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WO2019002459A1 - Enzyme und verfahren zur stereoselektiven reduktion von carbonylverbindungen, oxidation sowie stereoselektiven reduktiven aminierung - zur enantioselektiven darstellung von alkoholaminverbindungen - Google Patents

Enzyme und verfahren zur stereoselektiven reduktion von carbonylverbindungen, oxidation sowie stereoselektiven reduktiven aminierung - zur enantioselektiven darstellung von alkoholaminverbindungen Download PDF

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Publication number
WO2019002459A1
WO2019002459A1 PCT/EP2018/067407 EP2018067407W WO2019002459A1 WO 2019002459 A1 WO2019002459 A1 WO 2019002459A1 EP 2018067407 W EP2018067407 W EP 2018067407W WO 2019002459 A1 WO2019002459 A1 WO 2019002459A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
enzyme
hydroxy
fusion protein
compounds
oxidation
Prior art date
Application number
PCT/EP2018/067407
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Tarek SHANATI
Marion Ansorge-Schumacher
Original Assignee
Technische Universität Dresden
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Technische Universität Dresden filed Critical Technische Universität Dresden
Priority to EP18735275.2A priority Critical patent/EP3645500A1/de
Publication of WO2019002459A1 publication Critical patent/WO2019002459A1/de

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    • C07B2200/00—Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
    • C07B2200/07—Optical isomers

Definitions

  • the invention relates to enzymes and processes for the stereoselective reduction of carbonyl compounds for isomerization between ephedrine and pseudoephedrine and for the stereoselective reductive amination of chiral alpha-hydroxy ketones to the amine and the corresponding counterreactions. Also included are the corresponding fusion proteins, nucleotide sequences and vector, cell and organism. Furthermore, the invention relates to the corresponding methods.
  • Alcohol dehydrogenases are oxidoreductases (enzyme class 1), which catalyze the hydride transfer depending on the co-factor nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) or nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP). Alcohol dehydrogenases may be (R) - or (S) - specific according to the hydride transfer on the Si side or the re side of the prochiral carbonyl group.
  • Alcohol dehydrogenases are described for use in the synthesis of chiral arylaliphatic compounds.
  • One of these chiral arylaliphatic compounds is phenylacetylcarbinol (PAC), which serves as an intermediate in the pharmaceutical production of ephedrine and pseudoephedrine.
  • PAC phenylacetylcarbinol
  • Toukoniitty et al. describe the chemical synthesis of (R) -PAC via a platinum complex catalyst with an enantiomeric excess of 65% and a yield of 90% for both enantiomers (Toukoniitty et al., 2004).
  • Torres et al. disclose the synthesis of PAC with a rhodium catalyst (Rh / MCM-41), wherein Enantiomeric excess of up to 70% ee and a yield of 80% is achieved (Torres et al., 2014).
  • CN 101486998 A discloses a specific Morganella morganii carbonyl reductase (CMCC (B) NO 49208), its nucleic acid sequence and protein sequence.
  • the carbonyl reductase asymmetrically reduces the substrate 2-amino-1-phenyl-propanone to (D) - pseudoephedrine ((-) - (1 S, 2S) -2-methylamino-1-phenylpropan-1-ol) with addition of NAD + as a cofactor with a yield of 89%.
  • the enantiomeric purity of the product is not disclosed.
  • asymmetric ⁇ -hydroxycarbonyl compounds are prepared using pyruvate decarboxylases or their mutants.
  • WO 90/04639 A1 discloses a process for the preparation of (R) -phenylacetylcarbinol (PAC) from benzaldehyde and pyruvate, an immobilized cell mass of non-viable cells of mutant yeast strains which are resistant to aldehyde inhibition during PAC formation, preferably Saccharomyces cerevisiae P- 2180-1A-8pa, for use in the method and a method of making the immobilized cell mass.
  • the yeast strains form a pyruvate decarboxylase. By the method, yields of up to 73% are achieved.
  • WO 2001044486 A1 describes a process for the preparation of carbinols, in particular (R) -phenylacetylcarbinol (PAC), by means of yeast strains, in particular Saccharomyces cerevisiae, with a yield of up to 84% with an enantiomeric purity of 90% ee or an enantiomeric purity of up to 94% ee with a yield of 51%.
  • PAC -phenylacetylcarbinol
  • WO 99/09195 A1 discloses a process for preparing enantiomerically pure phenylacetylcarbinols, in particular (R) -phenylacetylcarbinol, from acetaldehyde and benzaldehydes in the presence of pyruvate-decarboxylase from Zymomonas, preferably Zymomonas mobilis, preference being given to reacting unsubstituted benzaldehyde.
  • the disadvantage is the formation of by-products and a low reaction rate in the event of deviations from the optimal acetaldehyde concentration of 20 to 50 mM.
  • DE 10142574 A1 describes the use of a two-phase system with at least one aqueous phase and preferably one organic phase, particularly preferably octanol.
  • a two-phase system with at least one aqueous phase and preferably one organic phase, particularly preferably octanol.
  • WO 2016/041535 A1 discloses a mutated lyase from Aceobacter pasteurianus and a method for the asymmetric synthesis of (S) -phenylacetylcarbinol (S-PAC) using the mutated lyase, wherein yields of up to 73% after 48 h and enantiomeric purity of up to 98% ee can be achieved.
  • DE3408850C2 describes the isomerization of similar compounds (with free amine or acetylated amino function) by acid treatment via an oxazolinium intermediate.
  • the disadvantage of the process under very harsh conditions very high temperatures, concentrated H2SO4 or HCl, temperatures close to acetic acid reflux, 50% NaOH). Enantiomeric purities are not published.
  • stereoselective in this case the diastereoselective
  • reductive amination of such chiral hydroxy ketones is a reaction of industrial interest.
  • the object of the present invention is to provide enzymes and processes for the stereoselective reduction of various carbonyl compounds to chiral Hydroxy compound and for the oxidation of these chiral hydroxy compounds (back) to the carbonyl compound and finally also to the isomerization between ephedrine and pseudoephedrine (combination of the latter reduction and oxidation). It is highly desirable to prepare both the chiral (R) and (S) compounds.
  • the object is achieved by an enzyme having an amino acid sequence with at least 85% identity to one of the sequences SEQ ID NO. 1 (EDH) or 2 (PseDH), where the enzyme is present as a monomer, dimer, polymer or immobilized.
  • EDH amino acid sequence with at least 85% identity to one of the sequences SEQ ID NO. 1 (EDH) or 2 (PseDH), where the enzyme is present as a monomer, dimer, polymer or immobilized.
  • enzyme stands for the enzyme with at least 85% identity to SEQ ID NO. 1
  • enzyme (PseDH) for the enzyme with at least 85% identity to SEQ ID NO. Second
  • Identity means the number of matching amino acids relative to the total number of amino acids.
  • the crosslinking of the proteins or the covalent compound and the compound via interactions to solid phases such as solid surfaces, polymers, polymer beads, glass beads or resin in, for example, particulate or particulate form.
  • the invention likewise provides a fusion protein comprising at least one amino acid sequence which has at least 85% identity to the sequence SEQ ID NO. 1 (EDH) or 2 (PseDH), wherein the fusion protein is present as a monomer, dimer, polymer or immobilized.
  • this also includes that the fusion protein according to the invention has both of the abovementioned amino acid sequences.
  • the fusion protein further comprises a label, a peptide linker, and / or another enzyme.
  • a marker or affinity tag is understood to mean a short peptide sequence which serves to detect and / or purify the fusion protein.
  • the marker is selected from a polyhistidine (His) tag, a streptavidin (Strep) tag, a maltose-binding protein (MBP) tag, an S-tag, or a glutathione S-transferase (GST). Day.
  • a peptide linker is understood to mean a short peptide sequence for linking components of the fusion protein while retaining their activity.
  • the peptide linker has 5 to 20 amino acids.
  • the additional enzyme is selected from NAD + or NADP + dependent enzymes.
  • NAD + - or NADP + -dependent enzymes can regenerate spent NAD (P) H.
  • NAD + - or NADP + -dependent enzymes are derived from alcohol dehydrogenases (ADH), formate dehydrogenases (FDH), glucose dehydrogenases (GDH), glucose-6-phosphate dehydrogenases (G6PDH), glutamate dehydrogenases (GluDH), NADH oxidases (NOX), NAD + - dependent hydrogenases or phosphite dehydrogenases (PtDH) selected.
  • the further enzyme is selected from formate dehydrogenases, for example from Candida boidinii (SEQ ID NO. 9).
  • the enzymes with an amino acid sequence SEQ ID NO. 1 or 2 can be isolated from Arthrobacter Speeles TS-15 (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Inhoffenstrasse 7B, 38124 Braunschweig, International Patent Application Number: DSM 32400, hereinafter referred to as DSM 32400).
  • the enzyme is a dehydrogenase, in particular a short-chain dehydrogenase (short-chain dehydrogenase / reductase superfamily, SDR) (Kavanagh et al., 2008).
  • a dehydrogenase in particular a short-chain dehydrogenase (short-chain dehydrogenase / reductase superfamily, SDR) (Kavanagh et al., 2008).
  • the enzyme having an amino acid sequence with at least 85% identity to SEQ ID NO. 1 is a prelog-specific ephedrine dehydrogenase (EDH).
  • EH prelog-specific ephedrine dehydrogenase
  • a prelog-specific ephedrine dehydrogenase (EDH) in the context of the invention is an enzyme which catalyzes the oxidation of (R) -hydroxy groups, in particular the oxidation of ephedrine according to formula (I): (1R, 2S) -2-methylamino-1-phenylpropane -1-ol - (S) -2-methylamino-1-phenylpropane-1-one
  • the enzymes of the present invention catalyze the reduction of the carbonyl compound, which is advantageously stereoselective.
  • the enzyme having an amino acid sequence with at least 85% identity to SEQ ID NO. 2 an anti-prelog specific pseudoephedrine dehydrogenase (PseDH).
  • An anti-prelog specific pseudoephedrine dehydrogenase (PseDH) in the sense of the invention is an enzyme which catalyzes the oxidation of (S) -hydroxy groups, in particular the oxidation of pseudoephedrine according to formula (II):
  • Diastereoselectivity and enantioselectivity includes. Diastereoselectivity is used when one of the possible diastereomeric products of one reaction is preferentially formed. Thus, in the case of enantioselectivity, the possible products are enantiomers and one of the possible enantiomers is preferentially formed.
  • the invention enables the catalytic oxidation of, in particular, ephedrine and pseudoephedrine to the product (S) -2-methylamino-1-phenylpropan-1-one.
  • the oxidation of the hydroxy group (of ephedrine or pseudoephedrine) by means of one of the enzymes according to the invention is combined with the stereoselective reduction of the resulting carbonyl group with the other enzymes according to the invention (SEQ ID NO. 1 or 2).
  • SEQ ID NO. 1 or 2 the other enzymes according to the invention
  • isomerized between ephedrine and pseudoephedrine proceeds via the intermediate in Figure 4 (Formula IV).
  • the enzyme has an amino acid sequence with at least 90% identity to one of the sequences SEQ ID NO. 1 or 2, particularly preferably at least 95% identity to one of the sequences SEQ ID NO. 1 or 2.
  • the enzyme has an amino acid sequence with at least 90% identity, preferably 95% identity in the active center of the enzyme having the sequence SEQ ID NO. 1 or 2 on.
  • An active center is understood to be the region of an enzyme which is responsible for the catalytic action by binding and reaction of the substrate.
  • the active site of ephedrine dehydrogenase (EDH) having the sequence SEQ ID NO. 1 comprises 54 amino acids, in particular amino acids 142 to 160 (SEQ ID NO: 3), amino acids 186 to 214 (SEQ ID NO: 4) and amino acids 242 to 247 (SEQ ID NO: 5).
  • the active site of pseudoephedrine dehydrogenase (PseDH) having the sequence SEQ ID NO. Figure 2 comprises 71 amino acids, particularly amino acids 135 to 156 (SEQ ID NO: 6), amino acids 182 to 220 (SEQ ID NO: 7), and amino acids 246 to 255 (SEQ ID NO: 8).
  • the enzyme of the invention has a length of 240 amino acids to 300 amino acids.
  • the enzyme according to the invention comprises one of the sequences SEQ ID NO. 1 or 2.
  • the enzyme comprises the sequence SEQ ID NO. 1 has a length of 249 amino acids to 280 amino acids. In a further embodiment, the enzyme comprising the sequence SEQ ID NO. 2 has a length of 274 amino acids to 300 amino acids.
  • the enzyme consists of one of the sequences SEQ ID NO. 1 or 2.
  • an enzyme obtained by isolation from the same organism Arthrobacter species TS-15 (DSM 32400), having an amino acid sequence with at least 85% identity to the sequence SEQ ID NO. 13 (AlAmDH),
  • this enzyme having an amino acid sequence with at least 85% identity to SEQ ID NO. 13 an anti-prelog specific alanine amine dehydrogenase (AlAmDH).
  • enzyme stands for the last-mentioned enzyme with at least 85% identity to SEQ ID NO. 13. In a preferred embodiment, the identity is 90%, more preferably 95%.
  • the latter enzyme catalyzes the stereoselective reductive amination of chiral alpha-hydroxy ketones to the 1-hydroxy-2-amino product and the opposite oxidation reaction of 1-hydroxy-2-amino compounds to the alpha-hydroxy ketone.
  • oxidation takes place in the presence of the EDH, PseDH or AlAmDH-encoding enzyme of the invention or fusion protein and cofactor NAD +; on the other hand, in the presence of NADH instead of NAD + , a reduction takes place.
  • the present enzyme regulates which functional group can be reacted by lowering the activation energy of the reaction (and acting as a catalyst).
  • NADH and NAD + are present simultaneously before or during the reaction, the equilibrium between reaction and backreaction is controlled by the present regenerant.
  • an enzyme is additionally used for the regeneration of the cofactor.
  • FDH with formic acid salts as a regenerating agent regenerate NAD +, whereas NADH is regenerated by, for example, NADH oxidase with O2.
  • the enzyme for regenerating the cofactor is preferably selected from alcohol dehydrogenases (ADH), formate dehydrogenases (FDH), glucose dehydrogenases (GDH), glucose-6-phosphate dehydrogenases (G6PDH), glutamate dehydrogenases (GluDH), NAD + -dependent hydrogenases or phosphite dehydrogenases (PtDH). It is preferably selected from formate dehydrogenases or NADH oxidases, particularly preferably from Candida boidinii (SEQ ID NO. 9).
  • the enzymes according to the invention advantageously have a high stereoselectivity in the reduction of carbonyl compounds, preferably in the reduction of carbonyl compounds of the formula (III), particularly preferably in the case of dicarbonyl compounds.
  • stereoselectivity is meant the preferred formation of one of several possible stereoisomers.
  • the enzymes according to the invention have a low substrate specificity.
  • substrate specificity is understood to mean the ability of enzymes to bind and convert only one particular substrate or group of substrates in their active site.
  • fusion protein according to the invention with a further enzyme selected from NAD + - or NADP + -dependent enzymes in a process for the stereoselective reduction of carbonyl compounds no co-factor is needed.
  • Another aspect of the invention relates to a nucleotide sequence comprising a sequence coding for an inventive enzyme or a fusion protein.
  • the nucleotide sequence comprises one of the sequences SEQ ID NO. 10 or SEQ ID NO. 1 1.
  • the nucleotide sequences SEQ ID NO. 10 or SEQ ID NO. 1 1, encoding the enzymes of the invention can be isolated from genomic material of Arthrobacter species TS-15 (DSM 32400).
  • a further aspect of the invention relates to a vector comprising at least one nucleotide sequence according to the invention.
  • a vector is understood to mean a delivery vehicle for the transfer of a nucleotide sequence into a cell.
  • the vector is recombinant.
  • Recombinant means an artificial molecule which has been assembled by means of genetic engineering methods.
  • the vector comprises one of the nucleotide sequences SEQ ID NO. 10 or SEQ ID NO. 1 1.
  • the vector is selected from a plasmid or cosmid.
  • a plasmid is understood to mean a small, annular, extrachromosomally present, double-stranded DNA molecule.
  • a cosmid is understood as meaning a plasmid which contains so-called cos sites (cohesive sites).
  • the vector further comprises a nucleotide sequence encoding an NAD + or NADP + -dependent enzyme.
  • NAD + - or NADP + -dependent enzymes can regenerate spent NAD (P) H.
  • NAD + - or NADP + -dependent enzymes are from alcohol dehydrogenases (ADH), formate dehydrogenases (FDH), glucose dehydrogenases (GDH), glucose-6-phosphate dehydrogenases (G6PDH), glutamate dehydrogenases (GluDH), NAD + -dependent hydrogenases or phosphite dehydrogenases ( PtDH) selected.
  • the vector comprises a nucleotide sequence encoding formate dehydrogenases, more preferably from Candida boidinii (SEQ ID NO: 12).
  • the invention furthermore relates to a cell or organism containing at least one nucleotide sequence according to the invention. Also included in one embodiment is that this nucleotide sequence is included as part of a vector in the cell or organism of the invention. In a preferred embodiment, the cell or organism is not human.
  • the nucleotide sequence of the invention is integrated into the genome of the cell or organism.
  • the cell or organism is from E. coli, Corynebacterium glutamicum, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris or from the genus Arthrobacter, Rhodococcus, preferably Arthrobacter aurescens; Bacillus, preferably Bacillus subtilis; Streptomyces or Pseudomonas, preferably Pseudomonas sp., Selected.
  • the cell or organism is Arthrobacter aurescens, preferably Arthrobacter species TS-15 (DSM 32400).
  • One aspect is also a fusion protein comprising an amino acid sequence that is at least
  • the enzyme is present as a monomer, dimer, polymer or immobilized.
  • One aspect is also the nucleotide sequence comprising a sequence coding for the last-mentioned inventive enzyme or the last-mentioned inventive fusion protein.
  • One aspect is also vector, cell or organism containing this latter nucleotide sequence.
  • the invention likewise provides a process for the stereoselective reduction of carbonyl compounds or for the oxidation of hydroxy compounds, comprising the steps of a) providing an enzyme according to the invention (EDH or PseDH) or a corresponding fusion protein,
  • the provision of enzymes in the methods of the invention involves, in addition to providing in isolated form, also providing a cell or organism comprising a nucleotide sequence encoding the corresponding enzyme of the invention. Under certain conditions, the cell or organism produces and deposits this enzyme free.
  • the cell or organism in the provision of the cell or the organism in the method according to the invention eliminates the protein purification of the enzyme. Further advantageously, the enzyme has a higher stability in the cell or organism.
  • alpha-aryl ketones are stereoselectively reduced to the corresponding 1-aryl-1-hydroxy compounds with the inventive method.
  • the carbonyl compound is selected from symmetrical or unsymmetrical, substituted or unsubstituted ketones, ⁇ - or ⁇ -diketones, ⁇ -ketoesters, ⁇ -aminoketones, ⁇ -hydroxyketones or ⁇ -haloketones.
  • the carbonyl compound comprises the following substrates:
  • Substituted according to the invention means the replacement of any number of hydrogen atoms to halogen, preferably Cl, F or I, against hydroxy, hydroxyalkyl, amino, aminoalkyl, carbonyl, carbamoyl, carboxylic acid chloride, acetyl, cyano, alkyl, alkenyl or alkenyl.
  • halogen preferably Cl, F or I
  • Alkyl, alkenyl or alkynyl in the context of the invention preferably denotes substituted or unsubstituted C1-C4 chains.
  • the at least one carbonyl compound is selected from dicarbonyl compounds, preferably from ⁇ - or ⁇ -diketones.
  • Dicarbonyl compounds are advantageously reacted selectively with the process according to the invention or with the enzyme according to the invention to give hydroxycarbonyl compounds.
  • the stereoselective reduction of the process according to the invention, in the case of a diketone starting compound, wherein one of the two carbonyl carbon atoms is substituted with an aromatic proceeds regioselectively, i. the carbonyl function is selectively reacted on the aromatic-substituted carbonyl carbon.
  • the ⁇ - or ⁇ -diketones are cyclic ⁇ - or ⁇ -diketones.
  • the at least one carbonyl compound is a carbonyl compound of the formula (III)
  • X is selected from unsubstituted or substituted aryl, preferably phenyl radicals; or heterocyclic radicals, preferably furanyl radicals, thiophene radicals or pyridine radicals; wherein Y is selected from unsubstituted or substituted alkyl, aryl, heterocyclic or substituted carbonyl radicals.
  • the carbonyl compound of formula (III) wherein X is selected from substituted phenyl radicals is selected from phenyl-a-carbonyl compounds having at least one alkyl group, one hydroxy group, one alkoxy group, preferably one methoxy group; and / or a halogen on the phenyl ring.
  • the carbonyl group of a dicarbonyl compound having a phenyl radical which is in opposition to the phenyl radical is advantageously regioselectively reduced by the process according to the invention or with the enzyme according to the invention.
  • the at least one carbonyl compound is a phenyl a-diketone.
  • the reaction steps according to the invention are carried out in at least one solvent.
  • a solvent is understood as meaning an inorganic or organic liquid which brings solid or liquid substances to solution by physical means.
  • the prerequisite for suitability as a solvent is that neither the solvent nor the solute chemically changes during the dissolution process.
  • the at least one solvent is selected from an aqueous solution or a two-phase system comprising an aqueous solution and at least one organic solvent.
  • the at least one organic solvent is particularly preferably made of long-chain alkanes, preferably hexane; long-chain alkanols, preferably 1-hexanol, 1-octanol or 1-decanol; or ethers, preferably cyclopentyl methyl ether (CPME), methyl tert-butyl ether (MTBE) or 2-methyltetrahydrofuran (2-MTHF); selected.
  • long-chain alkanes preferably hexane
  • long-chain alkanols preferably 1-hexanol, 1-octanol or 1-decanol
  • ethers preferably cyclopentyl methyl ether (CPME), methyl tert-butyl ether (MTBE) or 2-methyltetrahydrofuran (2-MTHF); selected.
  • the process according to the invention is carried out for the stereoselective reduction of carbonyl compounds or for the oxidation of hydroxy compounds in a two-branched system, with the specification for steps a) to c):
  • the solution of the sparingly soluble carbonyl compounds in the at least one organic solvent and the enzymatic activity of the enzyme is retained in the aqueous solution.
  • the provision of an enzyme or a fusion protein according to the invention is carried out in step a) and the at least one solvent is selected from an organic solvent, the organic solvent being selected from alcohols, preferably from alkanols, more preferably 1-decanol ,
  • step c) is carried out at a temperature between 0 ° C and 80 ° C, preferably at a temperature between 5 ° C and 50 ° C, more preferably at 20 ° C to 35 ° C.
  • At least one cofactor is added in step c).
  • Co-factors are understood to mean molecules and molecular groups which are necessary for the enzymatic activity of enzymes.
  • the cofactor is selected from NADH, NADPH and NAD + , preferably the cofactor is NADH or NAD + .
  • the cofactor is reacted in step c).
  • the co-factor is regenerated in step c). In one embodiment of the method according to the invention, the co-factor is regenerated by addition of an NAD + or NADP + -dependent enzyme.
  • NAD + - or NADP + -dependent enzymes are derived from alcohol dehydrogenases (ADH), formate dehydrogenases (FDH), glucose dehydrogenases (GDH), glucose-6-phosphate dehydrogenases (G6PDH), glutamate dehydrogenases (GluDH), NAD + -dependent hydrogenases or phosphite dehydrogenases ( PtDH) selected.
  • the NAD + or NADP + -dependent enzyme is selected from formate dehydrogenases, more preferably from Candida boidinii (SEQ ID NO. 9).
  • formate dehydrogenases more preferably from Candida boidinii (SEQ ID NO. 9).
  • no cofactor is required for the process according to the invention by addition of an NAD + or NADP + -dependent enzyme.
  • the co-factor is regenerated by addition of a formate dehydrogenase, more preferably from Candida boidinii.
  • a formate dehydrogenase more preferably from Candida boidinii.
  • the addition of formate (methanoic acid), preferably potassium formate takes place in step c); in a concentration of 0.2 mol / l to 2 mol / l, preferably 0.5 mol / l to 1 mol / l.
  • conversion rates of at least 5 mg per hour in 1 ml of solvent, preferably at least 10 mg per hour in 1 ml of solvent, more preferably even 15, are achieved. Furthermore, yields of up to 99% and stereoselectivities of up to 99% ee are advantageously achieved.
  • the invention also provides a process for the isomerization between ephedrine and pseudoephedrine, comprising the steps:
  • a cofactor such as NADH or NAD + is present during the contacting in step c) and d).
  • the cofactor in step c) differs from that in step d).
  • steps c) and d) at least one purification or isolation step for purifying or isolating the intermediate compound (S) -2-methylamino-1-phenylpropan-1-one is carried out.
  • the invention also provides a process for the stereoselective reductive amination of chiral alpha-hydroxy ketones to the 1-hydroxy-2-amino product or to the opposite oxidation of 1-hydroxy-2-amino compounds to the alpha-hydroxy ketone, comprising the steps
  • AlAmDH an enzyme according to the invention
  • AlAmDH a fusion protein according to the invention
  • Alanine-amine dehydrogenase also requires a cofactor such as NADH for reductive amination.
  • the opposite reaction, ie the reverse reaction, of the oxidation of 1-hydroxy-2-amino compounds to the alpha-hydroxy ketone also requires a cofactor, for example NAD + .
  • methylamine is additionally used for the reductive amination.
  • the reduction / oxidation process of the present invention is combined with the present invention's reductive amination of a hydroxyketone (previously obtained from the dicarbonyl compound) to a hydroxy-amino compound.
  • a hydroxyketone previously obtained from the dicarbonyl compound
  • a hydroxy-amino compound Preferably, an alpha-dicarbonyl compound used, so that according to the invention stereoselective reduction to the chiral alpha-hydroxy ketones and subsequent reductive amination of a 1-hydroxy-2-amino compound is formed.
  • the reductive amination proceeds preferably diastereoselectively.
  • 1-phenyl-1,2-propanedione is selectively converted to ephedrine or pseudoephedrine by this combination (see FIG. 4).
  • the reaction sequence via the R-alcohol (R-PAC) to the 1R, 2S-ephedrine can be catalyzed by means of EDH and AlAmDH.
  • the reaction sequence can be catalyzed by means of PseDH and AlAmDH via the S-alcohol (S-PAC) to the 1S, 2S-pseudoephedrine.
  • a chiral aminoalcohol can be prepared from the corresponding diketone in a cascade reaction enantioselectively with more than 98% ee and without by-products.
  • the chiral alpha-hydroxy ketone (starting material) is an alpha-aryl-alpha-hydroxy ketone, in particular (R) -PAC or (S) -PAC.
  • the invention also provides the use of at least one enzyme according to the invention (EDH or PseDH), at least one fusion protein according to the invention (EDH or PseDH) or at least one vector, cell or organism according to the invention (EDH or PseDH) in the processes according to the invention, for: - stereoselective reduction of carbonyl compounds or oxidation of hydroxy compounds, or
  • the invention also provides the use of an enzyme according to the invention (AlAmDH), a fusion protein (AlAmDH) according to the invention or a vector, cell or organism (AlAmDH) according to the invention in the method according to the invention, for:
  • the invention also provides a kit comprising:
  • At least one of the enzymes according to the invention (EDH, PseDH and AlAmDH),
  • EDH EH, PseDH and AlAmDH
  • the cofactor is a molecule that is essential for the function of the enzyme or fusion protein of the invention.
  • it is NAD + or NADH.
  • the kit further contains an enzyme for regenerating the cofactor, which is as defined above.
  • the sequencing technique MiSeq Sequencer (lllumina, 2x250 bp paired-end sequencing, v3 chemistry, 2.9 million reads) is used and the assembly of the reads is done via CLC Genomics software.
  • the software "mauve” is used and the resulting order is checked manually.
  • the expression of the native peptide sequences of EDH and PseDH is carried out by cloning the nucleotide sequences SEQ ID NO. 10 or SEQ ID NO. 1 1 without marker into a pETDuet vector. Furthermore, the nucleotide sequence of formate dehydrogenase (FDH) from Candida boidinii is in each case cloned into the second rear multiple cloning site.
  • FDH formate dehydrogenase
  • EDH and PseDH are expressed in the form of a fusion protein with formate dehydrogenase (FDH) from Candida boidinii in the recombinant strain E. coli SHuffleT7.
  • FDH formate dehydrogenase
  • a polyhistidine tag is inserted at the N-terminus as well as at the C-terminus.
  • the N-terminal marker consists of 6 histidine residues followed by a linker peptide "SSGHIDDDDKH" and FDH
  • the C-terminal marker consists of 6 histidine residues between EDH and PseDH and FDH, respectively, and EDH and PseDH showed enzymatic activity as fusion proteins.
  • EDH fusion protein was generated in which the N-terminus with the additional amino acid sequence "MNGRI” begins and a rigid short peptide linker "AAAKEAAAKAA” was inserted. This EDH fusion protein showed 30% higher enzymatic activity than the wild-type but was less soluble.
  • the two generated E. co // 'strains shuffle T7 with the vectors pETDuet_PseDH_FDH or pETDuet_EDH_FDH be used for two-phase whole cell biotransformation or two-phase cell-free biotransformation.
  • lyophilized cells or 10 mg for two-phase cell-free biotransformation are incubated for 30 min in 100 mM Kpi buffer (pH 7.5) and mixed until a homogeneous suspension is obtained. Subsequently, potassium formate is added at a final concentration of 0.1M to 1M. To a volume of the aqueous phase of 1 ml, 1 ml of organic solvent (cyclopentyl methyl ether (CPME) or hexanol) is added to the substrate.
  • organic solvent cyclopentyl methyl ether (CPME) or hexanol
  • the substrate concentration varies according to the enzyme activity and the solubility of the respective substrate from 20 mM to 600 mM, in particular 371, 5 mM acetylbenzoyl, 500 mM methyl benzyl formate, 50 mM 1-phenylglyoxal, 40 mM isatin, 500 mM 1-phenyl-1, 3- butanedione, 600 mM 1-phenyl-1-propanone, 145 mM desylbromide, 163 mM 4- Chlorobenzil, 20 mM 2,2'-furil, 380 mM benzil, 143 mM 2,2'-dichlorobenzil, 324 mM 4,4'-difluorobenzil and 335 mM 4,4'-dimethylbenzil.
  • Detection of the products was by 1 H NMR measurement at 400 MHz and deuterated chloroform (CDC) was used as the solvent).
  • the chiral separation of the substrates is carried out in the Knauer Smartline HPLC system with a CHIRALPAK IA column (250 x 4.6 mm particle size 5 ⁇ ) and by means of the eluent n-hexane: 2-isopropanol 9: 1 with a flow rate of 0.8 ml / min and a temperature of 25 ° C.
  • the analysis is performed at a wavelength of 256 nm.
  • the chirality of the products is determined by means of the rotation values measured by means of a polarimeter (Perkin Elmer) and compared with literature values (Giovannini et al., 2016).

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Abstract

Die Erfindung betrifft Enzyme zur Verwendung in einem Verfahren zur stereoselektiven Reduktion von Carbonylverbindungen oder Oxidation von Hydroxyverbindungen, in einem Verfahren zur Isomerisierung zwischen Ephedrin und Pseudoephedrin und in einem Verfahren zur stereoselektiven reduktiven Aminierung chiraler alpha-Hydroxyketone zum Amin und die Gegenreaktion. Es sind auch umfasst deren Aminosäuresequenz, Fusionsproteine umfassend das Enzym, sowie Vektor, Zelle oder Organismus enthaltend eine Nukleotidsequenz kodierend für das Enzym. Des Weiteren sind die entsprechenden Verfahren und Verwendung in diesen Verfahren umfasst.

Description

Enzyme und Verfahren zur stereoselektiven Reduktion von Carbonylverbindungen, Oxidation sowie stereoselektiven reduktiven Aminierung - zur enantioselektiven Darstellung von Alkoholaminverbidnungen
Die Erfindung betrifft Enzyme sowie Verfahren zur stereoselektiven Reduktion von Carbonylverbindungen zur Isomerisierung zwischen Ephedrin und Pseudoephedrin und zur stereoselektiven reduktiven Aminierung chiraler alpha-Hydroxyketone zum Amin und die entsprechenden Gegenreaktionen. Beinhaltet sind auch die korrespondierenden Fusionsproteine, Nukleotidsequenzen sowie Vektor, Zelle und Organismus. Des Weiteren betrifft die Erfindung die entsprechenden Verfahren.
Die Synthese pharmakologisch wirksamer Verbindungen erfolgt in der chemischen Industrie weitestgehend durch organische Synthesen. Für die Herstellung chiraler Verbindungen eignen sich organische Synthesen aufgrund geringer Ausbeuten und Enantioselektivitäten häufig nicht.
Eine Alternative bieten enzymkatalysierte Reaktionen, welche unter milden Bedingungen ablaufen und hohe Spezifitäten ermöglichen.
Die Synthese chiraler Hydroxylgruppen erfolgt herkömmlich aus der entsprechenden Carbonylverbindung, z. B. einem prochiralen Keton, Aldehyd oder Ester, unter Verwendung von Dehydrogenasen, insbesondere Alkoholdehydrogenasen. Alkoholdehydrogenasen sind Oxidoreduktasen (Enzymklasse 1 ), welche den Hydridtransfer in Abhängigkeit des Co-Faktors Nicotinamidadenindinukleotid (NAD) oder Nicotinamidadenindinukleotidphosphat (NADP) katalysieren. Alkoholdehydrogenasen können entsprechend des Hydridtransfers auf der Si-Seite oder der Re-Seite der prochiralen Carbonylgruppe (R)- oder (S)-spezifisch sein.
Alkoholdehydrogenasen werden zur Verwendung in der Synthese von chiralen arylaliphatischen Verbindungen beschrieben. Eine dieser chiralen arylaliphatischen Verbindungen ist das Phenylacetylcarbinol (PAC), welches als Intermediat in der pharmazeutischen Herstellung von Ephedrin und Pseudoephedrin dient. Für die Produktion dieses asymmetrischen a- Hydroxyketons wurden verschiedene Verfahren mit unterschiedlichen Enantiomerenreinheiten bzw. Ausbeuten entwickelt. Toukoniitty et al. beschreiben die chemische Synthese von (R)-PAC über einen Platin-Komplex-Katalysator mit einem Enantiomerenüberschuss von 65% und einer Ausbeute von 90% für beide Enantiomere (Toukoniitty et al. 2004). Torres et al. offenbaren die Synthese von PAC mit einem Rhodium-Katalysator (Rh/MCM-41 ), wobei ein Enantiomerenüberschuss von bis zu 70%ee und eine Ausbeute von 80% erreicht wird (Torres ei al. 2014).
Die CN 101486998 A offenbart eine spezifische Carbonylreduktase aus Morganella morganii (CMCC (B) NO. 49208), deren Nukleinsäuresequenz sowie Proteinsequenz. Die Carbonylreduktase reduziert das Substrat 2-Amino-1 -phenyl-propanon asymmetrisch zu (D)- Pseudoephedrin ((-)-(1 S,2S)-2-Methylamino-1 -phenylpropan-1 -ol) unter Zusatz von NAD+ als Co-Faktor mit einer Ausbeute von 89%. Die Enantiomerenreinheit des Produkts wird nicht offenbart.
Alternativ erfolgt die Herstellung von asymmetrischen α-Hydroxycarbonylverbindungen unter Verwendung von Pyruvatdecarboxylasen oder deren Mutanten.
WO 90/04639 A1 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von (R)-Phenylacetylcarbinol (PAC) aus Benzaldehyd und Pyruvat, eine immobilisierte Zellmasse nicht-viabler Zellen mutierter Hefestämme, welche resistent gegen Aldehydinhibierung während der PAC-Bildung sind, bevorzugt Saccharomyces cerevisiae P-2180-1A-8pa, zur Verwendung in dem Verfahren sowie ein Verfahren zur Herstellung der immobilisierten Zellmasse. Die Hefestämme bilden eine Pyruvatdecarboxylase. Mittels des Verfahrens werden Ausbeuten bis zu 73% erreicht.
WO 2001044486 A1 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Carbinolen, insbesondere (R)- Phenylacetylcarbinol (PAC), mittels Hefestämmen, insbesondere Saccharomyces cerevisiae, mit einer Ausbeute von bis zu 84% mit einer Enantiomerenreinheit von 90%ee bzw. einer Enantiomerenreinheit von bis zu 94%ee bei einer Ausbeute von 51 %.
WO 99/09195 A1 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von enantiomerenreinen Phenylacetylcarbinolen, insbesondere (R)-Phenylacetylcarbinol, aus Acetaldehyd und Benzaldehyden in Gegenwart von Pyruvatdecarboxylase aus Zymomonas, bevorzugt Zymomonas mobilis, wobei bevorzugt unsubstituiertes Benzaldehyd umgesetzt wird. Nachteilig sind die Bildung von Nebenprodukten sowie eine geringe Reaktionsgeschwindigkeit bei Abweichungen von der optimalen Acetaldehydkonzentration von 20 bis 50 mM.
Weiterhin beschreibt DE 10142574 A1 die Verwendung eines Zweiphasensystems mit mindestens einer wässrigen Phase und bevorzugt einer organischen Phase, besonders bevorzugt Octanol. Unter Verwendung des Verfahrens werden nach 395 Stunden bei 4°C 195,1 g/l (R)-PAC erhalten, was einer Ausbeute von 98% PAC, bezogen auf Benzaldehyd, und 92,9% PAC, bezogen auf Pyruvat, entspricht.
WO 2016/041535 A1 offenbart eine mutierte Lyase aus Aceobacter pasteurianus sowie ein Verfahren zur asymmetrischen Synthese von (S)-Phenylacetylcarbinol (S-PAC) unter Verwendung der mutierten Lyase, wobei Ausbeuten von bis zu 73% nach 48 h und Enantiomerenreinheit von bis zu 98%ee erreicht werden.
Ein anderes asymmetrisches Hydroxyketon, das (S)-3-Hydroxy-indolin-2-on, wird durch asymmetrische Reduktion von Isatin mit einem Enantiomerenüberschuss von 48%ee und einer Ausbeute von 68% erhalten (Birolli ei al. 2017).
Des Weiteren ist die Isomerisierung zwischen Ephedrin und Pseudoephedrin, die durch Kombination von Oxidation und Reduktion über das alpha-Amino-Keton-Zwischenprodukt verlaufen kann, von besonders hohem Interesse in der chemischen Industrie.
DE3408850C2 beschreibt die Isomerisierung ähnlicher Verbindungen (mit freiem Amin bzw. acetylierter Aminofunktion) mittels saurer Behandlung über ein Oxazolinium-Zwischenprodukt. Nachteilig wird im Verfahren unter sehr harschen Bedingungen gearbeitet (sehr hohe Temperaturen, konzentrierte H2SO4 bzw. HCl, Temperaturen nahe am Essigsäure-Rückfluss, 50%ige NaOH). Enantiomerenreinheiten sind nicht veröffentlicht.
Auch die stereoselektive (in diesem Fall die diastereoselektive) reduktive Aminierung solcher chiraler Hydroxyketone ist eine Reaktion von industriellem Interesse.
Mutti et al (2017) untersuchten die enzymkatalysierte reduktive Aminierung von Carbonylverbindungen zu chiralen (/^-konfigurierten Aminen. Die biokatalytische reduktive Aminierung zur Synthese (S)-konfigurierter Amine ist bisher nicht bekannt.
Turner et al. (2016) nutzen alpha-Keto-säuren zur reduktiven Aminierung, um (S)-aromatische Aminosäuren herzustellen.
Die Nachteile der bekannten Verfahren zur stereoselektiven Reduktion oder stereoselektiven reduktiven Aminierung sind die Bildung von Nebenprodukten, geringe Reaktionsgeschwindigkeiten oder hohe Substratspezifitäten.
Daher besteht die Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, Enzyme und Verfahren bereitzustellen zur stereoselektiven Reduktion verschiedener Carbonylverbindungen zur chiralen Hydroxyverbindung und zur Oxidation dieser chiralen Hydroxyverbindungen (zurück) zur Carbonylverbindung und schließlich auch zur Isomerisierung zwischen Ephedrin und Pseudoephedrin (Kombination der letztgenannten Reduktion und Oxidation). Dabei ist es im hohen Maße wünschenswert, sowohl die chiralen (R)- als auch (S)-Verbindungen herzustellen.
Ferner soll, vorrangig mit Enzymen aus dem gleichen Organismus, auch die stereoselektive reduktive Aminierung chiraler alpha-Hydroxyketone zum 1 -Hydroxy-2-Amin-Produkt sowie die Rückreaktion möglich sein.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch ein Enzym mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 85% Identität zu einer der Sequenzen SEQ ID NO. 1 (EDH) oder 2 (PseDH), wobei das Enzym als Monomer, Dimer, Polymer oder immobilisiert vorliegt.
Im Sinne der Erfindung steht Enzym (EDH) für das Enzym mit mindestens 85% Identität zur SEQ ID NO. 1 , und Enzym (PseDH) für das Enzym mit mindestens 85% Identität zur SEQ ID NO. 2.
Unter Identität wird die Anzahl an übereinstimmenden Aminosäuren bezogen auf die Gesamtanzahl an Aminosäuren verstanden.
Definition immobilisiert
Immobilisiert im Sinne der Erfindung umfasst die Quervernetzung der Proteine bzw. die kovalente Verbindung und die Verbindung über Wechselwirkungen zu festen Phasen wie beispielsweise festen Oberflächen, Polymeren, Polymerkügelchen (Beads), Glaskugeln oder Harz in beispielsweise partikulärer oder Teilchenform.
Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein Fusionsprotein, umfassend mindestens eine Aminosäuresequenz, die mindestens 85% Identität zu der Sequenz SEQ ID NO. 1 (EDH) oder 2 (PseDH) aufweist, wobei das Fusionsprotein als Monomer, Dimer, Polymer oder immobilisiert vorliegt.
Insbesondere ist damit auch umfasst, dass das erfindungsgemäße Fusionsprotein beide der oben genannten Aminosäuresequenzen aufweist.
In einer Ausführungsform umfasst das Fusionsprotein weiterhin einen Marker, einen Peptidlinker und/oder ein weiteres Enzym. Unter einem Marker oder Affinitätstag wird im Sinne der vorliegenden Erfindung eine kurze Peptidsequenz verstanden, welche zum Nachweis und/oder der Reinigung des Fusionsproteins dient. In einer Ausführungsform ist der Marker ausgewählt aus einem Polyhistidin (His)-Tag, einem Streptavidin (Strep)-Tag, einem Maltose-binding protein (MBP)-Tag, einem S-Tag oder einem Glutathion-S-Transferase (GST)-Tag.
Unter einem Peptidlinker wird eine kurze Peptidsequenz zur Verlinkung von Bestandteilen des Fusionsproteins unter Erhalt derer Aktivität verstanden. In einer Ausführungsform weist der Peptidlinker 5 bis 20 Aminosäuren auf.
In einer Ausführungsform ist das weitere Enzym aus NAD+- oder NADP+-abhängigen Enzymen ausgewählt. NAD+- oder NADP+-abhängige Enzyme können verbrauchtes NAD(P)H regenerieren. NAD+- oder NADP+-abhängige Enzyme sind aus Alkoholdehydrogenasen (ADH), Formiatdehydrogenasen (FDH), Glucosedehydrogenasen (GDH), Glucose-6-Phosphat- Dehydrogenasen (G6PDH), Glutamatdehydrogenasen (GluDH), NADH Oxidasen (NOX), NAD+- abhängigen Hydrogenasen oder Phosphitdehydrogenasen (PtDH) ausgewählt. In einer Ausführungsform ist das weitere Enzym aus Formiatdehydrogenasen ausgewählt, beispielsweise aus Candida boidinii (SEQ ID NO. 9).
Die Enzyme mit einer Aminosäuresequenz SEQ ID NO. 1 oder 2 können aus Arthrobacter Speeles TS-15 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstraße 7B, 38124 Braunschweig, Eingangsnummer der Internationalen Hinterlegungsstelle: DSM 32400, im Folgenden als DSM 32400 bezeichnet) isoliert werden.
Erfindungsgemäß ist das Enzym eine Dehydrogenase, insbesondere eine kurzkettige Dehydrogenase (short-chain dehydrogenase/reductase superfamily, SDR) (Kavanagh ei al. 2008).
Erfindungsgemäß ist das Enzym mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 85% Identität zu SEQ ID NO. 1 eine prelogspezifische Ephedrindehydrogenase (EDH). Eine prelogspezifische Ephedrindehydrogenase (EDH) im Sinne der Erfindung ist ein Enzym, welches die Oxidation von (R)-Hydroxygruppen, insbesondere die Oxidation von Ephedrin nach Formel (I) katalysiert: (1 R,2S)-2-Methylamino-1 -phenylpropan-1 -ol — (S)-2-Methylamino-1 -phenylpropan-1 -on
+ NAD+ + NADH + H+ (I). Steht als Cofaktor anstelle von NAD+ das NADH im Überschuss zur Verfügung wird die Gegenreaktion, d.h. die Reduktion der Carbonylgruppen, katalysiert. In einer Ausführungsform, in der mehr NADH als NAD+ vorliegt, katalysieren die erfindungsgemäßen Enzyme demnach die Reduktion der Carbonylverbindung, die vorteilhaft stereoselektiv verläuft.
Erfindungsgemäß ist das Enzym mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 85% Identität zu SEQ ID NO. 2 eine anti-prelogspezifische Pseudoephedrindehydrogenase (PseDH). Eine anti- prelogspezifische Pseudoephedrindehydrogenase (PseDH) im Sinne der Erfindung ist ein Enzym, welches die Oxidation von (S)-Hydroxygruppen, insbesondere die Oxidation von Pseudoephedrin nach Formel (II) katalysiert:
(1 S,2S)-2-Methylamino-1 -phenyl-propan-1 -ol — (S)-2-Methylamino-1 -phenylpropan-1 -on
+ NAD+ + NADH + H+ (II).
Steht als Cofaktor anstelle von NAD+ das NADH im Überschuss zur Verfügung wird die Reduktion der Carbonylgruppen katalysiert.
Vorteilhaft ist es folglich möglich, mit den Erfindungsgemäßen Enzymen (EDH oder PseDH), oder mit den erfindungsgemäßen Fusionsproteinen (EDH oder PseDH) Carbonylgruppen stereoselektiv zu reduzieren.
Unter Stereoselektivität im Sinne der Erfindung wird u.a. Diastereoselektivität und Enantioselektivität umfasst. Von Diastereoselektivität spricht man, wenn von den bei einer Reaktion möglichen, mehreren diastereomeren Produkten eines bevorzugt gebildet wird. Im Falle der Enantioselektivität sind die möglichen Produkte folglich Enantiomere und eines der möglichen Enantiomere wird bevorzugt gebildet.
Durch Kombination der vorhergehenden Ausführungsformen ermöglicht die Erfindung die katalytische Oxidation von insbesondere Ephedrin sowie Pseudoephedrin zu dem Produkt (S)-2- Methylamino-1 -phenylpropan-1 -on.
In einer vorteilhaften Ausführungsform wird die Oxidation der Hydroxygruppe (von Ephedrin bzw. Pseudoephedrin) mittels eines der erfindungsgemäßen Enzyme (SEQ. ID NO. 1 oder 2) kombiniert mit der stereoselektiven Reduktion der entstandenen Carbonylgruppe mit den anderen erfindungsgemäßen Enzymen (SEQ. ID NO. 1 oder 2). In dieser Ausführungsform wird folglich zwischen Ephedrin und Pseudoephedrin isomerisiert. Die Reaktion verläuft über das Zwischenprodukt in Fig. 4 (Formel IV). In einer bevorzugten Ausführungsform weist das Enzym eine Aminosäuresequenz mit mindestens 90% Identität zu einer der Sequenzen SEQ ID NO. 1 oder 2 auf, besonders bevorzugt mindestens 95% Identität zu einer der Sequenzen SEQ ID NO. 1 oder 2.
In einer weiteren Ausführungsform weist das Enzym eine Aminosäuresequenz mit mindestens 90% Identität, bevorzugt 95% Identität im aktiven Zentrum des Enzyms mit der Sequenz SEQ ID NO. 1 oder 2 auf. Unter einem aktiven Zentrum wird der Bereich eines Enzyms verstanden, welcher für die katalytische Wirkung durch Bindung und Umsetzung des Substrats zuständig ist.
Das aktive Zentrum der Ephedrindehydrogenase (EDH) mit der Sequenz SEQ ID NO. 1 umfasst 54 Aminosäuren, insbesondere die Aminosäuren 142 bis 160 (SEQ ID NO. 3), die Aminosäuren 186 bis 214 (SEQ ID NO. 4) und die Aminosäuren 242 bis 247 (SEQ ID NO. 5). Das aktive Zentrum der Pseudoephedrindehydrogenase (PseDH) mit der Sequenz SEQ ID NO. 2 umfasst 71 Aminosäuren, insbesondere die Aminosäuren 135 bis 156 (SEQ ID NO. 6), die Aminosäuren 182 bis 220 (SEQ ID NO. 7) und die Aminosäuren 246 bis 255 (SEQ ID NO. 8).
In einer Ausführungsform weist das erfindungsgemäße Enzym eine Länge von 240 Aminosäuren bis 300 Aminosäuren auf.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Enzym eine der Sequenzen SEQ ID NO. 1 oder 2.
In einer Ausführungsform weist das Enzym umfassend die Sequenz SEQ ID NO. 1 eine Länge von 249 Aminosäuren bis 280 Aminosäuren auf. In einer weiteren Ausführungsform weist das Enzym umfassend die Sequenz SEQ ID NO. 2 eine Länge von 274 Aminosäuren bis 300 Aminosäuren auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform besteht das Enzym aus einer der Sequenzen SEQ ID NO. 1 oder 2.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein Enzym, erhalten durch Isolation aus dem gleichen Organismus Arthrobacter species TS-15 (DSM 32400), mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 85% Identität zu der Sequenz SEQ ID NO. 13 (AlAmDH),
wobei die Sequenz die Aminosäuren in den Positionen
Serin (32), Threonin (364), Serin (368) und Threonin (371 ) umfasst,
wobei das Enzym als Monomer, Dimer, Polymer oder immobilisiert vorliegt. Erfindungsgemäß ist dieses Enzym mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 85% Identität zu SEQ ID NO. 13 eine anti-prelogspezifische Alanin-Amin-Dehydrogenase (AlAmDH).
Im Sinne der Erfindung steht Enzym (AlAmDH) für das zuletzt genannte Enzym mit mindestens 85% Identität zur SEQ ID NO. 13. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt die Identität bei 90%, besonders bevorzugt bei 95%.
Vorteilhaft katalysiert das zuletzt genannte Enzym die stereoselektive reduktive Aminierung von chiralen alpha-Hydroxy-Ketonen zum 1 -Hydroxy-2-Amino-Produkt und die dazu entgegengesetzte Oxidationsreaktion von 1 -Hydroxy-2-Amino-Verbindungen zum alpha- Hydroxy-Keton.
Je nachdem welches erfindungsgemäße Enzym und welcher Cofaktor überschüssig in der Reaktionsmischung vorliegt, findet stereoselektive Reduktion der Carbonylfunktion oder die Gegenreaktion Oxidation der Hydroxyfunktion statt bzw. stereoselektive reduktive Aminierung oder die Gegenreaktion Oxidation (der Aminofunktion zur Carbonylfunktion) statt.
Mit der Erfindung ist es vorteilhaft möglich, mit der kommerziell leicht zugänglichen und einfachen Ausgangsverbindung 1 -Phenyl-1 ,2-propandion (kreislaufartig) alle zur Synthese von (R)-PAC, (S)-PAC, Ephedrin oder Pseudoephedrin interessanten Reaktionen selektiv durchzuführen.
Vorteilhaft werden alle erfindungsgemäßen Enzyme aus dem gleichen Organismus isoliert.
In einer Ausführungsform findet bei Vorliegen des für EDH, PseDH bzw. AlAmDH kodierenden erfindungsgemäßen Enzyms oder Fusionsproteins und Cofaktor NAD+ eine Oxidation statt; bei Vorliegen von NADH anstelle von NAD+ findet dagegen eine Reduktion statt. Das vorliegende Enzym reguliert dabei, welche funktionelle Gruppe zur Reaktion gebracht werden kann, indem es die Aktivierungsenergie der Reaktion herabsetzt (und als Katalysator fungiert).
Liegen vor oder während der Reaktion NADH und NAD+ gleichzeitig vor wird das Gleichgewicht zwischen Reaktion und Gegenreaktion durch das vorliegende Regenerierungsmittel gesteuert. In dieser weiteren Ausführungsform wird zusätzlich ein Enzym zur Regenerierung des Cofaktors eingesetzt. Beispielsweise FDH mit Ameisensäuresalzen als Regenerierungsmittel regenerieren NAD+ wogegen NADH durch beispielsweise die NADH Oxidase mit O2 regeneriert wird.
Das Enzym zur Regenerierung des Cofaktors ist vorzugsweise ausgewählt aus Alkoholdehydrogenasen (ADH), Formiatdehydrogenasen (FDH), Glucosedehydrogenasen (GDH), Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenasen (G6PDH), Glutamatdehydrogenasen (GluDH), NAD+-abhängige Hydrogenasen oder Phosphitdehydrogenasen (PtDH). Bevorzugt ist es aus Formiatdehydrogenasen oder NADH Oxidasen ausgewählt, besonders bevorzugt aus Candida boidinii (SEQ ID NO. 9).
Vorteilhaft weisen die erfindungsgemäßen Enzyme (EDH und PseDH) eine hohe Stereoselektivität bei der Reduktion von Carbonylverbindungen auf, bevorzugt bei der Reduktion von Carbonylverbindungen der Formel (III), besonders bevorzugt bei Dicarbonylverbindungen. Unter Stereoselektivität wird die bevorzugte Bildung eines von mehreren möglichen Stereoisomeren verstanden.
Weiterhin vorteilhaft erfolgt mit den erfindungsgemäßen Enzymen (EDH und PseDH) eine regioselektive Reduktion von Dicarbonylverbindungen zu Hydroxycarbonylverbindungen. Unter Regioselektivität wird die bevorzugte Reaktion einer von mehreren möglichen Stellen innerhalb eines Moleküls verstanden.
Weiter vorteilhaft weisen die erfindungsgemäßen Enzyme eine geringe Substratspezifität auf. Unter Substratspezifität wird die Fähigkeit von Enzymen verstanden, nur ein bestimmtes Substrat oder eine bestimmte Substratgruppe in ihrem aktiven Zentrum binden und umsetzen zu können.
Vorteilhaft wird unter Verwendung des erfindungsgemäßen Fusionsproteins mit einem weiteren Enzym ausgewählt aus NAD+- oder NADP+-abhängigen Enzymen in einem Verfahren zur stereoselektiven Reduktion von Carbonylverbindungen kein Co-Faktor benötigt.
In einer Ausführungsform erfolgt durch Kombination mehrerer vorgenannter Ausführungsformen mit Hilfe der beiden unterschiedlichen erfindungsgemäßen Enzyme (EDH und PseDH) oder Fusionsproteine (EDH und PseDH) die Isomerisierung von Ephedrin zu Pseudoephedrin und umgekehrt (vgl. Fig. 4).
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eine Nukleotidsequenz umfassend eine Sequenz kodierend für ein erfindungsgemäßes Enzym oder ein Fusionsprotein.
In einer Ausführungsform umfasst die Nukleotidsequenz eine der Sequenzen SEQ ID NO. 10 oder SEQ ID NO. 1 1 . Die Nukleotidsequenzen SEQ ID NO. 10 oder SEQ ID NO. 1 1 , kodierend für die erfindungsgemäßen Enzyme, können aus genomischen Material von Arthrobacter species TS-15 (DSM 32400) isoliert werden. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft einen Vektor umfassend mindestens eine erfindungsgemäße Nukleotidsequenz Unter einem Vektor wird ein Transportvehikel zur Übertragung einer Nukleotidsequenz in eine Zelle verstanden.
In einer Ausführungsform ist der Vektor rekombinant. Unter rekombinant wird ein artifizielles Molekül verstanden, welches mittels gentechnischer Methoden zusammengesetzt wurde.
In einer Ausführungsform umfasst der Vektor eine der Nukleotidsequenzen SEQ ID NO. 10 oder SEQ ID NO. 1 1 .
In einer Ausführungsform ist der Vektor aus einem Plasmid oder Cosmid ausgewählt. Unter einem Plasmid wird ein kleines, ringförmiges, extrachromosomal vorliegendes, doppelsträngiges DNA- Molekül verstanden. Unter einem Cosmid wird ein Plasmid verstanden, welches sogenannte cos- sites (cohesive sites) enthält.
In einer Ausführungsform umfasst der Vektor weiterhin eine Nukleotidsequenz kodierend für ein NAD+- oder NADP+-abhängiges Enzym. NAD+- oder NADP+-abhängige Enzyme können verbrauchtes NAD(P)H regenerieren. NAD+- oder NADP+-abhängige Enzyme sind aus Alkoholdehydrogenasen (ADH), Formiatdehydrogenasen (FDH), Glucosedehydrogenasen (GDH), Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenasen (G6PDH), Glutamatdehydrogenasen (GluDH), NAD+-abhängigen Hydrogenasen oder Phosphitdehydrogenasen (PtDH) ausgewählt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Vektor eine Nukleotidsequenz kodierend für Formiatdehydrogenasen, besonders bevorzugt aus Candida boidinii (SEQ ID NO. 12).
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin eine Zelle oder Organismus enthaltend mindestens eine erfindungsgemäße Nukleotidsequenz. Ebenfalls umfasst ist in einer Ausführungsform, dass diese Nukleotidsequenz als Teil eines Vektors in der erfindungsgemäßen Zelle oder Organismus enthalten ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zelle oder der Organismus nicht menschlich.
In einer Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Nukleotidsequenz in das Genom der Zelle oder des Organismus integriert.
In einer Ausführungsform ist die Zelle oder der Organismus aus E. coli, Corynebacterium glutamicum, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris oder aus der Gattung Arthrobacter, Rhodococcus, bevorzugt Arthrobacter aurescens; Bacillus, bevorzugt Bacillus subtilis; Streptomyces oder Pseudomonas, bevorzugt Pseudomonas sp., ausgewählt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zelle oder der Organismus Arthrobacter aurescens, bevorzugt Arthrobacter species TS-15 (DSM 32400).
Ein Aspekt ist auch ein Fusionsprotein, umfassend eine Aminosäuresequenz, die mindestens
85% Identität zu der Sequenz SEQ ID NO. 13 aufweist,
wobei die Sequenz die Aminosäuren in den Positionen
Serin (32), Threonin (364), Serin (368) und Threonin (371 ) umfasst,
wobei das Enzym als Monomer, Dimer, Polymer oder immobilisiert vorliegt.
Ein Aspekt ist auch die Nukleotidsequenz umfassend eine Sequenz kodierend für das zuletzt genannte erfindungsgemäße Enzym oder das zuletztgenannte erfindungsgemäße Fusionsprotein.
Ein Aspekt ist auch Vektor, Zelle oder Organismus enthaltend diese letztgenannte Nukleotidsequenz.
Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein Verfahren zur stereoselektiven Reduktion von Carbonylverbindungen oder zur Oxidation von Hydroxyverbindungen umfassend die Schritte a) Bereitstellen eines erfindungsgemäßen Enzyms (EDH oder PseDH) oder eines entsprechenden Fusionsproteins,
b) Bereitstellen mindestens einer Carbonylverbindung oder Hydroxyverbindung, und c) Stereoselektive Reduktion dieser Carbonylverbindung oder Oxidation dieser Hydroxyverbindung durch Kontaktieren mit dem Enzym oder dem Fusionsprotein.
Das Bereitstellen von Enzymen in den erfindungsgemäßen Verfahren beinhaltet neben der Bereitstellung in isolierter Form auch das Bereitstellen einer Zelle oder eines Organismus, aufweisend eine Nukleotidsequenz, die für das entsprechende erfindungsgemäße Enzym kodiert, Unter bestimmten Bedingungen produziert die Zelle oder der Organismus dieses Enzym und setzt es frei. Vorteilhaft entfällt bei der Bereitstellung der Zelle oder des Organismus in den erfindungsgemäßen Verfahren die Proteinreinigung des Enzyms. Weiterhin vorteilhaft weist das Enzym in der Zelle oder dem Organismus eine höhere Stabilität auf. Vorteilhaft werden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren beispielsweise alpha-Arylketone zu den entsprechenden 1 -Aryl-1 -Hydroxy-Verbindungen stereoselektiv reduziert.
In einer Ausführungsform erfolgt das Verfahren zur stereoselektive Reduktion von Carbonylverbindungen in der Reihenfolge der Schritte a), b) und c) oder b), a) und c).
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Carbonylverbindung aus symmetrischen oder unsymmetrischen, substituierten oder unsubstituierten Ketonen, a- oder ß- Diketonen, a-Ketoestern, a-Aminoketonen, a-Hydroxyketonen oder a-Halogenketonen ausgewählt.
Insbesondere umfasst die Carbonylverbindung die folgenden Substrate:
2-(4-Chlorobenzoyl)pyridin (CAS 6318-51 -0), und
2- Benzoylpyridin (CAS 91 -02-1 ), und
3- Oxo-3-(2-thienyl)propionitril (CAS 33898-90-7).
Substituiert im Sinne der Erfindung bedeutet der Austausch beliebig vieler Wasserstoffatome gegen Halogen, vorzugsweise Cl, F oder I, gegen Hydroxy, Hydroxyalkyl, Amino, Aminoalkyl, Carbonyl, Carbamoyl, Carbonsäurechlorid, Acetyl, Cyano, gegen Alkyl, Alkenyl oder Alinkyl. Beim Austausch mehrerer Wasserstoffe können die Positionen unterschiedlich substituiert sein.
Alkyl, Alkenyl bzw. Alkinyl im Sinne der Erfindung bedeutet vorzugsweise substituiert oder unsubstituierte C1 -C4-Ketten.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die mindestens eine Carbonylverbindung aus Dicarbonylverbindungen, bevorzugt aus a- oder ß-Diketonen ausgewählt. Vorteilhaft werden Dicarbonylverbindungen mit dem erfindungsgemäßen Verfahren oder mit dem erfindungsgemäßen Enzym selektiv zu Hydroxycarbonylverbindungen umgesetzt. Vorteilhaft verläuft die stereoselektive Reduktion des erfindungsgemäßen Verfahrens, im Falle eines Diketons als Ausgangsverbindung, wobei eines der beiden Carbonyl-Kohlenstoffatome mit einem Aromaten substituiert ist, regioselektiv, d.h. es wird selektiv die Carbonylfunktion am Aromaten-substituierten Carbonalykohlenstoff umgesetzt.
In einer Ausführungsform sind die a- oder ß-Diketone zyklische a- oder ß-Diketone. In einer weiteren Ausführungsform ist die mindestens eine Carbonylverbindung eine Carbonylverbindung der Formel (III)
O
X
X Y (III),
wobei X ausgewählt ist aus unsubstituierten oder substituierten Aryl-, bevorzugt Phenylresten; oder heterozyklischen Resten, bevorzugt Furanylresten, Thiophenresten oder Pyridinresten; wobei Y ausgewählt ist aus unsubstituierten oder substituierten Alkyl, Aryl-, heterozyklischen Resten oder substituierten Carbonylresten.
In einer Ausführungsform ist die Carbonylverbindung der Formel (III), wobei X aus substituierten Phenylresten ausgewählt ist, aus Phenyl-a-Carbonylverbindungen mit mindestens einer Alkylgruppe, einer Hydroxygruppe, einer Alkoxygruppe, bevorzugt einer Methoxygruppe; und/oder einem Halogen am Phenylring ausgewählt. Vorteilhaft wird durch das erfindungsgemäße Verfahren oder mit dem erfindungsgemäßen Enzym regioselektiv die Carbonylgruppe einer Dicarbonylverbindungen mit einem Phenylrest reduziert, welche sich in Opposition zu dem Phenylrest befindet.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die mindestens eine Carbonylverbindung ein Phenyl- a-Diketon.
Besonders bevorzugte Ausführungsformen der mindestens einen Carbonylverbindung sind die folgenden Verbindungen:
1 -Phenyl-1 ,2-propandion (CAS No. 579-07-7)
1 -Phenyl-1 -propanon (CAS No. 93-55-0)
Benzil (CAS No. 134-81 -6)
Benzoylformamid (CAS No. 7505-92-2)
Benzoylformylchlorid (CAS No. 25726-04-9)
4-Chlorobenzil (CAS No. 2271 1 -23-5)
2,2'-Dichlorobenzil (CAS No. 21854-95-5)
4,4'-Difluorobenzil (CAS No. 579-39-5)
4,4'-Dimethylbenzil (CAS No. 3457^8-5)
1 -Phenyl-1 ,3-butandion (CAS No. 93-91 ^)
2,2'-Furil (CAS No. 492-94^)
1 -Phenylglyoxal (CAS No. 1074-12-0)
2,2'-Pyridil (CAS No. 492-73-9) 2,2'-Thenil (CAS No. 7333-07-5)
Methylbenzoylformiat (CAS No. 15206-55-0)
2,3-lndolindion (Isatin, CAS No. 91 -56-5)
lndan-1 ,2-dion (CAS No. 16214-27-0)
In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren werden die erfindungsgemäßen Reaktionsschritte in mindestens einem Lösungsmittel durchgeführt. Unter einem Lösungsmittel wird eine anorganische oder organische Flüssigkeit verstanden, welche feste oder flüssige Stoffe auf physikalischem Wege zur Lösung bringt. Voraussetzung für die Eignung als Lösungsmittel ist, dass sich beim Lösevorgang weder der lösende noch der gelöste Stoff chemisch verändern.
Bevorzugt ist das mindestens eine Lösungsmittel aus einer wässrigen Lösung oder einem Zweiphasensystem umfassend eine wässrige Lösung und mindestens ein organisches Lösungsmittel ausgewählt.
Besonders bevorzugt ist das mindestens eine organische Lösungsmittel aus langkettigen Alkanen, bevorzugt Hexan; langkettigen Alkanolen, bevorzugt 1 -Hexanol,1 -Octanol oder 1 - Decanol; oder Ethern, bevorzugt Cyclopentylmethylether (CPME), Methyl-tert-butylether (MTBE) oder 2-Methyltetrahydrofuran (2-MTHF); ausgewählt.
In einer Ausführungsform erfolgt das erfindungsgemäße Verfahren zur stereoselektiven Reduktion von Carbonylverbindungen oder zur Oxidation von Hydroxyverbindungen in einem Zwe i p h ase nsvste m , mit der Spezifizierung für die Schritte a) bis c):
a) Bereitstellen des Enzyms oder Fusionsproteins in einer wässrigen Lösung, b) Bereitstellen von Carbonyl- oder Hydroxyverbindung in mindestens einem organischen Lösungsmittel, und
c) Kontaktieren der wässrigen Lösung, enthaltend das Enzym oder Fusionsprotein, mit diesem mindestens einen organischen Lösungsmittel und stereoselektive Reduktion bzw. Oxidation über die Phasengrenze zwischen wässriger Lösung und dem mindestens einen organischen Lösungsmittel.
Vorteilhaft erfolgt bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens in einem Zweiphasensystem die Lösung der schwer löslichen Carbonylverbindungen in dem mindestens einen organischen Lösungsmittel und die enzymatische Aktivität des Enzyms bleibt in der wässrigen Lösung erhalten. In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt in Schritt a) die Bereitstellung eines erfindungsgemäßen Enzyms oder eines Fusionsproteins und ist das mindestens eine Lösungsmittel aus einem organischen Lösungsmittel ausgewählt, wobei das organische Lösungsmittel aus Alkoholen ausgewählt ist, bevorzugt aus Alkanolen, besonders bevorzugt 1 -Decanol.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird Schritt c) bei einer Temperatur zwischen 0°C und 80°C durchgeführt, bevorzugt bei einer Temperatur zwischen 5°C und 50°C, besonders bevorzugt bei 20°C bis 35°C.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in Schritt c) mindestens ein Co-Faktor zugesetzt. Unter Co-Faktoren werden Moleküle und Molekülgruppen verstanden, welche für die enzymatische Aktivität von Enzymen notwendig sind. In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der Co-Faktor ausgewählt aus NADH, NADPH und NAD+, bevorzugt ist der Co-Faktor NADH oder NAD+. In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Co-Faktor in Schritt c) umgesetzt.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt eine Regeneration des Co- Faktors in Schritt c). In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt eine Regeneration des Co-Faktors durch Zusatz eines NAD+- oder NADP+-abhängigen Enzyms. NAD+- oder NADP+-abhängige Enzyme sind aus Alkoholdehydrogenasen (ADH), Formiatdehydrogenasen (FDH), Glucosedehydrogenasen (GDH), Glucose-6-Phosphat- Dehydrogenasen (G6PDH), Glutamatdehydrogenasen (GluDH), NAD+-abhängigen Hydrogenasen oder Phosphitdehydrogenasen (PtDH) ausgewählt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das NAD+- oder NADP+-abhängige Enzym aus Formiatdehydrogenasen ausgewählt, besonders bevorzugt aus Candida boidinii (SEQ ID NO. 9). Vorteilhaft wird durch Zusatz eines NAD+- oder NADP+-abhängigen Enzyms kein Co-Faktor für das erfindungsgemäße Verfahren benötigt.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt eine Regeneration des Co-Faktors durch Zusatz einer Formiatdehydrogenase, besonders bevorzugt aus Candida boidinii. In einer weiteren Ausführungsform erfolgt in Schritt c) der Zusatz von Formiat (Methansäure), bevorzugt Kaliumformiat; in einer Konzentration von 0,2 mol/l bis 2 mol/l, bevorzugt 0,5 mol/l bis 1 mol/l.
Vorteilhaft werden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren für die Reduktion von 1 -Phenyl-1 ,2- Propandion Umsatzraten von mindestens 5 mg pro Stunde in 1 ml Lösungsmittel, bevorzugt mindestens 10 mg pro Stunde in 1 ml Lösungsmittel, besonders bevorzugt sogar 15, erreicht. Weiterhin vorteilhaft werden Ausbeuten bis zu 99% und Stereoselektivitäten bis zu 99%ee erreicht.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Isomerisierung zwischen Ephedrin und Pseudoephedrin, umfassend die Schritte:
a) Bereitstellen eines ersten erfindungsgemäßen Enzyms oder eines ersten erfindungsgemäßen Fusionsproteins, beide ausgewählt aus EDH und PseDH, b) Bereitstellen mindestens einer Verbindung, die Ephedrin oder Pseudoephedrin ist, c) Stereoselektive Reduktion oder Oxidation zur Zwischenverbindung (S)-2- Methylamino-1 -phenylpropan-1 -on durch Kontaktieren der Verbindungen aus Schritt b) mit der Verbindung aus Schritt a),
d) Kontaktieren der Zwischenverbindung mit einem zweiten erfindungsgemäßen Enzym oder einem zweiten erfindungsgemäßen Fusionsprotein, beide ausgewählt aus EDH und PseDH,
wobei das zweite Enzym vom ersten Enzym bzw. das zweite Fusionsprotein vom ersten Fusionsprotein verschieden ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform liegt beim Kontaktieren in Schritt c) und d) jeweils zusätzlich ein Cofaktor vor wie beispielsweise NADH oder NAD+. Der Cofaktor in Schritt c) unterscheidet sich von dem in Schritt d).
In einer Ausführungsform wird zwischen Schritt c) und d) mindestens ein Aufreinigungs- bzw. Isolierungsschritt zur Aufreinigung bzw. Isolierung der Zwischenverbindung (S)-2-Methylamino- 1 -phenylpropan-1 -on durchgeführt.
Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein Verfahren zur stereoselektiven reduktiven Aminierung chiraler alpha-Hydroxy-Ketone zum 1 -Hydroxy-2-Amino-Produkt oder zur dazu entgegengesetzen Oxidation von 1 -Hydroxy-2-Amino-Verbindungen zum alpha-Hydroxy-Keton, umfassend die Schritte
a) Bereitstellen eines erfindungsgemäßen Enzyms (AlAmDH), eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins (AlAmDH),
b) Bereitstellen mindestens eines chiralen alpha-Hydroxy-Ketons oder 1 -Hydroxy-2- Amino-Produkts, und
c) Stereoselektive reduktive Aminierung der Carbonylfunktion des chiralen alpha- Hydroxy-Ketons zur Aminofunktion oder
Oxidation der Aminofunktion des 1 -Hydroxy-2-Amino-Produkts zur Carbonylfunktion, durch Kontaktieren mit dem Enzym oder dem Fusionsprotein. Auch die Alanin-Amin-Dehydrogenase benötigt bei der reduktiven Aminierung einen Cofaktor wie beispielsweise NADH. Die entgegengesetzte Reaktion, d.h. die Rückreaktion, der Oxidation von 1 -Hydroxy-2-Amino-Verbindungen zum alpha-Hydroxy-Keton benötigt ebenfalls einen Cofaktor, beispielsweise NAD+.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird zur reduktiven Aminierung zusätzlich Methylamin eingesetzt.
Vorteilhaft ist es mit diesem erfindungsgemäßen Verfahren möglich die Ketofunktion stereoselektiv zum (S)-konfigurierten Amin umzusetzen.
In Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren und unter Nutzung mindestens einer der oben genannten Dicarbonylverbindungen wird das erfindungsgemäße Reduktions- /Oxidationsverfahren kombiniert mit der erfindungsgemäßen reduktiven Aminierung eines (zuvor aus der Dicarbonylverbindung erhaltenen) Hydroxyketons zu einer Hydroxy-Amino- Verbindungen.Vorzugsweise wird eine alpha-Dicarbonylverbindung eingesetzt, so dass nach erfindungsgemäßer stereoselektiver Reduktion zum chiralen alpha-Hydroxyketonen und anschließender reduktiver Aminierung eine 1 -Hydroxy-2-Amino-Verbindung gebildet wird. Die reduktive Aminierung verläuft bevorzugt diastereoselektiv.
Insbesondere wird durch diese Kombination 1 -Phenyl-1 ,2-propandion selektiv umgesetzt zu Ephedrin oder Pseudoephedrin (siehe Fig. 4). Ausgehend von dieser alpha-beta-Diketon- Verbindung 1 -Phenyl-1 ,2-propandion kann mittels EDH und AlAmDH die Reaktionsfolge über den R-Alkohol (R-PAC) zum 1 R,2S-Ephedrin katalysiert werden. Dem entgegen kann mittels PseDH und AlAmDH die Reaktionsfolge über den S-Alkohol (S-PAC) zum 1 S,2S-Pseudoephedrin katalysiert werden.
Somit kann im Rahmen dieser Erfindung ein chirales Aminoalkohol aus dem entsprechenden Diketon in einer Kaskadenreaktion enantioselektiv mit mehr als 98%ee und ohne Nebenprodukte dargestellt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das chirale alpha-Hydroxy-Ketone (Ausgangsstoff) ein alpha-Aryl-alpha-Hydroxy-Keton, insbesondere (R)-PAC bzw. (S)-PAC.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung mindestens eines erfindungsgemäßen Enzyms (EDH oder PseDH), mindestens eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins (EDH oder PseDH) oder mindestens eines erfindungsgemäßen Vektors, Zelle oder Organismus (EDH oder PseDH) in den erfindungsgemäßen Verfahren, zur: - stereoselektiven Reduktion von Carbonylverbindungen oder Oxidation von Hydroxyverbindungen, oder
- Isomerisierung zwischen Ephedrin und Pseudoephedrin.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Enzyms (AlAmDH), eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins (AlAmDH) oder eines erfindungsgemäßen Vektors, Zelle oder Organismus (AlAmDH) in dem erfindungsgemäßen Verfahren, zur:
- stereoselektiven reduktiven Aminierung chiraler alpha-Hydroxy-Ketone zum 1 -Hydroxy-2- Amino-Produkt, und/oder
- Oxidation von 1 -Hydroxy-2-Amino-Verbindungen zum alpha-Hydroxy-Keton.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Kit umfassend:
- Mindestens eines der erfindungsgemäßen Enzyme (EDH, PseDH und AlAmDH),
oder mindestens eines der erfindungsgemäßen Fusionsproteine (EDH, PseDH und AlAmDH),
- oder mindestens einen erfindungsgemäßen Vektor, Zelle oder Organismus (EDH, PseDH und AlAmDH), und
- Cofaktor.
Der Cofaktor ist ein Molekül, dass für die Funktion des erfindungsgemäßen Enzyms oder Fusionsproteins unerlässlich ist. Vorzugsweise ist es NAD+ oder NADH.
In einer Ausführungsform enthält das Kit des Weiteren ein Enzym zur Regenerierung des Cofaktors, welches wie oben definiert ist.
Für die Realisierung der Erfindung ist es auch zweckmäßig, die vorbeschriebenen Ausführungsformen und Merkmale der Ansprüche zu kombinieren. Ausführungsbeispiele
Nachfolgend soll die Erfindung anhand einiger Ausführungsbeispiele und zugehöriger Figuren eingehender erläutert werden. Die Ausführungsbeispiele sollen dabei die Erfindung beschreiben ohne diese zu beschränken.
Es zeigen die
Fig. 1 die Umsetzung einer Acetylbenzoylverbindung in einem rekombinanten E. co//'-Stamm, welcher EDH oder PseDH sowie eine Formiatdehydrogenase (FDH) co-exprimiert.
Fig. 2 die 1H-NMR-Daten des Produkts (R)-Phenylacetylcarbinol ((R)-PAC, (R)-1 -Hydroxy-1 - phenyl-propan-2-οη) nach der Reduktion von 1 -Phenyl-1 ,2-propandion mittels der erfindungsgemäßen EDH.
Fig. 3 die 1H-NMR-Daten des Produkts (S)-Phenylacetylcarbinol ((S)-PAC, (S)-1 -Hydroxy-1 - phenyl-propan-2-οη) nach der Reduktion von 1 -Phenyl-1 ,2-propandion mittels der erfindungsgemäßen PseDH.
Fig. 4 oben) die stereoselektive Reduktion von Carbonyl mit EDH bzw. PseDH; mitte) die reduktive Aminierung von der Ketofunktion mit AlAmDH; unten) die Isomerisierung zwischen Ephedrin und Pseudoephedrin mittels Oxidation und Reduktion mit EDH und PseDH.
Sequenzierung
Zur Sequenzierung wird die Sequenziertechnik MiSeq Sequenzierer (lllumina; 2x250 bp paired- end sequencing, v3 chemistry; 2.9 Mio reads) verwendet und die Assemblierung der Reads erfolgt über CLC Genomics Software. Um die erhaltenen Contigs entsprechend der Genomreferenzen einzuordnen, wird die Software„mauve" verwendet. Anschließend wird die erhaltene Reihenfolge manuell geprüft.
Expression der nativen Enzyme
Die Expression der nativen Peptidsequenzen der EDH und PseDH erfolgt durch Klonierung der Nukleotidsequenzen SEQ ID NO. 10 oder SEQ ID NO. 1 1 ohne Marker in einen pETDuet-Vektor. Weiterhin wird die Nukleotidsequenz der Formiatdehydrogenase (FDH) aus Candida boidinii jeweils in die zweite hintere Multiple cloning site kloniert. Mittels der so erhaltenen Vektoren pETDuet_PseDH_FDH oder pETDuet_EDH_FDH werden zwei E. co//'-Stämme SHuffel T7 enthaltend die Vektoren pETDuet_PseDH_FDH oder pETDuet_EDH_FDH generiert.
Expression von Enzymmutanten
Die Untersuchung von Enzymmutanten erfolgte an PseDH. Dazu wurde am C-Terminus eine Mutation eingefügt, insbesondere die letzten 12 Aminosäuren deletiert. Die entstandene Mutante zeigte eine Restaktivität von 17% im Vergleich zum Wildtyp.
Generierung eines Fusionsproteins
Die Enzyme EDH und PseDH werden in Form eines Fusionsproteins mit der Formiatdehydrogenase (FDH) aus Candida boidinii im rekombinanten Stamm E. coli SHuffleT7 exprimiert. Als Marker wird jeweils am N-Terminus sowie am C-Terminus ein Polyhistidin-tag eingefügt. Der N-terminale Marker besteht aus 6 Histidinresten gefolgt von einem Linkerpeptid „SSGHIDDDDKH" und FDH. Der C-terminale Marker besteht aus 6 Histidinresten zwischen EDH bzw. PseDH und FDH. EDH und PseDH zeigten als Fusionsproteine enzymatische Aktivität.
Weiterhin wurde ein EDH-Fusionsprotein generiert, in dem der N-Terminus mit der zusätzlichen Aminosäuresequenz „MNGRI" beginnt und ein rigider kurzer Peptidlinker „AAAKEAAAKAA" eingefügt wurde. Dieses EDH-Fusionsprotein zeigte eine 30% höhere enzymatische Aktivität als der Wildtyp, war jedoch weniger löslich.
Reduktion der Carbonylverbindungen
Die zwei generierten E. co//'-Stämme SHuffel T7 mit den Vektoren pETDuet_PseDH_FDH oder pETDuet_EDH_FDH werden für Zweiphasen-Ganzzellbiotransformation oder für Zweiphasen- Zellfreie Biotransformation eingesetzt.
Für die Zweiphasen-Ganzzellbiotransformation werden 20 mg lyophilisierte Zellen bzw. 10mg für die Zweiphasen-Zellfreie Biotransformation 30 min in 100 mM Kpi-Puffer (pH 7,5) inkubiert und gemischt bis eine homogene Suspension erhalten wird. Anschließend wird Kaliumformiat mit einer Endkonzentration von 0,1 M bis 1 M dazugeben. Zu einem Volumen der wässrigen Phase von 1 ml_ werden 1 ml_ organisches Lösungsmittel (Cyclopentylmethylether (CPME) oder Hexanol) mit dem Substrat dazugeben. Die Substratkonzentration variiert nach der Enzymaktivität und der Löslichkeit des jeweiligen Substrats von 20 mM bis 600 mM, insbesondere 371 ,5 mM Acetylbenzoyl, 500 mM Methylbenzylformiat, 50 mM 1 -Phenylglyoxal, 40 mM Isatin, 500 mM 1 - Phenyl-1 ,3-butandion, 600 mM 1 -Phenyl-1 -propanon, 145 mM Desylbromid, 163 mM 4- Chlorobenzil, 20 mM 2,2'-Furil, 380 mM Benzil, 143 mM 2,2'-Dichlorobenzil, 324 mM 4,4'- Difluorobenzil und 335 mM 4,4'-Dimethylbenzil.
Nachweis der Reduktion der Carbonylverbindungen
Der Nachweis der Produkte erfolgt mittels 1H-NMR-Messung mit 400 MHz und als Lösungsmittel wurde deuteriertes Chloroform (CDC ) verwendet). Die chirale Trennung der Substrate erfolgt im Knauer Smartline HPLC-System mit einer CHIRALPAK IA-Säule (250 x 4,6 mm Partikelgröße 5 μΜ) und mittels des Eluents n-Hexan:2-lsopropanol 9:1 mit einer Flussrate 0,8 ml/min und einer Temperatur von 25°C. Die Analyse wird bei einer Wellenlänge von 256 nm durchgeführt.
Die Chiralität der Produkte wird anhand der Drehwerte gemessen mittels Polarimeter (Perkin Elmer) bestimmt und mit Literaturwerten (Giovannini et al. 2016) verglichen.
Tab. 1 Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens mit Ephedrindehydrogenase (EDH) und/oder Pseudoephedrindehydrogenase (PseDH) reduzierte Carbonylverbindungen, der Nachweis des Umsatzes, Ausbeute, Enantiomerenreinheit sowie Umsatzrate.
Carbonylverbindung Reduktion Nachweis Ausbeute EnantioUmsatzrate mittels (%) meren(mg/h/ml) EDH oder reinheit
PseDH (%ee)
S R S R S R
2-(4-Chlorobenzoyl)- EDH 71
pyridin
(CAS 6318-51 -0)
2-Benzoylpyridin (CAS EDH 57
91 -02-1 )
3-Oxo-3-(2-thienyl)- EDH >99 >99
propionitril
(CAS 33898-90-7)
1 -Phenyl-1 ,2- PseDH NMR 99 99 99,9 99,9 10-15 4-8 propandion und EDH
(CAS No. 579-07-7)
1 -Phenyl-1 -propanon EDH HPLC 99 99,9
(CAS No. 93-55-0) Benzil PseDH HPLC 98,6 99,9
(CAS No. 134-81 -6) und EDH
4-Chlorobenzil EDH HPLC 99
(CAS No. 2271 1 -23-5)
2,2'-Dichlorobenzil PseDH HPLC 98 96,2 (CAS No. 21854-95-5) und EDH
4,4'-Difluorobenzil PseDH HPLC 98,4 99,7 (CAS No. 579-39-5) und EDH
4, 4'-Dimethyl benzil PseDH HPLC 99 95,7 (CAS No. 3457-48-5) und EDH
1 -Phenyl-1 ,3- PseDH HPLC 99,2 96,4 butandion und EDH
(CAS No. 93-91 -4)
2,2'-Furil PseDH HPLC 99,4 96,6
(CAS No. 492-94-4) und EDH
1 -Phenylglyoxal PseDH Abnahme der
(CAS No. 1074-12-0) Edukt- konzentration
2,2'-Pyridil PseDH Abnahme der
(CAS No. 492-73-9) und EDH Edukt- konzentration
2,2'-Thenil PseDH HPLC 97,1
(CAS No. 7333-07-5) und EDH
Methylbenzoylformiat PseDH HPLC 99,5 96,6 (CAS No. 15206-55-0) und EDH
Isatin PseDH HPLC 99
(CAS No. 91 -56-5) und EDH
lndan-1 ,2-dion PseDH HPLC 98,3
(CAS No. 16214-27-0) und EDH Zitierte Nichtpatentliteratur
W. G. Birolli, I. M. Ferrreira, E. D. Q. Jimenez, B. N. M. Silva, B. V. Silva, A. C. Pintoc and A. L. M. Porto (2017) First Asymmetrie Reduction of Isatin by Marine-Derived Fungi.
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1 Shuffle T7 E.coli-Zelle
2 ADHP
3 ADHAP
4 FDH
5 NADH
6 NAD+
7 HCOO-
8 C02

Claims

Patentansprüche
1 . Enzym mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 85% Identität zu einer der Sequenzen SEQ ID NO. 1 oder 2, wobei das Enzym als Monomer, Dimer, Polymer oder immobilisiert vorliegt.
2. Fusionsprotein umfassend mindestens eine Aminosäuresequenz, die mindestens 85% Identität zu der Sequenz SEQ ID NO. 1 oder 2 aufweist, wobei das Fusionsprotein als Monomer, Dimer, Polymer oder immobilisiert vorliegt.
3. Nukleotidsequenz umfassend eine Sequenz kodierend für ein Enzym nach Anspruch 1 oder ein Fusionsprotein nach Anspruch 2.
4. Vektor, Zelle oder Organismus enthaltend mindestens eine Nukleotidsequenz nach Anspruch 3.
5. Enzym, erhalten durch Isolation aus dem Organismus Arthrobacter species TS-15 DSM 32400, mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 85% Identität zu der Sequenz SEQ ID NO. 13,
wobei die Sequenz die Aminosäuren in den Positionen
Serin 32, Threonin 364, Serin 368 und Threonin 371 umfasst,
wobei das Enzym als Monomer, Dimer, Polymer oder immobilisiert vorliegt.
6. Fusionsprotein, umfassend eine Aminosäuresequenz, die mindestens 85% Identität zu der Sequenz SEQ ID NO. 13 aufweist,
wobei die Sequenz die Aminosäuren in den Positionen
Serin 32, Threonin 364, Serin 368 und Threonin 371 umfasst,
wobei das Enzym als Monomer, Dimer, Polymer oder immobilisiert vorliegt.
7. Nukleotidsequenz umfassend eine Sequenz kodierend für ein Enzym nach Anspruch 5 oder ein Fusionsprotein nach Anspruch 6.
8. Vektor, Zelle oder Organismus enthaltend eine Nukleotidsequenz nach Anspruch 7.
9. Verfahren zur stereoselektiven Reduktion von Carbonylverbindungen oder zur Oxidation von Hydroxyverbindungen umfassend die Schritte a) Bereitstellen eines Enzyms nach Anspruch 1 oder eines Fusionsproteins nach Anspruch 2,
b) Bereitstellen mindestens einer Carbonylverbindung oder Hydroxyverbindung, und c) Stereoselektive Reduktion dieser Carbonylverbindung oder Oxidation dieser Hydroxyverbindung durch Kontaktieren mit dem Enzym oder dem Fusionsprotein.
10. Verfahren zur Isomerisierung zwischen Ephedrin und Pseudoephedrin, umfassend die Schritte:
a) Bereitstellen eines ersten Enzyms gemäß Anspruch 1 oder eines ersten Fusionsproteins gemäß Anspruch 2, ausgewählt aus EDH und PseDH, b) Bereitstellen mindestens einer Verbindung, die Ephedrin oder Pseudoephedrin ist, c) Stereoselektive Reduktion oder Oxidation zur Zwischenverbindung (S)-2- ethylamino-1-phenylpropan-1 -on durch Kontaktieren der Verbindungen aus Schritt b) mit der Verbindung aus Schritt a), und
d) Kontaktieren der Zwischenverbindung mit einem zweiten Enzym gemäß Anspruch 1 oder einem zweiten Fusionsprotein gemäß Anspruch 2, ausgewählt aus EDH und PseDH,
wobei das zweite Enzym vom ersten Enzym bzw. das zweite Fusionsprotein vom ersten Fusionsprotein verschieden ist.
1 1 . Verfahren zur stereoselektiven reduktiven Aminierung chiraler alpha-Hydroxy-Ketone zum 1- Hydroxy-2-Amino-Produkt oder zur dazu entgegengesetzen Oxidation von 1 -Hydroxy-2- Amino-Verbindungen zum alpha-Hydroxy-Keton, umfassend die Schritte
a) Bereitstellen eines Enzyms nach Anspruch 5, eines Fusionsproteins nach Anspruch 6,
b) Bereitstellen mindestens eines chiralen alpha-Hydroxy-Ketons oder 1 -Hydroxy-2- Amino-Produkts, und
c) Stereoselektive reduktive Aminierung der Carbonylfunktion des chiralen alpha- Hydroxy-Ketons zur Aminofunktion oder
Oxidation der Aminofunktion des 1-Hydroxy-2-Amino-Produkts zur Carbonylfunktion, durch Kontaktieren mit dem Enzym oder dem Fusionsprotein.
12. Verwendung mindestens eines Enzyms gemäß Anspruch 1 , mindestens eines Fusionsproteins nach Anspruch 2 oder mindestens eines Vektors, Zelle oder Organismus nach Anspruch 4 in einem Verfahren gemäß Anspruch 9 oder 10, zur: - stereoselektiven Reduktion von Carbonylverbindungen oder Oxidation von Hydroxyverbindungen, oder
- Isomerisierung zwischen Ephedrin und Pseudoephedrin.
13. Verwendung eines Enzyms gemäß Anspruch 5, eines Fusionsproteins nach Anspruch 6 oder eines Vektors, Zelle oder Organismus nach Anspruch 8 in einem Verfahren gemäß Anspruch 1 1 , zur:
- stereoselektiven reduktiven Aminierung chiraler alpha-Hydroxy-Ketone zum 1-Hyroxy-2- Amino-Produkt, und/oder
- Oxidation von 1-Hydroxy-2-Amino-Verbindungen zum alpha-Hydroxy-Keton.
14. Kit umfassend:
- Mindestens eines der Enzyme nach Anspruch 1 oder 5,
oder mindestens eines der Fusionsproteine nach Anspruch 2 oder 6,
- oder mindestens einen Vektor, Zelle oder Organismus nach Anspruch 4 oder 8, und Cofaktor
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