EA023148B1 - Композиции на основе антагонистов pd-1 и их применение - Google Patents

Abstract

Описаны терапевтические композиции для увеличения Т-клеточного ответа, включающие слитый белок и агент, усиливающий эффективность действия указанного белка, и применение указанных композиций для производства лекарственного средства, увеличивающего Т-клеточный ответ, для лечения заболевания, поддающегося лечению путем увеличенного Т-клеточного ответа. Также раскрыт способ увеличения Т-клеточного ответа у человека, включающий введение указанному человеку слитого белка и агента, усиливающего эффективность действия указанного белка.

Description

Заявка на данное изобретение утверждает приоритет предварительных заявок США № 61/211697, зарегистрированной 2 апреля 2009 г., 61/091694, зарегистрированной 25 августа 2008 г., 61/091709 зарегистрированной 25 августа 2008 г., и 61/091705 зарегистрированной 25 августа 2008 г., раскрытия которых включены посредством ссылки в настоящем описании во всей полноте.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к терапевтическим композициям, содержащим соединение, которое препятствует передаче ингибиторного сигнала на Т-клетки в комбинации с потенцирующими агентами, и к применению указанных компонентов вместе или по отдельности для индукции Т-клеточных ответов, важных для лечения заболевания.

Уровень техники изобретения

Ответ Т-лимфоцитов на болезненные состояния, такие как инфекция и хронические заболевания, подобные раку, является сложным и включает в себя межклеточные взаимодействия и продукцию растворимых медиаторов (называемых цитокинами или лимфокинами). Активация Т-клеток обычно зависит от антигенспецифического сигнала в результате контакта Т-клеточного рецептора (ТСК) с антигенным пептидом, представленным с помощью главного комплекса гистосовместимости (МНС), тогда как степень указанной реакции контролируется положительными и отрицательными антиген-независимыми сигналами, испускаемыми рядом костимуляторных молекул. Указанные молекулы обычно являются членами семейства СЭ28/В7. Напротив, белок программируемой гибели клеток-1 (ΡΌ-1) является членом семейства рецепторов С.Н28. который передает отрицательный иммунный ответ, когда он индуцирован, на Т-клетки. Контакт между ΡΌ-1 и одним из его лигандов (В7-Н1 или В7-ЭС) индуцирует ингибиторный ответ, который уменьшает размножение Т-клеток и/или силу и/или продолжительность Т-клеточного ответа.

Таким образом, Т-лимфоцитарный ответ регулируется различными факторами, включающими в себя молекулы клеточной поверхности, которые работают как рецепторы, где рецепторы включают в себя комплекс ТСК, а также другие молекулы клеточной поверхности.

В целом, антигенспецифический Т-клеточный ответ опосредуется двумя сигналами: 1) взаимодействие ТСК с антигенным пептидом, представленным в окружении НС (сигнал 1); и 2) второй антигеннезависимый сигнал, передаваемый с помощью контакта между различными парами рецептор/лиганд (сигнал 2). Указанный второй сигнал является критическим для определения типа Т-клеточного ответа (активация или толерантность), а также для силы и продолжительности указанного ответа и регулируется положительными и отрицательными сигналами от костимуляторных молекул, таких как семейство белков В7.

Наиболее подробно охарактеризованным Т-клеточным путем является В7-СЭ28, в котором В7-1 (СЭ80) и В7-2 (СЭ86), каждый, могут вовлекать стимулирующий рецептор С.Н28 и ингибирующий рецептор СТЬА-4 (СЭ152). В сочетании с передачей сигнала посредством Т-клеточного рецептора связывание С.Н28 увеличивает антигенспецифическую пролиферацию Т-клетки, увеличивает продукцию цитокинов, стимулирует дифференцировку и эффекторную функцию и способствует выживаемости Т-клетки (Ьепкйоте, е! а1., Аппи. Кеу. 1ттипо1., 14:233-258 (1996); СйатЬегк и АШкоп, Сигг. Ορίη. 1ттипо1., 9:396-404 (1997) и Ка11ипе11 и Тйотркоп, Аппи. Кеу. 1ттипо1., 17:781-828 (1999)). Напротив, полагают, что передача сигнала через СТЬА-4 служит для передачи отрицательного сигнала, который ингибирует Т-клеточную пролиферацию, продукцию 1Ь-2 и развитие клеточного цикла (Кгитте1 и АШкоп, 1. Ехр. Мей., 183:2533-2540 (1996) и Аа1ипах е! а1., 1. Ехр. Мей., 183:2541-2550 (1996)). Другие члены семейства В7 костимуляторных молекул включают в себя В7-Н1 (Эопд, е! а1., Иа!иге Мей., 5:13651369 (1999) и Ргеетап, е! а1., 1. Ехр. Мей., 192:1-9 (2000)), В7-ОС (Ткепд, е! а1., 1. Ехр. Мей., 193:839-846 (2001) и Ьа!сЬтап, е! а1., Иа!иге 1ттипо1., 2:261-268 (2001)), В7-Н2 (^апд, е! а1., В1оой, 96:2808-2813 (2000); §теа11о№, е! а1., 1ттипйу, 11:423-432 (1999) и УокЫпада, е! а1., Иа!иге, 402:827-832 (1999)), В7-Н3 (СЬароуа1, е! а1., Иа!иге 1ттипо1., 2:269-274 (2001)) и В7-Н4 (Сйоц е! а1., 1. 1ттипо1., 171:4650-4654 (2003); §1са, е! а1., 1ттипйу, 18:849-861 (2003); Ргакай, е! а1., 1ттипйу, 18:863-873 (2003) и 2апд, е! а1., Ргос. Иа!1. Асай. 8с1. И.З.А., 100:10388-10392 (2003)). В7-Н5 (описан в АО 2006/012232) является недавно открытым членом семейства В7.

Молекулы семейства В7 имеют мембранный проксимальный 1дС (константный) домен и мембранный дистальный 1дУ (вариабельный) домен. Семейство СЭ28-подобных рецепторов указанных лигандов имеет общий внеклеточный 1дУ-подобный домен. Взаимодействия пар рецептор-лиганд опосредуются, главным образом, через остатки 1дУ-доменов лигандов и рецепторов (Зсйгаги, е! а1., Иа!иге 1ттипо1., 3:427-434 (2002)). В целом, 1дУ-домены, описывают как содержащие два листа, каждый из которых содержит слой β-тяжей (АйЬатк и Вагс1ау, Аппи. Кеу. 1ттипо1., 6:381-405 (1988)). Передний и задний листы СТЬА-4 содержат цепи А'ОРС'С и АВЕОС соответственно (Ок!гоу, е! а1., Зшепсе, 290:816-819 (2000)), тогда как передний и задний листы 1дУ-доменов В7 образованы из цепей АОРССС и ВЕО соответственно (Зсйтаги, е! а1., Иа!иге, 410:604-608 (2001); §!атрег, е! а1., Иа!иге, 410:608-611 (2001) и 1кет17и, е! а1., 1ттипйу, 12:51-60 (2000)). Кристаллографический анализ показал, что поверхность связывания СТЬА-4/В7 имеет решающую роль при взаимодействии СЭК3-аналогичной петли СТЬА-4, состоящей из мотива МУРРРУ, с поверхностью В7, образованной в основном цепями О, Р, С, С' и С

- 1 023148 (5>ο1ι\υ;·ιγΙζ. е1 а1., Ыа1иге, 410:604-608 (2001) и §1атрег, е1 а1., Ыа1иге, 410:608-611 (2001)). Данные, полученные на основе аминокислотной гомологии, изменчивости и компьютерного моделирования, подтверждают концепцию, что указанный мотив также является главным В7-связывающим сайтом для СЭ28 (Вфогабк е1 а1., 1. Мо1. ОгарН. Мобе1., 15:135-139 (1997)). Хотя мотив ΜΥΡΡΡΥ не является консервативным в 1СО8, исследованный рецептор В7-Н2 показал, что родственный мотив, содержащий последовательность ΡΌΡΡΡΡ и расположенный в аналогичном положении, представляет собой главную детерминанту для связывания 1СО8 с В7-Н2 (^аиб, е1 а1., 1. Ехр. Меб., 195:1033-1041 (2002)). В7ГОС (называемый также ΡΌ-Ε2 или СЭ273) является относительно новым членом семейства В7 и обладает аминокислотной последовательностью, которая приблизительно на 34% идентична последовательности В7-Н1 (называемого также ΡΌ-Ы). Ортологи В7-ЭС человека и мыши характеризуются приблизительно 70%ной идентичностью по аминокислотной последовательности. Несмотря на то что транскрипты В7-Н1 и В7-ЭС обнаружены в различных тканях (Понд. е1 а1., №йиге Меб., 5:1365-1369 (1999); Ьа1сЬтаи, е1 а1., №Циге 1ттиио1., 2:261-268 (2001) и Татига, В1ооб, 97:1809-1816 (2001)), профили экспрессии белков совершенно различны. В7-Н1 широко экспрессируется на многих типах тканей и клеток, в то время как экспрессия В7-ЭС ограничивается, главным образом, активированными дендритными клетками (ОС) и макрофагами.

Показано, что В7-Н1 и В7-ЭС связываются с ΡΌ-1 (Ргеетаи, е1 а1., 1. Ехр. Меб., 192:1027-1034 (2000)), отдаленным членом семейства С.П28 с иммунорецепторным тирозиновым ингибирующим мотивом (1Т1М) в цитоплазматическом домене (Ыйба. е1 а1., ЕМВО 1., 11:3887-3895 (1992)). ΡΌ-1, член семейства рецепторов СЭ28, индуцированно экспрессируется на активированных Т-клетках, В-клетках, натуральных киллерных (ΝΚ) клетках, моноцитах, ОС и макрофагах (Кеи, е1 а1., Сигг. Орш. 1ттиио1. 19:309314 (2007)).

Основным результатом связывания ΡΌ-1 с его лигандами является ингибирование передачи сигнала после Т-клеточного рецептора (ТСК). Следовательно, сигнальная трансдукция с помощью ΡΌ-1 обычно предоставляет супрессивный или ингибиторный сигнал Т-клетке, что приводит к уменьшению Т-клеточной пролиферации или другому уменьшению Т-клеточной активации. В7-Н1 является основным лигандом ΡΌ-1, вызывающим передачу ингибиторного сигнала в Т-клетки. Настоящее изобретение решает проблему нежелательного Т-клеточного ингибирования с помощью предоставления агентов, которые связываются с ΡΌ-1 и, таким образом, предотвращают передачу ингибиторного сигнала или иначе связываются с лигандами ΡΌ-1, такими как В7-Н1, тем самым предотвращая связывание лиганда с ΡΌ-1 для передачи ингибиторного сигнала. И в том, и в другом случае стимулируются Т-клеточные ответы, такие как Т-клеточная пролиферация или активация.

В7-Н1 является главным лигандом ΡΌ-1, вероятно, вследствие его более широкого распространения и более высоких уровней экспрессии. Ингибирование ΡΌ-1 происходит, только если ΡΌ-1 и ТСК тесно связаны друг с другом в контексте иммунного синапса. ΡΌ-1 и его лиганды являлись предметом обсуждения нескольких обзорных статей.

Повышенная экспрессия В7-Н1 также наблюдается при многих видах рака (включая рак молочной железы, колоректальный рак, рак пищевода, рак желудка, глиому, лейкемию, рак легких, меланому, множественную миелому, рак яичников, рак поджелудочной железы, почечно-клеточную карциному и рак уротелия), и связана с неблагоприятным прогнозом. В7-Н1 экспрессируется многими линиями опухолевых клеток, в особенности после стимуляции интерфероном гамма (ΙΡΝ-γ), и также активируется на инфильтрирующих опухоль миелоид-зависимых супрессорных клетках (МЭ§С). Например, ΡΌ-1 активируется на опухоль-специфических СЭ8 Т-клетках и ассоциируется с функциональной недостаточностью, анергией, истощением и апоптозом. Повышение экспрессии ΡΌ-1 также ассоциировано с дисфункциональными и/или супрессивными фенотипами дополнительных типов клеток, таких как регуляторные Т-клетки (Т-гед) и натуральные киллерные Т-клетки (№КТ).

Настоящее изобретение использует указанные молекулярные функции путем предоставления схем лечения заболеваний с помощью увеличения Т-клеточной активности, в частности лечения рака и инфекционных заболеваний.

Сущность изобретения

В одном аспекте настоящее изобретение относится к терапевтической композиции для увеличения Т-клеточного ответа, включающей слитый белок, содержащий первую и вторую пептидные части, где указанная первая пептидная часть состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из аминокислотной последовательности 8ЕО ГО NО: 1 полипептида В7ГОС дикого типа, аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 98% идентична последовательности аминокислот 20-221 или 20-121 8ЕО ГО NО: 1 и которая конкурирует ίη уйго с В7ГОС дикого типа за связывание с ΡΌ-1, внеклеточного домена В7ГОС, имеющего 8ЕО ГО NО: 3, или полипептида, отличающегося от него только консервативными аминокислотными заменами и который конкурирует ίη уйго с В7ГОС дикого типа за связывание с ΡΌ-1, где указанная вторая пептидная часть содержит Рс-область антитела и агент, усиливающий эффективность действия указанного белка, выбранный из группы, включающей циклофосфамид, аналог циклофосфамида, сунитиниб, анти-ТООТ^, иматиниб, антрациклины, оксалиплатин, доксоруби- 2 023148 цин, антагонисты ТЬК4 и антагонисты 1Ь-18, в фармацевтически приемлемом носителе.

В конкретном варианте осуществления указанный агент представляет собой циклофосфамид или аналог циклофосфамида.

Кроме того, в конкретном варианте осуществления композиция может дополнительно включать по меньшей мере один дополнительный агент, выбранный из группы, состоящей из антитела против ΡΌ-1, антитела против СТЬЛ4, ингибитора митоза, ингибитора ароматазы, антагониста Л2ЛК и ингибитора ангиогенеза.

В другом аспекте изобретение относится к композиции, в которой указанный В7-ЭС представляет собой В7-ОС человека.

В конкретном варианте осуществления указанная первая пептидная часть состоит из внеклеточного домена В7-ЭС дикого типа.

В другом конкретном варианте осуществления указанный фрагмент полноразмерного В7ГОС состоит из растворимой части полноразмерного В7-ЭС.

Настоящее изобретение также относится к композиции, в которой указанная первая пептидная часть состоит из аминокислотной последовательности 8ЕО ГО N0: 3 или полипептида, отличающегося от него только консервативными аминокислотными заменами.

В конкретном варианте осуществления указанная первая пептидная часть состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 98% идентична последовательности аминокислот 20-221 или 20-121 8Е0 ГО N0: 1, более предпочтительно указанная первая пептидная часть состоит из последовательности аминокислот 20-221 или 20-121 8Е0 ГО N0: 1.

В другом конкретном варианте осуществления указанный слитый белок содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности последовательности 8Е0 ГО N0: 9, 10, 12 или 13 и которая конкурирует ίη νίίτο с В7ГОС дикого типа за связывание с ΡΌ-1, предпочтительно указанный слитый белок содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 9, 10, 12 или 13.

Также настоящее изобретение относится к композиции, в которой указанный слитый белок представляет собой мономер.

В другом конкретном варианте осуществления указанный слитый белок образует димер, при этом указанный димер может представлять собой гомодимер или гетеродимер.

В еще одном конкретном варианте осуществления указанный слитый белок содержит первую пептидную часть, которая состоит из аминокислот 20-221 8Е0 ГО N0: 1, и вторую пептидную часть, которая состоит из шарнирной области, участков Сц2 и С_н3 Су1 иммуноглобулина человека, при этом указанная вторая пептидная часть предпочтительно содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 6.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для увеличения Т-клеточного ответа, включающей слитый белок, содержащий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 13 или её вариант, имеющий 95% идентичности с последовательностью 8Е0 ГО N0: 13 и который конкурирует ίη νίίτο с В7ГОС дикого типа за связывание с ΡΌ-1, фармацевтический приемлемый носитель и циклофосфамид.

В конкретном варианте осуществления композиция содержит циклофосфамид в количестве от около 0,45 до около 4,5 мг.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к применению указанной композиции для производства лекарственного средства, увеличивающего Т-клеточный ответ, для лечения заболевания, поддающегося лечению путем увеличенного Т-клеточного ответа, в частности инфекционного заболевания или рака.

В конкретном варианте осуществления рак представляет собой рак мочевого пузыря, рак мозга, рак молочной железы, рак шейки матки, колоректальный рак, рак пищевода, рак почек, рак печени, рак легких, назофарингеальный рак, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак кожи, рак желудка, рак матки, рак яичников, рак яичка или гематологический рак.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу увеличения Т-клеточного ответа у млекопитающего, включающему введение указанному млекопитающему указанной композиции.

В конкретном варианте осуществления способа указанная композиция содержит слитый белок в дозе 1-40 мг/кг.

В другом конкретном варианте осуществления указанное заболевание представляет собой инфекционное заболевание.

В еще одном конкретном варианте осуществления указанное заболевание представляет собой рак, в частности рак мочевого пузыря, рак мозга, рак молочной железы, рак шейки матки, колоректальный рак, рак пищевода, рак почек, рак печени, рак легких, назофарингеальный рак, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак кожи, рак желудка, рак матки, рак яичников, рак яичка или гематологический рак.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к терапевтической композиции для увеличения Т-клеточного ответа, содержащей слитый белок, включающий первую и вторую пептидные части, где указанная первая пептидная часть состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из последовательности внеклеточного домена В7-Н1, его фрагментов и вариантов, отличающиеся только консер- 3 023148 вативными аминокислотными заменами, которые конкурируют ίη νίίτο с В7ГОС дикого типа за связывание с ΡΌ-1, и где указанная вторая пептидная часть содержит Рс-область антитела, и агент, усиливающий эффективность действия указанного белка, выбранный из группы, включающей циклофосфамид, аналог циклофосфамида, сунитиниб, анти-ΤΟΝΡβ, иматиниб, антрациклины, оксалиплатин и доксорубицин, в фармацевтически приемлемом носителе.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к способу увеличения Т-клеточного ответа у человека, включающему введение указанному человеку слитого белка, содержащего первую и вторую пептидные части, где указанная первая часть состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 98% идентична последовательности аминокислот 20-221 или 20-121 §Еф ГО N0: 1 полипептида В7ГОС дикого типа и которая конкурирует ίη νίίτο с В7ГОС дикого типа за связывание с ΡΌ-1; аминокислотной последовательности фрагмента полноразмерного В7ГОС, которая конкурирует ίη νίίτο с В7ГОС дикого типа за связывание с ΡΌ-1, и аминокислотной последовательности внеклеточного домена В7ГОС или ее варианта, отличающегося от исходной последовательности только консервативными аминокислотными заменами, и где указанная вторая пептидная часть содержит Рс-область антитела; и агента, усиливающего эффективность действия указанного белка, выбранного из группы, включающей циклофосфамид, аналог циклофосфамида, сунитиниб, анти-ΤΟΝΕβ, иматиниб, антрациклины, оксалиплатин, доксорубицин, антагонисты ΤΕΚ4, и агонисты ГО-18, в фармацевтически приемлемом носителе, где указанный агент вводят перед указанным слитым белком.

В конкретном варианте осуществления указанный агент представляет циклофосфамид или аналог циклофосфамида.

В другом конкретном варианте осуществления указанный агент вводят по меньшей мере за X часов перед введением указанного слитого белка, где X выбирают из 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 24 и 30.

В следующем конкретном варианте осуществления изобретения циклофосфамид вводят человеку по меньшей мере за 24 ч перед введением слитого белка.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 показано, что В7ГОС-1д связывается с ΡΌ-1. Меченый В7ГОС-1д инкубировали в различных концентрациях с клетками линии СНО, конститутивно экспрессирующими ΡΌ-1, или с родительскими клетками СНО, которые не экспрессируют ΡΌ-1. Связывание анализировали с помощью проточной цитометрии. Среднее значение интенсивности флуоресценции (МР1) В7ГОС-1д (ось у) представлено в виде функции от концентрации зонда (ось х). В7ГОС-1д связывается с клетками ΟΗΟ.ΡΌ-1 (темный кружок), но не с нетрансфицированными клетками СНО (серый треугольник).

На фиг. 2 показано, что В7ГОС-1д конкурирует с В7-Н1 за связывание с ΡΌ-1. Немеченный В7ГОС-1д в различных концентрациях вначале инкубировали с клетками линии СНО, конститутивно экспрессирующими ΡΌ-1 перед добавлением меченого В7-Н1-1д к клеточной смеси. Среднее значение интенсивности флуоресценции (МР1) В7-Н1-1д (ось у) показано в виде функции от концентрации добавленного конкурента немеченного В7ГОС-1д (ось х). По мере того как возрастает концентрация немеченного В7ГОС-1д, количество меченого В7-Н1-1д, связавшегося с клетками СНО, уменьшается, что показывает, что В7ГОС-1д конкурирует с В7-Н1 за связывание с ΡΌ-1.

На фиг. 3 представлены результаты экспериментов, в которых комбинация циклофосфамида (СТХ или цитоксан) и димерный мышиный В7ГОС-1д вызывали в результате уничтожение привитых опухолей СТ26 (карцинома толстой кишки) у мышей. На графике А показан объем опухоли (мм³) против дней после прививки опухоли у мышей, получавших 100 мг/кг СТХ на 10-й день, тогда как на графике В показан объем опухоли (мм³) против дней после прививания опухоли у мышей, получивших СТХ на 10-й день, на следующий день после первого введения В7ГОС-1д. Каждая линия на каждом графике соответствует одной мыши. Черная стрелка обозначает введение В7ГОС-1д. На графике С показаны средние значения объема опухоли.

На фиг. 4 показаны результаты экспериментов, в которых комбинация СТХ и димерного мышиного В7ГОС-1д уничтожала привитые опухоли СТ26 (карцинома толстой кишки) у мышей и защищала при повторном введении СТ26. Мышам, которые получили СТХ и В7ГОС-1д и у которых не обнаружили опухолевого роста на 44-й день после прививания опухоли, повторно прививали опухоль. Позже мышам вновь проводили повторное введение опухолевых клеток на 70-й день. Ни у одной из мышей не наблюдали опухолевого роста к 100-му дню.

На фиг. 5 показано, что лечение СТХ и В7ГОС-1д приводило к формированию опухольспецифических СТЬ памяти. Мышам с уничтоженными прижившимися подкожными опухолями СТ26 после лечения СТХ и В7ГОС-1д повторно прививали клетки СТ26. Спустя семь дней выделяли спленоциты и активировали либо яичным альбумином, иррелевантным пептидом, либо АН1, СТ26специфическим пептидом. Клетки окрашивали вначале антителом анти-СО8 последующим внутриклеточным окрашиванием антителом анти-ΙΡΝγ перед анализом РАС8.

На фиг. 6 показаны эффекты различных доз В7ГОС-1д в комбинации с СТХ на уничтожение привитых опухолей СТ26 у мышей. Мышам породы Ва1Ь/С в возрасте 9-11 недель прививали подкожно 1 Е05

- 4 023148 клеток СТ26. На 9-й день мышам вводили ΙΡ 100 мг/кг СТХ. Через 24 ч, на 10-й день, мыши получали 30, 100 или 300 мкг В7-НС-1д с последующими 2 инъекциями каждую неделю, всего до 8 введений. Рост опухоли измеряли два раза в неделю.

На фиг. 7 представлены результаты экспериментов, в которых комбинация СТХ и антитела антиΡΌ-1 вызывала уничтожение привитых опухолей СТ26 (карцинома толстой кишки) у мышей. На графике А показан объем опухоли (мм³) в зависимости от дней после прививания опухоли у нелеченых мышей (т.е. мышей, получавших только среду для лекарства), на графике В представлен объем опухоли (мм³) в зависимости от дней после прививания опухоли у мышей, получавших только анти-РН-1, начиная с 11-го дня, по 300 мкг на инъекцию, 3 раза в неделю, до 12 инъекций, и на графике С показан объем опухоли (мм³) в зависимости от дней после прививания опухоли у мышей, получавших СТХ на 11-й день и первое введение анти-РН-1 на 12-й день, по 300 мкг на инъекцию, 3 раза в неделю, до 12 инъекций. Каждая линия на каждом графике обозначает одну мышь. Черная стрелка указывает введение анти-РН-1.

На фиг. 8 представлены результаты экспериментов, в которых комбинация СТХ и антитела антиСТЬА4 приводила к уничтожению привитых опухолей СТ26 (карцинома толстой кишки) у мышей. Здесь на графике А показан объем опухоли (мм³) в зависимости от дней после введения опухоли у мышей, получивших 100 мг/кг СТХ на 11-й день, тогда как на графике В показан объем опухоли (мм³) в зависимости от дней после введения опухоли у мышей, получавших СТХ на 11-й день и анти-СТЬА4 на 12-й день, в дозе 100 мкг на инъекцию, два раза в неделю, всего до 8 инъекций. Каждая линия на каждом графике обозначает одну мышь. Черная стрелка указывает введение анти-СТЬА-4.

На фиг. 9 представлены результаты экспериментов, в которых мышам породы Ва1Ь/С в возрасте 911 недель прививали 1 х 10⁵ клеток СТ26 подкожно. На 9-й день мышам вводили 100 мг/кг СТХ, ΙΡ. Через 24 ч, на 10-й день, мышам вводили 100 мкг В7-ОС-1д. В эксперименте использовали 5 групп: интактные мыши, которым не вводили каких-либо опухолевых клеток, мыши, которым вводили среду для лекарства, только СТХ, СТХ + В7-ОС-1д или только В7-НС-1д. Две интактные мыши и 4 мыши из других групп были удалены из исследования на 11-й день (2 дня после СТХ) и на 16-й день (7 дней после СТХ) для анализа Т-клеток. Левая панель показывает, что на 11-й день, через 2 дня после инъекции СТХ, количество Т-гед в селезенке мышей, получавших СТХ, было значительно ниже, чем количество Т-гед у мышей, которым прививали опухоль и вводили среду для лекарства. Правая панель показывает, что на 16-й день, через 7 дней после введения СТХ и через 6 дней после введения В7-ОС-1д, В7-ОС-1д существенно уменьшал количество ί'.Ή4' Т-клеток, экспрессирующих высокий уровень РЦ-1. Указанное снижение наблюдали как у мышей, получавших В7-ОС-1д, так и у мышей, получавших СТХ + В7-НС-1д. Предполагали, что мыши с привитыми опухолевыми клетками имели больше РН-1+/СН4+ Т-клеток в дренированном лимфоузле, по сравнению с интактными мышами.

На фиг. 10 представлены результаты экспериментов, в которых комбинация СТХ и В7-ОС-1д приводила к увеличению выживаемости у мышей при введении в хвостовую вену опухолевых клеток линии простаты мышей. Клетки §Р-1 выделяли из легких мышей, у которых развивались метастазы в результате инъекции клеток опухоли простаты ТРАМР. Мышам породы Β10Ό2 сначала вводили 3х10⁵ клеток §Р-1 с помощью инъекции в хвостовую вену. В дни 5, 12 и 19 мышам вводили 50 мг/кг СТХ, где указано. В дни 6, 13 и 20 мышам вводили 5 мг/кг В7-НС-1д, где указано. Здесь ЫТ обозначает не обработан.

Фиг. 11. Мышам породы Ва1Ь/С в возрасте 11-13 недель вводили изолированные печеночные метастазы с помощью инъекции в часть селезенки с ее последующим удалением (НетйрКеп щ)ес!юп 1ес11пк|ие). Селезенки анестезированных мышей делили на две половины и накладывали на половины скобки. Клетки СТ26 (1Е05) вводили в одну половину селезенки и через 30 с указанную половину селезенки удаляли и накладывали скобки на селезеночную дренирующую вену. На 10-й день мыши получали 1 инъекцию СТХ в дозе 50 мг/кг, 1Р. Через 24 ч, на 11-й день, мышам вводили рекомбинантный пептид листерии, несущий АН1, иммунодоминантный эпитоп СТ26, в дозе 0,1 ЬН₅₀ (1х10⁷ КОЕ), затем вводили на 14- и 17-й дни. Мышам также вводили В7-ОС-1д на 11-й день и затем на 18-й день. Наблюдали общую выживаемость мышей.

Определения

Если не указано иначе, все технические и научные термины, используемые в описании, обладают теми же значениями, как обычно понимаемые специалистом в данной области техники, к которой принадлежит раскрытое изобретение. В частности, следующие термины и фразы имеют следующее значение.

Термин передача ингибиторного сигнала предназначен для обозначения любой сигнальной трансдукции, обладающей эффектом отмены, или в других случаях уменьшения Т-клеточных ответов против антигена либо с помощью уменьшения Т-клеточной пролиферации, либо с помощью другого ингибиторного механизма, в результате чего величина или продолжительность иммуногенного Т-клеточного ответа уменьшается. Указанная передача ингибиторного сигнала может происходить вследствие связывания РЦ-1 с природным лигандом, например связывания РЦ-1 с В7-Н1 или некого другого члена указанного класса лигандов, В7-ОС, или может происходить вследствие связывания СТЬА4 с лигандами, такими как В7-1 или В7-2. В целом, соединения изобретения уменьшают указанную передачу ингибиторного сигна- 5 023148 ла и включают в себя, но без ограничения, антагонисты ΡΌ-1 и антагонисты СТЬЛ4.

Термин антагонист ΡΌ-1 обозначает любую молекулу, которая ослабляет передачу ингибиторного сигнала, опосредованного ΡΌ-1, находящегося на поверхности Т-клеток, В-клеток, натуральных киллерных (ΝΚ) клеток, моноцитов, ИС и макрофагов.

Указанный антагонист включает в себя молекулу, которая прерывает любой ингибиторный сигнал, создаваемый молекулой ΡΌ-1 на Т-клетке. В конкретных примерах изобретения антагонист ΡΌ-1 представляет собой молекулу, которая ингибирует, уменьшает, отменяет или иным способом уменьшает передачу ингибиторного сигнала через ΡΌ-1 рецепторный сигнальный путь. Указанное снижение может происходить, в случае если (ί) антагонист ΡΌ-1 изобретения связывается с рецептором ΡΌ-1 без инициирования сигнальной трансдукции для уменьшения или блокирования передачи ингибиторного сигнала; (ίί) антагонист ΡΌ-1 связывается с лигандом (например, с агонистом) рецептора ΡΌ-1, предотвращая его связывание с рецептором (например, в тех случаях, когда указанный агонист представляет собой В7-Н1); (ίίί) антагонист ΡΌ-1 связывается или иным способом ингибирует активность молекулы, которая является частью регуляторной цепи, которая, когда она не ингибирована, в результате стимулирует или иным способом способствует передаче ΡΌ-1 ингибиторного сигнала; или (ίν) антагонист ΡΌ-1 ингибирует экспрессию рецептора ΡΌ-1 или экспрессию его лиганда, в частности, путем уменьшения или отмены экспрессии одного или более генов, кодирующих ΡΌ-1, или одного или более его природных лигандов. Таким образом, антагонист ΡΌ-1 изобретения представляет собой молекулу, которая осуществляет уменьшение передачи ΡΌ-1 ингибиторного сигнала, увеличивая тем самым Т-клеточный ответ на один или более антигенов.

Используемый в описании термин антагонист СТЬЛ4 обозначает соединение, которое уменьшает СТЬЛ4-опосредованное ингибирование Т-клеточных реакций. Например, в Т-клетке СТЬЛ4 доставляет ингибиторный сигнал после связывания лигандов В7, таких как В7-1 и В7-2. Антагонист СТЬА4 представляет собой антагонист, который нарушает связывание указанных лигандов с СТЬА4 на активированных Т-клетках. В одном варианте осуществления антагонист представляет собой антитело анти-СТЬА4, которое связывается с СТЬА4, чтобы предотвратить связывание лиганда.

Используемый в описании термин активный фрагмент относится к части природного полипептида или к полипептиду с высокой гомологией последовательностей (например, по меньшей мере 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичности аминокислотной последовательности) с натуральным полипептидом и демонстрирует активность антагониста ΡΌ-1, например, при связывании ΡΌ-1 или при связывании с лигандом ΡΌ-1. В предпочтительных воплощениях указанный фрагмент состоит из внеклеточного домена (ЕСИ) белка В7-ИС, который связывается с ΡΌ-1, например, §ЕЦ ГО N0: 3, предпочтительно из его аминокислот 20-221. В случае полипептида ΡΌ-1 активный фрагмент представляет собой часть указанного полипептида, включающего в себя связывающий домен, который связывается с природным лигандом ΡΌ-1 для предотвращения стимуляции ΡΌ-1-опосредованной передачи ингибиторного сигнала с помощью указанного лиганда. Активные фрагменты могут быть идентифицированы по их способности конкурировать с молекулой, из которой они получены, при связывании с природным сайтом связывания. Например, активные фрагменты будут конкурировать с В7-ИС дикого типа за связывание с ΡΌ-1.

В отношении антитела термин активный фрагмент означает антигенсвязывающую часть антитела, которая является меньше, чем цельный иммуноглобулин. Указанные фрагменты включают в себя РаЬ и Р(аЬ')₂ фрагменты, способные реагировать или связываться с любым из полипептидов, раскрытых в описании, которые являются рецепторами или лигандами. Указанные фрагменты РаЬ и Р(аЬ')₂, лишенные Рсчасти интактного антитела, выводятся более быстро из циркуляции и могут обладать меньшим неспецифическим тканевым связыванием, чем интактное антитело (\УаЬ1 с1 а1., 1. Νικ. Мей. 24:316-325 (1983)). Также включены Ρν-фрагменты (НосЬтап, 1. е1 а1. (1973), ВюсЬет18йу, 12:1130-1135; §Ьагои, 1. е1 а1. (1976), ВюсЬет181гу, 15:1591-1594). Указанные различные фрагменты получают с помощью обычных технологических приемов, таких как протеазное расщепление или химическое расщепление (см., например, Кои88еаих е1 а1., Ме1Ь. Еп/уто1.. 121:663-69 (1986)).

Используемый в описании термин растворимая часть антагониста ΡΌ-1 означает часть полноразмерного полипептида, которая не включает в себя какую-либо часть трансмембранного участка или сегмента. Например, в отношении В7-ИС растворимая часть включает в себя внеклеточную часть (с Ν-терминальной сигнальной последовательностью или без нее), но не включает в себя какую-либо часть трансмембранного участка (или, по меньшей мере, не достаточную, чтобы уменьшить растворимость). Таким образом, ЕСИ В7-ИС человека показана как §ЕЦ ГО N0: 3 и состоит из 1дУ-подобного и 1дС-подобного доменов полноразмерной молекулы (т.е. аминокислоты 20-221 полноразмерной последовательности (8ЕЦ ГО N0: 1).

Используемый в описании костимуляторный полипептид представляет собой полипептид, который при взаимодействии с молекулой клеточной поверхности на Т-клетках модулирует активность Т-клетки. Таким образом, ответ Т-клетки может быть эффекторным (например, СТЬ или антителопродуцирующая В-клетка) ответом, хелперным ответом, обеспечивающим помощь одному или более эффекторным (например, СТЬ или антитело-продуцирующая В-клетка) ответам, или супрессивным ответом.

- 6 023148

Используемый в описании термин схема лечения относится к лечению заболевания или к способу достижения желаемого физиологического изменения, такому как увеличенный или сниженный ответ иммунной системы на антиген или иммуноген, например увеличение или уменьшение числа или активности одной или более клеток или типов клеток, которые вовлечены в указанный ответ, где указанное лечение или способ включают в себя введение животному, такому как млекопитающее, в частности человеку, достаточного количества двух или более химических агентов или компонентов указанной схемы для эффективного лечения заболевания или для получения указанного физиологического изменения, где указанные химические агенты или компоненты вводят вместе как часть одной композиции или вводят отдельно и независимо в то же самое время или в разные моменты времени (т.е. введение каждого агента или компонента отделено ограниченным периодом времени от введения одного или более агентов или компонентов) и где введение указанного одного или более агентов или компонентов обеспечивает результат, больший, чем результат, получаемый при введении любого из указанных агентов или компонентов по отдельности или изолированно.

Используемый в документе термин изолированный предназначен для описания соединения, представляющего интерес, (например, либо полинуклеотида, либо полипептида), которое находится в окружении, которое отличается от окружения, в котором соединение присутствует естественным образом, например, выделенный из своей природной среды, например, с помощью концентрирования полипептида до концентрации, в которой он не встречается в природе. Изолированный предназначен для включения соединений, которые находятся в образцах, которые значительно обогащены изобретением, представляющим интерес, и/или в которых соединение, представляющее интерес, частично или в основном очищают.

Используемый в описании термин полипептид относится к цепи аминокислот любой длины, без учета модификации (например, фосфорилирование или гликозилирование). Полипептид настоящего изобретения может представлять собой рекомбинантный полипептид, природный полипептид или синтетический полипептид, предпочтительно рекомбинантный полипептид.

Используемый в описании вариантный полипептид содержит по меньшей мере одно изменение аминокислотной последовательности по сравнению с аминокислотной последовательностью соответствующего полипептида дикого типа.

Используемое в описание изменение аминокислотной последовательности может представлять собой, например, замену, удаление или вставку одной или более аминокислот.

Используемые в описании термины часть, сегмент и фрагмент, при использовании в отношении полипептидов, относятся к непрерывной последовательности остатков, например аминокислотных остатков, последовательность которых образует часть большей последовательности. Например, если полипептид обрабатывали любой из обычных эндопептидаз, таких как трипсин или химотрипсин, олигопептиды, полученные в результате такой обработки, представляют собой части, сегменты или фрагменты исходного полипептида. Фрагмент полипептида, таким образом, относится к любой части полипептида, которая представляет собой более короткий полипептид полноразмерного белка. В целом, фрагменты будут иметь пять или более аминокислот в длину.

Производное, аналог или гомолог полипептида (или его фрагмента) изобретения могут представлять собой (ί) полипептид, в котором один или более аминокислотных остатков заменены консервативным или неконсервативным аминокислотным остатком (предпочтительно консервативным аминокислотным остатком) и указанный замещенный аминокислотный остаток может представлять собой или может не представлять собой остаток, кодированный генетическим кодом; или (ίί) полипептид, в котором один или более аминокислотных остатков включают в себя замещающую группу; или (ίίί) полипептид, в котором зрелый полипептид соединяют с другим соединением, таким как соединение для увеличения времени полужизни полипептида (например, полиэтиленгликоль); или (ίν) полипептид, в котором дополнительные аминокислоты соединяют со зрелым полипептидом, таким как лидирующая или секреторная последовательность или с последовательностью, которая применяется для очистки зрелого полипептида или пропротеиновой последовательности.

Подразумевается, что указанные производные и аналоги входят в объем знаний специалистов в данной области техники, если исходить из идей настоящего документа.

Используемая в описании валентность относится к числу доступных сайтов связывания в молекуле.

В соответствии с настоящим изобретением термин процентная идентичность или процент идентичности, когда относится к последовательности, означает, что последовательность сравнивают с заявленной или описанной последовательностью после выравнивания последовательности, которую нужно сравнить (сравниваемая последовательность) с описанной или заявленной последовательностью (референсная последовательность). Затем процентную идентичность определяют по следующей формуле:

Процентная идентичность= 100[1 -(С/К)], где С представляет собой число различий между референсной последовательностью и сравниваемой последовательностью на протяжении длины выравнивания между референсной последовательностью и сравниваемой последовательностью, где (ί) каждое основание или аминокислота в референсной

- 7 023148 последовательности, которая не имеет соответствующего выровненного основания или аминокислоты в сравниваемой последовательности, и (ίί) каждый гэп в референсной последовательности, и (ίίί) каждое выровненное основание или каждая выровненная аминокислота в референсной последовательности, которая отличается от выровненного основания или аминокислоты в сравниваемой последовательности, представляет собой отличие;

К является числом оснований или аминокислот в референсной последовательности на протяжении длины выравнивания со сравниваемой последовательностью, с любым гэпом, созданным в референсной последовательности, который также считают основанием или аминокислотой.

Если имеет место выравнивание между сравниваемой последовательностью и референсной последовательностью, для которых процентная идентичность, как рассчитано выше, приблизительно равна или больше, чем установленная минимальная процентная идентичность, в таком случае сравниваемая последовательность обладает установленной минимальной процентной идентичностью к референсной последовательности, даже если могут иметь место выравнивания, в которых вышеуказанная рассчитанная процентная идентичность является меньше, чем установленная процентная идентичность.

Используемый в описании термин консервативная замена аминокислот означает замену, при которой замененная аминокислота обладает сходными структурными или химическими свойствами, и неконсервативная замена аминокислот представляет собой замены, при которых заряд, гидрофобность или объем замененной аминокислоты существенно отличаются. Неконсервативные замены будут более существенно отличаться по их эффекту на сохранение (а) структуры пептидного каркаса в области замены, например конформации листа или спиральной конформации; (Ь) заряда или гидрофобности молекулы в сайте-мишени или (с) объема боковой цепи. Примеры консервативных замен аминокислот включают в себя такие замены, в которых замена происходит в пределах одной из пяти следующих групп: 1) малые алифатические неполярные или слабополярные остатки (А1а 8ет, ТЬг, Рго, О1у); 2) полярные, отрицательно заряженные остатки и их амиды (Акр, Аки, С1и, С1и); полярные, положительные заряженные остатки (Ηίκ, Агд, Ьук); большие алифатические неполярные остатки (МеЦ Ьеи, 11, Уа1, Сук) и большие ароматические остатки (РЬе, Туг, Тгр). Примерами неконсервативных замен аминокислот являются замены, где 1) гидрофильный остаток, например серил или треонил, заменяют на гидрофобный остаток, например лейцил, изолейцил, фенилаланил, валил или аланил; 2) цистеин или пролин заменяют на любой другой остаток; 3) остаток, содержащий положительно заряженную боковую цепь, например лизил, аргинил или гистидил, заменяют на отрицательно заряженный остаток, например глутамил или аспартил; или 4) остаток, содержащий объемную боковую цепь, например фенилаланин, заменяют на остаток, который не содержит боковой цепи, например глицин.

Термины индивид, хозяин, субъект и пациент используют в описании взаимозаменяемо, и они относятся к млекопитающему, включая, но без ограничения, приматов, например человека, а также грызунов, таких как мыши и крысы и другие лабораторные животные.

Используемый в описании термин эффективное количество или терапевтически эффективное количество означает дозу, достаточную для лечения, ингибирования или уменьшения одного или более симптомов болезненного состояния, которое нужно вылечить, или для обеспечения иным способом желаемого фармакологического и/или физиологического эффекта, в частности усиления Т-клеточного ответа к выбранному антигену. Точная доза будет варьировать в соответствии с множеством факторов, таких как субъект-зависимые переменные (например, возраст, состояние иммунной системы и т.д.), заболевание и лечение, которое нужно назначить.

Используемый в описании термин фармацевтически приемлемый носитель включает в себя любые и все растворители, дисперсные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие абсорбцию агенты и т.п. Применение указанных сред и агентов для фармацевтически активных субстанций хорошо известно в данной области техники. Кроме случаев, когда общеупотребительные среды или агент несовместимы с активным соединением, предусматривается их применение в терапевтической композиции. Дополнительные активные соединения также могут быть включены в композиции.

Термин антитело предназначен для включения интактных молекул, а также их фрагментов, которые включают в себя антигенсвязывающий сайт. Структура целого антитела часто предоставляется в виде Н₂Ь₂ и отражает тот факт, что антитела обычно содержат две легкие (Ь) аминокислотные цепи и две тяжелые (Н) аминокислотные цепи. Обе цепи содержат области, способные к взаимодействию со структурно комплементарной антигенной мишенью. Области, взаимодействующие с мишенью, обозначают как вариабельные или У-области, и они характеризуются отличиями в аминокислотной последовательности от антител другой антигенной специфичности. Вариабельные области Н- или Ь-цепей содержат аминокислотные последовательности, способные к специфическому связыванию с антигенными мишенями. В пределах указанных последовательностей расположены меньшие последовательности, получившие название гипервариабельных благодаря их чрезвычайной вариабельности среди антител с отличающейся специфичностью. Указанные гипервариабельные области также обозначают как определяющие комплементарность области или СЭК-области. Указанные СЭК-области отвечают за основную специфичность антитела в отношении определенной антигенной детерминантной структуры. Облас- 8 023148 ти СЭР представляют собой неконтактирующие участки аминокислот в пределах вариабельных областей, но было обнаружено, что независимо от видов позиционные расположения указанных критических аминокислотных последовательностей в пределах вариабельных областей тяжелых и легких цепей имеют сходные локализации в аминокислотных последовательностях вариабельных цепей.

Вариабельные тяжелые и легкие цепи всех антител, каждая, содержат три СЭР-области. которые не соприкасаются с другими (обозначаемыми Ь1, Ь2, Ь3, Н1, Н2, Н3) для соответствующих легких (Ь) и тяжелых (Н) цепей. Распространенные СЭР-области описаны КаЬа! с1 а1., 1. ΒίοΙ. СЬет. 252:6609-6616 (1977). Антитела, раскрытые в соответствии с изобретением, также могут быть полностью синтетическими, в которых полипептидные цепи антител синтезированы и, возможно, оптимизированы для связывания с полипептидами, раскрытыми в описании в качестве рецепторов. Указанные антитела могут представлять собой химерные или гуманизированные антитела и могут быть полностью тетрамерными по структуре или могут быть димерными и включать в себя только одну тяжелую и одну легкую цепи.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение предоставляет схему лечения или комбинированной терапии для лечения заболевания у млекопитающих, включающую в себя соединение, которое уменьшает или прекращает передачу ингибиторного сигнала в Т-клетки, предпочтительно Т-клетки человека, вводимое в сочетании с потенцирующим агентом для увеличения иммунного ответа.

Способы изобретения также относятся к применению широкого спектра иммуномодуляторов и их композиций. В целом, повышенный Т-клеточный ответ, полученный в результате указанных способов, является выше, чем повышенный Т-клеточный ответ, полученный в результате введения аналогичной дозы указанного антагониста ΡΌ-1 или указанного потенцирующего агента по отдельности.

Раскрытые композиции и схемы являются полезными для стимулирования или усиления иммунных ответов, вовлекающих Т-клетки. Таким образом, способы изобретения наиболее полезны в лечении болезненного состояния, которое может улучшиться при увеличении активности Т-клеток, где повышенный Т-клеточный ответ необходим или достаточен для лечения указанного заболевания, даже если заболевание не вызвано специфически или не отягощено сниженным Т-клеточным ответом. В предпочтительном варианте осуществления тип заболевания, которое нужно вылечить или предотвратить, представляет собой злокачественную опухоль или хроническое инфекционное заболевание, вызванное бактерией, вирусом, простейшим, гельминтом или другим внутриклеточным микробным патогеном, который подвергается атаке цитотоксических Т-лимфоцитов. Активация Т-клеток с использованием раскрытых композиций также полезна для лечения или предотвращения состояний, характеризующихся иммуносупрессией.

В соответствии с настоящим изобретением Т-клеточный ответ может регулироваться молекулами, которые связываются с рецепторами на поверхности Т-клеток и молекулами, которые связываются с лигандами указанных рецепторов. В случае ΡΌ-1 молекулы, которые связывают ΡΌ-1 чтобы уменьшить его ингибиторный эффект, и/или молекулы, которые связывают один или более лигандов ΡΌ-1, чтобы уменьшить их способность связываться с ΡΌ-1, обладают эффектом уменьшения способности ΡΌ-1 ингибировать Т-клеточный ответ, увеличивая, тем самым, указанный ответ и его иммунологические эффекты.

А. Антагонисты рецептора ΡΌ-1.

Предоставляются композиции, содержащие антагонисты рецепторов ΡΌ-1, и они включают в себя соединения или агенты, которые или связываются с лигандом ΡΌ-1 и блокируют его, чтобы препятствовать связыванию лиганда с рецептором ΡΌ-1 или ингибировать указанное связывание, или непосредственно связываются с рецептором ΡΌ-1 и блокируют его, не вызывая передачи ингибиторного сигнала через рецептор ΡΌ-1. В другом варианте осуществления антагонист рецептора ΡΌ-1 непосредственно связывается с рецептором ΡΌ-1 без инициирования передачи ингибиторного сигнала и также связывается с лигандом рецептора ΡΌ-1, чтобы уменьшить или ингибировать инициирование лигандом сигнальной трансдукции через рецептор ΡΌ-1. При уменьшении числа и/или количества лигандов, которые связываются с рецептором ΡΌ-1 и запускают трансдукцию ингибиторного сигнала, меньшее число клеток ослабляется негативным сигналом, передаваемым с помощью ΡΌ-1-сигнальной трансдукции, и может быть достигнут более сильный иммунный ответ.

В соответствии с настоящим изобретением сигнальная система ΡΌ-1 требует связывания с лигандом ΡΌ-1 (таким как В7-Н1 или В7-ЭС) в непосредственной близости с пептидным антигеном, представленным главным комплексом гистосовместимости (МНС) (см., например, Ртеетаи Ρτοο. Νηΐΐ. Асаб. 8ск ИЗА, 105:10275-10276 (2008)). Следовательно, белки, антитела или малые молекулы, которые предотвращают косвязывание ΡΌ-1 и ТСР на Т-клеточной мембране, являются эффективными антагонистами ΡΌ-1, предусмотренными настоящим изобретением.

Типичные антагонисты рецептора ΡΌ-1 включают в себя, но без ограничения, полипептиды В7-ЭС, включая их гомологи и варианты, а также активные фрагменты любого из вышеперечисленного, и гибридные белки, которые включают в себя любое из вышеперечисленного. В предпочтительном варианте осуществления гибридный белок включает в себя растворимую часть В7-ЭС, соединенную с Рс-частью антитела, такого как 1§С человека, и не содержит весь трансмембранный участок В7-ЭС человека или

- 9 023148 его часть. Антагонисты рецептора ΡΌ-1 также могут представлять собой малые молекулы антагонистов или антитела, которые уменьшают или нарушают ΡΌ-1-рецепторную сигнальную трансдукцию путем связывания с лигандами ΡΌ-1 или с самим ΡΌ-1, в особенности в тех случаях, когда косвязывание ΡΌ-1 с ТСК не наступает после такого связывания, при этом не запускается передача ингибиторного сигнала через рецептор ΡΌ-1.

Антагонисты рецептора ΡΌ-1, предоставляемые в описании, в целом применимы ίη νίνο и ех νίνο в качестве лекарств, стимулирующих иммунный ответ. В целом, раскрытые композиции антагонистов полезны для лечения субъекта, страдающего от заболевания или нарушения или имеющего предрасположенность к заболеванию или нарушению, где иммунная система субъекта увеличивает иммунный ответ.

1. Полипептиды В7-ЭС.

В определенных воплощениях белки В7-ЭС могут быть использованы в качестве антагонистов рецептора ΡΌ-1. В7-ЭС представляет собой природный лиганд ΡΌ-1 и связывается с ΡΌ-1 с более высокой аффинностью, чем В7-Н1, и может, таким образом, ингибировать взаимодействия Β7-Η1:ΡΌ-1. Подходящие полипептиды В7-ЭС, включая их варианты, гомологи и фрагменты, могут быть получены из следующих полноразмерных полипептидов В7-ЭС человека с эндогенным сигнальным пептидом (8ЕР ГО N0: 1) или без него (δΗΟ ГО N0: 2).

К1РЦШМЦЗЦ КУЕНЦТЗРНН Α8ΥΗΚΙΝΤΗ1 ΚΙ,ΚΡΡΡΟΚΝΡ ГАЬНКрЪСОК (ЗЕО Ю	ЕЫЗЪНОГААЬ ΓΤντνΡΚΕ1.Υ ЕЕАТЬЬЕЕОЬ РШЗКАЗРН1Р	ΙΙΕΗΟεΝντί, ЕСЦРЦТСЗНУ НЬСАГТАЗиЭ ΟνονΕϋΕΟΟΥ ОСТИУСУАИ ΠΥΚΥΓΊΤΚνΚ АЕУЗМРНУЗУ ΡΑΝΤ3Η5ΚΤΡ ВОЬУОУТЗУЬ	60 120 160 240 273
ЬКУРЕТОЕУБ ΒϋνΡΝΝΊΉνΚ ЬУЗЗКОТТКК N0:1)	ЬТСОАТСУРЬ ЕЬТГАЗГМХЗ РУТТТККБУЫ
ЗОМЕРЕТНРТ 3ΑΙ	КШН1Р1РРС ΙΙΑΡΙΡΙΑΤν
ЬРТУТУРКБЬ	ΥΙΙΕΗΟΒΝνΤ	ЬЕСиротезн	ТОЬеАГТАЗЪ	ΟΚνΕΝϋΤΒΡΗ	ЕЕКАТ1АЕЕО	во
ЬРЬОКАЗРН!	ΡΟνΟνΕΏΕΟΟ	γβοιιίγανΑ	ИЦУКУЬТЬЮ/	ΚΑ3ΥΕΚΙΝΤΗ	ШКУРЕТОЕУ	120
ЕЬТСОАТСУР	ΙΑΕν3ΜΡ№/3	νΡΑΝΤ8Η3ΚΤ	ΡΕΟΙ,ΥΟνΤδν	ЩЦКРРРСКЫ	РЗСЧРННТНУ	160
ЕЕЦТ1АЗШЦ	ОЗОМЕРЕТНР	ТИШН1Р1РР	С11АР1Р1АТ	УГАЬККОЬСО	КЕУЗЗКЦТТК	240
ЙРУГТТКЕБУ	Ν5ΑΙ					2Б4
(ЗЕО 10	N0:2)

Семейство молекул В7, включающее в себя В7ГОС, экспрессируется на поверхности клетки с мембранным проксимальным константным доменом 1дС и мембранным дистальным доменом 1дУ. Рецепторы указанных лигандов имеют общий внеклеточный 1дУ-подобный домен. Взаимодействия пар рецептор-лиганд опосредуются главным образом с помощью аминокислотных остатков в доменах 1дУ лигандов и рецепторов. В целом, домены 1дУ описываются, как имеющие два листа, каждый из которых содержит слой β-тяжей. Указанные β-тяжи обозначают как А', В, С, С', С, Ό, Е, Р и С. Структура указанных полипептидов описана в литературе (см. Мо1паг е1 а1., Сгук1а1 51гнс1нге оГ 1йе сотр1ех Ье1\\ееп ргодгаттеб беаШ-1 (ΡΌ-1) и ίΐκ йдапб ΡΌ-Ε2, ΡΝΑδ, νο1. 105, р. 10483-10488 (29 Лбу 2008)).

Трансмембранный белок, В7ГОС, в мономерной форме включает в себя домены 1дУ и 1дС, которые составляют внеклеточную часть молекулы (внеклеточный домен, или ЕСГО). причем 1дУ-подобный домен ответственен целиком или частично за связывание ΡΌ-1, а также за другие функции, перечисленные в способах изобретения. В отношении человеческого белка 1дУ-домен отличается тем, что он обладает соединенными дисульфидной связью тяжами В и Р (как указано выше), что представляется характерным для многих 1§У-доменов, и обладает трехмерной структурой, сходной с доменами 1дУ как В7-1, так и В7-2 (см. Мо1паг е1 а1. (2008), кирга).

В одном варианте осуществления вариантные полипептиды В7ГОС содержат аминокислотные изменения (т.е. замены, делеции или вставки) в пределах одного или более указанных β-тяжей в любой возможной комбинации. В другом варианте осуществления варианты В7ГОС содержат одно или более аминокислотных изменений (т.е. замены, делеции или вставки) в β-тяжах А', С, С', С, Ό, Е, Р или С. В предпочтительном варианте осуществления варианты В7ГОС включают в себя одно или более аминокислотных изменений в β-тяже С. В другом варианте осуществления фрагменты вариантного полипептида В7ГОС включают в себя домены 1дС и 1дУ В7ГОС. В другом варианте осуществления фрагменты вариантного полипептида В7ГОС включают в себя 1дУ-домен В7ГОС. Белки В7ГОС человека и мыши содержат короткий внутриклеточный домен, один трансмембранный домен и внеклеточный домен. Внеклеточный домен содержит два 1д-домена; мембранный проксимальный 1дС-домен и мембранный дистальный 1дУ-домен. Используемые фрагменты вариантных полипептидов В7ГОС включают в себя растворимые фрагменты. Растворимые фрагменты В7ГОС представляют собой фрагменты В7ГОС, которые могут быть слущены, секретированы или выделены другим путем из продуцирующих клеток. В одном варианте осуществления фрагменты вариантного полипептида В7ГОС включают в себя полный внеклеточный

- 10 023148 домен В7-ЭС. Внеклеточный домен В7-ЭС включает в себя аминокислоты приблизительно 20-221 В7ЭС мыши или человека или их активные фрагменты. В другом варианте осуществления фрагменты вариантного полипептида В7-ЭС включают в себя домены 1§С и 1§У В7-ЭС. В другом варианте осуществления фрагменты вариантного полипептида В7-ЭС включают в себя домен 1§У В7-ЭС.

Считают, что сигнальная система ΡΌ-1 требует связывания с лигандом ΡΌ-1 (обычно В7-Н1) в непосредственной близости с пептидным антигеном, представленным главным комплексом гистосовместимости (МНС) (Ртеетаи Ргос. Ναΐί. Лсай. δει. И8Л, 105:10275-10276 (2008)). Поэтому белки, антитела или малые молекулы, которые предотвращают совместное связывание ΡΌ-1 и ТСК на Т-клеточной мембране, являются эффективными антагонистами ΡΌ-1, предусмотренными настоящим изобретением.

Антагонист ΡΌ-1, применяемый в способах и композициях изобретения, включает в себя фрагменты белка В7-ЭС, содержащие ЕСЭ. Альтернативно, фрагменты В7-ЭС включают в себя часть внеклеточного домена, которая содержит 1дУ- или 1дУ-подобный домен, предпочтительно аминокислоты 20-221, более предпочтительно 20-121, которые являются достаточными для связывания с рецептором ΡΌ-1, чтобы препятствовать или предотвратить или иным способом уменьшить передачу ингибиторного сигнала через рецептор ΡΌ-1. В предпочтительном варианте осуществления фрагмент В7-ЭС конкурирует с В7-Н1 за связывание с рецепторами ΡΌ-1.

В одном варианте осуществления фрагменты вариантного полипептида В7-ЭС могут содержать область полипептида, которая является важной для связывания с ΡΌ-1. Указанные полипептидные фрагменты могут быть использованы для конкурирования за связывание с ΡΌ-1 и для предотвращения связывания нативного В7-ЭС с ΡΌ-1. Ввиду конкурирования за связывание с ΡΌ-1 указанные фрагменты могут быть полезны для усиления иммунного ответа, поскольку ингибирующие взаимодействия В7-Н1 и В7-ЭС с ΡΌ-1 ингибируют супрессию иммунных ответов, которая происходила бы в противном случае. Полипептидный фрагмент мышиного или человеческого В7-ЭС, который мог бы конкурентно связаться с ΡΌ-1, может содержать, например, аминокислоты 101-108 или 110-114. Связывание В7-ЭС дикого типа с ΡΌ-1 обычно ингибируется по меньшей мере на 50, на 60, на 70, на 75, на 80, на 90, на 95 или более чем на 95% по сравнению с уровнем связывания В7-ЭС дикого типа с ΡΌ-1 в отсутствие фрагмента указанного В7-ЭС дикого типа. Типичные фрагменты В7-ЭС, используемые в способах и/или композициях изобретения, включают в себя, но не ограничиваются, следующие внеклеточные домены В7-ЭС:

внеклеточный домен (ЕСО)В7-ОС человека:

ЬРТУТУРКБЬ ΥΙΙΕΗΟΒΝνΤ ЬЕСЦЕОТОЗН \ЩЪОА1ТАЗЬ ОКУЕМЦТЗРН	НЕКАТЬЬЕЕО	60
ЬРЬСКАЗРН! Ρονονκοκοο ΥΟϋΙΙΙΥΟνΑ ИЦУКУЬТЬКУ ΚΑ3ΥΚΚΙΝΤΗ	ΙΧ,ΚνΡΒΤϋΕν	120
ЁЬТСОАТОУР ЦАЕУЗМРВУЗ УРАИТЗНЗКТ РЕОЬУОУТЗУ ЬНЬКРРРОКИ	Ρ3ΟνΡΗΝΤΗν	130
РЕЬТЬАЗТШ, 030МЕРЙТНР ТИ		202

(ЗЕО Ю N0:3)

ЕСЭ В7-ЭС мыши:

ЬГТУТАРКЕУ ΥΤνθνθ33ν3 ЬЕСОГПККЕС ТЕЬЕСШАБЬ ΟΚνΕΝΟΤδίΧί	ЗЕНАТЬЬЕЕО	60
ЬРЬСКАЬРН! ΡΞνθνΕΌ3Ο<5 УНСЬИТСОАА ΗϋΥΚΥΙ,ΤνΚν ΚΑδΥΜΚΙΓΠΉ	1ЬЕУРСТОЕУ	120
ЦЬТСОАКОУР ΙΑΕνδΗΟΝνδ νΡΑΝΤδΗΙΚΤ РЁСЫОУТЗУ ЩЬКРОРЗКН	РЗСМРНКАНМ	180
КЕЬТЗАЦЦР ЬЕКМБРХУРК ТН		202

(ЗЕО Ю N0:4)

ЕСЭ В7-ЭС яванского макака:

ЬРТУТУРКБЬ ΥΙΙΕΗΟΞΝνΤ	ЬЕСИГОТСЗН \П1ЬОА1ТАЗЬ ОКУЕИЦТЗРН ЯЕКАТЬЬЕЕО	60
ЬРЬСКАЗГН! ΡΟνονΚΟΕδΟ	ΥΟαίΙΙΥΟνΑ ΗΟΥΚΥΤΤυΚν ΚΑ5ΥΚΚΙΝΤΗ ΙΙ,κνΡΕΤΟΕν	120
ЕЬТСОАТОУР ΙΑΕΥδΗΡΝνδ	УРАМТЗНЗНТ ΡΕΟΕΥΟντεν ЬЯЬКРРРСЯИ ГЗСТРИМТНУ	130
ЯЕЬТЦАЗХОЬ 030МЕРКТНР	ΤΗ	202
(Зеч Ю ΝΟ; 15)

Многочисленные последовательности других приматов, используемые в способах и композициях изобретения, предоставлены в Оп1атооп е1 а1., 1ттиио1оду, νοί. 124, р. 277-293 (2008).

Антагонист ΡΌ-1, используемый в композициях и способах изобретения, также включает в себя гибридный белок (как описано ниже), который включает в себя первую и вторую полипептидные части, где указанный гибридный белок или по меньшей мере его первая полипептидная часть, обладает активностью антагониста ΡΌ-1, в особенности если указанный гибридный белок связывается с ΡΌ-1 и блокирует его или связывается с лигандом ΡΌ-1 и блокирует его. Первая полипептидная часть указанного гибридного белка может включать в себя или состоять из любого из полипептидов-антагонистов ΡΌ-1 или их ΡΌ-1-связывающих фрагментов, перечисленных здесь иным образом, для применения в качестве антагонистов ΡΌ-1 в способах изобретения. В предпочтительном варианте осуществления указанного гибридного белка упомянутая первая полипептидная часть является Ν-концевой по отношению к упомянутой второй полипептидной части. В отдельном варианте осуществления упомянутая первая полипептидная часть соединяется с упомянутой второй полипептидной частью с помощью олигопептида в дополнение к

- 11 023148 аминокислотам, составляющим упомянутые первую и вторую полипептидные части, указанные соединяющие аминокислоты не снижают существенно ΡΌ-1-антагонистическую активность указанного гибридного белка.

В предпочтительном димерном гибридном белке димер получают в результате ковалентного связывания остатков Сук в СН-областях двух тяжелых цепей 1д, которые представляют собой те же остатки Сук, которые соединены дисульфидной связью в димеризованных нормальных тяжелых цепях 1д.

Большое число полипептидных последовательностей, которые обычно используют в качестве связывающих партнеров гибридных белков, хорошо известны в данной области техники. Примеры используемых полипептидных связывающих партнеров включают в себя, но без ограничения, зеленый флуоресцентный белок (ΟΡΡ), глутатион-8-трансферазу (О8Т), полигистидин, туе, гемаглютинин, Р1ад™ !ад (Койак, №\ν Науеп, СТ), мальтоза-связывающий белок Е и протеин А. Другой вариант осуществления предоставляет тетрамерную конструкцию, содержащую субстрат ΒίτΑ, соединенный с внеклеточным доменом вариантного полипептида В7-ЭС. Способы создания тетрамерной конструкции известны в данной области техники (см. Рейоуак, е! а1., 1. Ехр. Мей., 203:2281 (2006)).

Типичные мышиные гибридные белки В7-ЭС содержат аминокислоты 20-221 мышиного В7-ЭС, соединенные с аминокислотами 237-469 мышиного 1дС_2а (САА49868). В одном неограничивающем примере человеческие гибридные белки В7-ЭС содержат аминокислоты 20-221 В7-ЭС человека, соединенные с аминокислотами 245-476 1дС] человека (ААА02914). Сигнальные пептиды гибридных белков В7ОС включают в себя эндогенные сигнальные пептиды или любой другой сигнальный пептид, который способствует секреции гибридного белка из хозяина. В другом варианте осуществления первый полипептид включает в себя только 1дУ-домен. Другие варианты осуществления могут включать в себя шарнирный домен и Рс-домен антитела 1дС. такого как 1дС]. причем не представлено ни одного домена вариабельной области. Другие варианты осуществления включают в себя применение шарнирной области и Рс-области 1§О₂ или 1дС₄, особенно содержащие N2970 или другую мутацию, которая уменьшает эффекторную функцию.

В соответствии со способами и композициями изобретения полипептид, применяемый в качестве антагониста ΡΌ-1, или первая полипептидная часть гибридного белка, применяемого в качестве антагониста ΡΌ-1, включает в себя аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере 60% или по меньшей мере 65%, или по меньшей мере 70%, или по меньшей мере 75%, или по меньшей мере 80%, или по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 99%-ной идентичностью с аминокислотами 1-221 8ЕО ГО ΝΟ: 1, предпочтительно с аминокислотами 20-221 8ЕО ГО ΝΟ: 1, или с аминокислотами 26-221 8ЕО ГО ΝΟ: 1, или с аминокислотами 1-202 8ЕО ГО ΝΟ: 3 или 4, более предпочтительно с аминокислотами 20-121 8ЕО ГО ΝΟ: 1 или с аминокислотами 1-102 8ЕО ГО ΝΟ: 3 или 4.

В одном варианте осуществления полипептид, применяемый в качестве антагониста ΡΌ-1, или первая полипептидная часть гибридного белка, используемого в качестве антагониста ΡΌ-1, состоит из аминокислот 1-221 8ЕО ГО ΝΟ: 1, или состоит из аминокислот 20-221 8ЕО ГО ΝΟ: 1, или состоит из аминокислот 26-221 8ЕО ГО ΝΟ: 1, или состоит из аминокислот 1-202 8ЕО ГО ΝΟ: 3 или 4. В одном варианте осуществления (8ЕО ГО ΝΟ: 2), полипептид не включает в себя аминокислоты 1-19 8ЕО ГО ΝΟ: 1.

В других конкретных примерах антагонист полипептида ΡΌ-1 или первая полипептидная часть гибридного белка-антагониста ΡΌ-1 включает в себя аминокислотную последовательность 20-121 8ЕО ГО ΝΟ: 1, где предпочтительно он включает в себя аминокислотную последовательность ХУЭУКУ в положении остатков 110-114 или где он включает в себя аминокислоты 1-102 8ЕО ГО ΝΟ: 3, где предпочтительно он включает в себя аминокислотную последовательность ХУЭУКУ в положении остатков 91-95.

В предпочтительном варианте осуществления указанные процентные идентичности достигаются с помощью применения консервативных аминокислотных замен, как определено в другом месте настоящего описания.

В одном указанном варианте осуществления полипептидный антагонист ΡΌ-1 или первая полипептидная часть гибридного белка-антагониста ΡΌ-1 не включает в себя аминокислоты 1-19 8ЕО ГО ΝΟ: 1, или не включает в себя какую-либо часть трансмембранного домена, особенно указанный полный домен, или не включает в себя какую-либо часть внутриклеточного (или растворимого) домена, особенно указанный полный домен, лиганда ΡΌ-1 или другого белкового антагониста ΡΌ-1. В предпочтительном варианте осуществления указанный антагонист или первая полипептидная часть включает в себя только внеклеточный домен (ЕСЭ) 8ЕО ГО ΝΟ: 1, и, таким образом, включается в состав только растворимая часть полипептида указанной последовательности или фрагмент указанной растворимой части.

В других подобных вариантах осуществления полипептидный антагонист ΡΌ-1 или первая полипептидная часть гибридного белка-антагониста ΡΌ-1 включает в себя 1§У-домен или 1дУ-подобный домен или его ΡΌ-1-связывающий фрагмент лиганда ΡΌ-1 или состоит из 1дУ-домена, или 1дУ-подобного домена, или его ΡΌ-1-связывающего фрагмента лиганда ΡΌ-1. В конкретных примерах указанный лиганд ΡΌ-1 представляет собой молекулу В7ГОС или В7-Н1 дикого типа, предпочтительно молекулу В7ГОС или В7-Н1 дикого типа мыши или примата, предпочтительно человека. В других подобных вариантах

- 12 023148 осуществления полипептидный антагонист ΡΌ-1 или первая полипептидная часть гибридного белкаантагониста ΡΌ-1, ΡΌ-1-связывающий фрагмент 1§У-домена или 1§У-подобного домена, лиганда ΡΌ-1, особенно в случае 1дУ-домена или 1дУ-подобного домена состоит из аминокислот 20-121 8ЕО ГО N0: 1 или аминокислот 1-102 8ЕС ГО N0: 3.

Антагонист ΡΌ-1 изобретения также включает в себя ΡΌ-1-связывающий фрагмент аминокислот 20-121 8Е0 ГО N0: 1 (человеческой полноразмерной) или аминокислот 1-102 8Е0 ГО N0: 3 (внеклеточный домен или ЕСГО).

В конкретных воплощениях полипептид или ΡΌ-1-связывающий фрагмент также включает в себя аминокислоты №ЭУКУ в положении остатков 110-114 8Е0 ГО N0: 1 или №ЭУКУ в положении остатков 91-95 8Е0 ГО N0: 3. В качестве неограничивающих примеров указанный ΡΌ-1-связывающий фрагмент включает в себя по меньшей мере 10, или по меньшей мере 20, или по меньшей мере 30, или по меньшей мере 40, или по меньшей мере 50, или по меньшей мере 60, или по меньшей мере 70, или по меньшей мере 75, или по меньшей мере 80, или по меньшей мере 85, или по меньшей мере 90, или по меньшей мере 95, или по меньшей мере 100 расположенных рядом аминокислот последовательности аминокислот 20-121 8Е0 ГО N0: 1, где в предпочтительном варианте осуществления каждый ΡΌ-1связывающий фрагмент включал бы в себя в качестве подфрагмента аминокислоты №ЭУКУ. находящиеся в положении остатков 110-114 8Е0 ГО N0: 1, или №ЭУКУ в положении остатков 91-95 8ЕС) ГО N0: 3.

Другие предпочтительные полипептиды и ΡΌ-1-связывающие фрагменты, специально предусмотренные изобретением, включают в себя полипептидную последовательность аминокислот 20-121 8Е0 ГО N0: 1 (человеческую полноразмерную) и их ΡΌ-1-связывающие фрагменты, где в указанном полипептиде или ΡΌ-1-связывающем фрагменте цистеин представлен в положении остатков 42 и/или 102, причем цистеин в обеих позициях является предпочтительным, и/или где фенилаланин представлен в положении остатка 21, и/или где глутаминовая кислота представлена в положении остатка 28, и/или где треонин и/или глутамин представлен в положении остатка 60, и/или где глутаминовая кислота представлена в положении остатка 101, и/или где изолейцин представлен в положении остатка 103, и/или где изолейцин представлен в положении остатка 105, и/или где глицин представлен в положении остатка 107, и/или где валин представлен в положении остатка 108, и/или где триптофан представлен в положении остатка 110, и/или где аспарагиновая кислота представлена в положении остатка 111, и/или где тирозин представлен в положении остатка 112, и/или где лизин представлен в положении остатка 113, и/или где тирозин представлен в положении остатка 114, при условии, что в случае ΡΌ-1-связывающих фрагментов указанный фрагмент является достаточно большим, чтобы включать в себя указанные положения аминокислот.

Дополнительные предпочтительные полипептиды и ΡΌ-1-связывающие фрагменты, специально предусмотренные изобретением, включают в себя полипептидую последовательность аминокислот 1-102 8Е0 ГО N0: 3 (ЕСГО человека) или 8Е0 ГО N0: 4 (ЕСГО мыши) и их ΡΌ-1-связывающие фрагменты, где в указанном полипептиде или ΡΌ-1-связывающем фрагменте цистеин представлен в положении остатка 23 и/или 83, причем цистеин в обеих позициях является предпочтительным, и/или где фенилаланин представлен в положении остатка 2, и/или где глутаминовая кислота представлена в положении остатка 9, и/или где треонин или аргинин представлен в положении остатка 37, причем треонин является предпочтительным, и/или где глутамин представлен в положении остатка 41, и/или где аргинин представлен в положении остатка 82, и/или где лейцин представлен в положении остатка 84, и/или где изолейцин представлен в положении остатка 86, и/или где глицин представлен в положении остатка 88, и/или где аланин представлен в положении остатка 89, и/или где триптофан представлен в положении остатка 91, и/или где аспарагиновая кислота представлена в положении остатка 92, и/или где тирозин представлен в положении остатка 93, и/или где лизин представлен в положении остатка 94, и/или где тирозин представлен в положении остатка 95, при условии, что в случае ΡΌ-1-связывающих фрагментов указанный фрагмент является достаточно большим, чтобы включать в себя указанные положения аминокислот.

В дополнительных вариантах осуществления любой из указанных выше полипептидов также может включать в себя части или фрагменты, например, с 1 по 10 расположенных рядом аминокислот, извлеченных из сигнального, трансмембранного или С-концевого доменов полипептида В7ГОС или В7-Н1, например, мыши или примата, предпочтительно человека. Указанные полипептиды и/или ΡΌ-1связывающие фрагменты также могут быть представлены в любом из гибридных белков изобретения, например, где указанный полипептид или ΡΌ-1-связывающий фрагмент представляет собой первый полипептид указанного гибридного белка.

В конкретных примерах молекула, скомбинированная с потенцирующим агентом для применения в схеме лечения изобретения, включает в себя ΡΌ-1-связывающий фрагмент аминокислот 20-221 8ЕС ГО N0: 1. В одном подобном варианте осуществления фрагмент состоит из аминокислот 20-121 8ЕС ГО N0: 1, где предпочтительно фрагмент включает в себя аминокислоты 110-114 8ЕС ГО N0: 1. В некоторых вариантах осуществления представлен более чем один указанный фрагмент (как описано в другом месте настоящего документа) и молекула включает в себя по меньшей мере 2, 3, 4, 5 или более фрагментов белка В7ГОС, в особенности где фрагмент является частью или содержит часть аминокислот

- 13 023148

20-221 δΕΟ ΙΌ N0: 1. В предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере один указанный фрагмент состоит из аминокислот 20-121 δΕΟ ΙΌ N0: 1, более предпочтительно по меньшей мере один указанный фрагмент включает в себя аминокислоты 110-114 δΕΟ ΙΌ N0: 1 (т.е. последовательность ΑΌΥΚΥ (δΕΟ ΙΌ N0: 14)). В предпочтительных воплощениях ΡΌ-1-связывающий фрагмент включает в себя по меньшей мере 10, или по меньшей мере 25, или по меньшей мере 50, или по меньшей мере 75, или по меньшей мере 100 расположенных рядом аминокислот.

Эндогенный сигнальный пептид человека имеет следующую последовательность: ΜΙΡΕΕΕΜΕδΕ ΕΕ0ΕΗ0ΙΛΑ (δΕΟ ΙΌ N0: 5) и представляет собой первые 19 аминокислот δΕΟ ΙΌ N0: 1. В определенных воплощениях полипептидные фрагменты В7-0С могут включать в себя 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 расположенных рядом аминокислот эндогенного или гетерологичного сигнального пептида (который может быть использован для получения рекомбинантного полипептида В7-0С путем экспрессии и экспрессии из трансформированной клетки). Также следует понимать, что полезный полипептид В7-0С может включать в себя 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 расположенных рядом аминокислот трансмембранного домена В7-0С и/или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 расположенных рядом аминокислот цитоплазматического домена или их комбинации при условии, что фрагмент В7-0С сохраняет антагонистическую способность в отношении рецептора ΡΌ-1. Фенотипы мышей ΡΌ-1-/- предоставляют прямое доказательство того, что ΡΌ-1 является отрицательным регулятором иммунных ответов ίη νίνο. В отсутствие ΡΌ-1 у мышей на фоне С57ВЬ/6 медленно развивается волчаночно-подобный гломерулонефрит и прогрессирующий артрит (№зЫтцга, с1 а1., ΙιηιηιιηίΙν. 11:141-151 (1999)). У мышей ΡΌ-1-/- на фоне Ва1Ь/с стремительно развивается летальная аутоиммунная дилатационная кардиомиопатия (МзЫтцта, с1 а1., δαακο. 291:319-322 (2001)). Однако важное свидетельство указывает, что В7-0С может функционировать как костимуляционный активатор Т-клеточных ответов. В присутствии субоптимальных сигналов В7-0С ТСК вызывает увеличение пролиферации и продукцию цитокинов ίη νίίτο (Тзепд, с1 а1., ί. Εχρ. Мей. 193:839-846 (2001)). В то же время исследования ίη νίίτο показали отрицательную регуляторную роль В7-0С в Т-клеточных ответах. Представленные, на первый взгляд, противоречивые данные могут быть успешно объяснены экспрессией дополнительных рецепторов для В7-0С на Т-клетках, других, чем ΡΌ-1.

Следовательно, белки В7-0С, их варианты, фрагменты и гибриды могут обладать преимуществом непосредственного усиления Т-клеточных ответов при связывании с неизвестным рецептором, который активирует Т-клетку, в дополнение к усилению Т-клеточных ответов путем предотвращения ΡΌ-1опосредованной передачи ингибиторного сигнала.

2. Полипептиды В7-Н1.

В другом варианте осуществления соединение для применения в комбинации с потенцирующим агентом в схеме лечения изобретения представляет собой или включает в себя фрагмент В7-Н1 млекопитающего, предпочтительно мыши или примата, предпочтительно человека, где указанный фрагмент связывается с ΡΌ-1 и блокирует его, но не вызывает передачи ингибиторного сигнала через ΡΌ-1, и указанный фрагмент представляет собой по длине по меньшей мере 10, или по меньшей мере 20, или по меньшей мере 30, или по меньшей мере 40, или по меньшей мере 50, или по меньшей мере 60, или по меньшей мере 70, или по меньшей мере 80, или по меньшей мере 90, или по меньшей мере 100 расположенных рядом аминокислот. В других воплощениях фрагмент может быть различной длины при условии, что он характеризуется функцией связывания с ΡΌ-1, но не вызывает передачу ингибиторного сигнала, что приводит к уменьшению Т-клеточной пролиферации. Указанные фрагменты В7-Н1 также нашли применение в качестве первой полипептидной части гибридных белков изобретения. Последовательности В7-Н1 являются следующими:

полипептид В7-Н1 человека (δΕΟ ΙΌ N0. 16):

ΜΒΙΡΑΥΡΙΡΜ ТУИНЫЛАРТ УТУРКОЬУУУ ЕУСЗЦМТХЕС КРРУЕКрЬОЦ ААЫУУИЕМЕ

СКНИОРУНС ЕЕОЬКУОНЗЗ УЕ0НАНШКО ОЬ31ХЗМАА1Х) ХТЦУКЩОАС УУКСМ15УОО ΑΟΥΚΚΧΤνκν ΝΑΡΥΝΚΙΝΟΚ ХЬУТОРЧТЗЕ НЕЬТСОАЕОУ РКАЕУГИТЗЗ ОНОУЬЗОКТТ ΤΤΝ3ΚΗΕΕΚΙ. РЦЧТЗТЬЩЦ ТТТМБХРУСТ РККШРЕВНН ТАЕЬУ1РЕЬР 1АНРРМЕНТН хлпизашьс ьсчаьтрхрк ькксеммо'/к ксеюцтазк козотньеет полипептид В7-Н1 мыши (δΕΟ ΙΌ N0: 17):

ΜΗΙΓΑΟΙΙΡΤ АССН1ЛНАРТ ХТАРКЮЬУУУ ЕУОЗМУТМБС КРРУЕКЕШЬ ХАХДЛГУИЕКБ

120

180

240

280

ΟΕΟνίΰΡνΑΟ ЕЕЦЦКРОНЗН РНСНАЗЬРКЦ ОШКСНААЬО ХТЦУКЬОЦАО УУССИЗУСО 120

АЦУКР.ХТЬКУ ΝΑΡΥΚΚΙΝΟΚ 13ТОРАТ5ЕН ЕЫСОАЕОУР ЕАЕУХНТЦЗО НОРУЗСКЕЗ'/ 280

ТТЗНТЕСМЬЬ ЦУТЗЗЬКУЦА ГАГГОУРУСТГ ИЯЗфРСОННТ АЕЫХРБЬРА ТНРРОИЯТНН 240

УЬЬОЗШЬГЬ 1УУ5ТУЬЬРЬ ЕКОУНМЬОУЕ КСОУЕЦТЗЗК ИМТОТОРЕЕТ 2Э0

- 14 023148 полипептид ΡΌ-Ы Масаса ти1айа (8Еф ГО N0: 18):

МКХРАУР1РТ ΙΥΚΗΙΛΝΑΓΤ УТУРКЙЬУУУ БУеЗЙМТ1ЕС	ΚΡΡνΕΚΟΙ/31.	60
ТЗЫУУИЕМЕ ШОИЮРУНС БЕЙЬКУОНЗИ УКОКАОЬЬКО	ОЬЗЬСЙААЬН	120
хтоукьойас νγκςΜίεγαα аоуккхтуку ναρυνκινοη	1ЬУУХ)РУТ5Е	130
НЕЬТСОАЕСУ РКАЕУ1МТЗЗ ОНОУЪЗСКТТ ТТНЗККЕЕКЬ	ьвутетькш	240
ТТАЫЕ1РУС1 РККЬОРЕЕЙН ТАЕЬУХРЕЬР ЬАЬРРЫЕКТН	ЬУ1ЬСА1РЬЬ	300
ьсуаьтехгу ьккекммпнк кзсхкутизк коизтоьеет		340

Белки В7-Н1-1д описаны в №0 2001/014557 (опубл. 1 марта 2001 г.) и в №0 2002/079499 (опубл. 10 октября 2002 г.).

3. ΡΌ-1 и другие полипептиды.

Другие полезные полипептиды изобретения включают в себя полипептиды, которые связываются с лигандами рецептора ΡΌ-1. Они включают в себя рецепторный белок ΡΌ-1 или его растворимые фрагменты, которые могут связываться с лигандами ΡΌ-1, такими как В7-Н1 или В7ГОС, и предотвращать связывание с эндогенным рецептором ΡΌ-1, предотвращая, таким образом, передачу ингибиторного сигнала. Также показано, что В7-Н1 связывается с белком В7.1 (Вийе с1 а1., 1ттипйу, νοί. 27, ρ. 111-122, (2007)). Указанные фрагменты также включают в себя растворимую часть ЕСГО белка ΡΌ-1, которая включает в себя мутации, такие как мутация А99Ь, которая увеличивает связывание с природными лигандами (Μο1η;·π е1 а1., Сгуз1а1 ЧгисШге οί 1Не тотр1ех Ьейуееп ргодтаттеб 6еа!й-1 (ΡΌ-1) и Й8 Ндапб ΡΌ-Ε2, ΡΝΑδ, νο1. 105, ρ. 10483-10488 (29 1и1у 2008)). В7-1 или его растворимые фрагменты, которые могут связываться с лигандом В7-Н1 и предотвращать связывание с эндогенным рецептором ΡΌ-1, предотвращая, тем самым, передачу ингибиторного сигнала, также являются полезными.

Полипептиды ΡΌ-1, применяемые в способах изобретения, представляют собой следующие полипептиды:

ΡΌ-1 человека (§Еф ГО N0: 19):

МОХРОАРИРУ	УНАУЬОЬСИК	рснрьозрок	РННРРТРРРА	ььуутЕаинА	ТРТСЗРЗИТЗ	60
ΕΒΡνωνγκΜ	ЗРЗНОТХЖЬА	АРРЕОКЗОРС	ооскркутсзь	РН<ЗКОГНМ5У	унАКюгазст	120
УЬССАХЗЬАР	ХА01КЕ5ЙКА	ЕЬКУТЕЕКАЕ	УРТАНР5РЗР	КРАЗОРОТЬУ	уоуусеьызз	180
ЬУЬЬУИУЬАУ	1С8КААНСТ1	САКЕТООРЬК	ЕОР5АУРУР5	УПУСЕЬОРОН	КЕКТРЕРРУР	240
СУРЕОТЕУАТ	ХУРРЗОМСТЗ	ЗРАККОЗАЕКЗ	РНЗАОРЬЕРЕ	ООНСЗНРЬ		283

ΡΌ-1 яванского макака Суηοтο1ди8 тοηкеу (§Еф ГО N0: 20):

ΜΟΙΡΟΑΡΗΡν УИАУИЗЬОНК	РСНРЬЕЗРСК РМЯАРТРЗРА ЬЬЬУТЕСОИА ТГТСЗРЗИАЗ	60
ЕЗРУЬННУВН 3Ρ3Ν0ΤΟΚΙΑ	АРРЕЬКЗОРС ООСКРКУТКЬ РНСНСРНМЗУ УКАЯЮТОЗОТ	120
УЬСОАХЗЬАР КАОХКЕЗЬКА	ЕЬКУТЕККАЕ УРТАНРЗРЗР КРАООРОТЬУ УСУУССЬЬСЗ	130
ЬУЬЬУИУЬАУ ХСЗКААНСТХ	САККТСОРЬК ЕИРЗАУРУРЗ УВУСЕЬОРОИ КЕКТРЕРРУР	240
СУРЕОТЕУАТ ХУРРЗСМаТЗ	ЗРАККСЗАОС РНЗАОРЬВРЕ ОСНСЗИРЬ	236

В соответствии с изобретением, поскольку В7-1 и его фрагменты также могут связываться с В7-Н1 и передавать ингибиторную трансдукцию Т-клеткам через В7-Н1, блокирование указанного взаимодействия также может уменьшить передачу ингибиторного сигнала, которая происходит через В7-Н1. Соединения, применяемые в изобретении, включают в себя молекулы, которые блокируют указанный тип взаимодействия. Данные молекулы раскрыты в Вийе е1 а1. (2007) ранее и включают в себя антитела антиВ7-Н1 с двойной специфичностью, которые блокируют взаимодействие В7-Н1:В7-1 и В7-Η1:Ρ^-1, а также антитела, демонстрирующие моноспецифичность, которые блокируют взаимодействие Ρ^-^1:В7-1. Соединения, которые препятствуют указанному взаимодействию путем блокирования В7-1, также являются полезными и включают в себя анти-В7-1 антитела.

4. Вариантные полипептиды.

Полипептиды, используемые в изобретении, как описано, включают в себя полипептиды, которые изменены таким образом, что содержат одну или более аминокислотных замен, делеций или вставок. Способы мутагенеза известны в данной области техники. Мутированные или вариантные полипептиды ингибируют или уменьшают передачу ингибиторного сигнала через рецепторы ΡΌ-1 благодаря связыванию с лигандами ΡΌ-1. Альтернативно, варианты (например, полипептиды В7ГОС) могут связываться с рецептором ΡΌ-1 и ингибировать, уменьшать или блокировать передачу ингибиторного сигнала через рецептор ΡΌ-1. Вариантные полипептиды могут представлять собой полипептиды, полученные из видов любого происхождения. В одном варианте осуществления вариантный полипептид является полипептидом, полученным из видов млекопитающих. В предпочтительном варианте осуществления вариантный полипептид является по происхождению полипептидом мыши или примата, предпочтительно человека.

В одном варианте осуществления вариантный полипептид представляет собой полипептид В7ГОС, который обладает такой же связывающей способностью в отношении ΡΌ-1, как В7ГОС дикого типа или невариантный В7ГОС, но не обладает или обладает менее чем 10% способностью запускать передачу ингибиторного сигнала через рецептор ΡΌ-1, по сравнению с немутировавшим полипептидом В7ГОС. В

- 15 023148 других воплощениях вариантный полипептид В7-ЭС обладает связывающей способностью в отношении РЭ-1 большей на 10, 20, 30, 40, 50 или 60%, чем В7-ЭС дикого типа, без инициирования ингибиторной РЭ-1 сигнальной трансдукции.

Вариантный полипептид (например, вариантный полипептид В7-ЭС) включает в себя полипептиды, характеризующиеся любой комбинацией аминокислотных замен, делеций или вставок при условии, что антагонистическая активность в отношении РЭ-1 не уменьшается существенно в сравнении с диким типом. Однако, в случае если указанное уменьшение существует, оно должно составлять не более чем половину значения активности дикого типа, так что указанный вариант характеризуется по меньшей мере 50% антагонистической активностью белка дикого типа в отношении РЭ-1. предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 90 или 95%, при этом по меньшей мере 100% антагонистическая активность является особенно предпочтительной. Повышенные значения такой активности, полученные в результате применения указанного варианта, являются еще больше желательными. В одном варианте осуществления изолированные вариантные полипептиды В7-ЭС имеют аминокислотные изменения, такие что их аминокислотная последовательность характеризуется по меньшей мере 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99, 99,5 или 100% идентичностью с аминокислотной последовательностью полипептида В7-ЭС дикого типа, особенно с аминокислотной последовательностью дикого типа млекопитающего, предпочтительно мыши, или примата, предпочтительно человека, полипептида В7-ЭС дикого типа.

Идентичность полипептидной последовательности может быть рассчитана с помощью определения % идентичности, предоставленного выше.

Замены аминокислот в полипептидах могут быть консервативными или неконсервативными.

Молекулы семейства В7, включая В7-ЭС, экспрессируются на клеточной поверхности с мембранным проксимальным константным 1дС-доменом и мембранным дистальным 1дУ-доменом. Рецепторы указанных лигандов содержат общий внеклеточный 1дУ-подобный домен. Взаимодействия пар рецепторлиганд опосредуется главным образом через остатки в 1дУ-доменах лигандов и рецепторов. В целом, 1дУ-домены описывают как содержащие два листа, каждый из которых содержит слой β-тяжей. Указанные β-тяжи обозначают А', В, С, С', С, Ό, Е, Р и О. В одном варианте осуществления вариантные полипептиды В7-ЭС содержат аминокислотные изменения (т.е. замены, делеции или вставки) в одном или более β-тяжей в любой возможной комбинации. В другом варианте осуществления варианты В7-ЭС содержат одно или более аминокислотных изменений (т.е. замен, делеций или вставок) в А', С, С', С, Ό, Е, Р или О β-тяжах. В одном варианте осуществления варианты В7-ЭС содержат одно или более аминокислотных изменений в β-тяже О.

Что касается В7-ЭС мыши или примата, предпочтительно человека, вариантный полипептид В7-ЭС может содержать, без ограничения, замены, делеции или вставки в положениях, которые не уменьшат существенно связывание с РИ-1 по сравнению с немутантным В7-ЭС. Следует понимать, однако, что замены в перечисленных положениях аминокислот могут быть выполнены с применением аминокислоты или аналога аминокислоты. Например, замены в перечисленных положениях могут быть выполнены с помощью одной из встречающихся в природе аминокислот (например, аланин, аспарагиновая кислота, аспарагин, аргинин, цистеин, глицин, глутаминовая кислота, глутамин, гистидин, лейцин, валин, изолейцин, лизин, метионин, пролин, треонин, серии, фенилаланин, триптофан или тирозин).

Несмотря на то что описанные здесь замены, являются заменами в отношении В7-ЭС мыши и примата, предпочтительно человека, указано, что специалист в данной области техники может без труда произвести аналогичные изменения в соответствующих полипептидах других видов (например, крысы, хомяка, морской свинки, песчанки, кролика, собаки, кошки, лошади, свиньи, овцы, коровы или низшего примата).

Предпочтительные фрагменты включают в себя весь или часть внеклеточного домена В7-ЭС, полезного для связывания с РИ-1.

В одном варианте осуществления фрагменты вариантного полипептида В7-ЭС представляют собой фрагменты, которые сохраняют способность связываться с РИ-1 без инициирования передачи РИ-1 ингибиторного сигнала. Один вариант осуществления предоставляет вариантный полипептид В7-ЭС, который является фрагментом полноразмерного В7-ЭС и характеризуются обычно по меньшей мере 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98, 99, 100 или еще выше чем 100% антагонистической активностью полноразмерного вариантного полипептида В7-ЭС в отношении РИ-1.

Полезные фрагменты вариантных полипептидов В7-ЭС включают в себя растворимые фрагменты. Растворимые фрагменты В7-ЭС представляют собой фрагменты В7-ЭС, которые могут быть слущены с поверхности, секретированы или выделены иным способом из продуцирующих клеток. В одном варианте осуществления фрагменты вариантного полипептида В7-ЭС включают в себя полный внеклеточный домен В7-ЭС. Внеклеточный домен В7-ЭС включает в себя аминокислоты приблизительно от 20 до 221 аминокислоты В7-ЭС мыши или примата, предпочтительно человека. В другом варианте осуществления фрагменты вариантного полипептида В7-ЭС включают в себя домены 1дС и 1дУ В7-ЭС. В другом варианте осуществления фрагменты вариантного полипептида В7-ЭС включают в 1дУ-домен В7-ЭС.

- 16 023148

В одном варианте осуществления фрагменты вариантного полипептида В7-ЭС содержат участок полипептида, который является важным для способности связываться с ΡΌ-1. Указанные полипептидные фрагменты являются полезными для связывания и блокирования рецептора ΡΌ-1, чтобы предотвратить связывание природных лигандов с рецептором ΡΌ-1, усиливая, таким образом, иммунный ответ. Ингибирующие взаимодействия нативного В7-Н1 или В7-ЭС с ΡΌ-1 ингибируют супрессию иммунных ответов, которая происходила бы в противоположном случае. Фрагмент полипептида В7-ЭС мыши или примата, предпочтительно человека, который связывается с ΡΌ-1, содержит в качестве неограничивающего примера аминокислоты 101-105 или 111-113. Связывание В7-Н1 с рецептором ΡΌ-1 обычно ингибируется по меньшей мере на 50%, или по меньшей мере 60%, или по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере 75%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95% или больше по сравнению с уровнем связывания В7-Н1 с ΡΌ-1 в отсутствие указанного фрагмента.

Мутант А99Ь человеческого ΡΌ-1 связывает В7ГОС и В7-Н1 с более высокой аффинностью, чем немутированный ΡΌ-1 человека (Ъа/аг Мо1паг е! а1. ΡNА§, 105, р. 10483-10488 (2008)). В одном варианте осуществления изобретения соединение, предназначенное для уменьшения передачи ингибиторного сигнала, представляет собой растворимый белок, такой как ЕСГО ΡΌ-1, включающий в себя указанную мутацию.

5. Модифицированные полипептиды.

Полипептиды, применяемые в изобретении, как описано, включая варианты, гомологи и их фрагменты, могут быть модифицированы с помощью химических функциональных групп, которые обнаруживают в ассоциации с полипептидами в нормальной клеточной среде, например, с помощью фосфорилирования, метилирования, амидирования, сульфатирования, ацилирования, гликозилирования, сумоилирования и убиквитинирования полипептида. Указанные полипептиды также могут быть модифицированы с помощью химических функциональных групп, которые обычно не являются частью полипептидов в клеточной среде. Указанные модификации могут быть введены в молекулу путем реакции аминокислотных остатков-мишеней полипептида с органическим агентом, используемым для получения производных, который способен реагировать с выбранными боковыми цепями или с концевыми остатками. Другая полезная модификация представляет собой циклизацию белка. Указанные модификации также включают в себя введение метки, способной обеспечить детектируемый сигнал, прямо или косвенно, включающей в себя, но без ограничения, радиоактивные изотопы и флуоресцентные соединения.

Примеры химических производных полипептидов включают в себя остаток лизина и аминоконцевые остатки, образующие производные с сукциновым ангидридом или с другими ангидридами карбоновых кислот. Получение производных с циклическим карбоксильным ангидридом обладает эффектом изменения заряда остатков лизина. Другие подходящие реагенты для получения производных аминосодержащих остатков включают в себя имидоэфиры, такие как метилпиколинимидат; пиридоксальфосфат; пиридоксаль; хлорборгидрид; тринитробензолсульфоновая кислота; О-метилизомочевина; 2,4-пентандион и реакция с глиоксилатом, катализируемая трансаминазой. Карбоксильные боковые группы, аспартил или глутамил, могут быть выборочно модифицированы с помощью реакции с карбодиимидами (К-К=С=К-К'), такими как 1-циклогексил-3-(2-морфолинил-(4-этил)карбодиимид или 1-этил3-(4-азония-4,4-диметилфенил)карбодиимид. Кроме того, остатки аспартила и глутамила могут быть превращены в остатки аспарагинила и глутаминила с помощью реакции с аммиаком. Полипептиды изобретения также могут включать в себя одну или более Ό-аминокислот, которыми заменяют одну или более Ь-аминокислот.

В других воплощениях потенцирующий агент, такой как СТХ1 сам может быть частью соединения, которое уменьшает передачу ингибиторного сигнала, например, в случае, если потенцирующий агент химически связан с антагонистом ΡΌ-1 изобретения.

6. Гибридные белки.

Также предоставлены гибридные полипептиды, содержащие первый гибридный партнер или полипептидую часть, включающую в себя весь или часть белкового антагониста ΡΌ-1, например полипептид В7-ОС (включая, варианты, гомологи и их фрагменты), соединенный (ί) непосредственно со вторым полипептидом или (ίί) при желании, соединенный с линкерной пептидной последовательностью, которая объединена со вторым полипептидом. Наличие гибридного партнера может изменять, например, растворимость аффинность и/или валентность полипептидного антагониста ΡΌ-1. Раскрытые гибридные белки включают в себя любую комбинацию изменений аминокислот (т.е. замена, делеция или вставка), фрагмента и/или модификации пептидного антагониста ΡΌ-1, как описано выше. В одном варианте осуществления гибридные белки В7-ОС включают в себя внеклеточный домен белка В7-ОС в качестве первого связывающего партнера. В другом варианте осуществления указанные гибридные белки В7-ОС включают в себя домен 1дУ и 1дС белка В7-ОС в качестве первого связывающего партнера. В другом варианте осуществления вариантные гибридные белки В7-ОС включают в себя 1дУ-домен белка В7-ОС в качестве первого связывающего партнера.

Типичные первые гибридные партнеры включают в себя полипептид В7-ОС примата, предпочтительно человека, или мыши, его фрагменты и их варианты, раскрытые выше. Предпочтительные фрагменты включают в себя внеклеточный домен В7-ОС. Как описано, внеклеточный домен может включать

- 17 023148 в себя 1-10 расположенных рядом аминокислот сигнального пептида, трансмембранного домена В7-ЭС или их обоих.

В одном варианте осуществления композиции и/или продукты и/или способы изобретения применяют антагонист рецептора ΡΌ-1, в особенности полипептиды, включая варианты, гомологи и их фрагменты, которые соединяют с другими полипептидами для создания гибридных белков, которые противодействуют рецептору ΡΌ-1 путем связывания лиганда ΡΌ-1, такого как В7-Н1, тем самым ингибируют взаимодействие ингибирующего лиганда с ΡΌ-1. В другом варианте осуществления полипептидные антагонисты рецептора ΡΌ-1 или их варианты соединяют с другими полипептидами для создания гибридных белков, которые оказывают антагонистическое действие на рецептор ΡΌ-1 путем связывания и блокирования рецептора ΡΌ-1 и ингибируют или уменьшают передачу ингибиторного сигнала через ΡΌ-1.

Второй полипептидный связывающий партнер или вторая полипептидная часть могут представлять собой Ν-конец или С-конец относительно полипептидого антагониста ΡΌ-1. В предпочтительном варианте осуществления второй полипептид представляет собой С-конец полипептидного антагониста ΡΌ-1.

В предпочтительном варианте осуществления гибридный белок, предусмотренный для применения в способах и композициях и/или продуктах изобретения, включает в себя по меньшей мере часть антитела. С появлением методов молекулярной биологии и рекомбинантной технологии теперь возможно производить молекулы антител рекомбинантными способами и создавать, таким образом, нуклеотидные последовательности генов, которые кодируют специфические аминокислотные последовательности, обнаруженные в полипептидной структуре антител. Указанные антитела могут быть получены либо с помощью клонирования нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих полипептидные цепи указанных антител, либо с помощью прямого синтеза указанных полипептидных цепей со сборкой ίη νίίτο синтезированных цепей для создания активных тетрамерных (Н₂Ь₂) структур с аффинностью к специфическим эпитопам и антигенным детерминантам. Указанные способы обеспечивают легкое получение антител, имеющих последовательности, типичные для нейтрализующих антител, полученных из различных видов и источников.

Независимо от источника антител или их рекомбинантной конструкции или того, как они синтезированы, ίη νίίτο или ίη νίνο, с использованием трансгенных животных, например коров, коз и овец, с использованием больших клеточных культур лабораторного или коммерческого объема в биореакторах или с помощью прямого химического синтеза без использования живых организмов на какой-либо стадии процесса все антитела обладают сходной общей трехмерной структурой. Указанная структура часто представляется в виде Н₂Ь₂ и отражает тот факт, что антитела обычно включают в себя две легкие (Ь) аминокислотные цепи и две тяжелые (Н) аминокислотные цепи. Обе цепи содержат области, способные взаимодействовать со структурно комплементарной антигенной мишенью. Области, взаимодействующие с мишенью, обозначают как вариабельные или V области, и они характеризуются отличиями в аминокислотной последовательности от антител другой антигенной специфичности.

В предпочтительных воплощениях полипептидные антагонисты рецептора ΡΌ-1, включая фрагменты, мутанты и другие варианты, имеют первого партнера слияния, имеющего весь или часть белка В7-ЭС, или его варианта, слитого (ί) непосредственно со вторым полипептидом, или (ίί) необязательно слитого с пептидной линкерной последовательностью, которая слита со вторым полипептидом. Присутствие партнера слияния может изменить растворимость, аффинность и/или валентность В7-ЭС полипептида. В более предпочтительных воплощениях полипептиды В7-ЭС соединены с одним или более доменами константной области тяжелой цепи 1§, более предпочтительно с аминокислотной последовательностью, соответствующей шарнирной области, участкам С_Н2 и С_Н3 цепи Су1 иммуноглобулина человека, или шарнирной области, участкам С_Н2 и С_Н3 цепи Су2а иммуноглобулина мыши. В предпочтительном варианте осуществления константная область предпочтительно включает в себя мутацию (например, N2970). чтобы исключить или уменьшить связывание Рс-рецептора.

Шарнирная область, участки С_Н2 и С_Н3 цепи Су1 иммуноглобулина человека, имеют следующую аминокислотную последовательность:

ЕРК5СТЭКТНТ СРРСРАРЕШ ССРЗУРЬРРР КРКПТЬМ13К	ΤΡΒντσνννΠ	'/ЗНЕЕРСТКг	60
НИУУОСТЕУН ΝΑΚΤΚΡΗΕΕΟ УИЗТУРУУЗУ ЬТУЬН00Н1Л	ΟΚΕΥΚΟΚνδΝ	ΚΑΙ,ΡΑΡΙΕΚΤ	120
Ι3ΚΑΚ60ΡΚΕ РОУУТЬРРЗК ЕБЬТКИОУЗЬ ТСЬУКСРУРЗ	ΒίΑνΕΗΕδΚσ	ΟΡΒΝΝΥΚΤΤΡ	180
РУЬОЗЦСЗРР ЬУЗКЬТУЦКЗ ННОООИУРЗС ЗУМНЕАЬНПН	УТОКЕЬЗЬЗР	ОК	232
(ЗЕО Ю N0:6).

Шарнирная область, участки СН2 и СН3 цепи Су2а иммуноглобулина мыши имеют следующую аминокислотную последовательность:

ЕРКСРТ1КРС РРСКСРАРЛЬ ЬССРЗУПРР	рк!коуьм13 υΞΡίντσννν пузёоцроуо	60
ΙδΗΡνΝΝνδν НТАОТОТНЙЕ ОУИЗТЦЯУУЗ	АЬРЮНООИМ ЗСКЕГКСКУН НКПЬРАР1ЕН	120
Т13КРКСЗУН ΑΡΟνγνΣΡΡΡ ЕЕЕМТККОУТ	ЬТСМУТРРМР ΕϋΙΥνΕΜΤΝΝ ОКТЕШУКЫТ	180
ЕРУЬОЗЦСЗУ ГМУЗКЬКУЕК ЮТИУЕКИЗУЗ	СЗУУНБОЫТО ННТТКЗРЗКТ РСК	233

{ЗЕО Ю N0:7)

- 18 023148

Типичные гибридные белки В7ГОС мыши содержат аминокислоты 20-221 мышиного В7-ЭС. соединенного с аминокислотами 237-469 мышиного 1§О_2а (САА49868). Гибридные белки В7-ЭС человека могут содержать аминокислоты 20-221 человеческого В7-ЭС, соединенного с аминокислотами 245-476 человеческого 1дС₁ (ААА02914). Сигнальные пептиды гибридных белков В7ГОС могут быть эндогенными сигнальными пептидами или любым другим сигнальным пептидом, который способствует секреции гибридного белка из клетки-хозяина.

Репрезентативный гибридный белок В7-ЭС-1д мыши кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты §ЕЦ ГО N0: 8.

Следует понимать, что раскрытые последовательности нуклеиновых кислот могут быть кодоноптимизированными для увеличения уровней экспрессии для синтеза гибридных белков, применяемых в способах и композициях настоящего изобретения. Способы оптимизации кодонов известны в данной области техники.

Мышиный гибридный белок В7ГОС-1д, кодированный §ЕЦ ГО N0: 8, имеет следующую аминокислотную последовательность:

	БЬОЪНРУААЬ	ΡΤνΤΑΡΚΒνΥ	τνπνοδδνδΐ.	ЕССРСВВЕСТ	ЕЬЕСХЕАЗЬО	60
ΚνΕΝΠΤ3Ε0δ	ЕЯМЪЬЕЕОЬ	РЪОКАЬРШР	δνονκοδοςγ	ЕСЬУ1СОЛАН	СУКУЬТУКУК	120
Α3ΥΜΚΪΒΤΚΙ		ЬТООАВОУРЬ	ΑΕνδΜΟΚνδν	ΡΑΗΤ5ΗΙΚΤΡ	ЕСЬУОУГЗУЬ	180
КЬКРОРЗКЫР	ЗСМРИЫАНМК	ЕЬТЗАИПРЪ	ЗЯМЕРКУРЯТ	НЕРКСРТ1КР	СРРСКСРАРН	240
ььссрзупр	РРКТКПУЬМ!	δΐ,δΡίντσνν	νΟνδΕΟΡΡϋν	018ИРУМИУЕ	УНТАОТОТНК	300
	ЗАЬРЩНдОН	мзскеркску	НЫКОЬРАРТЕ	ЯТ13КРКЙ5У	КАРОУУУЬРР	360
РЕЕЕМТККОУ	ТЬТСМУТОГМ	ΡΕΟΙΥνΕΜΓΝ	ΝΟΚΤΕΙ4ΝΥΚΝ	ТЕРУЬОЗСОЗ	УРМУЗКЦКУЕ	420
ΚΚΝΗνΕΜί3Υ	ЗСЗ^ТНЕСЬН	нннтткзгзв	ТРОК			454
(ЗЕО ΙΟ	N0:9)

§ЕЦ ГО N0: 10 предоставляет аминокислотную последовательность мышиного гибридного белка В7ГОС-!д без сигнальной последовательности:

ЬРТУТАРКЕУ УТУЭУСЗЗУЗ ЬЕССГОККЕС ТЕЬЕЙ1НАЗЬ ОКУЕТОТЗЬО 5 ЕВАТЫ ЕЕО	60
ЬРЦЙКАЬРН! РЗУ0УКСЗС0 УВСЬУЮСАА ИОУКУЬТУКУ КАЗУМЙ1СТВ 1ЬЕУР6ТЙЕУ	120
ОЬТСОАДйУР ЦАЕУБИОКУЗ УРАНТЗНТКТ РЕСЬУОУТЗУ ЬНЬКРОРЗКИ РЗСМРННАНМ	130
КЕЬТЗАИСР ЬЗКМЕРКУРН ΤΗΕΡΒΟΡΤΙΚ РСРРСКСРАР ИЫЛСРЗУП РРРКТКЕУЬМ	240
18ЬЗР1УТСУ УУОУЗЕЦСРО У01ЙИРУННУ ЕУНТАОТОТН ЙЕСУЫЗТЬКУ ν3ΑΤ,ΡΙ<3Η0ϋ	300
НМЗЙКЕРКСК УНЫКСЬРАРТ ΕΚΤΙ3ΚΡΚ05 УКАРОУУУЬР РРЕЕЕМТККО УТЬТСМУТОР	360
МРЕ01УУЕНТ ИИСКТЕЬЫУК ИТЕРУЬОЗОС ЗУРМУЗКЬКУ БККНИУЕКМЗ УЗСЗУУНЕОЬ	420
НИННТТКЗРЗ КТРСК 435
(ЗЕО Ιϋ N0:10)

В одном варианте осуществления человеческий В7ГОС-1д кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты §ЕЦ ГО N0: 11, кодирующей аминокислотную последовательность В7ГОС-1д человека:

МТРЫЖМЬЗЬ Е1Х}Ш01ААЬ РТУТУРКЕЬУ ИВНСЗНУТЬ ЕСИГОТСЗНУ ИЬОАХТАЗЬО 60 КУЕК0Т5РИК ЕНАТЬЬЕЕОЬ Р1ЛКДЗГН1Р ОУОУКОЕООУ ОСШУСУАИ СУКУЬТЬКУК 120 Α3ΥΚΚΙΝΤΗΙ ЬКУРЕТСЕУЕ ЬТСОАТСУРЬ АЕУЗНРКУЗУ РАМТЗНЗЯТР ЕСЬУО'/ТЗУЬ 1ЭО КЬКРРРСНМР ЗСУРИИТНУК ЕЬТЬАЗЮЬО ЗОМЕРКТНРТ ИЕРКЗССКТН ТСРРСРАРЕЬ 24 0 ЬОСРЗУРЬРР РКРКСТ1Л13 ЕТРЕУТСУУУ СУЗ ИБО РЕУ К ГИИУТОСУБУ ННАКТКРКЕЕ 300 ОУИЗТУЕУУЗ УЬТУЪНОСМЬ ИСКЕУКСКУЗ ВКАЪРАРГЕК ΤΙ5ΚΑΚ0ζ}ΡΕ ЕРОУУТЬРРЗ 360 ИСЕЬТКИОУЗ ЬТСЬУКСРУР ЗИАУЕИЕЗИ 60РЕНИУКТТ РРУЬОЗСЙЗР РЬУЗКЬТУЛК 420 5К»ООСНУРЗ СЗУМНЕЛЬНИ НУТОКЗЬЗСЗ РСК 4 33 (ЗЕО 10 N0:12)

Настоящее изобретение, в частности, предусматривает вариант осуществления, где зрелый гибридный белок, используемый в способах и композициях изобретения, характеризуется удаленной сигнальной последовательностью. В предпочтительном варианте осуществления сигнальная последовательность полностью удалена.

- 19 023148

8Е0 ΙΌ NО: 13 предоставляет аминокислотную последовательность человеческого В7-ЭС-1д без сигнальной последовательности:

ЬРТУТУРКЕЬ	ΥΙΙΕΗΕδΝνΤ	ЬЕСИРВТСЗН	УМЦСА1ТАЗЦ	ОКУЕЫОТЗРН	КЕКАТЬЬЕЕС)	60
ЬРЬСКАЗГНГ	ρονονκοεαο	УОСПГУСУА	ИОУКУИХКУ	ΚΑ8ΥΚΚΙΝΤΗ	ιι,κνΡΒτοεν	120
ЕЬТСОАТСУР	ЬАЕУЗНРКУЗ	νΡΑΝΤ3Η3ΚΤ	РЕОЬУОУТЗУ	ЬКЬКРРРСКМ	гзсуриттну	130
КВ1/ПА31Ш,	050МЕРКТНР	тиерхзсихт	НТСРРСРАРЕ	ШМРЗУРЬР	РРКРКИТЬМ!	240
ЭНТРЕУТСУУ	ТОУЗНЕОРЕУ	КРЦИУУОСУЕ	УНМАКТКРКЕ	ΕΟΥΝΒΤΥΚνν	ЗУЦТУЦИОИМ	300
ьжзкеукску	ΒΝΚΑί,ΡΑΡΙΕ	КТ13КАКС0Р	КЕРОУУТЬРР	δΗΟΕΙ,ΤΚΝΟν	ЗЦТСЬУКОГУ	360
РЗО1АУЕНЕЗ	ΝΟΟΡΕΝΝΥΚΤ	ТРРУЬОЗООЗ	РРЬУЗКЬТУО	КЗЕНОССМУР	ЗСЗУИКЕАЬН	420
ИНУТОКЗЬЗЬ	ЗРСК					434
(ЗЕО ю N0:13).

Настоящее изобретение, в частности, предусматривает варианты осуществления, где раскрытые гибридные белки В7-ЭС-1д, используемые в раскрытых здесь способах и композициях, обладают последовательностью, идентичной по меньшей мере на 80, 85, 90, 99 или 100% по отношению к 8ЕО ГО NО: 9, 10, 12 или 13.

В другом варианте осуществления изобретения гибридный полипептид может характеризоваться биспецифической функцией, в соответствии с которой первый гибридный партнер связывается с лигандом ΡΌ-1, таким как В7-Н1, и второй гибридный партнер связывается с рецептором ΡΌ-1 без инициации передачи ингибиторного сигнала через рецептор ΡΌ-1.

Несмотря на то что полипептид, применяемый в изобретении, может быть мономерным или димерным, сами гибридные белки могут быть представлены в мономерной или олигомерной форме, предпочтительно в виде димера. В конкретных воплощениях гибридные белки, применяемые в качестве антагонистов ΡΌ-1 в способах и композициях изобретения, могут собираться спонтанно в олигомерные, в частности, димерные формы или могут быть химически связаны для создания указанных олигомеров с помощью способов, хорошо известных в данной области техники. Например, гибридный белок, применяемый в изобретении, может включать в себя часть полипептида В7ГОС, соединенную с частью антитела, и указанные части далее могут быть собраны в димер. В одном примере полипептид для применения в изобретении гибридизируют в виде одной аминокислотной цепи с Рс-областью антитела (например, где указанная конструкция экспрессируется из одного рекомбинантного полипептида), после чего два таких гибридных продукта соединяют друг с другом для создания гомодимера, например, с помощью дисульфидной связи между соответствующими Рс-областями.

Указанные димерные продукты могут представлять собой гомодимеры (где оба мономерных гибридных белка идентичны) или могут представлять собой гетеродимеры (где два различных гибридных белка связаны друг с другом). Отдельные мономеры указанных димеров могут быть связаны способами, известными в данной области техники, например, с помощью ковалентной связи (например, дисульфидная связь) или с помощью нековалентной связи (такой как ионное взаимодействие). В7ГОС-1д, применяемый в примерах изобретения, представлен в форме гомодимера, содержащего две копии 8ЕО ГО NО: 10, связанных вместе дисульфидной связью. Кроме того, гетеродимеры изобретения включают в себя биспецифические белки и гибридные белки, в которых одна мономерная часть связывается с ΡΌ-1 и другая часть связывается с природным лигандом ΡΌ-1. Указанные гетеродимеры создают путем соединения полипептидов и гибридных белков, полностью описанных в другой части настоящего документа.

В другом полезном варианте осуществления изобретения антагонист ΡΌ-1 представляет собой гетеродимер, где, например, два гибридных белка соединены вместе, но они не являются идентичными по аминокислотной последовательности. В конкретном примере каждый мономер может включать в себя Рс-часть антитела, соединенную с активным фрагментом полипептида В7ГОС, где указанные активные фрагменты являются фрагментами из различных частей полипептида В7ГОС или где гибридный белок, включающий в себя Рс-часть антитела, соединенную с полноразмерным нативным В7ГОС полипептидом, связан (например, поперечной связью) с гибридным белком, содержащим Рс-часть антитела и активный фрагмент полноразмерного нативного полипептида ΕΥ-ΌΟ В каждом указанном случае часть антитела, использованная для создания каждого мономерного гибридного белка, может отличаться в двух мономерных единицах. Любая указанная димерная комбинация в частности предусмотрена способами и композициями изобретения.

В предпочтительном димерном гибридном белке димер получают в результате ковалентного связывания Сук-остатков в СН-областях двух тяжелых цепей 1д, которые представляют собой те же самые Сукостатки, которые соединены дисульфидной связью в димеризованных тяжелых цепях обычного 1д.

Другое воплощение предоставляет тетрамерную конструкцию, содержащую субстрат ВйА, соединенный с внеклеточным доменом вариантного полипептида В7ГОС. Способы создания тетрамерных конструкций известны в данной области техники (см. ЕеПоуак. е1 а1., I. Ехр. Меб., 203:2281 (2006)).

- 20 023148

7. Анти-ГИ-! и другие антитела.

Другие антагонисты ΡΌ-1, предусмотренные способами изобретения, включают в себя антитела, которые связываются с ΡΌ-1 или с лигандами ΡΌ-1, и другие антитела.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу увеличения Т-клеточного ответа у млекопитающего, который в этом нуждается, включающему в себя назначение указанному млекопитающему эффективной схемы лечения, включающей в себя антитело и потенцирующий агент, где указанная схема лечения является эффективной для увеличения Т-клеточного ответа млекопитающего на указанный антиген.

Антитела :^11^0-1. применяемые в схеме (схемах) лечения изобретения, включают в себя, но без ограничения, антитела, описанные в следующих публикациях:

ΡΟΓ Ш03/00425 (Нагйу е! а1., АО 2003/099196), ΡΟΓ ΙΡ2006/309606 (Когтап е! а1., АО 2006/121168), ЕСТ И82008/008925 (Ы е! а1., АО 2009/014708), ЕСТ ΙΡ03/08420 (Нои)о е! а1., АО 2004/004771), ?СТ 1Ρ04/00549 (Нои)о е! а1., АО 2004/072286), ?СТ 1В2003/006304 (СоШик е! а1., АО 2004/056875), ΡСТ И82007/088851 (АЬтей е! а1., АО 2008/083174), 1’СТ И82006/026046 (Когтаи е! а1., АО 2007/005874), 1’СТ И82008/084923 (Теггей е! а1., АО 2009/073533), Вегдег е! а1., Сйи. Саисег Кек., то1. 14, р. 30443051 (2008).

Конкретным примером антитела анти-Ρ^-1, применяемого в способах изобретения, является МИХ-1106 (см. Кокак, патент США 20070166281 (опубл. 19 июля 2007 г.), абзац 42), человеческое антитело анти-Ρ^-1, предпочтительно вводимое в дозе 3 мг/кг.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу увеличения Т-клеточного ответа у млекопитающего, который в этом нуждается, включающему в себя назначение указанному млекопитающему эффективной схемы лечения, включающей в себя антитело анти-Ρ^-1 лиганда, например антитело анти-В7-Н1, и потенцирующий агент, где указанная схема лечения является эффективной для увеличения Т-клеточного ответа указанного млекопитающего на указанный антиген.

Антитела анти-В7-Н1, применяемые в схеме (схемах) лечения изобретения, включают в себя, но без ограничения, антитела, описанные в следующих публикациях:

1’СТ И806/022423 (АО 2006/133396, опубл. 14 декабря 2006 г.);

1’СТ И807/088851 (АО 2008/083174, опубл. 10 июля 2008 г.);

И8 2006/0110383 (опубл. 25 мая 2006 г.).

Конкретным примером антитела анти-В7-Н1, применяемого в способах изобретения, является МИХ-1105 (АО 2007/005874, опубл. 11 января 2007 г.)), человеческое антитело анти-В7-Н1.

Для антитела анти-В7-ИС см. патентные заявки США 7411051, 7052694, 7390888, 20060099203.

Другой вариант воплощения изобретения включает в себя биспецифическое антитело, которое включает в себя антитело, которое связывается с рецептором ЙИ-Е соединенное мостиковой связью с антителом, которое связывается с лигандом ΡΠ-Ε таким как В7-Н1. В предпочтительном варианте осуществления часть, связывающая ΡΠ-Ε уменьшает или ингибирует сигнальную трансдукцию через рецептор ΡΠ-1.

Антитело для применения в изобретении необязательно должно быть антителом анти-Ρ^-1 или антителом анти-Ρ^-1 лиганда, но может представлять собой другое антитело, используемое в опосредовании эффектов Т-клетки в иммунном ответе. В указанном аспекте настоящее изобретение относится к способу увеличения Т-клеточного ответа на антиген у млекопитающего, который в этом нуждается, включающему в себя введение указанному млекопитающему эффективной схемы лечения, включающей в себя антитело анти-СТЬА4 и потенцирующий агент, где указанная схема лечения является эффективной для увеличения Т-клеточного ответа указанного млекопитающего на указанный антиген. Пример антитела анти-СТЬА4, предусмотренного для применения в способах изобретения, включает в себя антитело, которое описано в ΡСТ И82006/043690 (р1ксЬко£Т е1 а1., АО 2007/056539).

Конкретные примеры антитела анти-СТЬА4, применяемого в способах изобретения представляют собой ипилимумаб, также известный как МИХ-010 или МИХ-101, человеческое антитело анти-СТЬА4, предпочтительно вводимое в дозе 10 мг/кг, и тремелимумаб человеческое антитело анти-СТЬА4, предпочтительно вводимое в дозе 15 мг/кг.

8. Малые молекулы антагонистов Ρϋ-1.

Антагонисты рецептора ΡΠ-1 также могут представлять собой малые молекулярные антагонисты. Термин малая молекула относится к небольшим органическим соединениям с молекулярным весом более 100 и менее 2500 Да, предпочтительно от 100 до 2000 Да, более предпочтительно приблизительно от 100 до 1250 Да, более предпочтительно приблизительно от 100 до 1000Да, более предпочтительно приблизительно от 100 до 750 Да, более предпочтительно от 200 до 500 Да. Малые молекулы часто включают в себя циклический углерод или гетероциклические структуры и/или ароматические или полиароматические структуры, замещенные одной или более функциональными группами. Малые молекулярные антагонисты уменьшают или препятствуют сигнальной трансдукции через рецептор ΡΠ-1 путем связывания с лигандами ΡΠ-Ε такими как В7-Н1 и В7-ИС и предотвращения взаимодействия лиганда с Ρϋ-1 или путем связывания и блокирования непосредственно рецептора ΡΠ-1 без инициирования сигнальной трансдукции через рецептор ΡΠ-1.

- 21 023148

В одном варианте осуществления указанная малая молекула может быть введена в комбинации с другим антагонистом ΡΌ-1 или с антагонистом СТЬА4, таким как антитело, специфичное к ΡΌ-1, или один из его лигандов или как антитело, специфичное к СТЬА4, или один из его лигандов. Таким образом, указанные малые молекулы могут быть введены в качестве соединений в один или более способов изобретения или могут быть введены в комбинации с другими соединениями, применяемыми в способах изобретения. Например, показано, что серии малых органических соединений связываются с лигандом В7-1 для предотвращения связывания с СТЬА4 (см. ЕгЬе е! а1., I. Вю1. СЬет., уо1. 277, р. 7363-7368 (2002). Указанные малые органические соединения могут быть введены отдельно или вместе с антителом анти-СТЬА4, в комбинации с введением СТХ, для уменьшения передачи ингибиторного сигнала Т-клеток.

В одном варианте осуществления антагонисты ΡΌ-1 или антагонисты СТЬА4, предусмотренные для применения в способах изобретения, включают в себя антисмысловые нуклеиновые кислоты, как ДНК, так и РНК, а также молекулы κίΡΌΚ. Указанные антисмысловые молекулы предотвращают экспрессию ΡΌ-1 на Т-клетках, а также продукцию Т-клеточных лигандов, таких как В7-Н1, ΡΌ-Ы и ΡΌ-Ό2. Например, мЬНК (например, длиной приблизительно 21 нуклеотид, которая специфична для гена, кодирующего ΡΌ-1 или кодирующего лиганд ΡΌ-1, и олигонуклеотиды которого могут быть без труда приобретены коммерчески), объединенный с носителями, такими как полиэтиленимин (см. СнЬШок-Рш/ е! а1., I. СНп. 1пуек!. 119(8):2231-2244 (2009), легко поглощается клетками, которые экспрессируют ΡΌ-1, а также лиганды ΡΌ-1 и уменьшает экспрессию указанных рецепторов и лигандов, чтобы обеспечить снижение передачи ингибиторного сигнала в Т-клетки, активируя, тем самым, Т-клетки.

В. Потенцирующие агенты.

В соответствии с изобретением активность антагониста ΡΌ-1 увеличивается, предпочтительно синергически, благодаря присутствию потенцирующего агента. Потенцирующий агент воздействует на увеличение эффективности антагониста рецептора ΡΌ-1, возможно с помощью более чем одного механизма, хотя точный механизм действия не является существенно важным для широкой лечебной практики настоящего изобретения.

В предпочтительном варианте осуществления потенцирующий агент представляет собой циклофосфамид. Циклофосфамид (СТХ, Цитоксан®, или Неосар®) представляет собой лекарство оксазафосфорин и аналоги и включает в себя ифосфамид (1РО, Ифекс), перфосфамид, трофосфамид (трофосфамид; иксотен) и фармацевтически приемлемые соли, сольваты, пролекарства и их метаболиты (патентная заявка США 20070202077, которая включена во всей полноте). Ифосфамид (МИТОКСАНА®) является структурным аналогом циклофосфамида и механизм его действия считают идентичным или в основном сходным с механизмом действия циклофосфамида. Перфосфамид (4-гидропероксициклофосфамид) и трофосфамид также являются алкилирующими агентами, которые структурно связаны с циклофосфамидом. Например, перфосфамид алкилирует ДНК, ингибируя тем самым репликацию ДНК и РНК и синтез белка. Новые производные оксазофосфоринов были созданы и оценены в качестве попытки улучшить селективность и получить ответ с меньшей цитотоксичностью для хозяина (Ыапд I, Ниапд М, Оиап V, Уи ХЦ, 2Ьои 8. Оек1дп оГ пе\у оха/ар1юкр1юппе апЬсапсег йгидк. Сигг Ρίκιπη Оек. 2007; 13(9):963-78. Ре\ае\у). Указанные производные включают в себя мафосфамид (ИЗС 345842), глуфосфамид (Ό19575, бета-О-гликозилизофосфорамид горчицы), 8-(-)-бромофосфамид (СВМ-11), ИЗС 612567 (альдофосфамид пергидротиазин) и ИЗС 613060 (альдофосфамид тиазолидин). Мафосфамид представляет собой аналог оксазафосфорина, который является химически стабильной солью 4-тиоэтансульфоновой кислоты 4-гидрокси-СРА. Г луфосфамид является производным 1РО, в котором изофосфорамид горчицы, алкилирующий метаболит 1РО, связан гликозидной связью с молекулой бета-О-глюкозы.

Дополнительные аналоги циклофосфамида описаны в патенте США 5190929 под названием Аналоги циклофосфамида, применяемые в качестве противоопухолевых агентов, который включен в описание посредством ссылки во всей своей полноте.

В других воплощениях потенцирующий агент представляет собой агент, который уменьшает активность и/или число регуляторных Т-лимфоцитов (Т-гед), предпочтительно сунитиниб (ЗИТЕИТ®), анти-ТОРв или иматиниб (ОЬЕЕУАС®). Описанная схема лечения также может включать в себя введение адъюванта.

Подходящие потенцирующие агенты также включают в себя ингибиторы митоза, такие как паклитаксел, ингибиторы ароматазы (например, летрозол) и ингибиторы ангиогенеза (ингибиторы УЕОР, например авастин, УЕОР-Тгар) (см., например, Όί е! а1., Уакси1аг епйо!ЬеЬа1 дгоМЬ Гас!ог Ь1оскайе гейисек ш1га!итога1 геди1а!огу Т-се11к апй епЬапсек !Ье еГПсасу оГ а ОМ-СЗР-кесгеЬпд сапсег 1ттипо!Ьегару. СЬп Сапсег Кек. 2006 Иоу. 15; 12(22):6808-16.), антрациклины, оксалиплатин, доксорубицин, антагонисты ТЬК4, и антагонисты ТЬ-18.

- 22 023148

С. Фармацевтические композиции.

В одном аспекте изобретение относится к терапевтической композиции, содержащей молекулу, которая предотвращает передачу ингибиторного сигнала через ΡΌ-1, или антагонист СТЬА4, и потенцирующий агент, в фармацевтически приемлемом носителе. Компоненты указанной композиции представлены в количестве, эффективном для увеличения Т-клеточного ответа у млекопитающего. В конкретных воплощениях потенцирующий агент представляет собой циклофосфамид или аналог циклофосфамида, примеры таких аналогов перечислены выше.

В других конкретных примерах потенцирующий агент представляет собой агент, который уменьшает активность регуляторных Т-лимфоцитов (Т-гед), где предпочтительно активность снижается вследствие уменьшения числа указанных Т-гед. В предпочтительных неограничивающих вариантах осуществления, агент представляет собой сунитиниб (δυΤΕΝΤ®), анти-ΤΟΡβ или иматиниб (СЬЕЕУАС®).

Потенцирующий агент, применяемый в составлении композиции изобретения, также включает в себя ингибиторы митоза, такие как паклитаксел, ингибиторы ароматазы (например, летрозол), ингибиторы ангиогенеза (ингибиторы УЕСР, например авастин, УЕСР-Тгар), антрациклины, оксалиплатин, доксорубицин, антагонисты ТЬР4 и антагонисты 1Ь-18.

Терапевтическая композиция изобретения также, по желанию, включает в себя по меньшей мере один дополнительный агент, который может представлять собой одно или более антитело антитело анти-СТЬА4, ингибитор митоза, ингибитор ароматазы, антагонист рецептора аденозина А2а (А2АР) или ингибитор ангиогенеза.

Любая из терапевтических композиций изобретения также может содержать один или более адъювантов, которые описаны в настоящем документе.

Антагонист ΡΌ-1, применяемый в качестве компонента терапевтической композиции изобретения, включает в себя любой из антагонистов ΡΌ-1, перечисленных в описании для применения в любом из способов изобретения. Например, указанный антагонист ΡΌ-1 включает в себя любой из гибридных белков, перечисленных в описании. Указанный антагонист также может представлять собой любой из полипептидов или ΡΌ-1-связывающих фрагментов, перечисленных в описании для применения в качестве первой полипептидной части любого из гибридных белков, описанных для применения в любом из способов изобретения. Такой антагонист может далее представлять собой антитело, такое как любое из известных антител анти-Ρ^-1, анти-137-ЭС или ант-В7-Н1, упомянутых в описании.

Терапевтическая композиция изобретения также включает в себя в дополнение или вместо вышеупомянутого антагониста ΡΌ-1 антитело анти-СТЬА4. Такая композиция, соответственно, содержит указанное антитело анти-СТЬА4 и потенцирующий агент из числа уже описанных здесь.

Терапевтическая композиция изобретения находит применение в любом из способов изобретения, раскрытых в описании. Указанная композиция, несмотря на то что предназначена для применения в качестве активного лечения состояния болезни, также может найти применение в качестве профилактической композиции для предотвращения любого из заболеваний, перечисленных в описании.

В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает терапевтическую композицию, содержащую антагонист ΡΌ-1 и потенцирующий агент в фармацевтически приемлемом носителе, где антагонист ΡΌ-1 и потенцирующий агент представлены в количестве, эффективном для увеличения Т-клеточного ответа у млекопитающего.

Терапевтические композиции в объеме изобретения включают в себя композиции, содержащие любую и все комбинации антагонистов ΡΌ-1 и/или антител, раскрытых в описании, с любым из перечисленных потенцирующих агентов. В качестве неограничивающих примеров терапевтическая композиция изобретения включает в себя композицию, содержащую эффективное количество одного или более антагонистов ΡΌ-1, например комбинацию любого или всех полноразмерных полипептидов, приведенных здесь в виде конкретных δΕΟ ГО N0 или их гомологов, вместе с одним или более фрагментами любого из указанных полипептидов, включая комбинации, где любое или все из них соединены с другими белками, например соединены с одним или более иммуноглобулинами, перечисленными здесь, или не соединены, и комбинации содержат один или более потенцирующих агентов, таких как циклофосфамид отдельно, или циклофосфамид плюс один или более его аналогов, только один или более аналогов циклофосфамида, или потенцирующий агент может состоять из циклофосфамида и агента, который уменьшает число Т-гед у млекопитающего, получающего композицию, или может состоять из аналога циклофосфамида плюс агент, который уменьшает число Т-гед, или потенцирующий агент может состоять только из одного или более агентов, которые уменьшают число Т-гед или другую активность Т-гед. Все указанные комбинации предусмотрены изобретением, если только композиция включает в себя по меньшей мере один антагонист ΡΌ-1 и/или антитело, опосредующее Т-клеточную активность, и по меньшей мере один потенцирующий агент.

Композиции изобретения также могут включать в себя дополнительные активные агенты. В предпочтительных воплощениях любой композиции изобретения фармацевтическая или терапевтическая композиция далее включает в себя по меньшей мере один дополнительный агент, выбранный из группы, включающей в себя антитело анти-Ρ^-1, антитело анти-СТЬА4, ингибитор митоза, такой как паклитаксел, ингибитор ароматазы, такой как летрозол, антагонист А2АР, ингибитор ангиогенеза, антрациклины,

- 23 023148 оксалиплатин, доксорубицин, антагонисты ТЬК4 и антагонисты 1Ь-18.

Антагонист ΡΌ-1 и/или потенцирующий агент могут быть введены с помощью любых подходящих средств. В предпочтительном варианте осуществления антагонист ΡΌ-1 и/или потенцирующий агент вводят в водном растворе с помощью парентеральной инъекции. Композиция также может быть в форме суспензии или эмульсии. В целом, предоставляют фармацевтические композиции, включающие в себя эффективные количества пептида или полипептида, и дополнительно включают в себя фармацевтически приемлемые растворители, консерванты, солюбилизаторы, эмульгаторы, адъюванты и/или носители. Указанные композиции включают в себя растворители: стерилизованную воду, забуференный физиологический раствор с различным буферным составом (например, Тт18-НС1, ацетат, фосфат), различными значениями рН и ионной силы; и, по желанию, добавки, такие как детергенты и солюбилизирующий компонент (например, Т№ЕЕН 20, Т№ЕЕН 80, ΡοΙγδοΦαΙο 80), антиоксиданты (например, аскорбиновая кислота, матабисульфит натрия) и консерванты (например, тимерсол, бензиловый спирт) и объемообразующие субстанции (например, лактоза, маннитол). Примерами неводных растворителей или сред для лекарства являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло и кукурузное масло, желатин, и органические эфиры для инъекций, такие как этилолеат. Композиции могут быть лиофилизированы и повторно растворены/ресуспендированы непосредственно перед употреблением. Композиции могут быть простерилизованы, например, путем фильтрования через фильтры, задерживающие бактерии, с включением в композиции стерилизующих агентов, путем облучения композиции или путем нагревания композиции.

Фармацевтические композиции изобретения могут быть введены парентеральным (внутримышечная, внутрибрюшинная, внутривенная (IV) или подкожная инъекция), трансдермальным (либо пассивно, либо с использованием электрофореза или электропорации) или трансмукозальным (назальным, вагинальным, ректальным или сублингвальным) способом введения. Способы изобретения не исключают введение антагониста ΡΌ-1 и потенцирующего агента отдельными и различными путями (например, местно).

Антагонист ΡΌ-1 и потенцирующий агент могут быть введены в одно и то же время или в разные моменты времени, при этом потенцирующий агент вводят до или после введения антагониста ΡΌ-1. В одном варианте осуществления потенцирующий агент вводят как до, так и после введения антагониста ΡΌ-1. В одном таком варианте осуществления один и тот же потенцирующий агент вводят до и после введения антагониста ΡΌ-1. В другом варианте осуществления потенцирующий агент вводят до введения антагониста ΡΌ-1.

Используемый в описании термин эффективное количество или терапевтически эффективное количество означает дозу, достаточную для лечения ингибирования или облегчения одного или более симптомов нарушения, которое лечат, или для предоставления иным образом желаемого фармакологического и/или физиологического эффекта. Точная дозировка будет варьировать в зависимости от ряда факторов, таких как субъект-зависимые переменные (например, возраст, состояние иммунной системы и т.д.), заболевание, и производимое лечение. Терапевтически эффективные количества антагонистов рецепторов ΡΌ-1 и/или антител вместе с потенцирующими агентами вызывают иммунный ответ, который должен быть достигнут или поддержан.

Выбранная доза зависит от желаемого терапевтического эффекта, от пути введения, и от продолжительности требуемого лечения. Обычно уровни доз 0,001-50 мг/кг массы тела вводят млекопитающим ежедневно. Предпочтительно указанная доза составляет 1-50 мг/кг, более предпочтительно 1-40 мг/кг или даже 1-30 мг/кг, при этом доза 2-20 мг/кг является также предпочтительной дозой. Примеры других доз включают в себя 2-15 мг/кг, или 2-10 мг/кг или даже 3-5 мг/кг, при этом доза 4 мг/кг представляет собой конкретный пример.

В схемах лечения с применением потенцирующего агента и антитела, такого как антитело анти-Ρ^-1 или антитело анти-СТЬЛ4, дозы обычно соответствуют интервалу 0,1-100 мг/кг, при этом более узкие интервалы от 1 до 50 мг/кг являются предпочтительными и диапазоны от 10 до 20 мг/кг являются более предпочтительными. Подходящая доза для субъекта человека составляет 5-15 мг/кг, при этом доза антитела 10 мг/кг (например, человеческое антитело анти-Ρ^-1, аналогичное ΜΌΧ-1106) является наиболее предпочтительной (плюс подходящая доза циклофосфамида или другого потенцирующего агента, введенная приблизительно за 24 ч перед введением антитела).

В целом, только в качестве примера лекарственные формы на основе веса тела для любого из антагонистов сигнальной трансдукции, применяемого в способах изобретения, включают в себя дозы в диапазоне 5-300 мг/кг, или 5-290 мг/кг, или 5-280 мг/кг, или 5-270 мг/кг, или 5-260 мг/кг, или 5-250 мг/кг, или 5-240 мг/кг, или 5-230 мг/кг, или 5-220 мг/кг, или 5-210 мг/кг, или 20-180 мг/кг, или 30-170 мг/кг, или 40-160 мг/кг, или 50-150 мг/кг, или 60-140 мг/кг, или 70-130 мг/кг, или 80-120 мг/кг, или 90-110 мг/кг, или 95-105 мг/кг, причем дозы 3, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 50 и 100 мг/кг являются конкретными примерами предпочтительных доз. Указанные дозы, разумеется, могут быть введены повторно. Доза, разумеется, будет коррелировать с видом млекопитающего, получающего указанную дозу. Дозы перечисленных выше интервалов мг/кг являются пригодными для млекопитающих, включая грызунов, таких как мыши и крысы, и для приматов, в особенности для человека, дозы, составляющие приблизительно 5, 10 и

- 24 023148 мг/кг, являются особенно предпочтительными для лечения человека.

В соответствии со схемой лечения изобретения потенцирующий агент, например циклофосфамид, вводят в нетоксических дозах, которые варьируют в зависимости от вида животного. В конкретных воплощениях потенцирующий агент вводят с помощью любого подходящего способа введения, включая парентеральный или пероральный, первый способ из двух упомянутых выше включает в себя системное введение, такое как внутривенное введение. Например, потенцирующий агент, подобный циклофосфамиду, обычно вводят перорально. Указанное введение может происходить в любой удобной дозе, зависящей от потенцирующего агента. Доза в каждом случае может быть основана на массе тела или доза может быть введена в виде единичной дозы.

Несмотря на то что СТХ сам по себе не токсичен, некоторые из его метаболитов являются цитотоксическими алкилирующими агентами, которые индуцируют образование перекрестных связей в ДНК и, в высоких дозах, разрывы цепи. Многие клетки являются устойчивыми к СТХ, потому что они экспрессируют высокие уровни детоксицирующего фермента альдегиддегидрогеназы (АЬИН). СТХ воздействует на пролиферирующие лимфоциты, поскольку лимфоциты (но не гемопоэтические стволовые клетки) экспрессируют низкие уровни АЬИН, и делящиеся клетки являются наиболее чувствительными к ДНКалкилирующим агентам.

Низкие дозы СТХ (<200 мг/кг) могут обладать иммуностимулирующими эффектами, включающими в себя стимуляцию противоопухолевых иммунных ответов в человеческих и мышиных моделях рака (Вгойе & Сооке СтЪ Кеу. 1ттипо1. 28:109-126 (2008)). Указанные низкие дозы являются субтерапевтическими и не обладают непосредственной противоопухолевой активностью. Напротив, высокие дозы СТХ ингибируют противоопухолевый ответ. Роль СТХ в потенцировании противоопухолевого иммунного ответа можно объяснить несколькими механизмами: (а) истощение С^4+С^25+ΡоxΡ3+Т-^ед (и в особенности пролиферирующих Т-гед, которые могут быть особенно супрессивными); (Ь) истощение В-лимфоцитов; (с) индукция оксида азота (ΝΟ), приводящая к супрессии роста опухолевых клеток; (й) мобилизация и размножение СЭ11Ь+Сг-1+ МЭ8С. Указанные первичные эффекты обладают многочисленными вторичными эффектами; например, после истощения Т-гед макрофаги производят большее количество ΙΡΝ-γ и меньшее количество 1Ь-10. Также показано, что СТХ индуцирует экспрессию ΙΡΝ типа I и усиливает гомеостатическую пролиферацию лимфоцитов.

Истощение Т-гед наиболее часто упоминают в качестве механизма, с помощью которого СТХ потенцирует противоопухолевый иммунный ответ. Указанное заключение основано отчасти на результатах экспериментов по адаптивному переносу. В модели с применением опухолевых клеток АВ1-НА обработка СТХ на 9-й день обеспечивала показатель эффективности лечения 75%. Перенос очищенных Т-гед на 12-й день почти полностью ингибировал СТХ-ответ (уап йег Мок! е! а1. Сапсег 1ттипо1. 1ттипо!Ьег. 58:1219-1228 (2009). Сходный результат наблюдали в модели с опухолевыми клетками ННИ2: адаптивный перенос СИ4+СИ25+ Т-гед после предварительной обработки СТХ устранял терапевтический ответ на вакцину (Та1еЬ. I. I. 1ттипо1. 176:2722-2729 (2006)).

Многочисленные клинические испытания с участием людей показали, что СТХ в низкой дозе является безопасным, хорошо переносимым и эффективным агентом для стимулирования противоопухолевых иммунных ответов (Вак, & Мак!гапде1о Сапсег 1ттипо1. 1ттипо1Нег. 47:1-12 (1998)).

Оптимальной дозой СТХ для потенцирования противоопухолевого иммунного ответа является доза, которая понижает в целом количества Т-клеток при снижении уровней Т-гед ниже диапазона нормальных значений, но которая является субтерапевтической дозой (см. МасЫе1к е! а1. Сапсег Кек. 61:3689-3697 (2001)).

В клинических испытаниях с участием людей, где СТХ использовали в качестве иммунопотенцирующего агента, обычно применяли дозу 300 мг/м². Для человека средней комплекции (6 футов, 170 фунтов (78 кг) с площадъю поверхности тела 1,98 м²), 300 мг/м² составляет 8 мг/кг, или 624 мг общего белка. В мышиной модели рака эффективность наблюдали в дозах, изменявшихся в диапазоне 15-150 мг/кг, что соответствует 0,45-4,5 мг общего белка у мыши весом 30 г (МасЫе1к е! а1. Сапсег Кек. 61:3689-3697 (2001), Непдк! е! а1. Сапсег Кек. 41:2163-2167 (1981), Непдк! Сапсег Кек. 40:2135-2141 (1980)).

Для более крупных млекопитающих, таких как примат, предпочтительно человек, пациент, могут быть использованы указанные дозы мг/м², но стандартные дозы, вводимые в течение конечного промежутка, могут быть предпочтительными. Указанные стандартные дозы могут быть введены на ежедневной основе в течение конечного промежутка времени, например вплоть до 3 дней, или вплоть до 5 дней, или вплоть до 7 дней, или вплоть до 10 дней, или вплоть до 15 дней, или вплоть до 20 дней, или вплоть до 25 дней, все специфически предусмотрены изобретением. Аналогичные схемы введения могут быть применены для других потенцирующих агентов, перечисленных в описании.

Все указанные введения могут происходить до или после введения ΡΌ-1-связывающей молекулы изобретения. Альтернативно, одна или более дозы ΡΌ-1-связывающей молекулы изобретения могут быть разнесены во времени с введением потенцирующего агента для формирования однообразного или неоднообразного курса лечения, при котором вводят одну или более дозы потенцирующего агента с последующими одной или более дозами ΡΌ-1-связывающего соединения с последующими одной или более

- 25 023148 дозами потенцирующего агента, согласно графику, выбранному или заданному исследователем или врачом, которые вводят указанные агенты.

В других конкретных вариантах осуществления схема лечения включает в себя многократные введения одного или более антагонистов ΡΌ-1. В некоторых вариантах осуществления указанные многократные введения антагонистов ΡΌ-1 происходят в сочетании с многократными введениями одного и того же или различных потенцирующих агентов.

Как и в других воплощениях изобретения, здесь потенцирующий агент вводят по меньшей мере за 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 24 или 30 ч до или после введения антагониста ΡΌ-1.

Фармацевтические композиции, используемые здесь, также содержат фармацевтически приемлемый носитель, включающий в себя любой подходящий растворитель или среду для лекарства, который включает в себя любой фармацевтический агент, который сам не вызывает продукции антител, вредных для субъекта, принимающего композицию, и который может быть введен без неспецифической токсичности. Фармацевтически приемлемые носители включают в себя, но без ограничения, жидкости, такие как вода, физиологический раствор, глицерин и этанол и т.п., включая носители, используемые для создания спреев для назальной доставки и другой доставки через респираторный тракт или для доставки в зрительную систему. Полное обсуждение фармацевтически приемлемых носителей, растворителей и других сред для лекарства представлено в КетшдЮп'к ΡЬа^тасеиί^са1 Заепсек (Маск ΡιιΚ Со., N.1 сиггет ебШоп).

Композиции вакцин (как обсуждается ниже) далее могут включать в себя дополнительные вещества для стабилизации значения рН или для функционирования в качестве адъювантов, увлажняющих агентов или эмульгирующих агентов, которые могут служить для улучшения эффективности вакцины.

Вакцины обычно создают для парентерального введения и вводят либо подкожно, либо внутримышечно. Указанные вакцины также могут быть созданы в виде суппозиториев или для перорального введения с помощью методов, известных в данной области техники, или для введения через назальный или респираторный пути.

Ό. Способы получения.

Изолированный полипептидный антагонист ΡΌ-1, включая варианты, гомологи и их фрагменты, либо дикого типа, либо мутировавшие, и гибридные белки, содержащие любое из указанного, все предусмотрены для включения в изобретение, могут быть получены, например, с помощью химического синтеза или с помощью рекомбинантной продукции в клетке-хозяине. Для рекомбинантного получения костимулирующего полипептида нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, может быть использована, чтобы трансформировать, трансдуцировать или трансфицировать бактериальную или эукариотическую клетку-хозяин (например, клетку насекомого, дрожжей или млекопитающего). Следует понимать, что нуклеотидные последовательности могут быть кодон-оптимизированными для увеличения уровней экспрессии белка в определенном типе клеткихозяина. Способы оптимизации кодонов хорошо известны в данной области техники. В целом, конструкции нуклеиновых кислот включают в себя регуляторную последовательность, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей костимуляторный полипептид. Регуляторные последовательности (также обозначаемые здесь как последовательности контроля экспрессии) обычно не кодируют генный продукт, но вместо этого воздействуют на экспрессию последовательностей нуклеиновой кислоты, с которой они функционально связаны. Сигнальные пептиды, используемые, чтобы секретировать белки из клетки, могут быть эндогенными сигнальными пептидами или любым другим сигнальным пептидом, который облегчает секрецию гибридного белка из хозяина.

Для общих молекулярно-биологических процедур, используемых в осуществлении настоящего изобретения, имеется ряд стандартных ссылок, которые содержат процедуры, хорошо известные в области молекулярной биологии и генной инженерии, и нет необходимости описывать указанные процедуры далее в настоящем документе. Полезные ссылки включают в себя 8атЬгоок, е1 а1., Мо1еси1аг С1отпд: А ЬаЬогаЮгу Мапиа1, 8есопб Ебйюп, Со1б Зрппд НагЬог, Ν.Υ., (1989), \Уи е1 а1., Мебюбк ш Оепе Вю1есЬпо1оду (СКС Ριό^. №υ Υо^к, ΝΥ, 1997) и КесотЫпаШ Оепе Ехргеккюп Ρι^^Κ, ш Мебюбк ш Мо1еси1аг Вю1оду, уо1. 62 (Тиап, еб., Нитапа Ριό^. ТоЮ\уа, Νί, 1997), раскрытия которых, таким образом, включены посредством ссылки.

Е. Лечение заболевания.

Заболевания, которые лечат или предотвращают с помощью введения терапевтической комбинации, предоставленной настоящим изобретением, включают в себя злокачественную опухоль или хроническое инфекционное заболевание, вызванное бактерией, вирусом, простейшим, гельминтом или другим микробным патогеном, который проникает внутрь клетки. Указанные заболевания часто лечат с помощью атаки цитотоксических Т-лимфоцитов. Поскольку настоящее изобретение предоставляет комбинированные терапии, полезные для усиления Т-клеточных ответов с помощью увеличения Т-клеточной активности, увеличения Т-клеточной пролиферации и уменьшения Т-клеточных ингибиторных сигналов, комбинированные терапии изобретения обладают уникальным преимуществом в лечении (или даже в предотвращении) указанных заболеваний. В одном варианте осуществления, поскольку вирусные инфекции устраняются, главным образом, Т-клетками, увеличение Т-клеточной активности является тера- 26 023148 певтически целесообразным для усиления выведения инфекционного вирусного агента из организма животного или примата, предпочтительно человека, субъекта. Таким образом, раскрытые соединения изобретения, с активностью антагониста рецептора РИ-1, вместе с потенцирующим агентом действуют в комбинации для лечения местных или системных вирусных инфекций. Инфекции, которые лечат с помощью соединений изобретения, включают в себя, но без ограничения, иммунодефицит (например, Н1У), папиллому (например, НРУ), герпес (например, Н8У), энцефалит, грипп (например, вирус гриппа человека А), гепатит (например, НСУ, НВУ) и простудные (например, риновирус человека) вирусные инфекции. Фармацевтические составы композиций антагонистов рецептора РИ-1 также могут быть введены для лечения системных вирусных заболеваний, включая, но без ограничения, СПИД, грипп, простудные заболевания или энцефалит.

Невирусные инфекции, поддающиеся лечению соединениями изобретения, включают в себя, но без ограничения, инфекции, вызываемые микроорганизмами, включая, но без ограничения:

ЛсСЧлотусеа, АпаЬаепа, ВасШиз, Вас£его1с1ез, ВдеЛоуИзгТо,

ВогсТе£еЛа, ВоггеЛа, СашруТоЬаскег, Саи1оЬас£ег, СМатус11а,

СЪгота Лит, С1оз£г1<Иит, СогупеЬасЛЛит,

Оеапососсиз, ЕзсВеЛсЛа, ЕРапсТзеЛа,

НеЛоЬас£ег, НаеторЪНиз, Нетор/зЛиз 1пР1иепга НурЬотТсгсЫит, ЬедтопеЛа, Ьер£зр1гоз1з,

СЫогоЫит, СуЬорТзада, На1окас£е1:1игп, тип В (НТВ) ,

ЛзЛЛа, МепТпдососсиз МТсгососсиз, МуоЬас£ег1ит, И£гоЪас£ег, 0зсЛ1а£оЛа, ΡΗοάοΕρίΓίΙΙπιπ, Е1ске££Б1а,

А, В и С, Ме£'папсЬас1:еЛит, МусорТазгаа, Мухососсиз, ЫегззегТа, РгосЫогоп, РгоСеиз, РзеисТстопаз,

За1топе11а, ЗЫдеЛа, 5р1гШил1,

5р1ГОсЬае£а, ЗСарВу1ососсиз, 3£гер£ососс\13, 3£гер£отусез, 5и1Во1оЪиз, ТВегторТазта, ШоЬасШиз, Тгеропета, νιΡΐίο, ТесзТпТа, Сгур£ососсиз пеоРогтапз, ЩзкорТазта зр. /например, Шз£ор1азта сарзи1а£шп), СапсНЛа а1Ысапз, СапеИЛа ЛорТсаЛз, Т)осагсИа аз£его1с1ез, К1ске1:£з1а гаскекзИ, ВлскеЛзла курки, Те1зТипап1а, МусорТазша рпешпопТае, СЫатусИа! рзЛкас!, СЫатусИаТ ЛаскюшаИз, РТазтосИшп зр. /например, РТазтосИшп РаТсарагит), Тгурапозота Ьгисе!, ЕпкатоеЪа ЫзкоТуЛса,

ТохорТазта допсШ, ТгТскютопаз уадТпаЛз и ЗсЫзкозота тапзопЛ

В одном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет способы и композиции для индуцирования или усиления иммунного ответа хозяина для лечения рака. Типы рака, которые можно лечить предоставляемыми композициями и способами, включают в себя, но без ограничения, следующие: рак мочевого пузыря, рак мозга, рак молочной железы, рак шейки матки, колоректальный рак, рак пищевода, рак почек, рак печени, рак легких, назофарингеальный рак, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак кожи, рак желудка, рак матки, рак яичников, рак яичек и гематологический рак.

Злокачественные опухоли, которые могут быть подвергнуты воздействию, классифицируют здесь в соответствии с эмбриональным происхождением ткани, из которой развивается опухоль. Карциномы представляют собой опухоли, возникающие из эндодермальной или эктодермальной тканей, таких как кожа или эпителиальная выстилка внутренних органов и желез. Саркомы, которые возникают реже, происходят из мезодермальных соединительных тканей, таких как кость, жир и хрящ. Лейкемии и лимфомы являются злокачественными опухолями гемопоэтических клеток костного мозга. Лейкемии пролиферируют в виде отдельных клеток, тогда как лимфомы проявляют тенденцию к росту в виде опухолевых масс. Злокачественные опухоли могут выявляться в различных органах и тканях организма при постановке диагноза рака.

В качестве демонстрации полезности схем лечения изобретения мышиный аналог В7-ЭС-1д (в котором мышиный В7-ЭС ЕСИ, который характеризуется 72% идентичности последовательности с белком человека, соединен с Рс-доменом мышиного 1дО_2а) тестировали в сингенных мышиных опухолевых моделях колоректального рака, мастоцитомы и других типов опухоли, включающих в себя предварительную обработку циклофосфамидом (СТХ), как описано в настоящем документе.

Результаты показали, что лечение однократной субтерапевтической дозой СТХ, который действует как иммунопотенцирующий агент, с последующим введением мышиного В7-ЭС-1О ликвидирует привитые опухоли СТ26 карциномы толстой кишки у 80% животных. Далее, в исследованиях с повторным введением клеток линии СТ26 карциномы толстой кишки не обнаружили повторного роста опухоли у мышей с ранее уничтоженными опухолями после лечения СТХ + мышиный В7-ЭС-1д. Также показано,

- 27 023148 что указанные мыши характеризовались повышенной популяцией опухоль-специфических СТЬ по сравнению с нативными мышами.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает применение соединения, которое уменьшает передачу ингибиторного сигнала в Т-клетку, как описано в другом разделе настоящего документа, для получения лекарства для увеличения Т-клеточного ответа с помощью комбинированной терапии, где указанное соединение вводят в сочетании с потенцирующим агентом. Далее, соединение, которое уменьшает передачу ингибиторного сигнала в Т-клетку, и указанный потенцирующий агент предоставляют в виде отдельных медикаментов для введения в разные моменты времени, где предпочтительно потенцирующий агент вводят раньше, чем соединение, которое уменьшает передачу ингибиторного сигнала, например, вплоть до 24 ч до введения ингибиторного соединения (или другие интервалы времени, перечисленные в описании). Предпочтительно соединение и потенцирующий агент предназначены для лечения инфекционного заболевания или рака, включая заболевания, вызванные любыми инфекционными агентами или видами рака, перечисленными в настоящем документе. В предпочтительном варианте осуществления соединение, применяемое в указанных способах, представляет собой рекомбинантный белок, состоящий из ЕСГО человека В7ГОС соединенного с Рс-доменом человека 1дС_ь обозначаемый здесь как В7ГОС-1д.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к медицинскому набору для введения соединения, которое уменьшает передачу ингибиторного сигнала в Т-клетку, как раскрыто в описании, в комбинации с потенцирующим агентом, указанный набор включает в себя:

(a) запас дозы соединения, которое уменьшает передачу ингибиторного сигнала в Т-клетку;

(b) запас потенцирующего агента;

(c) запас фармацевтически приемлемого носителя;

(б) отпечатанные инструкции по введению соединения при применении, как описано выше.

Р. Комбинированное лечение.

Вакцины вызывают сильный Т-клеточный ответ для уничтожения раковых клеток и инфицированных клеток или инфекционных агентов. Антагонисты рецептора ΡΌ-1, описанные в настоящем документе, могут быть введены в виде компонента вакцины вместе с потенцирующим агентом для предоставления костимуляторного сигнала Т-клеткам. Вакцины, раскрытые в описании, включают в себя антигены, антагонист рецептора ΡΌ-1 и дополнительно адъюванты и таргентные молекулы.

Антигены, против которых усиливают Т-клеточный ответ с помощью способов и композиции изобретения, включают в себя пептиды, белки, полисахариды, сахариды, липиды, нуклеиновые кислоты или их комбинации. Антигены в случае заболевания представлены в результате патологического процесса.

Раскрытые композиции антагонистов рецептора ΡΌ-1 могут быть введены в сочетании с профилактическими вакцинами, которые вызывают у субъекта устойчивость к последующему воздействию инфекционных агентов, или в сочетании с терапевтическими вакцинами, которые могут быть использованы, чтобы инициировать или усилить иммунный ответ у субъекта на заданный антиген, такой как опухолевый антиген у субъекта, имеющего рак, или вирусный антиген у субъекта, инфицированного вирусом.

Желаемый результат профилактического, терапевтического или десенсибилизационного иммунного ответа может варьировать в зависимости от заболевания, исходя из принципов, хорошо известных в данной области техники. Например, иммунный ответ против инфекционного агента может полностью предотвратить колонизацию и репликацию инфекционного агента, вызывая стерильный иммунитет и отсутствие симптомов заболевания. Однако вакцина против инфекционных агентов может считаться эффективной, если она уменьшает количество, тяжесть или продолжительность симптомов; если она уменьшает количество субъектов в популяции, имеющих симптомы заболевания; или уменьшает передачу инфекционного агента. Аналогичным образом, иммунные ответы против рака, аллергенов или инфекционных агентов могут полностью вылечить заболевание, могут уменьшить симптомы или могут представлять собой одну грань общего терапевтического воздействия на заболевание. Например, стимуляция иммунного ответа против рака может сочетаться с хирургическим, химиотерапевтическим, радиологическим, гормональным и другими иммунологическими подходами, чтобы воздействовать на лечение.

Способы и продукты изобретения не исключают применение адъюванта в дополнение к потенцирующему агенту. Такой адъювант может быть добавлен, например, вместе с антагонистом ΡΌ-1. Адъюванты, используемые в композициях и способах изобретения, включают в себя, но без ограничения, один или более из следующих: масляные эмульсии (например, адъювант Фрейнда); препараты сапонина; виросомы и вирусоподобные частицы; бактериальные и микробные производные; иммуностимулирующие олигонуклеотиды; АДФ-рибозилирующие токсины и обезвреженные производные; квасцы; ВСС; минералсодержащие композиции (например, минеральные соли, такие как соли алюминия и соли кальция, гидроксиды, фосфаты, сульфаты и т.д.); биоадгезивы и/или мукоадгезивы; микрочастицы; липосомы; композиции эфиров полиоксиэтилена и сложных эфиров полиоксиэтилена; мурамиловые пептиды; полифосфазен; соединения имидазолхинолона; и поверхностно-активные вещества (например, лизолецитин, полиолы плюроника, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианин лимфы улитки и динитрофенол). Полезные адъюванты также включают в себя иммуномодуляторы, такие как цитокины, интерлейкины (например, 1Ь-1, 1Ь-2, 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-6, 1Ь-7, 1Ь-12 и т.д.), интерфероны (например, интер- 28 023148 ферон-γ), макрофагальный колониестимулирующий фактор и фактор некроза опухоли.

Нет никаких препятствий для введения раскрытого антагониста рецептора ΡΌ-1, включая полипептиды, фрагменты, варианты, гомологи и гибридные белки, раскрытые здесь, субъекту, который нуждается в них, в комбинации с одним или более дополнительными терапевтическими агентами (в дополнение к потенцирующему агенту). Дополнительные терапевтические агенты выбирают, исходя из состояния, нарушения или заболевания, которое нужно вылечить. Например, антагонисты рецептора ΡΌ-1 могут быть введены совместно с одним или более дополнительными агентами, функцией которых является усиление или способствование развитию иммунного ответа, и которые рассматривают в описании как активные агенты. Указанные агенты включают в себя, но без ограничения, амсакрин, блеомицин, бусульфан, капецитабин, карбоплатин, кармустин, хлорамбуцил, цисплатин, кладрибин, клофарабин, кризантаспазу, цитарабин, дакарбазин, дактиномицин, даунорубицин, доцетаксел, доксорубицин, эпирубицин, этопозид, флударабин, фторурацил, гемцитабин, гидроксикарбамид, идарубицин, ифосфамид, иринотекан, лейковорин, липосомальный доксорубицин, липосомальный даунорубицин, ломустин, мелфалан, меркаптопурин, месну, метотрексат, митомицин, митоксантрон, оксалиплатин, паклитаксел, пеметрексед, пентостатин, прокарбазин, ралтитрексед, сатраплатин, стрептозоцин, тегафур-урацил, темозоломид, тенипозид, тиотепа, тиогуанин, топотекан, треосульфан, винбластин, винкристин, виндезин, винорелбин или их комбинации. Типичные проапоптатические агенты включают в себя, но без ограничения, флударабин, стауроспорин, циклогексимид, актиномицин И, лактозилцерамид, 15ά-ΡΟί(2) и их комбинации.

Виды терапии, предоставляемые способами и композициями настоящего изобретения, также могут быть использованы в сочетании с другими типами терапии, например с лучевой терапией, хирургическим вмешательством и т.п.

С. Анализы активности антагониста.

Настоящее изобретение описывает ряд специфических структур, полезных в осуществлении способов изобретения. Другие соединения, обладающие антагонистической активностью и используемые в способах изобретения, также могут быть идентифицированы с помощью ссылки на хорошо известные методики анализа для идентификации химических структур, которые связываются с ΡΌ-1, СТЬА4, и их лигандов, которые также обладают способностью уменьшать передачу ингибиторного сигнала в Т-клетки. Некоторые указанные анализы представляют собой анализы связывания, применяемые для определения, связывается ли выбранная химическая структура с рецепторами; указанные анализы хорошо известны в данной области техники, и нет необходимости подробно рассматривать их в настоящем документе (см., например, патент США 2008/0274490 (опубл. 6 ноября 2008 г.) и патент США 7105328 (опубл. 12 сентября 2006 г.), в каждом из которых показаны тесты для определения модуляторов сигнальной системы ΡΌ-1, использующих Т-клетки), раскрытия которых, таким образом, включены посредством ссылки во всей своей полноте. Другие тесты используют для определения эффектов агентов изобретения, таких как активные фрагменты, на активацию Т-клеток с помощью увеличения пролиферации и/или продукции цитокинов. Указанные анализы также хорошо известны в данной области техники. Например, повышенная пролиферация клеток может быть продемонстрирована с помощью увеличения захвата ³Н-тимидина (в результате увеличенного синтеза ДНК, необходимого для клеточного размножения) или с помощью ИФА и/или РИА для обнаружения повышенной продукции цитокинов Т-клетками в культуре.

В одном таком эксперименте ΡΌ-1-связывающую активность В7-ИС-1д человека оценивали с помощью ИФА. 96-луночные планшеты для теста ИФА покрывали 100 мкл 0,75 мкг/мл рекомбинантного человеческого ΡΌ-1/Рс (К&И §ук1етк), разведенного в буфере ВирН карбонат/бикарбонат, рН 9,4 (Иегсе) на 2 ч и затем блокировали раствором В8А Цасккои 1ттииоКекеагсЬ) в течение 90-120 мин. Серийные разведения В7-ИС-1д человека (дикий тип, а также мутеин И1118, и мутанты К1138, которые выбрали по причине сниженного связывания с ΡΌ-1), а также изотипа 1дС₁ человека в качестве контроля вводили для связывания в течение 90 мин. Связанный В7-ИС-1д обнаруживали с применением 100 мкл 0,5 мкг/мл биотина, конъюгированного с античеловеческим В7-ИС клоном М1Н 18 (Вюкиеисе) с последующим применением НКΡ-стрептавидина в разведении 1:1000 (ВИ Вюкаеисе) и субстрата ТМВ (ВюРХ). Абсорбцию считывали при длине волны 450 нм с применением планшетного ридера (Мо1еси1аг Иеуюек) и данные анализировали с помощью программы §ойМах с применением логического соответствия по четырем параметрам. Данные показали, что человеческий В7-ИС-1д (дикий тип) связывался с ΡΠ-1, но мутанты К1138 и И1118 не связывались ΡΠ -1.

При осуществлении методик настоящего изобретения следует понимать, что ссылки на конкретные буферы, среды, реагенты, клетки, условия культивирования и т.п. не являются ограничивающими, но предназначены для включения всех смежных материалов, которые специалист в данной области техники определит как представляющие интерес или ценность в конкретном контексте, в котором представлено данное обсуждение. Например, часто возможно заменить одну буферную систему или культуральную среду на другую и достичь сходных, если не идеальных, результатов. Специалистам в данной области техники известны указанные системы и методики, чтобы без неоправданных экспериментов произвести указанные замены, которые будут наилучшим образом служить их целям в применении способов и мето- 29 023148 дик, раскрытых в описании.

Изобретение описано более подробно в следующих неограничивающих примерах. Следует понимать, что указанные способы и примеры ни в коей мере не ограничивают изобретение в вариантах осуществления, описанных здесь, и что другие варианты осуществления и применения, без сомнения, могут быть предложены специалистами в данной области техники.

Примеры

Пример 1.

В7-ЭС-1д связывается с клетками СНО, экспрессирующими ΡΌ01.

Вначале конъюгировали В7-ЭС-1д с аллофикоцианином (АРС) и затем инкубировали в различных концентрациях с клетками линии СНО, конститутивно экспрессирующими ΡΌ-1, или с родительскими клетками СНО, которые не экспрессируют ΡΌ-1. Связывание анализировали с помощью проточной цитометрии. На фиг. 1 представлено среднее значение интенсивности флуоресценции (МР1) В7-^С-Iд-АΡС в виде функции от концентрации зонда (ось х). В7-^С-Iд-АΡС связывается с клетками ΟΉΟ.ΡΌ-1 (темный кружок), но не с нетрансфицированными клетками СНО (серый треугольник).

Пример 2.

В7-ЭС-1д конкурирует с В7-Н1 за связывание с ΡΌ-1.

Вначале конъюгировали В7-Н1-1д с аллофикоцианином (АРС). Немеченный В7-ЭС-1д в различных концентрациях вначале инкубировали с клетками линии СНО, конститутивно экспрессирующими ΡΌ-1, перед добавлением В7-Н1-Iд-АΡС к зонду и клеточной смеси. На фиг. 2 среднее значение интенсивности флуоресценции (МР1) В7-НI-РС-АΡС показано в виде функции от концентрации добавленного конкурента немеченного В7-ЭС-1д (ось х). По мере того как возрастает концентрация немеченного В7-ЭС-1д, количество В7-Н1-Iд-АΡС, связавшегося с клетками СНО, уменьшается, что показывает, что В7-ЭС-1д конкурирует с В7-Н1 за связывание с ΡΌ-1.

Пример 3.

Модель опухолевых клеток СТ26.

Клеточную линию колоректальной опухоли мышей, СТ26, получали из АТСС. Маточный банк клеток в пассаже 4 создавали в соответствии с руководством АТСС. Клетки тестировали и подтверждали отсутствие микоплазмы и другого патогенного заражения. Один флакон с опухолевыми клетками размораживали из криоконсервированного стока и выращивали на протяжении двух пассажей перед инокуляцией.

Клетки СТ26 отделяли в 1:5 разведении 30 мл полной среды (ВДМ1 + 10% РВ8, 2 мМ Ь-О1и и 1х Ρ/8) для 2-дневной культуры или в 1:10 разведении 30 мл полной среды для 3-дневной культуры. Клетки СТ26 собирали путем аспирирования среды, промывали флакон 5 мл ΡВ§, добавляли 5 мл трипсина, инкубировали при 37°С в течение 2 мин и затем нейтрализовали 10 мл полной среды. После центрифугирования при 600хд (~1000 об/мин) в течение 5 мин среду отсасывали и клеточный осадок ресуспендировали пипетированием с 10 мл обычной среды КΡМI. Указанную стадию отмывки повторяли три раза.

Количество клеток и жизнеспособность инокулированных клеток определяли с помощью окраски трипановым синим в соответствующем разведении (например, разведение 1:5, 10 мкл клеток + 40 мкл трипановый синий) и подтверждали с помощью клеточного счетчика ИОУА во время последней стадии промывки. Жизнеспособность клеток для инокулирования, как правило, составляла более 95%.

Для начальной инокуляции клетки СТ26 разводили до концентрации 6,7х10⁵ клеток/мл обычной средой КΡМI и хранили на льду. Обычно каждую мышь инокулировали 150 мкл (1х10⁵ клеток). На 9-й день всех мышей, несущих опухоль, вначале помещали в одну клетку и распределяли случайным образом по экспериментальным группам. Раствор СТХ восстанавливали 1х ΡВ§ до концентрации 4 мг/мл. Мышам вводили внутрибрюшинно (ΙΡ) 0,5 мл раствора СТХ, что давало в результате 2 мг для мыши весом 20 г, т.е. 100 мг/кг.

На 10-й день мышам вводили ΙΡ 0,5 мл В7-ЭС-1д (0,2 мг/мл), что давало в результате 0,1 мг для мыши весом 20 г, т.е. 5 мг/кг. Аналогичные дозы вводили 2 раза в неделю в течение 4 недель, всего 8 доз. Опухолевый рост контролировали путем измерения опухоли два раза в неделю, начиная со дня введения В7-ЭС-1д, посредством штангенциркуля с цифровой индикацией. Объем опухоли рассчитывали следующим образом:

Объем опухоли=п(Пк_Ьоп)²х(О1оп6)/6=~0,52х(ПкЬоп)²х(О1оп6).

Мышей умерщвляли и прекращали исследование, если объем опухоли достигал 2000 мм³ или если в месте инокуляции опухоли наблюдали кожные язвы и инфекции.

Пример 4.

Комбинация циклофосфамида и В7-ЭС-1д может уничтожать привитые опухоли.

Мышам породы Ва1Ь/С в возрасте 9-11 недель имплантировали подкожно 1,0х10⁵ клеток колоректальной опухоли СТ26, как описано выше. На 10-й день после имплантации опухоли мыши получали 100 мг/кг циклофосфамида. Лечение В7-ЭС-1д начинали на 1 день позже, на 11-й день. Мышей лечили 100 мкг В7-ЭС-1д, 2 дозы в неделю, в течение 4 недель и всего 8 доз. У 75% мышей, которые получали схему лечения СТХ + В7-ЭС-1д, привитые опухоли были уничтожены к 44 дню, тогда как все мыши в

- 30 023148 контрольной группе, получавшие только СТХ, погибли в результате опухолевого роста или были подвергнуты эвтаназии, поскольку опухоли превышали размеры, утвержденные 1ЛСИС (результаты представлены на фиг. 3). Указанные результаты демонстрируют эффективность схемы лечения на привитых опухолях и не ограничиваются профилактикой.

Пример 5.

Комбинация циклофосфамида и В7-ЭС-1д может уничтожить привитые опухоли и защитить против повторного опухолевого заражения.

Мышам из описанного выше эксперимента с уничтоженными привитыми колоректальными опухолями СТ26, повторно вводили 1х 10⁵ клеток СТ26 на 44-й день и на 70-й день. Отсутствие опухолевого роста при повторном введении опухолевых клеток позволяет предположить, что у мышей развился долговременный противоопухолевый иммунитет благодаря комбинированному лечению циклофосфамидом и В7-ЭС-1д. У всех мышей контрольной группы, получавших носитель, развились опухоли (результаты представлены на фиг. 4). Результаты демонстрируют эффективность схемы лечения в отношении привитых опухолей и показывают, что комбинированное лечение циклофосфамидом и В7-ЭС-1д приводило в результате к ответам с участием иммунной памяти на опухолевые антигены.

Пример 6.

Комбинация циклофосфамида и В7-ЭС-1д может создать опухоль-специфичные, цитотоксические Т-лимфоциты памяти.

Мышам из описанного выше эксперимента с уничтоженными привитыми колоректальными опухолями СТ26 повторно вводили 2,5х10⁵ клеток линии СТ26 на 44-й день. Через семь дней выделяли селезенки мышей. Мышиные спленоциты стимулировали 5 или 50 мкг/мл яичного альбумина (0УА) или пептидами АН1 в течение 6 ч в присутствии блокатора аппарата Голджи (ВИ Вю8с1епсе). Эффекторные Т-клетки памяти анализировали путем определения СЭ8'/1Р№/' Т-клеток. Результаты на фиг. 5 показывают, что мыши с уничтоженными опухолями СТ26 характеризовались значительным количеством СТ26-специфических Т-эффекторных клеток.

Пример 7. Дозозависимое воздействие В7-ЭС-1д на удаление опухолей.

Мышам породы Ва1Ь/С в возрасте 9-11 недель имплантировали подкожно 1,0х10⁵ клеток линии колоректальной опухоли СТ26. На 9-й день после имплантации опухоли мышам вводили однократную дозу циклофосфамида (100 мг/кг) и на 10-й день начинали лечение 30, 100 или 300 мкг В7-ЭС-1д, 2 дозы в неделю в течение 4 недель, всего 8 доз. На фиг. 6 показано, что при дозе 300 мкг опухоли исчезали у 70% мышей, при дозе 100 мкг опухоли исчезали у 40% мышей и доза 30 мкг вызывала уничтожение 10% опухолей.

Пример 8.

Комбинация циклофосфамида и анти-ΡΟ-! может уничтожать привитые опухоли.

Мышам породы Ва1Ь/С в возрасте 9-11 недель вводили подкожно 1,0х10⁵ клеток колоректальной опухоли СТ26. На 11-й день после введения опухолевых клеток мышам вводили однократную дозу циклофосфамида (100 мг/кг) и начинали лечение антителом анти-ΡΟ-! (250 мкг, клон 04, Ηίταηο Р. с1 а1., 2005, Сапсег КекеатсЬ), которое вводили 3 раза в неделю в течение четырех недель. К 50 дню после введения опухолевых клеток у 70% мышей, которые получали лечение по схеме СТХ + анти-Ρ^-1, исчезли привитые опухоли СТ26, тогда как все мыши контрольной группы и группы, получавшей только антиΡΌ-1, погибли в результате роста опухоли или были подвергнуты эвтаназии, поскольку размеры опухолей превышали размеры, установленные 1АСИС. Результаты свидетельствуют об эффективности схемы лечения в отношении привитых опухолей и не ограничиваются профилактикой. Результаты представлены на фиг. 7.

Пример 9.

Комбинация циклофосфамида и анти-СТЬА4 может ликвидировать привитые опухоли.

Мышам породы Ва1Ь/С в возрасте 9-11 недель вводили подкожно 1,0х10⁵ клеток колоректальной опухоли СТ26. На 11-й день после введения опухолевых клеток мыши получали 100 мг/кг циклофосфамида. Обработку анти-СТЬА4 (антимышиные СТЬА4 антитела из гибридомы хомяка - депозитный номер АТСС ИС10-4Р10-11) начинали на 1 день позже, на 12-й день. Мыши получали 100 мкг анти-СТЬА4, 2 дозы в неделю, в течение 4 недель. 56% мышей, которые получали лечение по схеме СТХ + антиСТЬА4, не имели опухоли на 50-й день после введения опухолевых клеток, тогда как все мыши контрольной группы погибли в результате роста опухоли или были подвергнуты эвтаназии, поскольку размеры опухолей превышали размеры, установленные 1АСИС. Результаты представлены на фиг. 8. Результаты свидетельствуют об эффективности схемы лечения в отношении привитых опухолей и не ограничиваются профилактикой.

Пример 10.

Схема лечения комбинацией циклофосфамида и В7-ЭС-1д приводит к уменьшению Т-гед в микроокружении опухоли.

На фиг. 9 представлены результаты экспериментов, в которых мышам породы Ва1Ь/С в возрасте 9-11 недель имплантировали 1,0х10⁵ клеток линии СТ26 подкожно. На 9-й день мышам вводили

- 31 023148

100 мг/кг СТХ, ΙΡ. Через 24 ч, на 10-й день, мыши получали 100 мкг В7-ЭС-1д. Выделяли 5 групп: интактные мыши, которым не вводили опухолевые клетки, группа, которой вводили носитель, группа СТХ, группа СТХ + В7-ЭС-1д и группа, получавшая только В7-ЭС-1д. Две интактные мыши и четыре мыши из других групп были выведены из исследования на 11-й день (2 дня после СТХ) и на 16-й день (7 дней после СТХ) для Т-клеточного анализа. На левой панели показано, что на 11-й день, 2 дня после инъекции СТХ, количество Т-гед в селезенке мышей, получавших СТХ, было значительно ниже, чем количество Тгед у мышей с имплантированными опухолями, получавших инъекции носителя. На правой панели показано, что на 16-й день, 7 дней после введения СТХ и 6 дней после введения В7-ЭС-1д, В7-ЭС-1д значительно уменьшал количество СИ4+ Т-клеток, экспрессирующих высокое количество ΡΌ-1. Указанный факт наблюдали как у мышей, получавших В7-ЭС-1д, так и у мышей, получавших СТХ + В7-ЭС-1д. Предполагалось, что мыши с имплантированными опухолевыми клетками должны иметь большее количество ΡΌ-1⁺/ΟΌ4⁺ Т-клеток в дренированном ΕΝ по сравнению с интактными мышами.

Пример 11.

Комбинация циклофосфамида и В7-ЭС-1д может повысить выживаемость мышей в модели метастатического рака предстательной железы.

Мышам породы В10.Э2 в возрасте 9-11 недель вводили внутривенно 3,0х10⁵ клеток 8Ρ-1, которые были выделены из легочных метастазов после инъекции родительских клеток ТКΑМΡ. Мыши группы СТХ получали 3 дозы СТХ, 50 мг/кг, на 5-, 12й и 19-й день. Мыши, обработанные В7-ИС-1д, получали 3 дозы В7-ЭС-1д, 5 мг/кг, на 6-, 13- и 20-й день. К 100 дню среди мышей контрольных групп, интактных мышей, мышей, получавших только СТХ, только В7-ЭС-1д, выжили 17%, тогда как среди мышей, получавших комбинацию СТХ и В7-ЭС-1д, выжили 43%. Результаты представлены на фиг. 10.

Пример 12.

Комбинация противораковой вакцины на основе листерии и В7-ЭС-1д может увеличить выживаемость мышей после имплантации клеток линии СТ26 в печень.

Мышам породы Ва1Ь/С в возрасте 11-13 недель имплантировали клетки СТ26 с помощью инъекции в часть селезенки с ее последующим удалением (йет1кр1ееи т]ес1юп (есйпкще) (УокЫтита К. е! а1., 2007, Сапсег Кекеагсй). На 10-й день мыши получали 1 инъекцию СТХ в дозе 50 мг/кг, ΙΡ.

Через 24 ч, на 11-й день, мышам вводили рекомбинантный пептид листерии, несущий АН1, иммунодоминантный эпитоп СТ26, в дозе 0,1 ЙО₅₀ (1х 10⁷ КОЕ), затем вводили на 14- и на 17-й день. Мышам также вводили В7-ЭС-1д на 11-й день и затем на 18-й день. На фиг. 11 показано, что все интактные мыши или мыши, получавшие СТХ и противораковую вакцину на основе листерии, погибли до 45-го дня. Среди мышей, получавших тройную комбинацию СТХ + противораковая вакцина на основе листерии и В7ИС-1д, выжили 60% животных.

- 32 023148

Список литературы

1. Вгобе 8, Сооке А. 1ттипе-ро(епйайпд е#ес(з οί Ше сЬетоШегареиЙс бгид сус1орЬо8рЬаггнбе. СгИ Веу.1ттипо1. 2008;28(2); 109-26

2. уап бег Моз( В©, Сигпе АЗ, МаЬепбгап 5, Ргоззег А, ОагаЫ А, ΒοΡίηεοπ ВУУ, Ν ον/а к АК, Ьаке ВА, Титог егабкайоп айег сус1орЬозрЬатйе берепбз оп сопсиггеп! бер1е(юп οί геди1а(огу Т сеПз: а го1е 1ог сускпд ТЫРВ2-ехрге531пд ейес1ог-зирргеззог Т сеПз ίη Ппгмйпд βίίεοίίνβ сКетоШегару. Сапсег 1ттипо1.1ттипоШег. 2009 Аид;58(8):1219-28

3. ТагеЬ б, СЬари! Ν, ЗсЬагб: Ν, Воих 8, ΝονβιιΙΙ 3, Мепагб С, ОЫппдЬеШ Р, Тегте М, Сагрепйег АР, Саггаззе-Зеге О, е( а1. СЬето(ттипо1Г|егэру οί (итоге: сус)орйозрЬат|бе зупегд/гез ν/ΐΙΗ ехозоте Ьазеб уасс(пез, 3.1ттипо1. 2006 Маг 1; 176(5):2722-9

4. Мас№е1з ЭР, ВеП1у ВТ, Етепз ΙΑ, ЕгсоИт АМ, Ι_βϊ ΒΥ, УУеМгаиЬ ϋ, Окоуе ΡΙ, ЗаЙее ЕМ. Сус1орЬозрЬат1бе, бохогиЬкт, апб расП(ахе1 епЬапсе Ше апй(итог 1ттипе гезропзе οί дгапи1осу(е/тасгорЬадесо1опу зЙти!аЙпд (ас(ог-зесгейпд ν/ήοΙβ-οβΙΙ уассюез ίη ΗΕΒ-2/пеи (о)епгеб тгсе. Сапсег Вез. 2001 Мау 1;61(9):3689-97

5. Вазз КК, Маз1гапде1о М3. 1ттипоро(епНайоп ννίΐή Ιονζ-бозе сус1орЬозрЬат1бе ίη Ше асйуе зреайс 1ттипоШегару οί сапсег. Сапсег 1ттипо1,1ттипоШег. 1998 Зер;47{1):1-12

6. Непдз1 ЗС, Мокуг МВ, Огау 8. Соорегайоп ЬеМееп сус1орЬозрЬапйбе 1итопс1ба1 ас1м1у апб (юз( апМшпог )ттип1(у ίη Ше сиге οί тгсе Ьеаппд (агде МОРС-315 (итогз. Сапсег Вез. 1981 Зип;41(6):2163-7

7. Непдз( ЗС, Мокуг МВ, Огау 8. 1трог(апсе οί йггйпд ίη сус1орЬозрйат1бе Шегару οί МОРС-315 (итог-Ьеаппд тке. Сапсег Вез. 1980 Зи1;40(7):2135-41

8. Тзипд К, Меко ЗВ, Тзипд ΥΙ_, Реркпзк! СВ, Νοτίοη ЗА. 1ттипе гезропзе адашз( 1агде (итогз егабгса(еб Ьу (геа(теп( ννίίΡι сус1орЬозрЬат1бе апб И-12. 3.1ттипок 1998 РеЫ ;160(3):1369-77

9. НопеусЬигсЬ 3, ΘΙβηηϊβ М3, ИНбде ΤΜ. Сус1орПозрЬат1бе ίηίιίΡΚίοη οί апЙ-СО40 топос(опа1 апЙЬобу-Ьазеб Шегару οί В сеП 1утрЬота ί$ берепбепГ оп СО11Ь+ сеПз. Сапсег Вез. 2005 Аид 15:65(16):7493-501

10. УУаба 8, УозЫтига К, Н|рк1зз Е1_, Нагпз Τ3, Уеп НК, Оо1бЬегд М\/, Сгоззо ЗР, Се(пе( ϋ, Оетагго АМ, Νβίίο 03, Апбегз В, РагбоН ОМ, □гаке СС. Сус1ор(юзрЬапгнбе аидтеп(з апй(итог 1ттип1(у: з(иб1ез ίη ап аиШсМЬопоиз ргоз(а(е сапсег тобек Сапсег Вез. 2009 Мау 15;69(10):4309-18.

11. Ргеетап.С.З. 3(гис(игез οί Ρΰ-1 \νί(Κ Йз Ндапбз: 81бе«/ауз апб бапсШд сЬеек (о сЬеек. Ргос. №11. Асаб. Зек и. 8. А 105, 10275-10276 (2008).

12. Вгобе,3. & Сооке,А, 1ттипе-ро(епйайпд еЯес(з οί Ше сйетоШегареийс бгид сус1орЬозрПат1бе. Сп( Ββν. 1ттипо1. 28, 109126 (2008).

- 33 023148

13. уап бег ΜοβΙ,Ρ.Ο. е1 а1. Титог егасйсайоп айег сус1орЬозрЬат1бе берепбз оп сопсиггеШ 6βρΙβ1ίοπ οί геди1а1огу Т сеНз: а го1е (ог сусйпд ТМРР2-ехргеззтд еНес1ог-зирргеззог Т сеНз ίη ИтШпд еЯесЙуе сЬето(Ьегару. Сапсег кптипо!. 1ттипо1Ьег, 58,1219-1228 (2009),

14. ΤβίβΡ,ί. е1 а1. СЬето1ттипо(Кегару οί (итогз: сус1орЬозрЬат1бе зупегд1гез ννϊΙΚ ехозоте Ьазеб уасстез. б. 1ттипо1. 176, 2722-2729 (2006).

15. Вазз.К.К. & Маз1гапде1о,М.З. 1ттипоро1еп(1а1юп ννΐΐίι Ιονχ-бозе сус1орЬозрЬат1бе ίη 1Ье асбуе зресШс 1ттипо1Ьегару οί сапсег. Сапсег 1ттипо1.1ттипо1Ьег. 47,1-12 (1998).

16. МасЬ1е1з,З.Р. е( а1. Сус1орЬозрЬат1бе, бохогиЫап, апб расШахе! епЬапсе (Ье апМитог 1ттипе гезропае οί дгапи1осу1е/тасгорЬадесо1опу зйти1аЬпд (аШог-зесгейпд »Ьо1е-се11 уасстез ϊη ΗΕΡ-2/пеи 1о1епгеб тюе. Сапсег Рез. 61, 3689-3697 (2001).

17. Непдз1,З.С., Мокуг.М.В., & Огау.З. СоорегаЬоп ЬеЪлгееп сус1орЬозрЬат1бе 1итолс1'ба1 асйуйу апб Ьоз1 апШитог |ттип1(у ίη (Ье сиге οί ιτιίοβ Ьеаппд 1агде МОРС-315 (итога. Сапсег Рез. 41, 21632167(1981),

18. Непдз1,З.С., Мокуг.М.В., & Огау.З. 1трог1апсе οί Ьггипд ίη сус1орЬозрЬат1бе (Ьегару οί МОРС-315 (итог-Ьеаппд тюе. Сапсег Рез. 40, 2135-2141 (1980).

19. Тзипд.К., Меко.Л.В., Тзипд.У.Е, ΡβρΙίηβΜ,Ο.Ρ,, & ΝοΠοη,ί.Α. 1ттипе гезропзе адатз1 1агде (итоге егабюа(еб Ьу 1геа1теп1 ууйЬ сус1орЬозрЬат|бе апб И-12. б. 1ттипо1.160,1369-1377 (1998).

20. НопеусЬигсЬ.З., ΟΙβηηίβ,Μ.3., & ПНбде.Т.М. Сус1орЬозрЬат1бе тШЬйюп οί апВ-С040 топос1опа! апКЬобу-Ьазеб (Ьегару οί В сеН )утрЬота Ϊ3 берепбеШ оп СР11Ь+ сеНз. Сапсег Рез. 65, 7493-7501 (2005).

21. ΙΛ/аба 3, УозШтига К, ΗϊρΗ$3 Е1_, Нагпз ТЗ, Уеп НР, Оо1бЬегд МУ, Сгоззо ЗР, Се(пе( О, Оетагго АМ, Νθίίο СЗ, Апбеге Р, РагбоП ОМ, Огаке СС. Сус1орЬо$рЬагтйбе аидтеШз аШПитог 1ттиШ(у: з(иб!ез ίη ап аи(осЬ(Ьопоиз ргоз(а(е сапсег тобек Сапсег Рез. 2009 Мау 15;69(10):4309-18.

- 34 023148

Список последовательностей

<110>	Ьапдегтапп, Зо1отоп
<120>	КОМПОЗИЦИИ АНТАГОНИСТОВ Ρΰ-1	И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ
<13 0>	21682-7
<14 0>
<141>
<15 0>	61/211,697
<151>	2009-04-02
<150>	61/091,692
<151>	2008-08-25
<150>	61/091,709
<151>	2008-08-25
<150>	61/091,705
<151>	2008-08-25
<160>	20
<17 0>	РаГепЫп νθΓΞίοη 3.4
<210>	1
<211>	273
<212>	РКТ
<213>	Ното зарЬепз
<4 0 0>	1
МеС 11е РНе Ьеи Ьеи Ьеи Мег Ьеи Зег	Ъеи С1и Ьеи 61п Ъеи ΗΪ5 С1п

10 15

Не А1а А1а Ьеи РЬе ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 Рго Ьуз С1и Ьеи Туг 11е 11е 20 25 30

01ч Н1з С1у Зег Азп Уа1 ТЬг Ьеи С1и Суз Азп РНе Азр ТНг С1у Зег 35 40 45

Н1з Уа1 Азп Ьеи С1у А1а 11е ТЬг А1а Зет Ьеи С1п Ьуз Уа! С1и Азп 50 55 60

Азр ТЬг Зег Рго Н1з Агд 61и Агд А1а ТНг Ьеи Ьеи С1и СЬи СЬп Ьеи 65 70 75 80

Рго Ьеи 61у Ьуз А1а Зег РНе ΗΪ3 11е Рго С1п Уа1 С1п Уа1 Агд Азр 85 90 95

СЬи СЬу СЬп Туг СЬп Суз 11е 11е Ые Туг СЬу УаЬ АЬа Тгр Азр Туг 100 105 110

Ьуз Туг Ьеи ТНг Ьеи Ьуз УаЬ Ьуз АЬа Зег Туг Агд Ьуз 11е Аэп ТНг 115 120 125

- 35 023148

НЬз Пе Ьеи Ьуз УаЬ Рго СЬи ТНг Азр СЬи УаЬ СЬи Ьеи ТНг Суз СЬп 130 135 140

АЬа ТНг СЬу Туг Рго Ьеи А1а СЬи УаЬ Зег Тгр Рго Азп УаЬ Зег УаЬ 145 150 155 160

Рго АЬа Азп ТЬг 5ег НЬз Зег Агд ТНг Рго СЬи СЬу Ьеи Туг СЬп УаЬ 165 170 175

ТНг Зег УаЬ Ьеи Агд Ьеи Ьуз Рго Рго Рго 01у Агд Азп РНе Зег Суз 180 185 190

УаЬ РНе Тгр Азп ТЬг НЬз УаЬ Агд О1и Ьеи ТЬг Ьеи АЬа Зег Не Азр 195 200 205

Ьеи СЬп Зег С1п МеС С1и Рго Агд ТЬг НЬз Рго ТНг Тгр Ьеи Ьеи НЬз 210 215 220

11е РНе Не Рго РЬе Суз Не 11е АЬа РНе Не РЬе Пе А1а ТНг УаЬ 225 230 235 240

Пе АЬа Ьеи Агд Ьуз С1п Ьеи Суз СЬп Ьуз Ьеи Туг Зег Зег Ьуз Азр 245 250 255

ТЬг ТНг Ьуз Агд Рго УаЬ ТЬг ТНг ТЬг Ьуз Агд С1и УаЬ Азп Зег А1а 260 265 270

11е <210> 2 <211> 254 <212> РЕТ <213> Ното зарЬепз <400> 2

Ьеи РЬе ТЬг УаЬ ТЬг УаЬ Рго Ьуз СЬи Ьеи Туг 11е 11е 61и НЬз С1у 15 10 15

Зег Азп УаЬ ТНг Ьеи СЬи Суз Азп РНе Азр ТЬг С1у Зег НЬз УаЬ Азп 20 25 30

Ьеи С1у А1а Не ТНг АЬа Зег Ьеи СЬп Ьуз УаЬ СЬи Азп Азр ТЬг Зег 35 40 45

Рго НЬз Агд СЬи Агд АЬа ТЬг Ьеи Ьеи СЬи СЬи СЬп Ьеи Рго Ьеи СЬу 50 55 60

- 36 023148

Ьуэ 65

АЬа

Зег

РЬе

НЬз

Ые 70

Рго

СЬп

УаЬ

СЬп

УаЬ 75

Агд

Азр

СЬи

СЬу

СЬп 80

Туг

СЬп

Суз

Не

Ые

Ые

Туг

СЬу

УаЬ

АЬа

Тгр

Азр

Туг

Ьуз

Туг

Ьеи

85

90

95

ТНг

Ьеи

Ьуз

Уа1

Ъуз

АЬа

Зег

Туг

Агд

Ьуз

Ые

Азп

ТНг

НЬз

Ые

Ьеи

ЬОО

105

110

Ьуз

УаЬ

Рго

СЬи

ТНг

Азр

СЬи

УаЬ

СЬи

Ьеи

ТНг

Суз

СЬп

АЬа

ТНг

СЬу

115

120

125

Туг

Рго

Ьеи

АЬа

СЬи

УаЬ

Зег

Тгр

Рго

Азп

УаЬ

Зег

УаЬ

Рго

АЬа

Азп

130

135

140

ТНг

Зег

НЬз

Зег

Агд

ТНг

Рго

СЬи

СЬу

Ьеи

Туг

СЬп

УаЬ

ТНг

Зег

7а1

145

150

155

160

Ьеи

Агд

Ьеи

Ьуз

Рго

Рго

Рго

СЬу

Агд

Азп

РНе

Зег

Суз

УаЬ

РНе

Тгр

165

170

175

Азп

ТНг

Шз

УаЬ

Агд

СЬи

Ьеи

ТНг

Ьеи

АЬа

Зег

Ые

Азр

Ьеи

СЬп

5ег

180

135

190

СЬп

МеЬ

СЬи

Рго

Агд

ТНг

НЬз

Рго

ТНг

Тгр

Ьеи

Ьеи

НЬз

Ые

РНе

11е

195

200

205

Рго

РЬе

Суз

ЬЬе

11е

А1а

РНе

Ые

РНе

Ые

АЬа

ТНг

УаЬ

Ые

АЬа

Ьеи

210

215

220

Агд

Ьуз

СЬп

Ьеи

Суз

СЬп

Ьуз

Ьеи

Туг

Зег

Зег

Ьуз

Азр

ТНг

ТНг

Ъуз

225

230

235

240

Агд

Рго

УаЬ

ТНг

ТНг

ТНг

Ьуз

Агд

СЬи

УаЬ

Азп

Зег

АЬа

Ые

245

250

<210> :

3

<2ΐι> :

202

<212> 1

РКТ

<213> 1

Ното

заргепз

<400> :

3

Ьеи

РНе

ТНг

ТНг

УаЬ

Рго

Ьуз

СЬи

Ьеи

Туг

Ые

Ые

СЬи

НЬз

С1у

1

5

10

15

Зег

Азп

УаЬ

ТНг

Ьеи

СЬи

Суз

Азп

РНе

Азр

ТНг

С1у

Зег

НЬз

УаЬ

Азп

25 30

- 37 023148

Ьеи

61у

А1а 35

Не

ТЬг

АЬа Бег

Ьеи 40

СЬп Ьуз УзЬ СЬи

Азп 45

Азр

ТЬг

Зег

Рго

НЬз

Агд

СЬи

Агд

АЬа

ТЬг

Ьеи

Ьеи

С1и

СЬи

СЬп

Ьеи

Рго

Ьеи

СЬу

50

55

60

Ьуз

А1а

5ег

РЬе

НЬз

Пе

Рго

СЬп

УаЬ

СЬп

УаЬ

Агд

Азр

СЬи

СЬу

61п

65

70

75

80

Туг

С1п

Суз

11е

11е

Пе

Туг

СЬу

УаЬ

АЬа

Тгр

Азр

Туг

Ьуз

Туг

Ьеи

85

90

95

ТЬг

Ьеи

Ьуз

УаЬ

Ьуз

АЬа

Зег

Туг

Агд

Ьуз

Ые

Азп

ТЬг

НЬз

11е

Ьеи

100

105

ЫО

Ьуз

УаЬ

Рго

СЬи

ТЬг

Азр

СЬи

УаЬ

СЬи

Ьеи

ТНг

Суз

СЬп

АЬа

ТЬг

СЬу

115

120

125

Туг

Рго

Ьеи

АЬа

СЬи

УаЬ

Зег

Тгр

Рго

Азп

УаЬ

Зег

УаЬ

Рго

АЬа

Азп

130

135

140

ТНг

Бег

ΗΪ5

Бег

Агд

ТЬг

Рго

СЬи

СЬу

Ьеи

Туг

СЬп

УаЬ

ТЬг

Зег

УаЬ

145

150

155

160

Ьеи

Агд

Ьеи

Ьуз

Рго

Рго

Рго

С1у

Агд

Азп

РЬе

Зег

Суз

УаЬ

РЬе

Тгр

165

170

175

Азп

ТЬг

Н1з

УаЬ

Агд

СЬи

Ьеи

ТЬг

Ьеи

АЬа

Зег

Ые

Азр

Ьеи

СЬп

Зег

180

185

190

С1п

МеЬ

й1и

Рго

Агд

ТЬг

НЬз

Рго

ТЬг

Тгр

195 200 <210> 4 <2Ы> 202 <212> РКТ <213> тигЬпе <400> 4

Ьеи

РЬе

ТЬг

Уа1

ТЬг

АЬа

Рго

Ьуз

СЬи

УаЬ

Туг

ТЬг

УаЬ

Азр

УаЬ

СЬу

1

5

10

15

Зег

Зег

УаЬ

Зег

Ьеи

СЬи

Суз

Азр

РЬе

Азр

Агд

Агд

СЬи

Суз

ТЬг

СЬи

20

25

30

Ьеи

СЬи

СЬу

Не

Агд

АЬа

Зег

Ьеи

СЬп

Ьуз

УаЬ

СЬи

Азп

Азр

ТЬг

Зег

35

40

45

Ьеи

СЬп

Зег

С1и

Агд

АЬа

ТЬг

Ьеи

Ьеи

СЬи

СЬи

СЬп

Ьеи

Рго

Ьеи

СЬу

- 38 023148

55 60

Ьуз 65

А1а

Ьеи РЬе Шз

Не 70

Рго Зег

7а1

С1п

Уа1 75

Агд

Азр

Зег

С1у

СЬп 80

Туг

Агд

Суз Ьеи Уа1

Не

Суз С1у

А1а

АЬа

Тгр

Азр

Туг

Ьуз

Туг

Ьеи

Й5

90

95

ТЬг

Уа1

Ьуз Уа1 Ьуз

А1а

Зег Туг

МеЬ

Агд

11е

Азр

ТЫ

Агд

Не

Ьеи

100

105

110

С1и

Уа1

Рго С1у ТЬг

С1у

СЬи Уа1

СЬп

Ьеи

ТЬг

Суз

СЬп

АЬа

Агд

СЬу

115

120

125

Туг

Рго

Ьеи А1а С1и

Уа1

Зег Тгр

СЬп

Азп

УаЬ

Зег

Уа1

Рго

АЬа

Азп

130

135

140

ТЬг

Зег

Н1з 11е Агд

ТЬг

Рго С1и

С1у

Ьеи

Туг

С1п

Уа1

ТЬг

Зег

νηΐ

145

150

155

160

Ъеи

Агд

Ьеи Ьуз Рго

С1п

Рго Зег

Агд

Азп

РЬе

Зег

Суз

МеЬ

РЬе

Тгр

165

170

175

Азп

А1а

Шз МеЬ Ьуз

С1и

Ьеи ТЬг

Зег

А1а

11е

Не

Азр

Рго

Ьеи

5ег

180

185

190

Агд

МеЬ

С1и Рго Ьуз

Уа1

Рго Агд

ТЬг

Тгр

195

200

<210>

5

<211>

19

<212>

РКТ

<213>

Ното зар1епз

<400>

5

МеС

Не

РЬе Ьеи Ьеи

Ьеи

МеЬ Ьеи

Зег

Ьеи

С1и

Ьеи

СЬп

Ьеи

НЬз

СЬп

1

5

10

15

Не

А1а

АЬа

<210>

6

<211>

232

<212>

РКТ

<213>

Ното зархепз

<400>

6

С1и

Рго

Ьуз Зег Суз

Азр

Ьуз ТЬг

НЬз

ТЬг

Сув

Рго

Рго

Суз

Рго

АЬа

1

5

10

15

- 39 023148

Рго

С1и

Ьеи

Ьеи 20

С1у

С1у

Рго

Зег

Уа1 25

РНе

Ьеи

РНе

Рго

Рго 30

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТНг

Ьеи

Мер

11е

Зег

Агд

ТЬг

Рго

С1и

Уа1

ТЬг

Суз

\7а1

17а 1

35

40

45

Уа1

Азр

Уа1

Зег

Шз

С1и

Азр

Рго

61и

17а 1

Ьуз

РНе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

50

55

60

Азр

С1у

Уа1

С1и

Уа1

НЁз

Азп

А1а

Ьуз

ТНг

Ьуз

Рго

Агд

С1и

С1и

61п

65

70

75

80

Туг

Азп

Зег

ТНг

Туг

Агд

Уа1

Уа1

Зег

17а 1

Ьеи

ТНг

17а1

Ьеи

НЁз

С1п

85

90

95

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

С1у

Ьуз

01и

Туг

Ьуз

СУ5

Ьуз

Уа1

Зег

Азп

Ьуз

А1а

100

105

110

Ьеи

Рго

А1а

Рго

11е

61и

Ьуз

ТНг

11е

Зес

Ьуз

А1а

Ьуз

С1у

С1п

Рго

115

120

125

Агд

С1и

Рго

<31п

Уа1

Туг

ТНг

Ьеи

Рго

Рго

Зег

Агд

Азр

С1и

Ьеи

ТНг

130

135

140

Ьуз

Азп

С1п

Уа1

Зег

Ьеи

ТНг

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

С1у

РЬе

Туг

Рго

Зег

145

150

155

160

Азр

Не

А1а

Уа1

С1и

Тгр

С1и

Зег

Азп

С1у

С1п

Рго

С1и

Азп

Азп

Туг

165

170

175

Ьуз

ТНг

ТЬг

Рго

Рго

УаЬ

Ьеи

Азр

Зег

Азр

С1у

Зег

РНе

РНе

Ьеи

Туг

180

135

190

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

Агд

Тгр

61п

С1п

С1у

Азп

Уа1

РЬе

195

200

205

Зег

Сув

Зег

Уа1

МеЬ

Низ

С1и

А1а

Ьеи

НЁЗ

Азп

НЁЗ

Туг

ТНг

С1п

Ьуз

210

215

220

Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго <31 у Ьуз

225

230

<210>	7
<211>	233
<212>	РКТ
<213>	МЫШИНЫЙ
<400>	7

- 40 023148

01 г 1

Рго

Агд

ОЬу

Рго 5

ТНг

11е

Ьуз

Рго

Суз 10

Рго

Рго

Суз

Ьуз

Суз 15

Рго

А1а

Рго

Азп

Ьеи

Ьеи

21у

С1у

Рго

Зег

УаЬ

РЬе

11е

РЬе

Рго

Рго

Ьуз

20

25

30

Не

Ьуэ

Аэр

Уа1

Ьеи

Мер

11е

Зег

Ьеи

Зег

Рго

11е

УаЬ

ТЬг

Суз

7а1

35

40

45

Уа1

УаЬ

Азр

УаЬ

Зег

С1и

Азр

Азр

Рго

Азр

УаЬ

СЬп

11е

Зег

Тгр

РНе

50

55

60

Уа1

Азп

Азп

УаЬ

СЬи

Уа1

НЬз

ТЬг

АЬа

СЬп

ТЬг

СЬп

ТЬг

НЬз

Агд

С1и

65

70

75

80

Азр

Туг

Азп

Зег

ТЬг

Ьеи

Агд

УаЬ

УаЬ

Зег

АЬа

Ьеи

Рго

11е

СЬп

ΗΪ3

85

90

95

εΐη

Азр

Тгр

Мер

Зег

С1у

Ьуз

СЬи

РЬе

Ьуз

Суз

Ьуз

УаЬ

Азп

Азп

Ьуз

100

105

110

Азр

Ьеи

Рго

АЬа

Рго

11е

С1и

Агд

ТЬг

11е

Зег

Ьуз

Рго

Ьуз

С1у

Зег

115

120

125

УаЬ

Агд

А1а

Рго

С1п

Уа1

Туг

УаЬ

Ьеи

Рго

Рго

Рго

СЬи

СЬи

СЬи

Ме£

130

135

140

ТЬг

Ьуз

Ьуз

εΐη

Уа1

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Суз

МеС

УаЬ

ТЬг

Азр

РЬе

МеЬ

Рго

145

150

155

160

С1и

Азр

11е

Туг

Уа1

СЬи

Тгр

ТНг

Азп

Азп

СЬу

Ьуз

ТЬг

С1и

Ьеи

Азп

165

170

175

Туг

Ьуз

Азп

ТЬг

СЬи

Рго

УаЬ

Ьеи

Азр

Зег

Азр

СЬу

Зег

Туг

РЬе

Ме£

180

185

190

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

Агд

Уа1

СЬи

Ьуз

Ьуз

Азп

Тгр

УаЬ

СЬи

Агд

Азп

Зег

195

200

205

Туг

Зег

Суз

Зег

Уа1

Уа1

Н1з

СЬи

ОЬу

Ьеи

НЬз

Азп

НЬз

НЬз

ТЬг

ТНг

210

215

220

Ьуз

Зег

РЬе

Зег

Агд

ТЬг

Рго

СЬу

Ьуз

225

230

<210> 8

<211> 1365

<212> ДНК

<213> искусственный

- 41 023148 <220>

<223> Мышиный В7-0С-1д <400> 8

аЪдс£дсЬсс	1;дсЪдсСда1:	ас£даассЪд	адс1Дасаас	С£са£сс1:д£	адсадсС^а	60
(ЛсассдЬда	садссссСаа	адаад1:д£ас	ассдЬадасд	Ссддсадсад	ЬдИдадссЬд	120
дадИдсдаСЛ	ЪСдассдсад	адааСдсасЬ	даасСддаад	дда1:аададс	сад££1:дсад	180
ааддЪадааа	аСда^асдСс	СсИдсааадС.	дааададсса	ссс£дс£дда	ддадсадсад	240
сссс^дддаа	аддс^ССд'С'С;	ссасаСсссЬ	ад^дСссаад	£дадада££с	сдддсад^ас	300
сд^ТдссЬдд	Ьса^сСдсдд	ддссдссИдд	дас^асаад!	асс£дасдд£	дааадЪсааа	360
дс£1:с71;аса	едаддаПада	сасСадда1:с	с£ддадд£Ьс	садд£.асадд	ддаддЬдсад	420
сЬЪассЬдсс	аддсЬададд	ЬЬаЬссссЪа	дсадаадСдЬ	ссХддсаааа	ЬдЪсадЪдЬЪ	480
ссЬдссааса	ссадссасаЪ	саддассссс	дааддссСсИ	ассадд1:сас	садСдЬЬсЬд	540
сдссИсаадс	сЬсадссЬад	садааасСИс	адс^дса^дИ	£с£ддаа1:дс	ИсасаИдаад	600
дадсСдасИ:	садссаСсаЪ	СдасссИсИд	адИсддаИдд	аасссааадЬ.	ссссадаасд	660
£дддадссаа	дадд'ЬссСас	даЬсаадссс	Сдсссдсс1:Ё	д£ааа1:дссс	адсбссаааС.	720
ЮдсОдддЬд	дассдЬсадЬ	сЬЬСаЬс^Ьс	седссааада	ОаааддасдЬ	сЬЬдаЬдаЬЬ	780
адтзсСдадсс	ссаЬсдТ.дас	а£дсд£С.д£д	д£ддаЁд£1:£	сададдасда	ссссдасд1:д	840
сааа^садЪЪ	ддЪЪсдССаа	саасдСддад	дЪдсаЪассд	сЁсааассса	дасссасада	900
дадда£11а1:а	асадсасссЬ	дсдддЬадЬд	Сссдссс^дс	сда£ссадса	ТсаддаТЛдд	960
а^дадсддда	аадад££саа	дИдСааддИа	аасаасааад	аЪсСдссадс	дссдаЪЬдаа	1020
сдаассаССа	дсаадссдаа	адддадсд^д	сдсдсассСс	аддССЬасдС	ссСЬссСсса	1090
ссадаададд	адаЬдасдаа	ааадсадд1;д	ассс^дасаЪ	дсаСддЬаас	гдас1Ы;а£д	1140
ссадаадаЬа	ССЁасдИдда	аЪддасЬааТ.	аасддааада	сададсЪсаа	ССасаадаас	1200
ас^дадссЛд	ССсЬддаССс	гдачзддсадс	|;асМ;1;а1;д1;	ас7ссааа71:	дадддГсдад	1260
аадаадааСЛ	дддЬсдадад	ааасадСЛаИ	адЬЪдсИсад	ИддИдсаСда	дддссЪссаИ	1320
ааЬсаОсаса	ссасааадЬс	сЬЬсадссда	асдсссддда	ааЪда		1365

<210> 9 <211> 454 <212> РКТ <213> искусственный <220>

<223> Мышиный В7-0С-1д <400> 9

Ме£ Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Рго 11е Ьеи Азп Ьеи Зег Ьеи С1п Ьеи НЬз Рго 15 10 15

- 42 023148

- 43 023148

Уа1

бег

С1и Азр Азр 275

Рго Азр 1/а1 280

С1п

11е Зег Тгр

РЬе 285

Уа1

Азп

Азп

Уа1

С1и

Уз1

Ηΐ3

ТЬг

А1а

С1п

ТЬг

СЬп

ТЬг

Нгз

Агд

С1и

Азр

Туг

Азп

290

295

300

Зег

ТНг

Ееи

Агд

17а1

Уа1

Зег

А1а

Ьеи

Рго

11е

С1п

Нгз

С1п

Азр

Тгр

305

310

315

320

МеГ

бег

С1у

Еуз

С1и

РЬе

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

Азп

Азп

Еуз

Азр

Ееи

Рго

325

330

335

А1а

Рго

Не

С1и

Агд

ТЬг

Не

Зег

Ьуз

Рго

Ьуз

С1у

Зег

Уа1

Агд

А1а

340

345

350

Рго

С1п

Уа1

Туг

Уа1

Ьеи

Рго

Рго

Рго

О1и

01и

С1и

МеЕ

ТЬг

Ьуз

Ьуз

355

360

365

С1п

Уа1

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Суз

МеГ

ν^ι

ТЬг

Азр

РЬе

МеЬ

Рго

С1и

Азр

Не

370

375

380

Туг

Уа1

С1и

Тгр

ТЬг

Азп

Азп

С1у

Ьуз

ТЬг

С1и

Ееи

Азп

Туг

Ьуз

Азп

385

390

395

400

ТЬг

С1и

Рго

17а 1

Ееи

Азр

5ег

Азр

С1у

Зег

Туг

РЬе

МеЕ

Туг

Зег

Ьуз

405

410

415

Ьеи

Агд

Уа1

С1и

Ъув

Ьуз

Азп

Тгр

Уа1

С1и

Агд

Азп

Зег

Туг

Зег

Суз

420

425

430

бег

Уа1

Уа1

Шз

61и

С1у

Ьеи

ΗΐΞ

Азп

Нгз

Шз

ТЬг

ТЬг

Ьуз

бег

РЬе

435

440

445

Зег

Агд

ТЬг

Рго

С1у

Ьуз

450 <210> 10 <211> 435 <212> РКТ <213> искусственный <220 <223> Мышиный гибридный белок В7-РС-1д без сигнальной последовательности <400 10

Ееи РЬе ТЬг Уа1 ТЬг А1а Рго Еуз Я1и Уа1 Туг ТЬг Уа1 Азр Уа1 С1у 15 10 15

- 44 023148

- 45 023148

Нхз

ТЬг АЬа СЬп 275

ТНг

СЬп ТЬг НЬз Агд СЬи Азр Туг Азп Зег ТНг

Ьеи

280

285

Агд

УаЬ

УаЬ

Зег

АЬа

Ьеи

Рго

Не

61п

НЬз

С1п

Азр

Тгр

МеЬ

Зег

СЬу

290

295

300

Ьуз

СЬи

РЬе

Ьуз

Суз

Ьуз

УаЬ

Азп

Азп

Ьуз

Азр

Ьеи

Рго

АЬа

Рго

ХЬе

305

310

315

320

С1и

Агд

ТЬг

11е

Зег

Ьуз

Рго

Ьуз

СЬу

Зег

УаЬ

Агд

А1а

Рго

СЬп

Уа1

325

330

335

Туг

УаЬ

Ьеи

Рго

Рго

Рго

СЬи

СЬи

СЬи

МеЬ

ТЬг

Ьуз

Ьуз

СЬп

УаЬ

ТНг

340

345

350

Ьеи

ТЬг

Суз

МеЬ

УаЬ

ТНг

Азр

РНе

МеЬ

Рго

СЬи

Азр

Не

Туг

УаЬ

СХи

355

360

365

Тгр

ТНг

Азп

Азп

СЬу

Ьуз

ТЬг

СЬи

Ьеи

Азп

Туг

Ьуз

Азп

ТНг

СЬи

Рго

370

375

380

УаЬ

Ьеи

Азр

Зег

Азр

С1у

Зег

Туг

РНе

МеЬ

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

Агд

УаЬ

385

390

395

400

СЬи

Ьуз

Ьуз

Азп

Тгр

УаЬ

СЬи

Агд

Азп

Зег

Туг

Зег

Су5

Зег

УаЬ

УаЬ

405

410

415

НЬз

СЬи

СЬу

Ьеи

НЬз

Азп

НЬз

НЬз

ТНг

ТЬг

Ьуз

Зег

РЬе

Зег

Агд

ТНг

420

425

430

Рго С1у Ьуз 435 <210> 11 <211> 1362 <212> ДНК <213> искусственный <220>

<223> Человеческий В7-0С-1д <400> 11

аЬдаЬсЬЬСс	СЬсЬсЬЬдаЬ дсЬдЕсЬЬЬд дааЬЬдсаас ЬЕсассаааЕ сдсддсссЬс	60
ЬЬЬасЬдСда	ссдЬдесааа адаасЬдьаЬ аЬсаЬЬдадс асдддЬсеаа ЬдЬдасссЬс	120
дэаЬдСаасЬ	ЬЬдасассдд садссасдЬЬ ааесьддддд ссаЬсасСдс садеЬЬдсаа	180
аэадЬЬдааа	эсдасасЬЬс ассЬсассдд дададддсаа сссЬсЬЬдда ддадсаасЬд	240
ссаЬЬдддда	аддссЬссЬЬ ЬсаЬаЬсссС саддЕдсадд ЬЬсдддаЬда дддасадЬас	300

- 46 023148

садсдсасса	ССаСсСасдд	сдСддсССдд	даССасаадС	аСсСдасссС	дааддСдааа	360
дсдСссСаСс	ддааазССаа	сасСсасаСС	сССааддСдс	сададасдда	сдаддСддаа	420
сСдасаСдсс	аадссассдд	сСасссдССд	дсададдСса	дсСддсссаа	сдСдадсдСа	480
ссСдсСааса	сССсСсаССс	Саддасассс	дадддссСсС	ассаддССас	аСссдСдсСс	540
сдссСсааас	сдсссссадд	ссддааС.ССС	адССдсдСдС	СССддааЬас	ссасдСдсда	600
дадсСдасСс	ССдсаСсСаС	СдаСсСдсад	ссеоадасдд	адссасддас	Ссасссаасс	660
СдддаассСа	ааСсССдсда	СаааасСсаС	ассСдСсссс	сССдсссадс	ссссдадсСС	720
сСдддаддСс	оеадсдсдсс	СсСдСССссс	ссаааассСа	аддасасасС	СаСдаСаСсс	780
сдаасдссдд	аадСдасаСд	сдСддССдСд	дасдСсСсас	асдаадассс	ддадд^дааа	840
ССсаасСддС	асдССдасдд	адССдаддСЬ	саСаасдсСа	адассаадсс	садададдад	900
сааСасааСС	ссассСаСсд	адСддССадС	дСасСдассд	ССЛСдсасса	адасСддсСд	960
ааСддаааад	ааСасаадСд	сааадСаСеа	аасааддсСС	СдссСдсасс	саСсдадаад	1020
асаассссса	аадссааадд	дсадсссадд	даассдсадд	СдСасасасс	сссассаСсс	1080
сдсдасдадс	Ъдасааадаа	СсаадСаСсс	сСдассСдсс	СддСдааадд	сССССассса	1140
ьссдаеассд	ссдСддааСд	ддаассаааС	ддасаассСд	адаасаасСа	саааассасС	1200
ссассСдСдс	ССдасадсда	сдддСссССС	ССссСдСаса	дСаадсСсас	СдСсдаСаад	1260
СсСсдсСддс	адсадддсаа	сдСсССССса	СдСадСдСда	Сдсасдаадс	СсСдсасаас	1320
саССасассс	адаадСсСсС	дСсасСдадс	ссаддСаааС	да		1362

<210> 12 <211> 453 <212> РЕТ <21 3> Искусственный <220>

<223> Человеческий Б7-БС-1д <400> 12

МеЬ Ые РНе Ьеи Ьеи Ьеи МеЬ Ьеи Зег Ьеи СЬи Ьеи СЬп Ьеи Ηίε СЬп

1

5

10

15

11е

АЬа

АЬа

Ьеи

РНе

ТНг

УаЬ

ТНг

Уа1

Рго

Ьуз

СЬи

Ьеи

Туг

Ые

Не

20

25

30

Е1и

НЬз

СЬу

Зег

Азп

Уа1

ТНг

Ьеи

СЬи

Суз

АЗП

РНе

Азр

ТЬг

СЬу

Зег

35

40

45

Ηίε

УаЬ

Αεη

Ьеи

СЬу

АЬа

Ые

ТНг

АЬа

Зег

Ьеи

6Ш

Ьуз

УаЬ

СЬи

Азп

50

55

60

Агр

ТЬг

Зег

Рго

НЬз

Агд

СЬи

Агд

АЬа

ТНг

Ьеи

Ьеи

СЬи

СХи

СЬп

Ьеи

- 47 023148

- 48 023148

325

330

335

Рго

Ые

61и

Ьуз

ТНг

Пе

Зег

Ьуз

А1а

Ьуз

СЬу

СЬп

Рго

Агд

СЬи

Рго

340

345

350

СЬп

УаЬ

Туг

ТНг

Ьеи

Рго

Рго

Зег

Агд

Азр

СЬи

Ьеи

ТНг

Ьу5

Азп

еьп

355

360

365

Уа1

Зег

Ьеи

ТНг

Суз

Ъеи

Уа1

Ьуз

СЬу

РНе

Туг

Рго

Зег

Азр

ЬЬе

АЬа

370

375

380

УаЬ

СЬи

Тгр

СЬи

Зег

А$п

С1у

С1п

Рго

СЬи

Азп

Азп

Туг

Ьуз

ТНг

ТНг

385

390

395

400

Рго

Рго

УаЬ

Ьеи

Азр

Зег

Азр

СЬу

Зег

РНе

РНе

Ьеи

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

405

410

415

ТНг

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

Агд

Тгр

СЬп

СЬп

61у

Азп

УаЬ

РНе

Зег

Суз

Зег

420

425

430

УаЬ

МеЬ

Шз

СЬи

АЬа

Ьеи

Ηΐ3

Азп

НЬз

Туг

ТНг

СЬп

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

435

440

445

Ьеи

Зег

Рго

СЬу

Ьуз

450 <210> 13 <211> 434 <212> РКТ <213> Искусствен™ <220>

<223> Человеческий В7-ОС-1д без сигнальной последовательности
<400> :	13
Ьеи РНе 1	ТНг УаЬ ТНг УаЬ Рго Ьу5 СЬи Ьеи Туг ЬЬе ЬЬе СЬи НЬз СЬу 5 10 15
Зег Авп	Уа1 ТНг Ьеи СЬи Суз Азп РНе Азр ТНг С1у Зег НЬз УаЬ Азп 20 25 30
Ьеи СЬу	АЬа Ые ТНг АЬа Зег Ьеи СЬп Ьуз Уа1 СЬи Азп Азр ТНг Зег 35 40 45
Рго Й13 50	Агд СЬи Агд АЬа ТНг Ьеи Ьеи СЬи СЬи СЬп Ьеи Рго Ьеи СЬу 55 60
Ьуз АЬа 65	Зег РНе НЬэ ЬЬе Рго СЬп УаЬ СЬп УаЬ Агд Азр СЬи СЬу СЬп 70 75 80

- 49 023148

Туг С1п Суз Ые Ые Ые Туг СЬу УаЬ АЬа Тгр Азр Туг Ьуз Туг Ьеи 85 90 95

ТНг Ьеи Ьуз УаЬ Ьуз А1а 5ег Туг Агд Ьуз Ые Азп ТНг Ηΐ3 Ые Ьеи 100 105 110

Ьуз Уа1 РГО СЬи ТНг Азр СЬи УаЬ СЬи Ьеи ТНг Суз СЬп АЬа ТНг С1у 115 120 125

Туг Рго Ьеи А1а СЬи УаЬ Зег Тгр Рго Азп УаЬ Зег Уа1 Рго АЬа Азп 130 135 140

ТЫ Зег НЬз Зег Агд ТНг Рго СЬи СЬу Ьеи Туг СЬп УаЬ ТНг Зег УаЬ 145 150 155 160

Ьеи Агд Ьеи Ьуз Рго Рго Рго СЯу Агд Азп РНе Зег Суз УаЬ РНе Тгр 165 170 175

Азп ТНг Шз УаЬ Агд С1и Ьеи ТНг Ьеи А1а Зег Ые Азр Ьеи СЬп Зег 180 185 190

СЬп МеГ СЬи Рго Агд ТНг НЬз Рго ТНг Тгр СЬи Рго Ьуз Зег Суэ Азр 195 200 205

Ьуз ТНг НЬз ТНг Суз Рго Рго Суз Рго АЬа Рго СЬи Ьеи Ьеи СЬу СЬу 210 215 220

Рго Зег УаЬ РНе Ьеи РНе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТНг Ьеи МеГ Ые 225 230 235 240

Зег Агд ТЬг Рго СЬи Уа1 ТНг Суз Уа1 УаЬ Уа1 Азр УаЬ Зег НЬз СЬи 245 250 255

Азр Рго СЬи УаЬ Ьуз РНе Азп Тгр Туг УаЬ Азр СЬу УаЬ СЬи УаЬ НЬз 260 265 270

Азп АЬа Ьуз ТНг Ьуз Рго Агд СЬи СЬи СЬп Туг Азп Зег ТНг Туг Агд 275 280 285

УаЬ УаЬ Зег УаЬ Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи НЬз СЬп Азр Тгр Ьеи Азп СЬу Ьуз 290 295 300

СЬи Туг Ьуз Суз Ьуз УаЬ Зег Азп Ьуз АЬа Ьеи Рго АЬа Рго Ые СЬи 305 310 315 320

Ьуз ТНг Ые Еег Ьуз АЬа Ьуз С1у С1п Рго Агд С1и Рго С1п Уа1 Туг 325 330 335

- 50 023148

ТЬг	Ьеи	Рго	Рго 340	Зег	Агд Авр	СЬи	Ьеи ТЬг Ьуа Аап 345	СЬп	УаЬ 350	Зег	Ьеи
ТЬг	Суз	Ьеи	УаЬ	Ьуз	СЬу РЬе	Туг	Рго Зег Аар 11е	АЬа	УаЬ	СЬи	Тгр
		355				360		365
61и	Зег	Азп	СЬу	СЬп	Рго СЬи	Аап	Аап Туг Ьуа ТЬг	ТНг	Рго	Рго	УаЬ
	370				375		380
Ьеи	Азр	5ег	Азр	СЬу	Зег РЬе	РЬе	Ьеи Туг Зег Ьуа	Ьеи	ТЬг	УаЬ	Азр
385					390		395				4 00
Ьуз	Зег	Агд	Тгр	СЬп	СЬп СЬу	Азп	УаЬ РЬе Зег Суз	Зег	УаЬ	МеЬ	НЬз
				405			410			415
СЬи	АЬа	Ьеи	Н1з	Авп	НЬз Туг	ТЬг	С1п Ьуз Зег Ьеи	Зег	Ьеи	Зег	Рго
			420				425		430
СЬу	Ьуз
<210>	14
<211>	5
<212>	РВТ
<213>	Ното	заргепз
<400>	14
Тгр	Азр	Туг	Ьуз	Туг
1				5
<210>	15
<211>	202
Х212>	РКТ
<213> :	Масаса £азс1си1аг1з
<400>	15
Ьеи	РЬе	ТЬг	УаЬ	ТЬг	7а1 Рго	Ьуз	С1и Ьеи Туг 11е	11е	СЬи	НЬз	СЬу
1				5			10			15
5ег	Азп	νπΐ	ТЬг	Ьеи	СЬи Суа	Азп	РЬе Аар ТЬг СЬу	Зег	НЬз	УаЬ	Азп
			20				25		30
Ьеи	СЬу	АЬа	11е	ТЬг	А1а Зег	Ьеи	С1п Ьуз УаЬ СЬи	Азп	Азр	ТЬг	Зег
		35				40		45
Рго	ΗΪ3	Агд	СЬи	Агд	АЬа ТЬг	Ьеи	Ьеи С1и С1и СЬп	Ьеи	Рго	Ьеи	СЬу
	50				55		60
Ьуз	А1а	Зег	РЬе	ΗΪΞ	11е Рго	СЬп	УаЬ СЬп УаЬ Агд	Азр	СЬи	СЬу	СЬп

- 51 023148

65

70

75

80

Туг

С1п

Суз

Ые

11е

Ые

Туг

С1у

УаЬ

АЬа

Тгр

Азр

Туг

Ьуз

Туг

Ьеи

85

90

95

ТЬг

Ьеи

Ьуз

Уа1

Ьуз

А1а

Зег

Туг

Агд

Ьуз

11е

Азп

ТЬг

Н15

Ые

Ьеи

100

105

но

Ьуз

Уа1

Рго

С1и

ТЬг

Азр

СЬи

Уа1

СЬи

Ьеи

ТЬг

Суз

С1п

А1а

ТЬг

С1у

115

120

125

Туг

Рго

Ьеи

А1а

С1и

Уа1

Зег

Тгр

Рго

Азп

УаЬ

Зег

Уа1

Рго

АЬа

Азп

130

135

140

ТЬг

5ег

НЬз

Зег

Агд

ТЬг

Рго

СЬи

С1у

Ьеи

Туг

С1п

УаЬ

ТЬг

Зег

УаЬ

145

150

155

160

Ьеи

Агд

Ьеи

Ьуз

Рго

Рго

Рго

С1у

Агд

Азп

РЬе

Зег

Суз

Уа!

РЬе

Тгр

165

170

175

Азп

ТНг

Н1з

Уа1

Агд

СЬи

Ьеи

ТЬг

Ьеи

АЬа

Зег

Пе

Азр

Ьеи

С1п

Зег

180

135

190

СЬп

МеС

С1и

Рго

Агд

ТЬг

НЬз

Рго

ТЬг

Тгр

195

200

<210>

16

<211>

290

<212>

РКТ

<213>

Ното

заргепз

<400>

16

МеЬ

Агд

Ые

РЬе

АЬа

УаЬ

РЬе

11е

РЬе

МеС

ТЬг

Туг

Тгр

ΗΪ3

Ьеи

Ьеи

1

5

10

15

Азп

А1а

РЬе

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

Рго

Ьуз

Азр

Ьеи

Туг

Уа1

Уа1

С1и

Туг

20

25

30

С1у

Зег

Азп

МеЬ

ТЬг

Ые

61и

Суз

Ьуз

РЬе

Рго

СЬи

Ьуз

СЬп

Ьеи

35

40

45

Азр

Ьеи

АЬа

АЬа

Ьеи

Пе

Уа1

Туг

Тгр

СЬи

МеГ

С1и

Азр

Ьуз

Азп

Ые

50

55

60

Ые

СЬп

РЬе

Уа1

НЬз

С1у

СЬи

СЬи

Азр

Ьеи

Ьуз

Уа1

СЬп

ΗΪ5

Зег

Зег

65

70

75

80

Туг

Агд

61п

Агд

А1а

Агд

Ьеи

Ьеи

Ьуз

Азр

С1п

Ьеи

Зег

Ьеи

С1у

Азп

35

90

95

АЬа

А1а

Ьеи

СЬп 100

Не

ТЬг Азр УаЬ

Ьуз 105

Ьеи

С1п

Азр

АЬа

СЬу 110

Уа1

Туг

Агд

Суз

МеЬ

11е

5ег

Туг

С1у

СЬу

А1а

Азр

Туг

Ьуз

Агд

Пе

ТЬг

УаЬ

115

120

125

Ьуз

Уа1

Азп

АЬа

Рго

Туг

Азп

Ьуз

Пе

Азп

С1п

Агд

11е

Ьеи

Уа1

УаЬ

130

135

140

Азр

Рго

УаЬ

ТЬг

Зег

СЬи

Ηΐ3

СЬи

Ьеи

ТНг

Суз

61п

А1а

СЬи

С1у

Туг

145

150

155

160

Рго

Ьуз

АЬа

СЬи

Уа1

Ые

Тгр

ТНг

Зег

Зег

Азр

Нгз

С1п

УаЬ

Ьеи

Зег

165

170

175

С1у

Ьуз

ТЬг

ТЬг

ТЬг

ТНг

Азп

Зег

Ьуз

Агд

СЬи

С1и

Ьуз

Ьеи

РНе

Азп

180

185

190

УаЬ

ТНг

Зег

ТНг

Ьеи

Агд

Пе

Азп

ТЬг

ТНг

ТНг

Азп

С1и

11е

РЬе

Туг

195

200

205

Суз

ТНг

РЬе

Агд

Агд

Ьеи

Азр

Рго

С1и

СЬи

Азп

Ηΐ3

ТЬг

АЬа

С1и

Ьеи

210

215

220

УаЬ

11е

Рго

СЬи

Ьеи

Рго

Ьеи

АЬа

Шз

Рго

Рго

Азп

СЬи

Агд

ТЬг

Н13

225

230

235

240

Ьее.

ν&1

Не

Ьеи

С1у

АЬа

11е

Ьеи

Ьеи

Суз

Ьеи

С1у

УаЬ

АЬа

Ьеи

ТНг

245

250

255

РЬе

Пе

РЬе

Агд

Ьеи

Агд

Ьуз

С1у

Агд

МеН

Ме!

Азр

УаЬ

Ьуз

Ьуз

Суз

260

265

270

СЬу

11е

СЬп

Азр

ТЬг

Азп

Зег

Ьуз

Ьуз

СЬп

Зег

Азр

ТНг

НЬз

Ьеи

СЬи

275

280

285

СЬи

ТЬг

290

<210

17

<211>

290

<212>

РЕТ

<213> 1

Миз тизси1из

<400>

17

МеЬ

Агд

Пе

РЬе

АЬа

С1у

Пе

11е

РНе

ТЬг

А1а

Суз

Суз

Н13

Ьеи

Ьеи

1

5

10

15

- 53 023148

- 54 023148

С1у

УаЬ

СЬи Азр ТНг 275

Зег

Зег

Ьуз 280

А$п

Агд

Азп

Азр

ТНг 285

СЬп

РНе

СЬи

СЬи

ТНг

290

<210> 18

<211> 290

<212> РКТ

<213> Масаса тиЬаГГа

<4оо> ;

18

Мег

Агд

11е РНе АЬа

Уа1

РНе

Ые

РЬе

ТНг

11е

Туг

Тгр

НЬз

Ьеи

Ьеи

1

5

10

15

Азп

АЬа

РНе ТНг УаЬ

ТНг

Уа1

Рго

Ъуз

Азр

Ьеи

Туг

УаЬ

УаЬ

СЬи

Туг

20

25

30

СЬу

Зег

Азп МеГ ТНг

Не

СЬи

Суз

Агд

РНе

Рго

νώΐ

СЬи

Ьуз

СЬп

Ьеи

35

40

45

СЬу

Ьеи

ТНг Зег Ьеи

11е

УаЬ

Туг

Тгр

СЬи

МеЁ

С1и

Азр

Ьуз

Азп

11е

50

55

60

Ые

СЬп

РНе УаЬ НЬз

С1у

СЬи

СЬи

Азр

Ней

Ьуз

ν^Ι

СЬп

НЬз

8ег

Азп

65

70

75

30

Туг

Агд

СЬп Агд АЬа

СЬп

Ьеи

Ьеи

Ьуз

Азр

С1п

Ьеи

Зег

Ьеи

СЬу

Азп

85

90

95

АЬа

АЬа

Ьеи Агд 11е

ТЬг

Азр

УаЬ

Ьуз

Ьеи

С1п

Азр

АЬа

СЬу

УаЬ

Туг

100

105

110

Агд

Суз

МеГ 11е Зег

Туг

СЬу

СЬу

А1а

Азр

Туг

Ьуз

Агд

11е

ТНг

УаЬ

115

120

125

Ьуз

УаЬ

Азп АЬа Рго

Туг

Азп

Ьуз

Не

Азп

СЬп

Агд

Ые

Ьеи

УаЬ

УаЬ

130

135

140

Азр

Рго

УаЬ ТНг Зег

СЬи

НЬз

СЬи

Ьеи

ТНг

Суз

С1п

АЬа

СЬи

СЬу

Туг

145

150

155

160

Рго

Ьуз

А1а СЬи Уа1

11е

Тгр

ТНг

Зег

Зег

Азр

ΗΪΞ

СЬп

УаЬ

Ьеи

Зег

165

170

175

СЬу

Ьуз

ТНг ТНг ТНг

ТЬг

Азп

Еег

Ьуз

Агд

СЬи

С1и

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Азп

180

185

190

- 55 023148

Уа1

ТЬг

Зег 195

ТНг

Ьеи

Агд

Не

Азп 200

ТЬг

ТНг

А1а Азп С1и 205

Не

РЬе

Туг

Суз

Не

РЬе

Агд

Агд

Ьеи

С1у

Рго

СЬи

СЬи

Азп

НЬз

ТЬг

АЬа

СЬи

Ьеи

210

215

220

Уа1

11е

Рго

С1и

Ьеи

Рго

Ьеи

АЬа

Ьеи

Рго

Рго

Азп

СЬи

Агд

ТНг

НЬз

225

230

235

240

Ьеи

УаЬ

Не

Ьеи

С1у

А1а

Не

РНе

Ьеи

Ьеи

Ьеи

С1у

Уа1

АЬа

Ьеи

ТЫ

245

250

255

РЬе

Не

РЬе

Туг

Ьеи

Агд

Ьуз

61у

Агд

МеГ

МеГ

Азр

МеГ

Ьуз

Ьуз

Зег

260

265

27 0

С1у

Не

Агд

7а1

ТЬг

Азп

Зег

Ьуз

Ьуз

СЬп

Агд

Азр

ТЬг

СЬп

Ьеи

СЬи

275

280

285

С1и

Й1Г

2 90

<210>

19

<211> .

288

<212?

РЕТ

<213> 1

Ното

зархепз

<400>

19

МеГ

СЬп

Не

Рго

С1п

А1а

Рго

Тгр

Рго

Уа1

Уа1

Тгр

АЬа

УаЬ

Ьеи

СЬп

1

5

10

15

Ьеи

С1у

Тгр

Агд

Рго

С1у

Тгр

РЬе

Ьеи

Азр

Зег

Рго

Азр

Агд

Рго

Тгр

20

25

30

Азп

Его

Рго

ТЬг

РНе

РЬе

Рго

АЬа

Ьеи

Ьеи

Уа1

УаЬ

ТНг

СЬи

СЬу

Азр

35

40

45

Азп

А1а

ТНг

РЬе

ТНг

Суз

Зег

РЬе

Зег

Азп

ТНг

Зег

СХи

Зег

РЬе

УаЬ

50

55

60

Ьеи

Азп

Тгр

Туг

Агд

МеГ

Зег

Рго

Зег

Азп

СЬп

ТНг

Азр

Ьуз

Ьеи

АЬа

65

70

75

80

А1а

РЬе

Рго

С1и

Азр

Агд

Зег

61п

Рго

С1у

С1п

Азр

Суз

Агд

РНе

Агд

85

90

95

Уа1

ТЬг

61п

Ьеи

Рго

Азп

61 у

Агд

Азр

РНе

ΗΪ5

МеГ

Зег

УаЬ

УаЬ

Агд

100

105

но

АЬа

Агд

Агд

Азп

Азр

Зег

С1у

ТНг

Туг

Ьеи

Суз

61у

АЬа

Не

Зег

Ьеи

- 56 023148

115 120 125

А1а

Рго 130

Ьуз А1э

СЁп

Не

Ьуз С1и 13Ь

Зег

Ьеи

Агд

А1а 140

СЁи

Ьеи

Агд

Уа1

ТЬг

С1и

Агд

Агд

А1а

С1и

17а 1

Рго

ТЬг

А1а

НЁЗ

Рго

Зег

Рго

Зег

Рго

145

150

155

160

Агд

Рго

А1а

01у

С1п

РЬе

<31п

ТЬг

Ьеи

Уа1

17а1

С1у

\7а1

1/а1

ЕЁу

61 у

165

170

175

Ьеи

Ьеи

С1у

Зег

Ьеи

Уа1

Ьеи

Ьеи

17а1

Тгр

17а1

Ьеи

А1а

17а 1

Не

Суз

180

185

190

Зег

Агд

А1а

А1а

Агд

61у

ТЬг

Не

С1у

А1а

Агд

Агд

ТЬг

<31у

С1п

Рго

195

200

205

Ьеи

Ьуз

61и

Азр

Рго

Зег

А1а

Уа1

Рго

Уа1

РЬе

Зег

Уа1

Азр

Туг

61у

210

215

220

51и

Ьеи

Азр

РЬе

С1п

Тгр

Агд

С1и

Ьуз

ТЬг

Рго

С1и

Рго

Рго

17а1

Рго

225

230

235

240

Суз

УаЬ

Рго

С1и

С1п

ТЫ

С1и

Туг

А1а

ТЬг

Не

Уа1

РЬе

Рго

Зег

61у

245

250

255

МеЬ

61у

ТЬг

Зег

Зег

Рго

А1а

Агд

Агд

61у

Зег

А1а

Аар

С1у

Рго

Агд

260

265

270

Зег

А1а

С1п

Рго

Ьеи

Агд

Рго

С1и

Азр

С1у

НЁЗ

Суз

Зег

Тгр

Рго

Ъеи

275 280 285 <210> 20 <2Η> 288 <212> РЕТ <213> Масаса РазсЁси1агЁЗ

<400> 20

МеЬ

61п

Не

Рго

С1п

А1а

Рго

Тгр

Рго

УаЁ

7а1

Тгр

А1а

17а1

Ьеи

61п

1

5

10

15

Ьеи

С1у

Тгр

Агд

Рго

61у

Тгр

РЬе

Ьеи

С1и

Зег

Рго

Азр

Агд

Рго

Тгр

20

25

30

Азп

А1а

Рго

ТЬг

РЬе

Зег

Рго

А1а

Ьеи

Ьеи

Ьеи

Уа 1

ТЬг

Й1и

С1у

Азр

35

40

45

Азп

А1а

ТЬг

РЬе

ТЬг

Суз

Зег

РЬе

Зег

Аап

А1а

Зег

С1и

Зег

РЬе

Уа1

50

55

60

Claims (33)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Терапевтическая композиция для увеличения Т-клеточного ответа, включающая слитый белок, содержащий первую и вторую пептидные части, где указанная первая пептидная часть состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из аминокислотной последовательности §Еф ГО N0: 1 полипептида В7-ИС дикого типа, аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 98% идентична последовательности аминокислот 20-221 или 20-121 §Еф ГО N0: 1 и которая конкурирует ίη νίίτο с В7ГОС дикого типа за связывание с ΡΌ-1, внеклеточного домена В7ГОС, имеющего 8Еф ГО N0: 3, или полипептида, отличающегося от него только консервативными аминокислотными заменами, и который конкурирует ίη νίίτο с В7-ИС дикого типа за связывание с ΡΌ-1, где указанная вторая пептидная часть содержит Рс-область антитела и агент, усиливающий эффективность действия указанного белка, выбранный из группы, включающей циклофосфамид, аналог циклофосфамида, сунитиниб, анти-ТООТв, иматиниб, антрациклины, оксалиплатин, доксорубицин, антагонисты ТЬК4 и антагонисты ГО-18, в фармацевтически приемлемом носителе.
2. 2. Композиция по п.1, где указанный агент представляет собой циклофосфамид или аналог циклофосфамида.
3. 3. Композиция по п.1, дополнительно включающая по меньшей мере один дополнительный агент, выбранный из группы, состоящей из антитела против ΡΌ-1, антитела против СТЬА4, ингибитора митоза, ингибитора ароматазы, антагониста А2АК и ингибитора ангиогенеза.
4. 4. Композиция по любому из пп.1-3, где указанный В7-ИС представляет собой В7-ИС человека.
5. 5. Композиция по любому из пп.1-4, где указанная первая пептидная часть состоит из внеклеточного домена В7-ИС дикого типа.
6. 6. Композиция по п.5, где указанный внеклеточный домен В7ГОС представляет собой растворимый внеклеточный домен.
7. 7. Композиция по любому из пп.1-4, где указанная первая пептидная часть состоит из аминокислотной последовательности §Еф ГО N0: 3 или полипептида, отличающегося от него только консервативными аминокислотными заменами.
8. 8. Композиция по любому из пп.1-4, где указанная первая пептидная часть состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 98% идентична последовательности аминокислот 20-221 или 20-121 8Еф ГО N0: 1.
9. 9. Композиция по любому из пп.1-4, где указанная первая пептидная часть состоит из последовательности аминокислот 20-221 или 20-121 §Еф ГО N0: 1.
10. 10. Композиция по любому из пп.1-4, где указанный слитый белок содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности последовательности §Еф ГО N0: 9, 10, 12 или 13, которая конкурирует ίη νίίτο с В7ГОС дикого типа за связывание с ΡΌ-1.
11. 11. Композиция по любому из пп.1-4, где указанный слитый белок содержит аминокислотную последовательность §Еф ГО N0: 9, 10, 12 или 13.
12. 12. Композиция по любому из пп.1-11, где указанный слитый белок представляет собой мономер.
13. 13. Композиция по любому из пп. 1-11, где указанный слитый белок образует димер.
14. 14. Композиция по п.13, где указанный димер представляет собой гомодимер.
15. 15. Композиция по п.13, где указанный димер представляет собой гетеродимер.
16. 16. Композиция по п.1, где указанный слитый белок содержит первую пептидную часть, которая состоит из аминокислот 20-221 §Еф ГО N0: 1, и вторую пептидную часть, которая состоит из шарнирной области, участков С_Н2 и С_Н3 Ογί иммуноглобулина человека.
17. 17. Композиция по любому из пп.1-16, где указанная вторая пептидная часть содержит аминокислотную последовательность §Еф ГО N0: 6.
18. 18. Фармацевтическая композиция для увеличения Т-клеточного ответа, включающая слитый белок, содержащий аминокислотную последовательность §Еф ГО N0: 13 или ее вариант, имеющий 95% идентичности с последовательностью 8Еф ГО N0: 13, который конкурирует ίη νίίτο с В7ГОС дикого типа за связывание с ΡΌ-1, фармацевтический приемлемый носитель и циклофосфамид.
19. 19. Композиция по пп.1, 2 или 18, содержащая циклофосфамид в количестве от около 0,45 до около 4,5 мг.
20. 20. Применение композиции по любому из пп.1-19 для производства лекарственного средства, увеличивающего Т-клеточный ответ, для лечения заболевания, поддающегося лечению путем увеличенного Т-клеточного ответа.
21. 21. Применение по п.20, где указанное заболевание представляет собой инфекционное заболевание.
22. 22. Применение по п.20, где указанное заболевание представляет собой рак.
23. 23. Применение по п.22, где указанный рак представляет собой рак мочевого пузыря, рак мозга, рак молочной железы, рак шейки матки, колоректальный рак, рак пищевода, рак почек, рак печени, рак легких, назофарингеальный рак, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак кожи, рак желудка, рак матки, рак яичников, рак яичка или гематологический рак.

    - 59 023148
24. 24. Способ увеличения Т-клеточного ответа у млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему композиции по любому из пп.1-19.
25. 25. Способ по п.24, где композиция содержит слитый белок в дозе 1-40 мг/кг.
26. 26. Способ по п.24, где указанное заболевание представляет собой инфекционное заболевание.
27. 27. Способ по п.24, где указанное заболевание представляет собой рак.
28. 28. Способ по п.27, где указанный рак представляет собой рак мочевого пузыря, рак мозга, рак молочной железы, рак шейки матки, колоректальный рак, рак пищевода, рак почек, рак печени, рак легких, назофарингеальный рак, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак кожи, рак желудка, рак матки, рак яичников, рак яичка или гематологический рак.
29. 29. Терапевтическая композиция для увеличения Т-клеточного ответа, содержащая слитый белок, включающий первую и вторую пептидные части, где указанная первая пептидная часть состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из последовательности внеклеточного домена В7ГОС, его фрагментов и вариантов, отличающиеся только консервативными аминокислотными заменами, которые конкурируют 1п уйго с В7ГОС дикого типа за связывание с ΡΌ-1, и где указанная вторая пептидная часть содержит Рс-область антитела и агент, усиливающий эффективность действия указанного белка, выбранный из группы, включающей циклофосфамид, аналог циклофосфамида, сунитиниб, анти-ТООТв, иматиниб, антрациклины, оксалиплатин и доксорубицин, в фармацевтически приемлемом носителе.
30. 30. Способ увеличения Т-клеточного ответа у человека, включающий введение указанному человеку слитого белка, содержащего первую и вторую пептидные части, где указанная первая часть состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 98% идентична последовательности аминокислот 20-221 или 20-121 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 1 полипептида В7ГОС дикого типа и которая конкурирует ш уйго с В7ГОС дикого типа за связывание с ΡΌ-1;

    аминокислотной последовательности фрагмента полноразмерного В7ГОС, которая конкурирует ш уйго с В7ГОС дикого типа за связывание с ΡΌ-1, и аминокислотной последовательности внеклеточного домена В7ГОС или ее варианта, отличающегося от исходной последовательности только консервативными аминокислотными заменами, где указанная вторая пептидная часть содержит Рс-область антитела; и агента, усиливающего эффективность действия указанного белка, выбранного из группы, включающей циклофосфамид, аналог циклофосфамида, сунитиниб, анти-ТООТ^, иматиниб, антрациклины, оксалиплатин, доксорубицин, антагонисты ТЬК4 и антагонисты ΙΕ-18, в фармацевтически приемлемом носителе, где указанный агент вводят перед указанным слитым белком.
31. 31. Способ по п.1, где указанный агент представляет циклофосфамид или аналог циклофосфамида.
32. 32. Способ по п.30 или 31, где указанный агент вводят по меньшей мере за X часов перед введением указанного слитого белка, где X выбирают из 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 24 и 30.
33. 33. Способ по п.30 или 31, где циклофосфамид вводят указанному человеку по меньшей мере за 24 ч перед введением слитого белка.

    Связывание В7ГОС4д с клетками СНО, экспрессирующими ΡΌ-01