cyclus enthalten. Gewünschtenfalls können diese Carbo- oder Heterozyklen auch noch substituiert sein.
Besonders vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung sind die enzymatische Reduktion der Dehydroalanin und Dehydroaspartat.
Die für das erfindungsgemäße Verfahren geeigneten Reduktasen (welche zuweilen auch als Enoat-Reduktasen bezeichnet werden) besitzen eine Polypeptidsequenz ge- mäss SEQ ID NO:1 , 2, oder 3 oder eine Polypeptidsequenz, die mindestens 80%, wie z.B. mindestens 90%, oder mindestens 95% und insbesondere mindestens 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität mit SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 4, 5 oder 6 aufweist.
Ein Polypeptid mit der SEQ ID NO:1 ist bekannt unter der Bezeichnung YqjM aus Ba- cillus subtilis. (UniprotKB/Swissprot entry P54550)
Ein Polypeptid mit der SEQ ID NO:2 wird kodiert vom OPR1 Gen aus Tomate. (U- niprotKB/Swissprot entry Q9XG54) Ein Polypeptid mit der SEQ ID NO:3 wird kodiert vom OYPR3 Gen aus Tomate. . (U- niprotKB/Swissprot entry Q9FEW9).
Ein Polypeptid mit der SEQ ID NO:4 ist bekannt unter der Bezeichnung OYE1 aus Saccharomyces carlsbergensis (Genbank Q02899).
Ein Polypeptid mit der SEQ ID NO:5 wird kodiert vom OYE2 Gen aus Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae Genlocus YHR179W) (Genbank Q03558).
Ein Polypeptid mit der SEQ ID NO:6 wird kodiert vom OYE3 Gen aus Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae Genlocus YPL171 C) (Genbank P 41816).
Die Ermittlung der Sequenzidentität soll für die hier beschriebenen Zwecke durch das Computerprogramm „GAP" der Genetics Computer Group (GCG) der University of Wisconsin erfolgen, wobei die Version 10.3 unter Verwendung der von GCG empfohlenen Standardparameter zum Einsatz kommen soll.
Solche Reduktasen können ausgehend von SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 4, 5, 6 durch dem Fachmann bekannte gezielte oder randomisierte Mutageneseverfahren erhalten wer- den. Alternativ kann jedoch auch in Mikroorganismen , bevorzugt in solchen der Gattungen Alishewanella, Alterococcus, Aquamonas, Aranicola, Arsenophonus, Azotivirga, Brenneria, Buchnera (aphid P-endosymbionts), Budvicia, Buttiauxella, Candidatus Phlomobacter, Cedecea, Citrobacter, Dickeya, Edwardsieila, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Ewingella, Grimontella, Hafnia, Klebsiella, Kluyvera, Leclercia, Leminorel- Ia, Moellerella, Morganella, Obesumbacterium, Pantoea, Pectobacterium, Photorhab- dus, Plesiomonas, Pragia, Proteus, Providencia, Rahnella, Raoultella, Salmonella, Samsonia, Serratia, Shigella, Sodalis, Tatumella, Trabulsiella, Wigglesworthia, Xe- norhabdus, Yersinia, Yokenella oder Zymomonas nach Reduktasen gesucht werden, die die o.g. Modellreaktion katalysieren und deren Aminosäuresequenz die geforderte Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 4, 5, 6 bereits aufweist oder durch Mutageneseverfahren erhalten wird.
Die Reduktase kann in gereinigter oder teilweise gereinigter Form oder auch in Form des Mikroorganismus selbst verwendet werden. Verfahren zur Gewinnung und Aufrei- nigung von Dehydrogenasen aus Mikroorganismen sind dem Fachmann hinreichend bekannt. Bevorzugt erfolgt die die enantioselektive Reduktion mit der Reduktase in Gegenwart eines geeigneten Cofaktors (auch als Cosubstrat bezeichnet). Als Cofaktoren für die Reduktion des Ketons dient üblicherweise NADH und/oder NADPH. Daneben können Reduktasen als zelluläre Systeme eingesetzt werden, die inherent Cofaktor enthalten, oder alternative Redoxmediatoren zugesetzt werden (A. Schmidt, F. Hollmann und B. Bühler „Oxidation of Alcohols" in K. Drauz und H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Or- ganic Synthesis 2002, Vol. III, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheim).
Bevorzugt erfolgt die enantioselektive Reduktion mit der Reduktase außerdem in Ge- genwart eines geeigneten Reduktionsmittels, welches den im Verlauf der Reduktion oxidierten Cofaktor regeneriert. Beispiele für geeignete Reduktionsmittels sind Zucker, insbesondere Hexosen, wie Glucose, Mannose, Fructose, und/oder oxidierbare Alkohole, insbesondere Ethanol, Propanol oder Isopropanol, sowie Formiat, Phosphit oder molekularer Wasserstoff. Zur Oxidation des Reduktionsmittels und damit verbunden zur Regeneration des Coenzyms kann eine zweite Dehydrogenase, wie z.B. Glucose- dehydrogenase bei Verwendung von Glucose als Reduktionsmittel oder Formiat- Dehydrogenase bei der Verwendung von Formiat als Reduktionsmittel, zugesetzt werden. Diese kann als freies oder immobilisiertes Enzym oder in Form von freien oder immobilisierten Zellen eingesetzt werden. Ihre Herstellung kann sowohl separat als auch durch Coexpression in einem (rekombinanten) Reduktase-Stamm erfolgen.
Eine bevorzugte Ausführungsform des beanspruchten Verfahrens ist die Regenerierung der Cofaktoren durch ein enzymatisches System, bei dem eine zweite Dehydrogenase, besonders bevorzugt eine Glucosedehydrogenase, verwendet wird.
Weiterhin kann es zweckmäßig sein, weitere die Reduktion fördernde Zusätze, wie z. B. Metallsalze oder Chelatbildner, wie. z. B. EDTA, zu zusetzten.
Die erfindungsgemäß verwendeten Reduktasen können frei oder immobilisiert einge- setzt werden. Unter einem immobilisierten Enzym versteht man ein Enzym, das an einen inerten Träger fixiert ist. Geeignete Trägermaterialien sowie die darauf immobilisierten Enzyme sind aus der EP-A-1149849, EP-A-1 069 183 und der DE-OS 100193773 sowie aus den darin zitierten Literaturstellen bekannt. Auf die Offenbarung dieser Schriften wird diesbezüglich in vollem Umfang Bezug genommen. Zu den ge- eigneten Trägermaterialien gehören beispielsweise Tone, Tonmineralien, wie Kaolinit, Diatomeenerde, Perlit, Siliciumdioxid, Aluminiumoxid, Natriumcarbonat, Calciumcarbonat, Cellulosepulver, Anionenaustauschermaterialien, synthetische Polymere, wie Po- lystyrol, Acrylharze, Phenolformaldehydharze, Polyurethane und Polyolefine, wie PoIy- ethylen und Polypropylen. Die Trägermaterialien werden zur Herstellung der geträger- ten Enzyme üblicherweise in einer feinteiligen, partikelförmigen Form eingesetzt, wobei poröse Formen bevorzugt sind. Die Partikelgröße des Trägermaterials beträgt übli- cherweise nicht mehr als 5 mm, insbesondere nicht mehr als 2 mm (Sieblinie). Analog kann bei Einsatz der Dehydrogenase als Ganzzell-Katalysator eine freie oder immobili- serte Form gewählt werden. Trägermaterialien sind z.B. Ca-Alginat, und Carrageenan. Enzyme wie auch Zellen können auch direkt mit Glutaraldehyd vernetzt werden (Cross- linking zu CLEAs). Entsprechende und weitere Immobilisierungsverfahren sind bei- spielsweise in J. Lalonde und A. Margolin „Immobilization of Enzymes" in K. Drauz und H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol. III, 991-1032, Wiley- VCH, Weinheim beschrieben.
Die Umsetzung kann in wässrigen oder nichtwässrigen Reaktionsmedien oder in 2- Phasensystemen oder (Mikro-)Emulsionen erfolgen. Bei den wässrigen Reaktionsmedien handelt es sich vorzugsweise um gepufferte Lösungen, die in der Regel einen pH- Wert von 4 bis 8, vorzugsweise von 5 bis 8, aufweisen. Das wässrige Lösungsmittel kann neben Wasser außerdem wenigstens einen Alkohol, z.B. Ethanol oder Isopropa- nol oder Dimethylsulfoxid enthalten.
Unter nicht-wässrigen Reaktionsmedien werden Reaktionsmedien verstanden, die weniger als 1 Gew.-%, vorzugsweise weniger als 0,5 Gew.-% Wasser, bezogen auf das Gesamtgewicht des flüssigen Reaktionsmediums, enthalten. Insbesondere kann die Umsetzung in einem organischen Lösungsmittel durchgeführt werden.
Geeignete organische Lösungsmittel sind beispielsweise aliphatische Kohlenwasserstoffe, vorzugsweise mit 5 bis 8 Kohlenstoffatomen, wie Pentan, Cyclopentan, Hexan, Cyclohexan, Heptan, Octan oder Cyclooctan, halogenierte aliphatische Kohlenwasserstoffe, vorzugsweise mit einem oder zwei Kohlenstoffatomen, wie Dichlormethan, ChIo- roform, Tetrachlorkohlenstoff, Dichlorethan oder Tetrachlorethan, aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Toluol, die XyIoIe, Chlorbenzol oder Dichlorbenzol, aliphatische acyclische und cyclische Ether oder Alkohole, vorzugsweise mit 4 bis 8 Kohlenstoffatomen, wie Ethanol, Isopropanol, Diethylether, Methyl-tert-butylether, Ethyl-tert- butylether, Dipropylether, Diisopropylether, Dibutylether, Tetrahydrofuran oder Ester wie Ethylacetat oder n-Butylacetat oder Ketone wie Methylisobutylketon oder Dioxan oder Gemische davon. Besonders bevorzugt werden die vorgenannten Ether, insbesondere Tetrahydrofuran, verwendet. Beispielsweise kann die Reduktion mit der Reduktase in einem wässrig-organischen Reaktionsmedium, wie z. B. Wasser/Isopropanol, in beliebigem Mischungsverhältnis wie z.B. 1 :99 bis 99:1 oder 10: 90 bis 90:10, oder einem wässrigen Reaktionsmedium durchgeführt werden.
Das Substrat (1 ) oder (2) wird vorzugsweise in einer Konzentration von 0,1 g/l bis 500 g/l, besonders bevorzugt von 1 g/l bis 50 g/l in die enzymatische Reduktion eingesetzt und kann kontinuierlich oder diskontinuierlich nach geführt werden.
Die Substrate (1 ) oder (2) können sowohl als E/Z-Gemische als auch isomerenrein eingesetzt werden.
Die enzymatische Reduktion erfolgt in der Regel bei einer Reaktionstemperatur unter- halb der Desaktivierungstemperatur der eingesetzten Reduktase und oberhalb von -10 0C. Besonders bevorzugt liegt sie im Bereich von 0 bis 100 0C, insbesondere von 15 bis 60 0C und speziell von 20 bis 40 0C, z.B. bei etwa 30 0C.
Zur Durchführung kann man beispielsweise das Substrat (1 ) oder (2) mit der Reduktase, dem Lösungsmittel und gegebenenfalls den Coenzymen, gegebenenfalls einer zweiten Dehydrogenase zur Regenerierung des Coenzyms und/oder weiteren Reduktionsmitteln vorlegen und das Gemisch durchmischen, z. B. durch Rühren oder Schütteln. Es ist aber auch möglich, die Reduktase in einem Reaktor, beispielsweise in einer Säule, zu immobilisieren, und durch den Reaktor eine das Substrat und gegebenenfalls Coenzyme und/oder Cosubstrate enthaltende Mischung zu leiten. Hierzu kann man die Mischung im Kreislauf durch den Reaktor leiten bis der gewünschte Umsatz erreicht ist.
In der Regel wird man die Reduktion bis zu einem Umsatz von wenigstens 70 %, besonders bevorzugt von wenigstens 85 % und insbesondere von wenigstens 95%, bezogen auf das in der Mischung enthaltene Substrat führen. Das Fortschreiten der Reaktion, d. h. die sequentielle Reduktion der Doppelbindung kann dabei durch übliche Methoden wie Gaschromatographie oder Hochdruckflüssigkeitschromatographie ver- folgt werden. „Funktionale Äquivalente" oder Analoga der konkret offenbarten Enzyme sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung davon verschiedene Polypeptide, welche weiterhin die gewünschte biologische Aktivität, wie z.B. Substratspezifität, besitzen. So versteht man beispielsweise unter „funktionalen Äquivalenten" Enzyme, die die Modellreaktion kata- lysieren und die mindestens 20 %, bevorzugt 50 %, besonders bevorzugt 75 %, ganz besonders bevorzugt 90 % der Aktivität eines Enzyms, umfassend eine der unter SEQ ID NO:1 , 2 oder 3 aufgeführten Aminosäuresequenzen, aufweist. Funktionale Äquivalente sind außerdem vorzugsweise zwischen pH 4 bis 10 stabil und besitzen vorteilhaft ein pH-Optimum zwischen pH 5 und 8 sowie ein Temperaturoptimum im Bereich von 200C bis 800C.
Unter „funktionalen Äquivalenten" versteht man erfindungsgemäß insbesondere auch Mutanten, welche in wenigstens einer Sequenzposition der oben genannten Aminosäuresequenzen eine andere als die konkret genannte Aminosäure aufweisen aber trotz- dem eine der oben genannten biologischen Aktivitäten besitzen. „Funktionale Äquivalente" umfassen somit die durch eine oder mehrere Aminosäure-Additionen, - Substitutionen, -Deletionen und/oder -Inversionen erhältlichen Mutanten, wobei die genannten Veränderungen in jeglicher Sequenzposition auftreten können, solange sie zu einer Mutante mit dem erfindungsgemäßen Eigenschaftsprofil führen. Funktionale Äquivalenz ist insbesondere auch dann gegeben, wenn die Reaktivitätsmuster zwischen Mutante und unverändertem Polypeptid qualitativ übereinstimmen, d.h. beispielsweise gleiche Substrate mit unterschiedlicher Geschwindigkeit umgesetzt werden. Beispiele für geeignete Aminosäuresubstitutionen sind folgender Tabelle zu entneh- men:
Ursprünglicher Rest Beispiele der Substitution
AIa Ser
Arg Lys
Asn GIn; His
Asp GIu
Cys Ser
GIn Asn
GIu Asp
GIy Pro
His Asn ; GIn
Ne Leu; VaI
Leu Ne; VaI
Lys Arg ; GIn ; GIu
Met Leu ; Ne
Phe Met ; Leu ; Tyr
Ser Thr Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp ; Phe
VaI Ne; Leu
„Funktionale Äquivalente" im obigen Sinne sind auch „Präkursoren" der beschriebenen Polypeptide sowie „funktionale Derivate" .
„Präkursoren" sind dabei natürliche oder synthetische Vorstufen der Polypeptide mit oder ohne der gewünschten biologischen Aktiviät.
„Funktionale Derivate" erfindungsgemäßer Polypeptide können an funktionellen Aminosäure-Seitengruppen oder an deren N- oder C-terminalen Ende mit Hilfe bekannter Techniken ebenfalls hergestellt werden. Derartige Derivate umfassen beispielsweise aliphatische Ester von Carbonsäuregruppen, Amide von Carbonsäuregruppen, erhältlich durch Umsetzung mit Ammoniak oder mit einem primären oder sekundären Amin; N-Acylderivate freier Aminogruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen; oder O-Acylderivate freier Hydroxygruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgrup- pen.
Im Falle einer möglichen Proteinglykosylierung umfassen erfindungsgemäße „funktionale Äquivalente" Proteine des oben bezeichneten Typs in deglykosylierter bzw. glyko- sylierter Form sowie durch Veränderung des Glykosylierungsmusters erhältliche abge- wandelte Formen.
"Funktionale Äquivalente" umfassen natürlich auch Polypeptide welche aus anderen Organismen zugänglich sind, sowie natürlich vorkommende Varianten. Beispielsweise lassen sich durch Sequenzvergleich Bereiche homologer Sequenzregionen festlegen und in Anlehnung an die konkreten Vorgaben der Erfindung äquivalente Enzyme ermitteln.
„Funktionale Äquivalente" umfassen ebenfalls Fragmente, vorzugsweise einzelne Domänen oder Sequenzmotive, der erfindungsgemäßen Polypeptide, welche z.B. die gewünschte biologische Funktion aufweisen.
„Funktionale Äquivalente" sind außerdem Fusionsproteine, welche eine der oben genannten Polypeptidsequenzen oder davon abgeleitete funktionale Äquivalente und wenigstens eine weitere, davon funktionell verschiedene, heterologe Sequenz in funk- tioneller N- oder C-terminaler Verknüpfung (d.h. ohne gegenseitigen wesentliche funktionelle Beeinträchtigung der Fusionsproteinteile) aufweisen. Nichtlimitierende Beispiele für derartige heterologe Sequenzen sind z.B. Signalpeptide oder Enzyme.
Homologe des erfindungsgemäßen Proteine können durch Screening kombinatorischer Banken von Mutanten, wie z.B. Verkürzungsmutanten, identifiziert werden. Beispielsweise kann eine variegierte Bank von Protein-Varianten durch kombinatorische Muta- genese auf Nukleinsäureebene erzeugt werden, wie z.B. durch enzymatisches Ligieren eines Gemisches synthetischer Oligonukleotide. Es gibt eine Vielzahl von Verfahren, die zur Herstellung von Banken potentieller Homologer aus einer degenerierten Oligo- nukleotidsequenz verwendet werden können. Die chemische Synthese einer degenerierten Gensequenz kann in einem DNA-Syntheseautomaten durchgeführt werden, und das synthetische Gen kann dann in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert werden. Die Verwendung eines degenerierten Gensatzes ermöglicht die Bereitstellung sämtli- eher Sequenzen in einem Gemisch, die den gewünschten Satz an potentiellen Proteinsequenzen kodieren. Verfahren zur Synthese degenerierter Oligonukleotide sind dem Fachmann bekannt (z.B. Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 1 1 :477).
Im Stand der Technik sind mehrere Techniken zum Screening von Genprodukten kombinatorischer Banken, die durch Punktmutationen oder Verkürzung hergestellt worden sind, und zum Screening von cDNA-Banken auf Genprodukte mit einer ausgewählten Eigenschaft bekannt. Diese Techniken lassen sich an das schnelle Screening der Genbanken anpassen, die durch kombinatorische Mutagenese erfindungsgemäßer Homologer erzeugt worden sind. Die am häufigsten verwendeten Techniken zum Screening großer Genbanken, die einer Analyse mit hohem Durchsatz unterliegen, umfassen das Klonieren der Genbank in replizierbare Expressionsvektoren, Transformieren der geeigneten Zellen mit der resultierenden Vektorenbank und Exprimieren der kombinatorischen Gene unter Bedingungen, unter denen der Nachweis der gewünschten Aktivität die Isolation des Vektors, der das Gen kodiert, dessen Produkt nachgewiesen wurde, erleichtert. Recursive-Ensemble-Mutagenese (REM), eine Technik, die die Häufigkeit funktioneller Mutanten in den Banken vergrößert, kann in Kombination mit den Screeningtests verwendet werden, um Homologe zu identifizieren (Arkin und Yourvan (1992) PNAS 89:781 1-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331 ). Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Nukleinsäuresequenzen (einzel- und dop- pelsträngige DNA- und RNA-Sequenzen, wie z.B. cDNA und mRNA), die für ein Enzym mit erfindungsgemäßer Reduktase -Aktivität kodieren. Bevorzugt sind Nukleinsäuresequenzen, welche z.B. für Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO:1 , 2 oder 3 cha- rakteristische Teilsequenzen davon kodieren.
Alle hierin erwähnten Nukleinsäuresequenzen sind in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen, wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäurebausteine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seiten 896-897) erfolgen. Die Anlagerung synthetischer Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mit Hilfe des Klenow-Fragmentes der DNA- Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonierungsverfahren werden in Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A laboratory manual, CoId Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.
Weitere Ausgestaltungen zur Durchführung des erfindungsgemäßen enzymatischen Reduktionsverfahrens:
Der pH-Wert im erfindungsgemäßen Verfahren wird vorteilhaft zwischen pH 4 und 12, bevorzugt zwischen pH 4,5 und 9, besonders bevorzugt zwischen pH 5 und 8 gehalten, min. 98 %ee erreicht.
Für das erfindungsgemäße Verfahren können wachsende Zellen verwendet werden, die für die Reduktase kodierenden Nukleinsäuren, Nukleinsäurekonstrukte oder Vektoren enthalten. Auch ruhende oder aufgeschlossene Zellen können verwendet werden. Unter aufgeschlossenen Zellen sind beispielsweise Zellen zu verstehen, die über eine Behandlung mit beispielsweise Lösungsmitteln durchlässig gemacht worden sind, oder Zellen die über eine Enzymbehandlung, über eine mechanische Behandlung (z.B.
French Press oder Ultraschall) oder über eine sonstige Methode aufgebrochen wurden. Die so erhaltenen Rohextrakte sind für das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhaft geeignet. Auch gereinigte oder angereinigte Enzyme können für das Verfahren verwendet werden. Ebenfalls geeignet sind immobilisierte Mikroorganismen oder Enzyme, die vorteilhaft in der Reaktion Anwendung finden können. Das erfindungsgemäße Verfahren kann batchweise, semi-batchweise oder kontinuierlich betrieben werden.
Die Durchführung des Verfahrens kann vorteilhafterweise in Bioreaktoren erfolgen, wie z.B. beschrieben in Biotechnology, Band 3, 2. Auflage, Rehm et al Hrsg., (1993) insbesondere Kapitel II.
Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Produkte können aus dem Reaktionsmedium mit dem Fachmann geläufigen Verfahren isoliert und gewünschten- falls aufgereinigt werden. Hierzu zählen Destillationsverfahren, chromatographische Verfahren, Extraktionsverfahren und Kristallisationsverfahren. Die Reinigung der Produkte kann je nach Anforderung durch Kombination mehrerer dieser Verfahren deutlich erhöht werden.
Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen, ohne sie jedoch einzuschränken. Hierbei wird auf beiliegende Abbildungen Bezug genommen, dabei zeigt:
Experimenteller Teil
Allgemeine Vorschrift zur asymmetrischen Bioreduktion
Die asymmetrische Bioreduktion der Substrate wurde gemäß der folgenden allgemeinen Vorschrift unter Verwendung der isolierten Enzyme YqjM, OPR1 , OPR3 und Zy- momonas mobilis Reduktase durchgeführt.
Die Enzympräparation (100-200μg) wurde zu einer Lösung des Substrats (5mM) in Tris Puffer 50 mM ph 1,5 (0,8ml) mit dem Cofaktor NADH oder NADPH (15 mM) zugesetzt und die Reaktion wurde bei 300C unter Schütteln (140rpm) durchgeführt. Nach 48 Stunden wurde das Reaktionsgemisch mit Ethylacetat extrahiert und die Reaktionspro- dukte über GC analysiert.
Bei Verwendung des Cofaktor-Recycling-Systems, wurde folgende Vorgehensweise gewählt:
NADH/FDH System Zu einer Mischung aus Substrat (5mM) oxidiertem Cofaktor NAD+ (100μM), Ammoni- umfomat (2OmM) in Tris Puffer 5OmM pH 7,5 (0,8ml) wurde FDH (10u) zugegeben nachdem das Enzym (100-200μg) zugegeben worden war und die Reaktion wurde bei 300C (140 rpm) für 48 Stunden durchgeführt.
NADH/GDH
Zu einer Mischung aus Substrat (5mM) oxidiertem Cofaktor NAD+ (100μM), Glucose (2OmM) in Tris Puffer 5OmM pH 7,5 (0,8ml) wurde (D)-GDH (10u) zugegeben nachdem das Enzym (100-200μg) zugegeben worden war und die Reaktion wurde bei 300C (140 rpm) für 48 Stunden durchgeführt.
NADPH/G6PDH
Zu einer Mischung aus Substrat (5mM) oxidiertem Cofaktor NADP+ (10μM), Glucose-6- Phosphat (2OmM) in Tris Puffer 5OmM pH 7,5 (0,8ml) wurde G6PDH (10u) zugegeben nachdem das Enzym (100-200μg) zugegeben worden war und die Reaktion wurde bei 30°C (140 rpm) für 48 Stunden durchgeführt.
ADH
Ein Aliquot OPR1 wurde zu einer Tris-HCL gepufferten Lösung ( 0,8 ml, 50 mM, pH 7,5) hinzugefügt, die das Substrat Methyl-2-Acetamidoacrylat (5mM) , das Co-Substrat 2-Propanol (3-60 mM, 0,6 -12 MolÄquiv.) und den oxidierten Cofaktor NAD+ (100μM) enthielt. Die ADH-A wurde hinzugefügt (ca. 2-3 U) und die Mischung bei 300C und 120 rpm für 42h gerührt. Das Produkt wurde mit Ethylacetat (2 x 0,5 ml) extrahiert, die vereinigten organischen Phasen wurden über Na2SC>4 getrocknet und die erhaltenen Pro- ben mit achiraler GC analysiert.
ADH_A wurde in Ecoli BL21 (DE3) (vector pETv22b) exprimiert. Nach einem thermischen Schock bei 65°C für 20 min. , wurde die ADH Lösung ohne weitere Aufreinigung verwendet.
Ein Aliquot des isolierten Enzyms wurde zu einer Tris-HCI gepufferten Lösung ( 0,8 ml, 50 mM, pH 7,5) hinzugefügt, die das Substrat Methyl 2-acetamidoacrylate (5mM) und den Cofaktor NADH oder NADPH (10 mM) enthielt. Die Reaktionsmischung wurde bei 30°C und 120 rpm für 64 h gerührt. Das Produkt wurde mit Ethylacetat (2 x 0,5 ml) extrahiert, die vereinigten organischen Phasen wurden über Na2SC>4 getrocknet und die erhaltenen Proben mit achiraler GC analysiert.
Das Produkt wurde identifiziert durch Vergleich mit authentischem unabhängig synthetisiertem Referenzmaterial durch Coinjection in GC-MS und achirale GC. Die Umset- zung wurde bestimmt unter Verwendung einer 6 % Cyanopropylphenyl phasen Kapillarsäule (Varian CP-1301 , 30 m, 0.25 mm, 0.25 μm), Detector Temperatur 240 0C, In- jector Temperatur 250 0C, split ratio 30:1. Temperaturprogramm für Methyl 2- acetamidoacrylate and N-acetyl-alanin methyl ester: 120 0C für 2 min, 10 °C/min auf 160 0C, 30 °C/min auf 200 0C, gehalten für 2 min. Retentionszeiten: 4.89 min and 5.12 min.
Der Enantiomerenüberschuß wurde bestimmt unter Verwendung einer modifizierten - Cyclodextrin Kapillarsäule (Chiraldex® B-TA, 40 m, 0.25 mm). Detector Temperatur 200 0C, I njector Temperatur 180 0C, split ratio 20:1. Temperaturprogramm: 130 0C für 5 min, 2°C/min auf 135 0C, 15 °C/min auf 180 0C, gehalten für 2 min. Retentionszeiten: {R/S)- and {S/R)- 5.18 and 5.35 min, resp. Die absolute Konfiguration ist "S" , nachgewiesen durch Vergleich mit authentischen Proben.
TABELLE 3
[2-propanol] mM Umsetzung %
3 (0.6 eq.) 54
6 (1.2 eq.) 90
7 (1.4 eq.) >99
8 (1.6 eq.) >99
10 (2 eq.) >99
20 (4 eq.) >99
60 (12 eq.) >99
Blank (no OPRI ) <3
GC-FID Analysen wurden auf einem Varian 3800 Gas Chromatographen mit H2 als Carriergas (14,5psi) durchgeführt.
Tabelle 1. Asymmetrische Bioreduktion von α-Dehydroaminosäurederivaten mit OPRl, OPR3, YqjM und Zymomonas mobilis Reduktase.
Zymomonas mobüis
OPRl 0PR3 YqjM
Substrat Produkt Cofaktor Reductase c. % E.e. % E.e. % E.e. % C. % E.e. %
^ XQ.Me NADH 16 91 <1 n.d 41 97 <] n.d
Y .C
NHA' O Me NADPH 21 95 <1 n.d. 50 98 <1 ILd c T NHAc '
NAD4ZFDH" 63 >98 n.d. - 9t >98 n.d. -
W
NADP+/G6PDHb 31 >98 n.d. - 51 >98 n.d. -
NADH 19 >99 <5 n.d. 26 >99 <5 ' n.d
.CO7Me
MeO1C MeO2C-^C°^e NADPH 21 >99 <5 n.d. 32
NHAc NHAc >99 <5 n.d
NAD+ZFDH a 98 >99 n.d. - >99 >99 n.d. -
(S)- NADP+,'G6PDHb 31 >99 n.d. 35 >99 n.d.
Tabelle 2. Asymmetrische Bioreduktion von α-Dehydroaminosäurederivaten mit OYEl, OYE2 und OYE3.
OYEl OYE2 OYE3
Substrat Produkt Cofaktor c. % E.e. % c. % E.e. % c. % E.e. %
1 NADH 30 95 6 85 15 95
^CO2Me \ ,CO2Me
2 NADPH 24 94 4 74 17 95 NH.Ac NHAc
3 NADVFDH" 7 >98 15 >98 89 >98
(S)
4 NADP7G6PDHb 14 >98 9 >98 42 >98
5 '" NADH <5 ad. n.c. 36 23
^•s. ^.CO.Mε ^-^ ,CO, Me MeO2C Y^ ι
6 MeO2C ^Y^ NADPH <5 n.d. - 76 10
NHAc NHAc
7 NAD+VFDH" n.d. _ n.d. _ >99 57
(S)
8 NADP+/G6PDHb n.d. - n.d. - 49 39
1 FDH - Formiat Dehydrogenase/Formiat. G6PDII = Glucose-6-phosphat Dehydrogenase/Glucose-6-phosphat.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur enzymatischen Herstellung von Aminosäuren der allgemeinen Formel (3) oder (4) aus alpha-Dehydroaminosäuren der allgemeinen Formel (1 ) oder (2)
(1) (2)
(3) (4)
wobei R 1 , R2 unabhängig voneinander für H, d-C6- Alkyl, C2-C6- Alkenyl, einen gegebenenfalls substituierten carbo- oder heterocyclischen, aromatischen oder nichtaromatischen Rest oder einen Alkylaryrest, oder einen Carboxylrest
( - COOR) steht,
R3 für H, Formyl, Acetyl, Propionyl, Benzyl, Benzyloxycarbonyl, BOC, Alloc steht,
R für H, CrC6- Alkyl, Aryl steht,
durch Reduktion einer Verbindung der Formel (1 ) oder (2) in Gegenwart einer Reduktase (i) umfassend wenigstens eine der Polypeptidsequenzen SEQ ID
N0:1 , 2, 3, 4, 5, 6 oder
(ii) mit einer funktional äquivalenten Polypeptidsequenz, die mindestens 80% Sequenzidentität mit SEQ ID N0:1 , 2, 3, 4, 5, 6 aufweist.
[20070989] DP/10.12.2008
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Reduktion mit NADPH oder NADH als Cofaktor durchgeführt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete Cofaktor enzymatisch regeneriert wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Cofaktor- Regenerierung durch Glucose-Dehydrogenase oder Formiatdehydrogenase oder einen sekundären Alkohol erfolgt.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Reduktion in einem wässrigen, wässrig-alkoholischen oder alkoholischen Reaktionsmedium erfolgt.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Reduktase immobilisiert vorliegt.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Enzym aus- gewählt ist unter Reduktasen aus Bacillus subtilis und Lycopersicum esculen- tum.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei eine Verbindung der Formel (1 ) umgesetzt wird, worin R1 für H, R2 für H, R3 für Acetyl steht.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Reaktion bei einer Temperatur im Bereich von 0 bis 450C und/oder einem pH-Wert im Bereich von 6 bis 8 erfolgt.
10. Verwendung einer Verbindung der Formel (3) oder (4), hergestellt nach einem Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche als Zwischenprodukt für die chemische oder enzymatische Wirkstoffsynthese.
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